CN111278971A - Gh9内切葡聚糖酶变体以及编码它们的多核苷酸 - Google Patents

Gh9内切葡聚糖酶变体以及编码它们的多核苷酸 Download PDF

Info

Publication number
CN111278971A
CN111278971A CN201880054037.9A CN201880054037A CN111278971A CN 111278971 A CN111278971 A CN 111278971A CN 201880054037 A CN201880054037 A CN 201880054037A CN 111278971 A CN111278971 A CN 111278971A
Authority
CN
China
Prior art keywords
seq
region
variant
amino acids
endoglucanase
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201880054037.9A
Other languages
English (en)
Inventor
R.N.蒙拉德
V.P.拉奥
R.K.赛内森
S.达拉尔
S.V.梅帕达姆
A.斯文德森
M.L.D.奥弗加德
L.安德森
G.H.门德斯
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Novozymes AS
Original Assignee
Novozymes AS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Novozymes AS filed Critical Novozymes AS
Publication of CN111278971A publication Critical patent/CN111278971A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2434—Glucanases acting on beta-1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2437—Cellulases (3.2.1.4; 3.2.1.74; 3.2.1.91; 3.2.1.150)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01004—Cellulase (3.2.1.4), i.e. endo-1,4-beta-glucanase

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Detergent Compositions (AREA)

Abstract

本发明涉及内切葡聚糖酶变体以及用于获得内切葡聚糖酶变体的方法。本发明还涉及编码所述变体的多核苷酸；包含所述多核苷酸的核酸构建体、载体、和宿主细胞；以及使用是变体的方法。

Description

GH9内切葡聚糖酶变体以及编码它们的多核苷酸
序列表的引用
本申请含有处于计算机可读形式的序列表，将其通过引用并入本文。
发明背景
技术领域
本发明涉及相对于亲本GH9内切葡聚糖酶在一种或多种特性中表现出改变的新型GH9内切葡聚糖酶变体，这些特性包括：洗涤剂稳定性(例如，在洗涤剂组合物中的改善的稳定性，例如，在螯合剂(例如，EDTA或柠檬酸盐)存在下)和/或储存稳定性(例如，在洗涤剂组合物中的改善的储存稳定性，例如，在螯合剂(例如，EDTA或柠檬酸盐)存在下)。本发明进一步涉及对用黄原胶裂解酶预处理的黄原胶具有活性的新型GH9内切葡聚糖酶变体。本发明还涉及包含编码本发明的变体的这些多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞，连同用于产生和使用本发明的这些变体的方法。本发明的变体适合用于在清洁过程和洗涤剂组合物中使用，如洗衣组合物和餐具清洗组合物，包括手洗和自动餐具清洗组合物。本发明进一步涉及包括用于在洗涤剂以及用于在钻探和石油工业中使用的本发明的变体和/或黄原胶裂解酶的组合物。
背景技术
黄原胶是一种来源于野油菜黄单胞菌的细菌包被的多糖。黄原胶通过由野油菜黄单胞菌细菌发酵葡萄糖、蔗糖或乳糖而产生。在发酵周期后，用异丙醇将该多糖从生长培养基中沉淀，干燥，并磨成细粉。稍后，将其添加至液体介质中，以形成胶质。黄原胶是由不同糖组成的天然多糖，这些不同糖通过若干不同键连接，例如β-D-甘露糖基-β-D-1,4-葡萄糖醛酸基键和β-D-葡糖基-β-D-1,4-葡糖基键。黄原胶在水中至少部分地可溶并且形成高粘稠溶液或凝胶。黄原胶的完全酶降解需要若干酶活性，包括黄原胶裂解酶活性和内切-β-1,4-葡聚糖酶活性。黄原胶裂解酶是切割黄原胶的β-D-甘露糖基-β-D-1,4-葡萄糖醛酸基键的酶并且已经被描述于文献中。黄原胶降解酶在本领域中是已知的，例如两种已经分离自溶藻弧菌类芽孢杆菌XL-1的黄原胶裂解酶(例如，Ruijssenaars等人(1999)‘A pyruvatedmannose-specific xanthan lyase involved in xanthan degradation byPaenibacillus alginolyticus XL-1[在由溶藻弧菌类芽孢杆菌XL-1降解黄原胶中涉及的一种丙酮酸甘露糖特异性黄原胶裂解酶]’，Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物]65(6):2446-2452，和Ruijssenaars等人(2000)‘A novel gene encoding xanthanlyase of Paenibacillus alginolyticus strain XL-1[一种编码溶藻弧菌类芽孢杆菌菌株XL-1的黄原胶降解酶的新颖基因]’，Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物]66(9):3945-3950)。糖苷水解酶是催化糖基键水解以释放更小的糖的酶。存在超过100种已经被分类的糖苷水解酶，参见Henrissat等人(1991)‘A classification of glycosylhydrolases based on amino-acid sequence similarities[基于氨基酸序列相似性的糖基水解酶的分类]’，J.Biochem.[生物化学杂志]280:309-316和Uniprot网站，www.cazy.org。糖苷水解酶家族9(GH9)由超过70种不同的酶组成，这些酶大部分是内切-葡聚糖酶(EC3.2.1.4)、纤维二糖水解酶(EC 3.2.1.91)、β-葡糖苷酶(EC 3.2.1.21)和外切-β-葡糖胺酶(EC 3.2.1.165)。近年来，黄原胶已经被用作许多消费品中的成分，包括食品(例如，在沙拉酱(salad dressing)和乳制品中作为增稠剂)和化妆品(例如，在牙膏和化妆品、霜剂和洗液中作为稳定剂和增稠剂，以阻止成分分离并提供产品的适中质地。另外，已经发现了黄原胶在石油工业中作为添加剂以调节钻井液的黏度的用途等。黄原胶的广泛使用已经使得希望降解包含黄原胶的溶液、凝胶或混合物从而允许更简单地去除副产品。用于降解黄原胶的内切葡聚糖酶和黄原胶裂解酶以及此类酶用于清洁目的(如去除包含污渍的黄原胶)以及在钻探和石油工业中的用途是本领域已知的，例如WO 2013167581 A1。
发现具有SEQ ID NO:2的已知黄原胶内切葡聚糖酶对具有螯合剂的洗涤剂的存在是敏感的。为了改善此类酶的适用性和/或成本和/或性能，对具有改变的特性的变体进行着持续搜寻，如增加的稳定性，例如在洗涤剂组合物中的改善的稳定性，例如在螯合剂存在下，例如EDTA或柠檬酸盐等。然而，大酶的诱变，随后突变体文库的纯化和功能分析可能是非常昂贵且费力的。
发明内容
由于具有SEQ ID NO:2的已知黄原胶内切葡聚糖酶是大酶(>1000个残基)，因此随机靶向其特性以改善例如洗涤剂组合物中的稳定性，例如在螯合剂存在下，是困难且昂贵的。
在一些方面，本发明鉴定了具有SEQ ID NO:2的已知黄原胶内切葡聚糖酶的蛋白质序列/结构中的螯合剂诱导的不稳定区域，这些区域在当该分子在具有EDTA的缓冲液中孵育时受到影响，并且因此，提供了关于何处使内切葡聚糖酶突变以稳定在洗涤剂中的分子的重要指导，所述洗涤剂例如包含螯合剂的洗涤剂组合物。
在一些方面，本发明涉及一种内切葡聚糖酶变体，该变体在选自下组的螯合剂诱导的不稳定区域中的一个或多个位置处包含改变(例如，取代、缺失或插入)，该组由以下组成：对应于SEQ ID NO:2的氨基酸1至94的区域10、对应于SEQ ID NO:2的氨基酸106至114的区域11、对应于SEQ ID NO:2的氨基酸139至209的区域12、对应于SEQ ID NO:2的氨基酸252至266的区域13、对应于SEQ ID NO:2的氨基酸302至338的区域14、对应于SEQ ID NO:2的氨基酸362至546的区域15、对应于SEQ ID NO:2的氨基酸596至611的区域16、对应于SEQ IDNO:2的氨基酸661至805的区域17、对应于SEQ ID NO:2的氨基酸829至838的区域18、和对应于SEQ ID NO:2的氨基酸1043至1055的区域19。
在一些方面，本发明涉及一种内切葡聚糖酶变体，该变体在选自下组的区域中的一个或多个位置处包含改变(例如，取代、缺失或插入)，该组由以下组成：对应于SEQ IDNO:2的氨基酸1至94的区域10、对应于SEQ ID NO:2的氨基酸106至114的区域11、对应于SEQID NO:2的氨基酸139至209的区域12、对应于SEQ ID NO:2的氨基酸252至266的区域13、对应于SEQ ID NO:2的氨基酸302至338的区域14、对应于SEQ ID NO:2的氨基酸362至546的区域15、对应于SEQ ID NO:2的氨基酸596至611的区域16、对应于SEQ ID NO:2的氨基酸661至805的区域17、对应于SEQ ID NO:2的氨基酸829至838的区域18、和对应于SEQ ID NO:2的氨基酸1043至1055的区域19，其中所述变体与SEQ ID NO:2具有至少60％且小于100％的序列同一性；优选地所述内切葡聚糖酶变体对用黄原胶裂解酶预处理的黄原胶具有活性。
在一些方面，本发明涉及具有以下特征中的一个或多个的亲本内切葡聚糖酶(例如，SEQ ID NO:2)的螯合剂诱导的不稳定区域：在螯合剂存在下，该区域的构象稳定性低于其相邻区域中的一个或多个或全部；和/或在螯合剂存在下，该区域比其相邻区域中的一个或多个或全部更多地暴露于所述螯合剂；和/或在螯合剂存在下，该区域比其相邻区域中的一个或多个或全部更容易接近所述螯合剂；和/或在螯合剂存在下，该区域比其相邻区域中的一个或多个或全部更具构象动态；和/或在螯合剂存在下，该区域比其相邻区域中的一个或多个或全部更容易接受氘掺入。
在一些方面，本发明涉及一种内切葡聚糖酶变体，该变体与SEQ ID NO:2具有至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列同一性。
在一些方面，本发明涉及一种内切葡聚糖酶变体，该变体在选自下组的区域中的一个或多个位置处包含改变(例如，取代、缺失或插入)，该组由以下组成：
i)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸1至94的区域10，例如，在选自下组的一个或多个位置处的所述改变，该组由以下组成：位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94，其中所述位置对应于SEQ ID NO:2的氨基酸位置(例如，使用SEQ ID NO:2的编号)，
ii)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸106至114的区域11，例如，在选自下组的一个或多个位置处的所述改变，该组由以下组成：位置107、108、109、110、111、112、113、114，其中所述位置对应于SEQ ID NO:2的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO:2的编号)，
iii)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸139至209的区域12，例如，在选自下组的一个或多个位置处的所述改变，该组由以下组成：位置139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209，其中所述位置对应于SEQ ID NO:2的氨基酸位置(例如，使用SEQ IDNO:2的编号)，
iv)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸252至266的区域13，例如，在选自下组的一个或多个位置处的所述改变，该组由以下组成：位置252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266，其中所述位置对应于SEQ ID NO:2的氨基酸位置(例如使用SEQID NO:2的编号)，
v)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸302至338的区域14，例如，在选自下组的一个或多个位置处的所述改变，该组由以下组成：位置302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338，其中所述位置对应于SEQ ID NO:2的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO:2的编号)，
vi)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸362至546的区域15，例如，在选自下组的一个或多个位置处的所述改变，该组由以下组成：位置362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500、501、502、503、504、505、506、507、508、509、510、511、512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、535、536、537、538、539、540、541、542、543、544、545、546，其中所述位置对应于SEQ ID NO:2的氨基酸位置(例如使用SEQ IDNO:2的编号)，
vii)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸596至611的区域16，例如，在选自下组的一个或多个位置处的所述改变，该组由以下组成：位置596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611，其中所述位置对应于SEQ ID NO:2的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO:2的编号)，
viii)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸661至805的区域17，例如，在选自下组的一个或多个位置处的所述改变，该组由以下组成：位置661、662、663、664、665、666、667、668、669、670、671、672、673、674、675、676、677、678、679、680、681、682、683、684、685、686、687、688、689、690、691、692、693、694、695、696、697、698、699、700、701、702、703、704、705、706、707、708、709、710、711、712、713、714、715、716、717、718、719、720、721、722、723、724、725、726、727、728、729、730、731、732、733、734、735、736、737、738、739、740、741、742、743、744、745、746、747、748、749、750、751、752、753、754、755、756、757、758、759、760、761、762、763、764、765、766、767、768、769、770、771、772、773、774、775、776、777、778、779、780、781、782、783、784、785、786、787、788、789、790、791、792、793、794、795、796、797、798、799、800、801、802、803、804、805，其中所述位置对应于SEQ ID NO:2的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO:2的编号)，
ix)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸829至838至1042的区域18，例如，在选自下组的一个或多个位置处的所述改变，该组由以下组成：位置829、830、831、832、833、834、835、836、837、838，其中所述位置对应于SEQ ID NO:2的氨基酸位置(例如，使用SEQ ID NO:2的编号)，
x)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸1043至1055的区19，例如，在选自下组的一个或多个位置处的所述改变，该组由以下组成：位置1043、1044、1045、1046、1047、1048、1049、1050、1051、1052、1053、1054、1055，其中所述位置对应于SEQ ID NO:2的氨基酸位置(例如，使用SEQ ID NO:2的编号)。
在一些方面，本发明涉及一种内切葡聚糖酶变体，该变体在以下区域中的一个或多个位置处包含改变(例如，取代、缺失或插入)：
a)选自下组的一个或多个区域，该组由以下组成：
i)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸1至94的区域10，例如，在选自下组的一个或多个位置处的所述改变，该组由以下组成：位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94，其中所述位置对应于SEQ ID NO:2的氨基酸位置(例如，使用SEQ ID NO:2的编号)，
ii)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸106至114的区域11，例如，在选自下组的一个或多个位置处的所述改变，该组由以下组成：位置107、108、109、110、111、112、113、114，其中所述位置对应于SEQ ID NO:2的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO:2的编号)，
iii)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸139至209的区域12，例如，在选自下组的一个或多个位置处的所述改变，该组由以下组成：位置139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209，其中所述位置对应于SEQ ID NO:2的氨基酸位置(例如，使用SEQ IDNO:2的编号)，
iv)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸252至266的区域13，例如，在选自下组的一个或多个位置处的所述改变，该组由以下组成：位置252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266，其中所述位置对应于SEQ ID NO:2的氨基酸位置(例如使用SEQID NO:2的编号)，
v)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸302至338的区域14，例如，在选自下组的一个或多个位置处的所述改变，该组由以下组成：位置302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338，其中所述位置对应于SEQ ID NO:2的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO:2的编号)，
vi)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸362至546的区域15，例如，在选自下组的一个或多个位置处的所述改变，该组由以下组成：位置362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500、501、502、503、504、505、506、507、508、509、510、511、512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、535、536、537、538、539、540、541、542、543、544、545、546，其中所述位置对应于SEQ ID NO:2的氨基酸位置(例如使用SEQ IDNO:2的编号)，
vii)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸596至611的区域16，例如，在选自下组的一个或多个位置处的所述改变，该组由以下组成：位置596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611，其中所述位置对应于SEQ ID NO:2的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO:2的编号)，
viii)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸661至805的区域17，例如，在选自下组的一个或多个位置处的所述改变，该组由以下组成：位置661、662、663、664、665、666、667、668、669、670、671、672、673、674、675、676、677、678、679、680、681、682、683、684、685、686、687、688、689、690、691、692、693、694、695、696、697、698、699、700、701、702、703、704、705、706、707、708、709、710、711、712、713、714、715、716、717、718、719、720、721、722、723、724、725、726、727、728、729、730、731、732、733、734、735、736、737、738、739、740、741、742、743、744、745、746、747、748、749、750、751、752、753、754、755、756、757、758、759、760、761、762、763、764、765、766、767、768、769、770、771、772、773、774、775、776、777、778、779、780、781、782、783、784、785、786、787、788、789、790、791、792、793、794、795、796、797、798、799、800、801、802、803、804、805，其中所述位置对应于SEQ ID NO:2的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO:2的编号)，
ix)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸829至838至1042的区域18，例如，在选自下组的一个或多个位置处的所述改变，该组由以下组成：位置829、830、831、832、833、834、835、836、837、838，其中所述位置对应于SEQ ID NO:2的氨基酸位置(例如，使用SEQ ID NO:2的编号)，
x)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸1043至1055的区19，例如，在选自下组的一个或多个位置处的所述改变，该组由以下组成：位置1043、1044、1045、1046、1047、1048、1049、1050、1051、1052、1053、1054、1055，其中所述位置对应于SEQ ID NO:2的氨基酸位置(例如，使用SEQ ID NO:2的编号)。
在一些方面，本发明涉及一种内切葡聚糖酶变体，该变体在选自下组的一个或多个位置处具有改变(例如，取代、缺失或插入)，该组由以下组成：位置SEQ ID NO:2的17、20、51、53、55、56、60、63、79、87、186、192、302、311、313、387、388、390、403、408、410、416、448、451、471、472、476、489、507、512、515、538、598、599、602、603、605、609、676、688、690、694、697、698、699、711、719、754、756、760、781、786、797、833、834、835、和1048，其中根据SEQ IDNO:2进行编号。
在一些方面，本发明涉及一种内切葡聚糖酶变体，该变体在选自下组的一个或多个位置处具有改变(例如，取代、缺失或插入)，该组由以下组成：S17A、F20P、F20N、F20G、F20Y、K51Q、K51H、E53P、E53G、Y55M、V56M、Y60F、S63F、Y579W、T87R、A186P、K192N、I302D、I302H、I302V、I302M、H311N、S313D、387T、K388R、K390Q、I403Y、E408D、E408S、E408P、E408A、E408G、E408N、P410G、Q416S、Q416D、A448E、A448W、A448S、K451S、G471S、S472Y、D476R、Q489P、K507R、K512P、S515V、S538C、S598Q、A599S、I602T、I602D、V603P、S605T、G609E、D676H、A688G、Y690F、T694A、T697G、R698W、T699A、T711V、T711Y、W719R、K754R、V756H、V756Y、S760G、T781M、N786K、T797S、A824D、N833D、Q834E、S835D、和F1048W，其中根据SEQ IDNO:2进行编号。
在一个实施例中，本发明涉及一种内切葡聚糖酶变体，该变体包含选自下组的在一个或多个位置处的改变(例如，取代、缺失或插入)，该组由在以下位置处的改变组成：17、20、302、311、313、408、476、602、688、697、和719，其中根据SEQ ID NO:2进行编号。
在一个优选的实施例中，本发明的内切葡聚糖酶变体包含选自下组的在一个或多个位置处的改变，该组由在以下位置处的改变组成：S17A、F20P、I302D、H311N、S313D、E408D、D476R、I602T、A688G、T697G、和W719R，其中根据SEQ ID NO:2进行编号。
在一个优选的实施例中，本发明的内切葡聚糖酶变体进一步包含选自下组的在一个或多个位置处的改变，该组由在以下位置处的改变组成：216、283、346、559、564、579、636、638、651,824、848、869、880、881、883、887、892、905、906、912、921、928、934、937、948、956、999、和1037。
在一个优选的实施例中，本发明的内切葡聚糖酶变体进一步包含选自下组的在一个或多个位置处的改变(例如，取代)，该组由以下组成：N216D、N216Q、A283D、A346D、A559P、A559N、A564E、Y579W、S636K、S636N、F638N、A651P、A824D、N848D、A869V、R880K、V881T、V881Q、T883R、T887K、T892P、N905D、F906A、A912V、K921R、S928D、Y934G、A937E、K948R、Q956Y、T999R、和A1037E。
在一个优选的实施例中，本发明的内切葡聚糖酶变体包含一个或多个以下的取代组：
F20Y+A448S+T781M
E408D+K451S
E408D+A448E
E408D
Y579W+E408D
在一个优选的实施例中，本发明的内切葡聚糖酶变体包含一个或多个以下的取代组：
Figure BDA0002387863890000111
Figure BDA0002387863890000121
在一个具体的方面，本发明的内切葡聚糖酶变体是在区域10、11、12、13、14、15、16、17、18、和19外的位置不包含任何氨基酸改变的一种内切葡聚糖酶变体。在这一方面，因此，内切葡聚糖酶变体在选自下组的区域中不包含任何改变(例如，取代、缺失或插入)，该组由以下组成：对应于SEQ ID NO:2的氨基酸95至105的区域1、对应于SEQ ID NO:2的氨基酸115至138的区域2、对应于SEQ ID NO:2的氨基酸210至251的区域3、对应于SEQ ID NO:2的氨基酸267至301的区域4、对应于SEQ ID NO:2的氨基酸339至361的区域5、对应于SEQ IDNO:2的氨基酸547至595的区域6、对应于SEQ ID NO:2的氨基酸612至660的区域7、对应于SEQ ID NO:2的氨基酸806至828的区域8、和对应于SEQ ID NO:2的氨基酸839至1045的区域9。
在一些方面，本发明涉及一种对用黄原胶裂解酶预处理的黄原胶具有活性的内切葡聚糖酶变体；优选地，所述活性包含内切葡聚糖酶EC 3.2.1.4活性，进一步优选地所述活性是内切葡聚糖酶EC 3.2.1.4活性。
在一些方面，本发明涉及一种内切葡聚糖酶变体，该变体相比亲本内切葡聚糖酶(例如与SEQ ID NO:2相比)具有在洗涤剂组合物中的改善的稳定性。
在一些方面，本发明涉及一种具有>1.0的半衰期改善因子(HIF)的内切葡聚糖酶变体。
在一些方面，本发明涉及一种包含本发明的至少一种内切葡聚糖酶变体的组合物。在另一方面，本发明涉及一种组合物，该组合物包含一种根据本发明的对用黄原胶裂解酶预处理的黄原胶具有活性的分离的GH9内切葡聚糖酶变体。在一个另外的方面，该组合物进一步包含一种具有黄原胶裂解酶活性的分离的多肽。
在一些方面，本发明涉及一种包含本发明的至少一种内切葡聚糖酶变体的组合物，其中所述组合物是洗涤剂组合物。在另一方面，本发明的洗涤剂组合物包含一种或多种用于降解黄原胶的洗涤剂组分。
在一些方面，本发明涉及本发明的组合物或本发明的内切葡聚糖酶变体的用途，其中所述用途选自下组，该组由以下组成：用于降解黄原胶，用于清洁过程，如衣物或硬表面清洁如餐具洗涤，以及用于控制钻井液的黏度。
在一些方面，本发明进一步涉及本发明的组合物用于降解黄原胶，用于洗涤或清洁纺织品和/或硬表面(如餐具洗涤)的用途，其中该组合物具有酶洗涤益处，或用于控制钻井液的黏度的益处。
在一些方面，本发明还涉及使用本发明的变体和组合物降解黄原胶的方法，其中黄原胶位于硬表面或纺织品的表面上，其中黄原胶用于压裂由钻井孔造成的地下地层，或其中黄原胶是一种钻孔滤饼中的组分。
在一些方面，本发明涉及一种用于获得(或产生)内切葡聚糖酶变体的方法，该方法包括向亲本内切葡聚糖酶中(例如，具有SEQ ID NO:2)引入在选自下组的螯合剂诱导的不稳定区域中的一个或多个位置处的改变(例如，取代、缺失或插入)，该组由以下组成：对应于SEQ ID NO:2的氨基酸1至94的区域10、对应于SEQ ID NO:2的氨基酸106至114的区域11、对应于SEQ ID NO:2的氨基酸139至209的区域12、对应于SEQ ID NO:2的氨基酸252至266的区域13、对应于SEQ ID NO:2的氨基酸302至338的区域14、对应于SEQ ID NO:2的氨基酸362至546的区域15、对应于SEQ ID NO:2的氨基酸596至611的区域16、对应于SEQ ID NO:2的氨基酸661至805的区域17、对应于SEQ ID NO:2的氨基酸829至838的区域18、和对应于SEQ ID NO:2的氨基酸1043至1055的区域19，其中所述变体与SEQ ID NO:2具有至少60％且小于100％的序列同一性，以及回收所述变体。
在一些方面，本发明涉及一种用于获得或产生内切葡聚糖酶变体的方法，该方法包括向亲本内切葡聚糖酶中(例如，具有SEQ ID NO:2或其他亲本内切葡聚糖酶)引入在以下区域中的一个或多个位置处的改变(例如，取代、缺失或插入)：
a)选自下组的区域，该组由以下组成：
i)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸1至94的区域10，例如，在选自下组的一个或多个位置处的所述改变，该组由以下组成：位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94，其中所述位置对应于SEQ ID NO:2的氨基酸位置(例如，使用SEQ ID NO:2的编号)，
ii)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸106至114的区域11，例如，在选自下组的一个或多个位置处的所述改变，该组由以下组成：位置107、108、109、110、111、112、113、114，其中所述位置对应于SEQ ID NO:2的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO:2的编号)，
iii)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸139至209的区域12，例如，在选自下组的一个或多个位置处的所述改变，该组由以下组成：位置139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209，其中所述位置对应于SEQ ID NO:2的氨基酸位置(例如，使用SEQ IDNO:2的编号)，
iv)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸252至266的区域13，例如，在选自下组的一个或多个位置处的所述改变，该组由以下组成：位置252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266，其中所述位置对应于SEQ ID NO:2的氨基酸位置(例如使用SEQID NO:2的编号)，
v)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸302至338的区域14，例如，在选自下组的一个或多个位置处的所述改变，该组由以下组成：位置302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338，其中所述位置对应于SEQ ID NO:2的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO:2的编号)，
vi)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸362至546的区域15，例如，在选自下组的一个或多个位置处的所述改变，该组由以下组成：位置362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500、501、502、503、504、505、506、507、508、509、510、511、512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、535、536、537、538、539、540、541、542、543、544、545、546，其中所述位置对应于SEQ ID NO:2的氨基酸位置(例如使用SEQ IDNO:2的编号)，
vii)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸596至611的区域16，例如，在选自下组的一个或多个位置处的所述改变，该组由以下组成：位置596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611，其中所述位置对应于SEQ ID NO:2的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO:2的编号)，
viii)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸661至805的区域17，例如，在选自下组的一个或多个位置处的所述改变，该组由以下组成：位置661、662、663、664、665、666、667、668、669、670、671、672、673、674、675、676、677、678、679、680、681、682、683、684、685、686、687、688、689、690、691、692、693、694、695、696、697、698、699、700、701、702、703、704、705、706、707、708、709、710、711、712、713、714、715、716、717、718、719、720、721、722、723、724、725、726、727、728、729、730、731、732、733、734、735、736、737、738、739、740、741、742、743、744、745、746、747、748、749、750、751、752、753、754、755、756、757、758、759、760、761、762、763、764、765、766、767、768、769、770、771、772、773、774、775、776、777、778、779、780、781、782、783、784、785、786、787、788、789、790、791、792、793、794、795、796、797、798、799、800、801、802、803、804、805，其中所述位置对应于SEQ ID NO:2的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO:2的编号)，
ix)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸829至838至1042的区域18，例如，在选自下组的一个或多个位置处的所述改变，该组由以下组成：位置829、830、831、832、833、834、835、836、837、838，其中所述位置对应于SEQ ID NO:2的氨基酸位置(例如，使用SEQ ID NO:2的编号)，
x)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸1043至1055的区19，例如，在选自下组的一个或多个位置处的所述改变，该组由以下组成：位置1043、1044、1045、1046、1047、1048、1049、1050、1051、1052、1053、1054、1055，其中所述位置对应于SEQ ID NO:2的氨基酸位置(例如，使用SEQ ID NO:2的编号)。
在一些方面，本发明涉及一种用于获得(或产生)根据本发明的内切葡聚糖酶变体的方法，该变体在选自下组的一个或多个位置处具有改变(例如，取代、缺失或插入)，该组由以下组成：位置SEQ ID NO:2的17、20、51、53、55、56、60、63、79、87、186、192、302、311、313、387、388、390、403、408、410、416、448、451、471、472、476、489、507、512、515、538、598、599、602、603、605、609、676、688、690、694、697、698、699、711、719、754、756、760、781、786、797、833、834、835、和1048，其中根据SEQ ID NO:2进行编号。
在一些方面，本发明涉及一种用于获得(或产生)根据本发明的内切葡聚糖酶变体的方法，该变体在选自下组的一个或多个位置处具有改变(例如，取代、缺失或插入)，该组由以下组成：S17A、F20P、F20N、F20G、F20Y、K51Q、K51H、E53P、E53G、Y55M、V56M、Y60F、S63F、Y579W、T87R、A186P、K192N、I302D、I302H、I302V、I302M、H311N、S313D、I387T、K388R、K390Q、I403Y、E408D、E408S、E408P、E408A、E408G、E408N、P410G、Q416S、Q416D、A448E、A448W、A448S、K451S、G471S、S472Y、D476R、Q489P、K507R、K512P、S515V、S538C、S598Q、A599S、I602T、I602D、V603P、S605T、G609E、D676H、A688G、Y690F、T694A、T697G、R698W、T699A、T711V、T711Y、W719R、K754R、V756H、V756Y、S760G、T781M、N786K、T797S、A824D、N833D、Q834E、S835D、和F1048W，其中根据SEQ ID NO:2进行编号。
在一些方面，本发明涉及一种用于获得(或产生)根据本发明的内切葡聚糖酶变体的方法，该变体在选自下组的一个或多个位置处具有改变(例如，取代、缺失或插入)，该组由以下组成：17、20、302、311、313、408、476、602、688、697、和719，其中根据SEQ ID NO:2进行编号。
在一些方面，本发明涉及一种用于获得(或产生)根据本发明的内切葡聚糖酶变体的方法，该变体具有选自下组的在一个或多个位置处的取代，该组由以下组成：S17A、F20P、I302D、H311N、S313D、E408D、D476R、I602T、A688G、T697G、和W719R，其中根据SEQ ID NO:2进行编号。
在一些方面，本发明涉及一种用于获得(或产生)根据本发明的内切葡聚糖酶变体的方法，该变体进一步具有选自下组的在一个或多个位置处的改变(例如，取代、缺失或插入)，该组由以下组成：216、283、346、559、564、579、636、638、651,824、848、869、880、881、883、887、892、905、906、912、921、928、934、937、948、956、999、和1037。
在一些方面，本发明涉及一种用于获得(或产生)根据本发明的内切葡聚糖酶变体的方法，该变体进一步具有选自下组的在一个或多个位置处的取代，该组由以下组成：N216D、N216Q、A283D、A346D、A559P、A559N、A564E、Y579W、S636K、S636N、F638N、A651P、A824D、N848D、A869V、R880K、V881T、V881Q、T883R、T887K、T892P、N905D、F906A、A912V、K921R、S928D、Y934G、A937E、K948R、Q956Y、T999R、和A1037E。
在一些优选的方面，本发明涉及一种用于获得(或产生)内切葡聚糖酶变体的方法，其中该变体包含一个或多个以下的取代组：
Figure BDA0002387863890000171
Figure BDA0002387863890000181
在一些优选的方面，本发明涉及一种用于获得(或产生))根据本发明的内切葡聚糖酶变体的方法，其中该变体包含一个或多个以下的取代组：
Figure BDA0002387863890000182
Figure BDA0002387863890000191
在一些方面，本发明涉及一种用于获得(或产生)根据本发明的内切葡聚糖酶变体的方法，该变体在一个或多个位置处具有改变(例如，取代、缺失或插入)，所述方法提供具有>1.0的半衰期改善因子(HIF)的变体。
在一些方面，本发明还涉及编码本发明的变体多肽的分离的多核苷酸；以及涉及核酸构建体；重组表达载体、和包含所述变体多核苷酸的重组宿主细胞。
序列表说明
SEQ ID NO:1是来自类芽孢杆菌属物种的亲本成熟内切葡聚糖酶的DNA序列。
SEQ ID NO:2是由SEQ ID NO:1编码的成熟多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:3是来自地衣芽孢杆菌的α-淀粉酶分泌信号的DNA序列。
SEQ ID NO:4是来自地衣芽孢杆菌的α-淀粉酶分泌信号的氨基酸序列。
定义
cDNA：术语“cDNA”意指可以通过从获得自真核或原核细胞的成熟的、剪接的mRNA分子进行反转录而制备的DNA分子。cDNA缺乏可以存在于对应基因组DNA中的内含子序列。初始的初级RNA转录物是mRNA的前体，其要通过一系列的步骤(包括剪接)进行加工，然后呈现为成熟的剪接的mRNA。
清洁或洗涤剂应用：术语“清洁或洗涤剂应用”意指应用内切葡聚糖酶在任何组合物中用于手动、机械或自动化清洁或洗涤硬表面或纺织品的目的的应用。
清洁组合物：术语“清洁组合物”是指用于从有待清洁的物品(如纺织品、餐具和硬表面)去除不希望的化合物的组合物。这些术语涵盖选择用于希望的具体类型的清洁组合物和产品的形式(例如，液体、凝胶、粉末、颗粒、糊状、或喷雾组合物)的任何材料/化合物，并且包括但不限于洗涤剂组合物(例如，液体和/或固体衣物洗涤剂和精细织物洗涤剂；硬表面清洁配制品，如用于玻璃、木材、陶瓷和金属台面以及窗户；地毯清洁剂；烤箱清洁剂；织物清新剂；织物软化剂；和纺织品和衣物预洗涤剂，连同餐具洗涤剂)。除了内切葡聚糖酶之外，该洗涤剂配制品还可以包含一种或多种另外的酶(如黄原胶裂解酶、蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、角质酶、纤维素酶、内切葡聚糖酶、木葡聚糖酶、果胶酶、果胶裂解酶、黄原胶酶、过氧化物酶、卤代加过氧酶、过氧化氢酶以及甘露聚糖酶，或其任何混合物)，和/或组分，例如表面活性剂、助洗剂、螯合剂(chelator)或螯合试剂(chelating agent)、漂白系统或漂白组分、聚合物、织物调理剂、泡沫促进剂、泡沫抑制剂、染料、香料、晦暗抑制剂、光学增亮剂、杀细菌剂、杀真菌剂、污垢悬浮剂、防蚀剂、酶抑制剂或稳定剂、酶激活剂、一种或多种转移酶、水解酶、氧化还原酶、上蓝剂以及荧光染料、抗氧化剂、和增溶剂。
编码序列：术语“编码序列”意指直接指定多肽的氨基酸序列的多核苷酸。编码序列的边界通常由可读框确定，所述可读框以起始密码子(如ATG、GTG或TTG)开始并且以终止密码子(如TAA、TAG或TGA)结束。编码序列可为基因组DNA、cDNA、合成DNA或其组合。
颜色澄清：在洗涤和穿着过程中，松动或破损纤维可以在织物的表面上积聚。一种后果是由于表面污染，织物的颜色看起来不太亮或不太强烈。从纺织品上去除松动或破损纤维将部分地恢复该纺织品的初始颜色和外观。如在此使用，术语“颜色澄清”意指纺织品的原始颜色的部分恢复。
控制序列：术语“控制序列”意指表达编码本发明的成熟多肽的多核苷酸所必需的核酸序列。每个控制序列对于编码所述多肽的多核苷酸来说可以是天然的(即，来自相同基因)或外源的(即，来自不同基因)，或相对于彼此是天然的或外源的。此类控制序列包括但不限于前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列、以及转录终止子。最少，控制序列包括启动子、以及转录和翻译终止信号。出于引入有利于将控制序列与编码多肽的多核苷酸的编码区连接的特异性限制位点的目的，所述控制序列可以提供有多个接头。
对应于：如本文使用的术语“对应于”是指确定序列中的特定氨基酸(其中参考了特定氨基酸序列)的方式。例如出于本发明的目的，当参考特定氨基酸位置时，技术人员会能够将另一氨基酸序列与所述已经被参考的氨基酸序列进行比对，从而确定哪一个特定氨基酸可能是在所述另一氨基酸序列中是感兴趣的。已经在本文其他地方描述了另一氨基酸序列与例如如在SEQ ID NO:2中阐明的序列或本文列出的任何其他序列的比对。可使用可替代的比对方法，并且这些方法为本领域技术人员所熟知。
降解黄原胶和黄原胶降解活性：可互换地使用术语“降解黄原胶”或“黄原胶降解活性”并且将其定义为将黄原胶解聚、降解或分解为更小的组分。黄原胶的降解可以是去除一个或多个侧链糖，将黄原胶的骨架切成更小的组分，或去除一个或多个侧链糖并且将黄原胶的骨架切成更小的组分。用于测量黄原胶降解的优选测定是如本文实例3中所述的还原糖测定。黄原胶降解活性的非限制性实例包括内切葡聚糖酶EC 3.2.1.4活性。
Δ反射值(remission value)(ΔRem)：在此将术语“δ反射”或“δ反射值”定义为在460nm处的反射比或反射测量值的结果。用一种具有类似颜色的小块布样，优选一种来自重复洗涤的小块布样作为背景测量该小块布样。在洗涤之前，测量代表每种布样类型的布样。Δ反射是洗涤的小块布样的反射值减去未洗涤的小块布样的反射值。
Δ酶性能值(ΔRem酶值)：在此将术语“δ酶反射值”定义为在460nm处的反射比或反射测量值的结果。用一种具有类似颜色的小块布样，优选一种来自重复洗涤的小块布样作为背景测量该小块布样。在洗涤之前，测量代表每种布样类型的布样。δ反射是用存在一种酶的洗涤剂洗涤的小块布样的反射值减去用不存在酶的洗涤剂洗涤的类似小块布样的反射值。
Δ酶强度值(ΔInt酶值)：在此将术语“δ酶强度”或“δ酶强度值”定义为如在AMSA测定中所定义的酶强度值的结果。δ强度是用存在一种酶的洗涤剂洗涤的小块布样区域的强度值减去用不存在酶的洗涤剂洗涤的小块布样区域的强度值。
洗涤剂组分：在此将术语“洗涤剂组分”定义为意指可用于洗涤剂组合物中的化学物质的类型。洗涤剂组分的实例是表面活性剂、水溶助长剂、助洗剂、共助洗剂、螯合剂或螯合试剂、漂白系统或漂白组分、聚合物、织物调色剂、织物调理剂、泡沫促进剂、抑泡剂、分散剂、染料转移抑制剂、荧光增白剂、香料、光学增亮剂、杀细菌剂、杀真菌剂、污垢助悬剂、污垢释放聚合物、抗再沉积剂、酶抑制剂或稳定剂、酶活化剂、抗氧化剂和增溶剂。洗涤剂组合物可以包含一种或多种任何类型的洗涤剂组分。
洗涤剂组合物：术语“洗涤剂组合物”是指用于从有待清洁的物品(例如纺织品、餐具和硬表面)去除不希望的化合物的组合物。洗涤剂组合物可以用于例如清洁纺织品、餐具以及硬表面，用于家用清洁剂和工业清洁两者。这些术语涵盖选择用于希望的具体类型的清洁组合物和产品的形式(例如，液体、凝胶、粉末、颗粒、糊状、或喷雾组合物)的任何材料/化合物，并且包括但不限于洗涤剂组合物(例如，液体和/或固体衣物洗涤剂和精细织物洗涤剂；硬表面清洁配制品，如用于玻璃、木材、陶瓷和金属台面以及窗户；地毯清洁剂；烤箱清洁剂；织物清新剂；织物软化剂；和纺织品和衣物预洗涤剂，连同餐具洗涤剂)。除了包含本发明的GH9内切葡聚糖酶和/或黄原胶裂解酶之外，该洗涤剂配制品还可以包含一种或多种另外的酶(如黄原胶裂解酶、蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、角质酶、纤维素酶、内切葡聚糖酶、木葡聚糖酶、果胶酶、果胶裂解酶、黄原胶酶、过氧化物酶、卤代加过氧酶(haloperoxygenase)、过氧化氢酶以及甘露聚糖酶，或其任何混合物)，和/或组分，例如表面活性剂、助洗剂、螯合剂(chelator)或螯合试剂(chelating agent)、漂白系统或漂白组分、聚合物、织物调理剂、泡沫促进剂、泡沫抑制剂、染料、香料、晦暗抑制剂、光学增亮剂、杀细菌剂、杀真菌剂、污垢悬浮剂、防蚀剂、酶抑制剂或稳定剂、酶激活剂、一种或多种转移酶、水解酶、氧化还原酶、上蓝剂以及荧光染料、抗氧化剂、和增溶剂。
餐具洗涤：术语“餐具洗涤”是指所有形式的洗涤餐具，例如手动或自动化餐具洗涤。洗涤餐具包括但不限于，清洁所有形式的餐用器皿，例如盘子、杯子、玻璃杯、碗、所有形式的刀具(如匙、刀、叉)、以及服务用具连同陶瓷、塑料、金属、瓷器、玻璃及丙烯酸酯。
餐具洗涤组合物：术语“餐具洗涤组合物”是指用于清洁硬表面的所有形式的组合物。本发明不限于任何特定类型的餐具洗涤组合物或任何特定的洗涤剂。
内切葡聚糖酶：术语“内切葡聚糖酶”或“EG”意指一种内切-1,4-(1,3；1,4)-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶(EC 3.2.1.4)，其催化纤维素、纤维素衍生物(如羧甲基纤维素和羟乙基纤维素)、地衣多糖中的1,4-β-D-糖苷键和混合β-1,3葡聚糖如谷物β-D-葡聚糖、木葡聚糖、黄原胶、以及包含纤维素组分的其他植物材料中的β-1,4键的内切水解。可以通过测量底物黏度的降低或通过还原糖测量所确定的还原性末端的增加来确定内切葡聚糖酶活性(Zhang等人，2006，Biotechnology Advances[生物技术进展]24:452-481)。用于测量内切葡聚糖酶活性的优选测定是如本文实例3中所述的还原糖测定。内切葡聚糖酶的非限制性实例包括具有SEQ ID NO:2的成熟亲本内切葡聚糖酶。
酶洗涤益处：本文中将术语“酶洗涤益处”定义为将酶添加到洗涤剂中与不具有该酶的相同洗涤剂相比的有利效果。可以由酶提供的重要洗涤益处是污渍去除伴随在洗涤和或清洁之后无可见污垢或污垢非常少、防止或减少在洗涤过程中所释放的污垢再沉积(一种又称作抗再沉积的作用)、完全或部分地恢复纺织品的白度(一种又称作增白的作用)，所述纺织品最初是白色的，但是在反复使用和洗涤后获得淡灰或淡黄色外观。不直接与污垢的催化去污或其再沉积的预防相关的纺织品护理益处对于酶洗涤益处而言也是重要的。此类纺织品护理益处的实例是防止或减少染料从一织物转移至另一织物或同一织物的另一部分(一种也被称作染料转移抑制或抗返染的作用)，从织物表面去除突出或断裂的纤维以减少起球倾向或去除已经存在的绒球或绒毛(一种也被称作抗起球的作用)，改善织物柔软性，织物的颜色澄清以及去除陷在织物或服装的纤维中的微粒状污垢。酶法漂白是一种另外的酶去垢力益处，其中通常将催化活性用于催化漂白组分(如过氧化氢或其他过氧化物)的形成。
表达：术语“表达”包括涉及多肽产生的任何步骤，包括但不限于：转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰、以及分泌。
表达载体：术语“表达载体”意指直链或环状DNA分子，其包含编码多肽的多核苷酸并且可操作地连接至提供用于其表达的控制序列。
片段：术语“片段”意指具有在成熟多肽的氨基和/或羧基末端不存在的一个或多个(例如，若干个)氨基酸的多肽；其中该片段具有内切葡聚糖酶活性。在一方面，一个片段包含成熟多肽的氨基酸数目的至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％或95％。
对用黄原胶裂解酶预处理的黄原胶具有活性的内切葡聚糖酶变体：将术语“对用黄原胶裂解酶预处理的黄原胶具有活性的内切葡聚糖酶变体”或一种“对用黄原胶裂解酶预处理的黄原胶具有活性且属于GH9类的糖基水解酶的内切葡聚糖酶”定义为一种多肽，该多肽包含一个属于GH9类的糖基水解酶的结构域且对用黄原胶裂解酶预处理的黄原胶具有活性(例如酶活性、黄原胶降解活性、内切葡聚糖酶EC 3.2.1.4活性)。用于测量用黄原胶裂解酶预处理的黄原胶的活性的优选测定是如本文实例3中所披露的。
对黄原胶具有活性的黄原胶裂解酶变体：将术语“对黄原胶具有活性的黄原胶裂解酶变体”定义为对黄原胶具有任何种类活性(例如酶活性、黄原胶降解活性、黄原胶裂解酶EC 4.2.2.12活性)的多肽。
半衰期：术语“半衰期”是酶在一组给定条件下失去其酶活性的一半所需的时间。它表示为T1/2并以小时(hr)进行测量。可以在给定的洗涤剂浓度和储存温度下计算野生型对照和/或变体的半衰期，因为降解遵循指数衰减并且孵育时间(小时)是已知的，即，根据以下公式：
T1/2(变体)＝(Ln(0.5)/Ln(RA-变体/100))*时间
T1/2(野生型)＝(Ln(0.5)/Ln(RA-野生型/100))*时间
其中“RA”是以百分比计的残余活性，“时间”是孵育时间。
半衰期改善因子：术语“半衰期改善因子”或“HIF”是与亲本多肽(如亲本内切葡聚糖酶)相比变体的半衰期的改善。在一组给定的储存条件下(洗涤剂浓度和温度)，半衰期改善因子(HIF)可以计算如下：
Figure BDA0002387863890000241
其中野生型(wt)在与变体相同的储存条件下孵育。在野生型和变体之间的稳定性差异太大而不能使用相同的孵育时间精确评估野生型和变体的半衰期的情况下，野生型和变体的孵育时间是不同的，例如，野生型为1h，最稳定的变体为138h。计算HIF的优选方法也在本文实例3中描述。
硬表面清洁：本文将术语“硬表面清洁”定义为清洁硬表面，其中硬表面可以包括地板、桌子、墙壁、屋顶等，连同硬物体的表面，如汽车(汽车洗涤)和餐具(餐具洗涤)。餐具洗涤包括但不限于，清洁盘子、杯子、玻璃杯、碗、及刀具(例如匙、刀、叉)、上菜用具、陶瓷、塑料、金属、瓷器、玻璃及丙烯酸酯。
宿主细胞：术语“宿主细胞”意指易于用包含本发明的多核苷酸的核酸构建体或表达载体进行转化、转染、转导等的任何细胞类型。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间出现的突变而与亲本细胞不完全相同的任何亲本细胞子代。
改善的特性：术语“改善的特性”意指与相对于亲本有所改进的变体相关的特征。此类改善的性质包括但不限于：催化效率、催化速率、化学稳定性、氧化稳定性、pH活性、pH稳定性、比活性、在储存条件下的稳定性、螯合剂稳定性、底物结合、底物裂解、底物特异性、底物稳定性、表面性质、热活性、和热稳定性。
改善的洗涤性能：在此将术语“改善的洗涤性能”定义为一种(变体)酶(还有酶的共混物，不只是变体还有骨架，以及与某种清洁组合物组合，等)相对于亲本蛋白酶变体的洗涤性能展示出一种蛋白质变体的洗涤性能的改变，例如增加的去污。术语“洗涤性能”包括在衣物洗涤并且例如在餐具洗涤中的洗涤性能。
分离的：术语“分离的”意指处于自然界中不存在的形式或环境中的物质。分离的物质的非限制性实例包括：(1)任何非天然存在的物质，(2)包括但不限于任何酶、变体、核酸、蛋白质、肽或辅因子的任何物质，所述物质至少部分地从与其性质相关的一种或多种或所有天然存在的成分中去除；(3)相对于自然界中发现的物质通过人工修饰的任何物质；或(4)通过相对于与其天然相关的其他组分，增加该物质的量而修饰的任何物质(例如，编码该物质的基因的多个拷贝；比与编码该物质的基因天然相关联的启动子更强的启动子的使用)。分离的物质可以存在于发酵液样品中。
洗涤：术语“洗涤”涉及家用洗涤和工业洗涤两者并且意指用一种包含本发明的清洁或洗涤剂组合物的溶液处理纺织品的过程。洗涤过程可以例如使用例如家用或工业洗衣机进行或可以手动进行。
成熟多肽：术语“成熟多肽”意指在翻译和任何翻译后修饰如N-末端加工、C-末端截短、糖基化作用、磷酸化作用等之后处于其最终形式的多肽。在一方面，该成熟多肽是SEQID NO:2的氨基酸1至1055。
在本领域中已知的是，宿主细胞可以产生由相同多核苷酸表达的两种或更多种不同的成熟多肽(即，具有不同的C-末端和/或N-末端氨基酸)的混合物。在本领域中还已知的是，不同的宿主细胞以不同的方式加工多肽，并且因此表达多核苷酸的一种宿主细胞当与表达相同多核苷酸的另一种宿主细胞相比时可产生不同的成熟多肽(例如，具有不同的C-末端和/或N-末端氨基酸)。
成熟多肽编码序列：术语“成熟多肽编码序列”意指一种编码成熟多肽的多核苷酸，该成熟多肽具有酶活性，例如对用黄原胶裂解酶预处理的黄原胶具有活性或具有黄原胶裂解酶活性。在一个方面，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:1的核苷酸1至3165。
突变体：术语“突变体”意指编码变体的多核苷酸。
核酸构建体：术语“核酸构建体”意指单链或双链的核酸分子，所述核酸分子是从天然存在的基因中分离的、或以本来不存在于自然界中的方式被修饰成含有核酸的区段、或是合成的，其含有一个或多个控制序列。
可操作地连接：术语“可操作地连接”意指如下的构型，在所述构型中，控制序列被放置在相对于多核苷酸的编码序列适当的位置处，使得所述控制序列引导所述编码序列的表达。
亲本：术语“亲本”或“亲本内切葡聚糖酶”意指对其作出改变以产生本发明的这些酶变体的具有内切葡聚糖酶活性的任何多肽。在一方面，亲本是具有与该变体相同的氨基酸序列但是在一个或多个这些指定位置不具有改变的内切葡聚糖酶。应理解的是，“具有相同的氨基酸序列”的表达涉及100％序列同一性。亲本内切葡聚糖酶的非限制性实例包括具有SEQ ID NO:2的成熟亲本内切葡聚糖酶。
序列同一性：两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性通过参数“序列同一性”来描述。出于本发明的目的，使用尼德曼-翁施算法(Needleman-Wunschalgorithm)(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]48:443-453)来确定两个氨基酸序列之间的序列同一性，该算法如EMBOSS软件包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件(The European Molecular Biology Open Software Suite)，Rice等人,2000,Trends Genet.[遗传学趋势]16:276-277)(优选5.0.0版本或更新版本)。所使用的参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5、以及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。使用尼德尔标记的“最长同一性”的输出(使用非简化(-nobrief)选项获得)作为同一性百分比并且如下计算：
(相同的残基x 100)/(比对长度-比对中的空位总数)
出于本发明的目的，使用尼德曼-翁施算法(Needleman和Wunsch,1970,同上)来确定两个脱氧核苷酸序列之间的序列同一性，该算法如EMBOSS软件包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件，Rice等人,2000,同上)(优选5.0.0版本或更新版本)。所使用的参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5、以及EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版本)取代矩阵。使用尼德尔标记的“最长同一性”的输出(使用非简化(-nobrief)选项获得)作为同一性百分比并且如下计算：
(相同的脱氧核糖核苷酸x 100)/(比对长度-比对中的空位总数)
严格条件：不同的严格条件定义如下。
术语“非常低严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃、于5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和25％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在45℃使用2X SSC、0.2％SDS将运载体材料洗涤三次，每次15分钟。
术语“低严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃、于5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和25％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在50℃使用2X SSC、0.2％SDS将运载体材料洗涤三次，每次15分钟。
术语“中严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃、于5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和35％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在55℃使用2X SSC、0.2％SDS将运载体材料洗涤三次，每次15分钟。
术语“中-高严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃、于5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和35％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在60℃使用2X SSC、0.2％SDS将运载体材料洗涤三次，每次15分钟。
术语“高严格条件”意指对于至少100个核苷酸长度的探针，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在65℃使用2X SSC、0.2％SDS将运载体材料洗涤三次，每次15分钟。
术语“非常高严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在70℃使用2X SSC、0.2％SDS将运载体材料洗涤三次，每次15分钟。
子序列：术语“子序列”意指具有从成熟多肽编码序列的5'端和/或3'端缺失的一个或多个(例如，若干个)核苷酸的多核苷酸；其中该子序列编码一个片段，该片段具有酶活性，例如对用黄原胶裂解酶预处理的黄原胶具有活性或具有黄原胶裂解酶活性。
纺织品：术语“纺织品”意指任何纺织品材料，该任何纺织品材料包括纱线、纱线中间体、纤维、非机织材料、天然材料、合成材料、以及任何其他纺织品材料，由这些材料制成的织物和由织物制成的产品(例如，服装和其他制品)。该纺织品或织物可以处于针织品、机织物、牛仔布、非机织物、毡、纱线、以及毛巾布的形式。这些纺织品可以是纤维素基的，例如天然纤维素，包括棉布、亚麻/亚麻布、黄麻、苎麻、剑麻或椰壳纤维或者人造纤维素(例如，来源于木浆)，包括黏胶纤维/人造丝、苎麻、醋酸纤维素纤维(三胞)、莱赛尔纤维(lyocell)或其共混物。纺织品或织物也可以是非纤维素基的，如天然聚酰胺，包括羊毛、驼毛、羊绒、马海毛、兔毛和蚕丝或合成聚合物如尼龙、芳族聚酰胺、聚酯、丙烯酸、聚丙烯和氨纶/弹性纤维(spandex/elastane)、或其共混物其以及纤维素基的和非纤维素基的纤维的共混物。共混物的实例是棉和/或人造丝/纤维胶与一种或几种伴随材料的共混物，该伴随材料如羊毛、合成纤维(例如聚酰胺纤维、丙烯酸纤维、聚酯纤维、聚乙烯醇纤维、聚氯乙烯纤维、聚亚胺酯纤维、聚脲纤维、芳香族聚酰胺纤维)以及含纤维素的纤维(例如人造丝/粘胶纤维、苎麻、亚麻/亚麻布、黄麻、醋酸纤维素纤维、莱赛尔纤维)。织物可以是常规的可洗涤衣物，例如有污迹的家用衣物。当使用术语织物或衣服时，旨在还包括广义术语纺织品。
纺织品护理益处：不直接与污垢的催化去污或其再沉积的预防相关的“纺织品护理益处”对于酶洗涤益处而言也是重要的。此类纺织品护理益处的实例是预防或减少染料从一个纺织品转移至另一个纺织品或同一纺织品的另一个部分(一种也被称作染料转移抑制或抗返染的作用)，从纺织品表面去除突出或断裂的纤维以减少起球倾向或去除已经存在的绒球或绒毛(一种也被称作抗起球的作用)，改善纺织品柔软性，使纺织品的颜色澄清以及去除陷在纺织品的纤维中的微粒状污垢。酶漂白是一种另外的酶洗涤益处，其中通常将催化活性用于催化漂白组分(例如过氧化氢或其他过氧化物或其他漂白种类)的形成。
变体：术语“变体”意指在一个或多个(例如若干个)位置处包含改变，即取代、插入和/或缺失的多肽(例如，GH9内切葡聚糖酶多肽)。取代意指用不同的氨基酸替代占用某一位置的氨基酸；缺失意指去除占据某一位置的氨基酸；并且插入意指邻近于并且紧跟着占据一个位置的氨基酸之后添加一个或多个(例如，若干个)氨基酸(例如，1-5个氨基酸)。本发明的内切葡聚糖酶变体的非限制性实例包括对用黄原胶裂解酶预处理的黄原胶具有活性的内切葡聚糖酶变体。本发明的变体的非限制性实例进一步包括具有成熟亲本(该成熟亲本具有SEQ ID NO:2)的至少20％、例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、或至少100％内切葡聚糖酶活性的变体。用于测量用黄原胶裂解酶预处理的黄原胶的活性的优选测定是如本文实例3中所披露的。
稳定性：术语“稳定性”意指对变化、解折叠、崩解、变性或活性损失的抗性或抗性程度。稳定性的非限制性实例包括构象稳定性、储存稳定性和在使用期间(例如在洗涤过程中)的稳定性，并且反映了作为时间函数的多肽(例如，根据本发明的内切葡聚糖酶变体)的稳定性，例如当所述多肽(例如所述内切葡聚糖酶变体)置于溶液中特别是在洗涤剂溶液中时，保留多少活性。该稳定性受到许多因素的影响，例如一种或多种螯合剂的存在、pH、温度、洗涤剂组合物，例如助洗剂、表面活性剂、螯合剂等的量。可使用如本文实例3中所述的半衰期改善因子(HIF)来测量内切葡聚糖酶稳定性。还可以使用如本文实例3中所述的还原糖测定来测量内切葡聚糖酶稳定性。
改善的稳定性：在此将术语“改善的稳定性”或“增加的稳定性”定义为相对于该亲本内切葡聚糖酶的稳定性、相对于具有与该变体相同的氨基酸序列但是在一个或多个这些指定位置上不具有改变的内切葡聚糖酶、或相对于SEQ ID NO:2，在洗涤剂组合物中(例如在溶液中，例如在螯合剂存在下，例如EDTA或柠檬酸盐)增加的稳定性。术语“改善的稳定性”和“增加的稳定性”包括“改善的化学稳定性”、“洗涤剂稳定性”或“改善的洗涤剂稳定性”。
改善的化学稳定性：在此将术语“改善的化学稳定性”定义为变体酶在一种或多种天然存在的或合成的、降低亲本酶的酶活性的化学品存在下孵育一段时间之后表现为保留酶活性。改善的化学稳定性还可导致变体在这些化学物质存在下更能(例如，比亲本更好地)催化反应。在本发明的一个具体方面，改善的化学稳定性是在洗涤剂中(特别是在液体洗涤剂中)的改善的稳定性。术语“洗涤剂稳定性”或“改善的洗涤剂稳定性”具体地是相比于亲本内切葡聚糖酶，当本发明的内切葡聚糖酶变体被混合到一种液体洗涤剂配制品(尤其是一种包含螯合剂(例如EDTA或柠檬酸盐)的液体洗涤剂配制品)中的内切葡聚糖酶的改善的稳定性。
构象稳定性：术语“构象稳定性”意指对构象变化、解折叠或崩解的抗性或抗性程度。因此，术语“构象更不稳定”意指对构象变化、解折叠或崩解的抗性更小或具有更小的抗性程度。
不稳定性：术语“不稳定性”意指缺乏稳定性。不稳定性的非限制性实例包括构象不稳定性、解折叠、变性、崩解、活性损失。
洗涤性能：术语“洗涤性能”被用作酶在例如洗涤或硬表面清洁过程中去除存在于有待清洁的物体上的污物的能力。可以通过计算在‘用于衣物洗涤的自动机械应力测定(AMSA)’中的所谓的强度值(Int)或如在此所定义的反射值(Rem)来量化洗涤性能的改善。
白度：在此将术语“白度”定义为在不同领域并且针对不同顾客具有不同含义的广义术语。白度的损失可以例如归因于灰化、黄化、或光学增亮剂/调色剂的去除。灰化和黄化可归因于污垢再沉积、身体污垢、来自例如铁和铜离子或染料转印的着色。白度可包括来自以下列表的一个或若干个问题：着色剂或染料作用；不完全污物去除(例如身体污垢、皮脂等)；再沉积(物体的灰化、黄化或其他变色)(去除的污垢与纺织品的其他部分(弄脏的或未弄脏的)再关联)；在应用过程中纺织品的化学变化；以及颜色的澄清或淡色化。
黄原胶裂解酶：在此将术语“黄原胶裂解酶”定义为对黄原胶具有活性(例如酶活性、黄原胶降解活性)的酶。黄原胶裂解酶的非限制性实例包括一种切割黄原胶中的β-D-甘露糖基-β-D-1,4-葡萄糖醛酸基键的酶(EC4.2.2.12)。
变体命名规则
出于本发明的目的，将SEQ ID NO:2中披露的成熟多肽用以确定另一种内切葡聚糖酶中的相对应的氨基酸残基。另一种内切葡聚糖酶的氨基酸序列与在SEQ ID NO:2中披露的成熟多肽进行比对，并且基于该比对，使用尼德曼-翁施算法(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]48:443-453)来确定对应于SEQ ID NO:2中披露的成熟多肽中的任何氨基酸残基的氨基酸位置编号，该算法如EMBOSS软件包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件(The European Molecular Biology Open Software Suite)，Rice等人，2000，Trends Genet.[遗传学趋势]16:276-277)(优选5.0.0版本或更新版本)。所使用的参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5、以及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。
可以通过使用若干计算机程序，使用其对应默认参数比对多个多肽序列来确定在另一种内切葡聚糖酶中的对应氨基酸残基的鉴定，所述计算机程序包括但不限于MUSCLE(通过对数期望值的多序列比较；版本3.5或更新版本；Edgar,2004,Nucleic AcidsResearch[核酸研究]32:1792-1797)，MAFFT(版本6.857或更新版本；Katoh和Kuma,2002,Nucleic Acids Research[核酸研究]30:3059-3066；Katoh等人,2005,Nucleic AcidsResearch[核酸研究]33:511-518；Katoh和Toh,2007,Bioinformatics[生物信息学]23:372-374；Katoh等人,2009,Methods in Molecular Biology[分子生物学方法]537:39-64；Katoh和Toh，2010，Bioinformatics[生物信息学]26:1899-1900)，以及采用ClustalW(1.83或更新版本；Thompson等人,1994,Nucleic Acids Research[核酸研究]22:4673-4680)的EMBOSS EMMA。
当其他酶与SEQ ID NO:2的成熟多肽相背离，这样使得传统的基于序列的比较方法不能检测其相互关系时(Lindahl和Elofsson,2000,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]295:613-615)，可使用其他成对序列比较算法。在基于序列的搜索中较高的敏感度可使用搜索程序来获得，这些搜索程序利用多肽家族的概率表现(谱)来搜索数据库。例如，PSI-BLAST程序通过迭代数据库搜索过程来产生多个谱，并且能够检测远距离同源物(Atschul等人,1997,Nucleic Acids Res.[核酸研究]25:3389-3402)。如果多肽的家族或超家族具有在蛋白结构数据库中的一个或多个代表，可以实现甚至更高的敏感度。程序例如GenTHREADER(Jones,1999,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]287:797-815；McGuffin和Jones,2003,Bioinformatics[生物信息学]19:874-881)利用来自多种来源(PSI-BLAST、二级结构预测、结构比对谱、以及溶剂化势)的信息作为预测查询序列的结构折叠的神经网络的输入。类似地，Gough等人,2000,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]313:903-919的方法可用于将未知结构的序列与存在于SCOP数据库中的超家族模型进行比对。这些比对进而可以用于产生多肽的同源性模型，并且使用出于该目的而开发的多种工具可以评估此类模型的准确度。
对于已知结构的蛋白质，若干工具和资源可用于检索并产生结构比对。例如，蛋白质的SCOP超家族已经在结构上进行比对，并且那些比对是可访问且可下载的。可以使用多种算法例如距离比对矩阵(Holm和Sander,1998,Proteins[蛋白质]33:88-96)或组合延伸(Shindyalov和Bourne,1998,Protein Engineering[蛋白质工程]11:739-747)比对两种或更多种蛋白质结构，并且这些算法的实施可以另外用于查询具有感兴趣结构的结构数据库，以便发现可能的结构同源物(例如，Holm和Park,2000,Bioinformatics[生物信息学]16:566-567)。
在描述本发明的变体中，为了便于参考，对以下所述的命名法进行了改编。采用了已接受的IUPAC单字母或三字母的氨基酸缩写。
取代.对于氨基酸取代，使用以下命名法：原始氨基酸、位置、被取代的氨基酸。因此，将在位置226处的苏氨酸被丙氨酸取代表示为“Thr226Ala”或“T226A”。多个突变通过加号(“+”)分开，例如“Gly205Arg+Ser411Phe”或“G205R+S411F”代表在位置205和位置411处的甘氨酸(G)和丝氨酸(S)分别被精氨酸(R)和苯丙氨酸(F)取代。
缺失.对于氨基酸缺失，使用以下命名法：原始氨基酸、位置、*。因此，将在位置195处的甘氨酸的缺失表示为“Gly195*”或“G195*”。多个缺失由加号(“+”)分开，例如，“Gly195*+Ser411*”或“G195*+S411*”。
插入.对于氨基酸插入，使用以下命名法：原始氨基酸、位置、原始氨基酸、插入的氨基酸。因此，将在位置195处的甘氨酸之后插入赖氨酸表示为“Gly195GlyLys”或“G195GK”。多个氨基酸的插入被表示为[原始氨基酸、位置、原始氨基酸、插入的氨基酸#1、插入的氨基酸#2；等]。例如，将在位置195处的甘氨酸之后插入赖氨酸和丙氨酸表示为“Gly195GlyLysAla”或“G195GKA”。
在此类情况下，通过将小写字母添加至在所插入的一个或多个氨基酸残基之前的氨基酸残基的位置编号而对所插入的一个或多个氨基酸残基进行编号。在以上实例中，该序列因此会是：
<u>亲本：</u> <u>变体：</u>
195 195 195a 195b
G G-K-A
多种改变.包含多种改变的变体由加号(“+”)分开，例如，“Arg170Tyr+Gly195Glu”或“R170Y+G195E”代表在位置170和位置195处的精氨酸和甘氨酸分别被酪氨酸和谷氨酸取代。多种改变的变体还可以由逗号(“，”)分开，例如“Arg170Tyr，Gly195Glu”或“R170Y，G195E”代表在位置170和位置195处的精氨酸和甘氨酸分别被酪氨酸和谷氨酸取代。不同改 变.在可于一个位置处引入不同改变的情况下，不同的改变由逗号分开，例如，“Arg170Tyr,Glu”代表用酪氨酸或谷氨酸取代在位置170处的精氨酸。因此，“Tyr167Gly,Ala+Arg170Gly,Ala”表示以下变体：
“Tyr167Gly+Arg170Gly”、“Tyr167Gly+Arg170Ala”、“Tyr167Ala+Arg170Gly”、和“Tyr167Ala+Arg170Ala”。
具体实施方式
具有SEQ ID NO:2的已知黄原胶内切葡聚糖酶是大酶(>1000个残基)，因此靶向其特性以改善例如洗涤剂组合物中的稳定性，例如在螯合剂存在下，是极其困难且昂贵的。在一些方面，本发明使用蛋白质工程化至选自由以下组成的区域靶向对内切葡聚糖酶分子的稳定性有影响的内切葡聚糖酶的特定区域：对应于SEQ ID NO:2的氨基酸1至94的区域10、对应于SEQ ID NO:2的氨基酸106至114的区域11、对应于SEQ ID NO:2的氨基酸139至209的区域12、对应于SEQ ID NO:2的氨基酸252至266的区域13、对应于SEQ ID NO:2的氨基酸302至338的区域14、对应于SEQ ID NO:2的氨基酸362至546的区域15、对应于SEQ ID NO:2的氨基酸596至611的区域16、对应于SEQ ID NO:2的氨基酸661至805的区域17、对应于SEQ IDNO:2的氨基酸829至838的区域18、和对应于SEQ ID NO:2的氨基酸1043至1055的区域19。
在一个实施例中，当使用蛋白质工程以试图稳定内切葡聚糖酶分子时，本发明大幅缩小了至靶标的残基的数量。
变体
在一个实施例中，本发明涉及具有SEQ ID NO:2的已知黄原胶内切葡聚糖酶的蛋白质序列中的螯合剂诱导的不稳定区域，这些区域在当该分子在具有EDTA的缓冲液中孵育时受到影响，所述区域如下：对应于SEQ ID NO:2的氨基酸1至94的区域10、对应于SEQ IDNO:2的氨基酸106至114的区域11、对应于SEQ ID NO:2的氨基酸139至209的区域12、对应于SEQID NO:2的氨基酸252至266的区域13、对应于SEQ ID NO:2的氨基酸302至338的区域14、对应于SEQ ID NO:2的氨基酸362至546的区域15、对应于SEQ ID NO:2的氨基酸596至611的区域16、对应于SEQ ID NO:2的氨基酸661至805的区域17、对应于SEQ ID NO:2的氨基酸829至838的区域18、和对应于SEQ ID NO:2的氨基酸1043至1055的区域19。该实施例涉及关于何处突变内切葡聚糖酶以使其分子在洗涤剂(例如，包含螯合剂(例如EDTA或柠檬酸盐)的洗涤剂组合物)中稳定的重要指导。
在一个实施例中，本发明涉及一种内切葡聚糖酶变体，该变体在选自下组的区域中的一个或多个位置处包含改变(例如，取代、缺失或插入)，该组由以下组成：对应于SEQID NO:2的氨基酸1至94的区域10、对应于SEQ ID NO:2的氨基酸106至114的区域11、对应于SEQ ID NO:2的氨基酸139至209的区域12、对应于SEQ ID NO:2的氨基酸252至266的区域13、对应于SEQ ID NO:2的氨基酸302至338的区域14、对应于SEQ ID NO:2的氨基酸362至546的区域15、对应于SEQ ID NO:2的氨基酸596至611的区域16、对应于SEQ ID NO:2的氨基酸661至805的区域17、对应于SEQ ID NO:2的氨基酸829至838的区域18、和对应于SEQ IDNO:2的氨基酸1043至1055的区域19；优选地，所述内切葡聚糖酶变体对用黄原胶裂解酶预处理的黄原胶具有活性，进一步优选地，所述活性是黄原胶降解活性。
在一个实施例中，本发明涉及一种内切葡聚糖酶变体，该变体在选自下组的区域中的一个或多个位置处包含改变(例如，取代、缺失或插入)，该组由以下组成：
i)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸1至94的区域10，例如，在选自下组的一个或多个位置处的所述改变，该组由以下组成：位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94，其中所述位置对应于SEQ ID NO:2的氨基酸位置(例如，使用SEQ ID NO:2的编号)，
ii)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸106至114的区域11，例如，在选自下组的一个或多个位置处的所述改变，该组由以下组成：位置107、108、109、110、111、112、113、114，其中所述位置对应于SEQ ID NO:2的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO:2的编号)，
iii)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸139至209的区域12，例如，在选自下组的一个或多个位置处的所述改变，该组由以下组成：位置139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209，其中所述位置对应于SEQ ID NO:2的氨基酸位置(例如，使用SEQ IDNO:2的编号)，
iv)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸252至266的区域13，例如，在选自下组的一个或多个位置处的所述改变，该组由以下组成：位置252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266，其中所述位置对应于SEQ ID NO:2的氨基酸位置(例如使用SEQID NO:2的编号)，
v)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸302至338的区域14，例如，在选自下组的一个或多个位置处的所述改变，该组由以下组成：位置302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338，其中所述位置对应于SEQ ID NO:2的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO:2的编号)，
vi)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸362至546的区域15，例如，在选自下组的一个或多个位置处的所述改变，该组由以下组成：位置362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500、501、502、503、504、505、506、507、508、509、510、511、512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、535、536、537、538、539、540、541、542、543、544、545、546，其中所述位置对应于SEQ ID NO:2的氨基酸位置(例如使用SEQ IDNO:2的编号)，
vii)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸596至611的区域16，例如，在选自下组的一个或多个位置处的所述改变，该组由以下组成：位置596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611，其中所述位置对应于SEQ ID NO:2的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO:2的编号)，
viii)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸661至805的区域17，例如，在选自下组的一个或多个位置处的所述改变，该组由以下组成：位置661、662、663、664、665、666、667、668、669、670、671、672、673、674、675、676、677、678、679、680、681、682、683、684、685、686、687、688、689、690、691、692、693、694、695、696、697、698、699、700、701、702、703、704、705、706、707、708、709、710、711、712、713、714、715、716、717、718、719、720、721、722、723、724、725、726、727、728、729、730、731、732、733、734、735、736、737、738、739、740、741、742、743、744、745、746、747、748、749、750、751、752、753、754、755、756、757、758、759、760、761、762、763、764、765、766、767、768、769、770、771、772、773、774、775、776、777、778、779、780、781、782、783、784、785、786、787、788、789、790、791、792、793、794、795、796、797、798、799、800、801、802、803、804、805，其中所述位置对应于SEQ ID NO:2的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO:2的编号)，
ix)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸829至838至1042的区域18，例如，在选自下组的一个或多个位置处的所述改变，该组由以下组成：位置829、830、831、832、833、834、835、836、837、838，其中所述位置对应于SEQ ID NO:2的氨基酸位置(例如，使用SEQ ID NO:2的编号)，
x)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸1043至1055的区19，例如，在选自下组的一个或多个位置处的所述改变，该组由以下组成：位置1043、1044、1045、1046、1047、1048、1049、1050、1051、1052、1053、1054、1055，其中所述位置对应于SEQ ID NO:2的氨基酸位置(例如，使用SEQ ID NO:2的编号)。
在一个实施例中，本发明涉及一种内切葡聚糖酶变体，该变体在选自下组的一个或多个区域中的一个或多个位置处包含改变(例如，取代、缺失或插入)，该组由以下组成：对应于SEQ ID NO:2的氨基酸1至94的区域10、对应于SEQ ID NO:2的氨基酸106至114的区域11、对应于SEQ ID NO:2的氨基酸139至209的区域12、对应于SEQ ID NO:2的氨基酸252至266的区域13、对应于SEQ ID NO:2的氨基酸302至338的区域14、对应于SEQ ID NO:2的氨基酸362至546的区域15、对应于SEQ ID NO:2的氨基酸596至611的区域16、对应于SEQ ID NO:2的氨基酸661至805的区域17、对应于SEQ ID NO:2的氨基酸829至838的区域18、和对应于SEQ ID NO:2的氨基酸1043至1055的区域19，其中所述变体与SEQ ID NO:2具有至少60％且小于100％的序列同一性；优选地，所述内切葡聚糖酶变体对用黄原胶裂解酶预处理的黄原胶具有活性，进一步优选地，所述活性是黄原胶降解活性。
在一个实施例中，本发明涉及本发明的一种内切葡聚糖酶变体，该变体在选自下组的一个或多个区域中的一个或多个位置处进一步包含改变(例如，取代、缺失或插入)，该组由以下组成：对应于SEQ ID NO:2的氨基酸1至94的区域10、对应于SEQ ID NO:2的氨基酸106至114的区域11、对应于SEQ ID NO:2的氨基酸139至209的区域12、对应于SEQ ID NO:2的氨基酸252至266的区域13、对应于SEQ ID NO:2的氨基酸302至338的区域14、对应于SEQID NO:2的氨基酸362至546的区域15、对应于SEQ ID NO:2的氨基酸596至611的区域16、对应于SEQ ID NO:2的氨基酸661至805的区域17、对应于SEQ ID NO:2的氨基酸829至838的区域18、和对应于SEQ ID NO:2的氨基酸1043至1055的区域19，其中所述变体与SEQID NO:2具有至少60％且小于100％的序列同一性，优选地，所述内切葡聚糖酶变体对用黄原胶裂解酶预处理的黄原胶具有活性，进一步优选地，所述活性是黄原胶降解活性。
在一个实施例中，本发明涉及本发明的一种内切葡聚糖酶变体，该变体在选自下组的一个区域(例如SEQ ID NO:2的或另一种亲本内切葡聚糖酶的)具有多个(如2、3、4、5、6、7、8、9或10个)改变，该组由以下组成：对应于SEQ ID NO:2的氨基酸1至94的区域10、对应于SEQ ID NO:2的氨基酸106至114的区域11、对应于SEQ ID NO:2的氨基酸139至209的区域12、对应于SEQ ID NO:2的氨基酸252至266的区域13、对应于SEQ ID NO:2的氨基酸302至338的区域14、对应于SEQ ID NO:2的氨基酸362至546的区域15、对应于SEQ ID NO:2的氨基酸596至611的区域16、对应于SEQ ID NO:2的氨基酸661至805的区域17、对应于SEQ ID NO:2的氨基酸829至838的区域18、和对应于SEQ ID NO:2的氨基酸1043至1055的区域19，其中所述变体与SEQ ID NO:2具有至少60％且小于100％的序列同一性，优选地，所述内切葡聚糖酶变体对用黄原胶裂解酶预处理的黄原胶具有活性，进一步优选地，所述活性是黄原胶降解活性。
在一个实施例中，本发明涉及本发明的一种内切葡聚糖酶变体，该变体在选自下组的多个(例如2、3、4、5、6、7、8、9或10个)区域(例如SEQ ID NO:2的或另一种亲本内切葡聚糖酶的)具有多个(例如2、3、4、5、6、7、8、9或10个)改变，该组由以下组成：对应于SEQ IDNO:2的氨基酸1至94的区域10、对应于SEQ ID NO:2的氨基酸106至114的区域11、对应于SEQID NO:2的氨基酸139至209的区域12、对应于SEQ ID NO:2的氨基酸252至266的区域13、对应于SEQ ID NO:2的氨基酸302至338的区域14、对应于SEQ ID NO:2的氨基酸362至546的区域15、对应于SEQ ID NO:2的氨基酸596至611的区域16、对应于SEQ ID NO:2的氨基酸661至805的区域17、对应于SEQ ID NO:2的氨基酸829至838的区域18、和对应于SEQ ID NO:2的氨基酸1043至1055的区域19，优选地，所述内切葡聚糖酶变体对用黄原胶裂解酶预处理的黄原胶具有活性，进一步优选地，所述活性是黄原胶降解活性。
在一个实施例中，本发明涉及内切葡聚糖酶变体，这些变体包含在成熟亲本多肽(例如，SEQ ID NO:2)的一个或多个(例如若干个)位置处的改变(例如，取代、缺失或插入)，其中每个改变独立地是取代、插入或缺失，其中该变体具有内切葡聚糖酶活性。
在一个实施例中，该变体与亲本内切葡聚糖酶的氨基酸序列具有至少60％，例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性。
在一个实施例中，该变体与SEQ ID NO:2的多肽具有至少60％，例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％，如至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列同一性。
在一个实施例中，本发明涉及本发明的一种内切葡聚糖酶变体，其中所述变体与SEQ ID NO:2具有至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列同一性。在另一个方面，变体在对应于以下位置的一个或多个(例如，若干个)位置处包含改变：SEQID NO:2的17、20、51、53、55、56、60、63、79、87、186、192、302、311、313、387、388、390、403、408、410、416、448、451、471、472、476、489、507、512、515、538、598、599、602、603、605、609、676、688、690、694、697、698、699、711、719、754、756、760、781、786、797、833、834、835、和1048，其中根据SEQ ID NO:2进行编号。
在实施例中，本发明的内切葡聚糖酶变体进一步包含选自下组的在一个或多个位置处的改变，该组由在以下位置处的改变组成：SEQ ID NO:2的216、283、346、559、564、579、636、638、651、824、848、869、880、881、883、887、892、905、906、912、921、928、934、937、948、956、999和1037。
在另一个方面，变体包含在对应于以下任何位置的两个位置处的改变：SEQ IDNO:2的17、20、51、53、55、56、60、63、79、87、186、192、302、311、313、387、388、390、403、408、410、416、448、451、471、472、476、489、507、512、515、538、598、599、602、603、605、609、676、688、690、694、697、698、699、711、719、754、756、760、781、786、797、833、834、835、和1048，其中根据SEQ ID NO:2进行编号。在实施例中，本发明的内切葡聚糖酶变体进一步包含选自下组的在一个或多个位置处的改变，该组由在以下位置处的改变组成：SEQ ID NO:2的216、283、346、559、564、579、636、638、651、824、848、869、880、881、883、887、892、905、906、912、921、928、934、937、948、956、999和1037。
在另一个方面，变体包含在对应于以下任何位置的三个位置处的改变：SEQ IDNO:2的17、20、51、53、55、56、60、63、79、87、186、192、302、311、313、387、388、390、403、408、410、416、448、451、471、472、476、489、507、512、515、538、598、599、602、603、605、609、676、688、690、694、697、698、699、711、719、754、756、760、781、786、797、833、834、835、和1048，其中根据SEQ ID NO:2进行编号。在一个实施例中，本发明的内切葡聚糖酶变体进一步包含选自下组的在一个或多个位置处的改变，该组由在以下位置处的改变组成：SEQ ID NO:2的216、283、346、559、564、579、636、638、651、824、848、869、880、881、883、887、892、905、906、912、921、928、934、937、948、956、999和1037。
因此，在一个实施例中，该变体包含在对应于以下位置的位置处的改变：17+20、17+51、17+53、17+55、17+56、17+60、17+63、17+79、17+87、17+192、17+302、7+387、17+388、17+390、17+403、17+408、17+410、17+416、17+448、17+451、17+471、17+472、17+507、17+512、17+515、17+538、17+598、17+602、17+605、17+609、17+676、17+694、17+698、17+699、17+711、17+754、17+760、17+781、17+786、17+797、17+834、17+835、20+51、20+53、20+55、20+56、20+60、20+63、20+79、20+87、20+192、20+302、20+387、20+388、20+390、20+403、20+408、20+410、20+416、20+448、20+451、20+471、20+472、20+507、20+512、20+515、20+538、20+598、20+602、20+605、20+609、20+676、20+694、20+698、20+699、20+711、20+754、20+760、20+781、20+786、20+797、20+834、20+835、51+53、51+55、51+56、51+60、51+63、51+79、51+87、51+192、51+302、51+387、51+388、51+390、51+403、51+408、51+410、51+416、51+448、51+451、51+471、51+472、51+507、51+512、51+515、51+538、51+598、51+602、51+605、51+609、51+676、51+694、51+698、51+699、51+711、51+754、51+760、51+781、51+786、51+797、51+834、51+835、53+55、53+56、53+60、53+63、53+79、53+87、53+192、53+302、53+387、53+388、53+390、53+403、53+408、53+410、53+416、53+448、53+451、53+471、53+472、53+507、53+512、53+515、53+538、53+598、53+602、53+605、53+609、3+676、53+694、53+698、53+699、53+711、53+754、53+760、53+781、53+786、53+797、53+834、53+835、55+56、55+60、55+63、55+79、55+87、55+192、55+302、55+387、55+388、55+390、55+403、55+408、55+410、55+416、55+448、55+451、55+471、55+472、55+507、55+512、55+515、55+538、55+598、55+602、55+605、55+609、55+676、55+694、55+698、55+699、55+711、55+754、55+760、55+781、55+786、55+797、55+834、55+835、56+60、56+63、56+79、56+87、56+192、56+302、56+387、56+388、56+390、56+403、56+408、56+410、56+416、56+448、56+451、56+471、56+472、56+507、56+512、56+515、56+538、56+598、56+602、56+605、56+609、56+676、56+694、56+698、56+699、56+711、56+754、56+760、56+781、56+786、56+797、56+834、56+835、60+63、60+79、60+87、60+192、60+302、60+387、60+388、60+390、60+403、60+408、60+410、60+416、60+448、60+451、60+471、60+472、60+507、60+512、60+515、60+538、60+598、60+602、60+605、60+609、60+676、60+694、60+698、60+699、60+711、60+754、60+760、60+781、60+786、60+797、60+834、60+835、63+79、63+87、63+192、63+302、63+387、63+388、63+390、63+403、63+408、63+410、63+416、63+448、63+451、63+471、63+472、63+507、63+512、63+515、63+538、63+598、63+602、63+605、63+609、63+676、63+694、63+698、63+699、63+711、63+754、63+760、63+781、63+786、63+797、63+834、63+835、79+87、79+192、79+302、79+387、79+388、79+390、79+403、79+408、79+410、79+416、79+448、79+451、79+471、79+472、79+507、79+512、79+515、79+538、79+598、79+602、79+605、79+609、79+676、79+694、79+698、79+699、79+711、79+754、79+760、79+781、79+786、79+797、79+834、79+835、87+192、87+302、87+387、87+388、87+390、87+403、87+408、87+410、87+416、87+448、87+451、87+471、87+472、87+507、87+512、87+515、87+538、87+598、87+602、87+605、87+609、87+676、87+694、87+698、87+699、87+711、87+754、87+760、87+781、87+786、87+797、87+834、87+835、192+302、192+387、192+388、192+390、192+403、192+408、192+410、192+416、192+448、192+451、192+471、192+472、192+507、192+512、192+515、192+538、192+598、192+602、192+605、192+609、192+676、192+694、192+698、192+699、192+711、192+754、192+760、192+781、192+786、192+797、192+834、192+835、302+387、302+388、302+390、302+403、302+408、302+410、302+416、302+448、302+451、302+471、302+472、302+507、302+512、302+515、302+538、302+598、302+602、302+605、302+609、302+676、302+694、302+698、302+699、302+711、302+754、302+760、302+781、302+786、302+797、302+834、302+835、387+388、387+390、387+403、387+408、387+410、387+416、387+448、387+451、387+471、387+472、387+507、387+512、387+515、387+538、387+598、387+602、387+605、87+609、387+676、387+694、387+698、387+699、387+711387+754、387+760、387+781、387+786、387+797、387+834、387+835、388+390、388+403、388+408、388+410、388+416、388+448、388+451、388+471、388+472、388+507、388+512、388+515、388+538、388+598、388+602、388+605、388+609、388+676、388+694、388+698、388+699、388+711、388+754、388+760、388+781、388+786、388+797、388+834、388+835、390+403、390+408、390+410、390+416、390+448、390+451、390+471、390+472、390+507、390+512、390+515、390+538、390+598、390+602、390+605、390+609、390+676、390+694、390+698、390+699、390+711、390+754、390+760、390+781、390+786、390+797、390+834、390+835、403+408、403+410、403+416、403+448、403+451、403+471、403+472、403+507、403+512、403+515、403+538、403+598、403+602、403+605、403+609、403+676、403+694、403+698、403+699、403+711、403+754、403+760、403+781、403+786、403+797、403+834、403+835、408+410、408+416、408+448、408+451、408+471、408+472、408+507、408+512、408+515、408+538、408+598、408+602、408+605、408+609、408+676、408+694、408+698、408+699、408+711、408+754、408+760、408+781、408+786、408+797、408+834、408+835、410+416、410+448、410+451、410+471、410+472、410+507、410+512、410+515、410+538、410+598、410+602、410+605、410+609、410+676、410+694、410+698、410+699、410+711、410+754、410+760、410+781、410+786、410+797、410+834、410+835、416+448、416+451、416+471、416+472、416+507、416+512、416+515、416+538、416+598、416+602、416+605、416+609、416+676、416+694、416+698、416+699、416+711、416+754、416+760、416+781、416+786、416+797、416+834、416+835、448+451、448+471、448+472、448+507、448+512、448+515、448+538、448+598、448+602、448+605、448+609、448+676、448+694、448+698、448+699、448+711、448+754、448+760、448+781、448+786、448+797、448+834、448+835、451+471、451+472、451+507、451+512、451+515、451+538、451+598、451+602、451+605、451+609、451+676、451+694、451+698、451+699、451+711、451+754、451+760、451+781、451+786、451+797、451+834、451+835、471+472、471+507、471+512、471+515、471+538、471+598、471+602、471+605、471+609、471+676、471+694、471+698、471+699、471+711、471+754、471+760、471+781、471+786、471+797、471+834、471+835、472+507、472+512、472+515、472+538、472+598、472+602、472+605、472+609、472+676、472+694、472+698、472+699、472+711、472+754、472+760、472+781、472+786、472+797、472+834、472+835、507+512、507+515、507+538、507+598、507+602、507+605、507+609、507+676、507+694、507+698、507+699、507+711、507+754、507+760、507+781、507+786、507+797、507+834、507+835、512+515、512+538、512+598、512+602、512+605、512+609、512+676、512+694、512+698、512+699、512+711、512+754、512+760、512+781、512+786、512+797、512+834、512+835、515+538、515+598、515+602、515+605、515+609、515+676、515+694、515+698、515+699、515+711、515+754、515+760、515+781、515+786、515+797、515+834、515+835、538+598、538+602、538+605、538+609、538+676、538+694、538+698、538+699、538+711、538+754、538+760、538+781、538+786、538+797、538+834、538+835、598+602、598+605、598+609、598+676、598+694、598+698、598+699、598+711、598+754、598+760、598+781、598+786、598+797、598+834、598+835、602+605、602+609、602+676、602+694、602+698、602+699、602+711、602+754、602+760、602+781、602+786、602+797、602+834、602+835、605+609、605+676、605+694、605+698、605+699、605+711、605+754、605+760、605+781、605+786、605+797、605+834、605+835、609+676、609+694、609+698、609+699、609+711、609+754、609+760、609+781、609+786、609+797、609+834、609+835、676+694、676+698、676+699、676+711、676+754、676+760、676+781、676+786、676+797、676+834、676+835、694+698、694+699、694+711、694+754、694+760、694+781、694+786、694+797、694+834、694+835、698+699、698+711、698+754、698+760、698+781、698+786、698+797、698+834、698+835、699+711、699+754、699+760、699+781、699+786、699+797、699+834、699+835、711+754、711+760、711+781、711+786、711+797、711+834、711+835、754+760、754+781、754+786、754+797、754+834、754+835 760+781、760+786、760+797、760+834、760+835、781+786、781+797、781+834、781+835、786+797、786+834、786+835、797+834、797+835、834+835、17+20+51、17+20+53、17+20+55、17+20+56、17+20+60、17+20+63、17+20+79、17+20+87、17+20+192、17+20+302、17+20+387、17+20+388、17+20+390、17+20+403、17+20+408、17+20+410、17+20+416、17+20+448、17+20+451、17+20+471、7+20+472、17+20+507、17+20+512、17+20+515、17+20+538、17+20+598、17+20+602、17+20+605、17+20+609、17+20+676、17+20+694、17+20+698、17+20+699、17+20+711、17+20+754、17+20+760、17+20+781、17+20+786、17+20+797、17+20+834、17+20+835、17+51+53、17+51+55、17+51+56、17+51+60、17+51+63、17+51+79、17+51+87、17+51+192、17+51+302、17+51+387、17+51+388、17+51+390、17+51+403、17+51+408、17+51+410、17+51+416、17+51+448、17+51+451、17+51+471、17+51+472、17+51+507、17+51+512、17+51+515、17+51+538、17+51+598、17+51+602、17+51+605、17+51+609、17+51+676、17+51+694、17+51+698、17+51+699、17+51+711、17+51+754、17+51+760、17+51+781、17+51+786、17+51+797、17+51+834、17+51+835、17+53+55、17+53+56、17+53+60、17+53+63、17+53+79、17+53+87、17+53+192、17+53+302、17+53+387、17+53+388、17+53+390、17+53+403、17+53+408、17+53+410、17+53+416、17+53+448、17+53+451、17+53+471、17+53+472、17+53+507、17+53+512、17+53+515、17+53+538、17+53+598、17+53+602、17+53+605、17+53+609、17+53+676、17+53+694、17+53+698、17+53+699、17+53+711、17+53+754、17+53+760、17+53+781、17+53+786、17+53+797、17+53+834、17+53+835、17+55+56、17+55+60、17+55+63、17+55+79、17+55+87、17+55+192、17+55+302、17+55+387、17+55+388、17+55+390、17+55+403、17+55+408、17+55+410、17+55+416、17+55+448、17+55+451、17+55+471、17+55+472、17+55+507、17+55+512、17+55+515、17+55+538、17+55+598、17+55+602、17+55+605、17+55+609、17+55+676、17+55+694、17+55+698、17+55+699、17+55+711、17+55+754、17+55+760、17+55+781、17+55+786、17+55+797、17+55+834、17+55+835、17+56+60、17+56+63、17+56+79、17+56+87、17+56+192、17+56+302、17+56+387、17+56+388、17+56+390、17+56+403、17+56+408、17+56+410、17+56+416、17+56+448、17+56+451、17+56+471、17+56+472、17+56+507、17+56+512、17+56+515、17+56+538、17+56+598、17+56+602、17+56+605、17+56+609、17+56+676、17+56+694、17+56+698、17+56+699、17+56+711、17+56+754、17+56+760、17+56+781、17+56+786、17+56+797、17+56+834、17+56+835、17+60+63、17+60+79、17+60+87、17+60+192、17+60+302、17+60+387、17+60+388、17+60+390、17+60+403、17+60+408、17+60+410、17+60+416、17+60+448、17+60+451、17+60+471、17+60+472、17+60+507、17+60+512、17+60+515、17+60+538、17+60+598、17+60+602、17+60+605、17+60+609、17+60+676、17+60+694、17+60+698、17+60+699、17+60+711、17+60+754、17+60+760、17+60+781、17+60+786、17+60+797、17+60+834、17+60+835、17+63+79、17+63+87、17+63+192、17+63+302、17+63+387、17+63+388、17+63+390、17+63+403、17+63+408、17+63+410、17+63+416、17+63+448、17+63+451、17+63+471、17+63+472、17+63+507、17+63+512、17+63+515、17+63+538、17+63+598、17+63+602、17+63+605、17+63+609、17+63+676、17+63+694、17+63+698、17+63+699、17+63+711、17+63+754、17+63+760、17+63+781、17+63+786、17+63+797、17+63+834、17+63+835、17+79+87、17+79+192、17+79+302、17+79+387、17+79+388、17+79+390、17+79+403、17+79+408、17+79+410、17+79+416、17+79+448、17+79+451、17+79+471、17+79+472、17+79+507、17+79+512、17+79+515、17+79+538、17+79+598、17+79+602、17+79+605、17+79+609、17+79+676、17+79+694、17+79+698、17+79+699、17+79+711、17+79+754、17+79+760、17+79+781、17+79+786、17+79+797、17+79+834、17+79+835、17+87+192、17+87+302、17+87+387、17+87+388、17+87+390、17+87+403、17+87+408、17+87+410、17+87+416、17+87+448、17+87+451、17+87+471、17+87+472、17+87+507、17+87+512、17+87+515、17+87+538、17+87+598、17+87+602、17+87+605、17+87+609、17+87+676、17+87+694、17+87+698、17+87+699、17+87+711、17+87+754、17+87+760、17+87+781、17+87+786、17+87+797、17+87+834、17+87+835、17+192+302、17+192+387、17+192+388、17+192+390、17+192+403、17+192+408、17+192+410、17+192+416、17+192+448、17+192+451、17+192+471、17+192+472、17+192+507、17+192+512、17+192+515、17+192+538、17+192+598、17+192+602、17+192+605、17+192+609、17+192+676、17+192+694、17+192+698、17+192+699、17+192+711、17+192+754、17+192+760、17+192+781、17+192+786、17+192+797、17+192+834、17+192+835、17+302+387、17+302+388、17+302+390、17+302+403、17+302+408、17+302+410、17+302+416、17+302+448、17+302+451、17+302+471、17+302+472、17+302+507、17+302+512、17+302+515、17+302+538、17+302+598、17+302+602、17+302+605、17+302+609、17+302+676、17+302+694、17+302+698、17+302+699、17+302+711、17+302+754、17+302+760、17+302+781、17+302+786、17+302+797、17+302+834、17+302+835、17+387+388、17+387+390、17+387+403、17+387+408、17+387+410、17+387+416、17+387+448、17+387+451、17+387+471、17+387+472、17+387+507、17+387+512、17+387+515、17+387+538、17+387+598、17+387+602、17+387+605、17+387+609、17+387+676、17+387+694、17+387+698、17+387+699、17+387+711、17+387+754、17+387+760、17+387+781、17+387+786、17+387+797、17+387+834、17+387+835、17+388+390、17+388+403、17+388+408、17+388+410、17+388+416、17+388+448、17+388+451、17+388+471、17+388+472、17+388+507、17+388+512、17+388+515、17+388+538、17+388+598、17+388+602、17+388+605、17+388+609、17+388+676、17+388+694、17+388+698、17+388+699、17+388+711、17+388+754、17+388+760、17+388+781、17+388+786、17+388+797、17+388+834、17+388+835、17+390+403、17+390+408、17+390+410、17+390+416、17+390+448、17+390+451、17+390+471、17+390+472、17+390+507、17+390+512、17+390+515、17+390+538、17+390+598、17+390+602、17+390+605、17+390+609、17+390+676、17+390+694、17+390+698、17+390+699、17+390+711、17+390+754、17+390+760、17+390+781、17+390+786、17+390+797、17+390+834、17+390+835、17+403+408、17+403+410、17+403+416、17+403+448、17+403+451、17+403+471、17+403+472、17+403+507、17+403+512、17+403+515、17+403+538、17+403+598、17+403+602、17+403+605、17+403+609、17+403+676、17+403+694、17+403+698、17+403+699、17+403+711、17+403+754、17+403+760、17+403+781、17+403+786、17+403+797、17+403+834、17+403+835、17+408+410、17+408+416、17+408+448、17+408+451、17+408+471、17+408+472、17+408+507、17+408+512、17+408+515、17+408+538、17+408+598、17+408+602、17+408+605、17+408+609、17+408+676、17+408+694、17+408+698、17+408+699、17+408+711、17+408+754、17+408+760、17+408+781、17+408+786、17+408+797、17+408+834、17+408+835、17+410+416、17+410+448、17+410+451、17+410+471、17+410+472、17+410+507、17+410+512、17+410+515、17+410+538、17+410+598、17+410+602、17+410+605、17+410+609、17+410+676、17+410+694、17+410+698、17+410+699、17+410+711、17+410+754、17+410+760、17+410+781、17+410+786、17+410+797、17+410+834、17+410+835、17+416+448、17+416+451、17+416+471、17+416+472、17+416+507、17+416+512、17+416+515、17+416+538、17+416+598、17+416+602、17+416+605、17+416+609、17+416+676、17+416+694、17+416+698、17+416+699、7+416+711、17+416+754、17+416+760、17+416+781、17+416+786、17+416+797、17+416+834、17+416+835、17+448+451、17+448+471、17+448+472、17+448+507、17+448+512、17+448+515、17+448+538、17+448+598、17+448+602、17+448+605、17+448+609、17+448+676、17+448+694、17+448+698、17+448+699、17+448+711、17+448+754、17+448+760、17+448+781、17+448+786、17+448+797、17+448+834、17+448+835、17+451+471、17+451+472、17+451+507、17+451+512、17+451+515、17+451+538、17+451+598、17+451+602、17+451+605、17+451+609、17+451+676、17+451+694、17+451+698、17+451+699、17+451+711、17+451+754、17+451+760、17+451+781、17+451+786、17+451+797、17+451+834、17+451+835、17+471+472、17+471+507、17+471+512、17+471+515、17+471+538、17+471+598、17+471+602、17+471+605、17+471+609、17+471+676、17+471+694、17+471+698、17+471+699、17+471+711、17+471+754、17+471+760、17+471+781、17+471+786、17+471+797、17+471+834、17+471+835、17+472+507、17+472+512、17+472+515、17+472+538、17+472+598、17+472+602、17+472+605、17+472+609、17+472+676、17+472+694、17+472+698、17+472+699、17+472+711、17+472+754、17+472+760、17+472+781、17+472+786、17+472+797、17+472+834、17+472+835、17+507+512、17+507+515、17+507+538、17+507+598、17+507+602、17+507+605、17+507+609、17+507+676、17+507+694、17+507+698、17+507+699、17+507+711、17+507+754、17+507+760、17+507+781、17+507+786、17+507+797、17+507+834、17+507+835、17+512+515、17+512+538、17+512+598、17+512+602、17+512+605、17+512+609、17+512+676、17+512+694、17+512+698、17+512+699、17+512+711、17+512+754、17+512+760、17+512+781、17+512+786、17+512+797、17+512+834、17+512+835、17+515+538、17+515+598、17+515+602、17+515+605、17+515+609、17+515+676、17+515+694、17+515+698、17+515+699、17+515+711、17+515+754、17+515+760、17+515+781、17+515+786、17+515+797、17+515+834、17+515+835、17+538+598、17+538+602、17+538+605、17+538+609、17+538+676、17+538+694、17+538+698、17+538+699、17+538+711、17+538+754、17+538+760、17+538+781、17+538+786、17+538+797、17+538+834、17+538+835、17+598+602、17+598+605、17+598+609、17+598+676、17+598+694、17+598+698、17+598+699、17+598+711、17+598+754、17+598+760、17+598+781、17+598+786、17+598+797、17+598+834、17+598+835、17+602+605、17+602+609、17+602+676、17+602+694、17+602+698、17+602+699、17+602+711、17+602+754、17+602+760、17+602+781、17+602+786、17+602+797、17+602+834、17+602+835、17+605+609、17+605+676、17+605+694、17+605+698、17+605+699、17+605+711、17+605+754、17+605+760、17+605+781、17+605+786、17+605+797、17+605+834、17+605+835、17+609+676、17+609+694、17+609+698、17+609+699、17+609+711、17+609+754、17+609+760、17+609+781、17+609+786、17+609+797、17+609+834、17+609+835、17+676+694、17+676+698、17+676+699、17+676+711、17+676+754、17+676+760、17+676+781、17+676+786、17+676+797、17+676+834、17+676+835、17+694+698、17+694+699、17+694+711、17+694+754、17+694+760、17+694+781、17+694+786、17+694+797、17+694+834、17+694+835、17+698+699、17+698+711、17+698+754、17+698+760、17+698+781、17+698+786、17+698+797、17+698+834、17+698+835、17+699+711、17+699+754、17+699+760、17+699+781、17+699+786、17+699+797、17+699+834、17+699+835、17+711+754、17+711+760、17+711+781、17+711+786、17+711+797、17+711+834、17+711+835、17+754+760、17+754+781、17+754+786、17+754+797、17+754+834、17+754+835、17+760+781、17+760+786、17+760+797、17+760+834、17+760+835、17+781+786、17+781+797、17+781+834、17+781+835、17+786+797、17+786+834、17+786+835、17+797+834、17+797+835、17+834+835、20+51+53、20+51+55、20+51+56、20+51+60、20+51+63、20+51+79、20+51+87、20+51+192、20+51+302、20+51+387、20+51+388、20+51+390、20+51+403、20+51+408、20+51+410、20+51+416、20+51+448、20+51+451、20+51+471、20+51+472、20+51+507、20+51+512 20+51+515、20+51+538、20+51+598、20+51+602、20+51+605、20+51+609、20+51+676、20+51+694、20+51+698、20+51+699、20+51+711、20+51+754、20+51+760、20+51+781、20+51+786、20+51+797、20+51+834、20+51+835、20+53+55、20+53+56、20+53+60、20+53+63、20+53+79、20+53+87、20+53+192、20+53+302、20+53+387、20+53+388、20+53+390、20+53+403、20+53+408、20+53+410、20+53+416、20+53+448、20+53+451、20+53+471、20+53+472、20+53+507、20+53+512、20+53+515、20+53+538、20+53+598、20+53+602、20+53+605、20+53+609、20+53+676、20+53+694、20+53+698、20+53+699、20+53+711、20+53+754、20+53+760、20+53+781、20+53+786、20+53+797、20+53+834、20+53+835、20+55+56、20+55+60、20+55+63、20+55+79、20+55+87、20+55+192、20+55+302、20+55+387、20+55+388、20+55+390、20+55+403、20+55+408、20+55+410、20+55+416、20+55+448、20+55+451 20+55+471、20+55+472、20+55+507、20+55+512、20+55+515、20+55+538、20+55+598、20+55+602、20+55+605、20+55+609、20+55+676、20+55+694、20+55+698、20+55+699、20+55+711、20+55+754、20+55+760、20+55+781、20+55+786、20+55+797、20+55+834、20+55+835、20+56+60、20+56+63、20+56+79、20+56+87、20+56+192、20+56+302、20+56+387、20+56+388、20+56+390、20+56+403、20+56+408、20+56+410、20+56+416、20+56+448、20+56+451、20+56+471、20+56+472、20+56+507、20+56+512、20+56+515、20+56+538、20+56+598、20+56+602、20+56+605、20+56+609、20+56+676、20+56+694、20+56+698、20+56+699、20+56+711、20+56+754、20+56+760、20+56+781、、+56+786、20+56+797、20+56+834、20+56+835、20+60+63、20+60+79、20+60+87、20+60+192、20+60+302、20+60+387、20+60+388、20+60+390、20+60+403、20+60+408、20+60+410、20+60+416、20+60+448、20+60+451、20+60+471、20+60+472、20+60+507、20+60+512、20+60+515、20+60+538、20+60+598、20+60+602、20+60+605、20+60+609、20+60+676、20+60+694、20+60+698、20+60+699、20+60+711、20+60+754、20+60+760、20+60+781、20+60+786、20+60+797、20+60+834、20+60+835、20+63+79、、20+63+87、20+63+192、20+63+302、20+63+387、20+63+388、20+63+390、20+63+403、20+63+408、20+63+410、20+63+416、20+63+448、20+63+451、20+63+471、20+63+472、20+63+507、20+63+512、20+63+515、20+63+538、20+63+598、20+63+602、20+63+605、20+63+609、20+63+676、20+63+694、20+63+698、20+63+699、20+63+711、20+63+754、20+63+760、20+63+781、20+63+786、20+63+797、20+63+834、20+63+835、20+79+87、20+79+192、20+79+302、20+79+387、20+79+388、20+79+390、20+79+403、20+79+408、20+79+410、20+79+416、20+79+448、20+79+451、20+79+471、20+79+472、20+79+507、20+79+512、20+79+515、20+79+538、20+79+598、20+79+602、20+79+605、20+79+609、20+79+676、20+79+694、20+79+698、20+79+699、20+79+711、20+79+754、20+79+760、20+79+781、20+79+786、20+79+797、20+79+834、20+79+835、20+87+192、20+87+302、20+87+387、20+87+388、20+87+390、20+87+403、20+87+408、20+87+410、20+87+416、20+87+448、20+87+451、20+87+471、20+87+472、20+87+507、20+87+512、20+87+515、20+87+538、20+87+598、20+87+602、20+87+605、20+87+609、20+87+676、20+87+694、20+87+698、20+87+699、20+87+711、20+87+754、20+87+760、20+87+781、20+87+786、20+87+797、20+87+834、20+87+835、20+192+302、20+192+387、20+192+388、20+192+390、20+192+403、20+192+408、20+192+410、20+192+416、20+192+448、20+192+451、20+192+471、20+192+472、20+192+507、20+192+512、20+192+515、20+192+538、20+192+598、20+192+602、20+192+605、20+192+609、20+192+676、20+192+694、20+192+698、20+192+699 20+192+711、20+192+754、20+192+760、20+192+781、20+192+786、20+192+797、20+192+834、20+192+835、20+302+387、20+302+388、20+302+390、20+302+403、20+302+408、20+302+410、20+302+416、20+302+448、20+302+451、20+302+471、20+302+472、20+302+507、20+302+512、20+302+515、20+302+538、20+302+598、20+302+602、20+302+605、20+302+609、20+302+676、20+302+694、20+302+698、20+302+699、20+302+711、20+302+754、20+302+760、20+302+781、20+302+786、20+302+797、20+302+834、20+302+835、20+387+388、20+387+390、20+387+403、20+387+408、20+387+410、20+387+416、20+387+448、20+387+451、20+387+471、20+387+472、20+387+507、20+387+512、20+387+515、20+387+538、20+387+598、20+387+602、20+387+605、20+387+609、20+387+676、20+387+694、20+387+698、20+387+699、20+387+711、20+387+754、20+387+760、20+387+781、20+387+786、20+387+797、20+387+834、20+387+835、20+388+390、20+388+403、20+388+408、20+388+410、20+388+416、20+388+448、20+388+451、20+388+471、20+388+472、20+388+507、20+388+512、20+388+515、20+388+538、20+388+598、20+388+602、20+388+605、20+388+609、20+388+676、20+388+694、20+388+698、20+388+699、20+388+711、20+388+754、20+388+760、20+388+781、20+388+786、20+388+797、20+388+834、20+388+835、20+390+403、20+390+408、20+390+410、20+390+416、20+390+448、20+390+451、20+390+471、20+390+472、20+390+507、20+390+512、20+390+515、20+390+538、20+390+598、20+390+602、20+390+605、20+390+609、20+390+676、20+390+694、20+390+698、20+390+699、20+390+711、20+390+754、20+390+760、20+390+781、20+390+786、20+390+797、20+390+834、20+390+835、20+403+408、20+403+410、20+403+416、20+403+448、20+403+451、20+403+471、20+403+472、20+403+507、20+403+512、20+403+515、20+403+538、20+403+598、20+403+602、20+403+605、20+403+609、20+403+676、20+403+694、20+403+698、20+403+699、20+403+711、20+403+754、20+403+760、20+403+781、20+403+786、20+403+797、20+403+834、20+403+835、20+408+410、20+408+416、20+408+448、20+408+451、20+408+471、20+408+472、20+408+507、20+408+512、20+408+515、20+408+538、20+408+598、20+408+602、20+408+605、20+408+609、20+408+676、20+408+694、20+408+698、20+408+699、20+408+711、20+408+754、20+408+760、20+408+781、20+408+786、20+408+797、20+408+834、20+408+835、20+410+416、20+410+448、20+410+451、20+410+471、20+410+472、20+410+507、20+410+512、20+410+515、20+410+538、20+410+598、20+410+602、20+410+605、20+410+609、20+410+676、20+410+694、20+410+698、20+410+699、20+410+711、20+410+754、20+410+760、20+410+781、20+410+786、20+410+797、20+410+834、20+410+835、20+416+448、20+416+451、20+416+471、20+416+472、20+416+507、20+416+512、20+416+515、20+416+538、20+416+598、20+416+602、20+416+605、20+416+609、20+416+676、20+416+694、20+416+698、20+416+699、20+416+711、20+416+754、20+416+760、20+416+781、20+416+786、20+416+797、20+416+834、20+416+835、20+448+451、20+448+471、20+448+472、20+448+507、20+448+512、20+448+515、20+448+538、20+448+598、20+448+602、20+448+605、20+448+609、20+448+676、20+448+694、20+448+698、20+448+699、20+448+711、20+448+754、20+448+760、20+448+781、20+448+786、20+448+797、20+448+834、20+448+835、20+451+471、20+451+472、20+451+507、20+451+512、20+451+515、20+451+538、20+451+598、20+451+602、20+451+605、20+451+609、20+451+676、20+451+694、20+451+698、20+451+699、20+451+711、20+451+754、20+451+760、20+451+781、20+451+786、20+451+797、20+451+834、20+451+835、20+471+472、20+471+507、20+471+512、20+471+515、20+471+538、20+471+598、20+471+602、20+471+605、20+471+609、20+471+676、20+471+694、20+471+698、20+471+699、20+471+711、20+471+754、20+471+760、20+471+781、20+471+786、20+471+797、20+471+834、20+471+835、20+472+507、20+472+512、20+472+515、20+472+538、20+472+598、20+472+602、20+472+605、20+472+609、20+472+676、20+472+694、20+472+698、20+472+699、20+472+711、20+472+754、20+472+760、20+472+781、20+472+786、20+472+797、20+472+834、20+472+835、20+507+512、20+507+515、20+507+538、20+507+598、20+507+602、20+507+605、20+507+609、20+507+676、20+507+694、20+507+698、20+507+699、20+507+711、20+507+754、20+507+760、20+507+781、20+507+786、20+507+797、20+507+834、20+507+835、20+512+515、20+512+538、20+512+598、20+512+602、20+512+605、20+512+609、20+512+676、20+512+694、20+512+698、20+512+699、20+512+711、20+512+754、20+512+760、20+512+781、20+512+786、20+512+797、20+512+834、20+512+835、20+515+538、20+515+598、20+515+602、20+515+605、20+515+609、20+515+676、20+515+694、20+515+698、20+515+699、20+515+711、20+515+754、20+515+760、20+515+781、20+515+786、20+515+797、20+515+834、20+515+835、20+538+598、20+538+602、20+538+605、20+538+609、20+538+676、20+538+694、20+538+698、20+538+699、20+538+711、20+538+754、20+538+760、20+538+781、20+538+786、20+538+797、20+538+834、20+538+835、20+598+602、20+598+605、20+598+609、20+598+676、20+598+694、20+598+698、20+598+699、20+598+711、20+598+754、20+598+760、20+598+781、20+598+786、20+598+797、20+598+834、20+598+835、20+602+605、20+602+609、20+602+676、20+602+694、20+602+698、20+602+699、20+602+711、20+602+754、20+602+760、20+602+781、20+602+786、20+602+797、20+602+834、20+602+835、20+605+609、20+605+676、20+605+694、20+605+698、20+605+699、20+605+711、20+605+754、20+605+760、20+605+781、20+605+786、20+605+797、20+605+834、20+605+835、20+609+676、20+609+694、20+609+698、20+609+699、20+609+711、20+609+754、20+609+760、20+609+781、20+609+786、20+609+797、20+609+834、20+609+835、20+676+694、20+676+698、20+676+699、20+676+711、20+676+754、20+676+760、20+676+781、20+676+786、20+676+797、20+676+834、20+676+835、20+694+698、20+694+699、20+694+711、20+694+754、20+694+760、20+694+781、20+694+786、20+694+797、20+694+834、20+694+835、20+698+699、20+698+711、20+698+754、20+698+760、20+698+781、20+698+786、20+698+797、20+698+834、20+698+835、20+699+711、20+699+754、20+699+760、20+699+781、20+699+786、20+699+797、20+699+834、20+699+835、20+711+754、20+711+760、20+711+781、20+711+786、20+711+797、20+711+834、20+711+835、20+754+760、20+754+781、20+754+786、20+754+797、20+754+834、20+754+835、20+760+781、20+760+786、20+760+797、20+760+834、20+760+835、20+781+786、20+781+797、20+781+834、20+781+835、20+786+797、20+786+834、20+786+835、20+797+834、20+797+835、20+834+835、51+53+55、51+53+56、51+53+60、51+53+63、51+53+79 51+53+87、51+53+192、51+53+302、51+53+387、51+53+388、51+53+390、51+53+403、51+53+408、51+53+410、51+53+416、51+53+448、51+53+451、51+53+471、51+53+472、51+53+507、51+53+512、51+53+515、51+53+538、51+53+598、51+53+602、51+53+605、51+53+609、51+53+676、51+53+694、51+53+698、51+53+699、51+53+711、51+53+754、51+53+760、51+53+781、51+53+786、51+53+797、51+53+834、51+53+835、51+55+56、51+55+60、51+55+63、51+55+79、51+55+87、51+55+192、51+55+302、51+55+387、51+55+388、51+55+390、51+55+403、51+55+408、51+55+410、51+55+416、51+55+448、51+55+451、51+55+471、51+55+472、51+55+507、51+55+512、51+55+515、51+55+538、51+55+598、51+55+602、51+55+605、51+55+609、51+55+676、51+55+694、51+55+698、51+55+699、51+55+711、51+55+754、51+55+760、51+55+781、51+55+786、51+55+797、51+55+834、51+55+835、51+56+60、51+56+63、51+56+79、51+56+87、51+56+192、51+56+302、51+56+387、51+56+388、51+56+390、51+56+403、51+56+408、51+56+410、51+56+416、51+56+448、51+56+451、51+56+471、51+56+472、51+56+507、51+56+512、51+56+515、51+56+538、51+56+598、51+56+602、51+56+605、51+56+609、51+56+676、51+56+694、51+56+698、51+56+699、51+56+711、51+56+754、51+56+760、51+56+781、51+56+786、51+56+797、51+56+834、51+56+835、51+60+63、51+60+79、51+60+87、51+60+192、51+60+302、51+60+387、51+60+388、51+60+390、51+60+403、51+60+408、51+60+410、51+60+416、51+60+448、51+60+451、51+60+471、51+60+472、51+60+507、51+60+512、51+60+515、51+60+538、51+60+598、51+60+602、51+60+605、51+60+609、51+60+676、51+60+694、51+60+698、51+60+699、51+60+711、51+60+754、51+60+760、51+60+781、51+60+786、51+60+797、51+60+834、51+60+835、51+63+79、51+63+87、51+63+192、51+63+302、51+63+387、51+63+388、51+63+390、51+63+403、51+63+408、51+63+410、51+63+416、51+63+448、51+63+451、51+63+471、51+63+472、51+63+507、51+63+512、51+63+515、51+63+538、51+63+598、51+63+602、51+63+605、51+63+609、51+63+676、51+63+694、51+63+698、51+63+699、51+63+711、51+63+754、51+63+760、51+63+781、51+63+786、51+63+797、51+63+834、51+63+835、51+79+87、51+79+192、51+79+302、51+79+387、51+79+388、51+79+390、51+79+403、51+79+408、51+79+410、51+79+416、51+79+448、51+79+451、51+79+471、51+79+472、51+79+507、51+79+512、51+79+515、51+79+538、51+79+598、51+79+602、51+79+605、51+79+609、51+79+676、51+79+694、51+79+698、51+79+699、51+79+711、51+79+754、51+79+760、51+79+781、51+79+786、51+79+797、51+79+834、51+79+835、51+87+192、51+87+302、51+87+387、51+87+388、51+87+390、51+87+403、51+87+408、51+87+410、51+87+416、51+87+448、51+87+451、51+87+471、51+87+472、51+87+507、51+87+512、51+87+515、51+87+538、51+87+598、51+87+602、51+87+605、51+87+609、51+87+676、51+87+694、51+87+698、51+87+699、51+87+711、51+87+754、51+87+760、51+87+781、51+87+786、51+87+797、51+87+834、51+87+835、51+192+302、51+192+387、51+192+388、51+192+390、51+192+403、51+192+408、51+192+410、51+192+416、51+192+448、51+192+451、51+192+471、51+192+472、51+192+507、51+192+512、51+192+515、51+192+538、51+192+598、51+192+602、51+192+605、51+192+609、51+192+676、51+192+694、51+192+698、51+192+699、51+192+711、51+192+754、51+192+760、51+192+781、51+192+786、51+192+797、51+192+834、51+192+835、51+302+387、51+302+388、51+302+390、51+302+403、51+302+408、51+302+410、51+302+416、51+302+448、51+302+451、51+302+471、51+302+472、51+302+507、51+302+512、51+302+515、51+302+538、51+302+598、51+302+602、51+302+605、51+302+609、51+302+676、51+302+694、51+302+698、51+302+699、51+302+711、51+302+754、51+302+760、51+302+781、51+302+786、51+302+797、51+302+834、51+302+835、51+387+388、51+387+390、51+387+403、51+387+408、51+387+410、51+387+416、51+387+448、51+387+451、51+387+471、51+387+472、51+387+507、51+387+512、51+387+515、51+387+538、51+387+598、51+387+602、51+387+605、51+387+609、51+387+676、51+387+694、51+387+698、51+387+699、51+387+711、51+387+754、51+387+760、51+387+781、51+387+786、51+387+797、51+387+834、51+387+835、51+388+390、51+388+403、51+388+408、51+388+410、51+388+416、51+388+448、51+388+451、51+388+471、51+388+472、51+388+507、51+388+512、51+388+515、51+388+538、51+388+598、51+388+602、51+388+605、51+388+609、51+388+676、51+388+694、51+388+698、51+388+699、51+388+711、51+388+754、51+388+760、51+388+781、51+388+786、51+388+797、51+388+834、51+388+835、51+390+403、51+390+408、51+390+410、51+390+416、51+390+448、51+390+451、51+390+471、51+390+472、51+390+507、51+390+512、51+390+515、51+390+538、51+390+598、51+390+602、51+390+605、51+390+609、51+390+676、51+390+694、51+390+698、51+390+699、51+390+711、51+390+754、51+390+760、51+390+781、51+390+786、51+390+797、51+390+834、51+390+835、51+403+408、51+403+410、51+403+416、51+403+448、51+403+451、51+403+471、51+403+472、51+403+507、51+403+512、51+403+515、51+403+538、51+403+598、51+403+602、51+403+605、51+403+609、51+403+676、51+403+694、51+403+698、51+403+699、51+403+711、51+403+754、51+403+760、51+403+781、51+403+786、51+403+797、51+403+834、51+403+835、51+408+410、51+408+416、51+408+448、51+408+451、51+408+471、51+408+472、51+408+507、51+408+512、51+408+515、51+408+538、51+408+598、51+408+602、51+408+605、51+408+609、51+408+676、51+408+694、51+408+698、51+408+699、51+408+711、51+408+754、51+408+760、51+408+781、51+408+786、51+408+797、51+408+834、51+408+835、51+410+416、51+410+448、51+410+451、51+410+471、51+410+472、51+410+507、51+410+512、51+410+515、51+410+538、51+410+598、51+410+602、51+410+605、51+410+609、51+410+676、51+410+694、51+410+698、51+410+699、51+410+711、51+410+754、51+410+760、51+410+781、51+410+786、51+410+797、51+410+834、51+410+835、51+416+448、51+416+451、51+416+471、51+416+472、51+416+507、51+416+512、51+416+515、51+416+538、51+416+598、51+416+602、51+416+605、51+416+609、51+416+676、51+416+694、51+416+698、51+416+699、51+416+711、51+416+754、51+416+760、51+416+781、51+416+786、51+416+797、51+416+834、51+416+835、51+448+451、51+448+471、51+448+472、51+448+507、51+448+512、51+448+515、51+448+538、51+448+598、51+448+602、51+448+605、51+448+609、51+448+676、51+448+694、51+448+698、51+448+699、51+448+711、51+448+754、51+448+760、51+448+781、51+448+786、51+448+797、51+448+834、51+448+835、51+451+471、51+451+472、51+451+507、51+451+512、51+451+515、51+451+538、51+451+598、51+451+602、51+451+605、51+451+609、51+451+676、51+451+694、51+451+698、51+451+699、51+451+711、51+451+754、51+451+760、51+451+781、51+451+786、51+451+797、51+451+834、51+451+835、51+471+472、51+471+507、51+471+512、51+471+515、51+471+538、51+471+598、51+471+602、51+471+605、51+471+609、51+471+676、51+471+694、51+471+698、51+471+699、51+471+711、51+471+754、51+471+760、51+471+781、51+471+786、51+471+797、51+471+834、51+471+835、51+472+507、51+472+512、51+472+515、51+472+538、51+472+598、51+472+602、51+472+605、51+472+609、51+472+676、51+472+694、51+472+698、51+472+699、51+472+711、51+472+754、51+472+760、51+472+781、51+472+786、51+472+797、51+472+834、51+472+835、51+507+512、51+507+515、51+507+538、51+507+598、51+507+602、51+507+605、51+507+609、51+507+676、51+507+694、51+507+698、51+507+699、51+507+711、51+507+754、51+507+760、51+507+781、51+507+786、51+507+797、51+507+834、51+507+835、51+512+515、51+512+538、51+512+598、51+512+602、51+512+605、51+512+609、51+512+676、51+512+694、51+512+698、51+512+699、51+512+711、51+512+754、51+512+760、51+512+781、51+512+786、51+512+797、51+512+834、51+512+835、51+515+538、51+515+598、51+515+602、51+515+605、51+515+609、51+515+676、51+515+694、51+515+698、51+515+699、51+515+711、51+515+754、51+515+760、51+515+781、51+515+786、51+515+797、51+515+834、51+515+835、51+538+598、51+538+602、51+538+605、51+538+609、51+538+676、51+538+694、51+538+698、51+538+699、51+538+711、51+538+754、51+538+760、51+538+781、51+538+786、51+538+797、51+538+834、51+538+835、51+598+602、51+598+605 51+598+609、51+598+676、51+598+694、51+598+698、51+598+699、51+598+711、51+598+754、51+598+760、51+598+781 51+598+786、51+598+797、51+598+834、51+598+835、51+602+605、51+602+609、51+602+676、51+602+694、51+602+698、51+602+699、51+602+711、51+602+754、51+602+760、51+602+781、51+602+786、51+602+797、51+602+834、51+602+835、51+605+609、51+605+676、51+605+694、51+605+698、51+605+699、51+605+711、51+605+754、51+605+760、51+605+781、51+605+786、51+605+797、51+605+834、51+605+835、51+609+676、51+609+694、51+609+698、51+609+699、51+609+711、51+609+754、51+609+760、51+609+781、51+609+786、51+609+797、51+609+834、51+609+835、51+676+694、51+676+698、51+676+699、51+676+711、51+676+754、51+676+760、51+676+781、51+676+786、51+676+797、51+676+834、51+676+835、51+694+698、51+694+699、51+694+711、51+694+754、51+694+760、51+694+781、51+694+786、51+694+797、51+694+834、51+694+835、51+698+699、51+698+711、51+698+754、51+698+760、51+698+781、51+698+786、51+698+797、51+698+834、51+698+835、51+699+711、51+699+754、51+699+760、51+699+781、51+699+786、51+699+797、51+699+834、51+699+835、51+711+754、51+711+760、51+711+781、51+711+786、51+711+797、51+711+834、51+711+835、51+754+760、51+754+781、51+754+786、51+754+797、51+754+834、51+754+835、51+760+781、51+760+786、51+760+797、51+760+834、51+760+835、51+781+786、51+781+797、51+781+834、51+781+835、51+786+797、51+786+834、51+786+835、51+797+834、51+797+835、51+834+835、53+55+56、53+55+60、53+55+63、53+55+79、53+55+87、53+55+192、53+55+302、53+55+387、53+55+388、53+55+390、53+55+403、53+55+408、53+55+410、53+55+416、53+55+448、53+55+451、53+55+471、53+55+472、53+55+507、53+55+512、53+55+515、53+55+538、53+55+598、53+55+602、53+55+605、53+55+609、53+55+676、53+55+694、53+55+698、53+55+699、53+55+711、53+55+754、53+55+760、53+55+781、53+55+786、53+55+797、53+55+834、53+55+835、53+56+60、53+56+63、53+56+79、53+56+87、53+56+192、53+56+302、53+56+387、53+56+388、53+56+390、53+56+403、53+56+408、53+56+410、53+56+416、53+56+448、53+56+451、53+56+471、53+56+472、53+56+507、53+56+512、53+56+515、53+56+538、53+56+598、53+56+602、53+56+605、53+56+609、53+56+676、53+56+694、53+56+698、53+56+699、53+56+711、53+56+754、53+56+760、53+56+781、53+56+786、53+56+797、53+56+834、53+56+835、53+60+63、53+60+79、53+60+87、53+60+192、53+60+302、53+60+387、53+60+388、53+60+390、53+60+403、53+60+408、53+60+410、53+60+416、53+60+448、53+60+451、53+60+471、53+60+472、53+60+507、53+60+512、53+60+515、53+60+538、53+60+598、53+60+602、53+60+605、53+60+609、53+60+676、53+60+694、53+60+698、53+60+699、53+60+711、53+60+754、53+60+760、53+60+781、53+60+786、53+60+797、53+60+834、53+60+835、53+63+79、53+63+87、53+63+192、53+63+302、53+63+387、53+63+388、53+63+390、53+63+403、53+63+408、53+63+410、53+63+416、53+63+448、53+63+451、53+63+471、53+63+472、53+63+507、53+63+512、53+63+515、53+63+538、53+63+598、53+63+602、53+63+605、53+63+609、53+63+676、53+63+694、53+63+698、53+63+699、53+63+711、53+63+754、53+63+760、53+63+781、53+63+786、53+63+797、53+63+834、53+63+835、53+79+87、53+79+192、53+79+302、53+79+387、53+79+388、53+79+390、53+79+403、53+79+408、53+79+410、53+79+416、53+79+448、53+79+451、53+79+471、53+79+472、53+79+507、53+79+512、53+79+515、53+79+538、53+79+598、53+79+602、53+79+605、53+79+609、53+79+676、53+79+694、53+79+698、53+79+699、53+79+711、53+79+754、53+79+760、53+79+781、53+79+786、53+79+797、53+79+834、53+79+835、53+87+192、53+87+302、53+87+387、53+87+388、53+87+390、53+87+403、53+87+408、53+87+410、53+87+416、53+87+448、53+87+451、53+87+471、53+87+472、53+87+507、53+87+512、53+87+515、53+87+538、53+87+598、53+87+602、53+87+605、53+87+609、53+87+676、53+87+694、53+87+698、53+87+699、53+87+711、53+87+754、53+87+760、53+87+781、53+87+786、53+87+797、53+87+834、53+87+835、53+192+302、53+192+387、53+192+388、53+192+390、53+192+403、53+192+408、53+192+410、53+192+416、53+192+448、53+192+451、53+192+471、53+192+472、53+192+507、53+192+512、53+192+515、53+192+538、53+192+598、53+192+602、53+192+605、53+192+609、53+192+676、53+192+694、53+192+698、53+192+699、53+192+711、53+192+754、53+192+760、53+192+781、53+192+786、53+192+797、53+192+834、53+192+835、53+302+387、53+302+388、53+302+390、53+302+403、53+302+408、53+302+410、53+302+416、53+302+448、53+302+451、53+302+471、53+302+472、53+302+507、53+302+512、53+302+515、53+302+538、53+302+598、53+302+602、53+302+605、53+302+609、53+302+676、53+302+694、53+302+698、53+302+699、53+302+711、53+302+754、53+302+760、53+302+781、53+302+786、53+302+797、53+302+834、53+302+835、53+387+388、53+387+390、53+387+403、53+387+408、53+387+410、53+387+416、53+387+448、53+387+451、53+387+471、53+387+472、53+387+507、53+387+512、53+387+515、53+387+538、53+387+598、53+387+602、53+387+605、53+387+609、53+387+676、53+387+694、53+387+698、53+387+699、53+387+711、53+387+754、53+387+760、53+387+781、53+387+786、53+387+797、53+387+834、53+387+835、53+388+390、53+388+403、53+388+408、53+388+410、53+388+416、53+388+448、53+388+451、53+388+471、53+388+472、53+388+507、53+388+512、53+388+515、53+388+538、53+388+598、53+388+602、53+388+605、53+388+609、53+388+676、53+388+694、53+388+698、53+388+699、53+388+711、53+388+754、53+388+760、53+388+781、53+388+786、53+388+797、53+388+834、53+388+835、53+390+403、53+390+408、53+390+410、53+390+416、53+390+448、53+390+451、53+390+471、53+390+472、53+390+507、53+390+512、53+390+515、53+390+538、53+390+598、53+390+602、53+390+605、53+390+609、53+390+676、53+390+694、53+390+698、53+390+699、53+390+711、53+390+754、53+390+760、53+390+781、53+390+786、53+390+797、53+390+834、53+390+835、53+403+408、53+403+410、53+403+416、53+403+448、53+403+451、53+403+471、53+403+472、53+403+507、53+403+512、53+403+515、53+403+538、53+403+598、53+403+602、53+403+605、53+403+609、53+403+676、53+403+694、53+403+698、53+403+699、53+403+711、53+403+754、53+403+760、53+403+781、53+403+786、53+403+797、53+403+834、53+403+835、53+408+410、53+408+416、53+408+448、53+408+451、53+408+471、53+408+472、53+408+507、53+408+512、53+408+515、53+408+538、53+408+598、53+408+602、53+408+605、53+408+609、53+408+676、53+408+694、53+408+698 53+408+699、53+408+711、53+408+754、53+408+760、53+408+781、53+408+786、53+408+797、53+408+834、53+408+835、53+410+416、53+410+448、53+410+451、53+410+471、53+410+472、53+410+507、53+410+512、53+410+515、53+410+538、53+410+598、53+410+602、53+410+605、53+410+609、53+410+676、53+410+694、53+410+698、53+410+699、53+410+711、53+410+754、53+410+760、53+410+781、53+410+786、53+410+797、53+410+834、53+410+835、53+416+448、53+416+451、53+416+471、53+416+472、53+416+507、53+416+512、53+416+515、53+416+538、53+416+598、53+416+602、53+416+605、53+416+609、53+416+676、53+416+694、53+416+698、53+416+699、53+416+711、53+416+754、53+416+760、53+416+781、53+416+786、53+416+797、53+416+834、53+416+835、53+448+451、53+448+471、53+448+472、53+448+507、53+448+512、53+448+515、53+448+538、53+448+598、53+448+602、53+448+605、53+448+609、53+448+676、53+448+694、53+448+698、53+448+699、53+448+711、53+448+754、53+448+760、53+448+781、53+448+786、53+448+797、53+448+834、53+448+835、53+451+471、53+451+472、53+451+507、53+451+512、53+451+515、53+451+538、53+451+598、53+451+602、53+451+605、53+451+609、53+451+676、53+451+694、53+451+698、53+451+699、53+451+711、53+451+754、53+451+760、53+451+781、53+451+786、53+451+797、53+451+834、53+451+835、53+471+472、53+471+507、53+471+512、53+471+515、53+471+538、53+471+598、53+471+602、53+471+605、53+471+609、53+471+676、53+471+694、53+471+698、53+471+699、53+471+711、53+471+754、53+471+760、53+471+781、53+471+786、53+471+797、53+471+834、53+471+835、53+472+507、53+472+512、53+472+515、53+472+538、53+472+598、53+472+602、53+472+605、53+472+609、53+472+676、53+472+694、53+472+698、53+472+699、53+472+711、53+472+754、53+472+760、53+472+781、53+472+786、53+472+797、53+472+834、53+472+835、53+507+512、53+507+515、53+507+538、53+507+598、53+507+602、53+507+605、53+507+609、53+507+676、53+507+694、53+507+698、53+507+699、53+507+711、53+507+754、53+507+760、53+507+781、53+507+786、53+507+797、53+507+834、53+507+835、53+512+515、53+512+538、53+512+598、53+512+602、53+512+605、53+512+609、53+512+676、53+512+694、53+512+698、53+512+699、53+512+711、53+512+754、53+512+760、53+512+781、53+512+786、53+512+797、53+512+834、53+512+835、53+515+538、53+515+598、53+515+602、53+515+605、53+515+609、53+515+676、53+515+694、53+515+698、53+515+699、53+515+711、53+515+754、53+515+760、53+515+781、53+515+786、53+515+797、53+515+834、53+515+835、53+538+598、53+538+602、53+538+605、53+538+609、53+538+676、53+538+694、53+538+698、53+538+699、53+538+711、53+538+754、53+538+760、53+538+781、53+538+786、53+538+797、53+538+834、53+538+835、53+598+602、53+598+605、53+598+609、53+598+676、53+598+694、53+598+698、53+598+699、53+598+711、53+598+754、53+598+760、53+598+781、53+598+786、53+598+797、53+598+834、53+598+835、53+602+605、53+602+609、53+602+676、53+602+694、53+602+698、53+602+699、53+602+711、53+602+754、53+602+760、53+602+781、53+602+786、53+602+797、53+602+834、53+602+835、53+605+609、53+605+676、53+605+694、53+605+698、53+605+699、53+605+711、53+605+754、53+605+760、53+605+781、53+605+786、53+605+797、53+605+834、53+605+835、53+609+676、53+609+694、53+609+698、53+609+699、53+609+711、53+609+754、53+609+760、53+609+781、53+609+786、53+609+797、53+609+834、53+609+835、53+676+694、53+676+698、53+676+699、53+676+711、53+676+754、53+676+760、53+676+781、53+676+786、53+676+797、53+676+834、53+676+835、53+694+698、53+694+699、53+694+711、53+694+754、53+694+760、53+694+781、53+694+786、53+694+797、53+694+834、53+694+835、53+698+699、53+698+711、53+698+754、53+698+760、53+698+781、53+698+786、53+698+797、53+698+834、53+698+835、53+699+711、53+699+754、53+699+760、53+699+781、53+699+786、53+699+797、53+699+834、53+699+835、53+711+754、53+711+760、53+711+781、53+711+786、53+711+797、53+711+834、53+711+835、53+754+760、53+754+781、53+754+786、53+754+797、53+754+834、53+754+835、53+760+781、53+760+786、53+760+797、53+760+834、53+760+835、53+781+786、53+781+797、53+781+834、53+781+835、53+786+797、53+786+834、53+786+835、53+797+834、53+797+835、53+834+835、55+56+60、55+56+63、55+56+79、55+56+87、55+56+192、55+56+302、55+56+387、55+56+388、55+56+390、55+56+403、55+56+408、55+56+410、55+56+416、55+56+448、55+56+451、55+56+471、55+56+472、55+56+507、55+56+512、55+56+515、55+56+538、55+56+598、55+56+602、55+56+605、55+56+609、55+56+676、55+56+694、55+56+698、55+56+699、55+56+711、55+56+754、55+56+760、55+56+781、55+56+786、55+56+797、55+56+834、55+56+835、55+60+63、55+60+79、55+60+87、55+60+192、55+60+302、55+60+387、55+60+388、55+60+390、55+60+403、55+60+408、55+60+410、55+60+416、55+60+448、55+60+451、55+60+471、55+60+472、55+60+507、55+60+512、55+60+515、55+60+538、55+60+598、55+60+602、55+60+605、55+60+609、5+60+676、55+60+694、55+60+698、55+60+699、55+60+711、55+60+754、55+60+760、55+60+781、55+60+786、55+60+797、55+60+834、55+60+835、55+63+79、55+63+87、55+63+192、55+63+302、55+63+387、55+63+388、55+63+390、55+63+403、55+63+408、55+63+410、55+63+416、55+63+448、55+63+451、55+63+471、55+63+472、55+63+507、55+63+512、55+63+515、55+63+538、55+63+598、55+63+602、55+63+605、55+63+609、55+63+676、55+63+694、55+63+698、55+63+699、55+63+711、55+63+754、55+63+760、55+63+781、55+63+786、55+63+797、55+63+834、55+63+835、55+79+87、55+79+192、55+79+302、55+79+387、55+79+388、55+79+390、55+79+403、55+79+408、55+79+410、55+79+416、55+79+448、55+79+451、55+79+471、55+79+472、55+79+507、55+79+512、55+79+515、55+79+538、55+79+598、55+79+602、55+79+605、55+79+609、55+79+676、55+79+694、55+79+698、55+79+699、55+79+711、55+79+754、55+79+760、55+79+781、55+79+786、55+79+797、55+79+834、55+79+835、55+87+192、55+87+302、55+87+387、55+87+388、55+87+390、55+87+403、55+87+408、55+87+410、55+87+416、55+87+448、55+87+451、55+87+471、55+87+472、55+87+507、55+87+512、55+87+515、55+87+538、55+87+598、55+87+602、55+87+605、55+87+609、55+87+676、55+87+694、55+87+698、55+87+699、55+87+711、55+87+754、55+87+760、55+87+781、55+87+786、55+87+797、55+87+834、55+87+835、55+192+302、55+192+387、55+192+388、55+192+390、55+192+403、55+192+408、55+192+410、55+192+416、55+192+448、55+192+451、55+192+471、55+192+472、55+192+507、55+192+512、55+192+515、55+192+538、55+192+598、55+192+602、55+192+605、55+192+609、55+192+676、55+192+694、55+192+698、55+192+699、55+192+711、55+192+754、55+192+760、55+192+781、55+192+786、55+192+797、55+192+834、55+192+835、、55+302+387、55+302+388、55+302+390、55+302+403、55+302+408、55+302+410、、55+302+416、55+302+448、55+302+451、55+302+471、55+302+472、55+302+507、55+302+512、55+302+515、55+302+538、55+302+598、55+302+602、55+302+605、55+302+609、55+302+676、55+302+694、55+302+698、55+302+699、55+302+711、55+302+754、55+302+760、55+302+781、55+302+786、55+302+797、55+302+834、55+302+835、55+387+388、55+387+390、55+387+403、55+387+408、55+387+410、55+387+416、55+387+448、55+387+451、55+387+471、55+387+472、55+387+507、55+387+512、55+387+515、55+387+538、55+387+598、55+387+602、55+387+605、55+387+609、55+387+676、55+387+694、55+387+698、55+387+699、55+387+711、55+387+754、55+387+760、55+387+781、55+387+786、、55+387+797、55+387+834、55+387+835、55+388+390、55+388+403、55+388+408、55+388+410、55+388+416、55+388+448、55+388+451、55+388+471、55+388+472、55+388+507、55+388+512、55+388+515、55+388+538、55+388+598、55+388+602、55+388+605、55+388+609、55+388+676、55+388+694、55+388+698、55+388+699、55+388+711、55+388+754、55+388+760、55+388+781、55+388+786、55+388+797、55+388+834、55+388+835、55+390+403、55+390+408、55+390+410、55+390+416、55+390+448、55+390+451、55+390+471、55+390+472、55+390+507、55+390+512、55+390+515、55+390+538、55+390+598、55+390+602、55+390+605、55+390+609、55+390+676、55+390+694、55+390+698、55+390+699、55+390+711、55+390+754、55+390+760、55+390+781、55+390+786、55+390+797、55+390+834、55+390+835、55+403+408、55+403+410、55+403+416、55+403+448、55+403+451、55+403+471、55+403+472、55+403+507、55+403+512、55+403+515、55+403+538、55+403+598、55+403+602、55+403+605、55+403+609、55+403+676、55+403+694、55+403+698、55+403+699、55+403+711、55+403+754、55+403+760、55+403+781、55+403+786、55+403+797、55+403+834、55+403+835、55+408+410、55+408+416、55+408+448、55+408+451、55+408+471、55+408+472、55+408+507、55+408+512、55+408+515、55+408+538、55+408+598、55+408+602、55+408+605、55+408+609、55+408+676、55+408+694、55+408+698、55+408+699、55+408+711、55+408+754、55+408+760、55+408+781、55+408+786、55+408+797、55+408+834、55+408+835、55+410+416、55+410+448、55+410+451、55+410+471、55+410+472、55+410+507、55+410+512、55+410+515、55+410+538、55+410+598、55+410+602、55+410+605、55+410+609、55+410+676、55+410+694、55+410+698、55+410+699、55+410+711、55+410+754、55+410+760、55+410+781、55+410+786、55+410+797、55+410+834、55+410+835、55+416+448、55+416+451、55+416+471、55+416+472、55+416+507、55+416+512、55+416+515、55+416+538、55+416+598、55+416+602、55+416+605、55+416+609、55+416+676、55+416+694、55+416+698、55+416+699、55+416+711、55+416+754、55+416+760、55+416+781、55+416+786、55+416+797、55+416+834、55+416+835、55+448+451、55+448+471、55+448+472、55+448+507、55+448+512、55+448+515、55+448+538、55+448+598、55+448+602、55+448+605、55+448+609、55+448+676、55+448+694、55+448+698、55+448+699、55+448+711、55+448+754、55+448+760、55+448+781、55+448+786、55+448+797、55+448+834、55+448+835、55+451+471、55+451+472、55+451+507、55+451+512、55+451+515、55+451+538、55+451+598、55+451+602、55+451+605、55+451+609、55+451+676、55+451+694、55+451+698、55+451+699、55+451+711、55+451+754、55+451+760、55+451+781、55+451+786、55+451+797、55+451+834、55+451+835、55+471+472、55+471+507、55+471+512、55+471+515、55+471+538、55+471+598、55+471+602、55+471+605、55+471+609、55+471+676、55+471+694、55+471+698、55+471+699、55+471+711、55+471+754、55+471+760、55+471+781、55+471+786、55+471+797、55+471+834、55+471+835、55+472+507、55+472+512、55+472+515、55+472+538、55+472+598、55+472+602、55+472+605、55+472+609、55+472+676、55+472+694、55+472+698、55+472+699、55+472+711、55+472+754、55+472+760、55+472+781、55+472+786、55+472+797、55+472+834、55+472+835、55+507+512、55+507+515、55+507+538、55+507+598、55+507+602、55+507+605、55+507+609、55+507+676、55+507+694、55+507+698、55+507+699、55+507+711、55+507+754、55+507+760、55+507+781、55+507+786、55+507+797、55+507+834、55+507+835、55+512+515、55+512+538、55+512+598、55+512+602、55+512+605、55+512+609、55+512+676、55+512+694、55+512+698、55+512+699、55+512+711、55+512+754、55+512+760、55+512+781、55+512+786、55+512+797、55+512+834、55+512+835、55+515+538、55+515+598、55+515+602、55+515+605、55+515+609、55+515+676、55+515+694、55+515+698、55+515+699、55+515+711、55+515+754、55+515+760、55+515+781、55+515+786、55+515+797、55+515+834、55+515+835、55+538+598、55+538+602、55+538+605、55+538+609、55+538+676、55+538+694、55+538+698、55+538+699、55+538+711、55+538+754、55+538+760、55+538+781、55+538+786、55+538+797、55+538+834、55+538+835、55+598+602、55+598+605、55+598+609、55+598+676、55+598+694、55+598+698、55+598+699、、55+598+711、55+598+754、55+598+760、55+598+781、55+598+786、55+598+797、55+598+834、55+598+835、55+602+605、55+602+609、55+602+676、55+602+694、55+602+698、55+602+699、55+602+711、55+602+754、55+602+760、55+602+781、55+602+786、55+602+797、55+602+834、55+602+835、55+605+609、55+605+676、55+605+694、55+605+698、55+605+699、55+605+711、55+605+754、55+605+760、55+605+781、55+605+786、55+605+797、55+605+834、55+605+835、55+609+676、55+609+694、55+609+698、55+609+699、55+609+711、55+609+754、55+609+760、55+609+781、55+609+786、55+609+797、55+609+834、55+609+835、55+676+694、55+676+698、55+676+699、55+676+711、55+676+754、55+676+760、55+676+781、55+676+786、55+676+797、55+676+834、55+676+835、55+694+698、55+694+699、55+694+711、55+694+754、55+694+760、55+694+781、55+694+786、55+694+797、55+694+834、55+694+835、55+698+699、55+698+711、55+698+754、55+698+760、55+698+781、55+698+786、55+698+797、55+698+834、55+698+835、55+699+711、55+699+754、55+699+760、55+699+781、55+699+786、55+699+797、55+699+834、55+699+835、55+711+754、55+711+760、55+711+781、55+711+786、55+711+797、55+711+834、55+711+835、55+754+760、55+754+781、55+754+786、55+754+797、55+754+834、55+754+835、55+760+781、55+760+786、55+760+797、55+760+834、55+760+835、55+781+786、55+781+797、55+781+834、55+781+835、55+786+797、55+786+834、55+786+835、55+797+834、55+797+835、55+834+835、56+60+63、56+60+79、56+60+87、56+60+192、56+60+302、56+60+387、56+60+388、56+60+390、56+60+403、56+60+408、56+60+410、56+60+416、56+60+448、56+60+451、56+60+471、56+60+472、56+60+507、56+60+512、56+60+515、56+60+538、56+60+598、56+60+602、56+60+605、56+60+609、56+60+676、56+60+694、56+60+698、56+60+699、56+60+711、56+60+754、56+60+760、56+60+781、56+60+786、56+60+797、56+60+834、56+60+835、56+63+79、56+63+87、56+63+192、56+63+302、56+63+387、56+63+388、56+63+390、56+63+403、56+63+408、56+63+410、56+63+416、56+63+448、56+63+451、56+63+471、56+63+472、56+63+507、56+63+512、56+63+515、56+63+538、56+63+598、56+63+602、56+63+605、56+63+609、56+63+676、56+63+694、56+63+698、56+63+699、56+63+711、56+63+754、56+63+760、56+63+781、56+63+786、56+63+797、56+63+834、56+63+835、56+79+87、56+79+192、56+79+302、56+79+387、56+79+388、56+79+390、56+79+403、56+79+408、56+79+410、56+79+416、56+79+448、56+79+451、56+79+471、56+79+472、56+79+507、56+79+512、56+79+515、56+79+538、56+79+598、56+79+602、56+79+605、56+79+609、56+79+676、56+79+694、56+79+698、56+79+699、56+79+711、56+79+754、56+79+760、56+79+781、56+79+786、56+79+797、56+79+834、56+79+835、56+87+192、56+87+302、56+87+387、56+87+388、56+87+390、56+87+403、56+87+408、56+87+410、56+87+416、56+87+448、56+87+451、56+87+471、56+87+472、56+87+507、56+87+512、56+87+515、56+87+538、56+87+598、56+87+602、56+87+605、56+87+609、56+87+676、56+87+694、56+87+698、56+87+699、56+87+711、56+87+754、56+87+760、56+87+781、56+87+786、56+87+797、56+87+834、56+87+835、56+192+302、56+192+387、56+192+388、56+192+390、56+192+403、56+192+408、56+192+410、56+192+416、56+192+448、56+192+451、56+192+471、56+192+472、56+192+507、56+192+512、56+192+515、56+192+538、56+192+598、56+192+602、56+192+605、56+192+609、56+192+676、56+192+694、56+192+698、56+192+699、56+192+711、56+192+754、56+192+760、56+192+781、56+192+786、56+192+797、56+192+834、56+192+835、56+302+387、56+302+388、56+302+390、56+302+403、56+302+408、56+302+410、56+302+416、56+302+448、56+302+451、56+302+471、56+302+472、56+302+507、56+302+512、56+302+515、56+302+538、56+302+598、56+302+602、56+302+605、56+302+609、56+302+676、56+302+694、56+302+698、56+302+699、56+302+711、56+302+754、56+302+760、56+302+781、56+302+786、56+302+797、56+302+834、56+302+835、56+387+388、56+387+390、56+387+403、56+387+408、56+387+410、56+387+416、56+387+448、56+387+451、56+387+471、56+387+472、56+387+507、56+387+512、56+387+515、56+387+538、56+387+598、56+387+602、56+387+605、56+387+609、56+387+676、56+387+694、56+387+698、56+387+699、56+387+711、56+387+754、56+387+760、56+387+781、56+387+786、56+387+797、56+387+834、56+387+835、56+388+390、56+388+403、56+388+408、56+388+410、56+388+416、56+388+448、56+388+451、56+388+471、56+388+472、56+388+507、56+388+512、56+388+515、56+388+538、56+388+598、56+388+602、56+388+605、56+388+609、56+388+676、56+388+694、56+388+698、56+388+699、56+388+711、56+388+754、56+388+760、56+388+781、56+388+786、56+388+797、56+388+834、56+388+835、56+390+403、56+390+408、56+390+410、56+390+416、56+390+448、56+390+451、56+390+471、56+390+472、56+390+507、56+390+512、56+390+515、56+390+538、56+390+598、56+390+602、56+390+605、56+390+609、56+390+676、56+390+694、56+390+698、56+390+699、56+390+711、56+390+754、56+390+760、56+390+781、56+390+786、56+390+797、56+390+834、56+390+835、56+403+408、56+403+410、56+403+416、56+403+448、56+403+451、56+403+471、56+403+472、56+403+507、56+403+512、56+403+515、56+403+538、56+403+598、56+403+602、56+403+605、56+403+609、56+403+676、56+403+694、56+403+698、56+403+699、56+403+711、56+403+754、56+403+760、56+403+781、56+403+786、56+403+797、56+403+834、56+403+835、56+408+410、56+408+416、56+408+448、56+408+451、56+408+471、56+408+472、56+408+507、56+408+512、56+408+515、56+408+538、56+408+598、56+408+602、56+408+605、56+408+609、56+408+676、56+408+694、56+408+698、56+408+699、56+408+711、56+408+754、56+408+760、56+408+781、56+408+786、56+408+797、56+408+834、56+408+835、56+410+416、56+410+448、56+410+451、56+410+471、56+410+472、56+410+507、56+410+512、56+410+515、56+410+538、56+410+598、56+410+602、56+410+605、56+410+609、56+410+676、56+410+694、56+410+698、56+410+699、56+410+711、56+410+754、56+410+760、56+410+781、56+410+786、56+410+797、56+410+834、56+410+835、56+416+448、56+416+451、56+416+471、56+416+472、56+416+507、56+416+512、56+416+515、56+416+538、56+416+598、56+416+602、56+416+605、56+416+609、56+416+676、56+416+694、56+416+698、56+416+699、56+416+711、56+416+754、56+416+760、56+416+781、56+416+786、56+416+797、56+416+834、56+416+835、56+448+451、56+448+471、56+448+472、56+448+507、56+448+512、56+448+515、56+448+538、56+448+598、56+448+602、56+448+605、56+448+609、56+448+676、56+448+694、56+448+698、56+448+699、56+448+711、56+448+754、56+448+760、56+448+781、56+448+786、56+448+797、56+448+834、56+448+835、56+451+471、56+451+472、56+451+507、56+451+512、56+451+515、56+451+538、56+451+598、56+451+602、56+451+605、56+451+609、56+451+676、56+451+694、56+451+698、56+451+699、56+451+711、56+451+754、56+451+760、56+451+781、56+451+786、56+451+797、56+451+834、56+451+835、56+471+472、56+471+507、56+471+512、56+471+515、56+471+538、56+471+598、56+471+602、56+471+605、56+471+609、56+471+676、56+471+694、56+471+698、56+471+699、6+471+711、56+471+754、56+471+760、56+471+781、56+471+786、56+471+797、56+471+834、56+471+835、56+472+507、56+472+512、56+472+515、56+472+538、56+472+598、56+472+602、56+472+605、56+472+609、56+472+676、56+472+694、56+472+698、56+472+699、56+472+711、56+472+754、56+472+760、56+472+781、56+472+786、56+472+797、56+472+834、56+472+835、56+507+512、56+507+515、56+507+538、56+507+598、56+507+602、56+507+605、56+507+609、56+507+676、56+507+694、56+507+698、56+507+699、56+507+711、56+507+754、56+507+760、56+507+781、56+507+786、56+507+797、56+507+834、56+507+835、56+512+515、56+512+538、56+512+598、56+512+602、56+512+605、56+512+609、56+512+676、56+512+694、56+512+698、56+512+699、56+512+711、56+512+754、56+512+760、56+512+781、56+512+786、56+512+797、56+512+834、56+512+835、56+515+538、56+515+598、56+515+602、56+515+605、56+515+609、56+515+676、56+515+694、56+515+698、56+515+699、56+515+711、56+515+754、56+515+760、56+515+781、56+515+786、56+515+797、56+515+834、56+515+835、56+538+598、56+538+602、56+538+605、56+538+609、56+538+676、56+538+694、56+538+698、56+538+699、56+538+711、56+538+754、56+538+760、56+538+781、56+538+786、56+538+797、56+538+834、56+538+835、56+598+602、56+598+605、56+598+609、56+598+676、56+598+694、56+598+698、56+598+699、56+598+711、56+598+754、56+598+760、56+598+781、56+598+786、56+598+797、56+598+834、56+598+835、56+602+605、56+602+609、56+602+676、56+602+694、56+602+698、56+602+699、56+602+711、56+602+754、56+602+760、56+602+781、56+602+786、56+602+797、56+602+834、56+602+835、56+605+609、56+605+676、56+605+694、56+605+698、56+605+699、56+605+711、56+605+754、56+605+760、56+605+781、56+605+786、56+605+797、56+605+834、56+605+835、56+609+676、56+609+694、56+609+698、56+609+699、56+609+711、56+609+754、56+609+760、56+609+781、56+609+786、56+609+797、56+609+834、56+609+835、56+676+694、56+676+698、56+676+699、56+676+711、56+676+754、56+676+760、56+676+781、56+676+786、56+676+797、56+676+834、56+676+835、56+694+698、56+694+699、56+694+711、56+694+754、56+694+760、56+694+781、56+694+786、56+694+797、56+694+834、56+694+835、56+698+699、56+698+711、56+698+754、56+698+760、56+698+781、56+698+786、56+698+797、56+698+834、56+698+835、56+699+711、56+699+754、56+699+760、56+699+781、56+699+786、56+699+797、56+699+834、56+699+835、56+711+754、56+711+760、56+711+781、56+711+786、56+711+797、56+711+834、、56+711+835、56+754+760、56+754+781、56+754+786、56+754+797、56+754+834、56+754+835、56+760+781、56+760+786、56+760+797、56+760+834、56+760+835、56+781+786、56+781+797、56+781+834、56+781+835、56+786+797、56+786+834、56+786+835、56+797+834、56+797+835、56+834+835、60+63+79、60+63+87、60+63+192、60+63+302、60+63+387、60+63+388、60+63+390、60+63+403、60+63+408、60+63+410、60+63+416、60+63+448、60+63+451、60+63+471、60+63+472、60+63+507、60+63+512、60+63+515、60+63+538、60+63+598、60+63+602、60+63+605、60+63+609、60+63+676、60+63+694、60+63+698、60+63+699、60+63+711、60+63+754、60+63+760、60+63+781、60+63+786、60+63+797、60+63+834、60+63+835、60+79+87、60+79+192、60+79+302、60+79+387、60+79+388、60+79+390、60+79+403、60+79+408、60+79+410、60+79+416、60+79+448、60+79+451、60+79+471、60+79+472、60+79+507、60+79+512、60+79+515、60+79+538、60+79+598、60+79+602、60+79+605、60+79+609、60+79+676、60+79+694、60+79+698、60+79+699、60+79+711、60+79+754、60+79+760、60+79+781、60+79+786、60+79+797、60+79+834、60+79+835、60+87+192、60+87+302、60+87+387、60+87+388、60+87+390、60+87+403、60+87+408、60+87+410、60+87+416、60+87+448、60+87+451、60+87+471、60+87+472、60+87+507、60+87+512、60+87+515、60+87+538、60+87+598、60+87+602、60+87+605、60+87+609、60+87+676、60+87+694、60+87+698、60+87+699、60+87+711、60+87+754、60+87+760、60+87+781、60+87+786、60+87+797、60+87+834、60+87+835、60+192+302、60+192+387、60+192+388、60+192+390、60+192+403、60+192+408、60+192+410、60+192+416、60+192+448、60+192+451、60+192+471、60+192+472、60+192+507、60+192+512、60+192+515、60+192+538、60+192+598、60+192+602、60+192+605、60+192+609、60+192+676、60+192+694、60+192+698、60+192+699、60+192+711、60+192+754、60+192+760、60+192+781、60+192+786、60+192+797、60+192+834、60+192+835、60+302+387、60+302+388、60+302+390、60+302+403、60+302+408、60+302+410、60+302+416、60+302+448、60+302+451、60+302+471、60+302+472、60+302+507、60+302+512、60+302+515、60+302+538、60+302+598、60+302+602、60+302+605、60+302+609、60+302+676、60+302+694、60+302+698、60+302+699、60+302+711、60+302+754、60+302+760、60+302+781、60+302+786、60+302+797、60+302+834、60+302+835、60+387+388、60+387+390、60+387+403、60+387+408、60+387+410、60+387+416、60+387+448、60+387+451、60+387+471、60+387+472、60+387+507、60+387+512、60+387+515、60+387+538、60+387+598、60+387+602、60+387+605、60+387+609、60+387+676、60+387+694、60+387+698、60+387+699、60+387+711、60+387+754、60+387+760、60+387+781、60+387+786、60+387+797、60+387+834、60+387+835、60+388+390、60+388+403、60+388+408、60+388+410、60+388+416、60+388+448、60+388+451、60+388+471、60+388+472、60+388+507、60+388+512、60+388+515、60+388+538、60+388+598、60+388+602、60+388+605、60+388+609、60+388+676、60+388+694、60+388+698、60+388+699、60+388+711、60+388+754、60+388+760、60+388+781、60+388+786、60+388+797、60+388+834、60+388+835、60+390+403、60+390+408、60+390+410、60+390+416、60+390+448、60+390+451、60+390+471、60+390+472、60+390+507、60+390+512、60+390+515、60+390+538、60+390+598、60+390+602、60+390+605、60+390+609、60+390+676、60+390+694、60+390+698、60+390+699、60+390+711、60+390+754、60+390+760、60+390+781、60+390+786、60+390+797、60+390+834、60+390+835、60+403+408、60+403+410、60+403+416、60+403+448、60+403+451、60+403+471、60+403+472、60+403+507、60+403+512、60+403+515、60+403+538、60+403+598、60+403+602、60+403+605、60+403+609、60+403+676、60+403+694、60+403+698、60+403+699、60+403+711、60+403+754、60+403+760、60+403+781、60+403+786、60+403+797、60+403+834、60+403+835、60+408+410、60+408+416、60+408+448、60+408+451、60+408+471、60+408+472、60+408+507、60+408+512、60+408+515、60+408+538、60+408+598、60+408+602、60+408+605、60+408+609、60+408+676、60+408+694、60+408+698、60+408+699、60+408+711、60+408+754、60+408+760、60+408+781、60+408+786、60+408+797、60+408+834、60+408+835、60+410+416、60+410+448、60+410+451、60+410+471、60+410+472、60+410+507、60+410+512、60+410+515、60+410+538、60+410+598、60+410+602、60+410+605、60+410+609、60+410+676、60+410+694、60+410+698、60+410+699、60+410+711、60+410+754、60+410+760、60+410+781、60+410+786、60+410+797、60+410+834、60+410+835、60+416+448、60+416+451、60+416+471、60+416+472、60+416+507、60+416+512、60+416+515、60+416+538、60+416+598、60+416+602、60+416+605、60+416+609、60+416+676、60+416+694、60+416+698、60+416+699、60+416+711、60+416+754、60+416+760、60+416+781、60+416+786、60+416+797、60+416+834、60+416+835、60+448+451、60+448+471、60+448+472、60+448+507、60+448+512、60+448+515、60+448+538、60+448+598、60+448+602、60+448+605、60+448+609、60+448+676、60+448+694、60+448+698、60+448+699、60+448+711、60+448+754、60+448+760、60+448+781、60+448+786、60+448+797、60+448+834、60+448+835、60+451+471、60+451+472、60+451+507、60+451+512、60+451+515、60+451+538、60+451+598、60+451+602、60+451+605、60+451+609、60+451+676、60+451+694、60+451+698、60+451+699、60+451+711、60+451+754、60+451+760、60+451+781、60+451+786、60+451+797、60+451+834、60+451+835、60+471+472、60+471+507、60+471+512、60+471+515、60+471+538、60+471+598、60+471+602、60+471+605、60+471+609、60+471+676、60+471+694、60+471+698、60+471+699、60+471+711、60+471+754、60+471+760、60+471+781、60+471+786、60+471+797、60+471+834、60+471+835、60+472+507、60+472+512、60+472+515、60+472+538、60+472+598、60+472+602、60+472+605、60+472+609、60+472+676、60+472+694、60+472+698、60+472+699、60+472+711、60+472+754、60+472+760、60+472+781、60+472+786、60+472+797、60+472+834、60+472+835、60+507+512、60+507+515、60+507+538、60+507+598、60+507+602、60+507+605、60+507+609、60+507+676、60+507+694、60+507+698、60+507+699、60+507+711、60+507+754、60+507+760、60+507+781、60+507+786、60+507+797、60+507+834、60+507+835、60+512+515、60+512+538、60+512+598、60+512+602、60+512+605、60+512+609、60+512+676、60+512+694、60+512+698、60+512+699、60+512+711、60+512+754、60+512+760、60+512+781、60+512+786、60+512+797、60+512+834、60+512+835、60+515+538、60+515+598、60+515+602、60+515+605、60+515+609、60+515+676、60+515+694、60+515+698、60+515+699、60+515+711、60+515+754、60+515+760、60+515+781、60+515+786、60+515+797、60+515+834、60+515+835、60+538+598、60+538+602、60+538+605、60+538+609、60+538+676、60+538+694、60+538+698、60+538+699、60+538+711、60+538+754、60+538+760、60+538+781、60+538+786、60+538+797、60+538+834、60+538+835、60+598+602、60+598+605、60+598+609、60+598+676、60+598+694、60+598+698、60+598+699、60+598+711、60+598+754、60+598+760、60+598+781、60+598+786、60+598+797、60+598+834、60+598+835、60+602+605、60+602+609、60+602+676、60+602+694、60+602+698、60+602+699、60+602+711、60+602+754、60+602+760、60+602+781、60+602+786、60+602+797、60+602+834、60+602+835、60+605+609、60+605+676、60+605+694、60+605+698、60+605+699、60+605+711、60+605+754、60+605+760、60+605+781、60+605+786、60+605+797、60+605+834、60+605+835、60+609+676、60+609+694、60+609+698、60+609+699、60+609+711、60+609+754、60+609+760、60+609+781、60+609+786、60+609+797、60+609+834、60+609+835、60+676+694、60+676+698、60+676+699、60+676+711、60+676+754、60+676+760、60+676+781、60+676+786、60+676+797、60+676+834、60+676+835、60+694+698、60+694+699、60+694+711、60+694+754、60+694+760、60+694+781、60+694+786、60+694+797、60+694+834、60+694+835、60+698+699、60+698+711、60+698+754、60+698+760、60+698+781、60+698+786、60+698+797、60+698+834、60+698+835、60+699+711、60+699+754、60+699+760、60+699+781、60+699+786、60+699+797、60+699+834、60+699+835、60+711+754、60+711+760、60+711+781、60+711+786、60+711+797、60+711+834、60+711+835、60+754+760、60+754+781、60+754+786、60+754+797、60+754+834、60+754+835、60+760+781、60+760+786、60+760+797、60+760+834、60+760+835、60+781+786、60+781+797、60+781+834、60+781+835、60+786+797、60+786+834、60+786+835、60+797+834、60+797+835、60+834+835、63+79+87、63+79+192、63+79+302、63+79+387、63+79+388、63+79+390、63+79+403、63+79+408、63+79+410、63+79+416、63+79+448、63+79+451、63+79+471、63+79+472、63+79+507、63+79+512、63+79+515、63+79+538、63+79+598、63+79+602、63+79+605、63+79+609、63+79+676、63+79+694、63+79+698、63+79+699、63+79+711、63+79+754、63+79+760、63+79+781、63+79+786、63+79+797、63+79+834、63+79+835、63+87+192、63+87+302、63+87+387、63+87+388、63+87+390、63+87+403、63+87+408、63+87+410、63+87+416、63+87+448、63+87+451、63+87+471、63+87+472、63+87+507、63+87+512、63+87+515、63+87+538、63+87+598、63+87+602、63+87+605、63+87+609、63+87+676、63+87+694、63+87+698、63+87+699、63+87+711、63+87+754、63+87+760、63+87+781、63+87+786、63+87+797、63+87+834、63+87+835、63+192+302、63+192+387、63+192+388、63+192+390、63+192+403、63+192+408、63+192+410、63+192+416、63+192+448、63+192+451、63+192+471、63+192+472、63+192+507、63+192+512、63+192+515、63+192+538、63+192+598、63+192+602、63+192+605、63+192+609、63+192+676、63+192+694、63+192+698、63+192+699、63+192+711、63+192+754、63+192+760、63+192+781、63+192+786、63+192+797、63+192+834、63+192+835、63+302+387、63+302+388、63+302+390、63+302+403、63+302+408、63+302+410、63+302+416、63+302+448、63+302+451、63+302+471、63+302+472、63+302+507、63+302+512、63+302+515、63+302+538、63+302+598、63+302+602、、63+302+605 63+302+609、63+302+676、63+302+694、63+302+698、63+302+699、63+302+711、63+302+754、63+302+760、63+302+781、63+302+786、63+302+797、63+302+834、63+302+835、63+387+388、63+387+390、63+387+403、63+387+408、63+387+410、63+387+416、63+387+448、63+387+451、63+387+471、63+387+472、63+387+507、63+387+512、63+387+515、63+387+538、63+387+598、63+387+602、63+387+605、63+387+609、63+387+676、63+387+694、63+387+698、63+387+699、63+387+711、63+387+754、63+387+760、63+387+781、63+387+786、63+387+797、63+387+834、63+387+835、63+388+390、63+388+403、63+388+408、63+388+410、63+388+416、63+388+448、63+388+451、63+388+471、63+388+472、63+388+507、63+388+512、63+388+515、63+388+538、63+388+598、63+388+602、63+388+605、63+388+609、63+388+676、63+388+694、63+388+698、63+388+699、63+388+711、63+388+754、63+388+760、63+388+781、63+388+786、63+388+797、63+388+834、63+388+835、63+390+403、63+390+408、63+390+410、63+390+416、63+390+448、63+390+451、63+390+471、63+390+472、63+390+507、63+390+512、63+390+515、63+390+538、63+390+598、63+390+602、63+390+605、63+390+609、63+390+676、63+390+694、63+390+698、63+390+699、63+390+711、63+390+754、63+390+760、63+390+781、63+390+786、63+390+797、63+390+834、63+390+835、63+403+408、63+403+410、63+403+416、63+403+448、63+403+451、63+403+471、63+403+472、63+403+507、63+403+512、63+403+515、63+403+538、63+403+598、63+403+602、63+403+605、63+403+609、63+403+676、63+403+694、63+403+698、63+403+699、63+403+711、63+403+754、63+403+760、63+403+781、63+403+786、63+403+797、63+403+834、63+403+835、63+408+410、63+408+416、63+408+448、63+408+451、63+408+471、63+408+472、63+408+507、63+408+512、63+408+515、63+408+538、63+408+598、63+408+602、63+408+605、63+408+609、63+408+676、63+408+694、63+408+698、63+408+699、63+408+711、63+408+754、63+408+760、63+408+781、63+408+786、63+408+797、63+408+834、63+408+835、63+410+416、63+410+448、63+410+451、63+410+471、63+410+472、63+410+507、63+410+512、63+410+515、63+410+538、63+410+598、63+410+602、63+410+605、63+410+609、63+410+676、63+410+694、63+410+698、63+410+699、63+410+711、63+410+754、63+410+760、63+410+781、63+410+786、63+410+797、63+410+834、63+410+835、63+416+448、63+416+451、63+416+471、63+416+472、63+416+507、63+416+512、63+416+515、63+416+538、63+416+598、63+416+602、63+416+605、63+416+609、63+416+676、63+416+694、63+416+698、63+416+699、63+416+711、63+416+754、63+416+760、63+416+781、63+416+786、63+416+797、63+416+834、63+416+835、63+448+451、63+448+471、63+448+472、63+448+507、63+448+512、63+448+515、63+448+538、63+448+598、63+448+602、63+448+605、63+448+609、63+448+676、63+448+694、63+448+698、63+448+699、63+448+711、63+448+754、63+448+760、63+448+781、63+448+786、63+448+797、63+448+834、63+448+835、63+451+471、63+451+472、63+451+507、63+451+512、63+451+515、63+451+538、63+451+598、63+451+602、63+451+605、63+451+609、63+451+676、63+451+694、63+451+698、63+451+699、63+451+711、63+451+754、63+451+760、63+451+781、63+451+786、63+451+797、63+451+834、63+451+835、63+471+472、63+471+507、63+471+512、63+471+515、63+471+538、63+471+598、63+471+602、63+471+605、63+471+609、63+471+676、63+471+694、63+471+698、63+471+699、63+471+711、63+471+754、63+471+760、63+471+781、63+471+786、63+471+797、63+471+834、63+471+835、63+472+507、63+472+512、63+472+515、63+472+538、63+472+598、63+472+602、63+472+605、63+472+609、63+472+676、63+472+694、63+472+698、63+472+699、63+472+711、63+472+754、63+472+760、63+472+781、63+472+786、63+472+797、63+472+834、63+472+835、63+507+512、63+507+515、63+507+538、63+507+598、63+507+602、63+507+605、63+507+609、63+507+676、63+507+694、63+507+698、63+507+699、63+507+711、63+507+754、63+507+760、63+507+781、63+507+786、63+507+797、63+507+834、63+507+835、63+512+515、63+512+538、63+512+598、63+512+602、63+512+605、63+512+609、63+512+676、63+512+694、63+512+698、63+512+699、63+512+711、63+512+754、63+512+760、63+512+781、63+512+786、63+512+797、63+512+834、63+512+835、63+515+538、63+515+598、63+515+602、63+515+605、63+515+609、63+515+676、63+515+694、63+515+698、63+515+699、63+515+711、63+515+754、63+515+760、63+515+781、63+515+786、63+515+797、63+515+834、63+515+835、63+538+598、63+538+602、63+538+605、63+538+609、63+538+676、63+538+694、63+538+698、63+538+699、63+538+711、63+538+754、63+538+760、63+538+781、63+538+786、63+538+797、63+538+834、63+538+835、63+598+602、63+598+605、63+598+609、63+598+676、63+598+694、63+598+698、63+598+699、63+598+711、63+598+754、63+598+760、63+598+781、63+598+786、63+598+797、63+598+834、63+598+835、63+602+605、63+602+609、63+602+676、63+602+694、63+602+698、63+602+699、63+602+711、63+602+754、63+602+760、63+602+781、63+602+786、63+602+797、63+602+834、63+602+835、63+605+609、63+605+676、63+605+694、63+605+698、63+605+699、63+605+711、63+605+754、63+605+760、63+605+781、63+605+786、63+605+797、63+605+834、63+605+835、63+609+676、63+609+694、63+609+698、63+609+699、63+609+711、63+609+754、63+609+760、63+609+781、63+609+786、63+609+797、63+609+834、63+609+835、63+676+694、63+676+698、63+676+699、63+676+711、63+676+754、63+676+760、63+676+781、63+676+786、63+676+797、63+676+834、63+676+835、63+694+698、63+694+699、63+694+711、63+694+754、63+694+760、63+694+781、63+694+786、63+694+797、63+694+834、63+694+835、63+698+699、63+698+711、63+698+754、63+698+760、63+698+781、63+698+786、63+698+797、63+698+834、63+698+835、63+699+711、63+699+754、63+699+760、63+699+781、63+699+786、63+699+797、63+699+834、63+699+835、63+711+754、63+711+760、63+711+781、63+711+786、63+711+797、63+711+834、63+711+835、63+754+760、63+754+781、63+754+786、63+754+797、63+754+834、63+754+835、63+760+781、63+760+786、63+760+797、63+760+834、63+760+835、63+781+786、63+781+797、63+781+834、63+781+835、63+786+797、63+786+834、63+786+835、63+797+834、63+797+835、63+834+835、79+87+192、79+87+302、79+87+387、79+87+388、79+87+390、79+87+403、79+87+408、79+87+410、79+87+416、79+87+448、79+87+451、79+87+471、79+87+472、79+87+507、79+87+512、79+87+515、79+87+538、79+87+598、79+87+602、79+87+605、79+87+609、79+87+676、79+87+694、79+87+698、79+87+699、79+87+711、79+87+754、79+87+760、79+87+781、79+87+786、79+87+797、79+87+834、79+87+835、79+192+302、79+192+387、79+192+388、79+192+390、79+192+403、79+192+408、79+192+410、79+192+416、79+192+448、79+192+451、79+192+471、79+192+472、79+192+507、79+192+512、79+192+515、79+192+538、79+192+598、79+192+602、79+192+605、79+192+609、79+192+676、79+192+694、79+192+698、79+192+699、79+192+711、79+192+754、79+192+760、79+192+781、79+192+786、79+192+797、79+192+834、79+192+835、79+302+387、、79+302+388、79+302+390、79+302+403、79+302+408、79+302+410、79+302+416、79+302+448、79+302+451、79+302+471、79+302+472、79+302+507、79+302+512、79+302+515、79+302+538、79+302+598、79+302+602、79+302+605、79+302+609、79+302+676、79+302+694、79+302+698、79+302+699、79+302+711、79+302+754、79+302+760、79+302+781、79+302+786、79+302+797、79+302+834、79+302+835、79+387+388、79+387+390、79+387+403、79+387+408、79+387+410、79+387+416、79+387+448、79+387+451、79+387+471、79+387+472、79+387+507、79+387+512、79+387+515、79+387+538、79+387+598、79+387+602、79+387+605、79+387+609、79+387+676、79+387+694、79+387+698、79+387+699、79+387+711、79+387+754、79+387+760、79+387+781、79+387+786、79+387+797、79+387+834、79+387+835、79+388+390、79+388+403、79+388+408、79+388+410、79+388+416、79+388+448、79+388+451、79+388+471、79+388+472、79+388+507、79+388+512、79+388+515、79+388+538、79+388+598、79+388+602、79+388+605、79+388+609、79+388+676、79+388+694、79+388+698、79+388+699、79+388+711、79+388+754、79+388+760、79+388+781、79+388+786、79+388+797、79+388+834、79+388+835、79+390+403、79+390+408、79+390+410、79+390+416、79+390+448、79+390+451、79+390+471、79+390+472、79+390+507、79+390+512、79+390+515、79+390+538、79+390+598、79+390+602、79+390+605、79+390+609、79+390+676、79+390+694、79+390+698、79+390+699、79+390+711、79+390+754、79+390+760、79+390+781、79+390+786、79+390+797、79+390+834、79+390+835、79+403+408、79+403+410、79+403+416、79+403+448、79+403+451、79+403+471、79+403+472、79+403+507、79+403+512、79+403+515、79+403+538、79+403+598、79+403+602、79+403+605、79+403+609、79+403+676、79+403+694、79+403+698、79+403+699、79+403+711、79+403+754、79+403+760、79+403+781、79+403+786、79+403+797、79+403+834、79+403+835、79+408+410、79+408+416、79+408+448、79+408+451、79+408+471、79+408+472、79+408+507、79+408+512、79+408+515、79+408+538、79+408+598、79+408+602、79+408+605、79+408+609、79+408+676、79+408+694、79+408+698、79+408+699、79+408+711、79+408+754、79+408+760、79+408+781、79+408+786、79+408+797、79+408+834、79+408+835、79+410+416、79+410+448、79+410+451、79+410+471、79+410+472、79+410+507、79+410+512、79+410+515、79+410+538、79+410+598、79+410+602、79+410+605、79+410+609、79+410+676、79+410+694、79+410+698、79+410+699、79+410+711、79+410+754、79+410+760、79+410+781、79+410+786、79+410+797、79+410+834、79+410+835、9+416+448、79+416+451、79+416+471、79+416+472、79+416+507、79+416+512、79+416+515、79+416+538、79+416+598、79+416+602、79+416+605、79+416+609、79+416+676、79+416+694、79+416+698、79+416+699、79+416+711、79+416+754、79+416+760、79+416+781、79+416+786、79+416+797、79+416+834、79+416+835、79+448+451、79+448+471、79+448+472、79+448+507、79+448+512、79+448+515、79+448+538、79+448+598、79+448+602、79+448+605、79+448+609、79+448+676、79+448+694、79+448+698、79+448+699、79+448+711、79+448+754、79+448+760、79+448+781、79+448+786、79+448+797、79+448+834、79+448+835、79+451+471、79+451+472、79+451+507、79+451+512、79+451+515、79+451+538、79+451+598、79+451+602、79+451+605、79+451+609、79+451+676、79+451+694、79+451+698、79+451+699、79+451+711、79+451+754、79+451+760、79+451+781、79+451+786、79+451+797、79+451+834、79+451+835、79+471+472、79+471+507、79+471+512、79+471+515、79+471+538、79+471+598、79+471+602、79+471+605、79+471+609、79+471+676、79+471+694、79+471+698、79+471+699、79+471+711、79+471+754、79+471+760、79+471+781、79+471+786、79+471+797、79+471+834、79+471+835、79+472+507、79+472+512、79+472+515、79+472+538、79+472+598、79+472+602、79+472+605、79+472+609、79+472+676、79+472+694、79+472+698、79+472+699、79+472+711、79+472+754、79+472+760、79+472+781、79+472+786、79+472+797、79+472+834、79+472+835、79+507+512、79+507+515、79+507+538、79+507+598、79+507+602、79+507+605、、79+507+609、79+507+676、79+507+694、79+507+698、79+507+699、79+507+711、79+507+754、79+507+760、79+507+781、79+507+786、79+507+797、79+507+834、79+507+835、79+512+515、79+512+538、79+512+598、79+512+602、79+512+605、79+512+609、79+512+676、79+512+694、79+512+698、79+512+699、79+512+711、79+512+754、79+512+760、79+512+781、79+512+786、79+512+797、79+512+834、79+512+835、79+515+538、79+515+598、79+515+602、79+515+605、79+515+609、79+515+676、79+515+694、79+515+698、79+515+699、79+515+711、79+515+754、79+515+760、79+515+781、79+515+786、79+515+797、79+515+834、79+515+835、79+538+598、79+538+602、79+538+605、79+538+609、79+538+676、79+538+694、79+538+698、79+538+699、79+538+711、79+538+754、79+538+760、79+538+781、79+538+786、79+538+797、79+538+834、79+538+835、79+598+602、79+598+605、79+598+609、79+598+676、79+598+694、79+598+698、79+598+699、79+598+711、79+598+754、79+598+760、79+598+781、79+598+786、79+598+797、79+598+834、79+598+835、79+602+605、79+602+609、79+602+676、79+602+694、79+602+698、79+602+699、79+602+711、79+602+754、79+602+760、79+602+781、79+602+786、79+602+797、79+602+834、79+602+835、79+605+609、79+605+676、79+605+694、79+605+698、79+605+699、79+605+711、79+605+754、79+605+760、79+605+781、79+605+786、79+605+797、79+605+834、79+605+835、79+609+676、79+609+694、79+609+698、79+609+699、9+609+711、79+609+754、79+609+760、79+609+781、79+609+786、79+609+797、79+609+834、79+609+835、79+676+694、79+676+698、79+676+699、79+676+711、79+676+754、79+676+760、79+676+781、79+676+786、79+676+797、79+676+834、79+676+835、79+694+698、79+694+699、79+694+711、79+694+754、79+694+760、79+694+781、79+694+786、79+694+797、79+694+834、79+694+835、79+698+699、79+698+711、79+698+754、79+698+760、79+698+781、79+698+786、79+698+797、79+698+834、79+698+835、79+699+711、79+699+754、79+699+760、79+699+781、79+699+786、79+699+797、79+699+834、79+699+835、79+711+754、79+711+760、79+711+781、79+711+786、79+711+797、79+711+834、79+711+835、79+754+760、79+754+781、79+754+786、79+754+797、79+754+834、79+754+835、79+760+781、79+760+786、79+760+797、79+760+834、79+760+835、79+781+786、79+781+797、79+781+834、79+781+835、79+786+797、79+786+834、79+786+835、79+797+834、79+797+835、79+834+835、87+192+302、87+192+387、87+192+388、87+192+390、87+192+403、87+192+408、87+192+410、87+192+416、87+192+448、87+192+451、87+192+471、87+192+472、87+192+507、87+192+512、87+192+515、87+192+538、87+192+598、87+192+602、87+192+605、87+192+609、87+192+676、87+192+694、87+192+698、87+192+699、87+192+711、87+192+754、87+192+760、87+192+781、87+192+786、87+192+797、87+192+834、87+192+835、87+302+387、87+302+388、87+302+390、87+302+403、87+302+408、87+302+410、87+302+416、87+302+448、87+302+451、87+302+471、87+302+472、87+302+507、87+302+512、87+302+515、87+302+538、87+302+598、87+302+602、87+302+605、87+302+609、87+302+676、87+302+694、87+302+698、87+302+699、87+302+711、87+302+754、87+302+760、7+302+781、87+302+786、87+302+797、87+302+834、87+302+835、87+387+388、87+387+390、87+387+403、87+387+408、87+387+410、87+387+416、87+387+448、87+387+451、87+387+471、87+387+472、87+387+507、87+387+512、87+387+515、87+387+538、87+387+598、87+387+602、87+387+605、87+387+609、87+387+676、87+387+694、87+387+698、87+387+699、87+387+711、87+387+754、87+387+760、87+387+781、87+387+786、87+387+797、87+387+834、87+387+835、87+388+390、87+388+403、87+388+408、87+388+410、87+388+416、87+388+448、87+388+451、87+388+471、87+388+472、87+388+507、87+388+512、87+388+515、87+388+538、87+388+598、87+388+602、87+388+605、87+388+609、87+388+676、87+388+694、87+388+698、87+388+699、87+388+711、87+388+754、87+388+760、87+388+781、87+388+786、87+388+797、87+388+834、87+388+835、87+390+403、87+390+408、87+390+410、87+390+416、87+390+448、87+390+451、87+390+471、87+390+472、87+390+507、87+390+512、87+390+515、87+390+538、87+390+598、87+390+602、87+390+605、87+390+609、87+390+676、87+390+694、87+390+698、87+390+699、87+390+711、87+390+754、87+390+760、87+390+781、87+390+786、87+390+797、87+390+834、87+390+835、87+403+408、87+403+410、87+403+416、87+403+448、87+403+451、87+403+471、87+403+472、87+403+507、87+403+512、87+403+515、87+403+538、87+403+598、87+403+602、87+403+605、87+403+609、87+403+676、87+403+694、87+403+698、87+403+699、87+403+711、87+403+754、87+403+760、87+403+781、87+403+786、87+403+797、87+403+834、87+403+835、87+408+410、87+408+416、87+408+448、87+408+451、87+408+471、87+408+472、87+408+507、87+408+512、87+408+515、87+408+538、87+408+598、87+408+602、87+408+605、87+408+609、87+408+676、87+408+694、87+408+698、87+408+699、87+408+711、87+408+754、87+408+760、87+408+781、87+408+786、87+408+797、87+408+834、87+408+835、87+410+416、87+410+448、87+410+451、87+410+471、87+410+472、87+410+507、87+410+512、87+410+515、87+410+538、87+410+598、87+410+602、87+410+605、87+410+609、87+410+676、87+410+694、87+410+698、87+410+699、87+410+711、87+410+754、87+410+760、87+410+781、87+410+786、87+410+797、87+410+834、87+410+835、87+416+448、87+416+451、87+416+471、87+416+472、87+416+507、87+416+512、87+416+515、87+416+538、87+416+598、87+416+602、87+416+605、87+416+609、87+416+676、87+416+694、87+416+698、87+416+699、87+416+711、87+416+754、87+416+760、87+416+781、87+416+786、87+416+797、87+416+834、87+416+835、87+448+451、87+448+471、87+448+472、87+448+507、87+448+512、87+448+515、87+448+538、87+448+598、87+448+602、87+448+605、87+448+609、87+448+676、87+448+694、87+448+698、87+448+699、87+448+711、87+448+754、87+448+760、87+448+781、87+448+786、87+448+797、87+448+834、87+448+835、87+451+471、87+451+472、87+451+507、87+451+512、87+451+515、87+451+538、87+451+598、87+451+602、87+451+605、87+451+609、87+451+676、87+451+694、87+451+698、87+451+699、87+451+711、87+451+754、87+451+760、87+451+781、87+451+786、87+451+797、87+451+834、87+451+835、87+471+472、87+471+507、87+471+512、87+471+515、87+471+538、87+471+598、87+471+602、87+471+605、87+471+609、87+471+676、87+471+694、87+471+698、87+471+699、87+471+711、87+471+754、87+471+760、87+471+781、87+471+786、87+471+797、87+471+834、87+471+835、87+472+507、87+472+512、87+472+515、87+472+538、87+472+598、87+472+602、87+472+605、87+472+609、87+472+676、87+472+694、87+472+698、87+472+699、87+472+711、87+472+754、87+472+760、87+472+781、87+472+786、87+472+797、87+472+834、87+472+835、87+507+512、87+507+515、87+507+538、87+507+598、87+507+602、87+507+605、87+507+609、87+507+676、87+507+694、87+507+698、87+507+699、87+507+711、87+507+754、87+507+760、87+507+781、87+507+786、87+507+797、87+507+834、87+507+835、87+512+515、87+512+538、87+512+598、87+512+602、87+512+605、87+512+609、87+512+676、87+512+694、87+512+698、87+512+699、87+512+711、87+512+754、87+512+760、87+512+781、87+512+786、87+512+797、87+512+834、87+512+835、87+515+538、87+515+598、87+515+602、87+515+605、87+515+609、87+515+676、87+515+694、87+515+698、87+515+699、87+515+711、87+515+754、87+515+760、87+515+781、87+515+786、87+515+797、87+515+834、87+515+835、87+538+598、87+538+602、87+538+605、87+538+609、87+538+676、87+538+694、87+538+698、87+538+699、87+538+711、87+538+754、87+538+760、87+538+781、87+538+786、87+538+797、87+538+834、87+538+835、87+598+602、87+598+605、87+598+609、87+598+676、87+598+694、87+598+698、87+598+699、87+598+711、87+598+754、87+598+760、87+598+781、87+598+786、87+598+797、87+598+834、87+598+835、87+602+605、87+602+609、87+602+676、87+602+694、87+602+698、87+602+699、87+602+711、87+602+754、87+602+760、87+602+781、87+602+786、87+602+797、87+602+834、87+602+835、87+605+609、87+605+676、87+605+694、87+605+698、87+605+699、87+605+711、87+605+754、87+605+760、87+605+781、87+605+786、87+605+797、87+605+834、87+605+835、87+609+676、87+609+694、87+609+698、87+609+699、87+609+711、87+609+754、87+609+760、87+609+781、87+609+786、87+609+797、87+609+834、87+609+835、87+676+694、87+676+698、87+676+699、87+676+711、87+676+754、87+676+760、87+676+781、87+676+786、87+676+797、87+676+834、87+676+835、87+694+698、87+694+699、87+694+711、87+694+754、87+694+760、87+694+781、87+694+786、87+694+797、87+694+834、87+694+835、87+698+699、87+698+711、87+698+754、87+698+760、87+698+781、87+698+786、87+698+797、87+698+834、87+698+835、87+699+711、87+699+754、87+699+760、87+699+781、87+699+786、87+699+797、87+699+834、87+699+835、87+711+754、87+711+760、87+711+781、87+711+786、87+711+797、87+711+834、87+711+835、87+754+760、87+754+781、87+754+786、87+754+797、87+754+834、87+754+835、87+760+781、87+760+786、87+760+797、87+760+834、87+760+835、87+781+786、87+781+797、87+781+834、87+781+835、87+786+797、87+786+834、87+786+835、87+797+834、87+797+835、87+834+835、192+302+387、192+302+388、192+302+390、192+302+403、192+302+408、192+302+410、192+302+416、192+302+448、192+302+451、192+302+471、192+302+472、192+302+507、192+302+512、192+302+515、192+302+538、192+302+598、192+302+602、192+302+605、192+302+609、192+302+676、192+302+694、192+302+698、192+302+699、192+302+711、192+302+754、192+302+760、192+302+781、192+302+786、192+302+797、192+302+834、192+302+835、192+387+388、192+387+390、192+387+403、192+387+408、192+387+410、192+387+416、192+387+448、192+387+451、192+387+471、192+387+472、192+387+507、192+387+512、192+387+515、192+387+538、192+387+598、192+387+602、192+387+605、192+387+609、192+387+676、192+387+694、192+387+698、192+387+699、192+387+711、192+387+754、192+387+760、192+387+781、192+387+786、192+387+797、192+387+834、192+387+835、192+388+390、192+388+403、192+388+408、192+388+410、192+388+416、192+388+448、192+388+451、192+388+471、192+388+472、192+388+507、192+388+512、192+388+515、192+388+538、192+388+598、192+388+602、192+388+605、192+388+609、192+388+676、192+388+694、192+388+698、192+388+699、192+388+711、192+388+754、192+388+760、192+388+781、192+388+786、192+388+797、192+388+834、192+388+835、192+390+403、192+390+408、192+390+410、192+390+416、192+390+448、192+390+451、192+390+471、192+390+472、192+390+507、192+390+512、192+390+515、192+390+538、192+390+598、192+390+602、192+390+605、192+390+609、192+390+676、192+390+694、192+390+698、192+390+699、192+390+711、192+390+754、192+390+760、192+390+781、192+390+786、192+390+797、192+390+834、192+390+835、192+403+408、192+403+410、192+403+416、192+403+448、192+403+451、192+403+471、192+403+472、192+403+507、192+403+512、192+403+515、192+403+538、192+403+598、192+403+602、192+403+605、192+403+609、192+403+676、192+403+694、192+403+698、192+403+699、192+403+711、192+403+754、192+403+760、192+403+781、192+403+786、192+403+797、192+403+834、192+403+835、192+408+410、192+408+416、192+408+448、192+408+451、192+408+471、192+408+472、192+408+507、192+408+512、192+408+515、192+408+538、192+408+598、192+408+602、192+408+605、192+408+609、192+408+676、192+408+694、192+408+698、192+408+699、192+408+711、192+408+754、192+408+760、192+408+781、192+408+786、192+408+797、192+408+834、192+408+835、192+410+416、192+410+448、192+410+451、192+410+471、192+410+472、192+410+507、192+410+512、192+410+515、192+410+538、192+410+598、192+410+602、192+410+605、192+410+609、192+410+676、192+410+694、192+410+698、192+410+699、192+410+711、192+410+754、192+410+760、192+410+781、192+410+786、192+410+797、192+410+834、192+410+835、192+416+448、192+416+451、192+416+471、192+416+472、192+416+507、192+416+512、192+416+515、192+416+538、192+416+598、192+416+602、192+416+605、192+416+609、192+416+676、192+416+694、192+416+698、192+416+699、192+416+711、192+416+754、192+416+760、192+416+781、192+416+786、192+416+797、192+416+834、192+416+835、192+448+451、192+448+471、192+448+472、192+448+507、192+448+512、192+448+515、192+448+538、192+448+598、192+448+602、192+448+605、192+448+609、192+448+676、192+448+694、192+448+698、192+448+699、192+448+711、192+448+754、192+448+760、192+448+781、192+448+786、192+448+797、192+448+834、192+448+835、192+451+471、192+451+472、192+451+507、192+451+512、192+451+515、192+451+538、192+451+598、192+451+602、192+451+605、192+451+609、192+451+676、192+451+694、192+451+698、192+451+699、192+451+711、192+451+754、192+451+760、192+451+781、192+451+786、192+451+797、192+451+834、192+451+835、192+471+472、192+471+507、192+471+512、192+471+515、192+471+538、192+471+598、192+471+602、192+471+605、192+471+609、192+471+676、192+471+694、192+471+698、192+471+699、192+471+711、192+471+754、192+471+760、192+471+781、192+471+786、192+471+797、192+471+834、192+471+835、192+472+507、192+472+512、192+472+515、192+472+538、192+472+598、192+472+602、192+472+605、192+472+609、192+472+676、192+472+694、192+472+698、192+472+699、192+472+711、192+472+754、192+472+760、192+472+781、192+472+786、192+472+797、192+472+834、192+472+835、192+507+512、192+507+515、192+507+538、192+507+598、192+507+602、192+507+605、192+507+609、192+507+676、192+507+694、192+507+698、192+507+699、192+507+711、192+507+754、192+507+760、192+507+781、192+507+786、192+507+797、192+507+834、192+507+835、192+512+515、192+512+538、192+512+598、192+512+602、192+512+605、192+512+609、192+512+676、192+512+694、192+512+698、192+512+699、192+512+711、192+512+754、192+512+760、192+512+781、192+512+786、192+512+797、192+512+834、192+512+835、192+515+538、192+515+598192+515+602、192+515+605、192+515+609、192+515+676、192+515+694、192+515+698、192+515+699、192+515+711、192+515+754、192+515+760、192+515+781、192+515+786、192+515+797、192+515+834、192+515+835、192+538+598、192+538+602、192+538+605、192+538+609、192+538+676、192+538+694、192+538+698、192+538+699、192+538+711、192+538+754、192+538+760、192+538+781、192+538+786、192+538+797、192+538+834、192+538+835、192+598+602、192+598+605、192+598+609、192+598+676、192+598+694、192+598+698、192+598+699、192+598+711、192+598+754、192+598+760、192+598+781、192+598+786、192+598+797、192+598+834、192+598+835、192+602+605、192+602+609、192+602+676、192+602+694、192+602+698、192+602+699、192+602+711、192+602+754、192+602+760、192+602+781、192+602+786、192+602+797、192+602+834、192+602+835、192+605+609、192+605+676、192+605+694、192+605+698、192+605+699、192+605+711、192+605+754、192+605+760、192+605+781、192+605+786、192+605+797、192+605+834、192+605+835、192+609+676、192+609+694、192+609+698、192+609+699、192+609+711、192+609+754、192+609+760、192+609+781、192+609+786、192+609+797、192+609+834、192+609+835、192+676+694、192+676+698、192+676+699、192+676+711、192+676+754、192+676+760、192+676+781、192+676+786、192+676+797、192+676+834、192+676+835、192+694+698、192+694+699、192+694+711、192+694+754、192+694+760、192+694+781、192+694+786、192+694+797、192+694+834、192+694+835、192+698+699、192+698+711、192+698+754、192+698+760、192+698+781、192+698+786、192+698+797、192+698+834、192+698+835、192+699+711、192+699+754、192+699+760、192+699+781、192+699+786、192+699+797、192+699+834、192+699+835、192+711+754、192+711+760、192+711+781、192+711+786、192+711+797、192+711+834、192+711+835、192+754+760、192+754+781、192+754+786、192+754+797、192+754+834、192+754+835、192+760+781、192+760+786、192+760+797、192+760+834、192+760+835、192+781+786、192+781+797、192+781+834、192+781+835、192+786+797、192+786+834、192+786+835、192+797+834、192+797+835、192+834+835、302+387+388、302+387+390、302+387+403、302+387+408、302+387+410、302+387+416、302+387+448、302+387+451、302+387+471、302+387+472、302+387+507、302+387+512、302+387+515、302+387+538、302+387+598、302+387+602、302+387+605、302+387+609、302+387+676、302+387+694、302+387+698、302+387+699、302+387+711、302+387+754、302+387+760、302+387+781、302+387+786、302+387+797、302+387+834、302+387+835、302+388+390、302+388+403、302+388+408、302+388+410、302+388+416、302+388+448、302+388+451、302+388+471、302+388+472、302+388+507、302+388+512、302+388+515、302+388+538、302+388+598、302+388+602、302+388+605、302+388+609、302+388+676、302+388+694、302+388+698、302+388+699、302+388+711、302+388+754、302+388+760、302+388+781、302+388+786、302+388+797、302+388+834、302+388+835、302+390+403、302+390+408、302+390+410、302+390+416、302+390+448、302+390+451、302+390+471、302+390+472、302+390+507、302+390+512、302+390+515、302+390+538、302+390+598、302+390+602、302+390+605、302+390+609、302+390+676、302+390+694、302+390+698、302+390+699、302+390+711、302+390+754、302+390+760、302+390+781、302+390+786、302+390+797、302+390+834、302+390+835、302+403+408、302+403+410、302+403+416、302+403+448、302+403+451、302+403+471、302+403+472、302+403+507、302+403+512、302+403+515、302+403+538、302+403+598、302+403+602、302+403+605、302+403+609、302+403+676、302+403+694、302+403+698、302+403+699、302+403+711、302+403+754、302+403+760、302+403+781、302+403+786、302+403+797、302+403+834、302+403+835、302+408+410、302+408+416、302+408+448、302+408+451、302+408+471、302+408+472、302+408+507、302+408+512、302+408+515、302+408+538、302+408+598、302+408+602、302+408+605、302+408+609、302+408+676、302+408+694、302+408+698、302+408+699、302+408+711、302+408+754、302+408+760、302+408+781、302+408+786、302+408+797、302+408+834、302+408+835、302+410+416、302+410+448、302+410+451、302+410+471、302+410+472、302+410+507、302+410+512、302+410+515、302+410+538、302+410+598、302+410+602、302+410+605、302+410+609、302+410+676、302+410+694、302+410+698、302+410+699、302+410+711、302+410+754、302+410+760、302+410+781、302+410+786、302+410+797、302+410+834、302+410+835、302+416+448、302+416+451、302+416+471、302+416+472、302+416+507、302+416+512、302+416+515、302+416+538、302+416+598、302+416+602、302+416+605、302+416+609、302+416+676、302+416+694、302+416+698、302+416+699、302+416+711、302+416+754、302+416+760、302+416+781、302+416+786、302+416+797、302+416+834、302+416+835、302+448+451、302+448+471、302+448+472、302+448+507、302+448+512、302+448+515、302+448+538、302+448+598、302+448+602、302+448+605、302+448+609、302+448+676、302+448+694、302+448+698、302+448+699、302+448+711、302+448+754、302+448+760、302+448+781、302+448+786、302+448+797、302+448+834、302+448+835、302+451+471、302+451+472、302+451+507、302+451+512、302+451+515、302+451+538、302+451+598、302+451+602、302+451+605、302+451+609、302+451+676、302+451+694、302+451+698、302+451+699、302+451+711、302+451+754、302+451+760、302+451+781、302+451+786、302+451+797、302+451+834、302+451+835302+471+472、302+471+507、302+471+512、302+471+515、302+471+538、302+471+598、302+471+602、302+471+605、302+471+609、302+471+676、302+471+694、302+471+698、302+471+699、302+471+711、302+471+754、302+471+760、302+471+781、302+471+786、302+471+797、302+471+834、302+471+835、302+472+507、302+472+512、302+472+515、302+472+538、302+472+598、302+472+602、302+472+605、302+472+609、302+472+676、302+472+694、302+472+698、302+472+699、302+472+711、302+472+754、302+472+760、302+472+781、302+472+786、302+472+797、302+472+834、302+472+835、302+507+512、302+507+515、302+507+538、302+507+598、302+507+602、302+507+605、302+507+609、302+507+676、302+507+694、302+507+698、302+507+699、302+507+711、302+507+754、302+507+760、302+507+781、302+507+786、302+507+797、302+507+834、302+507+835、302+512+515、302+512+538、302+512+598、302+512+602、302+512+605、302+512+609、302+512+676、302+512+694、302+512+698、302+512+699、302+512+711、302+512+754、302+512+760、302+512+781、302+512+786、302+512+797、302+512+834、302+512+835、302+515+538、302+515+598、302+515+602、302+515+605、302+515+609、302+515+676、302+515+694、302+515+698、302+515+699、302+515+711、302+515+754、302+515+760、302+515+781、302+515+786、302+515+797、302+515+834、302+515+835、302+538+598、302+538+602、302+538+605、302+538+609、302+538+676、302+538+694、302+538+698、302+538+699、302+538+711、302+538+754、302+538+760、302+538+781、302+538+786、302+538+797、302+538+834、302+538+835、302+598+602、302+598+605、302+598+609、302+598+676、302+598+694、302+598+698、302+598+699、302+598+711、302+598+754、302+598+760、302+598+781、302+598+786、302+598+797、302+598+834、302+598+835、302+602+605、302+602+609、302+602+676、302+602+694、302+602+698、302+602+699、302+602+711、302+602+754、302+602+760、302+602+781、302+602+786、302+602+797、302+602+834、302+602+835、302+605+609、302+605+676、202+605+694、302+605+698、302+605+699、302+605+711、302+605+754、302+605+760、302+605+781、302+605+786、302+605+797、302+605+834、302+605+835、302+609+676、302+609+694、302+609+698、302+609+699、302+609+711、302+609+754、302+609+760、302+609+781、302+609+786、302+609+797、302+609+834、302+609+835、302+676+694、302+676+698、302+676+699、302+676+711、302+676+754、302+676+760、302+676+781、302+676+786、302+676+797、302+676+834、302+676+835、302+694+698、302+694+699、302+694+711、302+694+754、302+694+760、302+694+781、302+694+786、302+694+797、302+694+834、302+694+835、302+698+699、302+698+711、302+698+754、302+698+760、302+698+781、302+698+786、302+698+797、302+698+834、302+698+835、302+699+711、302+699+754、302+699+760、302+699+781、302+699+786、302+699+797、302+699+834、302+699+835、302+711+754、302+711+760、302+711+781、302+711+786、302+711+797、302+711+834、302+711+835、302+754+760、302+754+781、302+754+786、302+754+797、302+754+834、302+754+835、302+760+781、302+760+786、302+760+797、302+760+834、302+760+835、302+781+786、302+781+797、302+781+834、302+781+835、302+786+797、302+786+834、302+786+835、302+797+834、302+797+835、302+834+835、387+388+390、387+388+403、387+388+408、387+388+410、387+388+416、387+388+448、387+388+451、387+388+471、387+388+472、387+388+507、387+388+512、387+388+515、387+388+538、387+388+598、387+388+602、387+388+605、387+388+609、387+388+676、387+388+694、387+388+698、387+388+699、387+388+711、387+388+754、387+388+760、387+388+781、387+388+786、387+388+797、387+388+834、387+388+835、387+390+403、387+390+408、387+390+410、387+390+416、387+390+448、387+390+451、387+390+471、387+390+472、387+390+507、387+390+512、387+390+515、387+390+538、387+390+598、387+390+602、387+390+605、387+390+609、387+390+676、387+390+694、387+390+698、387+390+699、387+390+711、387+390+754、87+390+760、387+390+781、387+390+786、387+390+797、387+390+834、387+390+835、387+403+408、387+403+410、387+403+416、387+403+448、387+403+451、387+403+471、387+403+472、387+403+507、387+403+512、387+403+515、387+403+538、387+403+598、387+403+602、387+403+605、387+403+609、387+403+676、387+403+694、387+403+698、387+403+699、387+403+711、387+403+754、387+403+760、387+403+781、387+403+786、387+403+797、387+403+834、387+403+835、387+408+410、387+408+416、387+408+448、387+408+451、387+408+471、387+408+472、387+408+507、387+408+512、387+408+515、387+408+538、387+408+598、387+408+602、387+408+605、387+408+609、387+408+676、387+408+694、387+408+698、387+408+699、387+408+711、387+408+754、387+408+760、387+408+781、387+408+786、387+408+797、387+408+834、387+408+835、387+410+416、387+410+448、387+410+451、387+410+471、87+410+472、387+410+507、387+410+512、387+410+515、387+410+538、387+410+598、387+410+602、387+410+605、387+410+609、387+410+676、387+410+694、387+410+698、387+410+699、387+410+711、387+410+754、387+410+760、387+410+781、387+410+786、387+410+797、387+410+834、387+410+835、387+416+448、387+416+451、387+416+471、387+416+472、387+416+507、387+416+512、387+416+515、387+416+538、387+416+598、387+416+602、387+416+605、387+416+609、387+416+676、387+416+694、387+416+698、387+416+699、387+416+711、387+416+754、387+416+760、387+416+781、387+416+786、387+416+797、387+416+834、387+416+835、387+448+451、387+448+471、387+448+472、387+448+507、387+448+512、387+448+515、387+448+538、387+448+598、387+448+602、387+448+605、387+448+609、387+448+676、387+448+694、387+448+698、387+448+699、387+448+711、387+448+754、387+448+760、387+448+781、387+448+786、387+448+797、387+448+834、387+448+835、387+451+471、387+451+472、387+451+507、387+451+512、387+451+515、387+451+538、387+451+598、387+451+602、387+451+605、387+451+609、387+451+676、387+451+694、387+451+698、387+451+699、387+451+711、387+451+754、387+451+760、387+451+781、387+451+786、387+451+797、387+451+834、387+451+835、387+471+472、387+471+507、387+471+512、387+471+515、387+471+538、387+471+598、387+471+602、387+471+605、387+471+609、387+471+676、387+471+694、387+471+698、387+471+699、387+471+711、387+471+754、387+471+760、387+471+781、387+471+786、387+471+797、387+471+834、387+471+835、387+472+507、387+472+512、387+472+515、87+472+538、387+472+598、387+472+602、387+472+605、387+472+609、387+472+676、387+472+694、387+472+698、387+472+699、387+472+711、387+472+754、387+472+760、387+472+781、387+472+786、387+472+797、387+472+834、387+472+835、387+507+512、387+507+515、387+507+538、387+507+598、387+507+602、387+507+605、387+507+609、387+507+676、387+507+694、387+507+698、387+507+699、387+507+711、387+507+754、387+507+760、387+507+781、387+507+786、387+507+797、387+507+834、387+507+835、387+512+515、387+512+538、387+512+598、387+512+602、387+512+605、387+512+609、387+512+676、387+512+694、387+512+698、387+512+699、387+512+711、387+512+754、387+512+760、387+512+781、387+512+786、387+512+797、387+512+834、387+512+835、387+515+538、387+515+598、387+515+602、387+515+605、387+515+609、387+515+676、387+515+694、387+515+698、387+515+699、387+515+711、387+515+754、387+515+760、387+515+781、387+515+786、387+515+797、387+515+834、387+515+835、387+538+598、387+538+602、387+538+605、387+538+609、387+538+676、387+538+694、387+538+698、387+538+699、387+538+711、387+538+754、387+538+760、387+538+781、387+538+786、387+538+797、387+538+834、387+538+835、387+598+602、387+598+605、387+598+609、387+598+676、387+598+694、387+598+698、387+598+699、387+598+711、387+598+754、387+598+760、387+598+781、387+598+786、387+598+797、387+598+834、387+598+835、387+602+605、387+602+609、387+602+676、387+602+694、387+602+698、387+602+699、387+602+711、387+602+754、387+602+760、387+602+781、387+602+786、387+602+797、387+602+834、387+602+835、387+605+609、387+605+676、387+605+694、387+605+698、387+605+699、387+605+711、387+605+754、387+605+760、387+605+781、387+605+786、387+605+797、387+605+834、387+605+835、387+609+676、387+609+694、387+609+698、387+609+699、387+609+711、387+609+754、387+609+760、387+609+781、387+609+786、387+609+797、387+609+834、387+609+835、387+676+694、387+676+698、387+676+699、387+676+711、387+676+754、387+676+760、387+676+781、387+676+786、387+676+797、387+676+834、387+676+835、387+694+698、387+694+699、387+694+711、387+694+754、387+694+760、387+694+781、387+694+786、387+694+797、387+694+834、387+694+835、387+698+699、387+698+711、387+698+754、387+698+760、387+698+781、387+698+786、387+698+797、387+698+834、387+698+835、387+699+711、387+699+754、387+699+760、387+699+781、387+699+786、387+699+797、387+699+834、387+699+835、387+711+754、387+711+760、387+711+781、387+711+786、387+711+797、387+711+834、387+711+835、387+754+760、387+754+781、387+754+786、387+754+797、387+754+834、387+754+835、387+760+781、387+760+786、387+760+797、387+760+834、387+760+835、387+781+786、387+781+797、387+781+834、387+781+835、387+786+797、387+786+834、387+786+835、387+797+834、387+797+835、387+834+835、388+390+403、388+390+408、388+390+410、388+390+416、388+390+448、388+390+451、388+390+471、388+390+472、388+390+507、388+390+512、388+390+515、388+390+538、388+390+598、388+390+602、388+390+605、388+390+609、388+390+676、388+390+694、388+390+698、388+390+699、388+390+711、388+390+754、388+390+760、388+390+781、388+390+786、388+390+797、388+390+834、388+390+835、388+403+408、388+403+410、388+403+416、388+403+448、388+403+451、388+403+471、388+403+472、388+403+507、388+403+512、388+403+515、388+403+538、388+403+598、388+403+602、388+403+605、388+403+609、388+403+676、388+403+694、388+403+698、388+403+699、388+403+711、388+403+754、388+403+760、388+403+781、388+403+786、388+403+797、388+403+834、388+403+835、388+408+410、388+408+416、388+408+448、388+408+451、388+408+471、388+408+472、388+408+507、388+408+512、388+408+515、388+408+538、388+408+598、388+408+602、388+408+605、388+408+609、388+408+676、388+408+694、388+408+698、388+408+699、388+408+711、388+408+754、388+408+760、388+408+781、388+408+786、388+408+797、388+408+834、388+408+835、388+410+416、388+410+448、388+410+451、388+410+471、388+410+472、388+410+507、388+410+512、388+410+515、388+410+538、388+410+598、388+410+602、388+410+605、388+410+609、388+410+676、388+410+694、388+410+698、388+410+699、388+410+711、388+410+754、388+410+760、388+410+781、388+410+786、388+410+797、388+410+834、388+410+835、388+416+448、388+416+451、388+416+471、388+416+472、388+416+507、388+416+512、388+416+515、388+416+538、388+416+598、388+416+602、388+416+605、388+416+609、388+416+676、388+416+694、388+416+698、388+416+699、388+416+711、388+416+754、388+416+760、388+416+781、388+416+786、388+416+797、388+416+834、388+416+835、388+448+451、388+448+471、388+448+472、388+448+507、388+448+512、388+448+515、388+448+538、388+448+598、388+448+602、388+448+605、388+448+609、388+448+676、388+448+694、388+448+698、388+448+699、388+448+711、388+448+754、388+448+760、388+448+781、388+448+786、388+448+797、388+448+834、388+448+835、388+451+471、388+451+472、388+451+507、388+451+512、388+451+515、388+451+538、388+451+598、388+451+602、388+451+605、388+451+609、388+451+676、388+451+694、388+451+698、388+451+699、388+451+711、388+451+754、388+451+760、388+451+781、388+451+786、388+451+797、388+451+834、388+451+835、388+471+472、388+471+507、388+471+512、388+471+515、388+471+538、388+471+598、388+471+602、388+471+605、388+471+609、388+471+676、388+471+694、388+471+698、388+471+699、388+471+711、388+471+754、388+471+760、388+471+781、388+471+786、388+471+797、388+471+834、388+471+835、388+472+507、388+472+512、388+472+515、388+472+538、388+472+598、388+472+602、388+472+605、388+472+609、388+472+676、388+472+694、388+472+698、388+472+699、388+472+711、388+472+754、388+472+760、388+472+781、388+472+786、388+472+797、388+472+834、388+472+835、388+507+512、388+507+515、388+507+538、388+507+598、388+507+602、388+507+605、388+507+609、388+507+676、388+507+694、388+507+698、388+507+699、388+507+711、388+507+754、388+507+760、388+507+781、388+507+786、388+507+797、388+507+834、388+507+835、388+512+515、388+512+538、388+512+598、388+512+602、388+512+605、388+512+609、388+512+676、388+512+694、388+512+698、388+512+699、388+512+711、388+512+754、388+512+760、388+512+781、388+512+786、388+512+797、388+512+834、388+512+835、388+515+538、388+515+598、388+515+602、388+515+605、388+515+609、388+515+676、388+515+694、388+515+698、388+515+699、388+515+711、388+515+754、388+515+760、388+515+781、388+515+786、388+515+797、388+515+834、388+515+835、388+538+598、388+538+602、388+538+605、388+538+609、388+538+676、388+538+694、388+538+698、388+538+699、388+538+711、388+538+754、388+538+760、388+538+781、388+538+786、388+538+797、388+538+834、388+538+835、388+598+602、388+598+605、388+598+609、388+598+676、388+598+694、388+598+698、388+598+699、388+598+711、388+598+754、388+598+760、388+598+781、388+598+786、388+598+797、388+598+834、388+598+835、388+602+605、388+602+609、388+602+676、388+602+694、388+602+698、388+602+699、388+602+711、388+602+754、388+602+760、388+602+781、388+602+786、388+602+797、388+602+834、388+602+835、388+605+609、388+605+676、388+605+694、388+605+698、388+605+699、388+605+711、388+605+754、388+605+760、388+605+781、388+605+786、388+605+797、388+605+834、388+605+835、388+609+676、388+609+694、388+609+698、388+609+699、388+609+711、388+609+754、388+609+760、388+609+781、388+609+786、388+609+797、388+609+834、388+609+835、388+676+694、388+676+698、388+676+699、388+676+711、388+676+754、388+676+760、388+676+781、388+676+786、388+676+797、388+676+834、388+676+835、388+694+698、388+694+699、388+694+711、388+694+754、388+694+760、388+694+781、388+694+786、388+694+797、388+694+834、388+694+835、388+698+699、388+698+711、388+698+754、388+698+760、388+698+781、388+698+786、388+698+797、388+698+834、388+698+835、388+699+711、388+699+754、388+699+760、388+699+781、388+699+786、388+699+797、388+699+834、388+699+835、388+711+754、388+711+760、388+711+781、388+711+786、388+711+797、388+711+834、388+711+835、388+754+760、388+754+781、388+754+786、388+754+797、388+754+834、388+754+835、388+760+781、388+760+786、388+760+797、388+760+834、388+760+835、388+781+786、388+781+797、388+781+834、388+781+835、388+786+797、388+786+834、388+786+835、388+797+834、388+797+835、388+834+835、390+403+408、390+403+410、390+403+416、390+403+448、390+403+451、390+403+471、390+403+472、390+403+507、390+403+512、390+403+515、390+403+538、390+403+598、390+403+602、390+403+605、390+403+609、390+403+676、390+403+694、390+403+698、390+403+699、390+403+711、390+403+754、390+403+760、390+403+781、390+403+786、390+403+797、390+403+834、390+403+835、390+408+410、390+408+416、390+408+448、390+408+451、390+408+471、390+408+472、390+408+507、390+408+512、390+408+515、390+408+538、390+408+598、390+408+602、390+408+605、390+408+609、390+408+676、390+408+694、390+408+698、390+408+699、390+408+711、390+408+754、390+408+760、390+408+781、390+408+786、390+408+797、390+408+834、390+408+835、390+410+416、390+410+448、390+410+451、390+410+471、390+410+472、390+410+507、390+410+512、390+410+515、390+410+538、390+410+598、390+410+602、390+410+605、390+410+609、390+410+676、390+410+694、390+410+698、390+410+699、390+410+711、390+410+754、390+410+760、390+410+781、390+410+786、390+410+797、390+410+834、390+410+835、390+416+448、390+416+451、390+416+471、390+416+472、390+416+507、390+416+512、390+416+515、390+416+538、390+416+598、390+416+602、390+416+605、390+416+609、390+416+676、390+416+694、390+416+698、390+416+699、390+416+711、390+416+754、390+416+760、390+416+781、390+416+786、390+416+797、390+416+834、390+416+835、390+448+451、390+448+471、390+448+472、390+448+507、390+448+512、390+448+515、390+448+538、390+448+598、390+448+602、390+448+605、390+448+609、390+448+676、390+448+694、390+448+698、390+448+699、390+448+711、390+448+754、390+448+760、390+448+781、390+448+786、390+448+797、390+448+834、390+448+835、390+451+471、390+451+472、390+451+507、390+451+512、390+451+515、390+451+538、390+451+598、390+451+602、390+451+605、390+451+609、390+451+676、390+451+694、390+451+698、390+451+699、390+451+711、390+451+754、390+451+760、390+451+781、390+451+786、390+451+797、390+451+834、390+451+835、390+471+472、390+471+507、390+471+512、390+471+515、390+471+538、390+471+598、390+471+602、390+471+605、390+471+609、390+471+676、390+471+694、390+471+698、390+471+699、390+471+711、390+471+754、390+471+760、390+471+781、390+471+786、390+471+797、390+471+834、390+471+835、390+472+507、390+472+512、390+472+515、390+472+538、390+472+598、390+472+602、390+472+605、390+472+609、390+472+676、390+472+694、390+472+698、390+472+699、390+472+711、390+472+754、390+472+760、390+472+781、390+472+786、390+472+797、390+472+834、390+472+835、390+507+512、390+507+515、390+507+538、390+507+598、390+507+602、390+507+605、390+507+609、390+507+676、390+507+694、390+507+698、390+507+699、390+507+711、390+507+754、390+507+760、390+507+781、390+507+786、390+507+797、390+507+834、390+507+835、390+512+515、390+512+538、390+512+598、390+512+602、390+512+605、390+512+609、390+512+676、390+512+694、390+512+698、390+512+699、390+512+711、390+512+754、390+512+760、390+512+781、390+512+786、390+512+797、390+512+834、390+512+835、390+515+538、390+515+598、390+515+602、390+515+605、390+515+609、390+515+676、390+515+694、390+515+698、390+515+699、390+515+711、390+515+754、90+515+760、390+515+781、390+515+786、390+515+797、390+515+834、390+515+835、390+538+598、390+538+602、390+538+605、390+538+609、390+538+676、390+538+694、390+538+698、390+538+699、390+538+711、390+538+754、390+538+760、390+538+781、390+538+786、390+538+797、390+538+834、390+538+835、390+598+602、390+598+605、390+598+609、390+598+676、390+598+694、390+598+698、390+598+699、390+598+711、390+598+754、390+598+760、390+598+781、390+598+786、390+598+797、390+598+834、390+598+835、390+602+605、390+602+609、390+602+676、390+602+694、390+602+698、390+602+699、390+602+711、390+602+754、390+602+760、390+602+781、390+602+786、390+602+797、390+602+834、390+602+835、390+605+609、390+605+676、390+605+694、390+605+698、390+605+699、390+605+711、390+605+754、390+605+760、390+605+781、390+605+786、390+605+797、390+605+834、390+605+835、390+609+676、390+609+694、390+609+698、390+609+699、390+609+711、390+609+754、390+609+760、390+609+781、390+609+786、390+609+797、390+609+834、390+609+835、390+676+694、390+676+698、390+676+699.390+676+711、390+676+754、390+676+760、390+676+781、390+676+786、390+676+797、390+676+834、390+676+835、390+694+698、390+694+699、390+694+711、390+694+754、390+694+760、390+694+781、390+694+786、390+694+797、390+694+834、390+694+835、390+698+699、390+698+711、390+698+754、390+698+760、390+698+781、390+698+786、390+698+797、390+698+834、390+698+835、390+699+711、390+699+754、390+699+760、390+699+781、390+699+786、390+699+797、390+699+834、390+699+835、390+711+754、390+711+760、390+711+781、390+711+786、390+711+797、390+711+834、390+711+835、390+754+760、390+754+781、390+754+786、390+754+797、390+754+834、390+754+835、390+760+781、390+760+786、390+760+797、390+760+834、390+760+835、390+781+786、390+781+797、390+781+834、390+781+835、390+786+797、390+786+834、390+786+835、390+797+834、390+797+835、390+834+835、403+408+410、403+408+416、403+408+448、403+408+451、403+408+471、403+408+472、403+408+507、403+408+512、403+408+515、403+408+538、403+408+598、403+408+602、403+408+605、403+408+609、403+408+676、403+408+694、403+408+698、403+408+699、403+408+711、403+408+754、403+408+760、403+408+781、403+408+786、403+408+797、403+408+834、403+408+835、403+410+416、403+410+448、403+410+451、403+410+471、403+410+472、403+410+507、403+410+512、403+410+515、403+410+538、403+410+598、403+410+602、403+410+605、403+410+609、403+410+676、403+410+694、403+410+698、403+410+699、403+410+711、403+410+754、403+410+760、403+410+781、403+410+786、403+410+797、403+410+834、403+410+835、403+416+448、403+416+451、403+416+471、403+416+472、403+416+507、403+416+512、403+416+515、403+416+538、403+416+598、403+416+602、403+416+605、403+416+609、403+416+676、403+416+694、403+416+698、403+416+699、403+416+711、403+416+754、403+416+760、403+416+781、403+416+786、403+416+797、403+416+834、403+416+835、403+448+451、403+448+471、403+448+472、403+448+507、403+448+512、403+448+515、403+448+538、403+448+598、403+448+602、403+448+605、403+448+609、403+448+676、403+448+694、403+448+698、403+448+699、403+448+711、403+448+754、403+448+760、403+448+781、403+448+786、403+448+797、403+448+834、403+448+835、403+451+471、403+451+472、403+451+507、403+451+512、403+451+515.403+451+538、403+451+598、403+451+602、403+451+605、403+451+609、403+451+676、403+451+694、403+451+698、403+451+699、403+451+711、403+451+754、403+451+760、403+451+781、403+451+786、403+451+797、403+451+834、403+451+835、403+471+472、403+471+507、403+471+512、403+471+515、403+471+538、403+471+598、403+471+602、403+471+605、403+471+609、403+471+676、403+471+694、403+471+698、403+471+699、403+471+711、403+471+754、403+471+760、403+471+781、403+471+786、403+471+797、403+471+834、403+471+835、403+472+507、403+472+512、403+472+515、403+472+538、403+472+598、403+472+602、403+472+605、403+472+609、403+472+676、403+472+694、403+472+698、403+472+699、403+472+711、403+472+754、403+472+760、403+472+781、403+472+786、403+472+797、403+472+834、403+472+835、403+507+512、403+507+515、403+507+538、403+507+598、403+507+602、403+507+605、403+507+609、403+507+676、403+507+694、403+507+698、403+507+699、403+507+711、403+507+754、403+507+760、403+507+781、403+507+786、403+507+797、403+507+834、403+507+835、403+512+515、403+512+538、403+512+598、403+512+602、403+512+605、403+512+609、403+512+676、403+512+694、403+512+698、403+512+699、403+512+711、403+512+754、403+512+760、403+512+781、403+512+786、403+512+797、403+512+834、403+512+835、403+515+538、403+515+598、403+515+602、403+515+605、403+515+609、403+515+676、403+515+694、403+515+698、403+515+699、403+515+711、403+515+754、403+515+760、403+515+781、403+515+786、403+515+797、403+515+834、403+515+835、403+538+598、403+538+602、403+538+605、403+538+609、403+538+676、403+538+694、403+538+698、403+538+699、403+538+711、403+538+754、403+538+760、403+538+781、403+538+786、403+538+797、403+538+834、403+538+835、403+598+602、403+598+605、403+598+609、403+598+676、403+598+694、403+598+698、403+598+699、403+598+711、403+598+754、403+598+760、403+598+781、403+598+786、403+598+797、403+598+834、403+598+835、403+602+605、403+602+609、403+602+676、403+602+694、403+602+698、403+602+699、403+602+711、403+602+754、403+602+760、403+602+781、403+602+786、403+602+797、403+602+834、403+602+835、403+605+609、403+605+676、403+605+694、403+605+698、403+605+699、403+605+711、403+605+754、403+605+760、403+605+781、403+605+786、403+605+797、403+605+834、403+605+835、403+609+676、403+609+694、403+609+698、403+609+699、403+609+711、403+609+754、403+609+760、403+609+781、403+609+786、403+609+797、403+609+834、403+609+835、403+676+694、403+676+698、403+676+699、403+676+711、403+676+754、403+676+760、403+676+781、403+676+786、403+676+797、403+676+834、403+676+835、403+694+698、403+694+699、403+694+711、403+694+754、403+694+760、403+694+781、403+694+786、403+694+797、403+694+834、403+694+835、403+698+699、403+698+711、403+698+754、403+698+760、403+698+781、403+698+786、403+698+797、403+698+834、403+698+835、403+699+711、403+699+754、403+699+760、403+699+781、403+699+786、403+699+797、403+699+834、403+699+835、403+711+754、403+711+760、403+711+781、403+711+786、403+711+797、403+711+834、403+711+835、403+754+760、403+754+781、403+754+786、403+754+797、403+754+834、403+754+835、403+760+781、403+760+786、403+760+797、403+760+834、403+760+835、403+781+786、403+781+797、403+781+834、403+781+835、403+786+797、403+786+834、403+786+835、403+797+834、403+797+835、403+834+835、408+410+416、408+410+448、408+410+451、408+410+471、408+410+472、408+410+507、408+410+512、408+410+515、408+410+538、408+410+598、408+410+602、408+410+605、408+410+609、408+410+676、408+410+694、408+410+698、408+410+699、408+410+711、408+410+754、408+410+760、408+410+781、408+410+786、408+410+797、408+410+834、408+410+835、408+416+448、408+416+451、408+416+471、408+416+472、408+416+507、408+416+512、408+416+515、408+416+538、408+416+598、408+416+602、408+416+605、408+416+609、408+416+676、408+416+694、408+416+698、408+416+699、408+416+711、408+416+754、408+416+760、408+416+781、408+416+786、408+416+797、408+416+834、408+416+835、408+448+451、408+448+471、408+448+472、408+448+507、408+448+512、408+448+515、408+448+538、408+448+598、408+448+602、408+448+605、408+448+609、408+448+676、408+448+694、408+448+698、408+448+699、408+448+711、408+448+754、408+448+760、408+448+781、408+448+786、408+448+797、408+448+834、408+448+835、408+451+471、408+451+472、408+451+507、408+451+512、408+451+515、408+451+538、408+451+598、408+451+602、408+451+605、408+451+609、408+451+676、408+451+694、408+451+698、408+451+699、408+451+711、408+451+754、408+451+760、408+451+781、408+451+786、408+451+797、408+451+834、408+451+835、408+471+472、408+471+507、408+471+512、408+471+515、408+471+538、408+471+598、408+471+602、408+471+605、408+471+609、408+471+676、408+471+694、408+471+698、408+471+699、408+471+711、408+471+754、408+471+760、408+471+781、408+471+786、408+471+797、408+471+834、408+471+835、408+472+507、408+472+512、408+472+515、408+472+538、408+472+598、408+472+602、408+472+605、408+472+609、408+472+676、408+472+694、408+472+698、408+472+699、408+472+711、408+472+754、408+472+760、408+472+781、408+472+786、408+472+797、408+472+834、408+472+835、408+507+512、408+507+515、408+507+538、408+507+598、408+507+602、408+507+605、408+507+609、408+507+676、408+507+694、408+507+698、408+507+699、408+507+711、408+507+754、408+507+760、408+507+781、408+507+786、408+507+797、408+507+834、408+507+835、408+512+515、408+512+538、408+512+598、408+512+602、408+512+605、408+512+609、408+512+676、408+512+694、408+512+698、408+512+699、408+512+711、408+512+754、408+512+760、408+512+781、408+512+786、408+512+797、408+512+834、408+512+835、408+515+538、408+515+598、408+515+602、408+515+605、408+515+609、408+515+676、408+515+694、408+515+698、408+515+699、408+515+711、408+515+754、408+515+760、408+515+781、408+515+786、408+515+797、408+515+834、408+515+835、408+538+598、408+538+602、408+538+605、408+538+609、408+538+676、408+538+694、408+538+698、408+538+699、408+538+711、408+538+754、408+538+760、408+538+781、408+538+786、408+538+797、408+538+834、408+538+835、408+598+602、408+598+605、408+598+609、408+598+676、408+598+694、408+598+698、408+598+699、408+598+711、408+598+754、408+598+760、408+598+781、408+598+786、408+598+797、408+598+834、408+598+835、408+602+605、408+602+609、408+602+676、408+602+694、408+602+698、408+602+699、408+602+711、408+602+754、408+602+760、408+602+781、408+602+786、408+602+797、408+602+834、408+602+835、408+605+609、408+605+676、408+605+694、408+605+698、408+605+699、408+605+711、408+605+754、408+605+760、408+605+781、408+605+786、408+605+797、408+605+834、408+605+835、408+609+676、408+609+694、408+609+698、408+609+699、408+609+711、408+609+754、408+609+760、408+609+781、408+609+786、408+609+797、408+609+834、408+609+835、408+676+694、408+676+698、408+676+699、408+676+711、408+676+754、408+676+760、408+676+781、408+676+786、408+676+797、408+676+834、408+676+835、408+694+698、408+694+699、408+694+711、408+694+754、408+694+760、408+694+781、408+694+786、408+694+797、408+694+834、408+694+835、408+698+699、408+698+711、408+698+754、408+698+760、408+698+781、408+698+786、408+698+797、408+698+834、408+698+835、408+699+711、408+699+754、408+699+760、408+699+781、408+699+786、408+699+797、408+699+834、408+699+835、408+711+754、408+711+760、408+711+781、408+711+786、408+711+797、408+711+834、408+711+835、408+754+760、408+754+781、408+754+786、408+754+797、408+754+834、408+754+835、408+760+781、408+760+786、408+760+797、408+760+834、408+760+835、408+781+786、408+781+797、408+781+834、408+781+835、408+786+797、408+786+834、408+786+835、408+797+834、408+797+835、408+834+835、410+416+448、410+416+451、410+416+471、410+416+472、410+416+507、410+416+512、410+416+515、410+416+538、410+416+598、410+416+602、410+416+605、410+416+609、410+416+676、410+416+694、410+416+698、410+416+699、410+416+711、410+416+754、410+416+760、410+416+781、410+416+786、410+416+797、410+416+834、410+416+835、410+448+451、410+448+471、410+448+472、410+448+507、410+448+512、410+448+515、410+448+538、410+448+598、410+448+602、410+448+605、410+448+609、410+448+676、410+448+694、410+448+698、410+448+699、410+448+711、410+448+754、410+448+760、410+448+781、410+448+786、410+448+797、410+448+834、410+448+835、410+451+471、410+451+472、410+451+507、410+451+512、410+451+515、410+451+538、410+451+598、410+451+602、410+451+605、410+451+609、410+451+676、410+451+694、410+451+698、410+451+699、410+451+711、410+451+754、410+451+760、410+451+781、410+451+786、410+451+797、410+451+834、410+451+835、410+471+472、410+471+507、410+471+512、410+471+515、410+471+538、410+471+598、410+471+602、410+471+605、410+471+609、410+471+676、410+471+694、410+471+698、410+471+699、410+471+711、410+471+754、410+471+760、410+471+781、410+471+786、410+471+797、410+471+834、410+471+835、410+472+507、410+472+512、410+472+515、410+472+538、410+472+598、410+472+602、410+472+605、410+472+609、410+472+676、410+472+694、410+472+698、410+472+699、410+472+711、410+472+754.410+472+760、410+472+781、410+472+786、410+472+797、410+472+834、410+472+835、410+507+512、410+507+515、410+507+538、410+507+598、410+507+602、410+507+605、410+507+609、410+507+676、410+507+694、410+507+698、410+507+699、410+507+711、410+507+754、410+507+760、410+507+781、410+507+786、410+507+797、410+507+834、410+507+835、410+512+515、410+512+538、410+512+598、410+512+602、410+512+605、410+512+609、410+512+676、410+512+694、410+512+698、410+512+699、410+512+711、410+512+754、410+512+760、410+512+781、410+512+786、410+512+797、410+512+834、410+512+835、410+515+538、410+515+598、410+515+602、410+515+605、410+515+609、410+515+676、410+515+694、410+515+698、410+515+699、410+515+711、410+515+754、410+515+760、410+515+781、410+515+786、410+515+797、410+515+834、410+515+835、410+538+598、410+538+602、410+538+605、410+538+609、410+538+676、410+538+694、410+538+698、410+538+699、410+538+711、410+538+754、410+538+760、410+538+781、410+538+786、410+538+797、410+538+834、410+538+835、410+598+602、410+598+605、410+598+609、410+598+676、410+598+694、410+598+698、410+598+699、410+598+711、410+598+754、410+598+760、410+598+781、410+598+786、410+598+797、410+598+834、410+598+835、410+602+605、410+602+609、410+602+676、410+602+694、410+602+698、410+602+699、410+602+711、410+602+754、410+602+760、410+602+781、410+602+786、410+602+797、410+602+834、410+602+835、410+605+609、410+605+676、410+605+694、410+605+698、410+605+699、410+605+711、410+605+754、410+605+760、410+605+781、410+605+786、410+605+797、410+605+834、410+605+835、410+609+676、410+609+694、410+609+698、410+609+699、410+609+711、410+609+754、410+609+760、410+609+781、410+609+786、410+609+797、410+609+834、410+609+835、410+676+694、410+676+698、410+676+699、410+676+711、410+676+754、410+676+760、410+676+781、410+676+786、410+676+797、410+676+834、410+676+835、410+694+698、410+694+699、410+694+711、410+694+754、410+694+760、410+694+781、410+694+786、410+694+797、410+694+834、410+694+835、410+698+699、410+698+711、410+698+754、410+698+760、410+698+781、410+698+786、410+698+797、410+698+834、410+698+835、410+699+711、410+699+754、410+699+760、410+699+781、410+699+786、410+699+797、410+699+834、410+699+835、410+711+754、410+711+760、410+711+781、410+711+786、410+711+797、410+711+834、410+711+835、410+754+760、410+754+781、410+754+786、410+754+797、410+754+834、410+754+835、410+760+781、410+760+786、410+760+797、410+760+834、410+760+835、410+781+786、410+781+797、410+781+834、410+781+835、410+786+797、410+786+834、410+786+835、410+797+834、410+797+835、410+834+835、416+448+451、416+448+471、416+448+472、416+448+507、416+448+512、416+448+515、416+448+538、416+448+598、416+448+602、416+448+605、416+448+609、416+448+676、416+448+694、416+448+698、416+448+699、416+448+711、416+448+754、416+448+760、416+448+781、416+448+786、416+448+797、416+448+834、416+448+835、416+451+471、416+451+472、416+451+507、416+451+512、416+451+515、416+451+538、416+451+598、416+451+602、416+451+605、416+451+609、416+451+676、416+451+694、416+451+698、416+451+699、416+451+711、416+451+754、416+451+760、416+451+781、416+451+786、416+451+797、416+451+834、416+451+835、416+471+472、416+471+507、416+471+512、416+471+515、416+471+538、416+471+598、416+471+602、416+471+605、416+471+609、416+471+676、416+471+694、416+471+698、416+471+699、416+471+711、416+471+754、416+471+760、416+471+781、416+471+786、416+471+797、416+471+834、416+471+835、416+472+507、416+472+512、416+472+515、416+472+538、416+472+598、416+472+602、416+472+605、416+472+609、416+472+676、416+472+694、416+472+698、416+472+699、416+472+711、416+472+754、416+472+760、416+472+781、416+472+786、416+472+797、416+472+834、416+472+835、416+507+512、416+507+515、416+507+538、416+507+598、416+507+602、416+507+605、416+507+609、416+507+676、416+507+694、416+507+698、416+507+699、416+507+711、416+507+754、416+507+760、416+507+781、416+507+786、416+507+797、416+507+834、416+507+835、416+512+515、416+512+538、416+512+598、416+512+602、416+512+605、416+512+609、416+512+676、416+512+694、416+512+698、416+512+699、416+512+711、416+512+754、416+512+760、416+512+781、416+512+786、416+512+797、416+512+834、416+512+835、416+515+538、416+515+598、416+515+602、416+515+605、416+515+609、416+515+676、416+515+694、416+515+698、416+515+699、416+515+711、416+515+754、416+515+760、416+515+781、416+515+786、416+515+797、416+515+834、416+515+835、416+538+598、416+538+602、416+538+605、416+538+609、416+538+676、416+538+694、416+538+698、416+538+699、416+538+711、416+538+754、416+538+760、416+538+781、416+538+786、416+538+797、416+538+834、416+538+835、416+598+602、416+598+605、416+598+609、416+598+676、416+598+694、416+598+698、416+598+699、416+598+711、416+598+754、416+598+760、416+598+781、416+598+786、416+598+797、416+598+834、416+598+835、416+602+605、416+602+609、416+602+676、416+602+694、416+602+698、416+602+699、416+602+711、416+602+754、416+602+760、416+602+781、416+602+786、416+602+797、416+602+834、416+602+835、416+605+609、416+605+676、416+605+694、416+605+698、416+605+699、416+605+711、416+605+754、416+605+760、416+605+781、416+605+786、416+605+797、416+605+834、416+605+835、416+609+676、416+609+694、416+609+698、416+609+699、416+609+711、416+609+754、416+609+760、416+609+781、416+609+786、416+609+797、416+609+834、416+609+835、416+676+694、416+676+698、416+676+699、416+676+711、416+676+754、416+676+760、416+676+781、416+676+786、416+676+797、416+676+834、416+676+835、416+694+698、416+694+699、416+694+711、416+694+754、416+694+760、416+694+781、416+694+786、416+694+797、416+694+834、416+694+835、416+698+699、416+698+711、416+698+754、416+698+760、416+698+781、416+698+786、416+698+797、416+698+834、416+698+835、416+699+711、416+699+754、416+699+760、416+699+781、416+699+786、416+699+797、416+699+834、416+699+835、416+711+754、416+711+760、416+711+781、416+711+786、416+711+797、416+711+834、416+711+835、416+754+760、416+754+781、416+754+786、416+754+797、416+754+834、416+754+835、416+760+781、416+760+786、416+760+797、416+760+834、416+760+835、416+781+786、416+781+797、416+781+834、416+781+835、416+786+797、416+786+834、416+786+835、416+797+834、416+797+835、416+834+835、448+451+471、448+451+472、448+451+507、448+451+512、448+451+515、448+451+538、448+451+598、448+451+602、448+451+605、448+451+609、448+451+676、448+451+694、448+451+698448+451+699、448+451+711、448+451+754、448+451+760、448+451+781、448+451+786、448+451+797、448+451+834、448+451+835、448+471+472、448+471+507、448+471+512、448+471+515、448+471+538、448+471+598、448+471+602、448+471+605、448+471+609、448+471+676、448+471+694、448+471+698、448+471+699、448+471+711、448+471+754、448+471+760、448+471+781、448+471+786、448+471+797、448+471+834、448+471+835、448+472+507、448+472+512、448+472+515、448+472+538、448+472+598、448+472+602、448+472+605、448+472+609、448+472+676、448+472+694、448+472+698、448+472+699、448+472+711、448+472+754、448+472+760、448+472+781、448+472+786、448+472+797、448+472+834、448+472+835、448+507+512、448+507+515、448+507+538、448+507+598、448+507+602、448+507+605、448+507+609、448+507+676、448+507+694、448+507+698、448+507+699、448+507+711、448+507+754、448+507+760、448+507+781、448+507+786、448+507+797、448+507+834、448+507+835、448+512+515、448+512+538、448+512+598、448+512+602、448+512+605、448+512+609、448+512+676、448+512+694、448+512+698、448+512+699、448+512+711、448+512+754、448+512+760、448+512+781、448+512+786、448+512+797、448+512+834、448+512+835、448+515+538、448+515+598、448+515+602、448+515+605、448+515+609、448+515+676、448+515+694、448+515+698、448+515+699、448+515+711、448+515+754、448+515+760、448+515+781、448+515+786、448+515+797、448+515+834、448+515+835、448+538+598、448+538+602、448+538+605、448+538+609、448+538+676、448+538+694、448+538+698、448+538+699、448+538+711、448+538+754、448+538+760、448+538+781、448+538+786、448+538+797、448+538+834、448+538+835、448+598+602、448+598+605、448+598+609、448+598+676、448+598+694、448+598+698、448+598+699、448+598+711、448+598+754、448+598+760、448+598+781、448+598+786、448+598+797、448+598+834、448+598+835、448+602+605、448+602+609、448+602+676、448+602+694、448+602+698、448+602+699、448+602+711、448+602+754、448+602+760、448+602+781、448+602+786、448+602+797、448+602+834、448+602+835、448+605+609、448+605+676、448+605+694、448+605+698、448+605+699、448+605+711、448+605+754、448+605+760、448+605+781、448+605+786、448+605+797、448+605+834、448+605+835、448+609+676、448+609+694、448+609+698、448+609+699、448+609+711、448+609+754、448+609+760、448+609+781、448+609+786、448+609+797、448+609+834、448+609+835、448+676+694、448+676+698、448+676+699、448+676+711、448+676+754、448+676+760、448+676+781、448+676+786、448+676+797、448+676+834、448+676+835、448+694+698、448+694+699、448+694+711、448+694+754、448+694+760、448+694+781、448+694+786、448+694+797、448+694+834、448+694+835、448+698+699、448+698+711、448+698+754、448+698+760、448+698+781、448+698+786、448+698+797、448+698+834、448+698+835、448+699+711、448+699+754、448+699+760、448+699+781、448+699+786、448+699+797、448+699+834、448+699+835、448+711+754、448+711+760、448+711+781、448+711+786、448+711+797、448+711+834、448+711+835、448+754+760、448+754+781、448+754+786、448+754+797、448+754+834、448+754+835、448+760+781、448+760+786、448+760+797、448+760+834、448+760+835、448+781+786、448+781+797、448+781+834、448+781+835、448+786+797、448+786+834、448+786+835、448+797+834、448+797+835、448+834+835、451+471+472、451+471+507、451+471+512、451+471+515、451+471+538、451+471+598、451+471+602、451+471+605、451+471+609、451+471+676、451+471+694、451+471+698、451+471+699、451+471+711、451+471+754、451+471+760、451+471+781、451+471+786、451+471+797、451+471+834、451+471+835、451+472+507、451+472+512、451+472+515、451+472+538、451+472+598、451+472+602、451+472+605、451+472+609、451+472+676、451+472+694、451+472+698、451+472+699、451+472+711、451+472+754、451+472+760、451+472+781、451+472+786、451+472+797、451+472+834、451+472+835、451+507+512、451+507+515、451+507+538、451+507+598、451+507+602、451+507+605、451+507+609、451+507+676、451+507+694、451+507+698、451+507+699、451+507+711、451+507+754、451+507+760、451+507+781、451+507+786、451+507+797、451+507+834、451+507+835、451+512+515、451+512+538、451+512+598、451+512+602、451+512+605、451+512+609、451+512+676、451+512+694、451+512+698、451+512+699、451+512+711、451+512+754、451+512+760、451+512+781、451+512+786、451+512+797、451+512+834、451+512+835、451+515+538、451+515+598、451+515+602、451+515+605、451+515+609、451+515+676、451+515+694、451+515+698、451+515+699、451+515+711、451+515+754、451+515+760、451+515+781、451+515+786、451+515+797、451+515+834、451+515+835、451+538+598、451+538+602、451+538+605、451+538+609、451+538+676、451+538+694、451+538+698、451+538+699、451+538+711、451+538+754、451+538+760、451+538+781、451+538+786、451+538+797、451+538+834、451+538+835、451+598+602、451+598+605、451+598+609、451+598+676、451+598+694、451+598+698、451+598+699、451+598+711、451+598+754、451+598+760、451+598+781、451+598+786、451+598+797、451+598+834、451+598+835、451+602+605、451+602+609、451+602+676、451+602+694、451+602+698、451+602+699、451+602+711、451+602+754、451+602+760、451+602+781、451+602+786、451+602+797、451+602+834、451+602+835、451+605+609、451+605+676、451+605+694、451+605+698、451+605+699、451+605+711、451+605+754、451+605+760、451+605+781、451+605+786、451+605+797、451+605+834、451+605+835、451+609+676、451+609+694、451+609+698、451+609+699、451+609+711、451+609+754、451+609+760、451+609+781、451+609+786、451+609+797、451+609+834、451+609+835、451+676+694、451+676+698、451+676+699、451+676+711、451+676+754、451+676+760、451+676+781、451+676+786、451+676+797、451+676+834、451+676+835、451+694+698、451+694+699、451+694+711、451+694+754、451+694+760、451+694+781、451+694+786、451+694+797、451+694+834、451+694+835、451+698+699、451+698+711、451+698+754、451+698+760、451+698+781、451+698+786、451+698+797、451+698+834、451+698+835、451+699+711、451+699+754、451+699+760、451+699+781、451+699+786、451+699+797、451+699+834、451+699+835、451+711+754、451+711+760、451+711+781、451+711+786、451+711+797、451+711+834、451+711+835、451+754+760、451+754+781、451+754+786、451+754+797、451+754+834、451+754+835、451+760+781、451+760+786、451+760+797、451+760+834、451+760+835、451+781+786、451+781+797、451+781+834、451+781+835、451+786+797、451+786+834、451+786+835、451+797+834、451+797+835、451+834+835、471+472+507、471+472+512、471+472+515、471+472+538、471+472+598、471+472+602、471+472+605、471+472+609、471+472+676、471+472+694、471+472+698、471+472+699、471+472+711、471+472+754、471+472+760、471+472+781、471+472+786、471+472+797、471+472+834、471+472+835、471+507+512、471+507+515、471+507+538、471+507+598、471+507+602、471+507+605、471+507+609、471+507+676、471+507+694、471+507+698、471+507+699、471+507+711、471+507+754、471+507+760、471+507+781、471+507+786、471+507+797、471+507+834、471+507+835、471+512+515、471+512+538、471+512+598、471+512+602、471+512+605、471+512+609、471+512+676、471+512+694、471+512+698、471+512+699、471+512+711、471+512+754、471+512+760、471+512+781、471+512+786、471+512+797、471+512+834、471+512+835、471+515+538、471+515+598、471+515+602、471+515+605、471+515+609、471+515+676、471+515+694、471+515+698、471+515+699、471+515+711、471+515+754、471+515+760、471+515+781、471+515+786、471+515+797、471+515+834、471+515+835、471+538+598、471+538+602、471+538+605、471+538+609、471+538+676、471+538+694、471+538+698、471+538+699、471+538+711、471+538+754、471+538+760、471+538+781、471+538+786、471+538+797、471+538+834、471+538+835、471+598+602、471+598+605、471+598+609、471+598+676、471+598+694、471+598+698、471+598+699、471+598+711、471+598+754、471+598+760、471+598+781、471+598+786、471+598+797、471+598+834、471+598+835、471+602+605、471+602+609、471+602+676、471+602+694、471+602+698、471+602+699、471+602+711、471+602+754、471+602+760、471+602+781、471+602+786、471+602+797、471+602+834、471+602+835、471+605+609、471+605+676、471+605+694、471+605+698、471+605+699、471+605+711、471+605+754、471+605+760、471+605+781、471+605+786、471+605+797、471+605+834、471+605+835、471+609+676、471+609+694、471+609+698、471+609+699、471+609+711、471+609+754、471+609+760、471+609+781、471+609+786、471+609+797、471+609+834、471+609+835、471+676+694、471+676+698、471+676+699、471+676+711、471+676+754、471+676+760、471+676+781、471+676+786、471+676+797、471+676+834、471+676+835、471+694+698、471+694+699、471+694+711、471+694+754、471+694+760、471+694+781、471+694+786、471+694+797、471+694+834、471+694+835、471+698+699、471+698+711、471+698+754、471+698+760、471+698+781、471+698+786、471+698+797、471+698+834、471+698+835、471+699+711、471+699+754、471+699+760、471+699+781、471+699+786、471+699+797、471+699+834、471+699+835、471+711+754、471+711+760、471+711+781、471+711+786、471+711+797、471+711+834、471+711+835、471+754+760、471+754+781、471+754+786、471+754+797、471+754+834、471+754+835、471+760+781、471+760+786、471+760+797、471+760+834、471+760+835、471+781+786、471+781+797、471+781+834、471+781+835、471+786+797、471+786+834、471+786+835、471+797+834、471+797+835、471+834+835、472+507+512、472+507+515、472+507+538、472+507+598、472+507+602、472+507+605、472+507+609、472+507+676、472+507+694、472+507+698、472+507+699、472+507+711、472+507+754、472+507+760、472+507+781、472+507+786、472+507+797、472+507+834、472+507+835、472+512+515、472+512+538、472+512+598、472+512+602、472+512+605、472+512+609、472+512+676、472+512+694、472+512+698、472+512+699、472+512+711、472+512+754、472+512+760、472+512+781、472+512+786、472+512+797、472+512+834、472+512+835、472+515+538、472+515+598、472+515+602、472+515+605、472+515+609、472+515+676、472+515+694、472+515+698、472+515+699、472+515+711、472+515+754、472+515+760、472+515+781、472+515+786、472+515+797、472+515+834、472+515+835、472+538+598、472+538+602、472+538+605、472+538+609、472+538+676、472+538+694、472+538+698、472+538+699、472+538+711、472+538+754、472+538+760、472+538+781、472+538+786、472+538+797、472+538+834、472+538+835、472+598+602、472+598+605、472+598+609、472+598+676、472+598+694、472+598+698、472+598+699、472+598+711、472+598+754、472+598+760、472+598+781、472+598+786、472+598+797、472+598+834、472+598+835、472+602+605、472+602+609、472+602+676、472+602+694、472+602+698、472+602+699、472+602+711、472+602+754、472+602+760、472+602+781、472+602+786、472+602+797、472+602+834、472+602+835、472+605+609、472+605+676、472+605+694、472+605+698、472+605+699、472+605+711、472+605+754、472+605+760、472+605+781、472+605+786、472+605+797、472+605+834、472+605+835、472+609+676、472+609+694、472+609+698、472+609+699、472+609+711、472+609+754、472+609+760、472+609+781、472+609+786、472+609+797、472+609+834、472+609+835、472+676+694、472+676+698、472+676+699、472+676+711、472+676+754、472+676+760、472+676+781、472+676+786、472+676+797、472+676+834、472+676+835、472+694+698、472+694+699、472+694+711、472+694+754、472+694+760、472+694+781、472+694+786、472+694+797、472+694+834、472+694+835、472+698+699、472+698+711、472+698+754、472+698+760、472+698+781、472+698+786、472+698+797、472+698+834、472+698+835、472+699+711、472+699+754、472+699+760、472+699+781、472+699+786、472+699+797、472+699+834、472+699+835、472+711+754、472+711+760、472+711+781、472+711+786、472+711+797、472+711+834、472+711+835、472+754+760、472+754+781、472+754+786、472+754+797、472+754+834、472+754+835、472+760+781、472+760+786、472+760+797、472+760+834、472+760+835、472+781+786、472+781+797、472+781+834、472+781+835、472+786+797、472+786+834、472+786+835、472+797+834、472+797+835、472+834+835、507+512+515、507+512+538、507+512+598、507+512+602、507+512+605、507+512+609、507+512+676、507+512+694、507+512+698、507+512+699、507+512+711、507+512+754、507+512+760、507+512+781、507+512+786、507+512+797、507+512+834、507+512+835、507+515+538、507+515+598、507+515+602、507+515+605、507+515+609、507+515+676、507+515+694、507+515+698、507+515+699、507+515+711、507+515+754、507+515+760、507+515+781、507+515+786、507+515+797、507+515+834、507+515+835、507+538+598、507+538+602、507+538+605、507+538+609、507+538+676、507+538+694、507+538+698、507+538+699、507+538+711、507+538+754、507+538+760、507+538+781、507+538+786、507+538+797、507+538+834、507+538+835、507+598+602、507+598+605、507+598+609、507+598+676、507+598+694、507+598+698、507+598+699、507+598+711、507+598+754、507+598+760、507+598+781、507+598+786、507+598+797、507+598+834、507+598+835、507+602+605、507+602+609、507+602+676、507+602+694、507+602+698、507+602+699、507+602+711、507+602+754、507+602+760、507+602+781、507+602+786、507+602+797、507+602+834、507+602+835、507+605+609、507+605+676、507+605+694、507+605+698、507+605+699、507+605+711、507+605+754、507+605+760、507+605+781、507+605+786、507+605+797、507+605+834、507+605+835、507+609+676、507+609+694、507+609+698、507+609+699、507+609+711、507+609+754、507+609+760、507+609+781、507+609+786、507+609+797、507+609+834、507+609+835、507+676+694、507+676+698、507+676+699、507+676+711、507+676+754、507+676+760、507+676+781、507+676+786、507+676+797、507+676+834、507+676+835、507+694+698、507+694+699、507+694+711、507+694+754、507+694+760、507+694+781、507+694+786、507+694+797、507+694+834、507+694+835、507+698+699、507+698+711、507+698+754、507+698+760、507+698+781、507+698+786、507+698+797、507+698+834、507+698+835、507+699+711、507+699+754、507+699+760、507+699+781、507+699+786、507+699+797、507+699+834、507+699+835、507+711+754、507+711+760、507+711+781、507+711+786、507+711+797、507+711+834、507+711+835、507+754+760、507+754+781、507+754+786、507+754+797、507+754+834、507+754+835、507+760+781、507+760+786、507+760+797、507+760+834、507+760+835、507+781+786、507+781+797、507+781+834、507+781+835、507+786+797、507+786+834、507+786+835、507+797+834、507+797+835、507+834+835、512+515+538、512+515+598、512+515+602、512+515+605、512+515+609、512+515+676、512+515+694、512+515+698、512+515+699、512+515+711、512+515+754、512+515+760、512+515+781、512+515+786、512+515+797、512+515+834、512+515+835、512+538+598、512+538+602、512+538+605、512+538+609、512+538+676、512+538+694、512+538+698、512+538+699、512+538+711、512+538+754、512+538+760、512+538+781、512+538+786、512+538+797、512+538+834、512+538+835、512+598+602、512+598+605、512+598+609、512+598+676、512+598+694、512+598+698、512+598+699、512+598+711、512+598+754、512+598+760、512+598+781、512+598+786、512+598+797、512+598+834、512+598+835、512+602+605、512+602+609、512+602+676、512+602+694、512+602+698、512+602+699、512+602+711、512+602+754、512+602+760、512+602+781、512+602+786、512+602+797、512+602+834、512+602+835、512+605+609、512+605+676、512+605+694、512+605+698、512+605+699、512+605+711、512+605+754、512+605+760、512+605+781、512+605+786、512+605+797、512+605+834、512+605+835、512+609+676、512+609+694、512+609+698、512+609+699、512+609+711、512+609+754、512+609+760、512+609+781、512+609+786、512+609+797、512+609+834、512+609+835、512+676+694、512+676+698、512+676+699、512+676+711、512+676+754、512+676+760、512+676+781、512+676+786、512+676+797、512+676+834、512+676+835、512+694+698、512+694+699、512+694+711、512+694+754、512+694+760、512+694+781、512+694+786、512+694+797、512+694+834、512+694+835、512+698+699、512+698+711、512+698+754、512+698+760、512+698+781、512+698+786、512+698+797、512+698+834、512+698+835、512+699+711、512+699+754、512+699+760、512+699+781、512+699+786、512+699+797、512+699+834、512+699+835、512+711+754、512+711+760、512+711+781、512+711+786、512+711+797、512+711+834、512+711+835、512+754+760、512+754+781、512+754+786、512+754+797、512+754+834、512+754+835、512+760+781、512+760+786、512+760+797、512+760+834、512+760+835、512+781+786、512+781+797、512+781+834、512+781+835、512+786+797、512+786+834、512+786+835、512+797+834、512+797+835、512+834+835、515+538+598、515+538+602、515+538+605、515+538+609、515+538+676、515+538+694、515+538+698、515+538+699、515+538+711、515+538+754、515+538+760、515+538+781、515+538+786、515+538+797、515+538+834、515+538+835、515+598+602、515+598+605、515+598+609、515+598+676、515+598+694、515+598+698、515+598+699、515+598+711、515+598+754、515+598+760、515+598+781、515+598+786、515+598+797、515+598+834、515+598+835、515+602+605、515+602+609、515+602+676、515+602+694、515+602+698、515+602+699、515+602+711、515+602+754、515+602+760、515+602+781、515+602+786、515+602+797、515+602+834、515+602+835、515+605+609、515+605+676、515+605+694、515+605+698、515+605+699、515+605+711、515+605+754、515+605+760、515+605+781、515+605+786、515+605+797、515+605+834、515+605+835、515+609+676、515+609+694、515+609+698、515+609+699、515+609+711、515+609+754、515+609+760、515+609+781、515+609+786、515+609+797、515+609+834、515+609+835、515+676+694、515+676+698、515+676+699、515+676+711、515+676+754、515+676+760、515+676+781、515+676+786、515+676+797、515+676+834、515+676+835、515+694+698、515+694+699、515+694+711、515+694+754、515+694+760、515+694+781、515+694+786、515+694+797、515+694+834、515+694+835、515+698+699、515+698+711、515+698+754、515+698+760、515+698+781、515+698+786、515+698+797、515+698+834、515+698+835、515+699+711、515+699+754、515+699+760、515+699+781、515+699+786、515+699+797、515+699+834、515+699+835、515+711+754、515+711+760、515+711+781、515+711+786、515+711+797、515+711+834、515+711+835、515+754+760、515+754+781、515+754+786、515+754+797、515+754+834、515+754+835、515+760+781、515+760+786、515+760+797、515+760+834、515+760+835、515+781+786、515+781+797、515+781+834、515+781+835、515+786+797、515+786+834、515+786+835、515+797+834、515+797+835、515+834+835、538+598+602、538+598+605、538+598+609、538+598+676、538+598+694、538+598+698、538+598+699、538+598+711、538+598+754、538+598+760、538+598+781、538+598+786、538+598+797、538+598+834、538+598+835、538+602+605、538+602+609、538+602+676、538+602+694、538+602+698、538+602+699、538+602+711、538+602+754、538+602+760、538+602+781、538+602+786、538+602+797、538+602+834、538+602+835、538+605+609、538+605+676、538+605+694、538+605+698、538+605+699、538+605+711、538+605+754、538+605+760、538+605+781、538+605+786、538+605+797、538+605+834、538+605+835、538+609+676、538+609+694、538+609+698、538+609+699、538+609+711、538+609+754、538+609+760、538+609+781、538+609+786、538+609+797、538+609+834、538+609+835、538+676+694、538+676+698、538+676+699、538+676+711、538+676+754、538+676+760、538+676+781、538+676+786、538+676+797、538+676+834、538+676+835、538+694+698、538+694+699、538+694+711、538+694+754、538+694+760、538+694+781、538+694+786、538+694+797、538+694+834、538+694+835、538+698+699、538+698+711、538+698+754、538+698+760、538+698+781、538+698+786、538+698+797、538+698+834、538+698+835、538+699+711、538+699+754、538+699+760、538+699+781、538+699+786、538+699+797、538+699+834、538+699+835、538+711+754、538+711+760、538+711+781、538+711+786、538+711+797、538+711+834、538+711+835、538+754+760、538+754+781、538+754+786、538+754+797、538+754+834、538+754+835、538+760+781、538+760+786、538+760+797、538+760+834、538+760+835、538+781+786、538+781+797、538+781+834、538+781+835、538+786+797、538+786+834、538+786+835、538+797+834、538+797+835、538+834+835、598+602+605、598+602+609、598+602+676、598+602+694、598+602+698、598+602+699、598+602+711、598+602+754、598+602+760、598+602+781、598+602+786、598+602+797、598+602+834、598+602+835、598+605+609、598+605+676、598+605+694、598+605+698、598+605+699、598+605+711、598+605+754、598+605+760、598+605+781、598+605+786、598+605+797、598+605+834、598+605+835、598+609+676、598+609+694、598+609+698、598+609+699、598+609+711、598+609+754、598+609+760、598+609+781、598+609+786、598+609+797、598+609+834、598+609+835、598+676+694、598+676+698、598+676+699、598+676+711、598+676+754、598+676+760、598+676+781、598+676+786、598+676+797、598+676+834、598+676+835、598+694+698、598+694+699、598+694+711、598+694+754、598+694+760、598+694+781、598+694+786、598+694+797、598+694+834、598+694+835、598+698+699、598+698+711、598+698+754、598+698+760、598+698+781、598+698+786、598+698+797、598+698+834、598+698+835、598+699+711、598+699+754、598+699+760、598+699+781、598+699+786、598+699+797、598+699+834、598+699+835、598+711+754、598+711+760、598+711+781、598+711+786、598+711+797、598+711+834、598+711+835、598+754+760、598+754+781、598+754+786、598+754+797、598+754+834、598+754+835、598+760+781、598+760+786、598+760+797、598+760+834、598+760+835、598+781+786、598+781+797、598+781+834、598+781+835、598+786+797、598+786+834、598+786+835、598+797+834、598+797+835、598+834+835、602+605+609、602+605+676、602+605+694、602+605+698、602+605+699、602+605+711、602+605+754、602+605+760、602+605+781、602+605+786、602+605+797、602+605+834、602+605+835、602+609+676、602+609+694、602+609+698、602+609+699、602+609+711、602+609+754、602+609+760、602+609+781、602+609+786、602+609+797、602+609+834、602+609+835、602+676+694、602+676+698、602+676+699、602+676+711、602+676+754、602+676+760、602+676+781、602+676+786、602+676+797、602+676+834、602+676+835、602+694+698、602+694+699、602+694+711、602+694+754、602+694+760、602+694+781、602+694+786、602+694+797、602+694+834、602+694+835、602+698+699、602+698+711、602+698+754、602+698+760、602+698+781、602+698+786、602+698+797、602+698+834、602+698+835、602+699+711、602+699+754、602+699+760、602+699+781、602+699+786、602+699+797、602+699+834、602+699+835、602+711+754、602+711+760、602+711+781、602+711+786、602+711+797、602+711+834、602+711+835、602+754+760、602+754+781、602+754+786、602+754+797、602+754+834、602+754+835、602+760+781、602+760+786、602+760+797、602+760+834、602+760+835、602+781+786、602+781+797、602+781+834、602+781+835、602+786+797、602+786+834、602+786+835、602+797+834、602+797+835、602+834+835、605+609+676、605+609+694、605+609+698、605+609+699、605+609+711、605+609+754、605+609+760、605+609+781、605+609+786、605+609+797、605+609+834、605+609+835、605+676+694、605+676+698、605+676+699、605+676+711、605+676+754、605+676+760、605+676+781、605+676+786、605+676+797、605+676+834、605+676+835、605+694+698、605+694+699、605+694+711、605+694+754、605+694+760、605+694+781、605+694+786、605+694+797、605+694+834、605+694+835、605+698+699、605+698+711、605+698+754、605+698+760、605+698+781、605+698+786、605+698+797、605+698+834、605+698+835、605+699+711、605+699+754、605+699+760、605+699+781、605+699+786、605+699+797、605+699+834、605+699+835、605+711+754、605+711+760、605+711+781、605+711+786、605+711+797、605+711+834、605+711+835、605+754+760、605+754+781、605+754+786、605+754+797、605+754+834、605+754+835、605+760+781、605+760+786、605+760+797、605+760+834、605+760+835、605+781+786、605+781+797、605+781+834、605+781+835、605+786+797、605+786+834、605+786+835、605+797+834、605+797+835、605+834+835、609+676+694、609+676+698、609+676+699、609+676+711、609+676+754、609+676+760、609+676+781、609+676+786、609+676+797、609+676+834、609+676+835、609+694+698、609+694+699、609+694+711、609+694+754、609+694+760、609+694+781、609+694+786、609+694+797、609+694+834、609+694+835、609+698+699、609+698+711、609+698+754、609+698+760、609+698+781、609+698+786、609+698+797、609+698+834、609+698+835、609+699+711、609+699+754、609+699+760、609+699+781、609+699+786、609+699+797、609+699+834、609+699+835、609+711+754、609+711+760、609+711+781、609+711+786、609+711+797、609+711+834、609+711+835、609+754+760、609+754+781、609+754+786、609+754+797、609+754+834、609+754+835、609+760+781、609+760+786、609+760+797、609+760+834、609+760+835、609+781+786、609+781+797、609+781+834、609+781+835、609+786+797、609+786+834、609+786+835、609+797+834、609+797+835、609+834+835、676+694+698、676+694+699、676+694+711、676+694+754、676+694+760、676+694+781、676+694+786、676+694+797、676+694+834、676+694+835、676+698+699、676+698+711、676+698+754、676+698+760、676+698+781、676+698+786、676+698+797、676+698+834、676+698+835、676+699+711、676+699+754、676+699+760、676+699+781、676+699+786、676+699+797、676+699+834、676+699+835、676+711+754、676+711+760、676+711+781、676+711+786、676+711+797、676+711+834、676+711+835、676+754+760、676+754+781、676+754+786、676+754+797、676+754+834、676+754+835、676+760+781、676+760+786、676+760+797、676+760+834、676+760+835、676+781+786、676+781+797、676+781+834、676+781+835、676+786+797、676+786+834、676+786+835、676+797+834、676+797+835、676+834+835、694+698+699、694+698+711、694+698+754、694+698+760、694+698+781、694+698+786、694+698+797、694+698+834、694+698+835、694+699+711、694+699+754、694+699+760、694+699+781、694+699+786、694+699+797、694+699+834、694+699+835、694+711+754、694+711+760、694+711+781、694+711+786、694+711+797、694+711+834、694+711+835、694+754+760、694+754+781、694+754+786、694+754+797、694+754+834、694+754+835、694+760+781、694+760+786、694+760+797、694+760+834、694+760+835、694+781+786、694+781+797、694+781+834、694+781+835、694+786+797、694+786+834、694+786+835、694+797+834、694+797+835、694+834+835、698+699+711、698+699+754、698+699+760、698+699+781、698+699+786、698+699+797、698+699+834、698+699+835、968+711+754、698+711+760、698+711+781、698+711+786、698+711+797、698+711+834、698+711+835、698+754+760、698+754+781、698+754+786、698+754+797、698+754+834、698+754+835、698+760+781、698+760+786、698+760+797、698+760+834、698+760+835、698+781+786、698+781+797、698+781+834、698+781+835、698+786+797、698+786+834、698+786+835、698+797+834、698+797+835、698+834+835、699+711+754、699+711+760、699+711+781、699+711+786、699+711+797、699+711+834、699+711+835、699+754+760、699+754+781、699+754+786、699+754+797、699+754+834、699+754+835、699+760+781、699+760+786、699+760+797、699+760+834、699+760+835、699+781+786、699+781+797、699+781+834、699+781+835、699+786+797、699+786+834、699+786+835、699+797+834、699+797+835、699+834+835、711+754+760、711+754+781、711+754+786、711+754+797、711+754+834、711+754+835、711+760+781、711+760+786、711+760+797、711+760+834、711+760+835、711+781+786、711+781+797、711+781+834、711+781+835、711+786+797、711+786+834、711+786+835、711+797+834、711+797+835、711+834+835、754+760+781、754+760+786、754+760+797、754+760+834、754+760+835、754+781+786、754+781+797、754+781+834、754+781+835、754+786+797、754+786+834、754+786+835、754+797+834、754+797+835、754+834+835、760+781+786、60+781+797、760+781+834、760+781+835、760+786+797、760+786+834、760+786+835、760+797+834、760+797+835760+834+835、781+786+797、781+786+834、781+786+835、781+797+834、781+797+835、781+834+835、786+797+834、786+797+835、786+834+835、和797+834+835of SEQ ID NO:2。
在另一方面，变体包含在对应于以下位置的每个位置(或至少四个位置)处的改变：SEQ ID NO:2的17、20、51、53、55、56、60、63、79、87、186、192、302、311、313、387、388、390、403、408、410、416、448、451、471、472、476、489、507、512、515、538、598、599、602、603、605、609、676、688、690、694、697、698、699、711、719、754、756、760、781、786、797、833、834、835、和1048，其中根据SEQ ID NO:2进行编号。
在另一方面，该变体在与位置17相对应的位置处包含改变或由其组成。在另一方面，对应于位置17的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代。在另一方面，该变体包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代S17A或由其组成。
在另一方面，该变体在与位置20相对应的位置处包含改变或由其组成。在另一方面，对应于位置20的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代。在另一方面，该变体包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代F20P、F20N、F20G、或F20Y，优选F20P或由其组成。
在另一方面，该变体在与位置51相对应的位置处包含改变或由其组成。在另一方面，对应于位置51的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代。在另一方面，该变体包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代K51Q或K51H，优选K51Q或由其组成。
在另一方面，该变体在与位置53相对应的位置处包含改变或由其组成。在另一方面，对应于位置53的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代。在另一方面，该变体包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代E53P或E53Q，优选E53P或由其组成。
在另一方面，该变体在与位置55相对应的位置处包含改变或由其组成。在另一方面，对应于位置55的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代。在另一方面，该变体包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代Y55M或由其组成。
在另一方面，该变体在与位置56相对应的位置处包含改变或由其组成。在另一方面，对应于位置56的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代。在另一方面，该变体包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代V56M或由其组成。
在另一方面，该变体在与位置60相对应的位置处包含改变或由其组成。在另一方面，对应于位置60的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代。在另一方面，该变体包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代Y60F或由其组成。
在另一方面，该变体在与位置63相对应的位置处包含改变或由其组成。在另一方面，对应于位置63的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代。在另一方面，该变体包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代S63F或由其组成。
在另一方面，该变体在与位置79相对应的位置处包含改变或由其组成。在另一方面，对应于位置79的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代。在另一方面，该变体包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代S79W或由其组成。
在另一方面，该变体在与位置87相对应的位置处包含改变或由其组成。在另一方面，对应于位置87的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代。在另一方面，该变体包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代T87R或由其组成。
在另一方面，该变体在与位置186相对应的位置处包含改变或由其组成。在另一方面，对应于位置186的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代。在另一方面，该变体包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代A186P或由其组成。在另一方面，该变体在与位置192相对应的位置处包含改变或由其组成。在另一方面，对应于位置192的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代。在另一方面，该变体包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代K192N或由其组成。
在另一方面，该变体在与位置302相对应的位置处包含改变或由其组成。在另一方面，对应于位置302的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代。在另一方面，该变体包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代I302D、I302V、I302M、或I302H，优选I302H或由其组成。
在另一方面，该变体在与位置311相对应的位置处包含改变或由其组成。在另一方面，对应于位置311的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代。在另一方面，该变体包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代H311N或由其组成。
在另一方面，该变体在与位置313相对应的位置处包含改变或由其组成。在另一方面，对应于位置302的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代。在另一方面，该变体包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代S313D或由其组成。
在另一方面，该变体在与位置387相对应的位置处包含改变或由其组成。在另一方面，对应于位置387的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代。在另一方面，该变体包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代I387T或由其组成。
在另一方面，该变体在与位置388相对应的位置处包含改变或由其组成。在另一方面，对应于位置388的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代。在另一方面，该变体包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代K388R或由其组成。
在另一方面，该变体在与位置390相对应的位置处包含改变或由其组成。在另一方面，对应于位置390的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代。在另一方面，该变体包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代K390Q或由其组成。
在另一方面，该变体在与位置403相对应的位置处包含改变或由其组成。在另一方面，对应于位置403的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代。在另一方面，该变体包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代I403Y或由其组成。
在另一方面，该变体在与位置408相对应的位置处包含改变或由其组成。在另一方面，对应于位置408的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代。在另一方面，该变体包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的改变E408D、E408S、E408P、E408A、E408G、E408N，优选E408D或由其组成。
在另一方面，该变体在与位置410相对应的位置处包含改变或由其组成。在另一方面，对应于位置410的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代。在另一方面，该变体包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代P410G或由其组成。
在另一方面，该变体在与位置416相对应的位置处包含改变或由其组成。在另一方面，对应于位置416的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代。在另一方面，该变体包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代Q416S或Q416D，优选Q416S或由其组成。
在另一方面，该变体在与位置448相对应的位置处包含改变或由其组成。在另一方面，对应于位置448的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代。在另一方面，该变体包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代A448E、A448S、或A448W，优选A448E或由其组成。
在另一方面，该变体在与位置451相对应的位置处包含改变或由其组成。在另一方面，对应于位置451的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代。在另一方面，该变体包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代K451Q和K451S，优选K451Q或由其组成。
在另一方面，该变体在与位置471相对应的位置处包含改变或由其组成。在另一方面，对应于位置471的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代。在另一方面，该变体包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代G471S或由其组成。
在另一方面，该变体在与位置472相对应的位置处包含改变或由其组成。在另一方面，对应于位置472的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代。在另一方面，该变体包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代S472Y或由其组成。
在另一方面，该变体在与位置476相对应的位置处包含改变或由其组成。在另一方面，对应于位置476的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代。在另一方面，该变体包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代D476R或由其组成。
在另一方面，该变体在与位置489相对应的位置处包含改变或由其组成。在另一方面，对应于位置489的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代。在另一方面，该变体包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代Q489P或由其组成。在另一方面，该变体在与位置507相对应的位置处包含改变或由其组成。在另一方面，对应于位置507的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代。在另一方面，该变体包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代K507R或由其组成。
在另一方面，该变体在与位置512相对应的位置处包含改变或由其组成。在另一方面，对应于位置512的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代。在另一方面，该变体包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代K512P或由其组成。
在另一方面，该变体在与位置515相对应的位置处包含改变或由其组成。在另一方面，对应于位置515的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代。在另一方面，该变体包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代S515V或由其组成。
在另一方面，该变体在与位置538相对应的位置处包含改变或由其组成。在另一方面，对应于位置538的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代。在另一方面，该变体包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代S538C或由其组成。
在另一方面，该变体在与位置598相对应的位置处包含改变或由其组成。在另一方面，对应于位置598的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代。在另一方面，该变体包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代S598Q或由其组成。
在另一方面，该变体在与位置599相对应的位置处包含改变或由其组成。在另一方面，对应于位置599的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代。在另一方面，该变体包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代A599S或由其组成。在另一方面，该变体在与位置602相对应的位置处包含改变或由其组成。在另一方面，对应于位置602的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代。在另一方面，该变体包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代I602T或I602D，优选I602T或由其组成。
在另一方面，该变体在与位置603相对应的位置处包含改变或由其组成。在另一方面，对应于位置603的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代。在另一方面，该变体包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代V603P或由其组成。
在另一方面，该变体在与位置605相对应的位置处包含改变或由其组成。在另一方面，对应于位置605的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代。在另一方面，该变体包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代S605T或由其组成。
在另一方面，该变体在与位置609相对应的位置处包含改变或由其组成。在另一方面，对应于位置609的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代。在另一方面，该变体包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代G609E或由其组成。
在另一方面，该变体在与位置676相对应的位置处包含改变或由其组成。在另一方面，对应于位置676的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代。在另一方面，该变体包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代D676H或由其组成。
在另一方面，该变体在与位置688相对应的位置处包含改变或由其组成。在另一方面，对应于位置688的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代。在另一方面，该变体包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代A688G或由其组成。
在另一方面，该变体在与位置690相对应的位置处包含改变或由其组成。在另一方面，对应于位置690的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代。在另一方面，该变体包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代Y690F或由其组成。在另一方面，该变体在与位置694相对应的位置处包含改变或由其组成。在另一方面，对应于位置694的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代。在另一方面，该变体包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代T694A或由其组成。
在另一方面，该变体在与位置697相对应的位置处包含改变或由其组成。在另一方面，对应于位置697的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代。在另一方面，该变体包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代T697G或由其组成。在另一方面，该变体在与位置698相对应的位置处包含改变或由其组成。在另一方面，对应于位置698的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代。在另一方面，该变体包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代R698W或由其组成。
在另一方面，该变体在与位置699相对应的位置处包含改变或由其组成。在另一方面，对应于位置699的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代。在另一方面，该变体包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代T699A或由其组成。
在另一方面，该变体在与位置711相对应的位置处包含改变或由其组成。在另一方面，对应于位置711的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代。在另一方面，该变体包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代T711V或T711T，优选T711V或由其组成。
在另一方面，该变体在与位置719相对应的位置处包含改变或由其组成。在另一方面，对应于位置719的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代。在另一方面，该变体包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代W719R或由其组成。
在另一方面，该变体在与位置754相对应的位置处包含改变或由其组成。在另一方面，对应于位置754的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代。在另一方面，该变体包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代K754R或由其组成。在另一方面，该变体在与位置756相对应的位置处包含改变或由其组成。在另一方面，对应于位置756的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代。在另一方面，该变体包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代V756H或V756Y或由其组成。
在另一方面，该变体在与位置760相对应的位置处包含改变或由其组成。在另一方面，对应于位置760的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代。在另一方面，该变体包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代S760G或由其组成。
在另一方面，该变体在与位置781相对应的位置处包含改变或由其组成。在另一方面，对应于位置781的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代。在另一方面，该变体包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代T781M或由其组成。
在另一方面，该变体在与位置786相对应的位置处包含改变或由其组成。在另一方面，对应于位置786的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代。在另一方面，该变体包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代N786K或由其组成。
在另一方面，该变体在与位置797相对应的位置处包含改变或由其组成。在另一方面，对应于位置797的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代。在另一方面，该变体包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代T797S或由其组成。
在另一方面，该变体在与位置824相对应的位置处包含改变或由其组成。在另一方面，对应于位置824的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代。在另一方面，该变体包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代A824D或由其组成。
在另一方面，该变体在与位置833相对应的位置处包含改变或由其组成。在另一方面，对应于位置833的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代。在另一方面，该变体包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代N833D或由其组成。
在另一方面，该变体在与位置834相对应的位置处包含改变或由其组成。在另一方面，对应于位置834的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代。在另一方面，该变体包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代Q834E或由其组成。
在另一方面，该变体在与位置835相对应的位置处包含改变或由其组成。在另一方面，对应于位置835的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代。在另一方面，该变体包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代S835D或由其组成。
在另一方面，该变体在与位置1048相对应的位置处包含改变或由其组成。在另一方面，对应于位置1048的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代。在另一方面，该变体包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代F1048W或由其组成。
在一个实施例中，本发明的内切葡聚糖酶变体进一步包含选自下组的在一个或多个位置处的改变，该组由在以下位置处的改变组成：216、283、346、559、564、579、636、638、651、824、848、869、880、881、883、887、892、905、906、912、921、928、934、937、948、956、999和1037，或对应于这些位置。
更具体地，本发明的内切葡聚糖酶变体进一步包含在选自下组的一个或多个位置处的一个或多个改变：N216D、N216Q、A283D、A346D、A559P、A559N、A564E、Y579W、S636K、S636N、F638N、A651P、A824D、N848D、A869V、R880K、V881T、V881Q、T883R、T887K、T892P、N905D、F906A、A912V、K921R、S928D、Y934G、A937E、K948R、Q956Y、T999R、和A1037E，或对应于这些位置。在另一方面，该变体在包含与选自下组的位置相对应的位置处的改变或由其组成，该组由在以下位置处的改变组成：
SEQ ID NO:2的17、20、51、53、55、56、60、63、79、87、186、192、302、311、313、387、388、390、403、408、410、416、448、451、471、472、476、489、507、512、515、538、598、599、602、603、605、609、676、688、690、694、697、698、699、711、719、754、756、760、781、786、797、833、834、835、和1048，其中根据SEQ ID NO:2进行编号。
在另一方面，对应于如上所述的任何位置的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代。在另一方面，该变体包含选自下组的取代或由其组成，该组由以下组成：S17A、F20P、F20N、F20G、F20Y、K51Q、K51H、E53P、E53G、Y55M、V56M、Y60F、S63F、T87R、A186P、K192N、I302D、I302H、I302V、I302M、H311N、S313D、I387T、K388R、K390Q、I403Y、E408D、E408S、E408P、E408A、E408G、E408N、P410G、Q416S、Q416D、A448E、A448W、A448S、K451S、G471S、S472Y、D476R、Q489P、K507R、K512P、S515V、S538C、Y579W、S598Q、A599S、I602T、I602D、V603P、S605T、G609E、D676H、A688G、Y690F、T694A、T697G、R698W、T699A、T711V、T711Y、W719R、K754R、V756H、V756Y、S760G、T781M、N786K、T797S、A824D、N833D、Q834E、S835D、和F1048W，其中根据SEQ ID NO:2进行编号。
在一个具体的实施例中，本发明涉及选自下组的内切葡聚糖酶变体，该组由以下组成：本文表2中所示的内切葡聚糖酶变体。
在一个具体的实施例中，本发明涉及选自下组的内切葡聚糖酶变体，该组由以下组成：本文表3中所示的内切葡聚糖酶变体。
在一个具体的实施例中，本发明涉及选自下组的内切葡聚糖酶变体，该组由以下组成：本文表4中所示的内切葡聚糖酶变体。
在一个具体的实施例中，本发明涉及选自下组的内切葡聚糖酶变体，该组由以下组成：本文表5中所示的内切葡聚糖酶变体。
在一个具体的实施例中，本发明涉及选自下组的内切葡聚糖酶变体，该组由以下组成：本文表6中所示的内切葡聚糖酶变体。这些变体在一个或多个(例如，若干个)其他位置上可进一步包括一个或多个另外的改变。
这些氨基酸改变可以具有微小性质，即，不会显著地影响蛋白质的折叠和/或活性的保守氨基酸取代或插入；典型地为1-30个氨基酸的小缺失；小的氨基-末端或羧基末端延伸，如氨基末端的甲硫氨酸残基；多达20-25个残基的小接头肽；或小的延伸，其通过改变净电荷或另一官能(例如聚组氨酸段、抗原表位或结合结构域)来促进纯化。
保守取代的实例是在下组之内：碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸及组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸及缬氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸及酪氨酸)及小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸及甲硫氨酸)。一般不会改变比活性的氨基酸取代是本领域已知的并且例如由H.Neurath和R.L.Hill,1979,于The Proteins[蛋白质],Academic Press[学术出版社],纽约中描述。常见取代为Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly。
可替代地，这些氨基酸改变具有这样一种性质：改变多肽的物理化学特性。例如，这些氨基酸改变可以改善多肽的热稳定性、改变底物特异性、改变最适pH等。
可以根据本领域中已知的程序，如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(Cunningham和Wells,1989,Science[科学]244:1081-1085)来鉴定多肽中的必需氨基酸。在后一项技术中，在分子中的每个残基处引入单个丙氨酸突变，并且测试所得突变分子的黄原胶裂解酶活性以鉴定对分子的活性关键的氨基酸残基。还参见，Hilton等人,1996,J.Biol.Chem.[生物化学杂志]271:4699-4708。酶或其他生物学相互作用的活性部位还可通过对结构的物理分析来确定，如由下述技术确定：核磁共振、晶体学(crystallography)、电子衍射、或光亲和标记，连同对推定的接触位点(contract site)氨基酸进行突变。参见，例如，de Vos等人,1992,Science[科学]255:306-312；Smith等人,1992,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]224:899-904；Wlodaver等人,1992,FEBS Lett.[欧洲生化学会联合会快报]309:59-64。还可以从与相关多肽的比对来推断必需氨基酸的身份。
在一个实施例中，本发明涉及本发明的一种内切葡聚糖酶变体，该变体与SEQ IDNO:2相比具有在1和20之间的改变总数，例如在1和10之间或在1和5之间，如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个改变。
在一个实施例中，本发明涉及本发明的一种内切葡聚糖酶变体，其中对用黄原胶裂解酶预处理的黄原胶的活性是黄原胶降解活性，优选地，所述黄原胶降解活性是内切葡聚糖酶EC 3.2.1.4活性；进一步优选地，所述黄原胶裂解酶具有EC 4.2.2.12活性。
在一个实施例中，该变体与亲本酶(例如，SEQ ID NO:2)相比具有在洗涤剂组合物中的改善的稳定性。
在一个实施例中，本发明涉及本发明的一种内切葡聚糖酶变体，其中所述变体与亲本内切葡聚糖酶(例如，具有SEQ ID NO:2)相比具有在洗涤剂组合物中的改善的稳定性；优选地，所述洗涤剂组合物包括螯合剂；进一步优选地，所述螯合剂是EDTA或柠檬酸盐。
在一个实施例中，本发明涉及本发明的一种内切葡聚糖酶变体，其中所述变体具有半衰期改善因子(HIF)≥1.0；优选地，所述变体具有>1.0的半衰期改善因子(HIF)。计算所述半衰期改善因子(HIF)的优选方法在本文实例3中描述。因此，残余活性(RA)可使用以下公式计算：
Figure BDA0002387863890001341
其中Abs(胁迫)是在胁迫MTP(例如在25℃下孵育过夜)中的样品在405nm处的吸光度，其减去在相同MTP中存在的空白缓冲液样品中估计的背景吸光度，Abs(参考)是在参照MTP(例如在5℃下孵育过夜)中的样品在405nm处的吸光度，其减去在相同MTP中存在的空白缓冲液样品中估计的背景吸光度，其中使用以下公式计算每种变体和亲本内切葡聚糖酶(例如在25℃)降解的半衰期：
Figure BDA0002387863890001342
其中T是胁迫和参考MTP的孵育时间，其中半衰期改善因子(HIF)使用以下公式计算：
Figure BDA0002387863890001343
其中T1/2wt(或野生型)是具有SEQ ID NO:2的成熟亲本内切葡聚糖酶的T1/2。
在一个实施例中，本发明涉及本发明的一种内切葡聚糖酶变体，其中将在洗涤剂组合物中的所述内切葡聚糖酶变体于25℃孵育持续从约17至约20小时的时间段后，确定半衰期改善因子(HIF)。
亲本
亲本内切葡聚糖酶可以是(a)与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少60％序列同一性的一种多肽；(b)由如下的多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸在低严格条件下与(i)SEQID NO:1的成熟多肽编码序列、或(ii)(i)的全长互补序列杂交；或(c)由如下多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列具有至少60％序列同一性。
在一方面，该亲本与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性，具有黄原胶裂解酶活性。在一方面，该亲本的氨基酸序列与SEQ ID NO:2的成熟多肽相差多达10个氨基酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个。
在另一方面，该亲本包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列或由其组成。在另一方面，该亲本包含SEQ ID NO:2的成熟多肽或由其组成。在另一方面，该亲本是SEQ ID NO:2的成熟多肽的片段，该片段包含SEQ ID NO:2的氨基酸数目的至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、或95％。在另一个实施例中，该亲本是SEQ ID NO:2的成熟多肽的等位基因变体。
在另一方面，该亲本是由如下的多核苷酸编码，该多核苷酸在非常低严格条件、低严格条件、中严格条件、中-高严格条件、高严格条件或非常高严格条件下与(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列、或(ii)(i)的全长互补序列杂交(Sambrook等人,1989,MolecularCloning:A Laboratory Manual[分子克隆实验指南]，第二版，冷泉港(Cold SpringHarbor)，纽约)。
可以使用SEQ ID NO:1的多核苷酸或其子序列、连同SEQ ID NO:2的多肽或其片段来设计核酸探针以根据本领域熟知的方法来鉴别并克隆对来自不同属或物种的菌株的亲本进行编码的DNA。特别地，可以遵循标准DNA印迹程序，使用此类探针来与目的细胞的基因组DNA或cDNA杂交，以便鉴定和分离其中的相应基因。此类探针可明显短于完整序列，但是长度应为至少15，如至少25、至少35、或至少70个核苷酸。优选地，该核酸探针长度为至少100个核苷酸，例如长度为至少200个核苷酸、至少300个核苷酸、至少400个核苷酸、至少500个核苷酸、至少600个核苷酸、至少700个核苷酸、至少800个核苷酸、或至少900个核苷酸。DNA和RNA探针两者都可使用。典型地将探针进行标记(例如，用32P、3H、35S、生物素、或抗生物素蛋白)，用于检测相应的基因。此类探针涵盖于本发明中。
可以针对与上文所述的探针杂交并编码亲本的DNA来筛选由此类其他菌株制备的基因组DNA或cDNA文库。来自此类其他菌株的基因组DNA或其他DNA可通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳或其他分离技术来分离。可将来自文库的DNA或分离的DNA转移到并固定在硝化纤维素或其他适合的运载体材料上。为了鉴定与SEQ ID NO:1或其子序列杂交的克隆或DNA，在DNA印迹中使用该运载体材料。
出于本发明的目的，杂交表示多核苷酸与对应于以下的标记的核酸探针杂交：(i)SEQ ID NO:1；(ii)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列；(iii)其全长互补序列；或(iv)其子序列；杂交是在非常低的至非常高的严格条件下进行。在这些条件下与该核酸探针杂交的分子可以使用例如X-射线胶片或本领域中已知的任何其他检测手段进行检测。
在一个方面，该核酸探针是SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列。在另一个方面，核酸探针是编码以下的多核苷酸：SEQ ID NO:2的多肽；其成熟多肽；或其片段。在另一个方面，核酸探针是SEQ ID NO:1。
在另一个实施例中，该亲本由如下的多核苷酸编码，该多核苷酸与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性。
该多肽可以是杂合多肽，其中一种多肽的区域在另一种多肽的区域的N-末端或C-末端处融合。
该亲本可以是融合多肽或可切割融合多肽，其中另一种多肽在本发明多肽的N-末端或C-末端处融合。通过将编码另一种多肽的多核苷酸融合于本发明的多核苷酸来产生融合多肽。用于产生融合多肽的技术是本领域已知的，且包括连接编码多肽的编码序列使得它们符合读框，而且融合多肽的表达处于一个或多个相同的启动子和终止子的控制之下。还可以使用内含肽技术构建融合多肽，其中在翻译后产生融合多肽(Cooper等人,1993,EMBO J.[欧洲分子生物学学会杂志]12:2575-2583；Dawson等人,1994,Science[科学]266:776-779)。
融合多肽可进一步包含两个多肽之间的裂解位点。在融合蛋白分泌之时，所述位点被裂解，从而释放出这两种多肽。裂解位点的实例包括但不限于在以下文献中披露的位点：Martin等人,2003,J.Ind.Microbiol.Biotechnol.[工业微生物生物技术杂志]3:568-576；Svetina等人,2000,J.Biotechnol.[生物技术杂志]76:245-251；Rasmussen-Wilson等人,1997,Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学]63:3488-3493；Ward等人,1995,Biotechnology[生物技术]13:498-503；和Contreras等人,1991,Biotechnology[生物技术]9:378-381；Eaton等人,1986,Biochemistry[生物化学]25:505-512；Collins-Racie等人,1995,Biotechnology[生物技术]13:982-987；Carter等人,1989,Proteins:Structure,Function,and Genetics[蛋白质：结构、功能以及遗传学]6：240-248；以及Stevens,2003,Drug Discovery World[药物发现世界]4:35-48。
该亲本可以从任何属的微生物中获得。出于本发明的目的，如在此与给出的来源结合使用，术语“从……获得”应当意指由多核苷酸编码的亲本是由该来源或由其中已经插入来自该来源的多核苷酸的菌株产生的。在一个方面，该亲本是胞外分泌的。
该亲本可以是细菌酶。例如，该亲本可以是革兰氏阳性细菌多肽，如芽孢杆菌属(Bacillus)、梭菌属(Clostridium)、肠球菌属(Enterococcus)、土芽孢杆菌属(Geobacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、海洋芽孢杆菌属(Oceanobacillus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、链球菌属(Streptococcus)或链霉菌属(Streptomyces)酶；或革兰氏阴性细菌多肽，如弯曲杆菌属(Campylobacter)、大肠杆菌(E.coli)、黄杆菌属(Flavobacterium)、梭杆菌属(Fusobacterium)、螺杆菌属(Helicobacter)、泥杆菌属(Ilyobacter)、奈瑟氏菌属(Neisseria)、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙门氏菌属(Salmonella)或脲原体属(Ureaplasma)酶。
在一方面，该亲本是嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)、凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)、坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)、灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、或苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)酶。
在另一方面，该亲本是类马链球菌(Streptococcus equisimilis)、化脓链球菌、乳房链球菌或马链球菌兽疫亚种(Streptococcus equi subsp.Zooepidemicus)酶。
在另一方面，该亲本是不产色链霉菌、除虫链霉菌、天蓝链霉菌、灰色链霉菌或浅青紫链霉菌酶。
该亲本可以是真菌酶。例如，该亲本可以是酵母酶，如假丝酵母属(Candida)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母(Schizosaccharomyces)或耶氏酵母属(Yarrowia)酶；或丝状真菌酶，例如枝顶孢霉属(Acremonium)、伞菌属(Agaricus)、链格孢属(Alternaria)、曲霉属(Aspergillus)、短梗霉属(Aureobasidium)、葡萄座腔菌属(Botryospaeria)、拟蜡菌属(Ceriporiopsis)、毛喙壳属(Chaetomidium)、金孢子菌属(Chrysosporium)、麦角菌属(Claviceps)、旋孢腔菌属(Cochliobolus)、鬼伞属(Coprinopsis)、乳白蚁属(Coptotermes)、棒囊壳属(Corynascus)、隐丛赤壳菌属(Cryphonectria)、隐球菌属(Cryptococcus)、色二孢属(Diplodia)、黑耳属(Exidia)、线黑粉酵母属(Filibasidium)、镰孢属(Fusarium)、赤霉属(Gibberella)、全鞭毛虫属(Holomastigotoides)、腐质霉属(Humicola)、耙齿菌属(Irpex)、香菇属(Lentinula)、小腔球菌属(Leptospaeria)、梨孢菌属(Magnaporthe)、黑果菌属(Melanocarpus)、亚灰树花菌属(Meripilus)、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、新美鞭菌属(Neocallimastix)、链孢菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉菌属(Penicillium)、平革菌属(Phanerochaete)、瘤胃壶菌属(Piromyces)、Poitrasia、假黑盘菌属(Pseudoplectania)、假披发虫属(Pseudotrichonympha)、根毛霉菌属(Rhizomucor)、裂褶菌属(Schizophyllum)、柱顶孢属(Scytalidium)、篮状菌属(Talaromyces)、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳霉属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)、木霉属(Trichoderma)、长毛盘菌属(Trichophaea)、轮枝孢属(Verticillium)、小包脚菇属(Volvariella)、或炭角菌属(Xylaria)酶。
在另一方面，该亲本是卡尔酵母(Saccharomyces carlsbergensis)、酿酒酵母、糖化酵母、道格拉氏酵母(Saccharomyces douglasii)、克鲁弗酵母(Saccharomyceskluyveri)、诺地酵母或卵形酵母酶。
在另一方面，该亲本是解纤维枝顶孢霉(Acremonium cellulolyticus)、棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、臭曲霉(Aspergillusfoetidus)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉、米曲霉(Aspergillus oryzae)、狭边金孢子菌(Chrysosporium inops)、嗜角质金孢子菌(Chrysosporium keratinophilum)、拉克淖金孢子菌(Chrysosporium lucknowense)、粪状金孢子菌(Chrysosporium merdarium)、毡金孢子菌(Chrysosporium pannicola)、昆士兰金孢子菌(Chrysosporium queenslandicum)、热带金孢子菌(Chrysosporium tropicum)、带纹金孢子菌(Chrysosporium zonatum)、杆孢状镰孢(Fusarium bactridioides)、禾谷镰孢(Fusarium cerealis)、库威镰孢(Fusariumcrookwellense)、黄色镰孢(Fusarium culmorum)、禾谷镰孢(Fusarium graminearum)、禾赤镰孢(Fusarium graminum)、异孢镰孢(Fusarium heterosporum)、合欢木镰孢(Fusariumnegundi)、尖孢镰孢(Fusarium oxysporum)、多枝镰孢(Fusarium reticulatum)、粉红镰孢(Fusarium roseum)、接骨木镰孢(Fusarium sambucinum)、肤色镰孢(Fusariumsarcochroum)、拟枝孢镰孢(Fusarium sporotrichioides)、硫色镰孢(Fusariumsulphureum)、圆镰孢(Fusarium torulosum)、拟丝孢镰孢(Fusarium trichothecioides)、镶片镰孢(Fusarium venenatum)、灰腐质霉(Humicola grisea)、特异腐质霉(Humicolainsolens)、疏棉状腐质霉(Humicola lanuginosa)、白囊耙齿菌(Irpex lacteus)、米黑毛霉(Mucor miehei)、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)、粗糙脉孢菌(Neurosporacrassa)、绳状青霉菌(Penicillium funiculosum)、产紫青霉(Penicilliumpurpurogenum)、黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、无色梭孢壳(Thielavia achromatica)、成层梭孢壳菌(Thielavia albomyces)、白毛梭孢壳(Thielavia albopilosa)、澳洲梭孢壳(Thielavia australeinsis)、粪梭孢壳(Thielaviafimeti)、小孢梭孢壳(Thielavia microspora)、卵孢梭孢壳(Thielavia ovispora)、秘鲁梭孢壳(Thielavia peruviana)、毛梭孢壳(Thielavia setosa)、瘤孢梭孢壳(Thielaviaspededonium)、耐热梭孢壳(Thielavia subthermophila)、土生梭孢壳(Thielaviaterrestris)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、康宁木霉(Trichodermakoningii)、长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)、里氏木霉(Trichoderma reesei)或绿色木霉(Trichoderma viride)酶。
在另一方面，该亲本是类芽孢杆菌属物种黄原胶裂解酶，例如，SEQ ID NO:2的黄原胶裂解酶。
应理解的是，对于前述物种，本发明涵盖完全和不完全阶段(perfect andimperfect states)，和其他分类学等同物(equivalent)，例如无性型，而与它们已知的种名无关。本领域的技术人员会容易地识别适当等同物的身份。
这些物种的菌株可容易地在许多培养物保藏中心为公众所获得，如美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)、德国微生物和细胞培养物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，DSMZ)、荷兰菌种保藏中心(Centraalbureau Voor Schimmelcultures，CBS)以及美国农业研究服务专利培养物保藏中心北方地区研究中心(Agricultural Research Service Patent CultureCollection,Northern Regional Research Center，NRRL)。
可以使用以上探针，鉴定亲本并从其他来源包括从自然界(例如，土壤、堆肥、水等)分离的微生物获得该亲本，或从天然材料(例如，土壤、堆肥、水等)直接获得DNA样品。用于从天然生境中直接分离微生物和DNA的技术是本领域熟知的。然后可通过类似地筛选另一种微生物或混合DNA样品的基因组DNA或cDNA文库来获得编码亲本的多核苷酸。一旦已经用一种或多种探针检测到编码亲本的多核苷酸，则可以通过利用对本领域的普通技术人员来说已知的技术来分离或克隆该多核苷酸(参见例如，Sambrook等人，1989，同上)。
变体的制备
本发明还涉及用于获得一种具有内切葡聚糖酶活性的变体的方法，这些方法包括：(a)向亲本内切葡聚糖酶中引入在对应于以下位置的一个或多个(例如，若干个)位置处的改变：SEQ ID NO:2的成熟多肽的SEQ ID NO:2的17、20、51、53、55、56、60、63、79、87、186、192、302、311、313、387、388、390、403、408、410、416、448、451、471、472、476、489、507、512、515、538、598、599、602、603、605、609、676、688、690、694、697、698、699、711、719、754、756、760、781、786、797、833、834、835、和1048，其中该变体具有内切葡聚糖酶活性；以及(b)回收该变体。
在一个实施例中，获得的变体进一步包含在对应于选自下组的位置的一个或多个位置处的改变，该组由在以下位置处的改变组成：SEQ ID NO:2的成熟多肽的SEQ ID NO:2的216、283、346、559、564、579、636、638、651,824、848、869、880、881、883、887、892、905、906、912、921、928、934、937、948、956、999和1037，其中该变体具有内切葡聚糖酶活性；以及(b)回收该变体。
可以使用本领域已知的任何诱变程序来制备变体，如定点诱变、合成基因构建、半合成基因构建、随机诱变、改组等。
定点诱变是在编码该亲本的多核苷酸中的一个或多个限定位点处引入一个或多个(例如，若干个)突变的技术。
通过涉及使用包含所希望的突变的寡核苷酸引物的PCR可以体外实现定点诱变。也可以通过盒式诱变进行体外定点诱变，所述盒式诱变涉及由限制酶在包括编码亲本的多核苷酸的质粒中的位点处切割并且随后将包含突变的寡核苷酸连接在多核苷酸中。通常，消化质粒和寡核苷酸的限制性酶是相同的，从而允许质粒和插入物的粘性末端彼此连接。参见例如，Scherer和Davis,1979,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]76:4949-4955；和Barton等人,1990,Nucleic Acids Res.[核酸研究]18:7349-4966。
还可以通过本领域中已知的方法在体内实现定点诱变。参见例如，美国专利申请公布号2004/0171154；Storici等人,2001,Nature Biotechnol.[自然生物技术]19:773-776；Kren等人,1998,Nat.Med.[自然医学]4:285-290；以及Calissano和Macino,1996,Fungal Genet.Newslett.[真菌遗传学时事通讯]43:15-16。
可以在本发明中使用任何定点诱变程序。存在可用于制备变体的许多可商购的试剂盒。
合成基因构建需要设计的多核苷酸分子的体外合成以编码感兴趣的多肽。基因合成可以利用多种技术来进行，如由Tian等人(2004,Nature[自然]432:1050-1054)所述的基于多路微芯片的技术、以及其中在光可编程的微流芯片上合成并组装寡核苷酸的类似技术。
使用已知的诱变、重组和/或改组方法，随后进行相关的筛选程序可以做出单或多氨基酸取代、缺失和/或插入并对其进行测试，该相关的筛选程序例如由Reidhaar-Olson和Sauer,1988,Science[科学]241:53-57；Bowie和Sauer,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]86:2152-2156；WO95/17413；或WO 95/22625披露的那些。其他可以使用的方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如Lowman等人,1991,Biochemistry[生物化学]30:10832-10837；美国专利号5,223,409；WO 92/06204)以及区域定向诱变(Derbyshire等人，1986，Gene[基因]46：145；Ner等人,1988,DNA 7:127)。
诱变/改组方法可以与高通量、自动化的筛选方法组合以检测由宿主细胞表达的克隆的、诱变的多肽的活性(Ness等人,1999,Nature Biotechnology[自然生物技术]17:893-896)。可从宿主细胞回收编码活性多肽的诱变的DNA分子，并使用本领域的标准方法快速测序。这些方法允许快速确定多肽中各个氨基酸残基的重要性。
通过组合合成基因构建、和/或定点诱变、和/或随机诱变、和/或改组的多方面来实现半合成基因构建。半合成构建典型地是利用合成的多核苷酸片段的过程结合PCR技术。因此，基因的限定区域可以从头合成，而其他区域可以使用位点特异性诱变引物来扩增，而还有其他区域可以进行易错PCR或非易错PCR扩增。然后可以对多核苷酸子序列进行改组。
实施例
在一个实施例中，本发明涉及包含至少一种(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种)本发明的内切葡聚糖酶变体的组合物。
在一个实施例中，本发明涉及包含至少一种(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种)本发明的内切葡聚糖酶变体的组合物，其中所述组合物是洗涤剂组合物。
在一个实施例中，本发明涉及包含至少一种(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种)本发明的内切葡聚糖酶变体的组合物，其进一步包含一种或多种洗涤剂组分；优选地，所述洗涤剂组分是一种螯合剂；进一步优选地，所述螯合剂是EDTA或柠檬酸盐。
在一个实施例中，本发明涉及包含至少一种(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种)本发明的内切葡聚糖酶变体的组合物，其中所述组合物是洗涤剂组合物，其进一步包含一种或多种洗涤剂组分；优选地，所述洗涤剂组分是一种螯合剂；进一步优选地，所述螯合剂是EDTA或柠檬酸盐。
在一个实施例中，本发明涉及包含至少一种(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种)本发明的内切葡聚糖酶变体的组合物，进一步包含一种或多种选自下组的另外的酶，该组由以下组成：黄原胶裂解酶、蛋白酶、淀粉酶、地衣聚糖酶、脂肪酶、角质酶、纤维素酶、内切葡聚糖酶、木葡聚糖酶、果胶酶、果胶裂解酶、黄原胶酶、过氧化物酶、卤代加过氧酶、过氧化氢酶以及甘露聚糖酶、或其任何混合物。
在一个实施例中，本发明涉及包含至少一种(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种)本发明的内切葡聚糖酶变体的组合物，其中所述组合物是洗涤剂组合物，其进一步包含一种或多种选自下组的另外的酶，该组由以下组成：黄原胶裂解酶、蛋白酶、淀粉酶、地衣聚糖酶、脂肪酶、角质酶、纤维素酶、内切葡聚糖酶、木葡聚糖酶、果胶酶、果胶裂解酶、黄原胶酶、过氧化物酶、卤代加过氧酶、过氧化氢酶以及甘露聚糖酶、或其任何混合物。
在一个实施例中，本发明涉及包含至少一种(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种)本发明的内切葡聚糖酶变体的组合物，其中所述组合物是洗涤剂组合物，其进一步包含一种或多种洗涤剂组分和一种或多种选自下组的另外的酶，该组由以下组成：黄原胶裂解酶、蛋白酶、淀粉酶、地衣聚糖酶、脂肪酶、角质酶、纤维素酶、内切葡聚糖酶、木葡聚糖酶、果胶酶、果胶裂解酶、黄原胶酶、过氧化物酶、卤代加过氧酶、过氧化氢酶以及甘露聚糖酶、或其任何混合物，优选地，所述洗涤剂组分是一种螯合剂；进一步优选地，所述螯合剂是EDTA或柠檬酸盐。
在一个实施例中，本发明涉及包含至少一种(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种)本发明的内切葡聚糖酶变体的组合物，其中所述组合物是洗涤剂组合物，其进一步包含一种或多种洗涤剂组分，其中所述洗涤剂组合物处于以下形式：条、均匀的片剂、具有两个或更多个层的片剂、具有一个或多个室的袋、规则的或压缩的粉末、颗粒、膏、凝胶、或规则的、压缩的或浓缩的液体。
在一个实施例中，本发明涉及本发明的组合物或本发明的内切葡聚糖酶变体的用途，其中所述用途选自下组：用于降解黄原胶，用于清洁过程，如衣物或硬表面清洁如餐具洗涤，以及用于控制钻井液的黏度。
在一个实施例中，本发明涉及本发明的组合物的用途，其中所述组合物具有酶洗涤益处。
在一个实施例中，本发明涉及编码本发明的内切葡聚糖酶变体的分离的多核苷酸。
在一个实施例中，本发明涉及能够表达本发明的多核苷酸的核酸构建体或表达载体；优选地，包含本发明的多核苷酸的所述核酸构建体或所述表达载体，该多核苷酸可操作地连接至指导该多肽在表达宿主中的产生的一个或多个控制序列。
在一个实施例中，本发明涉及包含本发明的多核苷酸的宿主细胞(例如，分离的宿主细胞，分离的重组宿主细胞)；优选地，所述多核苷酸可操作地连接至指导该多肽的产生的一个或多个控制序列；进一步优选地，所述宿主细胞是分离的宿主细胞。
在一个实施例中，本发明涉及一种用于获得(或产生)内切葡聚糖酶变体的方法，该方法包括向亲本内切葡聚糖酶中(例如，具有SEQ ID NO:2)引入在选自下组的区域中的一个或多个位置处的改变(例如，取代、缺失或插入)，该组由以下组成：对应于SEQ ID NO:2的氨基酸1至94的区域10、对应于SEQ ID NO:2的氨基酸106至114的区域11、对应于SEQ IDNO:2的氨基酸139至209的区域12、对应于SEQ ID NO:2的氨基酸252至266的区域13、对应于SEQ ID NO:2的氨基酸302至338的区域14、对应于SEQ ID NO:2的氨基酸362至546的区域15、对应于SEQ ID NO:2的氨基酸596至611的区域16、对应于SEQ ID NO:2的氨基酸661至805的区域17、对应于SEQ ID NO:2的氨基酸829至838的区域18、和对应于SEQ ID NO:2的氨基酸1043至1055的区域19，其中所述变体与SEQ ID NO:2具有至少60％且小于100％的序列同一性，以及回收所述变体；优选地，所述选自由区域10至19组成的组的区域是螯合剂诱导的不稳定区域；进一步优选地，所述方法进一步包括向亲本内切葡聚糖酶(例如，具有SEQID NO:2)中引入在选自由区域10至19组成的组的一个或多个区域中的一个或多个位置处的改变(例如，取代、缺失或插入)。
在一个实施例中，本发明涉及一种用于获得(或产生)根据本发明的内切葡聚糖酶变体的方法，其中所述内切葡聚糖酶变体与SEQ ID NO:2具有至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列同一性。
在一个实施例中，本发明涉及一种用于获得(或产生)根据本发明的内切葡聚糖酶变体的方法，该变体在选自下组的一个或多个位置处具有改变(例如，取代、缺失或插入)，该组由以下组成：SEQ ID NO:2的SEQ ID NO:2的位置17、20、51、53、55、56、60、63、79、87、186、192、302、311、313、387、388、390、403、408、410、416、448、451、471、472、476、489、507、512、515、538、598、599、602、603、605、609、676、688、690、694、697、698、699、711、719、754、756、760、781、786、797、833、834、835、和1048，其中每个位置对应于SEQ ID NO:2的位置。
在一个实施例中，本发明涉及一种用于获得(或产生)根据本发明的内切葡聚糖酶变体的方法，该变体在选自下组的一个或多个位置处具有改变(例如，取代、缺失或插入)，该组由以下组成：S17A、F20P、F20N、F20G、F20Y、K51Q、K51H、E53P、E53G、Y55M、V56M、Y60F、S63F、T87R、A186P、K192N、I302D、I302H、I302V、I302M、H311N、S313D、I387T、K388R、K390Q、I403Y、E408D、E408S、E408P、E408A、E408G、E408N、P410G、Q416S、Q416D、A448E、A448W、A448S、K451S、G471S、S472Y、D476R、Q489P、K507R、K512P、S515V、S538C、Y579W、S598Q、A599S、I602T、I602D、V603P、S605T、G609E、D676H、A688G、Y690F、T694A、T697G、R698W、T699A、T711V、T711Y、W719R、K754R、V756H、V756Y、S760G、T781M、N786K、T797S、A824D、N833D、Q834E、S835D、和F1048W，其中根据SEQ ID NO:2进行编号。
在一个实施例中，本发明的方法进一步包含在对应于选自下组的位置的一个或多个位置处改变内切葡聚糖酶变体，该组由在以下位置处的改变组成：216、283、346、559、564、579、636、638、651、824、848、869、880、881、883、887、892、905、906、912、921、928、934、937、948、956、999和1037。
在一个实施例中，本发明的方法进一步包含在对应于选自下组的位置的一个或多个位置处改变内切葡聚糖酶变体，该组由在以下位置处的改变组成：N216D、N216Q、A283D、A346D、A559P、A559N、A564E、Y579W、S636K、S636N、F638N、A651P、A824D、N848D、A869V、R880K、V881T、V881Q、T883R、T887K、T892P、N905D、F906A、A912V、K921R、S928D、Y934G、A937E、K948R、Q956Y、T999R、和A1037E。
在本发明的方法的实施例中，该变体包含一个或多个以下的取代组：
F20Y+A448S+T781M
E408D+K451S
E408D+A448E
E408D
Y579W+E408D
在本发明的方法的优选实施例中，该变体包含一个或多个以下的取代组：
Figure BDA0002387863890001461
Figure BDA0002387863890001471
在一个实施例中，本发明涉及一种用于获得(或产生)根据本发明的内切葡聚糖酶变体的方法，所述变体在一个或多个位置处具有改变(例如，取代、缺失或插入)，使得提供具有≥1.0的半衰期改善因子(HIF)的变体；优选地，所述变体具有>1.0的半衰期改善因子(HIF)。
在一个实施例中，本发明涉及一种产生内切葡聚糖酶变体的方法，该方法包括：在适合表达所述变体的条件下，培养本发明的宿主细胞(例如分离的宿主细胞、分离的重组宿主细胞)；以及任选地回收所述变体。
在一个实施例中，本发明涉及一种产生内切葡聚糖酶变体的方法，该方法包括：在适合表达所述变体的条件下，培养宿主细胞(例如分离的宿主细胞、分离的重组宿主细胞)；以及任选地回收所述变体，其中所述内切葡聚糖酶变体是本发明的变体。
在一个实施例中，本发明涉及一种用于降解黄原胶的方法，该方法包括：将本发明的组合物施用于黄原胶。
在一个实施例中，本发明涉及一种用于降解黄原胶的方法，该方法包括：将本发明的组合物施用于黄原胶，其中所述黄原胶是在纺织品的表面或硬表面上，如餐具洗涤。
在一个实施例中，本发明涉及一种用于降解黄原胶的方法，该方法包括：将本发明的组合物施用于黄原胶，其中所述黄原胶在由钻井孔造成的地下地层的压裂中使用。
在一个实施例中，本发明涉及一种用于降解黄原胶的方法，该方法包括：将本发明的组合物施用于黄原胶，其中所述黄原胶是钻孔滤饼中的组分。
在一个实施例中，本发明涉及用于鉴定内切葡聚糖酶多肽(例如，具有SEQ ID NO:2)或本发明的内切葡聚糖酶变体的螯合剂诱导的不稳定区域的氘的用途，优选地，所述螯合剂是EDTA或柠檬酸盐，进一步优选地，所述氘是D2O的形式。
在一个实施例中，本发明涉及用于鉴定内切葡聚糖酶(例如，具有SEQ ID NO:2的内切葡聚糖酶多肽或根据本发明的内切葡聚糖酶变体)的螯合剂诱导的不稳定区域的方法，所述方法包括：
i)在螯合剂存在下提供，优选地所述螯合剂是EDTA或柠檬酸盐：
a)一种内切葡聚糖酶多肽(例如具有SEQ ID NO：2或根据本发明的内切葡聚糖酶变体)，
ii)在不存在螯合剂的情况下提供：
b)根据a)的内切葡聚糖酶多肽，
iii)向i)和ii)提供氘(例如，最终氘浓度为95％)用于氢-氘交换，优选地所述氘是D2O的形式，
iv)用胃蛋白酶消化来自步骤iii)的氘化多肽，
v)鉴定步骤iv)中产生的胃酶肽，
vi)在存在和不存在所述螯合剂的情况下，量化和比较掺入到来自步骤v)的单个肽中的氘。
多核苷酸
本发明还涉及编码本发明的变体的分离的多核苷酸。因此，在一个方面，本发明涉及编码变体的分离的多核苷酸，该变体包含选自下组的螯合剂诱导的不稳定区域中的一个或多个位置处的改变，该组由以下组成：i)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸1至94的区域10、ii)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸106至114的区域11、iii)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸139至209的区域12、iv)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸252至266的区域13、v)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸302至338的区域14、vi)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸362至546的区域15、vii)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸596至611的区域16、viii)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸661至805的区域17、ix)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸829至838的区域18、和x)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸1043至1055的区域19，其中所述变体与SEQ ID NO:2具有至少60％且小于100％的序列同一性。
用于分离或克隆多核苷酸的技术是本领域已知的且包括从基因组DNA或cDNA或其组合进行分离。可以例如通过使用熟知的聚合酶链式反应(PCR)或表达文库的抗体筛选来检测具有共有结构特征的克隆DNA片段，实现从基因组DNA克隆多核苷酸。参见例如，Innis等人,1990,PCR:A Guide to Methods and Application[PCR：方法和应用指南],AcademicPress[学术出版社],纽约。可以使用其他核酸扩增程序例如连接酶链式反应(LCR)、连接激活转录(LAT)和基于多核苷酸的扩增(NASBA)。这些多核苷酸可以克隆进枯草芽孢杆菌或大肠杆菌的菌株或相关有机体中，并且因此，例如可以是该多核苷酸的多肽编码区的等位基因变体或物种变体。
编码本发明的多肽的多核苷酸的修饰对于合成基本上类似于该多肽的多肽可以是必需的。术语“基本上类似”于该多肽是指多肽的非天然存在的形式。这些多肽可以因某种工程化方式而与从其天然来源分离的多肽不同，例如在比活性、热稳定性、最适pH等方面不同的变体。这些变体可以基于以SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列(例如其子序列)形式呈现的多核苷酸，和/或通过引入不会改变该多肽的氨基酸序列，但对应于预定用于产生该酶的宿主生物体的密码子使用的核苷酸取代，或通过引入可能产生不同氨基酸序列的核苷酸取代来构建。对于核苷酸取代的一般描述，参见例如Ford等人，1991,ProteinExpression and Purification[蛋白表达与纯化]2:95-107。
核酸构建体
本发明还涉及包含编码本发明的变体的、可操作地连接至一个或多个控制序列上的多核苷酸的核酸构建体，该一个或多个控制序列在与控制序列相容的条件下指导编码序列在适合的宿主细胞中表达。因此，本发明涉及包含编码变体的多核苷酸的核酸构建体，该变体包含选自下组的螯合剂诱导的不稳定区域中的一个或多个位置处的改变，该组由以下组成：i)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸1至94的区域10、ii)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸106至114的区域11、iii)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸139至209的区域12、iv)对应于SEQ IDNO:2的氨基酸252至266的区域13、v)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸302至338的区域14、vi)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸362至546的区域15、vii)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸596至611的区域16、viii)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸661至805的区域17、ix)对应于SEQ IDNO:2的氨基酸829至838的区域18、和x)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸1043至1055的区域19，其中所述变体与SEQ ID NO:2具有至少60％且小于100％的序列同一性，与一个或多个控制序列可操作地连接，所述控制序列在与控制序列相容的条件下指导编码序列在适合的宿主细胞中的表达。
可以按多种方式操纵多核苷酸，以提供多肽的表达。取决于表达载体，在多核苷酸插入载体之前对其进行操作可以是理想的或必需的。用于利用重组DNA方法修饰多核苷酸的技术是本领域熟知的。
所述控制序列可为启动子，即，被宿主细胞识别用于表达编码本发明的多肽的多核苷酸的多核苷酸。所述启动子包含介导多肽的表达的转录控制序列。启动子可以是在宿主细胞中显示转录活性的任何多核苷酸，包括突变型、截短型和杂合型启动子，并且可以获得自编码与宿主细胞同源或异源的细胞外或细胞内多肽的基因。
用于在细菌宿主细胞中指导本发明核酸构建体的转录的适合启动子的实例是从以下基因中获得的启动子：解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、嗜热脂肪芽孢杆菌产麦芽糖淀粉酶基因(amyM)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因、苏云金芽孢杆菌cryIIIA基因(Agaisse和Lereclus,1994,Molecular Microbiology[分子微生物学]13:97-107)、大肠杆菌lac操纵子、大肠杆菌trc启动子(Egon等人,1988,Gene[基因]69:301-315)、天蓝链霉菌琼脂水解酶基因(dagA)和原核β-内酰胺酶基因(Villa-Kamaroff等人,1978,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]75:3727-3731)以及tac启动子(DeBoer等人,1983,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]80:21-25)。其他启动子描述于Gilbert等人,1980,Scientific American[科学美国人]242:74-94的“Usefulproteins from recombinant bacteria[来自重组细菌的有用蛋白质]”；和在Sambrook等人,1989,同上。串联启动子的实例披露于WO 99/43835中。
用于指导本发明的核酸构建体在丝状真菌宿主细胞中的转录的适合启动子的实例是从以下酶的基因获得的启动子：构巢曲霉乙酰胺酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、米曲霉TAKA淀粉酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、尖孢镰孢胰蛋白酶样蛋白酶(WO 96/00787)、镶片镰孢淀粉葡糖苷酶(WO 00/56900)、镶片镰孢Daria(WO 00/56900)、镶片镰孢Quinn(WO00/56900)、米黑根毛霉脂肪酶、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶IV、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉β-木糖苷酶，以及NA2-tpi启动子(一种修饰的启动子，其来自曲霉属中性α-淀粉酶基因，其中未翻译的前导序列由曲霉属丙糖磷酸异构酶基因的未翻译的前导序列替代；非限制性实例包括来自黑曲霉中性α-淀粉酶基因的经修饰的启动子，其中已经用来自构巢曲霉或米曲霉丙糖磷酸异构酶基因的未翻译的前导序列替换未翻译的前导序列)；及其突变型、截短型及杂合型启动子。
在酵母宿主中，有用的启动子获得自以下的基因：酿酒酵母烯醇酶(ENO-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母醇去氢酶/甘油醛-3-磷酸去氢酶(ADH1、ADH2/GAP)、酿酒酵母丙糖磷酸异构酶(TPI)、酿酒酵母金属硫蛋白(CUP1)、以及酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。酵母宿主细胞的其他有用的启动子由Romanos等人,1992,Yeast[酵母]8:423-488描述。
控制序列也可为由宿主细胞识别以终止转录的转录终止子。该终止子有效地连接到编码该多肽的多核苷酸的3’-末端。在宿主细胞中有功能的任何终止子可用于本发明中。
细菌宿主细胞的优选终止子从以下的基因获得：克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprH)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(amyL)、和大肠杆菌核糖体RNA(rrnB)。
丝状真菌宿主细胞的优选终止子获得自以下的基因：构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡萄糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶以及尖孢镰孢菌胰蛋白酶样蛋白酶。
用于酵母宿主细胞的优选的终止子从以下酶的基因获得：酿酒酵母烯醇化酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)、以及酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶。酵母宿主细胞的其他有用的终止子由Romanos等人(1992，同上)描述。
该控制序列也可以是启动子下游和基因的编码序列上游的mRNA稳定子区域，其增加该基因的表达。
适合的mRNA稳定子区域的实例是从以下获得的：苏云金芽孢杆菌cryIIIA基因(WO94/25612)和枯草芽孢杆菌SP82基因(Hue等人,1995,Journal of Bacteriology[细菌学杂志]177:3465-3471)。
控制序列也可以是前导序列，即对宿主细胞翻译很重要的mRNA的非翻译区域。该前导子有效地连接到编码该多肽的多核苷酸的5'-末端。可以使用在宿主细胞中有功能的任何前导序列。
用于丝状真菌宿主细胞的优选前导序列从米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶的基因获得。
酵母宿主细胞的适合的前导序列从以下酶的基因获得：酿酒酵母烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α因子、和酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)。
控制序列还可以是一种多腺苷酸化序列，有效地连接至该多核苷酸的3’末端并且当转录时由宿主细胞识别为将聚腺苷酸残基添加至所转录的mRNA的信号的序列。可以使用在宿主细胞中有功能的任何聚腺苷酸化序列。
用于丝状真菌宿主细胞的优选聚腺苷酸化序列从以下酶的基因获得：构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶以及尖孢镰孢胰蛋白酶样蛋白酶。
酵母宿主细胞的有用的聚腺苷酸化序列由Guo和Sherman,1995,Mol.CellularBiol.[分子细胞生物学]15:5983-5990描述。
控制序列也可为编码与多肽的N-末端连接的信号肽并指导多肽进入细胞的分泌途径的信号肽编码区。多核苷酸的编码序列的5’-端可以固有地含有在翻译阅读框架中与编码多肽的编码序列的区段天然地连接的信号肽编码序列。可替代地，编码序列的5’-端可以含有对编码序列是外源的信号肽编码序列。在编码序列天然地不含信号肽编码序列的情况下，可能需要外源信号肽编码序列。可替代地，外源信号肽编码序列可以单纯地替换天然信号肽编码序列以便增强多肽的分泌。然而，可以使用指导已表达多肽进入宿主细胞的分泌途径的任何信号肽编码序列。
用于细菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是从芽孢杆菌NCIB 11837产麦芽糖淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶、地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT、nprS、nprM)和枯草芽孢杆菌prsA的基因获得的信号肽编码序列。另外的信号肽由Simonen和Palva,1993,Microbiological Reviews[微生物评论]57:109-137描述。
用于丝状真菌宿主细胞的有效的信号肽编码序列是从以下酶的基因获得的信号肽编码序列：黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶、特异腐质霉纤维素酶、特异腐质霉内切葡聚糖酶V、疏棉状腐质霉脂肪酶和米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶。
用于酵母宿主细胞的有用的信号肽从酿酒酵母α-因子和酿酒酵母转化酶的基因获得。其他的有用的信号肽编码序列由Romanos等人(1992，同上)描述。
控制序列也可以是编码位于多肽N-末端处的前肽的前肽编码序列。所得的多肽被称为前体酶(proenzyme)或多肽原(或在一些情况下被称为酶原(zymogen))。多肽原通常是无活性的并且可通过催化裂解或自身催化裂解来自多肽原的前肽而转化为活性多肽。前肽编码序列可以从以下的基因获得：枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、嗜热毁丝霉漆酶(WO 95/33836)、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶和酿酒酵母α-因子。
在信号肽序列和前肽序列两者都存在的情况下，该前肽序列位于紧邻多肽的N-末端且该信号肽序列位于紧邻该前肽序列的N-末端。
还可希望的是添加调节序列，所述调节序列调节宿主细胞生长相关的多肽的表达。调节系统的实例是响应于化学或物理刺激而引起基因的表达开启或关闭的那些，包括调控化合物的存在。原核系统中的调节系统包括lac、tac和trp操纵子系统。在酵母中，可以使用ADH2系统或GAL1系统。在丝状真菌中，可以使用黑曲霉葡糖淀粉酶启动子、米曲霉TAKAα-淀粉酶启动子、以及米曲霉葡糖淀粉酶启动子。调节序列的其他实例是允许基因扩增的那些序列。在真核系统中，这些调节序列包括在甲氨蝶呤存在下扩增的二氢叶酸还原酶基因以及用重金属扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况下，编码该多肽的多核苷酸将与调控序列可操作地连接。
表达载体
本发明还涉及包含编码本发明的变体的多核苷酸、启动子、以及转录和翻译终止信号的重组表达载体。因此，本发明涉及重组表达载体，这些重组表达载体包含编码变体的多核苷酸、启动子、和转录和翻译终止信号，该变体在选自下组的螯合剂诱导的不稳定区域中的一个或多个位置处包含改变，该组由以下组成：i)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸1至94的区域10、ii)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸106至114的区域11、iii)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸139至209的区域12、iv)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸252至266的区域13、v)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸302至338的区域14、vi)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸362至546的区域15、vii)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸596至611的区域16、viii)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸661至805的区域17、ix)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸829至838的区域18、和x)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸1043至1055的区域19，其中所述变体与SEQ ID NO:2具有至少60％且小于100％的序列同一性。
多个核苷酸和控制序列可连接在一起以产生重组表达载体，所述重组表达载体可包括一个或多个便利的限制位点以允许编码所述多肽的多核苷酸在此类位点处的插入或取代。可替代地，可以通过将多核苷酸或包含所述多核苷酸的核酸构建体插入用于表达的适当载体中而表达所述多核苷酸。在产生所述表达载体时，所述编码序列位于所述载体中，这样使得所述编码序列与所述用于表达的适当控制序列可操作地连接。
重组表达载体可以是可以方便地经受重组DNA程序并且可以引起多核苷酸表达的任何载体(例如，质粒或病毒)。载体的选择将典型地取决于载体与待引入载体的宿主细胞的相容性。载体可以是直链或闭合环状质粒。
载体可以是自主复制载体，即作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如质粒、染色体外元件、微染色体或人工染色体。载体可以含有用于确保自我复制的任何手段。可替代地，载体可以是这样的载体，当它引入宿主细胞中时整合入基因组中并与其中已整合了它的一个或多个染色体一起复制。此外，可以使用单独的载体或质粒或两个或更多个载体或质粒，其共同含有待引入宿主细胞基因组的总DNA，或可以使用转座子。
载体优选地含有允许方便地选择转化细胞、转染细胞、转导细胞等细胞的一个或多个选择性标记。选择性标记是一种基因，其产物提供了杀生物剂抗性或病毒抗性、对重金属抗性、对营养缺陷型的原养型等。
细菌选择性标记的实例是地衣芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌dal基因、或赋予抗生素抗性(如氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素、新霉素、大观霉素、或四环素抗性)的标记。酵母宿主细胞的适合的标记包括但不限于：ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。用于在丝状真菌宿主细胞中使用的选择性标志包括但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(草胺膦乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)、pyrG(乳清苷-5’-磷酸脱羧酶)、sC(硫酸腺苷基转移酶)、以及trpC(邻氨基苯甲酸合酶)，连同其等同物。优选的用于曲霉细胞中的是构巢曲霉或米曲霉amdS和pyrG基因以及吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)bar基因。
载体优选地含有允许载体整合到宿主细胞的基因组中或载体在细胞中独立于基因组自主复制的一个或多个元件。
对于整合到所述宿主细胞基因组中，所述载体可以依靠编码所述多肽的多核苷酸序列或用于通过同源或非同源重组整合到所述基因组中的所述载体的任何其他元件。可替代地，所述载体可含有用于指导通过同源重组而整合入宿主细胞基因组中的染色体中的精确位置处的另外的多核苷酸。为了增加在精确位置处整合的可能性，整合元件应当含有足够数目的核酸，如100至10,000个碱基对、400至10,000个碱基对和800至10,000个碱基对，所述核酸与对应的靶序列具有高度序列同一性以增强同源重组的概率。整合元件可以是与宿主细胞基因组内的靶序列同源的任何序列。此外，整合元件可以是非编码或编码的多核苷酸。另一方面，载体可以通过非同源重组整合入宿主细胞的基因组中。
为了自主复制，载体还可以另外包含复制起点，所述复制起点使得载体在讨论中的宿主细胞中自主复制成为可能。复制起点可以是在细胞中发挥作用的介导自主复制的任何质粒复制子。术语“复制起点”或“质粒复制子”意指使质粒或载体能够在体内复制的多核苷酸。
细菌复制起点的实例是允许在大肠杆菌中复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177、和pACYC184的复制起点，以及允许在芽孢杆菌属中复制的质粒pUB110、pE194、pTA1060、和pAMβ1的复制起点。
用于酵母宿主细胞中的复制起点的实例是2微米复制起点、ARS1、ARS4、ARS1与CEN3的组合、及ARS4与CEN6的组合。
在丝状真菌细胞中有用的复制起点的实例是AMA1和ANS1(Gems等人,1991,Gene[基因]98:61-67；Cullen等人,1987,Nucleic Acids Res.[核酸研究]15:9163-9175；WO00/24883)。可以根据WO 00/24883中披露的方法完成AMA1基因的分离和包含所述基因的质粒或载体的构建。
可将本发明多核苷酸的多于一个拷贝插入宿主细胞以增加多肽的产生。通过将序列的至少一个另外的拷贝整合到宿主细胞基因组中或者通过包括与该多核苷酸一起的可扩增的选择性标记基因可以获得多核苷酸的增加的拷贝数目，其中通过在适当的选择性试剂的存在下培养细胞可以选择包含选择性标记基因的经扩增的拷贝以及由此该多核苷酸的另外的拷贝的细胞。
用于连接以上所述的元件以构建本发明的重组表达载体的程序是本领域的普通技术人员熟知的(参见例如，Sambrook等人,1989,同上)。
宿主细胞
本发明还涉及重组宿主细胞，这些重组宿主细胞包含编码本发明的变体的、可操作地连接至一个或多个控制序列的多核苷酸，该一个或多个控制序列指导本发明的变体的产生。因此，在一个方面，本发明涉及重组宿主细胞，这些重组宿主细胞包含编码变体的多核苷酸，该变体在选自下组的螯合剂诱导的不稳定区域中的一个或多个位置处包含改变，该组由以下组成：i)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸1至94的区域10，ii)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸106至114的区域11，iii)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸139至209的区域12，iv)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸252至266的区域13，v)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸302至338的区域14，vi)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸362至546的区域15，vii)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸596至611的区域16，viii)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸661至805的区域17，ix)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸829至838的区域18，和x)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸1043至1055的区域19，其中所述变体与SEQ ID NO:2具有至少60％且小于100％的序列同一性，该多核苷酸可操作地连接至一个或多个控制序列，这些控制序列指导变体的产生，该变体包含在选自下组的螯合剂诱导的不稳定区域中的一个或多个位置处的改变，该组由以下组成：i)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸1至94的区域10、ii)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸106至114的区域11、iii)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸139至209的区域12、iv)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸252至266的区域13、v)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸302至338的区域14、vi)对应于SEQID NO:2的氨基酸362至546的区域15、vii)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸596至611的区域16、viii)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸661至805的区域17、ix)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸829至838的区域18、和x)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸1043至1055的区域19，其中所述变体与SEQ ID NO:2具有至少60％且小于100％的序列同一性。
将包含多核苷酸的构建体或载体引入到宿主细胞中，这样使得该构建体或载体被维持作为染色体整合体或作为自主复制的染色体外载体，如早前所描述。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间出现的突变而与亲本细胞不完全相同的任何亲本细胞子代。宿主细胞的选择将在很大程度上取决于编码该多肽的基因及其来源。
宿主细胞可以是在本发明的多肽的重组产生中有用的任何细胞，例如原核细胞或真核细胞。
原核宿主细胞可以是任何革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。革兰氏阳性细菌包括但不限于：芽孢杆菌属、梭菌属、肠球菌属、土芽孢杆菌属(Geobacillus)、乳杆菌属、乳球菌属、大洋芽孢杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属和链霉菌属。革兰氏阴性细菌包括但不限于弯曲杆菌属、大肠杆菌、黄杆菌属、梭杆菌属、螺杆菌属、泥杆菌属、奈瑟氏菌属、假单胞菌属、沙门氏菌属、以及脲原体属。
细菌宿主细胞可以是任何芽孢杆菌属细胞，包括但不限于嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚硬芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌以及苏云金芽孢杆菌细胞。
细菌宿主细胞还可以是任何链球菌属细胞，包括但不限于类马链球菌、酿脓链球菌、乳房链球菌以及马链球菌兽疫亚种细胞。
细菌宿主细胞还可以是任何链霉菌属细胞，包括但不限于：不产色链霉菌、除虫链霉菌、天蓝链霉菌、灰色链霉菌以及浅青紫链霉菌细胞。
将DNA引入芽孢杆菌属细胞中可以通过以下来实现：原生质体转化(参见，例如，Chang和Cohen,1979,Mol.Gen.Genet.[分子遗传学与基因组学]168:111-115)、感受态细胞转化(参见例如，Young和Spizizen,1961，J.Bacteriol.[细菌学杂志]81:823-829；或Dubnau和Davidoff-Abelson,1971,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]56:209-221)、电穿孔(参见例如，Shigekawa和Dower,1988,Biotechniques[生物技术]6:742-751)或轭合(参见例如，Koehler和Thorne,1987,J.Bacteriol.[细菌学杂志]169:5271-5278)。将DNA引入大肠杆菌细胞中可以通过以下方式来实现：原生质体转化(参见例如，Hanahan,1983,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]166:557-580)或电穿孔(参见例如，Dower等人,1988,Nucleic Acids Res.[核酸研究]16:6127-6145)。将DNA引入链霉菌属细胞中可以通过以下来实现：原生质体转化、电穿孔(参见例如，Gong等人,2004,Folia Microbiol.(Praha)[叶线形微生物学(布拉格)]49:399-405)、轭合(参见例如，Mazodier等人,1989,J.Bacteriol.[细菌学杂志]171:3583-3585)、或转导(参见例如，Burke等人,2001,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]98:6289-6294)。将DNA引入假单孢菌属细胞中可以通过以下方式来实现：电穿孔(参见例如，Choi等人,2006,J.Microbiol.Methods[微生物学方法杂志]64:391-397)或接合(参见例如，Pinedo和Smets,2005,Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学]71:51-57)。可通过如下方法实现将DNA引入到链球菌属细胞：例如天然感受态(natural competence)(参见，例如，Perry和Kuramitsu,1981,Infect.Immun.[感染与免疫]32:1295-1297)、原生质体转化(参见例如，Catt和Jollick,1991,Microbios[微生物学]68:189-207)、电穿孔(参见例如，Buckley等人,1999,Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学]65:3800-3804)、或接合(参见例如，Clewell,1981,Microbiol.Rev.[微生物学评论]45:409-436)。然而，可以使用本领域已知的将DNA引入宿主细胞中的任何方法。
宿主细胞还可以是真核生物，如哺乳动物、昆虫、植物或真菌细胞。
宿主细胞可以是真菌细胞。如本文所用的“真菌”包括子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)和接合菌门(Zygomycota)以及卵菌门(Oomycota)和所有有丝分裂孢子真菌(如由Hawksworth等人在以下文献中所定义：Ainsworth and Bisby’s Dictionary of The Fungi[安斯沃思和拜斯比真菌字典],第8版,1995,CAB International[国际应用生物科学中心],University Press[大学出版社],Cambridge，UK[英国剑桥])。
真菌宿主细胞可以为酵母细胞。如在此使用的“酵母”包括产子囊酵母(ascosporogenous yeast)(内孢霉目(Endomycetales))、产担子酵母(basidiosporogenous yeast)和属于半知菌类(Fungi Imperfecti)(芽孢纲(Blastomycetes))的酵母。由于酵母的分类可在将来变化，出于本发明的目的，酵母应当如Biology and Activities of Yeast[酵母的生物学与活性](Skinner,Passmore和Davenport编，Soc.App.Bacteriol.Symposium Series No.9[应用细菌学学会专题论文集系列9],1980)中所描述的那样定义。
酵母宿主细胞可以是假丝酵母属、汉逊酵母属、克鲁弗酵母属、毕赤酵母属、酵母属、裂殖酵母属或耶氏酵母属细胞，如乳酸克鲁维酵母、卡尔酵母、酿酒酵母、糖化酵母、道格拉氏酵母、克鲁弗酵母、诺地酵母、卵形酵母或解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)细胞。
真菌宿主细胞可为丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌门(Eumycota)和卵菌门(Oomycota)的亚门的所有丝状形式(如由Hawksworth等人,1995(同上)所定义的)。丝状真菌通常的特征在于由几丁质、纤维素、葡聚糖、壳聚糖、甘露聚糖和其他复杂多糖构成的菌丝体壁。营养生长是通过菌丝延伸来进行的，而碳分解代谢是专性需氧的。相反，酵母(如酿酒酵母)的营养生长是通过单细胞菌体的出芽(budding)来进行的，而碳分解代谢可以是发酵性的。
丝状真菌宿主细胞可以是枝顶孢霉属、曲霉属、短梗霉属、烟管霉属(Bjerkandera)、拟腊菌属、金孢子菌属、鬼伞属、革盖菌属(Coriolus)、隐球菌属、线黑粉菌科(Filibasidium)、镰孢属、腐质霉属、梨孢菌属、毛霉属、毁丝霉属、新美鞭菌属、链孢菌属、拟青霉属、青霉属、平革菌属、射脉菌属(Phlebia)、瘤胃壶菌属、侧耳属(Pleurotus)、裂褶菌属、篮状菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属、栓菌属(Trametes)或木霉属细胞。
例如，丝状真菌宿主细胞可以是泡盛曲霉、臭曲霉、烟曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、黑刺烟管菌(Bjerkandera adusta)、干拟蜡菌(Ceriporiopsisaneirina)、卡内基拟蜡菌(Ceriporiopsis caregiea)、浅黄拟蜡孔菌(Ceriporiopsisgilvescens)、潘诺希塔拟蜡菌(Ceriporiopsis pannocinta)、环带拟蜡菌(Ceriporiopsisrivulosa)、微红拟蜡菌(Ceriporiopsis subrufa)、虫拟蜡菌(Ceriporiopsissubvermispora)、狭边金孢子菌(Chrysosporium inops)、嗜角质金孢子菌、卢克诺文思金孢子菌(Chrysosporium lucknowense)、粪状金孢子菌(Chrysosporium merdarium)、租金孢子菌、女王杜香金孢子菌(Chrysosporium queenslandicum)、热带金孢子菌、褐薄金孢子菌(Chrysosporium zonatum)、灰盖鬼伞(Coprinus cinereus)、毛革盖菌(Coriolushirsutus)、杆孢状镰孢、谷类镰孢、库威镰孢、大刀镰孢、禾谷镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖孢镰孢、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰孢、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰孢、镶片镰孢、特异腐质霉、柔毛腐质霉、米黑毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙链孢菌、产紫青霉、黄孢平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、射脉菌(Phlebiaradiata)、刺芹侧耳(Pleurotus eryngii)、土生梭孢壳霉、长域毛栓菌(Trametesvillosa)、变色栓菌(Trametes versicolor)、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉、或绿色木霉细胞。
可以将真菌细胞通过涉及原生质体形成、原生质体转化、以及细胞壁再生的方法以本身已知的方式转化。用于转化曲霉属和木霉属宿主细胞的适合程序描述于以下文献中：EP 238023,Yelton等人,1984,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]81:1470-1474以及Christensen等人,1988,Bio/Technology[生物/技术]6:1419-1422。用于转化镰孢属物种的适合方法由Malardier等人,1989,Gene[基因]78:147-156和WO 96/00787描述。可以使用由以下文献描述的程序转化酵母：Becker和Guarente,在Abelson,J.N.和Simon,M.I.编辑,Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology[酵母遗传学与分子生物学指南],Methods in Enzymology[酶学方法],第194卷,第182-187页,AcademicPress,Inc.[学术出版社有限公司],纽约)；Ito等人,1983,J.Bacteriol.[细菌学杂志]153:163；以及Hinnen等人,1978,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]75:1920。
生产方法
本发明还涉及产生变体的方法(例如，体外或离体的方法)，这些方法包括：(a)在适合该变体的表达的条件下培养本发明的宿主细胞；以及(b)回收该变体。因此，在一个方面，本发明涉及产生变体的方法(例如体外或离体方法)，该变体在选自下组的螯合剂诱导的不稳定区域中的一个或多个位置处包含改变，该组由以下组成：i)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸1至94的区域10、ii)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸106至114的区域11、iii)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸139至209的区域12、iv)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸252至266的区域13、v)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸302至338的区域14、vi)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸362至546的区域15、vii)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸596至611的区域16、viii)对应于SEQID NO:2的氨基酸661至805的区域17、ix)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸829至838的区域18、和x)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸1043至1055的区域19，其中所述变体与SEQ ID NO:2具有至少60％且小于100％的序列同一性，该方法包括在适于表达该变体的条件下培养包含编码该变体的多核苷酸的宿主细胞；并且(b)任选地，回收该变体。
本发明还涉及产生本发明的变体的方法(例如，体外或离体的方法)，这些方法包括(a)在有益于产生该多肽的条件下培养细胞，该细胞以其野生型形式产生该多肽；并且(b)回收该多肽。在一个优选的方面中，该细胞是类芽孢杆菌属细胞或微杆菌属细胞。
本发明还涉及产生本发明的变体的方法(例如，体外或离体的方法)，这些方法包括(a)在有益于产生该多肽的条件下培养本发明的重组宿主细胞；并且(b)回收该多肽。
宿主细胞是在适合使用本领域已知的方法产生多肽的营养培养基中培养的。例如，可以通过摇瓶培养，或者在一种适合的培养基中并在允许该多肽表达和/或分离的条件下在实验室或工业发酵罐中进行小规模或大规模发酵(包括连续发酵、分批发酵、分批给料发酵或固态发酵)来培养该细胞。使用本领域中已知的程序，培养发生在包含碳和氮来源及无机盐的适合的营养培养基中。适合的培养基可从商业供应商获得或可以根据公开的组成(例如，在美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)的目录中)制备。如果多肽被分泌到该营养培养基中，那么可以直接从该培养基中回收该多肽。如果多肽不进行分泌，那么其可以从细胞裂解液中进行回收。
该变体多肽可以使用本领域中已知的特定用于这些多肽的方法进行检测，例如用于确定纤维素或黄原胶裂解酶活性的方法。这些检测方法包括但不限于：特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。例如，可以使用酶测定来确定多肽的活性。
该变体多肽可以使用本领域已知的方法回收。例如，可通过常规方法，包括但不限于，收集、离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀，从营养培养基回收多肽。
可以通过本领域中已知的多种程序来纯化该多肽以获得基本上纯的多肽，这些程序包括但不限于：色谱法(例如，离子交换色谱、亲和色谱、疏水作用色谱、色谱聚焦、以及尺寸排阻色谱)、电泳程序(例如，制备型等电点聚焦)、差别溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE、或提取(参见例如，Protein Purification[蛋白质纯化]，Janson和Ryden编辑，VCH出版社(VCH Publishers)，纽约，1989)。
在一个替代方面，不回收该变体多肽，而是将表达该多肽的本发明的宿主细胞用作该变体多肽的来源。
组合物
在某一个方面，根据本发明的变体相比于亲本酶或者相比于具有与所述变体相同的氨基酸序列但不具有在一个或多个所述指定位置上的改变(例如取代、缺失或插入)的内切葡聚糖酶或者相比于具有SEQ ID NO:2的内切葡聚糖酶具有改善的在洗涤剂中的稳定性，其中洗涤剂中的活性和/或稳定性如本文实例3中所披露的那样测量。因此，在一个实施例中，本发明涉及包含变体的组合物，该变体在选自下组的螯合剂诱导的不稳定区域中的一个或多个位置处包含改变，该组由以下组成：i)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸1至94的区域10、ii)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸106至114的区域11、iii)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸139至209的区域12、iv)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸252至266的区域13、v)对应于SEQID NO:2的氨基酸302至338的区域14、vi)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸362至546的区域15、vii)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸596至611的区域16、viii)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸661至805的区域17、ix)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸829至838的区域18、和x)对应于SEQID NO:2的氨基酸1043至1055的区域19，其中所述变体与SEQ ID NO:2具有至少60％且小于100％的序列同一性。
除了酶，这些洗涤剂组合物可以包括其他组分。另外的组分的选择处于技术人员的能力范围内并且包括常规的成分，包括下文所述的示例性非限制性组分。对于织物护理，组分的选择可以包括以下考虑：待清洁的织物的类型、污垢的类型和/或程度、进行清洁时的温度、以及洗涤剂产品的配制。尽管根据具体的功能性对以下提及的组分由通用标题进行分类，但是这并不被解释为限制，因为如将被普通技术人员所理解，组分可以包含另外的功能性。
洗涤剂组合物可以适合洗涤纺织品，如例如织物、衣服或亚麻布，或用于清洁硬表面，例如像地板、桌子、或洗碗盘。
洗涤剂组合物
在一个实施例中，可以将本发明的变体以对应于以下的量添加至一种洗涤剂组合物中：每升的洗涤液0.0001mg-200mg的酶蛋白，如0.0005mg-100mg的酶蛋白，优选0.001mg-30mg的酶蛋白，更优选0.005mg-8mg的酶蛋白，甚至更优选0.01mg-2mg的酶蛋白。
用于在自动洗碗机(ADW)中使用的组合物例如可以包括按该组合物的重量计0.0001％-50％，例如0.001％-20％，例如0.01％-10％，例如0.05％-5％的酶蛋白。
用于在洗衣造粒(laundry granulation)中使用的组合物例如可以包括按该组合物的重量计0.0001％-50％，例如0.001％-20％，例如0.01％-10％，例如0.05％-5％的酶蛋白。
用于在洗衣液中使用的组合物例如可以包括按该组合物的重量计0.0001％-10％，例如0.001％-7％，例如0.1％-5％的酶蛋白。
可以使用常规稳定剂稳定本发明的洗涤剂组合物的一种或多种酶，这些常规稳定剂例如是多元醇，例如丙二醇或甘油、糖或糖醇、乳酸、硼酸或硼酸衍生物，例如芳香族硼酸酯，或苯基硼酸衍生物，例如4-甲酰苯基硼酸，并且可以如在例如WO 92/19709和WO 92/19708中所述配制该组合物。
在某些市场中，不同洗涤条件并且就其本身而言，使用不同类型的洗涤剂。这披露于例如EP 1 025 240中。例如，在亚洲(日本)使用低的洗涤剂浓度体系，而美国使用中等洗涤剂浓度体系，并且欧洲使用高的洗涤剂浓度体系。
低的洗涤剂浓度体系包含以下洗涤剂，其中在洗涤水中存在少于约800ppm的洗涤剂组分。日本洗涤剂典型地被认为是低的洗涤剂浓度体系，因为它们具有存在于洗涤水中的大约667ppm的洗涤剂组分。
中等洗涤剂浓度体系包含以下洗涤剂，其中在洗涤水中存在约800ppm与约2000ppm之间的洗涤剂组分。北美洗涤剂通常被认为是中等洗涤剂浓度体系，因为它们具有存在于洗涤水中的大约975ppm的洗涤剂组分。
高的洗涤剂浓度体系包含以下洗涤剂，其中在洗涤水中存在多于约2000ppm的洗涤剂组分。欧洲洗涤剂通常被认为是高的洗涤剂浓度体系，因为在洗涤水中它们具有大约4500-5000ppm的洗涤剂组分。
拉丁美洲洗涤剂通常是高泡沫磷酸盐助洗剂洗涤剂并且在拉丁美洲使用的洗涤剂的范围可以落入中等和高的洗涤剂浓度两者中，因为在洗涤水中它们的洗涤剂组分的范围是从1500ppm至6000ppm。此类洗涤剂组合物都是本发明的实施例。
本发明的多肽还可以结合到WO 97/07202中所披露的洗涤剂配制品中，通过引用将其结合在此。
表面活性剂
该洗涤剂组合物可以包含一种或多种表面活性剂，它们可以是阴离子型和/或阳离子型和/或非离子型和/或半极性型和/或兼性离子型、或其混合物。在具体实施例中，所述洗涤剂组合物包含一种或多种非离子型表面活性剂和一种或多种阴离子型表面活性剂的混合物。该一种或多种表面活性剂典型地以按重量计从约0.1％至60％(如约1％至约40％、或约3％至约20％、或约3％至约10％)的水平存在。基于所希望的清洁应用来选择所述一种或多种表面活性剂，并且所述表面活性剂包括本领域中已知的任何一种或多种常规表面活性剂。可以利用本领域中已知的用于在洗涤剂中使用的任何表面活性剂。
当包含在其中时，所述洗涤剂将通常包含按重量计从约1％至约40％(如从约5％至约30％，包括从约5％至约15％、或从约20％至约25％)的阴离子型表面活性剂。阴离子型表面活性剂的非限制性实例包括硫酸盐和磺酸盐，特别地，直链烷基苯磺酸盐(LAS)、LAS的异构体、支链烷基苯磺酸盐(BABS)、苯基链烷磺酸盐、α-烯烃磺酸盐(AOS)、烯烃磺酸盐、链烯烃磺酸盐、链烷-2,3-二基双(硫酸盐)、羟基链烷磺酸盐以及二磺酸盐、烷基硫酸盐(AS)(如十二烷基硫酸钠(SDS))、脂肪醇硫酸盐(FAS)、伯醇硫酸盐(PAS)、醇醚硫酸盐(AES或AEOS或FES，也被称为醇乙氧基硫酸盐或脂肪醇醚硫酸盐)、仲链烷磺酸盐(SAS)、石蜡烃磺酸盐(PS)、酯磺酸盐、磺化的脂肪酸甘油酯、α-磺酸基脂肪酸甲酯(α-SFMe或SES)(包括磺酸甲酯(MES))、烷基琥珀酸或烯基琥珀酸、十二烯基/十四烯基琥珀酸(DTSA)、氨基酸的脂肪酸衍生物、磺酸基琥珀酸或皂的二酯和单酯、及其组合。
当包含在其中时，所述洗涤剂将通常包含按重量计从约0％至约10％的阳离子型表面活性剂。阳离子型表面活性剂的非限制性实例包括烷基二甲基乙醇季胺(ADMEAQ)、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、二甲基二硬脂酰氯化铵(DSDMAC)、以及烷基苄基二甲基铵、烷基季铵化合物、烷氧基化季铵(AQA)化合物、及其组合。
当包含在其中时，所述洗涤剂将通常包含按重量计从约0.2％至约40％(例如从约0.5％至约30％，特别是从约1％至约20％、从约3％至约10％，如从约3％至约5％、或从约8％至约12％)的非离子型表面活性剂。非离子型表面活性剂的非限制性实例包括醇乙氧基化物(AE或AEO)、醇丙氧基化物、丙氧基化的脂肪醇(PFA)、烷氧基化的脂肪酸烷基酯(如乙氧基化的和/或丙氧基化的脂肪酸烷基酯)、烷基酚乙氧基化物(APE)、壬基酚乙氧基化物(NPE)、烷基多糖苷(APG)、烷氧基化胺、脂肪酸单乙醇酰胺(FAM)、脂肪酸二乙醇酰胺(FADA)、乙氧基化的脂肪酸单乙醇酰胺(EFAM)、丙氧基化的脂肪酸单乙醇酰胺(PFAM)、多羟基烷基脂肪酸酰胺、或葡萄糖胺的N-酰基N-烷基衍生物(葡糖酰胺(GA)、或脂肪酸葡糖酰胺(FAGA))、连同在SPAN和TWEEN商品名下可获得的产品、及其组合。
当被包括在其中时，所述洗涤剂将通常包含按重量计从约0％至约10％的半极性型表面活性剂。半极性型表面活性剂的非限制性实例包括氧化胺(AO)(如烷基二甲基氧化胺)、N-(椰油基烷基)-N,N-二甲基氧化胺和N-(牛油-烷基)-N,N-双(2-羟乙基)氧化胺、脂肪酸链烷醇酰胺和乙氧基化的脂肪酸链烷醇酰胺及其组合。
当被包括在其中时，所述洗涤剂将通常包含按重量计从约0％至约10％的兼性离子型表面活性剂。兼性离子型表面活性剂的非限制性实例包括甜菜碱、烷基二甲基甜菜碱、磺基甜菜碱、及其组合。
水溶助剂
水溶助剂是如下化合物，所述化合物在水溶液中溶解疏水化合物(或相反地，在非极性环境中溶解极性物质)。典型地，水溶助剂具有亲水和疏水两种特征(所谓的两亲特性，如由表面活性剂已知的)；然而，水溶助剂的分子结构一般不利于自发性自聚集，参见例如通过Hodgdon和Kaler(2007)，Current Opinion in Colloid&Interface Science[胶体和界面科学新见]12:121-128的综述。水溶助剂并不显示临界浓度，高于所述浓度就会发生如对表面活性剂而言所发现的自聚集以及脂质形成胶束、薄层或其他很好地定义的中间相。相反，许多水溶助剂显示连续类型的聚集过程，在所述过程中聚集物的大小随着浓度增加而增长。然而，许多水溶助剂改变了包含极性和非极性特征的物质的系统(包括水、油、表面活性剂、和聚合物的混合物)的相行为、稳定性、和胶体特性。水溶助剂常规地在从药学、个人护理、食品到技术应用的各个产业中应用。水溶助剂在洗涤剂组合物中的使用允许例如更浓的表面活性剂配制品(如在通过去除水而压缩液体洗涤剂的过程中)而不引起不希望的现象，如相分离或高黏度。
所述洗涤剂可以包含按重量计0-5％，如约0.5％至约5％，或约3％至约5％的水溶助剂。可以利用本领域中已知的用于在洗涤剂中使用的任何水溶助剂。水溶助剂的非限制性实例包括苯磺酸钠、对甲苯磺酸钠(STS)、二甲苯磺酸钠(SXS)、枯烯磺酸钠(SCS)、伞花烃磺酸钠、氧化胺、醇和聚乙二醇醚、羟基萘甲酸钠、羟基萘磺酸钠、乙基己基硫酸钠及其组合。
助洗剂和共助洗剂
所述洗涤剂组合物可以含有按重量计约0-65％(如约5％至约45％)的洗涤剂助洗剂或共助洗剂、或其混合物。在餐具洗涤洗涤剂中，助洗剂的水平典型地是40％-65％、特别地50％-65％。助洗剂和/或共助洗剂可以具体是形成具有Ca和Mg的水溶性络合物的螫合剂。可以利用本领域中已知的用于在衣物洗涤剂中使用的任何助洗剂和/或共助洗剂。助洗剂的非限制性实例包括沸石、二磷酸盐(焦磷酸盐)、三磷酸盐例如三磷酸钠(STP或STPP)、碳酸盐例如碳酸钠、可溶性硅酸盐例如硅酸钠、层状硅酸盐(例如来自赫斯特公司(Hoechst)的SKS-6)、乙醇胺例如2-氨基乙-1-醇(MEA)、二乙醇胺(DEA，也称为亚氨基二乙醇)、三乙醇胺(TEA，也称为2,2’,2”-次氨基三乙醇)、以及羧甲基菊粉(CMI)及其组合。
所述洗涤剂组合物还可以含有按重量计0-20％(如约5％至约10％)的洗涤剂共助洗剂或其混合物。洗涤剂组合物可以包括单独的共助洗剂、或与助洗剂如沸石助洗剂组合的共助洗剂。共助洗剂的非限制性实例包括聚丙烯酸酯的均聚物或其共聚物，如聚(丙烯酸)(PAA)或共聚(丙烯酸/马来酸)(PAA/PMA)。另外的非限制性实例包括柠檬酸盐、螯合剂(如氨基羧酸盐、氨基多羧酸盐和磷酸盐)、以及烷基琥珀酸或烯基琥珀酸。另外的具体实例包括2,2’,2”-次氨基三乙酸(NTA)、乙二胺四乙酸(EDTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、亚氨基二丁二酸(iminodisuccinic acid)(IDS)、乙二胺-N,N’-二丁二酸(EDDS)、甲基甘氨酸二乙酸(MGDA)、谷氨酸-N,N-二乙酸(GLDA)、1-羟基乙烷-1,1-二膦酸(HEDP)、乙二胺四-(亚甲基膦酸)(EDTMPA)、二亚乙基三胺五(亚甲基膦酸)(DTPMPA或DTMPA)、N-(2-羟乙基)亚氨基二乙酸(EDG)、天冬氨酸-N-单乙酸(ASMA)、天冬氨酸-N,N-二乙酸(ASDA)、天冬氨酸-N-单丙酸(ASMP)、亚氨基二丁二酸(iminodisuccinic acid)(IDA)、N-(2-磺甲基)-天冬氨酸(SMAS)、N-(2-磺乙基)-天冬氨酸(SEAS)、N-(2-磺甲基)-谷氨酸(SMGL)、N-(2-磺乙基)-谷氨酸(SEGL)、N-甲基亚氨基二乙酸(MIDA)、α-丙氨酸-N,N-二乙酸(α-ALDA)、丝氨酸-N,N-二乙酸(SEDA)、异丝氨酸-N,N-二乙酸(ISDA)、苯丙氨酸-N,N-二乙酸(PHDA)、邻氨基苯甲酸-N,N-二乙酸(ANDA)、磺胺酸-N,N-二乙酸(SLDA)、牛磺酸-N,N-二乙酸(TUDA)以及磺甲基-N,N-二乙酸(SMDA)、N-(2-羟乙基)-亚乙基二胺-N,N’,N’-三乙酸盐(HEDTA)、二乙醇甘氨酸(DEG)、二亚乙基三胺五(亚甲基膦酸)(DTPMP)、氨基三(亚甲基膦酸)(ATMP)及其组合和盐。另外的示例性助洗剂和/或共助洗剂描述于例如WO 09/102854、US 5977053中。
漂白系统
洗涤剂可以含有按重量计0-50％，如约0.1％至约25％的漂白系统。可以利用本领域中已知的用于在衣物洗涤剂中使用的任何漂白系统。合适的漂白系统组分包括漂白催化剂、光漂白剂、漂白活化剂、过氧化氢源如过碳酸钠和过硼酸钠、预成型过酸及其混合物。合适的预成型过酸包括但不限于：过氧羧酸及盐、过碳酸及盐、过亚氨酸(perimidic acids)及盐、过氧单硫酸及盐(例如过硫酸氢钾(Oxone(R))、及其混合物。漂白体系的非限制性实例包括与过酸形成漂白活化剂组合的基于过氧化物的漂白体系，其可以包含例如无机盐，包括碱金属盐例如过硼酸盐的钠盐(通常为单或四水合物)、过碳酸盐、过硫酸盐、过磷酸盐、过硅酸盐。术语漂白活化剂在本文意指与过氧化物漂白剂(像过氧化氢)反应以形成过酸的化合物。以此方式形成的过酸构成活化的漂白剂。在此将使用的合适漂白活化剂包括属于酯酰胺、酰亚胺或酸酐类别的那些。适合的实例是四乙酰基乙二胺(TAED)、4-[(3,5,5-三甲基己酰)氧基]苯磺酸钠(ISONOBS)、二过氧月桂酸、4-(十二酰基氧基)苯磺酸盐(LOBS)、4-(癸酰基氧基)苯磺酸盐、4-(癸酰基氧基)苯甲酸盐(DOBS)、4-(壬酰基氧基)-苯磺酸盐(NOBS)、和/或披露于WO 98/17767中的那些。感兴趣的漂白活化剂的具体家族披露于EP 624154中并且该家族中特别优选的是乙酰柠檬酸三乙酯(ATC)。ATC或短链甘油三酸酯(像三醋汀)具有以下优点，它是环境友好的，因为它最终降解为柠檬酸和醇。此外，乙酰柠檬酸三乙酯和三醋汀在储存时在产品中具有良好的水解稳定性，并且它是有效的漂白活化剂。最后，ATC为衣物洗涤添加剂提供良好的助洗能力。可替代地，漂白系统可以包含例如酰胺、酰亚胺或砜类型的过氧酸。漂白系统还可以包含过酸，如6-(苯二甲酰亚氨基)过己酸(PAP)。漂白系统还可以包括漂白催化剂。在一些实施例中，漂白组分可以是选自下组的有机催化剂，该组由以下组成：具有下式的有机催化剂：
Figure BDA0002387863890001681
(iii)及其混合物；其中每个R1独立地是包含从9至24个碳的支链烷基基团或包含从11至24个碳的直链烷基基团，优选地，每个R1独立地是包含从9至18个碳的支链烷基基团或包含从11至18个碳的直链烷基基团，更优选地，每个R1独立地选自下组，该组由以下组成：2-丙基庚基、2-丁基辛基、2-戊基壬基、2-己基癸基、正-十二烷基、正-十四烷基、正-十六烷基、正-十八烷基、异-壬基、异-癸基、异-十三基和异-十五烷基。其他示例性漂白系统描述于例如WO 2007/087258、WO 2007/087244、WO 2007/087259以及WO 2007/087242中。适合的光漂白剂可以例如是磺化的酞菁锌。
聚合物
洗涤剂可以含有按重量计0-10％(如0.5％-5％、2％-5％、0.5％-2％或0.2％-1％)的聚合物。可以利用本领域中已知的在洗涤剂中使用的任何聚合物。该聚合物可以作为如上文提到的共助洗剂起作用，或可以提供抗再沉积、纤维保护、污垢释放、染料转移抑制、油污清洁和/或抑泡特性。一些聚合物可以具有多于一种的上文提到的特性和/或多于一种的下文提到的基序。示例性聚合物包括(羧甲基)纤维素(CMC)、聚(乙烯醇)(PVA)、聚(乙烯吡咯烷酮)(PVP)、聚(乙二醇)或聚(环氧乙烷)(PEG)、乙氧基化的聚(亚乙基亚胺)、羧甲基菊粉(CMI)、和聚羧酸酯(如PAA、PAA/PMA、聚-天冬氨酸、和甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物)、疏水修饰的CMC(HM-CMC)和硅酮、对苯二甲酸和低聚乙二醇的共聚物、聚(对苯二甲酸乙二酯)和聚(氧乙烯对苯二甲酸酯)的共聚物(PET-POET)、PVP、聚(乙烯基咪唑)(PVI)、聚(乙烯吡啶-N-氧化物)(PVPO或PVPNO)以及聚乙烯吡咯烷酮-乙烯基咪唑(PVPVI)。另外的示例性聚合物包括磺化的聚羧酸酯、聚环氧乙烷和聚环氧丙烷(PEO-PPO)以及乙氧基硫酸二季铵盐。其他示例性聚合物披露于例如WO2006/130575中。还考虑了以上提到的聚合物的盐。
织物调色剂
本发明的洗涤剂组合物还可以包含织物调色剂(如染料或色素)，当配制在洗涤剂组合物中时，当所述织物与洗涤液接触时这些织物调色剂可以沉积在织物上，该洗涤液包含所述洗涤剂组合物，并且因此通过可见光的吸收/反射改变所述织物的色彩。荧光增白剂发射至少一些可见光。相比之下，当织物调色剂吸收至少部分可见光谱时，它们改变表面的色彩。合适的织物调色剂包括染料和染料-粘土轭合物，并且还可以包括色素。合适的染料包括小分子染料和聚合物染料。适合的小分子染料包括选自下组的小分子染料，该组由落入颜色索引(Colour Index，C.I.)分类的以下染料组成：直接蓝、直接红、直接紫、酸性蓝、酸性红、酸性紫、碱性蓝、碱性紫和碱性红、或其混合物，例如于WO 2005/03274、WO 2005/03275、WO 2005/03276和EP1876226中所描述的(将其通过引用并入本文)。洗涤剂组合物优选地包含从约0.00003wt％至约0.2wt％、从约0.00008wt％至约0.05wt％、或甚至从约0.0001wt％至约0.04wt％的织物调色剂。该组合物可以包含从0.0001wt％至0.2wt％的织物调色剂，当该组合物处于单位剂量袋的形式时，这可以是尤其优选的。适合的调色剂还披露于例如WO 2007/087257和WO 2007/087243中。
另外的酶
洗涤剂添加剂连同洗涤剂组合物可以包含一种或多种另外的酶，如黄原胶裂解酶、蛋白酶、脂肪酶、角质酶、淀粉酶、地衣聚糖酶、糖酶、纤维素酶、果胶酶、甘露聚糖酶、阿拉伯糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶、氧化酶，例如漆酶、和/或过氧化物酶。
一般而言，所选的一种或多种酶的特性应与所选的洗涤剂相容(即，最适pH、与其他酶和非酶成分的相容性等)，并且该一种或多种酶应以有效量存在。
纤维素酶：合适的纤维素酶包括细菌来源或真菌来源的那些。包括化学修饰的突变体或蛋白质工程化的突变体。合适的纤维素酶包括来自芽孢杆菌属、假单胞菌属、腐质霉属、镰孢属、梭孢壳菌属、支顶孢属的纤维素酶，例如披露于US 4,435,307、US 5,648,263、US 5,691,178、US 5,776,757以及WO 89/09259中的由特异腐质霉、嗜热毁丝霉和尖孢镰孢产生的真菌纤维素酶。
尤其合适的纤维素酶是具有颜色护理益处的碱性或中性纤维素酶。此类纤维素酶的实例是描述于EP 0 495 257、EP 0 531 372、WO 96/11262、WO96/29397、WO 98/08940中的纤维素酶。其他实例为纤维素酶变体，如在WO 94/07998、EP 0 531 315、US 5,457,046、US 5,686,593、US 5,763,254、WO 95/24471、WO 98/12307以及PCT/DK 98/00299中所描述的那些。
展现内切-β-1,4-葡聚糖酶活性的纤维素酶的实例(EC 3.2.1.4)是已经描述于WO02/099091中的那些。
纤维素酶的其他实例包括描述于WO 96/29397中的家族45纤维素酶，并且特别是在对应于WO 02/099091的SEQ ID NO:8中的以下位置的一个或多个位置处具有取代、插入和/或缺失的其变体：2、4、7、8、10、13、15、19、20、21、25、26、29、32、33、34、35、37、40、42、42a、43、44、48、53、54、55、58、59、63、64、65、66、67、70、72、76、79、80、82、84、86、88、90、91、93、95、95d、95h、95j、97、100、101、102、103、113、114、117、119、121、133、136、137、138、139、140a、141、143a、145、146、147、150e、150j、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160c、160e、160k、161、162、164、165、168、170、171、172、173、175、176、178、181、183、184、185、186、188、191、192、195、196、200、和/或20，优选地选自P19A、G20K、Q44K、N48E、Q119H或Q146R。
可商购的纤维素酶包括CelluzymeTM、和CarezymeTM(诺维信公司)、ClazinaseTM、和Puradax HATM(杰能科国际公司)、以及KAC-500(B)TM(花王株式会社(Kao Corporation))。
蛋白酶：另外的酶可以是另一种蛋白酶或蛋白酶变体。该蛋白酶可以是动物、植物或微生物来源的，包括化学或基因修饰的突变体。优选的是微生物来源。它可以是碱性蛋白酶，如丝氨酸蛋白酶或金属蛋白酶。丝氨酸蛋白酶可以例如是S1家族的(如胰蛋白酶)或S8家族的(如枯草杆菌蛋白酶)。金属蛋白酶的蛋白酶可以例如是来自例如家族M4、M5、M7或M8的嗜热菌蛋白酶。
术语“枯草杆菌酶”是指根据Siezen等人，Protein Engng.[蛋白质工程]4(1991)719-737和Siezen等人，Protein Science[蛋白质科学]6(1997)501-523的丝氨酸蛋白酶亚组。丝氨酸蛋白酶是特征在于在活性位点具有与底物形成共价加合物的丝氨酸的蛋白酶的亚组。枯草杆菌酶可以被划分为6个亚类，即，枯草杆菌蛋白酶家族、嗜热蛋白酶家族、蛋白酶K家族、羊毛硫氨酸抗生素肽酶家族、Kexin家族和Pyrolysin家族。在本发明的一个方面，该蛋白酶可以是一种枯草杆菌酶，如枯草杆菌蛋白酶或其变体。另外，枯草杆菌酶(和丝氨酸蛋白酶)的特征为除了丝氨酸以外，还具有两个活性位点氨基酸残基，即组氨酸和天冬氨酸残基。
枯草杆菌蛋白酶的实例是来源于芽孢杆菌的那些，如枯草杆菌蛋白酶lentus、芽孢杆菌lentus、枯草杆菌蛋白酶Novo、嘉士伯枯草杆菌蛋白酶(subtilisin Carlsberg)、地衣芽孢杆菌、枯草杆菌蛋白酶BPN’、枯草杆菌蛋白酶309、枯草杆菌蛋白酶147以及枯草杆菌蛋白酶168(描述于WO89/06279中)以及蛋白酶PD138(WO 93/18140)。另外的丝氨酸蛋白酶实例描述于WO 98/020115、WO 01/44452、WO 01/58275、WO 01/58276、WO03/006602以及WO04/099401中。枯草杆菌酶变体的实例可以是在任何以下位置上具有突变的那些：使用BPN’编号的3、4、9、15、27、36、68、76、87、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、106、118、120、123、128、129、130、160、167、170、194、195、199、205、217、218、222、232、235、236、245、248、252以及274。更优选地，枯草杆菌酶变体可以包含以下突变：S3T、V4I、S9R、A15T、K27R、*36D、V68A、N76D、N87S,R、*97E、A98S、S99G,D,A、S99AD、S101G,M,R S103A、V104I,Y,N、S106A、G118V,R、H120D,N、N123S、S128L、P129Q、S130A、G160D、Y167A、R170S、A194P、G195E、V199M、V205I、L217D、N218D、M222S、A232V、K235L、Q236H、Q245R、N252K、T274A(使用BPN’进行编号)。另外的优选的蛋白酶是来自迟缓芽孢杆菌DSM 5483的碱性蛋白酶(如在(例如)WO95/23221中所述)、以及其变体(在WO 92/21760、WO 95/23221、EP1921147以及EP 1921148中描述的)。
胰蛋白酶样蛋白酶的实例为胰蛋白酶(例如，猪或牛来源的)，以及在WO 89/06270和WO 94/25583中描述的镰孢属蛋白酶。有用的蛋白酶的实例是如WO 92/19729、WO 98/20115、WO 98/20116和WO 98/34946所描述的变体，特别是在下述位置中的一个或多个处发生取代的变体：27、36、57、76、87、97、101、104、120、123、167、170、194、206、218、222、224、235、以及274。
金属蛋白酶的实例是如描述于WO 07/044993中的中性金属蛋白酶。
优选的可商购的蛋白酶酶类包括AlcalaseTM、CoronaseTM、DuralaseTM、DurazymTM、EsperaseTM、EverlaseTM、KannaseTM、LiquanaseTM、Liquanase UltraTM、OvozymeTM、PolarzymeTM、PrimaseTM、RelaseTM、SavinaseTM和Savinase UltraTM(诺维信公司(NovozymesA/S))，AxapemTM(Gist-Brocases N.V.公司)，BLAP和BLAP X(Henkel AG&Co.KGaA)，ExcellaseTM、FN2TM、FN3TM、FN4TM、MaxacaTM、MaxapemTM、MaxataseTM、ProperaseTM、PurafastTM、PurafectTM、Purafect OxPTM、Purafect PrimeTM和PuramaxTM(杰能科有限公司(Genencorint.))。
脂肪酶和角质酶：合适的脂肪酶和角质酶包括细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰的或蛋白质工程化的突变体酶。实例包括来自嗜热真菌属的脂肪酶，例如如描述于EP258068和EP 305216中的来自疏绵状嗜热丝孢菌(早先命名为疏棉状腐质霉)；来自腐质霉属的角质酶，例如特异腐质霉(WO96/13580)；来自假单胞菌属的菌株的脂肪酶(这些中的一些现在改名为伯克霍尔氏菌属)，例如产碱假单胞菌或类产碱假单胞菌(EP 218272)、洋葱假单胞菌(EP 331376)、假单胞菌属菌株SD705(WO 95/06720和WO96/27002)、威斯康星假单胞菌(P.wisconsinensis)(WO 96/12012)；GDSL-型链霉菌属脂肪酶(WO 10/065455)；来自稻瘟病菌的角质酶(WO10/107560)；来自门多萨假单胞菌的角质酶(US 5,389,536)；来自褐色嗜热裂孢菌(Thermobifida fusca)的脂肪酶(WO 11/084412)；嗜热脂肪土芽孢杆菌脂肪酶(WO 11/084417)；来自枯草芽孢杆菌的脂肪酶(WO 11/084599)；以及来自灰色链霉菌(WO11/150157)和始旋链霉菌(S.pristinaespiralis)的脂肪酶(WO 12/137147)。
另外的实例是有时被称为酰基转移酶或过水解酶(perhydrolase)的脂肪酶，例如与南极假丝酵母脂肪酶A具有同源性的酰基转移酶(WO10/111143)、来自耻垢分枝杆菌的酰基转移酶(WO 05/56782)、来自CE 7家族的过水解酶(WO 09/67279)、以及耻垢分枝杆菌过水解酶的变体，特别是用于在来自亨斯迈纺织染化私人有限公司(Huntsman TextileEffects PteLtd)的商业化产品Gentle Power Bleach(柔和漂白剂)中使用的S54V变体(WO10/100028)。
其他实例是脂肪酶变体，如EP 407225、WO 92/05249、WO 94/01541、WO 94/25578、WO 95/14783、WO 95/30744、WO 95/35381、WO 95/22615、WO 96/00292、WO 97/04079、WO97/07202、WO 00/34450、WO 00/60063、WO 01/92502、WO 07/87508以及WO 09/109500中所述的那些。
优选的商业化脂肪酶产品包括LipolaseTM、LipexTM；LipolexTM和LipocleanTM(诺维信公司)，Lumafast(来自杰能科公司(Genencor))以及Lipomax(来自吉斯特布罗卡德斯公司(Gist-Brocades))。
淀粉酶
淀粉酶可以是α-淀粉酶、β-淀粉酶或葡糖淀粉酶并且可以是细菌或真菌来源的。包括化学修饰的突变体或蛋白质工程化的突变体。淀粉酶包括例如从芽孢杆菌属、例如地衣芽孢杆菌的特定菌株(更详细地描述于GB 1,296,839中)获得的α-淀粉酶。
淀粉酶的实例是具有WO 95/10603中的SEQ ID NO:3的那些或与SEQ ID NO:3具有90％序列同一性的其变体。优选的变体描述于WO 94/02597、WO 94/18314、WO 97/43424中以及WO 99/019467的SEQ ID NO:4中，如在一个或多个以下位置中具有取代的变体：在WO95/10603中SEQ ID NO:3的15、23、105、106、124、128、133、154、156、178、179、181、188、190、197、201、202、207、208、209、211、243、264、304、305、391、408、和444。
其他淀粉酶是WO 2016/203064的SEQ ID NO:1的变体，其与SEQ ID NO:1具有至少75％的序列同一性。优选的变体是包含在对应于SEQ ID NO:1的位置1、54、56、72、109、113、116、134、140、159、167、169、172、173、174、181、182、183、184、189、194、195、206、255、260、262、265、284、289、304、305、347、391、395、439、469、444、473、476、或477的一个或多个位置处的修饰的变体，其中所述α-淀粉酶变体与SEQ ID NO:1具有至少75％但小于100％的序列同一性。
可以使用的另外的淀粉酶是具有WO 02/010355中的SEQ ID NO:6的淀粉酶或其与SEQ ID NO:6具有90％序列同一性的变体。SEQ ID NO:6的优选的变体是在位置181和182中具有缺失并且在位置193中具有取代的那些。
其他淀粉酶实例是包含示于WO 2006/066594的SEQ ID NO:6中的来源于解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶的残基1-33和示于WO 2006/066594的SEQ ID NO:4中的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的残基36-483的杂合α-淀粉酶或具有90％序列同一性的其变体。此杂合α-淀粉酶的优选变体是在以下位置中的一个或多个中具有取代、缺失或插入的那些：G48、T49、G107、H156、A181、N190、M197、I201、A209和Q264。包含WO 2006/066594的SEQ ID NO:6中所示的来源于解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶的残基1-33和SEQ ID NO:4的残基36-483的杂合α-淀粉酶的最优选的变体是具有以下取代的那些：
M197T；
H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S；或
G48+T49+G107+H156+A181+N190+I201+A209+Q264。
另外的淀粉酶实例是具有WO 99/019467中的SEQ ID NO:6的淀粉酶或其与SEQ IDNO:6具有90％序列同一性的变体。SEQ ID NO:6的优选的变体是在以下位置中的一个或多个中具有取代、缺失或插入的那些：R181、G182、H183、G184、N195、I206、E212、E216和K269。特别优选的淀粉酶是在位置G182和H183或位置H183和G184中具有缺失的那些。
另外的淀粉酶是具有WO 96/023873的SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:7的那些或其与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:7具有90％序列同一性的变体。SEQID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:7的优选变体是在以下位置的一个或多个中具有取代、缺失或插入的那些：140、181、182、183、184、195、206、212、243、260、269、304以及476。更优选的变体是在位置182和183或位置183和184处具有缺失的那些。SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:7的最优选的淀粉酶变体是在位置183和184中具有缺失并且在位置140、195、206、243、260、304以及476中具有取代的那些。
可以使用的其他淀粉酶是具有WO 08/153815的SEQ ID NO:2、WO01/66712中的SEQID NO:10的淀粉酶或其与WO 08/153815的SEQ ID NO:2具有90％序列同一性或与WO 01/66712中的SEQ ID NO:10具有90％序列同一性的变体。WO 01/66712中的SEQ ID NO:10的优选变体是在以下位置中的一个或多个中具有取代、缺失或插入的那些：176、177、178、179、190、201、207、211和264。
可以使用的另外的淀粉酶是具有WO 09/061380的SEQ ID NO:2的淀粉酶或其与SEQ ID NO:2具有90％序列同一性的变体。SEQ ID NO:2的优选变体是在以下位置中的一个或多个中具有取代、缺失或插入的那些：Q87、Q98、S125、N128、T131、T165、K178、R180、S181、T182、G183、M201、F202、N225、S243、N272、N282、Y305、R309、D319、Q320、Q359、K444和G475。SEQ ID NO:2的更优选的变体是在以下位置中的一个或多个处具有取代的那些：Q87E,R、Q98R、S125A、N128C、T131I、T165I、K178L、T182G、M201L、F202Y、N225E,R、N272E,R、S243Q,A,E,D、Y305R、R309A、Q320R、Q359E、K444E以及G475K，和/或在位置R180和/或S181处具有缺失的那些。SEQ ID NO:2的最优选的淀粉酶变体是具有以下取代的那些：N128C+K178L+T182G+Y305R+G475K；N128C+K178L+T182G+F202Y+Y305R+D319T+G475K；S125A+N128C+K178L+T182G+Y305R+G475K；或S125A+N128C+T131I+T165I+K178L+T182G+Y305R+G475K，其中该变体任选地进一步在位置243处包括取代和/或在位置180和/或位置181处包括缺失。
淀粉酶的其他实例是具有WO 01/66712中的SEQ ID NO:12的α-淀粉酶或与SEQ IDNO:12具有至少90％，例如至少95％序列同一性的变体。优选的淀粉酶变体是在WO 01/66712中的SEQ ID NO:12中的以下位置中的一个或多个中具有取代、缺失或插入的那些：R28、R118、N174；R181、G182、D183、G184、G186、W189、N195、M202、Y298、N299、K302、S303、N306、R310、N314；R320、H324、E345、Y396、R400、W439、R444、N445、K446、Q449、R458、N471、N484。特别优选的淀粉酶包括具有D183和G184的缺失并且具有取代R118K、N195F、R320K和R458K的变体，以及另外在一个或多个选自下组的位置中具有取代的变体：M9、G149、G182、G186、M202、T257、Y295、N299、M323、E345和A339，最优选的是另外在所有这些位置中具有取代的变体。
可商购的淀粉酶是DuramylTM、TermamylTM、FungamylTM、StainzymeTM、StainzymePlusTM、NatalaseTM和BANTM(诺维信公司)，RapidaseTM和PurastarTM(来自杰能科国际有限公司)。
过氧化物酶/氧化酶：适合的过氧化物酶/氧化酶包括植物、细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰的突变体或蛋白质工程化的突变体。有用的过氧化物酶的实例包括来自鬼伞属，例如来自灰盖鬼伞的过氧化物酶，及其变体，如在WO 93/24618、WO 95/10602、以及WO 98/15257中描述的那些。
可商购的过氧化酶包括GuardzymeTM(诺维信公司)。
可以通过添加含有一种或多种酶的单独添加剂、或通过添加含有所有这些酶的组合添加剂而将一种或多种洗涤剂酶包含于洗涤剂组合物中。本发明的洗涤剂添加剂，即单独的或组合的添加剂，可以配制成例如颗粒、液体、浆液等。优选的洗涤剂添加剂配制品是颗粒，特别是无粉尘颗粒；液体，特别是稳定化液体；或浆液。
非尘颗粒可以例如如在US 4,106,991和4,661,452中所披露而产生，并且可以任选地通过本领域已知的方法进行涂覆。蜡状包衣材料的实例是平均分子量为1000至20000的聚(环氧乙烷)产品(聚乙二醇，PEG)；具有16至50个环氧乙烷单元的乙氧基化壬基酚；乙氧基化脂肪醇，其中所述醇含有12至20个碳原子，并且其中存在15至80个环氧乙烷单元；脂肪醇；脂肪酸；以及脂肪酸的甘油单酯、和甘油二酯、和甘油三酯。适合用于通过流化床技术应用的成膜包衣材料的实例在GB 1483591中给出。液体酶制剂可以例如通过根据已确立的方法添加多元醇(如丙二醇)、糖或糖醇、乳酸或硼酸而稳定化。受保护的酶可以根据EP238,216中披露的方法来制备。
辅料
还可以利用本领域中已知的用于在衣物洗涤剂中使用的任何洗涤剂组分。其他任选的洗涤剂组分包括防腐蚀剂、防缩剂、抗污垢再沉积剂、抗皱剂、杀细菌剂、粘合剂、腐蚀抑制剂、崩解剂(disintegrant)/崩解试剂(disintegration agent)、染料、酶稳定剂(包括硼酸、硼酸盐、CMC和/或多元醇如丙二醇)、织物调理剂(包括粘土)、填充剂/加工助剂、荧光增白剂/光学增亮剂、增泡剂、泡沫(泡)调节剂、香料、污垢悬浮剂、软化剂、抑泡剂、晦暗抑制剂以及芯吸剂，单独或组合使用。可以利用本领域中已知的用于在衣物洗涤剂中使用的任何成分。此类成分的选择完全在技术人员的技术范围内。
分散剂：本发明的洗涤剂组合物还可以包含分散剂。具体地，粉末洗涤剂可以包含分散剂。合适的水溶性有机材料包括均聚合或共聚合的酸或其盐，其中聚羧酸包含被不多于两个碳原子彼此分开的至少两个羧基。合适的分散剂例如描述于Powdered Detergents[粉末洗涤剂],Surfactant science series[表面活性剂科学系列],第71卷,马塞尔德克尔公司(Marcel Dekker,Inc.)中。
染料转移抑制剂：本发明的洗涤剂组合物还可以包括一种或多种染料转移抑制剂。适合的聚合物染料转移抑制剂包括但不局限于聚乙烯吡咯烷酮聚合物、多胺N-氧化物聚合物、N-乙烯吡咯烷酮与N-乙烯基咪唑的共聚物、聚乙烯噁唑烷酮以及聚乙烯咪唑或其混合物。当在主题组合物中存在时，染料转移抑制剂可以按该组合物的重量计以从约0.0001％至约10％、从约0.01％至约5％或甚至从约0.1％至约3％的水平存在。
荧光增白剂：本发明的洗涤剂组合物将优选地还包含另外的组分，这些组分可以给正在清洁的物品着色，例如荧光增白剂或光学增亮剂。其中增亮剂优选以约0.01％至约0.5％的水平存在。在本发明的组合物中可以使用合适用于在衣物洗涤剂组合物中使用的任何荧光增白剂。最常用的荧光增白剂是属于以下类别的那些：二氨芪-磺酸衍生物、二芳基吡唑啉衍生物和二苯基-联苯乙烯衍生物。荧光增白剂的二氨芪-磺酸衍生物型的实例包括以下的钠盐：4,4'-双-(2-二乙醇氨基-4-苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)芪-2,2'-二磺酸盐；4,4'-双-(2,4-二苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)芪-2.2'-二磺酸盐；4,4'-双-(2-苯胺基-4(N-甲基-N-2-羟基-乙基氨基)-s-三嗪-6-基氨基)芪-2,2'-二磺酸盐，4,4'-双-(4-苯基-2,1,3-三唑-2-基)芪-2,2'-二磺酸盐；4,4'-双-(2-苯胺基-4(1-甲基-2-羟基-乙基氨基)-s-三嗪-6-基氨基)芪-2,2'-二磺酸盐和2-(二苯乙烯基-4"-萘-1.,2':4,5)-1,2,3-三唑-2"-磺酸盐。优选的荧光增白剂是可从汽巴–嘉基股份有限公司(Ciba-Geigy AG)(巴塞尔，瑞士)获得的天来宝(Tinopal)DMS和天来宝CBS。天来宝DMS是4,4'-双-(2-吗啉基-4苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)芪二磺酸盐的二钠盐。天来宝CBS是2,2'-双-(苯基-苯乙烯基)二磺酸盐的二钠盐。还优选的是荧光增白剂是可商购的Parawhite KX，由印度孟买的派拉蒙矿物与化学品公司(Paramount Minerals and Chemicals)供应。合适用于本发明中使用的其他荧光剂包括1-3-二芳基吡唑啉和7-氨烷基香豆素。合适的荧光增亮剂水平包括从约0.01wt％、从0.05wt％、从约0.1wt％或甚至从约0.2wt％的较低水平至0.5wt％或甚至0.75wt％的较高水平。
污垢释放聚合物：本发明的洗涤剂组合物还可以包括一种或多种污垢释放聚合物，这些聚合物帮助从织物(如棉和基于聚酯的织物)去除污垢，特别是从基于聚酯的织物去除疏水性污垢。污垢释放聚合物可以例如是非离子型或阴离子型对苯二甲酸基的聚合物、聚乙烯基己内酰胺和相关共聚物、乙烯基接枝共聚物、聚酯聚酰胺，参见例如PowderedDetergents[粉末洗涤剂],Surfactant science series[表面活性剂科学系列],第71卷,第7章,马塞尔德克尔公司。另一种类型的污垢释放聚合物是包含核心结构和附接至该核心结构的多个烷氧基化基团的两亲性烷氧基化油污清洁聚合物。核心结构可以包含聚烷基亚胺结构或聚烷醇胺结构，如在WO 2009/087523中详细描述的(通过引用并入本文)。此外，无规接枝共聚物是适合的污垢释放聚合物。适合的接枝共聚物更详细地描述于WO 2007/138054、WO 2006/108856和WO2006/113314(特此通过引用的方式并入)中。其他污垢释放聚合物是取代的多糖结构，尤其是取代的纤维素结构，如修饰的纤维素衍生物，如EP 1867808或WO 2003/040279中所描述的那些(将二者都通过引用并入本文)。合适的纤维素聚合物包括纤维素、纤维素醚、纤维素酯、纤维素酰胺以及其混合物。合适的纤维素聚合物包括阴离子修饰的纤维素、非离子修饰的纤维素、阳离子修饰的纤维素、兼性离子修饰的纤维素及其混合物。合适的纤维素聚合物包括甲基纤维素、羧甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、酯羧甲基纤维素及其混合物。
抗再沉积剂：本发明的洗涤剂组合物还可以包括一种或多种抗再沉积剂，如羧甲基纤维素(CMC)、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚氧乙烯和/或聚乙二醇(PEG)、丙烯酸的均聚物、丙烯酸和马来酸的共聚物、和乙氧基化的聚乙亚胺。以上在污垢释放聚合物下所描述的基于纤维素的聚合物还可以作为抗再沉积剂起作用。
其他适合的辅料包括但不限于防缩剂、抗皱剂、杀细菌剂、粘合剂、载体、染料、酶稳定剂、织物柔软剂、填充剂、泡沫调节剂、助水溶剂、香料、色素、抑泡剂、溶剂以及用于液体洗涤剂的结构剂和/或结构弹性剂。
洗涤剂产品的配制品
该洗涤剂组合物可以处于任何常规形式，例如条、均匀的片剂、具有两个或更多个层的片剂、具有一个或多个室的袋、规则的或压缩的粉末、颗粒、膏、凝胶、或规则的、压缩的或浓缩的液体。存在多种洗涤剂配制品形式，如层(相同或不同相)、小袋、以及用于机器给药单位的形式。
袋可以被配置为单一室或多室。它可以具有适合保存该组合物的任何形式、形状和材料，例如在与水接触之前，不允许该组合物从袋中释放出来。所述袋由水溶性膜制成，它包含了一个内部体积。所述内部体积可以分成袋的室。优选的膜是聚合物材料，优选地形成膜或薄片的聚合物。优选的聚合物、共聚物或其衍生物选自聚丙烯酸酯、和水溶性丙烯酸酯共聚物、甲基纤维素、羧甲基纤维素、糊精钠、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、麦芽糊精、聚甲基丙烯酸酯，最优选地是聚乙烯醇共聚物和羟丙基甲基纤维素(HPMC)。优选地，聚合物在膜例如PVA中的水平是至少约60％。优选的平均分子量将典型地是约20,000至约150,000。膜还可以是共混组合物，包含可水解降解的和水溶性的聚合物共混物，如聚乳酸和聚乙烯醇(已知在商品参考号M8630下，如由美国印第安纳州盖里的克里斯克拉夫特工业产品公司(Chris Craft In.Prod.Of Gary,Ind.,US)销售)加增塑剂，像甘油、乙二醇、丙二醇、山梨醇及其混合物。所述袋可以包含固体洗衣清洁组合物或部分组分和/或液体清洁组合物或由水溶性膜分开的部分组分。用于液体组分的室在构成上可以与包含固体的室不同。参考：(US 2009/0011970A1)。
可以由水可溶袋中的或片剂的不同层中的室来将洗涤剂成分彼此物理分开。因此，可以避免组分间的不良的储存相互作用。在洗涤溶液中，每个室的不同溶解曲线还可以引起选择的组分的延迟溶解。
非单位剂量的液体或凝胶洗涤剂可以是水性的，典型地包含按重量计至少20％并且最高达95％的水，例如高达约70％的水、高达约65％的水、高达约55％的水、高达约45％的水、高达约35％的水。包括但不限于链烷醇、胺、二醇、醚以及多元醇的其他类型的液体可以被包括在水性液体或凝胶中。水性液体或凝胶洗涤剂可以包含从0-30％的有机溶剂。液体或凝胶洗涤剂可以是非水性的。
洗衣皂条
本发明的酶可以添加到洗衣皂条中并用于手洗衣物、织物和/或纺织品。术语洗衣皂条包括洗衣条、皂条、组合条(combo bar)、合成洗涤剂条以及洗涤剂条。条的类型通常区别在于他们包含的表面活性剂的类型，并且术语洗衣皂条包括包含来自脂肪酸的皂和/或合成皂的那些。洗衣皂条具有在室温下为固体而非液体、凝胶或粉末的物理形式。术语固体被定义为不随时间显著变化的物理形式，即如果固体物体(例如洗衣皂条)被放置在容器里，该固体物体不会为了填充其被放置的容器而发生改变。该条是固体时典型地是条的形式但也可能是其他的固体形状如圆形或椭圆。
所述洗衣皂条可以包含一个或多个另外的酶、蛋白酶抑制剂如肽醛类(或次硫酸盐加合物或半缩醛加合物)、硼酸、硼酸盐、硼砂和/或苯基硼酸衍生物如4-甲酸基本硼酸、一个或多个皂或合成的表面活性剂、多元醇如甘油、pH控制化合物如脂肪酸、柠檬酸、乙酸和/或甲酸、和/或一价阳离子和有机阴离子的盐，其中所述一价阳离子可以是例如Na+、K+或NH4 +并且所述有机阴离子可以是例如甲酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐或乳酸盐，这样使得所述一价阳离子和有机阴离子的盐可以是例如甲酸钠。
洗衣皂条还可以包含络合剂像EDTA和HEDP、香料和/或不同类型的填充剂、表面活性剂例如阴离子型合成表面活性剂、助洗剂、聚合的污垢释放剂、洗涤剂螯合剂、稳定试剂、填充剂、染料、着色剂、染料转移抑制剂、烷氧基化的聚碳酸酯、抑泡剂、结构剂、黏合剂、浸出剂、漂白活化剂、黏土去污剂、抗再沉积剂、聚合分散剂、增亮剂、织物柔软剂、香料和/或本领域已知的其他化合物。
洗衣皂条可以在常规的洗衣皂条制造设备中进行加工，该设备例如但不限于：混合器、压条机(例如两级真空压条机)、挤出机、切割机、标识压模、冷却隧道以及包装机。本发明不局限于通过任何单一方法制备洗衣皂条。可以在过程的不同阶段向皂中添加本发明的预混料。例如，可以制备包含皂、酶、任选地一种或多种另外的酶、蛋白酶抑制剂以及一价阳离子和有机阴离子的盐的预混料并且然后将该混合物压条。酶和任选的另外的酶可以同时添加作为蛋白酶抑制剂，例如以液体形式。除了混合步骤和压条步骤以外，该过程还可以进一步包含研磨、挤出、切割、压模、冷却和/或包装的步骤。
产生组合物的方法
本发明还涉及产生组合物的方法。该方法可以与洗涤剂组合物的(储存)稳定性相关：例如，Soap bar premix method[皂条预混方法]WO 2009155557。
用途
本发明还针对用于使用其组合物的方法。本发明可以例如用于任何需要降解黄原胶的应用中，如在洗涤剂中以及在石油工业中。在石油工业中，将黄原胶用于增加钻井液(特别是钻井泥浆)的黏度。在所有此类用途中，还将需要通过降解黄原胶来降低黏度，并且用于这样的黏度减少，可以适合地使用本发明的组合物，该组合物包括一种黄原胶裂解酶和对用黄原胶裂解酶预处理的黄原胶具有活性的GH9内切葡聚糖酶(例如根据本发明的其变体)。
用于降解黄原胶的用途
已经将黄原胶用作许多消费品(包括食品和化妆品)中的成分并且已经用于石油工业中。因此，黄原胶的降解可以导致改善的清洁过程，例如更容易去除含有胶质(例如黄原胶)的污渍，以及通常用于石油与钻探工业中的黄原胶的降解。因此，本发明针对本发明的GH9内切葡聚糖酶(例如本发明的变体)或其组合物用于降解黄原胶的用途。本发明还针对本发明的黄原胶裂解酶或其组合物用于降解黄原胶的用途。一个实施例是本发明的GH9内切葡聚糖酶(例如本发明的变体)与黄原胶裂解酶一起或其组合物用于降解黄原胶的用途。黄原胶的降解优选地可以使用黏度降低测定(例如，ViPr测定)或可替代地如本文实例3中所述来测量。
可替代地，可以使用由Lever(1972)，Anal.Biochem.[分析化学]47:273-279，1972开发的比色测定，通过用黄原胶裂解酶预处理的黄原胶上的还原末端的评估来测量GH9内切葡聚糖酶活性。一个优选实施例是用黄原胶裂解酶预处理的0.1％黄原胶的用途。可以通过计算空白与样品之间的差异确定用黄原胶裂解酶预处理的黄原胶的降解，其中大于0.5mAU，优选大于0.6mAU，更优选大于0.7mAU或甚至更优选大于0.8mAU的差异显示用黄原胶裂解酶预处理的黄原胶的降解。
可替代地，可以使用由Lever(1972),Anal.Biochem.[分析化学]47:273-279,1972研发的比色测定通过评估从黄原胶中释放的还原末端测量黄原胶裂解酶活性。一个优选实施例是0.1％黄原胶的用途。可以通过计算空白与样品之间的差异确定黄原胶的降解，其中大于0.1mAU，优选大于0.15mAU，更优选大于0.2mAU或甚至更优选大于0.25mAU的差异显示黄原胶的降解。
可替代地，可以使用由Lever(1972),Anal.Biochem.[分析化学]47:273-279,1972研发的比色测定通过评估从黄原胶中释放的还原末端测量GH9内切葡聚糖酶(例如本发明的变体)和黄原胶裂解酶活性。一个优选实施例是0.1％黄原胶的用途。可以通过计算空白与样品之间的差异确定黄原胶的降解，其中大于0.4mAU，优选大于0.5mAU，更优选大于0.6mAU或甚至更优选大于0.8mAU的差异显示黄原胶的降解。
本发明还涉及用于降解黄原胶的方法，这些方法包括向黄原胶施用包含一种或多种本发明的GH9内切葡聚糖酶(例如本发明的变体)的组合物。一个实施例是一种用于降解黄原胶的方法，该方法包括向黄原胶施用包含一种或多种本发明的GH9内切葡聚糖酶(例如本发明的变体)连同一种或多种黄原胶裂解酶的组合物。
在洗涤剂中的用途
本发明尤其涉及本发明的GH9内切葡聚糖酶(例如本发明的变体)或其组合物在清洁过程中的用途，如纺织品和织物的洗涤(例如家用衣物洗涤和工业衣物洗涤)，以及家用和工业硬表面清洁，如餐具洗涤。可以将本发明的GH9内切葡聚糖酶(例如本发明的变体)添加至包含一种或多种洗涤剂组分的洗涤剂组合物中。
在一些方面，本发明的GH9内切葡聚糖酶(例如本发明的变体)可以连同一种或多种黄原胶裂解酶或其组合物在清洁过程中使用，如纺织品和织物的洗涤(例如家用衣物洗涤和工业衣物洗涤)以及家用和工业硬表面清洁，如餐具洗涤。可以将本发明的GH9内切葡聚糖酶(例如本发明的变体)连同一种或多种黄原胶裂解酶添加至包含一种或多种洗涤剂组分的洗涤剂组合物中。
可以将本发明的多肽(例如本发明的变体)添加至洗涤剂组合物中并因此成为洗涤剂组合物的组分。洗涤剂组合物可以配制为例如用于家用和工业衣物清洁两者的手洗或机洗衣物洗涤剂组合物，包括适合用于预处理有污物的织物的洗衣添加剂组合物和漂洗添加的织物软化剂组合物，或者配制为用于一般家用或工业硬表面清洁操作的洗涤剂组合物，或者配制用于手洗或机洗(家用和工业两者)餐具洗涤操作。在一个具体方面，本发明涉及包含如本文所述的本发明多肽的洗涤剂添加剂。
本发明还涉及用于降解纺织品的表面或硬表面上的黄原胶的方法(如餐具洗涤)，这些方法包括向黄原胶施用包含一种或多种本发明的GH9内切葡聚糖酶(例如本发明的变体)的组合物。在一些方面，本发明涉及一种用于降解纺织品的表面或硬表面上的黄原胶的方法(如餐具洗涤)，该方法包括向黄原胶施用包含一种或多种本发明的GH9内切葡聚糖酶(例如本发明的变体)的组合物。在一些方面，本发明涉及包含一种或多种如本文描述的洗涤剂组分的组合物。具有酶洗涤益处的GH9内切葡聚糖酶(例如本发明的变体)的用途。
已经考虑了单独使用本发明的GH9内切葡聚糖酶(例如本发明的变体)给出酶洗涤益处，优选是对黄原胶的酶洗涤益处。
在一些方面，本发明涉及一种洗涤剂组合物的用途，该洗涤剂组合物包含一种或多种洗涤剂组分和一种本发明的分离的GH9内切葡聚糖酶(例如本发明的变体)连同一种黄原胶裂解酶。在一些方面，本发明涉及一种洗涤剂组合物的用途，该洗涤剂组合物包含一种或多种洗涤剂组分和一种本发明的分离的GH9内切葡聚糖酶(例如本发明的变体)连同一种黄原胶裂解酶。
在地下地层的压裂(石油钻探)中的用途
使用水力压裂来创造自钻孔延伸至岩层的地下压裂，以便增加通过地层可以产生的流体的流速。通常，将高黏度压裂液以足够压裂地下地层的压力泵入井中。为了维持向地层的增加的暴露，将固体支撑剂添加至压裂液中，通过施加至流体的高压将其带进压裂处。一旦高黏度压裂液将该支撑剂带进地层中，破碎物用于减少流体的黏度，这允许该支撑剂停留在压裂处中并且由此增加地层向井的暴露。破碎物通过减少聚合物的分子量而工作，以此方式‘破碎’或降解聚合物。压裂处然后变为一种高渗透性管道，用于有待产生的流体和天然气回至井中。此类过程进一步披露于美国专利号7,360,593、5,806,597、5,562,160、5,201,370和5,067,566中。
因此，本发明涉及本发明的GH9内切葡聚糖酶(例如本发明的变体)作为酶破碎物的用途。本发明的一个实施例是本发明的GH9内切葡聚糖酶(例如本发明的变体)连同黄原胶裂解酶作为酶破碎物的用途。
因此，本发明提供了一种用于破碎钻井孔中的黄原胶的方法，该方法包括：(i)将包括水性流体的可胶凝压裂液、一种或多种能水合的聚合物、用于交联能水合的聚合物以形成一种聚合物凝胶的适合的交联剂，以及一种或多种本发明的酶(即，酶破碎物，例如，本发明的变体)共混在一起；(ii)将交联聚合物凝胶在足够压裂周围地层的压力下泵入钻井孔中；并且(iii)允许酶破碎物降解交联聚合物，以减少流体的粘度，这样使得可以将流体从地层泵回至井表面。因此，本发明的GH9内切葡聚糖酶(例如本发明的变体)可以用于控制压裂液的黏度。在一个实施例中，一种或多种本发明的GH9内切葡聚糖酶(例如本发明的变体)连同一种或多种黄原胶裂解酶可以用于控制压裂液的黏度。
本发明的酶破碎物(例如本发明的变体)可以是压裂液或破碎物-交联剂-聚合物复合物的一种成分，该压裂液或复合物进一步包含一种能水合的聚合物和一种交联剂。压裂液或复合物可以是一种凝胶或可以是可胶凝化的。该复合物在以下方法中是有用的，该方法用于在一种压裂液中使用该复合物以将钻井孔周围的地下地层压裂，这是通过在足够将周围的地下地层压裂的压力下将该流体泵至钻井孔中的所希望的位置。该复合物可以通过维持特定条件的pH和温度来维持基本上非反应的状态，直到该流体被放置在钻井孔中的时刻并且完成所希望的压裂。一旦压力完成，该复合物维持无活性的特定条件便不再维持。当这些条件显著变化时，该复合物变得有活性并且破碎物开始催化聚合物降解，从而导致压裂液变得足够流动，以从地下地层泵至井表面。
其他用途
本发明的多肽(例如本发明的变体)可以另外地用于其中去除黄原胶是有益的其他应用中。
方法
降解黄原胶的方法，其中黄原胶用于压裂由钻井孔形成的地下地层
当钻井时，储层钻井液(RDF)在钻探设备内循环以冷却并清洁钻头，去除钻井孔外的钻屑，减少钻柱与钻孔的侧边之间的摩擦力，并且形成滤饼以便阻止流体渗漏进入地层中。用于形成滤饼的驱动力是应用以维持钻孔稳定性的较高的钻井孔压力。这一滤饼限制储层流体在钻探以及完井设备的放置过程中流入钻井孔。如果在井竣工之前或过程中未去除在钻探过程中造成的滤饼损伤，则当该井投入生产时可以出现一系列问题，即完井设备失败和受损的储层生产力。
钻井液(泥浆)(也称为储层钻井液(RDF))可以是合成/油基的或水基的。为了使钻井液对地层的侵入最小化，油基和水基泥浆滤饼两者都典型地包含一种桥接剂或增重剂，通常是碳酸钙颗粒、重晶石或两者的混合物，其桥接在地层的孔喉处并且由此形成相对低渗透性滤饼。油基和水基泥浆滤饼两者还都包含在钻探过程中带出的称作钻屑的固体，与添加在钻井液的配制品中的桥接/增重剂截然相反。这些固体可以是石英(砂)、粉砂和/或页岩，取决于储层地层以及由钻探路径至储层穿过的地层。另外，油基钻井泥浆包含陷于滤饼的孔域中的水滴，而水基泥浆滤饼包含聚合物，例如淀粉和黄原胶，以及其他无机盐。
形成泥浆滤饼对于钻探而言通常是必须的，特别是在具有钻井孔稳定性问题并且典型地具有高渗透性的疏松地层中。然后将滤饼用不同化学品处理，例如螯合剂或酸，以溶解方解石组分；和/或酶或氧化剂，以降解聚合物组分，从而恢复渗透性。
在一方面，本发明提供了一种用于降解黄原胶的方法，其中黄原胶用于压裂由钻井孔造成的地下地层，该方法是通过施用包含一种或多种本发明的酶(例如本发明的变体)的组合物。该方法包括以下步骤：(i)将包含一种或多种本发明的酶(例如本发明的变体)的处理流体泵入与有待去除的滤饼接触的钻孔中，以在该处理流体与邻接该滤饼的地层之间建立不同的压力并且(ii)在不同的压力周期过程中均匀地传播滤饼的处理，以通过该处理流体延迟突破。
在一个实施例中，该方法包括在地层与钻孔之间通过处理的滤饼建立渗透性。在另一个实施例中，该滤饼包括钻井固体和黏土，并且可以形成自水性钻井液。如果希望的话，用于处理水性钻井液滤饼的处理流体还可以包括一种氧化剂和/或螯合剂，或它可以是基本上不含螯合剂和氧化剂添加剂的。在另一个实例中，该滤饼可以形成自油或反相乳化钻井液。如果希望的话，用于处理油或反相乳化钻井液滤饼的处理流体还可以包括互溶剂、水润湿剂或其组合,从而将疏水性组分分散在滤饼中。
在一个实施例中，该处理流体包括一种或多种本发明的GH9内切葡聚糖酶(例如本发明的变体)。在一个优选实施例中，该处理流体包括一种或多种本发明的GH9内切葡聚糖酶(例如本发明的变体)以及一种或多种黄原胶裂解酶。
降解黄原胶的方法，其中黄原胶是钻孔滤饼中的一种组分
在一方面，本发明提供了一种一旦钻孔滤饼被泵至表面，用于清洁该滤饼的方法，该滤饼包含聚合物，例如黄原胶和钻井液固体。钻井泥浆从泥浆池泵至钻头然后再泵出至表面，在该过程中带出除其他东西之外的破碎的或切碎的岩石(钻屑)。将钻屑滤出并且将泥浆返回至泥浆池，在泥浆池中细粒可以沉淀和/或可以将添加化学品或酶(破碎物)进行添加。
用于降解黄原胶的方法(其中黄原胶是钻孔滤饼中的一种组分)包括以下步骤：(i)用一种处理流体处理该钻孔滤饼，该处理流体包含一种或多种本发明的酶(例如本发明的变体)并且(ii)将固体与流体分离。在一个实施例中，该处理流体包括一种或多种本发明的GH9内切葡聚糖酶(例如本发明的变体)。在一个优选实施例中，该处理流体包括一种或多种本发明的GH9内切葡聚糖酶(例如本发明的变体)以及一种或多种黄原胶裂解酶。
可以将钻孔滤饼在泥浆池中用一种或多种本发明的酶(例如本发明的变体)处理并且可以再循环钻井液。可替代地，一旦滤饼已经被一种或多种本发明的酶(例如本发明的变体)处理，使用固液分离方法(如离心)将固体与流体分离。
在以下段落中进一步定义本发明：
1.一种内切葡聚糖酶变体，该变体在选自下组的区域中的一个或多个位置处包含改变(例如，取代、缺失或插入)，该组由以下组成：
i)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸95至105的区域1，例如，在选自下组的一个或多个位置处的所述改变，该组由以下组成：位置95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105，其中所述位置对应于SEQ ID NO:2的氨基酸位置(例如，使用SEQ ID NO:2的编号)，
ii)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸115至138的区域2，例如，在选自下组的一个或多个位置处的所述改变，该组由以下组成：位置115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138，其中所述位置对应于SEQ ID NO:2的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO:2的编号)，
iii)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸210至251的区域3，例如，在选自下组的一个或多个位置处的所述改变，该组由以下组成：位置210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251，其中所述位置对应于SEQID NO:2的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO:2的编号)，
iv)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸267至301的区域4，例如，在选自下组的一个或多个位置处的所述改变，该组由以下组成：位置267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301，其中所述位置对应于SEQ ID NO:2的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO:2的编号)，
v)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸339至361的区域5，例如，在选自下组的一个或多个位置处的所述改变，该组由以下组成：位置339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361，其中所述位置对应于SEQID NO:2的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO:2的编号)，
vi)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸547至595的区域6，例如，在选自下组的一个或多个位置处的所述改变，该组由以下组成：位置547、548、549、550、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595，其中所述位置对应于SEQ ID NO:2的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO:2的编号)，
vii)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸612至660的区域7，例如，在选自下组的一个或多个位置处的所述改变，该组由以下组成：位置612、613、614、615、616、617、618、619、620、621、622、623、624、625、626、627、628、629、630、631、632、633、634、635、636、637、638、639、640、641、642、643、644、645、646、647、648、649、650、651、652、653、654、655、656、657、658、659、660，其中所述位置对应于SEQ ID NO:2的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO:2的编号)，
viii)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸806至828的区域8，例如，在选自下组的一个或多个位置处的所述改变，该组由以下组成：位置806、807、808、809、810、811、812、813、814、815、816、817、818、819、820、821、822、823、824、825、826、827、828，其中所述位置对应于SEQID NO:2的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO:2的编号)，和
ix)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸839至1042的区域9，例如，在选自下组的一个或多个位置处的所述改变，该组由以下组成：位置839、840、841、842、843、844、845、846、847、848、849、850、851、852、853、854、855、856、857、858、859、860、861、862、863、864、865、866、867、868、869、870、871、872、873、874、875、876、877、878、879、880、881、882、883、884、885、886、887、888、889、890、891、892、893、894、895、896、897、898、899、900、901、902、903、904、905、906、907、908、909、910、911、912、913、914、915、916、917、918、919、920、921、922、923、924、925、926、927、928、929、930、931、932、933、934、935、936、937、938、939、940、941、942、943、944、945、946、947、948、949、950、951、952、953、954、955、956、957、958、959、960、961、962、963、964、965、966、967、968、969、970、971、972、973、974、975、976、977、978、979、980、981、982、983、984、985、986、987、988、989、990、991、992、993、994、995、996、997、998、999、1000、1001、1002、1003、1004、1005、1006、1007、1008、1009、1010、1011、1012、1013、1014、1015、1016、1017、1018、1019、1020、1021、1022、1023、1024、1025、1026、1027、1028、1029、1030、1031、1032、1033、1034、1035、1036、1037、1038、1039、1040、1041、1042，其中所述位置对应于SEQ ID NO:2的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO:2的编号)，
其中所述变体与SEQ ID NO:2具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％、且小于100％的序列同一性；优选地，所述内切葡聚糖酶变体对用黄原胶裂解酶预处理的黄原胶具有活性，进一步优选地，所述活性是黄原胶降解活性。
2.如段落1所述的内切葡聚糖酶变体，该变体是选自下组的亲本内切葡聚糖酶的变体，该组由以下组成：
a)与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少60％序列同一性的多肽；
b)由在低严格条件下与(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列、或者(ii)(i)的全长互补序列杂交的多核苷酸编码的多肽；
c)由多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列具有至少60％的同一性；和
d)SEQ ID NO:2的成熟多肽的片段，该片段具有内切葡聚糖酶活性。
3.如段落2所述的内切葡聚糖酶变体，其中该亲本内切葡聚糖酶与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性。
4.如段落2-3中任一项所述的内切葡聚糖酶变体，其中该亲本内切葡聚糖酶由以下多核苷酸编码，该多核苷酸在低严格条件下、中严格条件下、中-高严格条件下、高严格条件下、或非常高严格条件下与(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列或者(ii)(i)的全长互补序列杂交。
5.如段落2-4中任一项所述的内切葡聚糖酶变体，其中该亲本内切葡聚糖酶由以下多核苷酸编码，该多核苷酸与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性。
6.如段落2-5中任一项所述的内切葡聚糖酶变体，其中该亲本内切葡聚糖酶包括SEQ ID NO:2的成熟多肽或由其组成。
7.如段落2-6中任一项所述的内切葡聚糖酶变体，其中该亲本内切葡聚糖酶是SEQID NO:2的成熟多肽的片段，其中该片段具有内切葡聚糖酶活性。
8.如段落2-7中任一项所述的内切葡聚糖酶变体，该变体与该亲本内切葡聚糖酶的氨基酸序列具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％同一性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列同一性。
9.如段落1-8中任一项所述的内切葡聚糖酶变体，其中所述变体与SEQ ID NO:2具有至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列同一性。
10.如段落1-9中任一项所述的内切葡聚糖酶变体，其中在一个或多个位置处的所述改变选自下组，该组由在以下位置处的改变组成：SEQ ID NO:2的17、20、51、53、55、56、60、63、79、87、186、192、302、311、313、387、388、390、403、408、410、416、448、451、471、472、476、489、507、512、515、538、598、599、602、603、605、609、676、688、690、694、697、698、699、711、719、754、756、760、781、786、797、833、834、835、和1048，其中根据SEQ ID NO:2进行编号。
11.如段落1-10中任一项所述的内切葡聚糖酶变体，其中在一个或多个位置处的所述改变选自下组，该组由以下组成：SEQ ID NO:2的S17A、F20P、F20N、F20G、F20Y、K51Q、K51H、E53P、E53G、Y55M、V56M、Y60F、S63F、T87R、A186P、K192N、I302D、I302H、I302V、I302M、H311N、S313D、I387T、K388R、K390Q、I403Y、E408D、E408S、E408P、E408A、E408G、E408N、P410G、Q416S、Q416D、A448E、A448W、A448S、K451S、G471S、S472Y、D476R、Q489P、K507R、K512P、S515V、S538C、Y579W、S598Q、A599S、I602T、I602D、V603P、S605T、G609E、D676H、A688G、Y690F、T694A、T697G、R698W、T699A、T711V、T711Y、W719R、K754R、V756H、V756Y、S760G、T781M、N786K、T797S、A824D、N833D、Q834E、S835D、和F1048W。
12.根据段落1-11中任一项所述的内切葡聚糖酶变体，其中该变体进一步包含选自下组的在一个或多个位置处的改变，该组由在以下位置处的改变组成：216、283、346、559、564、579、636、638、651,824、848、869、880、881、883、887、892、905、906、912、921、928、934、937、948、956、999和1037。
13.根据段落1至12中任一项所述的内切葡聚糖酶变体，进一步其中在一个或多个位置处的所述改变选自下组，该组由以下组成：N216D、N216Q、A283D、A346D、A559P、A559N、A564E、Y579W、S636K、S636N、F638N、A651P、A824D、N848D、A869V、R880K、V881T、V881Q、T883R、T887K、T892P、N905D、F906A、A912V、K921R、S928D、Y934G、A937E、K948R、Q956Y、T999R、和A1037E。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的内切葡聚糖酶变体，其中该变体包含一个或多个以下的取代组：
F20Y+A448S+T781M
E408D+K451S
E408D+A448E
E408D
Y579W+E408D
15.根据权利要求1-14中任一项所述的内切葡聚糖酶变体，其中该变体包含一个或多个以下的取代组：
Figure BDA0002387863890001911
Figure BDA0002387863890001921
16.如段落1-15中任一项所述的内切葡聚糖酶变体，其中与该亲本内切葡聚糖酶(例如SEQ ID NO:2)相比具有在1和25之间，例如1和20之间的改变总数，例如在1和10之间或在1和5之间，如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个改变。
17.如段落1-16中任一项所述的内切葡聚糖酶变体，其中所述对用黄原胶裂解酶预处理的黄原胶的活性是黄原胶降解活性，优选地，所述黄原胶降解活性是内切葡聚糖酶EC 3.2.1.4活性；进一步优选地，所述黄原胶裂解酶具有EC 4.2.2.12活性。
18.如段落1-17中任一项所述的内切葡聚糖酶变体，其中所述变体与亲本内切葡聚糖酶(例如，具有SEQ ID NO:2)相比具有在洗涤剂组合物中的改善的稳定性；优选地，所述洗涤剂组合物包括螯合剂；进一步优选地，所述螯合剂是EDTA或柠檬酸盐。
19.如段落1-18中任一项所述的内切葡聚糖酶变体，其中所述变体具有≥1.0的半衰期改善因子(HIF)；优选地，所述变体具有>1.0的半衰期改善因子(HIF)。
20.如段落19所述的内切葡聚糖酶变体，其中所述半衰期改善因子(HIF)是在所述内切葡聚糖酶变体在洗涤剂组合物中于25℃孵育持续从约5至约140小时的时间段后确定的。
21.一种组合物，所述组合物包含至少一种如段落1-20中任一项所述的内切葡聚糖酶变体。
22.如段落21所述的组合物，其中所述组合物不是洗涤剂组合物，优选地所述组合物是钻井液。
23.如段落21-22中任一项所述的组合物，该组合物进一步包含一种或多种组分；优选地，所述组分是螯合剂；进一步优选地，所述螯合剂是EDTA或柠檬酸盐。
24.如段落21-23中任一项所述的组合物，该组合物进一步包含选自下组的一种或多种另外的酶，该组由以下组成：内切葡聚糖酶、蛋白酶、淀粉酶、地衣聚糖酶、脂肪酶、角质酶、纤维素酶、黄原胶裂解酶、木葡聚糖酶、果胶酶、果胶裂解酶、黄原胶酶、过氧化物酶、卤代加过氧酶、过氧化氢酶以及甘露聚糖酶、或其任何混合物。
25.如段落21-24中任一项所述的组合物，其中所述组合物进一步包含内切葡聚糖酶，例如，黄原胶内切葡聚糖酶。
26.如段落21-25中任一项所述的组合物，其中所述组合物处于以下形式：条、均匀的片剂、具有两个或更多个层的片剂、具有一个或多个室的袋、规则的或压缩的粉末、颗粒、膏、凝胶、或规则的、压缩的或浓缩的液体。
27.如段落1-20中任一项所述的内切葡聚糖酶变体或如段落21-26中任一项所述的组合物的用途，其中所述用途选自下组，该组包括以下或由以下组成：
i)用于降解黄原胶的用途，以及
ii)用于控制钻井液的黏度的用途。
28.如段落27所述的用途，其中所述内切葡聚糖酶变体具有酶洗涤益处。
29.一种分离的多核苷酸，该多核苷酸编码如段落1-28中任一项所述的内切葡聚糖酶变体。
30.一种核酸构建体或表达载体，该核酸构建体或表达载体能够表达如段落29所述的多核苷酸；优选地，所述核酸构建体或所述表达载体包含如段落29所述的多核苷酸，该多核苷酸可操作地连接至指导该多肽在表达宿主内产生的一个或多个控制序列。
31.一种宿主细胞(例如，分离的宿主细胞、分离的重组宿主细胞)，该宿主细胞包含如段落29所述的多核苷酸；优选地，所述多核苷酸可操作地连接至指导该多肽的产生的一个或多个控制序列；进一步优选地，所述宿主细胞是分离的宿主细胞。
32.一种用于获得或产生内切葡聚糖酶变体的方法，该方法包括向亲本内切葡聚糖酶中(例如，具有SEQ ID NO:2或其他亲本内切葡聚糖酶)引入在以下区域中的一个或多个位置处的改变(例如，取代、缺失或插入)：
a)选自下组的区域，该组由以下组成：
i)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸1至94的区域10，例如，在选自下组的一个或多个位置处的所述改变，该组由以下组成：位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94，其中所述位置对应于SEQ ID NO:2的氨基酸位置(例如，使用SEQ ID NO:2的编号)，
ii)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸106至114的区域11，例如，在选自下组的一个或多个位置处的所述改变，该组由以下组成：位置107、108、109、110、111、112、113、114，其中所述位置对应于SEQ ID NO:2的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO:2的编号)，
iii)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸139至209的区域12，例如，在选自下组的一个或多个位置处的所述改变，该组由以下组成：位置139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209，其中所述位置对应于SEQ ID NO:2的氨基酸位置(例如，使用SEQ IDNO:2的编号)，
iv)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸252至266的区域13，例如，在选自下组的一个或多个位置处的所述改变，该组由以下组成：位置252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266，其中所述位置对应于SEQ ID NO:2的氨基酸位置(例如使用SEQID NO:2的编号)，
v)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸302至338的区域14，例如，在选自下组的一个或多个位置处的所述改变，该组由以下组成：位置302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338，其中所述位置对应于SEQ ID NO:2的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO:2的编号)，
vi)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸362至546的区域15，例如，在选自下组的一个或多个位置处的所述改变，该组由以下组成：位置362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500、501、502、503、504、505、506、507、508、509、510、511、512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、535、536、537、538、539、540、541、542、543、544、545、546，其中所述位置对应于SEQ ID NO:2的氨基酸位置(例如使用SEQ IDNO:2的编号)，
vii)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸596至611的区域16，例如，在选自下组的一个或多个位置处的所述改变，该组由以下组成：位置596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611，其中所述位置对应于SEQ ID NO:2的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO:2的编号)，
viii)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸661至805的区域17，例如，在选自下组的一个或多个位置处的所述改变，该组由以下组成：位置661、662、663、664、665、666、667、668、669、670、671、672、673、674、675、676、677、678、679、680、681、682、683、684、685、686、687、688、689、690、691、692、693、694、695、696、697、698、699、700、701、702、703、704、705、706、707、708、709、710、711、712、713、714、715、716、717、718、719、720、721、722、723、724、725、726、727、728、729、730、731、732、733、734、735、736、737、738、739、740、741、742、743、744、745、746、747、748、749、750、751、752、753、754、755、756、757、758、759、760、761、762、763、764、765、766、767、768、769、770、771、772、773、774、775、776、777、778、779、780、781、782、783、784、785、786、787、788、789、790、791、792、793、794、795、796、797、798、799、800、801、802、803、804、805，其中所述位置对应于SEQ ID NO:2的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO:2的编号)，
ix)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸829至838至1042的区域18，例如，在选自下组的一个或多个位置处的所述改变，该组由以下组成：位置829、830、831、832、833、834、835、836、837、838，其中所述位置对应于SEQ ID NO:2的氨基酸位置(例如，使用SEQ ID NO:2的编号)，
x)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸1043至1055的区19，例如，在选自下组的一个或多个位置处的所述改变，该组由以下组成：位置1043、1044、1045、1046、1047、1048、1049、1050、1051、1052、1053、1054、1055，其中所述位置对应于SEQ ID NO:2的氨基酸位置(例如，使用SEQ ID NO:2的编号)。
其中所述变体与SEQ ID NO:2具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％、且小于100％的序列同一性；以及
b)回收所述变体。优选地，(例如，SEQ ID NO:2的或另一种亲本内切葡聚糖酶的)所述选自由区域10-19组成的组的区域是螯合剂诱导的不稳定区域；进一步优选地，所述方法进一步包括向亲本内切葡聚糖酶(例如，具有SEQ ID NO:2或其他亲本内切葡聚糖酶)中引入在选自由区域10-19组成的组的一个或多个区域中的一个或多个位置处的改变(例如，取代、缺失或插入)。
33.如段落32所述的方法，其中所述内切葡聚糖酶变体与SEQ ID NO:2具有至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列同一性。
34.如段落32-33中任一项所述的方法，其中在一个或多个位置处的所述改变(例如，取代、缺失或插入)选自下组，该组由在以下位置处的改变组成：17、20、51、53、55、56、60、63、79、87、186、192、302、311、313、387、388、390、403、408、410、416、448、451、471、472、476、489、507、512、515、538、598、599、602、603、605、609、676、688、690、694、697、698、699、711、719、754、756、760、781、786、797、833、834、和835、和1048，其中根据SEQ ID NO:2进行编号。
35.如段落32-34中任一项所述的方法，其中在一个或多个位置处的所述改变选自下组，该组由以下组成：S17A、F20P、F20N、F20G、F20Y、K51Q、K51H、E53P、E53G、Y55M、V56M、Y60F、S63F、T87R、A186P、K192N、I302D、I302H、I302V、I302M、H311N、S313D、I387T、K388R、K390Q、I403Y、E408D、E408S、E408P、E408A、E408G、E408N、P410G、Q416S、Q416D、A448E、A448W、A448S、K451S、G471S、S472Y、D476R、Q489P、K507R、K512P、S515V、S538C、579W、S598Q、A599S、I602T、I602D、V603P、S605T、G609E、D676H、A688G、Y690F、T694A、T697G、R698W、T699A、T711V、T711Y、W719R、K754R、V756H、V756Y、S760G、T781M、N786K、T797S、A824D、N833D、Q834E、S835D、和F1048W，其中根据SEQ ID NO:2进行编号。
36.根据权利要求32-35中任一项所述的方法，其中该变体进一步包含选自下组的在一个或多个位置处的改变，该组由在以下位置处的改变组成：216、283、346、559、564、579、636、638、651,824、848、869、880、881、883、887、892、905、906、912、921、928、934、937、948、956、999、和1037。
37.根据权利要求32至36中任一项所述的方法，进一步其中在一个或多个位置处的所述改变选自下组，该组由以下组成：N216D、N216Q、A283D、A346D、A559P、A559N、A564E、Y579W、S636K、S636N、F638N、A651P、A824D、N848D、A869V、R880K、V881T、V881Q、T883R、T887K、T892P、N905D、F906A、A912V、K921R、S928D、Y934G、A937E、K948R、Q956Y、T999R、和A1037E。
38.根据权利要求32-37中任一项所述的方法，其中该变体包含一个或多个以下的取代组：
F20Y+A448S+T781M
E408D+K451S
E408D+A448E
E408D
Y579W+E408D
39.根据权利要求32-38中任一项所述的方法，其中该变体包含一个或多个以下的取代组：
Figure BDA0002387863890001981
Figure BDA0002387863890001991
40.如段落32-39中任一项所述的方法，其中在一个或多个位置处的所述改变(例如，取代、缺失或插入)提供了具有≥1.0的半衰期改善因子(HIF)的变体；优选地，所述变体具有>1.0的半衰期改善因子(HIF)。
41.一种产生内切葡聚糖酶变体的方法，该方法包括：
i)在适合表达所述变体的条件下培养如段落31所述的宿主细胞；和
ii)回收所述变体。
42.如段落41所述的方法，其中所述内切葡聚糖酶变体是根据段落1-20中任一项所述的变体。
43.一种用于降解黄原胶的方法，该方法包括：将如段落41-42中任一项所述的组合物施用于黄原胶。
44.如段落43所述的方法，其中所述黄原胶在表面或硬表面上。
45.如段落43所述的方法，其中所述黄原胶在由钻井孔穿透的地下地层的压裂中使用。
46.如段落43所述的方法，其中所述黄原胶是钻孔滤饼中的组分。
通过以下实例进一步描述本发明，这些实例不应理解为对本发明的范围进行限制。
实例
实例1：通过对具有SEQ ID NO:2的成熟亲本内切葡聚糖酶的定点诱变构建GH9内切葡聚糖酶变体
线性整合载体-系统克隆用于具有SEQ ID NO:1的成熟亲本核苷酸序列的克隆(同样也披露为WO 2013167581 A1的SEQ ID NO:1中的成熟肽)，其编码SEQ ID NO:2的GH9内切葡聚糖酶的成熟亲本多肽及其变体。线性整合构建体是PCR融合物，该融合物由两个枯草芽孢杆菌同源染色体区域之间的基因连同强启动子与氯霉素抗性标志的融合制备。该融合物通过重叠延伸(SOE)PCR进行剪接来制备(Horton,R.M,Hunt,H.D.,Ho,S.N.,Pullen,J.K.和Pease,L.R.(1989))。通过重叠延伸产生不使用限制性酶或基因剪接的工程杂合基因(Gene[基因]77:61-68)。专利申请WO 2003/095658中也描述了SOE PCR方法。在三联启动子系统(如WO 99/43835中所述)的控制下表达该基因，该启动子系统由包含稳定化序列的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因启动子(amyL)、解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因启动子(amyQ)和苏云金芽孢杆菌cryIIIA启动子组成。编码氯霉素乙酰基转移酶的基因被用作标记物(描述于例如Diderichsen,B.；Poulsen,G.B.；Joergensen,S.T.；A useful cloning vector forBacillus subtilis.[枯草芽孢杆菌的一种有用的克隆载体]Plasmid[质粒]30:312,1993)。在芽孢杆菌染色体上通过同源重组将最终的基因构建体整合到果胶裂解酶位点中。用包含至两个侧翼载体片段的突出端的基因特异性引物从对应的菌株的染色体DNA扩增基因片段。用地衣芽孢杆菌α-淀粉酶分泌信号(具有SEQ ID NO:3的核苷酸序列和SEQ ID NO:4的氨基酸序列)替代天然的分泌信号来表达所有基因。
通过大引物诱变方法，使用在所得序列中引入所希望的突变的特异性设计的诱变寡核苷酸，制备如下文实例3和4中所述的具有SEQ ID NO:2的来自类芽孢杆菌属物种-62047的成熟亲本GH9内切核酸酶的变体。将所希望的突变引入靶序列的此类诱变寡核苷酸的设计和生产方法是本领域技术人员熟知的。因此，对应于希望的一个或多个突变位点侧翼的DNA序列设计并合成诱变的寡核苷酸，其由限定取代的DNA碱基对分离。最终表达盒组成如上所述的来自类芽孢杆菌属物种-62047的参考GH9内切核糖核酸酶(即，具有SEQ IDNO:1的亲本GH9内切核糖核酸酶)。通过GH9内切葡聚糖酶基因的DNA测序证实了所希望的取代的成功引入。将等分部分的该PCR产物随后转化到枯草芽孢杆菌中。在每ml补充有10mMK2PO4，0.4％额外的葡萄糖和6μg氯霉素的LB琼脂板上选择转化体。使包含该整合表达构建体的所得重组枯草芽孢杆菌克隆在如下所述的液体培养基中进行生长。收获包含上清液的酶，并使用还原糖测定对酶(变体)进行胁迫测试或如下所述进行纯化。
通过使用标准方案(包含标准痕量金属混合物的TB-甘油培养基，如描述于F.William Studier,“Protein production by auto-induction in high-densityshaking cultures[在高密度振荡培养中通过自动诱导产生蛋白质]”，ProteinExpression and Purification[蛋白质表达和纯化],41(2005)207-234)的发酵产生上述变体并在收获前在30℃下生长4天。将用于胁迫测试的样品的上清液从在37℃生长的过夜培养物中接种，并随后以96孔板格式(上述TB-甘油培养基在痕量金属混合物中没有钙，在30℃下持续4天)发酵。
实例2：GH9内切葡聚糖酶变体的纯化
使用Sorval RC-6plus离心机(赛默飞世尔科技公司(ThermoFisherScientific))将培养液以13’000rpm(45min，18℃，F12S-6x 500转子)离心。向上清液中补充(NH4)2SO4至终浓度为0.8M。使用0.2μm瓶顶快速流动过滤器(Nalgene)过滤混合物。将混合物装载到用20mM Tris-HCl(具有0.8M(NH4)2SO4的pH 8.0)预平衡的50mL苯基-琼脂糖高性能柱(GE医疗集团(GE Healthcare)，乌普萨拉，瑞典)上。流速设定为3mL/min。加载蛋白质后，将流速增加至5mL/min，并用若干个柱体积的平衡缓冲液洗去未结合或松散结合的蛋白质。通过逐步增加洗脱缓冲液(20mM Tris-HCl，pH 8.0)进行洗脱。在(75％-100％)洗脱步骤期间洗脱靶蛋白。在纯化过程中收集8mL的级分。使用SDS-PAGE(NuPAGE，英杰公司)评估级分。合并用20mM Tris-HCl，pH 8.0洗脱的级分，并在用20mM Tris-HCl，pH 8.5预平衡的350mL G25脱盐柱上进行脱盐。将脱盐的蛋白质溶液施加在用20mM Tris-HCl，pH 8.5以2mL/min预平衡的20mL Source15Q柱上。使用至少两个柱体积的平衡缓冲液洗涤未结合或松散结合的蛋白质，直至获得稳定的UV基线。将流速升至4mL/min，并使用洗脱缓冲液(20mMTris-HCl，pH 8.5+750mM NaCl)通过线性NaCl梯度进行洗脱。在纯化过程中收集3mL级分。SDS-PAGE用于评估级分。合并纯的级分并且如果必要的话使用Vivaspin 20(10kDa截留，Sartorius公司)浓缩。使用280nm处的吸光度测量确定蛋白质浓度。
实例3：GH9内切葡聚糖酶变体的还原糖测定
可以使用由Lever(1972),Anal.Biochem.[分析化学]47:273-279，1972研发的比色测定，通过用黄原胶裂解酶预处理的黄原胶上的还原末端确定GH9内切葡聚糖酶(EG)活性(EC 3.2.1.4)。预处理的黄原胶是黄原胶糖的修饰形式，其中去除来自侧链的末端丙酮酸甘露糖(根据Nankai等人(1999)制备自科通(Keltran)来源)。GH9成熟亲本内切葡聚糖酶及其变体在预处理的黄原胶的葡聚糖骨架中的β(1,4)-葡糖基键处裂解，该黄原胶释放出具有还原末端的葡聚糖，并通过与对羟基苯甲酸酰肼(PAHBAH)反应来确定。在以下条件中：用于测定(例如表1)并用于估计残余活性(RA)、半衰期(T1/2)和半衰期改善因子(HIF)，颜色的增加与酶活性成正比。
表1.测定的描述
Figure BDA0002387863890002021
方法步骤：
使用磁力搅拌，将30μL酶样品(上清液或纯化的，10ppm-150ppm)与270μL洗涤剂在微量滴定板中混合15分钟。该板被称为“胁迫MTP”。将20μL混合物转移至新的MTP并使用两步稀释法(2x 10倍稀释)稀释100倍。将样品稀释到测定缓冲液(AB)中：50mM MOPS、4mMCaCl2、0.01％Triton X-100、pH 7.0。该稀释的MTP是参考MTP并且在5℃下储存过夜(以等于下面的胁迫MTP的时间间隔)。将胁迫MTP在25℃下孵育过夜(17h-20h)。在过夜孵育后，首先通过磁力搅拌将胁迫板混合15分钟，然后如对参考板所述将胁迫板稀释100倍。为了评估酶活性，将50μL稀释的酶:洗涤剂样品(来自参考和胁迫MTP)与50μL 4mg/mL经修饰的黄原胶在PCR板中混合。然后在50℃下孵育这些样品1h。最后，通过向PCR板中的所有样品添加75μL PAHBAH溶液(15mg/mL PAHBAH、50g/L酒石酸钠钾四水合物、20g/L NaOH)来估计还原末端的水平。然后在95℃下孵育这些样品10min。冷却至室温后，测量405nm处的吸光度。残余活性(RA)可使用以下公式计算：
RA(％)＝(Abs(胁迫))/(Abs(参考))×100％
Abs(胁迫)：在胁迫MTP(在25℃下孵育过夜)中的样品在405nm处的吸光度减去在相同MTP中存在的空白缓冲液样品中估计的背景吸光度。
Abs(参考)：在参考MTP(在5℃下孵育过夜)中的样品在405nm处的吸光度减去在相同MTP中存在的空白缓冲液样品中估计的背景吸光度。
另外，估计了每种变体和亲本内切葡聚糖酶在25℃降解的半衰期，计算了野生型对照和变体的半衰期(T1/2(以小时))，因为降解遵循指数衰减并且孵育时间(以小时)是已知的，即，根据以下式：
T1/2(变体)＝(Ln(0.5)/Ln(RA-变体/100))*时间
T1/2(野生型)＝(Ln(0.5)/Ln(RA-野生型/100))*时间半衰期改善因子(HIF)被计算为T1/2(变体)/T1/2(野生型)。
测试变体的HIF结果显示在下表2-5中。表3-5中的HIF以与表2中相同的方式计算，除了变体和对照的孵育温度略微升高(26-30摄氏度)。
表2.在25℃下孵育的具有相应半衰期改善因子(HIF)的成熟亲本GH9内切葡聚糖酶(SEQ ID NO:2)的纯化的变体
Figure BDA0002387863890002031
Figure BDA0002387863890002041
表3.在26℃下孵育的具有相应半衰期改善因子(HIF)的成熟亲本GH9内切葡聚糖酶(SEQ ID NO:2)的纯化的变体
Figure BDA0002387863890002042
表4.在28℃下孵育的具有相应半衰期改善因子(HIF)的成熟亲本GH9内切葡聚糖酶(SEQ ID NO:2)的纯化的变体
Figure BDA0002387863890002043
表5.在30℃下孵育的具有相应半衰期改善因子(HIF)的成熟亲本GH9内切葡聚糖酶(SEQ ID NO:2)的纯化的变体
Figure BDA0002387863890002044
实例4：计算黄原胶内切葡聚糖酶变体的半衰期和半衰期改善因子(HIF)
在给定的洗涤剂浓度和储存温度(宝莹通用凝胶公司(Persil Universal Gel)(PUG)95％，30℃，4周或更长时间)(针对野生型对照和/或变体)下计算半衰期(T1/2(以小时计))，因为残余活性遵循指数衰减并且孵育时间(小时)是已知的，即根据下式：
T1/2(变体)＝(Ln(0.5)/Ln(RA-变体/100))*时间
T1/2(野生型)＝(Ln(0.5)/Ln(RA-野生型/100))*时间
将半衰期改善因子(HIF)计算为HIF＝T1/2(变体)/T1/2(野生型)，其中野生型在与变体相同的储存条件下孵育。
在野生型和变体之间的稳定性差异太大而不能使用相同的孵育时间精确评估野生型和变体的半衰期的情况下，野生型和变体的孵育时间是不同的，例如，野生型为1h，最稳定的变体为672h，通过以下公式计算变体的半衰期改善因子：HIF＝T1/2(变体)/T1/2(野生型)，其中WT的T1/2是1.5小时。
表6
Figure BDA0002387863890002051
Figure BDA0002387863890002061
序列表
<110> 诺维信公司
<120> GH9内切葡聚糖酶变体以及编码它们的多核苷酸
<130> 14516-WO-PCT
<160> 4
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 12110
<212> DNA
<213> 类芽孢杆菌属物种-62047
<400> 1
tctggttgtt ttcttcattt caggtttcgc cctttccttg ccaaatataa gaaaaacggc 60
gttccgataa tcgcggtgac ggtgattcat aaggaaatgc aatccatctg gccagaacat 120
ctgcgtacac cagcaaaatg gcaccgaaca gtgccgaaaa cggaagcacg tattgataat 180
gttctccgat cagcttgcgg acaatatgcg ggacgagcag cccgacaaag ccaatcggcc 240
cggcgacggc tacggaagcg ccggaaagaa ttaaaataat caaactgatc agaatcctga 300
tgccgttcat attttgtcca agcccttttg ctgtttcgtc tccgagaccg agaacagaaa 360
cagaaccgga aaatacgagg gcaagcccga tgccaatgac agaaaaagga gcgatggtta 420
tgacgtcctg ccagttgctg ccgtcgattg cgcctgtcat ccagtacaga acatcctcac 480
ctgactcatt taaaataatg atggcctgtg tcatagagga gaggaacaag tgcacggcca 540
ttcctgacag cgccagcttg acaggcgtca ttccgccgga tgaggcaatc atatacacaa 600
tcgcgccgcc tgctgccgca cccgcaaaag cgaatataac agatgaatag ggcgatgccg 660
gcagaatgac gagagaagca acaacaaaaa gcgatgcacc cgcattcaca ccgaaaattt 720
ggggtgaagc cagaggattt ctggtcatag cctgcatcag cgcccctgct acagctaggc 780
tggcgccgac aaaaacgccg attaatgtgc ggggaaggcg aagagtagag atgatgagct 840
gttcctttga accgtcccat acaaaaagat atttcaatga atctatgatg ctgatgtctg 900
aggctcctac tgaaagattc agcccaagcc caaatataaa aataatcagt gcaatgataa 960
acatcatcag tcttgatgat gagcgccgtt tggctgaatg atacaacagt ctcacttcct 1020
tactgcgtct ggttgcaaaa acgaagaagc aaggattccc ctcgcttctc atttgtccta 1080
tttattatac acttttttaa gcacatcttt ggcgcttgtt tcactagact tgatgcctct 1140
gaatcttgtc caagtgtcac ggtccgcatc atagacttgt ccatttttca ccgctttgag 1200
atttttccag agcgggttcg ttttccactc atctacaatg gttttgcctt cgttggctga 1260
gatgaacaaa atatcaggat cgattttgct caattgctca aggctgacct cttgataggc 1320
gttatctgac ttcacagcgt gtgtaaagcc tagcatttta aagatttctc cgtcatagga 1380
tgatgatgta tgaagctgga aggaatccgc tcttgcaacg ccgagaacga tgttgcggtt 1440
ttcatctttc ggaagttcgg cttttagatc gttgatgact tttttgtgct cggcaagctt 1500
ttcttttcct tcatcttctt tatttaatgc tttagcaatg gtcgtaaagc tgtcgatcgt 1560
ttcgtcatat gtcgcttcac ggctttttaa ttcaatcgtc ggggcgattt ttttcagctg 1620
tttataaatg tttttatggc gctcagcgtc agcgatgatt aaatcaggct tcaaggaact 1680
gatgacctca agattgggtt cgctgcgtgt gcctacagat gtgtaatcaa tggagctgcc 1740
gacaagcttt ttaatcatat cttttttgtt gtcatctgcg atgcccaccg gcgtaatgcc 1800
gagattgtga acggcatcca agaatgaaag ctcaagcaca accacccgct taggtgtgcc 1860
gcttactgtc gtttttcctt cttcgtcatg gatcactctg gaatccttag actcgctttt 1920
gccgcttccg ttgttattct ggcttgatga acagccggat acaatgaggc aggcgagcaa 1980
taaaacactc atgatggcaa tcaacttgtt agaataggtg cgcatgtcat tcttcctttt 2040
ttcagattta gtaatgagaa tcattatcac atgtaacact ataatagcat ggcttatcat 2100
gtcaatattt ttttagtaaa gaaagctgcg tttttactgc tttctcatga aagcatcatc 2160
agacacaaat aagtggtatg cagcgttacc gtgtcttcga gacaaaaacg catgggcgtt 2220
ggctttagag gtttcgaaca tatcagcagt gacataagga aggagagtgc tgagataacc 2280
ggacaatttc ttttctattt catctgttag tgcaaattca atgtcgccga tattcatgat 2340
aatcgagaaa acaaagtcga tatcgatatg aaaatgttcc tcggcaaaaa ccgcaagctc 2400
gtgaattcct ggtgaacatc cggcacgctt atggaaaatc tgtttgacta aatcactcac 2460
aatccaagca ttgtattgct gttctggtga aaagtattgc attagacata cctcctgctc 2520
gtacggataa aggcagcgtt tcatggtcgt gtgctccgtg cagcggcttc tccttaattt 2580
tgatttttct gaaaataggt cccgttccta tcactttacc atggacggaa aacaaatagc 2640
tactaccatt cctcctgttt ttctcttcaa tgttctggaa tctgtttcag gtacagacga 2700
tcgggtatga aagaaatata gaaaacatga aggaggaata tcgacatgaa accagttgta 2760
aaagagtata caaatgacga acagctcatg aaagatgtag aggaattgca gaaaatgggt 2820
gttgcgaaag aggatgtata cgtcttagct cacgacgatg acagaacgga acgcctggct 2880
gacaacacga acgccaacac gatcggagcc aaagaaacag gtttcaagca cgcggtggga 2940
aatatcttca ataaaaaagg agacgagctc cgcaataaaa ttcacgaaat cggtttttct 3000
gaagatgaag ccgctcaatt tgaaaaacgc ttagatgaag gaaaagtgct tctctttgtg 3060
acagataacg aaaaagtgaa agcttgggca taaagcaagg aaaaaaccaa aaggccaatg 3120
tcggcctttt ggtttttttg cggtctttgc ggtgggattt tgcagaatgc cgcaatagga 3180
tagcggaaca ttttcggttc tgaatgtccc tcaatttgct attatatttt tgtgataaat 3240
tggaataaaa tctcacaaaa tagaaaatgg gggtacatag tggatgaaaa aagtgatgtt 3300
agctacggct ttgtttttag gattgactcc agctggcgcg aacgcagctg atttaggcca 3360
ccagacgttg ggatccaatg atggctgggg cgcgtactcg accggcacga caggcggatc 3420
aaaagcatcc tcctcaaatg tgtataccgt cagcaacaga aaccagcttg tctcggcatt 3480
agggaaggaa acgaacacaa cgccaaaaat catttatatc aagggaacga ttgacatgaa 3540
cgtggatgac aatctgaagc cgcttggcct aaatgactat aaagatccgg agtatgattt 3600
ggacaaatat ttgaaagcct atgatcctag cacatggggc aaaaaagagc cgtcgggaac 3660
acaagaagaa gcgagagcac gctctcagaa aaaccaaaaa gcacgggtca tggtggatat 3720
ccctgcaaac acgacgatcg tcggttcagg gactaacgct aaagtcgtgg gaggaaactt 3780
ccaaatcaag agtgataacg tcattattcg caacattgaa ttccaggatg cctatgacta 3840
ttttccgcaa tggttgtaaa acgacggcca gtgaattctg atcaaatggt tcagtgagag 3900
cgaagcgaac acttgatttt ttaattttct atcttttata ggtcattaga gtatacttat 3960
ttgtcctata aactatttag cagcataata gatttattga ataggtcatt taagttgagc 4020
atattagagg aggaaaatct tggagaaata tttgaagaac ccgaggatct agatcaggta 4080
ccgcaacgtt cgcagatgct gctgaagaga ttattaaaaa gctgaaagca aaaggctatc 4140
aattggtaac tgtatctcag cttgaagaag tgaagaagca gagaggctat tgaataaatg 4200
agtagaaagc gccatatcgg cgcttttctt ttggaagaaa atatagggaa aatggtactt 4260
gttaaaaatt cggaatattt atacaatatc atatgtatca cattgaaagg aggggcctgc 4320
tgtccagact gtccgctgtg taaaaaaaag gaataaaggg gggttgacat tattttactg 4380
atatgtataa tataatttgt ataagaaaat ggaggggccc tcgaaacgta agatgaaacc 4440
ttagataaaa gtgctttttt tgttgcaatt gaagaattat taatgttaag cttaattaaa 4500
gataatatct ttgaattgta acgcccctca aaagtaagaa ctacaaaaaa agaatacgtt 4560
atatagaaat atgtttgaac cttcttcaga ttacaaatat attcggacgg actctacctc 4620
aaatgcttat ctaactatag aatgacatac aagcacaacc ttgaaaattt gaaaatataa 4680
ctaccaatga acttgttcat gtgaattatc gctgtattta attttctcaa ttcaatatat 4740
aatatgccaa tacattgtta caagtagaaa ttaagacacc cttgatagcc ttactatacc 4800
taacatgatg tagtattaaa tgaatatgta aatatattta tgataagaag cgacttattt 4860
ataatcatta catatttttc tattggaatg attaagattc caatagaata gtgtataaat 4920
tatttatctt gaaaggaggg atgcctaaaa acgaagaaca ttaaaaacat atatttgcac 4980
cgtctaatgg atttatgaaa aatcatttta tcagtttgaa aattatgtat tatggagctc 5040
tataaaaatg aggagggaac cgaatgaaac aacaaaaacg gctttacgcc cgattgctga 5100
cgctgttatt tgcgctcatc ttcttgctgc ctcattctgc agcagcagcg atcgcaggcg 5160
tggttcaaag cgtgaatgtc tcccaagctg gttatagttc aaacgatttt aagacggcta 5220
cggtgactgc gtcggataaa ctaagcgata ctagctacca gatattgcaa ggcactaccg 5280
ttatcgcaac cggtacgatg aaggatgaag gatatgtatg gggcaaatat gtgtactcga 5340
tcgatttctc ctccgttaca gctacgggca ccaactttac gatccgtagc aacggagttt 5400
catcttacac gttccctatc caaaccaata tgtggaatga atataaggat gaaatgaccg 5460
cgttctaccg tttgctccgg actacggata cctttgcggc ctatcctgca gggtacagca 5520
atattgcgcc ttcgaataaa atattacatc cggattcttt ccttgatgat gctttttcgc 5580
cggaccgaac gacgcattat gacctgactg gcggttggtt cgatgcagga gactacggta 5640
agtatggcgg caatcagtgg gtacagggaa atatcgccat ctcttatctg cggcatgcct 5700
cttcggcggc ggtcaatttc gataaggata ccaacggcat tccggatctg gtggatgaag 5760
cgatctttgg tagtcagtac ttggtgaagt ttgccaatca gcttggcggg gccattcata 5820
atattttgag gaaaggcggc tttgtgcttc cgcataaagt gacagacaat gttccgggta 5880
acacagacga ccgagcgctc gaagctgtcg aagcggtggg aggctccggg aaatcctctg 5940
gctcgctggc ggcaacggcg cgagcgattc gcactgccat cgcgggcggt aaagtggcag 6000
cgaataaagt cgcccagctg cagacacttg cgaatgagtt tcaggctgcc gcaatcatct 6060
tctataatta cacattgact catcaaagtg gaaaccatgg ctcctatgga acaatgaaca 6120
atggagggat tgcaaatcct ctcttatggg cggaagtaca gttgtatctg ttaacagggg 6180
acgctgcata caagacgcaa gctcagacac gcattaatgc aataaatgaa gcctatgttt 6240
cgtccacgaa ttattgggat atgcatccga ttgcgctggc cgaattttat tcctgaagca 6300
ccaagcatat tatttcatca cgctgatgga tgaaacgcca tacggtgtat tgaaccaatt 6360
cggcaatttt ggtgtgaatg agccgcatgc atcgtatatg gccgatttgc tccgatatta 6420
tgaattgttt aacgatccgg tagcgcttcg agcggcgaag aaggcgctgt actggattgt 6480
cggcaacaat ccatggaata tcagctgggt atccggtgtc ggctccaact tcaccgattt 6540
cctgcacact cgtctggatg aagaagcata cagccagacg aatacaggcg ttgttctgcc 6600
tggagccatg gttagcggac cgaatatcaa agatccgaat aacaaattga gctctagccc 6660
ttggtatgag gataaaccta tttgggcaga tgacaccaat caatggagat acaacgaata 6720
tagtgtcagt atacagacgg gattattcta caccatcatg ggcttgtcgg cccttggcgg 6780
aaatgcatcc actggtggcg cggagcccgt taagctgccg atcacttggc ctatcattgg 6840
ggattatgtg actggggatg tgacggtatt cgcacagccg gaaggcagct tgagcaatgt 6900
gtcagcgaac ggaatcgtct tgagcccctc cgacggtgtc tatacgacga cagtaagcac 6960
aagcgctgat gcaccatata ccgaaagaaa agtacagatc aaagggacgg acgacagcgg 7020
attcaccact tatagcaata cacatttcac ggtggcgcct gcacttccgg atccatctca 7080
tcctttactt ttcgatgact ttaaccagaa aggaatctgg ggtagccaaa agctggattg 7140
ggtgaattgg tataaccaaa acggaggtac agcatcctac acgcggacga cagtggatac 7200
aagaacagtt gggaaatttg cacatacccc tgcagccact acatccaaag ccaaattcca 7260
gccgtggaaa tacaacgcaa atcttaacgg atatcgctat cttaatttca ccatgaagaa 7320
tccgggttat cccaatacca aaattcggat agcagcgaat gacggcacca aatcagttaa 7380
ccttacgagc ggcgaggttg cgatctcgag cacgtggaca acgtatcaat atgatttgaa 7440
tctgcatccg acgctgaaca agagcaacgt tctgattgag gtatggctca gcaacccaac 7500
tgcgggggca tatggggaaa ttctcattga cgaaatctcg gctgtgaata cgaacagcgg 7560
aacggcgcca accttatccg ccacaggtgt gaacgcctcg atcggtaatc agtcgacggt 7620
atttacttat acagcgacct acaccgatgc taataatcaa gcgccgtttg atgtccaggt 7680
cgtcattgac ggcgtcatcc gttcgatgac ggcggcggat cctactgaca ctacttattc 7740
cgatgggaga gtgtatacgt acgctactac cttgccggtg gggacgcata agttttactt 7800
ccggacgaca gatacaacca cgaacttcgt cagcacttcc gtgcaaaccg gaccaaccgt 7860
cattcggaat atacacatgc tgtaaaagac aatgcggatg cgagcggagg gaagtatcgc 7920
ttgttcaatg gtcggcaggc caacgattat attgaatatg cggtgaatgt ccctaaggct 7980
ggaacatatc aagtatctgc cagagccatg agattaagcg acaatgggat ctaccagctg 8040
cagattaacg gcagcaatca aggtactccg ttcgatactt accagtcatc ggggaagtat 8100
cttgactatg ctcttggaaa tgtgaccata actagcccgg gaacgcagtt atttcgattc 8160
aaagtaacgg gcaaaaatgc aagctcactc ggatataagc tgccgcttga tttcattcag 8220
cttgttccag ttccgtaaac gcgttaatca ataaaaaaac gctgtgcggt taaagggcac 8280
agcgtttttt tgtgtatcgg caatagttac ccttattatc aagataagaa agaaaaggat 8340
ttttcgctac gctcaaatcc tttaaaaaaa cacaaaagac cacatttttt aatgtggtct 8400
ttattcttca actaaagcac ccattagttc aacaaacgaa aattggataa agtgggatat 8460
ttttaaaata tatatttatg ttacagtaat attgactttt aaaaaaggat tgattctaat 8520
gaagaaagca gacaagtaag cctcctaaat tcactttaga taaaaattta ggaggcatat 8580
caaatgaact ttaataaaat tgatttagac aattggaaga gaaaagagat atttaatcat 8640
tatttgaacc aacaaacgac ttttagtata accacagaaa ttgatattag tgttttatac 8700
cgaaacataa aacaagaagg atataaattt taccctgcat ttattttctt agtgacaagg 8760
gtgataaact caaatacagc ttttagaact ggttacaata gcgacggaga gttaggttat 8820
tgggataagt tagagccact ttatacaatt tttgatggtg tatctaaaac attctctggt 8880
atttggactc ctgtaaagaa tgacttcaaa gagttttatg atttatacct ttctgatgta 8940
gagaaatata atggttcggg gaaattgttt cccaaaacac ctatacctga aaatgctttt 9000
tctctttcta ttattccatg gacttcattt actgggttta acttaaatat caataataat 9060
agtaattacc ttctacccat tattacagca ggaaaattca ttaataaagg taattcaata 9120
tatttaccgc tatctttaca ggtacatcat tctgtttgtg atggttatca tgcaggattg 9180
tttatgaact ctattcagga attgtcagat aggcctaatg actggctttt ataatatgag 9240
ataatgccga ctgtactttt tacagtcggt tttctaacga tacattaata ggtacgaaaa 9300
agcaactttt tttgcgctta aaaccagtca taccaataac ttaagggtaa ctagcctcgc 9360
cggaaagagc gaaaatgcct cacatttgtg ccacctaaaa aggagcgatt tacatatgag 9420
ttatgcagtt tgtagaatgc aaaaagtgaa atcagctgga ctaaaagggg ccgcagagta 9480
gaatggaaaa ggggatcgga aaacaagtat ataggaggag acctatttat ggcttcagaa 9540
aaagacgcag gaaaacagtc agcagtaaag cttgttccat tgcttattac tgtcgctgtg 9600
ggactaatca tctggtttat tcccgctccg tccggacttg aacctaaagc ttggcatttg 9660
tttgcgattt ttgtcgcaac aattatcggc tttatctcca agcccttgcc aatgggtgca 9720
attgcaattt ttgcattggc ggttactgca ctaactggaa cactatcaat tgaggataca 9780
ttaagcggat tcgggaataa gaccatttgg cttatcgtta tcgcattctt tatttcccgg 9840
ggatttatca aaaccggtct cggtgcgaga atttcgtatg tattcgttca gaaattcgga 9900
aaaaaaaccc ttggactttc ttattcactg ctattcagtg atttaatact ttcacctgct 9960
attccaagta atacggcgcg tgcaggaggc attatatttc ctattatcag atcattatcc 10020
gaaacattcg gatcaagccc ggcaaatgga acagagagaa aaatcggtgc attcttatta 10080
aaaaccggtt ttcaggggaa tctgatcaca tctgctatgt tcctgacagc gatggcggcg 10140
aacccgctga ttgccaagct ggcccatgat gtcgcagggg tggacttaac atggacaagc 10200
tgggcaattg ccgcgattgt accgggactt gtaagcttaa tcatcacgcc gcttgtgatt 10260
tacaaactgt atccgccgga aatcaaagaa acaccggatg cggcgaaaat cgcaacagaa 10320
aaactgaaag aaatgggacc gttcaaaaaa tcggagcttt ccatggttat cgtgtttctt 10380
ttggtgcttg tgctgtggat ttttggcggc agcttcaaca tcgacgctac cacaaccgca 10440
ttgatcggtt tggccgttct cttattatca caagttctga cttgggatga tatcaagaaa 10500
gaacagggcg cttgggatac gctcacttgg tttgcggcgc ttgtcatgct cgccaacttc 10560
ttgaatgaat taggcatggt gtcttggttc agtaatgcca tgaaatcatc cgtatcaggg 10620
ttctcttgga ttgtggcatt catcatttta attgttgtgt attattactc tcactatttc 10680
tttgcaagtg cgacagccca catcagtgcg atgtattcag catttttggc tgtcgtcgtg 10740
gcagcgggcg caccgccgct tttagcagcg ctgagcctcg cgttcatcag caacctgttc 10800
gggtcaacga ctcactacgg ttctggagcg gctccggtct tcttcggagc aggctacatc 10860
ccgcaaggca aatggtggtc catcggattt atcctgtcga ttgttcatat catcgtatgg 10920
cttgtgatcg gcggattatg gtggaaagta ctaggaatat ggtagaaaga aaaaggcaga 10980
cgcggtctgc ctttttttat tttcactcct tcgtaagaaa atggattttg aaaaatgaga 11040
aaattccctg tgaaaaatgg tatgatctag gtagaaagga cggctggtgc tgtggtgaaa 11100
aagcggttcc atttttccct gcaaacaaaa ataatggggc tgattgcggc tctgctggtc 11160
tttgtcattg gtgtgctgac cattacgtta gccgttcagc atacacaggg agaacggaga 11220
caggcagagc agctggcggt tcaaacggcg agaaccattt cctatatgcc gccggttaaa 11280
gagctcattg agagaaaaga cggacatgcg gctcagacgc aagaggtcat tgaacaaatg 11340
aaagaacaga ctggtgcgtt tgccatttat gttttgaacg aaaaaggaga cattcgcagc 11400
gcctctggaa aaagcggatt aaagaaactg gagcgcagca gagaaatttt gtttggcggt 11460
tcgcatgttt ctgaaacaaa agcggatgga cgaagagtga tcagagggag cgcgccgatt 11520
ataaaagaac agaagggata cagccaagtg atcggcagcg tgtctgttga ttttctgcaa 11580
acggagacag agcaaagcat caaaaagcat ttgagaaatt tgagtgtgat tgctgtgctt 11640
gtactgctgc tcggatttat tggcgccgcc gtgctggcga aaagcatcag aaaggatacg 11700
ctcgggcttg aaccgcatga gatcgcggct ctatatcgtg agaggaacgc aatgcttttc 11760
gcgattcgag aagggattat tgccaccaat cgtgaaggcg tcgtcaccat gatgaacgta 11820
tcggcggccg agatgctgaa gctgcccgag cctgtgatcc atcttcctat agatgacgtc 11880
aaatgctgcc gaaccaggaa gtaagcgtca acgatcaagt gtttattatc aatacgaaag 11940
tgatgaatca aggcgggcag gcgtatggga ttgtcgtcag cttcagggag aaaacagagc 12000
tgaagaagct gatcgacaca ttgacagagg ttcgcaaata ttcagaggat ctcagggcgc 12060
agactcatga attttcaaat aagctttatg cgattttagg gctgcgtcga 12110
<210> 2
<211> 1050
<212> PRT
<213> 类芽孢杆菌属物种-62047
<400> 2
Ile Ala Gly Val Val Gln Ser Val Asn Val Ser Gln Ala Gly Tyr Ser
1 5 10 15
Ser Asn Asp Phe Lys Thr Ala Thr Val Thr Ala Ser Asp Lys Leu Ser
20 25 30
Asp Thr Ser Tyr Gln Ile Leu Gln Gly Thr Thr Val Ile Ala Thr Gly
35 40 45
Thr Met Lys Asp Glu Gly Tyr Val Trp Gly Lys Tyr Val Tyr Ser Ile
50 55 60
Asp Phe Ser Ser Val Thr Ala Thr Gly Thr Asn Phe Thr Ile Arg Ser
65 70 75 80
Asn Gly Val Ser Ser Tyr Thr Phe Pro Ile Gln Thr Asn Met Trp Asn
85 90 95
Glu Tyr Lys Asp Glu Met Thr Ala Phe Tyr Arg Leu Leu Arg Thr Thr
100 105 110
Asp Thr Phe Ala Ala Tyr Pro Ala Gly Tyr Ser Asn Ile Ala Pro Ser
115 120 125
Asn Lys Ile Leu His Pro Asp Ser Phe Leu Asp Asp Ala Phe Ser Pro
130 135 140
Asp Arg Thr Thr His Tyr Asp Leu Thr Gly Gly Trp Phe Asp Ala Gly
145 150 155 160
Asp Tyr Gly Lys Tyr Gly Gly Asn Gln Trp Val Gln Gly Asn Ile Ala
165 170 175
Ile Ser Tyr Leu Arg His Ala Ser Ser Ala Ala Val Asn Phe Asp Lys
180 185 190
Asp Thr Asn Gly Ile Pro Asp Leu Val Asp Glu Ala Ile Phe Gly Ser
195 200 205
Gln Tyr Leu Val Lys Phe Ala Asn Gln Leu Gly Gly Ala Ile His Asn
210 215 220
Ile Leu Arg Lys Gly Gly Phe Val Leu Pro His Lys Val Thr Asp Asn
225 230 235 240
Val Pro Gly Asn Thr Asp Asp Arg Ala Leu Glu Ala Val Glu Ala Val
245 250 255
Gly Gly Ser Gly Lys Ser Ser Gly Ser Leu Ala Ala Thr Ala Arg Ala
260 265 270
Ile Arg Thr Ala Ile Ala Gly Gly Lys Val Ala Ala Asn Lys Val Ala
275 280 285
Gln Leu Gln Thr Leu Ala Asn Glu Phe Gln Ala Ala Ala Ile Ile Phe
290 295 300
Tyr Asn Tyr Thr Leu Thr His Gln Ser Gly Asn His Gly Ser Tyr Gly
305 310 315 320
Thr Met Asn Asn Gly Gly Ile Ala Asn Pro Leu Leu Trp Ala Glu Val
325 330 335
Gln Leu Tyr Leu Leu Thr Gly Asp Ala Ala Tyr Lys Thr Gln Ala Gln
340 345 350
Thr Arg Ile Asn Ala Ile Asn Glu Ala Tyr Val Ser Ser Thr Asn Tyr
355 360 365
Trp Asp Met His Pro Ile Ala Leu Ala Glu Phe Tyr Pro Val Ala Asp
370 375 380
Ser Ala Ile Lys Thr Lys Ile Gln Ser Ile Leu Lys His Gln Ala Tyr
385 390 395 400
Tyr Phe Ile Thr Leu Met Asp Glu Thr Pro Tyr Gly Val Leu Asn Gln
405 410 415
Phe Gly Asn Phe Gly Val Asn Glu Pro His Ala Ser Tyr Met Ala Asp
420 425 430
Leu Leu Arg Tyr Tyr Glu Leu Phe Asn Asp Pro Val Ala Leu Arg Ala
435 440 445
Ala Lys Lys Ala Leu Tyr Trp Ile Val Gly Asn Asn Pro Trp Asn Ile
450 455 460
Ser Trp Val Ser Gly Val Gly Ser Asn Phe Thr Asp Phe Leu His Thr
465 470 475 480
Arg Leu Asp Glu Glu Ala Tyr Ser Gln Thr Asn Thr Gly Val Val Leu
485 490 495
Pro Gly Ala Met Val Ser Gly Pro Asn Ile Lys Asp Pro Asn Asn Lys
500 505 510
Leu Ser Ser Ser Pro Trp Tyr Glu Asp Lys Pro Ile Trp Ala Asp Asp
515 520 525
Thr Asn Gln Trp Arg Tyr Asn Glu Tyr Ser Val Ser Ile Gln Thr Gly
530 535 540
Leu Phe Tyr Thr Ile Met Gly Leu Ser Ala Leu Gly Gly Asn Ala Ser
545 550 555 560
Thr Gly Gly Ala Glu Pro Val Lys Leu Pro Ile Thr Trp Pro Ile Ile
565 570 575
Gly Asp Tyr Val Thr Gly Asp Val Thr Val Phe Ala Gln Pro Glu Gly
580 585 590
Ser Leu Ser Asn Val Ser Ala Asn Gly Ile Val Leu Ser Pro Ser Asp
595 600 605
Gly Val Tyr Thr Thr Thr Val Ser Thr Ser Ala Asp Ala Pro Tyr Thr
610 615 620
Glu Arg Lys Val Gln Ile Lys Gly Thr Asp Asp Ser Gly Phe Thr Thr
625 630 635 640
Tyr Ser Asn Thr His Phe Thr Val Ala Pro Ala Leu Pro Asp Pro Ser
645 650 655
His Pro Leu Leu Phe Asp Asp Phe Asn Gln Lys Gly Ile Trp Gly Ser
660 665 670
Gln Lys Leu Asp Trp Val Asn Trp Tyr Asn Gln Asn Gly Gly Thr Ala
675 680 685
Ser Tyr Thr Arg Thr Thr Val Asp Thr Arg Thr Val Gly Lys Phe Ala
690 695 700
His Thr Pro Ala Ala Thr Thr Ser Lys Ala Lys Phe Gln Pro Trp Lys
705 710 715 720
Tyr Asn Ala Asn Leu Asn Gly Tyr Arg Tyr Leu Asn Phe Thr Met Lys
725 730 735
Asn Pro Gly Tyr Pro Asn Thr Lys Ile Arg Ile Ala Ala Asn Asp Gly
740 745 750
Thr Lys Ser Val Asn Leu Thr Ser Gly Glu Val Ala Ile Ser Ser Thr
755 760 765
Trp Thr Thr Tyr Gln Tyr Asp Leu Asn Leu His Pro Thr Leu Asn Lys
770 775 780
Ser Asn Val Leu Ile Glu Val Trp Leu Ser Asn Pro Thr Ala Gly Ala
785 790 795 800
Tyr Gly Glu Ile Leu Ile Asp Glu Ile Ser Ala Val Asn Thr Asn Ser
805 810 815
Gly Thr Ala Pro Thr Leu Ser Ala Thr Gly Val Asn Ala Ser Ile Gly
820 825 830
Asn Gln Ser Thr Val Phe Thr Tyr Thr Ala Thr Tyr Thr Asp Ala Asn
835 840 845
Asn Gln Ala Pro Phe Asp Val Gln Val Val Ile Asp Gly Val Ile Arg
850 855 860
Ser Met Thr Ala Ala Asp Pro Thr Asp Thr Thr Tyr Ser Asp Gly Arg
865 870 875 880
Val Tyr Thr Tyr Ala Thr Thr Leu Pro Val Gly Thr His Lys Phe Tyr
885 890 895
Phe Arg Thr Thr Asp Thr Thr Thr Asn Phe Val Ser Thr Ser Val Gln
900 905 910
Thr Gly Pro Thr Val Ile Arg Asn Lys Leu Glu Ala Glu Val Leu Ser
915 920 925
Ile Asn Leu Thr Asn Tyr Thr His Ala Val Lys Asp Asn Ala Asp Ala
930 935 940
Ser Gly Gly Lys Tyr Arg Leu Phe Asn Gly Arg Gln Ala Asn Asp Tyr
945 950 955 960
Ile Glu Tyr Ala Val Asn Val Pro Lys Ala Gly Thr Tyr Gln Val Ser
965 970 975
Ala Arg Ala Met Arg Leu Ser Asp Asn Gly Ile Tyr Gln Leu Gln Ile
980 985 990
Asn Gly Ser Asn Gln Gly Thr Pro Phe Asp Thr Tyr Gln Ser Ser Gly
995 1000 1005
Lys Tyr Leu Asp Tyr Ala Leu Gly Asn Val Thr Ile Thr Ser Pro
1010 1015 1020
Gly Thr Gln Leu Phe Arg Phe Lys Val Thr Gly Lys Asn Ala Ser
1025 1030 1035
Ser Leu Gly Tyr Lys Leu Pro Leu Asp Phe Ile Gln
1040 1045 1050
<210> 3
<211> 87
<212> DNA
<213> 地衣芽孢杆菌
<400> 3
atgaaacaac aaaaacggct ttacgcccga ttgctgacgc tgttatttgc gctcatcttc 60
ttgctgcctc attctgcagc agcagcg 87
<210> 4
<211> 29
<212> PRT
<213> 地衣芽孢杆菌
<400> 4
Met Lys Gln Gln Lys Arg Leu Tyr Ala Arg Leu Leu Thr Leu Leu Phe
1 5 10 15
Ala Leu Ile Phe Leu Leu Pro His Ser Ala Ala Ala Ala
20 25

Claims (27)

1.一种内切葡聚糖酶变体，所述变体在选自下组的螯合剂诱导的不稳定区域中的一个或多个位置处包含改变，该组由以下组成：
i)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸1至94的区域10，
ii)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸106至114的区域11，
iii)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸139至209的区域12，
iv)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸252至266的区域13，
v)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸302至338的区域14，
vi)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸362至546的区域15，
vii)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸596至611的区域16，
viii)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸661至805的区域17，
ix)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸829至838的区域18，和
x)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸1043至1055的区域19，
其中所述变体与SEQ ID NO:2具有至少60％且小于100％的序列同一性。
2.根据权利要求1所述的内切葡聚糖酶变体，其中所述变体与SEQ ID NO:2具有至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列同一性。
3.根据权利要求1至2中任一项所述的内切葡聚糖酶变体，其中在一个或多个位置处的所述改变选自下组，该组由在以下位置处的改变组成：SEQ ID NO:2的17、20、51、53、55、56、60、63、79、87、186、192、302、311、313、387、388、390、403、408、410、416、448、451、471、472、476、489、507、512、515、538、598、599、602、603、605、609、676、688、690、694、697、698、699、711、719、754、756、760、781、786、797、833、834、835、和1048，其中根据SEQ ID NO:2进行编号。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的内切葡聚糖酶变体，其中在一个或多个位置处的所述改变选自下组，该组由以下组成：S17A、F20P、F20N、F20G、F20Y、K51Q、K51H、E53P、E53G、Y55M、V56M、Y60F、S63F、T87R、A186P、K192N、I302D、I302H、I302V、I302M、H311N、S313D、I387T、K388R、K390Q、I403Y、E408D、E408S、E408P、E408A、E408G、E408N、P410G、Q416S、Q416D、A448E、A448W、A448S、K451S、G471S、S472Y、D476R、Q489P、K507R、K512P、S515V、S538C、Y579W、S598Q、A599S、I602T、I602D、V603P、S605T、G609E、D676H、A688G、Y690F、T694A、T697G、R698W、T699A、T711V、T711Y、W719R、K754R、V756H、V756Y、S760G、T781M、N786K、T797S、A824D、N833D、Q834E、S835D、和F1048W，其中根据SEQ ID NO:2进行编号。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的内切葡聚糖酶变体，其中在一个或多个位置处的所述改变选自下组，该组由在以下位置处的改变组成：17、20、302、311、313、408、476、602、688、697、和719，其中根据SEQ ID NO:2进行编号。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的内切葡聚糖酶变体，其中在一个或多个位置处的所述改变选自下组，该组由在以下位置处的改变组成：S17A、F20P、I302D、H311N、S313D、E408D、D476R、I602T、A688G、T697G、和W719R，其中根据SEQ ID NO:2进行编号。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的内切葡聚糖酶变体，其中该变体进一步包含选自下组的在一个或多个位置处的改变，该组由在以下位置处的改变组成：216、283、346、559、564、579、636、638、651,824、848、869、880、881、883、887、892、905、906、912、921、928、934、937、948、956、999、和1037，其中根据SEQ ID NO:2进行编号。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的内切葡聚糖酶变体，进一步其中在一个或多个位置处的所述改变选自下组，该组由以下组成：N216D、N216Q、A283D、A346D、A559P、A559N、A564E、Y579W、S636K、S636N、F638N、A651P、A824D、N848D、A869V、R880K、V881T、V881Q、T883R、T887K、T892P、N905D、F906A、A912V、K921R、S928D、Y934G、A937E、K948R、Q956Y、T999R、和A1037E，其中根据SEQ ID NO:2进行编号。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的内切葡聚糖酶变体，其中该变体包含一个或多个以下的取代组：
F20Y+A448S+T781M E408D+K451S E408D+A448E E408D Y579W+E408D
。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的内切葡聚糖酶变体，其中该变体包含一个或多个以下的取代组：
Figure FDA0002387863880000031
Figure FDA0002387863880000041
11.根据权利要求1至10中任一项所述的内切葡聚糖酶变体，其中所述内切葡聚糖酶变体对用黄原胶裂解酶预处理的黄原胶具有活性，优选地所述活性是黄原胶降解活性，进一步优选地所述黄原胶降解活性是内切葡聚糖酶EC 3.2.1.4活性。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的内切葡聚糖酶变体，其中所述变体与具有SEQID NO:2的亲本内切葡聚糖酶相比具有在洗涤剂组合物中的改善的稳定性。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的内切葡聚糖酶变体，其中所述变体具有>1.0的半衰期改善因子(HIF)。
14.一种组合物，所述组合物包含至少一种根据权利要求1至13中任一项所述的内切葡聚糖酶变体。
15.根据权利要求14所述的组合物，其中所述组合物不是洗涤剂组合物。
16.如权利要求14或15所述的组合物，其中所述组合物进一步包含具有黄原胶内切葡聚糖酶活性的多肽。
17.根据权利要求14-16所述的组合物或根据权利要求1至13中任一项所述的内切葡聚糖酶变体的用途，其中所述用途选自由以下组成的组：
i)用于降解黄原胶的用途，以及
ii)用于控制钻井液的黏度的用途。
18.一种用于获得或产生内切葡聚糖酶变体的方法，所述方法包括向具有SEQ ID NO:2的亲本内切葡聚糖酶中引入在选自下组的螯合剂诱导的不稳定区域中的一个或多个位置处的改变，该组由以下组成：
i)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸1至94的区域10，
ii)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸106至114的区域11，
iii)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸139至209的区域12，
iv)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸252至266的区域13，
v)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸302至338的区域14，
vi)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸362至546的区域15，
vii)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸596至611的区域16，
viii)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸661至805的区域17，
ix)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸829至838的区域18，和
x)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸1043至1055的区域19，
其中所述变体与SEQ ID NO:2具有至少60％且小于100％的序列同一性；以及任选地，回收所述变体。
19.根据权利要求18所述的方法，其中在一个或多个位置处的所述改变选自下组，该组由在以下位置处的改变组成：SEQ ID NO:2的17、20、51、53、55、56、60、63、79、87、186、192、302、311、313、387、388、390、403、408、410、416、448、451、471、472、476、489、507、512、515、538、598、599、602、603、605、609、676、688、690、694、697、698、699、711、719、754、756、760、781、786、797、833、834、835、和1048，其中根据SEQ ID NO:2进行编号。
20.根据权利要求18-19所述的方法，其中在一个或多个位置处的所述改变选自下组，该组由以下组成：S17A、F20P、F20N、F20G、F20Y、K51Q、K51H、E53P、E53G、Y55M、V56M、Y60F、S63F、T87R、A186P、K192N、I302D、I302H、I302V、I302M、H311N、S313D、I387T、K388R、K390Q、I403Y、E408D、E408S、E408P、E408A、E408G、E408N、P410G、Q416S、Q416D、A448E、A448W、A448S、K451S、G471S、S472Y、D476R、Q489P、K507R、K512P、S515V、S538C、Y579W、S598Q、A599S、I602T、I602D、V603P、S605T、G609E、D676H、A688G、Y690F、T694A、T697G、R698W、T699A、T711V、T711Y、W719R、K754R、V756H、V756Y、S760G、T781M、N786K、T797S、A824D、N833D、Q834E、S835D、和F1048W，其中根据SEQ ID NO:2进行编号。
21.根据权利要求18-20中任一项所述的方法，其中在一个或多个位置处的所述改变选自下组，该组由在以下位置处的改变组成：17、20、302、311、313、408、476、602、688、697、和719，其中根据SEQ ID NO:2进行编号。
22.根据权利要求18-21中任一项所述的方法，其中在一个或多个位置处的所述改变选自下组，该组由在以下位置处的改变组成：S17A、F20P、I302D、H311N、S313D、E408D、D476R、I602T、A688G、T697G、和W719R，其中根据SEQ ID NO:2进行编号。
23.根据权利要求18-22中任一项所述的方法，其中该变体进一步包含选自下组的在一个或多个位置处的改变，该组由在以下位置处的改变组成：216、283、346、559、564、579、636、638、651,824、848、869、880、881、883、887、892、905、906、912、921、928、934、937、948、956、999和1037，其中根据SEQ ID NO:2进行编号。
24.根据权利要求18-23中任一项所述的方法，进一步其中在一个或多个位置处的所述改变选自下组，该组由以下组成：N216D、N216Q、A283D、A346D、A559P、A559N、A564E、Y579W、S636K、S636N、F638N、A651P、A824D、N848D、A869V、R880K、V881T、V881Q、T883R、T887K、T892P、N905D、F906A、A912V、K921R、S928D、Y934G、A937E、K948R、Q956Y、T999R、和A1037E，其中根据SEQ ID NO:2进行编号。
25.根据权利要求18-24中任一项所述的方法，其中该变体包含一个或多个以下的取代组：
F20Y+A448S+T781M E408D+K451S E408D+A448E E408D Y579W+E408D
。
26.根据权利要求18-25中任一项所述的方法，其中该变体包含一个或多个以下的取代组：
Figure FDA0002387863880000061
Figure FDA0002387863880000071
27.根据权利要求18-26中任一项所述的方法，其中在一个或多个位置处的所述改变提供了具有半衰期改善因子(HIF)>1.0的变体。
CN201880054037.9A 2017-08-24 2018-08-03 Gh9内切葡聚糖酶变体以及编码它们的多核苷酸 Pending CN111278971A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
IN201741029993 2017-08-24
IN201741029993 2017-08-24
PCT/EP2018/071093 WO2019038058A1 (en) 2017-08-24 2018-08-03 GH9 ENDOGLUCANASE VARIANTS AND POLYNUCLEOTIDES ENCODING SUCH VARIANTS

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN111278971A true CN111278971A (zh) 2020-06-12

Family

ID=63244555

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201880054037.9A Pending CN111278971A (zh) 2017-08-24 2018-08-03 Gh9内切葡聚糖酶变体以及编码它们的多核苷酸

Country Status (5)

Country Link
US (1) US11525128B2 (zh)
EP (1) EP3673058A1 (zh)
CN (1) CN111278971A (zh)
CA (1) CA3070749A1 (zh)
WO (1) WO2019038058A1 (zh)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104271723A (zh) * 2012-05-07 2015-01-07 诺维信公司 具有黄原胶降解活性的多肽以及编码其的核苷酸
CN104968781A (zh) * 2012-12-24 2015-10-07 诺维信公司 具有内切葡聚糖酶活性的多肽以及对其进行编码的多核苷酸
CN105358670A (zh) * 2013-07-04 2016-02-24 诺维信公司 具有抗再沉积效果的具黄原胶裂解酶活性的多肽与编码它们的多核苷酸
CN106414730A (zh) * 2014-05-28 2017-02-15 诺维信公司 具有内切葡聚糖酶活性的多肽

Family Cites Families (129)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB1296839A (zh) 1969-05-29 1972-11-22
GB1483591A (en) 1973-07-23 1977-08-24 Novo Industri As Process for coating water soluble or water dispersible particles by means of the fluid bed technique
GB1590432A (en) 1976-07-07 1981-06-03 Novo Industri As Process for the production of an enzyme granulate and the enzyme granuate thus produced
DK187280A (da) 1980-04-30 1981-10-31 Novo Industri As Ruhedsreducerende middel til et fuldvaskemiddel fuldvaskemiddel og fuldvaskemetode
DK263584D0 (da) 1984-05-29 1984-05-29 Novo Industri As Enzymholdige granulater anvendt som detergentadditiver
WO1987000859A1 (en) 1985-08-09 1987-02-12 Gist-Brocades N.V. Novel lipolytic enzymes and their use in detergent compositions
EG18543A (en) 1986-02-20 1993-07-30 Albright & Wilson Protected enzyme systems
DK122686D0 (da) 1986-03-17 1986-03-17 Novo Industri As Fremstilling af proteiner
US4810414A (en) 1986-08-29 1989-03-07 Novo Industri A/S Enzymatic detergent additive
US5389536A (en) 1986-11-19 1995-02-14 Genencor, Inc. Lipase from Pseudomonas mendocina having cutinase activity
EP0305216B1 (en) 1987-08-28 1995-08-02 Novo Nordisk A/S Recombinant Humicola lipase and process for the production of recombinant humicola lipases
DK6488D0 (da) 1988-01-07 1988-01-07 Novo Industri As Enzymer
ATE129523T1 (de) 1988-01-07 1995-11-15 Novo Nordisk As Spezifische protease.
JP3079276B2 (ja) 1988-02-28 2000-08-21 天野製薬株式会社 組換え体ｄｎａ、それを含むシュードモナス属菌及びそれを用いたリパーゼの製造法
US5648263A (en) 1988-03-24 1997-07-15 Novo Nordisk A/S Methods for reducing the harshness of a cotton-containing fabric
EP0406314B1 (en) 1988-03-24 1993-12-01 Novo Nordisk A/S A cellulase preparation
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
GB8915658D0 (en) 1989-07-07 1989-08-23 Unilever Plc Enzymes,their production and use
WO1991017243A1 (en) 1990-05-09 1991-11-14 Novo Nordisk A/S A cellulase preparation comprising an endoglucanase enzyme
DK115890D0 (da) 1990-05-09 1990-05-09 Novo Nordisk As Enzym
JP3469234B2 (ja) 1990-09-13 2003-11-25 ノボザイムス アクティーゼルスカブ リパーゼ変異体
IL99552A0 (en) 1990-09-28 1992-08-18 Ixsys Inc Compositions containing procaryotic cells,a kit for the preparation of vectors useful for the coexpression of two or more dna sequences and methods for the use thereof
US5067566A (en) 1991-01-14 1991-11-26 Bj Services Company Low temperature degradation of galactomannans
EP0495258A1 (en) 1991-01-16 1992-07-22 The Procter & Gamble Company Detergent compositions with high activity cellulase and softening clays
EP0511456A1 (en) 1991-04-30 1992-11-04 The Procter & Gamble Company Liquid detergents with aromatic borate ester to inhibit proteolytic enzyme
EP0583420B1 (en) 1991-04-30 1996-03-27 The Procter & Gamble Company Built liquid detergents with boric-polyol complex to inhibit proteolytic enzyme
EP0583339B1 (en) 1991-05-01 1998-07-08 Novo Nordisk A/S Stabilized enzymes and detergent compositions
US5340735A (en) 1991-05-29 1994-08-23 Cognis, Inc. Bacillus lentus alkaline protease variants with increased stability
DE69229957T2 (de) 1991-12-13 2000-04-13 The Procter & Gamble Co., Cincinnati Acylierte citratester als ausgangsstoffe für persäuren
US5201370A (en) 1992-02-26 1993-04-13 Bj Services Company Enzyme breaker for galactomannan based fracturing fluid
DK28792D0 (da) 1992-03-04 1992-03-04 Novo Nordisk As Nyt enzym
DK72992D0 (da) 1992-06-01 1992-06-01 Novo Nordisk As Enzym
DK88892D0 (da) 1992-07-06 1992-07-06 Novo Nordisk As Forbindelse
ATE444356T1 (de) 1992-07-23 2009-10-15 Novozymes As Mutierte -g(a)-amylase, waschmittel und geschirrspülmittel
EP0663950B1 (en) 1992-10-06 2004-03-17 Novozymes A/S Cellulase variants
PL310326A1 (en) 1993-02-11 1995-12-11 Genencor Int Novel oxidation-stable mutants of alpha-amylase as well as detergent and starch liquefaction compositions containing them
DE69434242T2 (de) 1993-04-27 2006-01-12 Genencor International, Inc., Palo Alto Neuartige Lipasevarianten zur Verwendung in Reinigungsmitteln
FR2704860B1 (fr) 1993-05-05 1995-07-13 Pasteur Institut Sequences de nucleotides du locus cryiiia pour le controle de l'expression de sequences d'adn dans un hote cellulaire.
DK52393D0 (zh) 1993-05-05 1993-05-05 Novo Nordisk As
JP2859520B2 (ja) 1993-08-30 1999-02-17 ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ リパーゼ及びそれを生産する微生物及びリパーゼ製造方法及びリパーゼ含有洗剤組成物
EP0722490B2 (en) 1993-10-08 2013-10-23 Novozymes A/S Amylase variants
KR100338786B1 (ko) 1993-10-13 2002-12-02 노보자임스 에이/에스 H2o2-안정한퍼록시다제변이체
JPH07143883A (ja) 1993-11-24 1995-06-06 Showa Denko Kk リパーゼ遺伝子及び変異体リパーゼ
DE4343591A1 (de) 1993-12-21 1995-06-22 Evotec Biosystems Gmbh Verfahren zum evolutiven Design und Synthese funktionaler Polymere auf der Basis von Formenelementen und Formencodes
US5605793A (en) 1994-02-17 1997-02-25 Affymax Technologies N.V. Methods for in vitro recombination
KR970701264A (ko) 1994-02-22 1997-03-17 안네 제케르 지질분해효소의 변이체 제조방법(a method of preparing a viriant of a lipolytic enzyme)
EP1921148B1 (en) 1994-02-24 2011-06-08 Henkel AG & Co. KGaA Improved enzymes and detergents containing them
CA2185101A1 (en) 1994-03-08 1995-09-14 Martin Schulein Novel alkaline cellulases
WO1995030744A2 (en) 1994-05-04 1995-11-16 Genencor International Inc. Lipases with improved surfactant resistance
DK0765394T3 (da) 1994-06-03 2001-12-10 Novozymes As Oprensede Myceliopthora-laccaser og nukleinsyrer der koder for disse
AU2884595A (en) 1994-06-20 1996-01-15 Unilever Plc Modified pseudomonas lipases and their use
WO1996000292A1 (en) 1994-06-23 1996-01-04 Unilever N.V. Modified pseudomonas lipases and their use
AU2705895A (en) 1994-06-30 1996-01-25 Novo Nordisk Biotech, Inc. Non-toxic, non-toxigenic, non-pathogenic fusarium expression system and promoters and terminators for use therein
US5562160A (en) 1994-08-08 1996-10-08 B. J. Services Company Fracturing fluid treatment design to optimize fluid rheology and proppant pack conductivity
ATE389012T1 (de) 1994-10-06 2008-03-15 Novozymes As Ein enzympräparat mit endoglucanase aktivität
BE1008998A3 (fr) 1994-10-14 1996-10-01 Solvay Lipase, microorganisme la produisant, procede de preparation de cette lipase et utilisations de celle-ci.
EP0785994A1 (en) 1994-10-26 1997-07-30 Novo Nordisk A/S An enzyme with lipolytic activity
AR000862A1 (es) 1995-02-03 1997-08-06 Novozymes As Variantes de una ó-amilasa madre, un metodo para producir la misma, una estructura de adn y un vector de expresion, una celula transformada por dichaestructura de adn y vector, un aditivo para detergente, composicion detergente, una composicion para lavado de ropa y una composicion para la eliminacion del
JPH08228778A (ja) 1995-02-27 1996-09-10 Showa Denko Kk 新規なリパーゼ遺伝子及びそれを用いたリパーゼの製造方法
AU715423B2 (en) 1995-03-17 2000-02-03 Novozymes A/S Novel endoglucanases
JP4307549B2 (ja) 1995-07-14 2009-08-05 ノボザイムス アクティーゼルスカブ 脂肪分解活性を有する修飾された酵素
DE19528059A1 (de) 1995-07-31 1997-02-06 Bayer Ag Wasch- und Reinigungsmittel mit Iminodisuccinaten
ES2221934T3 (es) 1995-08-11 2005-01-16 Novozymes A/S Nuevas enzimas lipoliticas.
US5806597A (en) 1996-05-01 1998-09-15 Bj Services Company Stable breaker-crosslinker-polymer complex and method of use in completion and stimulation
US5763385A (en) 1996-05-14 1998-06-09 Genencor International, Inc. Modified α-amylases having altered calcium binding properties
WO1998008940A1 (en) 1996-08-26 1998-03-05 Novo Nordisk A/S A novel endoglucanase
EP0937138B1 (en) 1996-09-17 2006-04-26 Novozymes A/S Cellulase variants
WO1998015257A1 (en) 1996-10-08 1998-04-16 Novo Nordisk A/S Diaminobenzoic acid derivatives as dye precursors
CA2268772C (en) 1996-10-18 2008-12-09 The Procter & Gamble Company Detergent compositions comprising an amylolytic enzyme and a cationic surfactant
CA2270180C (en) 1996-11-04 2011-01-11 Novo Nordisk A/S Subtilase variants and compositions
CN1554750B (zh) 1996-11-04 2011-05-18 诺维信公司 枯草酶变种及组合物
US6159731A (en) 1997-02-12 2000-12-12 Massachusetts Institute Of Technology Daxx, a Fas-binding protein that activates JNK and apoptosis
JP4358431B2 (ja) 1997-10-13 2009-11-04 ノボザイムス アクティーゼルスカブ α−アミラーゼ変異体
MA25044A1 (fr) 1997-10-23 2000-10-01 Procter & Gamble Compositions de lavage contenant des variants de proteases multisubstituees.
US5955310A (en) 1998-02-26 1999-09-21 Novo Nordisk Biotech, Inc. Methods for producing a polypeptide in a bacillus cell
CA2344619C (en) 1998-10-26 2012-01-03 Novozymes A/S Constructing and screening a dna library of interest in filamentous fungal cells
AU1503800A (en) 1998-12-04 2000-06-26 Novozymes A/S Cutinase variants
CN100510096C (zh) 1999-03-22 2009-07-08 诺沃奇梅兹有限公司 用于在真菌细胞中表达基因的启动子
WO2000060063A1 (en) 1999-03-31 2000-10-12 Novozymes A/S Lipase variant
CN101974375B (zh) 1999-12-15 2014-07-02 诺沃奇梅兹有限公司 对蛋渍具有改进洗涤性能的枯草杆菌酶变体
EP1257176B1 (en) 2000-02-08 2008-04-30 DSM IP Assets B.V. Use of acid-stable proteases in animal feed
EP2221365A1 (en) 2000-03-08 2010-08-25 Novozymes A/S Variants with altered properties
EP1290150B1 (en) 2000-06-02 2005-08-24 Novozymes A/S Cutinase variants
US7360593B2 (en) 2000-07-27 2008-04-22 Vernon George Constien Product for coating wellbore screens
EP2204446A1 (en) 2000-08-01 2010-07-07 Novozymes A/S Alpha-amylase mutants with altered properties
AU2002311012A1 (en) 2001-06-06 2002-12-16 Novozymes A/S Endo-beta-1,4-glucanase from bacillus
DK200101090A (da) 2001-07-12 2001-08-16 Novozymes As Subtilase variants
US7314712B2 (en) 2001-07-27 2008-01-01 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Systems for in vivo site-directed mutagenesis using oligonucleotides
GB0127036D0 (en) 2001-11-09 2002-01-02 Unilever Plc Polymers for laundry applications
WO2003095658A1 (en) 2002-05-07 2003-11-20 Novozymes A/S Homologous recombination into bacterium for the generation of polynucleotide libraries
ATE407202T1 (de) 2003-05-07 2008-09-15 Novozymes As Enzymvarianten von subtilisin (subtilasen)
GB0314210D0 (en) 2003-06-18 2003-07-23 Unilever Plc Laundry treatment compositions
GB0314211D0 (en) 2003-06-18 2003-07-23 Unilever Plc Laundry treatment compositions
EP1633843A1 (en) 2003-06-18 2006-03-15 Unilever Plc Laundry treatment compositions
EP2664670B1 (en) 2003-12-03 2015-05-06 Danisco US Inc. Perhydrolase
AU2005318696B2 (en) 2004-12-23 2010-12-16 Novozymes A/S Alpha-amylase variants
ES2354269T3 (es) 2005-04-15 2011-03-11 Basf Se Polialquileminas anfifílicas alcoxiladas solubles en agua con un bloque interno de óxido de polietileno y un bloque externo de óxido de polipropileno.
JP2008538378A (ja) 2005-04-15 2008-10-23 ザ プロクター アンド ギャンブル カンパニー 修飾ポリエチレンイミンポリマーおよびリパーゼ酵素を有する液体洗濯洗剤組成物
CN101184835A (zh) 2005-05-31 2008-05-21 宝洁公司 包含聚合物的洗涤剂组合物及其使用
KR20080066921A (ko) 2005-10-12 2008-07-17 제넨코 인터내셔날 인코포레이티드 저장-안정성 중성 메탈로프로테아제의 용도 및 제조
US8518675B2 (en) 2005-12-13 2013-08-27 E. I. Du Pont De Nemours And Company Production of peracids using an enzyme having perhydrolysis activity
CN101484565B (zh) 2006-01-23 2011-12-14 宝洁公司 包含脂肪酶和漂白催化剂的组合物
EP2371948B1 (en) 2006-01-23 2017-04-19 Novozymes A/S Lipase variants
EP1976967A2 (en) 2006-01-23 2008-10-08 The Procter and Gamble Company Detergent compositions
CA2635927A1 (en) 2006-01-23 2007-08-02 The Procter And Gamble Company A composition comprising a lipase and a bleach catalyst
BRPI0710440A2 (pt) 2006-01-23 2011-08-16 Procter & Gamble composições contendo enzima e fotobranqueador
EP3101111A1 (en) 2006-01-23 2016-12-07 The Procter and Gamble Company Enzyme and fabric hueing agent containing compositions
WO2007087244A2 (en) 2006-01-23 2007-08-02 The Procter & Gamble Company Detergent compositions
DE602007007945D1 (de) 2006-05-31 2010-09-02 Basf Se Amphiphile pfropfpolymere auf basis von polyalkylenoxiden und vinylestern
DE202006009003U1 (de) 2006-06-06 2007-10-25 BROSE SCHLIEßSYSTEME GMBH & CO. KG Kraftfahrzeugschloß
EP1876226B1 (en) 2006-07-07 2011-03-23 The Procter & Gamble Company Detergent compositions
US8546121B2 (en) 2007-05-30 2013-10-01 Danisco Us Inc. Variants of an alpha-amylase with improved production levels in fermentation processes
DE602007013545D1 (de) 2007-07-02 2011-05-12 Procter & Gamble Mehrkammerbeutel enthaltend Waschmittel
EP2215202B2 (en) 2007-11-05 2024-01-10 Danisco US Inc. VARIANTS OF BACILLUS sp. TS-23 ALPHA-AMYLASE WITH ALTERED PROPERTIES
WO2009087523A2 (en) 2008-01-04 2009-07-16 The Procter & Gamble Company A laundry detergent composition comprising glycosyl hydrolase
US20090209447A1 (en) 2008-02-15 2009-08-20 Michelle Meek Cleaning compositions
US7919298B2 (en) 2008-02-29 2011-04-05 Novozymes A/S Polypeptides having lipase activity and polynucleotides encoding same
EP2299839A2 (en) 2008-06-20 2011-03-30 Solae, Llc Protein hydrolysate compositions stable under acidic conditions
US20110281324A1 (en) 2008-12-01 2011-11-17 Danisco Us Inc. Enzymes With Lipase Activity
WO2010100028A2 (en) 2009-03-06 2010-09-10 Huntsman Advanced Materials (Switzerland) Gmbh Enzymatic textile bleach-whitening methods
WO2010107560A2 (en) 2009-03-18 2010-09-23 Danisco Us Inc. Fungal cutinase from magnaporthe grisea
EP2411510A2 (en) 2009-03-23 2012-02-01 Danisco US Inc. Cal a-related acyltransferases and methods of use, thereof
WO2011084599A1 (en) 2009-12-21 2011-07-14 Danisco Us Inc. Detergent compositions containing bacillus subtilis lipase and methods of use thereof
EP2516611A1 (en) 2009-12-21 2012-10-31 Danisco US Inc. Detergent compositions containing geobacillus stearothermophilus lipase and methods of use thereof
WO2011084412A1 (en) 2009-12-21 2011-07-14 Danisco Us Inc. Detergent compositions containing thermobifida fusca lipase and methods of use thereof
WO2011150157A2 (en) 2010-05-28 2011-12-01 Danisco Us Inc. Detergent compositions containing streptomyces griseus lipase and methods of use thereof
US20140031272A1 (en) 2011-04-08 2014-01-30 Danisco Us Inc. Compositions
WO2016203064A2 (en) 2015-10-28 2016-12-22 Novozymes A/S Detergent composition comprising protease and amylase variants
CA3031609A1 (en) * 2016-08-24 2018-03-01 Novozymes A/S Gh9 endoglucanase variants and polynucleotides encoding same

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104271723A (zh) * 2012-05-07 2015-01-07 诺维信公司 具有黄原胶降解活性的多肽以及编码其的核苷酸
CN104968781A (zh) * 2012-12-24 2015-10-07 诺维信公司 具有内切葡聚糖酶活性的多肽以及对其进行编码的多核苷酸
CN105358670A (zh) * 2013-07-04 2016-02-24 诺维信公司 具有抗再沉积效果的具黄原胶裂解酶活性的多肽与编码它们的多核苷酸
CN106414730A (zh) * 2014-05-28 2017-02-15 诺维信公司 具有内切葡聚糖酶活性的多肽
US20170175096A1 (en) * 2014-05-28 2017-06-22 Novozymes A/S Polypeptides Having Endoglucanase Activity

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
YASUOYOSHIKUNI,JAY DKEASLING: "Pathway engineering by designed divergent evolution", 《CURRENT OPINION IN CHEMICAL BIOLOGY》 *

Also Published As

Publication number Publication date
WO2019038058A1 (en) 2019-02-28
EP3673058A1 (en) 2020-07-01
US20210155916A1 (en) 2021-05-27
CA3070749A1 (en) 2019-02-28
US11525128B2 (en) 2022-12-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US9988616B2 (en) Polypeptides having xanthan degrading activity and polynucleotides encoding same
CN109863244B (zh) Gh9内切葡聚糖酶变体以及编码它们的多核苷酸
CN109844110B (zh) 黄原胶裂解酶变体以及编码它们的多核苷酸
CN108350443B (zh) 具有黄原胶降解活性的多肽以及编码它们的多核苷酸
US11359188B2 (en) Xanthan lyase variants and polynucleotides encoding same
EP3017032A2 (en) Polypeptides having anti-redeposition effect and polynucleotides encoding same
EP2925849A2 (en) Polypeptides for cleaning or detergent compositions
EP3380609B1 (en) Polypeptides having protease activity and polynucleotides encoding same
EP3380608A1 (en) Polypeptides having protease activity and polynucleotides encoding same
EP3405572B1 (en) Polypeptides having protease activity and polynucleotides encoding same
US20170121643A1 (en) Polypeptides having amylase activity and polynucleotides encoding same
CN111278971A (zh) Gh9内切葡聚糖酶变体以及编码它们的多核苷酸
EP3401385A1 (en) Detergent composition comprising polypeptide comprising carbohydrate-binding domain
WO2018206535A1 (en) Carbohydrate-binding domain and polynucleotides encoding the same

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20200612