CN101310017A

CN101310017A - 具有内切葡聚糖酶活性的多肽和编码该多肽的多核苷酸

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Publication number: CN101310017A
Application number: CNA2006800430041A
Authority: CN
Inventors: 凯特杰·S·约翰森; 基思·吉布森; 普雷本·尼尔森; 赫勒·乌特拉普
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novo Nordisk AS
Priority date: 2005-11-16
Filing date: 2006-11-15
Publication date: 2008-11-19
Anticipated expiration: 2026-11-15
Also published as: JP5571310B2; EP1994148B1; BRPI0618658A2; JP2009517004A; CN101310017B; EP1994148A1; US20110201082A1; US20080280325A1; WO2007057418A1; US8309338B2; ATE515568T1

Abstract

本发明涉及具有内切葡聚糖酶活性的分离的多肽和编码所述多肽的分离的多核苷酸。本发明还涉及包含所述多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞，以及用于产生和使用所述多肽的方法。

Description

具有内切葡聚糖酶活性的多肽和编码该多肽的多核苷酸

序列

SEQ ID NO：1，编码芽孢杆菌属菌种(Bacillus sp.)ACE160内切葡聚糖酶的多核苷酸序列。

SEQ ID NO：2，芽孢杆菌属菌种ACE160内切葡聚糖酶和糖结合模块(carbohydrate binding module)的多肽序列。

发明领域

本发明涉及具有内切葡聚糖酶活性的分离的多肽和编码所述多肽的分离的多核苷酸。本发明还涉及包含所述多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞，以及用于在洗涤剂、纸和纸浆、石油钻井(oil drilling)、炼油(oil extraction)、酒和果汁(wine and juice)、食品成份(food ingredients)、动物饲料或纺织品工业中产生和使用所述多肽的方法。

发明背景

纤维素是通过β-1，4-糖苷键连接的葡萄糖的聚合物。纤维素链形成许多分子内和分子间氢键，导致不溶性纤维素微原纤维的形成。纤维素微生物水解成葡萄糖涉及以下三类主要的纤维素酶：(i)内切葡聚糖酶(EC 3.2.1.4)，其在整个纤维素分子中随机切割β-1，4-糖苷键，也称为内切-β-1，4-葡聚糖酶；(ii)纤维二糖水解酶(EC 3.2.1.91)，其从非还原端消化纤维素，释放纤维二糖；和(iii)β-葡糖苷酶(EC 3.2.1.21)，其水解纤维二糖和低分子量纤维糊精以释放葡萄糖。

β-1，4-糖苷键也存在于其它天然存在的聚合物中，例如在源自植物例如大麦和燕麦的β-葡聚糖中。在某些情况下，内切葡聚糖酶还提供对这些非纤维素聚合物的水解。

纤维素酶由许多微生物产生，并且通常以多种形式存在。对酶降解纤维素的经济意义的认识已经推动了对能够在工业上使用的微生物纤维素酶的广泛搜寻。结果，已经多种纤维素酶的酶性质和一级结构已经得到了研究。基于催化结构域氨基酸序列的疏水簇分析结果，这些纤维素酶被分成不同的糖基水解酶家族；已将真菌和细菌糖基水解酶分组为35个家族(Henrissat，B.：Aclassification of glycosyl hydrolases based on amino acid sequence similarities.Biochem.J.280(1991)，309-316。Henrissat，B.，and Bairoch，A.：New families inthe classification of glycosyl hydrolases based on amino acid sequence similarities.Biochem.J.293(1993)，781-788。)。大多数纤维素酶由被接头分开的糖结合模块(CBM)和催化结构域(CAD)组成，所述接头可富含脯氨酸和羟基氨基酸残基。已经基于纤维素酶的CBM的相似性建立了另一种纤维素酶分类法(Gilkes et al.(1991))，该分类生成五个糖基水解酶家族(I-V)。

纤维素酶由许多微生物合成，所述微生物包括真菌、放线菌、粘细菌和真细菌，但也由植物合成。特别是已经鉴定了具有很多种特异性的内切-β-1，4-葡聚糖酶。已经描述了许多细菌内切葡聚糖酶(Gilbert，H.J.and Hazlewood，G.P.(1993)J.Gen.Microbiol.139：187-194。Henrissat，B.，and Bairoch，A.：Newfamilies in the classification of glycosyl hydrolases based on amino acid sequencesimilarities.Biochem.J.293(1993)，781-788。)。

纤维素分解酶的一个重要工业用途是用于纸浆的处理，例如用于改进再循环纸的滤水(drainage)或用于再循环纸的脱墨。纤维素分解酶的另一个重要的工业用途是用于纤维素纺织品或织物的处理，例如作为洗涤剂组合物或织物柔软剂组合物中的成分，用于新织物的生物抛光(衣物整理(garment fin-ishing))，和用于获得含纤维素的织物特别是斜纹粗棉布(denim)的″石洗(stone-washed)″外观，并且已经提出用于这种处理的几种方法，例如在GB-A-1368 599、EP-A-0 307 564和EP-A-0 435 876、WO 91/17243、WO 91/10732、WO 91/17244、WO 95/24471和WO 95/26398中。日本专利申请no.13049/1999公开适合用于洗涤剂的源自芽孢杆菌属菌种KSM-S237(作为FERM-P-16067保藏)的耐热碱性纤维素酶。

提供可用于期望纤维素酶，优选内切-β-1，4-葡聚糖酶活性(内切葡聚糖酶，EC 3.2.1.4)的应用中的新纤维素酶或酶制剂，一直是人们的需求。

本发明的目的是提供多肽和多肽组合物，其在弱酸性至碱性条件下具有实质的(substantial)β-1，4-葡聚糖酶活性，并且在纸浆加工、纺织品处理、洗衣方法、提取方法或动物饲料中具有改进的性能；优选的是，这种性能优良的新内切葡聚糖酶可以使用重组技术高产率生产，或者是使用重组技术以高产率生产的。

发明概述

本发明涉及具有内切葡聚糖酶活性的分离的多肽，其选自下组：

(a)多肽，其具有与SEQ ID NO：2的氨基酸1至759具有至少72％同一性的氨基酸序列；

(b)多肽，其由在至少低严紧条件下与以下杂交的核苷酸序列编码：(i)SEQ ID NO：1的核苷酸100至2376，或(ii)(i)的互补链；和

(c)变体，其包含保守取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸的SEQ IDNO：2的氨基酸1至759。

本发明还涉及编码具有内切葡聚糖酶活性的多肽的分离的多核苷酸，其选自下组：

(a)编码多肽的多核苷酸，所述多肽具有与SEQ ID NO：2的氨基酸1至759具有至少72％同一性的氨基酸序列；

(b)多核苷酸，其在至少低严紧条件下与以下杂交：(i)SEQ ID NO：1的核苷酸100至2376，或(ii)(i)的互补链。

本发明还涉及包含所述多核苷酸的核酸构建体、重组表达载体和重组宿主细胞。

本发明还涉及用于产生这种具有内切葡聚糖酶活性的多肽的方法，其包括：(a)在有益于所述多肽产生的条件下培养包含核酸构建体的重组宿主细胞，所述核酸构建体包含编码该多肽的多核苷酸；和(b)回收所述多肽。

本发明的内切-β-1，4-葡聚糖酶具有稳定性和活性性质，这使其非常适合用于与含有表面活性剂和/或氧化活性类物质(例如化学漂白剂)的碱性水溶液相关的应用。这些应用条件非常普遍地存在于家用和工业洗涤剂、纺织品整理处理和纤维素纸浆的制造或再循环中。

因为本发明的内切葡聚糖酶在这些相关应用条件下维持其活性的程度是优异的，所以预期所述内切葡聚糖酶将比其它已知的酶更有用，例如，当用于洗涤剂中、用于纸/纸浆加工或用于纺织品处理时。因此本发明也涉及在洗涤剂或纺织品处理组合物、用于纸浆处理或用于生物质降解例如用于产生乙醇的组合物中使用本发明的多肽的方法。此外，本发明涉及用包含所述多肽的洗涤剂来洗涤纺织品、厨房用具或硬表面的方法，用于处理纤维素纺织品或织物的方法，例如软化、生物抛光或石洗。还包括用于改进再循环纸的滤水或再循环纸脱墨(de-inking)的方法。

本发明进一步涉及包含编码蛋白质的基因的核酸构建体，其中所述基因与编码信号肽的第一核苷酸序列中的一个或两个可操作地连接，所述第一核苷酸序列由SEQ ID NO：1的核苷酸1至99组成。

附图简述

图1，本发明的多肽的氨基酸序列(ACE160，SEQ ID NO：2)与现有技术的相关多肽的比对。现有技术多肽公开为：

名称	登录号	专利号
名称	登录号	专利号	KSM-64	ADP87708，GeneseqP	JP2004173598
KSM-365	AAR77395，GeneseqP	JP07203960-1994	KSM-64	ADP87708，GeneseqP	JP2004173598
KSM-365	AAR77395，GeneseqP	JP07203960-1994	KSM-634	AAR07478，GeneseqP	JP01281090
KSM-S237	ADP87707，GeneseqP	JP2004173598	KSM-634	AAR07478，GeneseqP	JP01281090
KSM-S237	ADP87707，GeneseqP	JP2004173598	MB1181	ABG76403，GeneseqP	WO200299091
KSM-635	P 19424，Uniprot	--	MB1181	ABG76403，GeneseqP	WO200299091

图2，显示本发明的内切葡聚糖酶(ACE160，SEQ ID NO：2)与现有技术多肽序列之间关系的系统树，其通过在DNAStar^TM程序包中程序MegAlign^TM版本5.05的ClustalV功能中用默认设置比对来构建。

定义

内切葡聚糖酶活性：术语“内切葡聚糖酶活性”在本文中定义为催化纤维素、地衣淀粉(lichenin)和谷物β-D-葡聚糖中的1，4-β-D-糖苷键内切水解(endohydrolysis)的水解活性，EC 3.2.1.4。用于测定内切葡聚糖酶活性的方法在下文中描述。

本发明的多肽具有由SEQ ID NO：2的氨基酸1至759所示氨基酸序列组成的多肽或由SEQ ID NO：2的氨基酸65至347组成的催化核心结构域的内切葡聚糖酶活性的至少70％，更优选至少80％，甚至更优选至少90％，甚至更优选至少95％，最优选至少98％，并且甚至最优选至少100％。

分离的多肽：术语“分离的多肽”用于本文中指通过SDS-PAGE测定为至少20％纯，优选至少40％纯，更优选至少60％纯，甚至更优选至少80％纯，最优选至少90％纯，甚至最优选至少95％纯的多肽。

基本上纯的多肽(substantially pure polypeptide)：术语“基本上纯的多肽”在本文表示多肽制备物，所述多肽制备物按重量计含有至多10％，优选至多8％，更优选至多6％，更优选至多5％，更优选至多4％，至多3％，甚至更优选至多2％，最优选至多1％，并且甚至最优选至多0.5％的与其天然伴随的(associated)的其它多肽材料。即，因此，优选所述基本上纯的多肽是按存在于制备物中的全部多肽材料的重量计至少92％纯，优选至少94％纯，更优选至少95％纯，更优选至少96％纯，更优选至少96％纯，更优选至少97％纯，更优选至少98％纯，甚至更优选至少99％纯，最优选至少99.5％纯，并且甚至最优选100％纯。

本发明的多肽优选是基本上纯的形式。具体而言，优选所述多肽是“实质上(essentially)纯的形式”，即，所述多肽制备物实质上(essentially)不含与其天然伴随的其它多肽材料。这可以通过，例如，用公知的重组方法或由经典纯化方法制备多肽来实现。

在本文中，术语“基本上纯的多肽”与术语“分离的多肽”和“分离形式的多肽”同义。

同一性：参数“同一性”描述两个氨基酸序列之间的相关性(relatedness)。

就本发明而言，通过使用来自EMBOSS软件包(http://emboss.org)版本 2.8.0的Needle程序来测定两个氨基酸序列之间的比对。Needle程序执行在Needleman，S.B.and Wunsch，C.D.(1970)J.Mol.Biol.48，443-453中描述的总体比对算法。使用的取代矩阵是BLOSUM62，缺口开启罚分(gap openingpenalty)是10，缺口延伸罚分(gap extension penalty)是0.5。

本发明的氨基酸序列(“发明序列”；例如SEQ ID NO：2的氨基酸1至759或SEQ ID NO：2的氨基酸65至347的催化核心结构域)和另一不同氨基酸序列(“外源序列”)之间的同一性程度如下计算：用两个序列比对中完全匹配的数目除以“发明序列”的长度或“外源序列”的长度中最短的一个。结果以百分比同一性表示。

当“发明序列”和“外源序列”在重叠的相同位置中具有同一氨基酸残基(在下述比对实例中用“|”表示)，发生完全匹配。序列的长度是序列中氨基酸残基的数目(例如SEQ ID NO：2的″发明序列″的长度是759个氨基酸)。

在以下比对实例中，重叠是序列1的氨基酸序列“HTWGER.NLG”；或序列2的氨基酸序列“HGWGEDANLA”。缺口用“.”表示。

比对实例

序列1：ACMSHTWGER.NLG

| ||| ||：

序列2：HGWGEDANLAMNPS

“发明序列”的重叠的长度可以是“发明序列”的长度的至少20％，更优选“发明序列”的长度的至少30％、40％、50％、60％、70％、80％或至少90％。

“外源序列”的重叠的长度可以是“外源序列”的长度的至少20％，更优选“发明序列”的长度的至少30％、40％、50％、60％、70％、80％或至少90％。

多肽片段：术语“多肽片段”在本文中定义为从SEQ ID NO：2或其同源序列的氨基和/或羧基末端缺失一个或多个氨基酸的多肽；其中所述片段具有内切葡聚糖酶活性。优选地，片段含有至少283个氨基酸残基，例如，SEQ ID NO：2的氨基酸65至347。

亚序列(subsequence)：术语“亚序列”在本文中定义为从SEQ ID NO：1或其同源序列的5′和/或3′端缺失一个或多个核苷酸的核苷酸序列；其中所述亚序列编码具有内切葡聚糖酶活性的多肽片段。优选地，亚序列含有至少849个核苷酸，例如，SEQ ID NO：1的核酸193至1041。

等位变体(allelic variant)：术语“等位变体”在本文中表示占据同一染色体基因座的基因的两种或更多种可选形式中的任一种。等位变异通过突变天然地发生，并且可导致种群内的多态性。基因突变可以是沉默的(在编码的多肽中无变化)或可以编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位变体是由基因的等位变体编码的多肽。

基本上纯的多核苷酸：术语“基本上纯的多核苷酸”用于本文指不含其它外来的或不期望的核苷酸的多核苷酸制备物，并且所述多核苷酸制备物处于适合于在基因工程化蛋白质生产体系中使用的形式。因此，基本上纯的多核苷酸按重量计含有至多10％，优选至多8％，更优选至多6％，更优选至多5％，更优选至多4％，更优选至多3％，甚至更优选至多2％，最优选至多1％，并且甚至最优选至多0.5％的与其天然伴随的其它多核苷酸材料。然而，基本上纯的多核苷酸可以包括天然存在的5’和3’非翻译区，例如启动子和终止子。优选基本上纯的多核苷酸是按重量计至少90％纯，优选至少92％纯，更优选至少94％纯，更优选至少95％纯，更优选至少96％纯，更优选至少97％纯，甚至更优选至少98％纯，最优选至少99％，并且甚至最优选至少99.5％纯的。本发明所述多核苷酸优选是基本上纯的形式。具体而言，优选的是，本文公开的多核苷酸是“实质上(essentially)纯的形式”，即，所述多核苷酸制备物实质上不含与其天然伴随的其它多核苷酸材料。在本文中，术语“基本上纯的多核苷酸”与术语“分离的多核苷酸”和“分离形式的多核苷酸”同义。所述多核苷酸可以是基因组、cDNA、RNA、半合成、合成来源的，或它们的任何组合。

核酸构建体：术语“核酸构建体”用于本文指单链或双链的核酸分子，所述核酸分子分离自天然存在的基因，或将所述核酸分子以本来不存在于(nototherwise exist)自然界中的方式修饰以含有核酸的片段。当所述核酸构建体含有本发明的编码序列表达所需的调控序列时，术语核酸构建体与术语“表达盒”同义。

调控序列(control sequence)：术语“调控序列”在本文定义为包括对编码本发明多肽的多核苷酸表达是必需的或有利的所有成分。每种调控序列对于编码所述多肽的核苷酸序列而言可以是天然的或外源的。这些调控序列包括但不限于前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列和转录终止子。至少，调控序列包括启动子和转录和翻译的终止信号。调控序列可以具有用于引入特异性限制位点的接头，所述特异性限制位点促进调控序列与编码多肽的核苷酸序列编码区的连接。

可操作地连接：术语“可操作地连接”在本文表示这样的构型，其中将调控序列置于相对于多核苷酸序列的编码序列的合适位置，使得调控序列指导多肽编码序列的表达。

编码序列：当用于本文时术语“编码序列”的意思是直接指定其蛋白产物的氨基酸序列的核苷酸序列。编码序列的边界通常由开读框决定，所述开读框通常以ATG起始密码子或可供选择的起始密码子例如GTG和TTG开始。编码序列可以是DNA、cDNA或重组核苷酸序列。

表达：术语“表达”包括多肽的产生所涉及的任何步骤，其包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。

表达载体：术语“表达载体”在本文定义为线性的或环状的DNA分子，其包含编码本发明多肽的多核苷酸，并且所述多核苷酸与提供用于其表达的额外核苷酸可操作地连接。

宿主细胞：如本文中所使用的术语“宿主细胞”包括任何对于使用包含本发明多核苷酸的核酸构建体的转化、转染、转导等易感的(susceptible)细胞类型。

发明详述

具有内切葡聚糖酶活性的多肽

在第一个方面，本发明涉及具有下述氨基酸序列的分离的多肽，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：2的氨基酸1至759即成熟多肽具有至少72％，优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，甚至更优选至少90％，最优选至少95％，并且甚至最优选至少97％的同一性程度，所述多肽具有内切葡聚糖酶活性(下文中称“同源多肽”)。在优选的方面，所述同源多肽具有与SEQID NO：2的氨基酸1至759相差十个氨基酸，优选相差五个氨基酸，更优选相差四个氨基酸，甚至更优选相差三个氨基酸，最优选相差两个氨基酸，并且甚至最优选相差一个氨基酸的氨基酸序列。

本发明的多肽优选包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列或其等位变体；或其具有内切葡聚糖酶活性的片段。在优选的方面，多肽包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列。在另外的优选方面，多肽由SEQ ID NO：2的氨基酸序列或其等位变体组成；或由其具有内切葡聚糖酶活性的片段组成。在另外的优选方面，多肽由SEQ ID NO：2的氨基酸序列组成。在另一个优选方面，多肽包含SEQID NO：2的氨基酸65至347中的催化核心结构域，或其等位变体；或其具有内切葡聚糖酶活性的片段。催化核心结构域的多肽具有与SEQ ID NO：2的氨基酸65至347具有至少86％，更优选至少88％，甚至更优选至少90％，最优选至少95％，并且甚至最优选至少97％的同一性程度的氨基酸序列。在另外的优选方面，多肽包含SEQ ID NO：2的氨基酸65至347中的催化核心结构域，或其变体；或其具有内切葡聚糖酶活性的片段。在另外的优选方面，多肽由SEQ ID NO：2的氨基酸65至347组成。

对催化核心结构域的注解基于与糖基水解酶家族5的纤维素酶的同源性(Henrissat B.A classification of glycosyl hydrolases based on amino acidsequence similarities.Biochem.J.280309-316(1991)；Henrissat B.，Bairoch A.New families in the classification of glycosyl hydrolases based on amino acidsequence similarities.Biochem.J.293781-788(1993)；Henrissat B.，Bairoch A.Updating the sequence-based classification of glycosyl hydrolases.Biochem.J.316695-696(1996)；Davies G.，Henrissat B.Structures and mechanisms ofglycosyl hydrolases.Structure 3853-859(1995)；Henrissat B.，Claeyssens M.，Tomme P.，Lemesle L.，Mornon J.-P. Cellulase families revealed by hydrophobiccluster analysis.Gene 8183-95(1989)；Py B.，Bortoli-German I.，Haiech J.，Chippaux M.，Barras F.Cellulase EGZ of Erwinia chrysanthemi：structuralorganization and importance of His98 and Glu133 residues for catalysis.ProteinEng.4325-333(1991))。催化核心结构域的结构域注解可以通过http://afmb.cnrs-mrs.fr/CAZY/、http://www.ebi.ac.uk/interpro/、http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/或http://www.expasy.org/prosite/获得。

在本发明的另一个方面，多肽包含SEQ ID NO：2的氨基酸368至569中的糖结合模块。在另一优选的方面，本发明涉及包含糖结合模块的多肽，所述糖结合模块与SEQ ID NO：2的氨基酸368至569具有至少67％，更优选至少70％，更优选至少80％，更优选至少85％，甚至更优选至少90％，最优选至少95％，并且甚至最优选至少97％的同一性程度。在另一优选的方面，多肽包含SEQ ID NO：2的氨基酸368至569中的糖结合模块，或其等位变体；或具有糖结合活性的它们的片段。在另外的优选方面，多肽由SEQ ID NO：2的氨基酸368至569组成。

糖结合模块属于家族17/28。CBM的注解基于与已知序列特别是KSM-635的CBM(Ozaki，K.Shikata，S.Kawai，S.Ito，S.Okamoto，K.；″Molecularcloning and nucleotide sequence of a gene for alkaline cellulose from Bacillus sp.KSM-635.″；J.Gen.Microbiol.136：1327-1334(1990)，Uniprot No.P19424)的同源性，所述KSM-635的CBM的注解为基于与半乳糖结合样结构域的相关性的CBM，所述半乳糖结合样结构域在Ito N.，Phillips S.E.，Stevens C.，OgelZ.B.，McPherson M.J.，Keen J.N.，Yadav K.D.，Knowles P.F.Novel thioether bondrevealed by a 1.7A crystal structure of galactose oxidase.Nature 350 87-90(1991)；Macedo-ribeiro S.，Bode W.，Huber R.，Quinn-Allen M.A.，Kim S.W.，Ortel T.L.，Bourenkov G.P.，Bartunik H.D.，Stubbs M.T.，Kane W.H.，Fuentes-priorP.Crystal structures of the membrane-binding C2 domain of human coagulationfactor V.Nature 402 434-439(1999)；Himanen J.P.，Raj ashankar K.R.，LackmannM.，Cowan C.A.，Henkemeyer M.，Nikolov D.B.Crystal structure of an Ephreceptor-ephrin complex.Nature 414 933-938(2001)[PUBMED：11780069][PUB00010665]；和Marintchev A.，Mullen M.A.，Maciejewski M.W.，Pan B.，Gryk M.R.，Mullen G.P.Solution structure of the single-strand break repair proteinXRCC1 N-terminal domain.Nat.Struct.Biol.6 884-893(1999)中描述。糖结合模块的结构域注解可通过http://afmb.cnrs-mrs.fr/CAZY/、http://www.ebi.ac.uk/interpro/、http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/或http://www.expasy.org/prosite/获得。

在第二个方面，本发明涉及具有内切葡聚糖酶活性的分离的多肽，所述分离的多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸在非常低严紧条件下，优选低严紧条件下，更优选中严紧条件下，更优选中-高严紧条件下，甚至更优选高严紧条件下，并且最优选非常高严紧条件下，与以下序列杂交：(i)SEQ ID NO：1的核苷酸100至2376，(ii)(i)的亚序列或(iii)(i)或(ii)的互补链(J.Sambrook，E.F.Fritsch，and T.Maniatis，1989，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，2dedition，Cold Spring Harbor，New York)。SEQ ID NO：1的亚序列含有至少100个连续的核苷酸或优选至少200个连续的核苷酸，更优选300、400、500、600、700、800、900个连续的核苷酸或甚至更优选至少1000个连续的核苷酸。此外，所述亚序列可编码具有内切葡聚糖酶活性的多肽片段。

可以利用SEQ ID NO：1的核苷酸序列或其亚序列，以及SEQ ID NO：2的氨基酸序列或其片段来设计核酸探针，根据本领域内公知的方法从不同属和种的菌株鉴定和克隆编码具有内切葡聚糖酶活性的多肽的DNA。具体而言，可根据标准的Southern印迹方法，将这些探针用于与感兴趣的属或种的基因组或cDNA杂交，以鉴定和分离其中相应的基因。这些探针可明显短于完整序列，但长度上应为至少14，优选至少25，更优选至少35，并且最优选至少70个核苷酸。然而，优选所述核酸探针的长度是至少100个核苷酸。例如，所述核酸探针的长度可以是至少200个核苷酸，优选至少300个核苷酸，更优选至少400个核苷酸，或最优选至少500个核苷酸。可以使用更长的探针，例如，长度是至少600个核苷酸，至少700个核苷酸，更优选至少800个核苷酸，或最优选至少900个核苷酸的核酸探针。DNA和RNA探针二者均可使用。通常将探针标记以探测相应的基因(例如，用³²P、³H、³⁵S、生物素或抗生物素蛋白(avidin)标记)。本发明包含这些探针。

因此，可以在由这些其它生物制备的基因组DNA文库中筛选与上述探针杂交并且编码具有内切葡聚糖酶活性的多肽的DNA。可以通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳或其它分离技术来分离来自这些其它生物的基因组DNA或其它DNA。可以将来自文库的DNA或分离的DNA转移至硝酸纤维素(nitrocellulose)或其它合适的载体材料并且固定于其上。为了鉴定与SEQ IDNO：1或其亚序列同源的克隆或DNA，将所述载体材料用在Sounthern印迹中。

就本发明而言，杂交表示核苷酸序列在非常低至非常高的严紧条件下与标记的核酸探针杂交，所述核酸探针对应于SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列、它的互补链或其亚序列。可使用例如X射线胶片(X-ray film)检测在这些条件下与核酸探针杂交的分子。

在优选的方面，核酸探针是SEQ ID NO：1的核苷酸193至1041。在另一优选的方面，核酸探针是编码SEQ ID NO：2的多肽的多核苷酸序列，或其亚序列。在另一优选的方面，核酸探针是SEQ ID NO：1。在另一优选的方面，核酸探针是SEQ ID NO：1的成熟多肽编码区。

对于长度至少100个核苷酸的长探针，将非常低至非常高的严紧条件定义为在42℃，在5X SSPE、0.3％SDS、200μg/ml已剪切并且变性的鲑精DNA，和对于非常低和低严紧性为25％的甲酰胺，对于中和中-高严紧性为35％的甲酰胺，或对于高和非常高严紧性为50％的甲酰胺中，根据标准的Southern印迹法进行预杂交和杂交最佳12至24小时。

对于长度为至少100个核苷酸的长探针，使用2X SSC、0.2％SDS优选至少在45℃(非常低严紧性)，更优选至少在50℃(低严紧性)，更优选至少在55℃(中严紧性)，更优选至少在60℃(中-高严紧性)，甚至更优选至少在65℃(高严紧性)，并且最优选至少在70℃(非常高严紧性)将载体材料最终洗涤三次，每次15分钟。优选地，使用0.2X SSC、0.2％SDS优选至少在45℃(非常低严紧性)，更优选至少在50℃(低严紧性)，更优选至少在55℃(中严紧性)，更优选至少在60℃(中-高严紧性)，甚至更优选至少在65℃(高严紧性)，并且最优选至少在70℃(非常高严紧性)进行所述洗涤。

对于长度大约15个核苷酸至大约70个核苷酸的短探针，将严紧条件定义为在比根据Bolton和McCarthy计算法(1962，Proceedings of the NationalAcademy of Sciences USA 48：1390)计算的T_m低大约5℃至大约10℃的温度，在0.9M NaCl、0.09M Tris-HCl pH 7.6、6mM EDTA、0.5％NP-40、1×Denhardt溶液、1mM焦磷酸钠(sodium pyrophosphate)、1mM磷酸二氢钠(sodiummonobasic phosphate)、0.1mM ATP和0.2mg每ml的酵母RNA中，根据标准的Southern印迹步骤进行预杂交、杂交和杂交后洗涤。

对于长度大约15个核苷酸至大约70个核苷酸的短探针，将所述载体材料在6X SCC加0.1％SDS中洗涤一次15分钟，并使用6X SSC在比计算的T_m低5℃至10℃的温度洗涤两次，每次15分钟。

在第三个方面，本发明涉及具有内切葡聚糖酶活性的分离的多肽，所述多肽由包含SEQ ID NO：1的核苷酸193或1041作为独特(unique)基序的多核苷酸编码。

在第四个方面，本发明涉及具有以下理化特性的分离的多肽：pI为4.4，最适pH为9，最适温度为40℃，且在pH 5-10.5具有稳定性。本发明的β-1，4-葡聚糖酶不被Fe(II)离子显著失活。所述多肽的酶活性对亚铁离子的存在的敏感性可能限制多肽的可应用性，例如在金属容器或设备中进行的方法。

在第五个方面，本发明涉及人工变体，所述人工变体包含保守取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸的SEQ ID NO：2或其成熟多肽。优选氨基酸改变在性质上是较不重要的(ofa minor nature)，即保守的氨基酸取代或插入，其不显著影响蛋白质的折叠和/或活性；通常为1至大约30个氨基酸的小缺失；小的氨基或羧基末端延伸，例如氨基末端甲硫氨酸残基；多至大约20-25个残基的小接头肽；或通过改变净电荷或其它功能来促进纯化的小延伸，例如多组氨酸序列(poly histidine tract)、抗原表位(antigenic epitope)或结合域(binding domain)。

保守取代的实例是在以下组之内：碱性氨基酸组(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸组(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸组(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸组(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)、芳族氨基酸组(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸组(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸)。通常不改变具体活性(specific activity)的氨基酸取代是本领域已知的，并且由例如H.Neurath and R.L.Hill，1979，In，The Proteins，Academic Press，New York描述。最普遍存在的交换是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly。

除了上述20种基本氨基酸，可以用非基本氨基酸(例如4-羟脯氨酸、6-N-甲基赖氨酸、2-氨基异丁酸、异缬氨酸和α-甲基丝氨酸)取代野生型多肽的氨基酸残基。可以用有限数量的非保守氨基酸、不由遗传密码编码的氨基酸和非天然氨基酸来取代氨基酸残基。“非天然氨基酸”在蛋白质合成后已经过修饰，并且/或者在它们的侧链具有不同于基本氨基酸的化学结构。非天然氨基酸能够以化学方法合成，并且优选是商业上能够获得的，包括2-哌啶酸(pipecolic acid)、噻唑烷酸(thiazolidine carboxylic acid)、脱氢脯氨酸、3-和4-甲基脯氨酸，和3，3-二甲基脯氨酸。

可供选择的是，氨基酸改变具有这样的性质，使得多肽的物理化学性质发生改变。例如，氨基酸改变可改进多肽的热稳定性，改变底物特异性，改变最适pH等。

能够根据本领域已知的方法，例如定点诱变或丙氨酸扫描诱变法(Cunningham and Wells，1989，Science 244：1081-1085)来鉴定亲本多肽中的必需氨基酸。在后一技术中，向分子中的每个残基引入单一丙氨酸突变，并且测试所得突变分子的生物活性(即，内切葡聚糖酶活性)以鉴定对于所述分子的活性而言关键的氨基酸残基。同样参见Hilton et al.，1996，J.Biol.Chem.271：4699-4708。酶的活性部位或其它的生物相互作用也可以通过结构的物理分析来测定，如通过以下这些技术：如核磁共振、晶体学、电子衍射或光亲和标记，结合对推定接触位点氨基酸的突变来加以测定。参见例如de Vos et al.，1992，Science 255：306-312；Smith et al.，1992，J.Mol.Biol.224：899-904；Wlodaver et al.，1992，FEBSLett.309：59-64。也可以从分析同与本发明多肽相关的多肽的同一性来推断必需氨基酸的身份。

可以使用已知的诱变、重组和/或改组(shuffling)方法，然后进行有关的筛选方法，例如那些由Reidhaar-Olson and Sauer，1988，Science 241：53-57；Bowieand Sauer，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：2152-2156；WO 95/17413；或WO 95/22625公开的那些方法来实现和测试单个或多个氨基酸取代。能够使用的其它方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如，Lowman et al.，1991，Biochem.30：10832-10837；美国专利号5,223,409；WO 92/06204)和区域定向诱变(Derbyshire et al.，1986，Gene 46：145；Ner et al.，1988，DNA 7：127)。

具有内切葡聚糖酶活性的多肽的来源

本发明的多肽可以获得自任何属的微生物。就本发明而言，用于本文与给定的来源有关的术语“获得自”的意思是核苷酸序列编码的多肽由所述来源产生，或由其中插入了来自所述来源的核苷酸序列的菌株产生。在优选的方面，获得自给定来源的多肽是胞外分泌的。

本发明的多肽可以是细菌多肽。例如，所述多肽可以是革兰氏阳性细菌多肽例如芽孢杆菌属(Bacillus)多肽，例如嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)多肽；或链霉菌属(Streptomyces)多肽，例如，浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)或鼠灰链霉菌(Streptomyces murinus)多肽；或革兰氏阴性细菌多肽，例如，大肠杆菌或假单胞菌属菌种(Pseudomonas sp.)多肽。

在另一优选的方面，多肽是芽孢杆菌属菌种ACE160多肽，例如SEQ IDNO：2的多肽。

可理解的是对于前述的种，本发明包含完全和不完全阶段(peffect andimperfect states)，和其它分类学的等同物(equivalent)，例如无性型(anamorph)，而与它们已知的种名无关。本领域技术人员将轻易地识别适合的等同物的身份。

对于公众而言，这些种的菌株可以容易地获自许多培养物保藏机构，诸如美国典型培养物保藏中心(the American Type Culture Collection)(ATCC)、德意志微生物和细胞培养物保藏中心(Deutsche Sammiung von Mikroorganismenund Zellkulturen GmbH)(DSMZ)、真菌菌种保藏中心(Centraalbureau VoorSchimmelcultures)(CBS)和农业研究机构专利培养物保藏中心北区研究中心(Agricultural Research Service Patent Culture Collection，Northern RegionalResearch Center)(NRRL)。

此外，可以使用上述的探针从其它来源，包括从自然界(例如，土壤、堆肥、水等)分离的微生物鉴定和获得这些多肽。用于从天然生境(habitat)分离微生物的技术是本领域内公知的。随后可通过相似地筛选其它微生物的基因组文库或cDNA文库来获得所述多核苷酸。一旦用所述探针检测到编码多肽的多核苷酸序列，就可以使用本领域普通技术人员熟知的技术分离或克隆所述多核苷酸(参见，例如，Sambrook et al.，1989，见上文)。

本发明的多肽还包括融合多肽或可切割的融合多肽，其中另外的多肽被融合到所述多肽或其片段的N末端或C末端。通过将编码另一种多肽的核苷酸序列(或其部分)融合于本发明的核苷酸序列(或其部分)来产生融合的多肽。产生融合多肽的技术是本领域已知的，包括连接编码多肽的编码序列以使它们共阅读框，并且使融合多肽的表达在相同启动子和终止子的控制下。

多核苷酸

本发明还涉及分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸具有编码本发明的多肽的核苷酸序列。在优选的方面，核苷酸序列是SEQ ID NO：1中所示。在另一优选的方面，核苷酸序列是SEQ ID NO：1的成熟多肽编码区。本发明还包含编码具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多肽或其成熟多肽的核苷酸序列，且由于遗传密码的简并性所述核苷酸序列不同于SEQ ID NO：1。本发明还涉及SEQ ID NO：1的亚序列，其编码具有内切葡聚糖酶活性的SEQ ID NO：2的片段，例如SEQ ID NO：2的氨基酸65至347的催化核心结构域或SEQ IDNO：2的氨基酸368至569的片段。

本发明还涉及突变多核苷酸，所述突变多核苷酸在SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列中包含至少一个突变，其中所述突变核苷酸序列编码由SEQ IDNO：2的氨基酸1至759组成的多肽。

用于分离或克隆编码多肽的多核苷酸的技术是本领域内已知的，包括从基因组DNA分离，从cDNA制备，或其组合。可通过例如使用熟知的聚合酶链式反应(PCR)或表达文库的抗体筛选来检测具有共有结构特性的克隆DNA片段，从而实现从这种基因组DNA克隆本发明的多核苷酸。参见，例如，Innis et al.，1990，PCR：A Guide to Methods and Application，Academic Press，New York。可以使用其它核酸扩增方法，例如连接酶链式反应(LCR)、连接活化转录(ligated activated transcription；LAT)和基于核苷酸序列的扩增(NASBA)。可以从芽孢杆菌属的菌株，或从其它或相关的生物克隆所述多核苷酸，因此所述多核苷酸可以是例如所述核苷酸序列的多肽编码区的等位基因变体或种间变体(species variant)。

本发明还涉及具有下述核苷酸序列的多核苷酸，所述核苷酸序列与SEQID NO：1的成熟多肽编码序列(即，核苷酸100至2376)具有至少60％，优选至少65％，更优选至少70％，更优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，甚至更优选至少95％，并且最优选至少97％同一性的同一性程度，所述多核苷酸编码活性多肽。

修饰编码本发明的多肽的核苷酸序列对于合成与所述多肽基本上相似的多肽可能是必需的。术语与所述多肽“基本上相似”指多肽的非天然存在的形式。这些多肽可能以某些工程改造的方式不同于从其天然来源分离的多肽，例如，比活性、热稳定性、最适pH等方面不同的人工变体。可以在作为SEQID NO：1的多肽编码区提供的核苷酸序列，例如其亚序列的基础上构建变体序列，和/或通过引入如下的核苷酸取代来构建变体序列：所述取代不产生由核苷酸序列编码的多肽的其它氨基酸序列，但是符合意欲产生酶的宿主生物的密码子用法；或者所述取代可产生不同的氨基酸序列。关于核苷酸取代的概述，参见，例如，Ford et al.，1991，Protein Expression and Purification 2：95-107。

本领域技术人员显而易见的是，这些取代可以在对于分子功能至关重要的区域之外进行，并且仍然产生活性多肽。对于由本发明的分离的多核苷酸编码的多肽活性关键的并且因此优选不加以取代的氨基酸残基，可以根据本领域公知的方法，例如定位诱变或丙氨酸扫描诱变法(参见，例如，Cunninghamand Wells，1989，Science 244：1081-1085)来鉴定。在后一技术中，在分子中的每个正电残基处引入突变，测试所得突变分子的内切葡聚糖酶活性，以鉴定对于所述分子的活性关键的氨基酸残基。底物-酶相互作用的位点也可以通过分析三维结构来确定，所述三维结构通过如核磁共振分析、晶体学或光亲和标记这样的技术来测定(参见，例如，de Vos et al.，1992，Science 255：306-312；Smith et al.，1992，Journal of Molecular Biology 224：899-904；Wlodaver et al.，1992，FEBS Letters 309：59-64)。

本发明还涉及编码本发明多肽的分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸在非常低严紧条件下，优选低严紧条件，更优选中严紧条件，更优选中-高严紧条件，甚至更优选高严紧条件，并且最优选非常高的严紧条件下，与以下杂交：(i)SEQ ID NO：1的核苷酸100至2376，(ii)SEQ ID NO：1的核苷酸193至1041，(iii)SEQ ID NO：1的核苷酸1104至1707或(iv)(i)至(iii)的互补链；或它们的如本文所定义的等位变体和亚序列(Sambrook et al.，1989，见上文)。

本发明还涉及分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸通过以下方法获得：(a)在非常低、低、中、中-高、高或非常高严紧条件下，将DNA的群体与以下杂交：(i) SEQ ID NO：1的核苷酸100至2376，或(ii)(i)的互补链；和(b)分离发生杂交的多核苷酸，其编码具有内切葡聚糖酶活性的多肽。

核酸构建体

本发明还涉及包含本发明的分离的多核苷酸的核酸构建体，所述分离的多核苷酸与一个或多个调控序列可操作地连接，所述调控序列在合适的宿主细胞中在与该调控序列相容的条件下指导编码序列的表达。

可以用许多方式操作编码本发明多肽的分离的多核苷酸以提供多肽的表达。依赖于表达载体，在将多核苷酸的序列插入载体之前对其进行操作可能是理想的或必需的。使用重组DNA方法修饰多核苷酸序列的技术是本领域熟知的。

调控序列可以是合适的启动子序列，其是由用于表达编码本发明多肽的多核苷酸的宿主细胞识别的核苷酸序列。启动子序列含有介导多肽的表达的转录调控序列。启动子可以是在所选的宿主细胞中显示转录活性的任何核苷酸序列，包括突变的、截断的和杂合的启动子，并且可以从编码与宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因获得。

用于指导本发明的核酸构建体转录，特别是在细菌宿主细胞中转录的合适启动子的实例是从下述获得的启动子：大肠杆菌lac操纵子、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)琼脂糖酶基因(dagA)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、嗜热脂肪芽孢杆菌产麦芽淀粉酶基因(amyM)、解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因和原核β-内酰胺酶基因(Villa-Kamaroff et al.，1978，Proceedings of the National Academy of SciencesUSA 75：3727-3731)，以及tac启动子(DeBoer et al.，1983，Proceedings of theNational Academy of Sciences USA 80：21-25)。另外的启动子在″Useful proteinsfrom recombinant bacteria″in Scientific American，1980，242：74-94中；和在Sambrook et al.，1989，见上文中有所描述。

用于指导本发明的核酸构建体在丝状真菌宿主细胞中转录的合适启动子的实例是从下列酶的基因获得的启动子：米曲霉(Aspergillus oryzae)TAKA淀粉酶、曼赫根毛霉(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉(Aspergillusniger)中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉(Aspergillus awamori)葡糖淀粉酶(glaA)、曼赫根毛霉脂肪酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)乙酰胺酶、镶片镰孢(Fusarium venenatum)淀粉葡糖苷酶(WO 00/56900)、镶片镰孢Daria(WO00/56900)、镶片镰孢Quinn(WO 00/56900)、尖镰孢(Fusarium oxysporum)胰蛋白酶样蛋白酶(WO 96/00787)、里氏木霉(Trichoderma reesei)β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶IV、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉β-木糖苷酶，以及NA2-tpi启动子(来自黑曲霉中性α-淀粉酶基因和米曲霉丙糖磷酸异构酶基因的启动子的杂合体)；和它们的突变的、截断的和杂合的启动子。

在酵母宿主中，有用的启动子从如下蛋白的基因获得：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH1，ADH2/GAP)、酿酒酵母丙糖磷酸异构酶(TPI)、酿酒酵母金属硫蛋白(CUP1)和酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。对于酵母宿主细胞其它有用的启动子由Romanos et al.，1992，Yeast 8：423-488描述。

调控序列也可以是合适的转录终止子序列，即由宿主细胞识别以终止转录的序列。所述终止子序列与编码所述多肽的核苷酸序列的3’末端可操作地连接。任何在所选宿主细胞中有功能的终止子均可以在本发明中使用。

对于丝状真菌宿主细胞优选的终止子从如下酶的基因获得：米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉α-葡糖苷酶和尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶。

对于酵母宿主细胞优选的终止子从如下酶的基因获得：酿酒酵母烯醇化酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)和酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶。对于酵母宿主细胞其它有用的终止子由Romanos et al.，1992，见上文描述。

调控序列还可以是合适的前导序列，即对于宿主细胞的翻译重要的mRNA非翻译区。前导序列可操作地连接于编码多肽的核苷酸序列的5’-末端。在所选宿主细胞中有功能的任何前导序列均可以在本发明中。

对于丝状真菌宿主细胞优选的前导序列从如下酶的基因获得：米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶。

对于酵母宿主细胞合适的前导序列从如下酶的基因获得：酿酒酵母烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α因子和酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)。

调控序列也可以是聚腺苷酸化序列，即与核苷酸序列的3’末端可操作地连接的序列，并且在转录时，宿主细胞将其识别为将聚腺苷残基添加至转录的mRNA的信号。在所选宿主细胞中有功能的任何聚腺苷酸化序列均可以在本发明中使用。

对于丝状真菌宿主细胞优选的聚腺苷酸化序列从如下酶的基因获得：米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶和黑曲霉α-葡糖苷酶。

对于酵母宿主细胞有用的聚腺苷酸化序列记载于Guo and Sherman，1995，Molecular Cellular Biology 15：5983-5990。

调控序列还可以是信号肽编码区，其编码与多肽的氨基末端相联，并且指导编码的多肽进入细胞分泌途径的氨基酸序列。核苷酸序列的编码序列5’端可固有地包含信号肽编码区，其与编码分泌多肽的编码区片段一起天然地连接在翻译阅读框中。或者，编码序列5’端可含有与所述编码序列异源的信号肽编码区。在编码序列不天然地含有信号肽编码区的场合，异源信号肽编码区可能是必需的。或者，外源信号肽编码区可以简单地取代天然信号肽编码区以增强多肽的分泌。然而，指导表达的多肽进入所选宿主细胞的分泌途径的任何信号肽编码区均可以在本发明中使用。

对于细菌宿主细胞有效的信号肽编码区是从下列蛋白的基因获得的信号肽编码区：芽孢杆菌属NCIB 11837产麦芽糖淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草溶菌素(subtilisin)、地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT、nprS、nprM)和枯草芽孢杆菌prsA。Simonenand Palva，1993，Microbiological Reviews 57：109-137描述了其它信号肽。

对于丝状真菌宿主细胞有效的信号肽编码区是从下述蛋白的基因获得的信号肽编码区：米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、特异腐质霉(Humicola insolens)纤维素酶和疏棉状腐质霉(Humicola lanuginosa)脂肪酶。

在优选的方面，信号肽编码区是SEQ ID NO：1的核苷酸1至99，其编码SEQ ID NO：2的氨基酸-33至-1。

对于酵母宿主细胞有用的信号肽从酿酒酵母α因子和酿酒酵母转化酶的基因获得。其它有用的信号肽编码区由Romanos et al.，1992，见上文描述。

调控序列还可以是前肽编码区，其编码位于多肽氨基末端的氨基酸序列。所得多肽称为酶原(proenzyme)或前多肽(propolypeptide)(或在某些情况下称为酶原(zymogen))。前多肽通常是无活性的，并且能够通过前肽的催化或自催化切割从前多肽转化成成熟活性多肽。可以从枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、酿酒酵母α因子、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶和嗜热毁丝霉漆酶(WO 95/33836)的基因获得前肽编码区。

当信号肽和前肽区二者均出现在多肽的氨基末端时，前肽区紧邻着(nextto)多肽氨基末端，而信号肽区紧邻着前肽区的氨基末端。

此外，最好添加调节序列，其允许相对于宿主细胞的生长来调节多肽的表达。调节系统的实例是导致基因表达响应于化学或物理刺激，包括调节性化合物的存在，而开启或关闭的那些系统。原核系统中的调节系统包括lac、tac和trp操纵基因系统。在酵母中，可以使用ADH2系统或GAL1系统。在丝状真菌中，可以使用TAKA α-淀粉酶启动子、黑曲霉葡糖淀粉酶启动子和米曲霉葡糖淀粉酶启动子作为调节序列。调节序列的其它实例是那些允许基因扩增的序列。在真核系统中，这些序列包括在甲氨蝶呤(methotrexate)存在下扩增的二氢叶酸还原酶基因，和随重金属(with heavy metal)扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况下，编码多肽的核苷酸序列可与调节序列可操作地连接。

表达载体

本发明还涉及重组表达载体，所述重组表达载体包含本发明的多核苷酸、启动子和转录和翻译终止信号。上文所述的多种核酸和调控序列可以结合在一起以产生重组表达载体，所述表达载体可以包括一个或多个方便的限制位点以允许在这些位点插入或替换编码多肽的核苷酸序列。或者，可以通过在合适的用于表达的载体中插入包含所述序列的核苷酸序列或核酸构建体来表达本发明的核苷酸序列。在制备表达载体的过程中，将编码序列置于载体中，致使该编码序列与合适的表达调控序列可操作地连接。

重组表达载体可以是任何载体(例如，质粒或病毒)，其能够方便地进行重组DNA步骤，并且能够产生核苷酸序列的表达。载体的选择将通常依赖于载体与将引入该载体的宿主细胞的相容性。载体可以是线状或闭合环状质粒。

载体可以是自主复制载体，即作为染色体外实体(entity)存在，其复制独立于染色体复制的载体，例如，质粒、染色体外元件、微型染色体(minichromosome)或人工染色体。载体可以含有任何用于确保自复制的手段(means)。或者，载体可以是当被引入宿主细胞中时，整合到基因组中并且与整合了该载体的染色体一起复制的载体。此外，可以使用单独的载体或质粒，或使用共同含有待引入宿主细胞基因组的完整DNA(total DNA)的两个或更多个载体或质粒，或可以使用转座子(transposon)。

本发明的载体优选地含有一个或多个选择性标记，其允许容易地选择被转化的细胞。选择性标记是基因，其产物提供杀生物剂或病毒抗性、对重金属的抗性、对营养缺陷型的原养性(prototrophy to auxotrophs)等。

条件性必需基因(conditionally essential gene)可以作为非抗生素选择性标记发挥作用。细菌条件性必需非抗生素选择性标记的非限制性例子是来自枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌或其它芽孢杆菌(Bacilli)的dal基因，这些基因仅当在缺乏D-丙氨酸条件下培养细菌时是必需的。当将细胞培养在存在半乳糖的条件下或培养在导致半乳糖存在的培养基中时，编码UDP-半乳糖更新(turnover)中涉及的酶的基因同样能够发挥细胞中的条件性必需标记的功能。这些基因的非限定性实例是来自枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌编码UTP依赖性磷酸化酶(EC 2.7.7.10)、UDP-葡萄糖依赖性尿苷酰转移酶(UDP-glucose-dependent uridylyltransferase)(EC 2.7.7.12)或UDP-半乳糖差向异构酶(EC 5.1.3.2)的那些基因。在以木糖为唯一碳源的基本培养基中培养的细胞中，木糖异构酶基因例如芽孢杆菌属的xylA同样能够用作选择性标记。在以葡糖酸为唯一碳源的基本培养基中培养的细胞中，利用葡糖酸所必需的基因gntK和gntP也能够用作选择性标记。其它条件性必需基因的实例是本领域已知的。抗生素选择性标记赋予对抗生素如氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素、红霉素、四环素、新霉素、潮霉素或甲氨喋呤的抗生素抗性。

对于酵母宿主细胞合适的标记是ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。用于丝状真菌宿主细胞的选择性标记包括但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(草铵膦(phosphinothricin)乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)(nitrate reductase)、pyrG(乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶)(orotidine-5’-phosphate decarboxylase)、sC(硫酸腺苷酰转移酶)和trpC(邻氨基苯甲酸合酶(anthranilate synthase))以及它们的等价物。优选用在曲霉属细胞中的是构巢曲霉或米曲霉的amdS和pyrG基因和吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)的bar基因。

本发明的载体优选含有允许载体整合入宿主细胞基因组或允许载体在细胞中独立于基因组自主复制的元件。

为了整合入宿主细胞基因组，载体可依赖编码多肽的多核苷酸的序列或用于通过同源或非同源重组整合入基因组的任何其它载体元件。或者，载体可以含有额外的核苷酸序列，用于指导通过同源重组整合入宿主细胞基因组染色体中的精确位置。为了增加在精确位置整合的可能性，整合元件应该优选含有足够数量的与相应目标序列具有高度同一性的核酸，如100至10,000个碱基对，优选400至10,000个碱基对，并且最优选800至10,000个碱基对，以增强同源重组的概率。整合元件可以是任何序列，其与宿主细胞基因组中的目标序列同源。此外，整合元件可以是非编码或编码核苷酸序列。另一方面，载体可以通过非同源重组整合到宿主细胞基因组中。

为了自主复制，载体可以进一步包含使载体能够在所述的宿主细胞中自主复制的复制起点。复制起点可以是介导自主复制的任何质粒复制子(replicator)，其在细胞中发挥功能。术语“复制起点”或“质粒复制子”在本文定义为使质粒或载体能够体内复制的核苷酸序列。

细菌复制起点的实例是允许在大肠杆菌中复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177和pACYC184的复制起点，和允许在芽孢杆菌中复制的质粒pUB110、pE194、pTA1060和pAMβ1的复制起点。

用于酵母宿主细胞中的复制起点的实例是2微米复制起点、ARS1、ARS4、ARS1和CEN3的组合，和ARS4和CEN6的组合。

在丝状真菌细胞中有用的复制起点的实例是AMA1和ANS1(Gems et al.，1991，Gene 98：61-67；Cullen et al.，1987，Nucleic Acids Research 15：9163-9175；WO 00/24883)。分离AMA1基因和构建包含该基因的质粒或载体可以根据公开于WO 00/24883中的方法完成。

可以将多于一个拷贝的本发明的多核苷酸插入宿主细胞以增加基因产物的产生。多核苷酸拷贝数的增加可通过如下方法获得：将至少一个额外拷贝的序列整合入宿主细胞基因组，或包括与多核苷酸一起的可扩增的选择性标记基因，其中细胞含有选择性标记基因的扩增的拷贝，并且由此可通过在合适的选择剂(selectable agent)存在下培养细胞来选择多核苷酸的额外拷贝。

用于连接上述元件以构建本发明重组表达载体的方法是本领域技术人员熟知的(参见，例如，Sambrook et al.，1989，见上文)。

宿主细胞

本发明还涉及包含本发明的多核苷酸的重组宿主细胞，将其有利地用于多肽的重组生产中。将包含本发明多核苷酸的载体引入宿主细胞中，使得该载体作为染色体整合体(chromosomal integrant)或作为前述的自主复制的染色体外载体被保持。术语“宿主细胞”包含亲本细胞的任何由于复制过程中发生的突变而异于亲本细胞的子代。宿主细胞的选择将在很大程度上依赖于编码多肽的基因和它的来源。

宿主细胞可以是单细胞微生物，例如原核生物，或者是非单细胞微生物，例如真核生物。

有用的单细胞微生物是细菌细胞，例如革兰氏阳性细菌，包括但不限于芽孢杆菌属细胞，例如，嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)、凝结芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌；或链霉菌属细胞，例如，浅青紫链霉菌和鼠灰链霉菌，或革兰氏阴性细菌例如大肠杆菌和假单胞菌属菌种。在优选的方面，细菌宿主细胞是迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌细胞。在另一优选的方面，芽孢杆菌属细胞是嗜碱的芽孢杆菌。

可通过如下方法实现将载体引入到细菌宿主细胞：例如原生质体转化(参见，例如，Chang and Cohen，1979，Molecular General Genetics 168：111-115)，使用感受态细胞(参见，例如，Young and Spizizen，1961，Journal of Bacteriology81：823-829或Dubnau and Davidoff-Abelson，1971，Journal of MolecularBiology 56：209-221)，电穿孔(参见，例如，Shigekawa and Dower，1988，Biotechniques 6：742-751)或接合(参见，例如，Koehler and Thorne，1987，Journalof Bacteriology 169：5771-5278)。

宿主细胞还可以是真核生物，例如哺乳动物、昆虫、植物或真菌细胞。

在优选的方面，宿主细胞是真菌细胞。“真菌”用在本文包括以下门：子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)和接合菌门(Zygomycota)(如由Hawksworth et al.，In，Ainsworth and Bisby’sDictionary of The Fungi，8th edition，1995，CAB International，University Press，Cambridge，UK所定义)以及卵菌门(Oomycota)(如Hawksworth et al.，1995，见上，171页中所引用)，和所有有丝分裂孢子真菌(mitosporic fungi)(Hawksworthet al.，1995，见上)。

在更优选的方面，真菌宿主细胞是酵母细胞。“酵母”用在本文包括产子囊酵母(ascosporogenous yeast)(内孢霉目(Endomycetales))、产担子酵母(basidiosporogenous yeast)和属于半知菌类(Fungi Imperfecti)(芽孢纲(Blastomycetes))的酵母。由于酵母的分类在未来可能改变，就本发明而言，将酵母定义为如Biology and Activities of Yeast(Skinner，F.A.，Passmore，S.M.，and Davenport，R.R.，eds，Soc.App.Bacteriol.Symposium Series No.9，1980)中所述。

在更加优选的方面，酵母宿主细胞是念珠菌属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)或西洋蓍霉属(Yarrowia)细胞。

在最优选的方面，酵母宿主细胞是卡尔酵母(Saccharomycescarlsbergensis)、酿酒酵母、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)、道格拉氏酵母(Saccharomyces douglasii)、克鲁弗酵母(Saccharomyces kluyveri)、诺地酵母(Saccharomyces norbensis)或卵形酵母细胞(Saccharomyces oviformis)。在另外最优选的方面，酵母宿主细胞是乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)细胞。在另外最优选的方面，酵母宿主细胞是解脂西洋蓍霉(Yarrowia lipolytica)细胞。

在另一更优选的方面，真菌宿主细胞是丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌门(Eumycota)和卵菌门的亚门(如由Hawksworth et al.，1995，见上文，所定义)的所有丝状形式。丝状真菌通常的特征在于由壳多糖(chitin)、纤维素、葡聚糖、壳聚糖(chitosan)、甘露聚糖和其它复杂多糖组成的菌丝壁。通过菌丝延伸进行营养生长，而碳分解代谢是专性需氧的。相反，酵母例如酿酒酵母的营养生长通过单细胞菌体(thallus)的出芽(budding)进行，而碳分解代谢可以是发酵性的。

在一个甚至更优选的方面，丝状真菌宿主细胞是枝顶孢霉属(Acremonium)、曲霉属、短梗霉属(Aureobasidium)、烟管霉属(Bjerkandera)、Ceriporiopsis、鬼伞属(Coprinus)、革盖菌属(Coriolus)、隐球菌属(Cryptococcus)、网孢菌属(Filobasidium)、镰孢属(Fusarium)、腐质霉属(Humicola)、梨孢菌属(Magnaporthe)、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、新考玛脂霉属(Neocallimastix)、脉孢菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)、平革菌属(Phanerochaete)、射脉菌属(Phlebia)、瘤胃壶菌属(Piromyces)、侧耳属(Pleurotus)、裂褶菌属(Schizophyllum)、踝节菌属(Talaromyces)、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)、栓菌属(Trametes)或木霉属(Trichoderma)细胞。

在一个最优选的方面，丝状真菌宿主细胞是泡盛曲霉、烟曲霉(Aspergillusfumigatus)、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、构巢曲霉、黑曲霉或米曲霉细胞。在另一个最优选方面，丝状真菌宿主细胞是杆孢状镰孢(Fusarium bactridioides)、禾谷镰孢(Fusarium cerealis)、库威镰孢(Fusarium crookwellense)、大刀镰孢(Fusarium culmorum)、禾本科镰孢(Fusarium graminearum)、禾赤镰孢(Fusarium graminum)、异孢镰孢(Fusariumheterosporum)、合欢木镰孢(Fusarium negundi)、尖镰孢、多枝镰孢(Fusariumreticulatum)、粉红镰孢(Fusarium roseum)、接骨木镰孢(Fusarium sambucinum)、肤色镰孢(Fusarium sarcochroum)、拟分枝孢镰孢(Fusarium sporotrichioides)、硫色镰孢(Fusarium sulphureum)、圆镰孢(Fusarium torulosum)、拟丝孢镰孢(Fusarium trichothecioides)或镶片镰孢(Fusarium venenatum)细胞。在另一最优选的方面，丝状真菌宿主细胞是黑刺烟管菌(Bjerkandera adusta)、Ceriporiopsisaneirina、Ceriporiopsis aneirina、Ceriporiopsis caregiea、Ceriporiopsisgilvescens、Ceriporiopsis pannocinta、Ceriporiopsis rivulosa、Ceriporiopsissubrufa、或Ceriporiopsis subvermispora、灰盖鬼伞(Coprinus cinereus)、毛革盖菌(Coriolus hirsutus)、特异腐质霉、疏棉状腐质霉、米赫毛霉Mucor miehei)、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)、粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)、严紫青霉(Penicillium purpurogenum)、黄孢平革菌(Phanerochaetechrysosporium)、辐射射脉菌(Phlebia radiata)、Pleurotus eryngii、土生梭孢壳(Thielavia terrestris)、绒毛栓菌(Trametes villosa)、杂色栓菌(Trametesversicolor)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、康宁木霉(Trichodermakoningii)、长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)、里氏木霉或绿色木霉(Trichodermaviride)菌株细胞。

可以将真菌细胞通过涉及原生质体形成、原生质体转化和细胞壁重建的方法以本身公知的方式转化。用于转化曲霉属和木霉属宿主细胞的合适方法在EP 238 023和Yelton et al.，1984，Proceedings of the National Academy ofSciences USA 81：1470-1474中描述。用于转化镰孢属菌种的合适方法由Malardier et al.，1989，Gene 78：147-156和WO 96/00787描述。可以使用由如下文献描述的方法转化酵母：Becker and Guarente，In Abelson，J.N.and Simon，M.I.，editors，Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology，Methods inEnzymology，Volume 194，pp 182-187，Academic Press，Inc.，New York；Ito et al.，1983，Journal of Bacteriology 153：163；和Hinnen et al.，1978，Proceedings of theNational Academy of Sciences USA 75：1920。

产生方法

本发明还涉及用于产生本发明多肽的方法，其包括：(a)在有益于产生多肽的条件下培养细胞，所述细胞以其野生型形式能够产生所述多肽；和(b)回收所述多肽。优选地，所述细胞是芽孢杆菌属的细胞。

本发明还涉及用于产生本发明的多肽的方法，其包括：(a)在有益于产生多肽的条件下培养宿主细胞；和(b)回收所述多肽。

本发明还涉及用于产生本发明的多肽的方法，其包括：(a)在有益于产生多肽的条件下培养宿主细胞，其中所述宿主细胞包含在SEQ ID NO：1的成熟多肽编码区中具有至少一个突变的突变核苷酸序列，其中所述突变核苷酸序列编码包含SEQ ID NO：2的氨基酸1-759或SEQ ID NO：2的氨基酸65至347或SEQ ID NO：2的氨基酸368至569的多肽，和(b)回收所述多肽。

在本发明的产生方法中，使用本领域熟知的方法在适合于产生所述多肽的营养培养基中培养细胞。例如，可以通过在合适培养基中和允许表达和/或分离所述多肽的条件下进行摇瓶培养，和实验室或工业发酵罐中的小规模或大规模发酵(包括连续、分批、补料分批或固态发酵)来培养细胞。使用本领域已知的方法在包含碳源和氮源和无机盐的合适营养培养基中进行培养。合适的培养基可以从商业供应者获得或可以根据公开的组成制备(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)。如果多肽分泌到营养培养基中，可以从所述培养基中直接回收该多肽。如果多肽不分泌，则可以从细胞裂解物(lysate)回收之。

可以使用本领域已知的对于所述多肽具有特异性的方法来检测多肽。这些检测方法可包括特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。例如，酶测定(enzyme assay)可用于测定如本文所述的多肽的活性。

所得多肽可以使用本领域已知的方法回收。例如，多肽可以通过常规方法，包括但不限于离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀等，从营养培养基中回收。

本发明的多肽可以通过多种本领域已知的方法纯化，所述方法包括但不限于层析(例如，离子交换、亲和、疏水、层析聚焦和大小排阻)、电泳方法(例如，制备型(preparative)等电聚焦)、差示溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE或提取(参见，例如，Protein Purification，J.-C.Janson and Lars Ryden，editors，VCH Publishers，New York，1989)。

本发明还涉及具有内切-β-1，4-葡聚糖酶活性，并且通过上述方法之一生产，优选通过重组产生技术生产的分离的酶。分离的酶优选不含同源杂质。这些杂质可由内源内切-β-1，4-葡聚糖酶基因生产，因此如果生产是在不表达具有内切-β-1，4-葡聚糖酶活性的内源多肽的宿主细胞中进行的，酶将不含同源杂质。

组合物

本发明还涉及包含本发明的多肽的组合物。优选地，所述组合物富含这种多肽。术语“富含”表示所述组合物的内切葡聚糖酶活性已经得以增加，例如，以至少1.1的富集因数(enrichment factor)增加。

所述组合物可以包含本发明的多肽作为主要酶成分，例如，单成分组合物。或者，所述组合物可以包含多种酶活性，例如氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、几丁质酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、卤素过氧化酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果胶分解酶、肽谷氨酰胺酶(peptidoglutaminase)、过氧化物酶、肌醇六磷酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶或木聚糖酶。额外的酶可以通过例如属于以下属或种的微生物产生：曲霉属，优选棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)、泡盛曲霉、烟曲霉、臭曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉或米曲霉；镰孢属，优选杆孢状镰孢、禾谷镰孢、库威镰孢、大刀镰孢、禾本科镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖镰孢、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰孢或镶片镰孢；腐质霉属，优选特异腐质霉或疏棉状腐质霉；或木霉属，优选哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉或绿色木霉。

可以依照本领域内已知的方法制备多肽组合物，并且可以是液体或干组合物的形式。例如，所述多肽组合物可以是颗粒(granulate)或微粒(microgranulate)的形式。可以将包括于所述组合物中的多肽依照本领域内已知方法稳定。

以下提供的实施例是本发明多肽组合物的优选的用途。本发明的多肽组合物的剂量和使用该组合物的其它条件可以基于本领域内已知的方法决定。

用途

纺织品应用

在另外的实施方式中，本发明涉及本发明的内切葡聚糖酶在纺织品整理方法例如生物抛光中的用途。生物抛光是对纱线(yarn)表面的特殊处理，其在手感和外观方面改善织物的质量，而不损失织物可湿性。生物抛光最重要的效果特征可在于起毛(fuzz)和起球(pilling)减少、光彩(gloss)/光泽(luster)增加、织物手感改善、持久柔软性增加及吸水性(water absorbency)改变。生物抛光通常在制造针织(knitted)和编织(woven)织物期间的湿加工中进行。湿加工包括例如脱浆、冲刷(scouring)、漂白、洗涤、染色/印染和整理等步骤。在这些步骤期间，织物或多或少地经受机械作用。通常而言，在针织或编织纺织品之后，接着对织物进行任选的脱浆阶段，其后是冲刷阶段等。脱浆是从纺织品去除浆料(size)的作用。在机械织机上纺织之前，通常用由淀粉或淀粉衍生物组成的浆料包覆经纱(warp yarn)，从而增加它们的拉伸强度(tensile strength)。纺织之后，必须在进一步加工织物之前将浆料包覆去除以保证均匀和防洗效果。在冲刷过程中，将杂质从织物去除。本发明的内切葡聚糖酶能够有利地用于纤维素和棉纺织品以及韧皮纤维的冲刷，并且可改进杂质去除的效率。

对纤维素纺织品赋予耐久免烫性(durable press)的一种最普遍使用的方法是通过纤维素交联化学整理。交联使纤维素在分子水平固定，并且显著减少纤维素衣物收缩和褶皱。用本发明的内切葡聚糖酶处理经耐久免烫处理的纤维素纺织品，可使受应力区域得到选择性的松弛，从而使边缘磨损最小化。

此外，可以利用本发明的内切葡聚糖酶高效地去除印染方法中使用的纺织品和设备中多余的羧甲基纤维素基印花色浆(print paste)。

已知为了实现生物抛光的效果，需要纤维素分解作用和机械作用的结合。还已知将纤维素酶处理与柔软剂的常规处理相结合可以实现″超柔软″。预期本发明的内切葡聚糖酶和该酶与其它酶的组合用于纤维素物品(cellulosics)(天然的和制造的纤维素物品、织物、衣物、纱线和纤维)生物抛光的用途是有利的，例如能够实现更彻底的抛光。相信可以通过应用例如WO 93/20278中描述的方法来获得生物抛光。进一步预期本发明的内切葡聚糖酶能够应用于同时或顺序的纺织品湿加工，包括脱浆、冲刷、漂白、生物抛光、染色和整理的不同组合。

石洗

已知染色织物，特别是斜纹粗棉布织物或细斜纹布(jeans)中的″石洗″外观(局部性的颜色磨损)可以如下提供：在浮石存在下洗涤由这种织物制造的斜纹粗棉布或细斜纹布以提供期望的织物颜色局部性浅化，或通过酶处理所述织物，具体而言用纤维素分解酶处理所述织物。本发明的内切葡聚糖酶(单独或与其它酶组合)的处理可以如US 4,832,864中公开的那样单独进行，与用量少于传统方法所需量的浮石一起进行，或者如WO 95/09225中公开的那样与珍珠岩(perlite)一起进行。用本发明的内切葡聚糖酶处理斜纹粗棉布织物与常规方法相比可以减少回染(backstaining)。

生物质降解

可将根据本发明的酶或酶组合物有利地应用，例如如下：

-用于去皮(debarking)，即在机械筒(mechanical drum)中去皮之前，用可部分降解富含果胶的形成层的水解酶预处理，从而导致有利的能源节约。

-用于脱纤维(匀浆(refining)或打浆(beating))，即在匀浆或打浆之前，用水解酶处理含有纤维素纤维的材料，由于酶在纤维表面的水解效果，致使能量消耗降低。

-用于纤维改性，即改进纤维性质(例如为了使粗纤维更柔韧)，其中需要跨越纤维壁的部分水解，所述水解需要较深渗透性的酶。

-用于滤水：用水解酶处理纸浆可以改善造纸纸浆的滤水能力。使用本发明的酶或酶组合物可以更有效，例如导致细粒部分(fines fraction)中的强力水合微原纤维束得到更高程度的松弛，所述强力水合的微原纤维束阻断纤维之间和造纸机丝网(wire mesh)中的中空间隙，从而限制滤水速率。

木质纤维素纸浆的处理可以例如WO 93/08275、WO 91/02839和WO92/03608中所述进行。

洗衣

本发明的酶或酶组合物在用于纺织品和衣物的家用或工业洗涤的洗涤剂组合物中可能是有用的，并且在织物的机洗处理方法中可能是有用的，所述方法包括在机洗方法的一个或多个洗涤循环期间用含有本发明的酶或酶制剂的洗涤溶液处理织物。

用于洗涤过程中的洗涤剂组合物通常包含常规成分例如表面活性剂(阴离子、非离子、两性离子、两性)、增效剂(builder)、漂白剂(过硼酸盐、过碳酸盐或过氧化氢)和其它成分，例如WO 97/01629中所述，将其通过提述全部并入本文。

洗涤剂应用

可以将本发明的酶添加至洗涤剂组合物，并且因此成为洗涤剂组合物的成分。

本发明的洗涤剂组合物可以例如配制为手洗或机洗的洗涤剂组合物，包括适于预处理沾污织物的洗衣添加剂组合物和添加了漂洗剂的织物柔软剂组合物，或将其配制为用于常规家庭硬表面清理操作的洗涤剂组合物，或配制用于手洗或机洗的洗碟(dishwashing)操作，特别用于自动洗碟(ADW)。

本发明的内切-β-1，4-葡聚糖酶提供例如改进去污和减少污垢再沉积等优点。特定的沾污，例如特定的食品沾污含有β-葡聚糖，其使得完全去除所述沾污难以实现。同样，织物的纤维素纤维可能含有由这种酶降解的β-葡聚糖聚合物，尤其在“ 非结晶”和表面区。在洗涤过程中，沾污中或织物上的这些β-葡聚糖的水解使污垢对织物的结合减少。

家庭洗衣过程在一定范围的条件下进行。通常而言，洗涤时间是5-60分钟，而洗涤温度是15-60℃，最通常是20-40℃。洗涤溶液通常是中性或碱性，最通常具有pH 7-10.5。通常使用漂白剂，尤其用于白色织物的洗涤。这些漂白剂通常是过氧化物漂白剂，例如过硼酸钠、过碳酸钠或过氧化氢。

在具体的方面，本发明提供包含本发明的酶的洗涤剂添加剂。洗涤剂添加剂以及洗涤剂组合物可包含一种或多种其它的酶例如蛋白酶、脂肪酶、角质酶、淀粉酶、糖酶、纤维素酶、果胶酶、甘露聚糖酶、阿拉伯糖酶(arabinase)、半乳聚糖酶、木聚糖酶、氧化酶，例如，漆酶和/或过氧化物酶。

通常选择的酶的性质应该与选择的洗涤剂相容(即，最适pH，与其它酶和非酶成分的相容性等)，并且所述酶应以有效量存在。

蛋白酶：合适的蛋白酶包括动物、植物或微生物来源的那些。微生物来源是优选的。包括经化学修饰或蛋白质工程化的突变体。所述蛋白酶可以是丝氨酸蛋白酶或金属蛋白酶，优选碱性微生物蛋白酶或胰蛋白酶样蛋白酶。碱性蛋白酶的实例是枯草杆菌蛋白酶，特别是源自芽孢杆菌属的那些，例如，枯草杆菌蛋白酶Novo、枯草杆菌蛋白酶Carlsberg、枯草杆菌蛋白酶309、枯草杆菌蛋白酶147和枯草杆菌蛋白酶168(在WO 89/06279中描述)。胰蛋白酶样蛋白酶的实例是胰蛋白酶(例如，猪或牛来源)和在WO 89/06270和WO94/25583中描述的镰孢属蛋白酶。

有用的蛋白酶的实例是在WO 92/19729、WO 98/20115、WO 98/20116和WO 98/34946中描述的变体，特别是在以下位置中的一个或多个具有取代的变体：27、36、57、76、87、97、101、104、120、123、167、170、194、206、218、222、224、235和274。

优选的商业上能够获得的蛋白酶包括Relase

、Alcalase

、Savinase、

Primase

、 Everlase

、Esperase、Ovozyme

、Coronase

、Polarzyme

和Kannase

(Novozymes A/S)，Maxatase^TM、Maxacal^TM、Maxapem^TM、Properase^TM、Purafect^TM、Purafect OxP^TM、FN2^TM、FN3^TM、FN4^TM和Purafect Prime^TM(Genencor International，Inc.)，BLAP X和BLAP S(Henkel)。

脂肪酶：合适的脂肪酶包括细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰的或蛋白质工程化的突变体。有用的脂肪酶的实例包括来自以下的脂肪酶：腐质霉属(同物异名嗜热霉属(Thermomyces))，例如，来自疏棉状腐质霉(细毛嗜热霉(T.lanuginosus))，如EP 258 068和EP 305 216中所述，或来自特异腐质霉，如WO 96/13580中所述，假单胞菌属脂肪酶，例如，来自产碱假单胞菌(P.alcaligenes)或类产碱假单胞菌(Ppseudoalcaligenes)(EP 218 272)、洋葱假单胞菌(P.cepacia)(EP 331 376)、施氏假单胞菌(P.stutzeri)(GB 1,372,034)、荧光假单胞菌(P.fluorescens)、假单胞菌属菌种(Pseudomonas sp.)菌株SD 705(WO95/06720和WO 96/27002)、威斯康星假单胞菌(P.wisconsinensis)(WO96/12012)、芽孢杆菌属脂肪酶，例如，来自枯草芽孢杆菌(Dartois et al.(1993)，Biochemica et Biophysica Acta，1131，253-360)、嗜热脂肪芽孢杆菌(JP64/744992)或短小芽孢杆菌(B.pumilus)(WO 91/16422)的脂肪酶。

其它实例是例如在WO 92/05249、WO 94/01541、EP 407 225、EP 260105、WO 95/35381、WO 96/00292、WO 95/30744、WO 94/25578、WO95/14783、WO 95/22615、WO 97/04079和WO 97/07202中描述的那些脂肪酶变体。

优选的商业上能够获得的脂肪酶包括Lipolase^TM和Lipolase Ultra^TM(Novozymes A/S)。

淀粉酶：合适的淀粉酶(α和/或β)包括细菌和真菌来源的那些。包括化学修饰的或蛋白质工程化的突变体。淀粉酶包括例如从芽孢杆菌属获得的α-淀粉酶，例如，地衣芽孢杆菌的一个特殊菌株，在GB 1,296,839中对其有更详细的描述。

有用的淀粉酶的实例是在WO 94/02597、WO 94/18314、WO 96/23873和WO 97/43424中描述的变体，特别在一个或多个以下位置具有取代的变体：15、23、105、106、124、128、133、154、156、181、188、190、197、202、208、209、243、264、304、305、391、408和444。

商业上使用的淀粉酶是Duramyl

、Termamyl

、Stainzyme

、Fungamyl

知BAN(Novozymes A/S)，Rapidase^TM、Purastar^TM和Purastar OxAm^TM(来自Genencor International Inc.)。

纤维素酶：其它合适的纤维素酶包括细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰或蛋白质工程化的突变体。合适的纤维素酶包括来自芽孢杆菌属、假单胞菌属、腐质霉属、镰孢属、梭孢壳属、枝顶孢霉属的纤维素酶，例如，产生自特异腐质霉、嗜热毁丝霉和尖镰孢的真菌纤维素酶，其公开于US4,435,307、US 5,648,263、US 5,691,178、US 5,776,757和WO 89/09259。

特别合适的纤维素酶是碱性或中性纤维素酶，其具有保护颜色的益处(colour care benefits)。这些纤维素酶的实例是在EP 0495257、EP 0531372、WO 96/11262、WO 96/29397、WO 98/08940中描述的纤维素酶。其它实例是纤维素酶变体，例如在WO 94/07998、EP 0531315、US 5,457,046、US5,686,593、US 5,763,254、WO 95/24471、WO 98/12307和WO 99/01544中描述的那些。

商业上能够获得的纤维素酶包括Celluzyme^TM、Renozyme

知Carezyme^TM(Novozymes A/S)，Clazinase^TM和Puradax HA^TM(Genencor International Inc.)，和KAC-500(B)^TM(Kao Corporation)。

过氧化物酶/氧化酶：合适的过氧化物酶/氧化酶包括植物、细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰或蛋白质工程化的突变体。有用的过氧化物酶的实例包括来自鬼伞属的过氧化物酶，例如来自灰盖鬼伞的及其变体，如在WO93/24618、WO 95/10602和WO 98/15257中描述的那些。

商业上能够获得的过氧化物酶包括Guardzyme^TM(Novozymes A/S)。

半纤维素酶：合适的半纤维素酶包括细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰或蛋白质工程化的突变体。合适的半纤维素酶包括甘露聚糖酶、地衣聚糖酶、木聚糖酶、阿拉伯糖酶、半乳聚糖酶、乙酰木聚糖酯酶、葡糖醛酸酶(glucorunidase)、阿魏酸酯酶、香豆酸酯酶和阿拉伯呋喃糖苷酶，如WO95/35362中描述。合适的甘露聚糖酶在WO 99/64619中描述。

通过添加含有一种或多种酶的单独的添加剂，或通过添加包含所有这些酶的组合添加剂，可将洗涤剂酶包括在洗涤剂组合物中。可将本发明的洗涤剂添加剂(即单独的添加剂或组合的添加剂)配制成例如，颗粒、液体、浆等。优选的洗涤剂添加剂剂型是颗粒，具体为非粉化性(non-dusting)颗粒，液体，具体为稳定的液体，或浆。

例如，可以如美国专利号4,106,991和4,661,452中所公开的产生非粉化颗粒，并且可以任选地通过本领域已知的方法包覆。蜡质包覆材料(waxy coatingmaterial)的实例是具有1000至20000的平均摩尔量的聚(环氧乙烷)产品(聚乙二醇，PEG)；具有从16至50个的环氧乙烷单元的乙氧基化壬基酚；乙氧基化脂肪醇，其中醇含有从12至20个碳原子，并且其中存在15至80个环氧乙烷单元；脂肪醇；脂肪酸；和脂肪酸的单酸甘油酯和甘油二酯和甘油三酯。适合于流化床技术应用的成膜包覆材料的实例提供于GB 1483591。例如，可根据已经建立的方法通过添加多元醇例如丙二醇、糖或糖醇、乳酸或硼酸来稳定化液体酶制剂。可以根据公开于EP 238,216中的方法来制备保护酶。

本发明的洗涤剂组合物可以是任何方便的形式，例如，条、片、粉末、颗粒、糊或液体。液体洗涤剂可以是含水的，通常含有多至70％的水和0-30％的有机溶剂，或非水性的(non-aqueous)。

洗涤剂组合物包含一种或多种表面活性剂，表面活性剂可以是非离子型的，包括半极性型的和/或阴离子型的和/或阳离子型的和/或两性离子型的。所述表面活性剂通常以按重量计0.1％至60％的水平存在。

当包括于其中时，所述洗涤剂将通常含有大约1％至大约40％的阴离子表面活性剂，例如直链烷基苯磺酸盐、α-烯烃磺酸酯(olefinsulfonate)、烷基硫酸盐(脂肪醇硫酸酯)、脂肪醇乙氧基硫酸盐(alcohol ethoxysulfate)、次级链烷磺酸盐(secondary alkanesulfonate)、α-磺基脂肪酸甲酯、烷基-或烯基琥珀酸或肥皂(soap)。

当包括在其中时，洗涤剂将通常含有大约0.2％至大约40％的非离子型表面活性剂，例如脂肪醇乙氧基化物、壬基苯酚乙氧基化物、烷基聚糖苷(alkylpolyglycoside)、烷基二甲基氧化胺(alkyldimethylamineoxide)、乙氧基化脂肪酸单乙醇酰胺(ethoxylated fatty acid monoethanolamide)、脂肪酸单乙醇酰胺、多羟基烷基脂肪酸酰胺或葡糖胺的N-酰基N-烷基衍生物(“葡糖酰胺(glucamide)”)。

洗涤剂可以含有0-65％的洗涤剂增效剂或络合剂例如沸石、二磷酸盐、三磷酸盐、膦酸盐(phosphonate)、碳酸盐(carbonate)、柠檬酸盐、氮川三乙酸(nitrilotriacetic acid)、乙二胺四乙酸、二亚乙基三胺五乙酸、烷基-或烯基琥珀酸、可溶硅酸盐或分层硅酸盐(layered silicates)(例如来自Hoechst的SKS-6)。

洗涤剂可包含一种或多种聚合物。实例是羧甲基纤维素、聚(乙烯基吡咯烷酮)、聚(乙二醇)、聚(乙烯醇)、聚(乙烯吡啶-N-氧化物)、聚(乙烯咪唑)、聚羧酸酯(polycarboxylates)例如聚丙烯酸酯(polyacrylates)、马来酸/丙烯酸共聚物和甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物。

洗涤剂可以含有漂白体系，其可以包含H₂O₂源例如过硼酸盐或过碳酸盐，H₂O₂源可以与形成过酸的漂白激活剂例如四乙酰乙二胺或壬酰氧苯磺酸酯(nonanoyloxybenzenesulfonate)组合。或者，漂白体系可以包含过氧酸，例如酰胺、二酰亚胺(imide)或砜类型的过氧酸。

本发明的洗涤剂组合物的酶可以使用常规稳定剂来稳定化，例如，多元醇例如丙二醇或甘油、糖或糖醇、乳酸、硼酸或硼酸衍生物，例如，芳香硼酸酯，或苯基硼酸(phenyl boronic acid)衍生物例如4-甲酰苯基硼酸(4-formylphenylboronic acid)，并且可以依照例如WO 92/19709和WO 92/19708中所述配制所述组合物。

洗涤剂还可以含有其它常规洗涤剂成分，例如，织物整理剂(fabricconditioner)包括粘土、泡沫促进剂、抑泡剂、防腐蚀剂、悬污剂、防污渍再沉积剂、染料、杀菌剂、光亮剂(optical brightener)、水溶助剂(hydrotrope)、晦暗抑制剂(tarnish inhibitors)或香料。

在洗涤剂组合物中的任何酶，特别是本发明的酶，可以按相当于每升洗涤液0.01-100mg酶蛋白，优选每升洗涤液0.05-5mg酶蛋白，特别是每升洗涤液0.1-1mg酶蛋白的量添加。

还可以将本发明的酶掺入公开于WO 97/07202的洗涤剂配制物，WO97/07202在本文中作为参考文献并入。

信号肽和前肽

本发明还涉及核酸构建体，所述核酸构建体包含编码蛋白质的基因，该基因与编码信号肽的核苷酸序列可操作地连接，其中所述基因对于编码信号肽的核苷酸序列是外源的。

本发明还涉及包含这些核酸构建体的重组表达载体和重组宿主细胞。

本发明还涉及用于产生蛋白质的方法，其包括(a)在适合于产生所述蛋白质的条件下培养这种重组宿主细胞；和(b)回收所述蛋白质。

可以将第一和第二核苷酸序列单独地与其它调控序列或组合地与其它调控序列一起可操作地连接至外源基因。这些其它调控序列如上所述。如前文所述，当信号肽和前肽区二者均出现在蛋白质的氨基末端时，前肽区紧邻着蛋白质的氨基末端，并且将信号肽区紧邻着前肽区的氨基末端。

蛋白质对于宿主细胞可以是天然的或异源的。术语“蛋白质”在本文的并不意在指称具体长度的编码产物，因此涵盖了肽、寡肽和蛋白质。术语“蛋白质”还包含两种或多种多肽结合形成的编码产物。蛋白质还包括杂合多肽，其包含从至少两种不同的蛋白质获得的部分或完整多肽序列的组合，所述至少两种不同的蛋白质中的一种或多种对于宿主细胞可以是异源的或天然的。蛋白质进一步包括上述蛋白质和杂合蛋白质的天然存在的等位变异和工程化变异。

优选地，蛋白质是激素或其变体，酶，受体或其部分，抗体或其部分，或报道蛋白(reporter)。在更优选的方面，蛋白质是氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂合酶(lyase)、异构酶或连接酶。在甚至更优选的方面，蛋白质是氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、几丁质酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、变位酶(mutanase)、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、肌醇六磷酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶或木聚糖酶。

基因可以从任何原核、真核或其它来源获得。

通过以下实施例进一步对本发明进行描述，但不应将其理解为对本发明范围的限制。

实施例

用作缓冲剂和底物的化学品是至少试剂等级的商业产品。

内切葡聚糖酶活性测试

材料：

Berol 537，由Akzo Nobel供应的非离子表面活性剂，或类似物(similar)。

Cellazyme C片剂，由Megazyme International，Ireland供应。

玻璃微纤维滤器，GF/C，9cm直径，由Whatman供应。

pH9,5缓冲溶液：

将21,0g NaHCO3和14,6g NaCl溶解在大约900ml去离子水中。添加10mlBerol 537(由Akzo Nobel供应的非离子表面活性剂)。通过添加4N NaOH来调节pH至9,5。其后调节总体积至1000ml。

方法：

在试管中，混合1ml pH9,5缓冲液和5ml去离子水。

添加100微升酶样品(或具有已知重量：重量稀释因子的酶样品稀释液)。向每个试管中添加1个Cellazyme C片剂，盖上管盖并且在涡旋混合器上混合10秒。将试管置于恒温水浴，温度40℃。在15、30和45分钟之后，通过颠倒试管来混合试管中的内容物，再置于水浴中。60分钟之后，通过倒置混合试管中的内容物，其后通过GF/C滤器过滤。将滤液收集至干净的试管中。

用分光光度计在590nm测量吸光度(A_enz(A_酶))。通过添加100μl水代替100微升酶稀释液来测量空白值A_water(A_水)。

计算A_delta＝A_enz-A_water

A_delta必须＜0.5。如果获得了较高的结果，以不同的酶稀释因子进行重复。求出DF0.1，其中DF0.1是得到A_delta＝0.1所需的稀释因子。

单位定义：

1个内切-β-葡聚糖酶活性单位(1 EBG)是在上文规定的测试条件下得出A_delta＝0.10的酶量。因此，例如，如果给定的酶样品在以稀释因子100稀释之后得出A_delta＝0.10，则所述酶样品具有100 EBG/g的活性。

在pH固定时以不同的温度范围运行活性测试，或者与之相反，在温度固定时以不同的pH范围运行活性测试，来测定内切葡聚糖酶的最适温度和pH。

实施例1筛选新的内切葡聚糖酶

通过将细菌培养在添加0.1％AZCL-β-葡聚糖(大麦，Megazyme)的TY琼脂上来筛选多种芽孢杆菌属菌株的碱性内切葡聚糖酶的产生。菌株ACE160在这种基质上产生蓝色晕图(halo)，通过测定部分16S rDNA来鉴定所述细菌，并且将所述序列插入系统树后显示ACE160是芽孢杆菌组(Bacillus group)的一个新种。

实施例2全长枯草蛋白酶(subtilase)的生产

基因组文库构建

通过使用标准分子生物学技术(Ausuble et al.1995“Current protocols inmolecular biology”Publ：John Wiley and sons)制备来自ACE160的染色体DNA。用Sau3A部分切割制备的DNA并且在琼脂糖凝胶上分离。洗脱3-8kb的片段，沉淀，再重悬在合适的缓冲液中。

使用Stratagene ZAP Express^TM预消化载体试剂盒和Stratagene ZAPExpress^TM预消化Gigapack

克隆试剂盒(Bam HI预消化的)(Stratagene Inc.，USA)遵循销售商的说明书/建议来制备基因组文库。所得lambdaZAP文库包含38000个pfu(蚀斑形成单位)，收集其中10000个进行总体切离(massexcision)。汇集(pool)所得的70000个大肠杆菌菌落。将大肠杆菌克隆汇集物(clone pool)通过以100μl的汇集物(pool)与100ml LB培养基混合进行稀释后，以每个琼脂平板100μl涂布在补充了0.1％AZCL-β-葡聚糖(大麦，Megazyme)和50μg/ml卡那霉素的LB上，并温育2-3天。50个琼脂平板上每个平板有1600-1800个菌落，从中获得了具有蓝色晕圈的三个菌落。从这三个菌落回收了质粒DNA并且用载体引物加以测序。

通过后续的引物步移法表征了内切-1，4-β-葡聚糖酶开读框(ORF)的完整核苷酸序列。三个菌落含有相同的ORF，如SEQ ID NO：1所示。

全长内切葡聚糖酶的产生

为了产生内切-1，4-β-葡聚糖酶，从野生型芽孢杆菌属菌种ACE160菌株的染色体DNA扩增基因。使用固有(indigenous)的跨膜信号肽来表达所述酶。

引物

ACE160-Bglu-Mlu1-4：

GATTAACGCGTTCCTCGTGCTGAGCACAGAGG(SEQ ID NO：3)

ACE160-Bglu-Sac1：

TTATGGAGCTCAAATCAACTCTAGGAGGCTG(SEQ ID NO：4)

将内切-1，4-β-葡聚糖酶基因扩增为大约2500nt的PCR产物。使用的引物是ACE160-Bglu-Sac1和ACE160-Bglu-Mlu1-4。模板DNA是芽孢杆菌属菌种ACE160的染色体DNA。使用Qiaquick^tm离心柱(spin column)按照推荐(Qiagen，Germany)回收PCR产物。通过琼脂糖凝胶电泳来评估分离的模板的质量。按照以下方案进行PCR：94℃，2分钟；40个循环的[94℃30秒，52℃30秒，68℃1分钟]；68℃10分钟后完成。在TAE缓冲液中在用溴化乙锭染色的1％琼脂糖凝胶上分析PCR产物，确认大小正确的单一条带。用限制酶Sac1和Mlu1消化PCR产物并利用GFX^TM PCR及凝胶条带纯化试剂盒(AmerhamBiosciences)加以纯化。

将消化并且纯化的PCR片段连接至Sac I和Mlu I消化的质粒pDG268NeoMCS-PramyQ/PrcryIII/cryIIIAstab/Sav(美国专利：5,955,310)。使用连接混合物转化至大肠杆菌TOP10F’(Invitrogen BV，The Netherlands)中，并选择几个菌落用于小量制备(QIAprep

spin，QIAGEN GmbH，Germany)。检查纯化质粒的插入序列，然后将纯化质粒转化到枯草芽孢杆菌菌株TH1中(TH1是一种枯草芽孢杆菌菌株(amy-，spo-，apr-，npr-)，系从菌株DN3(Noone etal.2000，J Bacteriol 182(6)1592-1599)通过转化和红霉素(Erytromycin)选择，插入构建体修饰而来。改变的基因型是：ykdA：：pDN3(PykdA-lacZ Pspac-ykdA)Ermr。TH1含有下列特征：全长ykdA启动子与LacZ报道基因融合。此外将ykdA基因置于IPTG诱导的Pspac启动子的调控下，使得ykdA基因不再具有其天然的调节。可以将该菌株用作表达克隆和文库的宿主，而表达并分泌蛋白质的转化体可以在含有X-gal和IPTG的平板上加以选择。TH1能够维持(maintain)在LB琼脂+6μg/mL红霉素上)。

将经转化的细胞涂布在补充了1％脱脂乳、100μg/L X-gal、1 mM IPTG、6μg/ml氯霉素和12μg/ml红霉素的LB-PG琼脂平板上。将涂布的细胞在37℃温育过夜，挑取具有蓝色并且无透明区(clearing zone)的菌落，通过PCR和核苷酸测序来确认正确的插入序列。

实施例3纯化来自芽孢杆菌属菌种ACE160的内切葡聚糖酶

从670ml发酵液纯化内切葡聚糖酶，通过对发酵液进行离心和过滤的组合从所述发酵液中去除细胞。用去离子水将体积调节至2升并且将pH滴定为8.5。将该材料上样至用25mM Tris缓冲液pH 8.5平衡的Q-sepharose柱。施加相同缓冲液中的NaCl梯度来洗脱酶，并汇集含有内切葡聚糖酶的级分。将该汇集物的一部分在以100mM乙酸钠pH 6作为液相的S-200凝胶过滤柱上分级。汇集含有内切葡聚糖酶的级分，并在Amicon超滤单元上浓缩大约三倍(three times)。通过SDS PAGE分析浓缩物，获得了大约80 kD的蛋白质带。

实施例4来自芽孢杆菌属菌种ACE160的内切葡聚糖酶的洗涤性能

使用这种方法来测定“酶去垢性效益”。

通过将沾污的棉织物样品和清洁棉织物样品二者一起在小规模洗涤测试设备中洗涤来进行洗涤测试。洗涤之后，通过光反射来评估棉织物上的污垢。对原先为沾污的棉织物和原先为清洁的棉织物样品两者进行评估。

棉织物：#2003白色纺织100％棉织物，由Tanigashira，4-11-15 KomatsuYodogawa-ku，Osaka，533-0004，Japan供应。在用于洗涤测试之前，将新的棉织物预洗涤三次。使用欧洲家用前载式洗衣机(front-loader washing machine)进行所述预洗涤，并且使用标准40℃洗涤流程。以0.5g/L的浓度向洗涤水中添加LAS(SurfacSDBS80烷基苯磺酸钠，80％)，并且通过加入碳酸钠将洗涤溶液的pH调节至10。在预洗涤之后，将织物在转鼓式干燥机(tumbler drier)中干燥。切割出大小5×5cm的经预洗涤的棉织物样片，大约每个重0.3g，并且将这些样片用于洗涤测试。

沾污的棉样片：从上述的5×5cm样片制备沾污的棉样片。使用β-葡聚糖(中等粘度，来源于大麦，由Megazymes International，Ireland供应)和碳黑(“用于去垢性测试的碳”，由Sentaku Kagaku Kyokai，Tokyo，Japan供应)来制备沾污的样片。通过搅拌和加温至＞50℃将大约0.67g β-葡聚糖溶解在100ml自来水(tap water)中。添加0.33g碳黑。用UltraTurrax T25混合器进行混合，以4000 rpm速度进行2分钟。向每个样片的中央施加250微升β-葡聚糖/碳。在室温使其干燥过夜。

洗涤测试：将三个沾污的样片和三个清洁的样片在Mini-Terg-O-Tometer机器中洗涤。Mini-Terg-O-Tometer是Jay C.Harris，“Detergency Evaluation andTesting”，Interscience Publishers Ltd.(1954)pp.60-61中描述的Terg-O-Tometer测试洗涤机的小规模型号。使用以下条件：

烧杯大小 250ml

洗涤溶液体积 100ml

洗涤温度 40℃

洗涤时间 30分钟

搅拌 150rpm

在开始测试之前将洗涤剂溶液预热至40℃。在30分钟洗涤期开始时添加织物和酶。在洗涤之后，将织物样片在流动的自来水下漂洗5分钟，然后展平并且使其在室温过夜风干。

仪器评估：使用Macbeth Color Eye 7000反射分光光度计来进行织物样片的光反射评估。测量在500nm进行。不包括UV滤光器。在每个样片的正面和反面上进行测量。沾污样片在沾污区域的中央进行测量。然后由对每种类型的六次测量计算沾污样片和清洁样片的反射的平均结果(R，500nm)。

洗涤剂溶液：如下制备洗涤剂溶液：对于1升溶液的制备，将0.5g碳酸钠和1.0g碳酸氢钠溶解在去离子水中，并且添加2ml含有117.8g/lCaCl₂.2H₂O和54.3g/l MgCl₂.6H₂O的溶液。这种钙/镁的添加提供了12°dH的水硬度。添加0.2g非离子表面活性剂(Berol

537，Akzo Nobel)和0.5g LAS(Surfac

SDBS80烷基苯磺酸钠，80％)，并且调节终体积至1升。调节pH至pH 9.5±0.1(通过添加碳酸钠或10％柠檬酸溶液)。

酶添加：将待测试的酶以已知浓度预溶解在水中，并且在洗涤流程开始时将所需量的酶添加至洗涤剂溶液。

计算酶的去垢性效益：酶的去垢性效益是对在洗涤测试中纳入酶之后，样片(原为沾污和原为清洁的)变得清洁了多少的量度。如下计算酶的去垢性效益：

在洗涤测试之后，沾污样品的平均R，500nm值是R，沾污。

在洗涤测试之后，清洁样品的平均R，500nm值是R，清洁。

对于使用酶的洗涤测试，酶去垢性效益是：有酶时的R，沾污+R，清洁之和减去无酶时的R，沾污+R，清洁之和。

以这种方法测定的酶的去垢性效益值是对污垢从织物的去除和污垢在织物上的再沉积的组合量度。因此酶的去垢性效益值可具有负值或正值。可将酶的去垢性效益值用于比较不同的酶的性能。最高的正去垢性效益值是优选的结果。为了比较，将源自芽孢杆菌属菌种ACE160的内切葡聚糖酶的洗涤性能与现有技术WO 2002/099091中公开的芽孢杆菌属内切葡聚糖酶MB1181-7的洗涤性能进行比较。

结果：

洗涤溶液中的酶活性酶的去垢性效益

ACE160，6 EBG/L 28,1

ACE160，12 EBG/L 29,9

MB1181-7，6 EBG/L 15,2

MB1181-7，12 EBG/L 22,2

结果显示，源自芽孢杆菌属菌种ACE160的内切葡聚糖酶与已知的内切葡聚糖酶相比给出较高的酶去垢性效益。

在本文描述和要求保护的本发明不限于由本文的具体方面公开的范围，因为这些方面旨在说明本发明的几个方面。任何等同的方面意欲在本发明的范围之内。当然，根据前文的描述，在本文显示和描述的内容之外对本发明的各种修饰对于本领域技术人员将是显而易见的。这些修饰也意欲落入所附权利要求的范围之内。如有冲突，以包括定义在内的本公开为准。

序列表

<110>诺维信公司(Novozymes A/S)

<120>内切葡聚糖酶

<130>10780.204-WO

<160>4

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>2379

<212>DNA

<213>芽孢杆菌属菌种ACE160(Bacillus sp.ACE160)

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(2376)

<220>

<221>信号肽

<222>(1)..(99)

<220>

<221>成熟肽

<222>(100)..(2376)

<400>1

gtg aga caa ccc ata ggt aaa aag ata att gct gca gga atg atc ttt 48

Val Arg Gln Pro Ile Gly Lys Lys Ile Ile Ala Ala Gly Met Ile Phe

-30 -25 -20

acc ctc tta ttt tcg tta atc gtc act gtg ttc cca act gct ggt caa 96

Thr Leu Leu Phe Ser Leu Ile Val Thr Val Phe Pro Thr Ala Gly Gln

-15 -10 -5

gca cta gaa tca gac tat agc cat tta tta gga aat gat gca gtg aag 144

Ala Leu Glu Ser Asp Tyr Ser His Leu Leu Gly Asn Asp Ala Val Lys

-1 1 5 10 15

cgc ccc tcg gaa ggc gga gct tta agt tta tgt aat gaa act act cca 192

Arg Pro Ser Glu Gly Gly Ala Leu Ser Leu Cys Asn Glu Thr Thr Pro

20 25 30

gta aaa cca aac cat gcg ggg gac cgt ggg aaa cca agc cac gca ggt 240

Val Lys Pro Asn His Ala Gly Asp Arg Gly Lys Pro Ser His Ala Gly

35 40 45

aaa gga aag cct ccc cat gct ggt aag cct gaa cat gcc gga cca aag 288

Lys Gly Lys Pro Pro His Ala Gly Lys Pro Glu His Ala Gly Pro Lys

50 55 60

cgt aaa aca ctg tgt gat gca acc ggc agc caa att cag ctc cgg ggg 336

Arg Lys Thr Leu Cys Asp Ala Thr Gly Ser Gln Ile Gln Leu Arg Gly

65 70 75

atg agc act cac gga ttg caa tgg ttt ggc gag att ata aat gat aat 384

Met Ser Thr His Gly Leu Gln Trp Phe Gly Glu Ile Ile Asn Asp Asn

80 85 90 95

gct ttt gct gct ctt tcc aac gac tgg gag gca aat atg atc cgc ctt 432

Ala Phe Ala Ala Leu Ser Asn Asp Trp Glu Ala Asn Met Ile Arg Leu

100 105 110

gcc atg tat att ggc gaa aat gga tat gcg act aac cct gaa gta aaa 480

Ala Met Tyr Ile Gly Glu Asn Gly Tyr Ala Thr Asn Pro Glu Val Lys

115 120 125

gaa ctt gtt tac gaa gga att gag ctt gca ttc aaa cat gat atg tat 528

Glu Leu Val Tyr Glu Gly Ile Glu Leu Ala Phe Lys His Asp Met Tyr

130 135 140

gta att gtt gac tgg cac gta cac gcc ccg gga gat cca agg gct gac 576

Val Ile Val Asp Trp His Val His Ala Pro Gly Asp Pro Arg Ala Asp

145 150 155

att tat tcc ggt gct cta gac ttt ttt aaa gaa att gca gac cac tat 624

Ile Tyr Ser Gly Ala Leu Asp Phe Phe Lys Glu Ile Ala Asp His Tyr

160 165 170 175

aag gac cat cct aag ttc cat tat att ata tgg gaa att gca aat gaa 672

Lys Asp His Pro Lys Phe His Tyr Ile Ile Trp Glu Ile Ala Asn Glu

180 185 190

cca agc cca aat aac agc gga gga cct gga att cct aat gat gaa aca 720

Pro Ser Pro Asn Asn Ser Gly Gly Pro Gly Ile Pro Asn Asp Glu Thr

195 200 205

gga tgg aaa gca gta aag gaa tat gct gaa cct atc gtg gaa atg ctt 768

Gly Trp Lys Ala Val Lys Glu Tyr Ala Glu Pro Ile Val Glu Met Leu

210 215 220

cgt gaa agg ggg gac aat ata att ctt gta ggc agc ccg aac tgg agc 816

Arg Glu Arg Gly Asp Asn Ile Ile Leu Val Gly Ser Pro Asn Trp Ser

225 230 235

cag cgc ccg gat tta gct gca gat aac cct ata gat gca aaa aat atc 864

Gln Arg Pro Asp Leu Ala Ala Asp Asn Pro Ile Asp Ala Lys Asn Ile

240 245 250 255

atg tac tct gtc cac ttc tat act gga tct cat gaa cct tca gat aca 912

Met Tyr Ser Val His Phe Tyr Thr Gly Ser His Glu Pro Ser Asp Thr

260 265 270

agc tat cct gaa ggc act ccg tcc tcg gaa cgg aat aac gtt atg gca 960

Ser Tyr Pro Glu Gly Thr Pro Ser Ser Glu Arg Asn Asn Val Met Ala

275 280 285

aat gta cga tat gca ctc gag aat ggt gct gca gtt ttt gct aca gaa 1008

Asn Val Arg Tyr Ala Leu Glu Asn Gly Ala Ala Val Phe Ala Thr Glu

290 295 300

tgg ggt aca agc caa gcc aat ggt gat ggc ggc cca tac ctt gac gaa 1056

Trp Gly Thr Ser Gln Ala Asn Gly Asp Gly Gly Pro Tyr Leu Asp Glu

305 310 315

gct gat gta tgg ctt aac ttc ctt aac gag aac aat atc agc tgg gtc 1104

Ala Asp Val Trp Leu Asn Phe Leu Asn Glu Asn Asn Ile Ser Trp Val

320 325 330 335

aac tgg tca ttg aca aat aaa aac gaa aca tca ggt tcc ttc act ccc 1152

Asn Trp Ser Leu Thr Asn Lys Asn Glu Thr Ser Gly Ser Phe Thr Pro

340 345 350

ttt gag ctg ggg aaa tcc aat gcc aca agt ctt gat cct ggc cct gaa 1200

Phe Glu Leu Gly Lys Ser Asn Ala Thr Ser Leu Asp Pro Gly Pro Glu

355 360 365

caa gca tgg tcc ctg ccg gaa cta agc gta tca ggc gag tat gtt cgt 1248

Gln Ala Trp Ser Leu Pro Glu Leu Ser Val Ser Gly Glu Tyr Val Arg

370 375 380

tca cga att aaa ggt agt ccg tat gaa ccg ttt gac cgg acg aaa ttt 1296

Ser Arg Ile Lys Gly Ser Pro Tyr Glu Pro Phe Asp Arg Thr Lys Phe

385 390 395

aat aaa gta atc tgg gat ttt aac gac ggt aca gtt cag ggg ttt gaa 1344

Asn Lys Val Ile Trp Asp Phe Asn Asp Gly Thr Val Gln Gly Phe Glu

400 405 410 415

gta aat gac gac agt cct gtt aaa gaa gaa ata gct gtc agc aat gca 1392

Val Asn Asp Asp Ser Pro Val Lys Glu Glu Ile Ala Val Ser Asn Ala

420 425 430

ggt aat gcc ctt caa att acc ggt ctt aat gct agc aac gac atc tcc 1440

Gly Asn Ala Leu Gln Ile Thr Gly Leu Asn Ala Ser Asn Asp Ile Ser

435 440 445

aca gat aac ttc tgg agt aac ctc agg ctt tca gcc aat tcc tgg gga 1488

Thr Asp Asn Phe Trp Ser Asn Leu Arg Leu Ser Ala Asn Ser Trp Gly

450 455 460

gaa tcg gtt aat atc ctg ggg gca gaa gaa ctg aca tta gat gtg atc 1536

Glu Ser Val Asn Ile Leu Gly Ala Glu Glu Leu Thr Leu Asp Val Ile

465 470 475

gtc gat gag cca act tcc gtc tca atc gca gca att ccg caa agt gca 1584

Val Asp Glu Pro Thr Ser Val Ser Ile Ala Ala Ile Pro Gln Ser Ala

480 485 490 495

gca gtt ggc tgg gca aat cct aac aat gcg gtc gtt gtt tct aaa gaa 1632

Ala Val Gly Trp Ala Asn Pro Asn Asn Ala Val Val Val Ser Lys Glu

500 505 510

gat ttc gca cct tat ggt ggc cag tat aag gct gtc ctg acg ata aca 1680

Asp Phe Ala Pro Tyr Gly Gly Gln Tyr Lys Ala Val Leu Thr Ile Thr

515 520 525

ccg gaa gat tct cca gct ctg ggt gcc ata gca aca cat agt gat gat 1728

Pro Glu Asp Ser Pro Ala Leu Gly Ala Ile Ala Thr His Ser Asp Asp

530 535 540

aac atg atg aat aac att atc ttg ttt ata ggt aca gaa aat gct gat 1776

Asn Met Met Asn Asn Ile Ile Leu Phe Ile Gly Thr Glu Asn Ala Asp

545 550 555

gta ctc tca ctt gat aac att aca gtt aaa ggt tcc atc gtt gaa att 1824

Val Leu Ser Leu Asp Asn Ile Thr Val Lys Gly Ser Ile Val Glu Ile

560 565 570 575

cca gta atc cat gat cca aag ggc atc gcg gtt ctt cct tca aac ttt 1872

Pro Val Ile His Asp Pro Lys Gly Ile Ala Val Leu Pro Ser Asn Phe

580 585 590

gag gac gga acc cgc caa ggc tgg gac tgg aac cct gaa tca ggg gta 1920

Glu Asp Gly Thr Arg Gln Gly Trp Asp Trp Asn Pro Glu Ser Gly Val

595 600 605

aaa act gct tta aca att aaa gag gcc gat ggt tca cat gcc cta tcc 1968

Lys Thr Ala Leu Thr Ile Lys Glu Ala Asp Gly Ser His Ala Leu Ser

610 615 620

tgg gag ttt gct tac ccg gaa gtt aaa cct ggt gat ggg tgg gca aca 2016

Trp Glu Phe Ala Tyr Pro Glu Val Lys Pro Gly Asp Gly Trp Ala Thr

625 630 635

gct cca cga ttg gag ttt tgg aaa gat gga ctg gta aga gga gca aac 2064

Ala Pro Arg Leu Glu Phe Trp Lys Asp Gly Leu Val Arg Gly Ala Asn

640 645 650 655

gat tac ctc tca ttt gat tta tac ctt gac cct gtc cgt gcc aca gag 2112

Asp Tyr Leu Ser Phe Asp Leu Tyr Leu Asp Pro Val Arg Ala Thr Glu

660 665 670

ggt gct atc aca aca cat ctc gta ttc cag ccg cca agt gct gga tac 2160

Gly Ala Ile Thr Thr His Leu Val Phe Gln Pro Pro Ser Ala Gly Tyr

675 680 685

tgg gta caa gct cca gct tct cac agc ata gat ttg tta aac tta gat 2208

Trp Val Gln Ala Pro Ala Ser His Ser Ile Asp Leu Leu Asn Leu Asp

690 695 700

tca gct gat atc aca gca gat gga ctg tac cat tat gaa gtg aaa ttc 2256

Ser Ala Asp Ile Thr Ala Asp Gly Leu Tyr His Tyr Glu Val Lys Phe

705 710 715

aat att aga gac att aca gca att caa gat gac aca gct ctg cgc aat 2304

Asn Ile Arg Asp Ile Thr Ala Ile Gln Asp Asp Thr Ala Leu Arg Asn

720 725 730 735

atg atc ctc ata ttg gag gat agg aac agc gac ttc gcg ggc cgg gcg 2352

Met Ile Leu Ile Leu Glu Asp Arg Asn Ser Asp Phe Ala Gly Arg Ala

740 745 750

ttc atc gac aat gta aga ttc gaa taa 2379

Phe Ile Asp Asn Val Arg Phe Glu

755

<210>2

<211>792

<212>PRT

<213>芽孢杆菌属菌种ACE160

<400>2

Val Arg Gln Pro Ile Gly Lys Lys Ile Ile Ala Ala Gly Met Ile Phe

-30 -25 -20

Thr Leu Leu Phe Ser Leu Ile Val Thr Val Phe Pro Thr Ala Gly Gln

-15 -10 -5

Ala Leu Glu Ser Asp Tyr Ser His Leu Leu Gly Asn Asp Ala Val Lys

-1 1 5 10 15

Arg Pro Ser Glu Gly Gly Ala Leu Ser Leu Cys Asn Glu Thr Thr Pro

20 25 30

Val Lys Pro Asn His Ala Gly Asp Arg Gly Lys Pro Ser His Ala Gly

35 40 45

Lys Gly Lys Pro Pro His Ala Gly Lys Pro Glu His Ala Gly Pro Lys

50 55 60

Arg Lys Thr Leu Cys Asp Ala Thr Gly Ser Gln Ile Gln Leu Arg Gly

65 70 75

Met Set Thr His Gly Leu Gln Trp Phe Gly Glu Ile Ile Asn Asp Asn

80 85 90 95

Ala Phe Ala Ala Leu Ser Asn Asp Trp Glu Ala Asn Met Ile Arg Leu

100 105 110

Ala Met Tyr Ile Gly Glu Asn Gly Tyr Ala Thr Asn Pro Glu Val Lys

115 120 125

Glu Leu Val Tyr Glu Gly Ile Glu Leu Ala Phe Lys His Asp Met Tyr

130 135 140

Val Ile Val Asp Trp His Val His Ala Pro Gly Asp Pro Arg Ala Asp

145 150 155

Ile Tyr Ser Gly Ala Leu Asp Phe Phe Lys Glu Ile Ala Asp His Tyr

160 165 170 175

Lys Asp His Pro Lys Phe His Tyr Ile Ile Trp Glu Ile Ala Asn Glu

180 185 190

Pro Ser Pro Asn Asn Ser Gly Gly Pro Gly Ile Pro Asn Asp Glu Thr

195 200 205

Gly Trp Lys Ala Val Lys Glu Tyr Ala Glu Pro Ile Val Glu Met Leu

210 215 220

Arg Glu Arg Gly Asp Asn Ile Ile Leu Val Gly Ser Pro Asn Trp Ser

225 230 235

Gln Arg Pro Asp Leu Ala Ala Asp Asn Pro Ile Asp Ala Lys Asn Ile

240 245 250 255

Met Tyr Ser Val His Phe Tyr Thr Gly Ser His Glu Pro Ser Asp Thr

260 265 270

Ser Tyr Pro Glu Gly Thr Pro Ser Ser Glu Arg Asn Asn Val Met Ala

275 280 285

Asn Val Arg Tyr Ala Leu Glu Asn Gly Ala Ala Val Phe Ala Thr Glu

290 295 300

Trp Gly Thr Ser Gln Ala Asn Gly Asp Gly Gly Pro Tyr Leu Asp Glu

305 310 315

Ala Asp Val Trp Leu Asn Phe Leu Asn Glu Asn Asn Ile Ser Trp Val

320 325 330 335

Asn Trp Ser Leu Thr Asn Lys Asn Glu Thr Ser Gly Ser Phe Thr Pro

340 345 350

Phe Glu Leu Gly Lys Ser Asn Ala Thr Ser Leu Asp Pro Gly Pro Glu

355 360 365

Gln Ala Trp Ser Leu Pro Glu Leu Ser Val Ser Gly Glu Tyr Val Arg

370 375 380

Ser Arg Ile Lys Gly Ser Pro Tyr Glu Pro Phe Asp Arg Thr Lys Phe

385 390 395

Asn Lys Val Ile Trp Asp Phe Asn Asp Gly Thr Val Gln Gly Phe Glu

400 405 410 415

Val Asn Asp Asp Ser Pro Val Lys Glu Glu Ile Ala Val Ser Asn Ala

420 425 430

Gly Asn Ala Leu Gln Ile Thr Gly Leu Asn Ala Ser Asn Asp Ile Ser

435 440 445

Thr Asp Asn Phe Trp Ser Asn Leu Arg Leu Ser Ala Asn Ser Trp Gly

450 455 460

Glu Ser Val Asn Ile Leu Gly Ala Glu Glu Leu Thr Leu Asp Val Ile

465 470 475

Val Asp Glu Pro Thr Ser Val Ser Ile Ala Ala Ile Pro Gln Ser Ala

480 485 490 495

Ala Val Gly Trp Ala Asn Pro Asn Asn Ala Val Val Val Ser Lys Glu

500 505 510

Asp Phe Ala Pro Tyr Gly Gly Gln Tyr Lys Ala Val Leu Thr Ile Thr

515 520 525

Pro Glu Asp Ser Pro Ala Leu Gly Ala Ile Ala Thr His Ser Asp Asp

530 535 540

Asn Met Met Asn Asn Ile Ile Leu Phe Ile Gly Thr Glu Asn Ala Asp

545 550 555

Val Leu Ser Leu Asp Asn Ile Thr Val Lys Gly Ser Ile Val Glu Ile

560 565 570 575

Pro Val Ile His Asp Pro Lys Gly Ile Ala Val Leu Pro Ser Asn Phe

580 585 590

Glu Asp Gly Thr Arg Gln Gly Trp Asp Trp Asn Pro Glu Ser Gly Val

595 600 605

Lys Thr Ala Leu Thr Ile Lys Glu Ala Asp Gly Ser His Ala Leu Ser

610 615 620

Trp Glu Phe Ala Tyr Pro Glu Val Lys Pro Gly Asp Gly Trp Ala Thr

625 630 635

Ala Pro Arg Leu Glu Phe Trp Lys Asp Gly Leu Val Arg Gly Ala Asn

640 645 650 655

Asp Tyr Leu Ser Phe Asp Leu Tyr Leu Asp Pro Val Arg Ala Thr Glu

660 665 670

Gly Ala Ile Thr Thr His Leu Val Phe Gln Pro Pro Ser Ala Gly Tyr

675 680 685

Trp Val Gln Ala Pro Ala Ser His Ser Ile Asp Leu Leu Asn Leu Asp

690 695 700

Ser Ala Asp Ile Thr Ala Asp Gly Leu Tyr His Tyr Glu Val Lys Phe

705 710 715

Asn Ile Arg Asp Ile Thr Ala Ile Gln Asp Asp Thr Ala Leu Arg Asn

720 725 730 735

Met Ile Leu Ile Leu Glu Asp Arg Asn Ser Asp Phe Ala Gly Arg Ala

740 745 750

Phe Ile Asp Asn Val Arg Phe Glu

755

<210>3

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>3

gattaacgcg ttcctcgtgc tgagcacaga gg 32

<210>4

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>4

ttatggagct caaatcaact ctaggaggct g 31

Claims

1.具有内切葡聚糖酶活性的分离的多肽，其选自下组：

a)多肽，其具有与SEQ ID NO：2的氨基酸1至759具有至少72％同一性的氨基酸序列；

b)多肽，其具有与SEQ ID NO：2的氨基酸65至347具有至少86％同一性的氨基酸序列；

c)多肽，其由在至少低严紧条件下与以下杂交的多核苷酸编码：(i)SEQ IDNO：1的核苷酸100至2376，(ii)SEQ ID NO：1的核苷酸193至1041，或(iii)(i)或(ii)的互补链；

d)变体，其包含保守取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸的SEQ ID NO：2的氨基酸1至759；

e)多肽，其由包含SEQ ID NO：1的核苷酸100至2376或SEQ ID NO：1的核苷酸193至1041的核苷酸序列编码。

2.权利要求1的多肽，其中包含SEQ ID NO：2的氨基酸368至569的片段具有糖结合模块活性。

3.权利要求1或2的多肽，所述多肽具有以下性质中的至少一种：

a)pI为4.4，

b)最适pH为9，

c)最适温度为40℃和

d)在pH 5-10.5的稳定性。

4.分离的多核苷酸，其包含编码权利要求1-3中任一项的多肽的核苷酸序列。

5.权利要求4的分离的多核苷酸，其在SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列中具有至少一个突变，其中所述突变体核苷酸序列编码由SEQ ID NO：2的氨基酸1至759组成的多肽。

6.核酸构建体，其包含权利要求4或5的多核苷酸，所述多核苷酸与一个或多个调控序列可操作地连接，所述调控序列指导多肽在表达宿主中的产生。

7.重组表达载体，其包含权利要求6的核酸构建体。

8.重组宿主细胞，其包含权利要求7的核酸构建体。

9.用于产生权利要求1-3中任一项的多肽的方法，其包括：(a)在有益于所述多肽产生的条件下培养细胞，所述细胞以其野生型形式能够产生所述多肽；和(b)回收所述多肽。

10.用于产生权利要求1-3中任一项的多肽的方法，其包括：(a)在有益于所述多肽产生的条件下培养包含核酸构建体的宿主细胞，其中所述核酸构建体包含编码所述多肽的核苷酸序列；和(b)回收所述多肽。

11.分离的多核苷酸，其在至少低严紧条件下与以下杂交：(i)SEQ IDNO：1的核苷酸100至2376，(ii)SEQ ID NO：1的核苷酸193至1041，(iii)SEQID NO：1的核苷酸1104至1707，或(iv)(i)、(ii)或(iii)的互补链。

12.酶组合物，其包含根据权利要求1-3的多肽。

13.根据权利要求12的组合物，其还包含选自下组的一种或多种酶：蛋白酶、纤维素酶、内切葡聚糖酶、β-葡聚糖酶、半纤维素酶、脂肪酶、过氧化物酶、漆酶、α-淀粉酶、葡糖淀粉酶、角质酶、果胶酶、还原酶、氧化酶、酚氧化酶、木质酶、支链淀粉酶、果胶酸裂合酶、木葡聚糖酶、木聚糖酶、果胶乙酰酯酶、多聚半乳糖醛酸酶、鼠李糖半乳糖醛酸酶、果胶裂合酶、甘露聚糖酶、果胶甲基酯酶、纤维二糖水解酶、转谷氨酰胺酶；或它们的混合物。

14.用于降解含纤维素的生物质的方法，其中用有效量的根据权利要求1-3中任一项的多肽或根据权利要求12或13的酶组合物来处理所述生物质。

15.根据权利要求1-3中任一项的多肽或根据权利要求12或13的酶组合物用于降解含纤维素的生物质的用途。

16.根据权利要求1-3中任一项的多肽或根据权利要求12或13的酶组合物在洗涤剂组合物中的用途。

17.根据权利要求1-3中任一项的多肽或根据权利要求12或13的酶组合物在纺织品整理方法中的用途。

18.根据权利要求1-3中任一项的多肽或根据权利要求12或13的酶组合物用于在染色的织物中获得颜色的局部磨损的用途。

19.洗涤剂组合物，其包含权利要求1-3中的多肽或根据权利要求12或13的酶组合物。

20.纺织品处理组合物，其包含权利要求1-3中的多肽或根据权利要求12或13的酶组合物。