CN103436456A

CN103436456A - 表达9家族糖苷水解酶基因CtAA9a的毕赤酵母工程菌株

Info

Publication number: CN103436456A
Application number: CN201310423134XA
Authority: CN
Inventors: 李多川; 韩超
Original assignee: Shandong Agricultural University
Current assignee: Shandong Agricultural University
Priority date: 2013-09-17
Filing date: 2013-09-17
Publication date: 2013-12-11

Abstract

本发明是一种表达嗜热毛壳菌Chaetomium thermophilum热稳定热稳定9家族糖苷水解酶基因CtAA9a的毕赤酵母工程菌Pichia pastoris GS-CT-9A。通过RT-PCR方法从嗜热毛壳菌Chaetomium thermophilum获得糖苷水解酶基因CtAA9a，将其克隆并插入到毕赤酵母整合表达载体pPIC9K中，然后将得到的糖苷水解酶基因CtAA9a表达载体pPIC9K/CtAA9a导入到毕赤酵母GS115中，再从中筛选出一种表达糖苷水解酶基因CtAA9a的酵母工程菌GS-CT-9A。该工程菌表达的糖苷水解酶CtAA9A对内切纤维素酶的活性具有明显的促进作用，混合酶比原始内切酶N24的降解纤维素的活性提高1.3倍。在Mn²⁺条件下，CtAA9A和CtAA9A+N24的纤维素酶活性可分别提高14倍和2.4倍。CtAA9A具有良好的热稳定性和提高纤维素酶活力的能力，可广泛用于纤维废料及其它工业领域，具有重大经济价值和社会价值。

Description

表达9家族糖苷水解酶基因CtAA9a的毕赤酵母工程菌株

（一）技术领域

本发明涉及生物工程，具体地说是一种表达具体地说是以嗜热毛壳菌Chaetomium thermophilum9家族糖苷水解酶基因CtAA9a的毕赤酵母工程菌株Pichia pastoris GS-CT-9A。

（二）背景技术

糖苷水解酶（英语：Glycoside hydrolases，又称糖苷酶）是一种专门水解配糖键（glycosidic bond），并产生两个较小的糖分子的酵素，也是自然界中的常见酵素之一。这类蛋白质在人类的产业上也有所应用，例如用来将纤维素与半纤维素等生物质能降解成可用的小分子。糖苷水解酶具有多个家族。

嗜热毛壳菌Chaetomium thermophilum是一种广泛分布于土壤中的嗜热真菌。该菌在微晶纤维素为唯一碳源的培养基中50℃条件下可以产生热稳定的纤维素酶和9家族糖苷水解酶。

嗜热毛壳菌产生的9家族糖苷水解酶CtAA9A具有微弱的纤维素酶活性，但对该菌株产生的内切纤维素酶N24的酶活性具有明显的促进作用,可使其活性提高1.3倍。在不同金属离子如Mn²⁺的作用下，CtAA9A和CtAA9A+N24的活性可分别提高14倍和2.4倍。

（三）发明内容

本发明从嗜热毛壳菌Chaetomium thermophilum获得内切β-1,4-葡聚糖酶基因的cDNA序列全长，命名为CtAA9a，CtAA9a基因DNA全长1053bp，包括信号肽序列，起始密码子和终止密码子，无内含子，编码328个氨基酸。具有信号肽序列（1-22aa MPSFVSKTLISALAGAASVAAH）及一个N糖基化位点和30个O糖基化位点。将CtAA9a编码的氨基酸序列在国际基因库中进行检索，发现属于糖苷水解酶第9家族。

构建重组表达质粒载体pPIC9K/CtAA9a，利用电转仪进行电击转化Pichia pastoris GS115，在MD和MM培养基上筛选，经PCR鉴定筛选阳性转化子，G418筛选多拷贝转化子，然后进行甲醇诱导表达，获得毕赤酵母工程菌株GS-CT-9A。该工程菌株接种于含BMGY培养基中，在28℃200rpm/min摇床培养6d后，糖苷水解酶的表达量为3.26mg/ml，分子量为65KDa，酶活力为0.0437U/ml，9A在65℃下是稳定的，处理60min后仍有95%以上的酶活性；70℃处理30min后仍保持77%的活性；80℃处理30min后保持26%的活性；90℃处理30min活性几乎完全丧失。

9家族糖苷水解酶CtAA9A对嗜热毛壳菌Chaetomium thermophilum内切纤维素酶N24的酶活性具有明显的促进作用，混合酶比原始酶N24的降解纤维素的能力提高1.3倍。不同金属离子对CtAA9A和CtAA9A+N24混合酶活性具有促进或抑制作用，其中在Mn²⁺条件下，CtAA9A和CtAA9A+N24的纤维素酶活性可分别提高32倍和2.4倍。

（四）附图说明：

图19家族糖苷水解酶CtAA9A的SDS-PAGE分析

泳道1：低分子量蛋白标准

泳道2：纯化的9家族糖苷水解酶CtAA9A

图2A:9家族糖苷水解酶CtAA9A的最适温度B:9家族糖苷水解酶CtAA9A的热稳定性测定

图39家族糖苷水解酶CtAA9A对内切纤维素酶N24活性的促进作用

图4金属离子Mn²⁺对CtAA9A纤维素酶及混合酶活性的影响

（五）具体实施方式

实施例1：嗜热毛壳菌Chaetomium thermophilum的分离鉴定

（1）标本采集：从堆肥中采集。

（2）分离培养：将采集标本取0.5克放置在PDA平板上50℃培养3天后，进行分离纯化。操作步骤参考Cooney and Emerson(1964)文献。

（3）鉴定:参考Cooney and Emerson(1964)和LaTouche(1950)文献。

实施例2：糖苷水解酶基因CtAA9a的克隆

（1）嗜热毛壳菌Chaetomium thermophilum总RNA的提取：参照Trizol试剂盒说明。

（2）cDNA第一条链的合成：按照Takara公司的TaKaRa RNA PCR kit(AMV)Ver3.0试剂盒说明书进行：取1～2μg总RNA，加RNase Free ddH₂O至9.5μL，将RNA样品在75℃变性5min，立即在冰浴中冷却5min，然后稍微离心一下，在冰浴中依次加入以下各种成分：10mmol/L dNTP Mixture2μL，10×RT Buffer(Mg²⁺)2μL，25mmol/L MgCl₂4μL，Oligo d(T)-Adaptor Primer1μL，RNase Inhibiter0.5μL，AMV Reverse Transcriptase1μL（Final Volume20μL），将反应液混合后，室温下放10min，然后42℃温育60min，再煮沸5min以灭活反转录酶。加入180μL DEPC处理的ddH₂O，稀释至200μL，混匀，稍微离心，保存于-20℃，备用。

（3）PCR反应（25μL）：cDNA2μL,10×Buffer2.5μL,10mmol/L dNTP2μL,25mmol/LMgCl22μL，上、下游引物各2μL，Taq DNA聚合酶0.5μL(5U/μL),ddH2O12μL。反应条件为94℃5min预变性；94℃40s，56℃40s，72℃1min,共32个循环，72℃延伸10min，4℃保存。

上游引物：5’-ATGCCTTCATTCGTTTCGAAG-3’

下游引物：5’-TTAGTGGGCAGCAAGGTCAC-3’

（4）基因克隆：取0.5μl PCR产物与pMD18-T载体进行连接，操作步骤按照TAKARA公司产品说明书进行。然后连接产物转化大肠杆菌DH5α菌株，在表面涂有氨卞青霉素(100μg/mL)的LB平板上生长过夜。挑取白色菌落，在LB液体培养基中培养过夜。

（5）质粒DNA的提取：碱法提取质粒DNA。

（6）序列测定：DNA双脱氧法测定核苷酸序列，在上海生物工程有限公司进行。序列引物为M13启动子引物。嗜热毛壳菌CtAA9a基因cDNA全长1053bp，包含起始密码子和终止密码子，无内含子，编码328个氨基酸。将此氨基酸序列在国际基因库中进行检索，发现属于糖苷水解酶第9家族。该序列如下：

(A)SEQ ID NO1的信息

（a）序列特征：*长度：1053碱基对；*类型：核酸；*链型：双链；*拓扑结构：线性

（b）分子类型：DNA

（c）假设：否

（d）反义：否

（e）最初来源：嗜热毛壳菌Chaetomium thermophilum

（f）序列描述：

（B）SEQ ID NO2的信息

（a）序列特征：*长度：328氨基酸；*类型：氨基酸；*链型：单链；*拓扑结构：线性

（b）分子类型：蛋白质

（c）序列描述：

实施方式3：表达载体的构建

（1）根据分离出的CtAA9a基因的核苷酸序列设计表达引物，在引物的5’端分别引入Ecor I和NotⅠ酶切位点,下游引物引入6个组氨酸序列，作为纯化标签：

上游引物：5’-CCGGAATTCCACCACCACCACCACCACGGCCACGTCAAGAAT-3’(Ecor I)；下游引物：5’-TTGCGGCCGCTTAGTGGGCAGCAAGGTC-3’(NotⅠ)（组氨酸序列）

(2)嗜热毛壳菌总RNA的提取:利用Trizol试剂提取。

（3）反转录合成cDNA第一条链：取2μg总RNA，加入5×反应缓冲液4μL，10mM dNTP2μL，核糖核酸酶抑制剂（40－200u/μL）0.5μL，引物oligodT(1μg/μL)1μL，反转录酶（10u/μL）2μL，42℃反应60min，然后85℃10min终止反应，稀释至200μL。

（4）PCR反应（25μL）：cDNA2μL,10×Buffer2.5μL,10mmol/L dNTP2μL,25mmol/LMgCl₂2μL，上、下游引物各2μL，Taq DNA聚合酶0.5μL(5U/μL),ddH₂O12μL。反应条件为94℃5min预变性；94℃40s，56℃40s，72℃1min,共32个循环，72℃延伸10min，4℃保存。

（5）基因克隆：取2μL PCR产物与pMD18－T载体进行连接，获得重组质粒pMD18T/CtAA9a操作步骤按TAKARA公司产品说明书进行。然后连接产物转化大肠杆菌DH5α，在涂有AMP的LB平板上生长过夜。挑取白色菌落，在LB液体培养基中培养过夜。

（6）质粒DNA提取：碱法提取质粒DNA。

（7）用Ecor I和Not Ⅰ对重组质粒pMD18-T/CtAA9a产物进行双酶切，同时用Ecor I和Not Ⅰ双酶切酵母表达质粒pPIC9K，DNA胶回收试剂盒回收纯化9a基因及载体pPIC9K片断。然后进行体外连接，获得重组质粒pPIC9K/CtAA9a,重组质粒转化大肠杆菌JM109，在含Amp的LB转化平板上挑选单菌落，提取质粒DNA，进行PCR和酶切鉴定，测序确认重组质粒的读码框正确。

实施例4.表达糖苷水解酶基因CtAA9a的酵母工程菌株的构建及筛选

（1）重组表达质粒的线性化:将重组表达质粒pPIC9K/CtAA9a用限制性内切酶Sac Ⅰ线性化。

（2）转化：电击转化酵母菌株Pichia pastoris GS115酵母感受态细胞，转化方法参见Invitrogen公司毕赤酵母操作手册。

（3）筛选：用灭菌牙签挑取转化子对应点种在MM和MD平板上，30℃培养2－4d,挑取在MD/MM平板上均生长良好的转化子为阳性转化子。挑取阳性转化子分别点种于250μg/mL、300μg/mL、400μg/mL、500μg/mL、600μg/mLG418的YPD平板上筛选多拷贝转化子。

实施方式5：毕赤酵母Pichia pastoris GS115的诱导表达和活性检测

（1）将阳性转化子接种于含25mL BMGY培养基中，30℃250rpm/min摇床培养24h（OD₆₀₀达2－6），离心收集菌体，将细胞重悬于适当体积的BMMY培养基中，至OD₆₀₀值为1.0，30℃250rpm/min继续培养，每24h补充甲醇至终浓度为0.5%，每24h取样，室温10，000g离心5min，取上清进行SDS-PAGE分析。

（2）酶活性检测：酶活性测定采用DNS法，反应体系及反应条件为100μL的酶液，加入200μL的0.5%微晶纤维素，100μL的醋酸缓冲液（0.4mol/L、pH5.0）60℃反应30min，加入400μL DNS试剂，煮沸10min，在540nm波长下测定光吸收值。对照组用失活的酶液做对照。以失活酶液的活性定义为100%，测定糖苷水解酶CtAA9A的相对酶活性。重复三次，取平均值。蛋白含量测定采用Bradford法。

（3）重组糖苷水解酶CtAA9A的最适反应温度、pH及热稳定性：诱导表达的重组糖苷水解酶经过GE公司的HisTrap FF crude金属配体亲和层析柱纯化带有组氨酸标记的重组蛋白质，获得电泳均一的纯化蛋白，用纯化的重组糖苷水解酶测定其性质。在不同温度和pH条件下分别测定重组糖苷水解酶的对纤维素的酶活力，将最高的酶活力定义为100％，分别计算不同温度条件下糖苷水解酶的相对酶活性；将重组糖苷水解酶在不同的温度下保温30min，检测剩余酶活力。重复三次，取平均值。

实施方式6：9家族糖苷水解酶对内切纤维素酶N24活性的促进作用及不同金属离子对其活性的影响

（1）糖苷水解酶对内切纤维素酶N24活性的促进作用

采用DNS法，分别测定CtAA9A、N24及混合酶在N24最适反应条件下的内切纤维素酶活性，混合酶为CtAA9A和N24等体积混合，反应体系为：CtAA9A50μL，N2450μL，200μL的0.5%CMC-Na，100μL的醋酸缓冲液（0.4mol/L、pH5.0）50℃反应30min，加入400μL DNS试剂，煮沸10min，在540nm波长下测定光吸收值。以不加糖苷水解酶CtAA9A的反应体系中的酶活性定义为100%，分别计算糖苷水解酶CtAA9A、内切纤维素酶N24以及混合酶的相对酶活性。重复三次，取平均值。

（2）金属离子Mn²⁺对糖苷水解酶CtAA9A纤维素酶活性的影响

在反应体系中加入不同的金属离子，使其终浓度为1mmol/L，在糖苷水解酶CtAA9A最适反应条件下测定其内切纤维素酶活性，不加金属离子反应体系中的酶活性定义为100%，计算不同金属离子条件下糖苷水解酶CtAA9A的相对酶活性。重复三次，取平均值。

（3）金属离子Mn²⁺对混合酶活性的影响

在反应体系中加入不同的金属离子，使其终浓度为1mmol/L，在内切纤维素酶N24最适反应条件下测定混合酶的内切纤维素酶活性，不加金属离子反应体系中的酶活性定义为100%，计算不同金属离子条件下混合酶的相对酶活性。重复三次，取平均值。

实施方式7：表达CtAA9a基因的毕赤酵母工程菌株GS-CT-9A的保藏

表达CtAA9a基因的毕赤酵母工程菌株GS-CT-9A的保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）；地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2013年7月19日；酵母工程菌株编号为： CGMCC No.7946；毕赤酵母工程菌株的分类命名为：巴氏毕赤酵母Pichia pastoris。

Claims

1.一种表达嗜热毛壳菌Chaetomium thermophilum9家族糖苷水解酶基因CtAA9a的酵母工程菌株，其特征在于该菌为一种毕赤酵母，通过RT-PCR方法从嗜热毛壳菌Chaetomium thermophilum获得热稳定9家族糖苷水解酶基因CtAA9a,将该基因克隆到毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K,获得表达重组质粒pPIC9K/CtAA9a,转化毕赤酵母GS115,从中筛选出表达热稳定糖苷水解酶基因CtAA9a的毕赤酵母工程菌株GS-CT-9A，该糖苷水解酶CtAA9A对内切纤维素酶的活性具有明显的促进作用。