DE69936760T2

DE69936760T2 - Neue Amylasen

Info

Publication number: DE69936760T2
Application number: DE69936760T
Authority: DE
Inventors: Hiroshi Haga-gun Hagihara; Kaori Haga-gun Kitayama; Yasuhiro Haga-gun Hayashi; Kazuaki Haga-gun Igarashi; Keiji Haga-gun Endo; Katsuya Haga-gun Ozaki
Original assignee: Kao Corp
Current assignee: Kao Corp
Priority date: 1998-12-21
Filing date: 1999-12-20
Publication date: 2008-05-21
Anticipated expiration: 2019-12-21
Also published as: US20020197698A1; DE69936760D1; DK1022334T3; US6403355B1; EP1022334A2; CN1257917A; US6916645B2; EP1022334B1; CN1552852A; EP1022334A3; CN1218039C

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft verflüssigende alkalische α-Amylasen, die eine hohe Resistenzleistung gegenüber Chelatbildnern aufweisen und die als Komponenten in Detergenzien verwendbar sind.
α-Amylasen werden in großem Umfang in verschiedenen Industriebereichen verwendet, wie zum Beispiel in der Stärke-, der Brau-, der Faser herstellenden Industrie, der pharmazeutischen und der Nahrungsmittelindustrie. Da α-Amylasen für ihre Eignung als eine Komponente in Detergenzien bekannt sind, werden sie sogar Spülmitteln für Geschirrspülmaschinen oder Waschpulvern als eine die Waschkraft verstärkende Komponente zugesetzt [Enzymes in Detergency, S. 203, Marcel Dekker Inc., New York (1995)].
Als verflüssigende α-Amylasen, die als Detergenzien verwendbar sind und ihre optimale Wirkung im alkalischen Bereich besitzen, sind diejenigen bekannt, die schon früher von den hier genannten Erfindern entdeckt wurden und von dem Stamm Bacillus sp. KSM-1378 (FERM BP-3048) abstammen. Vor kurzem wurden α-Amylasen mit einem p-Optimum bei etwa 8 bis 9,5 offenbart ( WO 95/2639 ). Sie ähneln in ihren Eigenschaften und Strukturen stark denen, die von dem Stamm KSM-1378 abstammen.
In einem Detergens ist ein Chelatbildner wie zum Beispiel Phosphorsäure, Zitronensäure oder Zeolith enthalten, der die Reinigung beeinträchtigende Ionen wie zum Beispiel Calcium-Ionen aus der Waschflüssigkeit entfernt. Seit vielen Jahren ist bekannt, dass verflüssigende α-Amylasen Calcium-Ionen benötigen, um ihre Enzymaktivität zu entfalten; diese Calcium-Ionen werden jedoch von den oben genannten Chelatbildnern oder dem stärkeren Chelatbildner EDTA desaktiviert [HANDBOOK OF AMYLASES AND RELATED ENZYMES, S. 43, The Amylase Research Society Japan (1988)]. In den letzten Tagen wurde berichtet, dass die Röntgenkristallographie-Analyse der bis zum jetzigen Zeitpunkt bekannten verflüssigenden α-Amylasen ergeben hat, dass in ihrem Molekül drei Calcium-Ionen vorhanden sind, und 13 Aminosäurereste mit besonders hoher Häufigkeit konserviert sind [Structure, 6, 281 (1998)].
Die Hemmung der Enzymaktivität durch einen Chelatbildner wurde auch bei der oben genannten verflüssigenden alkalischen α-Amylase, die von dem Stamm Bacillus sp. KSM-1378 (FERM BP-3048) abstammt, erkannt, und diese α-Amylase weist nicht immer genügend Wirksamkeit auf, wenn sie in einem Spülmittel für Geschirrspülmaschinen oder in einem Wäschewaschmittel enthalten ist. Die aus Bacillus licheniformis stammenden verflüssigende α-Amylasen (Termamyl und Duramyl, hergestellt von Novo Nordisk A/S), welche am häufigsten als Komponenten in Spülmitteln für Geschirrspülmaschinen oder Wäschewaschmitteln eingesetzt werden, sind ebenfalls ungenügend in ihrer Resistenzleistung gegenüber Chelatbildnern.
Von den bisher bekannten verflüssigenden Amylasen bleiben nur eine verflüssigende α-Amylase ( WO 90/11352 ) die von dem zu Pyrococcus sp. gehörenden Stamm abstammt und eine α-Amylase ( WO 96/02633 ), die von dem zu Sulfolobus sp. gehörenden Stamm abstammt, und die ihre Wirksamkeit im Verflüssigungsschritt der Stärke entfaltet, von einem Chelatbildner unbeeinflusst. Diese Enzyme haben ihren optimalen Wirkungs-pH-Wert jedoch im Bereich von 4 bis 6 beziehungsweise von 2,5 bis 4,5 und wirken nicht im alkalischen Bereich, so dass sie als Komponenten eines Detergens nicht geeignet sind.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es demnach, eine verflüssigende alkalische α-Amylase für Detergenzien bereitzustellen, die eine höhere Resistenzleistung gegenüber Chelatbildnern als herkömmliche Amylasen aufweist und die als Komponente eines Detergens verwendbar ist; sowie eine Detergenszusammensetzung, welche diese verflüssigende alkalische α-Amylase enthält.
In einem Aspekt stellt die vorliegende Erfindung somit eine verflüssigende alkalische Amylase bereit, welche eine Restaktivität von nicht weniger als 70 % besitzt, wenn sie bei pH 10 und 45°C für 30 Minuten in Anwesenheit von 1 bis 100 mM EDTA oder EGTA behandelt wird, und welche eine Aminosäuresequenz besitzt, die mindestens 80 % Homologie mit der in Sequenz ID NO. 1 oder No. 2 gezeigten Sequenz aufweist.
In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein DNA-Fragment bereit, das die verflüssigende alkalische Amylase codiert.
In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung eine Detergenszusammensetzung bereit, die die verflüssigende alkalische Amylase enthält.
1 ist ein Diagramm, das das Verhältnis zwischen EDTA-Konzentration und Restaktivität einer jeden der beiden verflüssigenden alkalischen Amylasen (K36 und K38) gemäß der vorliegenden Erfindung sowie von bekannten Amylasen, die in Detergenzien verwendet werden während der Behandlung darstellt; 2 ist ein Diagramm, das das Verhältnis zwischen EGTA-Konzentration und Restaktivität einer jeden der beiden verflüssigenden alkalischen Amylasen (K36 und K38) gemäß der vorliegenden Erfindung sowie von bekannten Amylasen, die in Detergenzien verwendet werden während der Behandlung darstellt; 3 ist ein Diagramm, das das Verhältnis zwischen Zeolith-Konzentration und Restaktivität der verflüssigenden alkalischen Amylase K36 gemäß der vorliegenden Erfindung während der Behandlung darstellt; 4 ist ein Diagramm, das das Verhältnis zwischen Zitronensäure-Konzentration und Restaktivität der verflüssigenden alkalischen Amylase K36 gemäß der vorliegenden Erfindung während der Behandlung darstellt; 5 ist ein Diagramm, das das Verhältnis zwischen Zeolith-Konzentration und Restaktivität der verflüssigenden alkalischen Amylase K38 gemäß der vorliegenden Erfindung während der Behandlung darstellt; 6 ist ein Diagramm, das das Verhältnis zwischen Zitronensäure-Konzentration und Restaktivität der verflüssigenden alkalischen Amylase K38 gemäß der vorliegenden Erfindung während der Behandlung darstellt; 7 ist ein Diagramm, das das Verhältnis zwischen Reaktions-pH-Wert und relativer Aktivität der verflüssigenden alkalischen Amylase K36 gemäß der vorliegenden Erfindung darstellt; 8 ist ein Diagramm, das das Verhältnis zwischen Reaktions-pH-Wert und relativer Aktivität der verflüssigenden alkalischen Amylase K38 gemäß der vorliegenden Erfindung darstellt; und 9 ist ein Diagramm, das das Verhältnis zwischen Behandlungszeit mit H₂O₂ und Restaktivität einer jeden der beiden verflüssigenden alkalischen Amylasen (K36 und K38) gemäß der vorliegenden Erfindung sowie von bekannten Amylasen, die in Detergenzien verwendet werden, darstellt.
Der Begriff "alkalische Amylase", wie er hierin verwendet wird, bezeichnet eine α-Amylase, die ihr pH-Optimum im alkalischen Bereich hat. Der Begriff "neutral", wie er hierin verwendet wird, bezeichnet einen pH-Bereich von 6 bis 8, während der Begriff "alkalisch" einen pH-Bereich bezeichnet, der höhere Werte aufweist als der neutrale Bereich. Wie im HANDBOOK OF AMYLASES AND RELATED ENZYMES [S. 40–41, The Amylase Research Society Japan (1988)] dargelegt, bezeichnet der Begriff "verflüssigende α-Amylase" α-Amylasen, die Stärken oder Stärke enthaltende Polysaccharide höchst willkürlich abbauen.
Das Enzym gemäß der vorliegenden Erfindung ist eine verflüssigende alkalische Amylase, welche eine Restaktivität von nicht weniger als 70 % besitzt, wenn sie bei pH 10 und 45°C für 30 Minuten in Anwesenheit von 1 bis 100 mM EDTA oder EGTA behandelt wird, wobei die Restaktivität vorzugsweise nicht weniger als 80 % und stärker bevorzugt nicht weniger als 90 % beträgt, und wobei das Enzym eine Aminosäuresequenz besitzt, die mindestens 80 % Homologie mit der in Sequenz ID NO. 1 oder NO. 2 gezeigten Sequenz aufweist.
Es ist erforderlich, dass das Enzym der Erfindung die oben genannte Resistenz gegenüber Chelatbildnern besitzt, vorzugsweise jedoch die unten beschriebenen Eigenschaften 1) und 2) aufweist, und stärker bevorzugt die unten beschriebenen Eigenschaften 1) bis 5) aufweist.
1) Optimaler Wirkungs-pH:
Es hat ein Wirkungsoptimum bei einem pH jenseits von 8,0 (als Ergebnis einer Reaktion bei 50°C für 15 Minuten mit löslicher Stärke als Substrat).
2) Aktivität:
Es hydrolysiert α-1,4-glucosidische Bindungen in Stärken, Amylose, Amylopektin und partiellen Abbauprodukten davon und bildet aus Amylose Glucose (G1), Maltose (G2), Maltotriose (G3), Maltotetraose (G4), Maltopentaose (G5), Maltohexaose (G6) und Maltoheptaose (G7). Es wirkt jedoch nicht auf Pullulan.
3) pH-Stabilität (Britton-Robinson-Puffer):
Es zeigt eine Restaktivität von nicht weniger als 70 % innerhalb eines pH-Bereichs von 6,5 bis 11,0, wenn es bei 40°C für 30 Minuten behandelt wird.
4) Wirkungstemperaturbereich und optimale Wirkungstemperatur:
Es wirkt in einem breiten Temperaturbereich von 20 bis 80°C, mit einer optimalen Wirkungstemperatur von 50 bis 60°C.
5) Temperaturstabilität:
Es zeigt eine Restaktivität von nicht weniger als als 80 % bei 40°C, wenn es für 30 Minuten in einem 50 mM Glycin-Natriumhydroxid-Puffer (pH 10) behandelt wird, und zeigt eine Restaktivität von etwa 60 % sogar bei 45°C.
Stärker bevorzugt besitzen Enzyme der Erfindung darüberhinaus die unten beschriebenen Eigenschaften 6).
6) Resistenz gegenüber einem Oxidationsmittel:
Es zeigt eine Restaktivität von nicht weniger als 70 %, wenn es bei pH 10 und 30°C für 60 Minuten in Anwesenheit von 2 % H₂O₂ behandelt wird.
Obgleich der spezifischen Aktivität des Enzyms der Erfindung keine besonderen Grenzen auferlegt sind, wird das mit der unter 7) unten beschriebenen spezifischen Aktivität besonders bevorzugt.
7) Spezifische Aktivität:
Die spezifische Aktivität, die sich aus der Enzymaktivität, wenn das Enzym bei pH 10 und 50°C für 15 Minuten (mit löslicher Stärke als Substrat) reagiert, und einer Proteinkonzentration wie mittels Proteinassay-Kit (hergestellt von Bio-rad Laborstories) gemessen errechnet, beträgt 3000 E/mg oder darüber.
Das Enzym der Erfindung kann eine Aminosäuresequenz, wie in sie im Sequenzprotokoll No. 1 oder 2 dargestellt und hierin nachstehend beschrieben ist, besitzen, und es kann die oben genannte Aminosäuresequenz mit der Ausnahme besitzen, dass Teile davon Substitutionen, Deletionen oder Hinzufügungen von einer oder mehreren Aminosäuren aufweisen. In Bezug auf Substitution, Deletion oder Hinzufügung ist die Homologie mindestens 80 %, vorzugsweise jedoch mindestens 90 %. Die Homologie wird im Übrigen mit der Lipman-Pearson-Methode berechnet [Science, 227, 1435 (1985)].
Eine der Besonderheiten der Aminosäuresequenz des Enzyms der Erfindung ist, dass, im Gegensatz zu den bisher bekannten verflüssigenden α-Amylasen, welche 13 ausgesprochen hoch konservierte Aminosäurereste an der Calcium-Anbindungsstelle aufweisen, das Enzym der Erfindung eine niedrige Konservierungsrate besitzt. Insbesondere fünf Reste von acht Resten, welche Asparaginsäure entsprechen und eine Carboxy-Seitenkette besitzen, die bei der herkömmlichen verflüssigenden α-Amylase eine wichtige Rolle in der Anbindung der Calciumatome spielen, stellen bei dem Enzym der Erfindung Asparagin oder Serin ohne Carboxy-Seitenkette dar, was darauf hindeutet, dass in diesem Molekül kein Calcium enthalten ist. In anderen Worten, es kann davon ausgegangen werden, dass das Enzym der Erfindung deshalb eine hohe Resistenzleistung gegenüber Chelatbildnern aufweist, weil es zur Expression seiner Enzymaktivität kein Calcium benötigt. Von solchen verflüssigenden α-Amylasen mit einer niedrigen Konservierungsrate bei den Aminosäureresten an der Calcium-Anbindungsstelle, die somit nicht so sehr auf Calcium angewiesen sind, ist nur die von Pyrococcus sp. abstammende Amylase bekannt [Appl. Environm. Microbiol., 63, 3569 (1997)]. Dieses Enzym ist jedoch als Komponente eines Detergens nicht geeignet, da es sich dabei um eine sauere Amylase handelt, die ihren optimalen Wirkungs-pH bei etwa 5,5 bis 6 besitzt und ihre Aktivität bei einer Temperatur, die nicht größer als 50°C ist, stark abnimmt. Die Aminosäuresequenz dieses Enzyms weist nur etwa 30 % Homologie mit der des Enzyms der Erfindung auf, was darauf hindeutet, dass die verflüssigende alkalische α-Amylase der vorliegenden Erfindung von diesem Enzym vollkommen verschieden ist. Dementsprechend handelt es sich bei der verflüssigenden alkalischen α-Amylase gemäß der vorliegenden Erfindung um ein neuartiges Enzym, das deutlich von den zum bisherigen Zeitpunkt bekannten verflüssigenden α-Amylasen unterschieden werden kann.

Das Enzym der vorliegenen Erfindung wird beispielsweise mittels Kultivierung von das Zielenzym produzierenden Bakterien, die zu Bacillus sp. gehören, hergestellt und das Enzym wird aus der Kultur gewonnen. Beispiele von solchen Zielenzyme produzierenden Bakterien umfassen die Stämme KSM-K36 und KSM-K38, welche die unten genannten mycologischen Eigenschaften aufweisen. Tabelle 1

	Stamm KSM-K36	Stamm KSM-K38
(a) Ergebnisse der mikroskopischen Beobachtung	Die Stämme K36 und K38 sind Bacilli von einer Größe von 1,0 bis 1,2 μm × 2,4 bis 5,4 μm beziehungsweise von 1,0 bis 1,2 μm × 1,8 bis 3,8 μm. Sie bilden eine ovale Endospore (1,0 bis 1,2 μm × 1,2 bis 1,4 Micrometer) im Zentrum oder in der Nähe des Zellendes. Positive Reaktion auf Gram-Färbung. Keine Säureresistenz.
(b) Wachstum in verschiedenen Medien Da der vorliegende Stamm alkaliphil ist, wurde dem Medium, das in den folgenden Tests verwendet wurde, 0,5 % Natriumcarbonat zugegeben.
• Plattenkultur mit Nähragar	Gutes Wachstum beobachtet. Die Kolonie weist eine runde Form auf. Sie hat eine flache Oberfläche aber einen rauhen Rand. Die Farbe der Kolonie ist blass erdfarbig.	Gutes Wachstum beobachtet. Die Kolonie weist eine runde Form auf. Sie hat eine flache Oberfläche und einen glatten Rand. Die Farbe der Kolonie ist gelblich braun.
• Schrägagar-Kultur mit Nähragar	Wachstum wird beobachtet.	Wachstum wird beobachtet.
• Kultur mit Nährbrühe	Wachstum wird beobachtet.	Wachstum wird beobachtet.
• Stichkultur mit Nährgelatine	Gutes Wachstum wird beobachtet. Keine Verflüssigung der Gelatine wird beobachtet.	Gutes Wachstum wird beobachtet. Keine Verflüssigung der Gelatine wird beobachtet.
• Lackmusmilch	Keine Veränderung wird beobachtet.	Keine Veränderung wird beobachtet.
(c) Physiologische Eigenschaften
• Reduktion eines Nitrats und Denitrifikationsreaktion	Reduktion eines Nitrats ist positiv. Denitrifikationsreaktion ist negativ.	Reduktion eines Nitrats ist positiv. Denitrifikationsreaktion ist negativ.

• MR-Test	Aufgrund des alkalischen Mediums ist eine Beurteilung unmöglich.	Aufgrund des alkalischen Mediums ist eine Beurteilung unmöglich.
• V-P-Test	Negativ.	Negativ.
• Indolbildung	Negativ.	Negativ.
• Bildung von Waserstoff-nitriden	Negativ.	Negativ.
• Stärkehydrolyse	Positiv.	Positiv.
• Assimilation von Zitronensäure	Wächst auf Medium nach Christensen, aber nicht in Koser-Medium oder auf Simmons-Agar.	Wächst auf Medium nach Christensen, aber nicht in Koser-Medium oder auf Simmons-Agar.
• Assimilation einer anorganischen Stickstoffquelle	Assimiliert ein Nitrat, aber nicht ein Ammoniumsalz.	Assimiliert ein Nitrat, aber nicht ein Ammoniumsalz.
• Bildung eines Farbstoffs	Bildung eines blass gelben Farbstoffs auf King β-Medium.	Negativ.
• Urease	Negativ.	Negativ.
• Oxidase	Negativ.	Negativ.
• Katalase	Positiv.	Positiv.
• Wachstumsbereich	Temperaturbereich für Wachstum ist 15 bis 40°C. Die optimale Wachstumstemperatur reicht von 30 bis 37°C. Der pH-Bereich für Wachstum ist 8,0 bis 11,0. Der optimale Wachstums-pH ist pH 10,0 bis 11,0.	Temperaturbereich für Wachstum ist 15 bis 40°C. Die optimale Wachstumstemperatur ist 30°C. Der pH-Bereich für Wachstum ist 9,0 bis 11,0. Der optimale Wachstums-pH ist ähnlich dem oben genannten.

• Verhalten gegenüber Sauerstoff	Aerophil.	Aerophil.
• O-F-Test	Kein Wachstum beobachtet.	Kein Wachstum beobachtet.
• Assimilation von Sacchariden	Assimiliert werden D-Galactose, D-Xylose, L-Arabinose, Lactose, Glycerin, Meribiose, Libose, D-Glucose, D-Mannose, Maltose, Saccharose, Trehalose, D-Mannit, Stärke, Raffinose und D-Fructose.
• Wachstum auf salzhaltigem Medium	Wachstum bei einer Salzkonzentration von 12 %, aber kein Wachstum bei einer Salzkonzentration von 15 %.

Den auf den oben genannten mikrobiologischen Eigenschaften beruhenden Untersuchungen zufolge und unter Bezugnahme auf "Bergey's Manual of Systematic Bacteriology" [Williams & Wilkins, United States of America (1986)] und "The Genus Bacillus" [Agricultural Research Service, Washington, D.C. (1973)] können diese Zellstämme als endosporenbildende Bacilli der Gattung Bacillus sp. klassifiziert werden.
Da sie im neutralen Bereich nicht zu wachsen vermögen, im hohen alkalischen Bereich jedoch gutes Wachstum aufweisen, gehören sie zu den alkaliphilen Mikroorganismen und können von den herkömmlichen Bakterien, die zu Bacillus gehören und Wachstum im neutralen Bereich aufweisen, unterschieden werden. Darüberhinaus wurden ihre mikrobiologischen und physiologischen Eigenschaften mit denen bekannter alkaliphiler Bacilli verglichen [Mikrobiol., 141, 1745 (1995)]. Demzufolge stimmen weder der Stamm KSM-K36 noch der Stamm KSM-K38 mit irgendeinem bekannten alkaliphilen Bacillus überein. Ein jeder der Stämme KSM-K36 und KSM-K38 wurde daher als ein neuartiger Stamm beurteilt und unter den Namen FERM BP-6945 und FERM BP-6946 am National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of Industrial Trade and Technology hinterlegt.
Die verflüssigende alkalische Amylase gemäß der vorliegenden Erfindung kann mittels Inokulation des oben genannten Mikroorganismus in einem Medium mit nachfolgender Inkubation in herkömmlicher Weise erhalten werden. Da der Mikroorganismus alkaliphil ist, ist ein alkalisches Medium vorzuziehen. Die verflüssigende alkalische Ziel-Amylase kann aus der so erhaltenen Kultur gewonnen werden. Der Überstand kann so, wie er ist, verwendet werden. Alternativ dazu kann die verflüssigende alkalische Amylase als gereinigtes Enzym verwendet werden, nachdem sie einem Aussalzen, Ausfällen oder einer Ultrafiltration unterzogen wurde, um so nach Bedarf das Rohenzym zu erhalten, das dann in herkömmlicher Weise gereinigt und kristallisiert wird.
Ein Beispiel des Reinigungsprozesses der verflüssigenden alkalischen Amylase der vorliegenden Erfindung wird nachstehend erläutert. Indem der Kulturüberstand einer (1) Ausfällung mit Ammoniumsulfat, (2) Säulenchromatographie mit DEAE-Toyopearl (TOSOH Corporation) oder (3) Gelfiltration unterworfen wird, ist es möglich, ein gereinigtes Enzym zu erhalten, das eine einzelne Bande sowohl in der Polyacrylamid-Gelelektrophorese (Gelkonzentration 10 %) als auch in der Natriumdodecylsulfat (SDS)-Elektrophorese aufweist.
Die verflüssigende alkalische Amylase gemäß der vorliegenden Erfindung kann auch dadurch hergestellt werden, indem ein die verflüssigende alkalische Amylase der vorliegenden Erfindung codierendes Gen sowie ein Vektorplasmid erhalten wird, welches dieses Gen enthält, dann ein geeigneter Mikroorganismus, vorzugsweise ein zu Bacillus sp. gehörendes Bakterium, unter Verwendung des Plasmids transformiert wird und der das transformierte Mikroorganismus oder Bakterium daraufhin inkubiert wird.
Beispiele dieses die verflüssigende alkalische Amylase der vorliegenden Erfindung codierenden Gens schliessen diejenigen mit einer Nukleotidsequenz, wie in dem Sequenzprotokollen Nr. 3 und 4 dargestellt, ein, welche anschliessend hierin beschrieben werden.
Wie oben beschrieben, hat die verflüssigende alkalische Amylase gemäß der vorliegenden Erfindung ihr pH-Optimum im alkalischen Bereich und weist eine hohe Resistenzleistung gegenüber Chelatbildnern auf, so dass sie als Enzym, das in ein Detergens eingeschlossen sein soll, besonders nützlich ist. Die verflüssigende alkalische Amylase der vorliegenden Erfindung weist – wie oben beschrieben – eine hohe Resistenz gegenüber einem Oxidationsmittel auf, so dass sie einem Detergens, das ein Oxidationsmittel, wie zum Beispiel ein Bleichmittel, enthält, zugesetzt werden kann. Die Menge an dem Enzym der Erfindung, die dem Detergens zugegeben wird, beträgt vorzugsweise 0,001 bis 5 Gewichts-%.
Zusätzlich zu der oben beschriebenen verflüssigenden alkalischen Amylase können bekannte Detergenskomponenten der Detergenszusammensetzung der vorliegenden Erfindung zugegeben werden. Beispiele von bekannten Detergenskomponenten schließen jene ein, die in WO 94/26881 auf Seite 5, rechte Spalte oben, Zeile 14 bis Zeile 29 auf derselben Seite, rechte Spalte unten, beschrieben sind, wie zum Beispiel grenzflächenaktive Mittel, Chelatbildner, alkalische Mittel, anorganische Salze, Bleichmittel und fluoreszierende Mittel.
Ein grenzflächenaktives Mittel wird einer Detergenszusammensetzung in einer Menge von 0,5 bis 60 Gewichts-% (was nachstehend einfach als "%" bezeichnet wird) zugesetzt, spezifischer ausgedrückt zu 10 bis 45 % einer Detergenszusammensetzung in Pulverform und zu 20 bis 50 % einer flüssigen Detergenszusammensetzung. Handelt es sich bei der Detergenszusammensetzung der vorliegenden Erfindung um ein bleichendes Waschmittel oder um ein Spülmittel für Geschirrspülmaschinen, so wird im Allgemeinen ein grenzflächenaktives Mittel in einer Menge von 1 bis 10 %, vorzugsweise von 1 bis 5 %, zugegeben, ein zweiwertiger Metall-Ionen-Fänger in einer Menge von 0,01 bis 50 %, vorzugsweise von 5–40 %, sowie ein alkalisches Mittel und ein anorganisches Salz in einer Gesamtmenge von 0,01 bis 80 %, vorzugsweise von 1 bis 40 %.
Ein die Wiederverschmutzung verhinderndes Mittel wird in einer Menge von 0,001 bis 10 %, vorzugsweise von 1 bis 5 %, zugesetzt.
Zusätzlich zu der Amylase der vorliegenden Erfinung können Protease, Cellulase, Protopektinase, Pektinase, Lipase, Hemicellulase, β-Glycosidase, Glucoseoxidase, Cholesterinoxidase und dergleichen eingesetzt werden. Diese Enzyme können in einer Menge von 0,001 bis 5 %, vorzugsweise von 0,1 bis 3 % zugegeben werden. Das Bleichmittel (z. B. Wasserstoffperoxid, Percarbonat oder dergleichen) wird vorzugsweise in einer Menge von 1 bis 10 % zugegeben. Bei Verwendung eines Bleichmittels kann ein Bleiche-Aktivator in einer Menge von 0,01 bis 10 % zugegeben werden. Beispiele von fluoreszierenden Mitteln schliessen fluoreszierende Mittel des Biphenyl-Typs (z. B. "Chinopearl CBS-X", Markenname) sowie des Stilbene-Typs (z. b. fluoreszierender Farbstoff vom DM-Typ) ein. Vorzugsweise wird das fluoreszierende Mittel in einer Menge von 0,001 bis 2 % zugegeben.
Die oben beschriebene Detergenszusammensetzung kann in flüssiger, Pulver-, Granulatform oder dergleichen bereitgestellt werden. Diese Detergenszusammensetzung kann als Wäschewaschmittel, Spülmittel für Geschirrspülmaschinen, Rohrreiniger, Reinigungsmittel für Zahnersatz oder Bleichmittel verwendet werden.
Beispiele
Die Enzymaktivität wurde gemäß der nachfolgend beschriebenen Methode unter Verwendung folgender Puffer gemessen:

pH 4,5 bis 6,0 Acetatpuffer

pH 6,0 bis 8,0 Kaliumphosphatpuffer

pH 9,0 bis 10,5 Glycin-Natriumhydroxid-Puffer

pH 10,0 bis 12,0 Carbonatpuffer

pH 4,0 bis 12,0 Britton-Robinson-Puffer
[Methode zum Messen der Amylaseaktivität]
1. Herstellungsverfahren eines Reagenzes
(Herstellung einer 1 %-igen wässrigen Lösung von löslicher Stärke)
5 g lösliche Stärke (aus Kartoffeln stammende Stärke, hergestellt von Sigma Chemical Co., Ltd.) wurden in 400 ml entionisiertem Wasser suspendiert. Die Suspension wurde durch etwa 10 Minuten langes Erhitzen, wobei sie in kochendem Wasser gerührt wurde, gelöst, und daraufhin durch Hinzufügen von entionisiertem Wasser auf ein Gesamtvolumen von 500 ml aufgefüllt.
(Herstellung eines 250 mM Glycin-Natriumhydroxid-Puffers (pH 10))
9,38 g Glycin (garantierte Klasse, hergestellt von Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) wurden in etwa 300 ml entionisiertem Wasser gelöst, und die so entstandene Lösung wurde daraufhin mittels einer etwa 5 N wässrigen Natriumhydroxid-Lösung unter Verwendung eines pH-Meters auf pH 10 eingestellt. Der pH-eingestellten Lösung wurde entionisiertes Wasser zugegeben, um ein Gesamtvolumen von 500 ml zu erhalten.
(Herstellung eines DNS-Reagenzes)
8 g Natriumhydroxid (garantierte Klasse, hergestellt von Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) wurden in 300 ml entionisiertem Wasser gelöst. Der so entstandenen Lösung wurden 2,5 g 3,5-Dinitrosalicylsäure (DNS, garantierte Klasse, hergestellt von Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) in Teilmengen zugegeben, während letztere sich in der ersteren löste. Nachdem die DNS sich vollständig gelöst hatte, wurden 150 g Natriumkaliumtartrat (garantierte Klasse, hergestellt von Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) zugegeben. Nach vollständiger Auflösung wurde der so entstandenen Lösung entionisiertes Wasser zugegeben, um ein Gesamtvolumen von 500 ml zu erhalten.
(Herstellung einer Glucose-Lösung für eine Kalibrierungskurve)
Unter Verwendung einer Glucose-Standardlösung (zur photoelektischen Verwendung, hergestellt von Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) und entionisiertem Wasser wurden Glucoselösungen von 0, 1, 2, 3, 4 beziehungsweise 5 μMol/0,1 ml hergestellt.
2. Methode zum Messen der Amylaseaktivität
(Verdünnung einer Enzymlösung)
Das gereinigte Enzym wurde mit einem 10 mM Glycin-Natriumhydroxid-Puffer (pH 10) verdünnt, um eine δ-Absorption [= (Absorption einer Probe) – (Absorption einer Leerprobe)] von nicht mehr als 0,6 zu erhalten.
(Messung einer Probe)
In einem Reagenzglas wurden 0,5 ml der 1 %-igen wässrigen Lösung der gelösten Stärke, 0,2 ml des 250 mM Glycin-Natriumhydroxid-Puffers (pH 10) und 0,2 ml entionisiertes Wasser (dieses Gemisch wird nachstehend als "Substrat-Lösung" bezeichnet) gefüllt und daraufhin in einem Wasserbad bei 50°C für etwa 5 Minuten vorläufig erhitzt. Nach dem vorläufigen Erhitzen wurden dem Reaktionsgemisch 0,1 ml einer exakt verdünnten Enzymlösung zugegeben und es konnte daraufhin bei 50°C für 15 Minuten reagieren. Nach Beenden der Reaktion wurde dem Reaktionsgemisch 1,0 ml des DNS-Reagenzes zugegeben, gefolgt von einer Farbentwicklung mittels Erhitzen in kochendem Wasser für 5 Minuten. Sofort danach wurde die Lösung in Eiswasser abgekühlt. Der so entstandenen Lösung wurden nach dem Abkühlen 4,0 ml entionisiertes Wasser zugegeben und daraufhin gemischt. Sodann wurde die Absorption der Lösung bei 535 nm gemessen.
(Messung der Leerprobe)
In einem Reagenzglas wurden 0,9 ml der Substratlösung gefüllt, und daraufhin 1,0 ml des DNS-Reagenzes zugegeben, gefolgt von der Zugabe von 0,1 ml einer Enzymlösung. Das so entstandene Gemisch wurde in kochendem Wasser 5 Minuten lang erhitzt, um eine Farbentwicklung zu bewirken. Sofort danach wurde das Reaktionsgemisch in Eiswasser abgekühlt. Nach dem Abkühlen wurden dem Reaktionsgemisch 4,0 ml entionisiertes Wasser zugegeben und daraufhin gemischt. Sodann wurde die Absorption der Lösung bei 535 nm gemessen.
(Herstellung der Kalibrierungskurve)
In einem Reagenzglas wurden 0,9 ml der Substratlösung gefüllt, und daraufhin 1,0 ml des DNS-Reagenzes sowie je 0,1 ml der Glucose-Lösungen zugegeben, um eine Kalibrierungskurve mit verschiedenen Konzentrationen zu erhalten. Das so entstandene Gemisch wurde in kochendem Wasser 5 Minuten lang erhitzt, um eine Farbentwicklung zu bewirken. Sofort danach wurde die Lösung in Eiswasser abgekühlt. Der so entstandenen Lösung wurden nach dem Abkühlen 4,0 ml entionisiertes Wasser zugegeben, und das Gemisch wurde daraufhin gut gemischt. Daraufhin wurde die Absorption der Lösung bei 535 nm gemessen. In einem Diagramm wurde die Glucose-Konzentration (μMol/0,1 ml) auf, der x-Achse (Abszisse) und die Absorption auf der y-Achse (Ordinate) aufgetragen und die Steigung dieser Liniendarstellung mit der Methode der kleinsten Quadrate bestimmt. Ein Umrechnungsfaktor (F) wurde gemäß folgender Formel errechnet: Umrechnungsfaktor (F) = [1/(Steigung)] × [1/15] × [1000/0,1]
Eine Kalibrierungskurve wurde im Übrigen immer erstellt, wenn eine Aktivität gemessen wurde.
(Berechnung der Aktivität)
Die Enzymmenge, die gebildet wird, wenn ein Zuckeräquivalent zu 1 μMol Glucose in einer Minute reduziert wird, wird als eine Einheit (1 E) definiert, und der Titer des Enzyms wurde gemäß folgender Formel errechnet: Amylaseaktivität (E/I) = [δ-Absorption] × [Umrechnungsfaktor (F)] × [Verdünnungsverhältnis]
[Testmethode der Resistenzleistung gegenüber Chelatbildnern]
(Herstellung der EDTA-Lösung)
Nachdem 9,3 g EDTA (hergestellt von Sigma Chemical Co., Ltd.) in etwa 80 ml entionisiertem Wasser gelöst worden waren, wurde die so entstandene Lösung mittels einer etwa 5 N wässrige Natriumhydroxid-Lösung unter Verwendung eines pH-Meters auf pH 8 eingestellt. Dieser pH-eingestellten Lösung wurde entionisiertes Wasser zugegeben, um ein Gesamtvolumen von 100 ml zu erhalten, wodurch eine 250 mM EDTA-Lösung hergestellt wurde. Die so entstandene Lösung wurde mit entionisiertem Wasser verdünnt, um 10 bis 100 mM EDTA-Lösungen zu erhalten.
Nachdem 9,5 g EGTA (hergestellt von Sigma Chemical Co., Ltd.) in etwa 80 ml entionisiertem Wasser gelöst worden waren, wurde die so entstandene Lösung mittels einer etwa 5 N wässriger Natriumhydroxid-Lösung unter Verwendung eines pH-Meters auf pH 8 eingestellt. Dieser pH-eingestellten Lösung wurde entionisiertes Wasser zugegeben, um ein Gesamtvolumen von 100 ml zu erhalten, wodurch eine 250 mM EGTA-Lösung hergestellt wurde. Die so entstandene Lösung wurde mit entionisiertem Wasser verdünnt, um 10 bis 100 mM EGTA-Lösungen zu erhalten.
(Testmethode der Resistenzleistung gegenüber Chelatbildnern)
Im Falle einer Behandlung mit 1 mM EDTA bei 45°C für 30 Minuten
In ein Reagenzglas wurden 0,1 ml der 10 mM EDTA-Lösung, 0,2 ml des 250 mM Glycin-Natriumhydroxid-Puffers (pH 10) und 0,1 ml entionisiertes Wasser eingefüllt, und daraufhin in einem Wasserbad bei 45°C etwa 5 Minuten lang vorläufig erhitzt. Nach dem vorläufigen Erhitzen wurden dem Reaktionsgemisch 0,1 ml einer mit einem 10 mM Glycin-Natriumhydroxid-Puffers (pH 10) exakt verdünnten Enzymlösung zugegeben. Das so entstandene Gemisch wurde bei 45°C 30 Minuten lang stehen gelassen. Nach 30 Minuten wurde eine 0,1 ml-Teilmenge dieser Lösung 0,9 ml der Substratlösung, die im Wasserbad bei 50°C vorläufig erhitzt worden war, zugegeben und die Rest-Enzymaktivität in Übereinstimmung mit der Methode zum Messen der Amylaseaktivität gemessen.
[Testmethode der Resistenzleistung gegenüber Oxidierungsmitteln]
In ein Reagenzglas wurden 0,067 ml Wasserstoffperoxid (eine 30%-ige wässrige Wasserstoffperoxid-Lösung, hergestellt von Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 0,2 ml des 250 mM Glycin-Natriumhydroxid-Puffers (pH 10) und 0,633 ml entionisiertes Wasser eingefüllt und daraufhin in einem Wasserbad bei 30°C etwa 5 Minutenlang vorläufig erhitzt. Nach dem vorläufigen Erhitzen wurden dem Reaktionsgemisch 0,1 ml einer mit einem 10 mM Glycin-Natriumhydroxid-Puffers (pH 10) exakt verdünnten Enzymlösung zugegeben. Das so entstandene Gemisch wurde bei 30°C 60 Minuten lang stehen gelassen. Nach 60 Minuten wurde eine 0,2 ml-Teilmenge dieser Lösung in ein Reagenzglas eingefüllt, das 1 μl Katalase (aus Schweineleber stammend, hergestellt von Boehringer Mannheim GmbH) enthielt und zuvor in Eiswasser gestellt worden war, womit das Wasserstoffperoxid desaktiviert und die Reaktion beendet wurde. Daraufhin wurde eine 0,1 ml-Teilmenge jener Lösung, bei der die Reaktion abgebrochen worden war, 0,9 ml der Substratlösung, die vorläufig im Wasserbad bei 50°C erhitzt worden war, zugegeben und die Rest-Enzymaktivität in Übereinstimmung mit der Methode zum Messen der Amylaseaktivität gemessen.
(Quantitative Proteinanalyse)
Quantitative Proteinanalyse wurde in Übereinstimmung mit der Standard-Assaymethode mittels Proteinassay-Kit II (Katalognummer 500-0002, hergestellt von Bio-rad Laborstories) durchgeführt, wobei Rinderserumalbumin als Proteinstandard dem Kit beigefügt war.
Beispiel 1: Screening von verflüssigenden alkalischen Amylasen mit Resistenzleistung gegenüber Chelatbildnern
Etwa 0,5 g Erde wurden in sterilisiertem Wasser suspendiert, und das Ganze wurde daraufhin bei 80°C 15 Minuten lang erhitzt. Der Überstand wurde nach der Hitzebehandlung richtig mit sterilisiertem Wasser verdünnt und dann auf Agar-Medium A zur Isolierung von Amylase produzierenden Mikroorganismen ausgestrichen. Mittels Inkubation bei 30°C für 2 Tage wurden Kolonien gebildet. Die Kolonie, die einen durchsichtigen Hof an ihrer Peripherie aufwies, der durch Stärkehydrolyse gebildet worden war, wurde ausgewählt und als Amylase produzierende Bakterien separiert.
Diese isolierten Bakterien wurden auf ein Medium B überimpft und daraufhin bei 30°C 2 Tage in aerober Schüttelkultur gehalten. Nach der Trennung der so entstandenen Kultur durch Zentrifugieren wurde die Resistenzleistung der Rohamylase in dem erhaltentenen Überstand gegenüber einem Chelatbildner (EDTA) gemessen. Zusätzlich wurde der optimale pH der Rohamylase gemessen, und damit wurden die die verflüssigende alkalische Amylase produzierenden Bakterien der vorliegenden Erfindung herausgesucht.

Gemäß der oben genannten Methode wurden der Stamm KSM-K36 und der Stamm KSM-K38, jeder zur Gattung Bacillus sp. gehörend, erhalten.

Medium A:	Trypton	1,5 %
	Soyton	0,5 %
	Natriumchlorid	0,5 %
	Gefärbte Stärke	0,5 %
	Agar	1,5 %
	Na₂CO₃	0,5 %
	(pH 10)
Medium B:	Trypton	1,5 %
	Soyton	0,5 %
	Natriumchlorid	0,5 %
	Lösliche Stärke	1,0 %
	Na₂CO₃	0,5 %
	(pH 10)

Beispiel 2: Kultur der Stämme KSM-K36 und KSM-K38
Jeder der beiden Stämme KSM-K36 und KSM-K38 wird, wie in Beispiel 1 beschrieben, in das Flüssigmedium B überimpft und daraufhin bei 30°C 2 Tage lang in aerober Schüttelkultur gehalten. Die Amylaseaktivität (pH 8,5) des durch zentrifugale Trennung gewonnenen Überstandes wurde gemessen. Als Ergebnis wurde herausgefunden, dass die Kulturlösung eine Aktivität von 1177 E beziehungsweise 557 E/I aufwies.
Beispiel 3: Reinigung der verflüssigenden alkalischen Amylase der vorliegenden Erfindung
Dem Kulturüberstand des Stammes Bacillus sp. KSM-K36 wurde Ammoniumsulfat zugesetzt, mit nachfolgendem Rühren, um eine 80 %ige Sättigung zu erhalten. Der so entstandene Niederschlag wurde gewonnen und in einem 10 mM Tris-Hydrochlorsäurepuffer (pH 7,5), der 2 mM CaCl₂ enthielt, gelöst; daraufhin wurde über Nacht eine Dialyse gegen den Puffer durchgeführt. Das Innendialysat wurde daraufhin auf eine DEAE-TOYOPEARL 650 M-Säule aufgetragen, welche mit demselben Puffer äquilibriert worden war, und dann das Protein entlang eines linearen Konzentrationsgradienten von NaCl (0 M bis 1 M) in demselben Puffer eluiert. Nach der Dialyse von aktiven Fraktionen gegen den oben beschriebenen Puffer wurde eine weitere Aufreinigung mittels Gelfiltrations-Säulenchromatographie durchgeführt. Die so erhaltenen aktiven Fraktionen wurden gegen denselben Puffer dialysiert, wodurch ein gereinigtes Enzym erhalten werden konnte, das sowohl in der Polyacrylamid-Gelelektrophorese (Gelkonzentration: 10 %) als auch in der Natrium-Dodecylsulfat (SDS)-Polyacrylamid-Gelelektrophorese eine einzelne Bande aufwies. Ein weiteres gereinigtes Protein wurde unter Anwendung einer ähnlichen Methode aus der Überstandskultur des Stammes Bacillus sp. KSM-K38 erhalten.
Beispiel 4: Resistenzleistung der verflüssigenden alkalischen Amylase der vorliegenen Erfindung gegenüber Chelatbildnern
Unter Verwendung von zwei gereinigten verflüssigenden alkalischen Amylasen der vorliegenden Erfindung (welche nachstehend als "K36" beziehungsweise "K38" abgekürzt werden), die aus den Stämmen KSM-K36 beziehungsweise KSM-K38 in Beispiel 3 gewonnen wurden, wird die Resistenzleistung gegenüber verschiedenen Chelatbildnern gemessen.
1) Resistenzleistung gegenüber EDTA oder EGTA
Einem 50 mM Glycin-Natriumhydroxid-Puffer (pH 10), der EDTA oder EGTA in einer Endkonzentration von 0 bis 100 mM enthielt (beide hergestellt von Sigma Co., Ltd.), wurde ein gereinigtes und mit einem 10 mM Glycin-Natriumhydroxid-Puffers (pH 10) richtig gelöstes Enzym zugegeben, woraufhin eine Behandlung bei einer vorher festgelegten Temperatur (30°C, 40°C oder 45°C) über 30 Minuten erfolgte. Die Restenzymaktivität des Reaktionsgemisches wurde in Übereinstimmung mit der Methode zum Messen der Amylaseaktivität [mit einem 50 mM Glycin-Natriumhydroxid-Puffer (pH 10)] gemessen. Als Kontrolle wurden gereinigte Produkte von Termamyl und Duramyl (beide aufgereinigt aus Produkten von Novo Industry A/S in Granulatform), welche aus Bacillus licheniformis stammende Amylasen darstellen, verwendet.
Wie in den 1 und 2 dargestellt, wurde bestätigt, dass sowohl K36 als auch K38 verglichen mit Termamyl und Duramyl eine hohe Resistenzleistung aufwiesen, die nicht von hoch konzentriertem EDTA oder EGTA beeinflusst wurde.
2) Resistenzleistung gegenüber Zitronensäure oder Zeolith
Einem 50 mM Glycin-Natriumhydroxid-Puffer (pH 10), der Trinatriumcitrat-Dihydrat (garantierte Klasse, hergestellt von Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) beziehungsweise synthetisches Zeolith A-3 (hergestellt von Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) in einer Endkonzentrationen von 0 bis 0,5 % enthielt, wurde ein gereinigtes und mit einem 10 mM Glycin-Natriumhydroxid-Puffers (pH 10) richtig gelöstes Enzym zugegeben, woraufhin eine Behandlung jeweils bei vorher festgelegten Temperaturen (40°C und 45°C) über 30 Minuten erfolgte. Die Restenzymaktivität des Reaktionsgemisches wurde in Übereinstimmung mit der Methode zum Messen der Amylaseaktivität [mit einem 50 mM Glycin-Natriumhydroxid-Puffer (pH 10)] gemessen.
Es wurde demzufolge bestätigt, dass sowohl K36 als auch K38 weder von Zitronensäure noch von Zeolith beeinflusst wurden (wie in den 3 bis 6 dargestellt).
Beispiel 5: Wirkungs-pH und optimaler Wirkungs-pH der verflüssigenden alkalischen Amylase der vorliegenden Erfindung
Wirkungs-pH und optimaler Wirkungs-pH sowohl von K36 als auch K38 wurden gemäß der Methode zum Messen der Amylaseaktivität unter Verwendung verschiedener Puffer mit einer Endkonzentration von 50 mM [Acetatpuffer (pH 4,5 bis 6,0), Kaliumphosphatpuffer (pH 6,0 bis 8,0), Glycin-Natriumhydroxid-Puffer (pH 9,0 bis 10,5) und Carbonatpuffer (pH 10,0 bis 12,0)] gemessen und als relative Aktivität angegeben, wobei die maximale Aktivität 100 % beträgt.
Demzufolge konnte bestätigt werden (wie in den 7 und 8 dargestellt), dass sowohl K36 als auch K38 innerhalb eines pH-Bereichs von 6,0 bis 10,0 wirken und der optimale Wirkungs-pH 8,0 bis 9,0 beträgt. Der angezeigte pH war im Übrigen der tatsächlich gemessene Wert des Reaktionsgemisches.
Beispiel 6: Resistenzleistung gegenüber Oxidationsmitteln und relative Enzymaktivität von verflüssigenden alkalischen Amylasen der vorliegenden Erfindung
Einem 50 mM Glycin-Natriumhydroxid-Puffer (pH 10), der H₂O₂ in einer Endkonzentration von 2 % (580 mM) enthielt, wurde ein mit einem 10 mM Glycin-Natriumhydroxid-Puffer (pH 10) verdünntes Enzym (K36, K38, Termamyl oder Duramyl) zugegeben und daraufhin bei 30°C 60 Minuten lang behandelt. Die Restaktivität wurde in entsprechenden Abständen gemäß der Methode zum Messen der Amylaseaktiviät gemessen [mit einem 50 mM Glycin-Natriumhydroxid-Puffer (pH 10)]. Die Resistenzleistung gegenüber einem Oxidationsmittel wurde durch die Restaktivität aufgezeigt, wobei die Aktivität vor der Behandlung 100 % betrug.
Demzufolge konnte gezeigt werden (9), dass sowohl K36 als auch K38 eine Restaktivität von nicht weniger als 70 % beibehielten, vorzugsweise nicht weniger als 94%, sogar nach einer Behandlung bei pH 10 und 30°C über 60 Minuten und in Gegenwart von 2 % H₂O₂, und somit genügend Resistenzleistung gegenüber Oxidationsmitteln aufwiesen.
Die spezifischen Aktivitäten von K36 und K38, die sich aus dem Enzymaktivitätswert, wenn die Reaktion bei pH 10 und 50°C für 15 Minuten stattfindet (mit einer löslichen Stärke als Substrat), und der mittels Proteinassay-Kit (Produkt von Bio-rad Laborstories) gemessenen Proteinkonzentration errechnen, waren 4300 E/mg beziehungsweise 3600 E/mg (Tabelle 2). Es zeigte sich, dass jedes Enzym eine spezifische Aktivität von nicht weniger als 3000 E/mg aufweist, eine ausgesprochen hohe spezifische Aktivität, verglichen mit Enzymen, die gegenüber Oxidationsmitteln resistent sind (LAMM·M202T ( WO98/44126 ) und Duamyl) und mittels Proteintechnologie-Verfahren hergestellt wurden. Entsprechend sind die verflüssigenden alkalischen Amylasen der vorliegenden Erfindung bezüglich der Menge, die einem Detergens, einer industriellen Fermentationsproduktion oder dergleichen zugegeben werden muss, vorteilhaft. Tabelle 2: Vergleich der spezifischen Aktivität

Enzym Spezifische Aktivität (U/mg)

K36 4300

K38 3600

LAMY* 4000

LAMM·M202T** 1700

Duramyl 500

* LAMY: Aus dem Stamm Bacillus sp. KSM-K1378 gewonnen.
** LAMY·M202T: das oben genannte Enzym mit Met202Thr substituiert.
Enzymaktivität: Aktivität wenn die Reaktion bei 50°C für 15 Minuten unter Verwendung eines Glycin-Natriumhydroxid-Puffer (pH 10) (mit einer löslichen Stärke als Substrat) stattfindet.
Proteinmenge: Gemessen mit Proteinassay-Kit (hergestellt von Bio-rad Laborstories)

Beispiel 7: Andere enzymatische Eigenschaften der verflüssigenden alkalischen Amylasen (K36 und K38) der vorliegenden Erfindung
Eine Analyse diese beiden gereinigten Enzyme ergab folgende Eigenschaften:
(1) Aktivität:
Jede der beiden Amylasen hydrolysiert α-1,4-glucosidische Bindungen in Stärken, Amylose, Amylopektin und partiellen Abbauprodukten davon und bildet aus Amylose Glucose (G1), Maltose (G2), Maltotriose (G3), Maltotetraose (G4), Maltopentaose (G5), Maltohexane (G6) und Maltoheptaose (G7). Sie wirken nicht auf Pullulan.
(2) pH-Stabilität (Britton-Robinson-Puffer):
Jede der beiden Amylasen zeigt eine Restaktivität von nicht weniger als 70 %, wenn sie bei 40°C für 30 Minuten innerhalb eines pH-Bereichs von 6,5 bis 11,0 behandelt wird.
(3) Wirkungstemperaturbereich und optimale Wirkungstemperatur:
Jede der beiden Amylasen wirkt in einem breiten Temperaturbereich von 20°C bis 80°C, mit einer optimalen Wirkungstemperatur von 50°C bis 60°C.
(4) Temperaturstabilität:
Nach einer Behandlung in einem 50 mM Glycin-Natriumhydroxid-Puffer (pH 10) bei verschiedenen Temperaturen für 30 Minuten, um so die Bedingungen der Enzymdesaktivierung zu untersuchen, zeigt jede der beiden Amylasen eine Restaktivität von nicht weniger als 80 % bei 40°C und eine Restaktivität von sogar etwa 60 % bei 45°C.
(5) Molekulargewicht:
Jede der beiden Amylasen hat ein Molekulargewicht von 55.000 ± 5.000 gemäß einer Messung mittels Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese.
(6) Isoelektrischer Punkt:
Jede der beiden Amylasen hat einen isoelektrischen Punkt von etwa pH 4,2, gemäß einer Messung mittels isoelektrisch fokussierender Elektrophorese.
(7) Auswirkung von grenzflächenaktiven Mitteln:
Jede der beiden Amylasen ist im Wesentlichen frei von Aktivitätshemmung (Grad der verbleibenden Aktivität nicht weniger als 90 %), wenn sie bei pH 10 und 30°C für 30 Minuten in einer 0,1 %igen Lösung aus grenzflächenaktiven Mittel, wie zum Beispiel linearen Natriumalkylbenzolsulfonaten, Natriumalkylsulfatestern, Natrium-Polyoxyethylen-Alkylsulfatestern, Natrium-α-olefinsulfonaten, Natrium-α-sulfoniertefettsäureester, Natriumalkylsulfonaten, DSD, Seifen oder Softanol behandelt worden war.
(8) Auswirkung von Metallsalzen:
Jede der beiden Amylasen wurde bei pH 10 und 30°C für 30 Minuten in Gegenwart von verschiedenen Metallsalzen behandelt, wobei deren Auswirkungen untersucht wurden. K36 wird demzufolge von 1 mM Mn²⁺ gehemmt (Hemmungsgrad: etwa 95 %) und von 1 mM Hg² ⁺, Be²⁺ oder Cd²⁺ schwach gehemmt (Hemmungsgrad: etwa 30 bis 40 %). K38 wird von 1 mM Mn²⁺ gehemmt (Hemmungsgrad: etwa 75 %) und von 1 mM Sr²⁺ oder Cd²⁺ schwach gehemmt (Hemmungsgrad: etwa 30 %).
(9) N-terminale Aminosäuresequenz
Die N-terminale Aminosäuresequenz einer jeden der beiden vorliegenden Amylasen wurde durch Edman-Abbau [Edman, P., Acta Chem. Scand., 4, 283 (1948)] mit Hilfe eines Protein-Sequenziergerätes (Modell 477A, hergestellt von ABI Corp.) ermittelt. Es wurde demzufoge festgestellt, dass sie die Sequenz Asp-Gly-Leu-Asn-Gly-Thr-Met-Met-Gln-Tyr-Tyr-Glu-Trp-His-Leu aufweisen.
Beispiel 8: Bewertung der Waschkraft eines Geschirrspülmittels für Geschirrspülmaschinen, das jede der vorliegenden verflüssigenden alkalischen Amylasen enthält
Die Waschkraft eines Geschirrspülmittels für Geschirrspülmaschinen, das jede der vorliegenden verflüssigenden alkalischen Amylasen (K36 und K38) enthält, wurde unter den nachstehend beschriebenen Bedingungen bewertet. Als Kontrolle wurde ein Geschirrspülmittel, das frei von den Enzymen der Erfindung war, verwendet.
(1) Herstellung von beschmutztem Geschirr
Auf eine Porzellanschale wurde 1 ml Hafermehl ('Oatmeal' – Quaker Corp.), welches in kochendem Leitungswasser gekocht worden waren, aufgetragen, und dann wurde Leitungswasser zugegeben, um es darin zu lösen. Nachdem die Schale bei Raumtemperatur 3 Stunden lang getrocknet worden war, wurde sie bei 5°C (semihermetisch abgeschlossene Bedingungen) bis zur weiteren Verwendung aufbewahrt. Drei Schalen wurden auf diese Weise hergestellt, um einmal gewaschen zu werden.
(2) Waschbedingungen

• Verwendete Geschirrspülmaschine: Vollautomatische Geschirrspülmaschine "NP-810", Markenname; hergestellt von Matsushita Electric Industries C., Ltd.
• Waschtemperatur: Wassertemperatur wird allmählich bis auf etwa 55°C erhöht
• Verwendetes Wasser zum Waschen: Leitungswasser
• Konzentration des Geschirrspülmittels: 0,2 Gewichts-%
• Waschzeit: etwa 20 Minuten waschen etwa 20 Minuten klarspülen (Standardprogramm)
• Wassermenge im Umlauf während des Waschvorgangs: 3,5 I

(3) Zusammensetzung des Spülmittels (% bedeutet Gewichts-%)
2,2 % "Pullulonic L-61", 24,7 % Natriumcarbonat, 24,7 % Natriumbicarbonat, 10,0 % Natriumpercarbonat, 12 % Nr. 1 Natriumsilikat, 20,0 % Trinatriumcitrat, 2,2 % "Propylenglycol 3000", 0,2 % Silikon "KST-04" (Markenname; hergestellt von Toshiba Silicone Co., Ltd.) und 4,0 % Sokaran "CP-45" (Markenname; hergestellt von BASF AG).
(4) Hinzuzufügende Enzymmenge
Der Aktivitätswert einer jeden der beiden gereinigten, unter Beispiel 3 erhaltenen Enzyme wurde mittels der oben beschriebenen Methode zum Messen der Amylaseaktivität unter Verwendung eines Glycin-Natriumhydroxid-Puffer (pH 10) als Puffer gemessen. Von diesem Ergebnis ausgehend, wurde die Amylase dem Detergens in einer Menge von 150 E zugegeben.
(5) Methode zur Bewertungs der Waschkraft
Eine Jodlösung wurde nach dem Waschvorgang auf die Schale aufgetragen und die Farbe auf Grund der Jod-Stärke-Reaktion makroskopisch beurteilt.
Das Spülmittel, das jedes der beiden vorliegenden Enzyme enthielt, entfernte den Flecken demnach vollständig und wies somit, verglichen mit einem Spülmittel, das frei von den vorliegendne Enzymen war, eine ausgezeichnete Waschkraft auf.
Beispiel 9:
Die mittels der Saito-Miura-Methode [Biochim. Biophys. Acta, 72 619 (1961)] extrahierte DNA des Chromosoms eines jeden der beiden Stämme KSM-K36 und KSM-K38 wurde als Matrize verwendet. Eine PCR wurde in herkömmlicher Weise unter Verwendung von zwei Oligonucleotid-Primern durchgeführt, welche, auf den Sequenzen Met-Gln-Tyr-Phe-Glu-Trp und Trp-Phe-Lys-Pro-Leu-Tyr basierend, entworfen worden waren. Diese Sequenzen waren in den bekannten verflüssigenden alkalischen Amylasen, welche von zu Bacillus sp. gehörenden Bakterien abstammten, hoch konserviert gewesen. In beiden Fällen wurde ein amplifiziertes DNA-Fragment von etwa 1,0 kb erhalten. Im Anschluss an die Analyse der Nucleotidsequenz des DNA-Fragments wurden die Nucleotidsequenzen des DNA-Fragments an der Stromaufwärts-Seite und an der Stromabwärts-Seite, welche mittels der Umkehr-PCR-Methode [T. Triglia, et al., Nucleic Acids Res., 16, 81 (1988)] und einem in vitro-PCR-Clonierungskit (hergestellt von Boehringer Mannheim GmbH) erhalten worden war, analysiert. In einer Genregion von etwa 1,7 kb in jedem der beiden Stämme wurde dementsprechend nur ein einziges offenes Leseraster (ORF) gefunden, das 501 Aminosäurereste codiert, wie im Sequenzprotokoll Nr. 1 und 2 dargestellt. Es konnte aufgeklärt werden, dass die Sequenz (Aminosäure Nr. Asp 1 bis Leu 15) in der aminoterminalen Region vollständig mit der aminoterminalen Sequenz (15 Aminosäurereste) der Amylasen K36 und K38, die aus der Kulturlösung der Stämme KSM-K36 und KSM-K38 aufgereinigt worden waren, übereinstimmt. Es wurde gefunden, dass die so bestimmten Gene der Amylasen K36 und K38 Nucleotidsequenzen aufweisen, wie sie im Sequenzprotokoll Nr. 3 beziehungsweise Nr. 4 gezeigt sind.
Beispiel 10
Mittels der PCR-Methode und unter Verwendung der chormosomalen DNA eines jeden der beiden Stämme als Matrize wurde ein DNA-Fragment von 1,7 kb, von 0,7 kb stromaufwärts des Initiationscodons bis 0,1 kb stromabwärts des Terminationscodons amplifiziert und im Anschluss daran in den Stamm Bacillus subtilis ISW 1214 unter Verwendung des Pendelvektors pHY300PLK (Markenname; hergestellt von Yakult Honsha Co., Ltd.) eingeführt. Der so erhaltene rekombinante Stamm von Bacillus subtilis wurde einer Flüssigkultur unterzogen, wobei in die Kulturlösung eine Amylase gebildet wurde. Auf Grund einer Analyse der Eigenschaften der aus dem entstandenen Kulturüberstand gereinigten Amylase mittels der in Beispiel 3 dargestellten Methode konnte gezeigt werden, dass sie eine gute Übereinstimmung mit jenen Amylasen aufwies, die aus der Kulturlösung eines jeden der Stämme KSM-K36 und KSM-K38 gereinigt wurden. Genau gesagt fällt der optimale Wirkungs-pH innerhalb eines Bereichs von 8 bis 9 beträgt, die spezifische Aktivität bei pH 10 etwa 4000 E/mg und ist die Resistenz sowohl gegenüber einem Chelatbildner als auch einem Oxidationsmittel hoch.
Verglichen mit den herkömmlich bekannten Amylasen für Detergenzien weisen die verflüssigenden alkalischen Amylasen der vorliegenden Erfindung eine hohe Resistenzleistung gegenüber Chelatbildnern auf. Ihr pH-Optimum liegt über 8. Die verflüssigenden alkalischen Amylasen gemäß der vorliegenden Erfindung können demnach in einem ausgesprochen weiten Bereich industrieller Anwendungen verwendet werden, wie zum Beispiel in dem Schritt zur Verarbeitung einer Stärke im alkalischen Bereich. Im Besonderen sind sie dort von Vorteil, wo sie in einem Spülmittel für Geschirrspülmaschinen, Wäschewaschpulver, Bleichmittel oder dergleichen, enthalten sind; sie besitzen somit eine große technische Bedeutung. Sequenzprotokoll

Claims

Verflüssigende alkalische Amylase, welche eine Restaktivität von nicht weniger als 70 % besitzt, wenn sie bei pH 10 und 45°C für 30 Minuten in Anwesenheit von 1 bis 100 mM EDTA oder EGTA behandelt wird, welche eine Aminosäuresequenz besitzt, die mindestens 80 % Homologie mit der in Sequenz ID NO. 1 oder NO. 2 gezeigten Sequenz aufweist.
Verflüssigende alkalische Amylase nach Anspruch 1, welche weiterhin die folgenden enzymatischen Eigenschaften besitzt: 1) pH-Optimum: sie besitzt ein pH-Optimum jeriseits von 8,0, wenn sie bei 50°C für 15 Minuten lösliche Stärke als Substrat hat; 2) Aktivität: sie hydrolysiert α-1,4-glucosidische Bindungen in Stärken, Amylose, Amylopektin und partiellen Abbauprodukten davon und bildet aus Amylose Glucose (G1), Maltose (G2), Maltotriose (G3), Maltotetraose (G4), Maltopentaose (G5), Maltohexaose (G6) und Maltoheptaose (G7); sie wirkt nicht auf Pullulan; 3) pH-Stabilität: sie zeigt eine Restaktivität von nicht weniger als 70 % innerhalb eines pH-Bereichs von 6,5 bis 11,0, wenn sie bei 40°C für 30 Minuten in Britton-Robinson-Puffer behandelt wird; 4) Wirkungstemperaturbereich und optimale Wirkungstemperatur: sie wirkt in einem breiten Temperaturbereich von 20 bis 80°C, mit einer optimalen Wirkungstemperatur von 50 bis 60°C; 5) Temperaturstabilität: sie zeigt eine Restaktivität von nicht weniger als 80 % bei 40°C, wenn sie für 30 Minuten in einem 50 mM Glycin-Natriumhydroxid-Puffer bei pH 10 behandelt wird, und zeigt eine Restaktivität von etwa 60 % bei 45°C.
Verflüssigende alkalische Amylase nach Anspruch 1 oder 2, welche zusätzlich die folgenden enzymatischen Eigenschaften besitzt: 6) Resistenz gegenüber einem Oxidationsmittel: sie zeigt eine Restaktivität von nicht weniger als 70 %, wenn sie bei pH 10 und 30°C für 60 Minuten in Anwesenheit von 2 % H₂O, behandelt wird.
DNA-Molekül, welches eine verflüssigende alkalische Amylase, wie in einem der Ansprüche 1 bis 3 beansprucht, codiert.
DNA-Molekül nach Anspruch 4, welches die Nucleotidsequenz von SEQ ID NO: 3 oder 4 besitzt, oder ein Fragment davon.
Verfahren zur Herstellung eines Proteins, wie in einem der Ansprüche 1 bis 3 beansprucht, umfassend die Züchtung von Bakterien, welche zu Bacillus sp. gehören, die Gewinnung des Proteins aus dem Überstand und, gegebenenfalls, die Aufreinigung des Proteins.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei die Bakterien die Bacillusstämme KSM-K36 (FERN BP 6945) oder KSM-K38 (FERN BP 6946) sind.
Detergenszusammensetzung, umfassend eine verflüssigende alkalische Amylase, wie in einem der Ansprüche 1 bis 3 beansprucht.