CN104968781A

CN104968781A - 具有内切葡聚糖酶活性的多肽以及对其进行编码的多核苷酸

Info

Publication number: CN104968781A
Application number: CN201380067437.0A
Authority: CN
Inventors: 刘晔; 汤岚; 赖伟坚
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novo Nordisk AS
Priority date: 2012-12-24
Filing date: 2013-12-24
Publication date: 2015-10-07

Abstract

提供了具有内切葡聚糖酶活性、催化结构域和碳水化物结合模块的多肽，以及编码这些多肽、催化结构域或碳水化物结合模块的多核苷酸。还提供了包括这些多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞以及生产和使用这些多肽、催化结构域或碳水化物结合模块的方法。

Description

具有内切葡聚糖酶活性的多肽以及对其进行编码的多核苷酸

对序列表的引用

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对生物材料保藏的参考

本申请包含对生物材料保藏的参考，该保藏通过引用结合在此。

发明背景

发明领域

本发明涉及具有内切葡聚糖酶活性、催化结构域和碳水化物结合模块的多肽，以及编码这些多肽、催化结构域和碳水化物结合结构域的多核苷酸。本发明还涉及包括这些多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞以及生产和使用这些多肽、催化结构域和碳水化物结合结构域的方法。本发明还涉及尤其是在生物石磨(biostoning)和生物抛光工艺中通过用具有内切葡聚糖酶活性的分离的多肽处理纺织品而制造纺织品的方法。

相关技术说明

纤维素酶或纤维素分解酶是涉及纤维素水解的酶。已知涉及三种主要类型的纤维素酶，即内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶。

纤维素酶具有一系列工业应用。在纺织工业中，将纤维素酶用于牛仔布整理中，以使用生物石磨工艺在牛仔布上产生时髦的石洗外观。使用生物抛光工艺，将纤维素酶还用于例如清理布衣表面上的绒毛和防止在其表面上形成绒球。

WO 96/29397披露了在工业应用中具有性能的酶制剂(例如洗衣组合物)，用于生物抛光新制造的纺织品、用于为纤维素织物或服装提供磨损外观以及用于处理纸浆。

WO 2010/076388披露了在低温下具有实质性能的真菌内切葡聚糖酶；将这些内切葡聚糖酶尤其是在纺织工业中，例如在生物整理或生物石磨中用于处理纤维素材料。

一种来自土生梭孢壳的糖苷水解酶家族45蛋白被披露为UNIPROT：G2QVH7。一种来自土生梭孢壳的具有内切葡聚糖酶活性的多肽被披露为GENESEQP：AZX33567。

一种来自大孢圆孢霉(Staphylotrichum coccosporum)的内切-β-D-1,4-葡聚糖酶被披露为UNIPROT：B5BNY1。一种来自大孢圆孢霉的具有内切葡聚糖酶活性的多肽被披露为GENESEQP：AEA35116。

一种来自土生梭孢壳的内切葡聚糖酶被披露为UNIPROT：G2R3B9。一种来自卢克诺文思金孢子菌(Chrysosporium lucknowense)的具有内切葡聚糖酶活性的多肽被披露为GENESEQP：ATS95010。在本领域中持续需要用于在生物抛光工艺中，尤其是在低温下获得具有良好的磨损效果和/或减少的起球趋势的新的内切葡聚糖酶和方法。

本发明旨在满足这些需要并提供具有内切葡聚糖酶活性的多肽和编码这些多肽的多核苷酸。

发明概述

本发明涉及具有内切葡聚糖酶活性的分离的多肽，这些分离的多肽选自下组，该组由以下各项组成：

(a)一种与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少80％序列一致性的多肽或一种与SEQ ID NO:4的成熟多肽具有至少85％序列一致性的多肽；一种多肽，该多肽与SEQ ID NO:6的成熟多肽具有至少85％的序列一致性；

(b)一种多肽，该多肽由以下多核苷酸编码，该多核苷酸在中、中-高、高或非常高严格条件下与(i)SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5的成熟多肽编码序列，(ii)其cDNA序列或(iii)(i)或(ii)的全长互补体杂交；

(c)一种多肽，该多肽由与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列具有至少80％序列一致性的多核苷酸编码、或由与SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列具有至少85％序列一致性的多核苷酸编码、或由与 SEQ ID NO:5的成熟多肽编码序列具有至少85％序列一致性的多核苷酸编码，或者其cDNA序列；

(d)SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6的成熟多肽的一种变体，该变体在一个或多个(例如，若干个)位置处包括取代、缺失和/或插入；以及

(e)(a)、(b)、(c)或(d)的多肽的一个片段，该片段具有内切葡聚糖酶活性。

本发明还涉及包括选自下组的催化结构域的分离的多肽，该组由以下各项组成：

(a)一种催化结构域，该催化结构域与SEQ ID NO:2的氨基酸22至237具有至少85％序列一致性、或与SEQ ID NO:4的氨基酸22至223具有至少90％序列一致性、或与SEQ ID NO:6的氨基酸21至222具有至少85％序列一致性；

(b)一种催化结构域，该催化结构域由以下多核苷酸编码，该多核苷酸在中、中-高、高或非常高严格条件下与(i)SEQ ID NO:1的核苷酸64至838或SEQ ID NO:3的核苷酸64至774或SEQ ID NO:5的核苷酸61至835，(ii)其cDNA序列或(iii)(i)或(ii)的全长互补体杂交；

(c)一种催化结构域，该催化结构域由与SEQ ID NO:1的核苷酸64至838具有至少85％序列一致性、或与SEQ ID NO:3的核苷酸64至774具有至少90％序列一致性、或与SEQ ID NO:5的核苷酸61至835具有至少85％序列一致性的多核苷酸、或其cDNA序列编码；

(d)SEQ ID NO:2的氨基酸22至237的一种变体、或SEQ ID NO:4的氨基酸22至223的一种变体、或与SEQ ID NO:6的核苷酸21至222具有至少85％序列一致性，该变体在一个或多个(例如，若干个)位置处包括取代、缺失和/或插入；以及

(e)(a)、(b)、(c)或(d)的催化结构域的一个片段，该片段具有内切葡聚糖酶活性。

本发明还涉及包括选自下组的碳水化物结合模块的分离的多肽，该组由以下各项组成：

(a)一种碳水化物结合模块，该碳水化物结合模块与SEQ ID NO: 2的氨基酸250至286具有至少80％序列一致性或与SEQ ID NO:4的氨基酸268至305具有至少85％序列一致性；

(b)一种碳水化物结合模块，该碳水化物结合模块由以下多核苷酸编码，该多核苷酸在中、中-高、高或非常高严格条件下与(i)SEQ ID NO:1的核苷酸875至985或SEQ ID NO:3的核苷酸907至1020，(ii)其cDNA序列或(iii)(i)或(ii)的全长互补体杂交；

(c)一种碳水化物结合模块，该碳水化物结合模块由与SEQ ID NO:1的核苷酸875至985具有至少80％序列一致性,或与SEQ ID NO:3的核苷酸907至1020具有至少85％序列一致性的多核苷酸、或其cDNA序列编码；

(d)SEQ ID NO:2的氨基酸250至286的一种变体或SEQ ID NO:4的氨基酸268至305的一种变体，该变体在一个或多个(例如，若干个)位置处包括取代、缺失和/或插入；以及

(e)(a)、(b)、(c)或(d)的碳水化物结合模块的一个片段，该片段具有结合活性。

本发明还涉及编码本发明多肽的分离的多核苷酸；核酸构建体；重组表达载体；包括这些多核苷酸的重组宿主细胞；以及产生这些多肽的方法。

本发明还涉及编码一种信号肽的多核苷酸，该信号肽包括SEQ ID NO:2的氨基酸1至21或SEQ ID NO:4的氨基酸1至21或SEQ ID NO:6的氨基酸1至18或由其组成；包括这些多核苷酸的核酸构建体、表达载体、以及重组宿主细胞；以及产生一种蛋白质的方法。

本发明还涉及尤其是在生物石磨和生物抛光工艺中通过用具有内切葡聚糖酶活性的分离的多肽处理纺织品而制造纺织品的方法。

在一些实施例中，可以将该方法应用于生物抛光工艺中。在一些实施例中，将该方法与染料在一种浴中进行。在一些实施例中，将该方法与过氧化氢酶在一种浴中进行。

在一些实施例中，提供了用于制造纺织品的方法。在一些实施例中，该纺织品被从织物制备为衣服。

在一些实施例中，该纺织品是一种含纤维素纺织品或纤维素纺织品。

本发明的优势在于，该方法可以在低温下进行，以便在纺织品制造工艺中节能。本发明的方法可以进一步显示出与染色步骤的良好相容性。

附图简要说明

图1：用于表达透明嗜热腐质霉(Humicola hyalothermophila)GH45内切葡聚糖酶基因的载体pGH45_Hya8473的DNA图谱。

图2：用于表达赫坎梭孢壳(Thielavia hyrcaniae)GH45内切葡聚糖酶基因的载体pGH45_Thihy3331的DNA图谱。

图3：用于表达赫坎梭孢壳GH45内切葡聚糖酶基因的载体pGH45_Thihy0507的DNA图谱。

定义

内切葡聚糖酶：术语“葡聚糖内切酶”是指内切-1,4-(1,3；1,4)-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶(E.C.3.2.1.4)，它催化纤维素、纤维素衍生物(例如羧甲基纤维素和羟乙基纤维素)、地衣多糖中的1,4-β-D-糖苷键，混合的β-1,3葡聚糖(例如谷物β-D-葡聚糖或木葡聚糖)中的β-1,4键，以及含有纤维素组分的其他植物材料的内切水解。可以通过测量底物粘度的降低或通过还原糖测定所确定的还原性末端的增加来确定内切葡聚糖酶活性(张(Zhang)等人，2006，生物技术进展(Biotechnology Advances)24:452-481)。可以根据高斯(Ghose)，1987，纯粹与应用化学(Pure and Appl.Chem.)59:257-268的第264页的第VI部分的程序，使用羧甲基纤维素(CMC)作为底物测定内切葡聚糖酶活性。

出于本发明的目的，根据实例中所述的程序测定内切葡聚糖酶活性。在一个方面中，本发明的多肽具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少100％的SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6的成熟多肽的内切葡聚糖酶活性。

典型地，内切葡聚糖酶具有至少两个功能结构域，一种碳水化物结合模块(CBM)和一个催化模块。将催化模块定义为能够酶促地切割纤维素，例如具有内切葡聚糖酶活性的氨基酸序列。催化模块不被视为是碳水化物结合模块。“接头序列”连接这两个功能模块。

碳水化物结合模块：将术语“碳水化物结合模块”(CBM)定义为结合至底物的氨基酸序列。CBM例如被描述于布拉斯顿(Boraston)等人，2004，生物化学杂志(Biochem.J.)382:769–781和汤美(Tomme)等人，约翰N.萨德勒(John N.Saddler)和迈克尔H.彭纳(Michael H.Penner)(编辑)，ACS研讨会丛刊，第618期，1995中。据信CBM结合至底物可增加酶的催化活性部分的功效。

现在普遍使用术语CBM；然而，使用术语“纤维素结合结构域”(CBD)描述特异性结合至纤维素底物的CBM的亚组。在上下文中，具有内切葡聚糖酶活性的多肽的CBM或CBD可以可互换地使用。

家族45或家族GH45或CEL45：在此将术语“家族45”或“家族GH45”或“CEL45”定义为根据亨利萨特(Henrissat)B.，1991，基于氨基酸序列相似性的糖基水解酶的分类(A classification of glycosyl hydrolases based on amino-acid sequence similarities)，生物化学杂志(Biochem.J.)280:309-316，和亨利萨特和贝洛赫(Bairoch)，1996，修正糖基水解酶的基于序列的分类(Updating the sequence-based classification of glycosyl hydrolases)，生物化学杂志316:695-696属于糖苷水解酶家族45的多肽。碳水化物结合模块经常与编码酶(例如糖基水解酶)的催化模块相关联。纪伦(Guillén)D，桑切斯(Sánchez)S，罗德里格斯-萨诺娅(Rodríguez-Sanoja)R.碳水化物结合结构域：生物学作用的多重性(Carbohydrate-binding domains:multiplicity of biological roles)，应用微生物学与生物技术(Applied Microbiology&Biotechnology)2010年2月；85(5):1241。可获得自：EDS基金索引(EDS Foundation Index)，伊普斯威奇，马萨诸塞州。

等位基因变体：术语“等位基因变体”意指占据同一染色体基因座的基因的两种或更多种可替代形式中的任一种。等位基因变异由突变天然产生，并且可以导致群体内的多态性。基因突变可以是沉默的(在所编码的多肽中没有改变)或可编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位基因变体是由基因的等位基因变体编码的多肽。

催化结构域：术语“催化结构域”意思指一种酶的包含该酶的催化机器的区域。

cDNA：术语“cDNA”是指可以通过从得自真核或原核细胞的成熟的、剪接的mRNA分子进行反转录而制备的DNA分子。cDNA缺乏可以存在于对应基因组DNA中的内含子序列。早先的初始RNA转录本是mRNA的前体，其在呈现为成熟的剪接的mRNA之前要经一系列的步骤进行加工，包括剪接。

编码序列：术语“编码序列”意指直接指定一个多肽的氨基酸序列的多核苷酸。编码序列的边界一般由一个开放阅读框架决定，该开放阅读框架从一个起始密码子(如ATG、GTG或TTG)开始并且以一个终止密码子(如TAA、TAG或TGA)结束。编码序列可以是一种基因组DNA、cDNA、合成DNA或其组合。

控制序列：术语“控制序列”意指对于表达编码本发明的成熟多肽的多核苷酸所必需的核酸序列。各个控制序列可以相对于编码多肽的多核苷酸是天然的(即，来自相同基因)或外源的(即，来自不同基因)，或相对于彼此是天然的或外源的。此类控制序列包括但不限于前导子、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列、以及转录终止子。至少，控制序列包括启动子，以及转录和翻译终止信号。出于引入有利于将这些控制序列与编码一种多肽的多核苷酸的编码区连接的特异性限制酶切位点的目的，这些控制序列可以提供有多个接头。

表达：术语“表达”包括涉及多肽产生的任何步骤，包括但不限于，转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰、以及分泌。

表达载体：术语“表达载体”意指线性或环状DNA分子，该分子包括编码多肽的多核苷酸并且该多核苷酸可操作地与提供用于其表达的控制序列相连接。

片段：术语“片段”意指在一种成熟多肽或结构域的氨基和/或羧基末端缺失一个或多个(例如，若干个)氨基酸的一种多肽或催化结构域或碳水化物结合模块；其中该片段具有内切葡聚糖酶活性或碳水化物结合活性。在一个方面中，一个片段包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6的成熟多肽的氨基酸数目的至少85％、90％或95％。

高严格条件：术语“高严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、 0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用0.2X SSC、0.2％SDS，在65℃下洗涤三次，每次15分钟。

宿主细胞：术语“宿主细胞”意指易于用包括本发明的多核苷酸的核酸构建体或表达载体转化、转染、转导等的任何细胞类型。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间发生的突变而与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。

分离的：术语“分离的”意指处于自然界中不出现的形式或环境中的物质。分离的物质的非限制性实例包括(1)任何非天然发生的物质，(2)包括但不限于任何酶、变体、核酸、蛋白质、肽或辅因子的任何物质，该物质至少部分地从与其本质相关的一种或多种或所有天然发生的成分中去除；(3)相对于天然发现的物质通过人工修饰的任何物质；或(4)通过增加该物质相对于与其天然相关的其他组分的量而修饰的任何物质(例如，宿主细胞中的重组体产量；编码该物质的基因的多拷贝；以及使用比编码该物质的基因天然相关的启动子强的启动子)。

成熟多肽：术语“成熟多肽”意指呈其在翻译以及任何翻译后修饰之后的最终形式的多肽，所述修饰如N-末端加工、C-末端截断、糖基化、磷酸化等。在一个方面中，基于预测SEQ ID NO:2的氨基酸1至21是信号肽的SignalP 3.0程序(本特森(Bendtsen)等人，2004，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)340:783-795)，成熟多肽是SEQ ID NO:2的氨基酸22至286、SEQ ID NO:4的氨基酸22至305以及SEQ ID NO:6的氨基酸19至222。通过N-末端测序对此进一步证实，该测序显示成熟肽以ASGNGQS开始，这与SEQ ID NO:2的氨基酸1至21是信号肽的预测是一致的。通过N-末端测序对此进一步证实，该测序显示成熟肽以ADGKSTR开始，这与SEQ ID NO:4的氨基酸1至21是信号肽的预测是一致的。通过N-末端测序对此进一步证实，该测序显示成熟肽以QATGKTT开始，这与SEQ ID NO:6的氨基酸1至18是信号肽的预测是一致的。

在本领域中已知的是，宿主细胞可以产生由相同多核苷酸表达的两种或更多种不同成熟多肽(即，具有一个不同的C-末端和/或N-末端氨基酸)的混合物。本领域还已知，不同的宿主细胞不同地加工多肽，并且因此一个表达一种多核苷酸的宿主细胞当与另一个表达相同多核苷酸的宿主细胞相比时可以产生一种不同的成熟多肽(例如，具有一个不同的C末端和/或N末端氨基酸)。在一个方面中，一个成熟多肽包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6的成熟多肽的氨基酸数目的多达105％、110％和115％。

成熟多肽编码序列：术语“成熟多肽编码序列”意指编码具有内切葡聚糖酶活性的成熟多肽的多核苷酸。在一个方面中，基于预测SEQ ID NO:1的核苷酸1至63编码信号肽的SignalP 3.0程序(本特森(Bendtsen)等人，2004，见上文)，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:1的核苷酸64至985或其cDNA序列。在另一个方面中，基于预测SEQ ID NO:3的核苷酸1至63编码信号肽的SignalP 3.0程序(本特森(Bendtsen)等人，2004，见上文)，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:3的核苷酸64至1020或其cDNA序列。在另一个方面中，基于预测SEQ ID NO:5的核苷酸1至54编码信号肽的SignalP 3.0程序(本特森(Bendtsen)等人，2004，见上文)，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:5的核苷酸55至835或其cDNA序列。

中严格条件：术语“中严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和35％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用0.2X SSC、0.2％SDS，在55℃下洗涤三次，每次15分钟。

中-高严格条件：术语“中-高严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和35％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用0.2X SSC、0.2％SDS，在60℃下洗涤三次，每次15分钟。

核酸构建体：术语“核酸构建体”意指单链或双链的一种核酸分子，该核酸分子是从天然发生的基因中分离的，或者以一种本来不存在于自然界中的方式被修饰成含有核酸的区段，或者是合成的，该核酸分子包括一个或多个控制序列。

可操作地连接：术语“可操作地连接”意指如下的构造，其中，控制序列相对于多核苷酸的编码序列安置在适当位置处，从而使得该控制序列指导该编码序列的表达。

序列一致性：两个氨基酸序列之间或者两个核苷酸序列之间的关联度通过参数“序列一致性”来描述。

出于本发明的目的，使用尼德曼-翁施(Needleman-Wunsch)算法(尼德曼和翁施，1970，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)48:443-453)来确定两个氨基酸序列之间的序列一致性，该算法是如EMBOSS软件包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件(The European Molecular Biology Open Software Suite)，赖斯(Rice)等人，2000，遗传学趋势(Trends Genet.)16:276-277)(优选5.0.0版或更新版本)的尼德尔(Needle)程序所实施的。使用的这些参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5，以及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。尼德尔标注的“最长的一致性”的输出(使用-非简化选项获得)被用作百分比一致性，并且如下计算：

(一致的残基X 100)/(比对长度-比对中的空位总数)

出于本发明的目的，使用尼德曼-翁施算法(尼德曼和翁施，1970，同上)确定两个脱氧核糖核苷酸序列之间的序列一致性，该算法是如EMBOSS软件包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件，赖斯等人，2000，同上)(优选5.0.0版或更新版本)的尼德尔程序所实施的。使用的这些参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5以及EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版本)取代矩阵。尼德尔标注的“最长的一致性”的输出(使用-非简化选项获得)被用作百分比一致性，并且如下计算：

(一致的脱氧核糖核苷酸X 100)/(比对长度-比对中的空位总数)

子序列：术语“子序列”意指使一个或多个(例如，若干个)核苷酸从成熟多肽编码序列的5'端和/或3'端缺失的多核苷酸；其中该子序列编码具有内切葡聚糖酶活性的片段。

变体：术语“变体”意指在一个或多个(例如，若干个)位置处包括改变(即，取代、插入和/或缺失)的具有内切葡聚糖酶活性的多肽。取代意指用一个不同氨基酸置换占用一个位置的氨基酸；缺失意指去除占据一个位置的氨基酸；并且插入意指邻近于占据一个位置的氨基酸添加一个或多个(例如，若干个)氨基酸(例如，1-5个氨基酸)。

非常高严格条件：术语“非常高严格条件”是指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用0.2X SSC、0.2％SDS，在70℃下洗涤三次，每次15分钟。

纺织品：在此使用术语“纺织品”意在包括含有纤维、纱线、织物以及服装。

织物可以通过机织(weaving)、针织(knitting)或非纺织操作自纤维形成。机织和针织需要纱线作为输入(input),而非纺织物是随机连接纤维的结果(可以把纸张看作非纺织的)。在本上下文中，术语“织物”也旨在包括纤维和其他类型的已加工织物。

根据本发明，本发明的方法可以应用于本领域已知的任何纺织品(机织的、针织的或非纺织的)。具体而言，本发明的方法可以应用于含纤维素的纺织品或纤维素纺织品，如棉、粘胶、人造纤维、苎麻、亚麻、莱赛尔纤维(lyocell)(例如，由考陶尔兹纤维公司(Courtaulds Fibers)生产的天丝棉(Tencel)或其混合物，或这些纤维与合成纤维(例如，聚酯、聚酰胺、尼龙)或其他天然纤维(如羊毛和蚕丝)一起的混合物，如粘胶/棉混纺物(blend)、莱赛尔纤维/棉混纺物、粘胶/羊毛混纺物、莱赛尔纤维/羊毛混纺物、棉/羊毛混纺物；亚麻(flax/linen)、苎麻以及其他基于纤维素纤维的织物，包括纤维素纤维与其他纤维(如羊毛、聚酰胺、丙烯酸纤维以及聚酯纤维)的所有混纺物，例如粘胶/棉/聚酯混纺物、羊毛/棉/聚酯混纺物、亚麻/棉混纺物等。

发明详细说明

具有内切葡聚糖酶活性的多肽

在一个实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少80％，例如至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列一致性的分离的多肽，这些分离的多肽具有内切葡聚糖酶活性。在一个实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:4的成熟多肽具有至少85％，例如至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列一致性的分离的多肽，这些分离的多肽具有内切葡聚糖酶活性。在一个实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:6的成熟多肽具有至少85％，例如至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列一致性的分离的多肽，这些分离的多肽具有内切葡聚糖酶活性。在一个方面中，这些多肽与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6的成熟多肽相差多达10个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸。

本发明的多肽优选地包括SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6的氨基酸序列或其等位基因变体或由其组成；或是其具有内切葡聚糖酶活性的片段。在另一个方面中，该多肽包括SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6的成熟多肽或由其组成。在另一个方面中，该多肽包括SEQ ID NO:2的氨基酸22至286、SEQ ID NO:4的氨基酸22至305或SEQ ID NO:6的氨基酸19至222或由其组成。在另一个实施例中，本发明涉及由以下多核苷酸编码的具有内切葡聚糖酶活性的一种分离的多肽，该多核苷酸在中严格条件、中-高严格条件、高严格条件或非常高严格条件下与(i)SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5的成熟多肽编码序列，(ii)其cDNA序列或(iii)(i)或(ii)的全长互补体杂交(萨姆布鲁克(Sambrook)等人，1989，分子克隆实验指南(Molecular Cloning,A Laboratory Manual)，第二版，冷泉港(Cold Spring Harbor)，纽约)。

可以使用SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5或其子序列，以及SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6的多肽或其片段来设计核酸探针，以便根据本领域熟知的方法鉴定和克隆编码来自不同属或种的菌株的具有内切葡聚糖酶活性的多肽的DNA。具体而言，可以根据标准DNA印迹程序，使用这类探针与感兴趣的细胞的基因组DNA或cDNA杂交，以便鉴别和分离其中的对应基因。这样的探针可以大大短于整个序列，但是长度应该为至少15个，例如至少25个、至少35个或至少70个核苷酸。优选地，核酸探针的长度为至少100个核苷酸，例如长度为至少200个核苷酸、至少300个核苷酸、至少400个核苷酸、至少500个核苷酸、至少600个核苷酸、至少700个核苷酸、至少800个核苷酸、或至少900个核苷酸。DNA和RNA探针两者都可使用。典型地将探针进行标记，用于检测相应的基因(例如，用³²P、³H、³⁵S、生物素或抗生物素蛋白)。本发明涵盖此类探针。

可以针对与以上描述的探针杂交并且编码具有内切葡聚糖酶活性的多肽的DNA，对从这类其他菌株制备的基因组DNA或cDNA库进行筛选。来自这类其他菌株的基因组DNA或其他DNA可以通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳，或其他分离技术来分离。来自文库的DNA或分离的DNA可转移到并固定在硝酸纤维素或其他适合的载体材料上。为了鉴定与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5或其子序列杂交的克隆或DNA，将该载体材料用于DNA印迹中。

出于本发明的目的，杂交指示该多核苷酸在非常低至非常高严格条件下与对应于以下各项的经过标记的核酸探针杂交：(i)SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5；(ii)SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5的成熟多肽编码序列；(iii)其cDNA序列；(iv)其全长互补体；或(v)其子序列。在这些条件下与该核酸探针杂交的分子可以使用例如X射线薄膜或本领域中已知的任何其他检测手段进行检测。

在一个方面中，该核酸探针是编码SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6的多肽；其成熟多肽；或其片段的多核苷酸。在另一个方面中，该核酸探针是SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5或其cDNA序列。

在另一个实施例中，本发明涉及一种具有内切葡聚糖酶活性的分离的多肽，该分离的多肽由以下多核苷酸编码，该多核苷酸与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5的成熟多肽编码序列或其cDNA序列具有至少80％，例如至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列一致性。

在另一个实施例中，本发明涉及SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6的成熟多肽的变体，这些变体在一个或多个(例如，若干个)位置处包括取代、缺失和/或插入。在一个实施例中，引入SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6的成熟多肽中的氨基酸取代、缺失和/或插入的数目多达10个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个。这些氨基酸变化可以具有微小性质，即，不会显著地影响蛋白质的折叠和/或活性的保守氨基酸取代或插入；典型地1-30个氨基酸的小缺失；小的氨基或羧基末端延伸，如氨基末端的甲硫氨酸残基；多达20-25个残基的小接头肽；或便于通过改变净电荷或另一种功能来纯化的小延伸，如聚组氨酸段(tract)、抗原表位或结合结构域。

保守取代的实例是在下组的范围内：碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸及组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸及缬氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸及酪氨酸)及小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸及甲硫氨酸)。一般不会改变比活性的氨基酸取代是本领域已知的并且例如由H.诺伊拉特(Neurath)和R.L.希尔(Hill)，1979，在蛋白质(The Proteins)，学术出版社(Academic Press)，纽约中描述。常见取代是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu、和Asp/Gly。

可替代地，氨基酸改变具有这样一种性质：改变多肽的物理化学特性。例如，氨基酸改变可以提高多肽的热稳定性、改变底物特异性、改变最适pH，等等。

可以根据本领域已知的程序来鉴定多肽中的必需氨基酸，例如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(坎宁安(Cunningham)和威尔斯(Wells)，1989，科学(Science)244:1081-1085)。在后一项技术中，在该分子中的每个残基处引入单个丙氨酸突变，并且对所得突变体分子的内切葡聚糖酶活性进行测试以鉴定对于该分子的活性至关重要的氨基酸残基。还参见，希尔顿(Hilton)等人，1996，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)271:4699-4708。也可结合假定接触位点氨基酸的突变，如通过以下技术例如核磁共振、结晶学、电子衍射、或光亲和标记进行确定的对结构进行物理学分析，从而确定酶的活性位点或其他生物学相互作用。参见例如德福斯(de Vos)等人，科学255:306-312；史密斯(Smith)等人，1992，分子生物学杂志224:899-904；沃勒达尔(Wlodaver)等人，1992，欧洲生物化学学会联盟通讯(FEBS Lett.)309:59-64。还可以从与相关多肽的比对来推断鉴别必需氨基酸。

使用已知的诱变、重组和/或改组方法、随后进行一个相关的筛选程序可以做出单一或多种氨基酸取代、缺失和/或插入并对其进行测试，这些相关的筛选程序例如由瑞德哈尔-奥尔森(Reidhaar-Olson)和萨奥尔(Sauer)，1988，科学(Science)241:53-57；鲍依(Bowie)和萨奥尔，1989，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)86:2152-2156；WO 95/17413；或WO 95/22625所描述的那些。可以使用的其他方法包括：易错PCR、噬菌体展示(例如，洛曼(Lowman)等人，1991，生物化学(Biochemistry)30:10832-10837；美国专利号5,223,409；WO 92/06204)以及区域定向诱变(德比希尔(Derbyshire)等人，1986，基因(Gene)46:145；内尔(Ner)等人，1988，DNA 7:127)。

诱变/改组方法可以与高通量自动筛选方法组合，以检测由宿主细胞表达的克隆的经诱变处理的多肽的活性(Ness(内斯)等人，1999，Nature Biotechnology(《自然生物技术》)17:893-896)。编码活性多肽的诱变的DNA分子可以回收自宿主细胞，并且使用本领域的标准方法对其进行迅速测序。这些方法允许迅速确定多肽中单个氨基酸残基的重要性。

多肽可以是杂合多肽，其中一个多肽的区域融合在另一多肽的区域的N末端或C末端。

多肽还可以是融合多肽或可切割的融合多肽，其中另一多肽融合在本发明的多肽的N-末端或C-末端。通过将编码另一多肽的多核苷酸融合到本发明的多核苷酸而产生融合多肽。用于产生融合多肽的技术在本领域是已知的，并包括连接编码多肽的编码序列，这样使得它们在框内并且使得融合多肽的表达处于相同的一个或多个启动子和终止子的控制下。融合多肽还可以使用内含肽技术构建，其中融合多肽在翻译后产生(库珀(Cooper)等人，1993，欧洲分子生物学学会杂志 (EMBO J.)12:2575-2583；道森(Dawson)等人，1994，科学(Science)266:776-779)。

融合多肽可以在两个多肽之间进一步包括一个切割位点。在融合蛋白分泌之时，该位点被切割，从而释放出这两个多肽。切割位点的实例包括但不限于以下各项中披露的位点：马丁(Martin)等人，2003，工业微生物学与生物技术杂志(J.Ind.Microbiol.Biotechnol.)3:568-576；斯韦蒂纳(Svetina)等人，2000，生物技术杂志(J.Biotechnol.)76:245-251；拉斯马森(Rasmussen)-威尔逊(Wilson)等人，1997，应用环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)63:3488-3493；华德(Ward)等人，1995，生物技术(Biotechnology)13:498-503；以及孔特拉斯(Contreras)等人，1991，生物技术9:378-381；伊顿(Eaton)等人，1986，生物化学(Biochemistry)25:505-512；柯林斯(Collins)-莱斯(Racie)等人，1995，生物技术13:982-987；卡特(Carter)等人，1989，蛋白质：结构、功能和遗传学(Proteins:Structure，Function，and Genetics)6:240-248；以及史蒂文斯(Stevens)，2003，世界药物发现(Drug Discovery World)4:35-48。

具有内切葡聚糖酶活性的多肽的来源

本发明的具有内切葡聚糖酶活性的多肽可以从任何属的微生物获得。出于本发明的目的，如在此结合一种给定的来源使用的术语“从...中获得”应意指由多核苷酸编码的多肽是由该来源或者由其中已经插入来自该来源的多核苷酸的一种菌株产生的。在一个方面中，获得自给定来源的多肽被分泌到细胞外。

该多肽可以是一种真菌多肽。例如，该多肽可以是一种腐质霉属多肽。

在另一个方面中，该多肽是一种透明嗜热腐质霉、灰腐质酶、柔毛腐质霉或特异腐质霉多肽。

在另一个方面中，该多肽是一种梭孢壳属多肽，例如赫坎梭孢壳、附着梭孢壳(Thielavia appendiculata)、沙生梭孢壳(Thielavia arenaria)、澳洲梭孢壳(Thielavia australiensis)、基生梭孢壳(Thielavia basicola)、Thielavia coactilis、纽西兰梭孢壳(Thielavia dacrydioides)、脆梭孢壳(Thielavia fragilis)、异宗梭孢壳(Thielavia heterothallica)、Thielavia hyalocarpa、赫坎梭孢壳、不均梭孢壳(Thielavia inaequalis)、居间梭孢壳(Thielavia intermedia)、Thielavia kuwaitensis、小孢梭孢壳(Thielavia microspora)、微小梭孢壳(Thielavia minuta)、Thielavia ovispora、Thielavia pallidospora、秘鲁梭孢壳(Thielavia peruviana)、亚嗜热梭孢壳(Thielavia subthermophila)、土生梭孢壳、栖土梭孢壳(Thielavia terricola)、扭曲梭孢壳(Thielavia tortuosa)或Thielavia wareingii多肽。将理解的是，对于以上提到的物种而言，本发明涵盖完全状态和不完全状态(perfect and imperfect states)二者、以及其他分类学等效物，例如无性型，而不管它们已知的物种名称是什么。本领域的普通技术人员将容易地识别适当等效物的身份。

这些物种的菌株可以容易地在许多培养物保藏中心为公众所获得，如美国典型培养物保藏中心(ATCC)、德国微生物菌种保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，DSMZ)、荷兰菌种保藏中心(Centraalbureau Voor Schimmelcultures，CBS)、以及美国农业研究菌种保藏中心北方地区研究中心(NRRL)。

可以使用以上提到的探针从其他来源，包括从自然界(例如，土壤、堆肥、水等等)分离的微生物或直接从自然材料(例如，土壤、堆肥、水等等)获得的DNA样品鉴定和获得该多肽。用于从自然生活环境中直接分离微生物和DNA的技术是本领域熟知的。然后可以通过类似地筛选另一微生物的基因组DNA或cDNA文库或混合的DNA样品来获得编码该多肽的多核苷酸。一旦用一种或多种探针检测到编码多肽的多核苷酸，就可以通过使用本领域普通技术人员已知的技术分离或克隆该多核苷酸(参见例如，萨姆布鲁克(Sambrook)等人，1989，同上)。

催化结构域

在一个实施例中，本发明还涉及与SEQ ID NO:2的氨基酸22至237具有至少85％，例如至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性的催化结构域。在一个实施例中，本发明还涉及与SEQ ID NO:4的氨基酸22至223具有至少90％，例如至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性的催化结构域。在一个实施例中，本发明还涉及与SEQ ID NO:6的氨基酸21至222具有至少85％，例如至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性的催化结构域。在一个方面中，这些催化结构域包括的氨基酸序列与SEQ ID NO:2的氨基酸22至237、SEQ ID NO:4的氨基酸22至223或SEQ ID NO:6的氨基酸21至222相差多达10个(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个)氨基酸。

这些催化结构域优选地包括SEQ ID NO:2的氨基酸22至237、SEQ ID NO:4的氨基酸22至223或SEQ ID NO:6的氨基酸21至222或其等位基因变体或由其组成；或是其具有内切葡聚糖酶活性的片段。

在另一个实施例中，本发明还涉及由以下多核苷酸编码的催化结构域，这些多核苷酸在中严格条件、中-高严格条件、高严格条件或非常高严格条件(如上所定义)下与(i)SEQ ID NO:1的核苷酸64至838、SEQ ID NO:3的核苷酸64至774或SEQ ID NO:5的核苷酸61至835，(ii)其cDNA序列或(iii)(i)或(ii)的全长互补体杂交(萨姆布鲁克(Sambrook)等人，1989，见上文)。

在另一个实施例中，本发明还涉及由以下多核苷酸编码的催化结构域，这些多核苷酸与SEQ ID NO:1的核苷酸64至838、SEQ ID NO:3的核苷酸64至774或SEQ ID NO:5的核苷酸61至835或其cDNA序列具有至少85％，例如至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性。

编码该催化结构域的多核苷酸优选地包括SEQ ID NO:1的核苷酸64至838、SEQ ID NO:3的核苷酸64至774或SEQ ID NO:5的核苷酸61至835或由其组成或者是包含在pGH45_Hya8473或pGH45_Thihy3331或pGH45_Thihy0507中的序列。

在另一个实施例中，本发明还涉及SEQ ID NO:2的氨基酸22至237或SEQ ID NO:4的氨基酸22至223或SEQ ID NO:6的氨基酸21至222的催化结构域变体，这些变体在一个或多个(例如，若干个)位置处包括取代、缺失和/或插入。在一个方面中，引入SEQ ID NO:2的氨基酸22至237、SEQ ID NO:4的氨基酸22至223或SEQ ID NO:6的氨基酸21至222的序列中的氨基酸取代、缺失和/或插入的数目多达 10个，例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、8个、9个、或10个。

结合结构域

在一个实施例中，本发明还涉及与SEQ ID NO:2的氨基酸250至286具有至少80％，例如至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性的碳水化物结合模块。在一个实施例中，本发明还涉及与SEQ ID NO:4的氨基酸268至305具有至少85％，例如至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性的碳水化物结合模块。在一个方面中，这些碳水化物结合模块包括的氨基酸序列与SEQ ID NO:2的氨基酸250至286或SEQ ID NO:4的氨基酸268至305相差多达10个(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个)氨基酸。

该碳水化物结合模块优选地包括SEQ ID NO:2的氨基酸250至286或SEQ ID NO:4的氨基酸268至305或其等位基因变体或由其组成；或是其具有碳水化物结合活性的片段。

在另一个实施例中，本发明还涉及由以下多核苷酸编码的碳水化物结合模块，这些多核苷酸在中严格条件、中-高严格条件、高严格条件或非常高严格条件(如上所定义)下与(i)SEQ ID NO:1的核苷酸875至985或SEQ ID NO:3的核苷酸907至1020，(ii)其cDNA序列或(iii)(i)或(ii)的全长互补体杂交(萨姆布鲁克(Sambrook)等人，1989，见上文)。

在另一个实施例中，本发明还涉及由以下多核苷酸编码的碳水化物结合模块，这些多核苷酸与SEQ ID NO:1的核苷酸875至985具有至少80％，例如至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性。

编码该碳水化物结合模块的多核苷酸优选地包括SEQ ID NO:1的核苷酸875至985或由其组成或是包含在质粒pGH45_Hya8473中的序列。

在另一个实施例中，本发明还涉及由以下多核苷酸编码的碳水化物结合模块，这些多核苷酸与SEQ ID NO:3的核苷酸907至1020具有至少85％，例如至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性。

编码该碳水化物结合模块的多核苷酸优选地包括SEQ ID NO:3的核苷酸907至1020或由其组成或是包含在质粒pGH45_Thihy3331中的序列。

在另一个实施例中，本发明还涉及SEQ ID NO:2的氨基酸250至286或SEQ ID NO:4的氨基酸268至305的碳水化物结合模块变体，这些变体在一个或多个(例如，若干个)位置处包括取代、缺失和/或插入。在一个方面中，引入SEQ ID NO:2的氨基酸250到286的序列中的氨基酸取代、缺失和/或插入的数目多达10个，例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、8个、9个、或10个。

可操作地连接至该碳水化物结合模块的催化结构域可以来自水解酶、异构酶、连接酶、裂解酶、氧化还原酶或转移酶，例如氨肽酶、淀粉酶、碳水化物酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质酶、环糊精葡萄糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、内切葡聚糖酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、变聚糖酶、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、木聚糖酶或β-木糖苷酶。编码催化结构域的多核苷酸可以从任何原核、真核或其他来源获得。

多核苷酸

本发明还涉及编码如在此所述的本发明的多肽、催化结构域或碳水化物结合模块的分离的多核苷酸。

用于分离或克隆多核苷酸的技术是本领域中已知的并且包括从基因组DNA或cDNA，或其组合进行分离。可以例如通过使用熟知的聚合酶链反应(PCR)或表达文库的抗体筛选来检测具有共有结构特征的克隆DNA片段，实现从基因组DNA克隆多核苷酸。参见例如，伊尼斯(Innis)等人，1990，PCR：方法和应用指南(PCR:A Guide to Methods and Application)，学术出版社(Academic Press)，纽约。可以使用其他核酸扩增程序例如连接酶链式反应(LCR)、连接激活转录(LAT)和基于多核苷酸的扩增(NASBA)。这些多核苷酸可以由腐质霉属菌株或相关生物体克隆，并且因此，例如可以是该多核苷酸的多肽编码区的等位基因或物种变体。

编码本发明多肽的多核苷酸的修饰对于合成实质上类似于该多肽的多肽可能是必需的。术语“实质上类似”于该多肽是指该多肽的非天然发生的形式。这些多肽在一些工程化方式方面可以不同于从其天然来源分离的多肽，例如具体活性、热稳定性、pH最佳值等方面不同的变体。这些变体可以基于以SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5的成熟多肽编码序列或其cDNA序列(例如其子序列)形式呈现的多核苷酸，和/或通过引入不会改变该多肽的氨基酸序列，但对应于预定用于产生该酶的宿主生物体的密码子用法的核苷酸取代，或通过引入可以产生不同氨基酸序列的核苷酸取代来构建。对于核苷酸取代的一般描述，参见例如，福德(Ford)等，1991，蛋白质表达与纯化(Protein Expression and Purification)2:95-107。

核酸构建体

本发明还涉及核酸构建体，这些核酸构建体包括可操作地连接至一个或多个控制序列的本发明的多核苷酸，在与控制序列相容的条件下，这些控制序列指导编码序列在合适的宿主细胞中的表达。

该多核苷酸可以按各种方式操纵以提供该多肽的表达。取决于表达载体，在其插入载体以前操纵多核苷酸可以是希望的或必需的。用于利用重组DNA方法修饰多核苷酸的技术是本领域熟知的。

该控制序列可以是一个启动子，即，被宿主细胞识别以对编码本发明多肽的多核苷酸进行表达的一种多核苷酸。该启动子包含转录控制序列，这些序列介导了该多肽的表达。该启动子可以是在宿主细胞中显示出转录活性的任何多核苷酸，包括突变型、截短型及杂合型启动子，并且可以是由编码与该宿主细胞同源或异源的细胞外或细胞内多肽的基因获得。

在细菌宿主细胞中，适合指导本发明的核酸构建体转录的启动子的实例是获得自以下各项的启动子：解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因 (amyQ)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、嗜热脂肪芽孢杆菌麦芽淀粉酶基因(amyM)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因、苏云金芽孢杆菌cryIIIA基因(阿盖斯(Agaisse)和里瑞克拉斯(Lereclus),1994，分子微生物学(Molecular Microbiology)13:97-107)、大肠杆菌lac操纵子、大肠杆菌trc启动子(埃贡(Egon)等人，1988，基因)69:301-315)，天蓝链霉菌琼脂酶基因(dagA)、和原核β-内酰胺酶基因(维拉-卡玛诺夫(Villa-Kamaroff)等人，1978，美国国家科学院院刊75:3727-3731)、连同tac启动子(德波尔(DeBoer)等人，1983，美国国家科学院院刊80:21-25)。另外的启动子描述于“来自重组细菌的有用蛋白(Useful proteins from recombinant bacteria)”，吉尔伯特(Gilbert)等人，1980，科学美国人(Scientific American)，242:74-94；以及萨姆布鲁克等人，1989，同上。串联启动子的实例披露在WO 99/43835中。

用于指导本发明的核酸构建体在丝状真菌宿主细胞中的转录的合适启动子的实例是从以下各项的基因获得的启动子：构巢曲霉乙酰胺酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、米曲霉TAKA淀粉酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶(WO 96/00787)、镶片镰孢淀粉葡糖苷酶(WO 00/56900)、镶片镰孢Daria(WO 00/56900)、镶片镰孢Quinn(WO 00/56900)、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)脂肪酶、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉木聚糖酶III、里氏木霉β-木糖苷酶、以及里氏木霉翻译延长因子，以及NA2tpi启动子(一种修饰的启动子，其来自曲霉属中性α-淀粉酶基因，其中未翻译的前导子由曲霉属丙糖磷酸异构酶基因的未翻译的前导子替代；非限制性实例包括修饰的启动子，其来自黑曲霉中性α-淀粉酶的基因，其中未翻译的前导子由构巢曲霉或米曲霉丙糖磷酸异构酶基因的未翻译的前导子替代)；及其突变型启动子、截短型启动子以及杂合型启动子。其他启动子描述于美国专利号6,011,147中。

在酵母宿主中，有用的启动子获得自以下各项的基因：酿酒酵母烯醇酶(ENO-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母醇去氢酶/甘油醛-3-磷酸去氢酶(ADH1、ADH2/GAP)、酿酒酵母丙糖磷酸异构酶(TPI)、酿酒酵母金属硫蛋白(CUP1)、以及酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。罗马诺斯(Romanos)等人，1992，酵母(Yeast)8:423-488描述了酵母宿主细胞的其他有用的启动子。

控制序列还可以是由宿主细胞识别以终止转录的一种转录终止子。该终止子可操作地连接到编码该多肽的多核苷酸的3'-末端。在该宿主细胞中起作用的任何终止子都可以用于本发明中。

用于细菌宿主细胞的优选终止子获得自克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprH)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(amyL)、以及大肠杆菌核糖体RNA(rrnB)的基因。

用于丝状真菌宿主细胞的优选终止子是从以下各项的基因获得：构巢曲霉乙酰胺酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉木聚糖酶III、里氏木霉β-木糖苷酶、以及里氏木霉翻译延长因子。

酵母宿主细胞的优选终止子是从以下各项的基因中获得的：酿酒酵母烯醇酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)、以及酿酒酵母甘油醛-3-磷酸去氢酶。Romanos(罗马诺斯)等人，1992，同上，描述了酵母宿主细胞的其他有用的终止子。

控制序列还可以是启动子下游和基因的编码序列上游的mRNA稳定子区，其增加该基因的表达。

适合的mRNA稳定区的实例是从以下获得的：苏云金芽孢杆菌cryIIIA基因(WO 94/25612)和枯草芽孢杆菌SP82基因(化(Hue)等人，1995，细菌学杂志(Journal of Bacteriology)177:3465-3471)。

该控制序列还可以是一个前导子，一种对宿主细胞翻译很重要的非翻译mRNA区域。该前导子可操作地连接到编码该多肽的多核苷酸的5'-末端。可以使用在宿主细胞中具有功能的任何前导子。

用于丝状真菌宿主细胞的优选前导子是从米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶的基因获得。

酵母宿主细胞的适合的前导子获得自以下各项的基因：酿酒酵母烯醇酶(ENO-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α-因子和酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)。

控制序列还可以是一种聚腺苷酸化序列，可操作地连接至该多核苷酸的3’-末端并且当转录时由宿主细胞识别为将聚腺苷酸残基添加至所转录的mRNA的信号的序列。可以使用在宿主细胞中起作用的任何聚腺苷酸化序列。

用于丝状真菌宿主细胞的优选聚腺苷酸化序列是从以下各项的基因获得：构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶、以及尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶。

有用于酵母宿主细胞的聚腺苷酸化序列在郭(Guo)和谢尔曼(Sherman)，1995，分子细胞生物学(Mol.Cellular Biol.)15:5983-5990中描述。

控制序列还可以是编码连接至多肽的N-末端的信号肽并指导该多肽进入细胞的分泌途径的信号肽编码区域。该多核苷酸的编码序列的5’端可以固有地包含在翻译读码框内与编码该多肽的编码序列的区段天然地连接的信号肽编码序列。可替代地，编码序列的5’端可以包含对编码序列而言是外源的信号肽编码序列。在编码序列不天然地包含信号肽编码序列的情况下，可能需要外源信号肽编码序列。可替代地，外源信号肽编码序列可简单地替换天然的信号肽编码序列以便增强该多肽的分泌。然而，可以使用指导所表达多肽进入宿主细胞的分泌通路的任何信号肽编码序列。

细菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是从以下各项的基因中获得的信号肽编码序列：芽孢杆菌NCIB 11837麦芽淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶、地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT、nprS、nprM)、以及枯草芽孢杆菌prsA。西蒙纳(Simonen)和帕尔瓦(Palva)，1993，微生物学评论(Microbiological Reviews)57:109-137描述了另外的信号肽。

用于丝状真菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是获得自以下项的基因的信号肽编码序列：黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶、特异腐质霉纤维素酶、特异腐质霉内切葡聚糖酶V、柔毛腐质霉脂肪酶以及米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶。

对于酵母宿主细胞有用的信号肽获得自以下项的基因：酿酒酵母α-因子和酿酒酵母转化酶。罗马诺斯(Romanos)等人，1992，同上，描述了其他有用的信号肽编码序列。

控制序列还可以是编码位于多肽的N-末端的前肽的前肽编码序列。生成的多肽被称为前体酶(proenzyme)或多肽原(或者在一些情况下被称为酶原(zymogen))。多肽原通常是无活性的并且可以通过从该多肽原上催化切割或自动催化切割前肽而被转化成一种活性多肽。前肽编码序列可以从以下各项的基因中获得：枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、嗜热毁丝霉漆酶(WO 95/33836)、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、以及酿酒酵母α-因子。

当信号肽和前肽序列同时存在时，前肽序列的位置紧邻于多肽的N-末端，且信号肽序列的位置紧邻于前肽序列的N-末端。

还可能希望地是添加调节序列，这些调控序列相对于宿主细胞的生长来调节多肽的表达。调节序列的实例是使得基因的表达响应于化学或物理刺激(包括调控化合物的存在)而开启或关闭的那些序列。在原核系统中的调节序列包括lac、tac、以及trp操纵基因系统。在酵母中，可以使用ADH2系统或GAL1系统。在丝状真菌中，可以使用黑曲霉葡糖淀粉酶启动子、米曲霉TAKA α-淀粉酶启动子和米曲霉葡糖淀粉酶启动子、里氏木霉纤维二糖水解酶I启动子、以及里氏木霉纤维二糖水解酶II启动子。调节序列的其他实例是允许基因扩增的那些。在真核系统中，这些调节序列包括在甲氨蝶呤存在下被扩增的二氢叶酸还原酶基因以及用重金属扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况中，编码多肽的多核苷酸将与调节序列可操作地连接。

表达载体

本发明还涉及包括本发明的多核苷酸、启动子、以及转录和翻译终止信号的重组表达载体。不同的核苷酸和控制序列可以连接在一起以产生一个重组表达载体，这一重组表达载体可以包括一个或多个便利的限制酶切位点以允许在这些位点处插入或取代编码该变体的多核苷酸。可替代地，该多核苷酸可以通过将该多核苷酸或包括该多核苷酸的核酸构建体插入用于表达的适当载体中来表达。在产生该表达载体时，该编码序列是位于该载体中，这样使得该编码序列与该供表达的适当控制序列可操作地连接。

重组表达载体可以是可便利地经受重组DNA程序并且可引起多核苷酸表达的任何载体(例如，质粒或病毒)。载体的选择将典型地取决于该载体与有待引入该载体的宿主细胞的相容性。该载体可以是一种线性的或闭合的环状质粒。

载体可以是自主复制载体，即，作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如，质粒、染色体外元件、微染色体、或人工染色体。该载体可以包含用于确保自我复制的任何装置。可替代地，该载体可以是这样一种载体，当它被引入该宿主细胞中时，被整合到基因组中并且与其中已整合了它的一个或多个染色体一起复制。此外，可以使用单一载体或质粒或两个或更多个载体或质粒(这些载体或质粒共同包含有待引入到宿主细胞的基因组中的总DNA)或转座子。

该载体优选包含允许容易选择转化细胞、转染细胞、转导细胞或类似细胞的一个或多个选择性标记。选择性标记是一种基因，该基因的产物提供了杀生物剂抗性或病毒抗性、重金属抗性、营养缺陷型的原养型、等。

细菌性选择性标记的实例是地衣芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌dal基因，或赋予抗生素抗性(例如氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素、新霉素、大观霉素或四环素抗性)的标记。用于酵母宿主细胞的适合的标记包括但不限于ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1、以及URA3。用于在丝状真菌宿主细胞中使用的选择性标记包括但不局限于adeA(磷酸核糖酰氨基咪唑-琥珀羧胺合酶)、adeB(磷酸核糖酰-氨基咪唑合酶)、amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(草丁膦乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)、pyrG(乳清酸核苷-5'磷酸脱羧酶)、sC(硫酸腺苷基转移酶)、以及trpC (邻氨基苯甲酸合酶)、连同其等效物。优选在曲霉属细胞中使用的是构巢曲霉或米曲霉amdS和pyrG基因以及吸水链霉菌bar基因。优选在木霉细胞中使用的是adeA、adeB、amdS、hph、和pyrG基因。

选择性标记可以是在W0 2010/039889中描述的双选择性标记系统。在一个方面，双选择性标记是hph-tk双选择性标记系统。

载体优选含有允许载体整合到宿主细胞的基因组中或载体在细胞中独立于基因组自主复制的一个或多个元件。

用于整合到宿主细胞基因组中，该载体可以依赖于编码多肽的多核苷酸的序列或该载体中通过同源或非同源重组而整合到该基因组中的任何其他元件。可替代地，该载体可以包含用于指导通过同源重组而整合到宿主细胞基因组中的一个或多个染色体中的一个或多个精确位置处的另外的多核苷酸。为了增加在精确位置处整合的可能性，这些整合的元件应包含足够数量的核酸，例如100至10,000个碱基对、400至10,000个碱基对、以及800至10,000个碱基对，这些碱基对与对应的靶序列具有高度的序列一致性以提高同源重组的可能性。这些整合元件可以是与宿主细胞的基因组内的靶序列同源的任何序列。此外，这些整合元件可以是非编码多核苷酸或编码多核苷酸。另一方面，该载体可以通过非同源重组整合到宿主细胞的基因组中。

对于自主复制，载体可以进一步包含使该载体能够在所讨论的宿主细胞中自主复制的复制起点。复制起点可以是在细胞中起作用的介导自主复制的任何质粒复制子。术语“复制起点”或“质粒复制子”意指使质粒或载体能够在体内复制的多核苷酸。

细菌的复制起点的实例是允许在大肠杆菌内进行复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177、以及pACYC184以及允许在芽孢杆菌内进行复制的pUB110、pE194、pTA1060、以及pAMβ1的复制起点。

用于在酵母宿主细胞中使用的复制起点的实例是2微米复制起点ARS1、ARS4、ARS1与CEN3的组合、以及ARS4与CEN6的组合。

在丝状真菌细胞中有用的复制起点的实例是AMA1和ANS1(格姆斯(Gems)等人，1991，基因(Gene)98:61-67；卡伦(Cullen)等人，1987，核酸研究(Nucleic Acids Res.)15:9163-9175；WO 00/24883)。AMA1基因的分离和包括该基因的质粒或载体的构建可根据WO 00/24883披露的方法完成。

可以将本发明的多核苷酸的多于一个的拷贝插入到宿主细胞中以增加多肽的产生。通过将序列的至少一个另外的拷贝整合到宿主细胞基因组中或者通过包含一个与该多核苷酸一起的可扩增的选择性标记基因可以获得多核苷酸的增加的拷贝数目，其中通过在适当的选择性试剂的存在下培养细胞可以选择包含选择性标记基因的经扩增的拷贝的细胞、以及由此该多核苷酸的另外的拷贝。

用于连接上述元件以构建本发明的重组表达载体的程序对于本领域普通技术人员而言是熟知的(参见，例如萨拉布鲁克(Sambrook)等人，1989，同上)。

宿主细胞

本发明还涉及重组宿主细胞，这些重组宿主细胞包括本发明的多核苷酸，该多核苷酸可操作地连接至一个或多个控制序列，该一个或多个控制序列指导本发明的多肽的产生。将包含多核苷酸的构建体或载体引入到宿主细胞中，这样使得该构建体或载体被维持作为染色体整合体或作为自主复制的染色体外载体，如早前所描述。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间发生的突变与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。宿主细胞的选择在很大程度上取决于编码该多肽的基因及其来源。

该宿主细胞可以是有用于重组产生本发明的多肽的任何细胞，例如原核细胞或真核细胞。

原核宿主细胞可以是任何革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。革兰氏阳性细菌包括但不限于芽孢杆菌属、梭菌属、肠球菌属、土芽孢杆菌属、乳酸杆菌属、乳球菌属、海洋芽孢杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属以及链霉菌属。革兰氏阴性细菌包括但不限于弯曲杆菌属、大肠杆菌、黄杆菌属、梭杆菌属、螺杆菌属、泥杆菌属、奈瑟氏菌属、假单孢菌属、沙门氏菌属、以及脲原体属。

细菌宿主细胞可以是任何芽孢杆菌的细胞，包括但不限于嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、以及苏云金芽孢杆菌的细胞。

细菌宿主细胞还可以是任何链球菌属的细胞，包括但不限于似马链球菌、酿脓链球菌、乳房链球菌和马链球菌兽瘟亚种的细胞。

细菌宿主细胞还可以是任何链霉菌细胞，包括但不局限于不产色链霉菌、除虫链霉菌、天蓝链霉菌、灰色链霉菌以及浅青紫链霉菌细胞。

将DNA引入芽孢杆菌属细胞中可通过以下来实现：原生质体转化(参见例如，张(Chang)和科恩(Cohen)，1979，分子遗传学与基因组学(Mol.Gen.Genet.)168:111-115)、感受态细胞转化(参见，例如，杨格(Young)和斯皮宰曾(Spizizen)，1961，细菌学杂志(J.Bacteriol.)81:823-829；或杜拜努(Dubnau)以及大卫杜夫-阿贝尔森(Davidoff-Abelson)，1971，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)56:209-221)、电穿孔(参见，例如，茂川(Shigekawa)和道尔(Dower)，1988，生物技术(Biotechniques)6:742-751)、或者接合(参见，例如克勒(Koehler)和索恩(Thorne)，1987，细菌学杂志169:5271-5278)。将DNA引入大肠杆菌细胞中可通过以下来实现：原生质体转化(参见例如，哈纳汗(Hanahan)，1983，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)166:557-580)或电穿孔(参见例如，道尔(Dower)等人，1988，核酸研究(Nucleic Acids Res.)16:6127-6145)。将DNA引入链霉菌属细胞中可通过以下来实现：原生质体转化、电穿孔(参见例如，贡(Gong)等人，2004，叶线形微生物学(Folia Microbiol.)(Praha(布拉格))49:399-405)、接合(参见例如，马佐迪耶(Mazodier)等人，1989，细菌学杂志(J.Bacteriol.)171:3583-3585)、或转导(参见例如，伯克(Burke)等人，2001，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)98:6289-6294)。将DNA引入假单孢菌属细胞中可通过以下来实现：电穿孔(参见例如，蔡(Choi)等人，2006，微生物学方法杂志(J.Microbiol.Methods)64:391-397)或接合(参见例如，皮内多(Pinedo)和斯梅茨(Smets)，2005，应用与环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)71:51-57)。将DNA引入链球菌属细胞中可通过以下来实现：天然感受态(参见例如，佩里(Perry)和藏满(Kuramitsu)，1981，感染与免疫(Infect.Immun.)32:1295-1297)、原生质体转化(参见，例如，凯特(Catt)和乔力克(Jollick)，1991，微生物学(Microbios)68:189-207)、电穿孔(参见，例如，巴克利(Buckley)等人，1999，应用与环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)65:3800-3804)、或者接合(参见，例如，克莱威尔(Clewell)，1981，微生物学评论(Microbiol.Rev.)45:409-436)。然而，可以使用本领域已知的用于将DNA引入宿主细胞中的任何方法。

宿主细胞还可以是真核细胞，如哺乳动物、昆虫、植物、或真菌细胞。

宿主细胞可以是真菌细胞。如在此使用的“真菌”包括子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)、以及接合菌门(Zygomycota)、连同卵菌门(Oomycota)和全部有丝分裂孢子真菌(如由霍克斯沃思(Hawksworth)等人在安斯沃思和拜斯比真菌词典(Ainsworth and Bisby’s Dictionary of The Fungi)，第8版，1995，国际应用生物科学中心(CAB International)，大学出版社(University Press)，英国剑桥(Cambridge，UK)中进行定义的)。

该真菌宿主细胞可以是酵母细胞。如在此使用的“酵母”包括产子囊酵母(内孢霉目)、产担子酵母和属于半知菌类(芽孢纲)的酵母。由于酵母的分类在未来可能改变，因此出于本发明的目的，酵母应如酵母的生物学和活性(Biology and Activities of Yeast)(斯金纳(Skinner)、帕斯莫尔(Passmore)、以及达文波特(Davenport)编辑，应用细菌学学会讨论会系列号9(Soc.App.Bacteriol.Symposium Series No.9)，1980)中所描述来定义。

酵母宿主细胞可以是假丝酵母属、汉逊酵母属、克鲁弗酵母属、毕赤酵母属、酵母属、裂殖酵母属、或亚罗酵母属细胞，例如乳酸克鲁弗酵母、卡氏酵母(Saccharomyces carlsbergensis)、酿酒酵母、糖化酵母、道格拉氏酵母(Saccharomyces douglasii)、克鲁费酵母(Saccharomyces kluyveri)、诺地酶母(Saccharomyces norbensis)、卵形酵母、或亚罗解脂酵母(Yarrowia lipolytica)细胞。

真菌宿主细胞可以是丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌门(Eumycota)和卵菌门的亚门(如由霍克斯沃思(Hawksworth)等人，1995，见上文所定义)的所有丝状形式。丝状真菌通常的特征在于由壳多糖、纤维素、葡聚糖、壳聚糖、甘露聚糖、以及其他复杂多糖构成的菌丝体壁。营养生长是通过菌丝延长，而碳分解代谢是专性需氧的。相反，酵母(如酿酒酵母)的营养生长是通过单细胞菌体的出芽(budding)，而碳分解代谢可以是发酵的。

丝状真菌宿主细胞可以是枝顶孢霉属、曲霉属、短梗霉属、烟管菌属、拟蜡菌属、金孢子菌属、鬼伞菌属、革盖菌属、隐球菌属、线黑粉酵母属、镰刀菌属、腐质霉属、梨孢菌属、毛霉属、毁丝霉属、新美鞭菌属、脉孢菌属、拟青霉属、青霉菌属、平革菌属、白腐菌属、瘤胃壶菌属、侧耳属、裂褶菌属、踝节菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属、栓菌属、或木霉属的细胞。

例如，丝状真菌宿主细胞可以是泡盛曲霉、臭曲霉、烟曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、黑刺烟管菌(Bjerkandera adusta)、干拟蜡菌(Ceriporiopsis aneirina)、卡内基拟蜡菌(Ceriporiopsis caregiea)、浅黄拟蜡孔菌(Ceriporiopsis gilvescens)、潘诺希塔拟蜡菌(Ceriporiopsis pannocinta)、环带拟蜡菌(Ceriporiopsis rivulosa)、微红拟蜡菌(Ceriporiopsis subrufa)、虫拟蜡菌(Ceriporiopsis subvermispora)、狭边金孢子菌(Chrysosporium inops)、嗜角质金孢子菌、卢克诺文思金孢子菌(Chrysosporium lucknowense)、粪状金孢子菌(Chrysosporium merdarium)、租金孢子菌、女王杜香金孢子菌(Chrysosporium queenslandicum)、热带金孢子菌、褐薄金孢子菌(Chrysosporium zonatum)、灰盖鬼伞(Coprinus cinereus)、毛革盖菌(Coriolus hirsutus)、杆孢状镰孢、谷类镰孢、库威镰孢、大刀镰孢、禾谷镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖镰孢、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰孢、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰孢、镶片镰孢、特异腐质霉、柔毛腐质霉、米黑毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙链孢菌、产紫青霉、黄孢平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、射脉菌(Phlebia radiata)、刺芹侧耳(Pleurotus eryngii)、土生梭孢壳、长域毛栓菌(Trametes villosa)、变色栓菌(Trametes versicolor)、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉或绿色木霉细胞。

可以将真菌细胞通过涉及原生质体形成、原生质体转化、以及细胞壁再生的方法以本身已知的方式转化。用于转化曲霉属和木霉属宿主细胞的合适程序描述于EP 238023，约尔顿(Yelton)等人，1984，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)81:1470-1474以及克里斯滕森(Christensen)等人，1988，生物/技术(Bio/Technology)6:1419-1422中。马拉迪耶(Malardier)等人，1989，基因(Gene)78:147-156和WO 96/00787描述了用于转化镰刀菌属物种的合适方法。可以使用由如以下文献描述的程序转化酵母：贝克尔(Becker)和瓜伦特(Guarente)，在阿贝尔森(Abelson)，J.N.和西蒙(Simon)，M.I.编，酵母遗传学与分子生物学指南，酶学方法(Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology,Methods in Enzymology)，第194卷，第182-187页，学术出版社有限公司(Academic Press,Inc.)，纽约；伊藤(Ito)等人，1983，细菌学杂志(J.Bacteriol.)153:163；以及伊嫩(Hinnen)等人，1978，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)75:1920。

产生方法

本发明还涉及产生本发明的多肽的方法，包括(a)在有益于产生该多肽的条件下培养一种细胞，该细胞以其野生型形式产生该多肽；并且可任选地(b)回收该多肽。在一个方面中，该细胞是一种曲霉属细胞。在另一个方面中，该细胞是一种米曲霉细胞。在另一个方面中，该细胞是米曲霉HowB101(WO 95/035385)。

本发明还涉及产生本发明的多肽的方法，包括(a)在有益于产生该多肽的条件下培养一种本发明的重组宿主细胞；并且可任选地(b)回收该多肽。

这些宿主细胞是在适合于使用本领域中已知的方法产生该多肽的一种营养培养基中培养的。例如，可以通过在适合的培养基中和在允许表达和/或分离该多肽的条件下，进行摇瓶培养，或者在实验室或工业发酵罐中进行小规模或大规模发酵(包括连续，分批，分批补料，或固态发酵)来培养细胞。该培养是使用本领域中已知的程序，在一种适合营养培养基中发生，该培养基包含碳和氮来源及无机盐。适合的培养基可从商业供应商获得或可以根据公开的组成(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)制备。如果多肽分泌到该营养培养基中，那么可直接从培养基中直接回收多肽。如果多肽不分泌，那么其可从细胞裂解液中进行回收。

可以使用特异性针对具有内切葡聚糖酶活性的多肽的本领域已知的方法来检测该多肽。这些检测方法包括但不限于，特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。例如，可以使用酶测定来确定该多肽的活性。

可以使用本领域已知的方法来回收多肽。例如，该多肽可以通过常规程序，包括但不限于，收集、离心、过滤、萃取、喷雾干燥、蒸发或沉淀，从该营养培养基回收。在一个方面中，回收包括该多肽的发酵液。

可以通过本领域已知的多种程序来纯化该多肽，以获得基本上纯的多肽，这些程序包括但不限于色谱法(例如，离子交换色谱、亲和色谱、疏水作用色谱、色谱聚焦以及尺寸排阻色谱)、电泳程序(例如，制备型等电点聚焦)、差别溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、SDS--PAGE、或萃取(参见，例如蛋白纯化(Protein Purification)，詹森(Janson)和赖登(Ryden)编辑，VCH出版社(VCH Publishers)，纽约，1989)。

在一个替代性方面中，没有回收该多肽，而是将表达该多肽的本发明的宿主细胞用作该多肽的来源。

植物

本发明还涉及分离的植物，例如转基因植物、植物部分或植物细胞，这些分离的植物包括本发明的多肽，从而表达并且产生可回收的量的多肽或结构域。多肽或结构域可从植物或植物部分回收。作为替代方案，包括该多肽或结构域的植物或植物部分可以按原样用于改善食品或饲料的质量，例如改善营养价值、可口性及流变学特性或破坏抗营养因素。

转基因植物可以是双子叶的(双子叶植物)或单子叶的(单子叶植物)。单子叶植物的实例是草例如草地早熟禾(蓝草，早熟禾属)，饲草例如羊茅属(Festuca)、黑麦草属(Lolium)，温带草例如剪股颖属(Agrostis)和谷物例如小麦、燕麦、黑麦、大麦、水稻、高粱、和玉蜀黍(玉米)。

双子叶植物的实例是烟草、豆类(如羽扇豆(lupins)、马铃薯、糖甜菜(sugar beet)、豌豆、豆(bean)和大豆(soybean))、以及十字花科植物(十字花科(family Brassicaceae))(如花椰菜、油菜籽、以及紧密相关的模式生物拟南芥)。

植物部分的实例是茎、愈伤组织、叶、根、果实、种子、以及块茎、以及包含这些部分的独立组织，例如，表皮、叶肉、薄壁组织(parenchyme)、维管组织、分生组织。特定植物细胞区室，如叶绿体、质外体(apoplast)、线粒体、液泡、过氧化物酶体以及细胞质也被认为是植物部分。此外，任何植物细胞，无论是何种组织来源，都被认为是植物部分。同样地，植物部分，如分离以有助于本发明的利用的特定组织和细胞也被认为是植物部分，例如胚、胚乳、糊粉和种皮。

同样包含于本发明范围内的是这类植物、植物部分以及植物细胞的子代。

可以根据本领域已知方法构建表达该多肽或结构域的转基因植物或植物细胞。简而言之，通过将编码该多肽或结构域的一个或多个表达构建体结合到植物宿主基因组或叶绿体基因组中并且将所得改性植物或植物细胞繁殖成转基因的植物或植物细胞来构建植物或植物细胞。

表达构建体方便地是核酸构建体，它包括编码多肽或结构域的多核苷酸，该多核苷酸可操作地与选择的植物或植物部分中表达该多核苷酸所需的适当调节序列连接。而且，表达构建体可包含用于鉴别整合了此表达构建体的植物细胞的选择性标记，和将此构建体引入所讨论的植物所必需的DNA序列(后者取决于所用的引入DNA的方法)。

例如基于希望在何时、何处、和怎样表达该多肽或结构域来确定调节序列，例如启动子和终止子序列以及任选的信号序列或转运序列的选择。例如编码多肽或结构域的基因的表达可以是组成型的或诱导型的，或者可以是发育、阶段或组织特异性的，并且基因产物可以被靶向至特定组织或植物部分，例如种子或叶。调节序列由例如塔格(Tague)等人，1988，植物生理学(Plant Physiology)86:506描述。

对于组成型表达，可以使用35S-CaMV、玉蜀黍泛素1、或水稻肌动蛋白1启动子(Franck(弗兰克)等人，1980，Cell(细胞)21:285-294；Christensen(克里斯滕森)等人，1992，Plant Mol.Biol.(植物分子生物学)18:675-689；Zhang(张)等人，1991，Plant Cell(植物细胞) 3:1155-1165)。器官特异性启动子可以是以下各项的启动子，例如来自贮藏库组织(例如种子、马铃薯块茎、和果实)(Edwards(爱德华兹)和Coruzzi(科鲁兹)，1990，Ann.Rev.Genet.(遗传学年鉴)24:275-303)，或来自代谢库组织(例如分生组织)(Ito(伊藤)等人，1994，Plant Mol.Biol.(植物分子生物学)24:863-878)，种子特异性启动子，例如来自水稻的谷蛋白、醇溶谷蛋白、球蛋白或白蛋白启动子(Wu(吴)等人，1998，Plant Cell Physiol.(植物与细胞生理学)39:885-889)，来自豆球蛋白B4的蚕豆启动子和来自蚕豆的未知种子蛋白基因(Conrad(康拉德)等人，1998，J.Plant Physiol.(植物生理学杂志)152:708-711)，来自种子油体蛋白的启动子(Chen(陈)等人，1998，Plant Cell Physiol.(植物与细胞生理学)39:935-941)，来自欧洲油菜的贮藏蛋白napA启动子，或本领域已知的任何其他种子特异性启动子，例如，如在WO 91/14772中所述的。此外，启动子可以是叶特异性启动子，例如来自水稻或番茄的rbcs启动子(Kyozuka(京冢)等人，1993，Plant Physiol.(植物生理学))，102:991-1000)，小球藻病毒腺嘌呤甲基转移酶基因启动子(Mitra(密特拉)和Higgins(希金斯)，1994，Plant Mol.Biol.(植物分子生物学)26:85-93)，来自水稻的aldP基因启动子(Kagaya(加贺)等人，1995，Mol.Gen.Genet.(分子和普通遗传学)248:668-674)，或伤口可诱导的启动子，例如马铃薯pin2启动子(Xu(徐)等人，1993，Plant Mol.Biol.(植物分子生物学)22:573-588)。同样，启动子可通过非生物处理，例如温度、干旱、或盐度变化来诱导，或通过外源施加激活启动子的物质(例如乙醇，雌激素，植物激素例如乙烯、脱落酸、和赤霉酸，以及重金属)来诱导。

还可使用启动子增强子元件，从而在植物中达到多肽或结构域的更高表达。例如，启动子增强子元件可以是位于启动子和编码多肽或结构域的多核苷酸序列之间的内含子。例如Xu(徐)等人，1993，同上披露了使用水稻肌动蛋白1基因的第一内含子来增强表达。

该选择性标记基因及该表达构建体的任何其他部分可以选自本领域中可用的那些。

可以根据本领域中已知的常规技术将核酸构建体结合到植物基因组中，这些常规技术包括土壤杆菌介导的转化、病毒介导的转化、微注射、粒子轰击、生物射弹转化、以及电穿孔(Gasser(加塞尔)等人，1990，Science(科学)244:1293；Potrykus(波特里库斯)，1990，Bio/Technology(生物/技术)8:535；Shimamoto(岛本)等人，1989，Nature(自然)338:274)。

目前根癌农杆菌介导的基因转移是一种用于产生转基因双子叶植物(关于综述，请参见霍伊卡(Hooykas)和施尔伯鲁特(Schilperoort)，1992，植物分子生物学(Plant Mol.Biol.)19:15-38)并且用于转化单子叶植物的方法，但对于这些植物还常常使用其他的转化方法。一种用于产生转基因单子叶植物的方法是胚性愈伤组织或发育的胚的粒子轰击(用转化DNA包衣的微观金或钨颗粒)(Christou(克里斯托)，1992，Plant J.(《植物杂志》)2:275-281；Shimamoto(岛本)，1994，Curr.Opin.Biotechnol.(《生物技术新见》)5:158-162；Vasil(瓦西尔)等人，1992，Bio/Technology(生物/技术)10:667-674)。如Omirulleh(奥米如列)等人，1993，Plant Molecular Biology(《植物分子生物学》)21:415-428中所描述，单子叶植物转化的替代方法基于原生质体转化。另外的转化方法包括美国专利号6,395,966和7,151,204(两者都通过引用以其全文结合于此)中所描述的那些。

在转化后，根据本领域熟知的方法选出已并入了表达构建体的转化体，并使其再生成为完整植物。通常设计转化程序用于通过如下方法在再生期间或在后续世代中选择性消除选择基因：例如，使用带有两个独立的T-DNA构建体的共转化或利用特异性重组酶位点特异性地切除选择基因。

除用本发明的构建体直接转化特定植物基因型外，还可以通过使具有该构建体的植物与缺乏该构建体的第二植物进行杂交来产生转基因植物。例如，可以通过杂交将编码多肽或结构域的构建体引入特定植物品种中，无需总是直接地转化该给定品种的植物。因此，本发明不仅涵盖了从根据本发明已经转化的细胞直接再生的植物，而且还涵盖了这类植物的后代。如在此使用的，后代可以是指根据本发明制备的亲本植物的任何代的后代。此类后代可以包含根据本发明制备的DNA构建体。杂交导致通过供体植物系与起始系交叉授粉，将转基因引入植物系。此类步骤的非限制性实例描述于美国专利号7,151,204中。

植物可以通过回交转化方法生成。例如，植物包含被称为回交转化的基因型、种系、近交体、或杂交体的植物。

可以使用遗传标记以协助本发明的一种或多种转基因从一个遗传背景渗入到另一个。标记协助的选择提供了相对于常规育种的优势，在于其可以用于避免由表型变异导致的错误。另外，遗传标记可以在具体杂交的个别后代中提供有关良种种质相对程度的数据。例如，当具有所希望性状并且另外具有非农艺学所希望的遗传背景的植物与良种亲本杂交时，可以使用遗传标记来选择不仅具有感兴趣的性状，还具有相对较大比例所希望种质的后代。以此方式，使一种或多种性状渗入特定遗传背景所需的世代数得以最小化。

本发明还涉及产生本发明的多肽或结构域的方法，这些方法包括(a)在有益于产生该多肽或结构域的条件下培养转基因植物或植物细胞，该转基因植物或植物细胞包含编码该多肽或结构域的多核苷酸；并且(b)回收该多肽或结构域。

内切葡聚糖酶活性的除去或降低

本发明还涉及产生亲本细胞的突变体的方法，该方法包括破坏或缺失编码本发明的多肽的多核苷酸或其部分，这导致突变体细胞比在相同条件下培养的亲本细胞产生的多肽少。

可以使用本领域熟知的方法通过降低或消除该多核苷酸的表达来构建突变体细胞，例如插入、破坏、替换、或缺失。在一个优选方面，将该多核苷酸失活。例如，待修饰或失活的多核苷酸可以是活性必需的编码区或其部分，或编码区的表达所需的调节元件。这种调控或控制序列的实例可以是启动子序列或其功能部分，即足以影响该多核苷酸的表达的部分。可修饰的其他控制序列包括但不局限于前导子、聚腺苷酸化序列、前肽序列、信号肽序列、转录终止子、和转录激活因子。

该多核苷酸的修饰或失活可以通过使亲本细胞经受诱变，并且选择该多核苷酸的表达被降低或消除的突变体细胞来进行。所述诱变可以是特异的或随机的，例如通过使用适宜的物理或化学诱变剂、通过使用适宜的寡核苷酸、或通过对DNA序列PCR产生诱变来进行。此外，诱变可通过使用这些诱变剂的任意组合来进行。

适用于本发明目的的物理或化学诱变剂的实例包括紫外线(UV)照射、羟胺、N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)、邻甲基羟胺、亚硝酸、乙基甲磺酸(EMS)、亚硫酸氢钠、甲酸以及核苷酸类似物。

当使用这些试剂时，诱变一般是在适宜条件下在所选的诱变处理试剂的存在下通过孵育有待诱变的亲本细胞并筛选和/或选择展示基因表达降低或不表达的突变体细胞来进行的。

该多核苷酸的修饰或失活可以通过在基因中或在其转录或翻译所需的调节元件中插入、取代、或缺失一个或多个核苷酸来完成。例如，可插入或除去核苷酸从而形成终止密码子的引入、起始密码子的除去、或开放读码框的改变。这些修饰或失活可根据本领域已知的方法通过定点诱变或PCR产生的诱变来完成。尽管大体上，修饰可以在体内进行，即直接在表达待修饰的多核苷酸的细胞上进行，但是优选的是如下所示例地在体外进行修饰。

便利的消除或降低多核苷酸的表达的方法的实例是基于基因替换、基因缺失、或基因破坏技术的。例如，在基因破坏方法中，将对应于内源多核苷酸的核酸序列在体外进行诱变以产生缺陷的核酸序列，然后将其转化到亲本细胞中以产生缺陷基因。通过同源重组，该缺陷的核酸序列替换内源多核苷酸。令人希望的是，缺陷的多核苷酸还编码可用于选择其中该多核苷酸已经被修饰或破坏的转化体的标记。在一个方面，用例如在此描述的那些选择性标记来破坏该多核苷酸。

本发明还涉及抑制具有内切葡聚糖酶活性的多肽在细胞中的表达的方法，这些方法包括向该细胞给予或在其中表达一种双链RNA(dsRNA)分子，其中该dsRNA包括本发明的多核苷酸的一个子序列。在一个优选方面，该dsRNA长约15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个或更多个双核苷酸。

该dsRNA优选是一个小干扰RNA(siRNA)或微小RNA(miRNA)。在一个优选方面，该dsRNA是用于抑制转录的小干扰RNA。在另一个优选方面，该dsRNA是用于抑制翻译的微小RNA。

本发明还涉及此类双链RNA(dsRNA)分子，包括用于抑制该多肽在细胞中的表达的SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列的部分。虽然本发明不局限于任何具体的作用机制，但是该dsRNA可以进入一个细胞并且导致相似的或相同的序列的单链RNA(ssRNA)(包括内源mRNA)的降解。当细胞被暴露于dsRNA时，来自同源基因的mRNA选择性地被一种叫做RNA干扰(RNAi)的过程所降解。

本发明的dsRNA可以用于基因沉默。在一个方面，本发明提供了使用本发明的dsRNAi来选择性地降解RNA的方法。可以在体外、离体或体内进行该过程。在一个方面，可以使用这些dsRNA分子来在细胞、器官或动物中产生功能缺失突变。用于制备并使用dsRNA分子选择性降解RNA的方法在本领域中是熟知的；参见例如美国专利号6,489,127；6,506,559；6,511,824；以及6,515,109。

本发明进一步涉及在编码该多肽的多核苷酸或其控制序列或编码该多肽的沉默基因中包括破坏或缺失的亲本细胞的突变体细胞，这导致与亲本细胞相比，该突变体细胞产生的多肽少或不产生多肽。

这些多肽缺陷的突变体细胞作为用于原生和异源多肽的表达的宿主细胞尤其有用。因此，本发明进一步涉及产生天然或异源多肽的方法，包括(a)在有益于产生该多肽的条件下培养该突变体细胞；并且(b)回收该多肽。术语“异源多肽”是指对该宿主细胞来说不是天然的多肽，例如天然蛋白质的变体。该宿主细胞可以包括多于一个拷贝的编码该原生或异源多肽的多核苷酸。

可使用本领域已知的方法进行培养和目的产物的纯化。

本发明用于产生基本上不含内切葡聚糖酶的产物的方法在真核多肽的生产中是特别感兴趣的，尤其是真菌蛋白质，例如酶。内切葡聚糖酶缺陷的细胞还可用于表达药学感兴趣的异源蛋白，例如激素、生长因子、受体等。术语“真核多肽”不仅包括天然多肽，还包括经过氨基酸替代、缺失或添加的修饰或用以增强活性、热稳定性、pH耐受性等的其他此类修饰的多肽，例如酶。

在另一个方面中，本发明涉及通过本发明的方法生产的基本上不含内切葡聚糖酶活性的蛋白产物。

发酵液配制品或细胞组合物

本发明还涉及包括本发明的多肽的一种发酵液配制品或细胞组合物。发酵液产物进一步包含在发酵过程中使用的另外的成分，例如像，细胞(包括含有编码本发明的多肽的基因的宿主细胞，这些宿主细胞被用于产生感兴趣的多肽)、细胞碎片、生物质、发酵介质和/或发酵产物。在一些实施例中，该组合物是含有一种或多种有机酸、杀死的细胞和/或细胞碎片、以及培养基的细胞杀灭的全培养液。

如在此使用的术语“发酵液”是指由细胞发酵产生、不经历或经历最低限的回收和/或纯化的制剂。例如，当微生物培养株在允许蛋白质合成(例如，由宿主细胞的酶表达)并且将蛋白质分泌到细胞培养基中的碳受限的条件下孵育生长到饱和时，产生发酵液。发酵液可以包含在发酵结束时得到的发酵材料的未分级的或分级的内容物。典型地，发酵液是未分级的并且包括在例如通过离心除去微生物细胞(例如，丝状真菌细胞)后存在的耗尽的培养基和细胞碎片。在一些实施例中，发酵液包含用过的细胞培养基、胞外酶、以及有活力的和/或无活力的微生物细胞。

在一个实施例中，该发酵液配制品和细胞组合物包括一种第一有机酸组分(包括至少一种1-5碳的有机酸和/或其盐)以及一种第二有机酸组分(包括至少一种6碳或更多碳的有机酸和/或其盐)。在一个具体实施例中，该第一有机酸组分是乙酸、甲酸、丙酸、其盐、或两种或更多种前述酸的混合物并且该第二有机酸组分是苯甲酸、环己烷羧酸、4-甲基戊酸、苯乙酸、其盐、或两种或更多种前述酸的混合物。

在一方面，该组合物包含一种或多种有机酸，并且任选地进一步包含杀死的细胞和/或细胞碎片。一个实施例中，从细胞杀灭的全培养液中去除这些杀死的细胞和/或细胞碎片，以提供不含这些组分的组合物。

这些发酵液配制品或细胞组合物可以进一步包含一种防腐剂和/或抗微生物(例如抑菌)剂，包括但不限于山梨醇、氯化钠、山梨酸钾、以及本领域中已知的其他试剂。

该细胞杀灭的全培养液或组合物可以包含在发酵终止时得到的发酵物质的未分级的内容物。典型地，该细胞杀死全培养液或组合物包含用过的培养基以及在微生物细胞(例如，丝状真菌细胞)生长至饱和、在碳限制条件下孵育以允许蛋白质合成之后存在的细胞碎片。在一些实施例中，细胞杀灭的全培养液或组合物含有耗尽的细胞培养基、胞外酶、和杀死的丝状真菌细胞。在一些实施例中，可以使用本领域已知方法来使细胞杀灭的全培养液或组合物中存在的微生物细胞透性化和/或裂解。

在此描述的全培养液或细胞组合物典型地是液体，但是可以含有不溶组分，例如杀死的细胞、细胞碎片、培养基组分、和或一种或多种不溶性酶。在一些实施例中，可以除去不溶性组分以提供澄清的液体组合物。

可以通过WO 90/15861或WO 2010/096673所述的方法产生本发明的全培养液配制品和细胞组合物。

酶组合物

本发明还涉及包含本发明的一种多肽的组合物。优选地，这些组合物富含这种多肽。术语“富含”指示该组合物的内切葡聚糖酶活性已经增加，例如，富集因子为至少1.1。

这些组合物可以包括本发明的多肽作为主要酶组分，例如单组分组合物。可替代地，这些组合物可以包括多种酶活性，如一种或多种(例如，若干种)选自下组的酶，该组由以下各项组成：水解酶、异构酶、连接酶、裂解酶、氧化还原酶、或转移酶，例如，α-半乳糖苷酶、α-葡糖苷酶、氨肽酶、淀粉酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、β-木糖苷酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质酶、环糊精葡萄糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、内切葡聚糖酶、酯酶、葡糖淀粉酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、变聚糖酶、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白分解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、或木聚糖酶。

这些组合物可根据本领域已知的方法制备并且可以是液体或干燥组合物的形式。可以根据本领域中已知的方法稳定这些组合物。

下文中给出本发明的组合物的优选用途的实例。可以基于本领域已知的方法来确定组合物的剂量和使用该组合物的其他条件。

用于纺织品的酶组合物

本发明进一步涉及用于纺织品的酶组合物，该酶组合物包括一种或多种如在本发明中定义的多肽。

该纺织品组合物可以适于特定用途，例如生物石磨或生物抛光，这些用途可以提供如减少起球、减少织物重量损失、增加磨损效果以及降低返染(backstaing)水平的纺织品益处中的至少一种。

该纺织品组合物可以进一步包括一种或多种选自下组的酶，该组由以下各项组成：过氧化氢酶、蛋白酶、脂肪酶、角质酶、淀粉酶、半纤维素酶、果胶酶、纤维素酶以及过氧化物酶/氧化酶。

该纺织品组合物典型地包括常规成分，包括但不限于提供与例如强度、抗起球性、吸水性以及可染性相关的优越效果的其他酶以及表面活性剂、稳定剂、润湿剂、分散剂、消泡剂、润滑剂、助洗剂体系等或其混合物。

该纺织品组合物可处于任何形式，例如固体、液体、膏体、凝胶或其任何组合。

用途

本发明还针对用具有内切葡聚糖酶活性的多肽或其组合物处理纺织品的以下方法。

生物抛光

将织物(例如纤维素材料的织物)加工成服装制造备用的材料涉及若干步骤：将纤维纺成纱线；由该纱线形成机织或针织织物；以及随后的准备过程、染色/印花和整理操作。在例如染色/印花和整理之前，对于除去来自纤维的天然的和人工诱导的杂质和用于改善其美学外观和可加工性而言准备过程是必需的。常见的准备过程包括脱浆(用于机织物)、精练和漂白，这些过程产生适于染色或整理的织物。

生物抛光是在纤维素织物制造过程中用酶(例如纤维素酶)对其进行处理的方法，该方法相对于“减少起球”而改善织物品质。生物抛光的最重要的效果可以由以下项表征：较少的起毛和起球，增加光彩/光泽(gloss/luster)，改善织物手感，增加持久柔软性和/或改善吸水性。通常在制造针织和机织织物或服装的湿润过程中进行生物抛光。湿润过程包括例如以下步骤：脱浆、精练、漂白、洗涤、染色/印花以及整理。可以在湿润步骤的任一步骤之后将生物抛光作为分开步骤而进行或可以与那些湿润步骤的任一步骤组合进行。如在此使用的，术语“生物抛光”、“去球”和“抗起球”是可互换的。

本发明涉及一种在生物抛光工艺中通过用具有内切葡聚糖酶活性的分离的多肽处理纺织品而制造纺织品的方法。

在一个实施例中，本发明提供了一种用于获得具有减少的起球的纤维素纺织品或含纤维素的纺织品的方法，该方法包括用水溶液中的具有内切葡聚糖酶活性的多肽处理纺织品。在此实施例中，生物抛光方法可以应用于纱线、织物或服装。

生物石磨

一些染色的织物(例如牛仔布织物)需要在编织之前将纱线染色。对于牛仔布织物，在编织之前，将经线例如用靛蓝染色并上浆。优选地，牛仔纱的染色是环染。本发明的一个优选实施例是用还原染料(例如靛蓝)、或靛蓝相关的染料(例如硫靛蓝)、或硫化染料、或直接染料、或活性染料或萘酚环染纱线。还可以用多于一种染料为纱线染色，例如首先用硫化染料并且然后用还原染料，或反之亦然。

优选地，在将纱线染色之前，使其经历精练和/或漂白，以便使牛仔布织物达到较高的品质。通常，在编织为染色的织物(例如牛仔布)之后，染色的织物或服装进入脱浆阶段，优选地接着是生物石磨步骤和/或颜色修饰步骤。

本发明还涉及一种在生物石磨工艺中通过用具有内切葡聚糖酶活性的分离的多肽处理纺织品而制造纺织品的方法。

在一个实施例中，本发明提供了一种用于向染色的织物或服装表面引入颜色密度的局部变化的方法，其中该方法包括使该织物或服装与如在本发明中定义的具有内切葡聚糖酶活性的多肽接触的步骤。优选地，该染色的织物或服装是纤维素织物或服装或含纤维素的织物或服装。更优选地，该染色的织物是牛仔布织物，甚至更优选地，是靛蓝染料染色的牛仔布织物。如在此使用的，术语“生物石磨”、“石洗(stone washing)”和“磨损”是可互换的。

在另一个实施例中，本发明提供了一种牛仔布制造工艺，该工艺包括：a)将该牛仔布织物脱浆；b)用具有内切葡聚糖酶活性的多肽生物石磨该牛仔布；c)漂洗。

信号肽

本发明还涉及编码信号肽的分离的多核苷酸，该信号肽包括SEQ ID NO:2的氨基酸1至21、SEQ ID NO:4的氨基酸1至21、SEQ ID NO: 6的氨基酸1至18或由其组成。这些多核苷酸可以进一步包括一个编码蛋白质的基因，该蛋白质可操作地连接到该信号肽。该蛋白质优选地对于该信号肽来说是外源的。在一个方面中，编码该信号肽的多核苷酸是SEQ ID NO:1的核苷酸1至63、SEQ ID NO:3的核苷酸1至63、SEQ ID NO:5的核苷酸1至54。本发明还涉及包括这些多核苷酸的核酸构建体、表达载体及重组宿主细胞。

本发明还涉及产生蛋白质的方法，包括(a)对包含这种多核苷酸的重组宿主细胞进行培养；并且(b)回收该蛋白质。

该蛋白质对于宿主细胞而言可以是天然的或异源的。术语“蛋白质”在此不意图是指一种特定长度的编码产物，并且因此涵盖肽、寡肽及多肽。术语“蛋白质”还涵盖组合形成编码的产物的两个或更多个多肽。这些蛋白质还包括杂合多肽和融合多肽。

优选地，该蛋白质是一种激素、酶、受体或其部分、抗体或其部分，或报告基因。例如，该蛋白质可以是一种水解酶、异构酶、连接酶、裂解酶、氧化还原酶、或转移酶，例如α-半乳糖苷酶、α-葡糖苷酶、氨肽酶、淀粉酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、β-木糖苷酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质酶、环糊精葡萄糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、内切葡聚糖酶、酯酶、葡糖淀粉酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、变聚糖酶、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、或木聚糖酶。

该基因可以从任何原核、真核或其他来源获得。

在以下编号的段落中进一步描述本发明的方法和组合物。

1.一种具有内切葡聚糖酶活性的分离的多肽，该分离的多肽选自下组，该组由以下各项组成：

(a)一种与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少80％序列一致性的多肽或一种与SEQ ID NO:4的成熟多肽具有至少85％序列一致性的多肽；一种与SEQ ID NO:6的成熟多肽具有至少85％序列一致性的多肽；

(b)一种多肽，该多肽由以下多核苷酸编码，该多核苷酸在中严格条件下与(i)SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5的成熟多肽编码序列，(ii)其cDNA序列或(iii)(i)或(ii)的全长互补体杂交；

(c)一种多肽，该多肽由与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列具有至少80％序列一致性的多核苷酸编码、或由与SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列具有至少85％序列一致性的多核苷酸编码、或由与SEQ ID NO:5的成熟多肽编码序列具有至少85％序列一致性的多核苷酸编码，或者其cDNA序列；

(d)SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6的成熟多肽的一种变体，该变体在一个或多个位置处包括取代、缺失和/或插入；以及

2.如段落1所述的多肽,该多肽包括SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6的成熟多肽或由其组成。

3.如段落2所述的多肽，其中该成熟多肽是SEQ ID NO:2的氨基酸22至286、SEQ ID NO:4的氨基酸22至305或SEQ ID NO:6的氨基酸19至222。

4.如段落1-3中任一项所述的多肽，该多肽是SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6的成熟多肽的一种变体，该变体在一个或多个位置处包括取代、缺失和/或插入。

5.如段落1所述的多肽，该多肽是SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6的一个片段，其中该片段具有内切葡聚糖酶活性。

6.一种分离的多肽，该分离的多肽包括选自下组的催化结构域，该组由以下各项组成：

(b)一种催化结构域，该催化结构域由以下多核苷酸编码，该多核苷酸在中严格条件下与(i)SEQ ID NO:1的核苷酸64至838或SEQ ID NO:3的核苷酸64至774或SEQ ID NO:5的核苷酸61至835，(ii)其cDNA序列或(iii)(i)或(ii)的全长互补体杂交；

(c)一种催化结构域，该催化结构域由与SEQ ID NO:1的催化结构域具有至少85％序列一致性、或与SEQ ID NO:3的核苷酸64至774具有至少90％序列一致性、或与SEQ ID NO:5的核苷酸61至835具有至少85％序列一致性的多核苷酸、或其cDNA序列编码；

(d)SEQ ID NO:2的氨基酸22至237的一种变体或SEQ ID NO:4的氨基酸22至223的一种变体、或与SEQ ID NO:6的核苷酸21至222具有至少85％序列一致性，该变体在一个或多个位置处包括取代、缺失和/或插入；以及

7.如段落6所述的多肽，该多肽进一步包括一种碳水化物结合模块。

8.一种分离的多肽，该分离的多肽包括可操作地连接至一种催化结构域的一种碳水化物结合模块，其中该结合结构域选自下组，该组由以下各项组成：

(a)一种碳水化物结合模块，该碳水化物结合模块与SEQ ID NO:2的氨基酸250至286具有至少80％序列一致性或与SEQ ID NO:4的氨基酸268至305具有至少85％序列一致性；

(b)一种碳水化物结合模块，该碳水化物结合模块由以下多核苷酸编码，该多核苷酸在中严格条件下与(i)SEQ ID NO:1的核苷酸875至985或SEQ ID NO:3的核苷酸907至1020，(ii)其cDNA序列或(iii)(i)或(ii)的全长互补体杂交；

(c)一种碳水化物结合模块，该碳水化物结合模块由与SEQ ID NO:1的核苷酸875至985具有至少80％序列一致性或与SEQ ID NO:3的核苷酸907至1020具有至少85％序列一致性的多核苷酸、或其cDNA序列编码；

(d)SEQ ID NO:2的氨基酸250至286的一种变体或SEQ ID NO:4的氨基酸268至305的一种变体，该变体在一个或多个位置处包括取代、缺失和/或插入；以及

(e)(a)、(b)、(c)或(d)的一个片段，该片段具有碳水化物结合活性。

9.如段落6所述的多肽，其中该催化结构域获得自水解酶、异构酶、连接酶、裂解酶、氧化还原酶或转移酶，例如氨肽酶、淀粉酶、碳水化物酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质酶、环糊精葡萄糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、内切葡聚糖酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、变聚糖酶、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、木聚糖酶或β-木糖苷酶。

10.如段落1-9中任一项所述的多肽，该多肽获得自腐质霉属，优选地获得自透明嗜热腐质霉，或获得自梭孢壳属，优选地获得自赫坎梭孢壳。

11.一种组合物，该组合物包括如段落1-10中任一项所述的多肽。

12.一种分离的多核苷酸，该多核苷酸编码如段落1-10中任一项所述的多肽。

13.一种核酸构建体或表达载体，该核酸构建体或表达载体包括如段落12所述的多核苷酸，该多核苷酸可操作地连接至指导该多肽在表达宿主内产生的一个或多个控制序列。

14.一种重组宿主细胞，该重组宿主细胞包括如段落12所述的多核苷酸，该多核苷酸可操作地连接至指导该多肽的产生的一个或多个控制序列。

15.一种产生如段落1-10中任一项所述的多肽的方法，该方法包括在有益于产生该多肽的条件下培养一种细胞，该细胞以其野生型形式产生该多肽。

16.如段落15所述的方法，该方法进一步包括回收该多肽。

17.一种产生具有内切葡聚糖酶活性的多肽的方法，该方法包括在有益于产生该多肽的条件下培养如段落14所述的宿主细胞。

18.如段落17所述的方法，该方法进一步包括回收该多肽。

19.用编码如段落1-10中任一项所述的多肽的多核苷酸转化的一种转基因植物、植物部分或植物细胞。

20.一种产生具有内切葡聚糖酶活性的多肽的方法，该方法包括在有益于产生该多肽的条件下培养如段落19所述的转基因植物或植物细胞。

21.如段落20所述的方法，该方法进一步包括回收该多肽。

22.一种用于处理纺织品的方法，该方法是通过用如段落1-10中任一项所述的多肽处理纺织品。

23.如段落22所述的方法，其中将该方法应用于生物抛光工艺中。

24.如段落22所述的方法，其中将该方法应用于生物石磨工艺中。

25.如段落22-24中任一项所述的方法，其中该方法进一步包括一种或多种选自下组的酶，该组由以下各项组成：过氧化氢酶、蛋白酶、脂肪酶、角质酶、淀粉酶、半纤维素酶、果胶酶、纤维素酶以及过氧化物酶。

26.如段落22-25中任一项所述的方法，其中处理该纺织品是制造该纺织品。

通过以下实例进一步描述本发明，这些实例不应当解释为限制本发明的范围。

实例

材料

用作缓沖液和底物的化学品至少是试剂等级的商品。

菌株

在这些实例中使用真菌菌株CBS454.80。根据形态特征和ITS rDNA序列二者，将菌株CBS454.80鉴定为透明嗜热腐质霉。

从收集自中国的土样中分离两个真菌菌株赫坎梭孢壳。根据形态特征和ITS rDNA序列二者，将这些菌株鉴定为赫坎梭孢壳。

培养基

PDA培养基由39克的马铃薯右旋糖琼脂和补足至1升的去离子水构成。

YPG培养基包含去离子水中的0.4％的酵母提取物、0.1％的KH₂PO₄、0.05％的MgSO₄·7H₂O、1.5％葡萄糖。

YPM培养基包含去离子水中的1％酵母提取物、2％的蛋白胨和2％的麦芽糖。

基本培养基板由342g的蔗糖、20ml的盐溶液(2.6％KCl、2.6％MgSO₄·7H₂O、7.6％KH₂PO₄、2ppm Na₂B₄O₇·10H₂O、20ppm CuSO₄·5H₂O、40ppm FeSO₄·7H₂O、40ppm MnSO₄·2H₂O、40ppm Na₂MoO₄·2H₂O、400ppm ZnSO₄·7H₂O)、20g的琼脂以及补足至1升的去离子水构成。

具有50mM乙酸盐的pH 5.0缓冲液：将2.873g乙酸钠和0.901g乙酸溶解于1L去离子水中；

具有50mM磷酸盐的pH 6.5缓冲液：将5.642g磷酸氢二钠十二水合物(Na₂HPO₄·12H₂O)和5.344g磷酸二氢钠二水合物(NaH₂PO₄·2H₂O)溶解于1L去离子水中；

具有50mM磷酸盐的pH 7.5缓冲液：将15.045g磷酸氢二钠十二水合物(Na₂HPO₄·12H₂O)和1.248g磷酸二氢钠二水合物(NaH₂PO₄·2H₂O)溶解于1L去离子水中；

具有50mM磷酸盐的pH 8.5缓冲液：将17.607g磷酸氢二钠十二水合物(Na₂HPO₄·12H₂O)和0.116g磷酸二氢钾(KH₂PO₄)溶解于1L去离子水中。

酶

Cellusoft(一种单组分土生梭孢壳GH45内切葡聚糖酶产品，可商购自诺维信公司)

纤维素酶A(如SEQ ID NO:7所示的特异腐质霉内切葡聚糖酶的成熟肽(根据WO 91/17243生产))

织物

双棉布(Cotton interlock)：40S，漂白的，HM-A0008，可获得自中国广州的HM棉业有限公司(HM Cotton Co.,Ltd)。

牛仔布：批号L001，7*7/76*42，12oz.，可获得自中国的杭州伊美有限公司(Hangzhou Yimei,Co.,Ltd)。

方法

重量损失确定

将小块布样在编号之前置于控制室(65％+/-5％湿度，20+/-1℃)中24小时，通过分析天平(用于100g以下的样品)或精密天平(用于100g以上的样品)称重并记录。在处理之后，将所有样品滚动干燥(AEG，LAVATHERM 37700，德国)1小时并在如以上提及的控制室中调节24小时。对于每份样品，重量损失定义如下：

起球记录(pilling notes)测试

将已经在标准气候(65％湿度，21℃)下预调节至少24小时的织物(包括处理的和未处理的)针对起球记录用Nu-马丁代尔(Martindale)测试仪(詹姆斯(James)H.希尔有限公司(Heal Co.Ltd)，英格兰)进行测试，用相同类型的未处理的织物作为磨损的织物。在2000回转之后进行标准的起球测试(瑞士标准(SN)198525)，通过从具有如下的定义的含义的1-5标记，其中1显示不良的抗起球而5显示优异的抗起球特性。因此，马丁代尔起球记录得分越高，该内切葡聚糖酶生物抛光处理越有效。

记录5：没有起球

记录4：轻微起球

记录3：中度起球

记录2：明显起球

记录1：严重起球

允许1/2、1/4记录

为了使结果更可靠，对每个样品由不同的人进行3个分开读数，并且这3个读数的平均值被采用作为起球记录的最终结果。

用于牛仔布的量色法

通过用预校准的DataColor SF450X(可替代地，可以使用等效设备)测量反射比而确定牛仔布样品的磨损水平和返染水平。每个样品取四个读数，并使用这些读数的平均值。用指数CIE L^*在样品的蓝面(正面)上评估磨损水平，并且用指数CIE b^*在样品的背面上评估返染水平。

L^*指示从0至100等级的白/黑变化，并且L^*的降低意味着黑色的增加(白色的减少)，并且L^*的增加意味着白色的增加(黑色的减少)。δL^*单位＝用某一纤维素酶处理的小块布样的L^*-在纤维素酶处理之前的小块布样的L^*。δL^*单位越大，牛仔布磨损水平越高，例如4的δL^*单位具有比3的δL^*单位高的磨损水平。

b^*指示蓝/黄变化，并且b^*的降低意味着蓝色的增加(黄色的减少)，并且b^*的增加意味着黄色的增加(蓝色的减少)。δb^*单位＝用某一纤维素酶处理的小块布样的b^*-在纤维素酶处理之前的小块布样的b^*。δb^*单位越大，对应的返染水平越低，例如-1.5的δb^*单位具有比-2.5的δb^*单位低的返染水平。

蛋白质含量

根据产品手册，用BCA^TM蛋白测定试剂盒(BCA^TM Protein Assay Kit)(产品编号23225，可商购自赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific Inc.))测量酶产品中的酶蛋白。

实例1：透明嗜热腐质霉基因组DNA提取

将透明嗜热腐质霉菌株CBS454.80接种到一个PDA板上并且在25℃下于暗处孵育5天。将若干个菌丝-PDA塞接种于包含了100ml的YPG培养基的500ml摇瓶中。在以160rpm振荡下，将这些烧瓶在25℃下孵育12天。通过过滤通过(美国加利福尼亚州拉霍亚的康碧泉公司(Calbiochem,La Jolla,CA,USA))来收集这些菌丝，并且在液氮中冷冻。将冷冻的菌丝体通过研钵和研杵磨成细粉，并且使用DNEASYMaxi试剂盒(凯杰有限公司(QIAGEN GmbH)，德国希尔登(Hilden,Germany))来分离基因组DNA。

实例2：基因组测序、装配与标注

将提取的基因组DNA样品寄往北京基因组研究所(Beijing Genome Institute)(BGI，深圳，中国)，用于使用GA2系统(亿明达公司(llumina,Inc.)，圣地亚哥，加利福尼亚州，美国)进行基因组测序。使用自有程序SOAPdenovo(李(Li)等人，2010，基因组研究(Genome Research)20(2):265-72)将原始读数在BGI装配。使用标准生物信息学方法分析装配的序列，用于发现基因并预测功能。简言之，使用基因ID(帕拉(Parra)等人，2000，基因组研究(Genome Research)10(4):511-515)预测基因。使用Blastall版本2.2.10(国家生物技术信息中心(NCBI)，贝塞斯达，马里兰州，美国)和HMMER版本2.1.1(国家生物技术信息中心(NCBI)，贝塞斯达，马里兰州，美国)根据结构同源性预测功能。通过对Blast结果的分析直接鉴定家族GH45内切葡聚糖酶候选物。使用Agene(蒙奇(Munch)和克罗格(Krogh)，2006，BMC生物信息学(BMC Bioinformatics)7:263)和SignalP程序(本特森(Bendtsen)等人，2004，分析生物学杂志(J.Mol.Biol.)340:783-795)鉴定起始密码子。使用Pepstats(欧洲生物信息研究所(European Bioinformatics Institute)，辛克斯顿，剑桥CB10 1SD，英国)估计蛋白质的等电点和分子量。

透明嗜热腐质霉GH45内切葡聚糖酶(GH45_Hya8473)的基因组DNA和推导的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2中。编码序列是核苷酸1-988，包括终止密码子TAA。编码的预测蛋白具有286个氨基酸。使用SignalP程序，预测了具有21个残基的信号肽，将其通过N-末端测序进一步证实显示成熟肽以ASGNGQS开始。编码的蛋白包含286个氨基酸，其中内切葡聚糖酶催化结构域为氨基酸22至237并且碳水化物结合模块为氨基酸250至286。

实例3：从基因组DNA中克隆透明嗜热腐质霉GH45内切葡聚糖酶基因

选择一个GH45内切葡聚糖酶基因GH45_Hya8473(SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2)用于表达克隆。

根据获得自基因组测序的DNA信息，设计以下示出的寡核苷酸引物从透明嗜热腐质霉菌株CBS454.80的基因组DNA中扩增GH45_Hya8473基因。引物由英杰公司(Invitrogen)(英杰公司，北京中国)制作。

正向引物：5’ACACAACTGGGGATCC ACC atgcgttcttctcctatccttcgc3’(SEQ ID NO：8)

反向引物：5’GTCACCCTCTAGATCT gccatctgacctcagcagaaca 3’(SEQ ID NO：9)

正向引物中的小写字符表示基因的编码区并且反向引物中的小写字符表示基因的侧翼区。大写部分与已经描述于WO 2011005867中的pPFJO355载体的插入位点同源。

对于每个基因，将20皮摩尔的引物对(正向引物和反向引物中的每一者)用于PCR反应中，该PCR反应由2微升的透明嗜热腐质霉CBS454.80基因组DNA、10微升的5XGC缓冲液、1.5微升的DMSO、各自2.5mM的dATP、dTTP、dGTP和dCTP以及0.6个单位的高保真DNA聚合酶(Finnzymes Oy公司，艾斯堡，芬兰)构成，终体积为50微升。扩增是使用帕尔帖热循环仪(Peltier Thermal Cycler)(MJ研究有限公司(MJ Research Inc.)，南旧金山，加利福尼亚州，美国)进行的，编程为：在98℃下变性1分钟；6个循环，在98℃下变性40秒、在65℃下退火40秒(其中每个循环降低1℃)和在72℃下延长1分钟；以及另外的25个循环，各自在94℃下40秒、60℃下40秒和72℃下1分钟；在72℃下最终延伸10分钟。然后将加热块转到4℃浸泡循环。

使用TBE缓冲液(90mM Tris-硼酸盐和1mM EDTA)通过1.0％琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，其中在UV光下看到预期大小1.0kb左右的单个产物带。然后，根据制造商的说明，通过使用illustra^TM GFX^TM PCR DNA和凝胶带纯化试剂盒(illustra^TM GFX^TM PCR DNA and Gel Band Purification Kit)(GE医疗集团(GE Healthcare)，白金汉郡，英国)从溶液中纯化PCR产物。

将质粒pPFJO355用Bam HI和Bgl II消化，使用TBE缓冲液通过1.0％琼脂糖凝胶电泳分离，并且根据制造商的说明，使用illustra^TM GFX^TM PCR DNA和凝胶带纯化试剂盒加以纯化。

使用In-fusion^TM Dry-down Mix(克罗泰克实验室有限公司(Clontech Laboratories,Inc.)，山景城，加利福尼亚州，美国)直接将片段克隆进表达载体pPFJO355中而无需限制酶切消化和连接。

使用In-fusion^TM Dry-down Mix将PCR产物和消化的载体连接在一起，从而产生质粒：pGH45_Hya8473(图1)，其中透明嗜热腐质霉GH45内切葡聚糖酶基因的转录在来自米曲霉α-淀粉酶的基因的启动子的控制之下。克隆操作是根据制造商的说明进行的。简言之，将用Bam HI和Bgl II消化的30ng的pPFJO355和60ng的透明嗜热腐质霉GH45 内切葡聚糖酶基因PCR产物添加至一个反应小瓶中并且通过添加去离子水而使粉末重悬浮于10微升的终体积中。将反应在37℃下孵育15分钟，并且然后在50℃下孵育15分钟。使用三微升的反应液转化大肠杆菌TOP10感受态细胞(天根生物科技(TIANGEN Biotech)(北京)有限公司，北京，中国)。通过菌落PCR检测包含表达构建体的大肠杆菌转化体，菌落PCR是一种用于直接从大肠杆菌菌落中快速筛选质粒插入片段的方法。简言之，在于每个PCR管(包括PCR缓冲液、MgCl₂、dNTP及从其产生PCR片段的引物对)中的预混合的PCR溶液等分部分中，通过用无菌尖端挑取并且在反应溶液中转动该尖端来添加单菌落。通常筛选7至10个菌落。PCR程序后，在琼脂糖凝胶上检查反应。给出预期大小的扩增的菌落可能包含正确的插入片段。使用Spin Miniprep试剂盒(凯杰有限公司，希尔登，德国)制备质粒DNA。使用3730XL DNA分析仪(应用生物系统公司(Applied Biosystems,Inc.)，福斯特市，加利福尼亚州，美国)通过DNA测序确认插入在pGH45_Hya8473中的透明嗜热腐质霉GH45内切葡聚糖酶基因。

实例4：透明嗜热腐质霉GH45内切葡聚糖酶基因在米曲霉中的表达

根据克里斯滕森(Christensen)等人(1988，生物/技术(Bio/Technology)6:1419-1422)的方法制备米曲霉HowB101(WO 95/035385)原生质体。用3微克的pGH45_Hya8473转化HowB101。转化产生大约50个转化体。将八个转化体分离到单独的基本培养基板上。

将四个转化体分开接种到于24孔板中的3ml的YPM培养基中并且在30℃下在150rpm混合下孵育。在3天孵育之后，根据制造商的说明，使用具有MES的4％-12％Bis-Tris凝胶(英杰公司(Invitrogen Corporation)，卡尔斯巴德，加利福尼亚州，美国)通过SDS-PAGE对来自每个培养物的20微升的上清液进行分析。将所得凝胶用INSTANTBLUE^TM(艾本德有限公司(Expedeon Ltd.)，剑桥巴布拉汉(Babraham Cambridge)，英国)染色。培养物的SDS-PAGE谱显示，透明嗜热腐质霉GH45内切葡聚糖酶基因被表达为检测到的蛋白带。主带是染污的，大小在35KD左右。将表达菌株指定为O8KVJ。

实例5：米曲霉表达菌株O8KVJ的发酵

用10ml的YPM洗涤O8KVJ的斜面并将其接种到8个包含400ml的YPM培养基的在30C、80rpm下振荡的2L烧瓶中，以产生用于表征酶的发酵液。在第3天收获培养物，并且使用0.45微米DURAPORE膜(密理博公司(Millipore)，贝德福德，马萨诸塞州，美国)进行过滤。

实例6：从米曲霉O8KVJ中纯化重组透明嗜热腐质霉GH45内切葡聚糖酶

用硫酸铵(80％饱和度)沉淀重组菌株O8KVJ的3200ml上清液并重新溶解于50ml 20mM NaAc缓冲液(pH 5.5)中，然后用相同缓冲液透析并且通过0.45mm过滤器过滤，终体积为80ml。将溶液施加到在20mM NaAc缓冲液(pH 5.5)中平衡的40ml QFast Flow柱(GE医疗集团，白金汉郡，英国)上，并且用线性NaCl梯度(0-0.5M)洗脱蛋白质。收集用0.1-0.3M NaCl洗脱的级分并用线性(NH₄)₂SO₄梯度(1.2-0M)进一步在40ml Phenyl Sepharose 6Fast Flow柱(GE 17-0965-05)上纯化。通过SDS-PAGE(NP0336BOX，NUPAGE 4％-12％BT GEL 1.5MM15W)评估级分，并且将包含大约35kDa的带的级分汇集。然后将汇集的溶液通过超滤进行浓缩。

实例7：内切葡聚糖酶活性测定

将0.2％AZCL-HE-纤维素(麦格酶(Megazyme)，I-AZCEL)悬浮于20mM Bis-Tris缓冲液(pH 6.0)中，同时通过轻轻搅拌添加0.01％Triton X-100，将其用作底物。然后，将120微升底物和30微升根据实例6制备的1mg/ml酶样品混合于微量滴定板中并在反应之前置于冰上。通过将微量滴定板转移至设定为50℃的测定温度的艾本德(Eppendorf)恒温混匀仪中来启动测定。将板在艾本德恒温混匀仪上在用于微量滴定板的700rpm的其振荡速率下孵育20分钟。通过将板转移回冰浴中终止孵育。然后，将板在冰冷的离心机中离心5分钟并将100微升上清液转移至微量滴定板中。读取OD₅₉₅作为内切纤维素酶活性的量度。一式三份地进行所有反应并且未添加酶的空白缓冲液被包括在测定中。

如果酶样品的OD₅₉₅值减去空白的OD₅₉₅值高于0，则将该酶定义为具有内切葡聚糖酶活性的酶。

在此实例中测试的透明嗜热腐质霉GH45样品的OD₅₉₅值减去空白的OD₅₉₅值高于0，显示本发明中的透明嗜热腐质霉GH45具有内切葡聚糖酶活性。

实例8：在洗衣指数计(Launder-O-meter)中透明嗜热腐质霉GH45和Cellusoft CR对牛仔布的磨损

在本实例中，将纯化自实例6的透明嗜热腐质霉GH45内切葡聚糖酶(SEQ ID NO:2的成熟肽)用于牛仔布磨损。将可商购产品Cellusoft CR作为基准也加以测试。

将未处理的牛仔布脱浆并裁剪为16cm宽和24cm长。将牛仔布裁剪和车缝，从而形成高为12.5cm并且重为约18g的筒。将这些筒在编号之前置于控制室(65％相对湿度，21℃)中24小时，通过分析天平称重并记录。在每个烧杯中放置一个经调节的筒，其中蓝色面朝里。对于每个烧杯，使用30个大螺母(M6M-SR-A4-80，耐酸的，M10DIN 934)、10个小螺母(M6M-SR-A4-80，耐酸的，M6DIN 934)、7个大星形磁铁(直径17mm，货号3-CO-411117，Cowie,Schweiz via Bie&Berntsen)以及3个小星形磁铁(直径14mm，货号3-CO-11117，Cowie,Schweiz via Bie&Berntsen)提供机械辅助。然后，根据表1，基于对实际织物重量的计算，添加如描述于培养基部分而制备的缓冲液和酶溶液，以得到70ml左右的总体积，这将产生3.8:1(v/w)的液体与织物的比。

在选择所需程序后启动洗衣指数计(LOM)机器，并且当温度达到预设温度(例如35℃或55℃)时，将其保持。每个烧杯装配一种内衬有2个neoprin垫片的盖子并且用金属夹紧装置紧密闭合。将这些烧杯加载到预热的LOM中。在水平位置，在这4个鼓位中的每个中，使用金属架来接纳并固定6个烧杯。闭合该LOM盖子并继续洗涤程序，并且启动计时。2小时后，从LOM中移出所有烧杯并将牛仔布样品转移到钝化溶液(2g/L碳酸钠)中在85℃下持续10分钟。然后，将小块布样在热水中漂洗2次并在冷水中漂洗2次。将牛仔布样品滚动干燥(AEG，LAVATHERM 37700，德国)1小时，并且然后在评估之前，将其在65％相对湿度、21℃下调节24小时。

通过用预校准DataColor SF450X测量内切葡聚糖酶处理之前和之后的反射比而确定牛仔布样品的磨损和返染水平。对于L^*和b^*两者而言，每个织物都取四个读数并且使用这四个读数的平均值。用样品蓝面的指数CIE L^*评估磨损水平，并且用样品背面的指数CIE b^*评估返染水平。

如表1所示，在35℃下，与pH 6.5下的0.086mg的Cellusoft CR/g织物相比，pH 7.5下的0.064mg透明嗜热腐质霉GH45内切葡聚糖酶/g织物产生更高的磨损水平，但是产生类似的返染水平；在55℃下，pH 7.5下的0.032mg透明嗜热腐质霉GH45内切葡聚糖酶/g织物给出了与其在35℃下0.064mg/g织物相类似的牛仔布磨损水平；而与其在35℃下0.064mg/g织物相比，pH 6.5下的0.043mgCellusoft CR/g织物产生了高得多的磨损水平。因此，透明嗜热腐质霉GH45内切葡聚糖酶在牛仔布磨损方面给出比Cellusoft C更平的温度曲线。并且为了达到类似的磨损水平，透明嗜热腐质霉GH45内切葡聚糖酶造成较低的返染水平。

表1.在35℃或55℃下，在LOM中，通过透明嗜热腐质霉GH45内切葡聚糖酶和Cellusoft CR的牛仔布磨损，2小时

注：每种条件的三个样品的平均值。

实例9：在洗衣指数计中在不同pH下用透明嗜热腐质霉GH45内切葡聚糖酶进行生物抛光

在本实例中，将纯化自实例6的透明嗜热腐质霉GH45内切葡聚糖酶(SEQ ID NO:2的成熟肽)用于生物抛光。

将棉布小块布样剪成约16cm*16cm(各自约5克)。将这些小块布样在编号之前置于控制室(65％相对湿度，21℃)中24小时，通过分析天平称重并记录。用洗衣指数计进行生物抛光。将两个调节的小块布样和20个大的钢球(总重220克)置于每个烧杯中，以提供机械辅助。将烧杯中填充根据表2的酶和如描述于培养基部分而制备的缓冲液，至总体积为100ml左右，其可以得到约10:1(v/w)的液体与织物的比。

类似于实例8操作LOM，除了以下例外：在4个鼓位中的每个中，将5个烧杯置于垂直位置。在预设温度55℃下，在不同pH下，进行0.016mg透明嗜热腐质霉GH45内切葡聚糖酶/g织物的处理1小时之后，从烧杯中移出小块布样并将其转移到具有2g/L的碳酸钠的钝化溶液中并在85℃下保持10min。然后，将小块布样在热水中漂洗2次并在冷水中漂洗2次。并且，在评估重量损失和起球记录之前，将它们如实例7滚动干燥1小时，在65％相对湿度、21℃下调节24小时。

如表2所概述，本发明的透明嗜热腐质霉GH45内切葡聚糖酶在生物抛光中在pH 6.5至pH 8.5下有效工作并且在pH 7.5下表现最佳。

表2.在55℃下，用透明嗜热腐质霉进GH45内切葡聚糖酶进行LOM生物抛光

pH	重量损失(％)	起球记录
			5	0.2	1.5
6.5	0.8	3.5
			7.5	0.9	4.0
8.5	0.6	3.4

实例10：在洗衣指数计中在不同温度下用透明嗜热腐质霉GH45内切葡聚糖酶和Cellusoft CR进行生物抛光

在本实例中，在不同温度下广泛地测试纯化自实例6的透明嗜热腐质霉GH45内切葡聚糖酶(SEQ ID NO:2的成熟肽)，其中Cellusoft CR作为基准。

织物制备和试验操作类似于实例9，除了以下例外：在此实例中用不同温度/剂量进行若干独立试验。

如表3所概述，在蛋白质基础上，本发明的透明嗜热腐质霉GH45内切葡聚糖酶强于Cellusoft CR：在35℃、pH 6.5下，0.064mg透明嗜热腐质霉GH45内切葡聚糖酶/g织物给出了与0.087mg Cellusoft CR/g织物类似的生物抛光性能；在45℃、pH 7.5下，0.008mg透明嗜热腐质霉GH45内切葡聚糖酶/g织物给出了与pH 6.5下的0.022mg Cellusoft CR/g织物类似的生物抛光性能；在55℃、pH 6.5下，0.016mg透明嗜热腐质霉GH45内切葡聚糖酶/g织物给出了比0.022mg Cellusoft CR/g织物更好的生物抛光性能。所以，在宽的温度范围内，在蛋白质基础上，在生物抛光中，透明嗜热腐质霉GH45强于Cellusoft CR。

表3.在不同温度下用透明嗜热腐质霉GH45内切葡聚糖酶和Cellusoft CR进行LOM生物抛光

实例11：在洗衣指数计中，在用或不用LAS的情况下,用透明嗜热腐质霉GH45内切葡聚糖酶、Cellusoft CR、纤维素酶A进行生物抛光

在本实例中，在存在或不存在0.2g/L的直链烷基苯磺酸盐(LAS)的情况下，针对生物抛光测试纯化自实例6的透明嗜热腐质霉GH45内切葡聚糖酶(SEQ ID NO:2的成熟肽)。可商购产品Cellusoft CR和纤维素酶A作为基准也被包括。

织物制备和试验操作类似于实例9，除了以下例外:在本实例中，在45℃和pH 7.5下进行针对透明嗜热腐质霉GH45内切葡聚糖酶的试验并且在pH 6.5下进行针对另外两者的试验和在所选烧杯中添加0.2g/L的LAS。每种样品的剂量规定于表4中。

如表4所概述，本发明的透明嗜热腐质霉GH45内切葡聚糖酶在pH 7.5下在存在0.2g/L的LAS下表现良好，指示此酶与此阴离子表面活性剂具有良好的相容性。Cellusoft CR也显示出与LAS良好的相容性，然而相比之下，当与该酶一起施加0.2g/L时，观察到纤维素酶A具有明显的性能下降。所以，在生物抛光步骤过程中，透明嗜热腐质霉GH45内切葡聚糖酶是一种与LAS具有良好相容性的纤维素酶。

表4.在45℃下，在用或不用LAS的情况下,用透明嗜热腐质霉GH45内切葡聚糖酶、Cellusoft CR和纤维素酶A进行LOM生物抛光

实例12：在洗衣指数计中在使用盐/染料的情况下用透明嗜热腐质霉GH45内切葡聚糖酶和Cellusoft CR进行生物抛光

在本实例中，在使用盐/一些代表性染料的情况下针对生物抛光测试纯化自实例6的透明嗜热腐质霉GH45内切葡聚糖酶(SEQ ID NO:2的成熟肽)。Cellusoft CR作为基准而被包括。

织物制备和试验操作类似于实例9，除了以下例外：在本实例中，在45℃和pH 7.5下进行针对透明嗜热腐质霉GH45内切葡聚糖酶的试验并且在pH 6.5下进行针对Cellusoft CR的试验并且如表5中所规定的还在一些所选烧杯中添加盐和染料。

如表5所概述，透明嗜热腐质霉GH45内切葡聚糖酶在pH 7.5下显示出与80g/L的Na₂SO₄或NaCl、或5％Black 5、或5％Blue 19、或80g/L的Na₂SO₄和5％空白5的组合的良好的相容性。所以，在生物抛光步骤过程中，透明嗜热腐质霉GH45内切葡聚糖酶是一种与盐和/或染料具有良好相容性的纤维素酶。

表5.在45℃下，用透明嗜热腐质霉GH45内切葡聚糖酶、Cellusoft CR，在用或不用盐和/或染料情况下进行LOM生物抛光

实例13：赫坎梭孢壳基因组DNA提取

将赫坎梭孢壳菌株接种到一个PDA板上并且在37℃下于暗处孵育5天。将若干个菌丝-PDA塞接种于包含了100ml的YPG培养基的500ml摇瓶中。在以160rpm振荡下，将这些烧瓶在45℃下孵育6天。通过过滤通过(美国加利福尼亚州拉霍亚的康碧泉公司(Calbiochem,La Jolla,CA,USA))来收集这些菌丝，并且在液氮中冷冻。将冷冻的菌丝通过研钵和研杵磨成细粉，并且使用由斯科特O.罗杰斯(Scott O.Rogers)&阿诺德J.本迪斯(Arnold J.Bendich)(植物分子生物学(Plant Molecular Biology)5:69-76，1985)研发的方法分离基因组DNA。

实例14：基因组测序、装配与标注

将提取的基因组DNA样品寄往贝瑞和康生物技术有限公司(BerryGenomics company)(北京，中国)，用于使用Hiseq2000系统(亿明达公司，圣地亚哥，加利福尼亚州，美国)进行基因组测序。使用程序Abyss 1.2.7(辛普森(Simpson)等人，2009，基因组研究(Genome Research)19(6):1117-1123)装配原始读数，其中k-mer为51并且品质得分截留值为16。使用标准生物信息学方法分析装配的序列，用于发现基因并预测功能。简言之，使用基因ID(帕拉(Parra)等人，2000，基因组研究(Genome Research)10(4):511-515)预测基因。使用Blastall版本2.2.10(国家生物技术信息中心(NCBI)，贝塞斯达，马里兰州，美国)和HMMER版本2.1.1(国家生物技术信息中心(NCBI)，贝塞斯达，马里兰州，美国)根据结构同源性预测功能。通过对Blast结果的分析直接鉴定家族GH45内切葡聚糖酶候选物。使用Agene(蒙奇(Munch)和克罗格(Krogh)，2006，BMC生物信息学(BMC Bioinformatics)7:263)和SignalP程序(本特森(Bendtsen)等人，2004，分析生物学杂志(J.Mol.Biol.)340:783-795)鉴定起始密码子。进一步使用SignalP估计信号肽的长度。使用Pepstats(欧洲生物信息研究所，辛克斯顿，剑桥CB10 1SD，英国)估计蛋白质的等电点和分子量。

赫坎梭孢壳GH45内切葡聚糖酶的基因组DNA和推导的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4中。编码序列是核苷酸1-1023，包括终止密码子。编码的预测蛋白具有305个氨基酸。使用 SignalP程序，预测了具有21个残基的信号肽，将其通过N-末端测序进一步证实显示成熟肽以ADGKSTR开始。编码的蛋白包含305个氨基酸，其中内切葡聚糖酶催化结构域为氨基酸22至223并且碳水化物结合模块为氨基酸268至305。

实例15：从基因组DNA中克隆赫坎梭孢壳GH45内切葡聚糖酶基因

选择一个GH45内切葡聚糖酶基因GH45_Thihy3331(SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4)用于表达克隆。

根据获得自基因组测序的DNA信息，设计以下示出的寡核苷酸引物从赫坎梭孢壳菌株的基因组DNA中扩增GH45_Hya3331基因。引物由英杰公司(英杰公司，北京中国)制作。

正向引物：5’ACACAACTGGGGATCC ACC atgcgctcgactcccgttc 3’(SEQ ID NO：10)

反向引物：5’GTCACCCTCTAGATCT cgccaaaaggggtagacgagtactc 3’(SEQ ID NO：11)

对于每个基因，将20皮摩尔的引物对(正向引物和反向引物中的每一者)用于PCR反应中，该PCR反应由2微升的赫坎梭孢壳基因组DNA、10微升的5XGC缓冲液、1.5微升的DMSO、各自2.5mM的dATP、dTTP、dGTP和dCTP以及0.6个单位的高保真DNA聚合酶(Finnzymes Oy公司，艾斯堡，芬兰)构成，终体积为50微升。扩增是使用帕尔帖热循环仪(MJ研究有限公司，南旧金山，加利福尼亚州，美国)进行的，编程为：在98℃下变性1分钟；6个循环，在98℃下变性40秒、在65℃下退火40秒(其中每个循环降低1℃)和在72℃下延长1分钟；以及另外的25个循环，各自在94℃下40秒、60℃下40秒和72℃下1分钟；在72℃下最终延伸10分钟。然后将加热块转到4℃浸泡循环。

使用TBE缓冲液(90mM Tris-硼酸盐和1mM EDTA)通过1.0％琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，其中在UV光下看到预期大小1.0kb 左右的单个产物带。然后，根据制造商的说明，通过使用illustra^TM GFX^TM PCR DNA和凝胶带纯化试剂盒(GE医疗集团，白金汉郡，英国)从溶液中纯化PCR产物。

使用In-fusion^TM Dry-down Mix(克罗泰克实验室有限公司，山景城，加利福尼亚州，美国)直接将片段克隆进表达载体pPFJO355中而无需限制酶切消化和连接。

使用In-fusion^TM Dry-down Mix将PCR产物和消化的载体连接在一起，从而产生质粒：pGH45_Thihy3331(图2)，其中赫坎梭孢壳GH45内切葡聚糖酶基因的转录在来自米曲霉α-淀粉酶的基因的启动子的控制之下。克隆操作是根据制造商的说明进行的。简言之，将用Bam HI和Bgl II消化的30ng的pPFJO355和60ng的赫坎梭孢壳GH45内切葡聚糖酶基因PCR产物添加至一个反应小瓶中并且通过添加去离子水而使粉末重悬浮于10微升的终体积中。将反应在37℃下孵育15分钟，并且然后在50℃下孵育15分钟。使用三微升的反应液转化大肠杆菌TOP10感受态细胞(天根生物科技(北京)有限公司，北京，中国)。通过菌落PCR检测包含表达构建体的大肠杆菌转化体，菌落PCR是一种用于直接从大肠杆菌菌落中快速筛选质粒插入片段的方法。简言之，在于每个PCR管(包括PCR缓冲液、MgCl₂、dNTP及从其产生PCR片段的引物对)中的预混合的PCR溶液等分部分中，通过用无菌尖端挑取并且在反应溶液中转动该尖端来添加单菌落。通常筛选7-10个菌落。PCR程序后，在琼脂糖凝胶上检查反应。给出预期大小的扩增的菌落可能包含正确的插入片段。使用Spin Miniprep试剂盒(凯杰有限公司，希尔登，德国)制备质粒DNA。使用3730XL DNA分析仪(应用生物系统公司，福斯特市，加利福尼亚州，美国)通过DNA测序确认插入在pGH45_Thihy3331中的赫坎梭孢壳GH45内切葡聚糖酶基因。

实例16：赫坎梭孢壳GH45内切葡聚糖酶基因在米曲霉中的表达

根据克里斯滕森(Christensen)等人(1988，生物/技术 (Bio/Technology)6:1419-1422)的方法制备米曲霉HowB101(WO 95/035385)原生质体。用3微克的pGH45_Thihy3331转化HowB101。转化产生大约50个转化体。将八个转化体分离到单独的基本培养基板上。

将四个转化体分开接种到于24孔板中的3ml的YPM培养基中并且在30℃下在150rpm混合下孵育。在3天孵育之后，根据制造商的说明，使用具有MES的4％-12％Bis-Tris凝胶(英杰公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚州，美国)通过SDS-PAGE对来自每个培养物的20μl的上清液进行分析。将所得凝胶用INSTANTBLUE^TM(艾本德有限公司，剑桥巴布拉汉，英国)染色。培养物的SDS-PAGE谱显示，赫坎梭孢壳GH45内切葡聚糖酶基因被表达为检测到的蛋白带。主带是染污的，大小在45KD左右。将表达菌株指定为O8KVN。

实例17：米曲霉表达菌株O8KVN的发酵

用10ml的YPM洗涤O8KVN的斜面并将其接种到10个包含400ml的YPM培养基的在30℃、80rpm下振荡的2L烧瓶中，以产生用于表征酶的发酵液。在第3天收获培养物，并且使用0.45微米DURAPORE膜(密理博公司，贝德福德，马萨诸塞州，美国)进行过滤。

实例18：从米曲霉O8KVN中纯化重组赫坎梭孢壳GH45内切葡聚糖酶

用硫酸铵(80％饱和度)沉淀重组菌株O8KVN的4000ml上清液并重新溶解于50ml 20mM NaAc缓冲液(pH 5.5)中，然后用相同缓冲液透析并且通过0.45mm过滤器过滤，终体积为80ml。将溶液施加到在20mM NaAc缓冲液(pH 5.5)中平衡的40ml QFast Flow柱(GE医疗集团，白金汉郡，英国)上，并且用线性NaCl梯度(0-0.5M)洗脱蛋白质，并且收集未结合至柱上的蛋白质并用线性(NH₄)₂SO₄梯度(1.2-0M)在40ml Phenyl Sepharose 6Fast Flow柱(GE 17-0965-05)上进一步纯化。通过SDS-PAGE(NP0336BOX，NUPAGE 4％-12％BT GEL 1.5MM15W)评估级分，并且将包含大约45kDa的带的级分汇集。然后将汇集的溶液通过超滤进行浓缩。

实例19：内切葡聚糖酶活性测定

根据实例7中的测定测试赫坎梭孢壳GH45(SEQ ID NO:4的成熟肽)的内切葡聚糖酶活性。

在此实例中测试的赫坎梭孢壳GH45样品的OD₅₉₅值减去空白的OD₅₉₅值高于0，显示本发明中的赫坎梭孢壳GH45(SEQ ID NO:4的成熟肽)具有内切葡聚糖酶活性。

实例20：在洗衣指数计中，赫坎梭孢壳GH45内切葡聚糖酶GH45_Thihy3331对牛仔布的磨损

在本实例中，将纯化自实例18的赫坎梭孢壳GH45内切葡聚糖酶GH45_Thihy3331(SEQ ID NO:4的成熟肽)用于牛仔布磨损。

将未处理的牛仔布脱浆并裁剪为16cm宽和24cm长。将牛仔布裁剪和车缝，从而形成高为12.5cm并且重为约18g的筒。将这些筒在编号之前置于控制室(65％相对湿度，21℃)中24小时，通过分析天平称重并记录。在每个烧杯中放置一个经调节的筒，其中蓝色面朝里。对于每个烧杯，使用30个大螺母(M6M-SR-A4-80，耐酸的，M10DIN 934)、10个小螺母(M6M-SR-A4-80，耐酸的，M6DIN 934)、7个大星形磁铁(直径17mm，货号3-CO-411117，Cowie,Schweiz via Bie&Berntsen)以及3个小星形磁铁(直径14mm，货号3-CO-11117，Cowie,Schweiz via Bie&Berntsen)提供机械辅助。然后，根据表6，基于对实际织物重量的计算，添加如描述于培养基部分而制备的缓冲液和酶溶液，以得到70ml左右的总体积，这将产生3.8:1(v/w)的液体与织物的比。

在选择所需程序后启动洗衣指数计(LOM)机器，并且当温度达到预设温度(例如35℃或55℃)时，将其保持。每个烧杯装配一种内衬有2个neoprin垫片的盖子并且用金属夹紧装置紧密闭合。将这些烧杯加载到预热的LOM中。在水平位置，在这4个鼓位中的每个中，使用金属架来接纳并固定6个烧杯。闭合该LOM盖子并继续洗涤程序，并且启动计时。2小时后，从LOM中移出所有烧杯并将牛仔布样品转移到钝化溶液(2g/L碳酸钠)中在85C下持续10分钟。然后，将小块布样在热水中漂洗2次并在冷水中漂洗2次。将牛仔布样品滚动干燥(AEG，LAVATHERM 37700，德国)1小时，并且然后在评估之前，将其在21℃、65％相对湿度下调节24小时。

如表6所示，在0.064mg酶/g织物的剂量下，赫坎梭孢壳GH45内切葡聚糖酶GH45-Thihy3331在牛仔布织物上产生了明显的磨损效果。并且，在35℃至55℃的温度范围内，其牛仔布磨损性能是稳定的，从而在石洗中为顾客提供更多的操作灵活性。

表6.在35℃或55℃下，在LOM中，通过GH45_Thihy3331的牛仔布磨损，2小时

注：每种条件的三个样品的平均值。

实例21：在洗衣指数计中在不同pH下用赫坎梭孢壳GH45内切葡聚糖酶GH45_Thihy3331进行生物抛光

在本实例中，将纯化自实例18的赫坎梭孢壳GH45内切葡聚糖酶GH45_Thihy3331(SEQ ID NO:4的成熟肽)用于在不同pH下进行生物抛光。

类似于实例20操作LOM，除了以下例外：在4个鼓位中的每个中，将5个烧杯置于垂直位置。在预设温度55℃下，在不同pH下，用0.032mgGH45_Thihy3331/g织物进行处理1小时之后，从烧杯中移出小块布样并将其转移到具有2g/L的碳酸钠的钝化溶液中并在85℃下保持10min。然后，将小块布样在热水中漂洗2次并在冷水中漂洗2次。并且，在评估重量损失和起球记录之前，将它们如实例20滚动干燥1小时，在21℃、65％相对湿度下调节24小时。

如表7所概述，本发明的赫坎梭孢壳GH45内切葡聚糖酶在棉生物抛光中在pH 6.5至pH 8.5下有效工作并且在pH 6.5至pH 7.5下表现最佳。

表7.在55℃和不同pH下用赫坎梭孢壳GH45内切葡聚糖酶GH45_Thihy3331进行LOM生物抛光

pH	剂量(mg酶蛋白/g织物)	重量损失(％)	起球记录
				6.5	0.032	0.8	3.3
7.5	0.032	0.6	3.3
				8.5	0.032	0.3	2.6

实例22：在洗衣指数计中在不同温度下用赫坎梭孢壳GH45内切葡聚糖酶GH45_Thihy3331进行生物抛光

在本实例中，将纯化自实例18的赫坎梭孢壳GH45内切葡聚糖酶GH45_Thihy3331(SEQ ID NO:4的成熟肽)用于在不同温度下进行生物抛光。

织物制备和LOM操作类似于实例21，除了以下例外:在本实例中，将pH固定在6.5处同时将3个不同温度应用于3个分开的试验。

如表8所概述，在pH 6.5下，在从35℃至55℃的宽的温度范围内，本发明的赫坎梭孢壳GH45内切葡聚糖酶GH45_Thihy3331在棉生物抛光中有效工作。

表8.在不同温度下用赫坎梭孢壳GH45内切葡聚糖酶GH45_Thihy3331进行LOM生物抛光

实例23：赫坎梭孢壳基因组DNA提取

实例24：基因组测序、装配与标注

将提取的基因组DNA样品寄往贝瑞和康生物技术有限公司(北京，中国)，用于使用Hiseq2000系统(亿明达公司，圣地亚哥，加利福尼亚州，美国)进行基因组测序。使用程序Abyss 1.2.7(辛普森(Simpson)等人，2009，基因组研究(Genome Research)19(6):1117-1123)装配原始读数，其中k-mer为51并且品质得分截留值为16。使用标准生物信息学方法分析装配的序列，用于发现基因并预测功能。简言之，使用基因ID(帕拉(Parra)等人，2000，基因组研究(Genome Research)10(4):511-515)预测基因。使用Blastall版本2.2.10(国家生物技术信息中心(NCBI)，贝塞斯达，马里兰州，美国)和HMMER版本2.1.1(国家生物技术信息中心(NCBI)，贝塞斯达，马里兰州，美国)根据结构同源性预测功能。通过对Blast结果的分析直接鉴定家族GH45内切葡聚糖酶候选物。使用Agene(蒙奇(Munch)和克罗格(Krogh)，2006，BMC生物信息学(BMC Bioinformatics)7:263)和SignalP程序(本特森(Bendtsen)等人，2004，分析生物学杂志(J. Mol.Biol.)340:783-795)鉴定起始密码子。进一步使用SignalP估计信号肽的长度。使用Pepstats(欧洲生物信息研究所(European Bioinformatics Institute)，辛克斯顿，剑桥CB10 1SD，英国)估计蛋白质的等电点和分子量。

赫坎梭孢壳GH45内切葡聚糖酶的基因组DNA和推导的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6中。编码序列是核苷酸1-838，包括终止密码子。编码的预测蛋白具有222个氨基酸。使用SignalP程序，预测了具有18个残基的信号肽，将其通过N-末端测序进一步证实显示成熟肽以QATGKTT开始。编码的蛋白包含222个氨基酸，其中内切葡聚糖酶催化结构域为氨基酸21至222。

实例25：从基因组DNA中克隆赫坎梭孢壳GH45内切葡聚糖酶基因

选择一个GH45内切葡聚糖酶基因GH45_Thihy0507(SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6)用于表达克隆。

根据获得自基因组测序的DNA信息，设计以下示出的寡核苷酸引物从赫坎梭孢壳菌株的基因组DNA中扩增GH45_Thihy0507基因。引物由英杰公司(英杰公司，北京中国)制作。

正向引物：5’ACACAACTGGGGATCC ACC atgcatctccccctg 3’(SEQ ID NO：12)

反向引物：5’GTCACCCTCTAGATCT attcaccatcgcatacagccac 3’(SEQ ID NO：13)

使用TBE缓冲液(90mM Tris-硼酸盐和1mM EDTA)通过1.0％琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，其中在UV光下看到预期大小0.9kb左右的单个产物带。然后，根据制造商的说明，通过使用illustra^TM GFX^TM PCR DNA和凝胶带纯化试剂盒(GE医疗集团，白金汉郡，英国)从溶液中纯化PCR产物。

使用In-fusion^TM Dry-down Mix将PCR产物和消化的载体连接在一起，从而产生质粒：pGH45_Thihy0507(图3)，其中赫坎梭孢壳GH45内切葡聚糖酶基因的转录在来自米曲霉α-淀粉酶的基因的启动子的控制之下。克隆操作是根据制造商的说明进行的。简言之，将用Bam HI和Bgl II消化的30ng的pPFJO355和60ng的赫坎梭孢壳GH45内切葡聚糖酶基因PCR产物添加至一个反应小瓶中并且通过添加去离子水而使粉末重悬浮于10微升的终体积中。将反应在37℃下孵育15分钟，并且然后在50℃下孵育15分钟。使用三微升的反应液转化大肠杆菌TOP10感受态细胞(天根生物科技(北京)有限公司，北京，中国)。通过菌落PCR检测包含表达构建体的大肠杆菌转化体，菌落PCR是一种用于直接从大肠杆菌菌落中快速筛选质粒插入片段的方法。简言之，在于每个PCR管(包括PCR缓冲液、MgCl2、dNTP及从其产生PCR片段的引物对)中的预混合的PCR溶液等分部分中，通过用无菌尖端挑取并且在反应溶液中转动该尖端来添加单菌落。通常筛选7-10个菌落。PCR程序后，在琼脂糖凝胶上检查反应。给出预期大小的扩增的菌落可能包含正确的插入片段。使用Spin Miniprep试剂盒(凯杰有限公司，希尔登，德国)制备质粒DNA。使用3730XL DNA分析仪(应用生物系统公司，福斯特市，加利福尼亚州，美国)通过DNA测序确认插入在pGH45_Thihy0507中的赫坎梭孢壳GH45内切葡聚糖酶基因。

实例26：赫坎梭孢壳GH45内切葡聚糖酶基因在米曲霉中的表达

根据克里斯滕森(Christensen)等人(1988，生物/技术(Bio/Technology)6:1419-1422)的方法制备米曲霉HowB101(WO 95/035385)原生质体。用3微克的pGH45_Thihy0507转化HowB101。转化产生大约50个转化体。将八个转化体分离到单独的基本培养基板上。

将四个转化体分开接种到于24孔板中的3ml的YPM培养基中并且在30℃下在150rpm混合下孵育。在3天孵育之后，根据制造商的说明，使用具有MES的4％-12％Bis-Tris凝胶(英杰公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚州，美国)通过SDS-PAGE对来自每个培养物的20μl的上清液进行分析。将所得凝胶用INSTANTBLUE^TM(艾本德有限公司(Expedeon Ltd.)，剑桥巴布拉汉(Babraham Cambridge)，英国)染色。培养物的SDS-PAGE谱显示，赫坎梭孢壳GH45内切葡聚糖酶基因被表达为检测到的蛋白带。2个主带的大小为25-30KD左右将表达菌株指定为O8KVP。

实例27：米曲霉表达菌株O8KVP的发酵

用10ml的YPM洗涤O8KVP的斜面并将其接种到10个包含400ml的YPM培养基的在30℃、80rpm下振荡的2L烧瓶中，以产生用于表征酶的发酵液。在第3天收获培养物，并且使用0.45微米DURAPORE膜(密理博公司，贝德福德，马萨诸塞州，美国)进行过滤。

实例28：从米曲霉O8KVP中纯化重组赫坎梭孢壳GH45内切葡聚糖酶

用硫酸铵(80％饱和度)沉淀重组菌株O8KVP的4000ml上清液并重新溶解于150ml 20mM Bis-Tris缓冲液(pH 6.0)中，并且通过0.45mm过滤器过滤。将溶液施加到40ml Phenyl Sepharose 6Fast Flow柱(17-0965-05，GE医疗集团，白金汉郡，英国)上，用线性(NH₄)₂SO₄ 梯度(1.2-0M)洗脱蛋白质，并且收集未结合至柱上的蛋白质并用线性NaCl梯度(0-0.5M)在于20mM Bis-Tris缓冲液(pH 6.0)中平衡的40ml Q FF柱(GE)上进一步纯化。通过SDS-PAGE(NP0336BOX，NUPAGE 4％-12％BT GEL 1.5MM15W)评估级分，并且将包含大约25kDa的带的级分汇集。然后将汇集的溶液通过超滤进行浓缩。

实例29：内切葡聚糖酶活性测定

根据实例7中的测定测试赫坎梭孢壳GH45(SEQ ID NO:6的成熟肽)的内切葡聚糖酶活性。

在此实例中测试的赫坎梭孢壳GH45(SEQ ID NO:6的成熟肽)的OD₅₉₅值减去空白的OD₅₉₅值高于0，显示本发明中的赫坎梭孢壳GH45具有内切葡聚糖酶活性。

实例30：在洗衣指数计中，用赫坎梭孢壳GH45内切葡聚糖酶GH45_Thihy0507进行生物抛光

在本实例中，将纯化自实例28的赫坎梭孢壳GH45内切葡聚糖酶GH45_Thihy0507(SEQ ID NO:6的成熟肽)用于生物抛光。

将棉布小块布样剪成约16cm*16cm(各自约5克)。将这些小块布样在编号之前置于控制室(65％相对湿度，21℃)中24小时，通过分析天平称重并记录。用洗衣指数计进行生物抛光。将两个调节的小块布样和20个大的钢球(总重220克)置于每个烧杯中，以提供机械辅助。将烧杯中填充根据表9的酶和如描述于培养基部分而制备的缓冲液，至总体积为100ml左右，其可以得到约10:1(v/w)的液体与织物的比。

在选择所需程序后启动洗衣指数计(LOM)机器，并且当温度达到预设温度(例如35℃、45℃或55℃)时，将其保持。每个烧杯装配一种内衬有2个neoprin垫片的盖子并且用金属夹紧装置紧密闭合。将这些烧杯加载到预热的LOM中。在垂直位，在这4个鼓位中的每个中，使用金属架来接纳并固定5个烧杯。闭合该LOM盖子并继续洗涤程序，并且启动计时。1小时后，从LOM中移出所有烧杯并将织物样品转移到钝化溶液(2g/L碳酸钠)中在85C下持续10分钟。然后，将小块布样在热水中漂洗2次并在冷水中漂洗2次。将织物样品滚动干燥(AEG，LAVATHERM 37700，德国)1小时，并且然后在评估重量损失和起球记录之前，将其在21℃、65％相对湿度下调节24小时。

如表9所示，在pH 6.5下，在从35℃至55℃的宽的温度范围内，赫坎梭孢壳GH45内切葡聚糖酶GH45-Thihy0507产生重量损失并在棉织物上给出了抗起球效应。它在35℃至45℃下表现最佳，在该温度下0.064mgGH45-Thihy0507/g产生接近3.0的起球记录，而相比之下，在55℃下达到类似的起球记录需要0.128mgGH45-Thihy0507/g。

表9.在不同温度、pH 6.5下，用赫坎梭孢壳GH45GH45_Thihy0507进行60min LOM生物抛光

实例31：在洗衣指数计中在不同pH下用赫坎梭孢壳GH45内切葡聚糖酶GH45_Thihy0507进行生物抛光

在本实例中，将纯化自实例28的赫坎梭孢壳GH45内切葡聚糖酶GH45_Thihy0507(SEQ ID NO:6的成熟肽)用于在不同pH下进行生物抛光。

织物制备和LOM操作类似于实例30，除了以下例外:在本实例中，将温度固定在55℃处同时应用不同pH。

如表10所概述，本发明的赫坎梭孢壳GH45内切葡聚糖酶在棉生物抛光中在pH 5至pH 8.5下有效工作并且在pH 5至pH 7.5下表现最佳。在55℃下的1小时处理中，在从5至7.5的pH范围内，0.256mg内切葡聚糖酶/g产生3.8至4.1的起球记录并且在pH 8.5下产生2.5的起球记录。

表10.在55℃和不同pH下用赫坎梭孢壳GH45内切葡聚糖酶GH45_Thihy0507进行LOM生物抛光

在此描述并且要求的本发明不限于在此披露的具体方面的范围，因为这些方面意图作为本发明若干方面的说明。预期任何等效方面都处于本发明的范围内。实际上，除在此所示和描述的那些之外，本发明的不同修改对于本领域普通技术人员而言从前述描述将变得清楚。这类修改也旨在落入所附权利要求书的范围内。在有冲突的情况下，以包括定义的本披露为准。

Claims

(d)SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6的成熟多肽的一种变体，该变体在一个或若干个位置处包括取代、缺失和/或插入；以及

2.如权利要求1所述的多肽，该多肽包括SEQ ID NO:2或SEQ IDNO:4或SEQ ID NO:6或者SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4或SEQ IDNO:6的成熟多肽或者由其组成。

3.如权利要求2所述的多肽，其中该成熟多肽是SEQ ID NO:2的氨基酸22至286、SEQ ID NO:4的氨基酸22至305或SEQ ID NO:6的氨基酸19至222。

4.如权利要求1-3中任一项所述的多肽，该多肽是SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6的成熟多肽的一种变体，该变体在一个或若干个位置处包括取代、缺失和/或插入。

5.一种分离的多肽，该分离的多肽包括选自下组的催化结构域，该组由以下各项组成：

(b)一种催化结构域，该催化结构域由以下多核苷酸编码，该多核苷酸在中严格条件下与(i)SEQ ID NO:1的核苷酸64至838或SEQID NO:3的核苷酸64至774或SEQ ID NO:5的核苷酸61至835，(ii)其cDNA序列或(iii)(i)或(ii)的全长互补体杂交；

6.如权利要求5所述的多肽，该多肽进一步包括一种碳水化物结合模块。

7.一种分离的多肽，该分离的多肽包括可操作地连接至一种催化结构域的一种碳水化物结合模块，其中该结合结构域选自下组，该组由以下各项组成：

(c)一种碳水化物结合模块，该碳水化物结合模块由与SEQ IDNO:1的核苷酸875至985具有至少80％序列一致性或与SEQ ID NO:3的核苷酸907至1020具有至少85％序列一致性的多核苷酸、或其cDNA序列编码；

8.如权利要求5所述的多肽，其中该催化结构域获得自水解酶、异构酶、连接酶、裂解酶、氧化还原酶或转移酶，例如氨肽酶、淀粉酶、碳水化物酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质酶、环糊精葡萄糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、内切葡聚糖酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、变聚糖酶、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、木聚糖酶或β-木糖苷酶。

9.如权利要求1-8中任一项所述的多肽，该多肽获得自腐质霉属，优选地获得自透明嗜热腐质霉，或获得自梭孢壳属，优选地获得自赫坎梭孢壳。

10.一种包括如权利要求1-9中任一项所述的多肽的组合物。

11.一种分离的多核苷酸，该多核苷酸编码如权利要求1-9中任一项所述的多肽。

12.一种核酸构建体或表达载体，该核酸构建体或表达载体包括如权利要求11所述的多核苷酸，该多核苷酸可操作地连接至指导该多肽在一个表达宿主内的产生的一个或多个控制序列。

13.一种重组宿主细胞，该重组宿主细胞包括如权利要求11所述的多核苷酸，该多核苷酸可操作地连接至指导该多肽的产生的一个或多个控制序列。

14.一种用如权利要求1-9中任一项所述的多肽处理纺织品的方法。

15.如权利要求14所述的方法，其中该方法进一步包括使用一种或多种选自下组的酶，该组由以下各项组成：过氧化氢酶、蛋白酶、脂肪酶、角质酶、淀粉酶、半纤维素酶、果胶酶、纤维素酶以及过氧化物酶。