DE69432610T2

DE69432610T2 - Oxidationsstabile Alpha-Amylase

Info

Publication number: DE69432610T2
Application number: DE69432610T
Authority: DE
Inventors: Leif Clinton Solheim; Scott D. Power; Carol A. Requadt; Colin Mitchinson
Original assignee: Genencor International Inc
Current assignee: Danisco US Inc
Priority date: 1993-02-11
Filing date: 1994-02-10
Publication date: 2004-04-01
Anticipated expiration: 2014-02-11
Also published as: CZ205795A3; NO953147D0; FI953797A0; US6297037B1; DK0867504T3; NZ262623A; DK0867504T4; CA2155831A1; ATE175235T1; DE69415659D1; WO1994018314A1; ATE239075T1; EP0867504B2; DK0689589T4; AU6239294A; EP0867504A1; US5849549A; FI953797A; CN1118172A; FI119694B

Description

Diese Anmeldung ist eine Teilanmeldung aus der europäischen Patentanmeldung Nr. 94 909 609.3, die am 10. Februar 1994 angemeldet wurde.
Die vorliegende Erfindung betrifft neue alpha-Amylasemutanten mit einer Aminosäuresequenz, die in der Natur nicht gefunden wird, wobei diese Mutanten eine Aminosäuresequenz aufweisen, in welcher ein oder mehrere Aminosäurerest(e) einer Vorläufer-alpha-Amylase, insbesondere eine oxidierbare Aminosäure, durch eine andere Aminosäure substituiert wurden. Die mutierten Enzyme der vorliegenden Erfindung zeigen veränderte Stabilitäts-/Aktivitätsprofile, einschließlich einer veränderten oxidativen Stabilität, einem veränderten pH-Leistungsprofil, einer veränderten spezifischen Aktivität und/oder einer veränderten Thermostabilität, aber nicht auf diese beschränkt. In einer besonderen Ausführungsform stellt die Erfindung Bacillus-alpha-Amylasen mit einer Substitution einer Aminosäure an einer Position, die M + 15 bei der alpha-Amylase von Bacillus licheniformis entspricht, bereit und stellt Anwendungen dieser alpha-Amylasen bereit.
Alpha-Amylasen (alpha-l,4-Glucan-4-glucanohydrolase, EC 3.2.1.1) hydrolysieren vorwiegend zufällig innere alpha-1,4-glycosidische Bindungen in Stärke, um Maltodextrine mit kleinerem Molekulargewicht zu erzeugen. Alpha-Amylasen weisen einen beträchtlichen kommerziellen Wert auf, indem sie in den Anfangsstadien (Verflüssigung) der Stärkeverarbeitung; bei der Alkoholherstellung; als Reinigungsmittel in Detergensmatrices; und in der Textilindustrie zum Entschlichten von Stärke verwendet werden. Alpha-Amylasen werden durch eine breite Vielzahl von Mikroorganismen einschließlich Bacillus und Aspergillus hergestellt, wobei die meisten kommerziellen Amylasen aus bakteriellen Quellen wie z. B. B. licheniformis, B. amyloliquefaciens, B. subtilis oder B. strearothermophilus hergestellt werden. In den vergangenen Jahren waren die bevorzugten Enzyme bei der kommerziellen Anwendung, aufgrund von deren Wärmestabilität und Leistungsfähigkeit, zumindest bei neutralen und leicht alkalischen pH's, jene aus B. licheniformis.
Früher gab es Untersuchungen, welche rekombinante DNA-Techniken verwendet haben, um zu erforschen, welche Reste für die katalytische Aktivität von Amylasen wichtig sind, und/oder um die Auswirkung zu erforschen, wenn gewisse Aminosäuren innerhalb des aktiven Zentrums von verschiedenen Amylasen modifiziert wurden (Vihinen, M. et al. (1990) J. Bichem. 107: 267–272; Holm, L. et al. (1990) Protein Engineering 3: 181–191; Takase, K. et al. (1992) Biochemica et Biophysica Acta. 1120: 281–288; Matsui, I. et al. (1992) Febs Letters Bd. 310, Nr. 3, Seiten 216–218); welche Reste für die thermische Stabilität wichtig sind (Suzuki, Y. et al. (1989) J. Biol. Chem. 264: 18933–18938); und eine Gruppe hat derartige Verfahren verwendet, um Mutationen an verschiedenen Histidinresten in einer B. licheniformis-Amylase einzuführen, wobei der Grund zur Erzeugung von Substitutionen an den Histidinresten darin lag, dass die Amylase von B. licheniformis (welche als thermostabil bekannt ist) im Vergleich zu anderen ähnlichen Bacillus-Amylasen einen Überschuss an Histidinen aufweist, und daher wurde vorgeschlagen, dass ein Ersetzen eines Histidins die Thermostabilität des Enzyms beeinflussen könnte (Declerck, N. et al. (1990) J. Biol. Chem. 265: 15481–15488; FR 2 665 178 A1; Joyet, P. et al. (1992) Bio Technology 10: 1579–1583).
Es wurde gefunden, dass alpha-Amylase durch Wasserstoffperoxid und andere Oxidationsmittel bei pH's zwischen 4 und 10,5 inaktiviert wird, wie in den Beispielen hierin beschrieben wird. Kommerziell können alpha-Amylaseenzyme unter dramatisch anderen Bedingungen wie beispielsweise Bedingungen mit sowohl hohem als auch niedrigem pH verwendet werden, was von der kommerziellen Anwendung abhängt. Beispielsweise können alpha-Amylasen bei der Verflüssigung von Stärke verwendet werden, was ein Verfahren ist, das vorzugsweise bei einem niedrigen pH (pH < 5,5) durchgeführt wird. Andererseits können Amylasen in kommerziellen Geschirrspül-oder Waschmitteldetergentien verwendet werden, welche oft Oxidationsmittel wie z. B. Bleichmittel oder Persäuren enthalten und welche unter sehr viel stärker alkalischen Bedingungen verwendet werden.
Um die Stabilität oder das Aktivitätsprofil von Amylaseenzymen unter variierenden Bedingungen zu verändern, wurde gefunden, dass ein selektiver Austausch, eine Substitution oder Deletion von oxidierbaren Aminosäuren wie z. B. Methionin, Tryptophan, Tyrosin, Histidin oder Cystein zu einem veränderten Profil der Enzymvariante im Vergleich zu ihrem Vorläufer führt. Da die derzeitig kommerziell verfügbaren Amylasen unter verschiedenen Bedingungen nicht akzeptabel (stabil) sind, besteht ein Bedarf für eine Amylase mit einem veränderten Stabilitäts- und/oder Aktivitätsprofil.
Diese veränderte Stabilität (oxidatives, thermisches oder pH-Leistungsprofil) kann erreicht werden, während eine adäquate enzymatische Aktivität im Vergleich zu dem Wildtyp- oder Vorläuferenzym beibehalten wird. Das charakteristische Merkmal, das durch die Einführung solcher Mutationen beeinflusst wird, kann eine Änderung bei der oxidativen Stabilität sein, während die thermische Stabilität beibehalten wird oder umgekehrt. Demgemäss kann die Substitution von unterschiedlichen Aminosäuren für eine oxidierbare Aminosäure(n) in der alpha-Amylase-Vorläufersequenz oder die Deletion von einer oder mehreren oxidierbaren Aminosäure(n) zu einer veränderten enzymatischen Aktivität bei einem pH, der von dem verschieden ist, welcher für die Vorläufer-alpha-Amylase als optimal angesehen wird, führen. Anders ausgedrückt können die mutierten Enzyme der vorliegenden Erfindung ebenfalls veränderte pH-Leistungsprofile aufweisen, welche auf der erhöhten oxidativen Stabilität des Enzyms beruhen können.
Die vorliegende Erfindung betrifft neue alpha-Amylasemutanten, die das Expressionsprodukt einer mutierten DNA-Sequenz sind, welche eine alpha-Amylase codiert, wobei die mutierte DNA-Sequenz von einer Vorläufer-alpha-Amylase durch die Substitution (Ersatz) einer oder mehrerer oxidierbarer Aminosäuren abgeleitet ist.
Derartige mutierte alpha-Amylasen werden im Allgemeinen durch in vitro-Modifikation einer Vorläufer-DNA-Sequenz, welche eine natürlich vorkommende oder rekombinante alpha-Amylase codiert, um die Substitution eines oder mehrerer Aminosäurereste in einer Vorläufer-Aminosäuresequenz zu codieren, erhalten.
Im Allgemeinen beruht die Substitution oder Deletion von einer oder mehreren Aminosäuren in der Aminosäuresequenz auf dem Ersatz oder der Deletion von einem oder mehreren Methionin- und/oder Tryptophanresten in einer solchen Sequenz. Diese oxidierbaren Aminosäurereste können durch irgendeine der anderen 20 natürlich vorkommenden Aminosäuren ersetzt werden. Wenn die gewünschte Wirkung ist, die Stabilität des Vorläufers zu verändern, kann der Aminosäurerest mit einer nicht oxidierbaren Aminosäure (wie beispielsweise Alanin, Arginin, Asparagin, Asparaginsäure, Glutaminsäure, Glutamin, Glycin, Isoleucin, Leucin, Lysin, Phenylalanin, Prolin, Serin, Threonin oder Valin) oder einer anderen oxidierbaren Aminosäure (wie z. B. Cystein, Methionin, Tryptophan, Tyrosin oder Histidin, welche in der Reihenfolge von am leichtesten oxidierbar bis weniger leicht oxidierbar aufgelistet sind) substituiert werden. Wenn in ähnlicher Weise die gewünschte Wirkung ist, die Thermostabilität zu verändern, kann irgendeine der anderen 20 natürlich vorkommenden Aminosäuren substituiert werden (d. h. Methionin kann durch Cystein substituiert werden).
Gemäß einem Aspekt der Erfindung wird eine mutierte alpha-Amylase bereitgestellt, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus:

(a) einer alpha-Amylase, welche das Expressionsprodukt einer mutierten DNA-Sequenz ist, welche eine alpha-Amylase codiert, wobei die mutierte DNA-Sequenz von einem Vorläufer der alpha-Amylase von Bacillus licheniformis durch Substitution einer Aminosäure an der Position M + 15 abgeleitet ist, und
(b) einer alpha-Amylase, welche das Expressionsprodukt einer mutierten DNA-Sequenz ist, welche eine alpha-Amylase codiert, wobei die mutierte DNA-Sequenz von einem Vorläufer der alpha-Amylase, welche eine alpha-Amylase von Bacillus ist, durch Substitution einer Aminosäure, die in entweder der primären oder tertiären Struktur M + 15 in der alpha-Amylase von Bacillus licheniformis entspricht, abgeleitet ist, wobei die alpha-Amylase ein verändertes pH- und/oder Temperaturleistungsprofil zeigt, wenn sie mit dem Wildtyp der Bacillus-alpha-Amylase verglichen wird.

Die bevorzugten substituierten Aminosäuren an der Position +15 sind Leucin (L), Threonin (T), Asparagin (N), Aspartat (D), Serin (S), Valin (V) und Isoleucin (I), auch wenn andere substituierte Aminosäuren, die oben nicht angegeben sind, ausgewählt werden können. Eine besonders bevorzugte Mutante der vorliegenden Erfindung ist M15L.
Eine Mutation (Substitution) an einem Tryptophanrest kann in Kombination mit Mutationen an anderen oxidierbaren Aminosäureresten durchgeführt werden. Insbesondere kann es vorteilhaft sein, durch Substitution von wenigstens einem Tryptophan in Kombination mit wenigstens einem Methionin zu modifizieren.
Die alpha-Amylasemutanten der vorliegenden Erfindung zeigen im Allgemeinen eine veränderte oxidative Stabilität in Gegenwart von Wasserstoffperoxid und anderen Oxidationsmitteln wie beispielsweise Bleichmittel oder Persäuren und insbesondere milderen Oxidationsmitteln wie beispielsweise Chloramin-T. Mutierte Enzyme mit erhöhter oxidativer Stabilität werden nützlich sein, um die Lagerfähigkeit und die Kompatibilität der Amylasen mit Bleichmittel, Perborat, Percarbonat oder Persäure, die in Reinigungsprodukten verwendet werden, zu verbessern. In ähnlicher Weise kann eine verringerte oxidative Stabilität bei industriellen Prozessen nützlich sein, welche ei ne schnelle und effiziente Auslöschung der enzymatischen Aktivität erfordern. Die mutierten Enzyme der vorliegenden Erfindung können ebenfalls ein verbreitertes pH-Leistungsprofil zeigen, wodurch Mutanten wie beispielsweise M15L eine Stabilität bei einem niedrigen pH zur Verflüssigung von Stärke zeigen. Die Mutanten der vorliegenden Erfindung können ebenfalls eine veränderte thermische Stabilität aufweisen, wodurch die Mutante entweder bei hohen oder bei niedrigen Temperaturen eine erhöhte Stabilität aufweisen kann. Es versteht sich, dass eine beliebige Änderung (Zunahme oder Abnahme) der enzymatischen charakteristischen Eigenschaften) der Mutante im Vergleich zu ihrem Vorläufer in Abhängigkeit von der gewünschten Endanwendung der alpha-Amylasemutante nützlich sein kann.
Zusätzlich zu Stärkeverarbeitungs- und Reinigungsanwendungen können Amylasevarianten der vorliegenden Erfindung bei beliebigen Anwendungen verwendet werden, bei welchen bekannte Amylasen verwendet werden; beispielsweise können Amylasevarianten in der Textilverarbeitung, der Nahrungsmittelverarbeitung usw. verwendet werden. Insbesondere wird erwartet, dass eine Enzymvariante, die durch Oxidation inaktiviert wurde, in einem Verfahren nützlich wäre, wo gewünscht wird, die Amylaseaktivität am Ende des Verfahrens vollständig zu entfernen, beispielsweise bei Anwendungen in der Verarbeitung von Tiefkühlkost.
Die alpha-Amylasemutanten der vorliegenden Erfindung sind von einem Bacillus-Stamm wie beispielsweise B. licheniformis, B. amyloliquefaciens und B. stearothermophilus, am meisten bevorzugt von Bacillus licheniformis, abgeleitet.
Es gibt eine neue Form der alpha-Amylase, die normalerweise von B. licheniformis erzeugt wird. Diese neue Form, welche als die A4-Form bezeichnet wird, weist zusätzliche vier Alaninreste am N-Terminus der sekretierten Amylase auf (4b). Derivate oder Mutanten der A4-Form der alpha-Amylase sind von der vorliegenden Erfindung umfasst. Unter Derivaten oder Mutanten der A4-Form wird verstanden, dass die vorliegende Erfindung die A4-Form von alpha-Amylase umfasst, welche eine oder mehrere zusätzliche Mutationen wie beispielsweise eine Mutation (Substitution, Ersatz oder Deletion) von einer oder mehreren oxidierbaren Aminosäuren enthält.
In einer Zusammensetzung, welche eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist, werden flüssige, gelförmige oder granuläre Detergenszusammensetrungen, welche die hierin beschriebenen alpha-Amylasemutanten umfassen, bereitgestellt.
Zusätzlich ist beabsichtigt, dass die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung eine alpha-Amylasemutante mit mehr als einer ortsspezifischen Mutation umfassen können.
In noch einer weiteren Zusammensetzung, die Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist, werden Zusammensetzungen bereitgestellt, die bei der Verarbeitung von Stärke und insbesondere der Verflüssigung von Stärke nützlich sind. Die Zusammensetzungen zur Verflüssigung von Stärke der vorliegenden Erfindung umfassen eine alpha-Amylasemutante der vorliegenden Erfindung. Zusätzlich ist beabsichtigt, dass solche Zusammensetzungen zusätzliche Komponenten, wie sie den Fachleuten bekannt sind, einschließlich z. B. Antioxidantien, Calcium, Ionen usw. umfassen können.
In einem Verfahren, welches einen Aspekt der vorliegenden Erfindung darstellt, werden Verfahren zum Verflüssigen von Stärke und insbesondere von granulären Stärkeaufschlämmmungen, entweder aus einem Nass- oder Trockenmahlverfahren, bereitgestellt. Im Allgemeinen wird in dem ersten Schritt des Stärkeabbauverfahrens die Stärkeaufschlämmung durch ein Erwärmen bei einer relativ hohen Temperatur (bis zu ca. 110°C) gelatiniert. Nachdem die Stärkeaufschlämmung gelatiniert ist, wird sie unter Verwendung einer alpha-Amylase verflüssigt und dextriniert. Die Bedingungen für eine solche Verflüssigung werden in den US-Patentanmeldungen 07/785,624 und 07/785,623 und dem US-Patent 5,180,699 beschrieben. Das vorliegende Verfahren zur Verflüssigung von Stärke umfasst das Zugeben zu einer Stärkeaufschlämmung einer wirksamen Menge einer alpha-Amylase der vorliegenden Erfindung, allein oder in Kombination mit zusätrlichen Hilfsstoffen wie beispielsweise einem Antioxidationsmittel, und das Umsetzen der Aufschlämmung für eine geeignete Zeit und bei einer geeignete Temperatur, um die Stärke zu verflüssigen.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung umfasst die DNA, welche die alpha-Amylasemutanten der vorliegenden Erfindung codiert (einschließlich der A4-Form und Mutanten von dieser) und Expressionsvektoren, welche die DNA codieren, wie auch Wirtszellen, welche mit solchen Expressionsvektoren transformiert sind.
Die Erfindung wird nun mittels eines Beispiels in Bezug auf die begleitenden Zeichnungen beschrieben:
1 zeigt die DNA-Sequenz des Gens für alpha-Amylase aus B. licheniformis (IN-CIB8061), Seq. ID Nr. 31, und ein abgeleitetes Translationsprodukt wie es in Gray, G. et al. (1986) J. Bacter. 166: 635–643 beschrieben wird.
2 zeigt die Aminosäuresequenz des reifen alpha-Amylaseenzyms aus B. licheniformis (NCIB8061), Seq. ID Nr. 32.
3 zeigt eine Ausrichtung der primären Strukturen von Bacillus-alpha-Amylasen. Die B. licheniformis-Amylase (Am-Lich), Seq. ID Nr. 33, wird von Gray, G. et al. (1986) J. Bact. 166: 635–643 beschrieben; die B. amyloliquefaciens-Amylase (Am-Amylo), Seq. ID Nr. 34, wird von Takkinen, K. et al. (1983) J. Biol. Chem. 285: 1007–1013 beschrieben; und die B. stearothermophilus (Am-Stearo), Seq. ID Nr. 35, wird von Ihara, H. et al. (1985) J. Biochem. 98: 95–103 beschrieben.
4 zeigt die Aminosäuresequenz der reifen alpha-Amylasevariante M197T Seq. ID Nr. 36.
4b zeigt die Aminosäuresequenz der A4 Form der alpha-Amylase aus B. licheniformis NCIB8061, Seq. ID Nr. 37. Die Nummerierung beginnt am N-Terminus, ausgehend von den vier zusätrlichen Alaninen.
5 zeigt das Plasmid pA4BL, worin sich BLAA auf das alpha-Amylasegen von B. licheniformis, PstI bis SstI, bezieht; Amp^R sich auf das Ampicillinresistenzgen aus pBR322 bezieht; und sich CAT auf das Chloramphenicolresistenzgen aus pC194 bezieht.
6 zeigt die Verbindungen Signalsequenz-reifes Protein für B. licheniformis (Seq. ID Nr. 38), B. subtilis (Seq. ID Nr. 39), B. licheniformis in pA4BL (Seq. ID Nr. 40) und B. licheniformis in pBLapr (Seq. ID Nr. 41).
7 zeigt die Inaktivierung von gewissen Alpha-Amylasen (Spezyme^® AA20, M15L) mit 0,88 M H₂O₂ bei pH 5,0, 25°C.
8 zeigt ein Schema für die Produktion von M15X-Kassettenmutanten.
9 zeigt die Expression von M15X-Varianten.
10 zeigt die spezifische Aktivität von M15X-Varianten im Hinblick auf lösliche Stärke.
11 zeigt die Wärmestabilität von M15X-Varianten bei 90°C, pH 5,0, 5 mM CaCl₂, 5 Minuten.
12 zeigt eine spezifische Aktivität im Hinblick auf Stärke und ein lösliches Substrat und die Leistungsfähigkeit bei einer Jetverflüssigung bei pH 5,5 von M15-Varianten als eine Funktion der prozentualen Aktivität des B. licheniformis-Wildtyps.
13 zeigt die Inaktivierung von B. licheniformis-alpha-Amylase (AA20 bei 0,65 mg/ml) mit Chloramin-T bei pH 8,0 im Vergleich zu den Varianten M197A (1,7 mg/ml) und M197L (1,7 mg/ml).
14 zeigt die Inaktivierung von B. licheniformis-alpha-Amylase (AA20 bei 0,22 mg/ml) mit Chloramin-T bei pH 4,0 im Vergleich zu den Varianten M197A (4,3 mg/ml) und M197L.
15 zeigt die Reaktion von B. licheniformis-alpha-Amylase (AA20 bei 0,75 mg/ml) mit Chloramin-T bei pH 5,0 im Vergleich zu den Doppelvarianten M197T/W138F (0,64 mg/ml) und M197T/W138Y (0,60 mg/ml).
Es wird angenommen, dass Amylasen, die bei der Verflüssigung von Stärke verwendet werden, einer gewissen Form von Inaktivierung unterliegen können, welche auf einer gewissen Aktivität beruht, die in der Stärkeaufschlämmung vorliegt (siehe US-Anmeldungen 07/785,624 und 07/785,623 und das US-Patent 5,180,669, das am 19. Januar 1993 herausgegeben wurde. Weiterhin kann die Verwendung einer Amylase in Gegenwart von Oxidationsmitteln wie beispielsweise in Bleichmittel oder Persäure enthaltenden Detergentien zu einer teilweisen oder vollständigen Inaktivierung der Amylase führen. Daher ist die vorliegende Erfindung darauf gerichtet, die oxidative Empfindlichkeit der Amylasen zu verändern. Die Enzymmutanten der vorliegenden Erfindung können ebenfalls ein verändertes pH-Profil und/oder eine veränderte thermische Stabilität aufweisen, welche auf der erhöhten oxidativen Stabilität des Enzyms bei niedrigen oder hohen pH-Werten beruhen kann.
Alpha-Amylase, wie hierin verwendet, umfasst natürlich vorkommende Amylasen wie auch rekombinante Amylasen. Bevorzugte Amylasen in der vorliegenden Erfindung sind alpha-Amylasen, die aus B. licheniformis oder B. stearothermophilius stammen, einschließlich der A4-Form der alpha-Amylase, die aus B. licheniformis stammt, wie sie hierin beschrieben wird.
Rekombinante alpha-Amylasen bezieht sich auf eine alpha-Amylase, in welcher die DNA-Sequenz, welche die natürlich vorkommende alpha-Amylase codiert, modifiziert ist, um eine mutierte DNA-Sequenz zu erzeugen, welche die Substitution, Insertion oder Deletion von einer oder mehreren Aminosäuren in der alpha-Amylasesequenz codiert. Geeignete Modifikationsverfahren werden hierin und ebenfalls in den US-Patenten 4,760,025 und 5,185,258 offenbart.
Homologien wurden zwischen fast allen Endoamylasen, die bis heute sequenziert wurden, gefunden, wobei diese von Pflanzen bis zu Säugetieren und Bakterien reichen (Nakajima, R. T. et al. (1986) Appl. Microbiol. Biotechnol. 23: 355–360; Rogers, J. C. (1985) Biochem. Biophys. Res. Commun. 128: 470–476). Es gibt vier Bereiche mit besonders hoher Homologie bei gewissen Bacillus-Amylasen, wie in 3 gezeigt ist, wobei die unterstrichenen Abschnitte die Bereiche mit hoher Homologie bezeichnen. Weiterhin wurden Sequenzausrichtungen verwendet, um die Beziehung zwischen Bacillus-Endoamylasen zu kartieren (Feng, D. F. and Doolittle, R. F. (1987) J. Molec. Evol. 35: 351–360). Die relative Sequenzhomologie zwischen B. stearothermophilus- und B. licheniformis-Amylase beträgt ca. 66%, wie nach Holm, L. et al. (1990) Protein Engineering 3 (3) Seiten 181–191 bestimmt wurde. Die Sequenzhomologie zwischen B. licheniformis- und B. amyloliquefaciens Amylasen beträgt ca. 81 %, nach Holm, L. et al., supra. Während die Sequenzhomologie wichtig ist, ist allgemein anerkannt, dass die strukturelle Homologie ebenfalls wichtig ist, wenn Amylasen oder andere Enzyme verglichen werden. Beispielsweise wurde eine strukturelle Homologie zwischen Pilzamylasen und bakterieller (Bacillus) Amylase vorgeschlagen, und daher sind die Pilzamylasen von der vorliegenden Erfindung umfasst.
Eine alpha-Amylasemutante weist eine Aminosäuresequenz auf, welche von der Aminosäuresequenz einer Vorläufer-alpha-Amylase abgeleitet ist. Die Vorläufer-alpha-Amylasen umfassen natürlich vorkommende alpha-Amylasen und rekombinante alpha-Amylasen (wie definiert). Die Aminosäuresequenz der alpha-Amylasemutante leitet sich von der Aminosäuresequenz der Vorläufer-alpha-Amylase durch die Substitution, Deletion oder Insertion von einer oder mehreren Aminosäuren der Vorläufer-Aminosäuresequenz ab. Eine solche Modifikation bezieht sich auf die Vorläufer-DNA-Sequenz, welche die Aminosäuresequenz der Vorläufer-alpha-Amylase codiert, und nicht auf die Manipulation des Vorläufer-alpha-Amylaseenzyms per se. Geeignete Verfahren für eine solche Manipulation der Vorläufer-DNA-Sequenz umfassen Verfahren, die hierin und in den US-Patenten 4,760,025 und 5,185,258 offenbart sind.
Spezifische Reste, welche den Position M15 und W138 der Bacillus licheniformis-alpha-Amylase entsprechen, wie auch alle Methionin-, Histidin-, Tryptophan-, Cystein- und Tyrosin-Positionen werden hierin zur Substitution oder Deletion identifiziert. Die Nummer der Aminosäureposition (d. h. +197) bezieht sich auf die Nummer, die der reifen Bacillus licheniformis-alpha-Amylasesequenz zugeordnet ist, die in 2 angegeben ist. Die Erfindung ist jedoch nicht auf die Mutation dieser bestimmten reifen alpha-Amylase (B. licheniformis) beschränkt sondern erstreckt sich auf Vorläufer-alpha-Amylasen, die Aminosäurereste an Positionen enthalten, welche dem bestimmten identifizierten Rest in der B. licheniformis-alpha-Amylase entsprechen. Ein Rest (Aminosäure) einer Vorläufer-alpha-Amylase entspricht einem Rest der B. licheniformis-alpha-Amylase, wenn er entweder homolog (d. h. in der Position in entweder der primären oder tertiären Struktur entsprechend) oder analog zu einem bestimmten Rest oder Anteil dieses Restes in der B. licheniformis-alpha-Amylase ist (d. h. die selbe oder eine ähnliche funktionale Kapazität aufweist, chemisch oder strukturell kombiniert zu werden, zu reagieren oder zu Wechselwirken).
Um eine Homologie bei der Primärstruktur festzustellen, wird die Aminosäuresequenz einer Vorläufer-alpha-Amylase direkt mit der Primärsequenz der B. licheniformis- alpha-Amylase und insbesondere mit einem Satz an Resten verglichen, von denen bekannt ist, dass diese bei allen alpha-Amylasen, deren Sequenz bekannt ist, unveränderlich sind, wie man in 3 sieht. Es ist ebenfalls möglich, äquivalente Reste in der Tertiärstruktur zu bestimmen: Kristallstrukturen wurden für die pankreatische alpha-Amylase von Schweinen (Buisson, G. et al. (1987) EMBO J. 6: 3909–3916); Taka-Amylase A aus Aspergillus oryzae (Matsuura, Y. et al. (1984) J. Biochem. (Tokyo) 95: 697–702); und eine saure alpha-Amylase aus A. niger (Boel, E. et al. (1990) Biochemistry 29: 6244–6249) berichtet, wobei die zwei ersten Strukturen ähnlich sind. Es gibt keine veröffentlichten Strukturen für Bacillus-alpha-Amylasen, auch wenn vorhergesagt wurde, dass diese gemeinsame Supersekundärstrukturen mit den Glucanasen aufweisen (MacGregor, E. A. & Svensson, B. (1989) Biochem. J. 259: 145-152), und eine Struktur für das B. stearothermophilus-Enzym wurde auf die der Taka-Amylase A modelliert (Holm, L. et al. (1990) Protein Engineering 3: 181–191). Die vier in hohem Maße konservierten Bereiche, die in 3 gezeigt sind, enthalten viele Reste, von denen angenommen wird, dass diese ein Teil des aktiven Zentrums sind (Matsuura, Y. et al. (1984) J. Biochem. (Tokyo) 95: 697–702; Buisson, G. et al. (1987) EMBO J. 6: 3909–3916; Vihinen, M. et al. (1990) J. Biochem. 107: 267–272) einschließlich, in der licheniformis-Nummerierung, His105; Arg229; Asp231; His235; Glu261 und Asp328.
Expressionsvektor, wie hierin verwendet, bezieht sich auf ein DNA-Konstrukt, das eine DNA-Sequenz enthält, die funktionsfähig mit einer geeigneten Kontrollsequenz verknüpft ist, welche in der Lage ist, die Expression der DNA in einem geeigneten Wirt zu bewirken. Solche Kontrollsequenzen können einen promotor, um eine Transkription zu bewirken, eine optionale Operatorsequenz, um eine solche Transkription zu steuern, eine Sequenz, welche geeignete mRNA-Ribosomenbindungsstellen codiert, und Sequenzen, welche die Termination der Transkription und Translation steuern, umfassen. Ein bevorzugter Promotor ist der B. subtilis aprE-Promotor. Der Vektor kann ein Plasmid, ein Phagenteilchen oder einfach ein potentielles genomisches Insert sein. Wenn er in einen geeigneten Wirt transformiert ist, kann der Vektor sich replizieren und unabhängig von dem Genom des Wirtes funktionieren, oder kann sich in einigen Fällen in das Genom selbst integrieren. In der vorliegenden Beschreibung werden Plasmid und Vektor manchmal austauschbar verwendet, da derzeit das Plasmid die am häufigsten verwendete Form eines Vektors ist. Jedoch soll die Erfindung solche anderen Formen von Expressionsvektoren, welche äquivalente Funktionen ausüben und welche im Stand der Technik bekannt sind oder bekannt werden, einschließen.
Wirtsstämme (oder Zellen), die in der vorliegenden Erfindung nützlich sind, sind im Allgemeinen prokaryotische oder eukaryotische Wirte und umfassen jeglichen transformierbaren Mikroorganismus, in welchem die Expression der alpha-Amylase erreicht werden kann. Insbesondere sind Wirtsstämme der selben Spezies oder Gattung, aus welcher die alpha-Amylase stammt, wie beispielsweise ein Bacillus Stamm geeignet. Vorzugsweise wird ein alpha-Amylase-negativer Bacillus-Stamm (Gene deletiert) und/oder ein alpha-Amylase und Protease-deletierter Bacillus Stamm wie beispielsweise der Bacillus subtilis-Stamm BG 2473 (ΔamyE, Δapr, Δnpr) verwendet. Wirtszellen werden mit Vektoren transformiert oder transfiziert, die unter Verwendung rekombinanter DNA-Techniken konstruiert wurden. Solche transformierten Wirtszellen sind in der Lage entweder Vektoren, welche die alpha-Amylase und deren Varianten (Mutanten) codieren, zu replizieren oder die gewünschte alpha-Amylase zu exprimieren.
Vorzugsweise werden die Mutanten der vorliegenden Erfindung während der Fermentation in das Kulturmedium sezerniert. Jede geeignete Signalsequenz, wie beispielsweise das aprE-Signalpeptid, kann verwendet werden, um die Sezernierung zu erreichen.
Viele der alpha-Amylasemutanten der vorliegenden Erfindung sind nützlich, um verschiedene Detergenszusammensetrungen, insbesondere gewisse Geschirrspülerreinigungszusammensetrungen, insbesondere jene Reinigungszusammensetrungen, die bekannte Oxidationsmittel enthalten, zu formulieren. Alpha-Amylasemutanten der Erfindung können in bekannte pulverförmige, flüssige oder gelförmige Detergentien mit einem pH zwischen 6,5 bis 12,0 formuliert werden. Eine geeignete granuläre Zusammensetzung kann erzeugt werden wie in den zusammen gehörenden US-Patentanmeldungen 07/429,881, 07/533,721 und 07/957,973 beschrieben wird. Diese Detergensreinigungszusammensetzungen können ebenfalls andere Enzyme wie beispielsweise bekannte Proteasen, Lipasen, Cellulasen, Endoglycosidasen oder andere Amylasen wie auch Aufbaustoffe, Stabilisatoren und andere Träger enthalten, die den Fachleuten bekannt sind. Diese Enzyme können als Cogranalien oder als Mischungen oder in irgendeiner anderen Weise, die den Fachleuten bekannt ist, vorliegen. Weiterhin ist von der vorliegenden Erfindung umfasst, dass Mehrfachmutanten bei Reinigungs- und anderen Anwendungen nützlich sein können. Beispielsweise kann eine Enzymmutante mit Änderungen an sowohl +15 als auch +197 eine erhöhte Leistung zeigen, die in einem Reinigungsprodukt nützlich ist.
Wie vorher beschrieben, können die alpha-Amylasemutanten der vorliegenden Efindung ebenfalls bei der Verflüssigung von Stärke nützlich sein. Die Verflüssigung von Stärke, insbesondere die Verflüssigung von granulärer Stärke in einer Aufschlämmung, wird typischerweise bei nahezu neutralen pH's und hohen Temperaturen durchgeführt. Wie in den US-Anmeldungen 07/788,624 und 07/785,623 und dem US-Patent 5,180,669 beschrieben wird, scheint es, dass ein Oxidationsmittel oder ein Inaktivierungsmittel einer gewissen Art ebenfalls bei typischen Verflüssigungsverfahren vorliegt, welches die Enzymaktivität beeinflussen kann; somit wird in diesen verwandten Patentanmeldungen ein Antioxidationsmittel zu dem Verfahren zugegeben, um das Enzym zu schützen.
Basierend auf den Bedingungen eines bevorzugten Verfahrens zur Verflüssigung, wie es in den US-Anmeldungen 07/788,624 und 07/785,623 und dem US-Patent 5,180,669 beschrieben wird, nämlich den Bedingungen eines niedrigen pH, einer hohen Temperatur und einer möglichen Oxidation, umfassen bevorzugte Mutanten der vorliegenden Erfindung zur Verwendung in Verflüssigungsverfahren Mutanten, die veränderte pH-Leistungsprofile (d. h. ein niedriges pH-Profil, pH < 6 und vorzugsweise pH < 5,5) und/oder eine veränderte thermische Stabilität (d. h. hohe Temperatur, ca. 90°C bis 110°C) und/oder eine veränderte oxidative Stabilität (d. h. eine erhöhte oxidative Stabilität) zeigen.
Somit wird durch die vorliegende Erfindung ein verbessertes Verfahren zum Verflüssigen von Stärke gelehrt, wobei das Verfahren das Verflüssigen einer granulären Stärkeaufschlämmung aus entweder einem Nass- oder Trockenmahlverfahren bei einem pH von ca. 4–6 durch das Zugeben einer wirksamen Menge einer alpha-Amylasemutante der vorliegenden Erfindung zu der Stärkeaufschlämmung; gegebenenfalls das Zugeben einer wirksamen Menge eines Antioxidationsmittels oder eines anderen Hilfsmittels zu der Aufschlämmung; und das Umsetzen der Aufschlämmung für eine geeignete Zeit und bei einer geeigneten Temperatur, um die Stärke zu verflüssigen, umfasst.
Das Folgende wird als ein Beispiel angegeben, und dieses soll nicht als eine Beschränkung des Umfanges der Ansprüche ausgelegt werden. Die hierin verwendeten Abkürzungen, insbesondere die Drei-Buchstaben- oder Ein-Buchstaben-Bezeichnungen für Aminosäuren, werden in Dale, J. W., Molecular Genetics of Bacteria, John Wiley & Sons. (1989) Appendix B beschrieben.
Experimentelles
Beispiel 1
Substitutionen der Methioninreste in der B. licheniformis-alpha-Amylase
Das alpha-Amylasegen (1) wurde aus B. licheniformis NCIB8061, welcher von der National Collection of Industrial Bacteria, Aberdeen, Schottland erhalten wurde, kloniert (Gray, G. et al. (1986) J. Bacteriology 166: 635–643). Das 1,72 kb-PstI-SstI-Fragment, welches die letzten drei Reste der Signalsequenz, das gesamte reife Protein und den Terminatorbereich codierte, wurde in M13MP18 subkloniert. Ein synthetischer Terminator wurde zwischen den BcII- und SstI-Stellen zugefügt, wobei eine synthetische Oligonukleotidkassette der folgenden Form verwendet wurde:
welche so geplant war, dass diese den Subtilisin-Transkriptionsterminator von B. amylollquefaciens enthielt (Wells et al. (1983) Nucleic Acid Research 11: 7911–7925).
Die gezielte Mutagenese durch Oligonukleotide verwendete im Wesentlichen die Vorschrift von Zoller, M. et al. (1983) Meth. Enzymol. 100: 468–500: Kurz gesagt wurden 5'-phosphorylierte Oligonukleotidprimer verwendet, um die gewünschten Mutationen auf der M13-Einzelstrang-DNA-Matrize einzuführen, indem die Oligonukleotide, die in Tabelle I aufgelistet sind, verwendet wurden, um jedes der sieben Methionine, welche in der B. licheniformis-alpha-Amylase gefunden werden, zu substituieren. Jedes mutagene Oligonukleotid führte ebenfalls eine Restriktionsendonukleasestelle ein, welche zum Screenen auf die verknüpfte Mutation verwendet werden konnte.
TABELLE I Mutagene Oligonukleotide zur Substitution der Methioninreste in der B. licheniformis-alpha-Amylase
Die fettgedruckten Buchstaben zeigen Veränderungen der Basen an, welche durch das Oligonukleotid eingeführt wurden.
Die Veränderungen von Codons, die in der Form M8A angegeben sind, waren Methionin (M) an Position +8, das zu Alanin (A) geändert wurde.
Die Unterstreichung zeigt die Restriktionsendonukleasestelle an, die durch das Oligonukleotid eingeführt wurde.
Der Heteroduplex wurde verwendet, um E. coli mutL-Zellen zu transfizieren (Kramen et al. (1984) Cell 38: 879), und nach einer Plaquereinigung wurden die Klone durch Restriktionsanalyse der RF1's analysiert. Positive Ergebnisse wurden durch Dideoxysequenzierung bestätigt (Sangen et al. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74: 5463-5467), und die PstI-SstI-Fragmente von jedem wurden in einen E. coli Vektor, das Plasmid pA4BL, subkloniert.
Plasmid pA4BL
Nach den Verfahren, die in der US-Anmeldung 860,468 (Power et al.) beschrieben werden, wurde eine stille PstI-Stelle an dem Codon +1 (der ersten Aminosäure, welche der Signalspaltungsstelle folgt) des aprE-Gens aus pS168-1 (Stahl, M. L. und Ferrari, E. (1984) J. Bacter. 158: 411–418) eingeführt. Der aprE-Promotor und der Signalpeptidbereich wurden dann aus einem pJH101-Plasmid (Ferrari, F. A. et al. (1983) J. Bacter. 154: 1513–1515) als ein HindIII-PstI-Fragment kloniert und in das von pUC18 abgeleitete Plasmid JM102 (Ferrari, E. und Hoch, J. A. (1989) Bacillus, Herausgeber C. R. Harwood, Plenum Pub., Seiten 57–72) subkloniert. Die Anfügung des PstI-SstI-Fragmentes aus der B. licheniformis-alpha-Amylase ergab pA4BL (5), welches die resultierende aprE-Signalpeptid-Amylaseverbindung, wie sie in 6 gezeigt ist, aufwies.
Transformation in B. subtilis
pA4BL ist ein Plasmid, das in der Lage ist, sich in E. coli zu replizieren und sich in das Chromosom von B. subtilis zu integrieren. Plasmide, die unterschiedliche Varianten enthielten, wurden in B. subtilis transformiert (Anagnostopoulos, C. und Spizizen, J. (1961) J. Bacter. 81: 741–746) und in das Chromosom an dem aprE-Locus durch einen Mechanismus vom Campbell-Typ integriert (Young, M. (1984) J. Gen. Microbiol. 130: 1613–1621). Der Bacillus subtilis Stamm BG2473 war ein Derivat von I168, aus welchem die Amylase (ΔamyE) und zwei Proteasen (Δapr, Δnpr deletiert worden waren (Stahl, M. L. und Ferrari, E., J. Bacter. 158: 411–418 und US-Patent 5,264,366, worauf hierin vollinhaltlich Bezug genommen wird). Nach der Transformation wurde die sacU32(Hy) (Nenner, D. J. et al. (1988) J. Bacter. 170: 296–300) Mutation durch PBS-1-vermittelte Transduktion eingeführt (Hoch, J. A. (1983) 154: 1513–1515).
Eine N-terminale Analyse der Amylase, welche von pA4BL in B. subtilis exprimiert wurde, zeigte, dass diese prozessiert worden war, wobei sie vier zusätzliche Alanine an dem N-Terminus des sezernierten Amylaseproteins aufwies ("A4-Form"). Diese zusätzlichen Reste wiesen keine wesentliche, nachteilige Wirkung auf die Aktivität oder die thermische Stabilität der A4-Form auf und können bei einigen Anwendungen die Leistungsfähigkeit erhöhen. In nachfolgenden Experimenten wurden die korrekt prozessierten Formen der licheniformis-Amylase und der Variante M197T durch eine sehr ähnliche Konstruktion erzeugt (siehe 6). Insbesondere wurde das 5'-Ende der A4-Konstruktion auf einem EcoRI-SstII-Fragment aus pA4BL (5) in M13BM20 (Boehringer Mannheim) subkloniert, um eine Matrize des codierenden Stranges für das nachstehende mutagene Oligonukleotid zu erhalten:
Dieser Primer eliminierte die Codons für die zusätzlichen vier N-terminalen Alanine, wobei im Hinblick auf korrekte Formen durch die Abwesenheit der PstI-Stelle gescreent wurde. Das Subklonieren des EcoRI-SstII-Fragmentes zurück in den pA4BL-Vektor (5) ergab das Plasmid pBLapr. Die M197T-Substitution konnte dann auf einem SstII-SstI-Fragment aus pA4BL (M197T) in den komplementären pBLapr-Vektor bewegt werden, um das Plasmid pBLapr (M197T) zu ergeben. Eine N-terminale Analyse der Amylase, die von pBLapr in B. subtilis exprimiert wurde, zeigte, dass diese mit dem selben N-Terminus prozessiert wurde, der in der B. licheniformis-alpha-Amylase gefunden wird.
Beispiel 2
Oxidative Empfindlichkeit der Methioninvarianten
Die alpha-Amylase von B. licheniformis, wie beispielsweise Spezyme^®AA20 (kommerziell erhältlich von der Genencor International, Inc.), wird schnell in Gegenwart von Wasserstoffperoxid inaktiviert (7). Verschiedene Methioninvarianten wurden in Schüttelkolbenkulturen von B. subtilis exprimiert, und die rohen Überstände wurden durch Ammoniumsulfatfällungen gereinigt. Die Amylase wurde aus einem 20%igen gesättigten Ammoniumsulfatüberstand ausgefällt, indem das Ammoniumsulfat auf 70 % Sättigung erhöht wurde, und wurde dann resuspendiert. Die Varianten wurden bei pH 5,0 bei 25°C an 0,88 M Wasserstoffperoxid ausgesetzt. Varianten an 6 der Methioninpositionen der B. licheniformis-alpha-Amylase waren immer noch für eine Oxidation durch Peroxid zugänglich, während die Substitution an der Position +197 (M197L) eine Beständigkeit gegenüber einer Peroxidoxidation zeigte (siehe 7). Jedoch zeigte eine anschließende Analyse, die nachstehend detaillierter beschrieben wird, dass eine Variante, während sie für eine Oxidation bei pH 5,0, 25°C, anfällig sein kann, unter anderen Bedingungen (d. h. bei der Verflüssigung) veränderte verbesserte Eigenschaften zeigen kann.
Beispiel 3
Konstruktion aller möglichen Varianten an der Position 197
Alle M197-Varianten (M197X) wurden in der A4-Form durch Kassettenmutagenese erzeugt wie in 8 dargestellt ist:

1. Eine gezielte Mutagenese (über eine Primerverlängerung in M13) wurde angewendet, um M197A zu erzeugen, wobei das nachstehende mutagene Oligonukleotid verwendet wurde:
welches ebenfalls eine EcoRV-Stelle (Codons 200–201) einführte, um die ClaI-Stelle (Codons 201–202) zu ersetzen.
2. Dann wurde der Primer LAAM12 (Tabelle II) verwendet, um eine weitere stille Restriktionsstelle (BstBI) über die Codons 186–188 hinweg einzuführen.
3. Die resultierende M197A (BstBI+, EcoRV+) Variante wurde dann in das Plasmid pA4BL subkloniert (PstI-SstI-Fragment), und das resultierende Plasmid mit BstBI und EcoRV verdaut und das große, den Vektor enthaltende Fragment durch Elektroelution aus einem Agarosegel isoliert.
4. Synthetische Primern LAAM14-30 (Tabelle II) wurden jeweils mit dem größtenteils komplementären gemeinsamen Primern LAAM13 (Tabelle II) reassoziieren gelassen. Die resultierenden Kassetten, welche für alle verbleibenden natürlich vorkommenden Aminosäuren an der Position +197 codierten, wurden einzeln in das Vektorfragment, das oben hergestellt wurde, ligiert.

Tabelle II Synthetische Oligonukleotide, welche zur Kassettenmutagenese verwendet wurden, um M197X-Varianten zu erzeugen
Die Kassetten waren so geplant, dass die EcoRV-Stelle bei der Ligation zerstört wurde, so dass die Plasmide aus E. coli-Transformanten in Hinblick auf den Verlust dieser einmaligen Stelle hin gescreent wurden. Zusätzlich enthielt der gemeinsame Grundstrang (bottom strand) der Kassette eine Verschiebung des Rasters und codierte eine NsiI-Stelle, so dass Transformanten, die von diesem Strang abgeleitet waren, durch ein Screenen im Hinblick auf das Vorliegen der einmaligen NsiI-Stelle eliminiert werden konnten und in keinem Fall erwartet werden konnte, dass diese zu der Expression einer aktiven Amylase führen würden.
Bei der Restriktionsanalyse positive wurden durch Sequenzieren bestätigt und zur Expression in Schüttelkolbenkulturen in B. subtilis transformiert. Die spezifische Aktivität gewisser M197X-Mutanten wurde dann unter Verwendung eines Tests mit löslichem Substrat bestimmt. Die Daten, die bei Verwendung der folgenden Testverfahren erzeugt wurden, sind nachstehend in Tabelle III angegeben.
Test mit löslichem Substrat: Ein Geschwindigkeitstest wurde auf der Grundlage eines Endpunkt-Testkits, das von Megazyme (Aust.) Pty. Ltd. geliefert wurde, entwickelt: Jedes Röhrchen mit Substrat (p-Nitrophenylmaltoheptaosid, BPNPG7) wurde in 10 ml sterilem Wasser gelöst, worauf eine 1 bis 4fache Verdünnung in Testpuffer (50 mM Maleatpuffer, pH 6,7, 5 mM Calciumchlorid, 0,002 % Tween 20) folgte. Tests wurden durchgeführt, indem 10 μl Amylase zu 790 μl des Substrates in einer Küvette bei 25°C zugegeben wurden. Hydrolysegeschwindigkeiten wurden als die Geschwindigkeit der Extinktionsänderung bei 410 nm nach einer Verzögerung von 75 Sekunden gemessen. Der Test war bis zu Geschwindigkeiten von 0,4 Absorptionseinheiten/Minute linear.
Die Amylaseproteinkonzentration wurde unter Verwendung des standardmäßigen Bio-Rad-Tests (Bio-Rad Laboratories) auf der Grundlage des Verfahrens von Brad ford, M. (1976) Anal. Biochem. 72: 248) gemessen, wobei Rinderserumalbuminstandards verwendet wurden.
Stärkehydrolysetest: Das Standardverfahren zum Testen der alpha-Amylaseaktivität von Spezyme^© AA20 wurde verwendet. Dieses Verfahren wird im Detail in Beispiel 1 der USSN 07/785,624 beschrieben, worauf hierin vollinhaltlich Bezug genommen wird. Native Stärke bildet mit Iod eine blaue Farbe, macht dieses aber nicht, wenn sie zu kürzeren Dextrinmolekülen hydrolysiert ist. Das Substrat ist lösliche Lintner-Stärke, 5 g/Liter, in Phosphatpuffer, pH 6,2 (42,5 g/Liter Kaliumdihydrogenphosphat, 3,16 g/Liter Natriumhydroxid). Die Probe wird in 25 mM Calciumchlorid zugegeben, und die Aktivität wird als die Zeit gemessen, die es dauert, um bei einer Inkubation bei 30°C einen negativen Iodtest zu ergeben. Die Aktivität wird in Liquefons pro g oder ml (LU) aufgezeichnet, was gemäß der folgenden Formel berechnet wird:
wobei LU = Liquefoneinheit
V = Volumen der Probe (5 ml)
t = Dextrinisierungszeit (Minuten)
D = Verdünnungsfaktor = Verdünnungsvolumen/ml oder g an zugegebenem Enzym.
TABELLE III
Beispiel 4
Charakterisierung der Variante M15L
Die Variante M15L, welche wie in den vorhergehenden Beispielen erzeugt wurde, zeigte keine erhöhte Amylaseaktivität (Tabelle III) und wurde immer noch durch Wasserstoffperoxid (7) inaktiviert. Sie zeigte jedoch eine deutlich erhöhte Leistungsfähigkeit bei der Jetverflüssigung von Stärke, insbesondere bei niedrigem pH, wie in Tabelle IV unten gezeigt ist.
Die Stärkeverflüssigung wurde typischerweise unter Verwendung eines Hydroheater M 103-M Dampfjets, welcher mit einer 2,5 Liter-Verzögerungsspirale hinter der Mischkammer und einem Rückschlagventil am Ende ausgerüstet war, durchgeführt. Die Stärke wurde zu dem Jet durch eine Moyno-Pumpe zugeführt, und der Dampf wurde über eine Dampfleitung mit 150 psi, die auf 90–100 psi verringert wurden, zugeführt. Temperatursonden waren unmittelbar nach dem Hydroheater-Jet und unmittelbar vor dem Rückschlagventil installiert.
Eine Stärkeaufschlämmung wurde aus einer Getreidenassmahlvorrichtung erhalten und innerhalb von zwei Tagen verwendet. Die Stärke wurde auf die gewünschten Feststoffgehalte mit entionisiertem Wasser verdünnt, und der pH der Stärke wurde mit 2% NaOH oder gesättigtem Na₂CO₃ eingestellt. Typische Verflüssigungsbedingungen waren:

Stärke 32%–35% Feststoffe

Calcium 40–50 ppm (30 ppm zugegeben)

pH 5,0–6,0

alpha-Amylase 12–14 LU/g Stärke auf Trockenbasis
Stärke wurde in den Jet mit ca. 350 ml/min eingeführt. Die Jettemperatur wurde bei 105° bis 107°C gehalten. Proben der Stärke wurden aus dem Jetkocher in eine zweite Verflüssigungsstufe bei 95°C überführt und dort für 90 Minuten gehalten.
Der Grad der Stärkeverflüssigung wurde unmittelbar nach der zweiten Stufe der Verflüssigung gemessen, indem die Dextroseäquivalenz (DE) der Probe bestimmt wurde und indem auf das Vorliegen von roher Stärke getestet wurde, jeweils gemäß den Verfahren, die in Standard Analytical Methods of the Member Companies of the Corn Refiners Association, Inc., 6. Ausgabe, beschrieben werden. Stärke wird, wenn sie im Allgemeinen unter den oben angegebenen Bedingungen und bei pH 6,0 behandelt wird, eine verflüssigte Stärke mit einer DE von ca. 10 und ohne rohe Stärke ergeben. Die Ergebnisse von Stärkeverflüssigungstests, welche die Mutanten der vorliegenden Erfindung verwenden, werden in Tabelle IV angegeben.
TABELLE IV Leistungsfähigkeit der Varianten M15L (A4-Form) und M15L bei der Stärkeverflüssigung
Beispiel 5
Konstruktion von M15X-Varianten
Indem im Allgemeinen den Verfahren gefolgt wurde, die in Beispiel 3 oben beschrieben sind, wurden alle Varianten an M15 (M15X) in einem nativen B. licheniformis durch Kassettenmutagenese erzeugt wie in 8 angegeben ist.

1. Es wurde eine gezielte Mutagenese (über Primerverlängerung in M13) verwendet, um einmalige Restriktionsstellen einzuführen, welche das M15-Codon flankierten, um die Insertion einer Mutagenesekassette zu erleichtern. Insbesondere wurden eine BstB1-Stelle an den Codons 11–13 und eine Msc1-Stelle an den Codons 18–20 unter Verwendung der zwei nachstehend gezeigten Oligonukleotide eingeführt.

2. Der Vektor für die M15X-Kassettenmutagenese wurde dann konstruiert, indem das Sfi1-SstII-Fragment aus der mutagenisierten Amylase (BstB1+, Msc1+) in das Plasmid pBLapr subkloniert wurde. Das resultierende Plasmid wurde dann mit BstB1 und Msc1 verdaut und das große Vektorfragment durch Elektroelution aus einem Polyacrylamidgel isoliert.
3. Mutagenesekassetten wurden wie mit den M197X-Varianten erzeugt. Synthetische Oligomere, welche jeweils eine Substitution am Codon 15 codierten, wurden mit einem gemeinsamen Grundprimer reassoziieren gelassen. Bei der richtigen Ligation der Kassette mit dem Vektor wird die Msc1 zerstört, was ein Screenen auf positive Transformanten über den Verlust dieser Stelle ermöglicht. Der Grundprimer enthält eine einmalige SnaB1-Stelle, was ermöglicht, dass die Transformanten, die von dem Grundstrang abgeleitet sind, durch ein Screenen auf die SnaBl-Stelle eliminiert werden. Dieser Primer enthält ebenfalls eine Verschiebung des Rasters, welche ebenfalls eine Amylaseexpression für die Mutanten, die von dem gemeinsamen Grundstrang abgeleitet sind, eliminieren würde.
Die synthetischen Kassetten sind in Tabelle V aufgelistet, und die allgemeine Kassettenmutagenesestrategie ist in 8 dargestellt.

TABELLE V Synthetische Oligonukleotide, die zur Kassettenmutagenese verwendet wurden, um M15X-Varianten zu erzeugen
Eine Unterstreichung zeigt Veränderungen des Codons an der Aminosäureposition 15.
Konservative Substitutionen wurden in manchen Fällen durchgeführt, um die Einführung von neuen Restriktionsstellen zu verhindern.
Beispiel 6
Verflüssigung im Labor mit M15X-Varianten
Elf alpha-Amylasevarianten mit Substitutionen an M15, die wie in Beispiel 5 erzeugt wurden, wurden im Hinblick auf die Aktivität im Vergleich zu Spezyme© AA20 (kommerziell erhältlich von der Genencor International, Inc.) bei einer Verflüssigung bei pH 5,5 unter Verwendung eines Laborverflüssigungssystems getestet. Das Verflüssigungssystem im Labormaßstab bestand aus einer Spirale aus rostfreiem Stahl (0,25 Inch Durchmesser, ungefähr 350 ml Volumen), welche mit einem 7 Inch langen statischen Mischelement, das ungefähr 12 Inch von dem vorderen Ende entfernt war, und einem 30 psi-Rückschlagventil an dem hinteren Ende ausgerüstet war. Die Spirale, außer die beiden Enden, wurde in ein Glycerol-Wasserbad eingetaucht, welches mit thermostatisch gesteuerten Heizelementen ausgerüstet war, welche das Bad bei 105°–106°C hielten.
Eine enzymhaltige Stärkeaufschlämmung, die durch Rühren in Suspension gehalten wurde, wurde bei ca. 70 ml/min über eine kolbengetriebene Dosierpumpe in die Reaktionsspirale eingeführt. Die Stärke wurde am Ende der Spirale gewonnen und wurde in die zweite Stufe (secondary hold) überführt (95°C für 90 Minuten). Unmittelbar nach der zweiten Stufe wurde die DE der verflüssigten Stärke bestimmt, wie in Beispiel 4 beschrieben ist. Die Ergebnisse sind in 12 gezeigt.
Beispiel 7
Charakterisierung der M15X-Varianten
Alle M15X-Varianten wurden in Bacillus subtilis vermehrt, und das Expressionsniveau wurde überwacht, wie in 9 gezeigt ist. Die Amylase wurde durch eine Fällung mit 20–70% Ammoniumsulfat isoliert und teilweise gereinigt. Die spezifische Aktivität dieser Varianten bei dem löslichen Substrat wurde wie in Beispiel 3 bestimmt ( 10). Viele der M15X-Amylasen weisen spezifische Aktivitäten auf, die größer sind als die von Spezyme^® AA20. Ein Labortest der Wärmestabilität wurde mit den Varianten durchgeführt, indem die Amylase bei 90°C für 5 Minuten in 50 mM Acetatpuffer pH 5 in Gegenwart von 5 mM CaCl₂ erwärmt wurde (11). Die meisten Varianten waren in diesem Test ebenso gut wie Spezyme^® AA20. Jene Varianten, die in diesem Test eine vernünftige Stabilität zeigten (wobei eine vernünftige Stabilität definiert ist als eine solche, bei der wenigstens ca. 60% der Wärmestabilität von Spezyme® AA20 erhalten werden), wurden im Hinblick auf die spezifische Aktivität bei Stärke und die Leistungsfähigkeit bei der Verflüssigung bei pH 5,5 getestet. Die interessantesten dieser Mutanten sind in 16 gezeigt. M15D, N und T zusammen mit L wiesen bei der Verflüssigung bei pH 5,5 eine bessere Leistung auf als Spezyme© AA20 und wiesen sowohl bei dem Test mit dem flüssigen Substrat als auch bei dem Stärkehydrolysetest erhöhte spezifische Aktivitäten auf.
Allgemein haben wir gefunden, dass wir durch ein Substituieren des Methionins an Position 15 Varianten mit erhöhter Leistungsfähigkeit bei einer Verflüssigung bei niedrigem pH und/oder erhöhter spezifischer Aktivität bereitstellen können.
Beispiel 8
Tryptophanempfindlichkeit gegenüber einer Oxidation
Chloramin-T (Natrium-N-chlor-p-toluolsulfonimid) ist ein selektives Oxidationsmittel, welches bei neutralem oder alkalischem pH Methionin zu Methioninsulfoxid oxidiert. Bei saurem pH wird Chloramin-T sowohl Methionin als auch Tryptophan modifizieren (Schechter, Y., Burstein, Y. and Patchornik, A. (1975) Biochemistry 14 (20) 4497-4503). 13 zeigt die Inaktivierung von B. licheniformis-alpha-Amylase mit Chloramin-T bei pH 8,0 (AA20 = 0,65 mg/ml, M197A = 1,7 mg/ml, M197L = 1,7 mg/ml). Die Daten zeigen, dass durch ein Verändern des Methionins an Position 197 zu Leucin oder Alanin die Inaktivierung der alpha-Amylase verhindert werden kann. Umgekehrt wird, wie in 14 gezeigt ist, bei pH 4,0 die Inaktivierung von M197A und M197L fortgesetzt, es werden aber mehr Äquivalente von Chloramin-T benötigt ( 18; AA20 = 0,22 mg/ml, M197A = 4,3 mg/ml, M197L = 0,53 mg/ml, 200 mM Na-Acetat bei 4,0). Dieses legt nahe, dass ebenfalls ein Tryptophanrest an der von Chloramin-T vermittelten Inaktivierung beteiligt ist. Weiterhin haben eine tryptische Kartierung und eine anschließende Aminosäuresequenzierung gezeigt, dass das Tryptophan an Position 138 durch Chloramin-T oxidiert wurde (Daten nicht gezeigt). Um dieses zu beweisen, wurden gezielte Mutanten an Tryptophan 138 erzeugt, wie nachstehend geschildert wird:
Herstellung der alpha-Amylase-Doppelmutanten W138 und M197
Gewisse Varianten von W138 (F, Y und A) wurden als Doppelmutanten mit M197T erzeugt (erzeugt nach der Offenbarung von Beispiel 3). Die Doppelmutanten wurden erzeugt, indem den Verfahren, die in den Beispielen 1 und 3 beschrieben werden, gefolgt wurde. Im Allgemeinen wurden einzelne negative Stränge der DNA von einem M13MP18-Klon der codierenden Sequenz mit 1,72 kb (Pst1-SstI) der B. licheniformis-alpha-Amylase M197T-Mutante hergestellt. Eine gezielte Mutagenese wurde, indem die Primer verwendet wurden, die nachstehend aufgelistet sind, im Wesentlichen durch das Verfahren von Zoller, M. et al. (1983) durchgeführt, außer dass das T4-Gen 32-Protein und die T4-Polymerase durch Klenow ersetzt wurden. Die Primer enthielten alle einmalige Stellen wie auch die gewünschte Mutation, um jene Klone mit der geeigneten Mutation zu identifizieren.
Tryptophan 138 zu Phenylalanin
Tryptophan 138 zu Tyrosin
Tryptophan 138 zu Alanin – Dieser Primer schafft ebenfalls einmalige Stellen stromaufwärts und stromabwärts der Position 138.
Mutanten wurden durch Restriktionsanalyse von W138F und W138Y identifiziert, welche durch DNA-Sequenzierung bestätigt wurden. Die W138A-Sequenz zeigte eine Nukleotiddeletion zwischen den einmaligen BspEI- und XmaI-Stellen, jedoch zeigte der Rest des Gens eine korrekte Sequenz. Das SstII/SstI-Fragment mit 1,37 kb, das sowohl die W138X- als auch die M197T-Mutation enthielt, wurde aus M13MP18 in den Expressionsvektor pBLapr überführt, was zu pBLapr (W138F, M197T) und pBLapr (W138Y, M197T) führte. Das Fragment, welches einmalige BspEI- und XmaI-Stellen enthielt, wurde in pBLapr (BspEI, XmaI, M197T) kloniert, da es nützlich ist, um Kassetten zu klonieren, die andere Aminosäuresubstitutionen an Position 138 enthalten.
Einzelne Mutationen an der Aminosäureposition 138
Nach den allgemeinen Methoden, die in den früheren Beispielen beschrieben sind, wurden gewisse Einzelvarianten von W138 (F, Y, L, N und C) erzeugt.
Das Asp718-SstI-Fragment mit 1,24 kb, welches die M197T-Mutation enthielt, in dem Plasmid pBLapr (W138X, M197T) von Beispiel 7 wurde durch das Wildtypfragment mit Methionin an 197 ersetzt, was zu pBLapr (W138F), pBLapr (W138Y) und pBLapr (BspEI, XmaI) führte.
Die Mutanten W138L, W138H und W138C wurden erzeugt, indem synthetische Kassetten in den pBLapr (BstEI, XmaI) Vektor ligiert wurden, wobei die folgenden Primer verwendet wurden:
Tryptophan 138 zu Leucin
Tryptophan 138 zu Histidin
Tryptophan 138 zu Cystein
Die Reaktion der Doppelmutanten M197T/W138F und M197T/W138Y mit Chloramin-T wurde mit dem Wildtyp verglichen (AA20 = 0,75 mg/ml, M197T/W138F = 0,64 mg/ml, M197T/W138Y = 0,60 mg/ml; 50 mM Na-Acetat bei pH 5,0). Die Ergebnisse, welche in 19 gezeigt sind, zeigen, dass die Mutagenese von Tryptophan 138 bewirkt hat, dass die Variante resistenter gegenüber Chloramin-T ist.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Eine alpha-Amylasemutante, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus: (a) einer alpha-Amylase, welche das Expressionsprodukt einer mutierten DNA-Sequenz ist, welche eine alpha-Amylase codiert, wobei die mutierte DNA-Sequenz von einem Vorläufer der alpha-Amylase von Bacillus licheniformis durch Substitution einer Aminosäure an Position M + 15 abgeleitet ist, und (b) einer alpha-Amylase, welche das Expressionsprodukt einer mutierten DNA-Sequenz ist, welche eine alpha-Amylase codiert, wobei die mutierte DNA-Sequenz von einem Vorläufer der alpha-Amylase, welche eine alpha-Amylase von Bacillus ist, durch Substitution einer Aminosäure, die in der Position in entweder der primären oder tertiären Struktur M + 15 in der alpha-Amylase von Bacillus licheniformis entspricht, abgeleitet ist, wobei die alpha-Amylase ein verändertes pH- und/oder Temperaturleistungsprofil zeigt, wenn sie mit dem Wildtyp der Bacillus-alpha-Amylase verglichen wird; unter dem Vorbehalt, dass die substituierende Aminosäure nicht Leu, Ile, Asn, Ser, Gln, Asp oder Glu ist.
Eine alpha-Amylasemutante nach Anspruch 1, welche weiterhin eine oder mehrere ortsspezifische Mutationen umfasst.
Eine alpha-Amylasemutante nach irgendeinem vorgehenden Anspruch, wobei der Vorläufer aus einem Bacillus stammt, der ausgewählt ist aus der Gruppe B. licheniformis, B. stearothermophilus und B. amyloliquefaciens
Eine alpha-Amylasemutante nach Anspruch 3, wobei der Vorläufer alpha-Amylase von Bacillus licheniformis ist.
DNA, die für eine alpha-Amylasemutante nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 4 codiert.
Expressionsvektoren, welche die DNA nach Anspruch 5 codieren.
Wirtszellen, welche mit dem Expressionsvektor nach Anspruch 6 transformiert sind.
Eine Detergenzzusammensetzung, welche eine alpha-Amylasemutante nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 4 umfasst.
Eine Detergenzzusammensetzung nach Anspruch 8, welche eine flüssige, gelförmige oder granuläre Zusammensetzung ist.
Eine Detergenzzusammensetzung nach Anspruch 8 oder Anspruch 9, welche weiterhin ein oder mehrere zusätzliche Enzyme umfasst.
Eine stärkeverflüssigende Zusammensetzung, welche eine alpha-Amylasemutante nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 4 umfasst.
Eine Detergenzzusammensetzung, welche eine alpha-Amylasemutante und ein oder mehrere zusätzliche Enzyme umfasst, wobei die alpha-Amylasemutante ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus (a) einer alpha-Amylase, welche das Expressionsprodukt einer mutierten DNA-Sequenz ist, welche eine alpha-Amylase codiert, wobei die mutierte DNA-Sequenz von einem Vorläufer der alpha-Amylase von Bacillus licheniformis durch Substitution einer Aminosäure an Position M + 15 abgeleitet ist, und (b) einer alpha-Amylase, welche das Expressionsprodukt einer mutierten DNA-Sequenz ist, welche eine alpha-Amylase codiert, wobei die mutierte DNA-Sequenz von einem Vorläufer der alpha-Amylase, welche eine alpha-Amylase von Bacillus ist, durch Substitution einer Aminosäure, die in der Position in entweder der primären oder tertiären Struktur M + 15 in der alpha-Amylase von Bacillus licheniformis entspricht, abgeleitet ist, wobei die alpha-Amylase ein verändertes pH- und/oder Temperaturleistungsprofil zeigt, wenn sie mit dem Wildtyp der Bacillus-alpha-Amylase verglichen wird.
Die Detergenzzusammensetzung nach Anspruch 12, wobei die alpha-Amylasemutante M15L ist.
Die Detergenzzusammensetzung nach Anspruch 12 oder Anspruch 13, wobei die alpha-Amylasemutante eine oder mehrere andere ortsspezifische Mutationen umfasst.
Eine Detergenzzusammensetzung wie in irgendeinem der Ansprüche 12 bis 14 beansprucht, wobei das zusätzliche Enzym oder die Enzyme ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus Amylase, Proteasen, Lipasen und Cellulasen.
Ein Verfahren zum Verflüssigen einer granulären Stärkeaufschlämmung aus entweder einem Nass- oder Trockenmahlverfahren bei einem pH von ca. 4 bis ca. 6, umfassend: (a) Zugeben einer wirksamen Menge einer alpha-Amylasemutante zu der Aufschlämmung; (b) gegebenenfalls Zugeben einer wirksamen Menge eines Antioxidationsmittels zu der Aufschlämmung; und (c) Umsetzen der Aufschlämmung für eine geeignete Zeit und bei einer geeigneten Temperatur, um die Stärke zu verflüssigen; wobei die alpha-Amylasemutante ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus: (a) einer alpha-Amylase, welche das Expressionsprodukt einer mutierten DNA-Sequenz ist, welche eine alpha-Amylase codiert, wobei die mutierte DNA-Sequenz von einem Vorläufer der alpha-Amylase von Bacillus licheniformis durch Substitution einer Aminosäure an Position M + 15 abgeleitet ist, und (b) einer alpha-Amylase, welche das Expressionsprodukt einer mutierten DNA-Sequenz ist, welche eine alpha-Amylase codiert, wobei die mutierte DNA-Sequenz von einem Vorläufer der alpha-Amylase, welche eine alpha-Amylase von Bacillus ist, durch Substitution einer Aminosäure, die in der Position in entweder der primären oder tertiären Struktur M + 15 in der alpha-Amylase von Bacillus licheniformis entspricht, abgeleitet ist, wobei die alpha-Amylase ein verändertes pH- und/oder Temperaturleistungsprofil zeigt, wenn sie mit dem Wildtyp der Bacillus-alpha-Amylase verglichen wird.
Eine Zusammensetzung zur Verflüssigung von Stärke, welche eine alpha-Amylasemutante umfasst, wobei die alpha-Amylasemutante ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus: (a) einer alpha-Amylase, welche das Expressionsprodukt einer mutierten DNA-Sequenz ist, welche eine alpha-Amylase codiert, wobei die mutierte DNA-Sequenz von einem Vorläufer der alpha-Amylase von Bacillus licheniformis durch Substitution einer Aminosäure an Position M + 15 abgeleitet ist, und (b) einer alpha-Amylase, welche das Expressionsprodukt einer mutierten DNA-Sequenz ist, welche eine alpha-Amylase codiert, wobei die mutierte DNA-Sequenz von einem Vorläufer der alpha-Amylase, welche eine alpha-Amylase von Bacillus ist, durch Substitution einer Aminosäure, die in der Position in entweder der primären oder tertiären Struktur M + 15 in der alpha-Amylase von Bacillus licheniformis entspricht, abgeleitet ist, wobei die alpha-Amylase ein verändertes pH- und/oder Temperaturleistungsprofil zeigt, wenn sie mit dem Wildtyp der Bacillus-alpha-Amylase verglichen wird.
Die Zusammensetzung zur Verflüssigung von Stärke nach Anspruch 17, wobei die alpha-Amylasemutante M15L ist.