CN110651038A

CN110651038A - 包含脂肪酶和亚硫酸盐的组合物

Info

Publication number: CN110651038A
Application number: CN201880028849.6A
Authority: CN
Inventors: J.文德; T.A.波尔森; M.D.G.P.托斯卡诺
Original assignee: Novozymes AS
Current assignee: Novozymes AS
Priority date: 2017-05-05
Filing date: 2018-05-04
Publication date: 2020-01-03
Also published as: US11078445B2; WO2018202846A1; US20200056122A1; EP3619304A1

Abstract

本发明涉及一种组合物，所述组合物包含：(a)亚硫酸盐源；和(b)亲本脂肪酶的脂肪酶变体，其中在半胱氨酸桥的

Description

包含脂肪酶和亚硫酸盐的组合物

序列表的引用

本申请包含处于计算机可读形式的序列表，将其通过引用并入本文。

发明背景

技术领域

本发明涉及包含亚硫酸盐源和脂肪酶变体的组合物。本发明还涉及脂肪酶变体以及本发明的组合物用于清洁例如表面的用途。此外，本发明还涉及多核苷酸、包含本发明的多核苷酸的核酸构建体、包含本发明的多核苷酸的表达载体、包含本发明的多核苷酸的宿主细胞、产生本发明的脂肪酶变体的方法、以及获得本发明的脂肪酶变体的方法。

背景技术

亚硫酸盐是在一些食品和人体中天然存在的物质。它们被用于食品(作为防腐剂或强化剂)以及非食品(如例如家庭产品)中，并因此被包含在各种组合物中。

脂肪酶已经被用于组合物中用于通过水解甘油三酯以产生脂肪酸来去除脂质污渍。当前的洗涤剂、清洁和/或织物护理组合物包含许多活性成分，所述成分干扰脂肪酶去除脂质污渍的能力。在一些组合物中，将亚硫酸盐源作为针对更不稳定的功能性成分(如但不限于颜料、聚合物、香料)的抗氧化剂添加，或者在磺化的表面活性剂中作为痕量/杂质。然而，亚硫酸盐可以影响脂肪酶的稳定性。

WO 2017/005640涉及组合物，所述组合物包含：(a)亚硫酸盐源；和(b)对亚硫酸盐具有改进的稳定性的亲本脂肪酶的脂肪酶变体。

需要包含亚硫酸盐和脂肪酶的组合物(包括洗涤剂组合物)，所述亚硫酸盐和脂肪酶在亚硫酸盐的存在下是稳定且有活性的。

发明内容

本发明涉及降低包含亚硫酸盐源的组合物中的脂肪酶的稳定性的问题。

在许多洗涤剂组合物中都存在亚硫酸盐(SO₃ ^2-)。亚硫酸盐可以破坏二硫键(R-S-S-R’)，并降低含有一个或多个半胱氨酸桥的脂肪酶的稳定性。诸位发明人出人意料地发现，可以通过用接近半胱氨酸桥的带负电荷的氨基酸屏蔽半胱氨酸桥来减少稳定性的降低。据信，这种作用是由于亚硫酸盐带负电荷，因此亚硫酸盐不易与带负电荷的脂肪酶区域结合。

因此，在第一方面，本发明涉及组合物，所述组合物包含：

(a)亚硫酸盐源；

(b)示为SEQ ID NO:2的亲本脂肪酶或与SEQ ID NO:2具有至少60％同一性的亲本脂肪酶的脂肪酶变体；

其中在半胱氨酸桥的20埃

内的亲本脂肪酶中的一个或多个氨基酸被带更多负电荷的氨基酸替代。

在一个实施例中，亲本脂肪酶是SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:8、或SEQ ID NO:10、或SEQ ID NO:12的多肽，或者其具有脂肪酶活性的片段。

在优选的实施例中，被替代的、优选被取代的氨基酸在半胱氨酸桥(即，从羧基基团到硫原子)的15埃内、优选10埃内、更优选5埃内。

在优选的实施例中，亚硫酸盐源选自：亚硫酸盐，如亚硫酸钠、亚硫酸钾、亚硫酸钙；亚硫酸氢盐，如亚硫酸氢钾、亚硫酸氢钠、亚硫酸氢钙；偏亚硫酸氢盐，如偏亚硫酸氢钾、偏亚硫酸氢钠、偏亚硫酸氢钙；或其任何组合。

在优选的实施例中，亚硫酸盐(为SO₃ ^2-)或偏亚硫酸氢盐(为S₂O₅ ^2-)的量是从0.1wt％至3wt％；从0.2wt％至2wt％；从0.5wt％至2wt％。

在特定实施例中，脂肪酶变体包括与以下对应的一个或多个取代：SEQ ID NO:2的Q15D、E，G23D、E，T35D、E，T37D、E，N39D、E，A40D、E，P42D、E，N101D、E，S105D、E，G106D、E，F184D、E，或T267D、E。

根据本发明，亲本脂肪酶可以包含一个或多个半胱氨酸桥。所述半胱氨酸桥优选位于亲本脂肪酶的表面上。

在本发明的特定实施例中，半胱氨酸桥是或对应于以下位置处的半胱氨酸桥中的一个或多个：

SEQ ID NO:2的

C22-C268、

C36-C41、和

C104-C107。

在本发明的实施例中，与亲本脂肪酶相比，本发明的脂肪酶变体在亚硫酸盐源的存在下具有改进的稳定性。

在优选的实施例中，组合物进一步包含表面活性剂。

在一方面，本发明涉及本发明的组合物用于清洁例如表面的用途。

本发明还涉及亲本脂肪酶的脂肪酶变体，其中所述变体具有脂肪酶活性，与SEQID NO:2或其具有脂肪酶活性的任何片段具有至少60％但小于100％序列同一性，并在对应于SEQ ID NO:2的残基15、23、35、37、39、40、42、101、105、106、184和267的位置处包含一个或多个(例如若干个)取代。

在特定实施例中，脂肪酶变体包括与选自以下组的取代对应的一个或多个取代：SEQ ID NO:2的Q15D、E，G23D、E，T35D、E，T37D、E，N39D、E，A40D、E，P42D、E，N101D、E，S105D、E，G106D、E，F184D，E，和T267D、E。

在一方面，本发明涉及编码本发明的变体的多核苷酸。

在一方面，本发明涉及包含本发明的多核苷酸的核酸构建体。

在一方面，本发明涉及包含本发明的多核苷酸的表达载体。

在一方面，本发明涉及包含本发明的多核苷酸、特别是本发明的表达载体的宿主细胞。

在一方面，本发明涉及产生脂肪酶变体的方法，所述方法包括：(a)在适合于表达所述变体的条件下培养本发明的宿主细胞；和(b)回收所述变体。

在一方面，本发明涉及用于获得本发明的脂肪酶变体的方法，所述方法包括：向在半胱氨酸桥的20埃

内的示为SEQ ID NO:2的亲本脂肪酶或与其具有至少60％序列同一性的亲本脂肪酶中引入带更多负电荷的氨基酸。

在优选的实施例中，向亲本脂肪酶中引入与SEQ ID NO:2中以下取代对应的一个或多个取代：Q15D、E，G23D、E，T35D、E，T37D、E，N39D、E，A40D、E，P42D、E，N101D、E，S105D、E，G106D、E，F184D、E，或T267D、E。

定义

脂肪酶：术语“脂肪酶(lipase)”、“脂肪酶(lipase enzyme)”、“脂肪分解酶”、“脂质酯酶”、“脂解多肽”以及“脂解蛋白”是指如酶命名法所定义的EC3.1.1类中的酶。它可以具有脂肪酶活性(三酰基甘油脂肪酶，EC3.1.1.3)、角质酶活性(EC3.1.1.74)、固醇酯酶活性(EC3.1.1.13)和/或蜡酯水解酶活性(EC3.1.1.50)。出于本发明的目的，根据实例部分中描述的程序确定脂肪酶活性：可以使用具有不同链长的底物，用PnP测定法确定水解活性。

在一方面，本发明的变体具有亲本脂肪酶的脂肪酶活性的至少20％，例如至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％。在一方面，亲本脂肪酶是SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、或SEQ ID NO:10、或SEQ IDNO:12的多肽，或者其具有脂肪酶活性的片段。

等位基因变体：术语“等位基因变体”意指占据同一染色体基因座的基因的两种或更多种替代形式中的任一种。等位基因变异通过突变而自然产生，并且可以导致群体内部的多态性。基因突变可以是沉默的(所编码的多肽无变化)或可以编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位基因变体是由基因的等位基因变体编码的多肽。

cDNA：术语“cDNA”意指可以通过从获得自真核或原核细胞的成熟的、剪接的mRNA分子进行反转录而制备的DNA分子。cDNA缺乏可以存在于对应基因组DNA中的内含子序列。初始的初级RNA转录物是mRNA的前体，其要通过一系列的步骤(包括剪接)进行加工，然后呈现为成熟的剪接的mRNA。

编码序列：术语“编码序列”意指多核苷酸，所述多核苷酸直接规定了变体的氨基酸序列。编码序列的边界通常由可读框确定，所述可读框以起始密码子(如ATG、GTG或TTG)开始并且以终止密码子(如TAA、TAG或TGA)结束。编码序列可为基因组DNA、cDNA、合成DNA或其组合。

控制序列：术语“控制序列”意指对于表达编码本发明的变体的多核苷酸所必需的核酸序列。每个控制序列对于编码所述变体的多核苷酸来说可以是原生的(即，来自相同基因)或外源的(即，来自不同基因)，或相对于彼此是原生的或外源的。此类控制序列包括但不限于前导序列、多腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列、和转录终止子。最少，控制序列包括启动子、以及转录和翻译终止信号。出于引入促进控制序列与编码变体的多核苷酸的编码区域连接的特异性限制位点的目的，控制序列可以提供有接头。

表达：术语“表达”包括涉及变体产生的任何步骤，包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰、以及分泌。

表达载体：术语“表达载体”意指直链或环状DNA分子，所述分子包括编码变体的多核苷酸并且可操作地连接至提供用于其表达的控制序列。

片段：术语“片段”意指在多肽的氨基和/或羧基末端不存在一个或多个(例如若干个)氨基酸的多肽；其中所述片段具有脂肪酶活性。在一方面，片段含有存在于亲本脂肪酶中的氨基酸的数目的至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％。在一方面，亲本脂肪酶是SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、或SEQ ID NO:10、或SEQ ID NO:12的多肽。在一方面，亲本脂肪酶是SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、或SEQ ID NO:10、或SEQ IDNO:12的氨基酸1-269。

高严格条件：术语“高严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在65℃使用2X SSC、0.2％SDS将运载体材料洗涤三次，每次15分钟。

宿主细胞：术语“宿主细胞”意指易于用包含本发明的多核苷酸的核酸构建体或表达载体进行转化、转染、转导等的任何细胞类型。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间出现的突变而与亲本细胞不完全相同的任何亲本细胞子代。

改进的特性：术语“改进的特性”意指与相对于亲本脂肪酶有所改进的变体相关的特征。此类改进的特性包括但不限于稳定性(如例如在亚硫酸盐源的存在下的稳定性、在洗涤剂组合物中的稳定性、在包含亚硫酸盐源的洗涤剂组合物中的稳定性、在贮藏条件下稳定性、在亚硫酸盐源的存在下在贮藏条件下的稳定性)、热稳定性以及在亚硫酸盐源的存在下的热稳定性。

分离的：术语“分离的”意指处于自然界中不存在的形式或环境中的物质。分离的物质的非限制性实例包括(1)任何非天然存在的物质，(2)包括但不限于任何酶、变体、核酸、蛋白质、肽或辅因子的任何物质，所述物质至少部分地从与其性质相关的一种或多种或所有天然存在的成分中去除；(3)相对于自然界中发现的物质通过人工修饰的任何物质；或(4)通过相对于与其天然相关的其他组分，增加所述物质的量而修饰的任何物质(例如，编码所述物质的基因的多个拷贝；比与编码所述物质的基因天然相关联的启动子更强的启动子的使用)。分离的物质可以存在于发酵液样品中。

低严格条件：术语“低严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃、于5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并且变性的鲑鱼精子DNA以及25％甲酰胺中预杂交和杂交12小时至24小时。最后在50℃使用2X SSC、0.2％SDS将运载体材料洗涤三次，每次15分钟。

成熟多肽：术语“成熟多肽”或“多肽的成熟部分”意指在翻译和任何翻译后修饰如N-末端加工、C-末端截短、糖基化作用、磷酸化作用等之后处于其最终形式的多肽。在一方面，成熟多肽是SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、或SEQ ID NO:10、或SEQ ID NO:12的氨基酸1至269。在本领域中已知的是，宿主细胞可以产生由相同多核苷酸表达的两种或多种不同的成熟多肽(即，具有不同的C-末端和/或N-末端氨基酸)的混合物。

成熟多肽编码序列：术语“成熟多肽编码序列”意指编码具有脂肪酶活性的成熟多肽的多核苷酸。在一方面，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、或SEQ ID NO:11的核苷酸1至807。

中严格条件：术语“中严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和35％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在55℃使用2X SSC、0.2％SDS将运载体材料洗涤三次，每次15分钟。

中-高严格条件：术语“中-高严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃在5X SSPE、0.3％SDS、200ug/mL剪切并变性的鲑鱼精子DNA和35％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在60℃使用2X SSC、0.2％SDS将运载体材料洗涤三次，每次15分钟。

突变体：术语“突变体”意指编码变体的多核苷酸。

核酸构建体：术语“核酸构建体”意指单链或双链的核酸分子，所述核酸分子是从天然存在的基因中分离的，或以本来不存在于自然界中的方式被修饰成包含核酸的区段，或是合成的，所述核酸分子包含一个或多个控制序列。

可操作地连接：术语“可操作地连接”意指如下的构型，在所述构型中，控制序列被放置在相对于多核苷酸的编码序列适当的位置处，使得所述控制序列引导所述编码序列的表达。

亲本或亲本脂肪酶：术语“亲本”或“亲本脂肪酶”意指进行改变以产生本发明的脂肪酶变体的脂肪酶。所述亲本可以是天然存在的(野生型)多肽或其变体或片段。此类亲本脂肪酶的实例是具有SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、或SEQ IDNO:10、或SEQ ID NO:12中给出的氨基酸序列的那些，或者其具有脂肪酶活性的片段。

序列同一性：两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的关联度通过参数“序列同一性”来描述。

出于本发明的目的，使用尼德曼-翁施算法(Needleman-Wunsch algorithm)(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]48:443-453)来确定两个氨基酸序列之间的序列同一性，所述算法如EMBOSS软件包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件(The European MolecularBiology Open Software Suite)，Rice等人,2000,TrendsGenet.[遗传学趋势]16:276-277)(优选5.0.0版本或更新版本)的尼德尔(Needle)程序中所实施的。使用的参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5、以及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。使用尼德尔标记的“最长同一性”的输出(使用非简化(-nobrief)选项获得)作为同一性百分比并且如下计算：

(同一的残基x 100)/(比对长度-比对中的空位总数)

出于本发明的目的，使用尼德曼-翁施算法(Needleman和Wunsch,1970,见上文)来确定两个脱氧核苷酸序列之间的序列同一性，所述算法如EMBOSS软件包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件，Rice等人,2000,见上文)(优选5.0.0版或更新版本)的尼德尔程序所实施的。所使用的参数是空位开放罚分10，空位延伸罚分0.5，以及EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版本)取代矩阵。使用尼德尔标记的“最长同一性”的输出(使用非简化(-nobrief)选项获得)作为同一性百分比并且如下计算：

(同一的脱氧核糖核苷酸x 100)/(比对长度-比对中的空位总数)

子序列：术语“子序列”意指具有从多肽编码序列的5'端和/或3'端缺失的一个或多个(例如，若干个)核苷酸的多核苷酸；其中所述子序列编码具有脂肪酶活性的片段。在一方面，子序列包含编码亲本脂肪酶的核苷酸1至807的数目的至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、或至少95％但小于100％。在一方面，编码亲本脂肪酶的核苷酸包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11，或者其编码具有脂肪酶活性的片段的子序列，或由其组成。

亚硫酸盐：术语“亚硫酸盐”意指含有亚硫酸盐离子[SO₃]^2-的化合物。术语“亚硫酸氢盐(bisulfite或hydrogen sulfite)”意指含有亚硫酸氢盐离子[HSO₃]^-的化合物。术语“偏亚硫酸氢盐”或“亚硫酸氢盐(disulfite)”意指含有偏亚硫酸氢盐离子[S₂O₅]^2-的化合物。出于本发明的目的，使用术语“亚硫酸盐源”覆盖提供在本发明的段落中提及的化合物的任何亚硫酸盐源。本发明包括有意添加的亚硫酸盐源。

变体：术语“变体”意指具有脂肪酶活性的、在一个或多个(例如若干个)位置包含改变(即取代、插入和/或缺失)的一个多肽。取代意指用不同的氨基酸替代占用某一位置的氨基酸；缺失意指去除占用某一位置的氨基酸；并且插入意指在邻接并且紧随占用某一位置的氨基酸之后添加氨基酸。本发明的变体具有亲本脂肪酶的多肽的至少20％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少100％的脂肪酶活性。在一方面，亲本脂肪酶包含SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、或SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12，或其具有脂肪酶活性的变体，或由其组成。

非常高严格条件：术语“非常高严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃在5X SSPE、0.3％SDS、200ug/mL剪切并变性的鲑鱼精子DNA和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在70℃使用2X SSC、0.2％SDS将运载体材料洗涤三次，每次15分钟。

非常低严格条件：术语“非常低严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃在5X SSPE、0.3％SDS、200ug/mL剪切并变性的鲑鱼精子DNA和25％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在45℃使用2X SSC、0.2％SDS将运载体材料洗涤三次，每次15分钟。

野生型脂肪酶：术语“野生型”脂肪酶意指由见于自然界中的天然存在的微生物(如细菌、酵母或丝状真菌)表达的脂肪酶。

变体命名惯例

出于本发明的目的，使用在SEQ ID NO:2的多肽来确定另一种脂肪酶中相应的氨基酸残基。将另一种脂肪酶的氨基酸序列与SEQ ID NO:2的脂肪酶进行比对，并且基于比对，使用如在EMBOSS包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件，Rice等人,2000,TrendsGenet.[遗传学趋势]16:276-277)(优选5.0.0版本或更新版本)的尼德尔程序中所实施的尼德曼-翁施算法(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]48:443-453)来确定与SEQ ID NO:2的多肽中的任何氨基酸残基相对应的氨基酸位置编号。使用的参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5、以及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。

可以通过使用若干计算机程序，使用其对应默认参数比对多个多肽序列来确定在另一种脂肪酶中的对应氨基酸残基的鉴别，所述计算机程序包括但不限于MUSCLE(通过对数预期的多序列比较；版本3.5或更新版本；Edgar,2004,Nucleic Acids Research[核酸研究]32:1792-1797)，MAFFT(版本6.857或更新版本；Katoh和Kuma,2002,Nucleic AcidsResearch[核酸研究]30:3059-3066；Katoh等人,2005,Nucleic Acids Research[核酸研究]33:511-518；Katoh和Toh,2007,Bioinformatics[生物信息学]23:372-374；Katoh等人,2009,Methods in Molecular Biology[分子生物学方法]537:39-64；Katoh和Toh,2010,Bioinformatics[生物信息学]26:1899-1900)，以及采用ClustalW(1.83或更新版本；Thompson等人，1994，Nucleic Acids Research[核酸研究]22:4673-4680)的EMBOSS EMMA。

当其他酶与SEQ ID NO:2的多肽相背离这样使得传统的基于序列的比较方法不能检测其关系时(Lindahl和Elofsson,2000,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]295:613-615)，可使用其他成对序列比较算法。在基于序列的搜索中较高的敏感度可使用搜索程序来获得，所述搜索程序利用多肽家族的概率表现(谱)来搜索数据库。例如，PSI-BLAST程序通过迭代数据库搜索过程来产生多个谱，并且能够检测远距离同源物(Atschul等人,1997,Nucleic Acids Res.[核酸研究]25:3389-3402)。如果多肽的家族或超家族具有在蛋白结构数据库中的一个或多个代表，可以实现甚至更高的敏感度。程序如GenTHREADER(Jones,1999,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]287:797-815；McGuffin和Jones,2003,Bioinformatics[生物信息学]19:874-881)利用来自多种来源(PSI-BLAST、二级结构预测、结构比对谱、以及溶剂化势)的信息作为预测查询序列的结构折叠的神经网络的输入。类似地，Gough等人,2000,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]313:903-919的方法可用于将未知结构的序列与存在于SCOP数据库中的超家族模型进行比对。这些比对进而可以用于产生多肽的同源性模型，并且使用出于所述目的而开发的多种工具可以评估此类模型的准确度。

对于已知结构的蛋白质，若干工具和资源可用于检索并产生结构比对。例如，蛋白质的SCOP超家族已经在结构上进行比对，并且那些比对是可访问且可下载的。可以使用多种算法如距离比对矩阵(Holm和Sander,1998,Proteins[蛋白质]33:88-96)或组合延伸(Shindyalov和Bourne,1998,Protein Engineering[蛋白质工程]11:739-747)比对两种或更多种蛋白质结构，并且这些算法的实施可另外用于查询具有感兴趣结构的结构数据库，以发现可能的结构同源物(例如，Holm和Park,2000,Bioinformatics[生物信息学]16:566-567)。

在描述本发明的变体中，为了便于参考，对以下所述的命名法进行了改编。采用了已接受的IUPAC单字母或三字母的氨基酸缩写。

取代.对于氨基酸取代，使用以下命名法：原始氨基酸、位置、被取代的氨基酸。因此，将在位置226处的苏氨酸被丙氨酸取代表示为“Thr226Ala”或“T226A”。多个突变通过加号(“+”)分开，例如“Gly205Arg+Ser411Phe”或“G205R+S411F”代表在位置205和位置411处的甘氨酸(G)和丝氨酸(S)分别被精氨酸(R)和苯丙氨酸(F)取代。

缺失.对于氨基酸缺失，使用以下命名法：原始氨基酸、位置、^*。因此，将在位置195处的甘氨酸的缺失表示为“Gly195*”或“G195*”。多个缺失由加号(“+”)分开，例如，“Gly195*+Ser411*”或“G195*+S411*”。

插入.对于氨基酸插入，使用以下命名法：原始氨基酸、位置、原始氨基酸、插入的氨基酸。因此，将在位置195处的甘氨酸之后插入赖氨酸表示为“Gly195GlyLys”或“G195GK”。多个氨基酸的插入被表示为[原始氨基酸、位置、原始氨基酸、插入的氨基酸#1、插入的氨基酸#2；等]。例如，将在位置195处的甘氨酸之后插入赖氨酸和丙氨酸表示为“Gly195GlyLysAla”或“G195GKA”。

在此类情况下，通过将小写字母添加至在所插入的一个或多个氨基酸残基之前的氨基酸残基的位置编号而对所插入的一个或多个氨基酸残基进行编号。在以上实例中，序列因此会是：

<u>亲本：</u>	<u>变体：</u>
		195	195 195a 195b
G	G-K-A

多种改变.包含多种改变的变体由加号(“+”)分开，例如，“Arg170Tyr+Gly195Glu”或“R170Y+G195E”代表在位置170和位置195处的精氨酸和甘氨酸分别被酪氨酸和谷氨酸取代。多个变体也可以被披露为例如“R170Y G195E”(即，在改变之间没有“+”)。

不同改变.在可于一个位置处引入不同改变的情况下，不同的改变由逗号分开，例如，“Arg170Tyr,Glu”代表用酪氨酸或谷氨酸取代在位置170处的精氨酸。因此，“Tyr167Gly,Ala+Arg170Gly,Ala”表示以下变体：

“Tyr167Gly+Arg170Gly”、“Tyr167Gly+Arg170Ala”、“Tyr167Ala+Arg170Gly”、和“Tyr167Ala+Arg170Ala”。

具体实施方式

本发明涉及一种组合物，所述组合物包含：(a)亚硫酸盐源，和(b)亲本脂肪酶的脂肪酶变体；以及所述组合物用于清洁例如表面的用途。本发明还涉及脂肪酶变体、编码所述变体的多核苷酸；包含所述多核苷酸的核酸构建体、载体、和宿主细胞；以及产生所述变体的方法。

组合物

本发明提供了组合物，所述组合物包含：

(a)亚硫酸盐源；

其中在半胱氨酸桥的20埃

在实施例中，亚硫酸盐源选自亚硫酸盐，包括亚硫酸钠、亚硫酸钾、亚硫酸钙；亚硫酸氢盐，如亚硫酸氢钾、亚硫酸氢钠、亚硫酸氢钙；偏亚硫酸氢盐，如偏亚硫酸氢钾、偏亚硫酸氢钠、偏亚硫酸氢钙；或其任何组合。

在实施例中，亚硫酸盐(为SO₃ ^2-)或偏亚硫酸氢盐(为S₂O₅ ^2-)的量的范围为从0,005wt％至5wt％，如从0,01wt％至3wt％、如从0.1wt％至2wt％、如从0.2wt％至1wt％、如从0.4wt％至0.6wt％、如从0.45wt％至0.55wt％、如0.005wt％、如0,01wt％、如0.1wt％、如0.25wt％、如0.5wt％，或这些范围或值的任何组合。

在实施例中，本发明的组合物包含脂肪酶变体，所述脂肪酶变体在对应于SEQ IDNO:2的残基15、23、35、37、39、40、42、101、105、106、184、267的位置处包含一个或多个(例如若干个)取代。

在实施例中，本发明的组合物中的变体包含对应于以下中一个或多个的取代：SEQID NO:2的Q15D、E，G23D、E，T35D、E，T37D、E，N39D、E，A40D、E，P42D、E，N101D、E，S105D、E，G106D、E，F184D、E，或T267D、E。

在实施例中，在半胱氨酸桥的20埃

内的亲本脂肪酶中的氨基酸被选自D或E的带负电荷的氨基酸替代。

在一方面，亲本脂肪酶是SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、或SEQ ID NO:12。

在实施例中，本发明的组合物包含示为SEQ ID NO:2的亲本脂肪酶的脂肪酶变体，或与所述亲本脂肪酶具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、但小于100％序列同一性的脂肪酶的脂肪酶变体，并且在对应于SEQ ID NO:2的氨基酸残基15、23、35、37、39、40、42、101、105、106、184、267的位置处包含一个或多个(例如若干个)取代。

在实施例中，亲本脂肪酶与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、或SEQ ID NO:12具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性。

在实施例中，亲本脂肪酶的变体选自由以下组成的组：

(a)由以下多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸在低严格条件、中严格条件、中-高严格条件、高严格条件或非常高严格条件下与(i)SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、或SEQ ID NO:11的多肽编码序列，或(ii)(i)的全长互补序列杂交；

(b)由以下多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、或SEQ ID NO:11的多肽编码序列具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性；和

(c)(a)或(b)的多肽的片段，特别是SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQID NO:8、SEQ ID NO:10、或SEQ ID NO:12的多肽的片段，所述片段具有脂肪酶活性。

在另一个实施例中，本发明的组合物中包含的变体包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多个取代。

在一方面，本发明涉及包括脂肪酶变体的组合物，所述变体进一步包含与选自以下的位置中的任一个对应的一个或多个(例如若干个)取代：SEQ ID NO:2的4、27、38、57、58、60、83、86、91、94、97、99、111、150、163、210、216、225、227、231、233、249、254、255、256、263、264、265、266、267、和269。在一方面，本发明涉及包括脂肪酶变体的组合物，所述变体进一步包含与选自以下的位置中的任一个对应的一个或多个(例如若干个)取代：SEQ IDNO:2的4V、27R、38A、57G、58A、60S、83T、86V、91A/N/Q、94K/R、97M、99K、111A、150G、163K、210K/Q、216P、225R、227G、231R、233R、249R、254S、255A、256K/T/V、263Q、264A、265T、266D、267A、和269N。

在另一个实施例中，本发明的组合物中包含的变体还包含与以下组对应的一组取代(使用SEQ ID NO:2进行编号)，所述组由以下组成：

在一方面，与亲本脂肪酶相比，所述变体具有增加的稳定性。在一方面，稳定性是在亚硫酸盐源的存在下的稳定性、在洗涤剂组合物中的稳定性、在包含亚硫酸盐源的洗涤剂组合物中的稳定性、在储存条件下的稳定性、在亚硫酸盐源的存在下在储存条件下的稳定性、热稳定性、以及在亚硫酸盐源的存在下的热稳定性。

下文阐述的组合物组分的非限制性列表适合用于所述组合物中，并且本文的方法可以合意地并入本发明的某些方面，例如用以辅助或增强清洁性能，用于处理有待清洁的底物，或用以修饰所述组合物的美感，就像与香料、着色剂、染料或类似物一起的情况。掺入任何组合物中的任何此类组分的水平是除了先前引用的用于掺入的任何材料之外的。这些另外的组分的精确性质及其掺入水平将取决于组合物的物理形式和将在其中使用组合物的清洁操作的性质。尽管根据具体的功能性对以下提及的组分由通用标题进行分类，但是这并不被解释为限制，因为如将被普通技术人员所理解，组分可以包含另外的功能性。

除非另外表明，否则以百分比计的量是按所述组合物的重量计(wt％)。适合的组分材料包括但不限于表面活性剂、助洗剂、螯合试剂、染料转移抑制剂、分散剂、酶、以及酶稳定剂、催化材料、漂白活化剂、过氧化氢、过氧化氢源、预成形的过酸、聚合物分散剂、粘土去除/抗再沉积剂、增亮剂、泡沫抑制剂、染料、调色染料、香料、香料递送系统、结构弹力剂、织物软化剂、运载体、水溶助剂、加工助剂、溶剂、抗氧化剂(例如亚硫酸盐源)、碱、防腐剂和/或颜料。除了以下披露内容，此类其他组分的适合的实例以及使用水平发现于US5576282、US 6306812、和US 6326348中，将其通过引用特此结合。

因此，在某些方面，本发明不包含以下附属材料中的一种或多种：表面活性剂、皂、助洗剂、螯合试剂、染料转移抑制剂、分散剂、另外的酶、酶稳定剂、催化材料、漂白活化剂、过氧化氢、过氧化氢源、预形成的过酸、聚合物分散剂、粘土去除/抗再沉积剂、增亮剂、泡沫抑制剂、染料、香料、香料递送系统、结构弹力剂、织物软化剂、运载体、水溶助剂、加工助剂、溶剂和/或颜料。然而，当一种或多种组分存在时，这样的一种或多种组分可以如下文详述的那样存在：

表面活性剂-根据本发明的组合物可以包含表面活性剂或表面活性剂体系，其中所述表面活性剂可以选自非离子型表面活性剂、阴离子型表面活性剂、阳离子型表面活性剂、两性表面活性剂、兼性离子型表面活性剂、半极性非离子型表面活性剂及其混合物。当存在时，表面活性剂典型地以从0.1wt％至60wt％、从0.2wt％到40wt％、从0.5wt％至30wt％、从1wt％至50wt％、从1wt％至40wt％、从1wt％至30wt％、从1wt％至20wt％、从3wt％至10wt％、从3wt％至5wt％、从5wt％至40wt％、从5wt％至30wt％、从5wt％至15wt％、从3wt％至20wt％、从3wt％至10wt％、从8wt％至12wt％、从10wt％至12wt％、从20wt％至25wt％或从25wt％-60wt％的水平存在。

适合的阴离子去污表面活性剂包括硫酸盐和磺酸盐去污表面活性剂。

适合的磺酸盐去污表面活性剂包括烷基苯磺酸盐，在一方面为C_10-13烷基苯磺酸盐。适合的烷基苯磺酸盐(LAS)可以通过使可商购的直链烷基苯(LAB)磺化而得到；适合的LAB包括低2-苯基LAB，如

或

其他适合的LAB包括高2-苯基LAB，如

适合的阴离子去污表面活性剂是通过DETAL催化工艺获得的烷基苯磺酸盐，但其他合成路线(如HF)也可以是适合的。在一方面，使用LAS的镁盐。

适合的硫酸盐去污表面活性剂包括烷基硫酸盐，在一方面为C_8-18烷基硫酸盐，或主要为C₁₂烷基硫酸盐。

另外的适合的硫酸盐去污表面活性剂是烷基烷氧基化硫酸盐，在一方面为烷基乙氧基化硫酸盐，在一方面为C_8-18烷基烷氧基化硫酸盐，在一方面为C_8-18烷基乙氧基化硫酸盐，典型地烷基烷氧基化硫酸盐具有从0.5至20或从0.5至10的平均烷氧基化度，典型地烷基烷氧基化硫酸盐是C_8-18烷基乙氧基化硫酸盐，具有0.5至10、从0.5至7、从0.5至5或从0.5至3的平均乙氧基化度。

烷基硫酸盐、烷基烷氧基化硫酸盐和烷基苯磺酸盐可以是直链或支链的、取代或未取代的。

去污表面活性剂可以是中链分支的去污表面活性剂，在一方面为中链分支的阴离子去污表面活性剂，在一方面为中链分支的烷基硫酸盐和/或中链分支的烷基苯磺酸盐，例如中链分支的烷基硫酸盐。在一方面，中链分支是C_1-4烷基，典型地为甲基和/或乙基。

阴离子型表面活性剂的非限制性实例包括硫酸盐和磺酸盐，特别地，直链烷基苯磺酸盐(LAS)、LAS的异构体、支链烷基苯磺酸盐(BABS)、苯基链烷磺酸盐、α-烯烃磺酸盐(AOS)、烯烃磺酸盐、链烯烃磺酸盐、链烷-2,3-二基双(硫酸盐)、羟基链烷磺酸盐以及二磺酸盐、烷基硫酸盐(AS)(如十二烷基硫酸钠(SDS))、脂肪醇硫酸盐(FAS)、伯醇硫酸盐(PAS)、醇醚硫酸盐(AES或AEOS或FES，也被称为醇乙氧基硫酸盐或脂肪醇醚硫酸盐)、仲链烷磺酸盐(SAS)、石蜡烃磺酸盐(PS)、酯磺酸盐、磺化的脂肪酸甘油酯、α-磺酸基脂肪酸甲酯(α-SFMe或SES)(包括甲酯磺酸盐(MES))、烷基琥珀酸或烯基琥珀酸、十二烯基/十四烯基琥珀酸(DTSA)、氨基酸的脂肪酸衍生物、磺酸基琥珀酸或皂的二酯和单酯、及其组合。阴离子型表面活性剂可以作为相应的酸或作为盐进行添加，或者可以用作具有乙醇胺，例如，单乙醇胺-直链烷基苯磺酸盐(MEA-LAS)的衍生物。

适合的非离子去污表面活性剂选自由以下组成的组：C₈-C₁₈烷基乙氧基化物，例如

C₆-C₁₂烷基苯酚烷氧基化物，其中所述烷氧基化物单元可以是乙烯氧基单元，丙烯氧基单元或其混合物；C₁₂-C₁₈醇和C₆-C₁₂烷基苯酚与环氧乙烷/环氧丙烷嵌段聚合物的缩合物，例如

C₁₄-C₂₂中链分支的醇；C₁₄-C₂₂中链分支的烷基烷氧基化物，典型地具有从1至30的平均烷氧基化度；烷基多糖，在一方面为烷基多糖苷；多羟基脂肪酸酰胺；醚封端的聚(烷氧基化)醇表面活性剂；及其混合物。

适合的非离子去污表面活性剂包括烷基多糖苷和/或烷基烷氧基化醇。

在一方面，非离子去污表面活性剂包括烷基烷氧基化醇，在一方面为C_8-18烷基烷氧基化醇，例如C_8-18烷基乙氧基化醇，所述烷基烷氧基化醇可以具有从1至50、从1至30、从1至20、或从1至10的平均烷氧基化度。在一方面，烷基烷氧基化醇可以是C_8-18烷基乙氧基化醇，具有从1至10、从1至7，更多是从1至5或从3至7的平均乙氧基化度。烷基烷氧基化醇可以是直链或支链的、以及取代或未取代的。适合的非离子型表面活性剂包括

非离子型表面活性剂的非限制性实例包括醇乙氧基化物(AE或AEO)、醇丙氧基化物、丙氧基化的脂肪醇(PFA)、烷氧基化的脂肪酸烷基酯(例如乙氧基化的和/或丙氧基化的脂肪酸烷基酯)、烷基酚乙氧基化物(APE)、壬基酚乙氧基化物(NPE)、烷基多糖苷(APG)、烷氧基化的胺、脂肪酸单乙醇酰胺(FAM)、脂肪酸二乙醇酰胺(FADA)、乙氧基化的脂肪酸单乙醇酰胺(EFAM)、丙氧基化的脂肪酸单乙醇酰胺(PFAM)、多羟基烷基脂肪酸酰胺、或葡萄糖胺的N-酰基N-烷基衍生物(葡糖酰胺(GA)、或脂肪酸葡糖酰胺(FAGA))、甲酯乙氧基化物(MEE)、连同在SPAN和TWEEN商品名下可获得的产品、及其组合。

适合的阳离子去污表面活性剂包括烷基吡啶化合物、烷基季铵化合物、烷基季鏻化合物、烷基三锍化合物及其混合物。

适合的阳离子去污表面活性剂是具有以下通式的季铵化合物：(R)(R₁)(R₂)(R₃)N⁺X^-，其中R是直链或支链的、取代或未取代的C_6-18烷基或烯基部分，R₁和R₂独立地选自甲基或乙基部分，R₃是羟基、羟甲基或羟乙基部分，X是提供电荷中性的阴离子，适合的阴离子包括卤化物，例如氯化物；硫酸盐；以及磺酸盐。适合的阳离子去污表面活性剂是单-C_6-18烷基单-羟乙基二甲基季铵氯化物。高度适合的阳离子去污表面活性剂是单-C_8-10烷基单-羟乙基二甲基季铵氯化物、单C_10-12烷基单-羟乙基二甲基季铵氯化物以及单-C₁₀烷基单-羟乙基二甲基季铵氯化物。

阳离子型表面活性剂的非限制性实例包括烷基二甲基乙醇季胺(ADMEAQ)、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、二甲基二硬脂酰氯化铵(DSDMAC)、以及烷基苄基二甲基铵、烷基季铵化合物、烷氧基化季铵(AQA)化合物、酯季铵及其组合。

适合的两性表面活性剂/兼性离子型表面活性剂包括氧化胺和甜菜碱(如烷基二甲基甜菜碱、磺基甜菜碱)、或其组合。本发明的胺中和的阴离子型表面活性剂-阴离子型表面活性剂以及辅助的阴离子辅助表面活性剂可以按酸形式存在，并且所述酸形式可以被中和以形成希望用于本发明的洗涤剂组合物的表面活性剂盐。典型的用于中和的试剂包括金属反离子碱，例如氢氧化物，如NaOH或KOH。用于中和本发明的阴离子型表面活性剂和处于其酸形式的辅助阴离子型表面活性剂或助表面活性剂的另外优选的试剂包括氨、胺或烷醇胺。优选烷醇胺。适合的非限制性实例包括单乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、以及其他本领域中已知的直链或支链的烷醇胺；例如，高度优选的烷醇胺包括2-氨基-1-丙醇、1-氨基丙醇、单异丙醇胺、或1-氨基-3-丙醇。胺中和可以进行到完全或部分的程度，例如，阴离子型表面活性剂混合物的部分可以被钠或钾中和，并且阴离子型表面活性剂混合物的部分可以被胺或烷醇胺中和。

半极性表面活性剂的非限制性实例包括氧化胺(AO)，如烷基二甲胺氧化物。

包含一种或多种阴离子型表面活性剂、和另外一种或多种非离子型表面活性剂、以及任选的如阳离子型表面活性剂的另外表面活性剂的混合物的表面活性剂系统可能是优选的。优选的阴离子与非离子型表面活性剂的重量比是至少2:1、或至少1:1至1:10。

在一方面，表面活性剂系统可包含由式A和式B表示的类异戊二烯表面活性剂的混合物：

其中Y是CH₂或无，并且Z可如此选择以使得所得的表面活性剂是选自以下表面活性剂：烷基羧酸酯表面活性剂、烷基多烷氧基表面活性剂、烷基阴离子型多烷氧基硫酸酯表面活性剂、烷基甘油酯磺酸酯表面活性剂、烷基二甲基氧化胺表面活性剂、基于烷基多羟基的表面活性剂、烷基磷酸酯表面活性剂、烷基甘油磺酸酯表面活性剂、烷基多葡糖酸酯表面活性剂、烷基多磷酸酯表面活性剂、烷基膦酸酯表面活性剂、烷基多糖苷表面活性剂、烷基单糖苷表面活性剂、烷基二糖苷表面活性剂、烷基磺基琥珀酸酯表面活性剂、烷基二硫酸酯表面活性剂、烷基二磺酸酯表面活性剂、烷基磺化琥珀酰胺酸酯表面活性剂、烷基葡萄糖酰胺表面活性剂、烷基牛磺酸酯表面活性剂、烷基肌氨酸酯表面活性剂、烷基甘氨酸酯表面活性剂、烷基羟乙基磺酸酯表面活性剂、烷基二链烷醇酰胺表面活性剂、烷基单链烷醇酰胺表面活性剂、烷基单链烷醇酰胺硫酸酯表面活性剂、烷基二羟基乙酰胺表面活性剂、烷基二羟基乙酰胺硫酸酯表面活性剂、烷基甘油酯表面活性剂、烷基甘油酯硫酸酯表面活性剂、烷基甘油醚表面活性剂、烷基甘油醚硫酸酯表面活性剂、烷基甲基酯磺酸酯表面活性剂、烷基多甘油醚表面活性剂、烷基多甘油醚硫酸酯表面活性剂、烷基山梨聚糖酯表面活性剂、烷基氨基烷烃磺酸酯表面活性剂、烷基酰胺丙基甜菜碱表面活性剂、基于烷基烯丙基化季铵盐的表面活性剂、基于烷基单羟基烷基-二-烷基化季铵盐的表面活性剂、基于烷基二-羟基烷基单烷基季铵盐的表面活性剂、烷基化季铵盐表面活性剂、烷基三甲基铵季铵盐表面活性剂、基于烷基多羟基烷基氧基丙基季铵盐的表面活性剂、烷基甘油酯季铵盐表面活性剂、烷基乙二醇胺季铵盐表面活性剂、烷基单甲基二羟基乙基季铵表面活性剂、烷基二甲基单羟基乙基季铵表面活性剂、烷基三甲基铵表面活性剂、基于烷基咪唑啉的表面活性剂、烯烃-2-基-琥珀酸酯表面活性剂、烷基a-磺化羧酸表面活性剂、烷基a-磺化羧酸烷基酯表面活性剂、α烯烃磺酸酯表面活性剂、烷基苯酚乙氧基化物表面活性剂、烷基苯磺酸酯表面活性剂、烷基磺基甜菜碱表面活性剂、烷基羟基磺基甜菜碱表面活性剂、烷基铵基羧酸甜菜碱表面活性剂、烷基蔗糖酯表面活性剂、烷基烷醇酰胺表面活性剂、烷基二(聚氧化乙烯)单烷基铵表面活性剂、烷基单(聚氧化乙烯)二烷基铵表面活性剂、烷基苄基二甲基铵表面活性剂、烷基氨基丙酸酯表面活性剂、烷基酰胺丙基二甲胺表面活性剂、或其混合物；并且如果Z是带电部分，则Z通过适合的金属或有机反离子被电荷平衡。适合的反离子包括金属反离子、胺、或烷醇胺，例如C1-C6烷醇铵。更确切地说，适合的反离子包括Na+、Ca+、Li+、K+、Mg+，例如单乙醇胺(MEA)、二乙醇胺(DEA)、三乙醇胺(TEA)、2-氨基-l-丙醇、1-氨基丙醇、甲基二乙醇胺、二甲基乙醇胺、单异丙醇胺、三异丙醇胺、l-氨基-3-丙醇、或其混合物。在一方面，组合物含有从5％至97％的一种或多种非类异戊二烯表面活性剂；和一种或多种辅助清洁添加剂；其中式A的表面活性剂与式B的表面活性剂的重量比为50:50至95:5。

皂-本文的组合物可以含有皂。不受理论的限制，可令人希望的是包括皂，因为它部分充当表面活性剂并且部分充当助洗剂，并且可用于抑制泡沫，并且此外，可以有利地与组合物的多种阳离子化合物相互作用以增强用本发明组合物处理的纺织品织物的柔软性。可以利用本领域中已知的用于在衣物洗涤洗涤剂中使用的任何皂。在一方面，组合物含有从0wt％至20wt％、从0.5wt％至20wt％、从4wt％至10wt％、或从4wt％至7wt％的皂。在一方面，组合物含有从0wt％至5wt％；从0wt％至2wt％、或从0wt％至1wt％。

本文有用的皂的实例包括油酸皂、棕榈酸皂、棕榈仁脂肪酸皂及其混合物。典型的皂处于具有不同链长和取代度的脂肪酸皂混合物的形式。一种这样的混合物是拔顶棕榈仁脂肪酸。

在一方面，皂选自游离脂肪酸。适合的脂肪酸是饱和和/或不饱和的并且可以从天然来源如植物或动物酯(例如，棕榈仁油、棕榈油、椰子油、巴巴苏油、红花油、妥尔油、蓖麻油、牛油和鱼油、油脂、及其混合物)中获得，或合成地制备(例如，经由石油的氧化或者经由费托法(Fisher Tropsch process)氢化一氧化碳)。

用于在本发明组合物中使用的适合的饱和脂肪酸的实例包括癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、花生酸和山萮酸。适合的不饱和脂肪酸种类包括：棕榈油酸、油酸、亚油酸、亚麻酸和蓖麻油酸。优选的脂肪酸的实例是饱和Cn脂肪酸、饱和Ci₂-Ci₄脂肪酸、和饱和或不饱和的Cn至Ci₈脂肪酸及其混合物。

当存在时，织物软化阳离子辅助表面活性剂与脂肪酸的重量比优选地是从约1:3至约3:1，更优选地从约1:1.5至约1.5:1，最优选地约1:1。

本文的皂和非皂阴离子型表面活性剂的水平是以酸式基础指定的按洗涤剂组合物的重量计的百分比。然而，正如本领域中通常理解的，在实践中使用钠、钾或链烷醇铵碱如氢氧化钠或单乙醇胺中和阴离子型表面活性剂和皂。

水溶助剂–本发明的组合物可以包含一种或多种水溶助剂。水溶助剂是如下化合物，所述化合物在水溶液中溶解疏水性化合物(或相反地，在非极性环境中溶解极性物质)。典型地，水溶助剂具有亲水和疏水两种特征(所谓的两亲特性，如由表面活性剂已知的)；然而，水溶助剂的分子结构一般不利于自发性自聚集，参见例如通过Hodgdon和Kaler(2007)，Current Opinion in Colloid&Interface Science[胶体和界面科学新见]12:121-128的综述。水溶助剂并不显示临界浓度，高于所述浓度就会发生如对表面活性剂而言所发现的自聚集以及脂质形成胶束、薄层或其他很好地定义的中间相。相反，许多水溶助剂显示连续类型的聚集过程，在所述过程中聚集物的大小随着浓度增加而增长。然而，许多水溶助剂改变了包含极性和非极性特征的物质的系统(包括水、油、表面活性剂、和聚合物的混合物)的相行为、稳定性、和胶体特性。水溶助剂常规地在从药学、个人护理、食品到技术应用的各个产业中应用。水溶助剂在洗涤剂组合物中的使用允许例如更浓的表面活性剂配制品(如在通过去除水而压缩液体洗涤剂的过程中)而不引起不希望的现象，如相分离或高粘度。

洗涤剂可以含有从0至10wt％，如从0至5wt％、0.5wt％至5wt％、或从3wt％至5wt％的水溶助剂。可以利用本领域中已知的用于在洗涤剂中使用的任何水溶助剂。水溶助剂的非限制性实例包括苯磺酸钠、对甲苯磺酸钠(STS)、二甲苯磺酸钠(SXS)、枯烯磺酸钠(SCS)、伞花烃磺酸钠、氧化胺、醇和聚乙二醇醚、羟基萘甲酸钠、羟基萘磺酸钠、乙基己基磺酸钠及其组合。

助洗剂-本发明的组合物可以包含一种或多种助洗剂、共助洗剂、助洗剂系统或其混合物。当使用助洗剂时，清洁组合物将典型地包含从0至65wt％、至少1wt％、从2wt％至60wt％或从5wt％至10wt％的助洗剂。在洗涤餐具清洁组合物中，助洗剂的水平典型地是40wt％至65wt％或50wt％至65wt％。所述组合物可以是基本上不含助洗剂；基本上不含意指“没有有意添加的”沸石和/或磷酸盐。典型的沸石助洗剂包括沸石A、沸石P和沸石MAP。典型的磷酸盐助洗剂是三聚磷酸钠。

助洗剂和/或共助洗剂可以具体是形成具有Ca和Mg的水溶性络合物的螯合试剂。可以使用本领域中已知用于在洗涤剂中使用的任何助洗剂和/或共助洗剂。助洗剂的非限制性实例包括沸石、二磷酸盐(焦磷酸盐)、三磷酸盐例如三磷酸钠(STP或STPP)、碳酸盐例如碳酸钠、可溶性硅酸盐例如偏硅酸钠、层状硅酸盐(例如来自赫斯特公司(Hoechst)的SKS-6)、乙醇胺(例如2-氨基乙-1-醇(MEA)、亚氨基二乙醇(DEA)和2,2’,2”-次氮基三乙醇(TEA))、以及羧甲基菊粉(CMI)、及其组合。

清洁组合物可以单独地包括共助洗剂，或与助洗剂(例如沸石助洗剂)组合。共助洗剂的非限制性实例包括聚丙烯酸酯的均聚物或其共聚物，如聚(丙烯酸)(PAA)或共聚(丙烯酸/马来酸)(PAA/PMA)。另外的非限制性实例包括柠檬酸盐、螯合剂(如氨基羧酸盐、氨基多羧酸盐和磷酸盐)、以及烷基琥珀酸或烯基琥珀酸。另外的具体实例包括2,2’,2”-次氨基三乙酸(NTA)、乙二胺四乙酸(EDTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、亚氨二琥珀酸(IDS)、乙二胺-N,N'-二琥珀酸(EDDS)、甲基甘氨酸二乙酸(MGDA)、谷氨酸-N,N-二乙酸(GLDA)、1-羟基乙烷-1,1-二基双(膦酸)(HEDP)、乙二胺四(亚甲基)四(膦酸)(EDTMPA)、二亚乙基三胺五(亚甲基)五(膦酸)(DTPMPA)、N-(2-羟乙基)亚氨基二乙酸(EDG)、天冬氨酸-N-单乙酸(ASMA)、天冬氨酸-N,N-二乙酸(ASDA)、天冬氨酸-N-单丙酸(ASMP)、亚氨二琥珀酸(IDA)、N-(2-磺甲基)天冬氨酸(SMAS)、N-(2-磺乙基)天冬氨酸(SEAS)、N-(2-磺甲基)谷氨酸(SMGL)、N-(2-磺乙基)谷氨酸(SEGL)、N-甲基亚氨基二乙酸(MIDA)、α-丙氨酸-N,N-二乙酸(α-ALDA)、丝氨酸-N,N-二乙酸(SEDA)、异丝氨酸-N,N-二乙酸(ISDA)、苯丙氨酸-N,N-二乙酸(PHDA)、邻氨基苯甲酸-N,N-二乙酸(ANDA)、对氨基苯磺酸-N、N-二乙酸(SLDA)、牛磺酸-N,N-二乙酸(TUDA)和磺甲基-N,N-二乙酸(SMDA)、N-(羟乙基)-亚乙基二胺三乙酸(HEDTA)、二乙醇甘氨酸(DEG)、二亚乙基三胺五(亚甲基膦酸)(DTPMP)、氨基三(亚甲基膦酸)(ATMP)、及其组合和盐。另外的示例性助洗剂和/或共助洗剂描述于例如WO09/102854、US 5977053中。

在一方面，本发明涉及包含亲本脂肪酶的脂肪酶变体的组合物，其中所述变体具有脂肪酶活性，在对应于亲本脂肪酶的位置15、23、35、37、39、40、42、101、105、106、184、267的位置处包含取代，所述组合物包含高达10wt％或15wt％硅铝酸盐(无水的基础上)和/或磷酸盐助洗剂，所述组合物具有大于4或7.5的储备碱度。

在一方面，亲本脂肪酶是SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、或SEQ ID NO:12。在一方面，取代选自亲本脂肪酶(特别是SEQ ID NO:2)的位置Q15D、E，G23,D、E，T35D、E，T37D、E，N39D、E，A40D、E，P42D、E，N101D、E，S105D、E，G106D、E，F184D、E或T267D、E。

如本文使用的，术语“储备碱度”是即为了计算储备碱度通过用盐酸滴定组合物的1％(w/v)溶液至pH 7.5所确定的所述组合物的缓冲能力的度量(g/NaOH/100g组合物)。可以如在WO 2006/090335中第9页上所披露的计算储备碱度。

在一方面，本发明涉及包括脂肪酶变体的组合物，所述变体进一步包含与选自以下的位置中的任一个对应的一个或多个(例如若干个)取代：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、或SEQ ID NO:12的4、27、38、57、58、60、83、86、91、94、97、99、111、150、163、210、216、225、227、230、231、233、249、250、254、255、256、263、264、265、266、267、和269。在一方面，本发明涉及包括脂肪酶变体的组合物，所述变体进一步包含与选自以下的位置中的任一个对应的一个或多个(例如若干个)取代：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、或SEQ ID NO:12的4V、27R、38A、57G、58A、60S、83T、86V、91A/N/Q、94K/R、97M、99K、111A、150G、163K、210K/Q、216P、225R、227G、231R、233R、249R、254S、255A、256K/T/V、263Q、264A、265T、266D、267A、和269N。

螯合试剂和晶体生长抑制剂-本文的组合物可以含有螯合试剂和/或晶体生长抑制剂。适合的分子包括铜、离子和/或锰螯合试剂及其混合物。适合的分子包括DTPA(二亚乙基三胺五乙酸)、HEDP(羟基乙烷二膦酸)、DTPMP(二亚乙基三胺五(亚甲基膦酸))、1,2-二羟基苯-3,5-二磺酸二钠盐水合物、乙二胺、二亚乙基三胺、乙二胺二琥珀酸(EDDS)、乙二胺四乙酸(EDTA)、N-羟基乙基乙二胺三乙酸(HEDTA)、三亚乙基四胺六乙酸(TTHA)、N-羟基乙基亚氨基二乙酸(HEIDA)、二羟基乙基甘氨酸(DHEG)、亚乙基二胺四丙酸(EDTP)、羧甲基菊粉(CMI)以及2-膦酰基丁烷1,2,4-三羧酸(

AM)及其衍生物。典型地，所述组合物可以包含从0.005wt％至15wt％，或从3.0wt％至10wt％的螯合试剂或晶体生长抑制剂。

漂白组分-适合用于掺入本发明的方法和组合物中的漂白组分包括多于一种漂白组分中的一种或混合物。适合的漂白组分包括漂白催化剂、光漂白剂、漂白活化剂、过氧化氢、过氧化氢源、预形成的过酸及其混合物。通常，当使用漂白组分时，本发明的组合物可以包含从0至30wt％、从0.00001wt％至90wt％、0.0001wt％至50wt％、从0.001wt％至25wt％或从1wt％至20wt％。适合的漂白组分的实例包括：

(1)预形成的过酸：适合的预形成的过酸包括但不限于选自由以下组成的组的化合物：预形成的过氧酸或其盐，典型地是过氧羧酸或其盐、或过氧硫酸或其盐。

预形成的过氧酸或其盐优选是过氧羧酸或其盐，典型地具有对应于以下化学式的化学结构：

其中：R¹⁴选自烷基、芳烷基、环烷基、芳基或杂环基团；R¹⁴基团可以是直链或支链的、取代或未取代的；且Y是实现电荷中性的任何适合的反离子，优选地，Y选自氢、钠或钾。优选地，R¹⁴是直链或支链的、取代或未取代的C_6-9烷基。优选地，过氧酸或其盐选自过氧己酸、过氧庚酸、过氧辛酸、过氧壬酸、过氧癸酸、及其盐，或其任何组合。特别优选的过氧酸是邻苯二甲酰亚胺基-过氧基-链烷酸，特别是ε-邻苯二甲酰亚胺基过氧基己酸(PAP)。优选地，过氧酸或其盐具有从30℃至60℃范围内的熔点。

预成形的过氧酸或其盐还可以是过氧硫酸或其盐，典型地具有对应于以下化学式的化学结构：

其中：R¹⁵选自烷基、芳烷基、环烷基、芳基或杂环基团；R¹⁵基团可以是直链或支链的、取代或未取代的；并且Z是达到电荷中性的任何适合的反离子，优选地，Z选自氢、钠或钾。优选地，R¹⁵是直链或支链的、取代或未取代的C_6-9烷基。优选地，此类漂白组分可以按从0.01wt％至50wt％或从0.1wt％至20wt％的量存在于本发明的组合物中。

(2)过氧化氢源包括例如无机过氧化氢合物盐，包括碱金属盐，如过硼酸盐(通常是一水合物或四水合物)、过碳酸盐、过硫酸盐、过磷酸盐、过硅酸盐的钠盐及其混合物。在本发明的一方面，无机过氧化氢合物盐是例如选自由以下组成的组的那些：过硼酸盐、过碳酸盐的钠盐及其混合物。当使用时，无机过氧化氢合物盐典型地以整体组合物的0.05wt％至40wt％或1wt％至30wt％的量存在并且典型地被掺入此类组合物中作为可以被涂覆的结晶固体。适合的包衣包括：无机盐，例如碱金属硅酸盐、碳酸盐或硼酸盐或其混合物，或有机材料，例如水溶性或水分散性聚合物、蜡、油或脂肪皂。优选地，此类漂白组分可以按0.01wt％至50wt％、或0.1wt％至20wt％的量存在于本发明的组合物中。

(3)术语漂白活化剂本文意指与过氧化氢反应以经由过水解反应形成过酸的化合物。以此方式形成的过酸构成活化的漂白剂。本文有待使用的适合的漂白活化剂包括属于酯、酰胺、酰亚胺或酸酐类别的那些。适合的漂白活化剂是具有R-(C＝O)-L的那些，其中R是烷基基团(优选是支链的)，当所述漂白活化剂是疏水的时候，具有从6个至14个碳原子，或从8个至12个碳原子，并且当所述漂白活化剂是亲水的时，具有小于6个碳原子或小于4个碳原子；并且L为离去基团。适合的离去基团的实例是苯甲酸及其衍生物-尤其是苯磺酸盐。适合的漂白活化剂包括十二酰氧基苯磺酸盐、癸酰氧基苯磺酸盐、癸酰氧基苯甲酸或其盐、3,5,5-三甲基己酰氧基苯磺酸盐、四乙酰基乙二胺(TAED)、4-[(3,5,5-三甲基己酰基)氧基]苯-1-磺酸钠(ISONOBS)、4-(十二酰基氧基)苯-1-磺酸盐(LOBS)、4-(癸酰基氧基)苯-1-磺酸盐、4-(癸酰基氧基)苯甲酸盐(DOBS或DOBA)、4-(壬酰基氧基)苯-1-磺酸盐(NOBS))、和/或披露于WO 98/17767中的那些。漂白活化剂的家族披露于EP 624154中并且在那个家族中特别优选的是乙酰柠檬酸三乙酯(ATC)。ATC或短链甘油三酸酯(像三醋汀)具有以下优点，它是环境友好的。此外，乙酰柠檬酸三乙酯和三醋精在存储时在产品中具有良好的水解稳定性，并且是有效的漂白活化剂。最后，ATC是多功能的，因为在过水解反应中释放的柠檬酸盐可以作为助洗剂起作用。可替代地，漂白系统可以包含例如酰胺、酰亚胺或砜类型的过氧酸。漂白系统还可以包含过酸，如6-(苯二甲酰亚氨基)过己酸(PAP)。适合的漂白活化剂还披露于WO 98/17767中。尽管可采用任何适合的漂白活化剂，但在本发明的一个方面，本主题清洁组合物可以包含NOBS、TAED或其混合物。当存在时，基于织物及家居护理组合物，过酸和/或漂白活化剂通常以0.1wt％至60wt％、0.5wt％至40wt％或0.6wt％至10wt％的量存在于组合物中。可以将一种或多种疏水性过酸或其前体与一种或多种亲水性过酸或其前体组合使用。优选地，此类漂白组分可以按0.01wt％至50wt％或0.1wt％至20wt％的量存在于本发明的组合物中。

可以对过氧化氢源和过酸或漂白活化剂的量进行选择，以使得可用氧(来自过氧化物源)与过酸的摩尔比是从1:1至35:1，或甚至2:1至10:1。

(4)二酰基过氧化物–优选的二酰基过氧化物漂白种类包括选自具有以下通式的二酰基过氧化物的那些：R¹-C(O)-OO-(O)C-R²，其中R¹表示C₆-C₁₈烷基，优选地是包含具有至少5个碳原子的直链并且任选地包含一个或多个取代基(例如–N⁺(CH₃)₃、-COOH或-CN)和/或在烷基的相邻碳原子之间插入的一个或多个中断部分(例如-CONH-或-CH＝CH-)的C₆-C₁₂烷基基团，并且R²表示与过氧化物部分可相容的脂肪族基团，以使得R¹和R²一起包含总共8个至30个碳原子。在一个优选方面，R¹和R²是直链的未取代的C₆-C₁₂烷基链。最优选地，R¹和R²是相同的。二酰基过氧化物(其中R¹和R²均是C₆-C₁₂烷基基团)是特别优选的。优选地，R基团(R₁或R₂)中的至少一个、最优选地仅有一个在α位不含有分支的或下垂的环，或优选在α位或β位都不含有分支的或下垂的环，或最优选在α位或β位或γ位都不含有分支的或下垂的环。在一个另外优选的方面，DAP可以是不对称的，这样使得R1酰基基团优选地迅速水解以产生过酸，但是R2酰基基团的水解缓慢。

四酰基过氧化物漂白性种类优选地选自以下通式的四酰基过氧化物：R³-C(O)-OO-C(O)-(CH₂)n-C(O)-OO-C(O)-R³，其中R³表示C₁-C₉烷基或C₃-C₇基团，并且n表示从2至12或4至10(包括端值)的整数。

优选地，二酰基和/或四酰基过氧化物漂白种类以足够提供按重量计至少0.5ppm、至少10ppm、或至少50ppm的洗涤液的量存在。在优选的方面，漂白种类以足够提供按重量计从0.5ppm至300ppm、从30ppm至150ppm的洗涤液的量存在。

优选地，漂白组分包括漂白催化剂(5和6)。

(5)优选的是有机(非金属)漂白催化剂，包括能够接受来自过氧酸和/或其盐的氧原子并且将所述氧原子转移至可氧化的底物的漂白催化剂。适合的漂白催化剂包括但不限于：亚胺阳离子和聚离子；亚胺兼性离子；修饰的胺；修饰的氧化胺；N-磺酰基亚胺；N-磷酰基亚胺；N-酰基亚胺；噻二唑二氧化物；全氟亚胺；环状糖酮及其混合物。

适合的亚胺阳离子及聚离子包括但不限于，N-甲基-3,4-二氢异喹啉鎓四氟硼酸盐，如Tetrahedron[四面体](1992),49(2),423-38中所述的进行制备(参见例如化合物4，第433页)；N-甲基-3,4-二氢异喹啉鎓对甲苯磺酸盐，如US 5360569中所述的进行制备(例如第11栏，实例1)；以及正辛基-3,4-二氢异喹啉鎓对甲苯磺酸盐，如US 5360568中所述的进行制备(例如第10栏，实例3)。

适合的亚胺鎓兼性离子包括但不限于，N-(3-磺丙基)-3,4-二氢异喹啉鎓，内盐，如US 5576282中所述的进行制备(例如第31栏，实例II)；N-[2-(磺氧基)十二烷基]-3,4-二氢异喹啉鎓，内盐，如US 5817614中所述的进行制备(例如，第32栏，实例V)；2-[3-[(2-乙基己基)氧基]-2-(磺氧基)丙基]-3,4-二氢异喹啉鎓，内盐，如WO 05/047264中所述的进行制备(例如，第18页，实例8)，以及2-[3-[(2-丁基辛基)氧基]-2-(磺氧基)丙基]-3,4-二氢异喹啉鎓，内盐。

适合的修饰的胺氧转移催化剂包括但不限于1,2,3,4-四氢-2-甲基-1-异喹啉醇，其可根据Tetrahedron Letters[四面体通讯](1987),28(48),6061-6064中描述的程序制备。适合的修饰的氧化胺氧气转移催化剂包括但不限于1-羟基-N-氧代-N-[2-(磺氧基)癸基]-1,2,3,4-四氢异喹啉钠。

适合的N-磺酰基亚胺氧转移催化剂包括但不限于3-甲基-1,2-苯并异噻唑1,1-二氧化物，其可根据Journal of Organic Chemistry[有机化学杂志](1990)，55(4),1254-61中描述的程序制备。

适合的N-膦酰基亚胺氧转移催化剂包括但不限于[R-(E)]-N-[(2-氯-5-硝基苯基)亚甲基]-对苯基-对-(2,4,6-三甲基苯基)次膦酸酰胺，其可根据Journal of theChemical Society[化学学会杂志],Chemical Communications[化学通讯](1994),(22),2569-70中描述的程序制备。

适合的N-酰基亚胺氧转移催化剂包括但不限于可以[N(E)]-N-(苯基亚甲基)乙酰胺，其可根据Polish Journal of Chemistry[波兰化学杂志](2003),77(5),577-590中描述的程序制备。

适合的噻二唑二氧化物氧转移催化剂包括但不限于3-甲基-4-苯基-1,2,5-噻二唑1,1-二氧化物，其可根据US 5753599(第9栏，实例2)中描述的程序制备。

适合的全氟亚胺氧转移催化剂包括但不限于(Z)-2,2,3,3,4,4,4-七氟-N-(壬氟丁基)丁酰亚胺氟化物，其可根据Tetrahedron Letters[四面体通讯](1994),35(34),6329-30中描述的程序制备。

适合的环状糖酮氧传递催化剂包括但不限于如在US 6649085(第12栏，实例1)中制备的1,2:4,5-二-O-异亚丙基-D-赤-2,3-己二酮(hexodiuro)-2,6-吡喃糖。

优选地，漂白催化剂包含亚胺离子和/或羰基官能团，并且通常能够在接受氧原子，尤其是从过氧酸和/或其盐接受氧原子后形成过氧亚胺正离子(oxaziridinium)和/或双环氧乙烷官能团。优选地，漂白催化剂包含过氧亚胺正离子官能团和/或在接受氧原子时，尤其是在接受来自过氧酸和/或其盐的氧原子时能够形成过氧亚胺正离子官能团。优选地，漂白催化剂包含环状亚胺离子官能团，优选其中所述环状部分具有从五个至八个原子(包括氮原子)、优选六个原子的环大小。优选地，漂白催化剂包含芳基亚胺离子官能团，优选二环芳基亚胺官能团，优选是3,4-二氢异喹啉鎓官能团。典型地，亚胺官能团是季亚胺官能团并且典型地在接受氧原子时，尤其是在接受来自过氧酸和/或其盐的氧原子时能够形成季过氧亚胺正离子官能团。在一方面，洗涤剂组合物包含具有不大于0、不大于-0.5、不大于-1.0、不大于-1.5、不大于-2.0、不大于-2.5、不大于-3.0或不大于-3.5的logP_o/w的漂白组分。下面更加详细地描述用于确定logP_o/w的方法。

典型地，漂白成分能够产生具有从0.01至0.30、从0.05至0.25或从0.10至0.20的X_SO的漂白种类。下面更加详细地描述用于确定X_SO的方法。例如，具有异喹啉鎓结构的漂白成分能够产生具有过氧亚胺正离子结构的漂白种类。在此实例中，X_SO是过氧亚胺正离子漂白种类的X_SO。

优选地，漂白催化剂具有对应于以下化学式的化学结构：

其中：n和m独立地为0至4，优选n和m均为0；每个R¹独立地选自取代的或未取代的基团，所述基团选自由以下组成的组：氢、烷基、环烷基、芳基、稠合芳基、杂环、稠合杂环、硝基、卤基、氰基、磺酸根、烷氧基、酮基、羧基以及烷氧羰基；并且任何两个连位的R¹取代基可以合并以形成稠合芳基、稠合碳环或稠合杂环；每个R²独立地选自取代的或未取代的基团，所述基团独立地选自由以下组成的组：氢、羟基、烷基、环烷基、烷芳基、芳基、芳烷基、亚烷基、杂环、烷氧基、芳基羰基、羧基烷基以及酰胺基团；任何R²可以与任何其他的R²结合在一起以形成常见环的一部分；任何偕R²可以合并以形成羰基；并且任何两个R²可以合并以形成取代的或未取代的稠合的不饱和部分；R³是C₁至C₂₀取代的或未取代的烷基；R⁴是氢或Q_t-A部分，其中：Q是分支或未分支的烯烃，t＝0或1，并且A是选自由以下组成的组的阴离子基团：OSO₃ ^-、SO₃ ^-、CO₂ ^-、OCO₂ ^-、OPO₃ ^2-、OPO₃H^-和OPO₂ ^-；R⁵是氢或-CR¹¹R¹²-Y-G_b-Y_c-[(CR⁹R¹⁰)_y-O]_k-R⁸部分，其中：每个Y独立地选自由以下组成的组：O、S、N-H或N-R⁸；并且每个R⁸独立地选自由以下组成的组：烷基、芳基和杂芳基，所述部分是取代或未取代的，并且无论是取代的还是未取代的，所述部分具有少于21个碳；每个G独立地选自由以下组成的组：CO、SO₂、SO、PO和PO₂；R⁹和R¹⁰独立地选自由以下组成的组：H和C₁-C₄烷基；R¹¹和R¹²独立地选自由以下组成的组：H和烷基，或者当放一起时可以结合形成羰基；b＝0或1；c可以＝0或1，但是如果b＝0，c必须＝0；y是从1至6的整数；k是从0至20的整数；R⁶是H，或是烷基、芳基或杂芳基部分；所述部分是取代或未取代的；并且如果X存在的话，它是适合的电荷平衡反离子，当R⁴为氢时X优选存在，适合的X包括但不限于：氯化物、溴化物、硫酸盐、甲硫酸盐、磺酸盐、对甲苯磺酸盐、四氟化硼合磷酸盐。

在本发明的一方面，漂白催化剂具有对应于以下通式的结构：

其中R¹³是含有从三个至24个碳原子(包括分支的碳原子)的支链烷基或含有从一个至24个碳原子的直链烷基；优选地，R¹³是含有从八个至18个碳原子的支链烷基或含有从八个至十八个碳原子的直链烷基；优选地，R¹³选自由以下组成的组：2-丙基庚基、2-丁基辛基、2-戊基壬基、2-己基癸基、正十二烷基、正十四烷基、正十六烷基、正十八烷基、异壬基、异癸基、异十三烷基和异十五烷基；优选地，R¹³选自由以下组成的组：2-丁基辛基、2-戊基壬基、2-己基癸基、异-十三烷基和异-十五烷基。

优选地，除了漂白催化剂，特别是有机漂白催化剂以外，漂白组分还包含过酸源。过酸源可以选自(a)预形成的过酸；(b)过碳酸盐、过硼酸盐或过硫酸盐(过氧化氢源)，优选与漂白活化剂组合；和(c)过水解酶以及酯，用于在纺织品或硬表面处理步骤中在水的存在下原位形成过酸。

当存在时，基于所述组合物，过酸和/或漂白活化剂通常以从0.1wt％至60wt％、从0.5wt％至40wt％或从0.6wt％至10wt％的量存在于组合物中。可以将一种或多种疏水性过酸或其前体与一种或多种亲水性过酸或其前体组合使用。

可以对过氧化氢源和过酸或漂白活化剂的量进行选择，以使得可用氧(来自过氧化物源)与过酸的摩尔比是从1:1至35:1、或2:1至10:1。

(6)含有金属的漂白催化剂–可以由催化金属络合物提供漂白组分。一种类型的含有金属的漂白催化剂是以下催化系统，所述催化系统包含具有限定的漂白催化活性的过渡金属阳离子(例如铜、铁、钛、钌、钨、钼或锰阳离子)，具有很少或不具有漂白催化活性的辅助金属阳离子(例如锌或铝阳离子)，以及对于催化性和辅助性金属阳离子具有限定的稳定性常数的隔离物，特别是乙二胺四乙酸、乙二胺四(亚甲基膦酸)及其水溶性盐。此类催化剂披露于US 4430243中。优选的催化剂描述于WO 09/839406、US 6218351和WO 00/012667中。特别优选的是过渡金属催化剂或因此作为交联桥多齿N-供体配体的配体。

如果希望的话，可以借助锰化合物催化本文的组合物。此类化合物以及使用水平在本领域中是熟知的并且包括例如披露于US 5576282中的基于锰的催化剂。

本文有用的钴漂白催化剂是已知的并且例如描述于US 5597936、US 5595967中。通过已知的程序可容易地制备此类钴催化剂，像例如US 5597936和US 5595967中传授的程序。

本文的组合物还可以适合地包括配体的过渡金属络合物，例如双哌啶酮(bispidone)(US 7501389)和/或大多环刚性配体-缩写为“MRL”。作为一个实际问题而并不作为限制之用，可以调整本文的组合物和方法，以在水性洗涤介质中提供大约至少一亿分之一的活性MRL种类，并且将典型地在洗涤液中提供从0.005ppm至25ppm、从0.05ppm至10ppm、或从0.1ppm至5ppm的MRL。

本发明的过渡金属漂白催化剂中的适合的过渡金属包括例如锰、铁和铬。适合的MRL包括5,12-二乙基-1,5,8,12-四氮杂双环[6.6.2]十六烷。通过已知的程序可容易地制备适合的过渡金属MRL，像例如US 6225464和WO00/32601中传授的程序。

(7)光漂白剂-适合的光漂白剂包括例如磺化的酞菁锌、磺化的酞菁铝、呫吨染料及其混合物。用于在本发明的组合物中使用的优选漂白组分包含过氧化氢源、漂白活化剂和/或有机过氧酸，任选地通过过氧化氢源和漂白活化剂与漂白催化剂相组合的反应而原位产生。优选的漂白组分包含漂白催化剂，优选如上文所述的有机漂白催化剂。

特别优选的漂白组分是漂白催化剂，特别是有机漂白催化剂。

示例性漂白系统还描述于例如WO 2007/087258、WO 2007/087244、WO2007/087259以及WO 2007/087242中。

织物调色剂-组合物可以包含织物调色剂。适合的织物调色剂包括染料、染料-粘土共轭物、以及颜料。适合的染料包括小分子染料和聚合物染料。适合的小分子染料包括选自由属于以下比色指数(C.I.)分类的染料组成的组的小分子染料：直接蓝、直接红、直接紫、酸性蓝、酸性红、酸性紫、碱性蓝、碱性紫和碱性红或其混合物。

在一方面，适合的小分子染料包括选自由以下组成的组的小分子染料：比色指数(英国皇家染色学会(Society of Dyers and Colorists)，英国布拉德福德)编号直接紫9、直接紫35、直接紫48、直接紫51、直接紫66、直接紫99、直接蓝1、直接蓝71、直接蓝80、直接蓝279、酸性红17、酸性红73、酸性红88、酸性红150、酸性紫15、酸性紫17、酸性紫24、酸性紫43、酸性红52、酸性紫49、酸性紫50、酸性蓝15、酸性蓝17、酸性蓝25、酸性蓝29、酸性蓝40、酸性蓝45、酸性蓝75、酸性蓝80、酸性蓝83、酸性蓝90和酸性蓝113、酸性黑1、碱性紫1、碱性紫3、碱性紫4、碱性紫10、碱性紫35、碱性蓝3、碱性蓝16、碱性蓝22、碱性蓝47、碱性蓝66、碱性蓝75、碱性蓝159及其混合物。在一方面，适合的小分子染料包括选自由以下组成的组的小分子染料：比色指数(英国皇家染色学会，英国布拉德福德)编号酸性紫17、酸性紫43、酸性红52、酸性红73、酸性红88、酸性红150、酸性蓝25、酸性蓝29、酸性蓝45、酸性蓝113、酸性黑1、直接蓝1、直接蓝71、直接紫51及其混合物。在一方面，适合的小分子染料包括选自由以下组成的组的小分子染料：比色指数(英国皇家染色学会，英国布拉德福德)编号酸性紫17、直接蓝71、直接紫51、直接蓝1、酸性红88、酸性红150、酸性蓝29、酸性蓝113或其混合物。

适合的聚合物染料包括选自由以下组成的组的聚合物染料：含有共轭色原体的聚合物(染料-聚合物共轭物)以及色原体共聚到聚合物主链中的聚合物，及其混合物。

在一方面，适合的聚合物染料包括选自由以下物质组成的组的聚合物染料：以名称

(美利肯公司(Milliken))销售的织物实质性着色剂，所述着色剂是由至少一种反应性染料和选自由下述聚合物组成的组的聚合物形成的染料-聚合物共轭物，所述聚合物包含选自由以下组成的组的部分：羟基部分、伯胺部分、仲胺部分、硫醇部分及其混合物。在仍一方面，适合的聚合物染料包括选自由以下组成的组的聚合物染料：

Violet CT、与活性蓝共轭的羟甲基纤维素(CMC)、活性紫或活性红染料如与C.I.活性蓝19共轭的CMC(由爱尔兰威克洛的麦格创公司(Megazyme)以产品名AZO-CM-CELLULOSE、产品代码S-ACMC销售)、烷氧基化三苯基-甲烷聚合着色剂、烷氧基化噻吩聚合着色剂及其混合物。

优选的调色染料包括发现于WO08/87497中的增白剂。这些增白剂可以由以下结构(I)表征：

其中R₁和R₂可以独立地选自：

a)[(CH₂CR'HO)_x(CH₂CR"HO)_yH]

其中R’选自由以下组成的组：H、CH₃、CH₂O(CH₂CH₂O)_zH、及其混合物；其中R”选自由以下组成的组：H、CH₂O(CH₂CH₂O)_zH、及其混合物；其中x+y≤5；其中y≥1；并且其中z＝0至5；

b)R₁＝烷基、芳基或芳基烷基，并且R₂＝[(CH₂CR'HO)_x(CH₂CR"HO)_yH]

其中R’选自由以下组成的组：H、CH₃、CH₂O(CH₂CH₂O)_zH、及其混合物；其中R”选自由以下组成的组：H、CH₂O(CH₂CH₂O)_zH、及其混合物；其中x+y≤10；其中y≥1；并且其中z＝0至5；

c)R₁＝[CH₂CH₂(OR₃)CH₂OR₄]并且R₂＝[CH₂CH₂(O R₃)CH₂O R₄]

其中R₃选自由以下组成的组：H、(CH₂CH₂O)_zH及其混合物；并且其中z＝0至10；

其中R₄选自由以下组成的组：(C₁-C₁₆)烷基、芳基基团、及其混合物；和

d)其中R1和R2可以独立地选自氧化苯乙烯、缩水甘油甲醚、异丁基缩水甘油醚、异丙基缩水甘油醚、叔丁基缩水甘油醚、2-乙基己基缩水甘油醚、以及缩水甘油十六烷基醚的氨基加成产物，随后为从1至10个环氧烷单位的加成。

本发明的优选增白剂可以由以下结构(II)表征：

其中R’选自由以下组成的组：H、CH₃、CH₂O(CH₂CH₂O)_zH、及其混合物；其中R”选自由以下组成的组：H、CH₂O(CH₂CH₂O)_zH、及其混合物；其中x+y≤5；其中y≥1；并且其中z＝0至5。

本发明的另外优选的增白剂可以由以下结构(III)表征：

典型地包含具有一共5个EO基团的混合物。适合的优选分子是在结构I中的具有在上文中“部分a”中的以下的下垂基团的那些。

表1

R1

R2

R’

R”

X

y

R’

R”

X

y

A

H

3

1

H

0

1

B

H

2

1

H

1

c＝b

H

1

H

2

1

d＝a

H

0

1

H

3

1

使用的另外的增白剂包括描述于US 2008/34511(联合利华(Unilever))中的那些。优选的试剂是“紫色13”。

适合的染料粘土共轭物包括选自下组的染料粘土共轭物，所述组包含至少一种阳离子/碱性染料和绿土及其混合物。在一方面，适合的染料粘土共轭物包括选自下组的染料粘土共轭物，所述组由以下部分组成：选自由C.I.碱性黄1至108、C.I.碱性橙1至69、C.I.碱性红1至118、C.I.碱性紫1至51、C.I.碱性蓝1至164、C.I.碱性绿1至14、C.I.碱性棕1至23、CI碱性黑1至11组成的组的一种阳离子/碱性染料；以及选自由蒙脱石粘土、锂蒙脱石粘土、皂石粘土及其混合物组成的组的粘土。在仍一方面，适合的染料粘土共轭物包括选自由以下组成的组的染料粘土共轭物：蒙脱石碱性蓝B7C.I.42595共轭物，蒙脱石碱性蓝B9C.I.52015共轭物，蒙脱石碱性紫V3C.I.42555共轭物，蒙脱石碱性绿G1 C.I.42040共轭物，蒙脱石碱性红R1C.I.45160共轭物，蒙脱石C.I.碱性黑2共轭物，锂蒙脱石碱性蓝B7C.I.42595共轭物，锂蒙脱石碱性蓝B9 C.I.52015共轭物，锂蒙脱石碱性紫V3 C.I.42555共轭物，锂蒙脱石碱性绿G1 C.I.42040共轭物，锂蒙脱石碱性红R1 C.I.45160共轭物，锂蒙脱石C.I.碱性黑2共轭物，皂石碱性蓝B7 C.I.42595共轭物，皂石碱性蓝B9 C.I.52015共轭物，皂石碱性紫V3 C.I.42555共轭物，皂石碱性绿G1 C.I.42040共轭物，皂石碱性红R1C.I.45160共轭物，皂石C.I.碱性黑2共轭物及其混合物。

适合的颜料包括选自由以下组成的组的颜料：黄士酮、阴丹酮、含有从1至4个氯原子的含氯阴丹酮、皮蒽酮、二氯皮蒽酮、单溴二氯皮蒽酮、二溴二氯皮蒽酮、四溴皮蒽酮、二萘嵌苯-3,4,9,10-四羧酸二酰亚胺(其中所述酰亚胺基团可以是未取代的或被C1-C3-烷基或苯基或杂环基团取代的，并且其中所述苯基和杂环基团可以另外地带有不赋予在水中的溶解性的取代基)、蒽素嘧啶羧酸酰胺、蒽酮紫、异蒽酮紫、二噁嗪颜料、每个分子可以含有高达2个氯原子的酞菁铜、多氯-酞菁铜或每个分子含有高达14个溴原子的多溴氯-酞菁铜，及其混合物。

在一方面，适合的颜料包括选自由群青蓝(C.I.颜料蓝29)、群青紫罗兰(C.I.颜料紫罗兰15)及其混合物组成的组的颜料。

上述织物调色剂可以组合使用(可以使用织物调色剂的任何混合物)。适合的调色剂更详细地描述于US 7208459中。染料在本发明的组合物中的优选水平是0.00001wt％至0.5wt％、或0.0001wt％至0.25wt％。优选在水中用于处理和/或清洁步骤的染料的浓度是从1ppb至5ppm、10ppb至5ppm或20ppb至5ppm。在优选的组合物中，表面活性剂的浓度将是从0.2至3g/l。

胶囊化物-组合物可以包含胶囊化物。在一方面，胶囊化物包含核心、具有内表面和外表面的包壳，所述包壳封装所述核心。

在所述胶囊化物的一方面，所述核心可以包含选自由以下组成的组的材料：香料增亮剂；染料；驱虫剂；硅酮；蜡；调味剂；维生素；织物软化剂；护肤剂；在一方面，石蜡；酶；抗细菌剂；漂白剂；感受剂(sensate)；及其混合物；并且所述包壳可以包含选自由以下组成的组的材料：聚乙烯；聚酰胺；聚乙烯醇，任选地含有其他共聚单体；聚苯乙烯；聚异戊二烯；聚碳酸酯；聚酯；聚丙烯酸酯；氨基塑料，在一方面，所述氨基塑料可以包含聚脲、聚氨酯和/或聚脲聚氨酯，在一方面，所述聚脲可以包含聚氧基亚甲基脲和/或三聚氰胺甲醛；聚烯烃；多糖，在一方面，所述多糖可以包含藻朊酸盐和/或壳聚糖；明胶；虫胶；环氧树脂；乙烯基聚合物水不溶性无机物；硅酮；及其混合物。

在所述胶囊化物的一方面，所述核心可以包含香料。

在所述胶囊化物的一方面，所述包壳可以包含三聚氰胺甲醛和/或交联的三聚氰胺甲醛。

在一方面，披露了适合的胶囊化物可以包含核心材料和包壳，所述包壳至少部分地包围所述核心材料。所述胶囊化物的至少75％、85％或90％可以具有从0.2MPa至10MPa、从0.4MPa至5MPa、从0.6MPa至3.5MPa或从0.7MPa至3MPa的抗断强度；并且具有从0％至30％、从0％至20％或从0％至5％的有益试剂泄露。

在一方面，所述胶囊化物的至少75％、85％或90％可以具有从1微米至80微米、从5微米至60微米、从10微米至50微米或从15微米至40微米的粒度。

在一方面，所述胶囊化物的至少75％、85％或90％可以具有从30至250nm、从80至180nm、或从100至160nm的颗粒壁厚。

在一方面，所述胶囊化物的核心材料可以包括一种选自由香料原材料组成的组的材料，和/或任选地包括一种选自由以下组成的组的材料：植物油，包括纯净植物油和/或共混植物油，包括蓖麻油(caster oil)、椰子油、棉籽油、葡萄籽油、油菜籽、大豆油、玉米油、棕榈油、亚麻籽油、红花油、橄榄油、花生油、椰子油、棕榈仁油、蓖麻油(castor oil)、柠檬油及其混合物；植物油的酯，酯，包括己二酸二丁酯、酞酸二丁酯、己二酸丁基苄酯、己二酸辛基苄酯、磷酸三甲苯酯、磷酸三辛酯及其混合物；直链或支链烃，包括具有高于约80℃的沸点的那些直链或支链烃；部分氢化的三联苯、二烷基邻苯二甲酸酯、烷基联苯(包括单异丙基联苯)、烷基化的萘(包括二丙基萘)、石油精(包括煤油)、矿物油及其混合物；芳香族溶剂，包括苯、甲苯及其混合物；硅酮油；及其混合物。

在一方面，所述胶囊化物的壁材料可以包括适合的树脂，所述树脂包括醛和胺的反应产物，适合的醛包括甲醛。适合的胺包括三聚氰胺、脲、苯并胍胺、甘脲及其混合物。适合的三聚氰胺包括羟甲基三聚氰胺、甲基化的羟甲基三聚氰胺、亚氨基三聚氰胺及其混合物。适合的脲包括二羟甲基脲、甲基化的二羟甲基脲、脲-间苯二酚及其混合物。

在一方面，在将胶囊化物添加至组合物之前、期间或之后，适合的甲醛清除剂可以与例如处于胶囊浆液中的胶囊化物一起使用和/或添加至这种组合物中。适合的胶囊可以通过US 2008/0305982、和/或US 2009/0247449的以下教导来制成。

在优选的方面，所述组合物还可以包含沉积助剂，优选由下组组成，所述组包含阳离子或非离子聚合物。适合的聚合物包括阳离子淀粉、阳离子羟基乙基纤维素、聚乙烯甲醛、槐树豆胶、甘露聚糖、木葡聚糖、罗望子胶、聚乙二醇对苯二甲酸酯，以及含有甲基丙烯酸二甲胺乙酯的聚合物，任选地具有一种或多种选自包含丙烯酸和丙烯酰胺的组的单体。

香料-在一方面，组合物包含香料，所述香料包含选自由以下组成的组的一种或多种香料原材料：1,1’-氧基双-2-丙醇；1,4-环己烷二甲酸二乙酯；(乙氧基甲氧基)环十二烷；1,3-壬二醇单乙酸酯；(3-甲基丁氧基)乙酸2-丙烯基酯；β-甲基环十二烷乙醇；2-甲基-3-[(1,7,7-三甲基双环[2.2.1]庚-2-基)氧]-1-丙醇；氧杂环十六烷-2-酮；α-甲基-苯甲醇乙酸酯；反式-3-乙氧基-1,1,5-三甲基环己烷；4-(1,1-二甲基乙基)环己醇乙酸酯；十二氢-3a,6,6,9a-四甲基萘并[2,1-b]呋喃；β-甲基苯丙醛；β-甲基-3-(1-甲基乙基)苯丙醛；4-苯基-2-丁酮；2-甲基丁酸乙酯；苯甲醛；2-甲基丁酸1-甲基乙酯；二氢-5-戊基-2(3H)呋喃酮；(2E)-1-(2,6,6-三甲基-2-环己烯-1-基)-2-丁烯-1-酮；十二醛；十一醛；2-乙基-α,α-二甲基苯丙醛；癸醛；α,α-二甲基苯乙醇乙酸酯；2-(苯基亚甲基)辛醛；2-[[3-[4-(1,1-二甲基乙基)苯基]-2-甲基亚丙基]氨基]苯甲酸甲酯；1-(2,6,6-三甲基-3-环己烯-1-基)-2-丁烯-1-酮；2-戊基环戊酮；3-氧代-2-戊基环戊乙酸甲酯；4-羟基-3-甲氧基苯甲醛；3-乙氧基-4-羟基苯甲醛；2-庚基环戊酮；1-(4-甲基苯基)乙酮；(3E)-4-(2,6,6-三甲基-1-环己烯-1-基)-3-丁烯-2-酮；(3E)-4-(2,6,6-三甲基-2-环己烯-1-基)-3-丁烯-2-酮；苯乙醇；2H-1-苯并吡喃-2-酮；4-甲氧基苯甲醛；10-十一烯醛；丙酸苯甲酯；β-甲基苯戊醇；1,1-二乙氧基-3,7-二甲基-2,6-辛二烯；α,α-二甲基苯乙醇；(2E)-1-(2,6,6-三甲基-1-环己烯-1-基)-2-丁烯-1-酮；乙酸苯甲酯；环己基丙酸-2-丙烯酯；己酸-2-丙烯酯；1,2-二甲氧基-4-(2-丙烯基)苯；1,5-二甲基-二环[3.2.1]辛烷-8-酮肟；4-(4-羟基-4-甲基戊基)-3-环己烯-1-甲醛；3-丁烯-2-醇；2-[[[2,4(或3,5)-二甲基-3-环己烯-1-基]亚甲基]氨基]苯甲酸甲酯；8-环十六烯-1-酮；甲基紫罗兰酮；2,6-二甲基-7-辛烯-2-醇；2-甲氧基-4-(2-丙烯基)苯酚；(2E)-3,7-二甲基-2,6-辛二烯-1-醇；2-羟基-苯甲酸(3Z)-3-己烯酯；2-十三碳烯腈；4-(2,2-二甲基-6-亚甲基环己基)-3-甲基-3-丁烯-2-酮；四氢-4-甲基-2-(2-甲基-1-丙烯基)-2H-吡喃；(2-甲基丁氧基)乙酸-2-丙烯基酯；苯甲酸2-羟基-3-甲基丁酯；(Z)-1-(2,6,6-三甲基-1-环己烯-1-基)-2-丁烯-1-酮；2-己基-3-氧代环戊烷甲酸甲酯；4-乙基-α,α-二甲基-苯丙醛；3-(4-羟基-4-甲基戊基)-3-环己烯-1-甲醛；1-(2,3,4,7,8,8a-六氢-3,6,8,8-四甲基-1H-3a,7-桥亚甲基薁-5-基)-[3R-(3α,3aβ,7β,8aα)]-乙酮；2-甲基-2H-吡喃-2-酮6-丁基四氢-十一醛；4-(1,1-二甲基乙基)-α-甲基-苯丙醛；5-庚基二氢-2(3H)-呋喃酮；2-[(7-羟基-3,7-二甲基亚辛基)氨基]苯甲酸甲酯；2-羟基-苯甲酸苯甲酯；2-甲氧基萘；2-己基-2-环戊烯-1-酮；5-己基二氢-2(3H)-呋喃酮；3-甲基-3-苯基-环氧乙烷羧酸乙酯；1,3,3-三甲基-2-氧杂二环[2.2.2]辛烷；苯戊醇，.γ.-甲基-；3,7-二甲基-3-辛醇；3,7-二甲基-2,6-辛二烯腈；3,7-二甲基-6-辛烯-1-醇；萜品醇乙酸酯；2-甲基-6-亚甲基-7-辛烯-2-醇二氢衍生物；3a,4,5,6,7,7a-六氢-4,7-桥亚甲基-1H-茚-6-醇丙酸酯；3-甲基-2-丁烯-1-醇乙酸酯；(Z)-3-己烯-1-醇乙酸酯；2-乙基-4-(2,2,3-三甲基-3-环戊烯-1-基)-2-丁烯-1-醇；4-(八氢-4,7-桥亚甲基-5H-茚-5-亚基)-丁醛；3-2,4-二甲基-环己烯-1-甲醛；1-(1,2,3,4,5,6,7,8-八氢-2,3,8,8-四甲基-2-萘)-乙酮；2-羟基-苯甲酸甲酯；2-羟基-苯甲酸己酯；2-苯氧基-乙醇；2-羟基-苯甲酸戊酯；2,3-庚二酮；2-己烯-1-醇；2,6-二甲基-6-辛烯-2-醇；大马酮(α、β、γ或δ或其混合物)，3a,4,5,6,7,7a-六氢-4,7-桥亚甲基-1H-茚-6-醇乙酸酯；9-十一烯醛；8-十一烯醛；异环柠檬醛；1-(1,2,3,5,6,7,8,8a-八氢-2,3,8,8-四甲基-2-萘)-乙酮；3,5-二甲基-3-环己烯-1-甲醛；2,4-二甲基-3-环己烯-1-甲醛；3,7-二甲基-1,6-辛二烯-3-醇；3,7-二甲基-1,6-辛二烯-3-醇乙酸酯；铃兰醛(p-t-Bucinal)、和2-[2-(4-甲基-3-环己烯-1-基)丙基]-环戊酮和1-甲基-4-(1-甲基乙烯基)环己烯及其混合物。

在一方面，组合物可以包含胶囊化的香料颗粒，所述颗粒包含水溶性羟基化合物或三聚氰胺-甲醛或修饰的聚乙烯醇。在一方面，胶囊化物包含(a)至少部分水溶的固体基质，所述基质包含一种或多种水溶性羟基化合物，优选淀粉；以及(b)由所述固体基质包封的香料油。

在另一方面，所述香料可以是与多胺(优选聚乙烯亚胺)预复合的，以形成席夫碱(Schiff base)。

聚合物-组合物可以包含一种或多种聚合物。实例为羧甲基纤维素、聚(乙烯基-吡咯烷酮)、聚(乙二醇)、聚(乙烯醇)、聚(乙烯基吡啶-N-氧化物)、聚(乙烯基咪唑)、聚羧酸酯(如聚丙烯酸酯)、马来酸/丙烯酸共聚物、以及甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物。

组合物可以包含一种或多种两亲清洁聚合物，例如具有以下一般结构的化合物：双

((C₂H₅O)(C₂H₄O)n)(CH₃)-N⁺-C_xH_2x-N⁺-(CH₃)-bis((C₂H₅O)(C₂H₄O)n)，其中n＝从20至30，并且x＝从3至8，或其硫酸化的或磺化的变体。

组合物可以包含两亲烷氧基化油脂清洁聚合物，所述聚合物具有平衡的亲水和疏水特性，这样使得它们从织物和表面去除油脂颗粒。本发明的两亲烷氧基化油脂清洁聚合物的具体方面包括一个核心结构和与那个核心结构附接的多个烷氧基化基团。这些可以包含烷氧基化的聚烯属烃亚胺(polyalkylenimine)，优选具有内聚环氧乙烷嵌段和外聚环氧丙烷嵌段。

烷氧基化的聚羧酸酯(例如从聚丙烯酸酯制备的那些)可在本文用于提供另外的油脂去除性能。此类材料描述于WO 91/08281和PCT 90/01815中。在化学上，这些材料包括每7-8个丙烯酸酯单元具有一条乙氧基侧链的聚丙烯酸酯。侧链具有式-(CH₂CH₂O)_m(CH₂)_nCH₃，其中m是2-3并且n是6-12。侧链是酯连接至聚丙烯酸酯“主链”，以提供“梳子状”聚合物类型结构。分子量可以不同，但典型地处于2000至50,000的范围内。此类烷氧基化的聚羧酸酯可以包含本文的组合物的从0.05wt％至10wt％。

本发明的类异戊二烯衍生的表面活性剂，以及与其他辅助表面活性剂和其他佐剂成分一起形成的混合物特别适合与两亲接枝共聚物使用，优选地所述两亲接枝共聚物包含(i)聚乙二醇主链；以及(ii)和至少一个下垂部分，所述下垂部分选自聚乙酸乙烯酯、聚乙烯醇及其混合物。优选的两亲接枝共聚物是由巴斯夫公司(BASF)供应的Sokalan HP22。适合的聚合物包括随机接枝共聚物，优选聚乙酸乙烯酯接枝的聚环氧乙烷共聚物，具有聚环氧乙烷主链和多重聚乙酸乙烯酯侧链。聚环氧乙烷主链的分子量优选是6000，并且聚环氧乙烷与聚乙酸乙烯酯的重量比是40比60，并且每50个环氧乙烷单位有不多于1个接枝点。

羧酸酯聚合物-本发明的组合物还包括一种或多种羧酸酯聚合物，如马来酸酯/丙烯酸酯随机共聚物或聚丙烯酸酯均聚物。在一方面，羧酸酯聚合物是具有从4,000Da至9,000Da或从6,000Da至9,000Da的分子量的聚丙烯酸酯均聚物。

去污聚合物-本发明的组合物还可以包括一种或多种去污聚合物，所述聚合物具有如由以下结构(I)、(II)或(III)之一所定义的结构：

(I)-[(OCHR¹-CHR²)_a-O-OC-Ar-CO-]_d

(II)-[(OCHR³-CHR⁴)_b-O-OC-sAr-CO-]_e

(III)-[(OCHR⁵-CHR⁶)_c-OR⁷]_f

其中：

a、b和c是从1至200；

d、e和f是从1至50；

Ar是1,4-取代的亚苯基；

sAr是1,3-取代的亚苯基，所述亚苯基在5位上被SO₃Me取代；

Me是Li、K、Mg/2、Ca/2、Al/3、铵、单烷基铵、二烷基铵、三烷基铵或四烷基铵，其中烷基基团是C₁-C₁₈烷基或C₂-C₁₀羟基烷基，或其混合物；

R¹、R²、R³、R⁴、R⁵和R⁶独立地选自H或C₁-C₁₈正烷基或异烷基；和

R⁷是直链或支链的C₁-C₁₈烷基，或直链或支链的C₂-C₃₀烯基，或具有5至9个碳原子的环烷基，或C₈-C₃₀芳基，或C₆-C₃₀芳基烷基。

适合的去污聚合物是聚酯去污聚合物，例如Repel-o-tex聚合物，包括Repel-o-tex、SF-2和SRP6，由罗地亚(Rhodia)供应。其他适合的去污聚合物包括Texcare聚合物，包括Texcare SRA100、SRA300、SRN100、SRN170、SRN240、SRN300和SRN325，由科莱恩(Clariant)供应。其他适合的去污聚合物是Marloquest聚合物，例如Marloquest SL，由萨索尔(Sasol)供应。

纤维素聚合物-本发明的组合物还包含一种或多种纤维素聚合物，包括选自烷基纤维素、烷基烷氧基烷基纤维素、羧基烷基纤维素、烷基羧基烷基纤维素的那些。在一方面，纤维素聚合物选自包含以下的组：羧甲基纤维素、甲基纤维素、甲基羟基乙基纤维素、甲基羧甲基纤维素及其混合物。在一方面，羧甲基纤维素具有从0.5至0.9的羧甲基取代度以及从100,000Da至300,000Da的分子量。

酶-组合物可以包含提供清洁性能和/或织物护理益处的一种或多种酶。适合的酶的实例包括但不限于半纤维素酶、过氧化物酶、蛋白酶、纤维素酶、木聚糖酶、脂肪酶、磷脂肪酶、酯酶、角质酶、果胶酶、甘露聚糖酶、果胶裂解酶、角蛋白酶、还原酶、氧化酶、酚氧化酶、脂加氧酶、木质素酶、支链淀粉酶、鞣酸酶、聚戊糖酶、马拉纳酶(malanase)、β-葡聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、透明质酸酶、软骨素酶、漆酶、叶绿素酶、淀粉酶或其混合物。典型的组合是酶混合物，可以包含例如蛋白酶和脂肪酶连同淀粉酶。当存在于组合物中时，前述另外的酶可以按组合物的重量计以从0.00001wt％至2wt％、从0.0001wt％至1wt％或从0.001wt％至0.5wt％酶蛋白的水平存在。

通常，一种或多种所选酶的特性应与选定的洗涤剂相容(即，最适pH，与其他酶和非酶成分的相容性等)，并且所述一种或多种酶应以有效量存在。

在一方面，优选的酶将包括纤维素酶。适合的纤维素酶包括细菌来源或真菌来源的那些。包括化学修饰的突变体或蛋白质工程化的突变体。适合的纤维素酶包括来自以下属的纤维素酶：芽孢杆菌属、假单胞菌属、腐质霉属、镰孢菌属、梭孢壳属、枝顶孢霉属，例如US 4435307、US 5648263、US 5691178、US 5776757以及WO 89/09259中披露的由特异腐质霉、嗜热毁丝霉以及尖孢镰孢菌产生的真菌纤维素酶。

特别适合的纤维素酶是具有颜色护理益处的碱性或中性纤维素酶。这样的纤维素酶的实例是EP 0495257、EP 0531372、WO 96/11262、WO 96/29397、WO 98/08940中描述的纤维素酶。其他实例是纤维素酶变体，如WO 94/07998、EP 0531315、US 5457046、US 5686593、US 5763254、WO 95/24471、WO 98/12307以及PCT/DK98/00299中描述的那些。

可商购的纤维素酶包括Celluzyme^TM和Carezyme^TMCelluclean、CarezymePremium、Whitezyme(诺维信公司(Novozymes A/S))、Clazinase^TM和Puradax HA^TM(杰能科国际有限公司(Genencor International Inc.))、以及KAC-500(B)^TM(花王株式会社(KaoCorporation))。

在一方面，优选的酶将包括蛋白酶。适合的蛋白酶包括细菌、真菌、植物、病毒或动物来源的那些，例如植物或微生物来源。优选的是微生物来源。包括化学修饰的突变体或蛋白质工程化的突变体。它可以是碱性蛋白酶，如丝氨酸蛋白酶或金属蛋白酶。丝氨酸蛋白酶可以例如是S1家族的(如胰蛋白酶)或S8家族的(如枯草杆菌蛋白酶)。金属蛋白酶可以例如是来自例如M4家族的嗜热菌蛋白酶或其他金属蛋白酶，如来自M5、M7或M8家族的那些。

术语“枯草杆菌酶”是指根据Siezen等人,Protein Engng.[蛋白质工程]4(1991)719-737和Siezen等人,Protein Science[蛋白质科学]6(1997)501-523的丝氨酸蛋白酶的亚组。丝氨酸蛋白酶是特征在于在活性位点具有与底物形成共价加合物的丝氨酸的蛋白酶的亚组。枯草杆菌酶可以被划分为6个亚类，即，枯草杆菌蛋白酶家族、嗜热蛋白酶家族、蛋白酶K家族、羊毛硫氨酸抗生素肽酶家族、Kexin家族和Pyrolysin家族。

枯草杆菌酶的实例是来源于芽孢杆菌属的那些，如描述于US 7262042和WO 09/021867中的迟缓芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌(B.alkalophilus)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、短小芽孢杆菌和吉氏芽孢杆菌(Bacillusgibsonii)；以及描述于WO 89/06279中的迟缓枯草杆菌蛋白酶(subtilisin lentus)、枯草杆菌蛋白酶Novo、枯草杆菌蛋白酶Carlsberg、地衣芽孢杆菌、枯草杆菌蛋白酶BPN’、枯草杆菌蛋白酶309、枯草杆菌蛋白酶147和枯草杆菌蛋白酶168以及描述于(WO 93/18140)中的蛋白酶PD138。其他有用的蛋白酶可以是描述于WO 92/175177、WO01/016285、WO 02/026024和WO 02/016547中的那些。胰蛋白酶样蛋白酶的实例是胰蛋白酶(例如猪或牛来源的)和镰孢属(Fusarium)蛋白酶(描述于WO 89/06270、WO 94/25583和WO 05/040372中)，以及来源于纤维单胞菌(Cellumonas)的胰凝乳蛋白酶(描述于WO 05/052161和WO 05/052146中)。

另外优选的蛋白酶是来自迟缓芽孢杆菌DSM 5483的碱性蛋白酶(如描述于例如WO95/23221中)及其变体(描述于WO 92/21760、WO 95/23221、EP 1921147以及EP 1921148中)。

金属蛋白酶的实例是如WO 07/044993(杰能科国际公司(Genencor Int.))中所述的中性金属蛋白酶，如来源于解淀粉芽孢杆菌的那些。

有用的蛋白酶的实例是描述于以下中的变体：WO 92/19729、WO96/034946、WO 98/20115、WO 98/20116、WO 99/011768、WO 01/44452、WO 03/006602、WO 04/03186、WO 04/041979、WO 07/006305、WO11/036263、WO 11/036264，尤其是在以下位置中的一个或多个处具有取代的变体：3、4、9、15、27、36、57、68、76、87、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、106、118、120、123、128、129、130、160、167、170、194、195、199、205、206、217、218、222、224、232、235、236、245、248、252以及274，使用BPN’进行编号。更优选地，枯草杆菌酶变体可以包含以下突变：S3T、V4I、S9R、A15T、K27R、*36D、V68A、N76D、N87S,R、*97E、A98S、S99G,D,A、S99AD、S101G,M,R S103A、V104I,Y,N、S106A、G118V,R、H120D,N、N123S、S128L、P129Q、S130A、G160D、Y167A、R170S、A194P、G195E、V199M、V205I、L217D、N218D、M222S、A232V、K235L、Q236H、Q245R、N252K、T274A(使用BPN’进行编号)。

适合的可商购的蛋白酶包括：以下列商品名出售的那些：

Duralase^Tm、Durazym^Tm、

以及

所有这些能以

或

(诺维信公司)出售；以下列商品名出售的那些：

Purafect

Preferenz^Tm、Purafect

Purafect

Purafect

Effectenz^Tm、以及

(丹尼斯克/杜邦公司(Danisco/DuPont))、Axapem^TM(吉斯特布罗卡德斯公司(Gist-Brocases N.V.))、BLAP(序列示于US 5352604的图29中)及其变体(汉高股份(Henkel AG))以及来自花王株式会社(Kao)的KAP(嗜碱芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶)。

在一方面，优选的酶将包括淀粉酶。适合的淀粉酶可以是α-淀粉酶或葡糖淀粉酶并且可以是细菌或真菌来源的。包括化学修饰的突变体或蛋白质工程化的突变体。淀粉酶包括例如获得自芽孢杆菌属的α-淀粉酶，例如GB1296839中更详细描述的地衣芽孢杆菌特定菌株的α-淀粉酶。

适合的淀粉酶包括具有WO 95/10603中的SEQ ID NO:3的淀粉酶或其与SEQ IDNO:3具有90％序列同一性的变体。优选变体描述于WO94/02597、WO 94/18314、WO 97/43424以及WO 99/019467的SEQ ID NO:4中，例如在一个或多个以下位置中具有取代的变体：15、23、105、106、124、128、133、154、156、178、179、181、188、190、197、201、202、207、208、209、211、243、264、304、305、391、408和444。

不同的适合的淀粉酶包括具有WO 02/010355中的SEQ ID NO:6的淀粉酶或其与SEQ ID NO:6具有90％序列同一性的变体。SEQ ID NO:6的优选的变体是在位置181和182中具有缺失并且在位置193中具有取代的那些。

其他适合的淀粉酶是包括示于WO 2006/066594的SEQ ID NO:6中的来源于解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶的残基1-33和示于WO 2006/066594的SEQ ID NO:4中的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的残基36-483的杂合α-淀粉酶或其具有90％序列同一性的变体。此杂合α-淀粉酶的优选变体是在以下位置中的一个或多个中具有取代、缺失或插入的那些：G48、T49、G107、H156、A181、N190、M197、I201、A209和Q264。包括示于WO 2006/066594的SEQ ID NO:6中的来源于解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶的残基1-33和SEQ ID NO:4的残基36-483的杂合α-淀粉酶的最优选变体是具有以下取代的那些：

M197T；

H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S；或

G48A+T49I+G107A+H156Y+A181T+N190F+I201F+A209V+Q264S。

适合的另外的淀粉酶是具有WO 99/019467中的SEQ ID NO:6的淀粉酶或其与SEQID NO:6具有90％序列同一性的变体。SEQ ID NO:6的优选的变体是在以下位置中的一个或多个中具有取代、缺失或插入的那些：R181、G182、H183、G184、N195、I206、E212、E216和K269。特别优选的淀粉酶是在位置R181和G182、或位置H183和G184中具有缺失的那些。

可以使用的另外的淀粉酶是具有WO 96/023873的SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQID NO:2或SEQ ID NO:7的那些或其与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ IDNO:7具有90％序列同一性的变体。SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:7的优选的变体是在以下位置中的一个或多个中具有取代、缺失或插入的那些：140、181、182、183、184、195、206、212、243、260、269、304以及476。更优选的变体是在位置181和182或位置183和184处具有缺失的那些。SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:7的最优选的淀粉酶变体是在位置183和184中具有缺失并且在位置140、195、206、243、260、304和476中的一个或多个中具有取代的那些。

可以使用的其他淀粉酶是具有WO 08/153815中的SEQ ID NO:2、WO01/66712中的SEQ ID NO:10的淀粉酶或其与WO 08/153815的SEQ ID NO:2具有90％序列同一性或与WO01/66712中的SEQ ID NO:10具有90％序列同一性的变体。WO 01/66712中的SEQ ID NO:10的优选变体是在一个或多个以下位置中具有取代、缺失或插入的那些：176、177、178、179、190、201、207、211和264。

另外的适合的淀粉酶是具有WO 09/061380中的SEQ ID NO:2的淀粉酶或其与SEQID NO:2具有90％序列同一性的变体。SEQ ID NO:2的优选的变体是在以下位置中的一个或多个中具有C-末端截短和/或取代、缺失或插入的那些：Q87、Q98、S125、N128、T131、T165、K178、R180、S181、T182、G183、M201、F202、N225、S243、N272、N282、Y305、R309、D319、Q320、Q359、K444和G475。SEQ ID NO:2的更优选的变体是在以下位置中的一个或多个处具有取代的那些：Q87E,R、Q98R、S125A、N128C、T131I、T165I、K178L、T182G、M201L、F202Y、N225E,R、N272E,R、S243Q,A,E,D、Y305R、R309A、Q320R、Q359E、K444E以及G475K，和/或在位置R180和/或S181或T182和/或G183处具有缺失的那些。SEQ ID NO:2的最优选的淀粉酶变体是具有以下取代的那些：

N128C+K178L+T182G+Y305R+G475K；

N128C+K178L+T182G+F202Y+Y305R+D319T+G475K；

S125A+N128C+K178L+T182G+Y305R+G475K；或

S125A+N128C+T131I+T165I+K178L+T182G+Y305R+G475K，其中所述变体是C-末端截短的，并且任选地进一步包含在位置243处的取代和/或在位置180和/或位置181处的缺失。

其他适合的淀粉酶是具有WO 01/66712中的SEQ ID NO:12的α-淀粉酶或与SEQ IDNO:12具有至少90％序列同一性的变体。优选的淀粉酶变体是在WO 01/66712中的SEQ IDNO:12中的以下位置中的一个或多个中具有取代、缺失或插入的那些：R28、R118、N174；R181、G182、D183、G184、G186、W189、N195、M202、Y298、N299、K302、S303、N306、R310、N314；R320、H324、E345、Y396、R400、W439、R444、N445、K446、Q449、R458、N471、N484。特别优选的淀粉酶包括具有D183和G184的缺失并且具有取代R118K、N195F、R320K和R458K的变体，以及另外在一个或多个选自下组的位置中具有取代的变体：M9、G149、G182、G186、M202、T257、Y295、N299、M323、E345和A339，最优选的是另外在所有这些位置中具有取代的变体。

其他实例是淀粉酶变体，如在WO 2011/098531、WO 2013/001078和WO 2013/001087中描述的那些。

可商购的淀粉酶是Duramyl^TM、Termamyl^TM、TermamylUltra^TM、Fungamyl^TM、Ban^TM、Stainzyme^TM、StainzymePlus^TM、

Supramyl^TM、Natalase^TM、Liquozyme X、BAN^TM、Resillience和Everest(来自诺维信公司)、

AT 9000百因美生物技术贸易有限公司(Biozym Biotech Trading GmbH)(奥地利维也纳威利斯塔斯(Wehlistrasse)27bA-1200、和Rapidase^TM、Purastar^TM/Effectenz^TM、Powerase、Preferenz S100、PreferenxS110、OPTISIZE HT

和PURASTAR

(丹尼斯克/杜邦公司)以及

(花王株式会社)。

适合的脂肪酶和角质酶包括细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰的或蛋白质工程化的突变体酶。实例包括来自嗜热真菌属的脂肪酶，例如，如EP 258068和EP 305216中所述的来自疏绵状嗜热丝孢菌(早先命名为疏棉状腐质霉)；来自腐质霉属的角质酶，例如特异腐质霉(WO 96/13580)；来自假单胞菌属的菌株的脂肪酶(这些中的一些现在改名为伯克霍尔氏菌属)，例如产碱假单胞菌或类产碱假单胞菌(EP 218272)、洋葱假单胞菌(EP331376)、假单胞菌属菌株SD705(WO 95/06720&WO 96/27002)、威斯康星假单胞菌(P.wisconsinensis)(WO 96/12012)；GDSL-型链霉菌属脂肪酶(WO 10/065455)；来自稻瘟病菌的角质酶(WO 10/107560)；来自门多萨假单胞菌的角质酶(US 5,389,536)；来自褐色嗜热裂孢菌(Thermobifidafusca)的脂肪酶(WO 11/084412，WO 13/033318)；嗜热脂肪土芽孢杆菌脂肪酶(WO 11/084417)；来自枯草芽孢杆菌的脂肪酶(WO 11/084599)；以及来自灰色链霉菌(WO 11/150157)和始旋链霉菌(S.pristinaespiralis)的脂肪酶(WO 12/137147)。

其他实例是脂肪酶变体，如EP 407225、WO 92/05249、WO 94/01541、WO 94/25578、WO 95/14783、WO 95/30744、WO 95/35381、WO 95/22615、WO 96/00292、WO 97/04079、WO97/07202、WO 00/34450、WO 00/60063、WO 01/92502、WO 07/87508以及WO 09/109500中所述的那些。

优选的商业化脂肪酶产品包括Lipolase^TM、Lipex^TM、LipexEvity^TM、Lipolex^TM、Lipoclean^TM和LipexEvity 100L(诺维信公司)、Lumafast(来自杜邦公司(DuPont))以及Lipomax^TM(来自吉斯特布罗卡德斯公司(Gist-Brocades))。

仍其他实例是有时称为酰基转移酶或过水解酶的脂肪酶，例如与南极假丝酵母(Candida antarctica)脂肪酶A具有同源性的酰基转移酶(WO10/111143)、来自耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)的酰基转移酶(WO05/56782)、来自CE 7家族的过水解酶(WO09/67279)以及耻垢分枝杆菌过水解酶的变体(特别是来自亨斯迈纺织品染化有限公司(Huntsman Textile Effects Pte Ltd)的商业产品Gentle Power Bleach中所用的S54V变体)(WO10/100028)。

在一方面，其他优选的酶包括微生物起源的展现出内切-β-1,4-葡聚糖酶活性的内切葡聚糖酶(EC3.2.1.4)，包括对于芽孢杆菌属的成员而言内源的细菌多肽(所述多肽具有与US 7141403中的氨基酸序列SEQ ID NO:2至少90％、94％、97％或99％同一性的序列)以及其混合物。适合的内切葡聚糖酶以商品名

和

(诺维信公司)销售。

其他优选的酶包括以商品名

销售的果胶裂解酶，以及以商品名

(诺维信公司)和

(丹尼斯克/杜邦公司)销售的甘露聚糖酶。

一种或多种洗涤剂酶可以通过添加含有一种或多种酶的单独的添加剂，或通过添加包含这些酶的全部或多种的组合添加剂而被包括在洗涤剂组合物中。本发明的洗涤剂添加剂，即单独的或组合的添加剂，可以配制成例如颗粒、液体、浆液、棒等。优选的洗涤剂添加剂配制品是颗粒，特别是无粉尘颗粒；液体，特别是稳定化液体；或浆液。

无粉尘颗粒可以例如US 4106991和US 4661452中所披露来制造，并且可以任选地通过本领域中已知的方法来涂覆。蜡状包衣材料的实例是平均分子量为1000至20000的聚(环氧乙烷)产品(聚乙二醇，PEG)；具有从16至50个环氧乙烷单元的乙氧基化的壬基酚；其中的醇包含从12至20个碳原子并且其中存在15至80个环氧乙烷单元的乙氧基化的脂肪醇；脂肪醇；脂肪酸；以及脂肪酸的甘油单酯、和甘油二酯、和甘油三酯。适用于通过流化床技术应用的成膜包衣材料的实例在GB1483591中给出。液体酶制剂可以例如通过根据已确立的方法添加多元醇(如丙二醇)、糖或糖醇、乳酸或硼酸而稳定化。受保护的酶可以根据EP238216中披露的方法来制备。

染料转移抑制剂-本发明的组合物还可以包括一种或多种染料转移抑制剂。适合的聚合物染料转移抑制剂包括但不限于聚乙烯吡咯烷酮聚合物、多胺N-氧化物聚合物、N-乙烯吡咯烷酮与N-乙烯基咪唑的共聚物、聚乙烯噁唑烷酮以及聚乙烯咪唑或其混合物。当存在于组合物中时，染料转移抑制剂可以按从0.0001wt％至10wt％、从0.01wt％至5wt％或从0.1wt％至3wt％的水平存在。

增亮剂-本发明的组合物还可以包含可以给正在清洁的物品着色的另外的组分，例如荧光增亮剂。

所述组合物可以包含具有以下结构的呈α-晶体形式的C.I.荧光增亮剂260：

在一方面，增亮剂是冷水可溶性增亮剂，如呈α-晶体形式的C.I.荧光增亮剂260。在一方面，增亮剂主要处于α-晶体形式，这意味着典型地至少50wt％、至少75wt％、至少90wt％、至少99wt％、或甚至基本上全部的C.I.荧光增亮剂260是处于α-晶体形式。

增亮剂典型地是处于微粒化微粒形式，具有从3至30微米、从3微米至20微米、或从3至10微米的加权平均初级粒度。

所述组合物可以包含呈β-晶体形式的C.I.荧光增亮剂260，并且(i)呈α-晶体形式的C.I.荧光增亮剂260与(ii)呈β-晶体形式的C.I.荧光增亮剂260的重量比可以是至少0.1或至少0.6。BE 680847涉及用于制得呈α-晶体形式的C.I.荧光增亮剂260的方法。

可以用于本发明中的商业光学增亮剂可以划分为多个亚组，所述亚组包括但不必限制于：二苯乙烯、吡唑啉、香豆素、羧酸、次甲基菁、二苯并噻吩-5,5-二氧化物、唑类、5元和6元环杂环的衍生物以及其他混杂剂。此类增亮剂的实例披露于“The Production andApplication of Fluorescent Brightening Agents”[荧光增亮剂的产生和应用],M.Zahradnik,由纽约John Wiley&Sons[约翰威利父子公司]出版(1982)。可以用于本发明组合物的光学增亮剂的具体非限制性实例是在US 4790856和US 3646015中鉴别的那些。

另外适合的增亮剂具有以下结构：

适合的荧光增亮剂水平包括从0.01wt％、从0.05wt％、从0.1wt％或从0.2wt％的较低水平至0.5wt％或0.75wt％的较高水平。

在一方面，增亮剂可以装载在粘土上以形成颗粒。硅酸盐-本发明的组合物还可以含有硅酸盐，如硅酸钠或硅酸钾。所述组合物可以包含从0wt％至小于10wt％硅酸盐，至9wt％、或至8wt％、或至7wt％、或至6wt％、或至5wt％、或至4wt％、或至3wt％、或甚至至2wt％，并且从高于0wt％、或从0.5wt％、或从1wt％的硅酸盐。适合的硅酸盐是硅酸钠。

分散剂-本发明的组合物还可以含有分散剂。适合的水溶性有机材料包括均聚合或共聚合的酸或其盐，其中聚羧酸包含被不多于两个碳原子彼此分开的至少两个羧基。

酶稳定剂-用于组合物中的酶可以通过各种技术来稳定。本文使用的酶可以通过钙和/或镁离子的水溶性来源的存在来稳定。常规的稳定剂的实例是，例如多元醇(如丙二醇或甘油)、糖或糖醇、和乳酸。所述洗涤剂组合物可以包括蛋白酶抑制剂，所述蛋白酶抑制剂是具有蛋白酶活性(例如丝氨酸蛋白酶活性)的可逆抑制剂。优选地，蛋白酶抑制剂是(可逆的)枯草杆菌蛋白酶抑制剂。特别地，蛋白酶抑制剂可以是肽醛、原硼酸(boric acid)或硼酸(boronic acid)；或这些中的任一种的衍生物。

蛋白酶抑制剂对丝氨酸蛋白酶的抑制常数K_i(mol/L)可以从1E-12至1E-03；更优选从1E-11至1E-04；甚至更优选从1E-10至1E-05；甚至更优选从1E-10至1E-06；并且最优选从1E-09至1E-07。

所述蛋白酶抑制剂可以是硼酸或其衍生物；优选为苯基硼酸或其衍生物。

在一方面，苯基硼酸衍生物具有以下式：

其中R选自由以下组成的组：氢、羟基、C₁-C₆烷基、取代的C₁-C₆烷基、C₁-C₆烯基以及取代的C₁-C₆烯基。优选地，R是氢、CH₃、CH₃CH₂或CH₃CH₂CH₂。

在优选的方面，蛋白酶抑制剂(苯基硼酸衍生物)为4-甲酰基-苯基-硼酸(4-FPBA)。

在另一个具体方面，蛋白酶抑制剂选自由以下组成的组：

噻吩-2硼酸、噻吩-3硼酸、乙酰胺苯基硼酸、苯并呋喃-2硼酸、萘-1硼酸、萘-2硼酸、2-FPBA、3-FBPA、4-FPBA、1-噻蒽硼酸、4-二苯并呋喃硼酸、5-甲基噻吩-2硼酸、硫茚硼酸、呋喃-2硼酸、呋喃-3硼酸、4,4联苯基-二硼酸、6-羟基-2-萘、4-(甲硫基)苯基硼酸、4(三甲基-甲硅烷基)苯基硼酸、3-溴代噻吩硼酸、4-甲基噻吩硼酸、2-萘基硼酸、5-溴噻吩硼酸、5-氯代噻吩硼酸、二甲基噻吩硼酸、2-溴代苯基硼酸、3-氯代苯基硼酸、3-甲氧基-2-噻吩、对-甲基-苯乙基硼酸、2-噻蒽硼酸、二苯并噻吩硼酸、4-羧基苯基硼酸、9-蒽基硼酸、3,5二氯苯基硼酸、二苯基硼酸酐、邻-氯代苯基硼酸、对-氯代苯基硼酸、间-溴代苯基硼酸、对-溴代苯基硼酸、对-氟代苯基硼酸、对-甲苯基硼酸、邻-甲苯基硼酸、辛基硼酸、1,3,5三甲基苯基硼酸、3-氯代-4-氟代苯基硼酸、3-氨基苯基硼酸、3,5-二-(三氟甲基)苯基硼酸、2,4二氯代苯基硼酸、4-甲氧基苯基硼酸。

在洗涤剂组合物中适合作为蛋白酶抑制剂的其他硼酸衍生物描述于US 4963655、US 5159060、WO 95/12655、WO 95/29223、WO 92/19707、WO 94/04653、WO 94/04654、U5442100、US 5488157以及US 5472628中。

所述蛋白酶抑制剂还可以是具有式X-B¹-B⁰-H的肽醛，其中所述基团具有以下含义：

a)H是氢；

b)B⁰是单个氨基酸残基，具有L-或D-构型并且具有化学式：NH-CHR’-CO；

c)B¹是单个氨基酸残基；和

d)X由一个或多个氨基酸残基构成(优选一个或两个)，任选地包括一种N-端保护基团。

NH-CHR’-CO(B⁰)是L-或D-氨基酸残基,其中R’可以是一种脂肪族或芳香族侧链，例如芳烷基，如苄基，其中R'可以是任选取代的。更特别地，B⁰残基可能是庞大的、中性的、极性的、疏水性的和/或芳香族的。实例是D-或L-型的Tyr(对酪氨酸)、间酪氨酸、3,4-二羟基苯丙氨酸、Phe、Val、Met、正缬氨酸(Nva)、Leu、Ile或正亮氨酸(Nle)。

在上式X-B¹-B⁰-H中，B¹残基可以是特别小的、脂肪族的、疏水性的和/或中性的。实例是丙氨酸(Ala)、半胱氨酸(Cys)、甘氨酸(Gly)、脯氨酸(Pro)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、缬氨酸(Val)、正缬氨酸(Nva)和正亮氨酸(Nle)，特别是丙氨酸、甘氨酸或缬氨酸。

具体地，X可以是一个或两个氨基酸残基，带有任选的N-末端保护基团(即所述化合物是三肽醛或四肽醛，具有或没有保护基团)。因此，X可以是B²、B³-B²、Z-B²或Z-B³-B²，其中B³和B²各自代表一个氨基酸残基，并且Z是N-端保护基团。B²残基可以是特别小的、脂肪族的和/或中性的，例如Ala、Gly、Thr、Arg、Leu、Phe或Val。特别地，B³残基可以是庞大的、疏水性的、中性的和/或芳香族的，例如Phe、Tyr、Trp、苯基甘氨酸、Leu、Val、Nva、Nle或Ile。

N-端的保护基团Z(如果存在的话)可以选自甲酰基、乙酰基、苯甲酰基、三氟乙酰基、氟甲氧基羰基、甲氧基琥珀酰基、芳香族的和脂肪族的尿烷保护基团、苄氧基羰基(Cbz)、叔丁氧羰基、金刚烷基氧基羰基、对甲氧苄基羰基(MOZ)、苄基(Bn)、对甲氧苄基(PMB)或对甲氧苯基(PMP)、甲氧羰基(Moc)；甲氧基乙酰基(Mac)；氨基甲酸甲酯或甲基氨基羰基/甲基脲基团。在具有保护基团的三肽醛(即X＝Z-B²)的情况下，Z优选是小的脂肪族基团，例如甲酰基、乙酰基、氟甲氧基羰基、叔丁氧基羰基、甲氧基羰基(Moc)；甲氧基乙酰基(Mac)；氨基甲酸甲酯或甲基氨基羰基/甲基脲基团。在具有保护基团的三肽醛(即X＝Z-B³-B²)的情况下，Z优选是庞大的芳香族基团，例如苯甲酰基、苄氧基羰基、对甲氧苄基羰基(MOZ)、苄基(Bn)、对甲氧苄基(PMB)或对甲氧苯基(PMP)。

适合的肽醛描述在WO 94/04651、WO 95/25791、WO 98/13458、WO 98/13459、WO98/13460、WO 98/13461、WO 98/13461、WO 98/13462、WO 07/141736、WO 07/145963、WO 09/118375、WO 10/055052和WO 11/036153中。更具体地，肽醛可以是Cbz-RAY-H、Ac-GAY-H、Cbz-GAY-H、Cbz-GAL-H、Cbz-VAL-H、Cbz-GAF-H、Cbz-GAV-H、Cbz-GGY-H、Cbz-GGF-H、Cbz-RVY-H、Cbz-LVY-H、Ac-LGAY-H、Ac-FGAY-H、Ac-YGAY-H、Ac-FGAL-H、Ac-FGAF-H、Ac-FGVY-H、Ac-FGAM-H、Ac-WLVY-H、MeO-CO-VAL-H、MeNCO-VAL-H、MeO-CO-FGAL-H、MeO-CO-FGAF-H、MeSO₂-FGAL-H、MeSO₂-VAL-H、PhCH₂O(OH)(O)P-VAL-H、EtSO₂-FGAL-H、PhCH₂SO₂-VAL-H、PhCH₂O(OH)(O)P-LAL-H、PhCH₂O(OH)(O)P-FAL-H、或MeO(OH)(O)P-LGAL-H。此处，Cbz是苄氧基羰基，Me是甲基，Et是乙基，Ac是乙酰基，H是氢，并且其他字母代表了由标准单个字母通知所指代的氨基酸残基(例如，F＝Phe，Y＝Tyr，L＝Leu)。

可替代地，肽醛可以具有如WO 11/036153中所述的式：

P-O-(A_i-X')_n-A_n+1-Q

其中Q是氢、CH₃、CX”₃、CHX”₂、或CH₂X”，其中X”是卤素原子；

其中一个X’是“双N-封端基团”CO、CO-CO、CS、CS-CS或CS-CO，最优选是urido(CO)，并且其他X’为空，

其中n＝1-10，优选2-5，最优选2,

其中A_i和A_n+1各自是具有以下结构的氨基酸残基：

对于至X'＝-CO-的右侧的残基而言，是–NH-CR”-CO-，或

对于至X'＝-CO-的左侧的残基而言，是–CO-CR”-NH-

其中R”是H-或可任选地取代的烷基或烷芳基基团，所述烷芳基基团能可任选地包括杂原子并且能可任选地被连接至N原子，并且

其中P是氢或任何C-端保护基团。

此类肽醛的实例包括α-MAPI、β-MAPI、F-脲-RVY-H、F-脲-GGY-H、F-脲-GAF-H、F-脲-GAY-H、F-脲-GAL-H、F-脲-GA-Nva-H、F-脲-GA-Nle-H、Y-脲-RVY-H、Y-脲-GAY-H、F-CS-RVF-H、F-CS-RVY-H、F-CS-GAY-H、抗痛素、GE20372A、GE20372B、糜蛋白酶抑素A、糜蛋白酶抑素B、以及糜蛋白酶抑素C。肽醛的另外的实例披露于特此通过引用而结合的WO2010/055052以及WO 2009/118375、WO 94/04651、WO 98/13459、WO 98/13461、WO 98/13462、WO 07/145963中。

可替代地，对于肽醛，蛋白酶抑制剂可以是具有式X-B¹-NH-CHR-CHOH-SO₃M的亚硫酸氢盐加合物，其中X、B¹和R如以上定义，并且M是H或碱性金属，优选Na或K，如WO 13/004636中所述的。

所述肽醛可以通过与亚硫酸氢钠的反应被转化成水溶性亚硫酸氢盐加合物，如在教科书，例如March,J.，Advanced Organic Chemistry[高等有机化学]，第四版，Wiley-Interscience[威利国际科学出版社]，美国，1992，第895页中所述。

所述亚硫酸氢盐加合物的水溶液可以通过使对应的肽醛与亚硫酸氢钠(sodiumbisulfite/sodium hydrogen sulfite，NaHSO₃)、亚硫酸氢钾(KHSO₃)的水溶液通过已知方法进行反应来制备，例如在WO 98/47523；US 6500802；US 5436229；J.Am.Chem.Soc.[美国化学学会杂志](1978)100,1228；Org.Synth.,Coll.[有机合成文集]第7卷:361中所述。

上述肽醛(或亚硫酸氢盐加合物)与所述蛋白酶的摩尔比可以是至少1:1或1.5:1，并且它可以小于1000:1，更优选小于500:1，甚至更优选从100:1至2:1或从20:1至2:1，或最优选的，摩尔比是从10:1至2:1。

甲酸盐(例如，甲酸钠)和甲酸也示出了作为蛋白酶活性抑制剂的良好作用。甲酸盐可以与上述蛋白酶抑制剂协同使用，如在WO 13/004635中所示。甲酸盐以至少0.1％w/w或0.5％w/w，例如至少1.0％、至少1.2％或至少1.5％的量存在于所述洗涤剂组合物中。所述盐的量值典型地低于5％w/w、低于4％或低于3％。

在一方面，蛋白酶为金属蛋白酶，且抑制剂为金属蛋白酶抑制剂，例如基于蛋白质水解物的抑制剂(例如，如在WO 08/134343中描述的)。

溶剂-适合的溶剂包括水和其他溶剂，例如亲脂性流体。适合的亲脂性流体的实例包括硅氧烷、其他硅酮、烃、乙二醇醚、甘油衍生物(例如甘油醚)、全氟化的胺、全氟化的和氢氟醚溶剂、低挥发性非氟化的有机溶剂、二醇溶剂、其他环境友好型溶剂及其混合物。

结构化剂/增稠剂-结构化液体可以从内部结构化，由此结构由初级成分(例如，表面活性剂材料)形成，和/或通过使用次级成分(例如，聚合物、粘土和/或硅酸盐材料)提供三维基质结构而从外部结构化。所述组合物可以包含从0.01wt％至5wt％、或从0.1wt％至2.0wt％的结构化剂。所述结构化剂典型地选自由以下组成的组：甘油二酯和甘油三酯、硬脂酸乙二醇双酯、微晶纤维素、基于纤维素的材料、微纤维纤维素、疏水修饰的碱性可膨胀的乳液(例如Polygel W30(3V西格玛(Sigma)))、生物聚合物，黄原胶、吉兰糖胶及其混合物。适合的结构化剂包括氢化的蓖麻油及其非乙氧基化的衍生物。适合的结构化剂披露于US 6855680中。此类结构化剂具有螺纹样结构化系统，所述系统具有一定范围的纵横比。其他适合的结构化剂和用于制得它们的方法描述于WO 10/034736中。

调节剂-本发明的组合物可以包括高熔点脂肪化合物。本文有用的高熔点脂肪化合物具有25℃或更高的熔点，并且选自由以下组成的组：脂肪醇、脂肪酸、脂肪醇衍生物、脂肪酸衍生物及其混合物。此类具有低熔点的化合物并非旨在被包括在此部分中。高熔点化合物的非限制性实例发现于International Cosmetic Ingredient Dictionary[国际化妆品成分词典]，第五版，1993，以及CTFA Cosmetic Ingredient Handbook[CTFA化妆品成分手册]，第二版，1992中。

鉴于提供改进的调节益处(如在施加至湿发的过程中的湿滑感、柔软度以及对干发的保湿感)，高熔点脂肪化合物以从0.1wt％至40wt％、从1wt％至30wt％、从1.5wt％至16wt％、从1.5wt％至8wt％的水平包括在所述组合物中。

本发明的组合物可以含有阳离子聚合物。在组合物中阳离子聚合物的浓度典型地范围为从0.05wt％至3wt％、从0.075wt％至2.0wt％、或从0.1wt％至1.0wt％。在预期使用组合物的pH下，适合的阳离子聚合物将具有至少0.5meq/gm、至少0.9meq/gm、至少1.2meq/gm、至少1.5meq/gm、或小于7meq/gm、以及小于5meq/gm的阳离子电荷密度，pH的范围将大体上是从pH 3至pH 9、或在pH 4与pH 8之间。本文，聚合物的“阳离子电荷密度”是指聚合物上的正电荷数目与聚合物的分子量之比。此类适合的阳离子聚合物的平均分子量将大体上是在10,000与10,000,000之间、在50,000与5,000,000之间或在100,000与3,000,000之间。

用于在本发明的组合物中使用的适合的阳离子聚合物含有阳离子含氮部分，如季铵或阳离子质子化的氨基部分。可以将任何阴离子反离子与阳离子聚合物关联使用，只要聚合物保持溶解于水中、组合物中、或组合物的凝聚相中，并且只要反离子在物理和化学上与组合物的主要成分相容或以另外的方式不会不适当地损害组合物性能、稳定性或美感。此类反离子的非限制性实例包括卤化物(例如，氯化物、氟化物、溴化物、碘化物)、硫酸盐和甲基硫酸盐。

此类聚合物的非限制性实例描述于CTFA Cosmetic Ingredient Dictionary[CTFA化妆品成分词典]，第3版，由Estrin、Crosley、和Haynes编著(The Cosmetic,Toiletry,and Fragrance Association,Inc.[化妆品、化妆用具以及香水联合公司]，Washington,D.C.[华盛顿特区](1982))。

用于在所述组合物中使用的其他适合的阳离子聚合物包括多糖聚合物，阳离子瓜尔豆胶衍生物，含四价氮的纤维素醚，合成聚合物，醚化纤维素、瓜尔豆胶和淀粉的共聚物。当使用的时候，本文的阳离子聚合物可溶解于组合物中或可溶解于组合物中的复合凝聚相中，所述凝聚相是由上文所述的阳离子聚合物和阴离子、两性和/或兼性离子型表面活性剂组分形成。阳离子聚合物的复合凝聚物还可以与组合物中其他带电荷的材料形成。适合的阳离子聚合物描述于US 3962418、US 3958581、和US 2007/0207109中。

本发明的组合物可以包含作为调节剂的非离子聚合物。具有大于1000的分子量的聚亚烷基乙二醇(polyalkylene glycol)在本文是有用的。具有以下通式的那些是有用的：

其中R⁹⁵选自由以下组成的组：H、甲基及其混合物。调节剂，并且特别是硅酮，可以被包含在组合物中。用于本发明的组合物中的调节剂典型地包含形成乳化液体颗粒的水不溶性、水分散性、非挥发性的液体。用于在所述组合物中使用的适合的调节剂是通常表征为以下的那些调节剂：硅酮(例如，硅酮油、阳离子硅酮、硅酮胶、高折射性硅酮、以及硅酮树脂)、有机调节油(例如，烃油、聚烯烃、以及脂肪酯)或其组合，或者以另外方式于本文的水性表面活性剂基质中形成液体分散颗粒的那些调节剂。此类调节剂应该在物理和化学上是与组合物的主要组分相容的，并且不应该以另外的方式不适当地损害组合物稳定性、美感或性能。

在组合物中调节剂的浓度应该足以提供所希望的调节益处。这种浓度可以随着调节剂、所希望的调节性能、调节剂颗粒的平均大小、其他组分的类型和浓度以及其他类似因素而变化。

硅酮调节剂的浓度范围典型地是从0.01wt％至10wt％。适合的硅酮调节剂以及对于硅酮的任选的悬浮剂的非限制性实例描述于美国再公告专利号34,584；US 5104646；US5106609；US 4152416；US 2826551；US 3964500；US 4364837；US 6607717；US 6482969；US5807956；US 5981681；US 6207782；US 7465439；US 7041767；US 7217777；US 2007/0286837A1；US 2005/0048549A1；US 2007/0041929A1；GB 849433；DE 10036533中，将所有文献通过引用并入本文；Chemistry and Technology of Silicones[硅酮的化学与技术]，纽约：Academic Press[学术出版社](1968)；通用电气硅酮橡胶产品数据列表SE 30、SE33、SE 54和SE 76；硅酮化合物(Silicon Compounds)，彼特拉克系统公司(PetrarchSystems,Inc.)(1984)；以及Encyclopedia of Polymer Science and Engineering[聚合物科学与工程化百科全书]，第15卷，第2版，第204-308页，John Wiley&Sons,Inc.[约翰威利父子公司](1989)中。

本发明的组合物还可以包含从0.05wt％至3wt％的至少一种有机调节油作为调节剂，单独或与其他调节剂例如硅酮(本文所述的)组合。适合的调节油包括烃油、聚烯烃、以及脂肪酯。还适合用于本文的组合物中的是在US 5674478和US 5750122或在US 4529586；US 4507280；US 4663158；US 4197865；US 4217914；US 4381919；以及US 4422853中所述的调节剂。

卫生与恶臭味-本发明的组合物还可以包含蓖麻酸锌、百里酚、季铵盐(如)、聚乙烯亚胺(例如来自巴斯夫公司(BASF)的

)及其锌络合物、银和银化合物(尤其是被设计为缓慢释放Ag⁺或纳米银分散体的那些)中的一种或多种。

益生素-组合物可以包含益生素，如WO 09/043709中所述的那些。

增泡剂-如果高的起泡是希望的，增泡剂(例如C₁₀-C₁₆烷醇酰胺或C₁₀-C₁₄烷基硫酸酯)可以典型地以1wt％至10wt％的水平掺入组合物中。C₁₀-C₁₄单乙醇和二乙醇酰胺阐述了此类增泡剂的典型的类别。此类增泡剂与高的起泡辅助表面活性剂(如，以上提及的氧化胺、甜菜碱、以及磺基甜菜碱(sultaine))一起使用也是有利的。如果希望的话，水溶性镁和/或钙盐(例如MgCl₂、MgSO₄、CaCl₂、CaSO₄等)可以典型地以0.1wt％至2wt％的水平添加，以提供另外的泡沫并且以增强油脂去除性能。

泡沫抑制剂-用于减少或抑制泡沫形成的化合物可以掺入本发明的组合物中。泡沫抑制在如在US 4489455和US 4489574中描述的所谓“高浓度清洁工艺”中以及在前载式(front-loading-style)洗涤机中可能是特别重要的。多种多样的材料可以用作泡沫抑制剂，并且泡沫抑制剂对于本领域的技术人员而言是熟知的。参见，例如Kirk OthmerEncyclopedia of Chemical Technology[柯克·奥思默化工百科全书]，第三版，第7卷，第430-447页(John Wiley&Sons,Inc.[约翰威利父子公司]，1979)。泡沫抑制剂的实例包括单羧基脂肪酸以及其中的可溶盐，高分子量烃例如石蜡，脂肪酸酯(例如，脂肪酸甘油三酯)，单价醇的脂肪酸酯，脂肪族C₁₈-C₄₀酮(例如，硬脂酮)，N-烷基化的氨基三嗪，优选具有约100℃之下的熔点的蜡烃，硅酮泡沫抑制剂，以及二级醇。泡沫抑制剂描述于US 2954347、US4265779、US 4265779、US 3455839、US 3933672、US 4652392、US 4978471、US 4983316、US5288431、US 4639489、US 4749740、US 4798679、US 4075118、EP 89307851.9、EP 150872、和DOS 2,124,526中。

对于有待用于自动洗衣机中的任何洗涤剂组合物，泡沫不应该形成到它们溢出洗涤机的程度。当使用时，泡沫抑制剂优选以“泡沫抑制量”存在。“泡沫抑制量”意指组合物的配制者可以选择这种泡沫控制剂的量，这个量将充分地控制泡沫以导致用于自动洗衣机中的低起泡衣物洗涤剂。

本文的组合物将通常包含从0至10wt％的泡沫抑制剂。当用作泡沫抑制剂时，单羧基脂肪酸以及其中的盐将典型地以高达5wt％的量存在。优选地，使用从0.5wt％至3wt％的脂肪单羧酸酯泡沫抑制剂。典型地以高达2.0wt％的量使用硅酮泡沫抑制剂，虽然可以使用更高的量。通常以从0.1wt％至2wt％的范围的量使用单硬脂酰磷酸酯泡沫抑制剂。典型地以从0.01wt％至5.0wt％的范围的量使用烃泡沫抑制剂，虽然可以使用更高的水平。典型地以0.2wt％至3wt％使用醇泡沫抑制剂。

本文的组合物可以在宽范围的pH内具有清洁活性。在某些方面，组合物具有从pH4至pH 11.5的清洁活性。在其他方面，组合物从pH6至pH11、从pH7至pH11、从pH8至pH11、从pH9至pH11、或从pH10至pH11.5具有活性。

本文的组合物可以在宽范围的温度(例如从10℃或更低至90℃)内具有清洁活性。优选地，所述温度将是低于50℃或40℃或甚至30℃。在某些方面，对于所述组合物来说的最适温度范围是从10℃至20℃、从15℃至25℃、从15℃至30℃、从20℃至30℃、从25℃至35℃、从30℃至40℃、从35℃至45℃、或从40℃至50℃。

在一方面，洗涤剂组合物可以包含：亚硫酸盐源，如例如亚硫酸氢钠；脂肪酶，如例如本发明的脂肪酶；直链烷基苯磺酸酯；C12-16 Pareth-9；丙二醇；醇乙氧基硫酸酯、水、聚乙烯亚胺乙氧基化物、甘油；脂肪酸盐；PEG-136聚乙酸乙烯酯；乙二胺二琥珀酸盐；单乙醇胺柠檬酸；乙二烯三胺五乙酸钠；联苯乙烯二苯基二磺酸二钠；甲酸钙；甲酸钠、氢化蓖麻油；染料；苯并异噻唑啉；香料；以及任选地一种或多种酶。在一方面，洗涤剂组合物可以包含：亚硫酸盐源，像例如亚硫酸钾；脂肪酶像例如本发明的脂肪酶；MEA-十二烷基苯磺酸盐；丙二醇；C12-14 Pareth-7；水；月桂醇聚醚硫酸酯MEA盐；MEA-棕榈仁油酸盐；PEI乙氧基化物；甘油；MEA柠檬酸盐；PARFUM；十二烷基苯磺酸；氯化镁；二苯乙烯基联苯二磺酸二钠；PEG/PPG-10/2丙基庚基醚；氢化蓖麻油；乙醇胺；聚苯乙烯；甲酸钠；山梨醇；三丙二醇；2-丙烯酸与乙烯基苯的聚合物；丁基苯基甲基丙酸；硫酸；和任选地更多的酶。

组合物的形式

本文所述的本发明的组合物可以被有利地用在例如洗衣应用、硬表面清洁、餐具洗涤应用、连同化妆品应用(如义齿、牙齿、头发和皮肤)中。本发明的组合物具体是固体或液体清洁和/或处理组合物。在一方面，本发明涉及组合物，其中所述组合物的形式选自由以下组成的组：规则的、压缩的或浓缩的液体；凝胶；膏；皂条；规则的或压缩的粉末；粒状固体；具有两个或更多个层(相同或不同相)的均匀或多层片剂；具有一个或多个室的袋；单室或多室单位剂型；或其任何组合。

所述组合物的形式可以将多个室(例如像可水溶的袋)中或片剂的不同层中的组分物理地彼此分离。因此，可以避免组分间的不良的储存相互作用。在洗涤溶液中，每个室的不同溶解曲线还可以引起选择的组分的延迟溶解。

袋可以被配置为单一室或多室。它可以具有适合用于容持所述组合物的任何形式、形状和材料，例如在与水接触之前，不允许所述组合物从袋中释放出来。所述袋由水溶性膜制成，它包含了一个内部体积。可以将所述内部体积分成袋的室。优选的膜是聚合物材料，优选地形成膜或薄片的聚合物。优选的聚合物、共聚物或其衍生物选自聚丙烯酸酯、和水溶性丙烯酸酯共聚物、甲基纤维素、羧甲基纤维素、糊精钠、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、麦芽糊精、聚甲基丙烯酸酯，最优选地是聚乙烯醇共聚物以及羟丙基甲基纤维素(HPMC)。优选地，聚合物在膜例如PVA中的水平是至少约60％。优选的平均分子量将典型地是约20,000至约150,000。膜还可以是共混组合物，其包含可水解降解并且水可溶的聚合物共混物，如聚乳酸和聚乙烯醇(已知在贸易参考号M8630下，如由美国印第安纳州的MonoSol有限责任公司(MonoSol LLC)销售)加增塑剂，像甘油、乙二醇、丙二醇、山梨醇及其混合物。所述袋可以包含固体洗衣清洁组合物或部分组分和/或液体清洁组合物或由水溶性膜分开的部分组分。用于液体组分的室在组成上可以与含有固体的室不同(US 2009/0011970A1)。

制造组合物的方法

本发明的组合物可以被配制为任何适合的形式，并且可通过被配制者所选择的任何方法来制备，这些方法的非限制性实例描述于申请人的实例中以及US 4990280；US20030087791A1；US 20030087790A1；US 20050003983A1；US 20040048764A1；US 4762636；US 6291412；US 20050227891A1；EP 1070115A2；US 5879584；US 5691297；US 5574005；US5569645；US 5565422；US 5516448；US 5489392；US 5486303中，将所有文献通过引用并入本文。本发明的组合物或根据本发明制备的组合物包括清洁和/或处理组合物，包括但不限于用于在织物和家居护理领域中处理织物、硬表面和任何其他表面的组合物，包括：空气护理(包括空气清新剂和气味递送系统)、汽车护理、餐具洗涤、织物调节(包括软化和/或清新)、洗衣去垢、洗衣和漂洗添加剂和/或护理、硬表面清洁和/或处理(包括地板和马桶清洁剂)、颗粒或粉末形式通用型或“重垢”洗涤剂，尤其是清洁洗涤剂；液体、凝胶或膏状形式通用型洗涤剂，尤其是所谓的重垢液体类型；液体精细织物洗涤剂；手动餐具洗涤剂或轻垢餐具洗涤剂，尤其是高起泡类型的那些；机器洗碗剂，包括用于供家庭和公共机构使用的不同的片剂、颗粒、液体和漂洗助剂类型：汽车或地毯香波，浴室清洁剂(包括马桶清洁剂)；以及清洁辅助剂，例如漂白添加剂以及“去污棒”或预处理类型、装载底物的组合物(例如添加干燥剂的片层)。优选的是用于清洁和/或处理纺织品和/或硬表面(最优选为纺织品)的组合物和方法。组合物优选地是在洗涤过程的预处理步骤中或主要洗涤步骤中(最优选用于纺织品洗涤步骤)使用的组合物。

如本文使用的，术语“织物和/或硬表面清洁和/或处理组合物”是清洁和处理组合物的子集，除非另外指出，所述子集包括颗粒或粉末形式通用型或“重垢”洗涤剂，尤其是清洁洗涤剂；液体、凝胶或膏状形式通用型洗涤剂，尤其是所谓的重垢液体类型；液体精细织物洗涤剂；手动餐具洗涤剂或轻垢餐具洗涤剂，尤其是高起泡类型的那些；机器餐具洗涤剂，包括用于供家庭和公共机构使用的不同的片剂、颗粒、液体和冲洗助剂类型；液体清洁和消毒剂，汽车或地毯香波，浴室清洁剂(包括马桶清洁剂)；织物调节组合物(包括软化和/或清新)，可以呈液体、固体和/或干燥剂片层形式；以及清洁辅助剂，例如漂白添加剂以及“去污棒”或预处理类型、装载底物的组合物(例如添加干燥剂的片层)。所有的可应用的此类组合物可以呈标准的、浓缩的或甚至高度浓缩的形式，甚至到此类组合物可以在某些方面呈非水性的程度。

本发明的脂肪酶变体

本发明还涉及亲本脂肪酶的脂肪酶变体，其中所述变体具有脂肪酶活性，与SEQID NO:2或其具有脂肪酶活性的任何片段具有至少60％但小于100％序列同一性，并在对应于亲本脂肪酶(特别是SEQ ID NO:2)的残基15、23、35、37、39、40、42、101、105、106、184、267的位置处包含一个或多个(例如若干个)取代。

在优选的实施例中，脂肪酶变体具有与以下取代对应的一个或多个取代：SEQ IDNO:2的Q15D、E，G23D、E，T35D、E，T37D、E，N39D、E，A40、DE，P42D、E，N101D、E，S105D、E，G106D、E，F184D、E或T267D、E。

在实施例中，亲本脂肪酶的变体包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、或42个取代。

在一方面，变体与亲本脂肪酶的氨基酸序列具有至少60％、例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列同一性。

在一方面，变体与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、或SEQID NO:10、或SEQ ID NO:12的多肽、或者其具有脂肪酶活性的片段具有至少60％，例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、如至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列同一性。

在一方面，本发明的变体中的取代的数目是1-40、1-30、1-20、1-10、1-5个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、或40个取代。

在一方面，变体包括在与亲本脂肪酶的位置15对应的位置处的取代。在一方面，亲本脂肪酶是SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、或SEQ ID NO:10、或SEQ ID NO:12。在一方面，在对应于SEQ ID NO:2的位置15的位置处的氨基酸被E或D取代。

在一方面，变体包括在与亲本脂肪酶的位置23对应的位置处的取代。在一方面，亲本脂肪酶是SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、或SEQ ID NO:10、或SEQ ID NO:12。在一方面，在对应于SEQ ID NO:2的位置23的位置处的氨基酸被E或D取代。

在一方面，变体包括在与亲本脂肪酶的位置35对应的位置处的取代。在一方面，亲本脂肪酶是SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、或SEQ ID NO:10、或SEQ ID NO:12。在一方面，在对应于SEQ ID NO:2的位置35的位置处的氨基酸被E或D取代。

在一方面，变体包括在与亲本脂肪酶的位置37对应的位置处的取代。在一方面，亲本脂肪酶是SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、或SEQ ID NO:10、或SEQ ID NO:12。在一方面，在对应于SEQ ID NO:2的位置37的位置处的氨基酸被E或D取代。

在一方面，变体包括在与亲本脂肪酶的位置39对应的位置处的取代。在一方面，亲本脂肪酶是SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQID NO:8、或SEQ ID NO:10、或SEQID NO:12。在一方面，在对应于SEQ ID NO:2的位置239的位置处的氨基酸被E或D取代。

在一方面，变体包括在与亲本脂肪酶的位置40对应的位置处的取代。在一方面，亲本脂肪酶是SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、或SEQ ID NO:10、或SEQ ID NO:12。在一方面，在对应于SEQ ID NO:2的位置40的位置处的氨基酸被E或D取代。

在一方面，变体包括在与亲本脂肪酶的位置42对应的位置处的取代。在一方面，亲本脂肪酶是SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、或SEQ ID NO:10、或SEQ ID NO:12。在一方面，在对应于SEQ ID NO:2的位置42的位置处的氨基酸被E或D取代。

在一方面，变体包括在与亲本脂肪酶的位置101对应的位置处的取代。在一方面，亲本脂肪酶是SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、或SEQ ID NO:10、或SEQ ID NO:12。在一方面，在对应于位置101的位置处的氨基酸被E或D取代。

在一方面，变体包括在与亲本脂肪酶的位置105对应的位置处的取代。在一方面，亲本脂肪酶是SEQ ID NO:2；SEQ ID NO:4；SEQ ID NO:6；SEQ ID NO:8；或SEQ ID NO:10；或SEQ ID NO:12。在一方面，在对应于SEQ ID NO:2的位置105的位置处的氨基酸被E或D取代。

在一方面，变体包括在与亲本脂肪酶的位置106对应的位置处的取代。在一方面，亲本脂肪酶是SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、或SEQ ID NO:10、或SEQ ID NO:12。在一方面，在对应于SEQ ID NO:2的位置106的位置处的氨基酸被E或D取代。

在一方面，变体包括在与亲本脂肪酶的位置184对应的位置处的取代。在一方面，亲本脂肪酶是SEQ ID NO:2；SEQ ID NO:4；SEQ ID NO:6；SEQ ID NO:8；或SEQ ID NO:10；或SEQ ID NO:12。在一方面，在对应于位置184的位置处的氨基酸被E或D取代。

在一方面，变体包括在与亲本脂肪酶的位置267对应的位置处的取代。在一方面，亲本脂肪酶是SEQ ID NO:2；SEQ ID NO:4；SEQ ID NO:6；SEQ ID NO:8；或SEQ ID NO:10；或SEQ ID NO:12。在一方面，在对应于SEQ ID NO:2的位置267的位置处的氨基酸被E或D取代。

在一方面，亲本脂肪酶的变体在与以下位置中的任一个对应的两个位置处包含取代：亲本脂肪酶(特别是SEQ ID NO:2)的Q15D、E，G23D、E，T35D、E，T37D、E，N39D、E，A40D、E，P42D、E，N101D、E，S105D、E，G106D、E，F184D、E或T267D、E。在一方面，亲本脂肪酶具有SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、或SEQ ID NO:10、或SEQ ID NO:12的氨基酸序列，或其具有脂肪酶活性的片段。

在一方面，亲本脂肪酶的变体包含与以下对应的位置处的两个取代或由其组成：Q15D+G23D、Q15D+G23E、Q15D+T35D、Q15D+T35E、Q15D+T37D、Q15D+T37E、Q15D+N39D、Q15D+N39E、Q15D+A40D、Q15D+A40E、Q15D+P42D、Q15D+P42E、Q15D+N101D、Q15D+N101E、Q15D+S105D、Q15D+S105E、Q15D+G106D、Q15D+G106E、Q15D+F184D、Q15D+F184E、Q15D+T267D、Q15D+T267E、Q15E+G23D、Q15E+G23E、Q15E+T35D、Q15E+T35E、Q15E+T37D、Q15E+T37E、Q15E+N39D、Q15E+N39E、Q15E+A40D、Q15E+A40E、Q15E+P42D、Q15E+P42E、Q15E+N101D、Q15E+N101E、Q15E+S105D、Q15E+S105E、Q15E+G106D、Q15E+G106E、Q15E+F184D、Q15E+F184E、Q15E+T267D、Q15E+T267E、G23D+T35D、G23D+T35E、G23D+T37D、G23D+T37E、G23D+N39D、G23D+N39E、G23D+A40D、G23D+A40E、G23D+P42D、G23D+P42E、G23D+N101D、G23D+N101E、G23D+S105D、G23D+S105E、G23D+G106D、G23D+G106E、G23D+F184D、G23D+F184E、G23D+T267D、G23D+T267E、G23E+T35D、G23E+T35E、G23E+T37D、G23E+T37E、G23E+N39D、G23E+N39E、G23E+A40D、G23E+A40E、G23E+P42D、G23E+P42E、G23E+N101D、G23E+N101E、G23E+S105D、G23E+S105E、G23E+G106D、G23E+G106E、G23E+F184D、G23E+F184E、G23E+T267D、G23E+T267E、T35D+T37D、T35D+T37E、T35D+N39D、T35D+N39E、T35D+A40D、T35D+A40E、T35D+P42D、T35D+P42E、T35D+N101D、T35D+N101E、T35D+S105D、T35D+S105E、T35D+G106D、T35D+G106E、T35D+F184D、T35D+F184E、T35D+T267D、T35D+T267E、T35E+T37D、T35E+T37E、T35E+N39D、T35E+N39E、T35E+A40D、T35E+A40E、T35E+P42D、T35E+P42E、T35E+N101D、T35E+N101E、T35E+S105D、T35E+S105E、T35E+G106D、T35E+G106E、T35E+F184D、T35E+F184E、T35E+T267D、T35E+T267E、T37D+N39D、T37D+N39E、T37D+A40D、T37D+A40E、T37D+P42D、T37D+P42E、T37D+N101D、T37D+N101E、T37D+S105D、T37D+S105E、T37D+G106D、T37D+G106E、T37D+F184D、T37D+F184E、T37D+T267D、T37D+T267E、T37E+N39D、T37E+N39E、T37E+A40D、T37E+A40E、T37E+P42D、T37E+P42E、T37E+N101D、T37E+N101E、T37E+S105D、T37E+S105E、T37E+G106D、T37E+G106E、T37E+F184D、T37E+F184E、T37E+T267D、T37E+T267E、N39D+A40D、N39D+A40E、N39D+P42D、N39D+P42E、N39D+N101D、N39D+N101E、N39D+S105D、N39D+S105E、N39D+G106D、N39D+G106E、N39D+F184D、N39D+F184E、N39D+T267D、N39D+T267E、N39E+A40D、N39E+A40E、N39E+P42D、N39E+P42E、N39E+N101D、N39E+N101E、N39E+S105D、N39E+S105E、N39E+G106D、N39E+G106E、N39E+F184D、N39E+F184E、N39E+T267D,N39E+T267E、A40D+P42D、A40D+P42E、A40D+N101D、A40D+N101E、A40D+S105D、A40D+S105E、A40D+G106D、A40D+G106E、A40D+F184D、A40D+F184E、A40D+T267D、A40D+T267E、A40E+P42D、A40E+P42E、A40E+N101D、A40E+N101E、A40E+S105D、A40E+S105E、A40E+G106D、A40E+G106E、A40E+F184D、A40E+F184E、A40E+T267D、A40E+T267E、P42D+N101D、P42D+N101E、P42D+S105D、P42D+S105E、P42D+G106D、P42D+G106E、P42D+F184D、P42D+F184E、P42D+T267D、P42D+T267E、P42E+N101D、P42E+N101E、P42E+S105D、P42E+S105E、P42E+G106D、P42E+G106E、P42E+F184D、P42E+F184E、P42E+T267D、P42E+T267E、N101D+S105D、N101D+S105E、N101D+G106D、N101D+G106E、N101D+F184D、N101D+F184E、N101D+T267D、N101D+T267E、N101E+S105D、N101E+S105E、N101E+G106D、N101E+G106E、N101E+F184D、N101E+F184E、N101E+T267D、N101E+T267E、S105D+S105E、S105D+G106D、S105D+G106E、S105D+F184D、S105D+F184E、S105D+T267D、S105D+T267E、S105E+G106D、S105E+G106E、S105E+F184D、S105E+F184E、S105E+T267D、S105E+T267E、G106D+F184D、G106D+F184E、G106D+T267D、G106D+T267E、G106E+F184D、G106E+F184E、G106E+T267D、G106E+T267E、F184D+T267D、F184D+T267E、F184E+T267D、和F184E+T267E。

在一方面，亲本脂肪酶变体的取代进一步包括在以下位置处的一组取代(使用SEQID NO:2进行编号)，所述位置对应于：

在一方面，亲本脂肪酶具有SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、或SEQ ID NO:10、或SEQ ID NO:12的氨基酸序列，或其具有脂肪酶活性的片段。

变体可以进一步在一个或多个(例如，若干个)其他位置处包含一个或多个另外的取代。

所述氨基酸改变可以具有微小性质，即，不会显著地影响蛋白质的折叠和/或活性的保守氨基酸取代或插入；典型地为1-30个氨基酸的小缺失；小的氨基-末端或羧基末端延伸，例如氨基末端的甲硫氨酸残基；多达20-25个残基的小接头肽；或小的延伸，其通过改变净电荷或另一官能(如聚组氨酸段、抗原表位或结合结构域)来促进纯化。

保守取代的实例是在下组之内：碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸及组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸及缬氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸及酪氨酸)及小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸及甲硫氨酸)。通常不会改变比活性的氨基酸取代是本领域已知的并且例如由H.Neurath和R.L.Hill,1979,于The Proteins[蛋白质],Academic Press[学术出版社],纽约中描述。常见取代为Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly。

可替代地，氨基酸改变具有这样一种性质：改变多肽的物理化学特性。例如，氨基酸改变可以改进多肽的热稳定性、改变底物特异性、改变最适pH等。

在另一个实施例中，变体进一步包含一个或多个(例如，若干个)改变，例如与选自以下的位置中的任一个对应的取代：亲本脂肪酶(特别是SEQ ID NO:2)的4、27、38、57、58、60、83、86、91、94、97、99、111、150、163、210、216、225、227、231、233、249、254、255、256、263、264、265、266、267和269。在一方面，变体进一步包含与选自以下的位置中的任一个对应的一个或多个(例如若干个)改变(例如，取代)：亲本脂肪酶的4V、27R、38A、57G、S58A、60S、83T、86V、91A/N/Q、94K/R、97M、99K、111A、150G、163K、210K/Q、216P、225R、L227G、231R、233R、249R、254S、255A、256K/T/V、263Q、264A、265T、266D、267A、和269N。在一方面，亲本脂肪酶具有SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、或SEQ ID NO:10、或SEQID NO:12的氨基酸序列，或其具有脂肪酶活性的片段。

可以根据本领域中已知的程序，如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(Cunningham和Wells,1989,Science[科学]244:1081-1085)来鉴别多肽中的必需氨基酸。在后种技术中，在分子中的每个残基处引入单个丙氨酸突变，并且测试所得突变分子的脂肪酶活性以鉴别对分子的活性关键的氨基酸残基。还参见，Hilton等人,1996,J.Biol.Chem.[生物化学杂志]271:4699-4708。酶或其他生物学相互作用的活性部位还可通过对结构的物理分析来确定，如由下述技术确定：核磁共振、晶体学(crystallography)、电子衍射、或光亲和标记，连同对推定的接触位点(contract site)氨基酸进行突变。参见，例如，de Vos等人,1992,Science[科学]255:306-312；Smith等人,1992,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]224:899-904；Wlodaver等人,1992,FEBS Lett.[欧洲生物化学学会联盟通讯]309:59-64。还可以从与相关多肽的比对来推断必需氨基酸的身份。

变体可以由SEQ ID NO:2的氨基酸数目的至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％组成或含有它们。

在一方面，与亲本脂肪酶相比，变体具有改进的稳定性。在一方面，亲本脂肪酶是SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、或SEQ ID NO:10、或SEQ ID NO:12。在一方面，与亲本脂肪酶相比，变体在亚硫酸盐源的存在下具有改进的稳定性。在一方面，亲本脂肪酶是SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、或SEQ ID NO:10、或SEQ ID NO:12。可以通过如实例1中所述的“稳定性测定”来确定在亚硫酸盐源的存在下的改进的稳定性。

在一方面，与亲本脂肪酶相比，变体在洗涤剂组合物中具有改进的稳定性。在一方面，亲本脂肪酶是SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、或SEQ ID NO:10、或SEQ ID NO:12。在一方面，与亲本脂肪酶相比，变体在包含亚硫酸盐源的洗涤剂组合物中具有改进的稳定性。在一方面，亲本脂肪酶是SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、或SEQ ID NO:10、或SEQ ID NO:12。

在一方面，与亲本脂肪酶相比，变体在储存条件下具有改进的稳定性。在一方面，亲本脂肪酶是SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、或SEQ ID NO:10、或SEQ ID NO:12。在一方面，与亲本脂肪酶相比，变体在亚硫酸盐源的存在下在储存条件下具有改进的稳定性。在一方面，亲本脂肪酶是SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQID NO:8、或SEQ ID NO:10、或SEQ ID NO:12。

在一方面，与亲本脂肪酶相比，变体具有改进的热稳定性。在一方面，亲本脂肪酶是SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、或SEQ ID NO:10、或SEQ ID NO:12。在一方面，与亲本脂肪酶相比，变体在亚硫酸盐源的存在下具有改进的热稳定性。在一方面，亲本脂肪酶是SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、或SEQ ID NO:10、或SEQ ID NO:12。

亲本脂肪酶

亲本脂肪酶可以是(a)与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、或SEQ ID NO:10、或SEQ ID NO:12的多肽具有至少60％序列同一性的多肽；(b)由以下多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸在低严格条件下与(i)SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、或SEQ ID NO:11的多肽编码序列，(ii)(i)的全长互补序列杂交；或(c)由以下多核苷酸编码的多肽，所述多肽与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、或SEQ ID NO:11的多肽编码序列具有至少60％序列同一性。

在一方面，亲本与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、或SEQID NO:10、或SEQ ID NO:12的多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性，所述多肽具有脂肪酶活性。在一方面，亲本的氨基酸序列与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、或SEQ IDNO:10、或SEQ ID NO:12的多肽相差多达40个氨基酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、或40个氨基酸。

在一方面，亲本包含SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、或SEQ ID NO:10、或SEQ ID NO:12的氨基酸序列，或由其组成。

在一方面，亲本是SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、或SEQID NO:10、或SEQ ID NO:12的多肽的片段，所述片段含有SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQID NO:6、SEQ ID NO:8、或SEQ ID NO:10、或SEQ ID NO:12的氨基酸数目的至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、或至少95％。

在一方面，亲本是SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、或SEQID NO:10、或SEQ ID NO:12的多肽的等位基因变体。

在一方面，亲本由以下多核苷酸编码，所述多核苷酸在非常低严格条件、低严格条件、中严格条件、中高严格条件、高严格条件或非常高严格条件下与(i)SEQ ID NO:1、SEQID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、或SEQ ID NO:11的多肽编码序列，(ii)(i)的全长互补序列杂交(Sambrook等人,1989,Molecular Cloning:A Laboratory Manual[分子克隆实验指南],第2版,Cold Spring Harbor[冷泉港],纽约)。

SEQ ID NO：1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9或SEQ IDNO:11的多核苷酸或其子序列，连同SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、或SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:12的多肽或其片段可以被用于设计核酸探针，以根据本领域熟知的方法从不同属或物种的菌株鉴别并克隆编码亲本的DNA。特别地，可以遵循标准DNA印迹程序，使用此类探针来与感兴趣的细胞的基因组DNA或cDNA杂交，以便鉴别和分离其中的相应基因。此类探针可明显短于完整序列，但是长度应为至少15，如至少25、至少35、或至少70个核苷酸。优选地，所述核酸探针长度为至少100个核苷酸，例如长度为至少200个核苷酸、至少300个核苷酸、至少400个核苷酸、至少500个核苷酸、至少600个核苷酸、至少700个核苷酸、至少800个核苷酸、或至少900个核苷酸。DNA和RNA探针两者都可使用。典型地将探针进行标记(例如，用³²P、³H、³⁵S、生物素、或抗生物素蛋白)，用于检测相应的基因。此类探针涵盖于本发明中。

可以针对与上文所述的探针杂交并编码亲本的DNA来筛选由此类其他菌株制备的基因组DNA或cDNA文库。来自此类其他菌株的基因组DNA或其他DNA可通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳或其他分离技术来分离。可将来自文库的DNA或分离的DNA转移到并固定在硝化纤维素或其他适合的运载体材料上。为了鉴别与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、或SEQ ID NO:11或其子序列杂交的克隆或DNA，将运载体材料用于DNA印迹中。

出于本发明的目的，杂交表明多核苷酸在非常低至非常高严格条件下，与标记的核酸探针杂交，所述核酸探针对应于(i)SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ IDNO:7、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:11；(ii)SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ IDNO:7、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:11的多肽编码序列；(iii)其全长互补序列；或(iv)其子序列。可以使用例如X-射线胶片或本领域已知的任何其他检测手段来检测在这些条件下核酸探针杂交的分子。

在一方面，核酸探针是SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、或SEQ ID NO:9、或SEQ ID NO:11的多肽编码序列。在一方面，核酸探针是SEQ ID NO:1、SEQID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、或SEQ ID NO:11的核苷酸数目的至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、或至少95％。在一方面，核酸探针是编码SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:8、或SEQ ID NO:10、或SEQ ID NO:12的多肽；其多肽；或其片段的多核苷酸。在一方面，核酸探针是SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、或SEQID NO:11。

在一方面，亲本由以下多核苷酸编码，所述多核苷酸与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、或SEQ ID NO:11的多肽编码序列具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性。

所述多肽可以是杂合多肽，其中一种多肽的区域在另一种多肽的区域的N-末端或C-末端处融合。

所述亲本可以是融合多肽或可切割融合多肽，其中另一种多肽在本发明多肽的N-末端或C-末端处融合。通过将编码另一种多肽的多核苷酸融合于本发明的多核苷酸来产生融合多肽。用于产生融合多肽的技术是本领域已知的，且包括连接编码多肽的编码序列使得它们符合读框，而且融合多肽的表达处于一个或多个相同的启动子和终止子的控制之下。还可以使用内含肽技术构建融合多肽，其中在翻译后产生融合多肽(Cooper等人,1993,EMBO J.[欧洲分子生物学学会杂志]12:2575-2583；Dawson等人,1994,Science[科学]266:776-779)。

融合多肽可进一步包含两个多肽之间的切割位点。在融合蛋白分泌之时，所述位点被切割，从而释放出这两种多肽。切割位点的实例包括但不限于在以下文献中披露的位点：Martin等人,2003,J.Ind.Microbiol.Biotechnol.[工业微生物生物技术杂志]3:568-576；Svetina等人,2000,J.Biotechnol.[生物技术杂志]76:245-251；Rasmussen-Wilson等人,1997,Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学]63:3488-3493；Ward等人,1995,Biotechnology[生物技术]13:498-503；和Contreras等人,1991,Biotechnology[生物技术]9:378-381；Eaton等人,1986,Biochemistry[生物化学]25:505-512；Collins-Racie等人,1995，Biotechnology[生物技术]13:982-987；Carter等人,1989,Proteins:Structure,Function,and Genetics[蛋白质：结构、功能以及遗传学]6:240-248；以及Stevens,2003,Drug Discovery World[药物发现世界]4:35-48。

亲本可以从任何属的微生物中获得。出于本发明的目的，如本文与给出的来源结合使用的，术语“从……获得”应当意指由多核苷酸编码的亲本是由所述来源或由其中已经插入来自所述来源的多核苷酸的菌株产生的。在一方面，亲本是胞外分泌的。

亲本可以是细菌脂肪酶。例如，亲本可以是革兰氏阳性细菌多肽，如芽孢杆菌属、梭菌属、肠球菌属、土芽孢杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、海洋芽孢杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属、链霉菌属或嗜热裂孢菌属脂肪酶；或革兰氏阴性细菌多肽，如弯曲杆菌属、大肠杆菌、黄杆菌属、梭杆菌属、螺杆菌属、泥杆菌属、奈瑟氏菌属、假单胞菌属、沙门菌属或脲原体属脂肪酶。

在一方面，亲本是嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)、凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)、坚硬芽孢杆菌(Bacillus firmus)、灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)脂肪酶。

在一方面，亲本是类马链球菌(Streptococcus equisimilis)、化脓链球菌、乳房链球菌、或马链球菌兽疫亚种(Streptococcus equi subsp.Zooepidemicus)脂肪酶。

在一方面，亲本是不产色链霉菌、除虫链霉菌、天蓝链霉菌、灰色链霉菌、或浅青紫链霉菌脂肪酶。

在一方面，亲本是阿尔巴嗜热裂孢菌(Thermobifida alba)或褐色嗜热裂孢菌(Thermobifidafusca)(之前称为褐色热单孢菌)脂肪酶。

亲本可以是真菌脂肪酶。例如，亲本可以是酵母脂肪酶，如假丝酵母属(Candida)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母(Schizosaccharomyces)或耶氏酵母属(Yarrowia)脂肪酶；或丝状真菌脂肪酶，例如枝顶孢霉属、伞菌属、链格孢属、曲霉属、短梗霉属、葡萄座腔菌属(Botryospaeria)、拟蜡菌属、毛喙壳属、金孢子菌属、麦角菌属、旋孢腔菌属、鬼伞属、乳白蚁属、棒囊壳属、隐丛赤壳菌属、隐球菌属、色二孢属、黑耳属、线黑粉酵母属(Filibasidium)、镰孢属、赤霉属、全鞭毛虫属、腐质霉属、耙齿菌属、香菇属(Lentinula)、小腔球菌属(Leptospaeria)、梨孢菌属(Magnaporthe)、黑果菌属(Melanocarpus)、亚灰树花菌属(Meripilus)、毛霉属、毁丝霉属、新美鞭菌属、链孢菌属、拟青霉属、青霉菌属、平革菌属、瘤胃壶菌属、Poitrasia、假黑盘菌属、假披发虫属、根毛霉菌属、裂褶菌属、柱顶孢属、篮状菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳霉属、弯颈霉属、木霉属、长毛盘菌属、轮枝孢属、小包脚菇属、或炭角菌属脂肪酶。

在一方面，亲本是卡尔酵母(Saccharomyces carlsbergensis)、酿酒酵母、糖化酵母、道格拉氏酵母(Saccharomyces douglasii)、克鲁弗酵母(Saccharomyces kluyveri)、诺地酵母或卵形酵母脂肪酶。

在一方面，亲本是解纤维枝顶孢霉(Acremonium cellulolyticus)、棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、臭曲霉(Aspergillusfoetidus)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillusoryzae)、狭边金孢子菌(Chrysosporiuminops)、嗜角质金孢子菌(Chrysosporiumkeratinophilum)、拉克淖金孢子菌(Chrysosporiumlucknowense)、粪状金孢子菌(Chrysosporiummerdarium)、毡金孢子菌(Chrysosporiumpannicola)、昆士兰金孢子菌(Chrysosporiumqueenslandicum)、热带金孢子菌(Chrysosporiumtropicum)、带纹金孢子菌(Chrysosporiumzonatum)、杆孢状镰孢(Fusarium bactridioides)、禾谷镰孢(Fusarium cerealis)、库威镰孢(Fusariumcrookwellense)、黄色镰孢菌(Fusariumculmorum)、禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)、禾赤镰孢(Fusarium graminum)、异孢镰孢(Fusarium heterosporum)、合欢木镰孢(Fusarium negundi)、尖孢镰孢菌(Fusariumoxysporum)、多枝镰孢(Fusarium reticulatum)、粉红镰孢菌(Fusarium roseum)、接骨木镰孢(Fusarium sambucinum)、肤色镰孢(Fusarium sarcochroum)、拟枝孢镰孢菌(Fusarium sporotrichioides)、硫色镰孢菌(Fusarium sulphureum)、圆镰孢(Fusariumtorulosum)、拟丝孢镰孢菌(Fusarium trichothecioides)、镶片镰孢菌(Fusariumvenenatum)、灰腐质霉(Humicolagrisea)、特异腐质霉(Humicolainsolens)、柔毛腐质霉(Humicolalanuginosa)、白囊耙齿菌(Irpexlacteus)、米黑毛霉(Mucor miehei)、嗜热毁丝霉(Myceliophthorathermophila)、粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)、绳状青霉菌(Penicillium funiculosum)、产紫青霉(Penicillium purpurogenum)、黄孢原毛平革菌(Phanerochaetechrysosporium)、无色梭孢壳(Thielaviaachromatica)、成层梭孢壳菌(Thielaviaalbomyces)、白毛梭孢壳(Thielaviaalbopilosa)、澳洲梭孢壳(Thielaviaaustraleinsis)、粪梭孢壳(Thielaviafimeti)、小孢梭孢壳(Thielaviamicrospora)、卵孢梭孢壳(Thielaviaovispora)、秘鲁梭孢壳(Thielaviaperuviana)、毛梭孢壳(Thielaviasetosa)、瘤孢梭孢壳(Thielaviaspededonium)、耐热梭孢壳(Thielaviasubthermophila)、土生梭孢壳(Thielaviaterrestris)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、康宁木霉(Trichoderma koningii)、长枝木霉(Trichodermalongibrachiatum)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、或绿色木霉(Trichoderma viride)脂肪酶。

在一方面，亲本是疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶，例如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQID NO:6、SEQ ID NO:8、或SEQ ID NO:10、或SEQ ID NO:12的脂肪酶。

应理解的是对于前述的种，本发明涵盖完全和不完全阶段(perfect andimperfect states)，和其他分类学的等同物(equivalent)，例如无性型(anamorph)，而与它们已知的种名无关。本领域的技术人员会容易地识别适当等同物的身份。

这些物种的菌株可容易地在许多培养物保藏中心为公众所获得，如美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)、德国微生物和细胞培养物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，DSMZ)、荷兰菌种保藏中心(CentraalbureauVoorSchimmelcultures，CBS)以及美国农业研究服务专利培养物保藏中心北方地区研究中心(Agricultural Research Service Patent CultureCollection,Northern Regional Research Center，NRRL)。

可以使用以上探针，鉴别亲本并从其他来源包括从自然界(例如，土壤、堆肥、水等)分离的微生物获得所述亲本，或从天然材料(例如，土壤、堆肥、水等)直接获得DNA样品。用于从天然生境中直接分离微生物和DNA的技术是本领域熟知的。然后可通过类似地筛选另一种微生物或混合DNA样品的基因组DNA或cDNA文库来获得编码亲本的多核苷酸。一旦已经用一种或多种探针检测到编码亲本的多核苷酸，则可以通过利用对本领域的普通技术人员来说已知的技术来分离或克隆所述多核苷酸(参见例如，Sambrook等人,1989,同上)。

变体的制备

本发明还涉及用于获得亲本脂肪酶的脂肪酶变体的方法，其中所述变体具有脂肪酶活性，在与亲本脂肪酶的位置15、23、35、37、39、40、42、101、105、106、184、267对应的位置处包含一个或多个(例如，若干个)取代，所述亲本脂肪酶可以具有SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12或其具有脂肪酶活性的片段的氨基酸序列。

在实施例中，取代选自与以下对应的位置：SEQ ID NO:2的Q15D、E，G23D、E，T35D、E，T37D、E，N39D、E，A40D、E，P42D、E，N101D、E，S105D、E，G106D、E，F184D、E，或T267D、E。

可以使用本领域已知的任何诱变程序来制备变体，如定点诱变、合成基因构建、半合成基因构建、随机诱变、改组等。

定点诱变是在编码所述亲本的多核苷酸中的一个或多个限定位点处引入一个或多个(例如，若干个)突变的技术。

通过涉及使用包含所希望的突变的寡核苷酸引物的PCR可以体外实现定点诱变。也可以通过盒式诱变进行体外定点诱变，所述盒式诱变涉及由限制酶在包括编码亲本的多核苷酸的质粒中的位点处切割并且随后将包含突变的寡核苷酸连接在多核苷酸中。通常，消化质粒和寡核苷酸的限制性酶是相同的，从而允许质粒和插入物的粘性末端彼此连接。参见例如，Scherer和Davis,1979,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]76:4949-4955；和Barton等人,1990,Nucleic Acids Res.[核酸研究]18:7349-4966。

还可以通过本领域中已知的方法在体内实现定点诱变。参见例如US 2004/0171154；Storici等人,2001,Nature Biotechnol.[自然生物技术]19:773-776；Kren等人,1998,Nat.Med.[自然医学]4:285-290；以及Calissano和Macino,1996,FungalGenet.Newslett.[真菌遗传学时事通讯]43:15-16)。

可以在本发明中使用任何定点诱变程序。存在可用于制备变体的许多可商购的试剂盒。

合成基因构建需要设计的多核苷酸分子的体外合成以编码感兴趣的多肽。基因合成可以利用多种技术来进行，如由Tian等人(2004,Nature[自然]432:1050-1054)所述的基于多路微芯片的技术、以及其中在光可编程的微流芯片上合成并组装寡核苷酸的类似技术。

使用已知的诱变、重组和/或改组方法、随后进行一个相关的筛选程序可以做出单或多氨基酸取代、缺失和/或插入并对其进行测试，所述相关的筛选程序例如由Reidhaar-Olson和Sauer,1988,Science[科学]241:53-57；Bowie和Sauer,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]86:2152-2156；WO 95/17413；或WO 95/22625。其他可以使用的方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如Lowman等人,1991,Biochemistry[生物化学]30:10832-10837；US5,223,409；WO92/06204)以及区域定向诱变(Derbyshire等人，1986，Gene[基因]46:145；Ner等人,1988,DNA 7:127)。

诱变/改组方法可以与高通量、自动化的筛选方法组合以检测由宿主细胞表达的克隆的、诱变的多肽的活性(Ness等人,1999,Nature Biotechnology[自然生物技术]17:893-896)。可从宿主细胞回收编码活性多肽的诱变的DNA分子，并使用本领域的标准方法快速测序。这些方法允许快速确定多肽中各个氨基酸残基的重要性。

通过组合合成基因构建、和/或定点诱变、和/或随机诱变、和/或改组的多方面来实现半合成基因构建。半合成构建典型地是利用合成的多核苷酸片段的过程结合PCR技术。因此，基因的限定区域可以从头合成，而其他区域可以使用位点特异性诱变引物来扩增，而还有其他区域可以进行易错PCR或非易错PCR扩增。然后可以对多核苷酸子序列进行改组。

多核苷酸

本发明还涉及编码本发明的变体的多核苷酸。

核酸构建体

本发明还涉及包含编码本发明的变体的、可操作地连接至一个或多个控制序列上的多核苷酸的核酸构建体，所述一个或多个控制序列在与控制序列相容的条件下指导编码序列在适合的宿主细胞中表达。

可以按多种方式来操纵多核苷酸以提供变体的表达。取决于表达载体，在多核苷酸插入载体之前对其进行操作可以是理想的或必需的。用于利用重组DNA方法修饰多核苷酸的技术是本领域熟知的。

控制序列可以是启动子，即由宿主细胞识别用于表达所述多核苷酸的多核苷酸。启动子包含介导变体的表达的转录控制序列。启动子可以是在宿主细胞中显示转录活性的任何多核苷酸，包括突变型、截短型和杂合型启动子，并且可以是从编码与宿主细胞同源或异源的细胞外或细胞内多肽的基因获得。

用于在细菌宿主细胞中指导本发明核酸构建体的转录的适合启动子的实例是从以下基因中获得的启动子：解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、嗜热脂肪芽孢杆菌产麦芽糖淀粉酶基因(amyM)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因、苏云金芽孢杆菌cryIIIA基因(Agaisse和Lereclus,1994,Molecular Microbiology[分子微生物学]13:97-107)、大肠杆菌lac操纵子、大肠杆菌trc启动子(Egon等人,1988,Gene[基因]69:301-315)、天蓝链霉菌琼脂水解酶基因(dagA)和原核β-内酰胺酶基因(Villa-Kamaroff等人,1978,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]75:3727-3731)以及tac启动子(DeBoer等人,1983,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]80:21-25)。其他启动子描述于Gilbert等人,1980,Scientific American[科学美国人]242:74-94的“Usefulproteins from recombinant bacteria[来自重组细菌的有用蛋白质]”；和在Sambrook等人,1989,同上。串联启动子的实例披露于WO 99/43835中。

用于指导本发明的核酸构建体在丝状真菌宿主细胞中的转录的适合启动子的实例是从以下的基因获得的启动子：构巢曲霉乙酰胺酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、米曲霉TAKA淀粉酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、尖孢镰孢胰蛋白酶样蛋白酶(WO 96/00787)、镶片镰孢淀粉葡糖苷酶(WO00/56900)、镶片镰孢Daria(Fusarium venenatum Daria)(WO 00/56900)、镶片镰孢Quinn(Fusarium venenatum Quinn)(WO 00/56900)、米黑根毛霉(Rhizomucormiehei)脂肪酶、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶IV、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉β-木糖苷酶，以及NA2-tpi启动子(一种修饰的启动子，其来自曲霉属中性α-淀粉酶基因，其中未翻译的前导序列由曲霉属丙糖磷酸异构酶基因的未翻译的前导序列替代；非限制性实例包括来自黑曲霉中性α-淀粉酶基因的修饰的启动子，其中已经用来自构巢曲霉或米曲霉丙糖磷酸异构酶基因的未翻译的前导序列替换未翻译的前导序列)；及其突变型、截短型及杂合型启动子。

在酵母宿主中，从以下酶的基因获得有用的启动子：酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母乙醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH1，ADH2/GAP)、酿酒酵母磷酸丙糖异构酶(TPI)、酿酒酵母金属硫蛋白(CUP1)、和酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。酵母宿主细胞的其他有用的启动子由Romanos等人,1992,Yeast[酵母]8:423-488描述。

控制序列也可为由宿主细胞识别以终止转录的转录终止子。终止子序列被可操作地连接至编码变体的多核苷酸的3’-末端。可以使用在宿主细胞中有功能的任何终止子。

细菌宿主细胞的优选终止子从以下的基因获得：克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprH)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(amyL)、和大肠杆菌核糖体RNA(rrnB)。

丝状真菌宿主细胞的优选终止子获得自以下的基因：构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡萄糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶以及尖孢镰孢菌胰蛋白酶样蛋白酶。

用于酵母宿主细胞的优选的终止子从以下酶的基因获得：酿酒酵母烯醇化酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)、以及酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶。酵母宿主细胞的其他有用的终止子由Romanos等人,1992,同上描述。

控制序列还可以是启动子下游和基因的编码序列上游的mRNA稳定子区域，其增加所述基因的表达。

适合的mRNA稳定子区的实例是从以下获得的：苏云金芽孢杆菌cryIIIA基因(WO94/25612)和枯草芽孢杆菌SP82基因(Hue等人，1995，Journal of Bacteriology[细菌学杂志]177:3465-3471)。

控制序列也可以是前导序列，即对宿主细胞翻译很重要的mRNA的非翻译区域。前导序列可操作地连接至编码所述变体的多核苷酸的5’-末端。可以使用在宿主细胞中有功能的任何前导序列。

用于丝状真菌宿主细胞的优选前导序列从米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶的基因获得。

酵母宿主细胞的适合的前导序列从以下酶的基因获得：酿酒酵母烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α因子、和酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)。

控制序列还可以是多腺苷酸化序列，即被可操作地连接至所述变体编码序列的3’-末端并且当转录时由宿主细胞识别成将多腺苷酸残基添加到所转录的mRNA上的信号的序列。可以使用在宿主细胞中有功能的任何多腺苷酸化序列。

丝状真菌宿主细胞的优选多腺苷酸化序列从以下酶的基因获得：构巢曲霉邻氨基苯甲酸酯合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉-α葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶、和尖孢镰孢胰蛋白酶样蛋白酶。

酵母宿主细胞的有用的多腺苷酸化序列由Guo和Sherman,1995,Mol.CellularBiol.[分子细胞生物学]15:5983-5990描述。

控制序列还可以是信号肽编码区，所述信号肽编码区编码与变体的N-末端连接的信号肽，并且指导变体进入细胞的分泌通路。多核苷酸的编码序列的5’-端可以固有地含有信号肽编码序列，所述信号肽编码序列在翻译阅读框中与编码变体的编码序列的区段天然地连接在一起。可替代地，编码序列的5'-端可包含对于编码序列为外源的信号肽编码序列。在编码序列天然地不包含信号肽编码序列的情况下，可能需要外源信号肽编码序列。可替代地，外源信号肽编码序列可以简单地替代天然信号肽编码序列，以便增强变体的分泌。然而，可以使用指导表达的变体进入宿主细胞的分泌通路的任何信号肽编码序列。

用于细菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是从芽孢杆菌NCIB 11837产麦芽糖淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶、地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT、nprS、nprM)和枯草芽孢杆菌prsA的基因获得的信号肽编码序列。另外的信号肽由Simonen和Palva,1993,Microbiological Reviews[微生物评论]57:109-137描述。

用于丝状真菌宿主细胞的有效的信号肽编码序列是从以下酶的基因获得的信号肽编码序列：黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶、特异腐质霉纤维素酶、特异腐质霉内切葡聚糖酶V、疏棉状腐质霉脂肪酶和米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶。

用于酵母宿主细胞的有用的信号肽从酿酒酵母α-因子和酿酒酵母转化酶的基因获得。其他的有用的信号肽编码序列由Romanos等人,1992,同上描述。

所述控制序列还可以是编码位于变体的N-末端的前肽的前肽编码序列。所得的多肽被称为前体酶(proenzyme)或多肽原(或在一些情况下被称为酶原(zymogen))。多肽原通常是无活性的并且可通过催化切割或自身催化切割来自多肽原的前肽而转化为活性多肽。前肽编码序列可以从以下的基因获得：枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、嗜热毁丝霉漆酶(WO 95/33836)、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、以及酿酒酵母α因子。

在信号肽序列和前肽序列两者都存在的情况下，前肽序列定位成紧邻变体的N-末端并且信号肽序列定位成紧邻前肽序列的N-末端。

还令人希望的可以是添加相对于宿主细胞的生长来调节变体的表达的调节序列。调节系统的实例是响应于化学或物理刺激而引起基因的表达开启或关闭的那些，包括调控化合物的存在。原核系统中的调节系统包括lac、tac和trp操纵子系统。在酵母中，可以使用ADH2系统或GAL1系统。在丝状真菌中，可以使用黑曲霉葡糖淀粉酶启动子、米曲霉TAKA α-淀粉酶启动子、以及米曲霉葡糖淀粉酶启动子。调节序列的其他实例是允许基因扩增的那些序列。在真核系统中，这些调节序列包括在甲氨蝶呤存在下扩增的二氢叶酸还原酶基因以及用重金属扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况下，编码变体的多核苷酸将与调节序列可操作地连接。

表达载体

本发明还涉及包括编码本发明的变体的多核苷酸、启动子、以及转录和翻译终止信号的表达载体(优选地重组表达载体)。各种核苷酸和控制序列可以连接在一起以产生重组表达载体，所述重组表达载体可以包括一个或多个适合的限制位点以允许在此类位点处插入或取代编码变体的多核苷酸。可替代地，可以通过将多核苷酸或包含所述多核苷酸的核酸构建体插入用于表达的适当载体中而表达所述多核苷酸。在产生所述表达载体时，所述编码序列位于所述载体中，这样使得所述编码序列与所述用于表达的适当控制序列可操作地连接。

重组表达载体可以是可以方便地经受重组DNA程序并且可以引起多核苷酸表达的任何载体(例如，质粒或病毒)。载体的选择将典型地取决于载体与待引入载体的宿主细胞的相容性。载体可以是直链或闭合环状质粒。

载体可以是自主复制载体，即作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如质粒、染色体外元件、微染色体或人工染色体。载体可以包含用于确保自我复制的任何手段。可替代地，载体可以是这样的载体，当它引入宿主细胞中时整合入基因组中并与其中已整合了它的一个或多个染色体一起复制。此外，可以使用单独的载体或质粒或两个或更多个载体或质粒，其共同包含待引入宿主细胞基因组的总DNA，或可以使用转座子。

载体优选地包含允许方便地选择转化细胞、转染细胞、转导细胞等细胞的一个或多个选择性标志。选择性标志是一种基因，其产物提供了杀生物剂抗性或病毒抗性、对重金属抗性、对营养缺陷型的原养型等。

细菌选择性标志的实例是地衣芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌dal基因、或赋予抗生素抗性(如氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素、新霉素、大观霉素、或四环素抗性)的标志。酵母宿主细胞的适合的标志包括但不限于：ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。用于在丝状真菌宿主细胞中使用的选择性标志包括但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(草胺膦乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)、pyrG(乳清苷-5’-磷酸脱羧酶)、sC(硫酸腺苷基转移酶)、以及trpC(邻氨基苯甲酸合酶)，连同其等同物。优选的用于曲霉细胞中的是构巢曲霉或米曲霉amdS和pyrG基因以及吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)bar基因。

载体优选地包含允许载体整合到宿主细胞的基因组中或载体在细胞中独立于基因组自主复制的一个或多个元件。

为了整合至宿主细胞基因组中，载体可以依赖于编码变体的多核苷酸序列或用于借助同源或非同源重组整合至基因组中的任何其他载体元件。可替代地，所述载体可包含用于指导通过同源重组而整合入宿主细胞基因组中的染色体中的精确位置处的另外的多核苷酸。为了增加在精确位置处整合的可能性，整合元件应当包含足够数目的核酸，如100至10,000个碱基对、400至10,000个碱基对和800至10,000个碱基对，所述核酸与对应的靶序列具有高度序列同一性以增强同源重组的概率。整合元件可以是与宿主细胞基因组内的靶序列同源的任何序列。此外，整合元件可以是非编码或编码的多核苷酸。另一方面，载体可以通过非同源重组整合入宿主细胞的基因组中。

为了自主复制，载体还可以另外包含复制起点，所述复制起点使得载体在讨论中的宿主细胞中自主复制成为可能。复制起点可以是在细胞中发挥作用的介导自主复制的任何质粒复制子。术语“复制起点”或“质粒复制子”意指使质粒或载体能够在体内复制的多核苷酸。

细菌复制起点的实例是允许在大肠杆菌中复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177、和pACYC184的复制起点，以及允许在芽孢杆菌属中复制的质粒pUB110、pE194、pTA1060、和pAMβ1的复制起点。

用于酵母宿主细胞中的复制起点的实例是2微米复制起点、ARS1、ARS4、ARS1与CEN3的组合、及ARS4与CEN6的组合。

在丝状真菌细胞中有用的复制起点的实例是AMA1和ANS1(Gems等人,1991,Gene[基因]98:61-67；Cullen等人,1987,Nucleic Acids Res.[核酸研究]15:9163-9175；WO00/24883)。可根据WO 00/24883中披露的方法完成AMA1基因的分离和包含所述基因的质粒或载体的构建。

可以将多于一个拷贝的本发明的多核苷酸插入宿主细胞中以增加变体的产生。通过将序列的至少一个另外的拷贝整合到宿主细胞基因组中或者通过包括与所述多核苷酸一起的可扩增的选择性标志基因可以获得多核苷酸的增加的拷贝数目，其中通过在适当的选择性试剂的存在下培养细胞可以选择包含选择性标志基因的经扩增的拷贝以及由此所述多核苷酸的另外的拷贝的细胞。

用于连接以上所述的元件以构建本发明的重组表达载体的程序是本领域的普通技术人员熟知的(参见例如，Sambrook等人,1989,同上)。

宿主细胞

本发明还涉及重组宿主细胞，所述重组宿主细胞包含编码本发明的变体的、可操作地连接至一个或多个控制序列的多核苷酸，所述一个或多个控制序列指导本发明的变体的产生。将包含多核苷酸的构建体或载体引入宿主细胞中，这样使得所述构建体或载体作为染色体整合体或作为自主复制的染色体外载体维持，如较早前所述。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间出现的突变而与亲本细胞不完全相同的任何亲本细胞子代。宿主细胞的选择在很大程度上将取决于编码变体的基因及其来源。

宿主细胞可以是在变体的重组产生中有用的任何细胞，例如原核细胞或真核细胞。

原核宿主细胞可以是任何革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。革兰氏阳性细菌包括但不限于：芽孢杆菌属(Bacillus)、梭菌属(Clostridium)、肠球菌属(Enterococcus)、土芽孢杆菌属(Geobacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、大洋芽孢杆菌属(Oceanobacillus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、链球菌属(Streptococcus)和链霉菌属(Streptomyces)。革兰氏阴性细菌包括但不限于弯曲杆菌属、大肠杆菌、黄杆菌属、梭杆菌属、螺杆菌属、泥杆菌属、奈瑟氏菌属、假单孢菌属、沙门氏菌属和脲原体属。

细菌宿主细胞可以是任何芽孢杆菌属细胞，包括但不限于嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚硬芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌以及苏云金芽孢杆菌细胞。

细菌宿主细胞还可以是任何链球菌属细胞，包括但不限于类马链球菌(Streptococcus equisimilis)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、乳房链球菌(Streptococcus uberis)以及马链球菌兽疫亚种(Streptococcus equisubsp.Zooepidemicus)细胞。

细菌宿主细胞还可以是任何链霉菌属细胞，包括但不限于：不产色链霉菌、除虫链霉菌、天蓝链霉菌、灰色链霉菌、以及浅青紫链霉菌细胞。

将DNA引入芽孢杆菌属细胞中可以通过以下方式来实现：原生质体转化(参见例如，Chang和Cohen,1979,Mol.Gen.Genet.[分子遗传学与基因组学]168:111-115)、感受态细胞转化(参见例如，Young和Spizizen,1961，J.Bacteriol.[细菌学杂志]81:823-829；或Dubnau和Davidoff-Abelson,1971,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]56:209-221)、电穿孔(参见例如，Shigekawa和Dower,1988，Biotechniques[生物技术]6:742-751)或接合(参见例如，Koehler和Thorne,1987,J.Bacteriol.[细菌学杂志]169:5271-5278)。将DNA引入大肠杆菌细胞中可以通过以下方式来实现：原生质体转化(参见例如，Hanahan，1983，J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]166:557-580)或电穿孔(参见例如，Dower等人，1988，Nucleic Acids Res.[核酸研究]16:6127-6145)。将DNA引入链霉菌属细胞中可以通过以下来实现：原生质体转化、电穿孔(参见例如，Gong等人,2004,Folia Microbiol.(Praha)[叶线形微生物学(布拉格)]49:399-405)、接合(参见例如，Mazodier等人,1989,J.Bacteriol.[细菌学杂志]171:3583-3585)、或转导(参见例如，Burke等人,2001,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]98:6289-6294)。将DNA引入假单孢菌属细胞中可以通过以下来实现：电穿孔(参见例如，Choi等人,2006,J.Microbiol.Methods[微生物学方法杂志]64:391-397)或接合(参见例如，Pinedo和Smets,2005,Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学]71:51-57)。将DNA引入链球菌属细胞中可以通过以下来实现：天然感受态(natural competence)(参见例如，Perry和Kuramitsu,1981,Infect.Immun.[感染与免疫]32:1295-1297)、原生质体转化(参见例如，Catt和Jollick,1991,Microbios[微生物学]68:189-207)、电穿孔(参见例如，Buckley等人,1999，Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学]65:3800-3804)、或接合(参见例如，Clewell,1981,Microbiol.Rev.[微生物学评论]45:409-436)。然而，可以使用本领域已知的将DNA引入宿主细胞中的任何方法。

宿主细胞还可以是真核生物，如哺乳动物、昆虫、植物或真菌细胞。

宿主细胞可以是真菌细胞。如本文使用的“真菌”包括子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)和接合菌门(Zygomycota)以及卵菌门(Oomycota)和所有有丝分裂孢子真菌(如由Hawksworth等人在以下文献中所定义：Ainsworth and Bisby’s Dictionary of The Fungi[安·贝氏菌物词典],第8版,1995,CAB International[国际应用生物科学中心],University Press,Cambridge[剑桥大学出版社]，英国)。

真菌宿主细胞可以为酵母细胞。如本文使用的“酵母”包括产子囊酵母(ascosporogenous yeast)(内孢霉目(Endomycetales))、产担子酵母(basidiosporogenous yeast)和属于半知菌类(Fungi Imperfecti)(芽孢纲(Blastomycetes))的酵母。由于酵母的分类可能在将来变化，出于本发明的目的，酵母应当如Biology and Activities of Yeast[酵母的生物学与活性](Skinner、Passmore和Davenport编辑,Soc.App.Bacteriol.Symposium Series No.9[应用细菌学学会专题论文集系列9],1980)中所述的那样定义。

酵母宿主细胞可以是假丝酵母属(Candida)细胞、汉逊酵母属(Hansenula)细胞、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)细胞、毕赤酵母属(Pichia)细胞、酵母菌属(Saccharomyces)细胞、裂殖酵母(Schizosaccharomyces)或耶罗维亚酵母属(Yarrowia)细胞、例如乳酸克鲁弗酵母(Kluyveromyces lactis)细胞、卡尔酵母(Saccharomycescarlsbergensis)细胞、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)细胞、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)细胞、道格拉氏酵母(Saccharomyces douglasii)细胞、克鲁弗酵母(Saccharomyces kluyveri)细胞、诺地酵母(Saccharomyces norbensis)细胞、卵形酵母(Saccharomyces oviformis)细胞或解脂耶罗维亚酵母(Yarrowialipolytica)细胞。

真菌宿主细胞可为丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌门(Eumycota)和卵菌门(Oomycota)的亚门的所有丝状形式(如由Hawksworth等人，1995(见上文)所定义的)。丝状真菌通常的特征在于由几丁质、纤维素、葡聚糖、壳多糖、甘露聚糖和其他复杂多糖构成的菌丝体壁。营养生长是通过菌丝延长来进行的，而碳分解代谢是专性需氧的。相反，酵母(如酿酒酵母)的营养生长是通过单细胞菌体的出芽(budding)来进行的，而碳分解代谢可以是发酵性的。

丝状真菌宿主细胞可以是枝顶孢霉属、曲霉属、短梗霉属、烟管霉属(Bjerkandera)、拟腊菌属、金孢子菌属、鬼伞属、革盖菌属(Coriolus)、隐球菌属、线黑粉菌科(Filibasidium)、镰孢属、腐质霉属、梨孢菌属、毛霉属、毁丝霉属、新美鞭菌属、链孢菌属、拟青霉属、青霉属、平革菌属、射脉菌属(Phlebia)、瘤胃壶菌属、侧耳属(Pleurotus)、裂褶菌属、篮状菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属、栓菌属(Trametes)或木霉属细胞。

例如，丝状真菌宿主细胞可以是泡盛曲霉、臭曲霉、烟曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、黑刺烟管菌(Bjerkanderaadusta)、干拟蜡菌(Ceriporiopsisaneirina)、卡内基拟蜡菌(Ceriporiopsiscaregiea)、浅黄拟蜡孔菌(Ceriporiopsisgilvescens)、潘诺希塔拟蜡菌(Ceriporiopsispannocinta)、环带拟蜡菌(Ceriporiopsisrivulosa)、微红拟蜡菌(Ceriporiopsissubrufa)、虫拟蜡菌(Ceriporiopsissubvermispora)、狭边金孢子菌(Chrysosporiuminops)、嗜角质金孢子菌、卢克诺文思金孢子菌(Chrysosporiumlucknowense)、粪状金孢子菌(Chrysosporiummerdarium)、毡金孢子菌、昆士兰金孢子菌(Chrysosporiumqueenslandicum)、热带金孢子菌、褐薄金孢子菌(Chrysosporiumzonatum)、灰盖鬼伞(Coprinus cinereus)、毛革盖菌(Coriolushirsutus)、杆孢状镰孢、禾谷镰孢、库威镰孢、大刀镰孢、禾谷镰孢菌、禾赤镰孢(Fusarium graminum)、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖孢镰孢菌、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰孢菌、硫色镰孢菌、圆镰孢、拟丝孢镰孢、镶片镰孢、特异腐质霉、疏棉状腐质霉、米黑毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙脉孢菌、产紫青霉、黄孢平革菌(Phanerochaetechrysosporium)、射脉菌(Phlebia radiata)、刺芹侧耳(Pleurotuseryngii)、土生梭孢壳霉、长域毛栓菌(Trametesvillosa)、变色栓菌(Trametesversicolor)、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉、或绿色木霉细胞。

可以将真菌细胞通过涉及原生质体形成、原生质体转化、以及细胞壁再生的方法以本身已知的方式转化。用于转化曲霉属和木霉属宿主细胞的适合程序在EP 238023和Yelton等人，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]81:1470-1474、以及Christensen等人，1988，Bio/Technology[生物/技术]6:1419-1422中描述。用于转化镰孢属物种的适合方法由Malardier等人，1989，Gene[基因]78:147-156，以及WO 96/00787描述。可以使用由如以下文献描述的程序转化酵母：Becker和Guarente,于Abelson,J.N.和Simon，M.I.编辑,Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology[酵母遗传学与分子生物学指南],Methods in Enzymology[酶学方法],第194卷,第182-187页,AcademicPress，Inc.[学术出版社有限公司],纽约中；Ito等人,1983,J.Bacteriol.[细菌学杂志]153:163；以及Hinnen等人,1978,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]75:1920。

产生方法

本发明还涉及产生亲本脂肪酶的变体的方法，所述方法包括：(a)在适合于表达所述变体的条件下培养本发明的宿主细胞；和(b)回收所述变体。

使用本领域已知的方法在适合于产生变体的营养介质中培养宿主细胞。例如，可以通过摇瓶培养，或者在适合的培养基中并在允许变体表达和/或分离的条件下在实验室或工业发酵罐中进行小规模或大规模发酵(包括连续发酵、分批发酵、分批给料发酵或固态发酵)来培养细胞。使用本领域中已知的程序，培养发生在包含碳和氮来源及无机盐的适合的营养介质中。适合的培养基可从商业供应商获得或可以根据公开的组成(例如，在美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)的目录中)制备。如果变体被分泌到营养介质中，则变体可以直接从培养基中回收。如果变体没有分泌，则它可以从细胞裂解液中回收。

可以使用本领域已知的对所述变体特异的方法检测所述变体。这些检测方法包括但不限于：特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。例如，可以使用酶测定来确定变体的活性(如实例中所述的那些)。

可以使用本领域已知的方法回收所述变体。例如，可以通过多种常规程序从营养介质中回收所述变体，所述常规方法包括但不限于收集、离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀。

可以通过本领域中已知的多种程序来纯化变体以获得基本上纯的变体，所述程序包括但不限于色谱法(例如，离子交换色谱、亲和色谱、疏水作用色谱、色谱聚焦、以及尺寸排阻色谱)、电泳程序(例如，制备型等电点聚焦)、差别溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE、或萃取(参见例如，Protein Purification[蛋白质纯化],Janson和Ryden编辑,VCHPublishers[VCH出版社],纽约,1989)。

在可替代的方面，没有回收变体，而是将表达变体的本发明的宿主细胞用作变体的来源。

脂肪酶颗粒

本发明的脂肪酶变体可以作为脂肪酶颗粒包含在水溶性膜中。所述脂肪酶颗粒可以含有一种或多种另外的酶，如下面所述。

脂肪酶颗粒是呈固体微粒形式的脂肪酶变体的任何形式。脂肪酶颗粒可以是脂肪酶晶体、脂肪酶沉淀、喷雾或冻干的脂肪酶或任何形式的粒状脂肪酶，为粉末或液体中的悬浮液。典型地，测量为等效球径(基于体积的平均粒度)的脂肪酶颗粒的粒度低于2mm，优选低于1mm、低于0.5mm、低于0.25mm、或低于0.1mm；并且高于0.05μm，优选高于0.1μm、高于0.5μm、高于1μm、高于5μm或高于10μm。在优选的方面，脂肪酶颗粒的粒度是从0.5μm至100μm。

脂肪酶颗粒包含至少1％w/w脂肪酶蛋白、优选至少5％w/w脂肪酶蛋白、至少10％w/w脂肪酶蛋白、至少20％w/w脂肪酶蛋白、至少30％w/w脂肪酶蛋白、至少40％w/w脂肪酶蛋白、至少50％w/w脂肪酶蛋白、至少60％w/w脂肪酶蛋白、至少70％w/w脂肪酶蛋白、至少80％w/w脂肪酶蛋白、或至少90％w/w脂肪酶蛋白。

在优选的实施例中，脂肪酶颗粒是脂肪酶晶体，或脂肪酶蛋白呈晶体形式。可以按如本领域中已知的多种方式进行酶结晶(例如，如WO 91/09943或WO 94/22903中所述的)。

脂肪酶可以被配制在如本领域已知的脂肪酶颗粒中，用于固体酶配制品，例如用于减少粉尘、改进稳定性和或改变酶的释放速率的配制品。脂肪酶颗粒还可以被配制在基质中或涂覆有试剂，所述基质或试剂抑制酶颗粒在用于制备水溶性膜的PVOH/膜溶液中溶解。

脂肪酶颗粒的表面上的脂肪酶分子还可以是交联的，像CLEC(交联酶晶体)或CLEA(交联酶聚集体)。

水溶性膜

水溶性膜、用于其中的任选成分以及制备它们的方法在本领域是熟知的。在一类实施例中，水溶性膜包含PVOH。PVOH是通常通过醇解(通常被称为水解或皂化)聚乙酸乙烯酯而制备的合成树脂。完全水解的PVOH(其中几乎所有乙酸基基团已被转化为醇基团)是仅在热水(高于约140°F(60℃))中溶解的强氢键键合的高度结晶聚合物。如果在聚乙酸乙烯酯水解之后允许剩余足够数目的乙酸基，那么所述PVOH聚合物被称作部分水解的，它的氢键键合更弱并且结晶度更低并且在冷水(低于约50°F(10℃))中是可溶的。中间冷/热水溶性膜可以包括例如中间部分水解的PVOH(例如，具有约94％至约98％的水解度)，并且仅在温水(例如，在约40℃及以上的温度下快速溶解)中易溶。完全和部分水解的PVOH类型都通常被称为PVOH均聚物，尽管部分水解的类型在技术上是乙烯醇-乙酸乙烯酯共聚物。

包括于水溶性膜中的PVOH的水解度可以是约75％至约99％。当水解度降低时，由树脂制成的膜将具有降低的机械强度但是在低于约20℃的温度更快的溶解。当水解度增加时，由树脂制成的膜将倾向于机械强度更高并且热成型性将倾向于降低。可以对PVOH的水解度进行选择这样使得所述树脂的水溶性是温度依赖性的，并且因此由树脂、相容性试剂以及另外的成分制成的膜的溶解度也受到影响。在一类实施例中，膜是冷水溶性的。冷水溶性膜(在低于10℃的温度下可溶于水中)可以包括水解度在约75％至约90％范围内、或在约80％至约90％范围内、或在约85％至约90％范围内的PVOH。在另一类实施例中，膜是热水溶性的。热水溶性膜(在至少约60℃的温度下可溶于水中)可以包括水解度为至少约98％的PVOH。

除了PVOH之外或在PVOH的替代方案中，其他所使用的成膜树脂可包括但不限于修饰的聚乙烯醇、聚丙烯酸酯、水溶性丙烯酸脂共聚物、聚丙烯酸酯、聚丙烯酰胺、聚乙烯吡咯烷酮、普鲁兰，水溶性天然聚合物包括但不限于瓜尔胶、黄原胶、角叉菜胶、以及淀粉，水溶性聚合物衍生物包括但不限于乙氧基化的淀粉和羟丙基化的淀粉、、聚(丙烯酰胺基-2-甲基丙烷磺酸钠)、聚马来酸单甲酯、其共聚物以及前述项的任何组合。在一类实施例中，成膜树脂是由乙烯醇、乙酸乙烯酯和丙烯酰胺基-2-甲基丙烷磺酸钠组成的三元共聚物。出人意料地，基于乙烯醇、乙酸乙烯酯和丙烯酰胺基-2-甲基丙烷磺酸钠的三元共聚物的水溶性膜已经展示出高百分比的酶回收。

水溶性树脂可以按任何适合的量(例如在约35wt％至约90wt％范围内的量)包括在所述水溶性膜中。水溶性树脂的量与所有酶、酶稳定剂和辅助添加剂的组合量相比的优选重量比可以是任何适合的比率，例如在约0.5至约5、或约1至约3、或约1至约2范围内的比率。

用于本文所述的膜中使用的水溶性树脂(包括但不限于PVOH树脂)可以由对于所希望的膜特性而言任何适合的粘度来表征，任选地在约5.0cP至约30.0cP、或约10.0cP至约25cP范围内的粘度。PVOH树脂的粘度通过使用具有UL适配器的布氏(Brookfield)LV型粘度计来测量新制备的溶液而确定，如在英国标准EN ISO 15023-2:2006附录E布氏测试法中所述的。在20℃阐述4％聚乙烯醇水溶液的粘度是国际惯例。本文以cP指定的所有PVOH粘度应被理解为是指在20℃下4％聚乙烯醇水溶液的粘度，除非另外说明。

本领域中熟知的是，PVOH树脂的粘度与同一PVOH树脂的重量平均分子量

相关，并且所述粘度通常被用作

的代理。因此，水溶性树脂的重均分子量任选地可以在约35,000至约190,000、或约80,000至约160,000的范围内。树脂的分子量只需要足以使得它被适合的技术模制形成塑料薄膜即可。

水溶性膜可以例如以适合于其预期目的的量包括其他任选添加剂成分，包括但不限于，增塑剂、表面活性剂、消泡剂、成膜剂、防粘连剂、内脱模剂、抗黄变剂以及其他功能性成分。

水被认为是对于PVOH和其他聚合物而言非常有效的增塑剂；然而，水的挥发性使其效用受到限制，因为聚合物膜需要对包括低和高相对湿度在内的多种环境条件具有至少一些耐受性(稳健性)。甘油的挥发性比水小得多，并且已经被很好地确立为对于PVOH和其他聚合物而言有效的增塑剂。如果在膜配制品中所使用的水平太高，甘油或其他这种液态增塑剂它们自身可以引起表面“出汗(sweating)”和油腻。这在膜中可以导致以下问题，例如给消费者的手以不可接受的触感，并且如果没有以一定的方式(例如，表面撒粉)减轻出汗，甚至会将膜阻断在辊上或成堆薄片中。这可以表征为过塑化。然而，如果添加至膜的增塑剂太少，所述膜对很多最终用途可能缺乏足够的延展性和柔性，例如被转化成最终使用类型，例如袋。

用于在本披露的水溶性膜中使用的增塑剂包括但不限于山梨醇、甘油、双甘油、丙二醇、乙二醇、二甘醇、三甘醇、四甘醇、聚乙二醇(高达MW400)、2甲基1,3丙二醇、乳酸、甘油一乙酸酯、三醋精、柠檬酸三乙酯、1,3-丁二醇、三羟甲基丙烷(TMP)、聚醚三醇及其组合。如上文所述的，多元醇通常可用作增塑剂。增塑剂使用越少，膜可能变得越脆，而增塑剂使用越多，膜可能失去拉伸强度。增塑剂可以按例如在约25phr至约50phr、或从约30phr至约45phr、或从约32phr至约42phr范围内的量包含于水溶性膜中。

用于在水溶性膜中使用的表面活性剂在本领域是熟知的。任选地，包括表面活性剂以在浇铸时帮助树脂溶液的分散。用于本披露的水溶性膜的适合的表面活性剂包括但不限于二烷基磺基琥珀酸酯、甘油和丙二醇的乳酸化脂肪酸酯、脂肪酸乳酰酯、烷基硫酸钠、聚山梨酯20、聚山梨酯60、聚山梨酯65、聚山梨酯80、烷基聚氧乙烯醚、卵磷脂、甘油和丙二醇的乙酰化脂肪酸酯、月桂基硫酸钠、脂肪酸乙酰化酯、肉豆蔻基二甲基氧化胺、三甲基牛脂烷基氯化铵、季铵化合物、其盐以及上述任何项的组合。因此，表面活性剂可以按例如小于约2phr，例如小于约1phr、或小于约0.5phr的量包含于水溶性膜中。

考虑使用的一种类型的次级组分是消泡剂。消泡剂可以有助于聚结泡沫气泡。在根据本披露的水溶性膜中使用的适合的消泡剂包括但不限于疏水性二氧化硅，例如细粒度的二氧化硅或煅制二氧化硅，包括Foam消泡剂(可得自爱墨瑞得高性能材料公司(Emerald Performance Materials))，包括Foam

327、Foam

UVD、Foam

163、Foam269、

338、Foam

290、Foam

332、Foam

349、Foam550以及Foam

339，它们是专有的非矿物油消泡剂。在实施例中，可以按0.5phr或更少的量使用消泡剂，例如0.05phr、0.04phr、0.03phr、0.02phr或0.01phr。优选地，为了避免应激致白，将避免显著量的二氧化硅。

用于制备水溶性物品(包括膜)的方法包括浇铸、吹塑、挤出或吹制挤出，如本领域中已知的。一类考虑的实施例由本文所述的水溶性膜通过浇铸形成表征，例如通过将本文所述的成分与水混合以产生水性混合物(例如具有任选地分散的固体的溶液)，向表面施加所述混合物，并且干燥去除水以产生膜。类似地，可通过干燥所述混合物，同时将其局限为所希望的形状以形成其他组合物。

在一类考虑的实施例中，通过浇铸水溶性混合物形成水溶性膜，其中所述水溶性混合物根据以下步骤制备：

(a)提供水溶性树脂、水以及排除增塑剂的任何任选的添加剂的混合物；

(b)将混合物煮沸30分钟；

(c)将混合物在烘箱中在至少40℃的温度脱气；任选地在40℃至70℃的范围内，例如约65℃；

(d)在65℃或更低的温度下向混合物中添加一种或多种酶、增塑剂以及另外的水；和

(e)在无涡旋的情况下搅拌混合物，直到混合物的颜色和稠度看起来大体上一致；任选地持续在30分钟至90分钟的范围内的一段时间，任选地至少1小时；和

(f)在搅拌的时间段之后迅速浇铸混合物(例如，在4小时、或2小时、或1小时内)。

如果过早地将酶添加至混合物(例如，与辅助添加剂或树脂一起)，酶活性可能降低。不旨在受任何具体理论的束缚，据信将具有酶的混合物煮沸导致酶变性并且在溶液中储存延长的时间段同样导致酶活性降低。

在一类实施例中，在中度至温和条件下通过迅速干燥膜使得根据本披露的水溶性膜保持高的酶活性。如本文使用的，迅速干燥是指小于24小时，任选地小于12小时、任选地小于8小时、任选地小于2小时、任选地小于1小时、任选地小于45分钟、任选地小于30分钟、任选地小于20分钟、任选地小于10分钟，例如在约6分钟至约10分钟或8分钟的范围内的干燥时间。如本文使用的，中度至温和条件是指低于170°F(77℃)，任选地在约150°F至约170°F(约66℃至约77℃)的范围内，例如，165°F(74℃)的干燥温度。随着干燥温度增加，酶倾向于越快变性，而随着干燥温度降低，干燥时间增加，由此使酶在延长的时间段内暴露在溶液中。

所述膜可用于产生包以容纳组合物，例如，衣物洗涤或餐具洗涤组合物，由此形成袋。本文所述的膜还可用于制备具有两个或更多个室的包，所述包由相同的膜或者结合其他聚合材料的膜制成。另外的膜可以是例如通过浇铸、吹塑、挤出或吹制挤出相同或者不同的聚合材料而获得的，如本领域中已知的。在一个类型的实施例中，适合用作另外的膜的聚合物、共聚物或其衍生物选自聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚环氧烷、聚丙烯酸、纤维素、纤维素醚、纤维素酯、纤维素酰胺、聚乙酸乙烯酯、聚羧酸和盐、聚氨基酸或肽、聚酰胺、聚丙烯酰胺、马来酸/丙烯酸的共聚物、多糖(包括淀粉和明胶)、天然胶(如黄原胶和角叉菜胶)。例如，聚合物可以选自聚丙烯酸酯和水溶性丙烯酸酯共聚物、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、糊精、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、麦芽糊精、聚甲基丙烯酸酯及其组合，或选自聚乙烯醇、聚乙烯醇共聚物和羟丙基甲基纤维素(HPMC)及其组合。

袋和/或包可以包含至少一个密封室。因此，袋可以包括单个室或多个室。所述袋可以具有含酶和不含酶的区域。在包括多个室的实施例中，每个室可以含有相同的和/或不同的组合物。进而，所述组合物可以采取任何适合的形式，包括但不限于液体、固体及其组合(例如，悬浮在液体中的固体)。在一些实施例中，所述袋包括第一、第二和第三室，其中每一个室分别容纳不同的第一、第二和第三组合物。在一些实施例中，如在EP 2258820中所述的，组合物可以是视觉上不同的。

多室袋和/或包的室可以具有一个或多个相同的或不同的尺寸和/或体积。本发明的多室袋的室可以是分开的或以任何适合方式结合的。在一些实施例中，第二和/或第三和/或随后的室叠加在第一室上。在一方面，第三室可以叠加在所述第二室上，所述第二室进而以夹层构型叠加在所述第一室上。可替代地，第二和第三室可以叠加在第一室上。然而，还可以同样地设想的是，第一、第二和任选地第三和随后的室可以按并排的关系相互附接。室可以被包装成一串，每个室通过穿孔线是各自地可分开的。因此，每个室可以被最终用户从所述串的剩余部分单独地撕去。

在一些实施例中，多室袋和/或包包括三个室，这三个室由一个大的第一室和两个较小的室组成。较小的第二和第三室叠加在大的第一室上。对所述室的尺寸和几何结构进行选择，这样使得此安排是可实现的。所述室的几何结构可以是相同或不同的。在一些实施例中，与第一室相比，第二和任选地第三室各自具有不同的几何结构和形状。在这些实施例中，第二和任选地第三室以某种设计被安排在第一室上。所述设计可以是装饰性的、教导性的、或说明性的，例如以说明一个概念或指导，和/或用于指示所述产品的来源。在一些实施例中，第一室是最大的室，它具有两个大的围绕周边密封的面，而第二室较小，它覆盖小于约75％、或小于约50％的第一室的一个面的表面积。在存在有一个第三室的实施例中，上述结构可以是相同的，但是所述第二和第三室覆盖小于约60％、或小于约50％、或小于约45％的所述第一室的一个面的表面积。

所述袋和/或包可以包含一种或多种不同的膜。例如，在单个室的实施例中，包可以由一个折叠到其自身上并且在边缘处密封的壁制成，或者可替代地，由两个在边缘处密封在一起的壁制成。在多个室的实施例中，包可以由一种或多种膜制成，这样使得任何给定的包室可以包含由单种膜或具有不同组成的多种膜制成的壁。在一个方面，多室袋包括至少三个壁：外上壁、外下壁和分隔壁。所述外上壁和所述外下壁通常是相对的并且形成所述袋的外部。分隔壁在袋的内部并且沿着密封线被固定至通常相对的外壁。分隔壁将多室袋的内部分隔成至少一个第一室和一个第二室。在一类实施例中，分隔壁可以是唯一含有酶的膜由此最小化消费者对酶的暴露。

袋和包可用任何适合的设备和方法制成。例如，单个室袋可用本领域公知的立式填充、卧式填充或转鼓填充技术制成。此类方法可以是连续的或间断的。可以将所述膜润湿和/或加热以提高其延展性。所述方法还可以涉及使用真空以将膜牵引到一个适合的模具中。一旦膜处在所述表面的水平部分上，将所述膜牵引到所述模具中的真空可以实施约0.2至约5秒、或约0.3至约3、或约0.5至约1.5秒。所述真空可以这样使得它提供例如在10毫巴至1000毫巴的范围内、或在100毫巴至600毫巴的范围内的一个下压。

所述模具(包可以在其中制成)可具有任何形状、长度、宽度和深度，取决于所述袋所需要的维度。如果希望的话，模具还可以彼此在大小和形状上不同。例如，最终的袋的体积可以为约5mL至约300mL、或约10mL至150mL、或约20mL至约100mL，并且所述模具大小可相应被调整。

在一方面，包包括第一密封室和第二密封室。通常，第二室与第一密封室呈叠加关系，这样使得第二密封室和第一密封室共用袋内部的一个分隔壁。

在一方面，包括第一室和第二室的包进一步包括第三密封室。通常，第三密封室与第一密封室呈叠加关系，这样使得第三密封室和第一密封室共用袋内部的一个分隔壁。

在不同方面，第一组合物和第二组合物选自以下组合之一：液体、液体；液体、粉末；粉末、粉末；以及粉末、液体。

在不同方面，第一、第二和第三组合物选自以下组合之一：固体、液体、液体以及液体、液体、液体。

在一方面，单个室或多个密封室含有组合物。所述多个室可以各自含有相同或不同的组合物。所述组合物选自液体、固体或其组合。

在所述方法中，热可以被施加至所述膜，通常称为热成型。可以用任何适合的手段施加热量。例如，在将所述膜供给到表面上之前或一旦在表面上，可以通过使它处于加热元件之下或通过热空气而直接对其加热。可替代地，例如，可以通过加热表面或将热物品施加到所述膜上而间接对其加热。可以使用红外光加热所述膜。所述膜可以被加热至至少50℃，例如，约50℃至约150℃、约50℃至约120℃、约60℃至约130℃、约70℃至约120℃、或约60℃至约90℃的温度。

可替代地，可以通过任何适合的手段润湿膜，例如，在将其供给到表面上之前或一旦在表面上，直接通过将润湿剂(包括水、膜组合物的溶液、用于膜组合物的增塑剂、或前述项的任何组合)喷雾到膜上，或间接通过润湿表面或通过将湿润物品施加到膜上。

一旦膜已经被加热和/或润湿，可以将它牵引到一个适当的模具中，优选地使用真空。例如，膜可以按至少约1.5的拉伸比，以及例如，任选地高达2的拉伸比热成型。可以通过使用任何适合的手段完成所述模制膜的填充。在一些实施例中，最优选的方法将取决于产品形式和所需要的填充速度。在一些实施例中，通过在线填充技术填充所述模制膜。然后通过任何适合的方法，使用第二膜将经填充的开口包封闭，以形成袋。这可以当处于水平位置并且在连续匀速运动中完成。可以通过以下方式完成封闭：连续地将第二膜(优选水溶性膜)供给到所述开口包上方和上面，并且然后优选将第一膜和第二膜一起密封，典型地在模具之间的区域并且因此在包之间。

可以利用任何适合的密封包和/或其独立室的方法。此类手段的非限制性实例包括热密封、溶剂焊接、溶剂密封或液封及其组合。可以在至少200°F(93℃)的温度下将所述水溶性包和/或其独立室热密封，例如在约220°F(约105℃)至约290°F(约145℃)、或约230°F(约110℃)至约280°F(约140℃)的范围内。典型地，只用热或溶剂处理将形成密封的区域。典型地，可以通过任何方法将热或溶剂施加到封闭材料上，并且典型地，只施加到将形成密封的区域上。如果使用溶剂密封或液封或焊接，可以优选的是同样施加热。优选的液封或溶剂密封/焊接方法包括选择性地将溶剂施加到模具之间的区域或封闭材料上、通过例如将其喷雾或印刷到这些区域上，并且然后施加压力到这些区域上，以形成密封。例如，可以使用如上文所述的密封辊和带(任选地也提供热)。

然后，可以通过切割装置将所形成的袋切割。可以使用任何已知方法完成切割。可以优选的是，还可以按连续方式进行切割，并且优选地以恒定的速度并且优选地当处于水平位置时。切割装置可以是例如锋利物品、或热物品、或激光，由此，在后者的情况下，热物品或激光“烧”穿膜/密封区域。

多室袋的不同室可以按并排样式一起制成，其中所得到的连体袋可以通过切割而被分开或可以不被分开。可替代地，室可以被分开地制成。

在一些实施例中，可以根据包括以下步骤的方法制成袋：

a)形成第一室(如上文所述的)；

b)在步骤(a)中形成的封闭室的一些或全部内形成凹口，以产生叠加在所述第一室之上的第二模制室；

c)借助第三膜填充并封闭所述第二室；

d)密封所述第一、第二和第三膜；和

e)切割所述膜以产生多室袋。

可以通过向步骤(a)中制备的室施加真空来实现步骤(b)中形成的凹口。

在一些实施例中，第二和/或第三室可以在分开的步骤中制成，并且然后与所述第一室结合，如EP 2088187或WO 2009/152031中所述的。

在其他实施例中，可以根据包括以下步骤的方法制成袋：

a)任选地使用热和/或真空，在第一成型机上使用第一膜形成第一室；

b)用第一组合物填充所述第一室；

c)在第二成型机上，任选地使用热和真空使第二膜变形，以制成第二和任选地第三模制室；

d)填充所述第二和任选地第三室；

e)使用第三膜密封所述第二和任选地第三室；

f)将所述密封的第二和任选地第三室放到所述第一室上；

g)密封所述第一、第二和任选地第三室；和

h)切割所述膜以产生多室袋。

可以基于所述第一成型机和第二成型机进行以上方法的适合性对其进行选择。在一些实施例中，第一成型机优选为卧式成型机，而第二成型机优选为转鼓成型机，优选地位于第一成型机之上。

应当理解的是，通过使用适当的进料站，有可能制造掺入多种不同或独特组合物和/或不同或独特液体、凝胶或膏状组合物的多室袋。

使用方法

本发明包括在织物和/或家居护理领域中用于清洁任何表面(包括处理纺织品或硬表面或其他表面)的方法。考虑了如所述的清洁可以是小规模(在例如家庭家务中)以及大规模(如在例如工业和专业环境中)两者。在本发明的一方面，所述方法包括在洗涤过程的预处理步骤或主要洗涤步骤(最优选用于在纺织品洗涤步骤中使用或可替代地用于在餐具洗涤(包括手动以及自动/机械餐具洗涤两者)中使用)中接触有待处理的表面的步骤。在本发明的一方面，将脂肪酶变体和其他组分顺序地添加至用于清洁和/或处理表面的方法中。可替代地，同时地添加脂肪酶变体和其他组分。

如本文使用的，洗涤包括但不限于擦洗和机械搅拌。洗涤可以用泡沫组合物进行(如WO 08/101958中所述的)，和/或通过施加交变压力(压力/真空)作为擦洗和机械搅拌的附加方法或替代方案来进行。对此类表面或织物进行干燥可以通过在家庭或工业环境中采用的通用手段中的任一种来完成。本发明的清洁组合物理想地适用于在洗衣以及餐具洗涤应用中使用。因此，本发明包括用于清洁物体(包括但不限于织物、餐具、刀具以及厨具)的方法。所述方法包括使待清洁的物体与所述清洁组合物接触的步骤，所述清洁组合物包括申请人的清洁组合物、清洁添加剂或其混合物中的至少一方面。织物可以包括能够在常规消费者或公共机构使用条件下被洗涤的大多数任何织物。所述溶液可以具有从8至10.5的pH。可以在溶液中以从500ppm至15.000ppm的浓度使用组合物。水温范围典型地是从5℃至90℃。水与织物之比典型地是从1:1至30:1。

在一个方面，本发明涉及使用亲本脂肪酶的脂肪酶变体用于产生组合物的方法，所述亲本脂肪酶具有SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:12的氨基酸序列，其中所述变体具有脂肪酶活性，在对应于SEQ ID NO:2的位置15、23、35、37、39、40、42、101、105、106、184、267的位置处包含取代。

在一方面，取代选自亲本脂肪酶的SEQ ID NO:2的位置Q15D、E，G23D、E，T35D、E，T37D、E，N39D、E，A40D、E，P42D、E，N101D、E，S105D、E，G106D、E，F184D、E，或T267D、E。在一方面，本发明涉及组合物用于清洁物体的用途。

在一方面，本发明涉及用于清洁表面的方法，所述方法包括使待清洁的表面上存在的脂质污渍与所述清洁组合物接触。在一方面，本发明涉及用于水解存在于表面上的污渍和/或污渍中的脂质的方法，所述方法包括使污渍和/或污渍与清洁组合物接触。在一方面，本发明涉及所述组合物在羧酸酯水解中的用途。在一方面，本发明涉及所述组合物在酯的水解、合成或交换中的用途。在一方面，本发明涉及所述组合物用于制造稳定配制品的用途。

在以下段落实施例中描述了本发明：

1.一种组合物，所述组合物包含：

(a)亚硫酸盐源；

其中在半胱氨酸桥的20埃

2.如段落1所述的组合物，其中被替代的、优选被取代的氨基酸在半胱氨酸桥(即，从羧基基团到硫原子)的15埃内、优选10埃内、更优选5埃内。

3.如段落1或2所述的组合物，其中所述亚硫酸盐源选自：亚硫酸盐，如亚硫酸钠、亚硫酸钾、亚硫酸钙；亚硫酸氢盐，如亚硫酸氢钾、亚硫酸氢钠、亚硫酸氢钙；偏亚硫酸氢盐，如偏亚硫酸氢钾、偏亚硫酸氢钠、偏亚硫酸氢钙；或其任何组合。

4.如段落1-3中任一项所述的组合物，其中亚硫酸盐(为SO₃ ^2-)或偏亚硫酸氢盐(为S₂O₅ ^2-)的量是从0.1wt％至3wt％、从0.2wt％至2wt％、从0.5wt％至2wt％。

5.如段落1-4中任一项所述的组合物，其中所述脂肪酶变体是示为SEQ ID NO:2的亲本脂肪酶的变体，或与所述亲本脂肪酶特别是示为SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:6、SEQ ID NO:8、或SEQ ID NO:10、或SEQ ID NO:12的亲本脂肪酶中任一个具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、但小于100％序列同一性的脂肪酶的变体；或其具有脂肪酶活性的片段。

6.如段落1-4中任一项所述的组合物，其中所述脂肪酶变体在对应于SEQ ID NO:2的氨基酸残基15、23、35、37、39、40、42、101、105、106、184、267的位置处进一步包含一个或多个(例如若干个)取代。

7.如段落1-6中任一项所述的组合物，其中在半胱氨酸桥的20埃

8.如段落1-7中任一项所述的组合物，其中所述脂肪酶变体包含对应于SEQ IDNO:2的Q15D、E，G23D、E，T35D、E，T37D、E，N39D、E，A40D、E，P42D、E，N101D、E，S105D、E，G106D、E，F184D、E，或T267D、E的取代。

9.如段落1-8中任一项所述的组合物，其中所述亲本脂肪酶与SEQ ID NO:2、SEQID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、或SEQ ID NO:10、或SEQ ID NO:12具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性。

10.如段落1-9中任一项所述的组合物，其中所述半胱氨酸桥在所述亲本脂肪酶的表面上。

11.如段落1-10中任一项所述的组合物，其中所述半胱氨酸桥是或对应于以下位置处的半胱氨酸桥中的一个或多个：

SEQ ID NO:2的C22-C268、

C36-C41、和

C104-C107。

12.如段落1-11中任一项所述的组合物，其中与所述亲本脂肪酶特别是SEQ IDNO:2相比，所述脂肪酶变体在亚硫酸盐源的存在下具有改进的稳定性。

13.如段落1-12中任一项所述的组合物，其中亲本脂肪酶的所述变体选自由以下组成的组：

(a)由以下多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸在低严格条件、中严格条件、中-高严格条件、高严格条件或非常高严格条件下与(i)SEQ ID NO:1的多肽编码序列，或(ii)(i)的全长互补序列杂交；

(b)由以下多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸与SEQ ID NO:1的多肽编码序列具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、但小于100％序列同一性；和

(c)具有脂肪酶活性的(a)或(b)的多肽的片段。

14.如段落1-13中任一项所述的组合物，其中亲本脂肪酶的所述变体包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个取代。

15.如段落1-14中任一项所述的组合物，其中所述组合物进一步包含表面活性剂。

16.如段落1-15中任一项所述的组合物在清洁包括织物、纺织品或硬表面的表面中的用途。

17.一种亲本脂肪酶的脂肪酶变体，其中所述变体具有脂肪酶活性，与SEQ ID NO:2或其具有脂肪酶活性的任何片段具有至少60％但小于100％序列同一性，并在对应于SEQID NO:2的残基15、23、35、37、39、40、42、101、105、106、184、267的位置处包含一个或多个(例如若干个)取代。

18.如段落17所述的变体，其中所述变体具有与以下取代对应的一个或多个取代：SEQ ID NO:2的Q15D、E，G23D、E，T35D、E，T37D、E，N39D、E，A40D、E，P42D、E，N101D、E，S105D、E，G106D、E，F184D、E，或T267D、E。

19.一种多核苷酸，所述多核苷酸编码如段落17或18中任一项所述的变体。

20.一种核酸构建体，所述核酸构建体包含如段落19所述的多核苷酸。

21.一种表达载体，所述表达载体包含如段落19所述的多核苷酸。

22.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含如段落19所述的多核苷酸。

23.一种产生脂肪酶变体的方法，所述方法包括：(a)在适合于表达所述变体的条件下培养如段落22所述的宿主细胞；和(b)回收所述变体。

24.一种获得如段落17或18中任一项所述的脂肪酶变体的方法，所述方法包括：向在半胱氨酸桥的20埃

25.如段落24所述的方法，其中被引入的、优选被取代的氨基酸在半胱氨酸桥(即，从羧基基团到硫原子)的15埃内、优选10埃内、更优选5埃内。

26.如段落24或25所述的方法，其中对带更多负电荷的氨基酸的取代是在与以下位置对应的位置处完成的：SEQ ID NO:2的15、23、35、37、39、40、42、101、105、106、184、267。

27.如段落24-26中任一项所述的方法，其中所述带负电荷的氨基酸是D或E。

28.如段落24-27中任一项所述的方法，其中向所述亲本脂肪酶中引入与以下取代对应的取代中的一个或多个：SEQ ID NO:2的Q15D、E，G23D、E，T35D、E，T37D、E，N39D、E，A40D、E，P42D、E，N101D、E，S105D、E，G106D、E，F184D、E，或T267D、E。

材料与方法

对硝基苯基(pNP)测定：

可以通过使用对硝基苯基酰基酯作为底物的动力学测定来确定脂肪酶的水解活性。

可以将以下这些底物在DMSO中的100mM储备溶液在测定缓冲液(50mM Tris；pH7.7；0.4％TritonX-100)中稀释至1mM 25的终浓度：对硝基苯基丁酸酯(C4)、对硝基苯基己酸酯(C6)、对硝基苯基癸酸酯(C10)、对硝基苯基月桂酸酯(C12)和对硝基苯基棕榈酸酯(C16)(所有都来自西格玛奥德里奇丹麦公司(Sigma-Aldrich Danmark A/S)，KirkebjergAllé84，2605布隆德比目录号：C4：N-9876，C6：N-0502，C10：N-0252，C12：N-2002，C16：N-2752)。

可以将在50mM Hepes(pH 8.0)；10ppm TritonX-100；+/-20mM CaCl₂中的本发明的脂肪酶、亲本脂肪酶和适当的对照(例如缓冲液(阴性)、Lipolase^TM&Lipex^TM(阳性))按0.01mg/mL；5x10-3 mg/mL；2.5x10-4 mg/mL；和1.25x10-4 mg/ml的终浓度添加至96孔能肯(NUNC)板(目录号：260836，Kamstrupvej 90，DK-4000，罗斯基勒(Roskilde))中的底物溶液中。可以在Spectra max 190(分子设备股份有限公司(Molecular Devices GmbH)，俾斯麦林(Bismarckring)39号，里斯河畔比伯拉赫(Biberach an der Riss)88400，德国)上，以10秒间隔，在405nm处监测由对硝基苯基酰基水解而释放的对硝基酚持续5分钟。可以将变体对一种或多种底物的水解活性与亲本脂肪酶对一种或多种底物的水解活性进行比较。

实例实例1

含和不含亚硫酸盐的洗涤剂组合物中脂肪酶变体的稳定性

如WO 2016/050661(通过引用并入)中所述的，构建并在米曲霉中表达SEQ ID NO:2的脂肪酶变体。

变体的生长：

将表达脂肪酶变体的转化子接种到含有200μl YP+2％麦芽糖的96孔MTP中。它们在34℃下生长120小时(未振荡)。

通过以下方式筛选变体：

将1g亚硫酸钠添加到100g洗涤剂组合物中(2017年3月从美国P&G公司购买的TIDE^TMOriginal Scent HE涡轮增压衣物洗涤剂(Turbo Clean Liquid LaundryDetergent))，并搅拌至少10分钟。^TM

将含有亚硫酸盐的90μL洗涤剂的等分试样添加到96孔板(有500μL空间)。

将不含亚硫酸盐的90μL洗涤剂的等分试样添加到96孔板(有500μL空间)。

将磁铁添加到板上。

将来自生长板的10μL培养基添加到每个洗涤剂板中。

用铝密封将板密封，并在磁性板搅拌器上振荡至少10min。

将板在加热箱中于49℃的塑料箱中孵育19小时。

稳定性测定：

稀释缓冲液：0.1M Tris-HCl，9mM CaCl₂，0.0225％Brij-30，pH 8.0

测定缓冲液：AOS底物缓冲液：100mM Tris，6.5mM脱氧胆酸盐，1.4g/L AOS缓冲液，pH 8.0

底物：100mL AOS缓冲液，0,5mM pNP-棕榈酸酯，1mM CaCl2

将230μL稀释缓冲液添加到孵育的板中。将洗涤剂板搅拌10min。

将来自洗涤剂板的5μL添加到新的含有295μL稀释缓冲液的板中，并振摇10min。

从前两个板(含有和不含亚硫酸盐)中取10μL到384孔板中。

将40μL底物溶液添加到板上，并在Elisa读取器中运行30min。

SEQ ID NO:2的以下变体在具有亚硫酸盐的洗涤剂组合物中具有改进的稳定性(即，增加的残留活性)：T35D、N39E、P42D、N101D、S105E、F184D。

本文所述和要求保护的本发明不限于本文公开的特定方面的范围，因为这些方面旨在作为本发明若干方面的说明。任何等同方面旨在处于本发明的范围之内。实际上，除了本文所示和描述的那些之外，本发明的各种修改对于本领域的技术人员会从前述说明变得显而易见。此类修改也旨在落入所附权利要求书的范围内。在冲突的情况下，以包括定义的本公开为准。

序列表

<110> 诺维信公司（Novozymes A/S）

Vind, Jesper

Poulsen, Thomas Agersten

Pereira, Miguel Duarte Guilherme

<120> 包含脂肪酶和亚硫酸盐的组合物

<130> 14413-WO-PCT

<160> 12

<170> PatentIn3.5版本

<210> 1

<211> 807

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(807)

<400> 1

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1 5 10 15

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50 55 60

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65 70 75 80

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100 105 110

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115 120 125

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130 135 140

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245 250 255

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260 265

<210> 2

<211> 269

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 2

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<210> 3

<211> 807

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(807)

<400> 3

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115 120 125

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<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 4

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<211> 807

<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> 合成构建体

<220>

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<400> 5

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260 265

<210> 6

<211> 269

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 6

Glu Val Ser Gln Asp Leu Phe Asn Gln Phe Asn Leu Phe Ala Gln Tyr

1 5 10 15

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260 265

<210> 7

<211> 807

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(807)

<400> 7

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Gly Thr Leu Val Pro Val Arg Arg Arg Asp Ile Val Lys Ile Glu Gly

225 230 235 240

atc gat gcc acc ggc ggc aat aac cag cct aac att ccg tcc atc cct 768

Ile Asp Ala Thr Gly Gly Asn Asn Gln Pro Asn Ile Pro Ser Ile Pro

245 250 255

gcg cac cta tgg tac ttc ggg tta att ggg aca tgt ctt 807

Ala His Leu Trp Tyr Phe Gly Leu Ile Gly Thr Cys Leu

260 265

<210> 8

<211> 269

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 8

Glu Val Ser Gln Asp Leu Phe Asn Gln Phe Asn Leu Phe Ala Gln Tyr

1 5 10 15

Ser Ala Ala Ala Tyr Cys Gly Lys Asn Asn Asp Ala Pro Ala Gly Thr

20 25 30

Asn Ile Thr Cys Thr Gly Asn Ala Cys Pro Glu Val Glu Lys Ala Asp

35 40 45

Ala Thr Phe Leu Tyr Ser Phe Glu Asp Ser Gly Val Gly Asp Val Thr

50 55 60

Gly Phe Leu Ala Leu Asp Asn Thr Asn Lys Leu Ile Val Leu Ser Phe

65 70 75 80

Arg Gly Ser Arg Ser Ile Glu Asn Trp Ile Gly Asn Leu Asn Phe Glu

85 90 95

Leu Lys Glu Ile Asn Asp Ile Cys Ser Gly Cys Arg Gly His Ala Gly

100 105 110

Phe Thr Ser Ser Trp Arg Ser Val Ala Asp Thr Leu Arg Gln Lys Val

115 120 125

Glu Asp Ala Val Arg Glu His Pro Asp Tyr Arg Val Val Phe Thr Gly

130 135 140

His Ser Leu Gly Gly Ala Leu Ala Thr Val Ala Gly Ala Asp Leu Arg

145 150 155 160

Gly Asn Gly Tyr Asp Ile Asp Val Phe Ser Tyr Gly Ala Pro Arg Val

165 170 175

Gly Asn Arg Ala Phe Ala Glu Phe Leu Thr Val Gln Thr Gly Gly Thr

180 185 190

Leu Tyr Arg Ile Thr His Thr Asn Asp Ile Val Pro Arg Leu Pro Pro

195 200 205

Arg Glu Phe Gly Tyr Ser His Ser Ser Pro Glu Tyr Trp Ile Lys Ser

210 215 220

Gly Thr Leu Val Pro Val Arg Arg Arg Asp Ile Val Lys Ile Glu Gly

225 230 235 240

Ile Asp Ala Thr Gly Gly Asn Asn Gln Pro Asn Ile Pro Ser Ile Pro

245 250 255

Ala His Leu Trp Tyr Phe Gly Leu Ile Gly Thr Cys Leu

260 265

<210> 9

<211> 807

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(807)

<400> 9

gag gtc tcg cag gat ctg ttt aac cag ttc aat ctc ttt gca cag tat 48

Glu Val Ser Gln Asp Leu Phe Asn Gln Phe Asn Leu Phe Ala Gln Tyr

1 5 10 15

tct gca gcc gca tac tgc gga aaa aac aat gat gcc cca gct ggt aca 96

Ser Ala Ala Ala Tyr Cys Gly Lys Asn Asn Asp Ala Pro Ala Gly Thr

20 25 30

aac att acg tgc acg gga aat gcc tgc ccc gag gta gag aag gcg gat 144

Asn Ile Thr Cys Thr Gly Asn Ala Cys Pro Glu Val Glu Lys Ala Asp

35 40 45

gca acg ttt ctc tac tcg ttt gaa gac tct gga gtg ggc gat gtc acc 192

Ala Thr Phe Leu Tyr Ser Phe Glu Asp Ser Gly Val Gly Asp Val Thr

50 55 60

ggc ttc ctt gct ctc gac aac acg aac aaa ttg atc gtc ctc tct ttc 240

Gly Phe Leu Ala Leu Asp Asn Thr Asn Lys Leu Ile Val Leu Ser Phe

65 70 75 80

cgt ggc tct cgt tcc ata gag aac tgg atc ggg aat ctt aac ttc gac 288

Arg Gly Ser Arg Ser Ile Glu Asn Trp Ile Gly Asn Leu Asn Phe Asp

85 90 95

ttg aaa gaa ata aat gac att tgc tcc ggc tgc agg gga cat gac ggc 336

Leu Lys Glu Ile Asn Asp Ile Cys Ser Gly Cys Arg Gly His Asp Gly

100 105 110

ttc act tcg tcc tgg agg tct gta gcc gat acg tta agg cag aag gtg 384

Phe Thr Ser Ser Trp Arg Ser Val Ala Asp Thr Leu Arg Gln Lys Val

115 120 125

gag gat gct gtg agg gag cat ccc gac tat cgc gtg gtg ttt acc gga 432

Glu Asp Ala Val Arg Glu His Pro Asp Tyr Arg Val Val Phe Thr Gly

130 135 140

cat agc ttg ggt ggt gca ttg gca act gtt gcc gga gca gac ctg cgt 480

His Ser Leu Gly Gly Ala Leu Ala Thr Val Ala Gly Ala Asp Leu Arg

145 150 155 160

gga aat ggg tat gat atc gac gtg ttt tca tat ggc gcc ccc cga gtc 528

Gly Asn Gly Tyr Asp Ile Asp Val Phe Ser Tyr Gly Ala Pro Arg Val

165 170 175

gga aac agg gct ttt gca gaa ttc ctg acc gta cag acc ggc gga aca 576

Gly Asn Arg Ala Phe Ala Glu Phe Leu Thr Val Gln Thr Gly Gly Thr

180 185 190

ctc tac cgc att acc cac acc aat gat att gtc cct aga ctc ccg ccg 624

Leu Tyr Arg Ile Thr His Thr Asn Asp Ile Val Pro Arg Leu Pro Pro

195 200 205

cgc gaa ttc ggt tac agc cat tct agc cca gaa tac tgg atc aaa tct 672

Arg Glu Phe Gly Tyr Ser His Ser Ser Pro Glu Tyr Trp Ile Lys Ser

210 215 220

gga acc ctt gtc ccc gtc cgg cga cga gac atc gtg aag ata gaa ggc 720

Gly Thr Leu Val Pro Val Arg Arg Arg Asp Ile Val Lys Ile Glu Gly

225 230 235 240

atc gat gcc acc ggc ggc aat aac cag cct aac att ccg gat atc cct 768

Ile Asp Ala Thr Gly Gly Asn Asn Gln Pro Asn Ile Pro Asp Ile Pro

245 250 255

gcg cac cta tgg tac ttc ggg tta att ggg aca tgt ctt 807

Ala His Leu Trp Tyr Phe Gly Leu Ile Gly Thr Cys Leu

260 265

<210> 10

<211> 269

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 10

Glu Val Ser Gln Asp Leu Phe Asn Gln Phe Asn Leu Phe Ala Gln Tyr

1 5 10 15

Ser Ala Ala Ala Tyr Cys Gly Lys Asn Asn Asp Ala Pro Ala Gly Thr

20 25 30

Asn Ile Thr Cys Thr Gly Asn Ala Cys Pro Glu Val Glu Lys Ala Asp

35 40 45

Ala Thr Phe Leu Tyr Ser Phe Glu Asp Ser Gly Val Gly Asp Val Thr

50 55 60

Gly Phe Leu Ala Leu Asp Asn Thr Asn Lys Leu Ile Val Leu Ser Phe

65 70 75 80

Arg Gly Ser Arg Ser Ile Glu Asn Trp Ile Gly Asn Leu Asn Phe Asp

85 90 95

Leu Lys Glu Ile Asn Asp Ile Cys Ser Gly Cys Arg Gly His Asp Gly

100 105 110

Phe Thr Ser Ser Trp Arg Ser Val Ala Asp Thr Leu Arg Gln Lys Val

115 120 125

Glu Asp Ala Val Arg Glu His Pro Asp Tyr Arg Val Val Phe Thr Gly

130 135 140

His Ser Leu Gly Gly Ala Leu Ala Thr Val Ala Gly Ala Asp Leu Arg

145 150 155 160

Gly Asn Gly Tyr Asp Ile Asp Val Phe Ser Tyr Gly Ala Pro Arg Val

165 170 175

Gly Asn Arg Ala Phe Ala Glu Phe Leu Thr Val Gln Thr Gly Gly Thr

180 185 190

Leu Tyr Arg Ile Thr His Thr Asn Asp Ile Val Pro Arg Leu Pro Pro

195 200 205

Arg Glu Phe Gly Tyr Ser His Ser Ser Pro Glu Tyr Trp Ile Lys Ser

210 215 220

Gly Thr Leu Val Pro Val Arg Arg Arg Asp Ile Val Lys Ile Glu Gly

225 230 235 240

Ile Asp Ala Thr Gly Gly Asn Asn Gln Pro Asn Ile Pro Asp Ile Pro

245 250 255

Ala His Leu Trp Tyr Phe Gly Leu Ile Gly Thr Cys Leu

260 265

<210> 11

<211> 807

<212> DNA

<213> 柔毛腐质霉

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(807)

<400> 11

gag gtc tcg cag gat ctg ttt aac cag ttc aat ctc ttt gca cag tat 48

Glu Val Ser Gln Asp Leu Phe Asn Gln Phe Asn Leu Phe Ala Gln Tyr

1 5 10 15

tct gca gcc gca tac tgc gga aaa aac aat gat gcc cca gct ggt aca 96

Ser Ala Ala Ala Tyr Cys Gly Lys Asn Asn Asp Ala Pro Ala Gly Thr

20 25 30

aac att acg tgc acg gga aat gcc tgc ccc gag gta gag aag gcg gat 144

Asn Ile Thr Cys Thr Gly Asn Ala Cys Pro Glu Val Glu Lys Ala Asp

35 40 45

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50 55 60

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Gly Phe Leu Ala Leu Asp Asn Thr Asn Lys Leu Ile Val Leu Ser Phe

65 70 75 80

cgt ggc tct cgt tcc ata gag aac tgg atc ggg aat ctt aac ttc gac 288

Arg Gly Ser Arg Ser Ile Glu Asn Trp Ile Gly Asn Leu Asn Phe Asp

85 90 95

ttg aaa gaa ata aat gac att tgc tcc ggc tgc agg gga cat gac ggc 336

Leu Lys Glu Ile Asn Asp Ile Cys Ser Gly Cys Arg Gly His Asp Gly

100 105 110

ttc act tcg tcc tgg agg tct gta gcc gat acg tta agg cag aag gtg 384

Phe Thr Ser Ser Trp Arg Ser Val Ala Asp Thr Leu Arg Gln Lys Val

115 120 125

gag gat gct gtg agg gag cat ccc gac tat cgc gtg gtg ttt acc gga 432

Glu Asp Ala Val Arg Glu His Pro Asp Tyr Arg Val Val Phe Thr Gly

130 135 140

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His Ser Leu Gly Gly Ala Leu Ala Thr Val Ala Gly Ala Asp Leu Arg

145 150 155 160

gga aat ggg tat gat atc gac gtg ttt tca tat ggc gcc ccc cga gtc 528

Gly Asn Gly Tyr Asp Ile Asp Val Phe Ser Tyr Gly Ala Pro Arg Val

165 170 175

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Gly Asn Arg Ala Phe Ala Glu Phe Leu Thr Val Gln Thr Gly Gly Thr

180 185 190

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Leu Tyr Arg Ile Thr His Thr Asn Asp Ile Val Pro Arg Leu Pro Pro

195 200 205

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210 215 220

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225 230 235 240

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Ile Asp Ala Thr Gly Gly Asn Asn Gln Pro Asn Ile Pro Asp Ile Pro

245 250 255

gcg cac cta tgg tac ttc ggg tta att ggg aca tgt ctt 807

Ala His Leu Trp Tyr Phe Gly Leu Ile Gly Thr Cys Leu

260 265

<210> 12

<211> 269

<212> PRT

<213> 柔毛腐质霉

<400> 12

Glu Val Ser Gln Asp Leu Phe Asn Gln Phe Asn Leu Phe Ala Gln Tyr

1 5 10 15

Ser Ala Ala Ala Tyr Cys Gly Lys Asn Asn Asp Ala Pro Ala Gly Thr

20 25 30

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35 40 45

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50 55 60

Gly Phe Leu Ala Leu Asp Asn Thr Asn Lys Leu Ile Val Leu Ser Phe

65 70 75 80

Arg Gly Ser Arg Ser Ile Glu Asn Trp Ile Gly Asn Leu Asn Phe Asp

85 90 95

Leu Lys Glu Ile Asn Asp Ile Cys Ser Gly Cys Arg Gly His Asp Gly

100 105 110

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115 120 125

Glu Asp Ala Val Arg Glu His Pro Asp Tyr Arg Val Val Phe Thr Gly

130 135 140

His Ser Leu Gly Gly Ala Leu Ala Thr Val Ala Gly Ala Asp Leu Arg

145 150 155 160

Gly Asn Gly Tyr Asp Ile Asp Val Phe Ser Tyr Gly Ala Pro Arg Val

165 170 175

Gly Asn Arg Ala Phe Ala Glu Phe Leu Thr Val Gln Thr Gly Gly Thr

180 185 190

Leu Tyr Arg Ile Thr His Thr Asn Asp Ile Val Pro Arg Leu Pro Pro

195 200 205

Arg Glu Phe Gly Tyr Ser His Ser Ser Pro Glu Tyr Trp Ile Lys Ser

210 215 220

Gly Thr Leu Val Pro Val Thr Arg Asn Asp Ile Val Lys Ile Glu Gly

225 230 235 240

Ile Asp Ala Thr Gly Gly Asn Asn Gln Pro Asn Ile Pro Asp Ile Pro

245 250 255

Ala His Leu Trp Tyr Phe Gly Leu Ile Gly Thr Cys Leu

260 265

Claims

1.一种组合物，所述组合物包含：

(a)亚硫酸盐源；

其中在半胱氨酸桥的内的亲本脂肪酶中的一个或多个氨基酸被带更多负电荷的氨基酸替代。

2.如权利要求1所述的组合物，其中所述脂肪酶变体是示为SEQ ID NO:2的亲本脂肪酶的变体，或与所述亲本脂肪酶具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、但小于100％序列同一性的脂肪酶的变体。

3.如权利要求1或2所述的组合物，其中所述脂肪酶变体在对应于SEQ ID NO:2的氨基酸残基15、23、35、37、39、40、42、101、105、106、184、267的位置处包含一个或多个(例如若干个)取代。

4.如权利要求1-3中任一项所述的组合物，其中在半胱氨酸桥的

内的亲本脂肪酶中的氨基酸被选自D或E的带负电荷的氨基酸替代，特别地，其中所述脂肪酶变体包含对应于SEQ ID NO:2的Q15D、E，G23D、E，T35D、E，T37D、E，N39D、E，A40D、E，P42D、E，N101D、E，S105D、E，G106D、E，F184D、E，或T267D、E的取代。

5.如权利要求1-4中任一项所述的组合物，其中所述亲本脂肪酶与SEQ ID NO:2具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性。

6.如权利要求1-5中任一项所述的组合物，其中所述半胱氨酸桥是或对应于以下位置处的半胱氨酸桥中的一个或多个：

SEQ ID NO:2的

C22-C268、

C36-C41、和

C104-C107。

7.如权利要求1-6中任一项所述的组合物，其中与所述亲本脂肪酶特别是SEQ ID NO:2相比，所述脂肪酶变体在亚硫酸盐源的存在下具有改进的稳定性。

8.如权利要求1-7中任一项所述的组合物，其中亲本脂肪酶的变体选自由以下组成的组：

(c)具有脂肪酶活性的(a)或(b)的多肽的片段。

9.如权利要求1-8中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含表面活性剂。

10.如权利要求1-9中任一项所述的组合物用于清洁表面的用途。

11.一种亲本脂肪酶的脂肪酶变体，其中所述变体具有脂肪酶活性，与SEQ ID NO:2或其具有脂肪酶活性的任何片段具有至少60％但小于100％序列同一性，并在对应于SEQ IDNO:2的残基15、23、35、37、39、40、42、101、105、106、184和267的位置处包含一个或多个(例如若干个)取代。

12.如权利要求11所述的变体，其中所述变体具有与以下取代对应的一个或多个取代：SEQ ID NO:2的Q15D、E，G23D、E，T35D、E，T37D、E，N39D、E，A40D、E，P42D、E，N101D、E，S105D、E，G106D、E，F184D、E，或T267D、E。

13.一种多核苷酸，所述多核苷酸编码如权利要求11或12中任一项所述的变体。

14.一种核酸构建体，所述核酸构建体包含如权利要求13所述的多核苷酸。

15.一种表达载体，所述表达载体包含如权利要求13所述的多核苷酸。

16.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含如权利要求13所述的多核苷酸。

17.一种产生脂肪酶变体的方法，所述方法包括：(a)在适合于表达所述变体的条件下培养如权利要求16所述的宿主细胞；和(b)回收所述变体。

18.一种获得如权利要求11或12中任一项所述的脂肪酶变体的方法，所述方法包括：向在半胱氨酸桥的

19.如权利要求18所述的方法，其中引入的带更多负电荷的氨基酸是在与以下位置中的一个或多个对应的位置处完成的：SEQ ID NO:2的15、23、35、37、39、40、42、101、105、106、184、267，特别地，其中所述带更多负电荷的氨基酸是D或E。

20.如权利要求18或19所述的方法，其中取代/引入的氨基酸中的一个或多个对应于以下取代：SEQ ID NO:2的Q15D、E，G23D、E，T35D、E，T37D、E，N39D、E，A40D、E，P42D、E，N101D、E，S105D、E，G106D、E，F184D、E，或T267D、E。