CN102899340B - 编码糖基水解酶家族6的内切葡聚糖酶基因Cel6及其应用 - Google Patents
编码糖基水解酶家族6的内切葡聚糖酶基因Cel6及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102899340B CN102899340B CN2012104189812A CN201210418981A CN102899340B CN 102899340 B CN102899340 B CN 102899340B CN 2012104189812 A CN2012104189812 A CN 2012104189812A CN 201210418981 A CN201210418981 A CN 201210418981A CN 102899340 B CN102899340 B CN 102899340B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cel6
- gene
- glycosyl hydrolase
- endoglucanase
- hydrolase family
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
一个编码糖基水解酶家族6的内切葡聚糖酶基因Cel6及其应用,其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示,上述基因编码的内切葡聚糖酶Cel6,其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示,该酶在分解纤维素中的应用。
Description
技术领域
本发明涉及一个编码糖基水解酶家族6的内切葡聚糖酶基因Cel6,该基因编码的蛋白质可用于降解纤维素。
背景技术
纤维素类物质是自然界中含量最丰富、最廉价却又未得到充分利用的可再生资源。纤维素是葡萄糖通过β-1,4糖苷键结合而成的高分子聚合物,纤维素是植物细胞壁的主要组分之一,占植物秸秆干重的40~50%(Lin Y,and S.Tanaka,2006,Ethanol fermentation from biomass resources:current state and prospects.Appl.Microbiol.Biotechnol.,69(3):627-642.)。
随着燃油价格的持续不断的增长和石油资源的匮乏,生物资源发酵生产酒精和寡糖类物质越来越成为人类研究的热点。纤维素通过水解作用生产葡萄糖,然后经过生物发酵生成酒精,前景十分广阔,不仅能降低二氧化碳的排放,还可以减少对汽油等非再生能源的依赖(于斌,齐鲁,2006,木质纤维素生产燃料乙醇的研究现状,化工进展,25(3):244-249.)。
目前降解纤维素的主要手段有:酸水解、酶水解、热水解、机械水解、离子辐射水解(John R,Whitaker,1994,Principles of Enzymology for the FoodScience(Second Edition).New York:Marcel Dekker:415-416.)。其中利用纤维素酶进行水解的条件温和,易于控制,产物较为单纯等方面的优点,在降解纤维素生产粮食和能源方面具有相当巨大的潜力。
通常纤维素酶可根据其不同的催化反应功能分为三种水解酶,分别为内切葡聚糖酶(endoglucanase,EC 3.2.1.4)、外切葡聚糖酶(exoglucanase或exoglucohydrolase,EC 3.2.1.91)和β-葡聚糖苷酶(β-glucosidase,EC3.2.1.21)。纤维素在这三种酶共同作用下可降解为葡萄糖,这三种酶被称为“完全纤维素酶系”。内切葡聚糖酶作用在纤维素分子内部的非结晶区域,随机切割纤维素多糖链1,4-糖苷键,产生不同长度的有非还原末端的小分子纤维素。
纤维素酶属于糖基水解酶类(glycosyl hydrolases),糖基水解酶有一个催化功能域和一个或多个其它的功能域组成,根据催化功能域的氨基酸序列相似性,糖基水解酶类被划分成不同的家族(Davies G,Henrissat B.,1995,Structures andmechanisms of glycosyl hydrolases.Structure 3:853-859.)。根据Cazy服务器(http://afmb.cnrs-mrs.fr/CAZY/)上所列糖基水解酶类,糖基水解酶类有108个家族,内切葡聚糖酶分属于糖基水解酶类家族1,3,5,6,7,8,9,10,12,26,44,45,48,51,61,74。
国内外对纤维素酶有近40多年的研究,生产纤维素酶的生物也非常广泛,绝大部分纤维素酶主要是由微生物发酵而产生,如细菌、真菌(木霉、青霉和曲霉)、放线菌等(Immanuel,R.Dhanusha,P Prema,et al,2006,Effect of differentgrowth parameters on endoglucanase enzyme activity by bacteria isolated from coirretting effluents of estuarine environment.International Journal of EnvironmentalScience and Technology,3:25–34.),目前研究最清楚的是里氏木霉(Shin CS,LeeJP,Lee JS,et al,2000,Enzyme production of Trichoderma ressei Rut C-30 onvarious lignocellulosic substrates.Applied Biochemistry and Biotechnology,84/86:237–245.)。除此之外,部分动物体内也可以产生纤维素酶,如牛的胃、木蠹蛾的唾液和蜗牛的胃液等都含有丰富的纤维素酶(Duan CJ,Feng JX.,2010,Miningmetagenomes for novel cellulase genes.Biotechnol Lett.32(12):1765-75.)。
目前,纤维素酶已经被广泛地应用于多个领域,主要有食品、酿酒、环保、饲料加工、纺织、农业、日化等方面。在水果和蔬菜加工中由于植物细胞壁的主要成分是果胶、纤维素和半纤维素等,因此,在水果与蔬菜加工的过程中适当使用纤维素酶,可将纤维素水解成葡萄糖等有效成分。另一方面,还可使植物细胞壁发生不同程度变化,如软化、膨胀、崩溃等,提高果蔬的可消化性,并使其口感更好;在白酒及其酒精生产中以纤维素为原料发酵生产酒精,使用的是二段法,即先用纤维素酶将纤维素糖化,再经酵母发酵成酒精;在茶叶加工中用酶法低温抽提,即先用纤维素酶将茶叶的细胞壁裂解抽提其中的有效成分,最后将含有有效成分的抽提液浓缩干燥便可制成可溶性茶。与传统的热浸提法相比,此方法可提高有效成分的得率,同时还可保持茶叶原有的色香味;在活性物质的提取中,如淀粉、蛋白质、活性多糖等物质的提取过程中,加入纤维素酶能大幅提高产品的收率(杜翠娇,任河,杜建敏等,2011,纤维素酶及其应用,食品工程,2:6-7.)
以内切葡聚糖酶为关键词查找国家知识产权局专利检索数据库,共出现69项发明专利。其中有23项发明专利是描述编码内切葡聚糖酶的基因及其应用,而其他46项是与内切葡聚糖酶在各种领域上的应用有关。在这23项与编码内切葡聚糖酶的基因及其应用相关的发明专利中的内切葡聚糖酶基因分别来自于各种细菌、霉菌、未培养微生物或人工合成的,在这23项专利中还没有一个内切葡聚糖酶基因是来自于链霉菌的。
发明内容
本发明从广西南宁筛选到的链霉菌GX6的基因组中克隆到一个编码糖基水解酶家族6的内切葡聚糖酶基因,在大肠杆菌宿主细胞中表达该基因生产内切葡聚糖酶,并能以纤维素为原料降解生成葡萄寡糖。
本发明涉及一个编码糖基水解酶家族6的内切葡聚糖酶基因Cel6,其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。是从链霉菌GX6的基因组中克隆得到。该内切葡聚糖酶基因Cel6的序列是由999个碱基组成,含有完整的内切葡聚糖酶基因Cel6的开放阅读框(Open Reading Frame,ORF),Cel6基因的起始密码子为GTG,终止密码子为TGA。
SEQ ID NO:2的蛋白质是基因Cel6编码的内切葡聚糖酶产物Cel6,由332个氨基酸组成,和Cel6催化功能域同源性最高的是与Streptomyces sp.e14(链霉菌e14)的secreted endoglucanase(分泌型的内切葡聚糖酶),两者的一致性=255/296(86%),相似性=278/296(94%)。
基因Cel6在大肠杆菌中表达的重组产物Cel6能够分解纤维素。
本发明还涉及含有本发明基因的表达载体,及用于转化本发明基因的宿主。
本发明提供了一个编码糖基水解酶家族6的内切葡聚糖酶基因Cel6,该基因所编码糖基水解酶家族6的内切葡聚糖酶在分解纤维素的用途。
附图说明
图1是筛选含有内切葡聚糖酶基因Cel6重组菌株的CMC选择平板图。
从图1了解到,含有内切葡聚糖酶基因Cel6的重组菌株能够在CMC选择平板上形成透明圈。
具体实施方式
下述实施方法是为了更好的解释本发明,而不应该被解释为限制本发明的目的。
在本发明的实施例中所用到的材料包括:大肠杆菌(Escherichia coli)株系XL1-blue,购自TaKaRa公司,表达载体pSE380,购自Invitrogen公司,CMC(carboxylmethylcellulose,羧甲基纤维素钠,购自Sigma公司,以及购自TaKaRa、MBI的限制性内切酶、修饰酶等试剂。
下面将通过实施例对本发明作详细描述:
1)链霉菌Streptomyces GX6基因组DNA的提取
链霉菌Streptomyces GX6的基因组DNA是按照BioFlux公司的细菌基因组DNA提取试剂盒Biospin Bacteria Genomic DNA Extraction Kit(目录号BSC12S1)的使用说明来提取的。
将提取好的链霉菌Streptomyces GX6的基因组DNA送华大基因公司测定基因组序列。
2)链霉菌Streptomyces GX6的基因组序列中编码内切葡聚糖基因序列的分析
将获得的链霉菌Streptomyces GX6的基因组序列用NCBI(National Centerfor Biotechnology Information,http://www.ncbi.nlm.nih.gov)上的软件ORF finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/orfig.cgi)和Blast(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)进行分析。结果共获得3个与内切葡聚糖酶具有较高同源性的开放阅读框(Open Reading Frame,ORF),本发明只涉及其中一个ORF。
3)编码糖基水解酶家族6的内切葡聚糖酶基因Cel6的核苷酸序列分析
基因Cel6的开放阅读框(Open Reading Frame,ORF)由999个核苷酸组成,序列如SEQ ID NO:1。其中,Cel6基因的起始密码子为GTG,终止密码子为TGA。
4)编码糖基水解酶家族6的内切葡聚糖酶基因Cel6编码的产物Cel6的氨基酸序列分析
内切葡聚糖酶基因Cel6编码一个含332个氨基酸的蛋白质,用DNAStar软件预测该蛋白质的理论分子量大小为34932.69道尔顿。
用简单组件结构研究工具(Simple Modular Architecture Research Tool,SMART,http://smart.embl-heidelberg.de)分析内切葡聚糖酶Cel6的组件结构,结果是自N端的47-322位氨基酸残基为糖基水解酶家族6(glycosyl hydrolase)的纤维素酶功能域。
5)编码糖基水解酶家族6的内切葡聚糖酶基因Cel6的克隆和表达
使用上游引物5’-TCGCCATGGTGCACCACCACCACCACCACGTCGTGGGGACGGCGCTGCTGGCCG-3’(含有NcoI位点和6хHis-tag)和下游引物5’-ACTAAGCTTTCACCCGCCGGCCCGGGC CAGCTGC-3’(含有HindIII位点),通过聚合酶链式反应(PCR)扩增内切葡聚糖酶基因Cel6,用限制性内切酶NcoI和HindIII酶切内切葡聚糖酶基因Cel6后,与经NcoI和HindIII酶切的表达载体pSE380进行连接。再将连接产物用CaCl2法转化到大肠杆菌XL1-blue中,涂布到含100μg/mL氨苄青霉素的LA平板上。转化得到的单菌落点板至含有100μg/mL氨苄青霉素和0.5%(W/V)CMC(羧甲基纤维素钠)的LA平板上,将平板置于37℃恒温箱培养8小时,对每个转点菌落逐个滴加1μl 1%(W/V)的IPTG诱导表达,然后将平板置于37℃恒温箱继续培养7小时。时间到后,进行氯仿熏蒸破胞,再把平板置于37℃恒温箱使表达的Cel6酶与CMC反应7小时。用0.1%的刚果红溶液染色15分钟后,再用1M的NaCl溶液脱色。观察选择平板。
然后进一步提取在选择平板上能形成透明圈的克隆子的质粒DNA,并将其命名为pSE-Cel6,用限制性内切酶NcoI和HindIII完全酶切pSE-Cel6后,进行0.8%琼脂糖凝胶电泳分析,结果pSE-Cel6除有一个约4.1kb的DNA片段外,还有一条大小约为1kb的DNA片段。
将含有质粒pSE-Cel6的大肠杆菌单菌落接种到含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中,37℃振荡培养,待OD600为0.4时,加入终浓度为0.5mmol/L IPTG、终浓度为100mmol/L山梨醇和终浓度为2.5mmol/L甜菜碱,20℃诱导20小时。11000rpm离心3min,收集菌体,用4mL 100mmol/L的pH 7.0磷酸缓冲液重悬菌体,超声波破胞9min。12000rpm离心10min,上清即为含有内切葡聚糖酶Cel6的粗酶液。
6)编码糖基水解酶家族6的内切葡聚糖酶Cel6酶活力的测定
取10μl内切葡聚糖酶Cel6的粗酶液,加入250μl 100mmol/L的pH 7.0磷酸缓冲液,与250μl 2%CMC溶液混合,在37℃作用30分钟后,加入1000μl DNS溶液,放置沸水中反应5分钟,室温冷却,用分光光度计测吸光度OD530。吸光度测定值与不同含量的葡萄糖吸光度标准曲线图作比较计算酶活。所述DNS试剂配制:称取1克NaOH用约40mL ddH2O溶解,再称取1克二硝基水杨酸、0.2克苯酚、0.05克无水亚硫酸钠、20克四水酒石酸钾钠,将其溶解于约30mLddH2O中,两种溶液混合,定容到100mL。
内切葡聚糖酶的酶活力单位(IU)定义为:每分钟催化产生1μmol还原糖所需的酶量。内切葡聚糖酶Cel6的水解CMC活性为16.78U。
Claims (5)
1.一个编码糖基水解酶家族6的内切葡聚糖酶基因Cel6,其特征在于,其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.权利要求1的基因所编码的蛋白质,其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
3.一种表达载体,其特征在于,它含有权利要求1所述的基因。
4.一种宿主细胞,其特征在于,它是含有权利要求3所述表达载体转化的原核细胞或真核细胞。
5.权利要求2所述的蛋白质在降解纤维素中的应用。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN2012104189812A CN102899340B (zh) | 2012-10-27 | 2012-10-27 | 编码糖基水解酶家族6的内切葡聚糖酶基因Cel6及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN2012104189812A CN102899340B (zh) | 2012-10-27 | 2012-10-27 | 编码糖基水解酶家族6的内切葡聚糖酶基因Cel6及其应用 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN102899340A CN102899340A (zh) | 2013-01-30 |
CN102899340B true CN102899340B (zh) | 2013-09-25 |
Family
ID=47571829
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN2012104189812A Expired - Fee Related CN102899340B (zh) | 2012-10-27 | 2012-10-27 | 编码糖基水解酶家族6的内切葡聚糖酶基因Cel6及其应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN102899340B (zh) |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1261913A (zh) * | 1997-07-04 | 2000-08-02 | 诺沃挪第克公司 | 来自糖丝菌的内切-β-1,4-葡聚糖酶 |
CN1353751A (zh) * | 1999-05-28 | 2002-06-12 | 诺沃奇梅兹有限公司 | 新型内切-β-1,4-葡聚糖酶 |
-
2012
- 2012-10-27 CN CN2012104189812A patent/CN102899340B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1261913A (zh) * | 1997-07-04 | 2000-08-02 | 诺沃挪第克公司 | 来自糖丝菌的内切-β-1,4-葡聚糖酶 |
CN1353751A (zh) * | 1999-05-28 | 2002-06-12 | 诺沃奇梅兹有限公司 | 新型内切-β-1,4-葡聚糖酶 |
Non-Patent Citations (8)
Title |
---|
Chellapandi and Himanshu.PRODUCTION OF ENDOGLUCANASE BY THE NATIVE STRAINS OF STREPTOMYCES ISOLATES IN SUBMERGED FERMENTATION.《Brazilian Journal of Microbiology》.2008,第39卷(第1期),全文. |
PRODUCTION OF ENDOGLUCANASE BY THE NATIVE STRAINS OF STREPTOMYCES ISOLATES IN SUBMERGED FERMENTATION;Chellapandi and Himanshu;《Brazilian Journal of Microbiology》;20080331;第39卷(第1期);全文 * |
Purification and Characterization of an Endoglucanase from Streptomyces lividans 66 and DNA Sequence of the Gene;Theberge et al;《APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY》;19920331;第58卷(第3期);全文 * |
Theberge et al.Purification and Characterization of an Endoglucanase from Streptomyces lividans 66 and DNA Sequence of the Gene.《APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY》.1992,第58卷(第3期),全文. |
李相前和邵蔚蓝.极耐热内切葡聚糖酶Cel12B的基因克隆、表达和酶学性质的研究.《南京师大学报(自然科学版)》.2006,第29卷(第3期),全文. |
极耐热内切葡聚糖酶Cel12B的基因克隆、表达和酶学性质的研究;李相前和邵蔚蓝;《南京师大学报(自然科学版)》;20060331;第29卷(第3期);全文 * |
短小芽孢杆菌β-1,4-葡聚糖内切酶基因的克隆及在大肠杆菌中的分泌表达;郭成栓等;《化学与生物工程》;20101231;第27卷(第12期);全文 * |
郭成栓等.短小芽孢杆菌β-1 4-葡聚糖内切酶基因的克隆及在大肠杆菌中的分泌表达.《化学与生物工程》.2010 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN102899340A (zh) | 2013-01-30 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Swathy et al. | Production and optimization of high grade cellulase from waste date seeds by Cellulomonas uda NCIM 2353 for biohydrogen production | |
Juturu et al. | Insight into microbial hemicellulases other than xylanases: a review | |
Yeoman et al. | Thermostable enzymes as biocatalysts in the biofuel industry | |
Maijala et al. | Characterization of hemicellulases from thermophilic fungi | |
Teixeira da Silva et al. | Effect of pH, temperature, and chemicals on the endoglucanases and β-glucosidases from the thermophilic fungus Myceliophthora heterothallica F. 2.1. 4. Obtained by solid-state and submerged cultivation | |
Kim et al. | Characterisation of a novel Bacillus sp. SJ-10 β-1, 3–1, 4-glucanase isolated from jeotgal, a traditional Korean fermented fish | |
CN104011214A (zh) | C.bescii耐热酶 | |
Polizeli et al. | Enzyme system from Aspergillus in current industrial uses and future applications in the production of second-generation ethanol | |
CN102888416B (zh) | 编码糖基水解酶家族3的β-葡萄糖苷酶基因及其应用 | |
Suvorov et al. | Novelties of the cellulolytic system of a marine bacterium applicable to cellulosic sugar production | |
CN103114100A (zh) | β-葡萄糖苷酶基因S-bgl3及其应用 | |
CN102719458B (zh) | 一种编码碱性β-葡萄糖苷酶基因及其应用 | |
WO2011094530A9 (en) | NOVEL β-GLUCOSIDASE AND USES THEREOF | |
CN102888417B (zh) | 编码糖基水解酶家族5的内切葡聚糖酶基因Cel5A及其应用 | |
CN102041252B (zh) | 高效内切葡聚糖酶RuCelB,其编码基因、制备方法与应用 | |
CN102174494B (zh) | 一种海洋适冷内切β-木聚糖酶XynB及其表达基因xynB与应用 | |
CN102899340B (zh) | 编码糖基水解酶家族6的内切葡聚糖酶基因Cel6及其应用 | |
WO2013176205A1 (ja) | キシラナーゼおよびそれを用いた糖の製造方法 | |
Li et al. | Mutation of conserved residues in the laminarinase Lam1092 increases the antioxidant activity of the laminarin product hydrolysates | |
CN102888418B (zh) | 链霉菌的内切葡聚糖酶基因Cel5B及其应用 | |
CN107699551B (zh) | 一种β-葡萄糖苷酶SPBGL5在水解木聚糖多糖类物质中的应用 | |
Cheawchanlertfa et al. | A novel amylolytic/xylanolytic/cellulolytic multienzyme complex from Clostridium manihotivorum that hydrolyzes polysaccharides in cassava pulp | |
CN105754973B (zh) | 一种β-葡萄糖苷酶的突变体W233D及其应用 | |
EP3262164B1 (en) | Hemicellulose-degrading compositions and uses thereof | |
CN103146725B (zh) | 热稳定β-葡萄糖苷酶基因及其应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C14 | Grant of patent or utility model | ||
GR01 | Patent grant | ||
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20130925 Termination date: 20151027 |
|
EXPY | Termination of patent right or utility model |