KR20020012249A

KR20020012249A - 신규한 엔도-베타-1,4-글루카나제

Info

Publication number: KR20020012249A
Application number: KR1020017015240A
Authority: KR
Inventors: 마르틴(사망) 슐레인; 마드스 에스켈룬트 비요른바드
Original assignee: 피아 스타르; 노보자임스 에이/에스
Priority date: 1999-05-28
Filing date: 2000-05-24
Publication date: 2002-02-15
Also published as: CN1177929C; DE60029955D1; EP1185631A1; EP1185631B1; MXPA01012179A; WO2000073428A1; BR0010998A; JP2003501021A; JP4837855B2; DE60029955T2; CA2374433A1; EP1185631B9; ATE335812T1; DE60029955T4; AU4744900A; CN1353751A

Abstract

글리코실 가수분해효소의 패밀리 9에 속하는 엔도-β-1,4-글루카나제 활성을 나타내는 효소는Bacillus licheniformisATCC 14580과 같은Bacillus에 속하는 균주로부터 얻을 수 있거나, 또는 이 균주에 내인성이다. (a) SEQ ID NO:1의 뉴클레오트드 76 내지 뉴클레오티드 1455, 또는 뉴클레오티드 76 내지 뉴클레오티드 1941에 나타낸 바와 같은 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 분자, (b) SEQ ID NO:2의 아미노산 잔기 26 내지 아미노산 잔기 485, 또는 아미노산 잔기 26 내지 아미노산 잔기 646의 아미노산 서열에 적어도 75% 동일한 폴리펩티드를 코드화하는 폴리뉴클레오티드 분자; (c) (a) 또는 (b)의 축퇴성 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 엔도-β-1,4-글루카나제 활성을 나타내는 효소 또는 효소 핵(효소의 촉매 활성 도메인)을 코드화하는 폴리뉴클레오티드(DNA) 분자가 분리되고, 다양한 산업 용도에 유용한 엔도글루카나제 효소가 발현된다.

Description

신규한 엔도-베타-1,4-글루카나제{NOVEL ENDO-BETA-1,4-GLUCANASES}

셀룰로스는 β-1,4-글루코시드 결합에 의해 연결된 글루코스의 중합체이다. 셀룰로스 사슬은 다수의 분자내 및 분자간 수소 결합을 형성하고, 이것은 불용성 셀룰로스 미세섬유의 형성을 가져온다. 셀룰로스의 글루코스로의 미생물 가수분해는 다음의 3가지 주요한 부류의 셀룰라제를 포함한다: (i) 셀룰로스 분자 전체에서 무작위로 β-1,4-글루코시드 연결을 절단하는 엔도글루카나제(EC 3.2.1.4); (ii) 비환원 단부로부터 셀룰로스를 소화하여 셀로비오스를 유리시키는 셀로비오가수분해효소(EC 3.2.1.91); 및 (iii) 셀로비오스 및 저분자량 셀로덱스트린을 가수분해하여 글루코스를 유리시키는 β-글루코시다제(EC 3.2.1.21).

셀룰라제는 많은 미생물에 의해 생성되고, 주로 복합적인 형태로 존재한다.셀룰로스의 효소 분해의 경제적 중요성의 인식은 산업적으로 사용될 수 있는 미생물 셀룰라제에 대한 광범위한 연구를 촉진하고 있다. 그 결과로서, 다수의 셀룰라제에 대한 효소 특성 및 주요한 구조가 조사되었다. 촉매 도메인의 아미노산 서열의 소수성 클러스터 분석의 결과를 기초로 하여, 이들 셀룰라제는 글리코실 가수분해효소의 상이한 패밀리안에 배치되었고, 진균 및 박테리아 글리코실 가수분해효소는 35개 패밀리로 분류되었다(Henrissat 등, (1991) (1993)). 대부분의 셀룰라제는 프롤린 및 히드록시 아미노 잔기에 풍부할 수 있는 링커에 의해 분리된 셀룰로스-결합 도메인(CBD) 및 촉매 도메인(CAD)으로 구성된다. 셀룰라제의 다른 부류는 그것들의 CBD의 유사성을 기초로 하여 수립되었으며(Gilkes 등, (1991)), 5개 패밀리의 글리코실 가수분해효소(I - V)를 제공한다.

셀룰라제는 진균류, 방선균류, 점액박테리아 및 진정박테리아를 포함하는 다수의 미생물에 의해 합성되며, 또한 식물에 의해서도 합성된다. 특히 광범위한 특이성의 엔도 β-1,4-글루카나제가 확인되었다. 많은 박테리아 엔도글루카나제가 설명되었다(Henrissat (1993); Gilbert 등, (1993)).

섬유소분해 효소의 중요한 산업적 사용은, 예를 들어 배수를 개선하거나 또는 재생지의 탈잉크를 위한 종이 펄프의 처리를 위한 사용이다. 섬유소분해 효소의 다른 중요한 산업적 사용은, 예를 들어 세제 조성물 또는 직물 유연제 조성물의 성분으로서 셀룰로스 텍스타일 또는 직물의 처리, 새 직물의 생물-폴리싱(의류 마무리), 및 셀룰로스-함유 직물, 특히 데님의 "돌-세척" 외관을 얻기 위한 사용이며, 그러한 처리를 위한 몇가지 방법이, 예를 들어 GB-A-1 368 599, EP-A-0 307 564 및EP-A-0 435 876, WO 91/17243, WO 91/10732, WO 91/17244, PCT/DK95/00 0108 및 PCT/DK95/00132에서 제안되었다.

셀룰라제, 바람직하게는 엔도-β-1,4-글루카나제 활성(EC 3.2.1.4)이 바람직한 용도에 사용될 수 있는 신규 셀룰라제 효소 또는 효소 제조물의 제공에 대한 요구가 항상 있어왔다.

본 발명의 목적은 약간의 산성 내지 알칼리성 조건하에 실질적인 섬유소분해 활성을 가지고, 종이 펄프 가공, 텍스타일 처리, 세탁 공정, 추출 공정 또는 동물 사료에 있어 개선된 성능을 갖는 신규 효소 및 효소 조성물을 제공하는 것이다. 바람직하게는 그러한 신규의 성능 좋은 엔도글루카나제는 고수율로 재조합 기법을 사용함에 의해 제조가능하거나 또는 제조된다.

본 발명은, 글리코실 가수분해효소의 패밀리 9에 속하고Bacillus lichenif-ormis패밀리 9 엔도-β-1,4-글루카나제에 적어도 75% 상동성인 엔도-β-1,4-글루카나제 활성을 나타내는 효소, 그러한 엔도-β-1,4-글루카나제를 코드화하는 분리된 폴리뉴클레오티드 분자, 그리고 세제, 종이 및 펄프, 기름 시추, 기름 추출, 와인 및 쥬스, 식품 성분, 동물 사료 또는 텍스타일 산업에서 이 효소의 사용에 관한 것이다.

(발명의 개요)

본 발명자들은 실질적인 섬유소분해 활성을 갖는 신규 효소, 즉 엔도-β-1,4-글루카나제(효소 명명법에 따라 EC 3.2.1.4로 분류된)를 발견했다. 이 효소는Bacillus licheniformis에 내인성이고, 글리코실 가수분해효소의 패밀리 9에 속한다. 그리고, 본 발명자들은 그러한 효소를 코드화하는 DNA를 클로닝하고 발현하는데 성공했다.

따라서, 제 1 양태로서 본 발명은 엔도-β-1,4-글루카나제 활성(EC 3.2.1.4)을 나타내는 효소에 관한 것으로서, 이것은 (a) SEQ ID NO:1의 위치 76 내지 1455의 DNA 서열에 의해 코드화되는 폴리펩티드; (b) DNA 서열이 발현되는 조건하에SEQ ID NO:1의 서열을 포함하는 세포를 배양함으로써 생성되는 폴리펩티드; (c) 동일성이 GAP 생성 패널티 3.0 GAP 확장 패널티 0.1을 사용하는 GCG 프로그램 패키지에 제공된 GAP에 의해 측정될 때, SEQ ID NO:2의 위치 26 내지 485의 아미노산 서열로부터 유도된 아미노산 서열을 포함하는 SEQ ID NO:2 폴리펩티드의 위치 26 내지 485에 적어도 75% 동일한 서열을 갖는 엔도-β-1,4-글루카나제 효소; 및 (d) 대장균 DSM 12805에 있는 플라스미드로부터 얻을 수 있는 DNA 서열의 일부를 코드화하는 엔도글루카나제에 의해 코드화되는 폴리펩티드 중 하나로부터 선택된다. 본 발명의 효소는 Henrissat 등에 의해 규정되는 바와 같은 글리코실 가수분해효소의 패밀리 9에 속하는 것으로 확인된다.

제 2 양태로서, 본 발명은 엔도-β-1,4-글루카나제 활성을 나타내는 효소의 촉매 활성 도메인을 코드화하는 분리된 폴리뉴클레오티드 분자, 바람직하게는 DNA 분자에 관한 것으로서, 이 분자는 (a) SEQ ID NO:1의 뉴클레오티드 76에서 뉴클레오티드 1455까지에 나타낸 바와 같은 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 분자; (b) (a)의 종 상동체; (c) SEQ ID NO:2의 아미노산 잔기 26에서 아미노산 잔기 485까지의 아미노산 서열에 적어도 75% 동일한 폴리펩티드를 코드화하는 폴리뉴클레오티드 분자; 및 (d) (a) 또는 (b)의 축퇴성 뉴클레오티드 서열로 구성된 군으로부터 선택된다. 바람직하게는, 폴리뉴클레오티드 분자는 중간 긴축 조건하에서 변성된 이중-스트랜드 DNA 프로브에 혼성화할 수 있으며, 여기에서 프로브는 SEQ ID NO:1의 위치 76 내지 1455에 나타낸 서열을 포함하는 DNA 프로브 및 적어도 약 100 염기쌍의 길이를 갖는 SEQ ID NO:1의 위치 76 내지 1455의 하위서열을포함하는 DNA 프로브로 구성되는 군으로부터 선택된다.

본 발명의 엔도글루카나제를 코드화하는 DNA 서열을 포함하는 플라스미드 pS J1678은 특허 과정을 위한 미생물 기탁의 국제 승인에 대한 부타페스트 조약에 따라 Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH(Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, Federal Republic of Germany)에 1999년 5월 14일자로 기탁번호 DSM 12805하에 본 발명자들에 의해 기탁된 대장균의 균주안에 형질전환되었다.

제 3, 제 4 및 제 5 양태로서, 본 발명은, 예를 들어 본 발명의 폴리뉴클레오티드 분자인 DNA 세그먼트를 포함하는 발현 벡터; 이 DNA 세그먼트 또는 발현 벡터를 포함하는 세포; 및 효소의 생성을 허가하는 조건하에서 세포를 배양하고, 배양물로부터 효소를 회수하는 것을 포함하는, 섬유소분해 활성을 나타내는 효소의 제조 방법을 제공한다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 (i) 상동성 불순물을 함유하지 않고, (ii) 효소가 상기 설명된 방법에 의해 제조되는 것을 특징으로 하는 섬유소분해 활성을 나타내는 분리된 효소를 제공한다.

더욱이, 본 발명은 나무 펄프의 처리 또는 생체물질(biomass)의 분해와 같은 산업적 용도를 위한 본 발명의 그러한 효소 또는 효소 제조물의 사용에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 박테리아 종Bacillus licheniformis의 균주로부터 유도되는 대장균 DSM 12805에 존재하는 플라스미드 pSJ1678 안에 클론된 DNA 서열을 코드화하는 엔도글루카나제를 숨기고 있는 대장균 균주 DSM 12805의 분리된 실질적으로 순수한 생물학적 배양물, 또는 상기 대장균 균주의 어떤 돌연변이에 관한 것이다.

본 발명의 엔도글루카나제는 CMC(엔도클루카나제)에 대한 높은 특이 활성을 가짐으로써 다수의 산업적 용도에서 유리하며, 대부분의 다른 엔도글루카나제와 달리, 본 발명의 효소는 고도의 결정질 셀룰로스를 분해할 수 있다. 더욱이, 이 효소는 60℃의 최적 온도를 갖고, pH 5.5와 9.5 사이에서 충분히 활성이다. 따라서, 본 발명의 효소는, 정상적으로는 셀로비오가수분해효소(들)(이것은 CMC에 대한 활성을 거의 가지지 않는다) 및 엔도글루카나제(들)를 모두 필요로 하는, 전체 생체물질 분해에 유리하게 사용될 수 있다.

(발명의 상세한 설명)

본원에 사용된 바와 같은 용어 "글리코실 가수분해효소 패밀리"는 Henrissat B.의 "아미노산 서열 유사성에 기초한 글리코실 가수분해효소의 분류" Biochem. J. 280:309-316(1991); Genrissat B., Bairoch A. "아미노산 서열 유사성에 기초한 글리코실 가수분해효소 분류의 새로운 패밀리" Biochem. J. 293:781-788(1993); Hen-rissat B., Bairoch A. "글리코실 가수분해효소의 서열 기초 분류의 업데이트" Bioc hem. J. 316:695-696(1996); 및 Davies G., Henrissat B. "글리코실 가수분해효소의 구조 및 메카니즘" Structure 3:853-859(1995)에 설명되었고, 이 모두가 참고자료로서 포함된다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "기능적 효소 특성"은 하나 이상의 촉매 활성을 나타내는 폴리펩티드의 물리적 및 화학적 특성을 의미하도록 의도된다. 기능적효소 특성의 예는 효소 활성, 특이적 효소 활성, 최대 활성에 대한 상대적 효소 활성(pH 또는 온도의 함수로 측정된), 안정성(시간에 따른 효소 활성의 저하), DSC 용융 온도, N-말단 아미노산 서열, 분자량(보통 SDS-PAGE로 측정된), 등전점(pI)이다.

본 발명과 관련하여 용어 "발현 벡터"는 DNA 분자의 전사를 제공하는 추가의 세그먼트에 작동가능하게 연결된 관심의 폴리펩티드를 코드화하는 세그먼트를 포함하는 선형 또는 환형인 DNA 분자를 표시한다. 그러한 추가의 세그먼트는 프로모터 및 터미네이터 서열을 포함할 수 있고, 선택적으로 하나 이상의 복제 기원, 하나 이상의 선택성 마아커, 인핸서, 폴리아데닐화 신호 등을 포함할 수 있다. 발현 벡터는 일반적으로 플라스미드 또는 바이러스성 DNA로부터 유도되거나, 또는 두 요소를 모두 함유할 수 있다. 본 발명의 발현 벡터는 재조합 DNA 과정이 편리하게 행해지는 어떤 발현 벡터일 수 있으며, 벡터의 선택은 주로 벡터가 도입될 숙주 세포에 좌우될 것이다. 따라서, 벡터는 자율 복제 벡터, 즉 염색체외 존재로서 존재하고, 그 복제가 염색체 복제에 독립적인 벡터, 예를 들어 플라스미드일 수 있다. 또는 달리, 벡터는, 숙주 세포안에 도입되었을 때, 숙주 세포 게놈안에 통합되어 벡터가 통합된 염색체(들)와 함께 복제되는 것일 수 있다.

폴리펩티드 또는 단백질의 발현과 관련하여 본원에 사용된 용어 "재조합 발현된" 또는 "재조합적으로 발현된"은 본 분야의 표준 규정에 따라 규정된다. 단백질의 재조합 발현은 일반적으로 상기 설명된 바와 같은 발현 벡터를 사용하여 수행된다.

용어 "분리된"은 폴리뉴클레오티드 분자에 적용되었을 때, 폴리뉴클레오티드가 그것의 천연적 유전 환경으로부터 제거됨으로써 다른 외적인 또는 원하지 않는 코딩 서열을 함유하지 않고, 유전적으로 조작된 단백질 제조 시스템내에서 사용하기 적합한 형태라는 것을 표시한다. 그러한 분리된 분자는, 그것의 천연 환경으로부터 분리되고 cDNA 및 게놈 클론을 포함하는 것들이다. 본 발명의 분리된 DNA 분자는 그것들이 보통 관련되는 다른 유전자를 함유하지 않지만, 프로모터 및 터미네이터와 같은 자연 발생적인 5' 및 3' 미번역 영역을 포함할 수 있다. 관련 영역의 확인은 당업자에게 명백할 것이다(예를 들어, Dynan 및 Tijan, Nature 316:774-78, 1985 참조). 용어 "분리된 폴리뉴클레오티드"는 "클론된 폴리뉴클레오티드"로 대신하여 쓸 수 있다.

단백질/폴리펩티드에 적용될 때, 용어 "분리된"은 단백질이 그것의 자생 환경과는 다른 조건에서 발견된다는 것을 나타낸다. 바람직한 형태로서, 분리된 단백질은 다른 단백질, 특히 다른 상동성 단백질(즉, "상동성 불순물" (아래 참조))을 실질적으로 함유하지 않는다. 40% 이상 순수한 형태의 단백질을 제공하는 것이 바람직하며, 더 바람직한 것은 60% 이상 순수한 형태이다.

더욱 더 바람직하게는, SDS-PAGE에 의해 측정된 바, 고도로 정제된 형태, 즉 80% 이상 순수한, 더 바람직하게는 95% 이상 순수한, 더욱 더 바람직하게는 99% 이상 순수한 단백질을 제공하는 것이 바람직하다.

용어 "분리된 단백질/폴리펩티드"는 "정제된 단백질/폴리펩티드"로 대신하여 쓸 수 있다.

용어 "상동성 불순물"은 본 발명의 폴리펩티드가 처음에 얻어진 상동성 세포로부터 기원하는 어떤 불순물(예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드 이외의 다른 폴리펩티드)을 의미한다.

특이적 미생물 공급원과 관련하여 본원에 사용된 바와 같은 용어 "로부터 얻어진"은 폴리뉴클레오티드 및/또는 폴리펩티드가 특이적 공급원에 의해, 또는 공급원으로부터의 유전자가 삽입된 세포에 의해 생성되었음을 의미한다.

용어 "작동가능하게 연결된"은 DNA 세그먼트와 관련될 때, 세그먼트가 그것들의 의도된 목적과 일치하여 작용하도록, 예를 들어 전사가 프로모터에서 개시되고 코딩 세그먼트를 통하여 진행되어 터미네이터까지 이르도록 정렬된 것을 표시한다.

용어 "폴리뉴클레오티드"는 5'에서 3' 단부쪽으로 해석되는 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 염기의 단일- 또는 이중-스트랜드 중합체를 표시한다. 폴리뉴클레오티드는 RNA 및 DNA를 포함하며, 천연 공급원으로부터 분리되거나, 시험관내에서 합성되거나, 또는 천연 분자와 합성 분자의 조합으로부터 제조될 수 있다.

용어 "폴리뉴클레오티드 분자의 보체"는 상보성 염기 서열 및 기준 서열과 비교하여 역방향을 갖는 폴리뉴클레오티드 분자를 표시한다. 예를 들어, 서열 5' ATGCACGGG 3'은 5' CCCGTGCAT 3'에 상보한다.

용어 "축퇴성 뉴클레오티드 서열"은 하나 이상의 축퇴성 코돈(폴리펩티드를 코드화하는 기준 폴리뉴클레오티드 분자와 비교하여)을 포함하는 뉴클레오티드의서열을 표시한다. 축퇴성 코돈은 상이한 뉴클레오티드 트리플렛을 함유하지만, 동일한 아미노산 잔기를 코드화한다(즉, GAU 및 GAC 트리플렛은 각각 Asp를 코드화한다).

용어 "프로모터"는 RNA 중합효소의 결합 및 전사의 개시를 제공하는 DNA 서열을 함유하는 유전자의 부분을 표시한다. 프로모터 서열은 항상은 아니지만, 보통은 유전자의 5' 비-코딩 영역에서 발견된다.

용어 "분비 신호 서열"은 더 큰 폴리펩티드의 성분으로서, 그것이 합성되는 세포의 분비 경로를 통해 더 큰 폴리펩티드를 지정하는 폴리펩티드("분비 펩티드")를 코드화하는 DNA 서열을 표시한다. 더 큰 펩티드는 보통 분비 경로를 통한 운반 동안 분비 펩티드를 제거하기 위해 절단된다.

폴리뉴클레오티드:

본 발명의 바람직한 구체예의 범위내에서, 본 발명의 분리된 폴리뉴클레오티드는 적어도 중간 긴축 조건하에, 유사한 크기의 SEQ ID NO:1의 영역, 또는 그것에 상보하는 서열에 혼성화할 것이다.

특히, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 적어도 중간 긴축 조건, 그러나 바람직하게는 아래 자세히 설명된 바와 같은 높은 긴축 조건하에, SEQ ID NO:1의 위치 76 내지 1455에 나타낸 서열인 효소의 촉매 도메인을 코드화하는 전서열 또는 적어도 약 100 염기쌍의 길이를 갖는 SEQ ID NO:1의 하위서열을 포함하는 어떤 프로브를 포함하는 변성된 이중-스트랜드 DNA 프로브에 혼성화할 것이다. 뉴클레오티드 프로브와 상동성 DNA 또는 RNA 서열간의 중간, 또는 높은 긴축도에서의 혼성화를 측정하기 위한 적합한 실험 조건은 10분간 5 x SSC(염화나트륨/시트르산나트륨, Sam-brook 등, 1989)에서 혼성화시키기 위한 DNA 단편 또는 RNA를 함유하는 필터의 예비 소킹, 5 x SSC, 5 x Denhardt's 용액(Sambrook 등, 1989), 0.5% SDS 및 100㎍/ ml의 변성된 초음파처리 연어 정자 DNA(Sambrook 등, 1989)의 용액에서 필터의 예비 혼성화, 이어서 약 45℃에서 12시간 동안 10ng/ml 농도의 무작위-초회항원자극된 (Feinberg A. P. 및 Vogelstein B. (1983) Anal. biochem. 132:6-13) 32P-dCTP-표지된(1 x 10⁹cpm/㎍ 보다 높은 특이 활성) 프로브를 함유하는 동일한 용액에서의 혼성화를 포함한다. 다음에, 필터는 적어도 60℃(중간 긴축도), 더 바람직하게는 적어도 65℃(중간/높은 긴축도), 더욱 더 바람직하게는 적어도 70℃(높은 긴축도), 가장 바람직하게는 적어도 75℃(매우 높은 긴축도)에서 2 x SSC, 0.5% SDS로 30분간 2번 세척된다.

이들 조건하에서 올리고뉴클레오티드 프로브가 혼성화한 분자는 엑스선 필름을 사용하여 검출된다.

이미 주목된 바와 같이, 본 발명의 분리된 폴리뉴클레오티드는 DNA 및 RNA를 포함한다. DNA 및 RNA의 분리 방법은 본 분야에 잘 공지되어 있다. 관심의 게놈을 코드화하는 DNA 및 RNA는 본 분야에 공지된 방법에 의하여 유전자 은행 또는 DNA 라이브러리에서 클론될 수 있다.

다음에, 본 발명의 엔도글루카나제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드화하는 폴리뉴클레오티드가 확인되고, 예를 들어 혼성화 또는 PCR에 의해 분리된다.

본 발명은 상이한 박테리아 균주로부터의 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드 대응부(오르토로그 또는 파라로그)를 더 제공한다. 특히 관심있는 것은Bacillus의 종을 포함하여, 그램-양성 호염기성 균주로부터의 엔도글루카나제 폴리펩티드이다.

본 발명의 엔도글루카나제 활성을 갖는 폴리펩티드의 종 상동체가, 종래의 클로닝 기법과 조합하여, 본 발명에 의해 제공된 정보 및 조성물을 사용하여 클론될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 DNA 서열은 이 단백질을 발현하는 세포 종류로부터 얻어진 염색체 DNA를 사용하여 클론될 수 있다. DNA의 적합한 공급원이 본원에 개시된 서열로부터 디자인된 프로브로 노던 블롯을 검사함으로써 확인될 수 있다. 다음에, 라이브러리가 양성 셀라인의 염색체 DNA로부터 제조된다. 다음에, 엔도글루카나제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드화하는 본 발명의 DNA 서열이 본 명세서 및 청구항에 개시된 서열로부터 디자인된 프로브로, 또는 개시된 서열에 기초한 한 세트 이상의 축퇴성 프로브로 검사하는 것과 같은, 여러가지 방법에 의해 분리될 수 있다. 또한, 본 발명의 DNA 서열은 본원에 개시된 서열로부터 디자인된 프라이머를 사용하여, 중합효소 사슬 반응 또는 PCR(Mullis, 미국 특허 4,683,202)을 사용하여 클론될 수 있다. 추가의 방법내에서, DNA 라이브러리를 사용하여 숙주 세포를 형질전환 또는 트랜스펙션할 수 있으며, 관심의 DNA 발현이Bacillus lichen-iformisATCC 14580으로부터 클론된 엔도글루카나제에 대해 생기는 항체(단일클론 또는 다중클론)를 사용하여 검출되고, 물질 및 방법 및 실시예 1 및 실시예 3에 설명된 바와 같이, 또는 엔도글루카나제 활성을 갖는 폴리펩티드에 관한 활성 시험에 의해 발현 및 정제될 수 있다.

대장균 DSM 12805에 존재하는 플라스미드 pSJ1678안에 클론된 DNA 서열의 일부 및/또는 본 발명의 DNA 서열 유사체를 코드화하는 엔도글루카나제는 엔도글루카나제 활성을 갖는 효소를 생성하는 박테리아 종Bacillus licheniformis의 균주, 바람직하게는 균주 ATCC 14580, 또는 본원에 설명된 바와 같은 다른 또는 관련된 유기체로부터 클론될 수 있다.

또는 달리, 서열 유사체는 대장균 DSM 12805에 존재하는 플라스미드로부터 얻을 수 있는 DNA 서열(이것은 첨부된 SEQ ID NO:1과 동일하다고 여겨진다)을 기초로 하여 구성될 수 있으며, 예를 들어 그것의 하위서열일 수 있고, 및/또는 DNA 서열에 의해 코드화되는 엔도글루카나제의 다른 아미노산 서열을 초래하지는 않지만, 효소의 생성이 의도되는 숙주 유기체의 코돈 용법에 상응하는 뉴클레오티드 치환의 도입에 의해, 또는 상이한 아미노산 서열(즉, 본 발명의 효소의 변이체)을 초래할 수 있는 뉴클레오티드 치환의 도입에 의해 구성될 수 있다.

또는 달리, 본 발명의 엔도글루카나제를 코드화하는 DNA는, 잘-공지된 과정에 따라서, 대장균 DSM 12805에 존재하는 플라스미드로부터 얻을 수 있는 DNA 서열을 기초로 하여 제조된 합성 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함에 의해, 아래 언급된 유기체 중 어떤 것과 같은 적합한 공급원으로부터 편리하게 클론될 수 있다.

다른 관련 서열을 얻기 위해 본 발명의 서열을 사용하는 방법:

본 발명의 엔도-베타-1,4-글루카나제를 코드화하는 폴리뉴클레오티드 서열과 관련하여 본원에 개시된 서열 정보는 다른 상동성 엔도글루카나제를 확인하기 위한 도구로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 중합효소 사슬 반응(PCR)이 여러가지 미생물공급원, 특히 여러가지 상이한Bacillus종으로부터의 다른 상동성 만난나제를 코드화하는 서열을 증폭하기 위해 사용될 수 있다.

폴리펩티드:

SEQ ID NO:2의 위치 26 내지 약 위치 485에 있는 아미노산의 서열은 성숙한 엔도글루카나제 서열의 촉매 활성 도메인이다. 효소는 촉매 활성 도메인에 작동가능하게 연결되고, SEQ ID NO:2의 약 위치 485에서 위치 646까지에 상응하는 아미노산 서열로 표시되는 셀룰로스 결합 도메인(CBD)을 더 포함한다. 본 엔도글루카나제의 CBD는 패밀리 3b에 속한다. 아래 참조.

또한, 본 발명은 SEQ ID NO:2의 폴리펩티드에 실질적으로 상동성인 엔도글루카나제 폴리펩티드 및 그것의 종 상동체(파라로그 또는 오르토로그)를 제공한다. 용어 "실질적으로 상동성"은 SEQ ID NO:2의 아미노산 번호 26 내지 485 또는 번호 26 내지 646에 나타낸 서열에 대해 75%, 바람직하게는 적어도 80%, 더 바람직하게는 적어도 85%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 또는 그것들의 오르토로그 또는 파라로그를 표시하기 위해 본원에 사용된다. 그러한 폴리펩티드는 SEQ ID NO:2의 아미노산 번호 26 내지 646에 나타낸 서열 또는 그것의 오르토로그 또는 파라로그에 대해 더 바람직하게는 적어도 95%의 동일성, 가장 바람직하게는 98% 이상의 동일성을 가질 것이다. 서열 동일성 퍼센트는, 본원에 그 전체가 참고자료로 포함되는 Needleman S. B. 및 Wunsch C. D. (1970), Journal of Molecular Biology, 48, 443-453에 설명된 바와 같은, GCG 프로그램 패키지(위스콘신 패키지용 프로그램 매뉴얼, 버젼 8, 1994, 8월, Genetics ComputerGroup, 미국 53711, 위스콘신, 매디슨, 사이언스 드라이브 575)에 제공된 GAP과 같은 본 분야에 공지된 컴퓨터 프로그램에 의하여, 종래의 방법에 의해 측정된다. GAP은 폴리펩티드 서열 비교에 대해 다음의 셋팅으로 사용된다: GAP 생성 패널티 3.0 및 GAP 확장 패널티 0.1.

폴리뉴클레오티드 분자의 서열 동일성은 DNA 서열 비교에 대해 다음의 셋팅으로 GAP을 사용하는 유사한 방법에 의해 측정된다: GAP 생성 패널티 5.0 및 GAP 확장 패널티 0.3.

실질적으로 상동성인 단백질 및 폴리펩티드는 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 또는 추가를 가짐을 특징으로 한다. 이들 변화는 바람직하게는 부차적 성질로서, 보존성 아미노산 치환(표 1 참조) 및 단백질 또는 폴리펩티드의 접힘 또는 활성에 의미 있는 영향을 미치지 않는 다른 치환; 전형적으로 1 내지 약 30 아미노산의 작은 결실; 및 작은 아미노- 또는 카르복실-말단 확장, 예컨대 아미노-말단 메티오닌 잔기, 약 20 내지 25 잔기까지의 작은 링커 펩티드, 또는 폴리-히스티딘 트랙, 단백질 A(Nilsson 등, EMBO J. 4:1075, 1985; Nilsson 등, Methods Enzymol. 198:3, 1991)와 같은 정제를 용이하게 하는 작은 확장(친화성 태그)이다. 일반적으로, 본원에 참고자료로서 포함되는 Ford 등, 단백질 발현 및 정제 2:95-107, 1991 참조. 친화성 태그를 코드화하는 DNA는 상업적 공급자(예를 들어, Pharmacia Biotech, 뉴저지 피스카타웨이; New England Biolabs, 매사츄세츠 베버리)로부터 입수가능하다.

그러나, 상기 설명된 변화가 바람직하게는 부차적 성질이기는 하지만, 그러한 변화는 또한, 엔도글루카나제 활성을 갖는 본 발명의 폴리펩티드에서 아미노- 또는 카르복실-말단 확장으로서 300 아미노산까지 또는 그 이상의 더 큰 폴리펩티드의 융합과 같은 더 큰 성질일 수도 있다.

보존성 아미노산 치환

염기성	아르기닌
	리신
	히스티딘
산성	글루탐산
	아스파르트산
극성	글루타민
	아스파라긴
소수성	로이신
	이소로이신
	발린
방향족	페닐알라닌
	트립토판
	티로신
작은 것	글리신
	알라닌
	세린
	트레오닌
	메티오닌

20개의 표준 아미노산에 더하여, 비-표준 아미노산(4-히드록시프롤린, 6-N-메틸 리신, 2-아미노이소부티르산, 이소발린 및 a-메틸 세린과 같은)이 본 발명에 따르는 폴리펩티드의 아미노산 잔기를 치환할 수 있다. 제한된 수의 비-보존성 아미노산, 유전 코드에 의해 코드화되지 않는 아미노산, 및 비천연 아미노산이 아미노산 잔기를 치환할 수 있다. "비천연 아미노산"은 단백질 합성 후 변형되고, 및/또는 표준 아미노산의 구조와는 상이한 측쇄(들)에서의 화학적 구조를 가진다. 비천연 아미노산은 화학적으로 합성될 수 있거나, 또는 바람직하게는 상업적으로 입수가능하고, 피페콜산, 티아졸리딘 카르복실산, 디히드로프롤린, 3- 및 4-메틸프롤린 및 3,3-디메틸프롤린을 포함한다.

본 발명의 엔도글루카나제 폴리펩티드에 있는 필수 아미노산은 부위-지정 돌연변이유발 또는 알라닌-스캐닝 돌연변이유발과 같은, 본 분야에 공지된 과정에 따라 확인될 수 있다(Cunningham 및 Wells, Science 244:1081-1085, 1989). 후자의 기법에서, 단일 알라닌 돌연변이가 분자에 있는 모든 잔기에 도입되고, 결과의 돌연변이 분자가 분자의 활성에 중요한 아미노산 잔기를 확인하기 위해 생물학적 활성(즉, 엔도글루카나제 활성)에 대해 시험된다. 또한, Hilton 등, J. Biol. Chem. 271:4699-4708, 1996 참조. 또한, 효소의 활성 부위 또는 다른 생물학적 상호작용이, 추정적 접촉 부위 아미노산의 돌연변이와 함께, 핵자기공명, 결정학, 전자 회절 또는 광친화성 표지화와 같은 기법에 의해 측정되는 바와 같은 물리적 구조 분석에 의해 측정될 수 있다. 예를 들어, de Vos 등, Science 255:306-312, 1992; Smith 등, J. Mol. Biol. 224:899-904, 1992; Wlodaver 등, FEBS Lett. 309:59-64, 1992 참조. 또한, 필수 아미노산의 확인은 본 발명에 따르는 폴리펩티드와 관련된 폴리펩티드와의 상동관계의 분석으로부터 추론될 수 있다.

Reidhaar-Olson 및 Sauer(Science 241:53-57, 1988), Bowie 및 Sauer(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2152-2156, 1989), WO 95/17413, 또는 WO 95/22625에 개시된 것들과 같이, 다중 아미노산 치환이 만들어지고, 공지된 방법의 돌연변이유발, 재조합 및/또는 셔플링을 사용하여 시험되고, 관련된 스크리닝 과정이 이어진다. 간단히 말해서, 이들 저자들은 폴리펩티드에서 2 이상의 위치를 동시에 무작위화하거나, 또는 상이한 돌연변이를 재조합/셔플링(WO 9517413, WO 95/22625)하고,이어서 기능적 폴리펩티드를 선택한 후, 돌연변이된 폴리펩티드를 서열화하여 각 위치에서 허용가능한 치환의 범위를 측정하는 방법을 개시한다. 사용될 수 있는 다른 방법은 파지 디스플레이(예를 들어, Lowman 등, Biochem. 30:10832-10837, 1991 ; Ladner 등, 미국 특허 번호 5,223,409; Huse, WIPO 공보 WO 92/06204) 및 영역-지정 돌연변이유발(Derbyshire 등, Gene 46:145, 1986; Ner 등, DNA 7:127, 1988)을 포함한다.

상기 개시된 바와 같은 돌연변이유발/셔플링 방법은 숙주 세포에서 클론, 돌연변이된 폴리펩티드의 활성을 검출하기 위한 고-처리량의 자동화된 스크리닝 방법과 조합될 수 있다. 활성 폴리펩티드를 코드화하는 돌연변이된 DNA 분자는 숙주 세포로부터 회수되고 현대적 장치를 사용하여 신속히 서열화될 수 있다. 이들 방법은 관심의 폴리펩티드에 있는 개별 아미노산 잔기의 중요성에 대한 신속한 측정을 허용하며, 미공지 구조의 폴리펩티드에 적용될 수 있다.

상기 논의된 방법을 사용하여, 당업자는 SEQ ID NO:2의 잔기 26 내지 약 485 또는 잔기 26 내지 646에 실질적으로 상동성이고 야생형 단백질의 엔도글루카나제 활성을 보유하는 여러가지 폴리펩티드를 확인 및/또는 제조할 수 있다.

본 발명의 엔도글루카나제 효소는, 촉매 도메인을 포함하는 효소 핵에 더하여, 또한 셀룰로스 결합 도메인(CBD), 작동가능하게 연결되는 효소의 셀룰로스 결합 도메인 및 효소 핵(촉매 활성 도메인)을 포함할 수 있다. 셀룰로스 결합 도메인 (CBD)은 상기 설명된 바와 같은 코드화된 효소의 통합 부분으로서 첨부된 SEQ ID NO:2에 존재하거나, 또는 다른 기원으로부터의 CBD가 엔도글루카나제안에 도입됨으로써 효소 혼성체를 만들 수 있다. 이와 관련하여, 용어 "셀룰로스 결합 도메인"은 Peter Tomme 등의 "셀룰로스 결합 도메인: 분류 및 특성", "불용성 탄수화물의 효소 분해", John N. Saddler 및 Michael H. Penner(판), ACS Symposium Series, No. 618, 1996에 의해 규정된 바와 같이 이해되도록 의도된다. 이 규정은 120 이상의 셀룰로스 결합 도메인을 10개 패밀리(I - X)로 분류하고, CBD가 셀룰라제(엔도글루카나제), 크실라나제, 만난나제, 아라비노푸라노시다제, 아세틸 에스터라제 및 키티나제와 같은 다양한 효소에서 발견됨을 증명했다. 또한, CBD는 비-가수분해성 다당류 결합 단백질로서 조류, 예를 들어 적조류Porphyra purpurea에서 발견되었다. Tomme 등의 앞서 인용한 책 참조. 그러나, 대부분의 CBD는 셀룰라제 및 크실라나제로부터 유래하며, CBD는 단백질의 N 및 C 말단에서 발견되거나, 또는 내부에 있다. 효소 혼성체는 본 분야에 공지되어 있고(예를 들어, WO 90/00609 및 WO 95/16782 참조), 엔도글루카나제를 코드화하는 DNA 서열에, 링커와 함께 또는 링커 없이 리게이션된 셀룰로스 결합 도메인을 코드화하는 DNA의 적어도 단편을 포함하는 DNA 구성물을 숙주 세포안에 형질전환하고, 이 융합된 유전자를 발현하도록 숙주 세포를 성장시킴에 의해 제조될 수 있다. 효소 혼성체는 다음 식에 의해 설명될 수 있다.

CBD - MR - X

여기에서, CBD는 적어도 셀룰로스 결합 도메인에 상응하는 아미노산 서열의 N-말단 또는 C-말단 영역이고; MR은 중앙 영역(링커)으로 결합, 또는 바람직하게는 약 2 내지 약 100 탄소 원자, 더 바람직하게는 2 내지 40 탄소 원자의 짧은 연결기일 수 있거나, 또는 바람직하게는 약 2 내지 약 100 아미노산, 더 바람직하게는 2 내지 40 아미노산이고; X는 본 발명의 제 1 또는 제 2 DNA 서열에 의해 코드화되는 폴리펩티드의 N-말단 또는 C-말단 영역이다.

바람직한 구체예에서, 본 발명의 분리된 폴리뉴클레오티드 분자는 셀룰로스 결합 도메인(CBD)을 코드화하는 부분적 DNA 서열을 포함한다. 그러한 부분적 DNA 서열의 예는 SEQ ID NO:1의 약 485에서 1941까지의 위치에 있는 뉴클레오티드 또는 대장균 DSM 12805에 존재하는 플라스미드 pSJ1678안에 클론된 DNA 서열의 CBD 코드화 부분에 상응하는 서열이다. 본 발명의 분리된 폴리뉴클레오티드 분자는 연결 영역을 코드화하는 부분적 뉴클레오티드 서열을 더 포함할 수 있고, 이 연결 영역은 분리된 폴리뉴클레오티드 분자에 의해 포함된 뉴클레오티드 서열에 의해 코드화는 효소의 셀룰로스 결합 도메인(CBD) 및 촉매 활성 도메인(CAD)를 작동가능하게 연결한다. 바람직하게는, 연결 영역은 약 2 아미노산 잔기에서 약 120 아미노산 잔기까지, 특히 10 내지 80 아미노산 잔기로 구성된다.

면역학적 교차 반응성

면역학적 교차 반응성을 측정하는데 사용되는 다중클론 항체, 특히 단일특이적 다중클론 항체가 정제된 섬유소분해 효소를 사용하여 제조될 수 있다. 더 구체적으로, 본 발명의 엔도글루카나제에 대한 항혈청이, N. Axelsen 등의 정량적 면역전기영동 매뉴얼, Blackwell Scientific Publications, 1973, 챕터 23, 또는 A. Johnstone 및 R. Thorpe, 면역화학 연습, Blackwell Scientific Publications, 1982(더 구체적으로 p. 27-31)에 의해 설명된 과정에 따라, 토끼(또는 다른 설치류)를 면역화함에 의해 생길 수 있다. 정제된 면역글로불린은, 예를 들어 염 침전 ((NH₄)₂SO₄)하고, 이어서 투석 및 이온 교환 크로마토그래피(예를 들어, DEAE-Sepha dex)함에 의해 항혈청으로부터 얻어질 수 있다. 단백질의 면역화학적 특성화는 오우크테를로니 이중-확산 분석(O. Ouchterlony, 실험 면역학 핸드북(D. M. Weir 판), Blackwell Scientific Publications, 1967, pp. 655-706), 교차 면역전기영동 (N. Axelsen 등, 위와 같음, 챕터 3 및 4), 또는 로켓 면역전기영동(N. Axelsen 등, 챕터 2)에 의해 행해질 수 있다.

미생물 공급원

본 발명의 목적에 있어서, 특이적 공급원과 관련하여 본원에 사용된 바와 같은 용어 "로부터 얻어진" 또는 "로부터 얻을 수 있는"은 효소가 특이적 공급원에 의해, 또는 공급원으로부터의 유전자가 삽입된 세포에 의해 생성되거나 또는 생성될 수 있음을 의미한다.

본 발명의 셀룰라제가Bacillus속의 균주, 특히Bacillus licheniformis의 균주에 속하는 그램-양성 박테리아로부터 얻어질 수 있음이 현재 숙고된다.

바람직한 구체예에서, 본 발명의 셀룰라제는 균주Bacillus licheniformisATCC 14580으로부터 얻어진다. 본 발명의 효소에 상동성인 효소를 코드화하는 DNA 서열이Bacillus속에 속하는 다른 균주로부터 얻어질 수 있음이 현재 숙고된다.

본 발명의 엔도-β-1,4-글루카나제가 유도될 수 있는Bacillus licheniformi s의 균주의 분리균은 기탁 번호 ATCC 14580하에 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(ATCC)로부터 공개적으로 입수가능하다.

더욱이, 본 발명의 엔도글루카나제를 코드화하는 DNA 서열을 포함하는 플라스미드 pSJ1678은 대장균의 균주안에 형질전환되고 기탁 번호 DSM 12805하에 기탁되었다.

재조합 발현 벡터

본 발명의 효소를 코드화하는 DNA 구성물을 포함하는 재조합 벡터는 재조합 DNA 과정이 편리하게 행해질 수 있는 어떤 벡터일 수 있으며, 벡터의 선택은 주로벡터가 도입될 숙주 세포에 좌우될 것이다. 따라서, 벡터는 자율 복제 벡터, 즉 염색체외 존재로서 존재하고, 그 복제가 염색체 복제에 독립적인 벡터, 예를 들어 플라스미드일 수 있다. 또는 달리, 벡터는, 숙주 세포안에 도입되었을 때, 일부분 또는 완전히 숙주 세포 게놈안에 통합되어 벡터가 통합된 염색체(들)와 함께 복제되는 것일 수 있다.

벡터는 바람직하게는 본 발명의 효소를 코드화하는 DNA 서열이 DNA의 전사에 필요한 추가의 세그먼트에 작동가능하게 연결된 발현 벡터이다. 일반적으로, 발현 벡터는 플라스미드 또는 바이러스성 DNA로부터 유도되거나, 또는 두 요소를 모두 함유할 수 있다. 용어 "작동가능하게 연결된"은 세그먼트가 그것들의 의도된 목적과 일치하여 작용하도록, 예를 들어 전사가 프로모터에서 개시되고 효소를 코딩하는 DNA 서열을 통하여 진행되도록 정렬된 것을 표시한다.

프로모터는 선택된 숙주 세포에서 전사 활성을 나타내고, 숙주 세포에 상동성 또는 이종성인 단백질을 코드화하는 유전자로부터 유도될 수 있는 어떤 DNA 서열일 수 있다.

박테리아 숙주 세포에 사용하기 적합한 프로모터의 예는Bacillus stearoth-ermophilus말토겐 아밀라제 유전자,Bacillus licheniformis알파-아밀라제 유전자,Bacillus amyloliquefaciens알파-아밀라제 유전자,Bacillus subtilis알칼리성 프로테아제 유전자 또는Bacillus pumilus크실로시다제 유전자의 프로모터, 또는 파지 람다 P_R또는 P_L프로모터 또는 대장균lac,trp또는tac프로모터를 포함한다.

본 발명의 효소를 코드화하는 DNA 서열은 또한, 필요하다면 적합한 터미네이터에 작동가능하게 연결될 수 있다.

본 발명의 재조합 벡터는 문제의 숙주 세포에서 벡터의 복제를 가능하게 하는 DNA 서열을 더 포함할 수 있다.

또한, 벡터는 선택성 마아커, 예를 들어 그 생성물이 숙주 세포의 결함을 보완하는 유전자, 또는 가나마이신, 클로로암페니콜, 에리트로마이신, 테트라시클린, 스펙티노마이신 등에 대한 내성, 또는 중금속 또는 제초제에 대한 내성을 코드화하는 유전자를 포함할 수 있다.

본 발명의 효소를 숙주 세포의 분비 경로안에 지정하기 위해서, 분비 신호 서열(또한, 리더 서열, 프레프로 서열 또는 프로 서열로 공지된)이 재조합 벡터에 제공될 수 있다. 분비 신호 서열은 정확한 리딩 프레임으로 효소를 코드화하는 DNA서열에 결합된다. 분비 신호 서열은 보통 효소를 코드화 하는 DNA 서열의 5'에 위치가 정해진다. 분비 신호 서열은 정상적으로 효소에 관련된 것일 수 있거나, 또는 다른 분비된 단백질을 코드화하는 유전자로부터 유래할 수 있다.

본 효소를 코딩하는 DNA 서열, 프로모터 및 선택적으로 터미네이터 및/또는 분비 신호 서열을 각각 리게이션하거나, 또는 적합한 PCR 증폭 계획에 의해 이들 서열을 어젬블링하고, 그것들을 복제 또는 통합에 필수적인 정보를 함유하는 적합한 벡터안에 삽입하기 위해 사용되는 과정은 당업자에서 잘 공지되어 있다(예를 들어, Sambrook 등, 앞에 인용한 책 참조).

숙주 세포

숙주 세포안에 도입된 클론된 DNA 분자는 문제의 숙주 세포에 상동성 또는 이종성일 수 있다. 만약 숙주 세포에 상동성이라면, 즉 사실상 숙주 세포에 의해 생성된다면, 그것은 전형적으로 천연 환경에서보다 다른 프로모터 서열 또는, 이용가능하다면 다른 분비 신호 서열 및/또는 터미네이터 서열에 작동가능하게 연결될 것이다. 용어 "상동성"은 문제의 숙주 유기체에 자생적인 효소를 코드화하는 DNA 서열을 포함하도록 의도된다. 용어 "이종성"은 사실상 숙주 세포에 의해 발현되지 않는 DNA 서열을 포함하도록 의도된다. 따라서, DNA 서열은 다른 유기체로부터 유래될 수 있거나, 또는 합성 서열일 수 있다.

본 발명의 클론된 DNA 분자 또는 재조합 벡터가 도입되는 숙주 세포는 원하는 효소를 생성할 수 있는 어떤 세포일 수 있으며, 박테리아, 이스트, 진균 및 고등 진핵 세포를 포함한다.

배양에 의해 본 발명의 효소를 생성할 수 있는 박테리아 숙주 세포의 예는Bacillus의 균주, 특히Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus circulans, Bacillus coagulans, Bacillus megatherium, Bacillus stear-othermophilus, Bacillus subtilis및Bacillus thuringiensis,Lactobacillus의 균주,Streptococcus의 균주,Streptomyces의 균주, 특히Streptomyces lividans및Streptomyces muriuns와 같은 그램-양성 박테리아일 수 있거나, 또는 숙주 세포는 대장균의 균주와 같은 그램-음성 박테리아일 수 있다.

박테리아의 형질전환은 원형질체 형질전환, 전기천공, 콘쥬게이션에 의해, 또는 제시된 공지의 방식으로 수용성(competent) 세포를 사용함에 의해 행해질 수 있다(예를 들어, 위와 같은 Sambrook 등 참조).

대장균과 같은 박테리아에서 효소를 발현할 때, 효소는 전형적으로 불용성 과립(봉입체로서 공지된)으로서 세포질에 보유될 수 있거나, 또는 박테리아 분비 서열에 의해 주변세포질 공간에 지정될 수 있다. 전자의 경우에, 세포가 융해되어 과립이 회수 및 변성되고, 이후 변성제를 희석함으로써 효소가 재접혀진다. 후자의 경우에, 효소는, 예를 들어 초음파처리 또는 삼투 충격에 의해 세포를 분열시켜 세포질 공간의 내용물을 유리시키고, 효소를 회수함으로써 주변세포질 공간으로부터 회수될 수 있다.

Bacillus의 균주 또는Streptomyces의 균주와 같은 그램-양성 박테리아에서 효소를 발현할 때, 효소는 세포질에 보유될 수 있거나, 또는 박테리아 분비 서열에의해 세포외 배지에 지정될 수 있다.

배양에 의해 본 발명의 효소를 생성할 수 있는 진균 숙주 세포의 예는, 예를 들어Aspergillus또는Fusarium의 균주, 특히Aspergillus awamori, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, 및Fusarium oxysporum, 및Trichoderma의 균주, 바람직하게는Trichoderma harzianum, Trichoderma reesei및Trichoderma viride이다.

진균 세포는 제시된 공지의 방식으로, 원형질체 형성 및 원형질체의 형질전환, 이어서 세포벽의 재생성을 포함하는 과정에 의해 형질전환될 수 있다. 숙주 세포로서Aspergillus의 균주의 사용이 본원에 참고자료로서 포함되는 EP 238 023 (Novo Nordisk A/S)에 설명된다.

배양에 의해 본 발명의 효소를 생성할 수 있는 이스트 기원의 숙주 세포의 예는, 예를 들어Hansenula sp.의 균주,Kluyveromyces sp.의 균주, 특히Kluyver-omyces lactis및Kluyveromyces marcianus, Pichia sp.의 균주,Saccharomyces의 균주, 특히Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisae, Saccharomy-ces kluyveri및Saccharomyces uvarum, Schizosaccharomyces sp.의 균주, 특히Schizosaccharomyces pombe,및Yarrowia sp.의 균주, 특히Yarrowia lipolytica이다.

배양에 의해 본 발명의 효소를 생성할 수 있는 식물 기원의 숙주 세포의 예는, 예를 들어Solanum tuberosum또는Nicotiana tabacum의 식물 세포이다.

섬유소분해 효소의 제조 방법

본 발명은 본 발명에 따르는 분리된 효소를 제조하는 방법을 제공하며, 여기에서 효소를 코드화하는 DNA 서열을 사용하여 형질전환되는 적합한 숙주 세포는 효소의 생성을 허가하는 조건하에서 배양되고, 결과의 효소가 배양물로부터 회수된다.

본원에 규정된 바와 같이, 분리된 폴리펩티드(예를 들어, 효소)는 본질적으로 다른 폴리펩티드를 함유하지 않는, 예를 들어 SDS-PAGE에 의해 측정된 바, 적어도 약 20% 순수한, 바람직하게는 적어도 약 40% 순수한, 더 바람직하게는 약 60% 순수한, 더욱 더 바람직하게는 약 80% 순수한, 가장 바람직하게는 약 90% 순수한, 더 가장 바람직하게는 약 95% 순수한 폴리펩티드이다.

용어 "분리된 폴리펩티드"는 "정제된 폴리펩티드"로 대신하여 쓸 수 있다.

효소를 코드화하는 DNA 서열을 포함하는 발현 벡터가 이종성 숙주 세포안에 형질전환될 때, 본 발명의 효소의 이종성 재조합 생성을 가능하게 하는 것이 가능하다.

이로써, 상동성 불순물을 함유하지 않는 것을 특징으로 하는, 고도로 정제된 또는 단일성분 섬유소분해 조성물을 만드는 것이 가능하다.

이와 관련하여, 상동성 불순물은 본 발명의 효소가 처음에 얻어진 상동성 세포로부터 기원하는 어떤 불순물(예를 들어, 본 발명의 효소 이외의 다른 폴리펩티드)을 의미한다.

본 발명에서, 상동성 숙주 세포는Bacillus licheniformis의 균주일 수 있다.

형질전환된 숙주 세포를 배양하는데 사용되는 배지는 문제의 숙주 세포를 성장시키는데 적합한 어떤 종래의 배지일 수 있다. 발현된 섬유소분해 효소는 배양 배지안에서 편리하게 분비될 수 있고, 원심분리 또는 여과에 의한 배지로부터 세포의 분리, 황산암모늄과 같은 염에 의한 배지의 단백질성(proteinaceous) 성분의 침전, 이어서 이온 교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피와 같은 크로마토그래피 과정을 포함하는 잘-공지된 과정에 의해 그것으로부터 회수될 수 있다.

효소 조성물

더 이상의 양태로서, 본 발명은 상기 설명된 바와 같은 엔도글루카나제 활성을 나타내는 효소를 포함하는 효소 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 효소 조성물은, 본 발명의 엔도글루카나제에 더하여, 하나 이상의 다른 효소 종류, 예를 들어 크실라나제 및 만난나제와 같은 헤미셀룰라제, 다른 셀룰라제 또는 엔도-β-1,4-글루카나제 성분, 키티나제, 리파제, 에스터라제, 펙티나제, 큐티나제, 피타제, 산화환원효소(퍼옥시다제, 할로퍼옥시다제, 산화효소, 락카제), 프로테아제, 아밀라제, 환원효소, 페놀산화효소, 리그니나제, 풀룰라나제, 펙테이트 리아제, 크실로글루카나제, 펙틴 아세틸 에스터라제, 폴리갈락투로나제, 람노갈락투로나제, 펙틴 리아제, 펙틴 메틸에스터라제, 셀로비오가수분해효소, 트랜스글루타미나제; 또는 그것들의 혼합물을 포함할 수 있다.

효소 조성물은 본 분야에 공지된 방법에 따라 제조될 수 있고, 액체 또는 건조 조성물의 형태일 수 있다. 예를 들어, 효소 조성물은 과립 또는 미세-과립의 형태일 수 있다. 조성물에 포함되는 효소는 본 분야에 공지된 방법에 따라 안정화될수 있다.

엔도글루카나제는 많은 상이한 산업 및 용도에 잠재적 사용을 가진다. 본 발명의 효소 조성물의 바람직한 사용의 예가 아래 주어진다. 본 발명의 효소 조성물의 용량 및 조성물이 사용되는 다른 조건은 본 분야에 공지된 방법을 기초로 하여 측정될 수 있다.

본 발명에 따르는 효소 조성물은 다음의 목적 중 적어도 하나에 유용할 수 있다.

효소

본 발명의 바람직한 구체예에서, 엔도글루카나제는 4 내지 11, 바람직하게는 5.5 내지 10.5 범위의 pH에서 활성을 나타낸다.

사용

생체물질 분해

본 발명에 따르는 효소 또는 효소 조성물은, 예를 들어 다음에 유리하게 적용될 수 있다.

- 나무껍질 벗기기 용, 즉 기계 드럼으로 나무껍질을 벗기기 전에 펙틴-부화 형성층 층을 부분적으로 분해할 수 있는 가수분해 효소를 사용한 전처리는 유리한 에너지 절약을 가져온다.

- 탈섬유화 용(리파이닝 또는 비팅), 즉 리파이닝 또는 비팅하기 전에 가수분해 효소로 셀룰로스 섬유를 함유하는 물질의 처리, 이것은 섬유의 표면에 대한 효소의 가수분해 효과로 인해 에너지 소비의 감소를 가져온다.

- 섬유 변형 용, 즉 더 깊이 침투하는 효소가 필요한, 섬유벽 전체의 부분적 가수분해가 요구되는 섬유 특성 개선(예를 들어, 더욱 유연한 거친 섬유를 만들기 위해서)

- 배수 용, 제지용 펄프의 배수능력이 가수분해 효소를 사용한 펄프의 처리에 의해 개선될 수 있다. 본 발명의 효소 또는 효소 조성물의 사용은 더욱 효과적일 수 있다. 예를 들어, 섬유 사이의 그리고 제지 기계의 와이어 메시의 빈 공간을 차단함으로써 배수 속도를 제한하는 미세한 부분에 있는 강하게 수화된 미세섬유의 다발을 보다 높은 정도로 느슨하게 한다.

리그노셀룰로스 펄프의 처리는 WO 93/08275, WO 91/02839 및 WO 92/03608에 설명된 바와 같이 수행될 수 있다.

세제 산업에서의 사용

본 발명의 효소 또는 효소 조성물은 텍스타일 또는 의류의 가정 또는 산업 세탁용 세제 조성물, 및 본 발명의 효소 또는 효소 제조물을 함유하는 세척액을 사용한 기계 세척 과정의 세척 사이클 동안 직물을 처리하는 것을 포함하는 직물의 기계 처리를 위한 과정에 유용할 수 있다.

전형적으로, 본 발명의 세제 조성물은, 예를 들어 본원에 참고자료로서 포함되는 WO 97/01629에 설명된 바와 같은, 계면활성제(음이온, 비이온, 쯔위터이온, 양쪽성)와 같은 종래의 성분, 빌더 및 기타 성분을 포함한다.

텍스타일 용도

다른 구체예로서, 본 발명은 생물-폴리싱 공정에서 본 발명의 엔도글루카나제의 사용에 관한 것이다. 생물-폴리싱은 직물 습윤성의 손실 없이 취급 및 외관과 관련하여 직물의 질을 개선하는 얀 표면에 대한 특이적인 처리이다. 생물-폴리싱의 가장 중요한 효과는 적은 보풀 및 필링, 증가된 글로스/광택, 개선된 직물 취급, 증가된 영구적 유연도 및 변경된 물 흡수성을 특징으로 한다. 생물-폴리싱은 보통편성포 및 직포 제조의 습식 가공에서 일어난다. 습식 가공은, 예를 들어 발호, 정련, 표백, 세척, 염색/날염 및 마무리와 같은 단계를 포함한다. 이들 각 단계 동안, 직물에는 보다 많은 또는 보다 적은 기계적 작용이 행해진다. 일반적으로, 텍스타일이 편성 또는 직조된 후, 직물은 발호 단계, 이어서 정련 단계 등으로 진행한다. 발호는 텍스타일로부터 풀을 제거하는 행위이다. 기계적 직기에서 직조하기 전에, 날실 얀을 그것의 인장 강도를 증가시키기 위해서 주로 풀 녹말 또는 녹말 유도체로 코팅한다. 직조 후, 균질성 및 세척-내항력의 결과를 확보하기 위해서 직물을 더 가공하기 전에 풀 코팅을 제거해야 한다. 생물-폴리싱의 효과를 달성하기 위해서, 섬유소분해 및 기계적 작용의 조합이 필요하다는 것이 공지되어 있다. 또한, "최고-유연도"는 셀룰라제를 사용한 처리가 종래의 유연제를 사용한 처리와 조합될 때 달성가능하다는 것이 공지되어 있다. 셀룰로스 직물의 생물-폴리싱을 위한 본 발명의 엔도글루카나제의 사용이 유리하다고 숙고되며, 예를 들어 더욱 완전한 폴리싱이 달성될 수 있다. 생물-폴리싱은, 예를 들어 WO 93/20278에 설명된 방법을 적용함으로써 얻어질 수 있다.

돌-세척

직물 색이 원하는 국부적 밝기로 되도록, 속돌의 존재하에 데님 또는 진 직물로 만들어진 데님 또는 진을 세척함에 의해, 또는 효소적으로, 특히 섬유소분해 효소를 사용하여 직물을 처리함에 의해, 염색된 직물, 특히 데님 직물 또는 진에 "돌-세척" 외관(색의 국부적 마모)을 제공하는 것이 공지되어 있다. 본 발명의 엔도글루카나제를 사용한 처리는 US 4,832,864에 개시된 바와 같이 단독으로, 종래의 과정에서 필요한 양보다 적은 양의 속돌과 함께, 또는 WO 95/09225에 개시된 바와 같은 펄라이트와 함께 수행될 수 있다.

CMC 유니트의 측정

CMC 유니트는 60℃에서 0.1M Mops 완충액(pH 7.5)를 사용하여 측정된다. 20분간 인큐베이션하고, PHAB를 사용하여 환원당의 형성을 측정한다. 1 CMC 유니트는 분당 1μmol 글루코스 당량의 형성에 상응한다. CMC(Hercules로부터의 카르복시 메틸 셀룰로스 7L) 최종 농도는 0.75%, DS 0.7이다.

물질 및 방법

균주

Bacillus licheniformisATCC 14580

B. subtilisPL2306. 이 균주는 공지의Bacillus subtilis의 전사 유니트에서 분열되어 결국 셀룰라제 음성 세포로 된 분열된 apr 및 npr 유전자(Diderichsen 등(1990))를 갖는B. subtilisDN1885이다. 분열은 A. L. Sonenshein 등(1993)에 설명된 바와 같이 본질적으로 수행된다.

수용성 세포가 Yasbin 등(1975)에 의해 설명된 바와 같이 제조 및 형질전환되었다.

플라스미드

국제 특허 공보 WO 94/19454에 개시된 pSJ1678.

pMOL944:

이 플라스미드는Bacillus subtilis에서 증식가능한 플라스미드, 가나마이신 내성 유전자를 만들고,B. lichemiformisATCC 14580의 amyL 유전자로부터 클론된 강 프로모터 및 신호 펩티드를 갖는 요소를 본질적으로 함유하는 pU110 유도체이다. 신호 펩티드는 그것이 신호 펩티드와 융합한 안에 있는 단백질의 성숙한 부분을 코드화하는 DNA를 편리하게 클론하도록 만드는 SacII 부위를 함유한다. 이것은 예비-단백질의 발현을 가져오며, 이것은 세포의 외부를 향해 지정된다.

플라스미드는 종래의 유전 조작 기법에 의하여 구성되며, 이것이 다음에 간단히 설명된다.

pMOL944의 구성:

pUB110 플라스미드(McKenzie T. 등, 1986)가 유일한 제한 효소 NciI로 소화된다. 플라스미드 pDN1981(Jorgensen P. L. 등, (1990))상에서 코드화된 amyL 프로모터로부터 증폭된 PCR 단편이 NciI로 소화되고, NciI 소화된 pUB110에 삽입되어 플라스미드 pSJ2624를 제공한다.

프라이머 #LWN5494는 플라스미드에 NotI 부위를 삽입한다.

다음에, 플라스미드 pSJ2624는 ScaI 및 NotI로 소화되고, pDN1981상에서 코드화된 amyL 프로모터상에서 증폭된 새로운 PCR 단편이 SacI 및 NotI로 소화되고, 그리고 이 DNA 단편이 SacI-NotI 소화된 pSJ2624에 삽입되어 플라스미드 pSJ2670을 제공한다.

이 클로닝은 제 1 amyL 프로모터 클로닝을 대체하며, 동일한 프로모터를 사용하지만 반대 방향이다. PCR 증폭에 사용된 2개 프라이머는 다음의 서열을 가진다:

플라스미드 pSJ2670은 제한 효소 PstI 및 BclI로 소화되고, 알칼리성 아밀라제 SP722(본원에 전체가 참고자료로서 포함되는 국제 특허 출원 공보 WO 95/26397에 개시된)를 코드화하는 클론된 DNA 서열로부터 증폭된 PCR 단편이 PstI 및 BclI로 소화되고 삽입되어 플라스미드 pMOL944를 제공한다. PCR 증폭에 사용된 2개 프라이머는 다음의 서열을 가진다:

프라이머 #LWN7901은 플라스미드에 SacII 부위를 삽입한다.

일반적 분자 생물학 방법

달리 언급되지 않는다면, DNA 조작 및 형질전환은 분자 생물학의 표준 방법을 사용하여 수행되었다(Sambrook 등, (1989); Ausubel F. M. 등 (판) (1995); Ha-rwood C. R., 및 Cutting S. M. (판) (1990)).

DNA 조작을 위한 효소는 공급자(예를 들어, 제한 엔도뉴클레아제, 리가제 등이 New England Biolabs, Inc.로부터 입수가능하다)의 설명서에 따라 사용되었다.

배지

TY (Ausubel 등(1995)에 설명된 바와 같은)

LB 아가 (Ausubel 등(1995)에 설명된 바와 같은)

LBPG는 0.5% 글루코스 및 0.05M 인산칼륨(pH 7.0)으로 보충된 LB 아가이다.

BPX 배지는 EP 0 506 780(WO 91/09129)에 설명된다.

다음의 실시예들이 본 발명을 예시한다.

실시예 1

Bacillus licheniformis 로부터 엔도-베타-1,4-글루카나제의 클로닝 및 발현

게놈 DNA 제조

균주Bacillus licheniformisATCC 14580을 ATCC(아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션, USA)에 의해 명기된 바와 같은 액체 배지 3에서 증식시켰다. 37℃ 및 300rpm에서 18시간 인큐베이션한 후, 세포를 수집하고 게놈 DNA를 Pitcher 등(1989)에 의해 설명된 방법에 의해 분리했다.

게놈 라이브러리 구성

Bacillus licheniformisATCC 14580의 게놈 DNA를 제한 효소 Sau3A로 부분적으로 소화시키고, 0.7% 아가로스겔 전기영동에 의해 크기 분별했다. 크기가 2에서 7kb 사이인 단편을 DEAE-셀룰로스 페이퍼(Dretzen 등, (1981)) 위에서 전기영동하여 분리했다. 분리된 DNA 단편을 BamHI 소화된 pSJ1678 플라스미드 DNA에 리게이션했다.

리게이션된 DNA를 사용하여 대장균 SJ2를 전기천공하고, 이 형질전환된 세포를 10mg/ml 클로로암페니콜 및 0.1% CMC(나트륨-카르복시-메틸-셀룰로스, Aqualon, 프랑스)를 함유하는 LB-아가 플레이트상에 두고, 플레이트를 37℃에서 18시간 동안 인큐베이션했다.

콜로니 혼성화에 의한 양성 클론의 확인

상기 설명된 바와 같이 구성된 대장균의 DNA 라이브러리를 0.1% CMC(나트륨-카르복시-메틸-셀룰로스, Aqualon, 프랑스) 및 10㎍/ml 클로로암페니콜을 함유하는 LB-아가 플레이트상에서 스크리닝하고, 37℃에서 8시간 또는 하룻밤 인큐베이션했다.

원래의 플레이트를 콩고 레드(SIGMA, USA) 1mg/ml를 함유하는 수용액 25ml를 사용하여 착색시켰다. 착색을 온건하게 궤도로 흔들면서 반 시간 계속하고, 이후 플레이트를 1M NaCl을 사용하여 15분씩 2번 세척했다.

누르스름한 무리가 셀룰라제 양성 클론이 존재하는 위치에 나타났고, 복제 플레이트로부터 이들 셀룰라제 양성 클론을 구제하고, 0.1% CMC 및 9㎍/ml 클로로암페니콜을 함유하는 LB-아가 플레이트 위에서 재-획선하고, 37℃에서 하룻밤 인큐베이션했다.

양성 클론의 특성화

재-획선한 플레이트로부터, 엔도글루카나제 양성 클론을 단일 콜로니로서 얻었고, 플라스미드를 추출했다. 표현형을 대장균 SJ2의 재형질전환에 의해 확인했고, 플라스미드를 제한 소화에 의해 특성화했다. 한 양성 클론을 MB629-3으로 명명했다.

엔도글루카나제 유전자를 Tag 데옥시-말단 순환 서열화 키트(Perkin-Elmer, USA)를 사용하여 DNA 서열화하고, DNA 단편을 코드화하는 클론된 엔도글루카나제의 각 측면상에서 pSJ1678에 유일한 프라이머로 시작하는 프라이머 워킹을 수행함에 의해 특성화했다.

서열 데이타의 분석을 Devereux 등(1984)에 따라 수행했다. 서열은 SEQ ID NO:1에 나타낸 DNA 서열에 상응한다.

아미노산 서열 SEQ ID NO:2(또한 Cel9로 표시)로 표시된 패밀리 9 엔도-베타 -1,4-글루카나제를 코딩하는 본 발명의 DNA 서열을 이들 2개 올리고머 뉴클레오티드로 구성된 PCR 프라이머 세트를 사용하여 PCR 증폭했다.

밑줄친 것은 제한 부위 PstI 및 NotI이다.

상기 설명된 바와 같은B. licheniformisATCC 14580으로부터 분리된 염색체 DNA를 제조자의 지시에 따라 AmpliTaq DNA 중합효소(Perkin Elmer)를 사용하는 PCR 반응에 템플레이트로서 사용했다. PCR 반응을 각 dNTP 20μM, AmpliTaq 중합효소 (Perkin Elmer, Cetus, USA) 2.5 유니트 및 각 프라이머 100pmol을 함유하는 PCR완충액(10mM 트리스-HCl, pH 8.3, 50mM MgCl₂, 0.01%(w/v) 겔라틴)중에 셋업했다.

PCR 반응을 DNA 열 순환기(Landgraf, 독일)를 사용하여 수행했다. 94℃에서 1분간 한번 인큐베이션하고, 이어서 30 사이클의 PCR을 94℃에서 30초간 변성 순환 프로필을 사용하여 수행하고, 60℃에서 1분간 아닐링하고, 72℃에서 2분간 확장했다. 증폭 생성물의 5㎕ 알리쿼트를 0.7% 아가로스 겔(NuSieve, FMC)중에서 전기영동에 의해 분석했다. 2.0kb 크기의 DNA 단편의 출현은 유전자 세그먼트의 적합한 증폭을 표시했다.

PCR 단편의 서브클로닝

상기 설명된 바와 같이 생성된 PCR 생성물의 45㎕ 알리쿼트를 제조자의 지시에 따라 QIAquick PCR 정제 키트를 사용하여 정제했다. 정제된 DNA를 10mM 트리스-HCl(pH 8.5) 50㎕에 용출시켰다. pMOL944 5㎍ 및 정제된 PCR 단편 25㎕를 PstI 및 NotI로 소화시키고, 0.8% 저 겔화 온도 아가로스(Seaplaque GTG, FMC) 겔중에서 전기영동하고, 관련된 단편을 겔로부터 절제하고, 제조자의 지시에 따라 QIAquick 겔 추출 키트(Qiagen, USA)를 사용하여 정제했다. 다음에, 분리된 PCR DNA 단편을 Pst I-NotI 소화되고 정제된 pMOL944에 리게이션했다. 리게이션을 각 DNA 단편 0.5㎍, T4 DNA 리가제 1U 및 T4 리가제 완충액(Boehringer Mannheim, 독일)을 사용하여 16℃에서 하룻밤 수행했다.

리게이션 혼합물을 사용하여 수용성B. subtilisPL2306을 형질전환했다. 형질전환된 세포를 LBPG-10㎍/ml 가나마이신 플레이트 위에 두었다. 37℃에서 18시간인큐베이션한 후, 몇개 클론을 신선한 아가 플레이트상에서 재-획선하고, 또한 10㎍/ml 가나마이신을 갖는 액체 TY 배양물중에서 성장시키고, 37℃에서 하룻밤 인큐베이션했다. 다음날, 세포 1ml를 사용하여,B.subtilis에 대한 제조자의 추천에 따라 Qiaprep 스핀 플라스미드 미니프렙 키트 #27106을 사용하여 세포로부터 플라스미드를 분리했다. 이 플라스미드 DNA를 DNA 서열화의 템플레이트로서 사용했다.

본 발명의 엔도-베타-1,4-글루카나제를 함유하는 한 클론을 취하여, 이 클론을 MB905로 표시했다.

MB905로부터의 플라스미드를 발현 시험을 위해B. licheniformisATCC 14580의 유도체에 도입했다. 이 균주를 MB924로 명명했다. 클론된 DNA 서열이 300rpm에서 5일간 37℃에서 BP-X 배지중에서 세포를 발효시킴으로써 발현되었다. 상청액에 나타난 엔도글루카나제 단백질은 SEQ ID NO:2의 성숙한 단백질에 상응했으며, 즉 SEQ ID NO:2의 위치 26 내지 646에 있는 아미노산에 상응하는 단백질 서열을 포함했다.

실시예 2

Bacillus licheniformis 로부터 엔도-베타-1,4-글루카나제의 정제 및 특성화

정제

실시예 1에 설명된 바와 같이 얻어진 MB924를 300rpm 37℃에서 5일간 500ml 2 격벽 쉐이크 플라스크에서 10㎍/ml 가나마이신을 갖는 15 x 200ml BPX 배지중에 성장시켰고, 이로써 배양 육즙 2500ml를 얻었다. 이 배양 유체를 아세트산을 사용하여 pH 7.5로 조정된 이온수 1 부피로 희석했다. 다음에, 응집을 위해 양이온제(C521 10%) 112.5ml 및 음이온제(A130 0.1%) 225ml를 교반 동안 가했다. 응집된 물질을 6℃에서 30분간 10000rpm에서 Sorval RC 3B 원심분리기를 사용하여 원심분리함으로써 분리했다. 결과의 상청액은 5000ml의 총부피중에 ml 당 120 CMC 유니트를 함유했다.

상청액을 Whatman 유리 필터 GF/D 및 C를 사용하여 정화하고, 마지막으로 컷오프가 10kDa인 필트론 UF 멤브레인상에서 농축했다. 총부피 1750ml를 pH 8.0으로 조정했다.

고도로 정제된 엔도글루카나제를 얻기 위하여, Q-세파로스 음이온-교환 크로마토그래피를 사용한 최종 단계를 수행했다. 용액 1750ml를 50mmol 트리스 pH 8.0의 완충액으로 평형화된 800ml 칼럼 함유 Q-세파로스(Pharmacia)에 적용했다. 엔도글루카나제가 결합했고, 0.5M NaCl 구배를 사용하여 용출했다. 95% 이상의 엔도글루카나제를 농축했다.

특성화

순수한 효소는 67kDa의 SDS-PAGE 단일 띠 및 5.6 근처의 등전점을 제공했다.

단백질 농도를 몰흡광계수 171640(서열로부터 추론된 아미노산 조성물에 기초한)을 사용하여 측정했다. pH 활성 프로파일은 60℃에서 pH 6.0과 9.2 사이에서 50% 이상의 상대 활성을 나타냈다. 최적 온도는 pH 7.5에서 65℃였다. DSC는 pH 6.2에서 77℃에서 용융을 나타냈다.

순수한 엔도글루카나제의 N-말단 측정: EYPHNYALLQK

순수한 엔도글루카나제는 글루코실 가수분해효소의 패밀리 9에 속하고 SEQID NO:2의 약 위치 26에서 약 위치 485까지의 아미노산 서열에 상응하는 촉매 도메인 및 촉매 도메인에 연결되고 SEQ ID NO:2의 약 위치 486에서 위치 644까지의 아미노산 서열로 표시되는 셀룰라제 결합 도메인(CBD)을 포함한다. CBD는 패밀리 3b에 속한다.

면역학적 특성:

덴마크 회사 DAKO에서, 토끼 다중클론 단일특이적 혈청을 종래의 기법을 사용하여 고도로 정제된 엔도-베타-1,4-글루카나제에 대해 생기게 했다. 혈청은 본 발명의 엔도글루카나제와 함께 아가로스 겔에서 좋은 단일 침전을 형성했다.

(참고문헌)

Claims

(a) SEQ ID NO:1의 위치 76 내지 1455의 DNA 서열에 의해 코드화되는 폴리펩티드;

(b) DNA 서열이 발현되는 조건하에 SEQ ID NO:1의 서열을 포함하는 세포를 배양함에 의해 생성되는 폴리펩티드;

(c) 동일성이 GAP 생성 패널티 3.0 및 GAP 확장 패널티 0.1을 사용하여 GCG 프로그램 패키지에 제공된 GAP에 의해 측정될 때, SEQ ID NO:2의 위치 26 내지 485의 아미노산 서열로부터 유도된 아미노산 서열을 포함하는 SEQ ID NO:2 폴리펩티드의 위치 26 내지 485에 적어도 75% 동일한 서열을 갖는 엔도-β-1,4-글루카나제 효소; 및

(d) 대장균 DSM 12805의 플라스미드로부터 얻을 수 있는 DNA 서열의 일부를 코드화하는 엔도글루카나제에 의해 코드화되는 폴리펩티드

중 하나로부터 선택되는 엔도-β-1,4-글루카나제 활성(EC 3.2.1.4)을 나타내는 효소.
제 1 항에 있어서, 글리코실 가수분해효소의 패밀리 9에 속하는 것을 특징으로 하는 효소.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,Bacillus licheniformisATCC 14580에 내인성인 폴리펩티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 효소.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 4 내지 11, 바람직하게는 5.5 내지 10.5 범위의 pH에서 활성인 것을 특징으로 하는 효소.
제 1 항에 있어서,

(a) SEQ ID NO:2의 위치 26 내지 646에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드; 또는

(b) 이 폴리펩티드와 적어도 75% 상동성인 폴리펩티드의 유사체

인 것을 특징으로 하는 효소.
(a) SEQ ID NO:1의 뉴클레오티드 76에서 뉴클레오티드 1455까지에 나타낸 바와 같은 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 분자;

(b) (a)의 종 상동체;

(c) SEQ ID NO:2의 아미노산 잔기 26에서 아미노산 잔기 485까지의 아미노산 서열에 적어도 75% 동일한 폴리펩티드를 코드화하는 폴리뉴클레오티드 분자;

(d) (a), (b), 또는 (c)에 상보성인 분자; 및

(e) (a) 또는 (b)의 축퇴성 뉴클레오티드 서열

로 구성되는 군으로부터 선택된 엔도-베타-1,4-엔도글루카나제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드화하는 분리된 폴리뉴클레오티드 분자.
제 6 항에 있어서,

(a) SEQ ID NO:1의 뉴클레오티드 76에서 뉴클레오티드 1941까지에 나타낸 바와 같은 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 분자;

(b) (a)의 종 상동체;

(c) SEQ ID NO:2의 아미노산 잔기 26에서 아미노산 잔기 646까지의 아미노산 서열에 적어도 75% 동일한 폴리펩티드를 코드화하는 폴리뉴클레오티드 분자;

(d) (a), (b), 또는 (c)에 상보성인 분자; 및

(e) (a) 또는 (b)의 축퇴성 뉴클레오티드 서열

로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드 분자.
제 6 항 또는 제 7 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 DNA인 것을 특징으로 하는 분리된 폴리뉴클레오티드 분자.
중간 긴축 조건하에 변성된 이중-스트랜드 DNA 프로브에 혼성화하며, 여기에서 프로브가 SEQ ID NO:1의 위치 76 내지 1455에 나타낸 서열을 포함하는 DNA 프로브 및 적어도 약 100 염기쌍의 길이를 갖는 SEQ ID NO:1의 위치 76 내지 1455의 하위서열을 포함하는 DNA 프로브로 구성된 군으로부터 선택되는, 엔도-베타-1,4-글루카나제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드화하는 분리된 폴리뉴클레오티드 분자.
제 6 항에 있어서, 원핵생물, 바람직하게는 박테리아, 더 바람직하게는 그램 양성 박테리아로부터의 DNA 라이브러리로부터 분리되거나, 또는 이 DNA 라이브러리를 기초로 하여 생성되는 것을 특징으로 하는 분리된 폴리뉴클레오티드 분자.
제 10 항에 있어서,Bacillus속에 속하는 균주, 특히Bacillus lichenifor-mis, 특히Bacillus licheniformisATCC 14580의 균주로부터의 DNA 라이브러리로부터 분리되거나, 또는 이 DNA 라이브러리를 기초로 하여 생성되는 것을 특징으로 하는 분리된 폴리뉴클레오티드 분자.
제 6 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 대장균 DSM 12805로부터 분리되는 것을 특징으로 하는 분리된 폴리뉴클레오티드 분자.
다음의 작동가능하게 연결된 요소인 전사 프로모터; (a) SEQ ID NO:1의 뉴클레오티드 76에서 뉴클레오티드 1455까지에 나타낸 바와 같은 뉴클레오티드 서열을 포함하는 엔도-베타-1,4-글루카나제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드화하는 폴리뉴클레오티드 분자, (b) SEQ ID NO:2의 아미노산 잔기 26에서 아미노산 잔기 485까지의 아미노산 서열에 적어도 75% 동일한 엔도-베타-1,4-글루카나제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드화하는 폴리뉴클레오티드 분자, 및 (c) (a) 또는 (b)의 축퇴성 뉴클레오티드 서열로 구성되는 군으로부터 선택된 DNA 세그먼트; 및 전사 터미네이터를 포함하는 발현 벡터.
제 13 항에 따르는 발현 벡터가 도입되며, DNA 세그먼트에 의해 코드화되는 폴리펩티드를 발현하는 배양 세포.
제 14 항에 있어서, 원핵 세포, 특히 박테리아 세포, 또는 엔도-베타-1,4-글루카나제 활성을 나타내는 폴리펩티드를 코드화하는 DNA 세그먼트가 기원하는 내인성 세포인 것을 특징으로 하는 세포.
제 15 항에 있어서,Bacillus의 균주, 바람직하게는Bacillus subtilis또는Bacillus lentus의 균주에 속하는 것을 특징으로 하는 세포.
제 15 항에 있어서,Bacillus licheniformis, 바람직하게는Bacillus liche-niformisATCC 14580의 균주에 속하는 것을 특징으로 하는 세포.
제 15 항에 있어서,Pseudomonas의 균주, 바람직하게는Pseudomonas fluore-scens또는Pseudomonas mendocina의 균주에 속하는 것을 특징으로 하는 세포.
제 14 항에 있어서,Streptomyces의 균주에 속하는 것을 특징으로 하는 세포.
제 14 항에 있어서,Saccharomyces의 균주, 바람직하게는Saccharomyces ce-revisiae의 균주에 속하는 것을 특징으로 하는 세포.
제 13 항에 따르는 발현 벡터가 도입되고, 이로써 DNA 세그먼트에 의해 코드화되는 폴리펩티드를 발현하는 세포를 배양하는 단계; 및 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하는, 엔도-베타-1,4-글루카나제 활성을 갖는 폴리펩티드의 제조 방법.
제 1 항에 따르는 효소를 포함하는 효소 조성물.
제 22 항에 있어서, 프로테아제, 셀룰라제(엔도글루카나제), β-글루카나제, 헤미셀룰라제, 리파제, 퍼옥시다제, 락카제, α-아밀라제, 글루코아밀라제, 큐티나제, 펙티나제, 환원효소, 산화효소, 페놀산화효소, 리그니나제, 풀룰라나제, 펙테이트 리아제, 크실로글루카나제, 크실라나제, 펙틴 아세틸 에스터라제, 폴리갈락투로나제, 람노갈락투로나제, 펙틴 리아제, 다른 만난나제, 펙틴 메틸에스터라제, 셀로비오가수분해효소, 트랜스글루타미나제; 또는 그것들의 혼합물로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 효소를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
(i) 상동성 불순물을 함유하지 않고, (ii) 제 21 항에 따르는 방법에 의해 제조되는 엔도-베타-1,4-글루카나제 활성을 갖는 분리된 효소.
균주 대장균 DSM 12805의 분리된 실질적으로 순수한 생물학적 배양물.
생체물질이 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항 및 제 24 항에 따르는 효소 또는 제 22 항 또는 제 23 항에 따르는 효소 조성물의 유효량으로 처리되는, 셀룰로스-함유 생체물질의 분해 방법.