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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Enzym, welches Endo-β-1,4-Glucanase-Aktivität besitzt,
dies Enzym gehört
zur Familie 9 der Glycosylhydrolasen und ist mindestens 75% homolog
zu einer Bacillus licheniformis-Familie 9 Endo-β-1,4-Glucanase, ein isoliertes
Polynukleotidmolekül
kodierend für
solch eine Endo-β-1,4-Glucanase,
und die Verwendung des Enzyms in den Detergens-, Papier- und Pulpe-, Ölbohrungs-, Ölextraktions-,
Wein- und Saft-, Lebensmittelinhaltsstoffe-, Tierfutter- oder Textilindustrien.
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HINTERGRUND
DER ERFINDUNG
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Cellulose
ist ein Polymer von Glucose, welche durch β-1,4-glycosidische Bindungen
verbunden ist. Die Celluloseketten bilden zahlreiche intra- und
intermolekulare Wasserstoffrückenbindungen,
was zu der Bildung von unlöslichen
Cellulosemikrofibrillen führt.
Die mikrobielle Hydrolyse von Cellulose zu Glucose schließt die folgenden
drei Hauptklassen von Cellulasen ein: (i) Endoglucanasen (EC 3.2.1.4),
welche zufallsbedingt β-1,4-glycosidische
Verbindungen überall
in Cellulosemolekülen
spalten; (ii) Cellobiohydrolasen (EC 3.2.1.91), welche Cellulose
vom nicht-reduzierenden Ende verdauen, was Cellobiose freisetzt;
und (iii) β-Glucosidasen (EC
3.2.1.21), welche Cellobiose und Cellodextrine mit geringem Molekulargewicht
hydrolysieren, um Glucose freizusetzen.
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Cellulasen
werden von vielen Mikroorganismen hergestellt und treten oft in
mehreren Formen auf. Das Erkennen der wirtschaftlichen Bedeutung
des enzymatischen Abbaus von Cellulose hat eine erhebliche Suche nach
mikrobiellen Cellulasen, welche industriell verwendet werden können, gefördert. Als
ein Ergebnis sind die enzymatischen Eigenschaften und die Primärstrukturen
einer großen
Anzahl von Cellulasen erforscht worden. Auf der Basis der Ergebnisse
einer hydrophoben Clusteranalyse der Aminosäuresequenz der katalytischen Domäne sind
diese Cellulasen in unterschiedliche Familien von Glycosylhydrolasen
eingeordnet worden; Pilz- und bakterielle Glycosylhydrolasen sind
in 35 Familien eingeteilt worden (Henrissat et al. (1991), (1993)).
Die meisten Cellulasen bestehen aus einer Cellulosebindedomäne (CBD)
und einer katalytischen Domäne
(CAD, catalytic domain), getrennt durch einen Linker, welcher reich
an Prolin- und Hydroxyaminoresten sein kann. Eine andere Klassifikation
von Cellulasen wurde begründet
auf der Basis der Ähnlichkeit
ihrer CBDs (Gikes et al. (1991)), was fünf Familien von Glycoxylhydrolasen
ergab (I–V).
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Cellulasen
werden durch eine große
Anzahl von Mikroorganismen synthetisiert, welche Pilze, Actinomyceten,
Myxobakterien und echte Bakterien einschließen, aber auch durch Pflanzen.
Insbesondere sind Endo-β-1,4-Glucanasen
einer Vielzahl an Spezifitäten
identifiziert worden. Es sind viele bakterielle Endoglucanasen beschrieben
worden (Henrissat (1993); Gilbert et al. (1993)).
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Eine
wichtige industrielle Verwendung von cellulolytischen Enzymen ist
die Verwendung für
die Behandlung von Papierpulpe, z. B. um die Dränage zu verbessern oder für das Entfernen
von Tinte „Deinking" von Altpapier. Eine
weitere wichtige industrielle Verwendung von cellulolytischen Enzymen
ist die Verwendung bei der Behandlung von cellulosehaltigen Textilien
oder Geweben, z. B. als Inhaltsstoffe in Detergenszusammensetzungen
oder Gewebeweichmacherzusammensetzungen zum Biopolieren (bio-polishing)
von neuem Gewebe (Bekleidungsveredelung) und um ein „stone-washed" Aussehen des Cellulose-enthaltenden
Gewebes zu erreichen, insbesondere bei Jeansstoff, und für eine solche
Behandlung sind verschiedene Verfahren vorgeschlagen worden, z.
B. in GB-A-1 368 599, EP-A-0 307 564 und EP-A-0 435 876, WO 91/17243,
WO 91/10732, WO 91/17244, PCT/DK95/000108 und PCT/DK95/00132.
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Es
besteht ein ständiger
Bedarf an dem Bereitstellen neuer Cellulase-Enzyme oder Enzympräparationen,
welche für
Anwendungen verwendet werden können,
bei denen Cellulaseaktivität,
bevorzugt eine Endo-β-1,4-Glucanase-Aktivität (EC 3.2.1.4)
wünschenswert
ist.
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Das
Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, neue Enzyme und Enzymzusammensetzungen
bereitzustellen, welche eine erhebliche cellulolytische Aktivität unter
leicht sauren bis basischen Bedingungen haben, und eine verbesserte
Leistung bei der Papierpulpeaufbereitung, der Textilbehandlung,
Waschverfahren, Extraktionsverfahren oder in Tierfutter haben, bevorzugt
sind solche neuen, leistungsstarken Endoglucanasen herstellbar oder
hergestellt durch Verwendung rekombinanter Techniken mit hohen Ausbeuten.
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ZUSAMMENFASSUNG
DER ERFINDUNG
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Die
Erfinder haben ein neues Enzym gefunden, welches eine erhebliche
cellulolytische Aktivität
aufweist, d.h. eine Endo-β-1,4-Glucanase
(klassifiziert nach der Enzym-Nomenklatur
als EC 3.2.1.4), dies Enzym ist endogen für Bacillus licheniformis und
gehört
zur Familie 9 der Glycosylhydrolasen, und die Erfinder haben es
geschafft, eine DNA-Sequenz
kodierend für
solch ein Enzym zu klonieren und zu exprimieren.
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Entsprechend
betrifft die vorliegende Erfindung in ihrem ersten Aspekt ein Enzym,
welches Endo-β-1,4-Glucanase-Aktivität (EC 3.2.1.4)
zeigt, welches ausgewählt
ist aus einem von (a) einem Polypeptid, das von der DNA-Sequenz
der Positionen 76 bis 1455 der SEQ ID Nr. 1 kodiert wird; (b) einem
Endo-β-1,4-Glucanase-Enzym
mit einer Sequenz einer Identität
von mindestens 75% mit den Positionen 26–485 des SEQ ID Nr. 2-Polypeptids, umfassend
eine Aminosäuresequenz
abgeleitet von der Aminosäuresequenz
der Positionen 26–485
von SEQ ID Nr. 2, wenn die Identität durch GAP bestimmt wird,
bereitgestellt in dem GCG-Programmpaket, unter Verwendung einer
GAP-Creation Penalty von 3,0 und einer GAP-Extension Penalty von 0,1;
und (c) einem Polypeptid, das durch die Endoglucanase kodiert wird,
die einen Teil der aus dem Plasmid aus Escherichia coli DSM 12805
erhältlichen
DNA-Sequenz kodiert. Das erfindungsgemäße Enzym ist als der Familie
9 der Glycosylhydrolasen angehörig
bestimmt worden, wie definiert durch Henrissat et al.
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In
ihrem zweiten Aspekt betrifft die Erfindung ein isoliertes Polynukleotdimolekül, bevorzugt
ein DNA-Molekül,
kodierend für
die katalytisch aktive Domäne
eines Enzyms, welches Endo-β-1,4-Glucanase-Aktivität zeigt,
wobei das Molekül
ausgewählt
ist aus der Gruppe bestehend aus (a) Polynukleotidmolekülen, umfassend
eine Nukleotidsequenz, wie in der SEQ ID Nr. 1 gezeigt von Nukleotid
76 bis Nukleotid 1455, (b) Polynukleotidmolekülen, die ein Polypeptid kodieren,
das zu mindestens 75% mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID Nr. 2
von Aminosäurerest
26 bis Aminosäurerest
485 identisch ist, und (c) einer degenerierten Nukleotidsequenz
von (a); bevorzugt ein Polynukleotidmolekül, welches in der Lage ist,
unter mittleren Stringenzbedingungen mit einer denaturierten doppelsträngigen DNA-Sonde
zu hybridisieren, wobei die Sonde ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend
aus DNA-Sonden, umfassend die in den Positionen 76–1455 der
SEQ ID Nr. 1 gezeigte Sequenz und DNA-Sonden, umfassend eine Subsequenz
der Positionen 76–1455
der SEQ ID Nr. 1, welche eine Länge
von mindestens ungefähr
100 Basenpaaren aufweist.
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Ein
Plasmid pSJ1678, umfassend eine DNA-Sequenz, kodierend für die Endoglucanase
der Erfindung ist in einen Stamm von Escherichia coli transformiert
worden, welcher durch die Erfinder entsprechend dem Budapester Vertrag über die
internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen
für die
Zwecke von Patentverfahren bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen
und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1B, D-38124 Braunschweig,
Bundesrepublik Deutschland, am 14. Mai 1999 unter der Hinterlegungsnummer
DSM 12805 hinterlegt wurde.
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In
ihrem dritten, vierten und fünften
Aspekt stellt die Erfindung einen Expressionsvektor bereit, umfassend
ein DNA-Segment, welches z. B. ein Polynukleotidmolekül der Erfindung
ist; eine Zelle, umfassend das DNA-Segment oder den Expressionsvektor;
und ein Verfahren zur Herstellung eines Enzyms, welches cellulolytische
Aktivität
zeigt, wobei das Verfahren das Kultivieren der Zelle unter Bedingungen
umfasst, welche die Herstellung des Enzyms und das Zurückgewinnen
des Enzyms aus der Kultur erlauben.
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In
wieder einem anderen Aspekt stellt die Erfindung ein isoliertes
Enzym bereit, welches cellulolytische Aktivität zeigt, gekennzeichnet dadurch,
dass (i) es frei von homologen Verunreinigungen ist, und (ii) das
Enzym durch das vorstehend beschriebene Verfahren hergestellt wird.
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Weiterhin
betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung von solch einem
Enzym oder einer Enzymzubereitung der Erfindung für gewerbliche
Anwendungen, wie zum Beispiel für
die Behandlung von Holzpulpe oder dem Abbau von Biomasse.
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Die
Erfindung betrifft auch eine isolierte, im Wesentlichen reine biologische
Kultur des Escherichia coli-Stamms DSM 12805, welcher die Endoglucanase-kodierende
DNA-Sequenz enthält, kloniert
in das Plasmid pSJ1678, welches in Escherichia coli DSM 12805 vorhanden
ist, der abgeleitet ist von einem Stamm der bakteriellen Spezies
Bacillus licheniformis, oder jeder Mutante dieses E. coli-Stammes.
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Die
Endoglucanase der Erfindung ist vorteilhaft bei einer Vielzahl von
gewerblichen Anwendungen, dadurch dass sie eine hohe spezifische
Aktivität
auf CMC (Endoglucanase) besitzt, und im Gegensatz zu den meisten
anderen Endoglucanasen ist das Enzym der Erfindung in der Lage,
hochkristalline Cellulose abzubauen. Weiterhin hat dieses Enzym
seine optimale Temperatur bei 60°C
und ist voll aktiv zwischen pH 5,5 und 9.5. Entsprechend kann das
erfindungsgemäße Enzym
vorteilhaft für
den Gesamtbiomasse-Abbau
verwendet werden, welcher normalerweise beide, sowohl Cellobiohydrolase(n)
(welche sehr geringe Aktivität
auf CMC besitzt) und Endoglucanase(n), benötigen würde.
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AUSFÜHRLICHE
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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Der
Begriff „Glycosylhydrolasefamilie", wie er hierin verwendet
wird, wurde beschrieben in Henrissat, B. „A classification of glycosyl
hydrolases based of amino-acid sequence similiarities." Biochem. J. 280: 309–316 (1991);
Henrissat, B., Bairoch, A. „New
families in the classification of glycosyl hydrolases based on amino-acid
sequence similarities. Biochem. J. 293: 781–788 (1993); Henrissat, B.,
Bairoch, A. "Updating
the sequence-based classification of glycosyl hydrolases." Biochem. J. 316:
695–696
(1996); und Davies, G., Henrissat, B. "Structures and mechanisms of glycosyl
hydrolases." Structure
3: 853–859
(1995); die insgesamt durch Bezugnahme eingeschlossen sind.
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Der
Begriff "funktionelle
enzymatische Eigenschaften" wie
er hierin verwendet wird, soll physikalische und chemische Eigenschaften
eines Polypeptids, welches eine oder mehrere katalytische Aktivitäten zeigt,
bedeuten. Beispiele von funktionellen enzymatischen Eigenschaften
sind enzymatische Aktivität,
spezifische enzymatische Aktivität,
relative enzymatische Aktivität
gegenüber
der maximalen Aktivität
(gemessen als eine Funktion von entweder pH oder Temperatur), Stabilität (Abbau
von enzymatischer Aktivität über die
Zeit) DSC-Schmelztemperatur, N-terminale Aminosäuresequenz, Molekulargewicht
(üblicherweise
gemessen durch SDS-PAGE), isoelektrischer Punkt (pI).
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Im
vorliegenden Zusammenhang kennzeichnet der Begriff „Expressionsvektor" ein DNA-Molekül, linear
oder zirkulär,
welches ein Segment umfasst, das für das interessierende Polypeptid
kodiert und funktionell mit zusätzlichen
Segmenten verknüpft
ist, welche seine Transkription unterstützen. Solche zusätzlichen
Segmente können
Promotor- und Terminatorsequenzen einschließen und können optional einen oder mehrere
Origins of Replication einschließen, einen oder mehrere selektierbare
Marker, einen Verstärker
(enhancer), ein Polyadenylierungssignal und Ähnliches. Expressionsvektoren
sind generell von Plasmid- oder viraler DNA abgeleitet oder können Elemente
von beiden enthalten. Der Expressionsvektor der Erfindung kann jeder
Expressionsvektor sein, der in geeigneter Weise rekombinanten DNA-Arbeitsverfahren
unterworfen ist, und die Wahl des Vektors wird oft abhängig sein
von der Wirtszelle, in die der Vektor eingebracht werden soll. Daher
kann der Vektor ein autonom replizierender Vektor sein, d.h. ein
Vektor, welcher als eine extrachromosomale Einheit existiert, deren
Replikation unabhängig
ist von der chromosomalen Replikation, z.B. ein Plasmid. Alternativ kann
der Vektor ein Vektor sein, welcher, wenn er in die Wirtszelle eingebracht
wird, in das Wirtszellgenom integriert wird und zusammen mit dem/den
Chromosom(en) repliziert wird, in die er integriert wurde.
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Der
Begriff „rekombinant
exprimiert" oder „rekombinanter
Weise exprimiert",
welcher hierin in Verbindung mit der Expression eines Polypeptids
oder Proteins verwendet wird, wird definiert nach der Standarddefinition
im Stand der Technik. Die rekombinante Expression eines Proteins
wird allgemein durch Verwenden eines Expressionsvektors, wie unmittelbar
vorstehend beschrieben, durchgeführt.
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Der
Begriff „isoliert" bezeichnet, wenn
er auf ein Polynukleotidmolekül
angewendet wird, dass das Polynukleotid aus seinem natürlichen
genetischen Milieu entfernt worden ist und daher frei von anderen
irrelevanten oder ungewünschten
kodierenden Sequenzen ist, und in einer Form vorliegt, welche geeignet
ist zur Verwendung innerhalb genetisch manipulierter Protein-Herstellungssysteme.
Solche isolierten Moleküle
sind diejenigen, die von ihrer natürlichen Umgebung abgetrennt
sind und schließen
cDNA und genomische Klone ein. Isolierte DNA-Moleküle der vorliegenden
Erfindung sind frei von anderen Genen, mit denen sie gewöhnlich assoziiert
sind, können
aber natürlich
vorkommende 5' und
3' untranslatierte
Regionen einschließen,
wie z.B. Promotoren und Terminatoren. Die Identifizierung von assoziierten
Regionen wird für
den Durchschnittsfachmann offensichtlich sein (siehe z.B. Dynan
und Tijan, Nature 315: 774–78,
1985). Der Begriff „ein
isoliertes Polynukleotid" kann
alternativ „ein
kloniertes Polynukleotid" genannt
werden.
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Wenn
er auf ein Protein/Polypeptid angewandt wird, besagt der Begriff „isoliert", dass das Protein
in einem anderem Zustand als in seiner natürlichen Umgebung gefunden wird.
In einer bevorzugten Form ist das isolierte Protein im Wesentlichen
frei von anderen Proteinen, besonders von anderen homologen Proteinen (d.h. „homologen
Verunreinigungen" (siehe
nachstehend)). Es ist bevorzugt, das Protein in einer mehr als 40% reinen
Form bereitzustellen, stärker
bevorzugt in einer mehr als 60% reinen Form.
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Noch
stärker
bevorzugt ist es bevorzugt, das Protein in einer hochreinen Form,
d.h. mehr als 80% rein, stärker
bevorzugt mehr als 95% rein und noch stärker bevorzugt mehr als 99%
rein bereitzustellen, wie durch SDS-PAGE bestimmt.
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Der
Begriff „isoliertes
Protein/Polypeptid" kann
alternativ „gereinigtes
Protein/Polypeptid" genannt
werden.
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Der
Begriff „homologe
Verunreinigungen" meint
jegliche Verunreinigung (z.B. ein anderes Polypeptid als das Polypeptid
der Erfindung), die von der homologen Zelle stammt, aus der das
erfindungsgemäße Polypeptid
ursprünglich
gewonnen wurde.
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Der
Begriff „gewonnen
aus", wie hierin
in Zusammenhang mit einer spezifischen mikrobiologischen Quelle
verwendet, meint, dass das Polynukleotid und/oder Polypeptid durch
die spezifische Quelle produziert wird oder durch eine Zelle in
die ein Gen aus der Quelle eingeführt worden war.
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Der
Begriff „funktionell
verknüpft" bezeichnet im Bezug
auf DNA-Segmente, dass die Segmente so angeordnet sind, dass sie
für ihren
beabsichtigten Zweck zusammen funktionieren, z.B. beginnt die Transkription im
Promotor und schreitet durch das kodierende Segment bis zu dem Terminator
voran.
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Der
Begriff „Polynukleotid" bezeichnet ein einzel-
oder doppelsträngiges
Polymer von Deoxyribonukleotid- oder Ribonukleotidbasen, gelesen
vom 5'- zum 3'-Ende. Polynukleotide
schließen
RNA und DNA ein und können
aus natürlichen
Quellen isoliert, in vitro synthetisiert oder aus einer Kombination
von natürlichen und
synthetischen Molekülen
hergestellt.
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Der
Begriff „Komplemente
der Polynukleotidmoleküle" bezeichnet Polynukleotidmoleküle, die
eine komplementäre
Basensequenz und umgekehrte Orientierung, verglichen mit der Referenzsequenz,
aufweisen. Zum Beispiel ist die Sequenz 5' ATGCACGGG 3' komplementär zu 5' CCCGTGCAT 3'.
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Der
Begriff „degenerierte
Nukleotidsequenz" bezeichnet
eine Sequenz von Nukleotiden, die ein oder mehrere degenerierte
Kodons einschließt
(verglichen mit einem Referenzpolynukleotidmolekül, welches ein Polypeptid kodiert).
Degenerierte Kodons enthalten unterschiedliche Triplets von Nukleotiden,
aber kodieren für
den gleichen Aminosäurenrest
(d.h. GAU- und GAC-Triplets kodieren jeweils Asp).
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Der
Begriff „Promotor" bezeichnet den Teil
eines Gens, welcher DNA-Sequenzen enthält, die das Binden der RNA-Polymerase
und die Initiation der Transkription unterstützen. Promotorsequenzen werden üblicherweise,
aber nicht immer, in den 5' nicht-kodierenden
Regionen von Genen gefunden.
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Der
Begriff „sekretorische
Signalsequenz" bezeichnet
eine DNA-Sequenz, welche für
ein Polypeptid kodiert (ein „sekretorisches
Peptid"), das, als
eine Komponente eines größeren Polypeptids,
das größere Polypeptid
durch einen sekretorischen Stoffwechselweg in einer Zelle führt, in
der es synthetisiert wird. Das größere Peptid wird üblicherweise
gespalten, um das sekretorische Peptid während des Durchgangs durch
den sekretorischen Stoffwechselweg zu entfernen.
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POLYNUKLEOTIDE:
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Innerhalb
bevorzugter Ausführungsformen
der Erfindung wird ein isoliertes Polynukleotid der Erfindung an ähnlich große Regionen
der SEQ ID NR: 1 hybridisieren, oder an eine hierzu komplementäre Sequenz,
unter mindestens mittleren Stringenzbedingungen.
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Insbesondere
werden Polynukleotide der Erfindung an denaturierte doppelsträngige DNA-Sonden hybridisieren,
umfassend entweder die volle Sequenz kodierend für die katalytische Domäne des Enzyms,
diese Sequenz ist in den Positionen 76–1455 von SEQ ID NR: 1 gezeigt,
oder jede Sonde umfassend eine Subsequenz von SEQ ID NR: 1, die
mindestens eine Länge
von 100 Basenpaaren aufweist, unter mindestens mittleren Stringenzbedingungen,
aber bevorzugt bei hohen Stringenzbedingungen, wie im Einzelnen
nachstehend beschrieben. Geeignete experimentelle Bedingungen zum
Bestimmen von Hybridisieren bei mittleren oder hohen Stringenzbedingungen
zwischen einer Nukleotidsonde und einer homologen DNA- oder RNA-Sequenz schließt Voreinweichen
der Filter, welche die zu Hybridisierenden DNA-Fragmente oder RNA
enthalten, in 5 × SSC
(Natriumchlorid/Natriumzitrat (Sodium chloride/sodium citrate) Sambrook
et al. 1989) für
10 min. ein, und Vorhybridisierung der Filter in einer 5 × SSC-Lösung, 5 × Denhardt's-Lösung (Sambrook
et al. 1989), 0,5% SDS und 100 μg/ml
denaturierte, ultraschallbehandelte Lachssperma-DNA (Sambrook et
al. 1989), gefolgt von Hybridisieren in derselben Lösung enthaltend
eine Konzentration von 10 ng/ml einer random-geprimeten (Feinberg,
A. P. and Vogelstein, B. (1983) Anal. Biochem. 132: 6–13), 32P-dCTP-markierten
(spezifische Aktivität
höher als
1 × 109
cpm/μg)
Sonde für
12 Stunden bei ca. 45°C.
Der Filter wird dann zweimal für
30 Minuten in 2 × SSC,
0,5% SDS bei mindestens 60°C
gewaschen (mittlere Stringenz), noch mehr bevorzugt bei mindestens
65°C (mittlere/hohe
Stringenz), noch mehr bevorzugt bei mindestens 70°C (hohe Stringenz)
und noch mehr bevorzugt bei mindestens 75°C (sehr hohe Stringenz).
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Moleküle an die
die Oligonukleotid-Sonde unter diesen Bedingungen hybridisiert,
werden detektiert, in dem ein Röntgenfilm
verwendet wird.
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Wie
vorher erwähnt,
schließen
die isolierten Polynukleotide der vorliegenden Erfindung DNA und
RNA ein. Verfahren für
die Isolierung von DNA und RNA sind im Stand der Technik gut bekannt.
DNA und RNA, welche für
interessierende Gene kodieren, können
in Genbanken oder DNA-Bibliotheken durch Mittel und Verfahren kloniert
werden, die im Stand der Technik bekannt sind.
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Die
Polynukleotide, die für
Polypeptide mit erfindungsgemäßer Endoglucanase-Aktivität kodieren, werden
dann identifiziert und isoliert durch, zum Beispiel, Hybridisierung
oder PCR.
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Die
vorliegende Erfindung stellt weiterhin Counterpart-Polypeptide und
Polynukleotide aus unterschiedlichen bakteriellen Stämmen (Orthologe
oder Paraloge) bereit. Von besonderem Interesse sind dabei Endoglucanase-Polypeptide
aus Gram-positiven, alkalophilen Stämmen, eingeschlossen Bacillus
Spezies.
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Spezies-Homologe
eines Polypeptids mit erfindungsgemäßer Endoglucanase-Aktivität können kloniert
werden, indem Information und Verbindungen, bereitgestellt durch
die vorliegende Erfindung, in Kombination mit konventionellen Klonierungstechniken
verwendet werden. Zum Beispiel kann eine DNA-Sequenz der vorliegenden
Erfindung kloniert werden, indem chromosomale DNA, erhalten aus
einem Zelltyp, der das Protein exprimiert, verwendet wird. Geeignete
Quellen für
DNA können
identifiziert werden durch das Erforschen von Northern Blots mit
Sonden, welche für
die hierin offenbarten Sequenzen designed wurden. Eine Bibliothek
wird dann aus der chromosomalen DNA einer positiven Zelllinie hergestellt.
Eine erfindungsgemäße DNA-Sequenz
kodierend für
ein Polypeptid, welches Endoglucanase-Aktivität aufweist, kann dann durch
eine Vielzahl von Verfahren isoliert werden, wie z.B. durch Erforschen
mit Sonden, designed aus den Sequenzen, welche in der vorliegenden
Beschreibung und den Ansprüchen
offenbart sind oder mit einem oder mehreren Reihen von degenerierten
Sonden, basierend auf die offenbarten Sequenzen. Eine DNA-Sequenz
der Erfindung kann auch kloniert werden, indem die Polymerase-Kettenreaktion
(polymerase chain reaction) oder PCR verwendet wird (Mullis, U.S.
Patent 4,683,202), in dem Primer verwendet werden, welche nach den
hierin offenbarten Sequenzen designed wurden. Innerhalb eines zusätzlichen
Verfahrens kann die DNA-Bibliothek verwendet werden, um Wirtszellen
zu transformieren oder transfizieren, und die Expression der interessierenden DNA
kann mit einem Antikörper
(monoklonal oder polyklonal) gerichtet gegen die Endoglucanase kloniert
aus B. licheniformis, ATCC 14580, welche exprimiert und gereinigt
wurde, wie in Materialien und Methoden und Beispielen 1 und 3 beschrieben,
detektiert werden, oder durch einen Aktivitätstest betreffend ein Polypeptid, welches
Endoglucanase-Aktivität
aufweist.
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Der
für die
Endoglucanase kodierende Teil der DNA-Sequenz, der in das Plasmid
pSJ1678 kloniert wurde, und in Escherichia coli DSM 12805 vorhanden
ist, und/oder eine analoge erfindungsgemäße DNA-Sequenz, kann aus einem
Stamm der bakteriellen Spezies Bacillus licheniformis, bevorzugt
der Stamm ATCC 14580, kloniert werden, welcher das Enzym mit Endoglucanase-Aktivität produziert
oder aus anderen oder verwandten Organismen, wie hierin beschrieben.
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Alternativ
kann die analoge Sequenz auf der Basis von DNA-Sequenzen erhältlich aus
dem Plasmid, welches in Escherichia coli DSM 12805 vorhanden ist
(von dem angenommen wird, dass es identisch mit der angefügten SEQ
ID NR: 1 ist) konstruiert werden, z.B. kann es eine Sub-Sequenz
davon sein, und/oder durch Einfügen
von Nukleotid-Substitutionen, welche nicht zu einer anderen Aminosäuresequenz
der Endoglucanase kodiert durch die DNA-Sequenz führen, aber
welche der Kodon-Verwendung des Wirtsorganismus, der für die Herstellung
des Enzyms vorgesehen ist, entspricht oder durch Einfügen von
Nukleotidsubstitutionen, welche zu einer unterschiedlichen Aminosäuresequenz
führen
(d.h. zu einer Variante des erfindungsgemäßen Enzyms) konstruiert werden.
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Alternativ
kann die DNA, kodierend für
eine Endoglucanase der Erfindung, in Übereinstimmung mit gut bekannten
Arbeitsverfahren in geeigneter Weise aus einer geeigneten Quelle,
so wie jeder der nachfolgend erwähnten
Organismen, durch Verwendung von synthetischen Oligonukleotid-Sonden,
hergestellt auf der Basis der DNA-Sequenz erhältlich von dem Plasmid, welches
in Escherichia coli DSM 12805 vorhanden ist, kloniert werden.
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Wie
man eine erfindungsgemäße Sequenz
verwendet, um andere verwandte Sequenzen zu erhalten: die offenbarte
Sequenzinformation, die hierin in Bezug gebracht wird mit einer
Polynukleotidsequenz kodierend für
eine Endo-β-1,4-Glucanase
der Erfindung, kann als ein Werkzeug verwendet werden, um andere
homologe Endoglucanasen zu identifizieren. Beispielsweise kann Polymerase-Kettenreaktion
(PCR) verwendet werden, um Sequenzen aus einer Vielzahl von mikrobiellen
Quellen zu amplifizieren, welche für andere homologe Mannanasen
kodieren, insbesondere aus unterschiedlichen Bacillus Spezies.
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POLYPEPTIDE:
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Die
Sequenz der Aminosäuren
in Position 26 bis ungefähr
Position 485 von SEQ ID NR: 2 ist eine reife Endoglucanase-Sequenz
der katalytisch aktiven Domäne.
Das Enzym umfasst weiterhin eine Cellulose-Bindedomäne (cellulose
binding domain, CBD), welche mit der katalytisch aktiven Domäne funktionell
verknüpft ist,
und welche durch eine Aminosäuresequenz
entsprechend der von ungefähr
Position 485 bis Position 646 der SEQ ID NR: 2 dargestellt wird.
Die CBD der vorliegenden Endoglucanase gehört zur Familie 3b, vgl. nachstehend.
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Die
vorliegende Erfindung stellt auch Endoglucanase-Polypeptide bereit,
welche im Wesentlichen homolog zu dem Polypeptid von SEQ ID NR:
2 sind. Der Begriff „im
Wesentlichen homolog" wird
hierin verwendet, um Polypeptide zu bezeichnen, die 75%, bevorzugt
mindestens 80%, stärker
bevorzugt mindestens 85% und noch stärker bevorzugt mindestens 90%
Sequenzidentität
zu der Sequenz, welche in Aminosäurenummern
26–485
oder Nummern 26–646
von SEQ ID NR: 2 gezeigt ist, aufweisen. Solche Polypeptide werden stärker bevorzugt
mindestens 95% identisch sein und am stärksten bevorzugt 98% oder mehr
zu der Sequenz identisch sein, die in Aminosäurenummern 26–646 von
SEQ ID NR: 2 gezeigt ist. Der Prozentsatz der Sequenzidentität wird durch
gebräuchliche
Verfahren bestimmt, durch Computerprogramme, welche im Stand der Technik
bekannt sind, wie zum Beispiel GAP, bereitgestellt in dem GCG-Programmpaket
(Program Manual for the Wisconsin Package, Version 8, August 1994,
Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin,
USA 53711) wie offenbart in Needleman, S. B. and Wunsch, C. D.,
(1970), Journal of Molecular Biology, 48, 443–453, welches hierdurch durch
Bezugnahme in seiner Gesamtheit einbezogen wird. GAP wird mit den folgenden
Einstellungen für
den Polypeptidsequenzvergleich verwendet: GAP Creation Penalty von
3,0 und GAP Extension Penalty von 0,1.
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Die
Sequenzidentität
von Polynukleotidmolekülen
wird durch ähnliche
Verfahren bestimmt, die GAP mit den folgenden Einstellungen für den DNA-Sequenzvergleich
verwenden: GAP Creation Penalty von 5,0 und GAP Extension Penalty
von 0,3.
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Im
Wesentlichen homologe Proteine und Polypeptide sind dadurch charakterisiert,
dass sie eine oder mehrere Aminosäuresubstitutionen, -deletionen
oder -additionen aufweisen. Diese Veränderungen sind bevorzugt von
geringer Natur, d.h. konservative Aminosäuresubstitutionen (siehe Tabelle
2) und andere Substitutionen, die nicht signifikant die Faltung
oder Aktivität
des Proteins oder Polypeptids beeinflussen; kleine Deletionen, typischerweise
von einer bis zu 30 Aminosäuren,
und kleine amino- oder carboxyterminale Verlängerungen (extension), wie
zum Beispiel ein aminoterminaler Methioninrest, ein kleines Linkerpeptid
von bis zu 20–25 Resten
oder eine kleine Verlängerung,
die die Aufreinigung beschleunigt (ein Affinity-Tag), wie beispielsweise ein
Poly-Histidin-Trakt, Protein A (Nilsson et al., EMBO J. 4: 1075,
1985; Nilsson et al., Methods Enzymol. 198: 3, 1991. Siehe im Allgemeinen
Ford et al., Protein Expression and Purification 2: 95–107, 1991.
DNAs, die für Affinity-Tags
kodieren, sind durch gewerbliche Anbieter erhältlich (z.B. Pharmacia Biotech,
Piscataway, NJ; New England Biolabs, Beverly, MA).
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Allerdings
können,
obgleich die Veränderungen,
welche vorstehend beschrieben sind bevorzugt von geringer Natur
sind, solche Veränderungen
auch größerer Natur
sein, wie zum Beispiel eine Fusion von großen Polypeptiden von bis zu
300 Aminosäuren
oder mehr, sowohl als amino- oder carboxyterminale Verlängerung an
einem Polypeptid der Erfindung, welches Endoglucanase-Aktivität aufweist.
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Tabelle
1 Konservative
Aminosäuresubstitutionen
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Zusätzlich zu
den 20 Standardaminosäuren
können
nicht-Standardaminosäuren
(wie z.B. 4-Hydroxyprolin, 6-N-Methyl-Lysin, 2-Aminobuttersäure, Isovalin
und a-Methylserin) durch Aminosäurereste
eines erfindungsgemäßen Polypeptids
ersetzt werden. Eine limitierte Anzahl von nicht-konservativen Aminosäuren, Aminosäuren, die
nicht durch den den genetischen Kode kodiert sind, und unnatürlichen
Aminosäuren
können
für Aminosäurereste
ersetzt werden. „Unnatürliche Aminosäuren" sind nach der Proteinsynthese
modifiziert worden und/oder weisen eine chemische Struktur in ihrer/ihren
Seitenkette(n) auf, welche unterschiedlich von der der Standardaminosäuren ist.
Unnatürliche
Aminosäuren
können
chemisch synthetisiert werden oder, bevorzugt, sind handelsüblich erhältlich und
schließen
Pipecolsäure,
Thiazolidin-Carbonsäure,
Dehydroprolin, 3- und 4-Methylprolin und 3,3-Dimethylprolin ein.
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Die
essentiellen Aminosäuren
in den Endoglucanase-Polypeptiden der vorliegenden Erfindung können nach
im Stand der Technik bekannten Arbeitsverfahren identifiziert werden,
wie beispielsweise „site-directed"/ortsgerichtete Mutagenese
oder „alaninscanning" Mutagenese (Cunningham
and Wells, Science 24410: 81–1085,
1989). Bei der letzteren Technik werden Alanin-Einzelmutationen
in jeden Rest des Moleküls
eingeführt
und die resultierenden Mutantenmoleküle werden auf ihre biologische
Aktivität
getestet (d.h. Endoglucanase-Aktivität), um Aminosäurereste
zu identifizieren, welche kritisch für die Aktivität des Moleküls sind.
Siehe auch Hilton et al., J. Biol. Chem. 271: 4699–4708, 1996.
Die aktive Stelle des Enzyms, oder eine andere biologische Interaktion,
kann also durch die physikalische Analyse der Struktur bestimmt
werden, wie durch solche Techniken wie Kernspinnresonanz (nuclear
magnetic resonance), Crystallographie, Elektronen-Diffraktion oder
Photoaffinitätslabelling,
in Verbindung mit der Mutation von mutmaßlichen Kontaktstellen-Aminosäuren, bestimmt.
Siehe zum Beispiel de Vos et al., Science 255: 306–312, 1992;
Smith et al., J. Mol. Biol. 224: 899–904, 1992; Wlodaver et al.,
FEBS Lett. 309: 59–64,
1992. Die Identitäten
von essentiellen Aminosäuren können auch
aus der Analyse von Homologien mit Polypeptiden abgeleitet werden,
welche mit einem Polypeptid der Erfindung in Beziehung stehen. Multiple
Aminosäuresubstitutionen
können
durchgeführt
und getestet werden, indem bekannte Verfahren der Mutagenese-Rekombination und/oder
des Shuffling, verwendet werden, gefolgt durch ein entsprechendes
Screeningverfahren, wie zum Beispiel die durch Reidhaar-Olson und Sauer
offenbarten (Science 241: 53–57,
1988), Bowie und Sauer (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2152–2156, 1989),
WO95/17413, oder WO 95/22625. Kurz, diese Autoren offenbaren Verfahren,
für das
simultane „Randomising" von zwei oder mehr
Positionen in einem Polypeptid, oder für das Rekombination/Shuffling
von unterschiedlichen Mutationen (WO 95/17413, WO 95/22625), gefolgt
durch Selektieren auf ein funktionelles Polypeptid und dann Sequenzieren
der mutagenisierten Polypeptide, um das Spektrum der erlaubten Substitutionen
an jeder Position zu bestimmen. Andere Verfahren, welche verwendet
werden können,
schließen
Phage-Display (z.B. Lowman et al., Biochem. 30: 10832–10837,
1991; Ladner et al., U.S. Patent No. 5,223,409; Huse, WIPO Veröffentlichung
WO 92/06204) und „region-directed" Mutagenese (Derbyshire
et al., Gene 46: 145, 1986; Ner et al., DNA 7: 127, 1988) ein.
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Mutagenese-/Shufflingverfahren
wie vorstehend offenbart können
mit hochdurchsatzautomatisierten Screeningverfahren kombiniert werden,
um die Aktivität
von klonierten mutagenisierten Polypeptiden in Wirtszellen zu detektieren.
Mutegenisierte DNA-Moleküle, welche
für aktive
Polypeptide kodieren, können
aus den Wirtszellen wiedergewonnen und rasch sequenziert werden,
in dem moderne Ausstattung verwendet wird. Diese Verfahren erlauben
die rasche Bestimmung der Wichtigkeit von einzelnen Aminosäureresten
in einem interessierenden Polypeptid und können auf Polypeptide unbekannter
Struktur angewandt werden.
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Durch
Verwenden der Verfahren wie vorstehend diskutiert kann ein Durchschnittsfachmann
eine Vielzahl von Polypeptiden identifizieren und/oder anfertigen,
welche im Wesentlichen homolog zu den Resten 26 bis ungefähr 485 oder
den Resten 26 bis 646 von SEQ ID NR: 2 sind und die Endoglucanase-Aktivität des Wildtypproteins
beibehalten.
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Das
Endoglucanaseenzym der Erfindung kann zusätzlich zu dem Enzymkern, der
die katalytische Domäne
umfasst, auch eine Zellulosebindedomäne (CBD) umfassen, wobei die
Zellulosebindedomäne
und der Enzymkern (die katalytisch aktive Domäne) des Enzyms funktionell
verknüpft
sind. Die Zellulosebindedomäne (CBD)
kann als integraler Bestandteil des kodierten Enzyms vorliegen,
wie vorstehend und in der eingefügten SEQ
ID Nr. 2 beschrieben, oder eine CBD von anderem Ursprung kann in
die Endoglucanase eingeführt
werden, so dass ein Enzym-Hybrid erzeugt wird. In diesem Zusammenhang
ist es beabsichtigt, dass der Begriff „Zellulosebindedomäne" so verstanden wird
wie von Peter Tomme et al. definiert „Cellulose-Binding Domains: Classification
and Properties" in
Enzymatic Degradation of Insoluble Carbohydrates", John N. Saddler und Michael H. Penner
(Hrsg.), ACS Symposium Series, Nr. 618, 1996. Diese Definition klassifiziert
mehr als 120 Zellulosebindedomänen
in 10 Familien (I–X)
und zeigt, dass die CBDs in verschiedenen Enzymen wie Cellulasen, Xylanasen,
Mannanasen, Arabinofuranosidasen, Acetylesterasen und Chitinasen
gefunden werden. CBDs wurden auch in Algen z.B. der Rotalge Porphyra
purpurea als nicht-hydrolytisches Polysaccharid-bindendes Protein
gefunden, siehe Tomme et al., op.cit. Jedoch stammen die meisten
CBDs aus Cellulasen und Xylanasen, CBDs werden an den N- und C-Termini
von Proteinen gefunden oder sie befinden sich im Inneren. Enzymhybride
sind im Stand der Technik bekannt, siehe z.B. WO 90/00609 und WO
95/16782, und können
durch das Transformieren eines DNA-Konstrukts in eine Wirtszelle hergestellt
werden, wobei das DNA-Konstrukt mindestens ein Fragment von DNA
umfasst, die für
die Zellulosebindedomäne
kodiert, welches mit oder ohne einen Linker an eine DNA-Sequenz
ligiert ist, die für
die Endoglucanase kodiert, sowie das Kultivieren der Wirtszelle
um das fusionierte Gen zu exprimieren. Enzymhybride können nach
der folgenden Formel beschrieben werden: CBD-MR-X, wobei
die CBD die N-terminale oder C-terminale Region einer Aminosäuresequenz
ist, die mindestens der Zellulosebindedomäne entspricht; MR ist die mittlere
Region (der Linker) und kann eine Bindung oder eine kurze Verbindungsgruppe
von vorzugsweise etwa 2–100
Kohlenstoffatomen Länge
sein, mehr bevorzugt von 2–40 Kohlenstoffatomen;
oder sie ist vorzugsweise von etwa 2–100 Aminosäuren Länge, mehr bevorzugt von etwa 2–40 Aminosäuren; und
X ist eine N-terminale oder C-terminale Region eines Polypeptids,
die durch die erste oder zweite DNA-Sequenz der Erfindung kodiert
wird.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
umfasst das isolierte Polynukleotidmolekül der Erfindung weiterhin eine
Teil-DNA-Sequenz, die für
eine Zellulosebindedomäne
(CBD) kodiert. Ein Beispiel für
eine solche Teil-DNA-Sequenz ist die Sequenz, die den Nukleotiden
in Positionen 485–1941
von SEQ ID Nr: 1 entspricht oder der für die CBD-kodierende Teil der DNA-Sequenz, die
in das Plasmid pSJ1678, das in Escherichia coli DSM 12805 vorliegt,
kloniert ist. Das isolierte Polynukleotidmolekül der Erfindung kann eine weitere
Teilnukleotidsequenz umfassen, die für eine Linker-Region kodiert,
wobei die Linker-Region funktionell mit der Zellulosebindedomäne (CBD)
und der katalytisch aktiven Domäne
(CAD, catalytically active domain) des Enzyms verknüpft ist,
das von der Nukleotidsequenz kodiert wird, die von dem isolierten
Polynukleotidmolekül
umfasst ist.
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Vorzugsweise
besteht die Linker-Region aus etwa 2 Aminosäureresten bis etwa 120 Aminosäureresten,
vorzugsweise 10–80
Aminosäureresten.
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Immunologische
Kreuzreaktivität
-
Polyklonale
Antikörper,
insbesondere monospezifische polyklonale Antikörper, die zum Bestimmen von
immunologischer Kreuzreaktivität
verwendet werden sollen, können
unter Verwendung eines gereinigten zellulolytischen Enzyms hergestellt
werden. Genauer kann ein Antiserum gegen die Endoglucanase der Erfindung
durch das Immunisieren von Kaninchen (oder anderen Nagetieren) gemäß dem Verfahren
erzeugt werden, dass von N. Axelsen et al. beschrieben ist in: A
Manual of Quantitative Immunoelectrophoresis, Blackwell Scientific
Publications, 1973, Kapitel 23, oder A. Johnstone und R. Thorpe,
Immunochemistry in Practice, Blackwell Scientific Publications,
1982 (genauer S. 27–31).
Gereinigte Immunglobuline können
aus den Antiseren erhalten werden, z.B. durch Salzpräzipitation
((NH4)2SO4) gefolgt von Dialyse und Ionenaustauscherchromatographie,
z.B. auf DEAE-Sephadex. Die immunchemische Charakterisierung von
Proteinen kann entweder durch Ouchterlony Doppeldiffusionsanalyse
(O. Ouchterlony in: Handbook of Experimental Immunology (D. M. Weir,
Hrsg.), Blackwell Scientific Publications, 1967, S. 655–706), ausgeführt werden,
durch gekreuzte Immunoelektrophorese (N. Axelsen et al., supra,
Kapitel 3 und 4), oder durch Rocket Immunoelectrophoresis (N. Axelsen
et al., Kapitel 2).
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Mikrobielle
Quellen
-
Für den Zweck
der vorliegenden Erfindung bedeutet der Begriff „erhalten aus" oder „erhältlich aus" wie er hierin in
Verbindung mit einer spezifischen Quelle verwendet wird, dass das
Enzym durch die spezifische Quelle oder durch eine Zelle, in welche
ein Gen aus der Quelle eingefügt
worden ist, produziert worden ist oder produziert werden kann.
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Es
wird gegenwärtig
erwogen, dass die Cellulase der Erfindung aus einem Gram-positiven
Bakterium erhalten werden kann, das zu der Familie Bacillus gehört, insbesondere
zu einem Stamm von Bacillus licheniformis.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
wird die Cellulase der Erfindung aus dem Stamm Bacillus licheniformis
ATCC 14580 erhalten. Es wird gegenwärtig erwogen, dass eine DNA-Sequenz,
die für
ein Enzym kodiert, das homolog zu dem Enzym der Erfindung ist, aus
anderen Stämmen,
die zu der Gattung Bacillus gehören,
erhalten werden kann.
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Ein
Isolat eines Stammes von Bacillus licheniformis, aus welchem eine
Endo-β-1,4-Glucanase der Erfindung
erhalten werden kann, ist allgemein erhältlich von der American Type
Culture Collection (ATCC) unter der Hinterlegungsnummer ATCC 14580.
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Des
Weiteren ist das Plasmid pSJ1678, das die DNA-Sequenz umfasst, die
für eine
Endeglucanase der Erfindung kodiert, in einen Stamm von Escherichia
coli transformiert und unter der Hinterlegungsnummer DSM 12805 hinterlegt
worden.
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Rekombinante
Expressionsvektoren
-
Ein
rekombinanter Vektor, der ein DNA-Konstrukt, das für das Enzym
der Erfindung kodiert, umfasst, kann irgendein Vektor sein, welcher
in bequemer Weise rekombinanten DNA-Verfahren unterzogen werden kann
und die Wahl des Vektors wird häufig
von der Wirtszelle abhängen,
in welche er eingeführt
werden soll. Daher kann der Vektor ein autonom replizierender Vektor
sein, d.h. ein Vektor, welcher als eine extrachromosomale Einheit
vorliegt, dessen Replikation von der chromosomalen Replikation unabhängig ist,
z.B. ein Plasmid. Alternativ kann der Vektor ein solcher sein, der,
wenn er in eine Wirtszelle eingeführt wird, teilweise oder in
seiner Gesamtheit in das Wirtszellgenom integriert und gemeinsam
mit dem/den Chromosom(en) repliziert, in welche er integriert hat.
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Der
Vektor ist vorzugsweise ein Expressionsvektor in welchem die DNA-Sequenz,
die für
das Enzym der Erfindung kodiert, funktionell mit zusätzlichen
Sequenzabschnitten verknüpft
ist, die für
die Transkription der DNA benötigt
werden. Im Allgemeinen ist der Expressionsvektor von einem Plasmid
oder von viraler DNA abgeleitet oder er kann Elemente von beidem
enthalten. Der Begriff „funktionell
verknüpft" gibt an, dass die Sequenzen
in einer solchen Weise angeordnet sind, dass sie gemeinsam für ihre beabsichtigten
Zwecke zusammenwirken, z.B. die Transkription beginnt in einem Promotor
und schreitet durch die DNA-Sequenz, die für das Enzym kodiert, fort.
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Der
Promotor kann eine beliebige DNA-Sequenz sein, welche transkriptionelle
Aktivität
in der Wirtszelle der Wahl zeigt, und er kann von Genen abgeleitet
sein, die für
Proteine kodieren, die entweder homolog oder heterolog in Bezug
auf die Wirtszelle sind.
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Beispiele
für geeignete
Promotoren zur Verwendung in bakteriellen Wirtszellen schließen den
Promotor des maltogenen Amylasegens von Bacillus stearothermophilus
ein, denjenigen des α-Amylasegens
von Bacillus licheniformis, denjenigen des α-Amylasegens von Bacillus amyloliquefaciens,
denjenigen für
das Gen der alkalischen Phosphatase von Bacillus subtilis, oder
denjenigen des Xylosidasegens von Bacillus pumilus, oder die PR- oder
PL-Promotoren des Phagen Lambda, oder die
Promotoren von E. coli lac, trp oder tac.
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Die
DNA-Sequenz, die für
das Enzym der Erfindung kodiert, kann auch, sofern nötig, funktionell
mit einem geeigneten Terminator verknüpft sein.
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Der
rekombinante Vektor der Erfindung kann weiterhin eine DNA-Sequenz
umfassen, die es dem Vektor ermöglicht,
in der fraglichen Wirtszelle zu replizieren.
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Der
Vektor kann auch einen Selektionsmarker umfassen, z.B. ein Gen,
dessen Produkt einen Defekt in der Wirtszelle komplementiert, oder
ein Gen, das für
eine Resistenz gegen z.B. Antibiotika wie Kanamycin, Chloramphenicol,
Erythromycin, Tetracyclin, Spectinomycin oder ähnliche kodiert, oder für eine Resistenz
gegenüber
Schwermetallen oder Herbiziden.
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Um
ein Enzym der vorliegenden Erfindung in den Sekretionsweg der Wirtszellen
zu leiten, kann eine sekretorische Signalsequenz (auch bekannt als
Leader-Sequenz, Präpro-Sequenz
oder Prä-Sequenz)
in dem rekombinanten Vektor bereitgestellt werden. Die sekretorische
Signalsequenz wird mit der DNA-Sequenz, die für das Enzym kodiert, im richtigen
Leseraster verbunden. Sekretorische Signalsequenzen werden im Allgemeinen
5' von der DNA-Sequenz
positioniert, die für
das Enzym kodiert. Die sekretorische Signalsequenz kann diejenige
sein, die normalerweise mit dem Enzym assoziiert ist, oder sie kann
von einem Gen stammen, das für
ein anderes sekretiertes Protein kodiert.
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Die
Verfahren, die zum Ligieren der DNA-Sequenzen verwendet werden,
die jeweils für
das vorliegende Enzym, den Promotor und optional den Terminator
und/oder die sekretorische Signalsequenz kodieren, oder die Verfahren
zum Zusammensetzen dieser Sequenzen durch geeignete PCR-Amplifikations-Verfahren und
zum Insertieren der Sequenzen in geeignete Vektoren, die die notwendige
Information für
die Replikation oder Integration enthalten, sind den Fachleuten
bekannt (siehe z.B., Sambrook et al., op.cit.).
-
Wirtszellen
-
Das
klonierte DNA-Molekül,
das in die Wirtszelle eingeführt
wird, kann entweder homolog oder heterolog zu dem fraglichen Wirt
sein. Wenn sie homolog zu der Wirtszelle ist, d.h. in der Wirtszelle
in der Natur produziert wird, wird sie typischerweise funktionell
mit einer anderen Promotorsequenz oder gegebenenfalls mit einer
anderen Signalsequenz und/oder Terminatorsequenz verbunden sein
als in ihrer natürlich
Umgebung. Es ist beabsichtigt, dass der Begriff „homolog" eine DNA-Sequenz einschließt, die
für ein
Enzym kodiert, das in dem fraglichen Wirtsorganismus natürlicher
Weise vorkommt. Es ist beabsichtigt, dass der Begriff „heterolog" eine DNA-Sequenz
einschließt,
die nicht natürlicherweise
in der Wirtszelle exprimiert wird. So kann die DNA-Sequenz aus einem
anderen Organismus oder sie kann eine synthetische Sequenz sein.
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Die
Wirtszelle, in welche das klonierte DNA-Molekül oder der rekombinante Vektor
der Erfindung eingeführt
wird, kann jede beliebige Zelle sein, die in der Lage ist, das gewünschte Enzym
zu produzieren und schließt
Bakterien, Hefe, Pilze und höhere
eukaryotische Zellen ein.
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Beispiele
für bakterielle
Wirtszellen, welche bei Kultivierung in der Lage sind, das Enzym
der Erfindung zu produzieren, kann ein Gram-positives Bakterium
sein, wie z.B. ein Stamm von Bacillus, insbesondere Bacillus alkalophilus,
Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus lautus, Bacillus
lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus circulans, Bacillus coagulans,
Bacillus megatherium, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis
und Bacillus thuringiensis, ein Stamm von Lactobacillus, ein Stamm
von Streptococcus, ein Stamm von Streptomyces, insbesondere Streptomyces
lividans und Streptomyces murinus oder die Wirtszelle kann ein Gram-negatives
Bakterium sein, wie zum Beispiel ein Stamm von Escherichia coli.
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Die
Transformation der Bakterien kann durch Protoplastentransformation,
Elektroporation, Konjugation oder durch Verwendung von kompetenten
Zellen in einer Art und Weise bewirkt werden, wie sie als solche bekannt
ist (vgl. z.B. Sambrook et al., oben).
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Bei
Expression des Enzyms in Bakterien wie z.B. Escherichia coli, kann
das Enzym im Zytoplasma zurückgehalten
werden, typischerweise als unlösliche
Granula (bekannt als Einschlusskörperchen „inclusion bodies"), oder das Enzym
kann von einer bakteriellen Sekretionssequenz in den periplasmatischen
Raum geleitet werden. Im ersten Fall werden die Zellen lysiert und
die Granula wiedergewonnen und denaturiert, wonach das Enzym durch
Verdünnen
des Denaturierungs-Mittels zurückgefaltet
wird. Im zweiten Fall wird das Enzym aus dem periplasmatischen Raum
durch Zerstören
der Zellen wiedergewonnen, z.B. durch Ultraschallbehandlung oder
osmotischen Schock, um die Inhalte des periplasmatischen Raums freizusetzen,
und das Enzym wiederzugewinnen.
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Bei
Expression des Enzyms in Gram-positiven Bakterien wie z.B. einem
Stamm von Bacillus oder einem Stamm von Streptomyces, kann das Enzym
im Zytoplasma zurückgehalten
werden oder kann von einer bakteriellen Sekretionssequenz in das
extrazelluläre
Medium geleitet werden.
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Beispiele
für Pilz-Wirtszellen,
welche bei Kultivierung in der Lage sind, das Enzym der Erfindung
zu produzieren, sind z.B. ein Stamm von Aspergillus oder Fusarium
insbesondere Aspergillus awamori, Aspergillus nidulans, Aspergillus
niger, Aspergillus oryzae, und Fusarium oxysporum, und ein Stamm
von Trichoderma, vorzugsweise Trichoderma harzinanum, Trichoderma
reesei und Trichoderma viride.
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Pilzzellen
können
durch ein Verfahren transformiert werden, das die Protoplastenbildung
und die Transformation der Protoplasten gefolgt von einer Regeneration
der Zellwand einbezieht, in einer Art und Weise, wie sie als solche
bekannt ist. Die Verwendung eines Stamms von Aspergillus als Wirtszelle
ist beschrieben in
EP 238 023 (Novo
Nordisk A/S).
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Beispiele
für eine
Wirtszelle mit Hefe-Ursprung, welche bei Kultivierung in der Lage
sind, das Enzym der Erfindung zu produzieren, ist z.B. ein Stamm
von Hansenula sp., ein Stamm von Kluyveromyces sp., insbesondere
Kluyveromyces lactis und Kluyveromyces marcianus, ein Stamm von
Pichia sp., ein Stamm von Saccharomyces, insbesondere Saccharomyces
carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces kluyveri
und Saccharomyces uvarum, ein Stamm von Schizosaccharomyces sp.,
insbesondere Schizosaccharomyces pombe und ein Stamm von Yarrowia
sp., insbesondere Yarrowia lipolytica.
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Beispiele
für eine
Wirtszelle mit pflanzlichem Ursprung, welche bei Kultivierung in
der Lage sind, das Enzym der Erfindung zu produzieren, ist z.B.
eine Pflanzenzelle von Solanum tuberosum oder Nicotiana tabacum.
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Verfahren
zum Herstellen eines zellulolytischen Enzyms
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Die
vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zum Herstellen eines
isolierten erfindungsgemäßen Enzyms
bereit, wobei eine geeignete Wirtszelle, welche mit einer DNA-Sequenz
kodierend für
das Enzym, transformiert worden ist, unter Bedingungen kultiviert
wird, die die Produktion des Enzyms erlauben, und das resultierende
Enzym wird aus der Kultur gewonnen.
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Wie
hier definiert, ist ein isoliertes Polypeptid (z.B. ein Enzym) ein
Polypeptid, welches im Wesentlichen frei ist von anderen Polypeptiden,
z.B. mindestens etwa 20% rein, vorzugsweise mindestens etwa 40% rein,
mehr bevorzugt etwa 60% rein, noch mehr bevorzugt etwa 80% rein,
am meisten bevorzugt etwa 90% rein und besonders am meisten bevorzugt
etwa 95% rein, wie durch SDS-PAGE bestimmt.
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Der
Begriff „isoliertes
Polypeptid" kann
alternativ „gereinigtes
Polypeptid" genannt
werden.
-
Wenn
ein Expressionsvektor, der eine DNA-Sequenz kodierend für das Enzym
umfasst, in eine heterologe Wirtszelle transformiert wird, ist es
möglich,
die heterologe rekombinante Herstellung des Enzyms der Erfindung
zu ermöglichen.
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Daher
ist es möglich,
eine hoch gereinigte oder einkomponentige zellulolytische Zusammensetzung herzustellen,
die dadurch gekennzeichnet ist, dass sie frei ist von homologen
Verunreinigungen.
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In
diesem Zusammengang bedeuten homologe Verunreinigungen jegliche
Verunreinigungen (z.B. andere Polypeptide als das Enzym der Erfindung),
welche aus der homologen Zelle stammen, aus welcher das Enzym ursprünglich erhalten
worden ist.
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In
der vorliegenden Erfindung kann die homologe Wirtszelle ein Stamm
von Bacillus licheniformis sein.
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Das
Medium, das für
das Kultivieren der transformierten Wirtszellen verwendet wird,
kann jegliches konventionelle Medium sein, das geeignet ist um die
fraglichen Wirtszellen wachsen zu lassen. Das exprimierte zellulolytische
Enzym kann in bequemer Weise in das Kulturmedium sekretiert werden
und kann daraus durch gut bekannte Verfahren einschließlich der
Trennung der Zellen von dem Medium durch Zentrifugation oder Filtration,
durch Präzipitieren
der proteinartigen Bestandteile des Mediums mit Hilfe eines Salzes
wie z.B. Ammoniumsulfat, gefolgt von chromatographischen Verfahren
wie zum Beispiel Ionenaustauscherchromatographie, Affinitätschromatographie,
oder ähnlichem,
gewonnen werden.
-
Enzymzusammensetzungen
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In
noch einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung eine
Enzymzusammensetzung umfassend ein Enzym, das Endoglucanase Aktivität wie vorstehend
beschrieben zeigt.
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Die
Enzymzusammensetzung der Erfindung kann zusätzlich zu der Endoglucanase
der Erfindung, ein oder mehrere Enzym-Typen umfassen, z.B. Hemicellulase
wie z.B. Xylanase und Mannanase, andere Cellulase oder Endo-β-1,4-Glucanase-Bestandteile,
Chitinase, Lipase, Esterase, Pectinase, Cutinase, Phytase, Oxidoreduktase
(Peroxidase, Haloperoxidase, Oxidase, Laccase), Protease, Amylase,
Reductase, Phenoloxidase, Ligninase, Pullulanase, Pectatlyase, Xylolglucanase,
Pectinacetylesterase, Polygalacturonase, Rhamnogalacturonase, Pectinlyase,
Pectinmethylesterase, Cellobiohydrolase, Transglutaminase; oder
Mischungen davon.
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Die
Enzymzusammensetzung kann gemäß Verfahren,
die im Stand der Technik bekannt sind, hergestellt werden und kann
in der Form einer Flüssigkeit
oder einer trocknen Zusammensetzung vorliegen. Zum Beispiel kann
die Enzymzusammensetzung in Form eines Granulats oder eines Mikrogranulats
vorliegen. Das Enzym, das in der Zusammensetzung beinhaltet werden
soll, kann gemäß Verfahren,
die im Stand der Technik bekannt sind, stabilisiert sein.
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Endoglucanasen
haben potentielle Verwendungen in einer Zahl von unterschiedlichen
Industrien und Anwendungen. Beispiele von bevorzugten Verwendungen
der Enzymzusammensetzung der Erfindung sind nachstehend angegeben.
Die Dosierung der Enzymzusammensetzung der Erfindung und anderer
Bedingungen unter welchen die Zusammensetzung verwendet wird, kann
auf der Basis von Verfahren, die im Stand der Technik bekannt sind,
bestimmt werden.
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Die
Enzymzusammensetzung gemäß der Erfindung
kann für
mindestens einen der folgenden Zwecke nützlich sein.
-
Das Enzym
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung zeigt die Endoglucanase Aktivität bei einem
pH in dem Bereich von 4–11,
bevorzugt 5,5–10,5.
-
Verwendungen
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Biomasse-Abbau
-
Das
erfindungsgemäße Enzym
oder die Enzymzusammensetzung kann z. B. wie folgt vorteilhaft angewandt
werden:
- – Zum
Entrinden, d.h. eine Vorbehandlung mit hydrolytischen Enzymen, die
teilweise die pektinreiche Cambiumschicht, vor dem Entrinden in
mechanischen Trommeln, abbauen kann, was zu vorteilhaften Energieeinsparungen
führt.
- – Für das Zerfasern
(defibration) (Raffinieren oder Schlagen, refining oder beating),
d.h. eine Behandlung von Cellulosefasern-enthaltendem Material mit
hydrolytischen Enzymen vor dem Refining oder Beating, was, durch
den hydrolysierenden Effekt der Enzyme auf die Oberflächen der
Fasern, zu der Abnahme des Energieverbrauchs führt.
- – Zur
Fasermodifikation, d.h. eine Verbesserung der Fasereigenschaften,
wo eine teilweise Hydrolyse über die
Faserwand hinaus gebraucht wird, was tiefer durchdringende Enzyme
erfordert (z. B. um grobe Fasern flexibler zu machen).
- – Zur
Entwässerung:
Die Entwässerbarkeit
von Pulpen zur Papierherstellung kann verbessert werden durch die
Behandlung der Pulpe mit hydrolysierenden Enzymen. Die Verwendung
des Enzyms oder der Enzymzusammensetzung der Erfindung kann effektiver
sein, z. B. zu einem höheren
Grad des Lösens
der Bündel stark
hydratisierter Mikrofibrillen in den „Fines"-Fraktionen führen, welche, indem sie die
hohlen Räumen zwischen
den Fasern und in dem Maschendraht der Papiermaschine blockieren,
die Entwässerungsrate
limitieren.
-
Die
Behandlung von lignocellulöser
Pulpe kann, z. B. durchgeführt
werden wie in WO 93/08275, WO 91/02839 und WO 92/03608 beschrieben.
-
Verwendung
in der Detergensindustrie
-
Das
Enzym oder die Enzymzusammensetzung der Erfindung kann in einer
Detergenszusammensetzung für
Haushalts- oder industrielles Waschen von Textilien und Bekleidung
verwendet werden, und für
einen Prozess der Maschinenbehandlung von Geweben, umfassend die
Behandlung des Gewebes mit einer Waschlösung während eines Waschzyklus eines
Maschinenwaschprozesses, welche das Enzym oder die Enzymzubereitung
der Erfindung enthält.
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Typischerweise
umfasst die Detergenszusammensetzung der Erfindung gebräuchliche
Inhaltsstoffe wie z. B. Tenside (anionisch, nicht-ionisch, zwitterionisch,
amphoter), Builder und andere Inhaltsstoffe, z. B. wie in WO 97/01629
beschrieben.
-
Textile Anwendungen
-
In
einer weiteren Ausführungsform
betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung der Endoglucanase
der Erfindung in einem Bio-Polishing-Verfahren. Bio-Polishing ist
eine spezifische Behandlung der Garnoberfläche, welche die Gewebequalität im Hinblick
auf die Handhabung und Erscheinung verbessert ohne einen Verlust
der Gewebebenetzbarkeit. Die wichtigsten Wirkungen des Bio-Polishing
können
gekennzeichnet werden durch weniger Fusseln und Pilling, verstärkten Glanz/Schimmer,
verbesserte Gewebehandhabung, verstärkte dauerhafte Weichheit und
geänderte
Wasserabsorption. Das Bio-Polishing geschieht üblicherweise bei der feuchten
Bearbeitung der Herstellung von gestrickten und gewebten Geweben.
Die feuchte Bearbeitung umfasst Schritte wie z. B. das Desizing,
Auswaschen, Bleichen, Waschen, Färben/Bedrucken
und Vollenden. Während
jedes dieser Schritte wird das Gewebe mehr oder weniger einer mechanischen
Einwirkung unterzogen. Im Allgemeinen geht das Gewebe, nachdem die
Textilien gestrickt oder gewebt worden sind, weiter zu einem Desizing-Schritt,
gefolgt von einem Auswaschungsschritt, etc. Desizing ist der Vorgang
des Entfernens von Appretur von Textilien. Vor dem Weben auf mechanischen
Webstühlen
werden die Kettenfäden oft
mit Appreturstärke
oder Stärkederivaten
beschichtet, um ihre Dehnungsstärke
zu vergrößern.
-
Nach
dem Weben muss die Appreturbeschichtung vor dem weiteren Bearbeiten
des Gewebes entfernt werden, um ein homogenes und waschechtes Ergebnis
sicherzustellen. Es ist bekannt, dass eine Kombination von cellulolytischer
und mechanischer Einwirkung benötigt
wird, um die Wirkungen des Bio-Polishing zu erreichen. Es ist auch
bekannt, dass eine „Super-Weichheit" erreichbar ist,
wenn die Behandlung mit einer Cellulase mit einer konventionellen
Behandlung mit Weichmachern kombiniert wird. Es wird daran gedacht,
dass die Verwendung der Endoglucanase der Erfindung zum Bio-Polishing
von Cellulosegeweben vorteilhaft ist, z. B. dass ein gründlicheres
Polishing erreicht werden kann. Bio-Polishing kann durch Anwenden
des Verfahrens, das z. B. in WO 93/20278 beschrieben ist, erhalten
werden.
-
Stone-Washing
-
Es
ist bekannt, dass ein „stone-washed" Aussehen (örtlich begrenzte
Abnutzung von Farbe) in gefärbtem
Gewebe bereitgestellt werden kann, insbesondere in Jeansgewebe,
oder in Jeans, entweder durch das Waschen des Jeansgewebes oder
der Jeans, die aus einem solchen Gewebe hergestellt sind, in der
Gegenwart von Bimssteinen, um das gewünschte örtlich begrenzte Aufhellen
der Farbe des Gewebes bereitzustellen oder durch das enzymatische
Behandeln des Gewebes, insbesondere mit cellulolytischen Enzymen.
Die Behandlung mit einer Endoglucanase der vorliegenden Erfindung
kann entweder alleine durchgeführt
werden, wie z. B. in
US 4,832,864 offenbart,
zusammen mit einer kleineren Menge an Bimsstein als in einem üblichen Verfahren
benötigt,
oder zusammen mit Perlit, wie in WO 95/09225 offenbart.
-
BESTIMMUNG VON CMC-EINHEITEN
-
CMC-Einheiten
ist bestimmt unter Verwenden von 0,1 Mops-Puffer, pH 7,5 bei 60°C. 20 min
Inkubation und Bestimmung der Bildung von reduzierenden Zuckern
unter Verwenden von PHAB. Eine CMC-Einheit entspricht der Bildung
von 1 Mikromol Glucoseäquivalent
pro Minute. Die CMC-(Carboxymethylcellulose 7L von Hercules)-Endkonzentration
ist 0,75%, DS 0,7.
-
MATERIALIEN
UND METHODEN
-
Stämme
-
Bacillus licheniformis
ATCC 14580.
-
B.
subtilis PL2306. Dieser Stamm ist der B. subtilis DN 1885 mit unterbrochenen
apr- und npr-Genen (Diderichsen et al. (1990)), welcher in der Transkriptionseinheit
des bekannten Bacillus subtilis-Cellulasegens unterbrochen ist,
was zu Cellulase-negativen Zellen fuhrt. Die Unterbrechung wurde
im Wesentlichen durchgeführt
wie in A. L. Sonenshein et al. (1993) beschrieben.
-
Kompetente
Zellen wurden hergestellt und transformiert wie durch Yaspin et
al. (1975) beschrieben.
-
Plasmide
-
pSJ1678
offenbart in der internationalen Patentveröffentlichung WO 94/19454.
-
pMOL944:
-
Dieses
Plasmid ist ein pUB110-Derivat, das im Wesentlichen Elemente enthält, die
das Plasmid in Bacillus subtilis vermehrbar machen, ein Kanamycin-Resistenzgen,
und das einen starken Promotor und ein Signalpeptid kloniert aus
dem amyL-Gen von B. licheniformis ATCC 14580 aufweist. Das Signalpeptid
enthält eine
SacII-Schnittstelle, was es geeignet macht, DNA, welche für den reifen
Teil eines Proteins in Verbindung mit dem Signalpeptid kodiert,
zu klonieren. Dies fuhrt zu der Expression eines Prä-Proteins,
welches an die Außenseite
der Zelle geführt
wird.
-
Das
Plasmid wurde durch konventionelle gentechnische Techniken konstruiert,
welche kurz im Folgenden beschrieben werden.
-
Konstruktion von pMOL944:
-
Das
pUB110-Plasmid (McKenzie, T. et al., 1986) wurde mit dem einmaligen
Restriktionsenzym NciI verdaut. Ein PCR-Fragment, amplifiziert von
dem amyL-Promotor kodiert durch das Plasmid pDN1981 (Jergensen P.
L. et al. (1990)), wurde mit NciI verdaut und in den NciI-verdauten
pUB110 inseriert, um das Plasmid pSJ2624 zu ergeben.
-
Die
zwei verwendeten Primer haben die folgenden Sequenzen:
-
-
Der
Primer #LWN5494 fügt
eine NotI-Schnittstelle in das Plasmid ein.
-
Das
Plasmid pSJ2624 wurde dann mit SacI und NotI verdaut und ein neues
PCR-Fragment, amplifiziert
auf den amyL-Promotor, kodiert auf dem Plasmid pDN1981, wurde mit
SacI und NotI verdaut und dieses DNA-Fragment wurde in den SacI-NotI-verdauten
pSJ2624 inseriert, um das Plasmid pSJ2670 zu ergeben.
-
Dieses
Klonieren ersetzt das erste amyL-Promotor-Klonieren mit dem gleichen
Promotor, aber in der gegensätzlichen
Richtung. Die zwei Primer, welche für die PCR-Amplifikation benutzt
wurden, haben die folgenden Sequenzen:
-
-
Das
Plasmid pSJ2670 wurde mit den Restriktionsenzymen PstI und BclI
verdaut, und ein PCR-Fragment, amplifiziert von einer klonierten
DNA-Sequenz, welche die für
die alkalische Amylase SP722 kodiert (offenbart in der Internationalen
Patentanmeldung, veröffentlicht
als WO 95/26397), wurde mit PstI und BclI verdaut und inseriert,
um das Plasmid pMOL944 zu ergeben. Die zwei Primer, welche für die PCR-Amplifikation verwendet
wurden, haben die folgende Sequenz:
-
-
Der
Primer #LWN7901 fügt
eine SacII-Schnittstelle in das Plasmid ein.
-
Allgemeine
molekularbiologische Verfahren
-
Sofern
nicht anderweitig erwähnt,
wurden die DNA-Manipulationen und Transformationen unter Verwenden
von Standardverfahren der Molekularbiologie durchgeführt (Sambrook
et al., (1989); Ausubel, F. M. et al. (Hrsg.) (1995); Harwood, C.
F., und Cutting, S. M. (Hrsg.) (1990)).
-
Die
Enzyme für
die DNA-Manipulationen wurden nach den Maßgaben der Anbieter verwendet
(z. B. Restriktionsendonukleasen, Ligasen, etc. sind von New England
Biolabs, Inc. erhältlich).
-
Medien
-
- TY (wie in Ausubel et al. (1995) beschrieben).
- LB-Agar (wie in Ausubel et al. (1995) beschrieben).
- LBPG ist LB-Agar ergänzt
mit 0,5% Glucose und 0,05 M Kaliumphosphat, pH 7,0
- BPX-Medium wird beschrieben in EP
0 506 780 (WO 91/09129).
-
Die
folgenden Beispielen erläutern
die Erfindung.
-
BEISPIEL 1
-
Klonieren und Expression
der Endo-Beta-1,4-Glucanase aus Bacillus licheniformis
-
Genomische
DNA-Präparation
-
Der
Stamm Bacillus licheniformis ATCC 14580 wurde in flüssigem Medium
3 vermehrt wie angegeben durch die ATCC (American Type Culture Collection,
USA). Nach 18 Stunden Inkubation bei 37°C und 300 rpm wurden die Zellen
geerntet und die genomische DNA wurde durch das Verfahren, welches
von Pitcher et al. (1989) beschrieben wurde, isoliert.
-
Aufbau einer genomischen
Bibliothek
-
Genomische
DNA von Bacillus licheniformis ATCC 14580 wurde teilweise mit dem
Restriktionsenzym Sau3A verdaut und durch Elektrophorese auf einem
0,7%-igem Agarosegel größenfraktioniert.
Die Fragmente, die zwischen 2 und 7 kb Größe aufwiesen, wurden durch
Elektrophorese auf DEAE-Zellulosepapier isoliert (Dretzen et al.
(1981)). Isolierte DNA-Fragmente wurden in mit BamHI verdaute pSJ1678
Plasmid DNA ligiert.
-
Die
ligierte DNA wurde bei der Elektroporation von E. coli SJ2 verwendet,
die transformierten Zellen wurden auf LB-Agarplatten ausplattiert,
welche 10 mg/ml Chloramphenicol und 0,1% CMC (Natriumcarboxymethylzellulose,
Aqualon, Frankreich) enthielten, die Platten wurden 18 Stunden bei
37°C inkubiert.
-
Identifikation
von positiven Klonen durch Koloniehybridisierung
-
Eine
DNA-Bibliothek in E. coli, konstruiert wie vorstehend beschrieben,
wurde auf LB-Agarplatten,
die 0,1% CMC (Natriumcarboxymethylzellulose, Aqualon, Frankreich)
und 10 μg/ml
Chloramphenicol enthielten, gescreent und über Nacht bei 37°C inkubiert.
Die Transformanten wurden anschließend als Kopie/Replik auf der
gleichen Art von Platten ausplattiert und diese neuen Platten wurden
für 8 Stunden
oder über
Nacht bei 37°C
inkubiert.
-
Die
Originalplatten wurden angefärbt,
indem 25 ml einer wässrigen
Lösung
enthaltend 1 mg/ml Congo-Rot (SIGMA, USA) verwendet wurde. Die Färbung wurde
für eine
halbe Stunde bei moderatem kreisförmigen Schütteln fortgesetzt, danach wurden
die Platten zweimal 15 Minuten gewaschen, indem 1 M NaCl verwendet
wurde.
-
Gelbliche
Höfe erschienen
an Positionen, an denen zellulase-positive Klone vorhanden waren,
von den Replikaplatten wurden diese zellulase-positiven Klone geborgen
und wieder auf LB-Agarplatten enthaltend 0,1% CMC und 9 μg/ml Chloramphenicol
ausgestrichen und bei 37°C über Nacht
inkubiert.
-
Charakterisierung
von positiven Klonen
-
Von
den wiederausgestrichenen Platten wurden die Endoglucanase-positiven
Klone als Einzelkolonien gewonnen und die Plasmide wurden extrahiert.
Die Phänotypen
wurden durch Retransformation von E. coli SJ2 bestätigt und
die Plasmide wurden durch Restriktionsverdaue charakterisiert. Ein
positiver Klon wurde MB629-3 genannt.
-
Das
Endoglucanase-Gen wurde durch DNA-Sequenzieren, in dem der Taq Deoxy-terminal
cycle sequencing kit (Perkin-Elmer, USA) verwendet und Primer Walking
durchgeführt
wurde, charakterisiert, indem mit Primern, einzigartig für das pSJ1678-Plasmid
und an jeder Seite des klonierten Endoglucanase-kodierenden DNA-Fragments
lokalisiert, begonnen wurde.
-
Die
Analyse der Sequenzdaten wurden nach Devereux et al. (1984) durchgeführt. Die
Sequenz entspricht der in SEQ ID Nr. 1 gezeigten DNA-Sequenz.
-
Die
DNA-Sequenz der Erfindung, kodierend für die Endo-Beta-1,4-Glucanase
Familie 9, dargestellt durch die Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 2 (auch
als Cel9 bezeichnet), wurde PCR-amplifiziert unter Verwenden des
PCR Primersets bestehend aus diesen zwei Oligonukleotiden:
-
-
-
Die
Restriktionsschnittstellen PstI und NotI sind unterstrichen.
-
Die
chromosomale DNA aus B. licheniformis ATCC 14580, die wie vorstehend
beschrieben isoliert wurde, wurde als Template in einer PCR-Reaktion
verwendet, indem die AmpliTaq-DNA-Polymerase (Perkin Elmer) nach
den Anweisungen des Herstellers verwendet wurde. Die PCR-Reaktion
wurde ausgeführt
in PCR-Puffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,3, 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, 0,01% (w/v) Gelatine) enthaltend 200 μm jeweils
dNTP, 2,5 Einheiten AmpliTaq-Polymerase (Perkin-Elmer, Cetus, USA)
und 100 pmol von jedem Primer.
-
Die
PCR-Reaktionen wurden durchgeführt,
indem ein DNA Thermal Cycler (Landgraf, Deutschland) verwendet wurde.
Eine Inkubation bei 94°C
für 1 Minute,
gefolgt durch dreißig
Zyklen PCR, durchgeführt,
indem ein Zyklusprofil Denaturierung bei 94°C für 30 Sek., Annealing bei 60°C für 1 Min.
und Verlängerung
bei 72°C
für 2 Min.
verwendet wurde. Fünf-μl Aliquots
des Amplifikationsproduktes wurden durch Elektrophorese in 0,7%-igem
Agarosegelen (NuSieve, FMC) analysiert. Das Auftreten eines DNA-Fragments
mit 2,0 kb Größe zeigte
eine korrekte Amplifikation des Gensegments.
-
Subklonierung
des PCR-Fragments
-
Fünfundvierzig-μl Aliquots
des PCR-Produkts, welches wie vorstehende beschrieben generiert
worden war, wurden gereinigt, indem QIAquick PCR Purification Kit
(Qiagen, USA) nach den Anweisungen des Herstellers verwendet wurde.
Die gereinigte DNA wurde in 50 μl
10 mM Tris-HCl, pH 8,5 eluiert. 5 μg von pMOL944 und fünfundzwanzig-μl des gereinigten
PCR-Fragments wurden mit PstI und NotI verdaut, einer Elektrophorese
in 0,8%-igen Agarosegelen aus einer Agarose, die bei geringen Temperaturen
geliert (SeaPlaque GTG, FMC) unterzogen, die relevanten Fragmente
wurden aus den Gelen ausgeschnitten und gereinigt, indem ein QIAquick
Gel Extraction Kit (Qiagen, USA) nach den Anweisungen des Herstellers
verwendet wurde. Das isolierte PCR-DNA-Fragment wurde dann in den
PstI-NotI verdauten und gereinigten pMOL944 ligiert. Die Ligation
wurde über
Nacht bei 16°C
durchgeführt,
indem 0,5 μg
jedes DNA-Fragments, 1 U der T4-DNA-Ligase und T4-Ligasepuffer (Boeringer
Mannheim, Deutschland) verwendet wurden.
-
Die
Ligationsmischung wurde verwendet, um kompetente B. subtilis PL2306
zu transformieren. Die transformierten Zellen wurden auf LBPG-10 μg/ml Kanamycinplatten
ausplattiert. Nach 18 Stunden Inkubation bei 37°C wurden einige Klone auf frischen
Agarplatten wieder ausgestrichen und auch in flüssigen TY-Kulturen mit 10 μg/ml Kanamycin
angezogen und über
Nacht bei 37°C
inkubiert. Am nächsten
Tag wurde 1 ml Zellen verwendet, um Plasmid von den Zellen zu isolieren,
indem das Qiaprep Spin Plasmid Miniprep Kit #27106 nach den Empfehlungen
des Herstellers für
die B. subtilis Plasmidaufbereitungen verwendet wurde. Diese Plasmid DNA
wurde als Template für
das DNA-Sequenzieren verwendet.
-
Ein
Klon enthaltend das Endo-Beta-1,4-Glucanase-Gen der Erfindung wurde
behalten, dieser Klon wurde als MB905 bezeichnet.
-
Das
Plasmid aus MB905 wurde für
Expressionsstudien in ein Derivat von B. licheniformis ATCC 14580 eingebracht.
Dieser Stamm wurde MB924 genannt. Die klonierte DNA-Sequenz wurde in
B. licheniformis exprimiert, indem die Zellen in BP-X-Medium bei
37°C für 5 Tage
bei 300 rpm fermentiert wurden. Das Endoglucanaseprotein, welches
in dem Überstand
auftauchte, entsprach dem reifen Protein von SEQ ID Nr. 2, d.h.
umfasste die Proteinsequenz entsprechend der Aminosäuren in
Position 26–646
von SEQ ID Nr. 2.
-
BEISPIEL 2
-
Reinigung und Charakterisierung
der Endo-Beta-1,4-Glucanase aus Bacillus licheniformis
-
Reinigung
-
MB924,
der wie in Beispiel 1 gewonnen wurde, wurde in 15 × 200 ml
BPX-Medium mit 10 μg/ml
Kanamycin in 500 ml Schüttelflaschen
mit zwei Schikanen für
5 Tage bei 37°C
bei 300 rpm angezogen, wobei 2500 ml Kulturbrühe gewonnen wurde. Die Kulturflüssigkeit
wurde mit einem Volumen ionisierten Wasser verdünnt und der pH auf 7,5 eingestellt,
indem Essigsäure
verwendet wurde. Dann wurden 112,5 ml kationisches Mittel (C521
10%) und 225 ml anionisches Mittel (A130 0,1%) während der Bewegung zur Flockenbildung
hinzugefügt.
Das ausgeflockte Material wurde durch Zentrifugation getrennt, indem
eine Sorval RC 3B Zentrifuge bei 10000 rpm für 30 Min. bei 6°C verwendet
wurde. Der entstehende Überstand
enthielt 120 CMC-Einheiten pro ml in einem Gesamtvolumen von 5000
ml.
-
Der Überstand
wurde geklärt,
indem Whatman Glasfilter GF/D und C verwendet wurden und schließlich durch
eine Filtron OF Membran mit einem Ausschlussvolumen von 10 kDa konzentriert.
Das Gesamtvolumen von 1750 ml wurde auf pH 8,0 eingestellt.
-
Um
eine hochreine Endoglucanase zu erhalten, wurde ein letzter Schritt
durchgeführt,
bei dem Q-Sepharose Anionaustausch Chromatographie verwendet wurde.
1750 ml der Lösung
wurden auf eine 800 ml Säule
enthaltend Q-Sepharose (Pharmacia) aufgetragen, die mit einem Puffer
von 50 mmol Tris pH 8,0 equilibriert wurde. Die gebundene Endoglucanase
wurde eluiert, indem ein 0,5 M NaCl Gradient verwendet wurde. Mehr
als 95% der Endoglucanase wurde konzentriert.
-
Charakterisierung
-
Das
gereinigte Enzym ergab eine Einzelbande von 67 kDa in der SDS-PAGE
und einen isoelektrischen Punkt von ungefähr 5,6.
-
Die
Proteinkonzentration wurde bestimmt, indem ein molarer Extinktionskoeffizient
von 171640 (basierend auf die Aminosäurezusammensetzung abgeleitet
aus der Sequenz) verwendet wurde. Die pH-Aktivitätsprofile zeigten mehr als
50% relative Aktivität
zwischen pH 6,0 und 9,2 bei 60°C.
Das Temperaturoptimum lag bei 65°C
bei pH 7,5. DSC zeigte einen Schmelzpunkt bei 77°C bei pH 6,2.
-
Die N-terminale Bestimmung
der gereinigten Endoglucanse:
-
-
Die
gereinigte Endoglucanase umfasst eine katalytische Domäne, die
zu der Familie 9 der Glycosylhydrolasen gehört, diese Domäne entspricht
der Aminosäuresequenz
von SEQ ID Nr. 2 von ungefähr
Position 26 bis ungefähr
Position 485, und eine Cellulasebindedomäne (CBD), welche mit der katalytischen
Domäne verbunden
ist und dargestellt wird durch die Aminosäuresequenz der SEQ ID Nr. 2
von ungefähr
Position 486 bis Position 644. Die CBD gehört zur Familie 3b.
-
Immunologische
Eigenschaften: Bei der dänischen
Firma DAKO wurde polyklonales, monospezifisches Kaninchenserum,
unter Verwenden konventioneller Techniken, gegen die hochgereinigte
Endo-Beta-1,4-Glucanase erzeugt. Das Serum zeigte ein schönes einzelnes
Präzipitat
in Agarosegelen mit der Endoglucanase der Erfindung.
-
LITERATUR
-
- Ausubel, F. M. et al. (Hrsg.) "Current protocols
in Molecular biology".
John Wiley and Sons, 1995.
- Axelsen, N., et al. in: A Manual of Quantitative Immunoelectrophoreis,
Blackwell Scientific Publications, 1973, Kapitel 23.
- Denman, S. et al.: Characterization of a Neocallumastix patriarum
cellulase cDNA (celA) homologous to Trichoderma reesei cellobiohydrolase
II, Appl. Environ. Microbiol. (1996), 62(6), 1889–1896.
- Damude, H. G. et al.: Substrate specificity of endoglucanase
A from Cellulomonas fimi: fundamental differences between endoglucanases
and exoglucanases from family 6, Biochem. J. (1996), 315(2), 467–72.
- Devereux et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12, 387–395.
- Diderichsen, B., Wedsted, U., Hedegaard, L., Jensen, B. R.,
Sjøholm,
C. (1990) Cloning of aldB, which encodes alpha-acetolactate decarboxylase,
an exoenzyme from Bacillus brevis. J. Bacteriol., 172, 4315–4321.
- Dretzen, G., Bellard, M., Sassone-Corsi, P., Chambon, P. (1981)
A reliable method for the recovery of DNA fragments from agarose
and acrylamide gels. Anal. Biochem., 112, 295–298.
- Feinberg, A. P. and Vogelstein, B. (1983) Anal. Biochem. 132:
6–13.
- Gilbert, H. J. and Hazlewood G. P. (1993) J. Gen. Microbiol.
139: 187–194.
- Gilkes, N. R., Henrissat, B., Kilburn, D. G., Miller Jr., R.
C. and Warren, R. A. J.: Domains in microbial β-1,4-glycanases; sequence conservation,
function, and enzyme families. Microbiol. Rev. 55 (1991), 305–315.
- Harwood, C. R., and Cutting, S. M. (Hrsg.) "Molecular Biological Methods for Bacillus", John Wiley and
Sons, 1990.
- Henrissat, B.: A classification of glycosyl hydrolases based
on amino acid sequence similarities. Biochem. J. 280 (1991), 309–316.
- Henrissat, B., and Bairoch, A.: New families in the classification
of glycosyl hydrolases based on amino acid sequence similarities.
Biochem. J. 293 (1993), 781–788.
- Johnstone, A. and R. Thorpe. Immunochemistry in Practice, Blackwell
Scientific Publications. 1982 (pp. 27–31).
- Jørgensen
P. L. et al. (1990) Gene, 96, p. 37–41.
- Leatherbarrow, R. J. (1991) Grafit version 3.0 Erithacus Software
Ltd. Staines, U. K.
- Lever, M. (1972) A new reaction for colormetric determination
of carbohydrates. Anal. Biochem. 47, 273–279.
- McKenzie, T. et al., 1986. Plasmid 15: 93–103.
- O. Ouchterlony in: Handbook of Experimental Immunology (D. M.
Weir, Hrsg.), Blackwell Scientific Publications, 1967, pp. 655–706.
- Pitcher, D. G., Saunders, N. A., Owen, R. J. (1989): Rapid extraction
of bacterial genomic DNA with guanidium thiocyanate. Lett. Appl.
Microbiol., 8, 151–156.
- Quillet, L. et al.: The gene encoding the beta-1,4-endoglucanase
(Cel) from Myxococcus xanthus: evidence for independent acquisition
by horizontal transfer of binding and catalytic domains from actinomycetes,
Gene (1995), 158(1), 23–9.
- Sambrook et al. (1989) Molecular cloning: A laboratory manual,
Cold Spring Harbor lab., Cold Spring Harbor, NY.
- Hrsg. A. L. Sonenshein, J. A. Hoch and Richard Losick (1993)
Bacillus subtilis and other Gram-Positive Bacteria, American Society
for microbiology, p. 618.
- Yasbin, R. E., Wilson, G. A. and Young, F. E. (1975) Transformation
and transfection of lysogenic strains of Bacillus subtilis: evidence
for selective induction of prophage in competent cells. J. Bacteriol.,
121: 296–304.
