CN104204199B

CN104204199B - 具有内切葡聚糖酶活性的多肽和编码该多肽的多核苷酸

Info

Publication number: CN104204199B
Application number: CN201380015793.8A
Authority: CN
Inventors: 赖伟坚; N.斯博德斯伯格; L.安德森
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novo Nordisk AS
Priority date: 2012-02-20
Filing date: 2013-02-19
Publication date: 2017-09-05
Anticipated expiration: 2033-02-19
Also published as: CN104204199A

Abstract

本发明涉及具有内切葡聚糖酶活性的分离的多肽、催化域、纤维素结合域和编码所述多肽、催化域、或纤维素结合域的多核苷酸。本发明还涉及包含所述多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞，以及生成和使用所述多肽、催化域、或纤维素结合域的方法。

Description

具有内切葡聚糖酶活性的多肽和编码该多肽的多核苷酸

涉及序列表

本申请包含计算机可读形式的序列表，其通过提及并入本文。

涉及生物材料的保藏物

本申请含有生物材料保藏物的提及，该保藏物通过提及并入本文。

发明背景

技术领域

本发明涉及具有内切葡聚糖酶活性的多肽，催化域，和内切葡聚糖酶结合域，和编码所述多肽，催化域，和内切葡聚糖酶结合域的多核苷酸。本发明亦涉及包含所述多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞，以及产生和使用所述多肽，催化域，和内切葡聚糖酶结合域的方法。

背景技术

纤维素是简单糖葡萄糖通过β-1,4-键共价连接的聚合物。许多微生物产生水解β-连接的葡聚糖的酶，诸如纤维素酶。纤维素酶包括内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶。内切葡聚糖酶在随机位置消化纤维素聚合物，使其暴露于纤维二糖水解酶攻击(attack)。纤维二糖水解酶从纤维素聚合物的末端顺序地释放纤维二糖的分子。纤维二糖是水溶性的β-1,4-连接的葡萄糖二聚体。β-葡糖苷酶将纤维二糖水解成葡萄糖。

纤维素酶有一大批工业应用。在纺织品产业中，纤维素酶在劳动布修整中用于在生物打磨(biostoning)工艺中在劳动布衣服中产生流行的砂洗外观。纤维素酶还用于例如清洁细毛，并且防止棉衣表面上形成小球。

WO9629397公开了具有内切葡聚糖酶活性的来自拟刺盘抱周刺座霉(Volutellacolletotrichoides)的多肽。

本发明提供了具有内切葡聚糖酶活性的多肽及编码该多肽的多核苷酸。

发明概述

本发明涉及具有内切葡聚糖酶活性的分离的多肽，其选自下组：

(a)多肽，其与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少80％序列同一性；

(b)多肽，其由多核苷酸编码，该多核苷酸在中等，中等-高，高、或非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列，(ii)其cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补物；

(c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸与SEQ ID NO:1或其cDNA序列的成熟多肽编码序列具有至少80％序列同一性；

(d)SEQ ID NO:2的成熟多肽的变体，其在一个或多个(例如几个)位置包含取代、缺失和/或插入；和

(e)(a)，(b)，(c)，或(d)的多肽的片段，其具有内切葡聚糖酶活性。

本发明还涉及包含催化域的分离的多肽，所述催化域选自下组：

(a)催化域，其与SEQ ID NO:2的氨基酸17至232具有至少80％序列同一性；

(b)催化域，其由多核苷酸编码，该多核苷酸在中等，中等-高、高、或非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQ ID NO:1的核苷酸49至953，(ii)其cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补物；

(c)催化域，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸与SEQ ID NO:1或其cDNA序列的核苷酸49至953具有至少80％序列同一性；

(d)SEQ ID NO:2的氨基酸17至232的变体，其在一个或多个(例如几个)位置包含取代、缺失和/或插入；和

(e)(a)，(b)，(c)，或(d)的催化域的片段，其具有内切葡聚糖酶活性。

本发明还涉及包含纤维素结合域的分离的多肽，所述结合域选自下组：

(a)纤维素结合域，其与SEQ ID NO:2的氨基酸267至305具有至少80％序列同一性；

(b)纤维素结合域，其由多核苷酸编码，该多核苷酸在中等，中等-高、高、或非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQ ID NO:1的核苷酸1056至1172，(ii)其cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补物；

(c)纤维素结合域，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸与SEQ ID NO:1或其cDNA序列的核苷酸1056至1172具有至少80％序列同一性；

(d)SEQ ID NO:2的氨基酸267至305的变体，其在一个或多个(例如几个)位置包含取代、缺失和/或插入；和

(e)(a)，(b)，(c)，或(d)的纤维素结合域的片段，其具有结合活性。

本发明还涉及编码本发明多肽的分离的多核苷酸；包含该多核苷酸的核酸构建体；重组表达载体；重组宿主细胞；和生成多肽的方法。

本发明还涉及用本发明的具有内切葡聚糖酶活性的酶处理纺织品的方法。

本发明还涉及编码包含或组成为SEQ ID NO:2的氨基酸1至16的信号肽的多核苷酸，其与编码蛋白质的基因可操作连接；包含该多核苷酸的核酸构建体，表达载体，和重组宿主细胞；和生成蛋白质的方法。

定义

内切葡聚糖酶：术语“内切葡聚糖酶”意指内切-1,4-(1,3；1,4)-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶(endo-1,4-β-D-glucan 4-glucanohydrolase)(E.C.3.2.1.4)，其催化纤维素、纤维素衍生物(例如羧甲基纤维素和羟乙基纤维素)、地衣淀粉(lichenin)中的1,4-β-D-糖苷键、混合的β-1,3葡聚糖例如谷类β-D-葡聚糖或木葡聚糖和含有纤维素组分的其它植物材料中的β-1,4键的内水解(endohydrolysis)。内切葡聚糖酶活性可通过测量底物粘度的减少或由还原糖测定法(Zhang等,2006,Biotechnology Advances 24:452-481)确定的还原端增加来确定。出于本发明的目的，根据Ghose,1987,Pure and Appl.Chem.59:257-268的第264页中部分VI的方法，使用羧甲基纤维素(CMC)作为底物来确定内切葡聚糖酶活性。

本发明的多肽具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的内切葡聚糖酶活性的至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或至少100％。

等位变体(allelic variant)：术语“等位变体”意指占据相同染色体基因座的基因的任何两种或更多种可选形式。等位变异通过突变天然地发生，并且可导致种群内的多态性。基因突变可以是沉默的(在编码的多肽中无变化)或可以编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位变体是由基因的等位变体编码的多肽。

结合域：术语“纤维素结合域”意指介导酶对纤维素底物的无定形区的结合的酶的区域。纤维素结合域(CBD)通常见于内切葡聚糖酶的N末端或C末端。

催化域：术语“催化域”意指含有酶的催化机构(catalytic machinery)的酶的区域。

cDNA：术语“cDNA”意指能够通过反转录从得自真核或原核细胞的成熟的、已剪接的mRNA分子制备得到的DNA分子。cDNA缺少通常存在于相应基因组DNA中的内含子序列。最初的(initial)初级RNA转录物是mRNA的前体，其通过一系列的步骤加工包括剪接，然后作为成熟的已剪接的mRNA出现。

编码序列：术语“编码序列”意指直接指定多肽的氨基酸序列的多核苷酸。编码序列的边界通常由开放阅读框决定，所述开放阅读框以起始密码子如ATG、GTG或TTG开始，并且以终止密码子如TAA、TAG或TGA结束。编码序列可以是基因组DNA、cDNA、合成DNA或其组合。

调控序列(control sequence)：术语“调控序列”意指对编码本发明的成熟多肽的多核苷酸表达是必需的核酸序列。各个调控序列对于编码所述成熟多肽的多核苷酸可以是天然的(即，来自同一基因)或外源的(即，来自不同基因)，或各个调控序列对于彼此可以是天然的或外源的。这些调控序列包括但不限于前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列和转录终止子。至少，调控序列包括启动子和转录和翻译的终止信号。调控序列可以配备用于引入特异性限制位点的接头，所述特异性限制位点促进调控序列与编码多肽的多核苷酸编码区的连接。

表达：术语“表达”包括涉及多肽产生的任何步骤，其包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。

表达载体：术语“表达载体”意指线性的或环状的DNA分子，其包含编码多肽的多核苷酸，并且所述多核苷酸与提供用于其表达的调控序列可操作地连接。

片段：术语“片段”意指从成熟多肽或域的氨基和/或羧基末端缺失一个或多个(例如几个)氨基酸的多肽或催化域或纤维素结合域；其中所述片段具有内切葡聚糖酶活性或纤维素结合活性。在一个方面，片段含有SEQ ID NO:2的成熟多肽的氨基酸数目的至少85％，90％，和95％。

高严格条件：术语“高严格条件”意指对于长度至少100个核苷酸的探针，在42℃，在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml已剪切并且变性的鲑精DNA和50％的甲酰胺中，根据标准的Southern印迹法进行预杂交和杂交12至24小时。使用2X SSC、0.2％SDS在65℃将载体材料最终洗涤三次，每次15分钟。

宿主细胞：术语“宿主细胞”意指适合于使用包含本发明多核苷酸的核酸构建体或表达载体进行转化、转染、转导等的细胞类型。术语“宿主细胞”涵盖亲本细胞的任何由于在复制中发生的突变而不同于亲本细胞的后代。

分离的：术语“分离的”意指以不在自然界出现的形式或环境存在的物质。分离的物质的非限定性实例包括(1)任何非天然存在的物质，(2)任何至少部分地与一种或多种或全部与其天然伴随的天然存在的成分脱离的物质，包括但不限于任何酶、变体、核酸、蛋白质、肽或辅因子；(3)任何相对于自然界中所见的该物质而言经过了人工修饰的物质；或(4)任何通过相对于与其天然伴随的其他组分增加该物质的量(例如，编码该物质的基因的多拷贝；以及使用比与编码该物质的基因天然伴随的启动子更强的启动子)而修饰的物质。分离的物质可以存在于发酵液样品中。

成熟多肽：术语“成熟多肽”意指以其在翻译和任何翻译后修饰之后的最终形式存在的多肽，所述修饰例如N-末端加工、C-末端截短、糖基化、磷酸化等。在一个方面，根据预测SEQ ID NO:2的氨基酸1至16是信号肽的SignalP程序(Nielsen等,1997,ProteinEngineering 10:1-6)，成熟多肽是SEQ ID NO:2的氨基酸17至305。本领域中已知宿主细胞可产生由相同多核苷酸表达的两种或更多种不同成熟多肽(即，具有不同的C-端和/或N-端氨基酸)的混合物。

成熟多肽编码序列：术语“成熟多肽编码序列”意指编码具有内切葡聚糖酶活性的成熟多肽的多核苷酸。在一个方面，根据预测SEQ ID NO:1的核苷酸1至48编码信号肽的SignalP程序(Nielsen等,1997，见上)，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:1或其cDNA序列的核苷酸49至1172。

中等严格条件：术语“中等严格条件”意指对于长度至少100个核苷酸的探针，在42℃，在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml已剪切并且变性的鲑精DNA和35％的甲酰胺中，根据标准的Southern印迹法进行预杂交和杂交12至24小时。使用2X SSC、0.2％SDS在55℃将载体材料最终洗涤三次，每次15分钟。

中等-高严格条件：术语“中等-高严格条件”意指对于长度至少100个核苷酸的探针，在42℃，在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml已剪切并且变性的鲑精DNA和35％的甲酰胺中，根据标准的Southern印迹法进行预杂交和杂交12至24小时。使用2X SSC、0.2％SDS在60℃将载体材料最终洗涤三次，每次15分钟。

核酸构建体：术语“核酸构建体”意指单链或双链的核酸分子，其分离自天然存在的基因，或其经修饰以本来不存在于(not otherwise exist)自然界中的方式含有核酸的区段，或其为合成的，其包含一个或多个调控序列。

可操作地连接：术语“可操作地连接”意指这样的构型，其中将调控序列置于相对于多核苷酸的编码序列的适当位置，使得调控序列指导编码序列的表达。

序列同一性：参数“序列同一性”描述两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性。

就本发明而言，两个氨基酸序列之间的序列同一性程度使用如EMBOSS软件包(EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite,Rice等,2000,TrendsGenet.16:276-277)，优选5.0.0版或更高版本的Needle程序中所执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443-453)来测定。使用的参数为缺口打开罚分(gap open penalty)10，缺口延伸罚分(gap extension penalty)0.5和EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版)取代矩阵。使用Needle标记为“最高同一性(longest identity)”的输出结果(使用-nobrief选项获得)作为同一性百分比，并计算如下：

(同样的残基x100)/(比对长度－比对中缺口的总数)

就本发明而言，两个核苷酸序列之间的序列同一性程度使用如EMBOSS软件包(EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite,Rice等,2000,见上文)，优选5.0.0版或更高版本的Needle程序中所执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970,见上文)来测定。使用的参数为缺口打开罚分10，缺口延伸罚分0.5和EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版)取代矩阵。使用Needle标记为“最高同一性”的输出结果(使用-nobrief选项获得)作为同一性百分比，并计算如下：

(同样的脱氧核糖核苷酸×100)/(比对长度－比对中缺口的总数)

亚序列：术语“亚序列(subsequence)”意指从成熟多肽编码序列的5’和/或3’端缺失一个或多个(例如几个)核苷酸的多核苷酸；其中所述亚序列编码具有内切葡聚糖酶活性的片段。

变体：术语“变体”意指在一个或多个(例如几个)位置包含改变，即取代、插入和/或缺失的具有内切葡聚糖酶活性的多肽。取代意指将占据某位置的氨基酸用不同的氨基酸替代；缺失意指去除占据某位置的氨基酸；而插入意指在在占据某位置的氨基酸附近添加一个或多个(例如几个)氨基酸，例如1-5个氨基酸。

非常高严格条件：术语“非常高严格条件”意指对于长度至少100个核苷酸的探针，在42℃，在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml已剪切并且变性的鲑精DNA和50％的甲酰胺中，根据标准的Southern印迹法进行预杂交和杂交12至24小时。使用2X SSC、0.2％SDS在70℃将载体材料最终洗涤三次，每次15分钟。

发明详述

具有内切葡聚糖酶活性的多肽

在一个实施方案中，本发明涉及与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有SEQ ID NO:2of至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或100％的序列同一性的分离的多肽，其具有内切葡聚糖酶活性。在一个方面，多肽与SEQ ID NO:2的成熟多肽相差不超过10个氨基酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8、或9个。

优选地，本发明的多肽包含或组成为SEQ ID NO:2的氨基酸序列或其等位变体；或是其具有内切葡聚糖酶活性的片段。在另一个方面，多肽包含或组成为SEQ ID NO:2的成熟多肽。在另一个方面，多肽包含或组成为SEQ ID NO:2的氨基酸17至305。

在另一个实施方案中，本发明涉及由多核苷酸编码的具有内切葡聚糖酶活性的分离的多肽，所述多核苷酸在中等严格条件，中等-高严格条件，高严格条件，或非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列，(ii)其cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补物(Sambrook等,1989,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,2dedition,Cold Spring Harbor,New York)。

可利用SEQ ID NO:1的多核苷酸或其亚序列，以及SEQ ID NO:2的多肽或其片段设计核酸探针，以根据本领域内公知的方法从不同属或种的菌株鉴定和克隆编码具有内切葡聚糖酶活性的多肽的DNA。具体而言，根据标准的Southern印迹方法，可将这些探针用于与感兴趣的细胞的基因组DNA或cDNA杂交，以鉴定和从其中分离相应的基因。这些探针可明显短于完整序列，但长度上应为至少15，例如至少25，至少35，或至少70个核苷酸。优选地，所述核酸探针是至少100个核苷酸的长度，例如，至少200个核苷酸，至少300个核苷酸，至少400个核苷酸，至少500个核苷酸，至少600个核苷酸，至少700个核苷酸，至少800个核苷酸，或至少900个核苷酸的长度。DNA和RNA探针二者均可使用。通常将探针标记以探测相应的基因(例如，用³²P、³H、³⁵S、生物素或抗生物素蛋白(avidin)标记)。这些探针涵盖于本发明中。

可从由这样的其它菌株制备的基因组DNA或cDNA文库中筛选与上述探针杂交并且编码具有内切葡聚糖酶活性的多肽的DNA。可以通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳，或通过其它分离技术分离来自这些其它菌株的基因组或其它DNA。可以将来自文库的DNA或分离的DNA转移至硝化纤维素(nitrocellulose)或其它合适的载体材料并且固定于其上。为了鉴定与SEQ ID NO:1或其亚序列杂交的克隆或DNA，将所述载体材料用在Sounthern印迹中。

就本发明而言，杂交表示多核苷酸在非常低至非常高的严格条件下与标记的核酸探针杂交，所述核酸探针对应于：(i)SEQ ID NO:1；(ii)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列；(iii)其cDNA序列；(iv)它们的全长互补物，或(v)它们的亚序列。可使用例如X射线胶片(X-ray film)或其他任何本领域中已知的检测手段检测在这些条件下与核酸探针杂交的分子。

在另一个方面，核酸探针是编码SEQ ID NO:2的多肽；其成熟多肽；或其片段的多核苷酸。在另一个方面，核酸探针是SEQ ID NO:1或其cDNA序列。

在另一个实施方案中，本发明涉及由多核苷酸编码的具有内切葡聚糖酶活性的分离的多肽，所述多核苷酸与SEQ ID NO:1或其cDNA序列的成熟多肽编码序列具有至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或100％的序列同一性。

在另一个实施方案中，本发明涉及SEQ ID NO:2的成熟多肽的变体，其在一个或多个(例如几个)位置包含取代、缺失和/或插入。在一个方面，导入SEQ ID NO:2的成熟多肽的氨基酸取代、缺失和/或插入的数量是不超过10个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、或9个。氨基酸改变可以是次要性的，即保守的氨基酸取代或插入，其不显著影响蛋白质的折叠和/或活性；通常为1至大约30个氨基酸的小缺失；小的氨基或羧基末端延伸，例如氨基末端甲硫氨酸残基；至多大约20-25个残基的小接头肽；或通过改变净电荷或其它功能来促进纯化的小延伸，如多组氨酸序列(poly histidine tract)、抗原表位(antigenic epitope)或结合域(binding domain)。

保守取代的实例是在以下组之内：碱性氨基酸组(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸组(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸组(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水氨基酸组(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)、芳族氨基酸组(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸组(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸)。通常不改变比活性(specific activity)的氨基酸取代是本领域已知的，并且由例如H.Neurath和R.L.Hill,1979,于The Proteins,Academic Press,New York中描述。最普遍发生的交换是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly。

或者，氨基酸改变具有导致多肽的物理化学特性改变的性质。例如，氨基酸改变可改善多肽的热稳定性，改变底物特异性，改变最适pH等。

可以根据本领域已知的方法，例如定位诱变或丙氨酸分区诱变法(Cunningham和Wells,1989,Science 244:1081-1085)来鉴定亲本多肽中的必需氨基酸。在后一技术中，将单一丙氨酸突变引入到分子中的每个残基，并且测试所得到的突变分子是否具有内切葡聚糖酶活性，以鉴定对于所述分子的活性关键的氨基酸残基。另参见Hilton等,1996,J.Biol.Chem.271:4699-4708。酶的活性部位或其它的生物相互作用也可以通过对结构的物理分析，结合针对推定的接触位点氨基酸的突变来确定，结构通过以下这些技术来测定：如核磁共振、晶体学、电子衍射或光亲和标记。参见例如de Vos等,1992,Science 255:306-312；Smith等,1992,J.Mol.Biol.224:899-904；Wlodaver等,1992,FEBS Lett.309:59-64。也可以从与相关多肽的同一性分析来推断必需氨基酸的身份。

可使用已知的诱变、重组和/或改组方法，然后进行相关的筛选过程，如由Reidhaar-Olson和Sauer,1988,Science 241:53-57；Bowie和Sauer,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:2152-2156；WO 95/17413；或者WO 95/22625所公开的那些，进行一个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入并加以测试。其他可使用的方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如Lowman等,1991,Biochemistry30:10832-10837；美国专利号5,223,409；WO 92/06204)和区域定向诱变(region-directed mutagenesis)(Derbyshire等,1986,Gene 46:145；等,1988,DNA7:127)。

诱变/改组方法可与高通量、自动筛选方法组合以检测由宿主细胞表达的经克隆、诱变的多肽的活性(Ness等,1999,Nature Biotechnology 17:893-896)。编码活性多肽的经诱变的DNA分子可自宿主细胞回收并使用本领域标准方法迅速测序。这些方法允许快速确定多肽中单个氨基酸残基的重要性。

所述多肽可为杂合多肽，其中一个多肽的区域融合于另一个多肽的区域的N端或C端。

所述多肽可为融合多肽或可切开的融合多肽，其中另一个多肽融合于本发明的多肽的N端或C端。通过将编码另一个多肽的多核苷酸融合于本发明的多核苷酸来产生融合多肽。产生融合多肽的技术是本领域已知的，并包括连接编码多肽的编码序列以使它们符合读框(in frame)，并且使融合多肽的表达在相同启动子和终止子的控制下。融合蛋白亦可使用内蛋白(intein)技术构建，其中融合物在翻译后产生(Cooper等,1993,EMBO J.12:2575-2583；Dawson等,1994,Science 266:776-779)。

融合多肽还可以在两个多肽之间包含切割位点。在分泌融合多肽时，所述位点就被切开，释放所述两个多肽。切开位点的实例包括，但不限于，公开于Martin等,2003,J.Ind.Microbiol.Biotechnol.3:568-76；Svetina等,2000,J.Biotechnol.76:245-251；Rasmussen-Wilson等,1997,Appl.Environ.Microbiol.63:3488-3493；Ward等,1995,Biotechnology 13:498-503；和Contreras等,1991,Biotechnology 9:378-381；Eaton等,1986,Biochem.25:505-512)；Collins-Racie等,1995,Biotechnology 13:982-987；Carter等,1989,Proteins:Structure,Function,and Genetics 6:240-248；以及Stevens,2003,Drug Discovery World 4:35-48中的位点。

具有内切葡聚糖酶活性的多肽的来源

本发明的具有内切葡聚糖酶活性的多肽可以获得自任何属的微生物。就本发明而言，用于本文与给定的来源有关的术语“获得自”，意思应为由多核苷酸编码的多肽由所述来源产生，或由其中插入了来自所述来源的多核苷酸的菌株产生。在一个方面，从给定来源获得的多肽是胞外分泌的。

所述多肽可为真菌多肽。例如，多肽可以是丝状真菌多肽，诸如枝顶孢多肽。

在另一个方面，多肽是直生枝顶孢(Acremonium strictum)、桃色枝顶孢(Acremonium persicinum),火红色枝顶孢(Acremonium rutilum)、薄状枝顶孢(Acremonium charticola)、针状枝顶孢(Acremonium fusigerum)、环带状枝顶孢(Acremonium zonatum)、地生枝顶孢(Acremonium terricola)、或Acremonium tubakii。

在另一个方面，多肽是嗜碱枝顶孢(Acremonium alcalophilum)多肽。

可理解的是对于前述的种，本发明包含完全和不完全阶段(perfect andimperfect states)，和其它分类学的等同物(equivalent)，例如无性型(anamorph)，而无论它们已知的种名。本领域技术人员将容易地识别适合的等同物的身份。

这些种的菌株在许多培养物保藏中心对于公众能够容易地取得，所述保藏中心诸如美国典型培养物保藏中心(the American Type Culture Collection)(ATCC)、德意志微生物和细胞培养物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen GmbH)(DSMZ)、真菌菌种保藏中心(Centraalbureau VoorSchimmelcultures)(CBS)和农业研究机构专利培养物保藏中心北区研究中心(Agricultural Research Service Patent Culture Collection,Northern RegionalResearch Center)(NRRL)。

可以利用上述的探针从其它来源，包括从自然界(例如，土壤、堆肥、水等)分离的微生物或直接获得自自然材料(例如，土壤、堆肥、水等)的DNA样品，鉴定并获得所述多肽。用于直接从天然生境(habitat)分离微生物和DNA的技术是本领域内公知的。随后可通过类似地筛选另一种微生物的基因组DNA或cDNA文库或混合的DNA样品来得到编码所述多肽的多核苷酸。一旦用探针检测到编码多肽的多核苷酸，就可以使用本领域普通技术人员已知的技术将所述多核苷酸分离或克隆(参见，例如，Sambrook等,1989,见上文)。

催化域

在一个实施方案中，本发明还涉及催化域，其与SEQ ID NO:2的氨基酸17至232具有至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或100％的序列同一性。在一个方面，催化域包含与SEQ ID NO:2的氨基酸17至232相差不超过10个氨基酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8、或9的氨基酸序列。

优选地，催化域包含或组成为SEQ ID NO:2的氨基酸17至232或其等位变体；或其具有内切葡聚糖酶活性的片段。

在另一个实施方案中，本发明还涉及催化域，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在中等严格条件，中等-高严格条件，高严格条件，或非常高严格条件(如上文定义)下与以下杂交：(i)SEQ ID NO:1的核苷酸49至953，(ii)其cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补物(Sambrook等，1989，见上文)。

在另一个实施方案中，本发明还涉及由多核苷酸编码的催化域，所述多核苷酸与SEQ ID NO:1或其cDNA序列的核苷酸49至953具有至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或100％的序列同一性。

优选地，编码催化域的多核苷酸包含或组成为SEQ ID NO:1的核苷酸49至953。

在另一个实施方案中，本发明还涉及SEQ ID NO:2的氨基酸17至232的在一个或多个(例如几个)位置处包含取代、缺失、和/或插入的催化域变体。在一个方面，引入SEQ IDNO:2的氨基酸17至232的序列中的氨基酸取代、缺失和/或插入的数目是10，例如1、2、3、4、5、6、8、或9。

结合域

在一个实施方案中，本发明还涉及纤维素结合域，其与SEQ ID NO:2的氨基酸267至305具有至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或100％序列同一性。在一个方面，所述纤维素结合域包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:2的氨基酸267至305相差不超过10个，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、或9个氨基酸。

所述纤维素结合域优选包含或组成为SEQ ID NO:2的氨基酸267至305或其等位变体，或为其具有纤维素结合活性的片段。

在另一个实施方案中，本发明还涉及纤维素结合域，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在非常低严格条件、低严格条件、中等严格条件，中等-高严格条件，高严格条件，或非常高严格条件(如上文定义)下与以下杂交：(i)SEQ ID NO:1的核苷酸1056至1172，(ii)其cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补物(Sambrook等，1989，见上文)。

在另一个实施方案中，本发明还涉及纤维素结合域，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸与SEQ ID NO:1的核苷酸1056至1172具有至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或100％序列同一性。

优选地，编码纤维素结合域的多核苷酸包含或组成为SEQ ID NO:1的核苷酸1056至1172。

在另一个实施方案中，本发明还涉及SEQ ID NO:2的氨基酸267至305在一个或多个(例如几个)位置包含取代、缺失和/或插入的纤维素结合域变体。在一个方面，引入SEQID NO:2的氨基酸267至305的序列中的氨基酸取代、缺失和/或插入数是10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、或9。

与纤维素结合域可操作连接的催化域可来自水解酶、异构酶、连接酶、裂合酶、氧还酶或转移酶，例如氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、内切葡聚糖酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、变聚糖酶、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、木聚糖酶或β-木糖苷酶。编码催化域的多肽可从任何原核、真核或其它来源获得。

多核苷酸

本发明亦涉及编码如本文中所述的本发明的多肽，催化域，或纤维素结合域的分离的多核苷酸。

用于分离或克隆多核苷酸的技术在本领域中是已知的，并包括从基因组DNA或cDNA，或其组合分离。可通过例如使用熟知的聚合酶链式反应(PCR)或表达文库的抗体筛选来检测具有共有结构特性的克隆DNA片段，从而实现从这种基因组DNA克隆多核苷酸。参见，例如，Innis等,1990,PCR:A Guide to Methods and Application,Academic Press,NewYork。可以使用其它核酸扩增方法，如连接酶链式反应(LCR)、连接活化转录(ligatedactivated transcription；LAT)和基于多核苷酸的扩增(NASBA)。可以从枝顶孢菌株，或相关生物体克隆所述多核苷酸，因此，例如可为所述多核苷酸的多肽编码区的等位基因变体或种间变体(species variant)。

修饰编码本发明多肽的多核苷酸对于合成与所述多肽基本上相似的多肽而言可能是必需的。术语与所述多肽“基本上相似”指多肽的非天然存在的形式。这些多肽可能以一些工程改造的方式而不同于从其天然来源分离的多肽，例如，比活性、热稳定性、最适pH等方面不同的变体。可以在作为SEQ ID NO:1的成熟多肽序列，或其cDNA序列，例如其亚序列呈现的多核苷酸的基础上和/或通过引入如下核苷酸取代：所述取代不导致多肽氨基酸序列的改变，但是符合意欲产生酶的宿主生物体的密码子用法；或者通过导入可产生不同的氨基酸序列的核苷酸取代来构建变体。关于核苷酸取代的概述，参见，例如，Ford等,1991,Protein Expression and Purification 2:95-107。

核酸构建体

本发明还涉及包含本发明的多核苷酸的核酸构建体，所述多核苷酸与一个或多个调控序列可操作地连接，所述调控序列在合适的宿主细胞中在与该调控序列相容的条件下指导编码序列的表达。

可以用许多方式操作所述多核苷酸以便于多肽的表达。取决于表达载体，在将多核苷酸插入载体之前对其进行操作可能是理想的或必需的。使用重组DNA方法修饰多核苷酸的技术是本领域熟知的。

调控序列可为启动子，其由用于表达编码本发明的多肽的多核苷酸的宿主细胞所识别的多核苷酸。启动子含有介导多肽的表达的转录调控序列。启动子可以是在宿主细胞中显示转录活性的任何多核苷酸，包括突变的、截短的和杂合的启动子，并且可以从编码与宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因获得。

用于在细菌宿主细胞中指导本发明的核酸构建体转录的合适启动子的实例是从下述获得的启动子：解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、嗜热脂肪芽孢杆菌产麦芽淀粉酶基因(amyM)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因、苏云金芽孢杆菌cryIIIA基因(Agaisse和Lereclus,1994,Molecular Microbiology 13:97-107)、大肠杆菌lac操纵子、大肠杆菌trc启动子(Egon等,1988,Gene 69:301-315)、天蓝链霉菌琼脂糖酶基因(dagA)和原核β-内酰胺酶基因(Villa-Kamaroff等,1978,Proceedings of theNational Academy of Sciences USA 75:3727-3731)，以及tac启动子(DeBoer等,1983,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:21-25)。另外的启动子在"Useful proteins fromrecombinant bacteria"于Gilbert等,1980,Scientific American,242:74-94中；和在Sambrook等,1989,见上文中描述。串联启动子的实例公开于WO99/43835。

用于指导本发明的核酸构建体在丝状真菌宿主细胞中转录的合适启动子的实例是从下列酶的基因获得的启动子：构巢曲霉乙酰胺酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、米曲霉TAKA淀粉酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶(WO 96/00787)、镶片镰孢淀粉葡糖苷酶(WO 00/56900)、镶片镰孢Daria(WO 00/56900)、镶片镰孢Quinn(WO 00/56900)、曼赫根毛霉(Rhizomucor miehei)脂肪酶、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶IV、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉β-木糖苷酶，以及NA2-tpi启动子(一种修饰的启动子，其来自在曲霉属中性α-淀粉酶基因，其中未翻译的前导序列由曲霉属丙糖磷酸异构酶的基因的未翻译的前导序列所替代；非限制性实例包括修饰的启动子，其来自黑曲霉中性α-淀粉酶的基因，其中未翻译的前导序列由构巢曲霉或米曲霉丙糖磷酸异构酶的基因的未翻译的前导序列所替代)；和它们的突变的、截短的和杂合的启动子。

在酵母宿主中，有用的启动子从如下的基因获得：酿酒酵母烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH1,ADH2/GAP)、酿酒酵母丙糖磷酸异构酶(TPI)、酿酒酵母金属硫蛋白(CUP1)和酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。对于酵母宿主细胞其它有用的启动子由Romanos等,1992,Yeast 8:423-488描述。

调控序列也可以是转录终止子，其由宿主细胞识别以终止转录。所述终止子与编码所述多肽的多核苷酸的3’末端可操作地连接。在本发明中，可使用在宿主细胞中有功能的任何终止子。

对于细菌宿主细胞优选的终止子从如下的基因获得：克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprH)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(amyL)和大肠杆菌核糖体RNA(rrnB)。

对于丝状真菌宿主细胞优选的终止子从如下酶的基因获得：构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶、和尖镰孢(Fusariumoxysporum)胰蛋白酶样蛋白酶。

对于酵母宿主细胞优选的终止子从如下酶的基因获得：酿酒酵母烯醇化酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)和酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶。对于酵母宿主细胞其它有用的终止子由Romanos等,1992,见上文描述。

调控序列还可以是启动子下游和基因的编码序列上游的mRNA稳定化区，其增加所述基因的表达。

合适的mRNA稳定化区的实例从如下的基因获得：苏云金芽孢杆菌cryIIIA基因(WO94/25612)和枯草芽孢杆菌SP82基因(Hue等,1995,Journal of Bacteriology 177:3465-3471)。

调控序列还可以是合适的前导序列，其为对于宿主细胞的翻译重要的mRNA非翻译区。前导序列可操作地连接于编码多肽的多核苷酸的5’-末端。可使用在宿主细胞中有功能的任何前导序列。

对于丝状真菌宿主细胞优选的前导序列从如下酶的基因获得：米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶。

对于酵母宿主细胞合适的前导序列从如下酶的基因获得：酿酒酵母烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α因子和酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)。

调控序列也可以是聚腺苷酸化序列，其是与多核苷酸的3’末端可操作地连接的序列，并且在转录时，宿主细胞将其识别为将聚腺苷残基添加至转录的mRNA的信号。可使用在宿主细胞中有功能的任何聚腺苷酸化序列。

对于丝状真菌宿主细胞优选的聚腺苷酸化序列从如下酶的基因获得：构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶和尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶。

对于酵母宿主细胞有用的聚腺苷酸化序列由Guo和Sherman,1995,Mol.CellularBiol.15:5983-5990描述。

调控序列还可以是信号肽编码区，其编码与多肽的N端相连的信号肽，并指导所述多肽进入细胞分泌途径。多核苷酸的编码序列5’端可固有地包含信号肽编码序列，其与编码所述多肽的编码序列的区段一起天然地连接在翻译阅读框中。或者，编码序列5’端可含有对于所述编码序列外源的信号肽编码序列。当编码序列天然不含有信号肽编码序列时，外源信号肽编码序列可能是必需的。或者，可直接用外源信号肽编码序列取代天然信号肽编码序列以增强多肽的分泌。然而，可使用指导表达的多肽进入宿主细胞的分泌途径的任何信号肽编码序列。

对于细菌宿主细胞有效的信号肽编码序列是从如下酶的基因获得的信号肽编码序列：芽孢杆菌属NCIB 11837产麦芽糖淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶(subtilisin)、地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT,nprS,nprM)和枯草芽孢杆菌prsA。另外的信号肽由Simonen和Palva,1993,Microbiological Reviews 57:109-137描述。

对于丝状真菌宿主细胞有效的信号肽编码序列是从如下酶的基因获得的信号肽编码序列：黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶、特异腐质霉纤维素酶、特异腐质霉内切葡聚糖酶V、疏棉状腐质霉脂肪酶和曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶。

对于酵母宿主细胞有用的信号肽从酿酒酵母α因子和酿酒酵母转化酶的基因获得。其它有用的信号肽编码序列由Romanos等,1992,见上文描述。

调控序列还可以是前肽编码序列，其编码位于多肽N端的前肽。所得多肽称为酶原(proenzyme)或前多肽(propolypeptide)(或在某些情况下称为酶原(zymogen))。前多肽通常是无活性的，并且能够通过前肽的催化或自催化切割从前多肽转化为活性多肽。可以从枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、嗜热毁丝霉漆酶(WO95/33836)、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶和酿酒酵母α因子的基因获得前肽编码序列。

当信号肽和前肽序列二者均存在时，将前肽序列置于紧接着(next to)多肽的N端，并且将信号肽序列置于紧接着前肽序列的N端。

同样理想的是添加调节序列，其相对于宿主细胞的生长来调节多肽的表达。调节系统的实例是引起基因表达响应化学或物理刺激物，包括调节化合物的存在而开启或关闭的那些系统。原核系统中的调节系统包括lac、tac和trp操纵基因系统。在酵母中，可使用ADH2系统或GAL1系统。在丝状真菌中，可以使用黑曲霉葡糖淀粉酶启动子、米曲霉TAKAα-淀粉酶启动子和米曲霉葡糖淀粉酶启动子。调节序列的其它实例是那些允许基因扩增的序列。在真核系统中，这些调节序列包括在氨甲蝶呤(methotrexate)存在下扩增的二氢叶酸还原酶基因，和以重金属(with heavy metal)扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况下，编码多肽的多核苷酸将与调节序列可操作地连接。

表达载体

本发明还涉及重组表达载体，所述重组表达载体包含本发明的多核苷酸、启动子和转录和翻译终止信号。多种核苷酸和调控序列可以结合在一起以产生重组表达载体，所述表达载体可以包括一个或多个方便的限制位点以允许在这些位点插入或取代编码多肽的多核苷酸。或者，可以通过在适当的用于表达的载体中插入包含所述多核苷酸的核酸构建体或多核苷酸来表达所述多核苷酸。在制备表达载体的过程中，将编码序列置于载体中，从而将该编码序列与适当的调控序列可操作地连接以供表达。

重组表达载体可以是任何能够方便地进行重组DNA步骤，并且能够产生多核苷酸的表达的载体(例如，质粒或病毒)。载体的选择将通常依赖于载体与将引入该载体的宿主细胞的相容性。载体可以是线状或闭合环状质粒。

载体可以是自主复制载体，即，作为染色体外实体(entity)存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如，质粒、染色体外元件、微型染色体(minichromosome)或人工染色体。载体可以含有任何用于确保自我复制的手段(means)。或者，载体可以是一种当被引入宿主细胞中时，整合到基因组中并且与整合了该载体的染色体一起复制的载体。此外，可以使用单独的载体或质粒或两个或更多个载体或质粒，其共同含有待引入宿主细胞基因组的完整DNA(total DNA)，或可以使用转座子(transposon)。

所述载体优选地含有一个或多个选择性标记，以便于容易地选择经转化、转染、转导等的细胞。选择性标记是这样的基因，其产物提供杀生物剂或病毒抗性、对重金属的抗性、对营养缺陷型的原养性(prototrophy to auxotrophs)等。

细菌选择性标记的实例是地衣芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌dal基因，或赋予抗生素抗性的标记，所述抗生素抗性例如氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素、新霉素、壮观霉素或四环素抗性。对于酵母宿主细胞合适的标记包括但不限于ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。用于丝状真菌宿主细胞的选择性标记包括但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(草铵膦(phosphinothricin)乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)(nitrate reductase)、pyrG(乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶)(orotidine-5’-phosphate decarboxylase)、sC(硫酸腺苷酰转移酶)和trpC(邻氨基苯甲酸合酶(anthranilate synthase))以及它们的等同物。优选用在曲霉属细胞中的是构巢曲霉或米曲霉amdS和pyrG基因和吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)bar基因。

所述载体优选含有允许载体整合入宿主细胞基因组或载体在细胞中独立于基因组的自主复制的元件。

为了整合入宿主细胞基因组，载体可依赖编码多肽的多核苷酸的序列或用于通过同源或非同源重组整合入基因组的任何其它载体元件。或者，载体可以含有用于指导通过同源重组整合入宿主细胞基因组染色体中的精确位置的额外的多核苷酸。为了增加在精确位置整合的可能性，整合元件应含有足够数量的与相应的目标序列具有高度序列同一性的核酸，如100至10,000碱基对，400至10,000碱基对，和800至10,000碱基对，以提高同源重组的概率。整合元件可为任何与宿主细胞基因组中的目标序列同源的序列。此外，整合元件可为非编码或编码的多核苷酸。另一方面，可以将载体通过非同源重组整合到宿主细胞的基因组中。

为了自主复制，载体可以还包含复制起点，其使载体能够在所述的宿主细胞中自主地复制。复制起点可以是在细胞中发挥功能的介导自主复制的任何质粒复制子(replicator)。术语“复制起点”或“质粒复制子”意指能够使质粒或载体体内复制的多核苷酸。

细菌复制起点的实例是允许在大肠杆菌中复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177和pACYC184的复制起点，和允许在芽孢杆菌属中复制的质粒pUB110、pE194、pTA1060和pAMβ1的复制起点。

用于酵母宿主细胞中的复制起点的实例是2微米复制起点，ARS1,ARS4,ARS1和CEN3的组合，和ARS4和CEN6的组合。

在丝状真菌细胞中有用的复制起点的实例是AMA1和ANS1(Gems等,1991,Gene 98:61-67；Cullen等,1987,Nucleic Acids Res.15:9163-9175；WO00/24883)。分离AMA1基因和构建包含该基因的质粒或载体能够根据公开于WO 00/24883中的方法完成。

可以将多于一个拷贝的本发明的多核苷酸插入宿主细胞以增加多肽的产生。多核苷酸拷贝数的增加可通过如下方法获得：将至少一个额外拷贝的序列整合入宿主细胞基因组，或将可扩增的选择性标记基因包括于多核苷酸，其中可通过在合适的选择剂(selectable agent)存在下培养细胞来选择含有选择性标记基因的扩增拷贝，且由此含有多核苷酸的额外拷贝的细胞。

用于连接上述元件以构建本发明的重组表达载体的方法是本领域技术人员熟知的(参见，例如，Sambrook等,1989,见上文)。

宿主细胞

本发明还涉及重组宿主细胞，其包含本发明的多核苷酸可操作地连接于一个或多个指导本发明多肽的产生的调控序列。将包含多核苷酸的构建体或载体引入宿主细胞，使所述构建体或载体如前所述作为染色体整合体或者作为自我复制的染色体外载体维持。术语“宿主细胞”包括亲本细胞的任何由于复制过程中发生的突变而不同于亲本细胞的后代。宿主细胞的选择将在很大程度上依赖于编码多肽的基因及其来源。

宿主细胞可以是在本发明的多肽的重组产生中有用的任何细胞，例如，原核或真核细胞。

原核宿主细胞可以是任何革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。革兰氏阳性细菌包括但不限于，芽孢杆菌属、梭菌属、肠球菌属、地芽孢杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、海洋芽孢杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属和链霉菌属。革兰氏阴性细菌包括但不限于，弯曲杆菌属、大肠杆菌、黄杆菌属、梭杆菌属、螺杆菌属、泥杆菌属、奈瑟氏菌属、假单胞菌属、沙门氏菌属和脲原体属。

细菌宿主细胞可以是任何芽孢杆菌属细胞，包括但不限于嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌细胞。

细菌宿主细胞还可以是任何链球菌属细胞，包括但不限于，似马链球菌、酿脓链球菌、乳房链球菌和马链球菌兽瘟亚种细胞。

细菌宿主细胞还可以是任何链霉菌属细胞，包括但不限于，不产色链霉菌、除虫链霉菌、天蓝链霉菌、灰色链霉菌和浅青紫链霉菌细胞。

可通过如下方法实现将DNA引入到芽孢杆菌属细胞：原生质体转化(参见，例如，Chang和Cohen,1979,Mol.Gen.Genet.168:111-115)，感受态细胞转化(参见，例如，Young和Spizizen,1961,J.Bacteriol.81:823-829或Dubnau和Davidoff-Abelson,1971,J.Mol.Biol.56:209-221)，电穿孔(参见，例如，Shigekawa和Dower,1988,Biotechniques6:742-751)或接合(参见，例如，Koehler和Thorne,1987,J.Bacteriol.169:5771-5278)。可通过如下方法实现将DNA引入到大肠杆菌细胞：原生质体转化(参见，例如，Hanahan,1983,J.Mol.Biol.166:557-580)或电穿孔(参见，例如，Dower等,1988,Nucleic Acids Res.16:6127-6145)。可通过如下方法实现将DNA引入到链霉菌属细胞：原生质体转化，电穿孔(参见，例如，Gong等,2004,Folia Microbiol.(Praha)49:399-405)，接合(参见，例如，Mazodier等,1989,J.Bacteriol.171:3583-3585)，或转导(参见，例如，Burke等,2001,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98:6289-6294)。可通过如下方法实现将DNA引入到假单胞菌属细胞：电穿孔(参见，例如，Choi等,2006,J.Microbiol.Methods 64:391-397)或接合(参见，例如，Pinedo和Smets,2005,Appl.Environ.Microbiol.71:51-57)。可通过如下方法实现将DNA引入到链球菌属细胞：天然感受态(natural competence)(参见，例如，Perry和Kuramitsu,1981,Infect.Immun.32:1295-1297)，原生质体转化(参见，例如，Catt和Jollick,1991,Microbios.68:189-207)，电穿孔(参见，例如，Buckley等,1999,Appl.Environ.Microbiol.65:3800-3804)或接合(参见，例如，Clewell,1981,Microbiol.Rev.45:409-436)。然而，可使用本领域已知的将DNA引入宿主细胞的任何方法。

宿主细胞还可为真核生物，如哺乳动物、昆虫、植物或真菌细胞。

宿主细胞可为真菌细胞。“真菌”用在本文包括以下门：子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)和接合菌门(Zygomycota)以及卵菌门(Oomycota)和所有有丝分裂孢子真菌(mitosporic fungi)(如由Hawksworth等,于Ainsworth and Bisby’s Dictionary of The Fungi,第8版,1995,CAB International,University Press,Cambridge,UK中所定义)。

真菌宿主细胞可为酵母细胞。“酵母”用在本文包括产子囊酵母(ascosporogenousyeast)(内孢霉目(Endomycetales))、产担子酵母(basidiosporogenous yeast)和属于半知菌类(Fungi Imperfecti)(芽孢纲(Blastomycetes))的酵母。由于酵母的分类在未来可能改变，就本发明而言，将酵母定义为如Biology and Activities of Yeast(Skinner,Passmore,和Davenport编,Soc.App.Bacteriol.Symposium Series No.9,1980)中所述。

酵母宿主细胞可为假丝酵母属、汉逊酵母属(Hansenula)、克鲁维酵母属、毕赤酵母属、酵母属、裂殖酵母属或西洋蓍霉属细胞，如乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyceslactis)、卡尔酵母、酿酒酵母、糖化酵母、道格拉氏酵母、克鲁弗酵母、诺地酵母、卵形酵母、或解脂西洋蓍霉(Yarrowia lipolytica)细胞。

真菌宿主细胞可为丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌门(Eumycota)和卵菌门的亚门(如由Hawksworth等,1995,见上文，所定义)的所有丝状形式。丝状真菌通常的特征在于由壳多糖(chitin)、纤维素、葡聚糖、壳聚糖(chitosan)、甘露聚糖和其它复杂多糖构成的菌丝体壁。通过菌丝延伸进行营养生长，而碳分解代谢是专性需氧的。相反，酵母例如酿酒酵母的营养生长通过单细胞菌体的出芽生殖(budding)进行，而碳分解代谢可以是发酵性的。

丝状真菌宿主细胞可为枝顶孢霉属、曲霉属、短梗霉属、烟管霉属(Bjerkandera)、拟蜡菌属、金孢子菌属、鬼伞属(Coprinus)、革盖菌属(Coriolus)、隐球菌属、Filibasidium、镰孢属、腐质霉属、梨孢菌属、毛霉属、毁丝霉属、新考玛脂霉属、脉孢菌属、拟青霉属、青霉属、平革菌属(Phanerochaete)、射脉菌属(Phlebia)、瘤胃壶菌属、侧耳属(Pleurotus)、裂褶菌属、踝节菌属、嗜热子囊菌属、梭孢霉属、弯颈霉属、栓菌属(Trametes)或木霉属细胞。

例如，丝状真菌宿主细胞可为泡盛曲霉、烟曲霉、臭曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、黑刺烟管菌(Bjerkandera adusta)、干拟蜡菌(Ceriporiopsis aneirina)、Ceriporiopsis caregiea、Ceriporiopsis gilvescens、Ceriporiopsis pannocinta、Ceriporiopsis rivulosa、Ceriporiopsis subrufa、虫拟蜡菌(Ceriporiopsissubvermispora)、Chrysosporium inops、嗜角质金孢子菌、Chrysosporium lucknowense、Chrysosporium merdarium、毡金孢子菌、Chrysosporium queenslandicum、热带金孢子菌、Chrysosporium zonatum、灰盖鬼伞(Coprinus cinereus)、毛革盖菌(Coriolushirsutus)、杆孢状镰孢、禾谷镰孢、库威镰孢、大刀镰孢、禾本科镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖镰孢、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰孢、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰孢、镶片镰孢、特异腐质霉、疏棉状腐质霉、米黑毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙脉孢菌、产紫青霉、黄孢平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、辐射射脉菌(Phlebiaradiata)、刺芹侧耳(Pleurotus eryngii)、土生梭孢霉、长绒毛栓菌(Trametes villosa)、变色栓菌(Trametes versicolor)、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉或绿色木霉细胞。

可以将真菌细胞通过涉及原生质体形成、原生质体转化和细胞壁再生的方法以本身公知的方式转化。用于转化曲霉属和木霉属宿主细胞的合适方法在EP 238023和Yelton等,1984,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:1470-1474以及Christensen等,1988,Bio/Technology 6:1419-1422中描述。用于转化镰孢属菌种的合适方法由Malardier等,1989,Gene 78:147-156和WO 96/00787描述。可以使用由如下文献描述的方法转化酵母：Becker和Guarente,于Abelson,J.N.和Simon,M.I.编,Guide to Yeast Genetics and MolecularBiology,Methods in Enzymology,Volume 194,pp 182-187,Academic Press,Inc.,NewYork；Ito等,1983,J.Bacteriol.153:163；和Hinnen等,1978,Proc.Natl.Acad.Sci.USA75:1920。

产生方法

本发明还涉及用于产生本发明多肽的方法，其包括：(a)在有助于产生多肽的条件下培养细胞，所述细胞以其野生型形式产生所述多肽；和(b)回收所述多肽。

本发明还涉及用于产生本发明的多肽的方法，其包括：(a)在有助于产生多肽的条件下培养本发明的重组宿主细胞；和(b)回收所述多肽。在一个优选的方面，细胞是枝顶孢细胞。在一个更优选的实施方案中，细胞是嗜碱枝顶孢细胞。

所述宿主细胞使用本领域已知的方法在适合于产生所述多肽的营养培养基中培养。例如，可以通过在合适培养基中和允许表达和/或分离所述多肽的条件下实施的摇瓶培养，或实验室或工业发酵罐中的小规模或大规模发酵(包括连续、分批、补料分批或固态发酵)来培养细胞。使用本领域已知的方法在合适的营养培养基中进行培养，所述营养培养基包含碳源和氮源和无机盐。合适的培养基能够从商业供应商获得或可以根据公开的组成制备(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)。如果多肽分泌到营养培养基中，该多肽可以从所述培养基中直接回收。如果多肽不分泌，其可以从细胞裂解物(lysate)回收。

可以使用本领域已知的对于所述多肽特异性的方法来检测多肽。这些检测方法包括但不限于特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。例如，酶测定法(enzymeassay)可用于确定多肽的活性。

多肽可以使用本领域已知的方法回收。例如，多肽可以通过常规方法从营养培养基中回收，所述常规方法包括但不限于收集、离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀。

多肽可以通过多种本领域已知的方法纯化以获得基本上纯的多肽，所述方法包括但不限于层析(例如，离子交换、亲和、疏水、层析聚焦和大小排阻)、电泳方法(例如，制备型(preparative)等电聚焦)、差示溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE或提取(参见，例如，Protein Purification,Janson和Ryden编,VCH Publishers,New York,1989)。

在另一个方面，不回收多肽，而是使用表达所述多肽的本发明的宿主细胞作为所述多肽的来源。

植物

本发明还涉及分离的植物，例如，转基因植物、植物部分或植物细胞，其包含本发明的多核苷酸，从而以可回收的量表达和产生所述多肽或域。多肽或域可从植物或植物部分回收。或者，可以按原样(as such)将含有该多肽或域的植物或植物部分用于改进食品或饲料的质量，例如，改进营养价值、适口性(palatability)和流变性质(rheologicalproperties)，或用于破坏抗营养因子。

转基因植物可以是双子叶的(双子叶植物)或单子叶的(单子叶植物)。单子叶植物的实例是草(grasses)，如草地早熟禾(meadow grass)(蓝草(blue grass)，早熟禾属(Poa))；饲用牧草(forage grass)如羊茅属(Festuca)、黑麦草属(Lolium)；寒地型牧草(temperate grass)，如Agrostis(翦股颖属)；和谷类，例如，小麦、燕麦、黑麦、大麦、稻(rice)、高粱和玉蜀黍(maize)(玉米)。

双子叶植物的实例是烟草(tobacco)，豆类(legumes)，如羽扇豆(lupins)，马铃薯，糖甜菜(sugar beet)，豌豆，豆(bean)和大豆(soybean)和十字花科的(cruciferous)植物(十字花科(family Brassicaceae))，如花椰菜(cauliflower)，油菜籽(rape seed)和紧密相关的模型生物体拟南芥(Arabidopsis thaliana)。

植物部分的实例是茎(stem)、愈伤组织(callus)、叶(leaf)、根(root)、果实(fruit)、种子(seed)和块茎(tuber)，以及包含这些部分的独立组织，例如，表皮(epidermis)、叶肉(mesophyll)、薄壁组织(parenchyme)、维管组织(vascular tissue)、分生组织(meristem)。具体的植物细胞区室(compartments)，如叶绿体(chloroplast)、质外体(apoplast)、线粒体(mitochondria)、液泡(vacuole)、过氧化物酶体(peroxisome)和细胞质(cytoplasm)也被认为是植物部分。此外，任何植物细胞，无论什么组织来源，都被认为是植物部分。同样地，植物部分，如被分离用来促进本发明的应用的具体组织和细胞也被认为是植物部分，例如胚(embryo)、胚乳(endosperm)、糊粉(aleurone)和种皮(seed coat)。

同样包含于本发明范围内的还有这些植物、植物部分和植物细胞的后代。

表达多肽或域的转基因植物或植物细胞可以依照本领域已知方法构建。简而言之，通过如下方法构建所述植物或植物细胞：将编码多肽或域的一个或多个表达构建体导入植物宿主基因组或叶绿体基因组，并且将所得的经修饰的植物或植物细胞繁殖为转基因植物或植物细胞。

表达构建体便利地是包含编码多肽或域的多核苷酸的核酸构建体，所述多核苷酸与在选择的植物或植物部分中表达该多核苷酸所需的适当的调节序列可操作地连接。此外，表达构建体可以包含对于鉴定植物细胞有用的选择性标记，在所述植物细胞中整合了表达构建体和将该构建体引入到所述植物中所必需的DNA序列(后者依赖于使用的DNA引入方法)。

调节序列的选择，例如启动子和终止子序列和任选地信号或转运序列的选择，举例来说，基于期望何时、何处以及如何表达多肽或域而确定。例如，编码多肽或域的基因的表达可以是组成型的或诱导型的，或可以是发育、阶段或组织特异性的，并且基因产物可以靶向特定的组织或植物部分如种子或叶。调节序列由例如Tague等,1988,PlantPhysiology 86:506所述。

对于组成性表达，可以使用35S-CaMV、玉米泛素1或稻肌动蛋白1启动子(Franck等,1980,Cell 21:285-294,Christensen等,1992,Plant Mo.Biol.18:675-689；Zhang等,1991,Plant Cell 3:1155-1165)。器官特异性启动子可以是例如来自贮藏库组织(storagesink tissue)例如种子、马铃薯块茎和果实的启动子(Edwards和Coruzzi,1990,Ann.Rev.Genet.24:275-303)，或来自代谢库组织(metabolic sink tissue)例如分生组织的启动子(Ito等,1994,Plant Mol.Biol.24:863-878)，种子特异性启动子诸如来自稻的谷蛋白(glutelin)、醇溶蛋白(prolamin)、球蛋白(globulin)或白蛋白(albumin)启动子(Wu等,1998,Plant Cell Physiol.39:885-889)，来自豆球蛋白(legumin)B4和蚕豆(Viciafaba)的未知的种子蛋白基因的蚕豆启动子(Conrad等,1998,J.Plant Physiol.152:708-711)、来自种子油体蛋白(oil body protein)的启动子(Chen等,1998,Plant CellPhysiol.39:935-941)，来自欧洲油菜(Brassica napus)的贮藏蛋白napA启动子，或本技术领域公知的任何其他种子特异性的启动子，例如，在WO 91/14772中所描述的。此外，启动子可为叶特异性的启动子，如来自稻或番茄的rbcs启动子(Kyozuka等,1993,PlantPhysiol.102:991-1000)，小球藻病毒(chlorella virus)腺嘌呤甲基转移酶(adeninemethyltransferase)基因启动子(Mitra和Higgins,1994,Plant Mol.Biol.26:85-93)，来自稻的aldP基因启动子(Kagaya等,1995,Mol.Gen.Genet.248:668-674)，或伤口诱导的启动子，如马铃薯pin2启动子(Xu等,1993,Plant Mol.Biol.22:573-588)。同样地，所述启动子可通过非生物的处理诱导，所述非生物的处理诸如温度、干旱或盐度变化，或通过外源施加的激活所述启动子的物质诱导，例如乙醇、雌激素(oestrogens)、植物激素(planthormones)如乙烯、脱落酸(abscisic acid)和赤霉酸(gibberellic acid)，和重金属。

启动子增强子元件也可以用于实现多肽或域在植物中的较高表达。例如，启动子增强子元件可以是内含子，其置于启动子和编码多肽或域的多核苷酸之间。例如Xu等,1993,见上，公开了使用稻肌动蛋白1基因的第一内含子以增强表达。

选择性标记基因和表达构建体的任何其它部分可以选自本领域内可用的那些。

将核酸构建体根据本领域已知的常规技术导入植物基因组，所述常规技术包括土壤杆菌属(Agrobacterium)介导的转化、病毒介导的转化、显微注射(microinjection)、粒子轰击、生物射弹转化和电穿孔(Gasser等,1990,Science244:1293；Potrykus,1990,Bio/Technology 8:535；Shimamoto等,1989,Nature338:274)。

根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的基因转移(gene transfer)，是一种产生转基因双子叶植物(其综述，参见Hooykas和Schilperoort,1992,PlantMol.Biol.19:15-38)，和用于转化单子叶植物的方法，虽然对于这些植物可使用其他的转化方法。一种产生转基因单子叶植物的方法是用粒子(用转化DNA涂覆的微观的金或钨粒子)轰击胚愈伤组织(embryonic calli)或发育中的胚(developing embryos)(Christou,1992,Plant J.2:275-281；Shimamoto,1994,Curr.Opin.Biotechnol.5:158-162；Vasil等,1992,Bio/Technology 10:667-674)。转化单子叶植物的一种替代方法是基于原生质体转化，如由Omirulleh等,1993,Plant Mol.Biol.21:415-428所描述的。其它转化方法包括描述于美国专利号6,395,966和7,151,204中的那些(两者均通过提述以其整体并入本文)。

转化之后，根据本领域熟知的方法选择具有导入的表达构建体的转化体并且再生成为完整植物。通常设计转化方法用于通过如下方法在再生期间或在后续世代中选择性消除选择基因：例如，使用带有两个独立的T-DNA构建体的共转化或通过特异性重组酶位点特异性地切除选择基因。

除了直接用本发明的构建体直接转化具体植物基因型之外，还可通过将具有构建体的植物与缺乏该构建体的第二植物杂交来制备转基因植物。举例而言，可将编码多肽或域的构建体通过杂交而引入特定植物品种，而根本无需直接转化该给定品种的植物。因此，本发明不仅涵盖从依照本发明经转化的细胞直接再生的植物，还包括此类植物的后代(progeny)。如用于本文的，后代可指依照本发明制备的亲本植物任何世代的后裔(offspring)。此种后代可包含依据本发明制备的DNA构建体。杂交导致转基因通过将起始种系供体植物种系交叉授粉而引入植物种系。此类步骤的非限制性实例描述于美国专利号7,151,204。

植物通过回交转化方法生成。举例而言，该植物包括称作回交转化的基因型、种系、近交体(inbred)或杂交体(hybrid)的植物。

可使用遗传标记以协助本发明的一种或多种转基因从一个遗传背景基因渗入(introgression)至另一个。标记协助的选择提供了相对于常规育种的优势，在于其可用于避免由表型变异导致的错误。进一步，遗传标记可在特定杂交的个体后代中提供有关良种种质相对程度的数据。举例而言，当本不(otherwise)具有非农艺学所需的遗传背景但具有所需性状的植物与良种亲本杂交时，可使用遗传标记来选择不仅具有目标性状，还具有相对较大比例的所需种质的后代。以此方式，使一种或多种性状基因渗入特定遗传背景所需的世代数得到最小化。

本发明亦涉及产生本发明的多肽或域的方法，其包括：(a)在有助于产生所述多肽或域的条件下培养转基因植物或植物细胞，所述植物或植物细胞包含编码多肽或域的多核苷酸；和(b)回收所述多肽或域。

去除或减少内切葡聚糖酶活性

本发明还涉及用于产生亲本细胞突变体的方法，其包括破坏或缺失编码本发明的多肽的多核苷酸或其部分，所述方法导致在相同条件下培养时，与亲本细胞相比突变的细胞产生较少的所述多肽。

可以使用本领域熟知的方法(例如，插入、破坏、替代或缺失)通过减少或消除多核苷酸的表达来构建突变细胞。在一个优选的方面，所述多核苷酸是失活的。待修饰或失活的多核苷酸可以是，例如，编码区或其对活性关键的部分，或表达编码区所需的调节元件。这种调节或调控序列的实例可以是启动子序列或其功能部分，即，足以影响多核苷酸表达的部分。用于可能的修饰的其它调控序列包括但不限于前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、信号肽序列、转录终止子和转录激活子。

可以通过向亲本细胞施以诱变，并且选择其中已将多核苷酸的表达减少或消除的突变细胞来进行多核苷酸的修饰或失活。诱变可能是特异性的或随机的，可以通过例如使用合适的物理或化学诱变剂进行，通过使用合适的寡核苷酸进行，或通过将所述DNA序列进行PCR产生的诱变。此外，可以通过使用这些诱变剂的任何组合来进行诱变。

适合于本发明目的的物理或化学诱变剂的实例包括紫外线(UV)照射、羟胺、N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)、O-甲基羟胺、亚硝酸、乙基甲烷磺酸酯(ethyl methanesulphonate)(EMS)、亚硫酸氢钠、甲酸和核苷酸类似物。

当使用这些试剂时，通常通过如下方法来进行所述诱变：在合适条件下存在选定的诱变剂时温育待诱变的亲本细胞，并筛选和/或选择显示基因表达减少的或无基因表达的突变体细胞。

多核苷酸的修饰或失活可以通过插入、取代或缺失基因中的一个或多个核苷酸或其转录或翻译所需的调控元件实现。例如，可以插入或去除核苷酸从而导致引入终止密码子，去除起始密码子，或改变开读框。按照本领域已知的方法通过定位诱变或PCR产生的诱变可以实现这种修饰或失活。尽管在理论上所述修饰可以在体内进行，即，直接在表达待修饰的多核苷酸的细胞上进行，但优选如下面所示例的那样在体外进行所述修饰。

消除或减少多核苷酸表达的便利方式的例子有基于基因取代，基因缺失，或基因破坏的技术。例如，在基因破坏方法中，将相应于内源多核苷酸的核酸序列在体外进行诱变以产生缺陷性的核酸序列，然后将其转化入亲本细胞中以产生缺陷基因。通过同源重组，所述缺陷性核酸序列替代了内源性多核苷酸。可能理想的是所述缺陷性多核苷酸还编码标记，其可用于选择其中多核苷酸被修饰或破坏的转化子。在一个方面，用可选择的标记(如本文所述的那些)来破坏所述多核苷酸。

本发明亦涉及在细胞中抑制具有内切葡聚糖酶活性的多肽的表达的方法，其包括向细胞施用或在细胞中表达双链RNA(dsRNA)分子，其中所述dsRNA包含本发明的多核苷酸的亚序列。在一个优选的方面，所述dsRNA长度为约15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多个双链体核苷酸。

所述dsRNA优选为小干扰RNA(siRNA)或微RNA(miRNA)。在一个优选的方面，所述dsRNA是用于抑制转录的小干扰RNA。在另一个优选的方面，所述dsRNA是用于抑制翻译的微RNA。

本发明亦涉及这样的双链RNA(dsRNA)分子，其包含SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列的一部分，以供在细胞中抑制所述多肽的表达。尽管本发明并不受任何具体作用机制的限制，但所述dsRNA可进入细胞并导致类似或相同序列的单链RNA(ssRNA)，包括内源mRNA的降解。当细胞暴露于dsRNA时，来自同源基因的mRNA通过称为RNA干扰(RNAi)的过程受选择性降解。

本发明的dsRNA可用于基因沉默。在一个方面，本发明提供了使用本发明的dsRNAi选择性降解RNA的方法。该方法可在体外、离体或体内实施。在一个方面，所述dsRNA分子可用于在细胞、器官或动物中生成功能丧失的突变。用于制备和使用dsRNA分子选择性降解RNA的方法是本领域中公知的，参见，例如美国专利号6,489,127；6,506,559；6,511,824；和6,515,109。

本发明进一步涉及亲本细胞的突变体细胞，其包含编码多肽的多核苷酸或其调控序列的破坏或缺失或编码所述多肽的基因的沉默，这导致与亲本细胞相比突变体细胞产生更少的多肽或不产生多肽。

多肽缺陷型突变细胞作为表达天然和异源多肽的宿主细胞特别有用。所以，本发明进一步涉及生产天然或异源多肽的方法，其包括：(a)在有助于生产多肽的条件下培养突变细胞；和(b)回收所述多肽。术语“异源多肽”意指对宿主细胞不是天然的多肽，例如，天然蛋白的变体。宿主细胞可包含超过一个拷贝的编码所述天然或异源多肽的多核苷酸。

用于培养和纯化感兴趣的产物的方法可以通过本领域已知的方法进行。

本发明用于产生基本上无内切葡聚糖酶活性的产物的方法在真核多肽，特别是真菌蛋白质例如酶的产生中是特别令人有兴趣的。内切葡聚糖酶活性缺陷细胞也可以用于表达在制药上有意义的异源蛋白质例如激素、生长因子、受体等。术语“真核多肽”不仅包括天然多肽，也包括通过氨基酸取代、缺失或添加或其它这样的修饰而被修饰以增强了活性、热稳定性、pH耐受性等的多肽，例如酶。

在其他方面，本发明涉及基本上无内切葡聚糖酶活性的蛋白质产物，其通过本发明的方法产生。

组合物

本发明亦涉及包含本发明的多肽的组合物。

所述组合物可包含本发明的多肽作为主要酶组分，例如单组分组合物。或者，所述组合物可包含多种酶活性，如选自下组的一种或多种(例如几种)酶：纤维素酶、具有纤维素分解增强活性的GH61多肽、蛋白酶、脂肪酶、角质酶、淀粉酶、果胶酶、半纤维素酶、氧化还原酶、过氧化物酶、漆酶、和转移酶。

所述组合物可依照本领域中已知的方法制备，并可为液体或干组合物的形式。所述组合物可依照本领域中已知的方法稳定化。

在一个实施方案中，组合物包含常规的成分，包括但不限于其他酶，及表面活性剂、稳定剂、湿润剂、分散剂、消泡剂、润滑剂、增洁剂系统，等等，或其混合物。

用途

本发明还涉及用具有内切葡聚糖酶活性的多肽或其组合物处理纺织品的以下方法。

生物抛光(Biopolishing)

将织物，诸如纤维素材料的织物加工成准备好制成衣服的材料牵涉几个步骤：将纤维纺成纱线；从纱线构成编织或编结织物；及随后的准备过程，染色/印花和修整(finishing)操作。准备过程对于从纤维除去天然的和人为的杂质及对于改善其在例如染色/印花和修整前的美学外观和可处理性是必需的。常见的准备过程包括脱浆(对于编织商品)，冲刷(scouring)，和漂白，这产生适合于染色或修整的织物。

生物抛光(Biopolishing)是一种在纤维素织物制造过程中通过在“降低的起球形成”方面改善织物质量的酶，诸如纤维素酶对其处理的方法。生物抛光的最重要效果的特征可以在于较小的细毛和起球，增加的光泽表面/光泽，改善的织物手感，增加的持久柔软性和/或改善的吸水性。生物抛光通常在制造编结和编织的织物或服装的湿加工(wetprocessing)中发生。湿加工包括诸如以下的步骤，例如脱浆、冲刷、漂白、清洗、染色/印花和修整。生物抛光可以在任何湿润步骤后作为分开的步骤或者可以作为分开的步骤在任一湿润步骤后或与那些湿润步骤之任一组合实施。

本发明涉及制造纺织品的方法，其通过在生物抛光过程中用具有内切葡聚糖酶活性的分离的多肽处理纺织品进行。

在一个实施方案中，本发明提供了用于获得具有降低的起球形成的纤维质或含纤维素的纺织品的方法，该方法包括用水溶液中的具有内切葡聚糖酶的多肽处理纺织品。在此实施方案中，可以对纱线、织品或衣服应用生物抛光方法。

生物磨光(Biostoning)

一些染色的织品，如粗斜纹棉布织品需要在编织前对纱线染色。对于粗斜纹棉布织品，将经纱例如用靛青染色，并且在编织前确定大小。优选地，粗斜纹棉布织品的染色是环染(ring-dyeing)。本发明的一个优选的实施方案是用瓮染料(vat dye)诸如靛青，或靛青相关染料诸如硫靛(thioindigo)，或硫化染料(sulfur dye)，或直接染料，或反应性染料，或萘酚对纱线的环染。纱线也可以用超过一种染料染色，例如首先用硫化染料，然后用瓮染料，或者反之亦然。

优选地，纱线在其被染色前经历冲刷(scouring)和/或漂白，以实现较高的粗斜纹棉布织品质量。一般地，在编织成染色织品诸如粗斜纹棉布后，染色织品或衣服进行到脱浆阶段，优选接着进行生物磨光步骤和/或颜色修改步骤。

本发明还涉及制造纺织品的方法，其通过在生物磨光过程中用具有内切葡聚糖酶活性的分离的多肽处理纺织品进行。

在一个实施方案中，本发明提供了用于将颜色密度的局部变化引入染色织品或衣服表面的方法，其中该方法包括以下步骤：使织品或衣服与如本发明中定义的具有内切葡聚糖酶的多肽接触。优选地，染色织品或衣服是纤维质或含有纤维素的织品或衣服。更优选地，染色织品是粗斜纹棉布织品，甚至更优选地，靛青染色的粗斜纹棉布织品。

在另一个实施方案中，本发明提供了粗斜纹棉布制造方法，其包括：a)将粗斜纹棉布织品脱浆；b)用具有内切葡聚糖酶活性的多肽对粗斜纹棉布生物磨光；c)漂洗。

信号肽

本发明还涉及编码信号肽的分离的多核苷酸，所述信号肽包含或组成为SEQ IDNO:2的氨基酸1至16。多核苷酸可以进一步包含编码蛋白质的基因，其与信号肽可操作连接。优选地，蛋白质对于信号肽是外来的。在一个方面，编码信号肽的多核苷酸是SEQ IDNO:1的氨基酸1至48。在另一个方面，编码信号肽的多核苷酸是SEQ ID NO:1的氨基酸1至48。

本发明还涉及包含此种多核苷酸的核酸构建体、表达载体和重组宿主细胞。

本发明还涉及产生蛋白质的方法，包括：(a)培养包含此种多核苷酸的重组宿主细胞；和(b)回收所述蛋白质。

所述蛋白质对于宿主细胞可以是天然的或异源的。术语“蛋白质”在本文的意思不是指特定长度的编码产物，并且因此涵盖肽、寡肽和多肽。术语“蛋白质”还涵盖经组合以形成编码产物的两种以上多肽。所述蛋白质还包括杂合多肽和融合多肽。

优选蛋白质是激素、酶、受体或其部分、抗体或其部分，或报告蛋白(reporter)。例如，所述蛋白质可为水解酶、异构酶、连接酶、裂合酶(lyase)、氧化还原酶或转移酶，例如氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、内切葡聚糖酶、酯酶、alpha-半乳糖苷酶、beta-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、alpha-葡糖苷酶、beta-葡糖苷酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、变聚糖酶(mutanase)、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、肌醇六磷酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、或木聚糖酶。

基因可以从任何原核、真核或其它来源获得。

通过以下实施例进一步对本发明进行描述，但不应将其理解为对本发明范围的限制。

本方法和组合物在以下编号段落中进一步描述。

1.一种具有内切葡聚糖酶活性的分离的多肽，其选自下组：

(a)多肽，其与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或100％序列同一性；

(b)多肽，其由多核苷酸编码，该多核苷酸在中等严格条件，中等-高严格条件、高严格条件、或非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列，(ii)其cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补物；

(c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸与SEQ ID NO:1或其cDNA序列的成熟多肽编码序列具有至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或100％序列同一性；

2.在段落1的多肽的一些实施方案中，多肽与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％序列同一性。

3.在段落1的多肽的一些实施方案中，多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸在中等严格条件，中等-高严格条件，高严格条件，或非常高的严格条件下与以下杂交：(i)SEQ IDNO:1的成熟多肽编码序列，(ii)其cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补物。

4.在前述段落中任一项的多肽的一些实施方案中，多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列或其cDNA序列具有至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％序列同一性。

5.在前述段落中任一项的多肽的一些实施方案中，多肽包含或组成为SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:2的成熟多肽。

6.在段落5的多肽的一些实施方案中，其中所述成熟多肽是SEQ ID NO:2的氨基酸17至305。

7.在段落1-4中任一项的多肽的一些实施方案中，其是SEQ ID NO:2的成熟多肽的在一个或多个位置包含取代、缺失和/或插入的变体。

8.在段落1的多肽的一些实施方案中，多肽是SEQ ID NO:2的片段，其中所述片段具有内切葡聚糖酶活性。

9.一种包含催化域的分离的多肽，所述催化域选自下组：

(c)催化域，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸与SEQ ID NO:1或其cDNA序列的催化域具有至少80％序列同一性；

(d)SEQ ID NO:2的氨基酸17至232的在一个或多个位置包含取代、缺失和/或插入的变体，和

10.在段落9的多肽的一些实施方案中，多肽进一步包含纤维素结合域。

11.一种分离的多肽，其包含与催化域可操作连接的纤维素结合域，其中所述结合域选自下组：

(d)SEQ ID NO:2的氨基酸267至305的变体，其在一个或多个位置包含取代、缺失和/或插入；和

(e)(a)，(b)，(c)，或(d)的片段，其具有纤维素结合活性。

12.在段落11的多肽的一些实施方案中，所述催化域获自内切葡聚糖酶。

13.在段落1-12中任一项的多肽的一些实施方案中，所述多肽获自枝顶孢属，优选嗜碱枝顶孢。

14.一种组合物，其包含段落1-13中任一项的多肽。

15.一种用于处理纺织品的方法，其通过用段落1-13中任一项的分离的多肽处理纺织品进行。

16.一种分离的多核苷酸，其编码段落1-13中任一项的多肽。

17.一种核酸构建体或表达载体，其包含与一种或多种调控序列可操作连接的段落16的多核苷酸，所述调控序列指导所述多肽在表达宿主中生成。

18.一种重组宿主细胞，其包含与一种或多种调控序列可操作连接的段落16的多核苷酸，所述调控序列指导所述多肽的生成。

19.一种生成段落1-13中任一项的多肽的方法，其包括：

(a)在有助于所述多肽生成的条件下培养细胞，所述细胞以其野生型形式产生所述多肽；和

(b)回收所述多肽。

20.一种生成具有内切葡聚糖酶活性的多肽的方法，其包括：

(a)在有助于所述多肽生成的条件下培养段落18的宿主细胞；和

(b)回收所述多肽。

21.一种转基因植物、植物部分或植物细胞，其用编码段落1-13中任一项的多肽的多核苷酸转化。

22.一种生成具有内切葡聚糖酶活性的多肽的方法，其包括：

(a)在有助于所述多肽生成的条件下培养段落21的转基因植物或植物细胞；和

(b)回收所述多肽。

23.一种生成亲本细胞的突变体的方法，其包括使编码段落1-13中任一项的多肽的多核苷酸失活，这产生比亲本细胞生成更少的多肽的突变体。

24.通过段落23的方法生成的突变体细胞。

25.段落24的突变体细胞，其进一步包含编码天然或异源蛋白的基因。

26.一种生成蛋白质的方法，其包括：

(a)在有助于所述蛋白质生成的条件下培养段落24或段落25的突变体细胞；和

(b)回收所述蛋白质。

27.一种双链抑制性RNA(dsRNA)分子，其包含段落16的多核苷酸的亚序列，其中任选地，所述dsRNA是siRNA或miRNA分子。

28.段落27的双链抑制性RNA(dsRNA)分子，其长度是约15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多个双链体核苷酸。

29.一种抑制细胞中具有内切葡聚糖酶活性的多肽的表达的方法，其包括对细胞施用或在细胞中表达段落27或28的双链抑制性RNA(dsRNA)分子。

30.一种通过段落29的方法生成的细胞。

31.段落30的细胞，其进一步包含编码天然或异源蛋白质的基因。

32.一种生成蛋白质的方法，其包括：

(a)在有助于所述蛋白质生成的条件下培养段落30或31的细胞；和

(b)回收所述蛋白质。

33.一种分离的多核苷酸，其编码包含或组成为SEQ ID NO:2的氨基酸1至17的信号肽。

34.一种核酸构建体或表达载体，其包含与段落33的多核苷酸可操作连接的编码蛋白质的基因，其中所述基因对于编码信号肽的多核苷酸而言是外来的。

35.一种重组宿主细胞，其包含与段落33的多核苷酸可操作连接的编码蛋白质的基因，其中所述基因对于编码信号肽的多核苷酸而言是外来的。

36.一种生成蛋白质的方法，其包括：

(a)在有助于所述蛋白质生成的条件下培养重组宿主细胞，其包含与段落33的多核苷酸可操作连接的编码蛋白质的基因，其中所述基因对于编码信号肽的多核苷酸而言是外来的；和

(b)回收所述蛋白质。

实施例

材料

用作缓冲液和底物的化学品是至少试剂级的商业产品。

菌株

嗜碱枝顶孢菌株CBS114.92用作具有内切葡聚糖酶活性的多肽的来源。米曲霉(Aspergillus oryzae)MT3568菌株用于表达编码具有内切葡聚糖酶活性的多肽的嗜碱枝顶孢基因。米曲霉MT3568是米曲霉JaL355(WO2002/40694)的amdS(乙酰胺酶)破坏基因衍生物，其中pyrG营养缺陷型通过破坏米曲霉乙酰胺酶(amdS)基因恢复。依照欧洲专利EP0238023(其并入本文)的方法制备MT3568原生质体。

培养基和溶液

YP+2％葡萄糖培养基由1％酵母提取物，2％蛋白胨和2％葡萄糖构成。这里的％指重量百分比。

PDA琼脂板由马铃薯浸液(通过在水中煮沸300g切片(清洗但削皮的)马铃薯达30分钟，然后通过粗棉布弃去或过滤培养基生成马铃薯浸液)构成。然后，添加蒸馏水，直到总体积悬浮液是1升，接着是20g右旋糖和20g琼脂粉末。通过以15psi高压灭菌15分钟(Bacteriological Analytical Manual,8th Edition,Revision A,1998)灭菌培养基。

LB板由10g细菌用胰蛋白胨，5g酵母提取物，10g氯化钠，15g细菌用琼脂，和至1升的去离子水构成。通过以15psi高温灭菌15分钟灭菌培养基(Bacteriological AnalyticalManual,8th Edition,Revision A,1998)。

COVE蔗糖板由342g蔗糖(Sigma S-9378)，20g琼脂粉末，20ml Cove盐溶液(26gMgSO₄.7H2O,26g KCL,26g KH₂PO₄,50ml Cove微量金属溶液)和至1升的去离子水构成。通过以15psi高温灭菌15分钟灭菌培养基(Bacteriological Analytical Manual,8thEdition,Revision A,1998)。将培养基冷却至60℃，并添加10mM乙酰胺，15mM CsCl，TritonX-100(50μl/500ml)。

Cove微量金属溶液由0.04g Na₂B4O₇.10H₂O，0.4g CuSO₄.5H₂O，1.2gFeSO₄.7H₂O，0.7g MnSO₄.H₂O，0.8g Na₂MoO₄.2H₂O，10g ZnSO₄.7H₂O，和至1升的去离子水构成。

Dap-4C培养基由20g右旋糖，10g麦芽糖，11g MgSO₄.7H₂O，1g KH₂PO₄，2g柠檬酸，5.2g K₃PO₄.H₂O，0.5g酵母提取物(Difco)，1ml Dowfax 63N10(Dow Chemical Company)，0.5ml KU6痕量金属溶液，2.5g CaCO₃，和至1升的去离子水构成。通过以15psi高温灭菌15分钟灭菌培养基(Bacteriological Analytical Manual,8th Edition,Revision A,1998)。在使用前，每150ml培养基对Dap-4C培养基添加3.5ml无菌50％(NH₄)₂HPO₄和5ml无菌20％乳酸。

KU6痕量金属溶液由0.13g NiCl₂，2.5g CuSO₄.5H₂O，13.9gFeSO₄.7H₂O，8.45gMnSO₄.H₂O，6.8g ZnCl₂，3g柠檬酸，和至1升的去离子水构成。

具有50mM乙酸盐的pH 5.0缓冲液：将2.873g乙酸钠和0.901g乙酸在去离子水中溶解。

具有50mM磷酸盐的pH 6.5缓冲液：将5.642g磷酸氢二钠十二水合物(Na₂HPO₄·12H₂O)和5.344g磷酸二氢钠脱水物(NaH₂PO₄·2H₂O)在1L去离子水中溶解。

具有50mM磷酸盐的pH 7.5缓冲液：将15.045g磷酸氢二钠十二水合物(Na₂HPO₄·12H₂O)和1.248g磷酸二氢钠脱水物(NaH₂PO₄·2H₂O)在1L去离子水中溶解。

具有50mM磷酸盐的pH 8.5缓冲液：将17.607g磷酸氢二钠十二水合物(Na₂HPO₄·12H₂O)和0.116g磷酸二氢钾(KH₂PO₄)在1L去离子水中溶解。

酶

Vc GH45：来自Volutella colletotrichoides的GH45(WO9629397中的序列Id No:17)。

织品

棉毛布(Cotton interlock)：40S，漂白的，HM-A0008，可获自HM Cotton,Guangzhou,Co.,Ltd,China。

粗斜纹棉布：批次No L001，7*7/76*42，12OZ，可获自Hangzhou Yimei,Co.,Ltd,China。

方法

重量减轻测定

将样本在设条件的房间(65％+/-5％适度，21+/-1℃)中放置24小时，之后对它们计数，通过分析天平(对于低于100g的样品)或精密天平(对于超过100g的样品)称重，并记录。在处理后，将所有样品翻滚干燥1小时，并在如上文提及的设条件的房间中调节24小时。对于每份样品，如下文限定重量减轻：重量减轻％＝((处理前的重量-处理后的重量)x100)/(处理前到达重量)

起球记录测试

在正常气候(65％+/-5％湿度，21+/-1℃)中预先调节后，用Nu-MartindaleTester(James H.Heal Co.Ltd,England)磨损经处理的和/或未处理的织品，相同类型的未处理织品在底部作为磨损的织品。在2000次旋转后通过1-5的分级实施标准的起球测试(Swiss Norm(SN)198525)，意义如下限定：

记录5：无起球

记录4：略微起球

记录3：中等起球

记录2：清楚起球

记录1：重度起球

容许1/2和1/4记录。对于每份样品，使用来自>＝2名技术人员的独立评级的记录的平均值作为起球记录。

通过A280得到的蛋白质含量

对于纯化的蛋白质样品，使用280nm吸光度测量样品的蛋白质浓度。如下实施测量：将样品用蒸馏水以合适的因数稀释，然后用分光光度计UV 1700在280nm测试吸光度，蒸馏水作为空白。计算基于：ε＝65065M^-1cm^-1和分子量＝30725g/mol(对于本发明的纯化的GH45内切葡聚糖酶P242X6)，和ε＝73545M^-1cm^-1和分子量＝30687g/mol(对于基于成熟蛋白序列的纯化的VcGH45)。依照Lambert Beers定律Abs＝εx c x l计算酶样品的浓度。

Abs代表280nm的吸光度。

c代表酶浓度。

l代表标准石英小杯的光路长度。

实施例1：嗜碱枝顶孢菌株CBS114.92的DNA序列信息的来源

基因组序列信息由美国能源部联合基因组研究所(Joint Genome Institute,JGI)产生。从JGI下载基因组的初步装配，并使用Pedant-Pro^TM序列分析包(BiomaxInformatics AG,Martinsried,Germany)分析。使用由软件构建的基因模型作为起始点以检测基因组中的GH45同源物。使用多个已知GH45蛋白序列作为指导手动构建更精确的基因模型。

实施例2：嗜碱枝顶孢菌株CBS114.92基因组DNA提取

为了生成基因组DNA以进行PCR扩增，通过于26℃生长7天将嗜碱枝顶孢菌株CBS114.92在PDA琼脂板上增殖。使用自PDA板收获的孢子接种有挡板摇瓶中的25ml YP+2％葡萄糖培养基，并于26℃在以85rpm摇动的情况中温育72小时。

依照修改的DNeasy Plant Maxi试剂盒方案(Qiagen Danmark,Copenhagen,Denmark)分离基因组DNA。通过以14,000x g离心2分钟收获来自上述培养物的真菌材料。将上清液除去，并将0.5g团粒在具有石英砂的液氮中冷冻，并在预先冷却的研钵中研磨成细粉末。将粉末转移至15ml离心管，并添加5ml缓冲液AP1(预热至65℃)和10μl RNA酶A储备溶液(100mg/ml)，接着进行有力的涡旋振荡。在于65℃在定期倒转该管的情况中温育10分钟后，通过温和混合，接着在冰上温育10分钟将1.8ml缓冲液AP2添加至溶胞物。然后，将溶胞物以3000x g于室温离心5分钟，并将上清液弃入置于50ml收集管中的QIAshredder maxi旋转柱中。这继之以于室温以3000x g离心5分钟。将流过物转移入新的50ml管中，并添加1.5个体积的缓冲液AP3/E，接着涡旋振荡。将15ml样品转移入置于50ml收集管中的DNeasyMaxi旋转柱中，并于室温以3000x g离心5分钟。弃去流过物，并将12ml缓冲液AW添加至置于50ml收集管中的DNeasy Maxi旋转柱中，并于室温以3000x g离心10分钟。在弃去流过物后，重复离心以处置剩余的乙醇。将DNeasy Maxi旋转柱转移至新的50ml管，并添加0.5ml缓冲液AE(预热至70℃)。在于室温温育5分钟后，通过于室温以3000x g离心5分钟洗脱样品。用额外的0.5ml缓冲液AE重复洗脱，并组合洗脱物。于260nm通过UV分光光度计测量收获的DNA的浓度。

实施例3：构建含有编码具有内切葡聚糖酶活性的GH45多肽家族的嗜碱枝顶孢菌株CBS114.92基因组序列的米曲霉表达载体

下文显示的两个合成的寡核苷酸引物设计用于从实施例2中制备的嗜碱枝顶孢菌株CBS114.92基因组DNA中PCR扩增GH45内切葡聚糖酶基因(本文给予名称P242X6基因)。使用IN-FUSION^TM克隆试剂盒(BD Biosciences,Palo Alto,CA,USA)直接对表达载体pDau109(WO 2005/042735)克隆片段。

正向引物：F-P242X6

5’-ACACAACTGGGGATCCACC-3’(SEQ ID NO:3)反向引物：R-P242X6

5’-CCCTCTAGATCTCGAG -3’(SEQ ID NO:4)

框中的字母代表基因序列。有下划线的序列与pDau109的插入位点是同源的使用MJ Research PTC-200DNA Engine实施PCR反应。使用高保真性PCR试剂盒(Finnzymes Oy,Espoo,Finland)进行PCR扩增。PCR反应由5μl 5X HF缓冲液(FinnzymesOy,Espoo,Finland)，0.5μl dNTP(10mM)，0.5μlDNA聚合酶(0.2个单位/μl)(Finnzymes Oy,Espoo,Finland)，1μl引物F-P242X6(5μM)，1μl引物R-P242X6(5μM)，0.5μl嗜碱枝顶孢基因组DNA(100ng/μl)，和16.5μl去离子水构成，总体积为25μl。PCR条件是于95℃持续2分钟的1个循环，35个各于98℃持续10秒，60℃持续30秒，和72℃持续2.5分钟的循环；和于72℃持续10分钟的1个循环。然后，将样品于12℃保持，直到从PCR仪取出。

使用40mM Tris碱，20mM乙酸钠，1mM二钠EDTA(TAE)缓冲液通过1.0％琼脂糖凝胶电泳分离反应产物，其中从凝胶中切出1235bp产物条带，并使用illustraPCR DNA和凝胶条带纯化试剂盒(GE Healthcare Life Sciences,Brondby,Denmark)依照制造商的用法说明纯化。使用IN-FUSION^TM克隆试剂盒将片段克隆入经Bam HI和Xho I消化的pDau109中，产生质粒pP242X6。将P242X6基因克隆入经Bam HI-Xho I消化的pDau109中导致嗜碱枝顶孢P242X6基因在NA2-tpi双重启动子的控制下转录。NA2-tpi是一种经修饰的来自编码黑曲霉中性alpha-淀粉酶的基因的启动子，其中非翻译前导物已经用来自编码构巢曲霉丙糖磷酸异构酶的基因的非翻译前导物替换。

依照IN-FUSION^TM克隆试剂盒用法说明实施克隆方案，生成P242X6GH45构建体。依照制造商的方案将经处理的质粒和插入物转化入OneTOP10F化学感受态大肠杆菌细胞(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)中，并将其铺板到每ml补充有0.1mg氨苄青霉素的LB板上。在于37℃温育过夜后，在LB氨苄青霉素板上的选择下看到菌落生长。将用P242X6GH45构建体转化的两个菌落在每ml补充有0.1mg氨苄青霉素的LB培养基中培养，并用QIAprepSpin Miniprep Kit(QIAGEN Inc.,Valencia,CA,USA)依照制造商的方案分离质粒。

用载体引物和P242X6基因特异性引物对分离的质粒测序以测定没有PCR错误的代表性质粒表达克隆。

实施例4：表征编码具有内切葡聚糖酶活性的P242X6GH45多肽的嗜碱枝顶孢CBS114.92基因组序列

使用3.1版BIG-DYE^TM终止剂化学(Applied Biosystems,Inc.,Foster City,CA,USA)和引物步行策略，用Applied Biosystems 3700型自动化DNA测序仪实施嗜碱枝顶孢CBS114.92P242X6GH45基因组克隆的DNA测序。对核苷酸序列数据细察质量，并且借助于PHRED/PHRAP软件(University of Washington,Seattle,WA,USA)将所有序列彼此比较。获得的序列与来自北京基因组研究所(Beijing Genome Institute)(BGI,Shenzhen,China)的序列相同。

嗜碱枝顶孢P242X6基因的核苷酸序列和推到的氨基酸序列分别显示于SEQ IDNO:1和SEQ ID NO:2。SEQ ID NO:1的编码序列是包括终止密码子的1175bp，并且被90bp(核苷酸81至170)，56bp(核苷酸420至475)，52bp(核苷酸538至589)，和59bp(核苷酸638至696)的内含子中断。SEQ ID NO:2的编码预测蛋白质是305个氨基酸。使用SignalP程序(Nielsen等,1997,Protein Engineering 10:1-6)，预测16个残基的信号肽。预测的成熟蛋白含有289个氨基酸，预测的分子量为30.7kDa，且等电pH为4.92。通过使用BLAST与所有CAZY限定的亚族模块比对氨基酸序列预测内切葡聚糖酶催化域为氨基酸17至232(Cantarel等,2009,Nucleic Acids Res.37:D233-238)，其中使用亚族内单一的最显著比对预测GH45域。

使用具有缺口打开罚分10，缺口延伸罚分0.5，和EBLOSUM62矩阵的Needleman和Wunsch算法(Needleman and Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443-453)测定氨基酸序列的全面成对全局比对。比对显示了编码具有内切葡聚糖酶活性的P242X6GH45多肽的嗜碱枝顶孢基因的推导氨基酸序列(SEQ ID NO:2)与具有内切葡聚糖酶活性的来自Volutellacolletotrichoides的预测GH45家族蛋白(登录号GENESEQP:AED55857)的推导的氨基酸序列共享70.4％同一性(排除缺口)。

实施例5：嗜碱枝顶孢GH45内切葡聚糖酶P242X6的表达

将表达质粒pP242X6转化入米曲霉MT3568中。米曲霉MT3568是JaL355的AMDS(乙酰胺酶)受破坏的衍生物(WO 2002/40694)，其中pyrG营养缺陷型在敲除米曲霉乙酰胺酶(AMDS)基因的过程中恢复。

经由单一无性孢子将转化体在COVE蔗糖选择板上纯化，之后在PDA板上使它们形成孢子。从在YP+2％葡萄糖培养基中于30℃的1ml 96深孔静止培养的培养上清液分析转化体的嗜碱枝顶孢GH45多肽生成。通过考马斯染色在E-Page 8％SDS-PAGE 48孔凝胶(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)上确认表达。将1个转化体选择以进行进一步工作，并称作转化体-1。

对于较大规模的生产，将转化体-1孢子分散到PDA板上，并于37℃温育5天。将汇合的孢子板用5ml 0.01％20清洗两次以使收集的孢子数目最大化。然后，使用孢子悬浮液接种25个含有100ml Dap-4C培养基的500ml烧瓶中。将培养物于30℃在以100rpm不断摇动的情况中温育。在接种后第4天，通过过滤流过瓶顶式MF75Supor MachV 0.2μmPES滤器(Thermo Fisher Scientific,Roskilde,Denmark)收集培养液。来自此转化体的新鲜培养液产生约40kDa的GH45蛋白条带。表观的和预期的分子量之间的差异归因于糖基化。通过肽测序确认此条带作为嗜碱枝顶孢GH45多肽的身份。

实施例6：用于生成嗜碱枝顶孢GH45内切葡聚糖酶P242X6的备选方法

基于鉴定为SEQ ID NO:1的核苷酸序列，可以从许多售主，诸如Gene Art(GENEARTAG BioPark,Josef-Engert-Str.11,93053,Regensburg,Germany)或DNA 2.0(DNA2.0,1430O'Brien Drive,Suite E,Menlo Park,CA 94025,USA)获得合成基因。合成基因可以设计为掺入别的DNA序列，诸如限制性位点或同源重组区以促进对表达载体的克隆。

使用上文描述的两个合成寡核苷酸引物F-P242X6和F-P242X6，可以使用简单的PCR反应从SEQ ID NO:1的合成基因扩增全长可读框。然后，可以将基因克隆入表达载体中，例如如上文描述的，并在宿主细胞中，例如在如上文描述的米曲霉中表达。

实施例7：嗜碱枝顶孢GH45内切葡聚糖酶P242X6的纯化

将来自实施例5的转化体的培养液过滤流过0.2μm(微米)PES瓶顶式滤器以除去残留的表达宿主。将经过滤的培养液用等体积的2.4M磷酸铵，pH6.0稀释，并将样品再一次过滤流过0.2微米PES瓶顶式滤器以除去任何沉淀物。将粗制蛋白质滤液在用结合缓冲液(具有1.2M硫酸铵的20mM Tris-HCl，pH 6，补充有0.5mM CaCl₂)平衡的苯基Sepharose高效柱(GE Healthcare)上加载。使用2个柱体积的结合缓冲液洗去未结合的蛋白质。通过用洗脱缓冲液(补充有0.5mM CaCl₂的20mM Tris-HCl,pH 6.0)进行的线性梯度，引起12个柱体积里从1.2M至0.0M的降低硫酸铵梯度实施洗脱。在梯度后，通过至少4个柱体积的洗脱缓冲液洗脱剩余的蛋白质。

通过活性测定法鉴定含有纤维素酶的级份。简言之，将0.2％(w/v)AZCL-HE-纤维素浆(Megazyme,I-AZCEL)在0.1M磷酸钠缓冲液，pH 7.5中制备。将0.575mL AZCL-HE-纤维素浆与25微升样品混合，接着是热混合仪(于40℃1400rpm搅动)的20分钟温育。将0.1mL 1MNaOH添加至管以停止反应，并将样品于+5℃以14000rpm离心5分钟。将200微升反应混合物从每份样品转移至96孔微量滴定板，并读出590nm的吸光度。在SDS-PAGE(NuPAGE,invitrogen)上分析显示超过0.1AU的OD590的级份，并合并纯的级份。

实施例8：在Launder-O-meter中的生物抛光

在本实施例中使用自实施例7纯化的嗜碱枝顶孢GH45内切葡聚糖酶P242X6(SEQID NO:2的成熟肽，在此实施例中缩写为Aa GH45)进行生物抛光，并且将其性能与纯化的切葡聚糖酶Vc GH45比较。

将棉织品样本切成约16cm x 16cm(各约5克)。将各样本置于设条件的房间(65％湿度，21℃)中24小时，之后将它们计数，通过分析天平称重，并记录。用Launder-O-meter进行生物抛光。将2个条件化的样本和20个大钢球(总共220克左右)置于每个烧杯中。将烧杯充满如表1中规定的酶和缓冲液至总体积100ml，其可以得到液体与织品比率为约10:1(v/w)。

在选择需要的程序后开始Launder-O-Meter(LOM)仪，并且在温度达到35℃或55℃时它可以保持。给每个烧杯安装以2个Neoprin垫圈为衬里且与金属箝位装置紧密接近的盖。将烧杯加载到预热的LOM中。使用金属架在垂直位置在4个鼓状位置中每个容纳并保护5个烧杯。于35或55℃在预置的温度处理1小时后，将样本从烧杯取出，并转移到具有2g/L碳酸钠的灭活溶液中，并于85℃保持10分钟。然后，将样本从灭活浴中取出，并在热水中漂洗2次及在冷水中漂洗2次。将它们翻滚干燥1小时，条件化24小时，之后在重量减轻和起球记录方面评估。

表1中汇总的结果提示了在本文测试的所有pH/温度，本发明中生成的Aa GH45在加载相同量的蛋白质时与Vc GH45显示更好的性能。于55℃，0.032mg蛋白质/克织品的AaGH45在pH 6.5，7.5和8.5分别提供3.3，3.6，3.5的起球记录；比较而言，0.032mg蛋白质/克织品的Vc GH45在pH 6.5，7.5和8.5提供分别1.8，2.9，1.8的起球记录。于35℃，0.032mg蛋白质/克织品的Aa GH45在pH 6.5，7.5和8.5分别提供3.0，3.1，3.3的起球记录；比较而言，0.032mg蛋白质/克织品的Vc GH45在7.5和8.5两者都提供2.5的起球记录。Aa GH45于35和55℃(其中于55℃，性能更高)在6.5至8.5的较宽pH范围中(其中于pH7.5至8.5，性能更高)良好起作用。

表1：Aa GH45和Vc GH45在LOM中于35或55℃，pH 5-8.5生物抛光1小时

本文中描述并要求保护的发明在范围上不限于本文中公开的具体方面，因为这些方面意图为例示本发明的几个方面。任何等同方面意图在本发明的范围内。实际上，在本文中显示和描述的那些外，本发明的各种修改从上述描述看对于本领域技术人员会变得显而易见。此类修改也意图落入所附权利要求书的范围内。在冲突的情况中，应以包括定义在内的本公开内容为准。

Claims

1.一种具有内切葡聚糖酶活性的分离的多肽，其选自下组：

(a)多肽，其与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有100％序列同一性；

(b)多肽，其获自嗜碱枝顶孢(Acremonium alcalophilum)，与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少99％序列同一性；

(c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸与SEQ ID NO:1或其cDNA序列的成熟多肽编码序列具有100％序列同一性。

2.权利要求1的多肽，其组成为SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:2的成熟多肽。

3.权利要求1的多肽，其中所述成熟多肽是SEQ ID NO:2的氨基酸17至305。

4.一种包含催化域的分离的多肽，所述催化域选自下组：

(a)催化域，其与SEQ ID NO:2的氨基酸17至232具有100％序列同一性；

(b)催化域，其获自嗜碱枝顶孢(Acremonium alcalophilum)，与SEQ ID NO:2的氨基酸17至232具有至少99％的序列同一性；

(c)催化域，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸与SEQ ID NO:1或其cDNA序列的催化域具有100％序列同一性。

5.权利要求4的多肽，其进一步包含纤维素结合域。

6.权利要求4的多肽，其中所述催化域从内切葡聚糖酶获得。

7.权利要求1-6中任一项的多肽，其获自枝顶孢属(Acremonium)。

8.权利要求7的多肽，其获自嗜碱枝顶孢(Acremonium alcalophilum)。

9.一种组合物，其包含权利要求1-8中任一项的多肽。

10.一种用于处理纺织品的方法，其通过用权利要求1-8中任一项的分离的多肽处理纺织品进行。

11.一种分离的多核苷酸，其编码权利要求1-8中任一项的多肽。

12.一种核酸构建体或表达载体，其包含与一种或多种调控序列可操作连接的权利要求11的多核苷酸，所述调控序列指导所述多肽在表达宿主中生成。

13.一种生成权利要求1-8中任一项的多肽的方法，其包括：

(a)在有助于所述多肽生成的条件下培养细胞，所述细胞包含与一种或多种调控序列可操作连接的权利要求11的多核苷酸，所述调控序列指导所述多肽的生成，并且所述细胞以其野生型形式产生所述多肽；和

(b)回收所述多肽。