JP6027092B2 - 組成物 - Google Patents

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Description

本発明は、組成物（特に、洗剤として用いるためとは限らない）に関する。本発明はまた、組成物を用い、表面及び物品、例えば、衣料品及び食卓用品を洗浄する方法に関する。
Ｗｏｓｔｅｎ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００１，５５，６２５〜６４６に記載されるとおり、ヒドロホビンは、糸状菌の生育及び発生において広範囲な役割を果たす、一般的な真菌由来のタンパク質である。例えば、それらは、気中菌糸の形成及び菌糸の疎水性表面への接着に関与する。
ヒドロホビンが機能するメカニズムは、疎水性−親水性界面（特に、空気と水の界面）で両親媒性膜に自己組織化する特性を主体とする。
典型的には、ヒドロホビンは、クラスＩ及びＩＩに分けられる。本明細書においてより詳細に記載されるとおり、クラスＩＩのヒドロホビンが組織化した両親媒性膜は、室温で様々な溶媒（特に、水性エタノールとは限らない）に再溶解させることができる。対照的に、クラスＩのヒドロホビンが組織化した両親媒性膜は、はるかに溶解性が低く、強酸（例えば、トリフルオロ酢酸又はギ酸）にのみ再溶解する。
ヒドロホビンを含有する洗剤組成物は、当該技術分野において既知である。例えば、米国公開公報第２００９／０１０１１６７号（国際公開公報第２００７／０１４８９７号に対応する）には、布を洗浄するためのヒドロホビン、具体的には、融合ヒドロホビンの使用、及びそれを含有する組成物が記載されている。
当該技術分野において、より少量で用いることができ、それにより環境への影響を最小限に抑えることができる、界面活性剤を含有する洗剤組成物が依然として必要とされている。
本発明の一態様では、
（ａ）脂質分解酵素；及び
（ｂ）本明細書において定義されるヒドロホビン；を含む組成物が提供される。
本発明の別の態様では、
（ａ）脂質分解酵素；
（ｂ）本明細書において定義されるヒドロホビン；及び
（ｃ）洗剤；を含む組成物が提供される。
本発明の一態様では、
（ａ）ＧＸ脂質分解酵素（式中、Ｇはグリシンであり、Ｘはオキシアニオンホールを形成するアミノ酸残基である（ＧＸ脂質分解酵素は、ａｂＨ２３、ａｂＨ２５、及びａｂＨ１５からなる群から選択されるα／β加水分解酵素スーパーファミリーに属する））；及び
（ｂ）本明細書において定義されるヒドロホビン；を含む組成物が提供される。
本発明の別の態様では、
（ａ）ＧＸ脂質分解酵素（式中、Ｇはグリシンであり、Ｘはオキシアニオンホールを形成するアミノ酸残基である）；
（ｂ）本明細書において定義されるヒドロホビン；及び
（ｃ）洗剤；を含む組成物が提供される。
本発明の更なる態様によると、表面を本明細書において定義される組成物と接触させることにより、脂質汚れを表面から除去する方法が提供される。
本発明の更に他の態様によると、脂質汚れを表面から減らすか、又は除去するための本明細書において定義される組成物の使用が提供される。
本発明の更なる態様によると、表面を本明細書において定義される組成物と接触させる工程を含む、表面を洗浄する方法が提供される。
本発明の更なる態様によると、物品を本明細書において定義される組成物と接触させる工程を含む、物品、具体的には、衣料品又は食卓用品を洗浄する方法が提供される。
利点
驚くべきことに、ヒドロホビンと、脂質分解酵素と、場合により洗剤と、の組み合わせが、油脂汚れを、表面、例えば、布、衣類又は食器類表面から除去し得ることが判明した。既存の市販の洗剤を用いて、かかる汚れを除去することは一般的には難しい。この効果により、洗浄組成物において組み合わせを用いる可能性が与えられる。
具体的には、驚くべきことに、ヒドロホビンと、上述のａｂＨスーパーファミリーから選択されるＧＸ脂質分解酵素とを組み合わせることで、これらのタンパク質のいずれかを単独で用いた場合に期待される相加効果よりも著しく改良された洗浄効果が発揮されることが判明した。これらの特性により、洗浄組成物において洗剤の代わりとして組み合わせを用いることで、かかる組成物の環境への影響を最小限に抑えることができる可能性がある。
驚くべきことに、ヒドロホビン、ＧＸ脂質分解酵素、及び洗剤を組み合わせることで、これら３種の成分を単独で用いた場合に期待される相加効果よりも著しく改良された洗浄効果が発揮されることも判明した。これらの特性により、洗浄組成物において必要とされる洗剤の量を本組み合わせにより最小限に抑えることで、かかる組成物の環境への影響が最小限に抑えられる可能性がある。
加熱不活性化した液体洗剤ＡＲＩＥＬ（商標）Ｃｏｌｏｒ存在下、かつ脂質分解酵素の非存在下、種々の特定のヒドロホビン濃度下での、洗剤濃度に応じた汚れ除去指数（ＳＲＩ）（％）の変化を示すグラフ。 加熱不活性化した液体洗剤ＡＲＩＥＬ（商標）Ｃｏｌｏｒの存在下、かつ脂質分解酵素の非存在下、種々の特定の洗剤濃度下での、ヒドロホビン濃度に応じたＳＲＩ（％）の変化を示すグラフ。 加熱不活性化した粉末洗剤ＡＲＩＥＬ（商標）Ｃｏｌｏｒの存在下、かつ脂質分解酵素の非存在下、種々の特定のヒドロホビン濃度下での、洗剤濃度に応じたＳＲＩ（％）の変化を示すグラフ。 脂質分解酵素ＬＩＰＥＸ（商標）及び加熱不活性化した液体洗剤ＡＲＩＥＬ（商標）Ｃｏｌｏｒの存在下、種々の特定のヒドロホビン濃度下での、洗剤濃度に応じたＳＲＩ（％）の変化を示すグラフ。 脂質分解酵素ＬＩＰＥＸ（商標）及び加熱不活性化した液体洗剤ＡＲＩＥＬ（商標）Ｃｏｌｏｒの存在下、種々の特定の洗剤濃度下での、ヒドロホビン濃度に応じたＳＲＩ（％）の変化を示すグラフ。 脂質分解酵素ＬＩＰＥＸ（商標）及び加熱不活性化した粉末洗剤ＡＲＩＥＬ（商標）Ｃｏｌｏｒの存在下、種々の特定のヒドロホビン濃度下での、洗剤濃度に応じたＳＲＩ（％）の変化を示すグラフ。 脂質分解酵素ＬＩＰＥＸ（商標）及び加熱不活性化した粉末洗剤ＡＲＩＥＬ（商標）Ｃｏｌｏｒの存在下、種々の特定の洗剤濃度下での、ヒドロホビン濃度に応じたＳＲＩ（％）の変化を示すグラフ。 脂質分解酵素ＬＩＰＥＸ（商標）の存在下、かつ洗剤の非存在下での、ヒドロホビン濃度に応じたＳＲＩ（％）の変化を示すグラフ。 脂質分解酵素ＬＩＰＯＭＡＸ（商標）及び加熱不活性化した液体洗剤ＡＲＩＥＬ（商標）Ｃｏｌｏｒの存在下、種々の特定のヒドロホビン濃度下での洗剤濃度に応じたＳＲＩ（％）の変化を示すグラフ。 脂質分解酵素ＬＩＰＯＭＡＸ（商標）及び加熱不活性化した液体洗剤ＡＲＩＥＬ（商標）Ｃｏｌｏｒの存在下、種々の特定の洗剤濃度下でのヒドロホビン濃度に応じたＳＲＩ（％）の変化を示すグラフ。 脂質分解酵素ＬＩＰＯＭＡＸ（商標）及び加熱不活性化した粉末洗剤ＡＲＩＥＬ（商標）Ｃｏｌｏｒの存在下、種々の特定のヒドロホビン濃度下での、洗剤濃度に応じたＳＲＩ（％）の変化を示すグラフ。 脂質分解酵素ＬＩＰＯＭＡＸ（商標）及び加熱不活性化した粉末洗剤ＡＲＩＥＬ（商標）Ｃｏｌｏｒの存在下、種々の特定の洗剤濃度下での、ヒドロホビン濃度に応じたＳＲＩ（％）の変化を示すグラフ。 脂質分解酵素ＬＩＰＯＭＡＸ（商標）の存在下かつ洗剤の非存在下での、ヒドロホビン濃度に応じたＳＲＩ（％）の変化を示すグラフ。 脂質分解酵素ＳｐｒＬｉｐ２及び加熱不活性化した液体洗剤ＡＲＩＥＬ（商標）Ｃｏｌｏｒの存在下、種々の特定のヒドロホビン濃度下での、洗剤濃度に応じたＳＲＩ（％）の変化を示すグラフ。 脂質分解酵素ＳｐｒＬｉｐ２及び加熱不活性化した液体洗剤ＡＲＩＥＬ（商標）Ｃｏｌｏｒの存在下、種々の特定の洗剤濃度下での、ヒドロホビン濃度に応じたＳＲＩ（％）の変化を示すグラフ。 脂質分解酵素ＳｐｒＬｉｐ２及び加熱不活性化した粉末洗剤ＡＲＩＥＬ（商標）Ｃｏｌｏｒの存在下、種々の特定のヒドロホビン濃度下での、洗剤濃度に応じたＳＲＩ（％）の変化を示すグラフ。 脂質分解酵素ＳｐｒＬｉｐ２及び加熱不活性化した粉末洗剤ＡＲＩＥＬ（商標）Ｃｏｌｏｒの存在下、種々の特定の洗剤濃度下での、ヒドロホビン濃度に応じたＳＲＩ（％）の変化を示すグラフ。 脂質分解酵素ＳｐｒＬｉｐ２の存在下かつ洗剤の非存在下での、ヒドロホビン濃度に応じたＳＲＩ（％）の変化を示すグラフ。 脂質分解酵素ＴｆｕＬｉｐ２及び加熱不活性化した液体洗剤ＡＲＩＥＬ（商標）Ｃｏｌｏｒの存在下、種々の特定のヒドロホビン濃度下での、洗剤濃度に応じたＳＲＩ（％）の変化を示すグラフ。 脂質分解酵素ＴｆｕＬｉｐ２及び加熱不活性化した液体洗剤ＡＲＩＥＬ（商標）Ｃｏｌｏｒの存在下、種々の特定の洗剤濃度下での、ヒドロホビン濃度に応じたＳＲＩ（％）の変化を示すグラフ。 脂質分解酵素ＴｆｕＬｉｐ２及び加熱不活性化した粉末洗剤ＡＲＩＥＬ（商標）Ｃｏｌｏｒの存在下、種々の特定のヒドロホビン濃度下での、洗剤濃度に応じたＳＲＩ（％）の変化を示すグラフ。 脂質分解酵素ＴｆｕＬｉｐ２及び加熱不活性化した粉末洗剤ＡＲＩＥＬ（商標）Ｃｏｌｏｒの存在下、種々の特定の洗剤濃度下での、ヒドロホビン濃度に応じたＳＲＩ（％）の変化を示すグラフ。 脂質分解酵素ＴｆｕＬｉｐ２の存在下かつ洗剤の非存在下での、ヒドロホビン濃度時に応じたＳＲＩ（％）の変化を示すグラフ。 配列番号１：トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）ＨＦＢＩＩ（Ｙ１１８９４．１）のヒドロホビンをコードしているＤＮＡ配列。 配列番号２：トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）ＨＦＢＩＩ（Ｐ７９０７３．１）のヒドロホビンのアミノ酸配列。 配列番号３：トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）ＨＦＢＩ（Ｚ６８１２４．１）のヒドロホビンをコードしているＤＮＡ配列。 配列番号４：トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）ＨＦＢＩ（Ｐ５２７５４．１）のヒドロホビンのアミノ酸配列。 配列番号５：シゾフィラム・コムーネ（Schizophyllum commune）ＳＣ３（Ｍ３２３２９．１）のヒドロホビンをコードしているＤＮＡ配列。 配列番号６：シゾフィラム・コムーネ（Schizophyllum commune）ＳＣ３（ＡＡＡ９６３２４．１）のヒドロホビンのアミノ酸配列。 配列番号７：ニューロスポラ・クラッサ（Neurospora crassa）ＥＡＳ（Ｘ６７３３９．１）のヒドロホビンをコードしているＤＮＡ配列。 配列番号８：ニューロスポラ・クラッサ（Neurospora crassa）ＥＡＳ（ＡＡＢ２４４６２．１）のヒドロホビンのアミノ酸配列。 配列番号９：タラロミセス・サーモフィルス（Talaromyces thermophilus）ＴＴ１（ＴＴ１ヒドロホビン前駆体をコードしているＤＮＡ配列、米国特許第７２４１７３４号の配列番号４）。 配列番号１０：タラロミセス・サーモフィルス（Talaromyces thermophilus）ＴＴ１（ＴＴ１ヒドロホビン前駆体のアミノ酸配列、米国特許第７２４１７３４号の配列番号３）。 配列番号１１：ＬＩＰＥＸ（商標）の成熟アミノ酸配列。 太字で示されるシグナル配列を有する、配列番号１２：ＳｐｒＬｉｐ２（ストレプトマイセス・プリスチナエスピラリス（Streptomyces pristinaespiralis）ＡＴＣＣ ２５４８６ Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｂ５Ｈ９Ｑ８，ＮＣＢＩ：ＺＰ＿０６９１２６５４．１）の全アミノ酸配列。 配列番号１３：フザリウム・ヘテロスポルム（Fusarium heterosporum）ホスホリパーゼ（国際公開公報第２００５／０８７９１８号において開示されており、Ｄａｎｉｓｃｏ Ａ／Ｓから、ＧＲＩＮＤＡＭＹＬ ＰＯＷＥＲＢＡＫＥ ４１００（商標）として入手できる）の成熟アミノ酸配列。 配列番号２９：国際公開公報第９８／４５４５３号に開示されるＬｉｐａｓｅ ３の全アミノ酸配列。残基１〜２７０は、配列番号１４として本明細書において言及される成熟配列を含む。 配列番号１４：Ｌｉｐａｓｅ ３の成熟アミノ酸配列。 配列番号１５：ＬＩＰＯＭＡＸ（商標）の成熟アミノ酸配列。 配列番号１６：ＴｆｕＬｉｐ２の成熟アミノ酸配列。 配列番号１７：ＳｐｒＬｉｐ２の成熟アミノ酸配列。 配列番号１８：シグナル配列（アミノ酸残基１〜１７）、プロペプチド（アミノ酸残基１８〜２２）、及び成熟配列（アミノ酸残基２３〜２９１−図１６において配列番号１１として示される）を含む、ＬＩＰＥＸの全アミノ酸配列。 配列番号１９：シグナル配列（アミノ酸残基１〜２４）、及び成熟配列（アミノ酸残基２５〜３１３−図２０において配列番号１５として示される）を含む、ＬＩＰＯＭＡＸの全アミノ酸配列。 配列番号２０：シグナル配列（アミノ酸残基１〜４０）、及び成熟配列（アミノ酸残基４１〜３０１−図２１において配列番号１６として示される）を含む、ＴｆｕＬｉｐ２の全アミノ酸配列。 配列番号２１：国際公開公報第２００５／０８７９１８号において開示されるフザリウム・ヘテロスポルム（Fusarium heterosporum）ＣＢＳ ７８２．８３（野生型）由来の脂質分解酵素のタンパク質プレプロ配列。プレプロ配列は、酵素の成熟型が、好ましくは、図１８において配列番号１３として示される酵素を含むような翻訳修飾を受ける；ある種の宿主生物において、タンパク質は、多数の更なるアミノ酸が、Ｎ又はＣ末端に付加されるように、Ｎ末端がプロセシングされていてもよい。 配列番号２２：合成されたｐｒＬｉｐ２遺伝子のヌクレオチド配列。 配列番号２３：発現プラスミドｐＺＱ２０５（ｃｅｌＡシグナル配列に下線を付す）由来のＳｐｒＬｉｐ２遺伝子のヌクレオチド配列。 配列番号２４：プラスミドｐＺＱ２０５（シグナル配列に下線を付す）から産生されたＳｐｒＬｉｐ２のアミノ酸配列。 ｐＺＱ２０５発現ベクターのプラスミドマップ。 ＳｐｒＬｉｐ２によるｐＮＢ加水分解を示すグラフ。 ＳｐｒＬｉｐ２によるｐＮＰＰ加水分解を示すグラフ。 洗剤の非存在下での、ＳｐｒＬｉｐ２によるトリオクタン酸塩加水分解を示すグラフ。 洗剤の存在下での、ＳｐｒＬｉｐ２によるトリオクタン酸塩加水分解を示すグラフ。 洗剤の存在下及び非存在下でのＳｐｒＬｉｐ２の性能を示すグラフ。 配列番号２５：ＮＣＢＩデータベース上で受入番号ＪＣ８０６１として入手可能であるゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Geobacillus stearothermophilus）株Ｔ１（ＧｅｏＴ１）由来のリパーゼのアミノ酸配列（シグナル配列に下線を付す）。 配列番号２６：配列番号２５と細菌セルラーゼの触媒ドメインのカルボキシ末端との融合体であるＢＣＥ−ＧｅｏＴ１融合タンパク質のアミノ酸配列。 配列番号２７：ＧＥＮＢＡＮＫ受入番号Ｐ３７９５７として入手できるバチルス・スブチリス（Bacillus subtilis）１６８（ＬｉｐＡ）由来のリパーゼのアミノ酸配列（シグナル配列に下線を付す）。 配列番号２８：配列番号２７と細菌セルラーゼの触媒ドメインのカルボキシ末端との融合体であるＢＣＥ−ＬｉｐＡ融合タンパク質のアミノ酸配列。 配列番号３０：ＢａｍＨＩ部位前のＮｓｉＩ−ＭｌｕＩ−ＨｐａＩ制限酵素認識部位のヌクレオチド配列。
ヒドロホビン
本明細書において、用語「ヒドロホビン」は、親水性と疎水性の界面で自己組織化することができるポリペプチドを意味し、かつ一般式（Ｉ）：
（Ｙ１）ｎ−Ｂ１−（Ｘ１）ａ−Ｂ２−（Ｘ２）ｂ−Ｂ３−（Ｘ３）ｃ−Ｂ４−（Ｘ４）ｄ−Ｂ５−（Ｘ５）ｅ−Ｂ６−（Ｘ６）ｆ−Ｂ７−（Ｘ７）ｇ−Ｂ８−（Ｙ２）ｍ （Ｉ）
（式中、
ｍ及びｎは、独立して、０〜２０００であり；
Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５、Ｂ６、Ｂ７及びＢ８は、それぞれ独立して、Ｃｙｓ、Ｌｅｕ、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｍｅｔ又はＧｌｙから選択されるアミノ酸であり、残基Ｂ１〜Ｂ８のうち少なくとも６つはＣｙｓであり、
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、Ｙ１及びＹ２は、独立して、任意のアミノ酸を表し；
ａは、１〜５０であり；
ｂは、０〜５であり；
ｃは、１〜１００であり；
ｄは、１〜１００であり；
ｅは、１〜５０であり；
ｆは、０〜５０であり；及び
ｇは、１〜１００である）を有するとして定義される。
適当には、ヒドロホビンは、ヒドロホビンコアにおいて、４０〜１２０個のアミノ酸の配列を有する。より好ましくは、ヒドロホビンは、ヒドロホビンコアにおいて、４５〜１００個のアミノ酸の配列を有する。一実施形態では、ヒドロホビンは、ヒドロホビンコアにおいて、５０〜９０個、好ましくは５０〜７５個、より好ましくは５５〜６５個のアミノ酸の配列を有する。本明細書において、用語「ヒドロホビンコア」は、残基Ｂ１で始まり、残基Ｂ８で終わる配列を意味する。
式（Ｉ）において、残基Ｂ１〜Ｂ８のうちの少なくとも６つ、好ましくは少なくとも７つ、最も好ましくは８つ全てはＣｙｓである。
式（Ｉ）において、一実施形態では、ｍは、適当には、０〜５００、好ましくは０〜２００、より好ましくは０〜１００、更により好ましくは０〜２０、更により好ましくは０〜１０、更により好ましくは０〜５、最も好ましくは０である。
式（Ｉ）において、一実施形態では、ｎは、適当には、０〜５００、好ましくは０〜２００、より好ましくは０〜１００、更により好ましくは０〜２０、更により好ましくは０〜１０、最も好ましくは０〜３である。
式（Ｉ）において、ａは、好ましくは３〜２５、より好ましくは５〜１５である。一実施形態では、ａは５〜９である。
式（Ｉ）において、ｂは、好ましくは０〜２、より好ましくは０である。
式（Ｉ）において、ｃは、好ましくは５〜５０、より好ましくは５〜４０である。一実施形態では、ｃは１１〜３９である。
式（Ｉ）において、ｄは、好ましくは２〜３５、より好ましくは４〜２３である。一実施形態では、ｄは８〜２３である。
式（Ｉ）において、ｅは、好ましくは２〜１５、より好ましくは５〜１２である。一実施形態では、ｅは５〜９である。
式（Ｉ）において、ｆは、好ましくは０〜２、より好ましくは０である。
式（Ｉ）において、ｇは、好ましくは３〜３５、より好ましくは６〜２１である。一実施形態では、ｇは６〜１８である。
好ましくは、本発明において用いられるヒドロホビンは、一般式（ＩＩ）：
（Ｙ１）ｎ−Ｂ１−（Ｘ１）ａ−Ｂ２−（Ｘ２）ｂ−Ｂ３−（Ｘ３）ｃ−Ｂ４−（Ｘ４）ｄ−Ｂ５−（Ｘ５）ｅ−Ｂ６−（Ｘ６）ｆ−Ｂ７−（Ｘ７）ｇ−Ｂ８−（Ｙ２）ｍ （ＩＩ）
（式中、
ｍ及びｎは、独立して、０〜２０であり；
Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５、Ｂ６、Ｂ７及びＢ８は、それぞれ独立して、Ｃｙｓ、Ｌｅｕ、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｍｅｔ又はＧｌｙから選択されるアミノ酸であり、残基Ｂ１〜Ｂ８のうち少なくとも７つはＣｙｓであり；
ａは、３〜２５であり；
ｂは、０〜２であり；
ｃは、５〜５０であり；
ｄは、２〜３５であり；
ｅは、２〜１５であり；
ｆは、０〜２であり；及び
ｇは、３〜３５である）を有する。
式（ＩＩ）において、残基Ｂ１〜Ｂ８のうちのうちの少なくとも７つ、好ましくは８つ全ては、Ｃｙｓである。
より好ましくは、本発明において用いられるヒドロホビンは、一般式（ＩＩＩ）：
（Ｙ１）ｎ−Ｂ１−（Ｘ１）ａ−Ｂ２−Ｂ３−（Ｘ３）ｃ−Ｂ４−（Ｘ４）ｄ−Ｂ５−（Ｘ５）ｅ−Ｂ６−Ｂ７−（Ｘ７）ｇ−Ｂ８−（Ｙ２）ｍ （ＩＩＩ）
（式中、
ｍ及びｎは、独立して、０〜２０であり；
Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５、Ｂ６、Ｂ７及びＢ８は、それぞれ独立して、Ｃｙｓ、Ｌｅｕ、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｍｅｔ又はＧｌｙから選択されるアミノ酸であり、残基Ｂ１〜Ｂ８のうち少なくとも７つはＣｙｓであり；
ａは、５〜１５であり；
ｃは、５〜４０であり；
ｄは、４〜２３であり；
ｅは、５〜１２であり；及び
ｇは、６〜２１である）を有する。
式（ＩＩＩ）において、残基Ｂ１〜Ｂ８のうちのうちの少なくとも７つ、好ましくは８つはＣｙｓである。
式（Ｉ）、（ＩＩ）及び（ＩＩＩ）において、残基Ｂ１〜Ｂ８のうちの６つ又は７つがＣｙｓであるとき、残基Ｂ３〜Ｂ７は、Ｃｙｓであるのが好ましい。
式（Ｉ）、（ＩＩ）及び（ＩＩＩ）において、残基Ｂ１〜Ｂ８のうちの７つがＣｙｓであるとき、（ａ）Ｂ１及びＢ３〜Ｂ８はＣｙｓであり、Ｂ２はＣｙｓ以外であり；（ｂ）Ｂ１〜Ｂ７はＣｙｓであり、Ｂ８はＣｙｓ以外であり、（ｃ）Ｂ１はＣｙｓ以外であり、Ｂ２〜Ｂ８はＣｙｓであることが好ましい。残基Ｂ１〜Ｂ８のうちの７つがＣｙｓであるとき、他の残基は、Ｓｅｒ、Ｐｒｏ又はＬｅｕであるのが好ましい。一実施形態では、Ｂ１及びＢ３〜Ｂ８はＣｙｓであり、Ｂ２はＳｅｒである。別の実施態様では、Ｂ１〜Ｂ７はＣｙｓであり、Ｂ８はＬｅｕである。更なる実施態様では、Ｂ１はＰｒｏであり、Ｂ２〜Ｂ８はＣｙｓである。
本発明において用いられるヒドロホビンのシステイン残基は、還元型で存在してもよく、あるいは任意の可能な組み合わせで互いジスルフィド（−Ｓ−Ｓ−）架橋を形成してもよい。特に好ましい実施態様の一例では、残基Ｂ１〜Ｂ８の８つ全てがＣｙｓであるとき、ジスルフィド架橋は、次のシステイン残基ペア：Ｂ１とＢ６；Ｂ２とＢ５；Ｂ３とＢ４；Ｂ７とＢ８；のうちの１つ以上（好ましくは少なくとも２つ、より好ましくは少なくとも３つ、最も好ましくは４つ全て）間で形成されてもよい。代替的な好ましい実施態様では、残基Ｂ１〜Ｂ８の８つ全てがＣｙｓであるとき、ジスルフィド架橋は、次のシステイン残基ペア：Ｂ１とＢ２；Ｂ３とＢ４；Ｂ５とＢ６；Ｂ７とＢ８；のうちの１つ以上（好ましくは少なくとも２つ、より好ましくは少なくとも３つ、最も好ましくは４つ全て）間で形成されてもよい。
本発明において有用な具体的なヒドロホビンの例は、次の刊行物：Ｌｉｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｖ．２００５，２９，８７７〜８９６；Ｋｕｂｉｃｅｋ ｅｔ ａｌ．，ＢＭＣ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２００８，８，４；Ｓｕｎｄｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｎ，２００８，３９，７７３〜７８４；Ｗｅｓｓｅｌｓ，Ａｄｖ．Ｍｉｃｒ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１９９７，３８，１〜４５；Ｗｏｓｔｅｎ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００１，５５，６２５〜６４６；Ｈｅｋｔｏｒ ａｎｄ Ｓｃｈｏｌｔｍｅｉｊｅｒ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２００５，１６，４３４〜４３９；Ｓｚｉｌｖａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００７，４６，２３４５〜２３５４；Ｋｉｓｋｏ ｅｔ ａｌ．Ｌａｎｇｍｕｉｒ，２００９，２５，１６１２〜１６１９；Ｂｌｉｊｄｅｎｓｔｅｉｎ，Ｓｏｆｔ Ｍａｔｔｅｒ，２０１０，６，１７９９〜１８０８；Ｗｏｓｔｅｎ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．１９９４，１３，５８４８〜５８５４；Ｈａｋａｎｐａａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２００４，２７９，５３４〜５３９；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．；Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．，２００４，１３，８１０〜８２１；Ｄｅ Ｖｏｃｈｔ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．１９９８，７４，２０５９〜２０６８；Ａｓｋｏｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２００６，７，１２９５〜１３０１；Ｃｏｘ ｅｔ ａｌ．；Ｌａｎｇｍｕｉｒ，２００７，２３，７９９５〜８００２；Ｌｉｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２００１，２，５１１〜５１７；Ｋａｌｌｉｏ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２００７，２８２，２８７３３〜２８７３９；Ｓｃｈｏｌｔｍｅｉｊｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２００１，５６，１〜８；Ｌｕｍｓｄｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｌｌｏｉｄｓ ＆ Ｓｕｒｆａｃｅｓ Ｂ：Ｂｉｏｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ，２００５，４４，１７２〜１７８；Ｐａｌｏｍｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２００３，４，２０４〜２１０；Ｋｉｒｋｌａｎｄ ａｎｄ Ｋｅｙｈａｎｉ，Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，Ｊｕｌｙ １７ ２０１０（ｅ−ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ）；Ｓｔｕｂｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｆｏｏｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３０ Ｊｕｎｅ ２０１０（ｅ−ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ）；Ｌａａｋｓｏｎｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｌａｎｇｍｕｉｒ，２００９，２５，５１８５〜５１９２；Ｋｗａｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２００８，３８２，７０８〜７２０；Ｙｕ ｅｔ ａｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００８，１５４，１６７７〜１６８５；Ｌａｈｔｉｎｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．，２００８，５９，１８〜２４；Ｓｚｉｌｖａｙ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，２００７，５８１１，２７２１〜２７２６；Ｈａｋａｎｐａａ ｅｔ ａｌ．，Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ．Ｂｉｏｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．２００６，６２，３５６〜３６７；Ｓｃｈｏｌｔｍｅｉｊｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２００２，６８，１３６７〜１３７３；Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ，ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，２００６，７ Ｓｕｐｐ．４，Ｓ１６；国際公開公報第０１／５７０６６号；国際公開公報第０１／５７５２８号；国際公開公報第２００６／０８２２５３号；国際公開公報第２００６／１０３２２５号；国際公開公報第２００６／１０３２３０号；国際公開公報第２００７／０１４８９７号；国際公開公報第２００７／０８７９６７号；国際公開公報第２００７／０８７９６８号；国際公開公報第２００７／０３０９６６号；国際公開公報第２００８／０１９９６５号；国際公開公報第２００８／１０７４３９号；国際公開公報第２００８／１１０４５６号；国際公開公報第２００８／１１６７１５号；国際公開公報第２００８／１２０３１０号；国際公開公報第２００９／０５００００号；米国公開公報第２００６／０２２８４８４号；欧州公開公報第２０４２１５６Ａ号；（これらの内容は、引用により本明細書に組み込む）に記載され、例示されるものを含む。
一実施形態では、ヒドロホビンは、配列番号２、４、６、８又は１０から選択されるポリペプチド、又はヒドロホビンコアにおいてこれらの配列のいずれかに対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有し、かつ上述のヒドロホビンの自己組織化特性を保持しているポリペプチドである。
ヒドロホビンの供給源
一実施形態では、ヒドロホビンは、微生物に由来する又は由来し得る。微生物は、好ましくは細菌又は真菌であってもよく、より好ましくは真菌であってよい。好ましい実施態様では、ヒドロホビンは、糸状菌に由来する又は由来し得る。
一実施形態では、ヒドロホビンは、担子菌門又は子嚢菌門の真菌に由来するか又は由来し得る。
一実施形態では、ヒドロホビンは、クラドスポリウム（Cladosporium）属（特に、クラドスポリウム・フルバム（C. fulvum）又はクラドスポリウム・ヘルバレム（C. herbarum））、オフィストマ（Ophistoma）属（特に、オフィストマ・ウルミ（O. ulmi））、クリホネクトリア（Cryphonectria）属（特に、クリホネクトリア・パラシチカ（C. parasitica））、トリコデルマ（Trichoderma）属（特に、トリコデルマ・ハルジアナム（T. harzianum）、トリコデルマ・ロンギブリキアタム（T. longibrichiatum）、トリコデルマ・アスペレルム（T. asperellum）、トリコデルマ・コニンギオプシス（T. Koningiopsis）、トリコデルマ・アグレッシブム（T. aggressivum）、トリコデルマ・ストロマチクム（T. stromaticum）、又はトリコデルマ・リーゼイ（T. reesei））、ジベレラ（Gibberella）属（特に、ジベレラ・モニリフォルミス（G. moniliformis））、ニューロスポラ（Neurospora）属（特に、ニューロスポラ・クラッサ（N. crassa））、マガナポルト（Maganaporthe）属（特に、マガナポルト・グリセア（M. grisea））、ヒポクレア（Hypocrea）属（特に、ヒポクレア・ジェコリナ（H. jecorina）、ヒポクレア・アトロビリジス（H. atroviridis）、ヒポクレア・ビレンス（H. virens）、又はヒポクレア・リクシイ（H lixii））、キサントリア（Xanthoria）属（特に、キサントリア・エクタノイデス（X. ectanoides）、及びキサントリア・パリエチナ（X. parietina））、エメリセラ（Emericella）属（特に、エメリセラ・ニデュランス（E. nidulans））、アスペルギルス（Aspergillus）属（特に、アスペルギルス・フミガタス（A. fumigatus）、アスペルギルス・オリザエ（A. oryzae））、パラコッシオイデス（Paracoccioides）属（特に、パラコッシオイデス・ブラシリエンシス（P. brasiliensis））、メタリジウム（Metarhizium）属（特に、メタリジウム・アニソプライエ（M. anisoplaie））、プロイロツス（Pleurotus）属（特に、プロイロツス・オストレアツス（P. ostreatus））、コプリナス（Coprinus）属（特に、コプリナス・シネレウス（C. cinereus））、ジコチオネマ（Dicotyonema）属（特に、ジコチオネマ・グラブラタム（D. glabratum））、フラムリナ（Flammulina）属（特に、フラムリナ・ヴェルティペス（F. velutipes））、シゾフィラム（Schizophyllum）属（特に、シゾフィラム・コムーネ（S. commune））、アガリクス（Agaricus）属（特に、アガリクス・ビスポラス（A. bisporus））、ピソリツス（Pisolithus）属（特に、ピソリツス・ティンクトリウス（P. tinctorius））、トリコロマ（Tricholoma）属（特に、トリコロマ・テレウム（T. terreum））、フォリオタ（Pholioka）属（特に、フォリオタ・ナメコ（P. nameko））、タラロミセス（Talaromyces）属（特に、タラロミセス・サーモフィルス（T. thermophilus））、又はアグロサイブ（Agrocybe）属（特に、アグロサイブ・アエゲリタ（A. aegerita））の真菌に由来する又は由来し得る。
アッセイ
本発明において用いられるヒドロホビンは、特性の１つとして親水性／疎水性界面でのヒドロホビンの自己組織化特性を有する。
本発明の定義に従って、自己組織化は、タンパク質をポリテトラフルオロエチレン（ＴＥＦＬＯＮ（登録商標））に吸着させ、Ｃｉｒｃｕｌａｒ Ｄｉｃｈｒｏｉｓｍ（ＣＤ）を用いて、新たに形成されたα−ヘリックスに対応するＣＤスペクトルにおけるモチーフの発生により例示される、二次構造の変化を確立することにより、検出することができる（Ｄｅ Ｖｏｃｈｔ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．１９９８，７４，２０５９〜２０６８）。ＣＤスペクトル分析を行う際の手順は、全てＡｓｋｏｌｉｎ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２００６，７，１２９５〜１３０１に見ることができる。
一実施形態では、本発明において用いられるヒドロホビンは、界面（特に、限定するものではないが空気と水の界面など）での表面特性に対する効果により特徴付けられる。表面特性は、表面張力（特に、平衡表面張力）、又は表面せん断レオロジー（特に、表面ずり弾性（貯蔵弾性率））であってもよい。
一実施形態では、ヒドロホビンは、水と空気との界面における平衡表面張力を、４５ｍＮ／ｍ未満、好ましくは４０ｍＮ／ｍ未満、より好ましくは３５ｍＮ／ｍ未満に低減させてもよい。対照的に、純水の表面張力は、室温で７２ｍＮ／ｍである。典型的には、水と空気との界面における平衡表面張力のかかる低減は、５×１０−８Ｍ〜２×１０−６Ｍ、より好ましくは１×１０−７Ｍ〜１×１０−６Ｍのヒドロホビン濃度を用いて達成され得る。典型的には、水と空気との界面における平衡表面張力のかかる低減は、０℃〜５０℃の範囲の温度、特に室温で達成され得る。平衡表面張力の変化は、張力計を用いて、Ｃｏｘ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｇｍｕｉｒ，２００７，２３，７９９５〜８００２に記載される方法に従い、測定することができる。
別の実施態様では、ヒドロホビンは、水と空気との界面における表面ずり弾性を、３００〜７００ｍＮ／ｍ、好ましくは４００〜６００ｍＮ／ｍまで増加させてもよい。典型的には、水と空気との界面におけるかかる表面ずり弾性は、１×１０−４Ｍ〜０．０１Ｍ、好ましくは５×１０−４Ｍ〜２×１０−３Ｍ、特に１×１０−３Ｍのヒドロホビン濃度を用いて達成され得る。典型的には、水と空気との界面におけるかかる表面ずり弾性は、０℃〜５０℃の範囲の温度、特に室温で達成され得る。平衡表面張力の変化は、レオメーターを用いて、Ｃｏｘ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｇｍｕｉｒ，２００７，２３，７９９５〜８００２に記載の方法に従い、測定することができる。
一部の実施態様では、本発明において用いられるヒドロホビンは、生物系界面活性剤である。生物系界面活性剤は、生細胞により合成される界面活性物質である。それらは、表面張力を低減し、エマルションを安定させ、泡立ちを促進する特性を有し、かつ一般的に非毒性及び生分解性である。
本発明の組成物において有用な具体的なヒドロホビンの例を、以下の表１に挙げる。
Figure 0006027092
Figure 0006027092
融合タンパク質
本発明と関連するヒドロホビンの定義には、ヒドロホビンと別のポリペプチドとの融合タンパク質、並びにヒドロホビンと他の分子（例えば、多糖）の結合体を包含する。
一実施形態では、ヒドロホビンは、ヒドロホビン融合タンパク質である。本明細書において、用語「融合タンパク質」は、天然ではヒドロホビン中に生じない更なるペプチド配列（本明細書において、「融合パートナー」として記載される）を結合しているヒドロホビン配列（上で定義され、例示される）を意味する。
一実施形態では、融合パートナーは、ヒドロホビンコアのアミノ末端に結合して、これにより（Ｙ１）ｍ基を形成してもよい。この実施態様では、ｍは、１〜２０００、好ましくは２〜１０００、より好ましくは５〜５００、更により好ましくは１０〜２００、更により好ましくは２０〜１００の範囲であってもよい。
一実施形態では、融合パートナーは、ヒドロホビンコアのカルボキシル末端に結合して、これにより（Ｙ２）ｎ基を形成してもよい。この実施態様では、ｎは、１〜２０００、好ましくは２〜１０００、より好ましくは５〜５００、更により好ましくは１０〜２００、更により好ましくは２０〜１００の範囲であってもよい。
別の実施態様では、融合パートナーは、ヒドロホビンコアのアミノ末端とカルボキシル末端の両方に結合してもよい。この実施態様では、融合パートナーは、同一であっても又は異なっていてもよく、好ましくは、ｍ及びｎに好ましい値として上で定義された、アミノ酸残基数を有するアミノ酸配列を有する。
一実施形態では、ヒドロホビンは融合タンパク質ではなく、ｍ及びｎは０である。
クラスＩ及びＩＩヒドロホビン
当該技術分野において、ヒドロホビンは、クラスＩとＩＩに分類される。クラスＩ及びＩＩのヒドロホビンは、溶解度などの多くの観点に基づき区別できることが知られている。本明細書において記載されるとおり、ヒドロホビンは、界面（特に、水と空気の界面）で両親媒性の界面膜に自己組織化する。クラスＩのヒドロホビンからなる自己組織化両親媒性膜は、一般的に、強酸（典型的には、ｐＫａ ４未満を有するもの（例えば、ギ酸又はトリフルオロ酢酸））にのみ再溶解されるのに対し、クラスＩＩのヒドロホビンからなる両親媒性膜はより様々な溶媒に溶解させることができる。
一実施形態では、ヒドロホビンは、クラスＩＩのヒドロホビンである。別の実施態様では、ヒドロホビンは、クラスＩのヒドロホビンである。
一実施形態では、用語「クラスＩＩのヒドロホビン」は、上述の水と空気との界面における自己組織化特性を有するヒドロホビン（本明細書において定義され、例示される）を意味し、組織化した両親媒性膜は、室温でエタノール水溶液（６０体積％）に少なくとも０．１％（ｗ／ｗ）の濃度で再溶解することが可能である。対照的に、この実施態様では、用語「クラスＩのヒドロホビン」は、上述の自己組織化特性を有し、但しこの規定の再溶解特性を有さないヒドロホビン（本明細書において定義され、例示される）を意味する。
別の実施態様では、用語「クラスＩＩのヒドロホビン」は、上述の水と空気との界面における自己組織化特性を有するヒドロホビン（本明細書において定義され、例示される）を意味し、組織化した両親媒性膜は、室温でドデシル硫酸ナトリウム水溶液（２重量％）に少なくとも０．１％（ｗ／ｗ）の濃度で再溶解することが可能である。対照的に、この実施態様では、用語「クラスＩのヒドロホビン」は、上述の自己組織化特性を有し、但しこの規定の再溶解特性を有さないヒドロホビン（本明細書において定義され、例示される）を意味する。
クラスＩ及びＩＩのヒドロホビンはまた、ヒドロホビンタンパク質に含まれる数多くの疎水性／親水性領域により区別することもできる。
一実施形態では、用語「クラスＩＩのヒドロホビン」は、上述の自己組織化特性を有し、残基Ｂ３とＢ４の間の領域、すなわち（Ｘ３）ｃ基が主に疎水性である、ヒドロホビン（本明細書において定義され、例示される）を意味する。対照的に、この実施態様では、用語「クラスＩのヒドロホビン」は、上述の自己組織化特性を有し、但し残基Ｂ３とＢ４の間の領域、すなわち（Ｘ３）ｃ基が主に親水性である、ヒドロホビン（本明細書において定義され、例示される）を意味する。
一実施形態では、用語「クラスＩＩのヒドロホビン」は、上述の自己組織化特性を有し、かつ残基Ｂ７とＢ８の間の領域、すなわち（Ｘ７）ｇ基が主に疎水性である、ヒドロホビン（本明細書において定義され、例示される）を意味する。対照的に、この実施態様では、用語「クラスＩのヒドロホビン」は、上述の自己組織化特性を有し、但し残基Ｂ７とＢ８の間の領域、すなわち（Ｘ７）ｇ基が主に親水性である、ヒドロホビン（本明細書において定義され、例示される）を意味する。
ヒドロホビンタンパク質の種々の領域の相対的疎水性及び親水性は、Ｋｙｔｅ ａｎｄ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９８２，１５７，１０５〜１３２に詳述される方法を用い、ヒドロホビンのヒドロパシーパターンを比較することにより、確定することができる。この参考文献の教示に従い、コンピュータープログラムを利用し、タンパク質の親水性及び疎水性をそのアミノ酸配列に沿って連続的に評価することができる。この目的のため、この方法は、２０個のアミノ酸側鎖のそれぞれの親水性と疎水性を比較する、ヒドロパシースケール（文献に由来する多数の実験的観察に基づく）を用いる。プログラムは、配列を進みながら、予め決められた長さのセグメント内の平均ヒドロパシーを連続して測定する、ムービングセグメントアプローチを用いる。連続スコアを、アミノ末端からカルボキシ末端までプロットする。同時に、配列決定したタンパク質の大部分に見られるアミノ酸組成のヒドロパシーの重要な平均値に対応する、中間点のラインを記した。方法は、ヒドロホビンについて、Ｗｅｓｓｅｌｓ，Ａｄｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１９９７，３８，１〜４５に更に記載されている。
一実施形態では、用語「クラスＩＩのヒドロホビン」は、上述の自己組織化特性を有し、残基Ｂ３とＢ４の間の領域、すなわち（Ｘ３）ｃ基が主に疎水性である、ヒドロホビン（本明細書において定義され、例示される）を意味する。対照的に、この実施態様では、用語「クラスＩのヒドロホビン」は、上述の自己組織化特性を有し、但し残基Ｂ３とＢ４の間の領域、すなわち（Ｘ３）ｃ基が主に親水性である、ヒドロホビン（本明細書において定義され、例示される）を意味する。
一実施形態では、用語「クラスＩＩのヒドロホビン」は、上述の自己組織化特性を有し、残基Ｂ７とＢ８の間の領域、すなわち（Ｘ７）ｇ基が主に疎水性である、ヒドロホビン（本明細書において定義され、例示される）を意味する。対照的に、この実施態様では、用語「クラスＩのヒドロホビン」は、上述の自己組織化特性を有し、残基Ｂ７とＢ８の間の領域、すなわち（Ｘ７）ｇ基が主に親水性である、ヒドロホビン（本明細書において定義され、例示される）を意味する。
ヒドロホビンタンパク質の種々の領域の相対的疎水性及び親水性は、Ｋｙｔｅ ａｎｄ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９８２，１５７，１０５〜１３２に詳述される方法、及びヒドロホビンについて、Ｗｅｓｓｅｌｓ，Ａｄｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１９９７，３８，１〜４５に記載される方法を用いて、ヒドロホビンのヒドロパシーパターンを比較することにより、確定することができる。
クラスＩＩのヒドロホビンは、その保存配列により特徴付けることもできる。
一実施形態では、本発明において用いられるクラスＩＩのヒドロホビンは、一般式（ＩＶ）：
（Ｙ１）ｎ−Ｂ１−（Ｘ１）ａ−Ｂ２−Ｂ３−（Ｘ３）ｃ−Ｂ４−（Ｘ４）ｄ−Ｂ５−（Ｘ５）ｅ−Ｂ６−Ｂ７−（Ｘ７）ｇ−Ｂ８−（Ｙ２）ｍ （ＩＶ）
（式中、
ｍ及びｎは、独立して、０〜２００であり；
Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５、Ｂ６、Ｂ７及びＢ８は、それぞれ独立して、Ｃｙｓ、Ｌｅｕ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｍｅｔ又はＧｌｙから選択されるアミノ酸配列であり（残基Ｂ１〜Ｂ８のうち少なくとも６つはＣｙｓである）；
ａは、６〜１２であり；
ｃは、８〜１６であり；
ｄは、２〜２０であり；
ｅは、４〜１２であり；
ｇは、５〜１５である）を有する。
式（ＩＶ）において、ａは、好ましくは７〜１１である。
式（ＩＶ）において、ｃは、好ましくは１０〜１２であり、より好ましくは１１である。
式（ＩＶ）において、ｄは、好ましくは４〜１８であり、より好ましくは４〜１６である。
式（ＩＶ）において、ｅは、好ましくは６〜１０であり、より好ましくは９又は１０である。
式（ＩＶ）において、ｇは、好ましくは６〜１２であり、より好ましくは７〜１０である。
一実施形態では、本発明において用いられるクラスＩＩのヒドロホビンは、一般式（Ｖ）：
（Ｙ１）ｎ−Ｂ１−（Ｘ１）ａ−Ｂ２−Ｂ３−（Ｘ３）ｃ−Ｂ４−（Ｘ４）ｄ−Ｂ５−（Ｘ５）ｅ−Ｂ６−Ｂ７−（Ｘ７）ｇ−Ｂ８−（Ｙ２）ｍ （Ｖ）
（式中、
ｍ及びｎは、独立して、０〜１０であり；
Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５、Ｂ６、Ｂ７及びＢ８は、それぞれ独立して、Ｃｙｓ、Ｌｅｕ又はＳｅｒから選択されるアミノ酸であり（残基Ｂ１〜Ｂ８のうち少なくとも７つはＣｙｓである）；
ａは、７〜１１であり；
ｃは、１１であり；
ｄは、４〜１８であり；
ｅは、６〜１０であり；
ｇは、７〜１０である）を有する。
式（ＩＶ）及び（Ｖ）において、残基Ｂ１〜Ｂ８のうちの少なくとも７つ、好ましくは８つ全ては、Ｃｙｓである。
式（ＩＶ）及び（Ｖ）において、残基Ｂ１〜Ｂ８のうちのうちの７つがＣｙｓであるとき、残基Ｂ３〜Ｂ７はＣｙｓであることが好ましい。
式（ＩＶ）及び（Ｖ）において、残基Ｂ１〜Ｂ８のうちの７つがＣｙｓであるとき、（ａ）Ｂ１及びＢ３〜Ｂ８はＣｙｓであり、Ｂ２はＣｙｓ以外であり；（ｂ）Ｂ１〜Ｂ７はＣｙｓであり、Ｂ８はＣｙｓ以外であるか、又は（ｃ）Ｂ１はＣｙｓ以外であり、Ｂ２〜Ｂ８はＣｙｓである、ことが好ましい。残基Ｂ１〜Ｂ８のうちの７つがＣｙｓであるとき、他の残基は、Ｓｅｒ、Ｐｒｏ又はＬｅｕであるのが好ましい。一実施形態では、Ｂ１及びＢ３〜Ｂ８はＣｙｓであり、Ｂ２はＳｅｒである。別の実施態様では、Ｂ１〜Ｂ７はＣｙｓであり、Ｂ８はＬｅｕである。更なる実施態様では、Ｂ１はＰｒｏであり、Ｂ２〜Ｂ８はＣｙｓである。
式（ＩＶ）及び（Ｖ）において、好ましくは、（Ｘ３）ｃ基は、配列モチーフＺＺＸＺ（式中、Ｚは脂肪族アミノ酸であり；Ｘは任意のアミノ酸である）を含む。本明細書において、用語「脂肪族アミノ酸」は、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）及びプロリン（Ｐ）からなる群から選択されるアミノ酸を意味する。
より好ましくは、（Ｘ３）ｃ基は、ＬＬＸＶ、ＩＬＸＶ、ＩＬＸＬ、ＶＬＸＬ、及びＶＬＸＶからなる群から選択される配列モチーフを含む。最も好ましくは、（Ｘ３）ｃ基は、配列モチーフＶＬＸＶを含む。
式（ＩＶ）及び（Ｖ）において、好ましくは、（Ｘ３）ｃ基は、配列モチーフＺＺＸＺＺＸＺ（式中、Ｚは脂肪族アミノ酸であり；Ｘは任意のアミノ酸である）を含む。より好ましくは、（Ｘ３）ｃ基は、配列モチーフＶＬＺＶＺＸＬ（式中、Ｚは脂肪族アミノ酸であり；Ｘは任意のアミノ酸である）を含む。
一実施形態では、ヒドロホビンは、配列番号２、４、６、８又は１０から選択されるポリペプチド、又はヒドロホビンコアにおいてこれらの配列のいずれかに対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有するポリペプチドである。「ヒドロホビンコア」は、残基Ｂ１で始まり、残基Ｂ８で終わる配列を意味する。
一実施形態では、ヒドロホビンは、子嚢菌門の真菌に由来する又は由来し得る。一実施形態では、ヒドロホビンは、クラドスポリウム（Cladosporium）属（特に、クラドスポリウム・フルバム（C. fulvum））、オフィストマ（Ophistoma）属（特に、オフィストマ・ウルミ（O. ulmi））、クリホネクトリア（Cryphonectria）属（特に、クリホネクトリア・パラシチカ（C. parasitica））、トリコデルマ（Trichoderma）属（特に、トリコデルマ・ハルジアナム（T. harzianum）、トリコデルマ・ロンギブリキアタム（T. longibrichiatum）、トリコデルマ・アスペレルム（T. asperellum）、トリコデルマ・コニンギオプシス（T. Koningiopsis）、トリコデルマ・アグレッシブム（T. aggressivum）、トリコデルマ・ストロマチクム（T. stromaticum）又はトリコデルマ・リーゼイ（T. reesei））、ジベレラ（Gibberella）属（特に、ジベレラ・モニリフォルミス（G. moniliformis））、ニューロスポラ（Neurospora）属（特に、ニューロスポラ・クラッサ（N. crassa））、マガナポルト（Maganaporthe）属（特に、マガナポルト・グリセア（M. grisea））、又はヒポクレア（Hypocrea）属（特に、ヒポクレア・ジェコリナ（H. jecorina）、ヒポクレア・アトロビリジス（H. atroviridis）、ヒポクレア・ビレンス（H. virens）又はヒポクレア・リクシイ（H lixii））の真菌に由来する又は由来し得る。
好ましい実施態様では、ヒドロホビンは、トリコデルマ（Trichoderma）属（特に、トリコデルマ・ハルジアナム（T. harzianum）、トリコデルマ・ロンギブリキアタム（T. longibrichiatum）、トリコデルマ・アスペレルム（T. asperellum）、トリコデルマ・コニンギオプシス（T. Koningiopsis）、トリコデルマ・アグレッシブム（T. aggressivum）、トリコデルマ・ストロマチクム（T. stromaticum）、又はトリコデルマ・リーゼイ（T. reesei））の真菌に由来する又は由来し得る。特に好ましい実施態様では、ヒドロホビンは、トリコデルマ・リーゼイ（T. reesei）種の真菌に由来する又は由来し得る。
より好ましい実施態様では、ヒドロホビンは：
（ａ）ＨＦＢＩＩ（配列番号２；真菌トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）に由来し得る）；
（ｂ）ＨＦＢＩ（配列番号４；真菌トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）に由来し得る）；
（ｃ）ＳＣ３（配列番号６；真菌シゾフィラム・コムーネ（Schizophyllum commune）に由来し得る）；
（ｄ）ＥＡＳ（配列番号８；真菌ニューロスポラ・クラッサ（Neurospora crassa）に由来し得る）；及び
（ｅ）ＴＴ１（配列番号１０；真菌タラロミセス・サーモフィルス（Talaromyces thermophilus）に由来し得る）からなる群から選択されるタンパク質；又はヒドロホビンコアにおいてこれらの配列のいずれかに対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有するタンパク質である。
より好ましい実施態様では、ヒドロホビンは、
（ａ）ＨＦＢＩＩ（配列番号１；真菌トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）に由来し得る）；
（ｂ）ＨＦＢＩ（配列番号３；真菌トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）に由来し得る）；
（ｃ）ＳＣ３（配列番号５；真菌シゾフィラム・コムーネ（Schizophyllum commune）に由来し得る）；
（ｄ）ＥＡＳ（配列番号７；真菌ニューロスポラ・クラッサ（Neurospora crassa）に由来し得る）；及び
（ｅ）ＴＴ１（配列番号９；真菌タラロミセス・サーモフィルス（Talaromyces thermophilus）に由来し得る）からなる群から選択されるポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質、又は上記（ａ）〜（ｅ）において定義されるポリヌクレオチドに対して、遺伝コードの結果として縮重しているポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質である。
特に好ましい実施態様では、ヒドロホビンは、タンパク質「ＨＦＢＩＩ」（配列番号２；トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）に由来し得る）であるか、又はそのヒドロホビンコアにおいて、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有するタンパク質である。
一実施形態では、ヒドロホビンは、組成物の初期成分として存在してもよい。別の実施態様では、ヒドロホビンは、組成物においてその場（例えば、ヒドロホビン融合タンパク質のその場での加水分解により）で生成されてもよい。
代替の実施態様では、ヒドロホビンは、チャプリン（chaplin）で全体的又は部分的に置き換えられてもよい。チャプリンは、疎水性−親水性界面で自己組織化することが可能であり、それ故、ヒドロホビンと機能的に等価である、ヒドロホビン様タンパク質である。チャプリンは、糸状菌及び細菌（例えば、アクチノミセス（Actinomycetes）及びストレプトマイセス（Streptomyces））において同定されている。ヒドロホビンとは異なり、それらは、２つのシステイン残基のみを有し、ただ１つのジスルフィド架橋を形成し得る。チャプリンの例は、国際公開公報第０１／７４８６４号、米国公開公報第２０１０／０１５１５２５号及び米国公開公報第２０１０／００９９８４４号、並びにＴａｌｂｏｔ，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．２００３，１３，Ｒ６９６〜Ｒ６９８に記載されている。
脂質分解酵素
本明細書において、用語「脂質分解酵素」は、脂質基質に作用して遊離脂肪酸分子を遊離させることができる酵素として定義される。好ましくは、脂質分解酵素は、脂質基質（特に、トリグリセリド、糖脂質及び／又はリン脂質（これらに限らない））においてエステル結合を加水分解し、遊離脂肪酸分子を遊離させることができる酵素である。可能性のある脂質基質の例は、後述する。
本発明において用いられる脂質分解酵素は、好ましくは、非極性脂質と極性脂質の両方に対し活性を有する。本明細書で使用するとき、用語「極性脂質」は、リン脂質及び／又は糖脂質を意味する。好ましくは、本明細書で使用するとき、用語「極性脂質」は、リン脂質と糖脂質の両方を意味する。極性脂質及び非極性脂質は、Ｅｌｉａｓｓｏｎ ａｎｄ Ｌａｒｓｓｏｎ，「Ｃｅｒｅａｌｓ ｉｎ Ｂｒｅａｄｍａｋｉｎｇ：Ａ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｏｌｌｏｉｄａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ」，ｐｕｂｌ．Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，１９９３において考察されている。
具体的には、本発明において用いられる脂質分解酵素は、好ましくは、次の種類の脂質：トリグリセリド；リン脂質（特に、ホスファチジルコリン（ＰＣ）及び／又はＮ−アシルホスファチジルエタノールアミン（ＡＰＥ）（これに限らない））；及び糖脂質（特に、ジガラクトシルジグリセリド（ＤＧＤＧ）（これに限らない））に対する活性を有する。
本明細書において、用語「遊離脂肪酸」は、式Ｒ−Ｃ（＝Ｏ）−ＯＨ（式中、Ｒは、直鎖又は分岐鎖の飽和又は不飽和のヒドロカルビル基である）の化合物を意味し、化合物は、合計４〜４０個の炭素原子、好ましくは６〜４０個の炭素原子、例えば、少なくとも１０〜４０個の炭素原子、例えば、１２〜４０個、例えば、１４〜４０個、１６〜４０個、１８〜４０個、２０〜４０個、又は２２〜４０個の炭素原子、より好ましくは１０〜２４個、特に１２〜２２個、具体的には１４〜１８個、例えば、１６個又は１８個の炭素原子を有する。１つの具体的な実施態様では、かかるアシル基は、アルカノイル基である。あるいは、かかるアシル基は、アルケノイル基を含み、アルケノイル基は、例えば、１〜５個の二重結合、好ましくは１、２又は３個の二重結合を有してもよい。
適当には、本発明において用いる脂質分解酵素は、ホスホリパーゼ活性（例えば、ホスホリパーゼＡ１活性（Ｅ．Ｃ．３．１．１．３２）、又はホスホリパーゼＡ２活性（Ｅ．Ｃ．３．１．１．４））；グリコリパーゼ活性（Ｅ．Ｃ．３．１．１．２６）、トリアシルグリセロール加水分解活性（Ｅ．Ｃ．３．１．１．３）、脂質アシルトランスフェラーゼ活性（ｔｈｅ Ｅｎｚｙｍｅ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ（１９９２）ｏｆ ｔｈｅ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙに従い、一般的にＥ．Ｃ．２．３．１．ｘとして分類される）、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される活性の１つ以上を有していてもよい。かかる脂質分解酵素は、当該技術分野で周知である。
適当には、本発明において用いる脂質分解酵素は、ホスホリパーゼ（例えば、ホスホリパーゼＡ１（Ｅ．Ｃ．３．１．１．３２）、又はホスホリパーゼＡ２（Ｅ．Ｃ．３．１．１．４））；グリコリパーゼ又はガラクトリパーゼ（Ｅ．Ｃ．３．１．１．２６）、トリアシルグリセリドリパーゼ（Ｅ．Ｃ．３．１．１．３）であり得る。かかる酵素は、更なる付随活性、例えば、脂質アシルトランスフェラーゼ付随活性を発揮してもよい。
好ましくは、本発明において用いる脂質分解酵素は、トリアシルグリセロール加水分解活性（Ｅ．Ｃ．３．１．１．３）を有する。
脂質分解酵素は、酵素のオキシアニオンホールの構造及び配列分析に基づき３つの種類（ＧＸ、ＧＧＧＸ、又はＹ）のうちの１つに属するものとして分類され得る。
「ＧＸ脂質分解酵素」は、酵素の、オキシアニオンホールを形成する残基Ｘが、構造上十分に保存され、かつ厳密に保存されたグリシンが後に続いているものである。
「ＧＧＧＸ酵素」は、十分に保存されたＧＧＧパターンと、これに続いて保存されている疎水性アミノ酸Ｘとが存在し、残基Ｘの前のグリシンの骨格アミドがオキシアニオンホールを形成するものである。
「Ｙ脂質分解酵素」は、オキシアニオンホールが、アミド骨格からは形成されないものの、チロシン側鎖のヒドロキシル基により形成されるものである。
一態様では、本発明は、ＧＸ脂質分解酵素の使用に関する。
適当には、オキシアニオンホールを形成する残基Ｘは、Ｍ、Ｑ、Ｆ、Ｓ、Ｔ、Ａ、Ｌ、又はＩであり得る。好ましくは、オキシアニオンホールを形成する残基Ｘは、Ｍ、Ｑ、Ｆ、Ｓ又はＴであってもよい。
一実施形態では、脂質分解酵素は、次のα／β加水分解酵素スーパーファミリーａｂＨ２３（好ましくはａｂＨ２３．０１）、ａｂＨ２５（好ましくは２５．０１）、ａｂＨ１６（好ましくは１６．０１）、ａｂＨ１８（好ましくはａｂＨ１８．０１）、及びａｂＨ１５（好ましくは１５．０１又は１５．０２）のうちの１つに属し得る。
一実施形態では、脂質分解酵素は、次のα／β加水分解酵素スーパーファミリーａｂＨ２３（好ましくはａｂＨ２３．０１）、ａｂＨ２５（好ましくは２５．０１）、ａｂＨ１６（好ましくは１６．０１）、及びａｂＨ１５（好ましくは１５．０２）のうちの１つに属し得る。
一実施形態では、好ましくは、脂質分解酵素は、ａｂＨ２３スーパーファミリーのメンバーとして、好ましくは、Ｌｉｐａｓｅ ＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇデータベースにおけるａｂＨ２３．０１相同ファミリーのメンバーとして分類される。
これらのスーパーファミリーに関する詳細は、Ｌｉｐａｓｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｌｅｄ．ｕｎｉ−ｓｔｕｔｔｇａｒｔ．ｄｅ／）上で見ることができる。本明細書においてＬｉｐａｓｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇデータベースに言及するとき、２００９年１２月１０日付けでリリースされたデータベースのバージョン３．０を参照している。
具体的には、一実施形態では、脂質分解酵素は、糸状菌由来のＧＸ脂質分解酵素であるならば、ａｂＨ２３スーパーファミリーに属すると考えることができる。好ましくは、酵素の触媒三残基が、リゾプス・ミーハイ（Rhizopus miehei）由来のリパーゼのもの、例えば、スイスプロットＰ１９５１５と一致する場合、脂質分解酵素は、ＧＸ脂質分解酵素である。
ａｂＨ２３スーパーファミリーに属する脂質分解酵素の例としては、表２に記載のものが挙げられる。
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この実施態様では、好ましくは、オキシアニオンホールを形成する残基は、セリン又はスレオニンである。
好ましくは、脂質分解酵素は、リゾプス・ミーハイ（Rhizopus miehei）様相同ファミリーａｂＨ２３．０１に属する。適当には、本発明において用いる特に好ましい酵素には、サーモマイセス（Thermomyces）（好ましくは、サーモマイセス・ラヌギノサス（T. lanuginosus））、フザリウム（Fusarium）（好ましくは、フザリウム・ヘテロスポラム（F. hetereosporum））、アスペルギルス（Aspergillus）（好ましくは、アスペルギルス・チュビエンギシス（A. tubiengisis）及び／又はアスペルギルス・フミガタス（A. fumigatus））、及びリゾプス（Rhizopus）（好ましくは、リゾプス・アリーズス（R. arrihzus））、好ましくは、サーモマイセス（Thermomyces）（好ましくは、サーモマイセス・ラヌギノサス（T. lanuginosus））、フザリウム（Fusarium）（好ましくは、フザリウム・ヘテロスポラム（F. hetereosporum））、又はアスペルギルス（Aspergillus）（好ましくは、アスペルギルス・チュビエンギシス（A. tubiengisis））由来の相同ファミリーａｂＨ２３．０１に分類される任意の脂質分解酵素が含まれ得る。かかる脂質分解酵素の例は、国際公開公報第９４／０２６１７号において開示され、本明細書において配列番号１１として示されるＬＩＰＥＸ（商標）（サーモマイセス・ラヌギノサス（Thermomyces lanuginosus）脂質分解酵素、国際公開公報第２００５／０８７９１８号において開示され、本明細書において配列番号１３として示されるフザリウム・ヘテロスポルム（Fusarium heterosporum）脂質分解酵素（Ｄａｎｉｓｃｏ Ａ／Ｓより、Ｇｒｉｎｄａｍｙｌ ＰＯＷＥＲＢＡＫＥ ４１００（商標）として入手可能）、及びＬｉｐａｓｅ ３（国際公開公報第９８／４５４５３号において開示され、本明細書において配列番号１４として示されるアスペルギルス・ツビゲンシス（Aspergillus tubigensis）脂質分解酵素）を含む。
本発明の一実施形態では、触媒三残基が、ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｎｏｗｌｅｄｇｅ ｂａｓｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｓｐｒｏｔ／及びｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ／）において、受入番号Ｐ１９８３３（２００５年７月２６日付バージョン）の下に示されるモラクセラ（Moraxella）リパーゼ１様脂質分解酵素のものと一致する場合、脂質分解酵素は、ａｂＨ２５スーパーファミリーに属すると考えることができる。
このファミリーに属する脂質分解酵素の例は、表３に示されるものを含む。
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この実施態様では、好ましくは、オキシアニオンホールを形成する残基は、Ｍ、Ｑ、Ａ、Ｆ、Ｌ又はＩである。
本発明の一実施形態では、触媒三残基が、ストレプトマイセス（Streptomyces）のものと一致する場合、脂質分解酵素は、ａｂＨ１６スーパーファミリーに属すると考えることができる。
このファミリーに属する脂質分解酵素の例は、表４に示されるものを含む。
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この実施態様では、好ましくは、オキシアニオンホールを形成する残基は、Ｔ又はＱである。
本発明の一実施形態では、触媒三残基が、ＧＸバークホルデリア（Burkholderia）リパーゼのものと一致する場合、脂質分解酵素は、ａｂＨ１５スーパーファミリーに属すると考えることができる。
このファミリーに属する脂質分解酵素の例は、表５に示されるもの、及び本明細書において配列番号１５として示されるＬＩＰＯＭＡＸを含む。
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本明細書を通じて、Ｌｉｐａｓｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｄａｔａｂａｓｅ（バージョン３．０）に従い、具体的なスーパーファミリー及び／又は相同ファミリーに分類される酵素の例が提供される。本発明の一実施形態では、本発明の脂質分解酵素は、これらの例示された群の１種又は複数の脂質分解酵素から選択されてもよい。
別の実施態様では、本発明において用いる脂質分解酵素は、以下の属：サーモマイセス（Thermomyces）（好ましくは、サーモマイセス・ラヌギノサス（T. lanuginosus））、サーモビフィダ（Thermobifida）（好ましくは、サーモビフィダ・フスカ（T. fusca））、シュードモナス（Pseudomonas）（好ましくは、シュードモナス・アルカリゲネス（P. alcaligenes））、及びストレプトマイセス（Streptomyces）（好ましくは、ストレプトマイセス・プリスチナエスピラリス（S. pristinaespiralis））の１種以上に由来するものであってもよい。
適当には、脂質分解酵素は、以下のアミノ酸配列：
ａ）配列番号１１；
ｂ）配列番号１５；
ｃ）配列番号１６；
ｄ）配列番号１７；
ｅ）ａ）〜ｄ）において定義されるアミノ酸配列のいずれか１つに対して、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９１％、好ましくは少なくとも９２％、好ましくは少なくとも９３％、好ましくは少なくとも９４％、好ましくは少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９６％、好ましくは少なくとも９７％、好ましくは少なくとも９８％、又は好ましくは少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列；又は
ｆ）１つ又は幾つかの修飾（すなわち、欠損、置換及び／又は挿入）、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９個のアミノ酸修飾を除き、又はそれ以上の、例えば、１０個のアミノ酸修飾を除き、ａ）〜ｄ）のいずれか１つに詳述され、かつ脂質分解酵素活性を有するアミノ酸配列；の１種以上が含まれ得る。
適当には、脂質分解酵素は、ａｂＨ １５スーパーファミリー、好ましくはａｂＨ １５．０１スーパーファミリーに属してもよい。
適当には、脂質分解酵素は、以下のアミノ酸配列
ａ）配列番号２５；
ｂ）配列番号２６；
ｃ）図３６に示される、シグナルペプチドを欠く配列番号２５；
ｄ）ａ）〜ｃ）において定義されるアミノ酸配列のいずれか１つに対して、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９１％、好ましくは少なくとも９２％、好ましくは少なくとも９３％、好ましくは少なくとも９４％、好ましくは少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９６％、好ましくは少なくとも９７％、好ましくは少なくとも９８％、又は好ましくは少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列；又は
ｅ）１つ又は幾つかの修飾（すなわち、欠損、置換及び／又は挿入）、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９個のアミノ酸修飾を除き、又はそれ以上の、例えば、１０個のアミノ酸修飾を除き、ａ）〜ｃ）のいずれか１つに詳述され、かつ脂質分解酵素活性を有するアミノ酸配列；のうちの１種以上が含まれ得る。
適当には、脂質分解酵素は、ゲオバチルス（Geobacillus）種、好ましくは、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（G stearothermophilus）株Ｔ１（ＧｅｏＴ１）（例えば、配列番号２５に示されるもの）からクローン化されたリパーゼを含み得る。一部の実施態様では、脂質分解酵素（例えば、ＧｅｏＴ１）は、細菌のセルロースの触媒ドメインのカルボキシ末端（例えば、配列番号２６に示されるもの）に融合させる。一部の実施態様では、細菌のセルラーゼは、オランダのＣｅｎｔｒａｌ Ｂｕｒｅａｕ ｖｏｏｒ Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ，Ｂａａｍにより、ＣＢＳ ６７０．９３（ＢＣＥ１０３として言及される）として寄託されたバチルス（Bacillus）株に由来する。一部の実施態様では、脂質分解酵素（例えば、ＧｅｏＴ１）は、切断可能なリンカーにより、ＢＣＥ１０３セルラーゼと結合させる。したがって、一部の実施態様では、脂質分解酵素（例えば、ＧｅｏＴ１）は、融合タンパク質ではない。
適当には、脂質分解酵素は、ａｂＨ １８スーパーファミリー、好ましくはａｂＨ １８．０１スーパーファミリーに属し得る。
適当には、脂質分解酵素は、以下のアミノ酸配列
ｆ）配列番号２７；
ｇ）配列番号２８；
ｈ）図３６において示される、シグナルペプチドを欠く配列番号２７；
ｉ）ａ）〜ｃ）において定義されるアミノ酸配列のいずれか１つに対して、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９１％、好ましくは少なくとも９２％、好ましくは少なくとも９３％、好ましくは少なくとも９４％、好ましくは少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９６％、好ましくは少なくとも９７％、好ましくは少なくとも９８％、又は好ましくは少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列；又は
ｊ）１つ又は幾つかの修飾（すなわち、欠損、置換及び／又は挿入）、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９個のアミノ酸修飾を除き、又はそれ以上の、例えば、１０個のアミノ酸修飾を除き、ａ）〜ｃ）のいずれか１つに詳述され、かつ脂質分解酵素活性を有するアミノ酸配列；のうちの１種以上を含み得る。
適当には、脂質分解酵素は、バチルス・スブチリス（Bacillus subtilis）からクローン化されたリパーゼ、好ましくは、バチルス・スブチリス（Bacillus subtilis）由来のリパーゼＡ（ＬｉｐＡ）（例えば、配列番号２７に示されるもの）を含み得る。一部の実施態様では、脂質分解酵素（例えば、ＬｉｐＡ）は、細菌のセルロースの触媒ドメインのカルボキシ末端に融合する（例えば、配列番号２８に示されるもの）。一部の実施態様では、細菌のセルラーゼは、オランダのＣｅｎｔｒａｌ Ｂｕｒｅａｕ ｖｏｏｒ Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ，Ｂａａｍにより、ＣＢＳ ６７０．９３（ＢＣＥ１０３として言及される）として寄託されたバチルス（Bacillus）株に由来する。一部の実施態様では、脂質分解酵素（例えば、ＬｉｐＡ）は、切断可能なリンカーにより、ＢＣＥ１０３セルラーゼに結合する。したがって、一部の実施態様では、脂質分解酵素（例えば、ＬｉｐＡ）は、融合タンパク質ではない。
一態様において、本明細書において用いられる「リパーゼ」、「リパーゼ酵素」、「脂質分解酵素」、「脂質分解ポリペプチド」、又は「脂質分解タンパク質」は、脂質分解能（例えば、トリグリセリド又はリン脂質を分解する能力）を発揮する酵素、ポリペプチド、又はタンパク質に言及する。脂肪分解酵素は、例えばリパーゼ、ホスホリパーゼ、エステラーゼ又はクチナーゼであってよい。本明細書で用いられるとおり、脂質分解活性は、当該技術分野において既知の任意の手法（例えば、Ｇｕｐｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２００３，３７：６３〜７１；米国特許第５，９９０，０６９号；及び国際公開公報第９６／１８７２９号を参照）に従い、測定され得る。
一態様では、本発明は、
ａ）配列番号１７において示されるポリペプチド、又はリパーゼ活性を有するその断片；
ｂ）配列番号１７として示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９１％、好ましくは少なくとも９２％、好ましくは少なくとも９３％、好ましくは少なくとも９４％、好ましくは少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９６％、好ましくは少なくとも９７％、好ましくは少なくとも９８％、又は好ましくは少なくとも９９％の同一性を有し、かつリパーゼ活性を有するポリペプチド；又は
ｃ）１つ又は幾つかの修飾（すなわち、欠損、置換及び／又は挿入）、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９個のアミノ酸修飾を除き、又はそれ以上の、例えば、１０個のアミノ酸修飾を除き、配列番号１７に詳述され、かつリパーゼ活性を有するポリペプチド；
ｄ）配列番号２３のヌクレオチド配列により、又は遺伝コードの縮重に起因し配列番号２３のヌクレオチド配列に関連する核酸により、コードされるポリペプチド；
ｅ）配列番号２３として示されるアミノ酸配列に対して、又は遺伝コードの縮重により、配列番号２３のヌクレオチド配列と関連する核酸に対して、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９１％、好ましくは少なくとも９２％、好ましくは少なくとも９３％、好ましくは少なくとも９４％、好ましくは少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９６％、好ましくは少なくとも９７％、好ましくは少なくとも９８％、又は好ましくは少なくとも９９％の同一性を有する核酸配列によりコードされる、リパーゼ活性を有するポリペプチド；
ｆ）厳密な条件下で配列番号２３の核酸配列の相補鎖とハイブリド形成する核酸配列によりコードされ、リパーゼ活性を有するポリペプチド；又は
ｇ）リパーゼ活性を有する、ストレプトマイセス（Streptomyces）（好ましくは、ストレプトマイセス・プリスチナエスピラリス（S. pristinaespiralis））に由来し得る（好ましくは、由来する）ポリペプチド；を含む洗剤又は洗浄組成物を提供する。
適当には、ポリペプチドは、組成物の総重量の０．０１〜２重量ｐｐｍの濃度で存在し得る。組成物は、更に、プロテアーゼ、アミラーゼ、グルコアミラーゼ、マルトース生成アミラーゼ、非マルトース生成アミラーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、カルボヒドラーゼ、セルラーゼ、ペクチナーゼ、マンナナーゼ、アラビナーゼ、ガラクタナーゼ、キシラナーゼ、オキシダーゼ、ラッカーゼ、ペルオキシダーゼ及びアシルトランスフェラーゼからなる群から選択される１種以上の酵素が含まれ得る。
適当には、組成物は、１種以上の界面活性剤、例えば、非イオン性（半極性を含む）、アニオン性、カチオン性及び双性イオン性からなる群から選択される１種以上の界面活性剤を含み得る。
適当には、組成物は、粉末状であっても、あるいは液体状であってもよい。
本発明は、更に、表面を、
ａ）配列番号１７において示されるポリペプチド、又はリパーゼ活性を有するその断片；
ｂ）配列番号１７として示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９１％、好ましくは少なくとも９２％、好ましくは少なくとも９３％、好ましくは少なくとも９４％、好ましくは少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９６％、好ましくは少なくとも９７％、好ましくは少なくとも９８％、又は好ましくは少なくとも９９％の同一性を有し、かつリパーゼ活性を有するポリペプチド；又は
ｃ）１つ又は幾つかの修飾（すなわち、欠損、置換及び／又は挿入）、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９個のアミノ酸修飾を除き、又はそれ以上の、例えば、１０個のアミノ酸修飾を除き、配列番号１７に詳述され、かつリパーゼ活性を有するポリペプチド；
ｄ）配列番号２３のヌクレオチド配列により、又は遺伝コードの縮重に起因し配列番号２３のヌクレオチド配列に関連する核酸によりコードされるポリペプチド；
ｅ）配列番号２３として示されるアミノ酸配列に対して、又は遺伝コードの縮重に起因し配列番号２３のヌクレオチド配列と関連する核酸に対して、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９１％、好ましくは少なくとも９２％、好ましくは少なくとも９３％、好ましくは少なくとも９４％、好ましくは少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９６％、好ましくは少なくとも９７％、好ましくは少なくとも９８％、又は好ましくは少なくとも９９％の同一性を有する核酸配列によりコードされる、リパーゼ活性を有するポリペプチド；
ｆ）厳密な条件下で配列番号２３の核酸配列の相補鎖とハイブリド形成する核酸配列によりコードされる、リパーゼ活性を有するポリペプチド；又は
ｇ）リパーゼ活性を有する、ストレプトマイセス（Streptomyces）（好ましくは、ストレプトマイセス・プリスチナエスピラリス（S. pristinaespiralis））に由来し得る（好ましくは、由来する）ポリペプチド；を含む組成物と接触させることにより、脂質汚れを表面から除去する方法を提供する。
別の態様では、本発明は、洗浄及び／又は洗剤における、
ａ）配列番号１７において示されるポリペプチド、又はリパーゼ活性を有するその断片；
ｂ）配列番号１７として示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９１％、好ましくは少なくとも９２％、好ましくは少なくとも９３％、好ましくは少なくとも９４％、好ましくは少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９６％、好ましくは少なくとも９７％、好ましくは少なくとも９８％、又は好ましくは少なくとも９９％の同一性を有し、かつリパーゼ活性を有するポリペプチド；又は
ｃ）１つ又は幾つかの修飾（すなわち、欠損、置換及び／又は挿入）、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９個のアミノ酸修飾を除き、又はそれ以上の、例えば、１０個のアミノ酸修飾を除き、配列番号１７に詳述され、かつリパーゼ活性を有するポリペプチド；
ｄ）配列番号２３のヌクレオチド配列により、又は遺伝コードの縮重に起因し配列番号２３のヌクレオチド配列に関連する核酸により、コードされるポリペプチド；
ｅ）配列番号２３として示されるアミノ酸配列に対して、又は遺伝コードの縮重に起因し配列番号２３のヌクレオチド配列と関連する核酸に対して、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９１％、好ましくは少なくとも９２％、好ましくは少なくとも９３％、好ましくは少なくとも９４％、好ましくは少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９６％、好ましくは少なくとも９７％、好ましくは少なくとも９８％、又は好ましくは少なくとも９９％の同一性を有する核酸配列によりコードされる、リパーゼ活性を有するポリペプチド；
ｆ）厳密な条件下で配列番号２３の核酸配列の相補鎖とハイブリド形成する核酸配列によりコードされる、リパーゼ活性を有するポリペプチド；又は
ｇ）リパーゼ活性を有する、ストレプトマイセス（Streptomyces）（好ましくは、ストレプトマイセス・プリスチナエスピラリス（S. pristinaespiralis））に由来し得る（好ましくは由来する）ポリペプチド；を含む組成物の使用を提供する。
例えば、かかる使用は、脂質汚れを表面から減らすか又は取り除くことを目的とする場合がある。
別の態様では、本発明は、表面を洗浄する方法であって、表面を、
ａ）配列番号１７において示されるポリペプチド、又はリパーゼ活性を有するその断片；
ｂ）配列番号１７として示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９１％、好ましくは少なくとも９２％、好ましくは少なくとも９３％、好ましくは少なくとも９４％、好ましくは少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９６％、好ましくは少なくとも９７％、好ましくは少なくとも９８％、又は好ましくは少なくとも９９％の同一性を有し、かつリパーゼ活性を有するポリペプチド；又は
ｃ）１つ又は幾つかの修飾（すなわち、欠損、置換及び／又は挿入）、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９個のアミノ酸修飾を除き、又はそれ以上の、例えば、１０個のアミノ酸修飾を除き、配列番号１７に詳述され、かつリパーゼ活性を有するポリペプチド；
ｄ）配列番号２３のヌクレオチド配列により、又は遺伝コードの縮重に起因し配列番号２３のヌクレオチド配列に関連する核酸により、コードされるポリペプチド；
ｅ）配列番号２３として示されるアミノ酸配列に対して、又は遺伝コードの縮重に起因し配列番号２３のヌクレオチド配列と関連する核酸に対して、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９１％、好ましくは少なくとも９２％、好ましくは少なくとも９３％、好ましくは少なくとも９４％、好ましくは少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９６％、好ましくは少なくとも９７％、好ましくは少なくとも９８％、又は好ましくは少なくとも９９％の同一性を有する核酸配列によりコードされる、リパーゼ活性を有するポリペプチド；
ｆ）厳密な条件下で配列番号２３の核酸配列の相補鎖とハイブリド形成する核酸配列によりコードされる、リパーゼ活性を有するポリペプチド；又は
ｇ）リパーゼ活性を有する、ストレプトマイセス（Streptomyces）（好ましくは、ストレプトマイセス・プリスチナエスピラリス（S. pristinaespiralis））に由来し得る（好ましくは、由来する）ポリペプチド；を含む組成物と接触させる工程を含む方法を提供する。
更なる態様では、本発明は、物品を洗浄する方法であって、物品を、
ａ）配列番号１７において示されるポリペプチド、又はリパーゼ活性を有するその断片；
ｂ）配列番号１７として示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９１％、好ましくは少なくとも９２％、好ましくは少なくとも９３％、好ましくは少なくとも９４％、好ましくは少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９６％、好ましくは少なくとも９７％、好ましくは少なくとも９８％、又は好ましくは少なくとも９９％の同一性を有し、かつリパーゼ活性を有するポリペプチド；又は
ｃ）１つ又は幾つかの修飾（すなわち、欠損、置換及び／又は挿入）、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９個のアミノ酸修飾を除き、又はそれ以上の、例えば、１０個のアミノ酸修飾を除き、配列番号１７に詳述され、かつリパーゼ活性を有するポリペプチド；
ｄ）配列番号２３のヌクレオチド配列により、又は遺伝コードの縮重に起因し配列番号２３のヌクレオチド配列に関連する核酸により、コードされるポリペプチド；
ｅ）配列番号２３として示されるアミノ酸配列に対して、又は遺伝コードの縮重に起因し配列番号２３のヌクレオチド配列と関連する核酸に対して、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９１％、好ましくは少なくとも９２％、好ましくは少なくとも９３％、好ましくは少なくとも９４％、好ましくは少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９６％、好ましくは少なくとも９７％、好ましくは少なくとも９８％、又は好ましくは少なくとも９９％の同一性を有する核酸配列によりコードされる、リパーゼ活性を有するポリペプチド；
ｆ）厳密な条件下で配列番号２３の核酸配列の相補鎖とハイブリド形成する核酸配列によりコードされる、リパーゼ活性を有するポリペプチド；又は
ｇ）リパーゼ活性を有する、ストレプトマイセス（Streptomyces）（好ましくは、ストレプトマイセス・プリスチナエスピラリス（S. pristinaespiralis））に由来し得る（好ましくは、由来する）ポリペプチド；を含む組成物と接触させる工程を含む方法を提供する。
適当には、物品は、衣料品又は食卓用品であり得る。
本発明は、脂質分解酵素及びヒドロホビンを含む組成物の、多くの適用、方法、及び使用を提供する。誤解を避けるため、これらの適用、方法、及び使用のそれぞれは、
ａ）配列番号１７において示されるポリペプチド、又はリパーゼ活性を有するその断片；
ｂ）配列番号１７として示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９１％、好ましくは少なくとも９２％、好ましくは少なくとも９３％、好ましくは少なくとも９４％、好ましくは少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９６％、好ましくは少なくとも９７％、好ましくは少なくとも９８％、又は好ましくは少なくとも９９％の同一性を有し、かつリパーゼ活性を有するポリペプチド；又は
ｃ）１つ又は幾つかの修飾（すなわち、欠損、置換及び／又は挿入）、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９個のアミノ酸修飾を除き、又はそれ以上の、例えば、１０個のアミノ酸修飾を除き、配列番号１７に詳述され、かつリパーゼ活性を有するポリペプチド；
ｄ）配列番号２３のヌクレオチド配列により、又は遺伝コードの縮重に起因し配列番号２３のヌクレオチド配列に関連する核酸により、コードされるポリペプチド；
ｅ）配列番号２３として示されるアミノ酸配列に対して、又は遺伝コードの縮重に起因し配列番号２３のヌクレオチド配列と関連する核酸に対して、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９１％、好ましくは少なくとも９２％、好ましくは少なくとも９３％、好ましくは少なくとも９４％、好ましくは少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９６％、好ましくは少なくとも９７％、好ましくは少なくとも９８％、又は好ましくは少なくとも９９％の同一性を有する核酸配列によりコードされる、リパーゼ活性を有するポリペプチド；
ｆ）厳密な条件下で配列番号２３の核酸配列の相補鎖とハイブリド形成する核酸配列によりコードされる、リパーゼ活性を有するポリペプチド；又は
ｇ）リパーゼ活性を有する、ストレプトマイセス（Streptomyces）（好ましくは、ストレプトマイセス・プリスチナエスピラリス（S. pristinaespiralis））に由来し得る（好ましくは、由来する）ポリペプチド；を含む組成物に適用されてもよい。
宿主細胞
本発明に関連して用語「宿主細胞」は、上述のヌクレオチド配列又は発現ベクターのいずれかを含み、本明細書に記載される固有の特性を有する酵素の組み換え産生において用いられる、任意の細胞を含む。
したがって、本発明の更なる実施態様は、本発明の酵素を発現するヌクレオチド配列により形質転換又は形質移入した宿主細胞を提供する。細胞は、前記ベクターに適合する細胞が選択され、例えば、原核（例えば、細菌）、真菌、酵母又は植物細胞であってもよい。好ましくは、宿主細胞は、ヒト細胞ではない。
適当な細菌宿主生物の例は、グラム陽性又はグラム陰性細菌種である。
本発明の酵素をコードするヌクレオチド配列の性質、及び／又は発現タンパク質の更なる処理の望ましさに応じて、真核生物宿主（例えば、酵母又は他の真菌）が好ましい場合がある。しかしながら、ある種のタンパク質は、酵母細胞から不完全に分泌され、又は一部の場合では、適切なプロセシングを受けない（例えば、酵母中で過剰にグリコシル化される）。これらの例では、異なる真菌宿主生物が選択されるべきである。
適当な宿主細胞（例えば、酵母、真菌、及び植物宿主細胞）を使用することで、本発明の組み換え発現産物に対して最適な活性を与えるために必要とされ得る、翻訳後修飾（例えば、ミリストイル化、グリコシル化、トランケーション、脂質化、及びチロシン、セリン又はスレオニンリン酸化、又はＮ末端アセチル化）が提供される。
宿主細胞は、プロテアーゼ欠損株又はプロテアーゼマイナス株であってもよい。
宿主細胞の遺伝子型を改変して、発現性を向上させてもよい。
宿主細胞の改変例としては、ジスルフィド結合形成を増強するための、細胞質におけるプロテアーゼ欠損、レアｔＲＮＡの補充、及び還元電位の改変が挙げられる。
例えば、宿主細胞エシェリキア・コリ（E. coli）にレアｔＲＮＡを過剰発現させて、Ｋａｎｅ（Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（１９９５），６，４９４〜５００「Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｒａｒｅ ｃｏｄｏｎ ｃｌｕｓｔｅｒｓ ｏｎ ｈｉｇｈ−ｌｅｖｅｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ Ｅ．ｃｏｌｉ」）に例示され、記載される異種タンパク質の発現を改良してもよい。宿主細胞の多数の還元酵素を欠損させ、これにより、Ｂｅｓｓｅｔｔｅ（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ（１９９９），９６，１３７０３〜１３７０８「Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｆｏｌｄｉｎｇ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｗｉｔｈ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｄｉｓｕｌｐｈｉｄｅ ｂｏｎｄｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｃｙｔｏｐｌａｓｍ」）に例示され、記載される、安定なジスルフィド結合の形成を支持することもできる。
単離
一態様では、本発明において用いる酵素は、単離形態であってもよい。
用語「単離された」は、配列又はタンパク質が、配列又はタンパク質は、天然で当然関連し、天然で観察される少なくとも１つの他の成分を少なくとも実質的に含まないことを意味する。
精製
一態様では、本発明において用いる酵素は、精製形態で用いられてもよい。
用語「精製された」は、配列が、比較的純粋な状態であること、例えば、少なくとも純度約５１％純度、又は少なくとも約７５％、又は少なくとも約８０％、又は少なくとも純度約９０％、又は少なくとも純度約９５％、又は少なくとも純度約９８であることを意味する。
本発明によるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列のクローニング
本明細書において定義される固有の特性を有するポリペプチド、又は修飾に適したポリペプチドのいずれかをコードするヌクレオチド配列は、前記ポリペプチドを産生する任意の細胞又は生物から単離されてもよい。ヌクレオチド配列の単離のための種々の方法が、当該技術分野において周知である。
例えば、ゲノムＤＮＡ及び／又はｃＤＮＡライブラリーは、ポリペプチドを産生する生物由来の染色体ＤＮＡ又はメッセンジャーＲＮＡを用いて、構築されてもよい。ポリペプチドのアミノ酸配列が既知であれば、標識オリゴヌクレオチドプローブを合成し、これを用いて、生物から調製されたゲノムライブラリーからポリペプチドをコードするクローンを同定してもよい。あるいは、別の既知のポリペプチド遺伝子に対して相同な配列を含有する標識オリゴヌクレオチドプローブを用いて、ポリペプチドをコードしているクローンを同定することができる。後者の場合、より厳密度の低いハイブリダイゼーション条件及び洗浄条件が用いられる。
あるいは、ポリペプチドをコードするクローンは、ゲノムＤＮＡの断片を発現ベクター（例えば、プラスミド）に挿入し、得られたゲノムＤＮＡライブラリーを用いて、酵素を発現しない細菌を形質転換し、次に、形質転換させた細菌を、ポリペプチドにより阻害された酵素を含有させた寒天上に蒔き、ポリペプチドを発現するクローンを同定できるようにすることにより、同定できる。
更に別の方法では、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、確立された標準的方法により、例えば、Ｂｅｕｃａｇｅ Ｓ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．（１９８１）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２２，１８５９〜１８６９に記載のホスホロアミダイト法、又はＭａｔｔｈｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９８４）ＥＭＢＯ Ｊ．３，８０１〜８０５に記載の方法により合成を行い調製することもできる。ホスホロアミダイト法では、オリゴヌクレオチドは、例えば、自動ＤＮＡ合成機により合成され、精製され、アニーリングされ、ライゲーションされ、適当なベクターにクローン化される。
ヌクレオチド配列は、標準的な技術により、合成、ゲノム又はｃＤＮＡ由来（必要に応じて）の断片をライゲーションさせることで調製される、ゲノム由来の配列と合成由来の配列の混合体、合成由来の配列とｃＤＮＡ由来の配列の混合体、又はゲノム由来の配列とｃＤＮＡ由来の配列の混合体であってもよい。ライゲーションさせる各断片は、ヌクレオチド配列全体の様々な部分に相当する。ＤＮＡ配列はまた、特異的なプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により調製されてもよい（例えば、米国特許第４，６８３，２０２号、又はＳａｉｋｉ Ｒ Ｋ ｅｔ ａｌ．（Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８）２３９，４８７〜４９１）に記載される）。
ヌクレオチド配列
本発明はまた、本明細書において定義される固有の特性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列も包含する。本明細書で使用するとき、用語「ヌクレオチド配列」は、オリゴヌクレオチド配列又はポリヌクレオチド配列、及び変異体、相同体、断片及びこれらの誘導体（例えば、その部分）を指す。ヌクレオチド配列は、ゲノム由来又は合成由来又は組換え由来であってもよく、２本鎖又は１本鎖であってもよく、センス鎖又はアンチセンス鎖のいずれかである。
本発明に関連する用語「ヌクレオチド配列」は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ、及びＲＮＡを含む。好ましくは、ヌクレオチド配列は、ＤＮＡ、より好ましくはコード配列のｃＤＮＡである。
好ましい実施態様では、本明細書において定義される、固有の特性を有するポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列自体は、天然環境でも存在する天然に関連する配列に結合する、天然の環境にある天然ヌクレオチド配列を対象としない。参照しやすいように、この好ましい実施態様を、「天然でないヌクレオチド配列」と呼ぶ。これに関連して、用語「天然のヌクレオチド配列」は、天然に関連し、天然の環境に存在するプロモーター全体に作動可能に結合している、天然環境にあるヌクレオチド配列全体を意味する。
しかしながら、本発明の範囲により包含されるアミノ酸配列は、天然生物において、ヌクレオチド配列の発現後に単離及び／又は精製することができる。しかしながら、好ましくは、本発明の範囲に包含されるアミノ酸配列は、天然生物においてヌクレオチド配列により発現されてもよいものの、ヌクレオチド配列は、生物内において、天然では関連するプロモーターの制御下には置かない。
好ましくは、ポリペプチドは、天然のポリペプチドではない。これに関して、用語「天然ポリペプチド」は、その天然の状態であり、かつ天然のヌクレオチド配列により発現されている、ポリヌクレオチド全体を意味する。
典型的には、本明細書において定義される固有の特性を有するポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列は、組み換えＤＮＡ技術（すなわち、組み換えＤＮＡ）を用いて、調製される。しかしながら、本発明の別の実施態様では、ヌクレオチド配列は、当該技術分野において周知の化学的方法（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ ＭＨ ｅｔ ａｌ．（１９８０）Ｎｕｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ Ｓｙｍｐ Ｓｅｒ ２１５〜２３ ａｎｄ Ｈｏｒｎ Ｔ ｅｔ ａｌ．（１９８０）Ｎｕｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ Ｓｙｍｐ Ｓｅｒ ２２５〜２３２を参照）の全体又は一部を用いて、合成することができる。
分子進化
酵素をコードしているヌクレオチド配列を単離したか、又は推定酵素をコードしているヌクレオチド配列を同定したならば、ヌクレオチド配列を選別し、改変すること、例えば、本発明に従う酵素を調製するために、配列に変異を導入することが望ましい場合がある。
変異は、合成オリゴヌクレオチドを用いて導入されてもよい。これらのオリゴヌクレオチドは、所望の変異部位に隣接するヌクレオチド配列を含有する。
適当な方法は、Ｍｏｒｉｎａｇａ ｅｔ ａｌ．（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９８４）２，６４６〜６４９）に記載されている。酵素をコードしているヌクレオチド配列に変異を導入する別の方法は、Ｎｅｌｓｏｎ ａｎｄ Ｌｏｎｇ（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９８９），１８０，１４７〜１５１）に記載されている。
例えば上述の部位特異的変異誘導の代わりに、例えば、市販のキット（例えば、ＳｔｒａｔａｇｅｎｅのＧｅｎｅＭｏｒｐｈ ＰＣＲ突然変異誘発キット、又はＣｌｏｎｔｅｃｈのＤｉｖｅｒｓｉｆｙ ＰＣＲランダム突然変異誘発キット）を用いて、変異をランダムに導入することができる。欧州特許第０ ５８３ ２６５号は、ＰＣＲベースの変異誘発を最適化する方法に言及しており、この方法と、変異原性のＤＮＡ類似体（例えば、欧州特許第０ ８６６ ７９６号に記載されるもの）の使用とを組み合わせることもできる。エラープローンＰＣＲ技術は、好ましい特徴を有する脂質アシルトランスフェラーゼの変異体の産生に適している。国際公開公報第０２／０６４５７号は、リパーゼの分子進化に言及する。
新規配列を得るための第３の方法は、任意の数の制限酵素又は酵素（例えば、Ｄｎａｓｅ Ｉ）を用い、機能的タンパク質をコードする全ヌクレオチド配列を再構成することにより、異なるヌクレオチド配列を断片化するというものである。あるいは、１つ以上の異なるヌクレオチド配列を用い、全ヌクレオチド配列の再構成中に変異を導入することができる。ＤＮＡシャッフリングリング技術及びファミリーシャッフリング技術は、好ましい特徴を有する脂質アシルトランスフェラーゼの変異体の産生に適している。「シャッフリング」を行う適当な方法は、欧州特許第０ ７５２ ００８号、欧州特許第１ １３８ ７６３号、欧州特許第１ １０３ ６０６号において見ることができる。シャッフリングはまた、米国特許第６，１８０，４０６号及び国際公開公報第０１／３４８３５号に記載される他の形態のＤＮＡ変異誘発法と組み合わせることもできる。
したがって、インビボ又はインビトロのいずれかで、ヌクレオチド配列に多数の部位特異的変異又はランダム変異を生じさせること、及びコードされているポリペプチドのうち機能の改良されているものを種々の手法によりスクリーニングすること、ができる。インシリコ及びエキソ介在組み換え方法（例えば、国際公開公報第００／５８５１７号、米国特許第６，３４４，３２８号、米国特許第６，３６１，９７４号を参照）を用いて、例えば、分子進化を行うことができ、分子進化により生じた変異体は既知の酵素又はタンパク質に対して非常に低い相同性を保持する。これにより得られるかかる変異体は、既知のトランスフェラーゼ酵素に有意な構造的類似性を有し得るが、非常に低いアミノ酸配列相同性を有する。
更に、非限定的な例として、ポリヌクレオチド配列の変異又は天然の変異体は、新たな変異体を生成するために野生型又は他の変異又は天然の変異体のいずれかと組み合わせることができる。かかる新たな変異体は、コードされているポリペプチドのうち機能の改良されているものについてスクリーニングすることもできる。
上述及び類似の分子進化方法を適用することにより、タンパク質構造又は機能の任意の先行知識を有さずとも、好ましい特徴を有する本発明の酵素の変異体の同定及び選択することが可能になり、予測可能なものではないが、有用な変異又は変異体の創出を可能にする。当該技術分野では、酵素活性を最適化又は変更する際に分子進化を適用する多数の例が存在しており、かかる例としては、次の：宿主細胞又はインビトロにおける発現及び／又は活性の最適化、酵素活性の増加、基質及び／又は産物特異性の変更、酵素又は構造安定性の増加又は低下、好ましい環境条件（例えば、温度、ｐＨ、基質）における酵素活性／特異性の変化の１つ以上が挙げられるが、これらに限定されない。
当業者には明らかなように、分子進化ツールを用いて、酵素を変化させ、酵素の機能性を改良してもよい。
適当には、本発明において用いられる脂質分解酵素をコードしているヌクレオチド配列は、変異体をコードし得る（すなわち、脂質分解酵素は、親酵素と比較した場合に少なくとも１つのアミノ酸置換、欠損又は付加を含有し得る）。変異体酵素は、親酵素と少なくとも７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９９％の相同性を保持する。
脂質分解酵素変異体は、親酵素と比較して、トリグリセリド、及び／又はモノグリセリド及び／又はジグリセリドに対して低減した活性を有してもよい。
適当には、酵素変異体は、トリグリセリド及び／又はモノグリセリド及び／又はジグリセリドに対する活性を有し得る。
あるいは、変異体酵素は、増加した熱安定性を有してもよい。
変異体酵素は、次の、極性脂質、リン脂質、レシチン、ホスファチジルコリン、糖脂質、ジガラクトシルモノグリセリド、モノガラクトシルモノグリセリドの１つ以上に対して増加した活性を有してもよい。
脂質アシルトランスフェラーゼの変異体が知られており、かかる変異体の１つ以上は、本発明による方法及び使用法、並びに／あるいは本発明による酵素組成物における使用に適当であり得る。ほんの一例として、脂質アシルトランスフェラーゼの変異体は、本発明に従い用いることのできる以下の参考文献において記載されている：Ｈｉｌｔｏｎ ＆ Ｂｕｃｋｌｅｙ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９１ Ｊａｎ １５：２６６：９９７〜１０００；Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９４ Ｊａｎ ２１；２６９：２１４６〜５０；Ｂｒｕｍｌｉｋ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９９６ Ａｐｒ；１７８：２０６０〜４；Ｐｅｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．１９９８ Ｍａｒ；７：５８７〜９９。
アミノ酸配列
本発明はまた、本発明の方法及び／又は使用法のいずれか１つにおいて用いる酵素をコードしているヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列の使用も包含する。
本明細書で使用するとき、用語「アミノ酸配列」は、用語「ポリペプチド」及び／又は用語「タンパク質」と同義である。一部の場合では、用語「アミノ酸配列」は、用語「ペプチド」と同義である。一部の場合では、用語「アミノ酸配列」は、「酵素」と同義である。
アミノ酸配列は、適当な供給源から調製／単離してもよく、あるいは合成により作成してもよく、あるいは組み換えＤＮＡ技術を使用することにより調製してもよい。
適当には、アミノ酸配列は、本明細書で示される単離ポリペプチドから標準的な技術により得ることができる。
単離ポリペプチドからアミノ酸配列を決定する適当な方法の１つは、以下のとおりである：
精製ポリペプチドを凍結乾燥させ、凍結乾燥材料１００μｇを、８Ｍ尿素と０．４Ｍ炭酸水素アンモニウムとの混合物（ｐＨ ８．４）５０μｌに溶解する。溶解したタンパク質を変性させ、５０℃で１５分間還元し、続いて、窒素をオーバーレイし、４５ｍＭジチオスレイトール５μｌを加える。室温まで冷却後、１００ｍＭヨードアセトアミド５μｌを加え、室温で１５分間、暗所、窒素下においてシステイン残基を誘導体化させる。
水１３５μｌと、水５μｌ中エンドプロテアーゼＬｙｓ−Ｃ ５μｇとを、上記反応混合物に加え、３７℃、窒素下で、２４時間消化を行う。
得られたペプチドを、溶媒Ａ：水中０．１％ ＴＦＡ、及び溶媒Ｂ：アセトニトリル中０．１％ ＴＦＡを用い、ＶＹＤＡＣ Ｃ１８カラム（０．４６×１５ｃｍ；１０μｍ；Ｔｈｅ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｇｒｏｕｐ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）を使用し、逆相ＨＰＬＣにより分離する。選別したペプチドに対し、同一の溶媒系を用いてＤｅｖｅｌｏｓｉｌ Ｃ１８カラムで再びクロマトグラフィーを行い、その後、Ｎ末端の配列決定を行う。製造元（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）の指示に従い、パルス液体高速サイクルを用い、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ４７６Ａ配列決定装置を使用して、配列決定を行う。
配列同一性又は配列相同性
ここで、用語「相同体」は、目的のアミノ酸配列及び目的のヌクレオチド配列とある一定の相同性を有する配列を意味する。ここで、用語「相同性」は、「同一性」と同等とみなすことができる。
相同アミノ酸配列及び／又はヌクレオチド配列は、機能的活性を保持し、及び／又は酵素活性を増強するポリペプチドを提供及び／又はコードすべきである。
本開示の文脈において、相同配列は、目的の配列に対して、少なくとも５０％、５５％、６０％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一、好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むと解される。典型的には、相同体は、目的のアミノ酸配列と同一の活性部位などを含むであろう。相同性はまた、類似性（すなわち、類似の化学特性／機能を有するアミノ酸残基）の観点から考えることができるが、本発明の文脈では、配列同一性の観点で相同性を表すことが好ましい。
本開示の文脈において、相同配列は、本発明のポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列（目的配列）に対して、少なくとも７５、８５又は９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一、好ましくは、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であり得るヌクレオチド配列を含むと解される。典型的には、相同体は、目的の配列と同一の、活性部位などをコードする配列を含むであろう。相同性はまた、類似性（すなわち、類似の化学特性／機能を有するアミノ酸残基）の観点から考えることができるが、本発明の文脈では、配列同一性の観点で相同性を表すことが好ましい。
相同性比較は、目、又はより一般的には、容易に入手可能な配列比較プログラムを利用して、行うことができる。これらの市販の入手可能なコンピュータープログラムは、２つ以上の配列間の相同性（％）を計算することができる。
相同性（％）は、隣接配列にわたって計算してもよく、すなわち、１つの配列を他の配列と整列させ、１つの配列中の各アミノ酸を、他の配列中の対応するアミノ酸と一残基ずつ同時に直接比較する。これは、「無ギャップ」アラインメントと呼ばれる。典型的には、かかる無ギャップアラインメントは、比較的残基数の短い場合にのみ実施される。
この手法は非常に単純でかつ着実な手法であるものの、例えば、本来であれば同一である配列対において、１箇所に挿入又は欠失が入っている場合を考慮に入れることができず、以降のアミノ酸残基はアラインメントから除外されることになり、したがって、グローバルアラインメントを実施した場合に、相同性（％）が大幅に低下する可能性がある。これらを踏まえ、ほとんどの配列比較法は、全体的な相同性スコアに対して重すぎるペナルティを設けずに、可能性のある挿入及び欠失を考慮に入れ、最適なアラインメントを生成するよう設計されている。この手法は、配列アラインメント時に「ギャップ」を挿入して、局所的な相同性を最大化させることで実施される。
しかしながら、これらのより複雑な手法は各ギャップに対して「ギャップペナルティ」を割り当てるものであり、同数の同一のアミノ酸に関し可能な限りギャップが少なくなる−比較する２つの配列間の関連性がより大きく反映される−ような配列アラインメントは、ギャップを多く含むアラインメントと比較してより高いスコアが付けられるようになる。「アフィンギャップコスト」は、一般的に用いられる手法であり、この手法では、ペナルティは、ギャップの伸長に対して比較的重く設定され、ギャップ中で続く各残基に対しては軽く設定される。この手法は、最も一般的に使用されているギャップスコアリング系である。当然のことながら、ギャップペナルティが高い場合には、ギャップ数がより少なくなるよう最適化されたアラインメントが得られることになる。ほとんどのアラインメントプログラムは、ギャップペナルティを変更することができる。しかしながら、配列比較の際にこのようなソフトウェアを用いる場合、デフォルト値を使用することが好ましい。
したがって、配列の最大一致度を計算するには、第一にギャップペナルティを考慮に入れて最適アラインメントを行うことが必要とされる。このようなアラインメントを実施するのに好適なコンピュータープログラムはＶｅｃｔｏｒ ＮＴＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．）である。配列比較を行うことができる他のソフトウェアの例は、ＢＬＡＳＴ ｐａｃｋａｇｅ（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．１９９９ Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４ｔｈ Ｅｄ−Ｃｈａｐｔｅｒ １８を参照）、及びＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．１９９０ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４０３〜４１０）を含むが、これらに限定されない。ＢＬＡＳＴとＦＡＳＴＡのいずれをもオフライン及びオンライン検索に利用することができる（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．１９９９，７〜５８〜７〜６０を参照）。しかしながら、一部の用途に関しては、ベクターＮＴＩプログラムを用いることが好ましい。タンパク質とヌクレオチド配列を比較する際には、ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓと呼ばれる新規ツールも利用することができる（ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ １９９９ １７４：２４７〜５０；ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ １９９９ １７７：１８７〜８、及びｔａｔｉａｎａ＠ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照）。
最終的な相同性（％）は、同一性の観点から評価され得るものの、アラインメント方法は、典型的には、全か無かの対比較に基づくものではない。その代わりに、一般的にはスケールを用いた類似性スコアマトリックスが用いられ、各対比較に対し、化学的類似性又は進化距離に基づきスコアが割り当てられる。一般的に用いられるこのようなマトリックス例としては、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックスが挙げられ、この場合、プログラムにはＢＬＡＳＴ向けのデフォルトのマトリックスが適する。ベクターＮＴＩプログラムには、概して、公共のデフォルト値、又は提供された場合にはカスタムされたシンボル比較表のいずれかが用いられる（更なる詳細については使用者マニュアルを参照されたい）。一部の用途に関しては、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ ＡＤＶＡＮＣＥ（商標）１０パッケージのデフォルト値を用いることが好ましい。
あるいは、相同性（％）は、ＣＬＵＳＴＡＬ（Ｈｉｇｇｉｎｓ ＤＧ ＆ Ｓｈａｒｐ ＰＭ（１９８８），Ｇｅｎｅ ７３，２３７〜２４４）に類似するアルゴリズムに基づき、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ ＡＤＶＡＮＣＥ（商標）１０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．）において多重配列アラインメント機能を用い、算出することができる。
ソフトウェアにより最適アラインメントを生成すれば、相同性（％）、好ましくは配列同一性（％）を算出することができる。ソフトウェアは、典型的には、配列比較の一部としてこの算出を行い、計算結果を生成する。
適当には、ヌクレオチド配列に対する同一度は、少なくとも２０個の連続するヌクレオチド、好ましくは少なくとも３０個の連続するヌクレオチド、好ましくは少なくとも４０個の連続するヌクレオチド、好ましくは少なくとも５０個の連続するヌクレオチド、好ましくは少なくとも６０個の連続するヌクレオチド、好ましくは少なくとも１００個の連続するヌクレオチドにわたって決定される。
適当には、ヌクレオチド配列に対する同一度は、配列全長にわたって決定することができる。
配列同一性を決定する場合にはギャップペナルティを用いるべきであり、好ましくは、ペアワイズアラインメントの際には、プログラムのデフォルトパラメータを使用する。例えば、次のパラメーターが、現在ＢＬＡＳＴ ２でペアワイズアラインメントを行う際にデフォルトのパラメーターである：
Figure 0006027092
一実施形態では、好ましくは、ヌクレオチド配列及び／又はアミノ酸配列の配列同一性は、上で定義されるスコアリングパラメーターセットを用いるＢＬＡＳＴ２（ｂｌａｓｔｎ）を用いて決定されてもよい。
本発明の目的に際し、同一度は、配列間で同一である残基数に基づくものである。本発明よる同一度は、アミノ酸配列については、当該技術分野において既知のコンピュータープログラム（例えば、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ ＡＤＶＡＮＣＥ（商標）１１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．））により適当に決定されてもよい。ペアワイズアラインメントの際に用いられるスコアリングパラメーターは、好ましくは、Ｇａｐ ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ ｐｅｎａｌｔｙを１１としＧａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｐｅｎａｌｔｙを１とするＢＬＯＳＵＭ６２である。
適当には、アミノ酸配列に対する同一度は、少なくとも２０個の連続するアミノ酸、好ましくは少なくとも３０個の連続するアミノ酸、好ましくは少なくとも４０個の連続するアミノ酸、好ましくは少なくとも５０個の連続するアミノ酸、好ましくは少なくとも６０個の連続するアミノ酸、好ましくは少なくとも１００個の連続するアミノ酸にわたって決定される。
好適には、アミノ酸に対する同一度は、配列全長にわたって決定することができる。
配列はまた、サイレント変異を生じ機能的には等価な物質を生成するようなアミノ酸残基の欠失、挿入又は置換を有してもよい。基質の二次結合活性が保持されるのであれば、残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性、及び／又は両親媒性における類似性に基づき、アミノ酸を意図的に置換してもよい。例えば、負に荷電したアミノ酸としては、アスパラギン酸及びグルタミン酸が挙げられ；正に荷電したアミノ酸としては、リジン及びアルギニンが挙げられ；類似の親水性値を有する、無電荷の極性頭部を有するアミノ酸としては、ロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、フェニルアラニン、及びチロシンが挙げられる。
例えば、以下の表に従い、保存的置換がなされてもよい。第２列の同一ブロックのアミノ酸、好ましくは、第３列の同一ラインのアミノ酸は、それぞれ他のものに置換されてもよい：
Figure 0006027092
本発明はまた、同様の置換（例えば、塩基性に対して塩基性、酸性に対して酸性、極性に対して極性など）を生じ得る相同置換（本明細書において用いられる置換及び置き換えはいずれも、既存のアミノ酸残基を、代わりの残基で置き換えることを意味する）包含する。非相同置換、すなわち、１種類の残基から別の残基への置換、あるいは非天然のアミノ酸（例えば、オルニチン（本明細書において、以下、Ｚとして言及される）、ジアミノ酪酸オルニチン（本明細書において、以下、Ｂとして言及される）、ノルロイシンオルニチン（本明細書において、以下、Ｏとして言及される）、ピリジルアラニン、チエニルアラニン、ナフチルアラニン及びフェニルグリシン）の包含も生じさせることができる。
置き換えはまた、非天然アミノ酸により行われてもよい。
変異体のアミノ酸配列は、アルキル基（例えば、メチル、エチル、又はプロピル基）を含む配列の任意の２つのアミノ酸残基の間で挿入され得る適当なスペーサー基の他にアミノ酸スペーサー残基（例えば、グリシン又はβ−アラニン残基）が含まれ得る。変異体のその他の形態が、ペプトイド形態の１種以上のアミノ酸残基の存在に関与することは、当業者に十分に理解されるだろう。誤解を避けるため、「ペプトイド形態」により、変異体アミノ酸残基（ここで、α−炭素置換基は、残基のα−炭素ではなくむしろ窒素原子上にある）を指す。ペプトイド形態のペプチドを調製するプロセスは、当該技術分野（例えば、Ｓｉｍｏｎ ＲＪ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ（１９９２）８９，９３６７〜９３７１、及びＨｏｒｗｅｌｌ ＤＣ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９５）１３，１３２〜１３４）において知られている。
本発明において用いるヌクレオチド配列、又は本明細書において定義される固有の特性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列には、その範囲内に、合成ヌクレオチド又は修飾ヌクレオチドが包含され得る。オリゴヌクレオチドに対する多数の異なる種類の修飾が、当該技術分野において知られている。これらの修飾としては、メチルホスホネート及びホスホロチオエート骨格、及び／又は分子の３’及び／又は５’末端でのアクリジン又はポリリジン鎖の付加が挙げられる。本発明の目的のため、本明細書において記載されるヌクレオチド配列が、当該技術分野で利用可能な任意の方法により修飾されてもよいことは理解されるべきである。かかる修飾は、ヌクレオチド配列のインビボ活性又は寿命を増すために行われてもよい。
本発明はまた、本明細書において考察される配列に相補的なヌクレオチド配列、又は任意の誘導体、断片又はこれらの誘導体も包含する。配列がこれらの断片に相補的である場合、この配列は、他の生物おいて、類似のコード配列を同定するためのプローブなどとして用いることができる。
本発明の配列に対し１００％相同ではないものの、本発明の範囲内にあるポリヌクレオチドは、多数の方法で得ることができる。本明細書に記載される配列の他の変異体は、様々な個体（例えば、異なる集団由来の個体）から作成したＤＮＡライブラリーを探索することにより、得てもよい。加えて、他のウイルス／細菌、又は細胞由来の相同体、具体的には、哺乳類細胞（例えば、ラット、マウス、ウシ、霊長類細胞）において見られる細胞由来の相同体を得ることができ、かかる相同体及びその断片は、一般に、本明細書に列挙する配列に示される配列と選択的にハイブリッド形成させることができる。かかる配列は、他の動物種から作成したｃＤＮＡライブラリー、又は他の動物種由来のゲノムＤＮＡライブラリーを探索することにより、及びかかるライブラリーを、添付の配列表の配列のいずれか１つの全長又は一部を比較するプローブを用いて、中程度に厳密な条件から非常に厳密な条件下で探索することにより、得てもよい。同様の考察を、本発明のポリペプチド又はヌクレオチド配列の種相同体及びアレル変異体を得ることに適用する。
変異体及び株／種相同体はまた、本発明の配列内の保存アミノ酸配列をコードする変異体及び相同体内の標的配列を標的にするよう設計されたプライマーを用いる縮重ＰＣＲを用いて得てもよい。保存配列は、例えば、いくつかの変異体／相同体由来のアミノ酸配列を整列させることにより予測することができる。配列アラインメントは、当該技術分野において既知のコンピューターソフトウエアを用いて行うことができる。例えば、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ ＰｉｌｅＵｐプログラムが広く用いられる。
縮重ＰＣＲにおいて用いられるプライマーは１箇所以上に縮重を含有しており、既知の配列に対し単一の配列プライマーを用いて配列をクローニングする際に用いられる条件よりも厳密度の低い条件で用いられるであろう。
あるいは、かかるポリヌクレオチドは、特徴付けられる配列を部位特異的変異誘導することにより得てもよい。このような変異誘導は、例えば、ポリヌクレオチド配列を発現している特定の宿主細胞に関し、好ましいコドン最適化を行う際に、サイレントコドン配列変化が必要とされる場合に有用である。他の配列変化が、制限ポリペプチド認識部位を導入するため、又はポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの特性又は機能を変えるために所望されている場合もある。
本発明のポリヌクレオチド（ヌクレオチド配列）を用いて、プライマー（例えば、ＰＣＲプライマー、別の増幅反応のためのプライマー）、プローブ（例えば、放射性又は非放射性標識を用い、従来の手法により示される標識で標識されている）を生成してもよく、又はポリヌクレオチドをベクターにクローニングしてもよい。かかるプライマー、プローブ、及び他の断片は、少なくとも１５個、好ましくは、少なくとも２０個、例えば、少なくとも２５、３０又は４０個のヌクレオチド長であり、本明細書において用いられる本発明の用語「ポリヌクレオチド」にも包含される。
本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡポリヌクレオチド）及びプローブは、組み換えにより、合成により、又は当業者に利用可能な任意の手段により作成されてもよい。それらはまた、標準的技術によりクローン化されてもよい。
一般に、プライマーは、所望の核酸配列のヌクレオチドを一度に１つずつ合成する段階的製造を包含する合成方法により作成される。自動技術を用いてこれを行う技術は、当該技術分野において容易に利用できる。
より長いポリヌクレオチドは、一般的に、組み換え法（例えば、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）クローニング技術）を用いて作成される。組み換え法では、クローン化することが望まれる脂質標的配列の領域に隣接するプライマー（例えば、約１５〜３０個のヌクレオチド）対を作り、このプライマーを、動物又はヒト細胞から得られるｍＲＮＡ又はｃＤＮＡと接触させ、所望の領域の増幅をもたらす条件下でポリメラーゼ連鎖反応を行い、増幅断片を単離し（例えば、反応混合物をアガロースゲルで精製することにより）、増幅されたＤＮＡを回収する工程が包含されるであろう。増幅させたＤＮＡを適当なクローニングベクターにクローン化することができるように、プライマーは、適当な制限酵素認識部位を含有するよう設計されてもよい。
ハイブリダイゼーション
本発明はまた、本発明の配列に相補的な配列、あるいは本発明の配列又は本発明の配列に相補的な配列のいずれかとハイブリッド形成し得る配列の使用も包含する。
本明細書で使用するとき、用語「ハイブリッド形成」には、「核酸鎖が塩基対形成により相補鎖と結合する工程」、並びにポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法で実施される増幅工程を包含するものとする。
本発明はまた、本明細書において考察される目的の配列に相補的な配列とハイブリッド形成させることのできるヌクレオチド配列、又は任意の誘導体、断片又はこれらの誘導体の使用も包含する。
本発明は、本明細書において示すヌクレオチド配列に対してハイブリッド形成し得る配列に相補的な配列も包含する。
ハイブリダイゼーション条件は、Ｂｅｒｇｅｒ ａｎｄ Ｋｉｍｍｅｌ（１９８７，Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１５２，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ）において教示されるとおり、ヌクレオチド結合複合体の融解温度（Ｔｍ）に基づくものであり、以下で説明されるとおりに定義される「厳密度」を与える。
最も厳密な条件は、典型的には、約Ｔｍ−５℃（プローブのＴｍから５℃下げた温度）であり；非常に厳密な条件は、約５℃〜１０℃（Ｔｍ未満）であり；中程度に厳密な条件は約１０℃〜２０℃（Ｔｍ未満）であり；及び厳密どの低い条件は、約２０℃〜２５℃（Ｔｍ未満）である。最も厳密な条件下でハイブリダイゼーションは、同一のヌクレオチド配列を同定するか又は検出するのに使用することができ、一方、厳密度が中程度な（又は低い）条件下でのハイブリダイゼーションは、類似又は関連するポリヌクレオチド配列を同定又は検出するのに使用することができることは、当業者に理解されるであろう。
好ましくは、本発明は、本明細書において定義される固有の特性を有するポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列と、厳密度が高い条件又は厳密度が中程度の条件下でハイブリッド形成させることのできる配列と相補的である配列の使用を包含する。
より好ましくは、本発明は、本明細書において定義される固有の特性を有するポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列と、厳密度の高い条件（例えば、６５℃、及び０．１×ＳＳＣ｛１×ＳＳＣ＝０．１５Ｍ ＮａＣｌ，０．０１５Ｍクエン酸Ｎａ，ｐＨ ７．０｝）下でハイブリッド形成させることができる配列と相補的である配列の使用を包含する。
本発明はまた、本明細書において考察されるヌクレオチド配列（本明細書において考察される配列の相補配列を含む）とハイブリッド形成させることができるヌクレオチド配列の使用に関する。
本発明また、本明細書において考察されるヌクレオチド配列（本明細書において考察されるものの任意の相補配列を含む）とハイブリッド形成させることができる配列と相補的であるヌクレオチド配列の使用に関する。
本発明の範囲内に、本明細書において考察されるヌクレオチド配列に、中程度に厳密な条件下から最も厳密な条件下でハイブリッド形成させることができるヌクレオチド配列の使用も含まれる。
好ましい態様では、本発明は、本明細書において考察されるヌクレオチド配列、又はその相補鎖と、厳密な条件（例えば、５０℃、及び０．２×ＳＳＣ）下でハイブリッド形成させることができるヌクレオチド配列の使用も対象にする。
より好ましい態様では、本発明は、本明細書において考察されるヌクレオチド配列又はその相補鎖と、厳密度の高い条件（例えば、６５℃、及び０．１×ＳＳＣ）下でハイブリッド形成させることができるヌクレオチド配列の使用を対象とする。
生物学的活性
好ましくは、変異体配列などは、少なくとも、本明細書において提示される配列と同じくらい生物学的に活性である。
本明細書において用いられる「生物学的活性」は、天然で生じる配列と同様の構造機能（必ずしも同程度ではない）、及び／又は同様の制御機能（必ずしも同程度ではない）、及び／又は同様の生化学的機能（必ずしも同程度ではない）を有する配列に言及する。
組み換え
一態様では、本発明において用いる配列は、組み換え配列、すなわち、組み換えＤＮＡ技術を用いて調製された配列である。
これらの組み換えＤＮＡ技術は、当業者の能力内である。かかる技術は、文献（例えば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，ａｎｄ Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｂｏｏｋｓ １〜３，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）において説明されている。
合成
一態様では、本発明において用いる配列は、合成配列、すなわち、インビトロでの化学合成又は酵素合成により調製された配列である。このような配列としては、宿主生物（例えば、メチロトローフ酵母ピチア（Pichia）及びハンセヌラ（Hansenula））に最適なコドンを利用して調整される配列が挙げられるが、これらに限定されない。
ポリペプチドの発現
本発明において用いるヌクレオチド配列、又は本明細書において定義される固有の特性を有するポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列は、組み換え体を複製可能なベクターに組み込むことができる。ベクターを用いて、ポリペプチド形態で、及び／又は適合性のある宿主細胞において、ヌクレオチド配列を複製し、発現してもよい。発現は、プロモーター／エンハンサー、及び他の発現制御シグナルを含む制御配列を用いて、制御してもよい。原核生物のプロモーター及び真核生物細胞において機能するプロモーターを用いてもよい。組織特異的プロモーター又は刺激特異的プロモーターを用いてもよい。上述の２種以上の異なるプロモーター由来の配列を含むキメラプロモーターを用いてもよい。
ヌクレオチド配列を発現させることで宿主組み換え細胞により産生されるポリペプチドは、用いる配列及び／又はベクターによって、分泌させるか、又は細胞内に含有させることができる。コード配列は、特定の原核生物又は真核生物の細胞膜を介して、基質コード配列の分泌を指示する、シグナル配列を考慮して設計することができる。
発現ベクター
用語「発現ベクター」は、インビボ又はインビトロで発現可能なコンストラクトを意味する。
好ましくは、発現ベクターは、適当な宿主生物のゲノムに組み込まれる。用語「組み込み」は、好ましくは、ゲノムへの安定的な組み込みを対象とする。
本発明において用いる酵素をコードしているヌクレオチド配列は、ベクター内に存在させてよく、ベクター内では、ヌクレオチド配列は、適当な宿主生物によりヌクレオチド配列を発現させるために提供することができる制御配列に、作動可能に連結されている。
本発明において用いるベクターにより、後述の適当な宿主細胞を形質転換させて、本発明のポリペプチドを発現させてもよい。
ベクター（例えば、プラスミド、コスミド、又はファージベクター）の選択は、多くの場合、ベクターを導入する宿主細胞によって異なる。
本発明において用いるベクターは、１種以上の選択可能なマーカー遺伝子、例えば、抗生物質耐性（例えば、アンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコール又はテトラサイクリン耐性）を付与する遺伝子を含有してもよい。あるいは、選択は、同時形質転換（国際公開公報第９１／１７２４３号に記載される）により行われてもよい。
ベクターは、例えば、ＲＮＡの産生のため、インビトロで用いられてもよく、又は宿主細胞を遺伝子導入、形質転換、形質導入又は感染させるために使用してもよい。
ベクターには、対象とする宿主細胞中でのベクターの複製を可能にするヌクレオチド配列を更に含有させることもできる。かかる配列例としては、プラスミドｐＵＣ１９、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＵＢ１１０、ｐＥ１９４、ｐＡＭＢ１及びｐＩＪ７０２の複製起点が挙げられる。
制御配列
一部の用途では、本発明において用いるヌクレオチド配列は、例えば、選択した宿主細胞によりヌクレオチド配列を発現させることのできる制御配列に、作動可能に連結させる。例えば、本発明は、かかる制御配列に作動可能に連結させた本発明のヌクレオチド配列を含むベクターを対象とする（すなわち、ベクターは発現ベクターである）。
用語「作動可能に連結させた」は、記載の配列を、この連結により、企図された様式で機能させることができるよう、配列が並置されていることを意味する。コード配列に「作動可能に連結させた」制御配列は、制御配列に適した条件下でコード配列を発現させることのできるような方法でライゲーションさせる。
用語「制御配列」は、プロモーター及びエンハンサー並びにその他の発現制御シグナルを含む。
用語「プロモーター」は、当該技術分野で一般的な意味、例えば、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位で用いられる。
本発明の酵素をコードしているヌクレオチド配列の発現は、異種制御領域（例えば、プロモーター、分泌リーダー及び終結領域）の選択に応じ増強させることもできる。
好ましくは、本発明によるヌクレオチド配列は、少なくともプロモーターに作動可能に連結されている。
細菌、真菌、又は酵母宿主におけるヌクレオチド配列の転写を検出するのに適当なプロモーターの例は、当該技術分野において周知である。
コンストラクト
用語「コンストラクト」（「複合体」、「カセット」及び「ハイブリッド」などの用語と同義である）は、本発明の使用の際し本明細書で定義される固有の特性を有するポリペプチドをコードしており、プロモーターに直接的又は間接的に連結している、ヌクレオチド配列を含む。間接的な接着の例としては、イントロン配列（例えば、Ｓｈ１イントロン又はＡＤＨイントロン）を本発明のプロモーター及びヌクレオチド配列間に介在させるなど、適当なスペーサー基を提供することが挙げられる。直接的又は間接的接着を含む、本発明に関連する用語「融合させた」についても同様である。一部の場合では、用語は、天然環境にあるとき、通常であれば野生型遺伝子プロモーターと関連するタンパク質をコードしているヌクレオチド配列の、天然にみられる組み合わせを対象としない。
コンストラクトは、更に、遺伝子コンストラクトの選別を可能にするマーカーを含有するか、又は発現するものであってもよい。
一部の用途に関しては、好ましくは、コンストラクトは、少なくとも、プロモーターに作動可能に連結させた、本発明のヌクレオチド配列、又は本明細書において定義される固有の特性を有するポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列を含む。
生物
本発明に関連する用語「生物」は、本発明によるヌクレオチド配列、あるいは本明細書において定義される固有の特性を有するポリペプチド及び／又はそれから得られる産物をコードするヌクレオチド配列を含み得る、任意の生物を含む。
本発明に関連する用語「遺伝子導入生物」は、本明細書において定義される固有の特性を有するポリペプチド及び／又はそれから得られる産物をコードしているヌクレオチド配列、並びに／あるいは生物内において、本明細書において定義される固有の特性を有するポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列を発現させることができるプロモーターを含む任意の生物を包含する。好ましくは、ヌクレオチド配列は、生物のゲノムに組み込まれる。
適当な生物としては、原核生物、真菌、酵母又は植物が挙げられる。
用語「遺伝子導入生物」は、天然の環境にある天然のプロモーターの制御下であるとき、天然の環境にあるで天然のヌクレオチドコード配列を対象としない。
したがって、本発明の遺伝子導入生物には、本明細書において定義される固有の特性を有するポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列、本明細書において定義されるコンストラクト、本明細書において定義されるベクター、本明細書において定義されるプラスミド、本明細書において定義される細胞、又はそれらの産物をいずれか１つ、又は組み合わせて含む生物を含む。例えば、遺伝子導入生物はまた、本明細書において定義される固有の特性を有するポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列を、天然の脂質アシルトランスフェラーゼをコードしている配列と関連しないプロモーターの制御下で含んでいてもよい。
宿主細胞／生物の形質転換
宿主生物は、原核生物又は真核生物であり得る。
適当な原核生物宿主の例としては、細菌、例えば、エシェリキア・コリ（E. coli）及びバチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）、好ましくは、バチルス・リケニフォルミス（B. licheniformis）が挙げられる。
原核生物宿主の形質転換についての教示は、当該技術分野において十分に書式化されている（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８９，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）を参照）。原核生物宿主を用いる際、ヌクレオチド配列は、例えば、イントロンを取り除くなど、形質転換前に適当に改変させることが必要である場合もある。
別の実施態様では、遺伝子導入生物は酵母であり得る。
糸状菌細胞は、当該技術分野において既知の種々の方法（例えば、プロトプロストの形成、及びプロトプロストの形質転換、続く、既知の方法での細胞壁の再生成に関与する過程）を用いて、形質転換されてもよい。宿主微生物としてのアスペルギルス（Aspergillus）の使用は、欧州特許第０ ２３８ ０２３号に記載されている。一実施形態では、好ましくは、トリコデルマ・リーゼイ（T. reesei）が宿主生物である。
別の宿主生物は、植物であり得る。植物を形質転換するために用いられる一般的な技術の総説は、Ｐｏｔｒｙｋｕｓ（Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ（１９９１）４２：２０５〜２２５）及びＣｈｒｉｓｔｏｕ（Ａｇｒｏ−Ｆｏｏｄ−Ｉｎｄｕｓｔｒｙ Ｈｉ−Ｔｅｃｈ Ｍａｒｃｈ／Ａｐｒｉｌ １９９４ １７〜２７）において見られる。植物の形質転換についての更なる教示は、欧州公開公報第０４４９３７５号において見られる。
真菌、酵母及び植物の形質転換についての一般的な教示は、以下の節に提示される。
形質転換させた真菌
宿主生物は、真菌、例えば、糸状菌であってもよい。適当なかかる宿主の例としては、フザリウム（Fusarium）属、サーモマイセス（Thermomyces）属、アクレモニウム（Acremonium）属、アスペルギルス（Aspergillus）属、ペニシリウム（Penicillium）属、ムコール（Mucor）属、ニューロスポラ（Neurospora）属、トリコデルマ（Trichoderma）属などに属する任意のメンバーが挙げられる。一実施形態では、トリコデルマ（Trichoderma）は、宿主生物であり、好ましくは、トリコデルマ・リーゼイ（T. reesei）である。
糸状菌の形質転換についての教示は、糸状菌の形質転換及び真菌の培養の標準的技術が当該技術分野において周知であることが記載されている米国公開公報第５７４１６６５号において総説されている。ニューロスポラ・クラッサ（N. crassa）に適用される技術についての広範な総説は、例えば、Ｄａｖｉｓ ａｎｄ ｄｅ Ｓｅｒｒｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ（１９７１）１７Ａ：７９〜１４３において見られる。
糸状菌の形質転換についての更なる教示は、米国公開公報第５６７４７０７号において総説されている。
一態様では、宿主生物は、アスペルギルス（Aspergillus）属、例えば、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）であり得る。
本発明による遺伝子導入アスペルギルス（Aspergillus）はまた、次の、例えば、Ｔｕｒｎｅｒ Ｇ．１９９４（Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅｔｉｃ ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ．Ｉｎ：Ｍａｒｔｉｎｅｌｌｉ Ｓ．Ｄ．，Ｋｉｎｇｈｏｒｎ Ｊ．Ｒ．（Ｅｄｉｔｏｒｓ）Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ：５０ ｙｅａｒｓ ｏｎ．Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ｖｏｌ ２９．Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ａｍｓｔｅｒｄａｍ １９９４．ｐｐ．６４１〜６６６）の教示により、調製することができる。
糸状菌における遺伝子発現は、Ｐｕｎｔ ｅｔ ａｌ．Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２００２）；２０（５）：２００〜６，Ａｒｃｈｅｒ ＆ Ｐｅｂｅｒｄｙ Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９７）１７：２７３〜３０６に総説されている。
形質転換させた酵母
別の実施態様では、遺伝子導入生物は酵母であり得る。
酵母における異種遺伝子発現の原理の総説は、例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ（１９９５），４９：３４１〜５４、及びＣｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（１９９７）；８：５５４〜６０において提供される。
これに関して、酵母（例えば、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisi）種又はピキア・パストリス（Pichia pastoris）種又はハンセヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）種）（ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ（２０００ ２４：４５〜６６）を参照）は、異種遺伝子発現のための媒体として用いてもよい。
サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisi）における異種遺伝子発現、及び遺伝子産物の分泌の原理の総説は、Ｅ Ｈｉｎｃｈｃｌｉｆｆｅ Ｅ Ｋｅｎｎｙ（１９９３，「Ｙｅａｓｔ ａｓ ａ ｖｅｈｉｃｌｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｇｅｎｅｓ」，Ｙｅａｓｔｓ，Ｖｏｌ ５，Ａｎｔｈｏｎｙ Ｈ Ｒｏｓｅ ａｎｄ Ｊ．Ｓｔｕａｒｔ Ｈａｒｒｉｓｏｎ，ｅｄｓ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｌｔｄ．）により与えられる。
酵母の形質転換のため、幾つかの形質転換プロトコールが開発されてきた。例えば、本発明によるサッカロマイセス（Saccharomyces）は、次の、Ｈｉｎｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，（１９７８，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ＵＳＡ ７５，１９２９）；Ｂｅｇｇｓ，Ｊ Ｄ（１９７８，Ｎａｔｕｒｅ，Ｌｏｎｄｏｎ，２７５，１０４）；及びＩｔｏ，Ｈ ｅｔ ａｌ．（１９８３，Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １５３，１６３〜１６８）の教示のいずれかにより、調製することができる。
形質転換させた酵母細胞は、種々の選択マーカー（例えば、栄養要求マーカー、優性抗生物質耐性マーカー）を用いて、選別することができる。
適当な酵母宿主生物は、バイオテクノロジーにおいて関連する酵母種（例えば、ピキア（Pichia）種、ハンセヌラ（Hansenula）種、クリベロマイセス（Kluyveromyces）、ヤロウィニア（Yarrowinia）種、サッカロマイセス・セレビシエ（S. cerevisiae）を含むサッカロマイセス（Saccharomyces）種、又はシゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyce pombe）を含むシゾサッカロミセス（Schizosaccharomyce）種から選択される酵素種（これらに限定されない））から選択することができる。
メチロトローフ酵母種であるピキア・パストリス（Pichia pastoris）株を、宿主生物として用いてもよい。
一実施形態では、宿主生物は、ハンセヌラ（Hansenula）種、例えば、ハンセヌラ・ポリモルファ（H. polymorpha）（国際公開公報第０１／３９５４４号において記載される）であってもよい。
形質転換させた植物／植物細胞
本発明に適当な宿主生物は、植物であってもよい。一般的な技術の総説は、Ｐｏｔｒｙｋｕｓ（Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ（１９９１）４２：２０５〜２２５）及びＣｈｒｉｓｔｏｕ（Ａｇｒｏ−Ｆｏｏｄ−Ｉｎｄｕｓｔｒｙ Ｈｉ−Ｔｅｃｈ Ｍａｒｃｈ／Ａｐｒｉｌ １９９４ １７〜２７）による記事、又は国際公開公報第０１／１６３０８号において見ることができる。遺伝子導入植物では、フィトステロールエステル及びフィトステアノールエステルなどの産生レベルを増強させることもできる。
培養及び産生
本発明のヌクレオチド配列で形質転換させた宿主細胞は、コードしている酵素の産生につながり、かつ細胞及び／又は培養培地から酵素の回収を容易にする条件下で培養されてもよい。
細胞を培養するために用いられる培地は、対象とする宿主を成長させ、酵素を発現させるのに適当な、任意の通常培地であってもよい。
組み換え細胞により産生されるタンパク質は、細胞表面に提示されてもよい。
酵素は、宿主細胞から分泌されてもよく、周知の手法を用いて、適当には、培養培地から回収される。
分泌
多くの場合、ポリペプチドは、発現宿主から培養培地へ分泌され、この培養培地からより容易に酵素を回収することができるようなものであることが所望される。本発明によると、分泌リーダー配列は、所望の発現宿主に基づき、選択されてもよい。ハイブリッドシグナル配列はまた、本発明に関連して用いられてもよい。
天然の脂質アシルトランスフェラーゼをコードしているヌクレオチド配列と関連しない分泌リーダー配列の典型的な例は、真菌アミログルコシダーゼ（ＡＧ）遺伝子（例えば、アスペルギルス（Aspergillus）由来のｇｌａＡ（１８及び２４アミノ酸バージョン））、Ａ−ファクター遺伝子（酵母（例えば、例えば、サッカロマイセス（Saccharomyces）、クリベロマイセス（Kluyveromyces）及びハンセヌラ（Hansenula））、又はα−アミラーゼ遺伝子（バチルス（Bacillus）））を起源とするものである。
検出
アミノ酸配列の発現を検出及び測定する種々のプロトコールが、当該技術分野において知られている。例としては、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）及び蛍光標示式細胞分取法（ＦＡＣＳ）が挙げられる。
多種多様な標識及び複合体形成技術が当業者により知られており、種々の核酸及びアミノ酸アッセイにおいて用いることができる。
多数の会社（例えば、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ，ＵＳＡ）、Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）、及びＵＳ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐ（Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ，ＵＳＡ））が、これらの手法の市販のキット及びプロトコールを供給する。
適当なレポーター分子又は標識としては、放射性核種、酵素、蛍光、化学発光、又は発色剤、並びに基質、補因子、阻害剤、磁性粒子などが挙げられる。かかる標識の使用を教示する特許は、米国公開公報第３，８１７，８３７号；米国公開公報第３，８５０，７５２号；米国公開公報第３，９３９，３５０号；米国公開公報第３，９９６，３４５号；米国公開公報第４，２７７，４３７号；米国公開公報第４，２７５，１４９号及び米国公開公報第４，３６６，２４１号を含む。
また、組み換え免疫グロブリンは、米国公開公報第４，８１６，５６７号において示されるとおり産生されてもよい。
融合タンパク質
本発明において用いる酵素は、例えば、その抽出及び精製を補助するために、融合タンパク質として産生されてもよい。融合タンパク質のパートナーの例としては、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、６ｘＨｉｓ、ＧＡＬ４（ＤＮＡ結合ドメイン及び／又は転写活性化ドメイン）及びβ−ガラクトシダーゼが挙げられる。融合タンパク質パートナーと、融合タンパク質配列の除去を可能にするための目的のタンパク質配列との間に切断部位を含有させることも好適であり得る。好ましくは、融合タンパク質は、タンパク質配列の活性を妨げない。
エシェリキア・コリ（E. coli）における遺伝子融合発現システムは、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９５）６：５０１〜６に総説されている。
本明細書において定義される固有の特性を有するポリペプチドのアミノ酸配列を、非天然配列とライゲーションさせて、融合タンパク質をコードさせることもできる。例えば、基質活性に影響し得る因子についてペプチドライブラリーをスクリーニングするため、市販の抗体により認識される非天然のエピトープを発現する化学基質をコードさせることが有用な場合がある。
追加ＰＯＩ
本発明により用いる配列はまた、１種以上の対象とする追加タンパク質（ＰＯＩ）又は対象とするヌクレオチド配列（ＮＯＩ）と複合させて用いられてもよい。
ＰＯＩの非限定的な例は、でんぷん代謝に関与するタンパク質又は酵素、グリコーゲン代謝に関与するタンパク質又は酵素、アセチルエステラーゼ、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、アラビナーゼ、アラビノフラノシダーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、キモシン、クチナーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エピメラーゼ、エステラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、α−グルカナーゼ、グルカンリアーゼ、エンド−β−グルカナーゼ、グルコアミラーゼ、グルコースオキシダーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、グルクロニダーゼ、ヘミセルラーゼ、ヘキソースオキシダーゼ、加水分解酵素、インベルターゼ、イソメラーゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、リアーゼ、マンノシダーゼ、オキシダーゼ、オキシドレダクターゼ、ペクチン酸リアーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ペクチンデポリメラーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、ペクチン分解酵素、ペルオキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、フィターゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロテアーゼ、ラムノ−ガラクツロナーゼ、リボヌクレアーゼ、タウマチン、トランスフェラーゼ、輸送タンパク質、トランスグルタミナーゼ、キシラナーゼ、ヘキソースオキシダーゼ（Ｄ−ヘキソース：Ｏ２−オキシドレダクターゼ、ＥＣ １．１．３．５）、又はその組み合わせを含む。ＮＯＩは、これらの配列のいずれかに対するアンチセンス配列であってもよい。
ＰＯＩは、更に、例えば、抽出及び精製を補助するための融合タンパク質であってもよい。
ＰＯＩは、更に、分泌配列と融合させてもよい。
界面活性剤
本発明の組成物は、洗浄組成物及び／又は洗剤組成物の成分を形成してもよい。具体的には、本発明のある種の実施態様には、更に、洗剤を含有させてもよい。
一般に、洗浄組成物及び洗剤組成物は、当該技術分野において十分に記載されており、適当な洗浄組成物及び洗剤組成物の更なる記載については、国際公開公報第９６／３４９４６号；国際公開公報第９７／０７２０２号；及び国際公開公報第９５／３００１１号を参照されたい。
本発明の化合物は、例えば、汚れの付着した布地の事前処理に適当な洗濯添加組成物、及びすすぎ時添加用布地軟化剤組成物を含む、手洗い又は機械洗い用洗剤組成物として配合されてもよく、あるいは一般家庭の硬質表面の洗浄操作に用いる洗浄組成物（洗車用又は洗浄組成物を含む）として配合されてもよく、あるいは食器手洗い操作又は食器機械洗浄操作用に配合されてもよい。本発明の化合物は、ハンドソープ、シャンプー及びシャワージェルを含むがこれらに限定されない、パーソナル衛生製品として用いるために考案されてもよい。
一実施形態では、本発明の洗濯組成物は、脂質分解酵素、ヒドロホビン、及び場合により、洗剤を、１種以上の酵素、例えば、プロテアーゼ、カルボキシペプチダーゼ、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、グルコアミラーゼ、マルトース生成アミラーゼ、非マルトース生成アミラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、ホスホリパーゼ、糖転移酵素、キチナーゼ、クチナーゼ、カルボヒドラーゼ、セルラーゼ、ペクチナーゼ、マンナナーゼ、マンノシダーゼ、アラビナーゼ、ガラクタナーゼ、キシラナーゼ、オキシダーゼ、ポリエステラーゼ、ラッカーゼ、シクロデキストリンエステラーゼ、フィターゼ、カタラーゼ、ハロペルオキシダーゼ、及び／又はペルオキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペプチドグルタミナーゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、トランスグルタミナーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、リボヌクレアーゼ、及び／又はその組み合わせと組み合わせて含んでもよい。一般的に、選択される酵素の特性は、選択される洗剤に適したものであるべき（例えば、至適ｐＨ、他の酵素及び非酵素成分などとの適合性）であり、酵素は有効量で存在すべきである。
プロテアーゼ：適当なプロテアーゼには、動物、野菜又は微生物起源のものを含む。化学的に修飾した又はタンパク質を遺伝子操作した変異体も適している。プロテアーゼは、セリンプロテアーゼ又はメタロプロテアーゼ（例えば、アルカリ微生物プロテアーゼ又はトリプシン様プロテアーゼ）であってもよい。アルカリプロテアーゼの例としては、サブチリシン、特に、バチルス（Bacillus）種に由来するもの、例えば、サブチリシンＮｏｖｏ、サブチリシンＣａｒｌｓｂｅｒｇ、サブチリシン３０９（例えば、米国特許第６，２８７，８４１号を参照）、サブチリシン１４７、及びサブチリシン１６８（例えば、国際公開公報第８９／０６２７９号を参照）が挙げられる。トリプシン様プロテアーゼの例としては、トリプシン（例えば、ブタ又はウシ起源のもの）、フザリウム（Fusarium）プロテアーゼ（例えば、国際公開公報第８９／０６２７０号及び国際公開公報第９４／２５５８３号を参照）が挙げられる。有用なプロテアーゼの例としては、国際公開公報第９２／１９７２９号及び国際公開公報第９８／２０１１５号に記載される変異体も挙げられるが、これらに限定されない。適当な市販のプロテアーゼ酵素としては、ＡＬＣＡＬＡＳＥ（登録商標）、ＳＡＶＩＮＡＳＥ（登録商標）、ＬＩＱＵＡＮＡＳＥ（登録商標）、ＯＶＯＺＹＭＥ（登録商標）、ＰＯＬＡＲＺＹＭＥ（登録商標）、ＥＳＰＥＲＡＳＥ（登録商標）、ＥＶＥＲＬＡＳＥ（登録商標）、及びＫＡＮＮＡＳＥ（登録商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ，以前はＮｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ Ａ／Ｓ）；ＥＸＣＥＬＬＡＳＥ（商標）、ＭＡＸＡＴＡＳＥ（登録商標）、ＭＡＸＡＣＡＬ（商標）、ＭＡＸＡＰＥＭ（商標）、ＰＲＯＰＥＲＡＳＥ（登録商標）、ＰＲＯＰＥＲＡＳＥ Ｌ（登録商標）、ＰＵＲＡＦＥＣＴ（登録商標）、ＰＵＲＡＦＥＣＴ Ｌ（登録商標）、ＰＵＲＡＦＡＳＴ（商標）、ＯＸＰ（商標）、ＦＮ２（商標）、及びＦＮ３（商標）（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ−Ｄａｎｉｓｃｏ Ａ／Ｓの一部門）が挙げられる。
ポリエステラーゼ：適当なポリエステラーゼには、国際公開公報第０１／３４８９９号（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ）及び国際公開公報第０１／１４６２９号（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ）に記載されるものが含まれるが、これらに限定されず、本明細書において考察される他の酵素と任意に組み合わせて含有させることができる。
アミラーゼ：組成物には、アミラーゼ（例えば、α−アミラーゼ（ＥＣ ３．２．１．１）、Ｇ４−形成アミラーゼ（ＥＣ ３．２．１．６０）、β−アミラーゼ（ＥＣ ３．２．１．２）及びγ−アミラーゼ（ＥＣ ３．２．１．３））を含有させることができる。これらのアミラーゼには、細菌又は真菌起源のアミラーゼが含まれ、化学的に修飾された又はタンパク質を遺伝子操作した変異体が含まれる。市販のアミラーゼとしては、例えば、ＤＵＲＡＭＹＬ（登録商標）、ＴＥＲＭＡＭＹＬ（商標）、ＦＵＮＧＡＭＹＬ（登録商標）及びＢＡＮ（商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ，以前はＮｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ Ａ／Ｓ）、ＲＡＰＩＤＡＳＥ（登録商標）、及びＰＵＲＡＳＴＡＲ（登録商標）（Ｄａｎｉｓｃｏ ＵＳＡ，Ｉｎｃ．）、ＬＩＱＵＥＺＹＭＥ（商標）、ＮＡＴＡＬＡＳＥ（商標）、ＳＵＰＲＡＭＹＬ（商標）、ＳＴＡＩＮＺＹＭＥ（商標）、ＦＵＮＧＡＭＹＬ及びＢＡＮ（商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓ）、ＲＡＰＩＤＡＳＥ（商標）、ＰＵＲＡＳＴＡＲ（商標）、ＰＵＲＡＳＴＡＲＯＸＡＭ（商標）及びＰＯＷＥＲＡＳＥ（商標）（Ｄａｎｉｓｃｏ ＵＳＡ Ｉｎｃ．より）、ＧＲＩＮＤＡＭＹＬ（商標）ＰｏｗｅｒＦｒｅｓｈ、ＰＯＷＥＲＦｌｅｘ（商標）及びＧＲＩＮＤＡＭＹＬ ＰｏｗｅｒＳｏｆｔ（Ｄａｎｉｓｃｏ Ａ／Ｓより）などが挙げられるが、これらに限定されない。
ペルオキシダーゼ／オキシダーゼ：組成物において用いるために企図された適当なペルオキシダーゼ／オキシダーゼには、植物、細菌又は真菌起源のものを含む。化学修飾した変異体又はタンパク質を遺伝子操作した変異体が含まれる。有用なペルオキシダーゼの例としては、国際公開公報第９３／２４６１８号、国際公開公報第９５／１０６０２号、及び国際公開公報第９８／１５２５７号に記載される、コプリナス（Coprinus）由来、例えば、コプリナス・シネレウス（C. cinereus）由来のペルオキシダーゼ、及びその変異体が挙げられる。市販のペルオキシダーゼとしては、ＧＵＡＲＤＺＹＭＥ（登録商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓ）が挙げられる。
セルラーゼ：適当なセルラーゼは、細菌又は真菌起源のものを含む。化学修飾した変異体又はタンパク質を遺伝子操作した変異体が含まれる。適当なセルラーゼとしては、バチルス（Bacillus）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、フミコラ（Humicola）属、フザリウム（Fusarium）属、チエラビア（Thielavia）属、アクレモニウム（Acremonium）属由来のセルラーゼ、例えば、米国特許第４，４３５，３０７号；第５，６４８，２６３号；第５，６９１，１７８号；第５，７７６，７５７号；及び国際公開公報第８９／０９２５９号などに開示される、フミコラ・インソレンス（Humicola insolens）、ミセリオフトラ・テルモフィラ（Myceliophthora thermophila）及びフザリウム・オキシスポラム（Fusarium oxysporum）から産生される真菌セルラーゼが挙げられる。用いるために企図された典型的なセルラーゼは、布に対し有益な色ケア効果を有するものである。かかるセルラーゼの例としては、欧州特許第０４９５２５７号；欧州特許第５３１３７２号；国際公開公報第９９／２５８４６号（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）、国際公開公報第９６／３４１０８号（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）、国際公開公報第９６／１１２６２号；国際公開公報第９６／２９３９７号；及び国際公開公報第９８／０８９４０号などに記載のセルラーゼが挙げられる。他の例としては、セルラーゼ変異体、例えば、国際公開公報第９４／０７９９８号；国際公開公報第９８／１２３０７号；国際公開公報第９５／２４４７１号；国際公開公報第９９／０１５４４号；欧州公開公報第５３１ ３１５号；米国特許第５，４５７，０４６号；第５，６８６，５９３号；及び第５，７６３，２５４号に記載のものが挙げられる。市販のセルラーゼとしては、ＣＥＬＬＵＺＹＭＥ（登録商標）、ＣＡＲＥＺＹＭＥ（登録商標）及びＥＮＤＯＬＡＳＥ（登録商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ，旧称Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ Ａ／Ｓ）；ＣＬＡＺＩＮＡＳＥ（商標）及びＰＵＲＡＤＡＸ（登録商標）ＨＡ（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ）；及びＫＡＣ−５００（Ｂ）（商標）（花王株式会社）が挙げられる。
市販のマンナナーゼの例としては、ＭＡＮＮＡＷＡＹ（商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ，Ｄｅｎｍａｒｋ）及びＭＡＮＮＡＳＴＡＲ（商標）（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ）が挙げられる。
本発明の組成物は、固体又は液体のいずれかとして配合することができる。製剤の例としては、顆粒、ペレット、スラリー、バー、ペースト、フォーム、ゲル、ストリップなどが挙げられる。好ましい洗剤補助製剤は、顆粒、特に、非散布顆粒、液体、特に、安定化された液体、又はスラリーである。液体洗剤は、水性であってよく、典型的には、最大７０％の水と０〜３０％の機溶媒を含有してよく、又は非水性であってもよい。
非散布顆粒は、米国特許第４，１０６，９９１号及び第４，６６１，４５２号に開示されるとおり生成されてもよく、場合により、当該技術分野において既知の方法により、コーティングされてもよい。ワックスコーティング材料の例としては、平均分子量１０００〜２００００を有するポリ（エチレンオキシド）製品（ポリエチレングリコール，ＰＥＧ）；１６〜５０個のエチレンオキシド単位を有するエトキシ化ノニルフェノール；エトキシ化脂肪アルコール（ここで、アルコールは、１２〜２０個の炭素原子を含有し、１５〜８０個のエチレンオキシド単位が存在する）；脂肪アルコール；脂肪酸；及び脂肪酸のモノ−及びジ−及びトリグリセリドである。流動層技術による適用に適当なフィルム形成コーティング材料の例は、独逸特許第１４８３５９１号において与えられる。液体酵素製剤は、例えば、確立された方法に従い、ポリオール（例えば、プロピレングリコール）、糖又は糖アルコール、乳酸又はホウ酸を加えることにより、安定化させてもよい。保護化酵素（Protected enzyme）を、欧州公開公報第２３８２１６号に開示される方法に従い調製してもよい。
洗剤組成物はまた、１種以上の更なる界面活性剤を含んでいてもよく、界面活性剤は、半極性などの非イオン性界面活性剤、及び／又はアニオン性及び／又はカチオン性及び／又は双性イオン性界面活性剤であってもよい。界面活性剤は、典型的には、０．１〜６０重量％の濃度で存在する。
含有させる際、洗剤には、通常、約１％〜約４０％でアニオン性界面活性剤、例えば、直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩、α−オレインスルホン酸塩、アルキルスルホン酸塩（脂肪アルコールスルホン酸塩）、アルコールエトキシスルホン酸塩、２級アルカンスルホン酸塩、α−スルホ脂肪酸メチルエステル、アルキル−又はアルケニルコハク酸、又はせっけんを含有させる。
含有させる際、洗剤には、通常、約０．２％〜約４０％で非イオン性界面活性剤、例えば、アルコールエトキシレート、ノニルフェノールエトキシレート、アルキルポリグリコシド、アルキルジメチルアミンオキシド、エトキシ化脂肪酸モノエタノールアミド、脂肪酸モノエタノールアミド、ポリヒドロキシアルキル脂肪酸アミド、又はグルコサミンの他のＮ−アシル又はＮ−アルキル誘導体を含有させる。
洗剤には、０〜６５％洗剤結合剤、又は錯化剤、例えば、ゼオライト、二リン酸塩、三リン酸塩、ホスホン酸塩、炭酸塩、クエン酸塩、ニトロ三酢酸、エチレンジアミン四酢酸、ジエチレントリアミン五酢酸、アルキル−又はアルケニルコハク酸、可溶性ケイ酸塩又は層状ケイ酸塩（例えば、ＨｏｅｃｈｓｔのＳＫＳ−６）を含有させてもよい。
洗剤は、１種以上のポリマーを含んでいてもよい。例は、カルボキシメチルセルロース、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（ビニルピリジン−Ｎ−オキシド）、ポリ（ビニルイミダゾール）、ポリカルボキシレート、例えば、ポリアクリル酸塩、マレイン酸／アクリル酸共重合体及びメタクリル酸ラウリル／アクリル酸共重合体である。
洗剤には、過酸化水素供給源、例えば、過ホウ酸塩又は過炭酸塩（漂白活性化剤を形成する過酸、例えば、テトラアセチルエチレンジアミン又はノナノイルオキシベンゼンスルホン酸塩と組み合わせてもよい）を含む漂白系を含有させてもよい。あるいは、漂白系は、例えば、アミド、イミド、又はスルホン型のペルオキシ酸を含むものであってもよい。
本発明の洗剤組成物の酵素は、通常の安定化剤、例えば、ポリオール、例えば、プロピレングリコール又はグリセロール、糖又は糖アルコール、乳酸、ホウ酸、又はホウ酸誘導体、例えば、芳香族ホウ酸エステル、又はフェニルボロン酸誘導体、例えば、４−ホルミルフェニルボロン酸を用いて安定化されてもよく、組成物は、例えば、国際公開公報第９２／１９７０９号及び国際公開公報第９２／１９７０８号に記載されるとおり、配合することもできる。
洗剤には、他の通常の洗剤成分、例えば、クレイを含む柔軟剤、フォームブースター、抑泡剤、防食剤、汚れ懸濁化剤、再付着防止剤、染料、殺菌剤、光学的光沢剤、ヒドロトロープ、変色防止剤、又は香料を含有させてもよい。
用量
本発明の組成物において、ヒドロホビンは、本明細書に記載される効果を発揮させるのに十分な任意の濃度で存在させ得る。適当には、ヒドロホビンは、組成物の総重量の０．００１重量％〜５重量％、好ましくは０．００２重量％〜２．５重量％、より好ましくは０．００５重量％〜１重量％、更により好ましくは０．０１重量％〜０．５重量％の濃度で存在する。特に好ましい例において、ヒドロホビンは、組成物の総重量の０．０１、０．０５、０．１、０．２５又は０．４重量％の濃度で存在する。
本発明の組成物において、脂質分解酵素は、本明細書に記載される効果を発揮させるのに十分な任意の濃度で存在させ得る。
適当には、脂質分解酵素は、純粋な酵素タンパク質が組成物の総重量の０．００１〜４００ｐｐｍ、好ましくは０．００２〜２００ｐｐｍ、より好ましくは０．００５〜１００ｐｐｍ、更により好ましくは０．０１〜５０ｐｐｍ、更により好ましくは０．０２〜２５ｐｐｍになるような濃度で存在する。
適当には、脂質分解酵素は、組成物１ｇ当たりの酵素活性単位が、０．０２５〜２５、好ましくは０．０５〜１０、より好ましくは０．１〜５単位になるような濃度で存在する。活性は、後述のトリオクタン酸アッセイ従い測定され、活性１単位は、酵素溶液１ｇにより１分間で１μｍｏｌの遊離脂肪酸が生成されることを表す。
本発明の組成物が洗剤を含む場合、洗剤は、本明細書において記載される効果を発揮させるのに十分な任意の濃度で存在してもよい。適当には、洗剤は、洗浄溶液の体積（Ｌ）により０．００１〜２０ｇ／Ｌ、好ましくは０．０１〜１０ｇ／Ｌ、より好ましくは０．０５〜５ｇ／Ｌ、更により好ましくは０．１〜２５ｇ／Ｌの濃度で存在し、特に好ましい例において、洗剤は、洗浄溶液の０．０１、０．０５、０．１、０．２５又は０．４ｇ／Ｌの濃度で存在する。
トリオクタン酸アッセイ
２つのバッファー：０．０５Ｍ ４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）（ｐＨ ８．２に調整）、又は０．０５Ｍ Ｎ−シクロヘキシル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）（ｐＨ １０に調整）のいずれか１つを用い、エタノール（５％）に予め懸濁した０．４％トリオクタン酸から組成物に含有させるトリオクタン酸の反応エマルションを調製した。いずれのバッファーも、水の硬度を２４０ｐｐｍに調整した。最終的なアッセイ混合物は、トリグリセリドの乳化を促進するために、様々な量の洗剤を含んでいた。
高速せん断混合を２分間（２４０００ｍ−１，Ｕｌｔｒａ Ｔｕｒｒａｘ Ｔ２５，Ｊａｎｋｅ ＆ Ｋｕｎｋｅｌ）行い、次に、酵素３０μＬを含有させた９６ウェルマイクロタイタープレートに１５０μＬを移し、反応エマルションを調製した。遊離脂肪酸の生成を、非エステル化脂肪酸（ＮＥＦＡ）の定量的測定用のインビトロ酵素比色分析アッセイにより測定した。この方法は遊離脂肪酸に特異的なものであり、添加したアシルＣｏＡシンテターゼの存在下で、脂肪酸によって補酵素Ａ（ＣｏＡ）がアシル化されることに基づくものである。このようにして生成したアシルＣｏＡは、添加されたアシルＣｏＡオキシダーゼによって酸化され、ペルオキシダーゼの存在下で過酸化水素が生成される。これにより、３−メチル−Ｎ−エチル−Ｎ（β−ヒドロキシエチル）−アニリンと４−アミノアンチピリンとの酸化縮合が可能となり、比色測定により測定することができる紫色の付加化合物が形成される。３０℃で６分間のインキュベーション後に生成された遊離脂肪酸の量は、ＮＥＦＡ ＨＲ（２）キット（Ｗａｋｏ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ ＧｍｂＨ，Ｇｅｒｍａｎｙ）中の材料を用い、ＮＥＦＡ Ａ溶液１２０μＬを含有させた９６ウェルマイクロタイタープレートに加水分解溶液３０μＬを移すことにより測定した。３０℃で３分間インキュベートした後、ＮＥＦＡ Ｂ溶液６０μＬを加えた。３０℃で４．５分間インキュベート後、５２０ｎｍのＯＤを測定した。
洗濯組成物
本発明において用いられるヒドロホビンは、洗濯組成物中でその場で（例えば、洗濯組成物においてヒドロホビン前駆体（例えば、ヒドロホビン融合タンパク質）の加水分解により）、生成されてもよい。
ヒドロホビン前駆体（例えば、ヒドロホビン融合タンパク質）は、本発明において用いられるヒドロホビンをその場で生成するために必要とされる。ヒドロホビン前駆体は、洗濯組成物の初期成分として存在してもよい。あるいは、ヒドロホビン前駆体が当初存在しないか、又は十分なヒドロホビン前駆体が当初存在しない場合、この成分を組成物に加えることができる。
所望なら、触媒（具体的には、酵素、特に、プロテアーゼ酵素）を存在させてもよい。触媒は、洗濯組成物の初期成分として存在させることもできる。あるいは、触媒が当初存在しないか、又は十分な触媒が当初存在しない場合、この成分を組成物に加えることができる。
洗濯組成物は更に汚れを含んでいてもよく、この汚れは、脂質（特に、トリグリセリド及び／又はジグリセリド及び／又はモノグリセリド）であってもよい。汚れは、表面、例えば、布地上でに存在してもよい。したがって、本発明の洗濯組成物は、表面、例えば、布地が含まれ得る。
ヒドロホビン前駆体を、本発明において用いられるヒドロホビンに変換することで、布地から脂質を含む汚れを除去する助けとなり得る。
洗浄方法
本発明は更に、表面を本発明による組成物に接触させることにより、この表面から脂質汚れを除去する方法を含む。更に、本発明は、表面を本発明による組成物に接触させる工程を含む、表面を洗浄する方法を含む。更に、本発明は、物品を本発明による組成物に接触させる工程を含む、物品（特に、衣料品又は食卓用品（これに限らない））を洗浄する方法を含む。
別の態様では、油脂汚れを布から除去する方法が提供される。方法は、一般的には、油脂汚れを有する布地を識別する工程、この布地を本発明の組成物と接触させる工程、布地を濯いで、油脂汚れを布地から除去する工程を含む。
一部の実施態様では、脂質分解酵素、ヒドロホビン、及び場合により洗剤は、単一の組成物中に一緒に存在する。一部の実施態様では、脂質分解酵素、ヒドロホビン、及び場合により洗剤は、異なる組成物中に分けられ、これらは布地と接触させる前に組み合わされ、又は布上で一緒に混合される。したがって、リパーゼ及び補助剤の適用は、結果として同時であってもよい。一部の実施態様では、接触は、洗浄の前処理工程、すなわち、布を手洗い又は機械洗いする前に生じる。一部の実施態様では、接触は、布を手洗い又は機械洗いするのと同時に生じる。接触は、本組成物を洗浄水と混合した結果、組成物を布にスプレーした、注いだ、又は浸けた結果、又はアプリケーターを用いて組成物を適用した結果として生じてもよい。
方法は、典型的には、脂肪酸エステル、例えば、トリグリセリドを含む、様々な油汚れ又は油脂汚れ部分を除去するのに有効である。
すすぎは場合により洗浄後に行ってもよいこと、及びある種の態様では、本洗浄方法は、本質的には、布を組成物と接触させた後に完了することは理解されるだろう。
食品
本発明の組成物は、食品の成分として用いられてもよい。本明細書で使用するとき、用語「食品」は、ヒト及び／又は動物の消費に適当である物質を意味する。
適当には、本明細書で使用するとき、用語「食品」は、消費が容易である形態の食品を意味してもよい。しかしながら、あるいは又は更に、本明細書で使用するとき、用語「食品」は、食品の調製において用いられる１つ以上の材料を意味してもよい。ほんの一例として、用語「食品」は、生地から作られる焼成食品、並びに前記焼成食品の製造において用いられる生地の両方を包含する。
食品は、使用及び／又は適用方法及び／又は摂取方法に応じ、溶液形態であっても、又は固形物であってもよい。
食品（例えば、機能食品）として、又はその製造において用いられるとき、本発明の組成物は、栄養的に許容される担体、栄養的に許容される希釈剤、栄養的に許容される賦形剤、栄養的に許容されるアジュバント、栄養的に活性な成分のうち１つ以上と組み合わせて用いられてもよい。
好ましい態様では、本発明は、次の、卵、卵ベースの製品（マヨネーズ、サラダドレッシング、ソース、アイスクリーム、卵パウダー、加工卵黄及びそれから作られた製品を含むがこれに限定されない）；パン、ケーキ、菓子生地製品、薄板状生地、液体バター、マフィン、ドーナツ、ビスケット、クラッカー及びケーキを含む、焼成食品；チョコレート、キャンディー、キャラメル、ハラワ、ガム（無糖及び加糖ガムを含む）、風船ガム、ソフト風船ガム、チューイングガム及びプリンを含む、菓子類；ソルベを含む冷凍製品、好ましくは、アイスクリーム及びアイスミルクを含む冷凍乳製品；チーズ、バター、ミルク、コーヒークリーム、ホイップクリーム、カスタードクリーム、ミルク飲料及びヨーグルトを含む、乳製品；ムース、ホイップベジタブルクリーム、加工肉製品を含む肉製品；食用油及び油脂、気泡及び無気泡ホイップ製品、水中油型エマルション、油中水型エマルション、マーガリン、ショートニング、及び低脂肪及び非常に低脂肪のスプレッドを含むスプレッド；ドレッシング、マヨネーズ、ディップ、クリームベースのソース、クリームベースのスープ、飲料、スパイスエマルション及びソースの１つ以上から選択される、上で定義された食品を提供する。
適当には、本発明による食品は、ケーキ、ペストリー、菓子類、チョコレート、ファッジを含む、「嗜好食品」であってもよい。
一態様では、本発明による食品は、生地製品又は焼成品、例えば、パン、揚げた製品、スナック、ケーキ、パイ、ブラウニー、クッキー、ヌードル、スナック類、例えば、クラッカー、グラハムクラッカー、プレッツェル及びポテトチップス、及びパスタであってもよい。
別の態様では、本発明による食品は、便利な食品、例えば、ある程度火が通っているか又はある程度調理済みの製品であってもよい。かかるある程度火が通っているか又はある程度調理済みの製品の例は、上述の生地及び焼成品のうちある程度加熱されたものを含む。
更なる態様では、本発明による食品は、植物由来の食品製品、例えば、小麦粉、プレミックス、油、油脂、ココアバター、コーヒー用クリーム、サラダドレッシング、マーガリン、スプレッド、ピーナッツバター、ショートニング、アイスクリーム、調理油であってもよい。
別の態様では、本発明による食品は、バター、ミルク、アイスクリーム、様々な形態（細切り、塊、スライス又は粉）のチーズ、例えば、ナチュラルチーズ、プロセスチーズ、イミテーションチーズ、クリームチーズ、アイスクリーム、冷菓、ヨーグルト、ヨーグルトドリンク、バター脂肪、無水乳脂肪、他の乳製品を含む、乳製品であってもよい。本発明による酵素は、乳製品中の脂肪の安定性を向上させ得る。
別の態様では、本発明による食品は、動物由来成分を含有する食品製品、例えば、加工肉製品、調理油、ショートニングであってもよい。
更なる態様では、本発明による食品は、飲料、果実、ミックスフルーツ、野菜、マリネード又はワインであってもよい。
一態様では、本発明による食品は、植物に由来する油（すなわち、植物油）、例えば、オリーブ油、ひまわり油、ピーナッツ油又は菜種油である。油は、錬り油であってもよい。
（実施例１）
以下の実験を行い、市販の加熱不活性化洗剤の存在下又は非存在下でヒドロホビンを加えることにより、リパーゼの洗浄性能が増強されるかどうかを試験した。
用いたリパーゼは、以下のとおりであった（それぞれ１回量で添加した）：
ＬＩＰＥＸ（商標）（ａｂＨ２３．１，真菌由来）（配列番号１１）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓより市販）、１．２５ｍｇ／ｍＬ
ＬＩＰＯＭＡＸ（商標）（ａｂＨ１５．２，ファミリーｌ−１）（配列番号１５）（Ｄａｎｉｓｃｏ Ａ／Ｓより市販）、６ｍｇ／ｍＬ
ＳｐｒＬｉｐ２（ａｂＨ１６，ファミリーｌ−７）（配列番号１７）、２５８μＬ／ｍＬ
ＴｆｕＬｉｐ２（ａｂＨ２５．１，ファミリーＩＩＩ）（配列番号１６）、３０．８μＬ／ｍＬ
ヒドロホビンＨＦＢＩＩ（配列番号２；真菌のトリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）に由来）をヒドロホビンとして用いた。ＨＦＢＩＩ ２６．６ｇ（１５０ｍｇ／ｇヒドロホビンタンパク質を含有する）を水１００ｍＬに溶解させ、４０ｇ／Ｌヒドロホビンタンパク質を含有している溶液を得た。溶液を必要に応じて希釈して、組成物の総重量の０．０１、０．０５、０．１、０．２５及び０．４０重量％となるようヒドロホビンの１回量を得た。
加熱不活性化液体洗剤（ＡＲＩＥＬ（商標）ｃｏｌｏｕｒ ｌｉｑｕｉｄ）及び加熱不活性化粉末洗剤（ＡＲＩＥＬ（商標）ｃｏｌｏｕｒ ｐｏｗｄｅｒ）を洗剤として用いた。これらはＰｒｏｃｔｅｒ ＆ Ｇａｍｂｌｅより市販されている。洗剤を必要に応じて希釈して、０、０．１、０．２５及び０．４ｇ／Ｌの１回量を得た。
洗剤を、次のとおり、加熱不活性化した：液体洗剤は９５℃のウォーターバスに２時間置き、一方、粉末洗剤は、０．１ｇ／ｍＬ水溶液としてホットプレート上で１時間沸騰させた。加熱処理により、市販の洗剤処方中の任意のタンパク質成分の酵素活性を、非酵素系洗剤成分の特性は保持したまま不活性化する。加熱後、洗剤を希釈し、リパーゼ酵素活性についてアッセイする。
汚れた布地に対するリパーゼ及びヒドロホビンの洗浄性能を、微小布片アッセイフォーマットで試験した。２４ウェルプレートフォーマット（Ｎｕｎｃ，Ｄｅｎｍａｒｋ）にセットした脂質を含有する合成汚れ（ＣＳ−６１布片：綿、着色剤を含むウシの脂肪、Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｔｅｓｔｍａｔｅｒｉａｌｓ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓから購入）を用いて、汚れの除去実験を行った。各アッセイウェルが、予め裁断したＣＳ−６１布片の１３ｍｍの小片を含有するように設定した。布片は、スキャナー（ＭｉＣｒｏｔｅｋ Ｓｃａｎ Ｍａｋｅｒ ９００）を用いて予め測定し、２４ウェルプレートに入れた。
液体洗剤の試験には２０ｍＭ ４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）（０．２Ｍ，ｐＨ ８．２）をバッファーとして用い、粉末洗剤の試験には２０ｍＭ Ｎ−シクロヘキシル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）（０．２Ｍ，ｐＨ １０．０）をバッファーとして用いた。いずれのバッファーも、２４００ｐｐｍに希釈した１５０００ｐｐｍの２／１Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋により、水硬度を２４フランス硬度（フランス硬度の１、すなわちＦＨ−１は、水１Ｌ当たり炭酸カルシウム１０ｍｇとして定義される）に調整した。
２４ウェルプレートを用い、各ウェルには溶液１ｍｌを含有させた。各行のヒドロホビン濃度は、次のとおりであった：０；組成物の総重量の０．０１重量％；０．０５重量％；０．１重量％；０．２５重量％；及び０．４重量％。各列の洗剤濃度は、次のとおりであった：０；０．１ｇ／Ｌ；０．２５ｇ／Ｌ；及び０．４ｇ／Ｌ。
上述の適当なバッファー９００μＬを、布片を含有させた２４ウェルプレートの各ウェルに加えた。ヒドロホビン溶液１００μＬを、各ウェルに加えた。各ウェルに体積１００μＬの酵素試料を加え反応を開始した。プレートを、３７℃で３０分間、２００ｒｐｍで振盪した。インキュベート後、反応バッファーを除去し、各ウェル内の布地を１ｍＬの蒸溜水で３回すすぎ洗いした。すすぎ水を取り除いた後、布片を５０℃で４時間乾燥させ、反射率を測定した。１回洗浄サイクル後に、洗浄性能を定量した。それぞれの布片に対し、洗浄後及び洗浄前のＲＧＢカラー測定値の差として、汚れの除去度を計算した。ＲＧＢ測定値はスキャナー（ＭｉＣｒｏｔｅｋ Ｓｃａｎ Ｍａｋｅｒ ９００）を用いて取得した。
洗浄した布の汚れ除去指数における差分（ΔＳＲＩ）を、洗浄していない布と比較して、式：
汚れ除去率（％）（ＲＧＢ）＝（汚れ除去ΔＥ（ＲＧＢ）／開始時の汚れΔＥ（ＲＧＢ））×１００％
（式中、
Figure 0006027092
ＲＧＢｒｅｆ値は、汚れのない綿（白）の値である）を用いて計算した。
結果を、以下のとおり、図１ａ〜５ｅに示す。
図１ａ〜１ｃ：脂質分解酵素なし（対照）
図２ａ〜２ｅ：脂質分解酵素ＬＩＰＥＸ（商標）（ａｂＨ２３．１）
図３ａ〜３ｅ：脂質分解酵素ＬＩＰＯＭＡＸ（商標）（ａｂＨ１５．２）
図４ａ〜４ｅ：脂質分解酵素ＳｐｒＬｉｐ２（ａｂＨ１６）
図５ａ〜５ｅ：脂質分解酵素ＴｆｕＬｉｐ２（ａｂＨ２５．１）
具体的には、図２ｅ、４ｅ及び５ｅは、洗剤の非存在下で、系中に存在させたリパーゼに対するヒドロホビンの効果を説明する。これらの図は、これらのリパーゼについて、少なくとも、個別に使用した場合に観察され得る相加効果より優れた相乗効果を観察することができることを示す。
加えて、図２ｂは、ヒドロホビン、リパーゼＬＩＰＥＸ（登録商標）及び洗剤ＡＲＩＥＬ（登録商標）Ｃｏｌｏｒ Ｌｉｑｕｉｄを組み合わせて用いた場合、洗剤濃度を増加させるにつれ、系の性能は、洗剤を使用しない場合と比較してより低濃度のヒドロホビン（０．４％ではなく０．０５％）でプラトーに達することを示す。更に、図５ｂは、ヒドロホビン、リパーゼＴｆｕＬｉｐ２及び洗剤ＡＲＩＥＬ（登録商標）Ｃｏｌｏｒ Ｌｉｑｕｉｄを組み合わせて用いると、洗剤濃度及びヒドロホビン濃度を増加させることにより、洗浄効果の改良を達成する（特に、０．４ｇ／Ｌ洗剤及び０．４％ヒドロホビンにより）ことができることを示している。
加えて、図２ｄは、ヒドロホビン、リパーゼＬＩＰＥＸ（登録商標）、及び洗剤ＡＲＩＥＬ（登録商標）Ｃｏｌｏｒ Ｐｏｗｄｅｒを組み合わせて用いた場合、パフォーマンスのパターンは、洗剤濃度をより低濃度にしても（系は０．０５％ヒドロホビンでプラトーに達する）影響を受けないことを示す。しかしながら、洗剤濃度が高くなるほど、より高いＳＲＩ値に達することができる（０．４ｇ／Ｌ洗剤で３０％）。更に、図５ｄは、ヒドロホビン、リパーゼＴｆｕＬｉｐ２及び洗剤ＡＲＩＥＬ（登録商標）Ｃｏｌｏｒ Ｐｏｗｄｅｒを組み合わせて用いた場合、系の全パフォーマンスは、系中の洗剤濃度を増加させると改善することを説明する。
最後に、図１ｂは、リパーゼの非存在下で、ヒドロホビン及び洗剤ＡＲＩＥＬ（登録商標）Ｃｏｌｏｒ Ｌｉｑｕｉｄを組み合わせて用いた場合、低濃度のヒドロホビン（０．０１〜０．１％）及び洗剤（０．２５ｇ／Ｌ未満）でわずかな相乗効果が生じることを示す。
実施例２−ストレプトマイセス・プリスチナエスピラリス（Streptomyces pristinaespiralis）ＡＴＣＣ ２５４８リパーゼ（ＳｐｒＬｉｐ２）のクローニング及び発現
ＳｐｒＬｉｐ２遺伝子を、ＧｅｎｅＲａｙ（Ｓｈａｎｇｈａｉ，Ｃｈｉｎａ）により合成した。ＮｈｅＩ／ＢａｍＨＩにより２カ所を切断し、ライゲーションし、発現プラスミドｐＫＢ１２８にＳｐｒＬｉｐ２合成遺伝子をクローニングした。プラスミドｐＫＢ１２８は、プラスミドｐＫＢ１０５の誘導体（米国公開公報第２００６／０１５４８４３号に記載）であり、Ａ４プロモーター−ＣｅｌＡシグナル配列の供給源である。プラスミドｐＫＢ１２８は、ＢａｍＨＩ認識部位の前にＮｓｉＩ−ＭｌｕＩ−ＨｐａＩ制限酵素認識部位（ａｔｇｃａｔａｃｇｃｇｔｇｔｔａａｃ；配列番号３０）を含有する。アスペルギルス・ニガー（A. niger）Ａ４プロモーター及びＣｅｌＡ切断シグナル配列は、ＳｐｒＬｉｐ２遺伝子配列（推定成熟タンパク質に対応する）の５’末端に存在させ、１１ＡＧ３転写終結配列は、ＳｐｒＬｉｐ２遺伝子配列の３’末端に融合させた。ｐＫＢ１２８を制限酵素ＮｈｅＩ及びＢａｍＨＩにより切断した後、同様に切断したＳｐｒＬｉｐ２合成遺伝子とライゲーションさせて、ｐＺＱ２０５発現ベクター（図３０）を構築し、続いて、エシェリキア・コリ（E. coli）細胞を形質転換させた。ＳｐｒＬｉｐ２遺伝子の正確な配列をＤＮＡ配列決定により確認した。
ｐＺＱ２０５のプラスミドＤＮＡにより、宿主ストレプトマイセス・リビダンス（Streptomyes lividans）ＴＫ２３プロトプロスト細胞（米国公開公報第２００６／０１５４８４３号に記載）を形質転換させた。３つの形質転換体を採取し、播種用振盪フラスコ（ジメチルスルホキシド中５０ｕｇ／ｍｌチオストレプトンを含有するＴＳＧ培地１５ｍｌ）に移し、２００ｒｐｍで振盪しながら、３０℃で２日間増殖させた。播種用振盪フラスコの２日目培養液３ｍｌを、タンパク質産生のため、ストレプトマイセス（Streptomyces）変法産生培地ＩＩ ３０ｍｌに移した。産生培地を、２００ｒｐｍで振盪しながら、３０℃で２日間増殖させた。タンパク質を細胞外培地に分泌させ、濾過した培地を用いて洗浄アッセイを行い、生化学的特性評価実験を行った。使用量は、Ｂｉｏｒａｄタンパク質アッセイ（５００−０００６ＥＤＵ）を用いたブラッドフォールド式のアッセイにより決定し、Ｂｉｏ−ＲａｄのＣｒｉｔｅｒｉｏｎ無染色系を用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥにより評価した純度について補正した、総タンパク質に基づくものであった。
実施例３−ＳｐｒＬｉｐ２の生化学的特徴
ＳｐｒＬｉｐ２のリパーゼ／エステラーゼ活性を、パラ−ニトロフェニルブチレートエステル（ｐＮＢ）及びパラ−ニトロフェニルパルミテート（ｐＮＰＰ）を基質として用いて試験した。各基質の２０ｍＭ原液（ジメチルスルホキシド（Ｐｉｅｒｃｅ，２０６８８，水含有量＜０．２％）に溶解したｐ−ニトロフェニルブチレート，ｐＮＢ，Ｓｉｇｍａ，ＣＡＳ ２６３５−８４−９，カタログ番号Ｎ９８７６）及びジメチルスルホキシドに溶解したｐ−ニトロフェニルパルミテート，ｐＮＰＰ；Ｓｉｇｍａ，ＣＡＳ １４９２−３０−４，カタログ番号Ｎ２７５２）を調製し、−８０℃で長期保存した。ＳｐｒＬｉｐ２発現細胞由来の濾過細胞上清を、９６ウェルマイクロタイタープレート中で、アッセイバッファー［２％ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）（Ｓｉｇｍａ）を含有する、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ ８．２）（０．７５ｍＭ ＣａＣｌ２及び０．２５ｍＭ ＭｇＣｌ２を含有）］により連続希釈し、２５℃で平衡化した。１：２０希釈した基質（アッセイバッファー中）１００μｌを、別のマイクロタイタープレートに加えた。プレートを、３００ｒｐｍで振盪しながら、２５℃で１０分間、平衡化した。基質を含有させたプレートに希釈プレート由来の酵素溶液１０μｌを加え、反応を開始させた。プレートを直ちに、２５℃で平衡化した動力学的に測定可能な分光光度計に移した。動力学的モードの吸光度変化を、５分間、４１０ｎｍで読み取った。バックグランド速度（酵素を含まない）を、試験試料の速度から引いた。試料濃度を次のとおり決定した：
試料濃度＝（未知速度×標準濃度）／標準速度
結果を図３２（ｐＮＢ加水分解）及び３３（ｐＮＰＰ加水分解）に示す（加水分解の相対速度）。
実施例４−ＳｐｒＬｉｐ２によるトリグリセリドの加水分解
このアッセイは、リパーゼによるトリグリセリド基質からの脂肪酸の遊離を測定するよう設計した。アッセイは、リパーゼをトリグリセリドエマルションとインキュベーションすることにより脂肪酸の遊離を生じさせ、これにより乳化基質の濁度を低下させる、加水分解反応からなる。アッセイに用いたトリグリセリド基質は、トリオクタン酸グリセリル（Ｓｉｇｍａ，ＣＡＳ ５３８−２３−８，カタログ番号Ｔ９１２６−１００ＭＬ）であった。アラビアゴム（Ｓｉｇｍａ，ＣＡＳ ９０００−０１−５，カタログ番号Ｇ９７５２；５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ ８．２）中１０ｍｇ／ｍｌアラビアゴム溶液）５０ｍｌ、又は洗剤溶液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ ８．２）中０．１％加熱不活性化Ｔｉｄｅ（登録商標）冷水用洗剤（Ｐｒｏｃｔｅｒ ＆ Ｇａｍｂｌｅ，Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ，ＯＨ，ＵＳＡ）（０．７５ｍＭ ＣａＣｌ２及び０．２５ｍＭ ＭｇＣｌ２を含有））５０ｍｌをトリグリセリド３７５μｌと混合することにより、乳化トリオクタン酸（０．７５％（ｖ／ｖ又はｗ／ｖ））を調製した。溶液を混合し、少なくとも２分間超音波処理して、安定なエマルションを調製した。乳化基質２００μｌを、９６ウェルマイクロタイタープレートに加えた。連続希釈酵素試料（ＳｐｒＬｉｐ２を発現する細胞由来の培養上清を濾過したもの）２０μｌを、基質を含有させたプレートに加えた。プレートシールでプレートを覆い、２０℃で２０分間インキュベーションした。インキュベーション後、製造元により示されるとおり、ＨＲ Ｓｅｒｉｅｓ ＮＥＦＡ−ＨＲ（２）ＮＥＦＡキット（Ｗａｋｏ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ ＧｍｂＨ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、溶液中の脂肪酸の存在を５５０ｎｍでの吸光度の増加として決定した。結果を、図３４（洗剤なし）及び３５（洗剤あり）に示す。
実施例５−ＳｐｒＬｉｐ２の洗浄性能
ＳｐｒＬｉｐ２の洗浄性能を、市販の加熱不活性化洗剤の存在下又は非存在下で試験した。酵素２５８μｌを蒸留水１ｍｌに希釈することにより、リパーゼの原液を調製した。洗剤は、Ｐｒｏｃｔｅｒ ＆ Ｇａｍｂｌｅ（Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ，ＯＨ，ＵＳＡ）の加熱不活性化液体洗剤（ＡＲＩＥＬ（商標）ｃｏｌｏｒ ｌｉｑｕｉｄ）及び加熱不活性化粉洗剤（ＡＲＩＥＬ（商標）ｃｏｌｏｒ ｐｏｗｄｅｒ）を用いた。
２４ウェルプレートフォーマット（Ｎｕｎｃ，Ｄｅｎｍａｒｋ）にセットした脂質を含有する合成汚れ（ＣＳ−６１布片：綿、着色剤を含むウシの脂肪、Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｔｅｓｔｍａｔｅｒｉａｌｓ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓから購入）を用いて、汚れの除去実験を行った。各アッセイウェルが、予め裁断したＣＳ−６１布片の１３ｍｍの小片を含有するように設定した。布片は、スキャナー（ＭｉＣｒｏｔｅｋ Ｓｃａｎ Ｍａｋｅｒ ９００）を用いて予め測定し、２４ウェルプレートに入れた。液体洗剤の試験には２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ ８．２）、及び粉末洗剤の試験用には２０ｍＭ ＣＡＰＳ（ｐＨ １０．０）を用いた。いずれのバッファーも、２４００ｐｐｍに希釈した（希釈係数６．２５）１５０００ｐｐｍの２／１ Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋により、水硬度を２４フランス硬度に調整した。洗剤を、０；０．１ｇ／Ｌ；０．２５ｇ／Ｌ；及び０．４ｇ／Ｌの濃度で試験した。上述の適当なバッファー１ｍＬを、布片を含有させた２４ウェルプレートの各ウェルに加えた。各ウェルに体積１００μＬの酵素試料を加え反応を開始した。プレートを、３７℃で３０分間、２００ｒｐｍで振盪した。インキュベート後、反応バッファーを除去し、各ウェル内の布地を１ｍＬの蒸溜水で３回すすぎ洗いした。洗浄した布片を５０℃で４時間乾燥させ、それらの反射率を測定した。１回洗浄サイクル後に、洗浄性能を定量した。それぞれの布片に対し、洗浄後及び洗浄前のＲＧＢカラー測定値の差として、汚れの除去度を計算した。ＲＧＢ測定値はスキャナー（ＭｉＣｒｏｔｅｋ Ｓｃａｎ Ｍａｋｅｒ ９００）を用いて取得した。洗浄した布の汚れ除去指数（ＳＲＩ）を、洗浄していない布と比較して、式：
％汚れ除去（ＲＧＢ）＝（汚れ除去ΔＥ（ＲＧＢ）／開始時の汚れΔＥ（ＲＧＢ））×１００％
（式中、
Figure 0006027092
ＲＧＢｒｅｆは、汚れのない綿（白）の値である）を用いて計算した。
結果を図３６に示す。
本明細書において言及される全刊行物は、引用により本明細書に取り込まれる。本発明に記載の方法及び系の各種改変及び変更は、当業者にとって、本発明の範囲及び趣旨を逸脱せずとも明らかなものであろう。本発明は、具体的な好ましい実施態様と関連して記載されているが、請求の範囲に記載の発明が、かかる具体的な実施態様により過度に限定されないことは理解されるべきである。実際、本発明の実施に関し、化学、生化学、及びバイオテクノロジー又は関連分野の当業者にとって明らかである各種改変は、添付の請求の範囲内であることが意図されている。

Claims (14)

  1. （ａ）ＧＸ脂質分解酵素（式中、Ｇはグリシンであり、Ｘはオキシアニオンホールを形成するアミノ酸残基である）；及び
    （ｂ）一般式（Ｉ）を有するヒドロホビン：
    （Ｙ１）ｎ−Ｂ１−（Ｘ１）ａ−Ｂ２−（Ｘ２）ｂ−Ｂ３−（Ｘ３）ｃ−Ｂ４−（Ｘ４）ｄ−Ｂ５−（Ｘ５）ｅ−Ｂ６−（Ｘ６）ｆ−Ｂ７−（Ｘ７）ｇ−Ｂ８−（Ｙ２）ｍ （Ｉ）
    （式中、
    ｍ及びｎは、独立して、０であり；
    Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５、Ｂ６、Ｂ７及びＢ８は、それぞれ独立してＣｙｓ、Ｌｅｕ、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｍｅｔ又はＧｌｙから選択されるアミノ酸であり、残基Ｂ１〜Ｂ８のうち少なくとも６つはＣｙｓであり；
    Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、Ｙ１及びＹ２は、独立して任意のアミノ酸を表し；
    ａは、１〜５０であり；
    ｂは、０〜５であり；
    ｃは、１〜１００であり；
    ｄは、１〜１００であり；
    ｅは、１〜５０であり；
    ｆは、０〜５０であり；及び
    ｇは、１〜１００である）
    を含むとともに、前記ＧＸ脂質分解酵素が、ａｂＨ２３、ａｂＨ２５、ａｂＨ１５及びａｂＨ１６からなる群から選択されるα／β加水分解酵素スーパーファミリーに属するものである、組成物。
  2. （ｃ）洗剤
    を更に含む、請求項１に記載の組成物。
  3. ＧＸ脂質分解酵素が、ａｂＨ２３．０１、ａｂＨ ２５．０１、ａｂＨ１６．０１及びａｂＨ１５．０２からなる群から選択されるα／β加水分解酵素スーパーファミリーに属する、請求項１又は２に記載の組成物。
  4. オキシアニオンホールを形成する残基Ｘが、Ｍ、Ｑ、Ｆ、Ｓ、Ｔ、Ａ、Ｌ及びＩからなる群から選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
  5. ＧＸ脂質分解酵素が、糸状菌に由来する又は由来し得る、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
  6. 脂質分解酵素が、組成物の総重量の０．００１〜２０重量ｐｐｍの濃度で存在する、請求項１〜５のいずれかに記載の組成物。
  7. ヒドロホビンが、クラドスポリウム（Cladosporium）、オフィストマ（Ophistoma）、クリホネクトリア（Cryphonectria）、トリコデルマ（Trichoderma）、ジベレラ（Gibberella）、ニューロスポラ（Neurospora）、マガナポルト（Maganaporthe）、ヒポクレア（Hypocrea）、キサントリア（Xanthoria）、エメリセラ（Emericella）、アスペルギルス、パラコッシオイデス（Paracoccioides）、メタリジウム（Metarhizium）、プロイロツス（Pleurotus）、コプリナス（Coprinus）、ジコチオネマ（Dicotyonema）、フラムリナ（Flammulina）、シゾフィラム（Schizophyllum）、アガリクス（Agaricus）、ピソリツス（Pisolithus）、トリコロマ（Tricholoma）、フォリオタ（Pholioka）、タラロミセス（Talaromyces）及びアグロサイブ（Agrocybe）からなる群から選択される属の真菌に由来する又は由来し得る、請求項１に記載の組成物。
  8. ヒドロホビンが、クラスＩＩのヒドロホビンである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物。
  9. ヒドロホビンが、組成物の総重量の０．００１〜５重量％の濃度で存在する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組成物。
  10. 洗剤が、０．００１〜５ｇ／Ｌの濃度で存在する、請求項２〜９のいずれか一項に記載の組成物。
  11. プロテアーゼ、アミラーゼ、グルコアミラーゼ、マルトース生成アミラーゼ、非マルトース生成アミラーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、カルボヒドラーゼ、セルラーゼ、ペクチナーゼ、マンナナーゼ、アラビナーゼ、ガラクタナーゼ、キシラナーゼ、オキシダーゼ、ラッカーゼ及びペルオキシダーゼからなる群から選択される１種以上の酵素を更に含有する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組成物。
  12. 非イオン性（半極性を含む）、アニオン性、カチオン性及び双性イオン性からなる群から選択される１種以上の界面活性剤を更に含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組成物。
  13. 粉末状又は液体状である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の組成物。
  14. 表面を請求項１〜１３のいずれか一項に記載の組成物と接触させることにより、表面から脂質汚れを取り除く方法。
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