DE69535733T2

DE69535733T2 - Ein enzympräparat mit endoglucanase aktivität

Info

Publication number: DE69535733T2
Application number: DE69535733T
Authority: DE
Inventors: Martin Schülein; Karen Margrethe Oxenboll; Lene Nonboe Andersen; Soren Flensted Lassen; Markus Sakari Kauppinen; Jack Bech Nielsen
Original assignee: Novozymes AS
Current assignee: Novozymes AS
Priority date: 1994-10-06
Filing date: 1995-10-06
Publication date: 2009-04-23
Anticipated expiration: 2015-10-07
Also published as: DE69535733D1; EP1995303A2; WO1996011262A1; US5919691A; AU3604595A; EP1995303A3; ATE389012T1; EP0788541B1; EP0788541A1; US6071735A; JPH10507073A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Enzymzusammensetzung, ein isoliertes Enzym mit cellulytischer (Endoglucanase) Aktivität bei alkalischen Bedingungen, ein DNA-Konstrukt, das das Enzym kodiert, ein Verfahren zum Herstellen des Enzyms oder der Enzymzusammensetzung, eine Detergenszusammensetzung, die das Enzym oder die Zusammensetzung umfasst, und Verwendung des Enzyms, z. B. in der Detergensindustrie, der Textilindustrie und der Papierzellstoffindustrie.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Endoglucanasen (EC Nr. 3.2.1.4) bestehen aus einer Gruppe von Hydrolasen, welche die Endohydrolyse von 1,4-β-D-glycosidischen Bindungen in Cellulose, Cellulosederivaten (wie Carboxymethylcellulose und Hydroxyethylcellulose), Lichenin, β-1,4-Bindungen in gemischten β-1,3-Glucanen, wie Getreide-β-D-Glucanen oder Xyloglucane und anderes Pflanzenmaterial, das cellulosehaltige Teile enthält, katalysiert. Der berechtigte Name ist Endo-1,4-β-D-Glucan-4-Glucanhydrolase, aber in der vorliegenden Beschreibung wird der abgekürzte Begriff Endoglucanase verwendet. Es kann verwiesen werden auf T. -M. Enveri, "Microbial Cellulases" in W. M. Fogarty, Microbial Enzymes and Biotechnology, Applied Science Publishers, S. 183–224 (1983); Methods in Enzymology, (1988) Bd. 160, S. 200–391 (herausgegeben durch Wood, W. A. und Kellogg, S. T.); Béguin, P., "Molecular Biology of Cellulose Degradation", Annu. Rev. Microbiol. (1990); Bd. 44, S. 219–248; Béguin, P. und Hubert, J-P., "The biological degradation of cellulose", FEMS Microbiology Reviews 13 (1994) S. 25–58; Henrissat, B., "Cellulases and their interaction with cellulose", Cellulose (1994), Bd. 1, S. 169–196. Cellulosen kommen in Verbindung mit vielen Harzen vor und sie sind Bestandteile von Zellwänden, z. B. in Früchten, Gemüse und Getreide.
Für Endoglucanasen wurde festgestellt, dass sie durch zahlreiche Arten von Organismen, wie Pflanzen und Mikroorganismen, hergestellt werden, und Endoglucanasen mit einer breiten Vielfalt von Spezifitäten wurden identifiziert.
Endoglucanasen aus Pilzen wurden beschrieben durch Sheppard, P. O., et al., "The use of conserved cellulase family-specific sequences to clone Cellulase homologue cDNAs from Fusarium oxysporum", Gene, (1994), Bd. 15, S. 163–167, Saloheimo, A., et al., "A novel, small endoglucanase gene, eg15, from Trichoderma reesei isolated by expression in yeast", Molecular Microbiology (1994), Bd. 13(2), S. 219–228; van Arsdell, J. N. et al, (1987), Cloning, characterization, and expression in Saccharomyces cerevisiae of endoglucanase I from Trichoderma reesei, Bio/Technology 5: 60–64; Penttilä, M. et al., (1986), "Homology between cellulase genes of Trichoderma reesei: complete nucleotide sequence of the endoglucanase I gene", Gene 45:253–263; Saloheimo, M. et al, (1988), "EGIII, a new endoglucanase from Trichoderma reesei: the characterization of both gene and enzyme", Gene 63: 11–21; Gonzáles, R., et al., "Cloning, sequence analysis and yeast expression of the egl1 gene from Trichoderma longibrachiatum", Appl. Microbiol. Biotechnol., (1992), Bd. 38, S. 370–375; Ooi, T. et al. "Cloning and sequence analysis of a cDNA for cellulase (FI-CMCase) from Aspergillus aculeatus", Curr. Genet., (1990), Bd. 18, S. 217–222; Ooi, T. et al, "Complete nucleotide sequence of a gene coding for Aspergillus aculeatus cellulase (FI-CMCase)", Nucleic Acids Research, (1990), Bd. 18, Nr. 19, S. 5884; Xue, G. et al., "Cloning and expression of multiple cellulase cDNAs from the anaerobic rumen fungus Neocallimastix patriciarum in E. coli", J. Gen. Microbiol., (1992), Bd. 138, S. 1413–1420; Xue, G. et al., "A novel polysaccharide hydrolase cDNA (celD) from Neocallimastix patriciarum encoding three multi-functional catalytical domains with high endoglucanase, cellobiohydrolase and xylanase activities", J. Gen. Microbiol., (1992), Bd. 138, S. 2397–2403; Zhou, L. et al., "Intronless celB from the anaerobic fungus Neocallimastix patriciarum encodes a modular family A endoglucanase", Biochem. J., (1994), Bd. 297, S. 359–364; Dalbøge, H. und Heldt-Hansen, H. P., "A novel method for efficient expression cloning of fungal enzyme genes", Mol. Gen. Genet., (1994), Bd. 243, S. 253–260; Ali, B. R. S. et al., "Cellulases and hemicellulases of the anaerobic fungus Piromyces constitute a multiprotein cellulose-binding complex and are encoded by multigene families", FEMS Microbiol. Lett., (1995), Bd. 125, Nr. 1, S. 15–21.
WO 91/17243 (Novo Nordisk A/S) offenbart eine Cellulasezubereitung, bestehend aus einem homogenen Endoglucanasebestandteil, der immunoreaktiv mit einem Antikörper ist, der gegen eine stark aufgereinigte 43-kDa-Endoglucanase, die aus Humicola insolens, DSM 1800 abgeleitet ist, gerichtet ist.
WO 91/17244 (Novo Nordisk A/S) offenbart ein neues (Hemi)-Cellulose abbauendes Enzym, wie eine Endoglucanase, eine Cellobiohydrolase oder eine β-Glucosidase, die aus einem anderen Pilz als Trichoderma und Phanerochaete abgeleitet sein kann.
WO 93/20193 offenbart eine aus Aspergillus aculeatus ableitbare Endoglucanase.
WO 94/00578 (Commonwealth Scientific and Industrial Research Organisation) beschreibt ein Verfahren zum Klonieren einer Cellulase mit der Aktivität von anaeroben Pilzen aus Pansen, was Neocallimastix patriciarum einschließt.
WO 94/14953 (Novo Nordisk A/S) beschreibt eine Endoglucanase aus einem Pilz zum Abbauen oder Modifizieren von Pflanzenzellwandbestandteilen, z. B. zum Herstellen von Wein oder Saft, etc. Die Endoglucanase kann abgeleitet sein aus Aspergillus aculeatus, CBS 101.43.
WO 94/21801 (Genencor Inc.) betrifft ein Cellulasesystem, das aus Trichoderma longibrachiatum isoliert wurde, das Endoglucanaseaktivität aufweist.
WO 94/26880 (Gist Brocades N. V.) offenbart ein isoliertes Gemisch von Cellulose abbauenden Enzymen, die bevorzugt aus Trichoderma, Aspergillus oder Disporotrichum erhalten werden, umfassend Endoglucanase-, Cellubiohydrolase- und Xyloglucanaseaktivität.
WO 95/02043 (Novo Nordisk A/S) beschreibt ein Enzym mit Endoglucanaseaktivität, abgeleitet aus Trichoderma harzianum, das für mehrere Zwecke, einschließlich z. B. Abbau oder Modifikation von Pflanzenzellwänden, verwendet werden kann.
Kang, M. G., Park, H. M., Kim, Y. S., Lee, J. R., Kim, Y. K., Lee, Y. H.: Abstract from 94th General Meeting, American Society Microbiology, K-112, 1994, offenbart den Stamm Cephalosporium sp., RYM-202, und die Aufreinigung von 3 Cellulasen (EC 3.2.1.4, P-I, P-II,P-III), mit pH-Wert-Optima in dem alkalischen Bereich.
In Peberdy, J. F., (1987) ist offenbart, dass Cephalosporium-Arten mit einigen Ausnahmen im Allgemeinen jetzt in Acremonium umbenannt wurden.
Endoglucanasen werden weitgehend industriell verwendet, z. B. innerhalb der Detergensindustrie, in der Textilindustrie, in der Papierzellstoffverarbeitung und in der Lebensmittel- und Futterindustrie.
Es gibt ein stetig bestehendes Bedürfnis zum Bereitstellen neuer Endoglucanasen, bevorzugt in Einzelkomponenten- oder Monokomponentenform, die für Anwendungen verwendet werden können, wo eine einzelne oder dominierende Endoglucanaseaktivität wünschenswert ist.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, neue Enzyme mit wesentlich cellulytischer Aktivität bei alkalischen Bedingungen und einer verbesserten Leistung in der Papierzellstoffverarbeitung, Textilbehandlung, Waschverfahren und/oder in Tierfuttermittel bereitzustellen; bevorzugt neue Monokomponentencellulasen, stärker bevorzugt Monokomponentenendoglucanasen, die durch rekombinante Techniken hergestellt werden können.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Es wurde jetzt überraschenderweise festgestellt, dass eine Enzymzusammensetzung, die hohe cellulytische (Endoglucanase-) Aktivität bei alkalischen Bedingungen zeigt, d. h. ein Cellulaseenzym, das herstellbar durch oder ableitbar aus Pilzen der Gattung Acremonium ist, dessen Pilze nicht immunologisch kreuzreaktiv mit Antikörpern sind, die gegen Humicola insolens, DSM 1800, Fusarium oxysporum, DSM 2672, Myceliophthora thermophile, CBS 117.65, und Cephalosporium sp., RYM-202 gerichtet sind.
Da die Pilzorganismen zu Acremonium (oder Cephalosporium) gehören, sind sie allgemein dafür bekannt, zum Herstellen von Antibiotika fähig zu sein, sollte die Cellulase bevorzugt durch rekombinante Techniken hergestellt werden, d. h. sie sollte kloniert und exprimiert werden.
Daher betrifft die vorliegende Erfindung noch genauer neuartige Cellulasen, die ableitbar aus, oder herstellbar durch Pilze sind, die ausgewählt sind aus der Gruppe von Stämmen bestehend aus Acremonium sp., insbesondere Acremonium sp., CBS 478.94.
Es ist ein DNA-Konstrukt offenbart, umfassend eine DNA-Sequenz, die ein Enzym kodiert, das Endoglucanaseaktivität aufweist, dessen DNA-Sequenz die N-terminale DNA-Sequenz umfasst, die in SEQ ID NO: 1 und in der C-terminalen DNA-Sequenz in SEQ ID NO: 2 gezeigt ist, und/oder der DNA-Sequenz, die aus dem Plasmid in Saccharomyces cerevisiae, DSM 10076, erhältlich ist, oder ein Analogon davon; oder dessen DNA-Sequenz, die in SEQ ID NO: 3 gezeigte DNA-Sequenz umfasst, und/oder die DNA-Sequenz, die aus dem Plasmid in Saccharomyces cerevisiae DSM 9969 erhältlich ist, oder ein Analogon davon; oder dessen DNA-Sequenz die in SEQ ID NO: 4 gezeigte DNA-Sequenz umfasst, und/oder die DNA-Sequenz, die aus dem Plasmid in Saccharomyces cerevisiae DSM 9977 erhältlich ist, oder ein Analogon davon; oder dessen DNA-Sequenz die in SEQ ID NO: 5 gezeigte DNA-Sequenz umfasst, und/oder die DNA-Sequenz, die aus dem Plasmid in Saccharomyces cerevisiae DSM 10077 erhältlich ist, oder ein Analogon davon; oder dessen DNA-Sequenz die in SEQ ID NO: 6 gezeigte DNA-Sequenz umfasst, und/oder der DNA-Sequenz, die aus dem Plasmid in Saccharomyces cerevisiae DSM 10079 erhältlich ist, oder ein Analogon davon; oder dessen DNA-Sequenz die N-terminale (partielle) in SEQ ID NO: 7 gezeigte DNA-Sequenz umfasst und/oder die DNA-Sequenz, die aus dem Plasmid in Saccharomyces cerevisiae DSM 10084 erhältlich ist oder ein Analogon davon. Die aus dem/den Plasmid(en) in DSM 10076 und DSM 9969 erhältlichen DNA-Sequenzen haben Acremonium sp., DSM 265.95 als den Spenderorganismus. Die aus dem/den Plasmid(en) in DSM 9977, DSM 10077, DSM 10079 und DSM 10084 erhältlichen DNA-Sequenzen haben Acremonium sp., DSM 487.94 als den Spenderorganismus.
Die Enzymzusammensetzung und die isolierte oder klonierte und exprimierte Cellulase der Erfindung können in einem beliebigen industriellen Verfahren, das eine alkalische Cellulase erfordert, z. B. zum Bereitstellen einer lokalisierten Variation der Farbintensität von gefärbten Stoffen, wie „Stone-Washing" von Jeansstoff, zum Verbessern der Entwässerung einer wässrigen Suspension von Papierzellstoff, für die Druckfarbenentfernung von Recyclingpapier, in Detergenszusammensetzungen und in Weichspülern.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
In dem ursprünglichen Auswahlverfahren von Pilzquellen, die zum Herstellen eines Enzyms mit weitgehend cellulytischer Aktivität bei alkalischen Bedingungen fähig sein kann, kann das Auswahlverfahren für Pilzquellen (erhalten z. B. aus Erde) durch Lösen von Erde, durch direktes Animpfen durch Erdstaub, kleine Partikel oder durch Pflanzenwurzeln auf festen Chapek- und Hetchinson-Medien ausgeführt werden, und die Arten können durch Animpfung von einer isolierten Kultur auf einem herkömmlichen festen Medium in Petrischalen identifiziert werden. Das Vorhandensein von cellulytischer Aktivität kann dann durch visuelle Beobachtung des Pilzwachstums auf Filterpapier oder durch Ausbildung von klaren Zonen auf festen Medien, die amorphe Cellulose enthalten, qualitativ eingeschätzt werden. Weiterhin kann das Vorhandensein von Cellulaseaktivität unter alkalischen Bedingungen eingeschätzt werden durch 7–10 Tage Kultivierung auf Agar-amorpher säuregetränkter Cellulose bei 28°C, Installation des Blocks in Agar HEC-LAS (geradkettiges Alkylbenzolsulfonat, Konzentration 0,12–0,24%) bei pH 9–10,6 und Inkubation bei 40°C für ½–2 Tage und visuelle Feststellung von cellulytischer Aktivität durch Beobachten einer weißen Aufklarungszone in dem blau gefärbten HES (1% AZCL-HEC-Lösung, erhalten von Megazyme, Australien).
In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung eine Enzymzusammensetzung, die abgeleitet aus oder herstellbar durch Pilze ist, die ausgewählt sind aus der Gattung Acremonium. Stärker bevorzugt betrifft die Erfindung eine Enzymzusammensetzung mit Endoglucanaseaktivität, die abgeleitet aus oder herstellbar durch Pilze des Stamms Acremonium sp., CBS 478.94 ist.
Die Stämme Acremonium persicinum, CBS 169.65, Acremonium acremonium, AHU 9519, Acremonium brachypenium, CBS 866.73, Acremonium dichromosporum, CBS 683.73, Acremonium obclavatum, CBS 311.74, Acremonium pinkertoniae, CBS 157.70, Acremonium roseogriseum, CBS 134.56, Acremonium incoloratum CBS 146.62 und Acremonium furatum, CBS 299.70H und Cephalosporium sp., CBS 535.71, werden alle für handelsübliche Stämme gehalten, die in dem Katalog der relevanten Hinterlegungseinrichtung an dem Prioritätstag dieser Patentanmeldung publiziert waren.
Der Stamm, der am 28. September 1994 im Centraalbureau voor Schimmelcultures unter der Nummer CBS 478.94 in Übereinstimmung mit den Vorschriften des Budapester Abkommens hinterlegt wurde, gehört zu Acremonium sp. Die Kultur ist charakterisiert durch ein Hyalinmyzel unter Ausbildung von einzeln auftretenden aufrechten und schlanken Phialiden, aus denen Hyalinkonidien hergestellt werden. Die Phialiden sind durch ein bestimmtes basales Septum begrenzt. Die Konidien sind ellipsoid (0,5–1) × (1–2) μm. Diese Beobachtungen basieren auf einer auf YPG-Agar gewachsenen Kultur.
Der Stamm, der am 7. April 1995 beim Centraalbureau voor Schimmelcultures unter der Nummer CBS 265.95 in Einklang mit den Vorschriften des Budapester Vertrags hinterlegt wurden, gehören zu Acremonium sp.
Das Enzym
In dem vorliegenden Zusammenhang betrifft der Begriff „cellulytische Aktivität" die Fähigkeit des Enzyms, Cellulose zu Glucose, Cellobiose, Triose und anderen Cello-Oligosachariden abzubauen. Diese Fähigkeit kann durch Ausbildung von Aufklarungszonen in einem Carboxymethylcellulose-(CMC)-Gel unter den nachfolgend spezifizierten Bedingungen bestimmt werden.
In dem vorliegenden Zusammenhang wird der Begriff „Enzym" so verstanden, dass er ein reifes Protein oder eine Vorläuferform davon, als auch ein funktionelles Fragment davon, das im Wesentlichen die Aktivität des Enzyms der vollen Länge hat, einschließt. Des Weiteren ist der Begriff „Enzym" dafür vorgesehen, Homologe des Enzyms einzuschließen. Solche Homologe umfassen eine Aminosäuresequenz, die einen Grad an Identität von mindestens 60% mit der Aminosäuresequenz des parentalen Enzyms, d. h. der parentalen Cellulase aufweist. Der Grad an Identität kann bestimmt werden durch herkömmliche Verfahren, siehe z. B. Altshul et al., Bull. Math. Bio. 48: 603–616, 1986, und Henikoff und Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915–10919, 1992. In Kürze, um die Auswertung des Abgleichs zu optimieren, werden zwei Aminosäuresequenzen unter Verwendung einer „gap opening penalty" von 10, einer „gap extension penalty" von 1 und der „blosum 62"-Auswertungsmatrix von Henikoff und Henikoff, supra, abgeglichen.
Alternativ dazu kann das Homolog des Enzyms eines sein, das durch eine Nukleotidsequenz kodiert wird, die mit einer Oligonukleotidsonde hybridisiert, die auf der Basis der Nukleotidsequenz oder einer Aminosäuresequenz unter den folgenden Bedingungen zubereitet wurde:
Vortränken in 5 × SSC und Vorhybridisieren für 1 h bei etwa 40°C in einer Lösung von 20% Formamid, 5 × Denhardt's-Lösung, 50 mM Natriumphosphat, pH 6,8, und 50 μg denaturierter, mit Ultraschall behandelter Kalbsthymus-DNA, gefolgt von Hybridisierung in der gleichen Lösung, ergänzt mit 100 μM ATP für 18 h bei etwa 40°C, gefolgt von einem Waschen in 0,4 × SSC bei einer Temperatur von etwa 45°C.
Moleküle, an die die Oligonukleotidsonde unter diesen Bedingungen hybridisiert, werden unter Verwendung von Standard-Detektionsverfahren (z. B. Southern Blotting) detektiert.
Homologe des vorliegenden Enzyms können eine oder mehrere Aminosäuresubstitutionen, -deletionen oder -additionen haben. Diese Änderungen sind bevorzugt von unbedeutender Natur, d. h. konservative Aminosäuresubstitutionen, die nicht wesentlich die Faltung oder Aktivität des Proteins beeinträchtigen; kleine Deletionen, typischerweise von einer bis etwa 30 Aminosäuren; kleine amino- oder carboxyterminale Verlängerungen, wie ein aminoterminaler Metheoninrest, ein kleines Linkerpeptid von bis zu etwa 20 bis 25 Resten, oder eine kleine Verlängerung, die eine Aufreinigung erlaubt, wie eine Polyhistidin-Anhang, ein antigenes Epitop oder eine Bindungsdomäne. Siehe, im Allgemeinen, Ford et al., Protein Expression and Purification 2: 95–107, 1991. Beispiele für konservative Substitutionen sind innerhalb der Gruppe von basischen Aminosäuren (wie Arginin, Lysin, Histidin), sauren Aminosäuren (wie Glutaminsäure und Asparaginsäure), polaren Aminosäuren (wie Glutamin und Asparagin), hydrophoben Aminosäuren (wie Leucin, Isoleucin, Valin), aromatischen Aminosäuren (wie Phenylalanin, Tryptophan, Tyrosin) und kleinen Aminosäuren (wie Glycin, Alanin, Serin, Threonin, Methionin).
Es ist für den Fachmann ersichtlich, dass solche Substitutionen außerhalb der Regionen gemacht werden können, die für die Funktion des Moleküls kritisch sind und weiterhin in einem aktiven Enzym resultieren. Für die Aktivität des erfindungsgemäßen Enzyms essentielle Aminosäuren, und daher bevorzugt nicht einer Substitution unterzogen, können entsprechend in der Technik bekannten Verfahren, wie ortsspezifische Mutagenese oder Alanin-Scanning-Mutagenese (Cunnignham und Wells, Science 244, 1081–1085, 1989), identifiziert werden. In der letzteren Technik werden Mutationen an jedem Rest in dem Molekül eingeführt, und die resultierenden mutierten Moleküle werden auf cellulytische Aktivität getestet, um Aminosäurereste zu identifizieren, die für die Aktivität des Moleküls kritisch sind. Stellen der Liganden-Rezeptor-Interaktion können auch durch Analyse der Kristallstruktur bestimmt werden, wie bestimmt durch solche Techniken, wie Kernspin-Resonanz, Kristallographie oder Photoaffinitätsmarkierung. Siehe z. B. de Vos et al., Science 255: 306–312, 1992; Smith et al., J. Mol. Biol. 224: 899–904, 1992; Wlodaver et al., FEBS Lett. 309: 59–64, 1992.
Das Homolog kann eine allelische Variante, d. h. eine alternative Form eines Gens sein, das durch Mutation entsteht, oder ein verändertes Enzym, das durch das mutierte Gen kodiert wird, aber mit der wesentlich gleichen Aktivität wie das erfindungsgemäße Enzym. Folglich können Mutationen still (keine Änderung in dem kodierten Enzym) sein oder sie können Enzyme mit einer veränderten Aminosäuresequenz kodieren.
Das Homolog des vorliegenden Enzyms kann auch eine homologe Gattung oder Art sein, d. h. ein Enzym mit einer ähnlichen Aktivität, die aus einer anderen Art abgeleitet wurde.
Ein Homolog des Enzyms kann durch Zubereiten einer genomischen oder cDNA-Bibliothek einer Zelle der fraglichen Art und durch Screenen nach DNA-Sequenzen, die für das gesamte oder einen Teil des Homologs kodieren, unter Verwendung von synthetischen Oligonukleotidsonden, in Einklang mit Standardtechniken, z. B. wie beschrieben durch Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989, oder mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR) unter Verwendung von spezifischen Primern, wie beschrieben durch Sambrook et al., supra.
Das erfindungsgemäße Enzym ist in einer isolierten Form, d. h. bereitgestellt in einem anderen Zustand als in seiner natürlichen Umgebung, welches Erde ist, möglicherweise mongolische Erdsorten. In einer bevorzugten Form ist das isolierte Enzym im Wesentlichen frei von anderen Proteinen, insbesondere anderen Enzymen aus pilzlichem Ursprung. Das Enzym der vorliegenden Erfindung kann z. B. aus Pilzen der Gattung Acremonium isoliert werden, vorausgesetzt, das Enzym ist nicht immunologisch kreuzreaktiv mit Antikörpern, die gegen Endoglucanasen (EC 3.2.1.4) aus Humicola insolens, DSM 1800, Fusarium oxysporum, DSM 2672, Myceliophthora thermophile, CBS 117.65, oder Cephalosporium sp., RYM-202, gerichtet sind. In einer Ausführungsform ist das Enzym der vorliegenden Erfindung erhältlich aus dem Überstand von Acremonium sp., Acremonium persicinum, Acremonium acremonium, Cephalosporium sp., Acremonium brachypenium, Acremonium dichromosporum, Acremonium obclavatum, Acremonium pinkertoniae, Acremonium roseogriseum, Acremonium incoloratum, und Acremonium furatum.
Das isolierte Enzym kann z. B. durch SDS-PAGE charakterisiert werden und unter Verwendung von in der Technik bekannten Verfahren getestet werden. Zum Beispiel hat das erfindungsgemäße Enzym ein pH-Optimum oberhalb etwa 7, stärker bevorzugt oberhalb etwa 8, insbesondere oberhalb etwa 9.
Weiterhin haben das isolierte Enzym und die Enzymzusammensetzung der Erfindung bevorzugt eine relative Aktivität bei pH 10 von mindestens 50%, verglichen zu der Aktivität bei pH 8,5, wobei die Aktivität in Savi-U-Einheiten auf einem geeigneten Substrat gemessen wird.
Bevorzugt sind das isolierte Enzym und die Enzymzusammensetzung der Erfindung in Gegenwart von geradkettigem Natriumalkylbenzolsulfonat, Natriumpolyoxyethylenalkylsulfat, Natriumdodecylsulfat, Natrium-α-Olefinsulfonat, Natriumalkylsulfonat und α-Sulfofettsäureestern stabil.
Es kann bevorzugt sein, das Enzym in einer hochgereinigten Form bereitzustellen, d. h. größer als 90% rein, stärker bevorzugt 95% und am meisten bevorzugt 99% rein, wie durch SDS-PAGE bestimmt.
Es ist ein DNA-Konstrukt offenbart, umfassend eine DNA-Sequenz, die ein Enzym, das Endoglucanaseaktivität aufweist, kodiert, welche DNA-Sequenz umfasst:

a) die N-terminale DNA-Sequenz, die in SEQ ID NO: 1 gezeigt ist und die C-terminale DNA-Sequenz, die in SEQ ID NO: 2 gezeigt ist, und/oder die DNA-Sequenz, die aus dem Plasmid in Saccharomyces cerevisiae, DSM 10076, erhältlich ist, oder
b) ein Analogon der N-terminalen DNA-Sequenz, die in SEQ ID NO: 1 gezeigt ist und der C-terminalen DNA-Sequenz, die in SEQ ID NO: 2 gezeigt ist, und/oder die DNA-Sequenz, die aus dem Plasmid in Saccharomyces cerevisiae, DSM 10076, erhältlich ist, welche
i) homolog mit der N-terminalen DNA-Sequenz ist, die in SEQ ID NO: 1 gezeigt ist und der C-terminalen DNA-Sequenz, die in SEQ ID NO: 2 gezeigt ist, und/oder der DNA-Sequenz, die aus dem Plasmid in Saccharomyces cerevisiae, DSM 10076, erhältlich ist, oder
ii) mit der gleichen Oligonukleotidsonde hybridisiert wie die N-terminale DNA-Sequenz, die in SEQ ID NO: 1 gezeigt ist, und der C-terminalen DNA-Sequenz, die in SEQ ID NO: 2 gezeigt ist, und/oder der DNA-Sequenz, die aus dem Plasmid in Saccharomyces cerevisiae, DSM 10076, erhältlich ist, oder
iii) ein Polypeptid kodiert, welches homolog mit dem Polypeptid ist, das kodiert wird durch eine DNA-Sequenz, umfassend die N-terminale DNA-Sequenz, gezeigt in SEQ ID NO: 1 und die C-terminale DNA-Sequenz, gezeigt in SEQ ID NO: 2, und/oder die DNA-Sequenz, die aus dem Plasmid in Saccharomyces cerevisiae, DSM 10076, erhältlich ist, oder
iv) ein Polypeptid kodiert, welches immunologisch reaktiv mit einem Antikörper ist, der gegen die aufgereinigte Endoglucanase gerichtet ist, die durch die N-terminale DNA-Sequenz, die in SEQ ID NO: 1 gezeigt ist, und die C-terminale DNA-Sequenz, die in SEQ ID NO: 2 gezeigt ist, und/oder die aus dem Plasmid in Saccharomyces cerevisiae, DSM 10076, erhältlich ist, kodiert ist.

Es wird angenommen, dass die N-terminalen und C-terminalen partiellen DNA-Sequenzen, die in SEQ ID NO: 1, bzw. 2 gezeigt sind, identisch sind zu den entsprechenden partiellen DNA-Sequenzen, die aus dem Plasmid in Saccharomyces cerevisiae, DSM 10076, erhältlich sind.
Der Stamm Saccharomyces cerevisiae wurde unter der Hinterlegungsnummer DSM 10076 am 30. Juni 1995 bei der DSM – Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Maascheroder Weg 1b, D-38125 Braunschweig, Deutschland, dem Budapester Vertrag entsprechend hinterlegt.
Es ist ein DNA-Konstrukt beschrieben, umfassend eine DNA-Sequenz, die ein Enzym kodiert, das Endoglucanaseaktivität aufweist, welche DNA-Sequenz umfasst:

a) die DNA-Sequenz, die in SEQ ID NO: 3 gezeigt ist und/oder die DNA-Sequenz, die aus dem Plasmid in Saccharomyces cerevisiae, DSM 9969, erhältlich ist, oder
b) ein Analogon der DNA-Sequenz, die in SEQ ID NO: 3 gezeigt ist und/oder der DNA-Sequenz, die aus dem Plasmid in Saccharomyces cerevisiae, DSM 9969, erhältlich ist, welche
i) homolog mit der DNA-Sequenz ist, die in SEQ ID NO: 3 und/oder der DNA-Sequenz, die aus dem Plasmid in Saccharomyces cerevisiae, DSM 9969, erhältlich ist, oder
ii) mit der gleichen Oligonukleotidsonde hybridisiert wie die DNA-Sequenz, die in SEQ ID NO: 3 gezeigt ist, und/oder der DNA-Sequenz, die aus dem Plasmid in Saccharomyces cerevisiae, DSM 9969, erhältlich ist, oder
iii) ein Polypeptid kodiert, welches homolog zu dem Polypeptid ist, das durch eine DNA-Sequenz kodiert ist, umfassend die DNA-Sequenz, die in SEQ ID NO: 3 gezeigt ist und/oder die DNA-Sequenz, die aus dem Plasmid in Saccharomyces cerevisiae, DSM 9969, erhältlich ist, oder
iv) ein Polypeptid kodiert, welches immunologisch reaktiv mit einem Antikörper ist, der gegen die gereinigte Endoglucanase gerichtet ist, die durch die DNA-Sequenz kodiert wird, die in SEQ ID NO: 3 gezeigt ist, und/oder erhältlich ist aus dem Plasmid in Saccharomyces cerevisiae, DSM 9969.

Es wird angenommen, dass die DNA-Sequenz, die in SEQ ID NO: 3 gezeigt ist, identisch zu den entsprechenden partiellen DNA-Sequenzen ist, die aus dem Plasmid in Saccharomyces cerevisiae, DSM 9969, erhältlich sind.
Der Stamm Saccharomyces cerevisiae wurde unter der Hinterlegungsnummer DSM 9969 am 11. Mai 1995 bei der DSM – Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Maascheroder Weg 1b, D-38125 Braunschweig, Deutschland, entsprechend dem Budapester Vertrag hinterlegt.
Es ist ein DNA-Konstrukt beschrieben, umfassend eine DNA-Sequenz, die ein Enzym kodiert, das Endoglucanaseaktivität aufweist, welche DNA-Sequenz umfasst:

a) die DNA-Sequenz, die in SEQ ID NO: 4 gezeigt ist und/oder die DNA-Sequenz, die aus dem Plasmid in Saccharomyces cerevisiae, DSM 9977, erhältlich ist, oder
b) ein Analogon der DNA-Sequenz, die in SEQ ID NO: 4 gezeigt ist und/oder der DNA-Sequenz, die aus dem Plasmid in Saccharomyces cerevisiae, DSM 9977, erhältlich ist, welches
i) homolog mit der DNA-Sequenz ist, die in SEQ ID NO: 4 gezeigt ist, und/oder der DNA-Sequenz, die aus dem Plasmid in Saccharomyces cerevisiae, DSM 9977, erhältlich ist, oder
ii) mit der gleichen Oligonukleotidsonde hybridisiert wie die DNA-Sequenz, die in SEQ ID NO: 4 gezeigt ist, und/oder der DNA-Sequenz, die aus dem Plasmid in Saccharomyces cerevisiae, DSM 9977, erhältlich ist, oder
iii) ein Polypeptid kodiert, welches homolog zu dem Polypeptid ist, das durch eine DNA-Sequenz kodiert wird, umfassend die DNA-Sequenz, die in SEQ ID NO: 4 gezeigt ist und/oder der DNA-Sequenz, die aus dem Plasmid in Saccharomyces cerevisiae, DSM 9977, erhältlich ist, oder
iv) ein Polypeptid kodiert, welches immunologisch reaktiv mit einem Antikörper ist, der gegen die gereinigte Endoglucanase gerichtet ist, die durch die DNA-Sequenz kodiert wird, die in SEQ ID NO: 4 gezeigt ist, und/oder erhältlich ist aus dem Plasmid in Saccharomyces cerevisiae, DSM 9977.

Es wird angenommen, dass die DNA-Sequenz, die in SEQ ID NO: 4 gezeigt ist, identisch zu den entsprechenden partiellen DNA-Sequenzen ist, die aus dem Plasmid in Saccharomyces cerevisiae, DSM 9977, erhältlich sind.
Der Stamm Saccharomyces cerevisiae wurde unter der Hinterlegungsnummer DSM 9977 am 11. Mai 1995 bei der DSM – Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Maascheroder Weg 1b, D-38125 Braunschweig, Deutschland, entsprechend dem Budapester Vertrag hinterlegt.
Es ist ein DNA-Konstrukt offenbart, umfassend eine DNA-Sequenz, die ein Enzym kodiert, das Endoglucanaseaktivität aufweist, welche DNA-Sequenz umfasst:

a) die DNA-Sequenz, die in SEQ ID NO: 5 gezeigt ist, und/oder die DNA-Sequenz, die aus dem Plasmid in Saccharomyces cerevisiae, DSM 10077, erhältlich ist, oder
b) ein Analogon der DNA-Sequenz, die in SEQ ID NO: 5 gezeigt ist und/oder der DNA-Sequenz, die aus dem Plasmid in Saccharomyces cerevisiae, DSM 10077, erhältlich ist, welche
i) homolog mit der DNA-Sequenz ist, die in SEQ ID NO: 5 gezeigt ist, und/oder der DNA-Sequenz, die aus dem Plasmid in Saccharomyces cerevisiae, DSM 10077, erhältlich ist, oder
ii) mit der gleichen Oligonukleotidsonde hybridisiert wie die DNA-Sequenz, die in SEQ ID NO: 5 gezeigt ist, und/oder der DNA-Sequenz, die aus dem Plasmid in Saccharomyces cerevisiae, DSM 10077, erhältlich ist, oder
iii) ein Polypeptid kodiert, welches homolog mit dem Polypeptid ist, das durch eine DNA-Sequenz kodiert wird, umfassend die DNA-Sequenz, die in SEQ ID NO: 5 gezeigt ist und/oder der DNA-Sequenz, die aus dem Plasmid in Saccharomyces cerevisiae, DSM 10077, erhältlich ist, oder
iv) ein Polypeptid kodiert, welches immunologisch reaktiv mit einem Antikörper ist, der gegen die aufgereinigte Endoglucanase gerichtet ist, die durch die DNA-Sequenz kodiert wird, die in SEQ ID NO: 5 gezeigt ist, und/oder die aus dem Plasmid in Saccharomyces cerevisiae, DSM 10077, erhältlich ist.

Es wird angenommen, dass die DNA-Sequenz, die in SEQ ID NO: 5 gezeigt ist, zu den entsprechenden partiellen DNA-Sequenzen, die aus dem Plasmid in Saccharomyces cerevisiae, DSM 10077, erhältlich sind, identisch ist.
Der Stamm Saccharomyces cerevisiae wurde unter der Hinterlegungsnummer DSM 10077 am 30. Juni 1995 bei der DSM – Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Maascheroder Weg 1b, D-38125 Braunschweig, Deutschland, entsprechend dem Budapester Vertrag hinterlegt.
In noch einem weiteren Aspekt ist ein DNA-Konstrukt offenbart, umfassend eine DNA-Sequenz, die ein Enzym kodiert, das Endoglucanaseaktivität aufweist, welche DNA-Sequenz umfasst:

a) die DNA-Sequenz, die in SEQ ID NO: 6 gezeigt ist, und/oder die DNA-Sequenz, die aus dem Plasmid in Saccharomyces cerevisiae, DSM 10079, erhältlich ist, oder
b) ein Analogon der DNA-Sequenz, die in SEQ ID NO: 6 gezeigt ist, und/oder der DNA-Sequenz, die aus dem Plasmid in Saccharomyces cerevisiae, DSM 10079, erhältlich ist, welche
i) homolog mit der DNA-Sequenz ist, die in SEQ ID NO: 6 gezeigt ist, und/oder der DNA-Sequenz, die aus dem Plasmid in Saccharomyces cerevisiae, DSM 10079, erhältlich ist, oder
ii) mit der gleichen Oligonukleotidsonde hybridisiert wie die DNA-Sequenz, die in SEQ ID NO: 6 gezeigt ist, und/oder der DNA-Sequenz, die aus dem Plasmid in Saccharomyces cerevisiae, DSM 10079, erhältlich ist, oder
iii) ein Polypeptid kodiert, welches homolog zu dem Polypeptid ist, das durch eine DNA-Sequenz kodiert wird, umfassend die DNA-Sequenz, die in SEQ ID NO: 6 gezeigt ist, und/oder der DNA-Sequenz, die aus dem Plasmid in Saccharomyces cerevisiae, DSM 10079, erhältlich ist, oder
iv) ein Polypeptid kodiert, welches immunologisch reaktiv mit einem Antikörper ist, der gegen die gereinigte Endoglucanase gerichtet ist, die durch die DNA-Sequenz kodiert wird, die in SEQ ID NO: 6 gezeigt ist, und/oder erhältlich ist aus dem Plasmid in Saccharomyces cerevisiae, DSM 10079.

Es wird angenommen, dass die DNA-Sequenz, die in SEQ ID NO: 6 gezeigt ist, identisch zu den entsprechenden partiellen DNA-Sequenzen ist, die aus dem Plasmid in Saccharomyces cerevisiae, DSM 10079, erhältlich sind.
Der Stamm Saccharomyces cerevisiae wurde unter der Hinterlegungsnummer DSM 10079 am 30. Juni 1995 bei der DSM – Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Maascheroder Weg 1b, D-38125 Braunschweig, Deutschland, entsprechend dem Budapester Vertrag hinterlegt.
Es ist ein DNA-Konstrukt offenbart, umfassend eine DNA-Sequenz, die ein Enzym kodiert, das Endoglucanaseaktivität aufweist, welche DNA-Sequenz umfasst:

a) die N-terminale DNA-Sequenz, die in SEQ ID NO: 7 gezeigt ist, und/oder die DNA-Sequenz, die aus dem Plasmid in Saccharomyces cerevisiae, DSM 10084, erhältlich ist, oder
b) ein Analogon der N-terminalen DNA-Sequenz, die in SEQ ID NO: 7 gezeigt ist, und/oder der DNA-Sequenz, die aus dem Plasmid in Saccharomyces cerevisiae, DSM 10084, erhältlich ist, welche
i) homolog mit der N-terminalen DNA-Sequenz ist, die in SEQ ID NO: 7 gezeigt ist, und/oder der DNA-Sequenz, die aus dem Plasmid in Saccharomyces cerevisiae, DSM 10084, erhältlich ist, oder
ii) mit der gleichen Oligonukleotidsonde hybridisiert wie die N-terminale DNA-Sequenz, die in SEQ ID NO: 7 gezeigt ist, und/oder der DNA-Sequenz, die aus dem Plasmid in Saccharomyces cerevisiae, DSM 10084, erhältlich ist, oder
iii) ein Polypeptid kodiert, welches homolog zu dem Polypeptid ist, das durch eine DNA-Sequenz kodiert wird, umfassend die N-terminale DNA-Sequenz, die in SEQ ID NO: 7 gezeigt ist, und/oder der DNA-Sequenz, die aus dem Plasmid in Saccharomyces cerevisiae, DSM 10084, erhältlich ist, oder
iv) ein Polypeptid kodiert, welches immunologisch reaktiv mit einem Antikörper ist, der gegen die aufgereinigte Endoglucanase gerichtet ist, die durch die N-terminale DNA-Sequenz kodiert wird, die in SEQ ID NO: 7 gezeigt ist, und/oder erhältlich ist aus dem Plasmid in Saccharomyces cerevisiae, DSM 10084.

Es wird angenommen, dass die N-terminale partielle DNA-Sequenz, die in SEQ ID NO: 7 gezeigt ist, identisch zu den entsprechenden partiellen DNA-Sequenzen ist, die aus dem Plasmid in Saccharomyces cerevisiae, DSM 10084, erhältlich sind.
Der Stamm Saccharomyces cerevisiae wurde unter der Hinterlegungsnummer DSM 10084 am 30. Juni 1995 bei der DSM – Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Maascheroder Weg 1b, D-38125 Braunschweig, Deutschland, entsprechend dem Budapester Vertrag hinterlegt.
In dem vorliegenden Zusammenhang ist das „Analogon" der partiellen DNA-Sequenzen, die in SEQ ID NO: 1 oder 2 oder 3 oder 4 oder 5 oder 6 gezeigt sind, dafür vorgesehen, eine beliebige DNA-Sequenz anzudeuten, die ein Enzym kodiert, das Endoglucanaseaktivität aufweist, welche eine beliebige oder alle der Eigenschaften i)–iv) hat. Die analoge DNA-Sequenz

a) kann aus einem anderen oder verwandten (z. B. dem gleichen) Organismus isoliert werden, der das Enzym mit Endoglucanaseaktivität auf der Basis der DNA-Sequenzen, die in SEQ ID NO: 1 oder 2 oder 3 oder 4 oder 5 oder 6 gezeigt sind, herstellt, z. B. unter Verwendung der hierin beschriebenen Verfahren, und kann daher z. B. eine allelische oder Art-Variante der DNA-Sequenz sein, die die hierin gezeigten DNA-Sequenzen umfasst,
b) kann auf Basis der DNA-Sequenzen hergestellt sein, die in SEQ ID NO: 1 oder 2 oder 3 oder 4 oder 5 oder 6 gezeigt sind, z. B. durch Einführung von Nukleotidsubstitutionen, welche nicht zu einer anderen Aminosäuresequenz der Endoglucanase führen, die durch die DNA-Sequenz kodiert ist, aber welche der Kodon-Verwendung des Wirtsorganismus, der für die Herstellung des Enzyms vorgesehen ist, entspricht, oder durch Einführung von Nukleotidsubstitutionen, welche zu einer unterschiedlichen Aminosäuresequenz führen. In dem letzteren Fall sind die Aminosäureaustausche jedoch bevorzugt von einer geringfügiger Natur, d. h. konservative Aminosäuresubstitutionen, die nicht wesentlich die Faltung oder Aktivität des Proteins beeinträchtigen, kleine Deletionen, typischerweise von einer bis etwa 30 Aminosäuren; kleine Amino- oder carboxyterminale Verlängerungen, wie ein aminoterminale Methioninrest, ein kleines Linkerpeptid von bis zu etwa 20 bis 25 Resten, oder eine kleine Verlängerung, die eine Aufreinigung ermöglicht, wie ein Polyhistidin-Anhang, ein antigenes Epitop oder eine Bindungsdomäne. Siehe im Allgemeinen Ford et al., Protein Expression and Purification 2: 95–107, 1991. Beispiele für konservative Substitutionen sind innerhalb der Gruppe von basischen Aminosäuren (wie Arginin, Lysin, Histidin), sauren Aminosäuren (wie Glutaminsäure und Asparaginsäure), polare Aminosäuren (wie Glutamin und Asparagin), hydrophobe Aminosäuren (wie Leucin, Isoleucin, Valin), aromatische Aminosäuren (wie Phenylalanin, Tryptophan, Tyrosin) und kleine Aminosäuren (wie Glycin, Alanin, Serin, Threonin, Methionin).

Es ist für den Fachmann ersichtlich, dass solche Substitutionen außerhalb der Regionen gemacht werden können, die für die Funktion des Moleküls kritisch sind und weiterhin in einem aktiven Polypeptid resultieren. Für die Aktivität des Polypeptids wesentliche Aminosäuren, die durch das erfindungsgemäße DNA-Konstrukt kodiert werden, und daher bevorzugt nicht einer Substitution unterzogen werden, können durch im Stand der Technik bekannte Verfahren identifiziert werden, wie ortsspezifische Mutagenese oder Alanin-Scanning-Mutagenese (Cunnignham und Wells, Science 244, 1081–1085, 1989). In der letzteren Technik werden Mutationen an jedem Rest in dem Molekül eingeführt, und die resultierenden mutierten Moleküle werden auf ihre biologische (Endoglucanase-) Aktivität getestet, um die Aminosäurereste zu identifizieren, die für die Aktivität des Moleküls kritisch sind. Stellen der Substrat-Enzym-Interaktion können auch durch Analyse der Kristallstruktur, wie bestimmt durch solche Techniken wie Kernspin-Resonanz, Kristallographie oder Photoaffinitätsmarkierung, bestimmt werden. Siehe z. B. de Vos et al., Science 255: 306–312, 1992; Smith et al., J. Mol. Biol. 224: 899–904, 1992; Wlodaver et al., FEBS Lett. 309: 59–64, 1992.
Die Endoglucanase, die durch die DNA-Sequenz des erfindungsgemäßen DNA-Konstrukts kodiert wird, kann eine Cellulose-Bindungsdomäne (CBD) umfassen, die als ein integraler Teil des kodierten Enzyms besteht, oder eine CBD aus einem anderen Ursprung kann in das Endoglucanaseenzym eingeführt werden.
Die obenstehend in i) genannte Homologie wird bestimmt als der Grad an Identität zwischen zwei Sequenzen, der eine Abstammung der ersten Sequenz von der zweiten andeutet. Die Homologie kann geeigneterweise mittels im Stand der Technik bekannter Computerprogramme bestimmt werden, wie GAP, bereitgestellt in dem GCG-Programmpaket (Needleman, S. B. und Wunsch, C. D., Journal of Molecular Biology, 48: 443–453, 1970). Unter Verwendung von GAP mit den folgenden Einstellungen für einen DNA-Sequenzvergleich: GAP creation penalty von 5,0 und GAP extension penalty von 0,3, weist der kodierende Bereich der DNA-Sequenz einen Grad an Identität von bevorzugt mindestens 40%, stärker bevorzugt mindestens 50%, stärker bevorzugt mindestens 60%, stärker bevorzugt mindestens 70%, noch stärker bevorzugt mindestens 80%, insbesondere mindestens 90%, mit dem kodierenden Bereich der (vollständigen oder partiellen) DNA-Sequenzen, die jeweils in SEQ ID NO: 1 oder 2 oder 3 oder 4 oder 5 oder 6 oder 7 gezeigt sind, oder der/den DNA-Sequenz(en), die aus dem jeweiligen Plasmid in Saccharomyces cerevisiae, DSM 10076, DSM 9969, DSM 9977, DSM 10077, DSM 10079 oder DSM 10084 erhältlich ist/sind.
Die obenstehend in ii) genannte Hybridisierung ist dafür vorgesehen anzudeuten, dass die analoge DNA-Sequenz zu der gleichen Sonde hybridisiert wie die DNA-Sequenz, die das Endoglucanaseenzym kodiert, unter bestimmten spezifizierten Bedingungen, die im Detail in dem „Materialien und Methoden"-Abschnitt hiernach beschrieben sind. Normalerweise ist die analoge DNA-Sequenz hoch homolog zu der DNA-Sequenz, z. B. mindestens 70% homolog zu den (vollständigen oder partiellen) jeweiligen DNA-Sequenzen, die in SEQ ID NO: 1 oder 2 oder 3 oder 4 oder 5 oder 6 oder 7 gezeigt sind, die eine erfindungsgemäße Endoglucanase kodieren, z. B. mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90% oder sogar mindestens 95% homolog zu der DNA-Sequenz.
Die obenstehend in iii) genannte Homologie wird bestimmt als der Grad an Identität zwischen den beiden Sequenzen, der eine Abstammung der ersten Sequenz von der zweiten andeutet. Die Homologie kann geeigneterweise mittels im Stand der Technik bekannter Computerprogramme bestimmt werden, wie GAP, das in dem GCG-Programmpaket bereitgestellt ist (Needleman, S. B. und Wunsch, C. D., Journal of Molecular Biology, 48: 443–453, 1970). Unter Verwendung von GAP mit den folgenden Einstellungen für einen Polypeptid-Sequenzvergleich: GAP creation penalty von 3,0 und GAP extension penalty von 0,1, weist das durch eine analoge DNA-Sequenz kodierte Polypeptid einen Grad an Identität von bevorzugt mindestens 70%, stärker bevorzugt mindestens 80%, insbesondere mindestens 90% mit dem Enzym auf, das durch ein DNA-Konstrukt kodiert wird, das die (vollständige oder partielle) jeweilige DNA-Sequenz umfasst, die in SEQ ID NO: 1 oder 2 oder 3 oder 4 oder 5 oder 6 oder 7 gezeigt ist, oder die DNA-Sequenz, die jeweils aus dem Plasmid in Saccharomyces cerevisiae, DSM 10076, DSM 9969, DSM 9977, DSM 10077, DSM 10079 oder DSM 10084 erhältlich ist.
In Verbindung mit der obenstehenden Eigenschaft iv) ist es beabsichtigt, eine Endoglucanase anzudeuten, die durch eine DNA-Sequenz, die aus dem jeweiligen Stamm DSM 10076 oder DSM 9969 oder DSM 9977 oder DSM 10077 oder DSM 10079 oder DSM 10084 isoliert ist, kodiert ist, und in einem mit der DNA-Sequenz transformierten Wirtsorganismus hergestellt ist, oder durch den jeweiligen Stamm DSM 10076 oder DSM 9969 oder DSM 9977 oder DSM 10077 oder DSM 10079 oder DSM 10084 hergestellt ist. Die immunologische Reaktivität kann durch das in dem „Materialien und Methoden"-Abschnitt beschriebene Verfahren bestimmt werden.
In weiteren Aspekten werden ein Expressionsvektor, der ein erfindungsgemäßes DNA-Konstrukt enthält, eine Zelle, umfassend das DNA-Konstrukt oder den Expressionsvektor und ein Verfahren zum Herstellen eines Enzyms, das Endoglucanaseaktivität aufweist, offenbart, welches Verfahren das Kultivieren der Zelle unter Bedingungen, die die Herstellung des Enzyms erlauben und das Rückgewinnen des Enzyms aus der Kultur, umfasst.
In einem noch weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Enzym, das Endoglucanaseaktivität aufweist, welches Enzym

a) durch ein erfindungsgemäßes DNA-Konstrukt kodiert ist,
b) durch das erfindungsgemäße Verfahren hergestellt ist, und/oder
c) immunologisch reaktiv mit einem Antikörper ist, der gegen eine aufgereinigte Endoglucanase gerichtet ist, die durch die (vollständige oder partielle) jeweilige DNA-Sequenz, die in SEQ ID NO: 1 oder 2 oder 3 oder 4 oder 5 oder 6 oder 7 gezeigt ist, oder die DNA-Sequenz, die aus dem jeweiligen Plasmid in Saccharomyces cerevisiae, DSM 10076 oder DSM 9969 oder DSM 9977 oder DSM 10077 oder DSM 10079 oder DSM 10084 erhältlich ist, kodiert ist.

Die obenstehend in c) erwähnte Endoglucanase kann durch die DNA-Sequenz, die aus dem jeweiligen Stamm Saccharomyces cerevisiae, DSM 10076 oder DSM 9969 oder DSM 9977 oder DSM 10077 oder DSM 10079 oder DSM 10084 isoliert ist, kodiert werden, und in einem mit der DNA-Sequenz transformierten Wirtsorganismus hergestellt werden oder durch den jeweiligen Stamm DSM 10076 oder DSM 9969 oder DSM 9977 oder DSM 10077 oder DSM 10079 oder DSM 10084 hergestellt werden.
Expressionsklonierung in Hefe
Die erfindungsgemäße DNA-Sequenz, die ein Enzym kodiert, das Endoglucanaseaktivität aufweist, kann durch ein allgemeines Verfahren isoliert werden, einbeziehend

– Klonieren einer DNA-Bibliothek aus Acremonium sp., insbesondere aus Acremonium sp., CBS 478.94 in geeignete Vektoren,
– Transformieren geeigneter Hefewirtszellen mit den Vektoren,
– Kultivieren der Wirtszellen unter geeigneten Bedingungen, um ein beliebiges Enzym von Interesse, das durch einen Klon in der DNA-Bibliothek kodiert ist, zu exprimieren,
– Screenen auf positive Klone durch Bestimmen jeglicher Endoglucanaseaktivität des Enzyms, das durch solche Klone hergestellt wird, und
– Isolieren der enzymkodierenden DNA aus solchen Klonen.

Das allgemeine Verfahren ist weiterhin offenbart in WO 94/14953 . Eine detailliertere Beschreibung des Auswahlverfahrens ist im nachstehenden Beispiel 6 gegeben.
Die DNA-Sequenz, die für das Enzym kodiert, kann z. B. durch Screenen einer cDNA-Bibliothek von Acremonium sp. isoliert werden, und Auswählen von Klonen, die die geeignete Enzymaktivität (d. h. Endoglucanaseaktivität) exprimieren oder aus Saccharomyces cerevisiae, DSM 10076 oder DSM 10077 oder DSM 10079 oder DSM 10084, jeweils hinterlegt gemäß dem Budapester Abkommen am 30. Juni 1995 bei der DSM (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Maascheroder Weg 16, D-38124 Braunschweig, Deutschland) oder aus Saccharomyces cerevisiae, DSM 9969 oder DSM 9977, jeweils hinterlegt gemäß dem Budapester Abkommen am 11. Mai 1995 bei der DSM (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH). Die geeignete DNA-Sequenz kann dann aus dem Klon durch Standardverfahren, z. B. wie beschrieben in Beispiel 6, isoliert werden.
Es wird erwartet, dass eine DNA-Sequenz, die für ein homologes Enzym kodiert, d. h. eine analoge DNA-Sequenz, aus anderen Mikroorganismen erhältlich ist. Zum Beispiel kann die DNA-Sequenz durch ähnliches Screenen einer cDNA-Bibliothek eines anderen Pilzes, z. B. ein Stamm eines Aspergillus sp., insbesondere ein Stamm von A. aculeatus oder A. niger, ein Stamm von Trichoderma sp., insbesondere ein Stamm von Z reesei, Z viride, T. longibrachiatum, T. harzianum oder T. koningii oder ein Stamm von Fusarium sp., insbesondere ein Stamm von F. oxysporum oder ein Stamm von einem Humicola sp., oder ein Stamm von einem Neocallimastix sp., ein Piromyces sp., ein Penicillium sp., ein Agaricus sp. oder ein Phanerochaete sp. abgeleitet sein.
Alternativ dazu kann die DNA, die für eine erfindungsgemäße Endoglucanase kodiert, in Einklang mit gut bekannten Verfahren, zweckmäßig aus DNA aus einer geeigneten Quelle, wie ein beliebiger der obenstehend erwähnten Organismen, durch Verwenden von synthetischen Oligonukleotidsonden, die auf der Basis von einer hierin offenbarten DNA-Sequenz hergestellt sind, isoliert werden. Eine geeignete Oligonukleotidsonde kann z. B. auf der Basis der jeweiligen Nukleotidsequenz hergestellt sein, die in einer beliebigen der (vollständigen oder partiellen) Sequenzen gezeigt ist, die in SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 oder 7 verzeichnet sind, oder einer geeigneten Subsequenz davon.
Eine große Auswahl von Indikatorsystemen für die unterschiedlichen Arten von Enzymen kann für das Screenen von Hefekolonien auf Agarplatten verwendet werden. Cellulasen und Endoglucanasen können z. B. durch Aufklarungszonen in Carboxymethylcellulose nach Färben mit Kongorot identifiziert werden.
Nukleinsäurekonstrukt
Wie hierin verwendet, ist der Begriff „Nukleinsäurekonstrukt" dafür vorgesehen, ein beliebiges Nukleinsäuremolekül von eDNA-, genomischem DNA-, synthetischem DNA- oder RNA-Ursprung anzudeuten. Der Begriff „Konstrukt" ist dafür vorgesehen, ein Nukleinsäuresegment anzudeuten, welches einzel- oder doppelsträngig sein kann und welches auf einer kompletten oder partiellen natürlich vorkommenden Nukleotidsequenz, die ein Enzym von Interesse kodiert, basieren kann. Das Konstrukt kann wahlweise andere Nukleinsäuresegmente enthalten.
Das Nukleinsäurekonstrukt, das das erfindungsgemäße Enzym kodiert, kann geeigneterweise von genomischem oder cDNA-Ursprung sein, z. B. erhalten durch Herstellen einer genomischen oder cDNA-Bibliothek und Screenen auf DNA-Sequenzen, die für das gesamte oder einen Teil des Enzyms kodiert, durch Hybridisierung unter Verwendung von synthetischen Oligonukleotidsonden in Einklang mit Standardtechniken (siehe Sambrook et al., supra).
Das das Enzym kodierende Nukleinsäurekonstrukt kann auch synthetisch durch etablierte Standardverfahren, z. B. das Phosphoramiditverfahren, beschrieben durch Beaucage und Caruthers, Tetrahedron Letters 22 (1981), 1859–1869, oder dem Verfahren, beschrieben durch Matthes et al., EMBO Journal 3 (1984), 801–805, hergestellt werden. Entsprechend dem Phosphoramiditverfahren werden Oligonukleotide synthetisiert, z. B. in einem automatisierten DNA-Synthesizer, gereinigt, angelagert, ligiert und kloniert in geeignete Vektoren.
Weiterhin kann das Nukleinsäurekonstrukt von gemischtem synthetischem und genomischem, gemischtem synthetischem und cDNA- oder gemischtem genomischem und cDNA-Ursprung sein, hergestellt durch Ligieren von Fragmenten aus (gegebenenfalls) synthetischem, genomischem oder cDNA-Ursprung, wobei die Fragmente verschiedenen Teilen des gesamten Nukleinsäurekonstrukts entsprechen, im Einklang mit Standardtechniken.
Das Nukleinsäurekonstrukt kann auch durch Polymerasekettenreaktionen unter Verwendung von synthetischen Primern, z. B. wie beschrieben in US 4,683,202 oder Saiki et al., Science 239 (1988), 487–491 hergestellt werden.
Das Nukleinsäurekonstrukt ist bevorzugt ein DNA-Konstrukt, wobei dieser Begriff ausschließlich in dieser Beschreibung und den Ansprüchen verwendet wird.
Rekombinanter Vektor
Ein rekombinanter Vektor, umfassend ein DNA-Konstrukt, das das erfindungsgemäße Enzym kodiert, kann ein beliebiger Vektor sein, welcher zweckmäßigerweise rekombinanten DNA-Verfahren unterzogen wird, und die Wahl des Vektors hängt oft von der Wirtszelle ab, in die er eingeführt werden soll. Daher kann der Vektor ein autonom replizierender Vektor sein, d. h. ein Vektor, der als eine extrachromosomale Einheit vorliegt, dessen Replikation unabhängig von chromosomaler Replikation ist, z. B. ein Plasmid. Alternativ dazu kann der Vektor einer sein, welcher, wenn er in eine Wirtszelle eingeführt wird, in das Wirtszellgenom integriert ist und zusammen mit dem/den Chromosom(en), in das/die er integriert wurde, zusammen repliziert wird.
Der Vektor ist bevorzugt ein Expressionsvektor, in dem die DNA-Sequenz, die das erfindungsgemäße Enzym kodiert, funktionsfähig mit zusätzlichen Segmenten verknüpft ist, die für die Transkription der DNA benötigt sind. Im Allgemeinen ist der Expressionsvektor abgeleitet aus einem Plasmid oder aus viraler DNA, oder kann Elemente von beiden enthalten. Der Begriff „funktionsfähig verknüpft" deutet an, dass die Segmente so angeordnet sind, dass sie für ihre beabsichtigten Zwecke zusammenarbeiten, z. B. die Transkription in einem Promotor initiiert und sich über die DNA-Sequenz, die für das Enzym kodiert, fortsetzt.
Der Promotor kann eine beliebige DNA-Sequenz sein, welche transkriptionelle Aktivität in der Wirtszelle der Wahl zeigt, und kann aus Genen abgeleitet sein, die gegenüber der Wirtszelle entweder homologe oder heterologe Proteine kodieren.
Beispiele für geeignete Promotoren zur Verwendung in Hefewirtszellen schließen Promotoren aus glykolytischen Genen der Hefe (Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255 (1980), 12073–12080; Alber und Kawasaki, J. Mol. Appl. Gen. 1 (1982), 419–434) oder Alkoholdehydrogenase-Gene (Young et al., in Genetic Engineering of Microorganisms for Chemicals (Hollaender et al, Hrsg.), Plenum Press, New York, 1982), oder die TPI1-( US 4,599,311 ) oder ADH2-4c-(Russell et al., Nature 304 (1983), 652–654)-Promotoren ein.
Beispiele für geeignete Promotoren zur Verwendung in filamentösen Pilzwirtszellen sind z. B. der ADH3-Promotor (McKnight et al., The EMBO J. 4 (1985), 2093–2099) oder der tpiA-Promotor. Beispiele für andere verwendbare Promotoren sind solche, die aus den Genen abgeleitet sind, die die A. oryzae TAKA-Amylase, Rhizomucor miehei Aspartat-Proteinase, A. niger neutrale α-Amylase, A. niger säurestabile α-Amylase, A. niger oder A. awamori Glucoamylase (gluA), Rhizomucor miehei Lipase, A. oryzae alkalische Protease, A. oryzae Triosephosphatisomerase oder A. nidulans Acetamidase kodieren. Bevorzugt sind die TAKA-Amylase und gluA-Promotoren.
Beispiele für geeignete Promotoren zur Verwendung in bakteriellen Wirtszellen schließen den Promotor des Bacillus stearothermophilus maltogene Amylase-Gens, des Bacillus licheniformis alpha Amylase-Gens, des Bacillus amyloliquefaciens BAN Amylase-Gens, des Bacillus subtilis alkalische Protease-Gens oder des Bacillus pumilus Xylosidase-Gens oder die Lambda-Phage P_R- oder P_L-Promotoren oder die E. coli lac-, trp- oder tac-Promotoren ein.
Die das erfindungsgemäße Enzym kodierende DNA-Sequenz kann auch, wenn notwendig, funktionsfähig mit einem geeigneten Terminator verbunden sein.
Der erfindungsgemäße rekombinante Vektor kann weiterhin eine DNA-Sequenz umfassen, die es dem Vektor ermöglicht, in der fraglichen Wirtszelle zu replizieren.
Der Vektor kann auch einen Selektionsmarker umfassen, z. B. ein Gen, dessen Produkt einen Defekt in der Wirtszelle ergänzt, wie das Gen, das für die Dihydrofolatreduktase (DHFR) kodiert oder das Schizosaccharomyces pombe TPI-Gen (beschrieben durch P. R. Russell, Gene 40, 1985, S. 125–130). Selektionsmarker für filamentöse Pilze schließen amdS, pyrG, argB, niaD, sC ein.
Um ein Enzym der vorliegenden Erfindung in den sekretorischen Weg der Wirtszelle zu steuern, kann eine sekretorische Signalsequenz (auch bekannt als eine Leadersequenz, Präprosequenz oder Präsequenz) in dem rekombinanten Vektor bereitgestellt werden. Die sekretorische Signalsequenz ist mit der DNA-Sequenz, die das Enzym kodiert, in dem richtigen Leseraster verbunden. Sekretorische Signalsequenzen sind allgemein 5' zu der DNA-Sequenz, die das Enzym kodiert, positioniert. Die sekretorische Signalsequenz kann jene sein, die normalerweise mit dem Enzym assoziiert ist, oder kann aus einem Gen sein, das ein anderes sekretiertes Protein kodiert.
Für die Sekretion aus Hefezellen kann die sekretorische Signalsequenz ein beliebiges Signalpeptid kodieren, welches eine wirksame Steuerung des exprimierten Enzyms in den sekretorischen Weg der Zelle gewährleistet. Das Signalpeptid kann ein natürlich vorkommendes Signalpeptid sein, oder ein funktioneller Teil davon, oder es kann ein synthetisches Peptid sein. Als geeignete Signalpeptide wurden das α-Faktor-Signalpeptid (siehe US 4,870,008 ), das Signalpeptid der Maus-Speichel-Amylase (siehe O. Hagenbuchle et al., Nature 289, 1981, S. 643–646), ein modifiziertes Carboxypeptidase-Signalpeptid (siehe L. A. Valls et al., Cell 48, 1987, S. 887–897), das Hefe-BAR1-Signalpeptid (siehe WO 87/02670 ), oder die Hefe-Aspartatprotease 3 (YAP3) Signalpeptid (siehe M. Egel-Mitani et al., Yeast 6, 1990, S. 127–137) gefunden.
Für eine wirksame Sekretion in Hefe kann eine Sequenz, die ein Leaderpeptid kodiert, auch downstream der Signalsequenz und upstream der DNA-Sequenz, die das Enzym kodiert, eingefügt werden. Die Funktion des Leaderpeptids ist es, dem exprimierten Enzym zu erlauben, aus dem endoplasmatischen Retikulum zu dem Golgi-Apparat und weiter zu einem sekretorischen Vesikel zur Sekretion in das Kulturmedium gesteuert zu werden (d. h. Export des Enzyms über die Zellwand oder zumindest über die zelluläre Membran in den periplasmatischen Raum der Hefezelle). Das Leaderpeptid kann das Hefe-α-Faktor-Leaderpeptid sein (dessen Verwendung beschrieben ist z. B. in US 4,546,082 , EP 16201 , EP 123 294 , EP 123 544 und EP 163 529 ). Alternativ dazu kann das Leaderpeptid ein synthetisches Leaderpeptid sein, d. h. ein Leaderpeptid, das nicht in der Natur vorkommt. Synthetische Leaderpeptide können z. B. hergestellt werden wie beschrieben in WO 89/02463 oder WO 92/11378 .
Zur Verwendung in filamentösen Pilzen kann das Signalpeptid zweckmäßigerweise aus einem Gen abgeleitet sein, das eine Aspergillus sp.-Amylase oder -Glucoamylase kodiert, ein Gen, das eine Rhizomucor miehei-Lipase oder -Protease, eine Humicola lanuginosa-Lipase kodiert. Das Signalpeptid ist bevorzugt abgeleitet aus einem Gen, das eine A. oryzae TAKA-Amylase, A. niger neutrale α-Amylase, A. niger säurestabile Amylase oder A. niger-Glucoamylase kodiert.
Die Vorgehensweisen, die zum Ligieren der DNA-Sequenzen verwendet wurden, die für das vorliegende Enzym kodieren, der Promotor und wahlweise der Terminator, und bzw. oder die sekretorische Signalsequenz, und diese in geeignete Vektoren, die die Information enthalten, die für die Replikation notwendig ist, einzufügen, sind dem Fachmann gut bekannt (siehe z. B. Sambrook et al., op. cit.).
Wirtszellen
Die das vorliegende Enzym kodierende DNA-Sequenz, eingeführt in die Wirtszelle, kann entweder homolog oder heterolog bezüglich dem fraglichen Wirt sein. Wenn sie bezüglich der Wirtszelle homolog ist, d. h. durch die Wirtszelle in der Natur hergestellt wird, wird sie typischerweise funktionsfähig mit einer anderen Promotorsequenz, oder wenn zutreffend, einer anderen sekretorischen Signalsequenz und/oder Terminatorsequenz, als in ihrem natürlichen Umfeld, verknüpft. Der Begriff „homolog" ist dafür vorgesehen, eine cDNA-Sequenz einzuschließen, die ein gegenüber dem fraglichen Wirtsorganismus natives Enzym kodiert. Der Begriff „heterolog" ist dafür vorgesehen, eine DNA-Sequenz einzuschließen, die in der Natur durch die Wirtszelle nicht exprimiert wird. Daher kann die DNA-Sequenz aus einem anderen Organismus sein, oder sie kann eine synthetische Sequenz sein.
Die Wirtszelle, in die das DNA-Konstrukt oder der rekombinante Vektor der Erfindung eingeführt wird, kann eine beliebige Zelle sein, die zum Herstellen des vorliegenden Enzyms fähig ist und schließt Bakterien, Hefe, Pilze und höhere eukaryotische Zellen ein.
Beispiele für bakterielle Wirtszellen, welche, bei Kultivierung, zum Herstellen des erfindungsgemäßen Enzyms fähig sind, sind grampositive Bakterien, wie Stämme von Bacillus, wie Stämme von B. subtilis, B. licheniformis, B. lentus, B. brevis, B. stearothermophilus, B. alkalophilus, B. amyloliquefaciens, B. coagulans, B. circulans, B. lautus, B. megatherium oder B. thuringiensis, oder Stämme von Streptomyces, wie S. lividans oder S. murinus, oder gramnegative Bakterien, wie Echerichia coli. Die Transformation der Bakterien kann durch Protoplastentransformation erfolgen oder durch Verwendung von kompetenten Zellen in einer per se bekannten Weise (siehe Sambrook et al., supra).
Wenn das Enzym in Bakterien wie E. coli exprimiert wird, kann das Enzym in dem Cytoplasma zurückbehalten werden, typischerweise als unlösliche Granula (bekannt als Einschlusskörper) oder können zu dem periplasmatischen Raum durch eine bakterielle Sekretionssequenz gesteuert werden. In dem ersten Fall werden die Zellen lysiert und die Granula rückgewonnen und denaturiert, wonach das Enzym durch Verdünnen des Denaturierungsmittel rückgefaltet wird. In dem letzteren Fall kann das Enzym aus dem periplasmatischen Raum durch Zersetzen der Zellen zurückgewonnen werden, z. B. durch Behandlung mit Ultraschall oder osmotischem Schock, um die Inhalte des periplasmatischen Raums freizusetzen, und das Enzym rückzugewinnen.
Beispiele für geeignete Hefezellen schließen Zellen von Saccharomyces spp. oder Schizosaccharomyces spp., insbesondere Stämme von Saccharomyces cerevisiae oder Saccharomyces kluyveri ein. Verfahren zum Transformieren von Hefezellen mit heterologer DNA und das Herstellen heterologer Enzyme davon sind beschrieben z. B. in US 4,599,311 , US 4,931,373 , US 4,870,008 , US 5,037,743 und US 4,845,075 . Transformierte Zellen werden durch einen Phänotyp, der durch einen Selektionsmarker bestimmt ist, gewöhnlich einer Wirkstoffresistenz oder die Fähigkeit, in der Abwesenheit eines besonderen Wirkstoffes zu wachsen, z. B. Leucin, ausgewählt. Ein bevorzugter Vektor zur Verwendung in Hefe ist der POT1-Vektor, offenbart in US 4,931, 373 . Die das erfindungsgemäße Enzym kodierenden DNA-Sequenz kann eine Signalsequenz und wahlweise eine Leadersequenz, wie z. B. obenstehend beschrieben, vorangehen. Weitere Beispiele für geeignete Hefezellen sind Stämme von Kluyveromyces, wie K. lactis, Hansenula, z. B. H. polymorpha, oder Pichia, z. B. P. pasloris (siehe Gleeson et al., J. Gen. Microbiol. 132, 1986, S. 3459–3465; US 4,882,279 ).
Beispiele für andere Pilzzellen sind Zellen von filamentösen Pilzen, z. B. Aspergillus spp., Neurospora spp., Fusarium spp. oder Trichoderma spp., insbesondere Stämme von A. oryzae, A. nidulans oder A. niger. Die Verwendung von Aspergillus spp. für die Expression von Proteinen ist beschrieben in z. B. EP 272 277 , EP 230 023 . Die Transformation von F. oxysporum kann zum Beispiel ausgeführt werden, wie beschrieben durch Malardier et al., 1989, Gene 78: 147–156.
Wenn ein filamentöser Pilz als die Wirtszelle verwendet wird, kann sie mit dem erfindungsgemäßen DNA-Konstrukt transformiert werden, zweckmäßigerweise durch Einfügen des DNA-Konstrukts in das Wirtschromosom, um eine rekombinante Wirtszelle zu erhalten. Diese Integration wird allgemein für vorteilhaft erachtet, da die DNA-Sequenz wahrscheinlicher stabil in der Zelle unterhalten wird. Integration der DNA-Konstrukte in das Wirtschromosom kann entsprechend herkömmlicher Verfahren, z. B. durch homologe oder heterologe Rekombination durchgeführt werden.
Die obenstehend beschriebene transformierte oder transfizierte Wirtszelle wird dann in einem geeigneten Nährmedium unter Bedingungen, die die Expression des vorliegenden Enzyms erlauben, kultiviert, wonach das resultierende Enzym aus der Kultur rückgewonnen wird. Das zum Kultivieren der Zellen verwendete Medium kann ein beliebiges herkömmliches, zum Züchten der Wirtszellen geeignetes Medium sein, wie Minimal- oder komplexe Medien, die geeignete Zusätze enthalten. Geeignete Medien sind von handelsüblichen Lieferanten erhältlich oder können entsprechend publizierter Rezepturen (z. B. in Katalogen der American Type Culture Collection) zubereitet werden. Das durch die Zellen hergestellte Enzym kann dann aus dem Kulturmedium durch herkömmliche Verfahren, einschließlich Abtrennen der Wirtszellen von dem Medium durch Zentrifugation oder Filtration, Präzipitieren der proteinhaltigen Bestandteile des Überstands oder Filtrats mittels eines Salzes, z. B. Ammoniumsulfat, Aufreinigung durch eine Vielzahl von chromatographischen Verfahren, z. B. Ionenaustauschchromatographie, Gelfiltrationschromatographie, Affinitätschromatographie, oder dergleichen, abhängig von der Art des fraglichen Enzyms, rückgewonnen werden.
In noch einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung zur Behandlung von Cellulose oder Cellulose-haltigem Material mit einer Enzymzubereitung, welche angereichert ist mit einem Enzym, das Endoglucanaseaktivität aufweist, wie obenstehend beschrieben.
Zum Beispiel ist die Enzymzubereitung der vorliegenden Erfindung verwendbar für den Abbau oder die Modifikation von Pflanzenzellwand enthaltenden Materialien, wobei die Zubereitung mit einem Enzym mit Endoglucanaseaktivität angereichert ist, wie obenstehend beschrieben.
Die Enzymzubereitung, die mit einem erfindungsgemäßen Enzym angereichert wurde, kann z. B. eine Enzymzusammensetzung sein, umfassend vielfache enzymatische Aktivitäten, insbesondere eine Enzymzusammensetzung, umfassend vielfache Pflanzenzellwand abbauende Enzyme, wie Pectinex^®, Pectinex Ultra SP^®, Celluclast oder Celluzyme (alle verfügbar von Novo Nordisk A/S). In dem vorliegenden Zusammenhang soll der Begriff „angereichert" andeuten, dass die Endoglucanaseaktivität der Enyzmzusammensetzung erhöht wurde, z. B. mit einem Anreicherungsfaktor von mindestens 1, 1, zweckmäßigerweise aufgrund des Hinzufügens eines erfindungsgemäßen Enzyms, hergestellt durch das obenstehend beschriebene Verfahren.
Alternativ dazu kann die mit einem Enzym mit cellulytischer (Endoglucanase-) Aktivität angereicherte Enzymzusammensetzung eine sein, welche ein erfindungsgemäßes Enzym als den enzymatischen Hauptbestandteil umfasst, z. B. eine Monokomponenten-Enzymzubereitung.
Das Screenen und die Expressionsklonierung können ausgeführt werden unter Verwendung der folgenden:
MATERIALIEN UND METHODEN
Donororganismus: mRNA wurde aus Acremonium sp., CBS 478.94 bzw. Acremonium sp., CBS 265.95 isoliert, die in einem Cellulose enthaltenden Fermentationsmedium mit Rühren wachsen gelassen werden, um ausreichende Belüftung zu gewährleisten. Myzelien wurden nach 4 bis 6 Tagen Wachstum geerntet, umgehend in flüssigem Stickstoff gefroren und bei –80°C gelagert.
Hefestämme: Der verwendete Saccharomyces cerevisiae-Stamm war yNG231 (MAT α, leu2, ura3-52, his4-539, pep4-delta 1, cir+) oder JG169 (MAT a; ura3-52; leu 2-3, 112; his 3-D200; pep 4-1137; prc1:: HIS3; prb1 :: LEU2; cir+).
Plasmide: Das den Hefe-TPI-Promotor enthaltende Expressionsplasmid pYHD17 wurde hergestellt aus dem kommerziell verfügbaren Plasmid pYES 2.0 (Invitrogen). Das Plasmid und seine Herstellung sind weiterhin beschrieben in WO 93/11249 .
Der Aspergillus-Expressionsvektor pHD414 ist ein Derivat des Plasmids p775 (beschrieben in EP 238 023 ). Die Herstellung von pHD414 ist weiterhin beschrieben in WO 93/11249 .
Extraktion von Gesamt-RNA wurde durchgeführt mit Guanidiniumthiocyanat, gefolgt durch Ultrazentrifugation durch ein 5,7 M CsCl-Kissen, und die Isolation von poly(A) ⁺RNA wurde ausgeführt durch Oligo(dT)-Cellulose-Affinitätschromatographie unter Verwendung der in WO 94/14953 beschriebenen Verfahren.
cDNA-Synthese und Modifikation: Doppelsträngige cDNA wurde aus 5 μg poly(A) ⁺RNA durch das RNase-H-Verfahren (Gubler & Hoffman, 1983, Sambrook et al., 1989) unter Verwendung der Haarnadelmodifikation synthetisiert. Das Verfahren ist weiterhin beschrieben in WO 95/02043 . Nachdem die ds cDNA mit Nuklease der Mungbohne (Bethesda Research Laboratories) behandelt wurde, wurden die Enden mit T4-DNA-Polymerase (Invitrogen) geglättet, und die cDNA wurde in die nicht-palindromischen BastX-I-Adaptoren (Invitrogen) ligiert, wie beschrieben in WO 95/02043 .
Herstellung der cDNA-Bibliotheken: Die angepasste ds cDNA wurde durch Zentrifugation rückgewonnen, in 70% Ethanol gewaschen und in 25 ml H₂O resuspendiert. Vor der Bibliothek-Ligation im Großmaßstab wurden vier Testligationen in 10 μl Ligationspuffer (der Gleiche wie obenstehend), jeweils enthaltend 1 μl ds cDNA (Reaktionsgefäße #1–#3), 2 Einheiten T4-Ligase (Invitrogen) und 50 ng (Gefäß #1), 100 ng (Gefäß #2) und 200 ng (Gefäße #3 und #4) Bst XI geschnittener Hefeexpressionsvektor (entweder pYES-2.0-Vektor (Invitrogen) oder pYHD17) ausgeführt.
Unter Verwendung der optimalen Bedingungen wurde eine Ligation im Großmaßstab in 40 μl Ligationspuffer angesetzt. Ein-μl-Aliquots wurden in elektrokompetente E. coli-1061-Zellen transformiert, und die transformierten Zellen wurden titriert und die Bibliothek auf LB + Ampicillin-Platten mit 5000 bis 7000 c.f.u./Platte ausplattiert. Zu jeder Platte wurden 3 ml Medium hinzugefügt. Die Bakterien wurden heruntergekratzt, 1 ml Glycerin wurde hinzugefügt und bei –80°C als Pools gelagert. Die verbleibenden 2 ml wurden zur DNA-Isolierung verwendet. Für weitere Details wird verwiesen auf WO 95/02043 .
Herstellung von Hefebibliotheken: Um zu gewährleisten, dass alle bakteriellen Klone in Hefe getestet wurden, wurde eine 5fach größere Anzahl an Hefetransformanden als die Anzahl an bakteriellen Klonen in den Ursprungspools als das Limit gesetzt.
Ein-μl-Aliquots von aufgereinigter Plasmid-DNA (100 ng/μl) aus einzelnen Pools wurden in 40 μl kompetente S. cerevisiae-JG-169-Zellen (OD600 = 1,5) in 500 ml YPD elektroporiert (200 Ω, 1,5 kV, 25 μF) zweimal in kaltem DIW, einmal in kaltem 1 M Sorbit gewaschen, resuspendiert in 0,5 ml 1 M Sorbit, (Becker & Guarante, 1991). Nach der Zugabe von 1 ml 1 M kaltem Sorbit wurden 80-μl-Aliquots auf SC + Glucose-Uracil-Agarplatten plattiert, um 250–500 c.f.u./Platte zu ergeben und bei 30°C für 3–5 Tage inkubiert.
Identifikation von positiven Kolonien: Nach 3–5 Tagen Wachstum wurden die Agarplatten auf mehrere Sätze von SC + Galactose-Uracil Agarplatten als Abdruck ausplattiert. Ein Satz der Replikaplatten enthielt 0,1% AZCL-HE-Cellulose. Diese Platten wurden für 3–7 Tage bei 30°C inkubiert. Endoglucanase-positive Kolonien wurden als durch einen blauen Vorhof umgebene Kolonien identifiziert.
Zellen aus enzympositiven Kolonien wurden zur Isolierung von Einzelkolonien auf Agar ausgestrichen und eine Enzym herstellende Einzelkolonie wurde für jede der identifizierten Endoglucanase herstellenden Kolonien ausgewählt.
Charakterisierung von positiven Klonen: Die positiven Klone wurden als Einzelkolonien erhalten, die cDNA-Inserts wurden direkt aus der Hefekolonie vervielfältigt unter Verwendung von biotinylierten Polylinker-Primern, aufgereinigt durch das Magnetic-Beads-System (Dynabead M-280, Dynal) und einzeln durch Sequenzieren des 5'-Endes jedes DNA-Klons unter Verwendung des Kettenabbruchverfahrens (Sanger et al., 1977) und des Sequenase-Systems (United States Biochemical) charakterisiert.
Isolation eines cDNA-Gens zur Expression in Aspergillus:
Eine oder mehrere Endoglucanase herstellende Hefekolonien wurden in 20 ml YPD-Brühe in einem 50-ml-Glasteströhrchen angeimpft. Das Röhrchen wurde für 2 Tage bei 30°C geschüttelt. Die Zellen wurden durch Zentrifugation für 10 Minuten bei 3000 UpM geerntet.
DNA wurde entsprechend WO 94/144953 isoliert und in 50 μl Wasser gelöst. Die DNA wurde unter Verwendung von Standardverfahrensweisen in E. coli transormiert. Die Plasmid DNA wurde unter Verwendung von Standardverfahrensweisen aus E. coli isoliert und durch Restriktionsenzymanalyse analysiert. Das cDNA-Insert wurde unter Verwendung geeigneter Restriktionsenzyme herausgeschnitten und in einen Aspergillus-Expressionsvektor ligiert.
Transformation von Aspergillus oryzae oder Aspergillus niger
Protoplasten können, wie in WO 95/02043 , Seite 16, Zeile 21 bis Seite 17, Zeile 12 beschrieben, hergestellt werden.
100 μl Protoplastensuspension werden mit 5–25 μg der geeigneten DNA in 10 μl STC (1,2 M Sorbit, 10 mM Tris-HCl, pH = 7,5, 10 mM CaCl₂) gemischt. Die Protoplasten werden mit p3SR2 (ein A. nidulans-amdS-Gen tragendes Plasmid) gemischt. Die Mischung wird für 25 Minuten bei Raumtemperatur belassen. 0,2 ml 60% PEG 4000 (BDH 29576), 10 mM CaCl₂ und 10 mM Tris-HCl, pH 7,5 werden hinzugefügt und vorsichtig (zweimal) gemischt und letztlich werden 0,85 ml der gleichen Lösung hinzugefügt und vorsichtig gemischt. Die Mischung wird für 25 Minuten bei Raumtemperatur belassen, für 15 Minuten bei 2500 g zentrifugiert und das Pellet wird in 2 ml 1,2 M Sorbit resuspendiert. Nach einer weiteren Sedimentation werden die Protoplasten auf Minimalplatten ausgestrichen (Cove, Biochem., Biophys. Acta 113 (1966) 51–56), die 1,0 M Sacharose, pH 7,0, 10 mM Acetamid als Stickstoffquelle und 20 mM CsCl enthalten, um Hintergrundwachstum zu inhibieren. Nach Inkubation für 4–7 Tage bei 37°C werden Sporen gepickt und für Einzelkolonien ausgestrichen. Dieses Verfahren wird wiederholt und Sporen einer Einzelkolonie werden nach der zweiten Reisolation als ein bestimmter Transformant gelagert.
Test von A. oryzae-Transformanden
Jeder der Transformanden wurde in 10 ml YPM angeimpft und vermehrt. Nach 2–5 Tagen Inkubation bei 37°C wurden 10 ml Überstand abgenommen. Die Endoglucanaseaktivität wurde, wie obenstehend beschrieben, durch AZCL-HE-Cellulose oder AZCL-β-Glucan identifiziert.
Hybridisierungsbedingungen (zu verwenden zum Bewerten der Eigenschaft i) des erfindungsgemäßen DNA-Konstruktes):
Geeignete Bedingungen zum Bestimmen einer Hybridisierung zwischen einer Oligonukleotidsonde und einer "analogen" DNA-Sequenz beziehen ein vorheriges Durchtränken des DNA-Fragment enthaltenden Filters ein, um in 5 × SSC zu hybridisieren, und ein Prähybridisieren für 1 h bei –50°C in einer Lösung von 5 × SSC, 5 × Denhardt's-Lösung, 50 mM Natriumphosphat, pH 6,8 und 50 μg denaturierter, mit Ultraschall behandelter Kalbsthymus-DNA, gefolgt von Hybridisierung in der gleichen Lösung, ergänzt mit 50 μCi 32-P-dCTP-markierter Sonde für 18 h bei –50°C, gefolgt von zweimaligem Waschen in 2 × SSC, 0,2% SDS bei 50°C für 30 Minuten.
Eine in der Hybridisierung zu verwendende geeignete Oligonukleotidsonde kann auf Basis der DNA-Sequenz zubereitet werden, die in SEQ ID NO: 1 (oder 2 oder 3 oder 4 oder 5 oder 6 oder 7) gezeigt ist.
Immunologische Kreuzreaktivität: Antikörper, die zum Bestimmen der immunologischen Kreuzreaktivität verwendet werden sollen, können durch Verwenden einer aufgereinigten Endoglucanase zubereitet werden. Noch genauer können durch Immunisieren von Kaninchen (oder anderen Nagern) ein Antiserum gegen die erfindungsgemäße Endoglucanase erzeugt werden, entsprechend dem Verfahren, beschrieben durch N. Axelsen et al., in: A Manual of Quantitative Immunoelectrophoresis, Blackwell Scientific Publications, 1973, Kapitel 23, oder A. Johnstone und R. Thorpe, Immunochemistry in Practice, Blackwell Scientific Publications, 1982 (genauer S. 27–31). Aufgereinigte Immunglobuline können aus den Antiseren z. B. durch Salzpräzipitation (NH₄)₂SO₄), gefolgt von Dialyse und Ionenaustauschchromatographie, z. B. auf DEAE-Sephadex erhalten werden. Immunochemische Charakterisierung von Proteinen kann entweder durch Outcherlony-Doppeldiffusionsanalyse (O. Ouchterlony in: Handbook of Experimental Immunology (D. M. Weir, Hrsg.), Blackwell Scientific Publications, 1967, S. 655–706), durch gekreuzte Immunoelektrophorese (N. Axelsen et al., supra, Kapitel 3 und 4), oder durch Rocket-Immunoelektrophorese (N. Axelsen et al., Kapitel 2) durchgeführt werden.
Medien

YPD: 10 g Hefeextrakt, 20 g Pepton, H₂O auf 900 ml. Autoklaviert, 100 ml 20% Glucose (sterilfiltriert) hinzugefügt.
YPM: 10 g Hefeextrakt, 20 g Pepton, H₂O auf 900 ml. Autoklaviert, 100 ml 20% Maltodextrin (sterilfiltriert) hinzugefügt.
10 × Basalsalze: 75 g Hefe-Stickstoff-Base, 113 g Bernsteinsäure, 68 g NaOH, H₂O ad 1000 ml, sterilfiltriert.
SC-URA: 100 ml 10 × Basalsalze, 28 ml 20% Kasaminosäuren ohne Vitamine, 10 ml 1% Tryptophan, H₂O ad 900 ml, autoklaviert, 3,6 ml 5% Threonin und 100 ml 20% Glucose oder 20% Galactose hinzugefügt.
SC-URA-Agar: SC-URA, 20 g/l Agar hinzugefügt.
AZCL-β-Glucan, AZCL-Xyloglucan, AZCL-HE-Cellulose (Megazyme, Australien).

Verwendungen
Detergenszusammensetzungen
Entsprechend der Erfindung kann die Cellulase typischerweise ein Bestandteil einer Detergenszusammensetzung sein. Als solcher kann sie in der Detergenszusammensetzung in der Form eines nicht staubenden Granulates, einer stabilisierten Flüssigkeit, oder einem geschützten Enzym eingeschlossen sein. Nicht staubende Granulate können zum Beispiel hergestellt werden, wie offenbart in US 4,106,991 und US 4,661,452 (beide zur Novo Industri A/S) und können wahlweise durch in der Technik bekannte Verfahren beschichtet werden. Beispiele für wachsartige Beschichtungsstoffe sind Poly(ethylenoxid)-Produkte (Polyethylenglykol, PEG) mit mittleren Molekulargewichten von 1000 bis 20.000; ethoxylierte Nonylphenole mit von 16 bis 50 Ethylenoxideinheiten; ethoxylierte Fettalkohole, in denen der Alkohol von 12 bis 20 Kohlenstoffatome enthält und in dem 15 bis 80 Ethylenoxideinheiten sind; Fettalkohole; Fettsäuren; und Mono- und Di- und Triglyceride von Fettsäuren. Beispiele für filmbildende Beschichtungsmaterialien, geeignet zur Anwendung durch Flüssigbetttechniken sind in Patent GB 1483591 gegeben. Flüssige Enzymzubereitungen können z. B. durch Hinzufügen eines Polyols, wie Propylenglykol, einem Zucker oder Zuckeralkohol, Milchsäure oder Borsäure, entsprechend bewährter Verfahren stabilisiert werden. Andere Enzymstabilisiatoren sind im Stand der Technik gut bekannt. Geschützte Enzyme können entsprechend dem in EP 238 216 offenbarten Verfahren zubereitet werden.
Die Detergenszusammensetzung der Erfindung kann in einer beliebigen zweckmäßigen Form, z. B. als Puder, Granula, Paste oder Flüssigkeit, vorliegen. Ein flüssiges Detergens kann wässrig sein, typischerweise enthaltend bis zu 70% Wasser und 0–30% organisches Lösemittel, oder nicht-wässrig sein.
Die Detergenszusammensetzung umfasst ein oder mehrere Tenside, von denen jedes anionisch, nicht-ionisch, kationisch oder zwitterionisch sein kann. Das Detergens wird gewöhnlich 0–50% anionisches Tensid, wie geradkettiges Alkylbenzolsulfonat (LAS), Alpha-Olefinsulfonat (AOS), Alkylsulfat (Fettalkoholsulfat) (AS), Alkoholethoxysulfat (AEOS oder AES), sekundäre Alkansulfonate (SAS), Alpha-Sulfofettsäuremethylester, Alkyl- oder Alkenylbernsteinsäure, oder Seife enthalten. Sie kann auch 0–40% eines nicht-ionischen Tensids, wie Alkoholethoxylat (AEO oder AE), carboxylierte Alkoholethoxylate, Nonylphenolethoxylate, Alkylpolyglycoside, Alkyldimethylaminoxid, ethoxylierte Fettsäuremonoethanolamid, Fettsäuremonoethanolamid, oder Polyhydroxyalkylfettsäureamid (wie z. B. beschrieben in WO 92/06154 ) enthalten.
Die Detergenszusammensetzung kann zusätzlich ein oder mehrere andere Enzyme, wie Amylase, Lipase, Cutinase, Protease, Peroxidase und Oxidase, z. B. Laccase, umfassen.
Das Detergens kann 1–65% eines Detergensbildners oder Komplexierungsmittels, wie Zeolith, Diphosphat, Triphosphat, Phosphonat, Citrat, Nitrilotriessigsäure (NTA), Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), Diethylentriaminpentaessigsäure (DTMPA), Alkyl- oder Alkenylbernsteinsäure, lösliche Silikate oder Schichtsilikate (z. B. SKS-6 von Hoechst) enthalten. Das Detergens kann auch unausgebildet, d. h. im Wesentlichen frei von Detergensbildnern, sein.
Das Detergens kann eine oder mehrere Polymere umfassen. Beispiele sind Carboxymethylcellulose (CMC), Poly(vinylpyrrolidon) (PVP), Polyethylenglykol (PEG), Poly(vinylalkohol) (PVA), Polycarboxylate, wie Polyacrylate, Malein-/Acrylsäurecopolymere und Laurylmethacrylat-/Acrylsäurecopolymere.
Das Detergens kann ein Bleichsystem enthalten, welches eine H₂O₂-Quelle, wie Perborat oder Percarbonat, umfassen kann, welches mit einem Persäure bildenden Bleichaktivator, wie Tetraacetylethylendiamin (TAED) oder Nonanoyloxybenzolsulfonat (NOBS) kombiniert werden kann. Alternativ dazu kann das Bleichsystem Peroxysäuren z. B. des Amid-, Imid- oder Sulfontyps umfassen.
Die Enzyme der erfindungsgemäßen Detergenszusammensetzungen können unter Verwendung herkömmlicher Stabilisierungsmittel, z. B. eines Polyols wie Propylenglykol oder Glycerin, eines Zuckers oder Zuckeralkohols, Milchsäure, Borsäure oder eines Borsäurederivats, wie z. B. eines aromatischen Borsäureesters, stabilisiert sein und kann, wie beschrieben z. B. in WO 92/19709 und WO 92/19708 formuliert sein.
Das Detergens kann auch andere herkömmliche Detergensbestandteile, wie z. B. Gewebezusatzstoffe, einschließlich Tone, Schaumverstärker, Seifenschaumsuppressoren, Anti-Korrosionsmittel, schmutzlösende Mittel, Anti-Schmutz-Wiederablagerungsmittel, Färbemittel, Bakterizide, optische Aufheller oder Duftstoff enthalten.
Der pH (gemessen in wässriger Lösung bei der Konzentration der Verwendung) wird gewöhnlich neutral oder alkalisch, z. B. im Bereich von 7–11, sein.

Besondere Formen von Detergenszusammensetzungen innerhalb des Bereichs der Erfindung schließen ein: 1) Eine Detergenszusammensetzung, formuliert als ein Granulat mit einer Schüttdichte von mindestens 600 g/l, umfassend

Geradkettiges Alkylbenzolsulfonat (berechnet als Säure)	7–12%
Alkoholethoxysulfat (z. B. C_12-18 Alkohol, 1–2 EO) oder Alkylsulfat (z. B. C_16-18)	1–4%
Alkoholethoxylat (z. B. C_14-15 Alkohol, 7 EO)	5–9%
Natriumcarbonat (als Na₂CO₃)	14–20%
Lösliches Silicat (als Na₂O, 2SiO₂)	2–6%
Zeolith (als NaAlSiO₄)	15–22%
Natriumsulfat (als Na₂SO₄)	0–6%
Natriumcitrat/Zitronensäure (als C₆H₅Na₃O₇/C₆H₈O₇)	0–15%
Natriumperborat (als NaBO₃·H₂O)	11–18%
TAED	2–6%
Carboxymethylcellulose	0–2%
Polymere (z. B. Malein-/Acrylsäurecopolymer, PVP, PEG)	0–3%
Enzyme (berechnet als reines Enzymprotein)	0,0001–0,1%
Geringfügige Bestandteile (z. B. Seifenschaumsuppressoren, Duftstoff, optische Aufheller, Photobleiche)	0–5%

2) Eine Detergenszusammensetzung, formuliert als ein Granulat mit einer Schüttdichte von mindestens 600 g/l, umfassend

Geradkettiges Alkylbenzolsulfonat (berechnet als Säure)	6–11%
Alkoholethoxysulfat (z. B. C_12-18 Alkohol, 1–2 EO) oder Alkylsulfat (z. B. C_16-18)	1–3%
Alkoholethoxylat (z. B. C_14-15 Alkohol, 7 EO)	5–9%
Natriumcarbonat (als Na₂CO₃)	15–21%
Lösliches Silicat (als Na₂O, 2SiO₂)	1–4%
Zeolith (als NaAlSiO₄)	24–34%
Natriumsulfat (als Na₂SO₄)	4–10%
Natriumcitrat/Zitronensäure (als C₆H₅Na₃O₇/C₆H₈O₇)	0–15%
Carboxymethylcellulose	0–2%
Polymere (z. B. Malein-/Acrylsäurecopolymer, PVP, PEG)	1–6%
Enzyme (berechnet als reines Enzymprotein)	0,0001–0,1
Geringfügige Bestandteile (z. B. Seifenschaumsuppressoren, Duftstoff)	0–5%

3) Eine Detergenszusammensetzung, formuliert als ein Granulat mit einer Schüttdichte von mindestens 600 g/l, umfassend

Geradkettiges Alkylbenzolsulfonat (berechnet als Säure)	5–9%
Alkoholethoxylat (z. B. C_12-15 Alkohol, 7 EO)	7–14%
Seife als Fettsäure (z. B. C_16-22 Fettsäure)	1–3%
Natriumcarbonat (als Na₂CO₃)	10–17%
Lösliches Silicat (als Na₂O, 2SiO2)	3–9%
Zeolith (als NaAlSiO₄)	23–33%
Natriumsulfat (als Na₂SO₄)	0–4%
Natriumperborat (als NaBO₃·H₂O)	8–16%
TAED	2–8%
Phosphonat (z. B. EDTMPA)	0–1%
Carboxymethylcellulose	0–2%
Polymere (z. B. Malein-/Acrylsäurecopolymer, PVP, PEG)	0–3%
Enzyme (berechnet als reines Enzymprotein)	0,0001–0,1%
Geringfügige Bestandteile (z. B. Seifenschaumsuppressoren, Duftstoff, optische Aufheller)	0–5%

4) Eine Detergenszusammensetzung, formuliert als ein Granulat mit einer Schüttdichte von mindestens 600 g/l, umfassend

Geradkettiges Alkylbenzolsulfonat (berechnet als Säure)	8–12%
Alkoholethoxylat (z. B. C_12-15 Alkohol, 7 EO)	10–25%
Natriumcarbonat (als Na₂CO₃)	14–22%
Lösliches Silicat (als Na₂O, 2SiO₂)	1–5%
Zeolith (als NaAlSiO₄)	25–35%
Natriumsulfat (als Na₂SO₄)	0–10%
Carboxymethylcellulose	0–2%
Polymere (z. B. Malein-/Acrylsäurecopolymer, PVP, PEG)	1–3%
Enzyme (berechnet als reines Enzymprotein)	0,0001–0,1%
Geringfügige Bestandteile (z. B. Seifenschaumsuppressoren, Duftstoff)	0–5%

5) Eine wässrige, flüssige Detergenszusammensetzung, umfassend

Geradkettiges Alkylbenzolsulfonat (berechnet als Säure)	15–21%
Alkoholethoxylat (z. B. C_12-15 Alkohol, 7 EO oder C_12-15 Alkohol, 5 EO)	12–18%
Seife als Fettsäure (z. B. Oleinsäure)	3–13%
Alkenylbernsteinsäure (C_12-14)	0–13%
Aminoethanol	8–18%
Zitronensäure	2–8%
Phosphonat	0–3%
Polymere (z. B. PVP, PEG)	0–3%
Borat (als B₄O₇)	0–2%
Ethanol	0–3%
Propylenglykol	8–14%
Enzyme (berechnet als reines Enzymprotein)	0,0001–0,1%
Geringfügige Bestandteile (z. B. Dispersionsmittel, Seifenschaumsuppressoren, Duftstoff, optische Aufheller)	0–5%

6) Eine wässrige, strukturierte, flüssige Detergenszusammensetzung, umfassend

Geradkettiges Alkylbenzolsulfonat (berechnet als Säure)	15–21%
Alkoholethoxylat (z. B. C_12-15 Alkohol, 7 EO oder C_12-15 Alkohol, 5 EO)	3–9%
Seife als Fettsäure (z. B. Oleinsäure)	3–10%
Zeolith (als NaAlSiO₄)	14–22%
Kaliumcitrat	9–18%
Borat (als B₄O₇)	0–2%
Carboxymethylcellulose	0–2%
Polymere (z. B. PEG, PVP)	0–3%
Ankerpolymere, wie z. B. Laurylmethacrylat/Acrylsäure-Copolymer; molares Verhältnis 25:1; MW 3800	0–3%
Glycerin	0–5%
Enzyme (berechnet als reines Enzymprotein)	0,0001–0,1%
Geringfügige Bestandteile (z. B. Dispersionsmittel, Seifenschaumsuppressoren, Duftstoff, optische Aufheller)	0–5%

7) Eine Detergenszusammensetzung, formuliert als ein Granulat mit einer Schüttdichte von mindestens 600 g/l, umfassend

Fettalkoholsulfat	5–10%
Ethoxyliertes Fettsäuremonoethanolamid	3–9%
Seife als Fettsäure	0–3%
Natriumcarbonat (als Na₂CO₃)	5–10%
Lösliches Silicat (als Na₂O, 2SiO2)	1–4%
Zeolith (als NaAlSiO₄)	20–40%
Natriumsulfat (als Na₂SO₄)	2–8%
Natriumperborat (als NaBO₃·H₂O)	12–18%
TAED	2–7%
Polymere (z. B. Malein-/Acrylsäurecopolymer, PEG)	1–5%
Enzyme (berechnet als reines Enzymprotein)	0,0001–0,1%
Geringfügige Bestandteile (z. B. optische Aufheller, Seifenschaumsuppressoren, Duftstoff)	0–5%

8) Eine Detergenszusammensetzung, formuliert als ein Granulat, umfassend

Geradkettiges Alkylbenzolsulfonat (berechnet als Säure)	8–14%
Ethoxyliertes Fettsäuremonoethanolamid	5–11%
Seife als Fettsäure	0–3%
Natriumcarbonat (als Na₂CO₃)	4–10%
Lösliches Silicat (als Na₂O, 2SiO₂)	1–4%
Zeolith (als NaAlSiO₄)	30–50%
Natriumsulfat (als Na₂SO₄)	3–11%
Natriumcitrat (als C₆H₅Na₃O₇)	5–12%
Polymere (z. B. PVP, Malein-/Acrylsäurecopolymer, PEG)	1–5%
Enzyme (berechnet als reines Enzymprotein)	0,0001–0,1%
Geringfügige Bestandteile (z. B. Seifenschaumsuppressoren, Duftstoff)	0–5%

9) Eine Detergenszusammensetzung, formuliert als ein Granulat, umfassend

Geradkettiges Alkylbenzolsulfonat (berechnet als Säure)	6–12%
Nicht-ionisches Tensid	1–4%
Seife als Fettsäure	2–6%
Natriumcarbonat (als Na₂CO₃)	14–22%
Zeolith (als NaAlSiO₄)	18–32%
Natriumsulfat (als Na₂SO₄)	5–20%
Natriumcitrat (als C₆H₅Na₃O₇)	3–8%
Natriumperborat (als NaBO₃·H₂O)	4–9%
Bleichaktivator (z. B. NOBS oder TAED)	1–5%
Carboxymethylcellulose	0–2%
Polymere (z. B. Polycarboxylat oder PEG)	1–5%
Enzyme (berechnet als reines Enzymprotein)	0,0001–0,1%
Geringfügige Bestandteile (z. B. optische Aufheller, Duftstoff)	0–5%

10) Eine wässrige, flüssige Detergenszusammensetzung, umfassend

Geradkettiges Alkylbenzolsulfonat (berechnet als Säure)	15–23%
Alkoholethoxysulfat (z. B. C_12-15 Alkohol, 2–3 EO)	8–15%
Alkoholethoxylat (z. B. C_12-15 Alkohol, 7 EO, oder C_12-15 Alkohol, 5 EO)	3–9%
Seife als Fettsäure (z. B. Laurinsäure)	0–3%
Aminoethanol	1–5%
Natriumcitrat	5–10%
Hydrotropikum (z. B. Natriumtoluolsulfonat)	2–6%
Borat (als B₄O₇)	0–2%
Carboxymethylcellulose	0–1%
Ethanol	1–3%
Propylenglykol	2–5%
Enzyme (berechnet als reines Enzymprotein)	0,0001–0,1%
Geringfügige Bestandteile (z. B. Polymere, Dispersionsmittel, Duftstoff, optische Aufheller)	0–5%

11) Eine wässrige, flüssige Detergenszusammensetzung, umfassend

Geradkettiges Alkylbenzolsulfonat (berechnet als Säure)	20–32%
Alkoholethoxylat (z. B. C_12-15 Alkohol, 7 EO, oder C_12-15 Alkohol, 5 EO)	6–12%
Aminoethanol	2–6%
Zitronensäure	8–14%
Borat (als B₄O₇)	1–3%
Polymer (z. B. Malein-/Acrylsäure-Copolymer, Ankerpolymer, wie z. B. Laurylmethacrylat-/Acrylsäure-Copolymer)	0–3%
Glycerin	3–8%
Enzyme (berechnet als reines Enzymprotein)	0,0001–0,1%
Geringfügige Bestandteile (z. B. Hydrotropikum, Dispersionsmittel, Duftstoff, optische Aufheller)	0–5%

12) Eine Detergenszusammensetzung, formuliert als ein Granulat mit einer Schüttdichte von mindestens 600 g/l, umfassend

Anionisches Tensid (geradkettiges Alkylbenzolsulfonat, Alkylsulfat, alpha-Olefinsulfonat, alpha-Sulfofettsäuremethylester, Alkansulfonate, Seife)	25–40%
Nicht-ionisches Tensid (z. B. Alkoholethoxylat)	1–10%
Natriumcarbonat (als Na₂CO₃)	8–25%
Lösliche Silicate (als Na₂O, 2SiO₂)	5–15%
Natriumsulfat (als Na₂SO₄)	0–5%
Zeolith (als NaAlSiO₄)	15–28%
Natriumperborat (als NaBO₃·4H₂O)	0–20%
Bleichaktivator (z. B. TAED oder NOBS)	0–5%
Enzyme (berechnet als reines Enzymprotein)	0,0001–0,1%
Geringfügige Bestandteile (z. B. Duftstoff, optische Aufheller)	0–3%

13) Detergensformulierungen, wie beschrieben in 1)–12), wobei das gesamte oder Teile des geradkettigen Alkylbenzolsulfonats ersetzt wird durch (C₁₂-C₁₈)-Alkylsulfat. 14) Eine Detergenszusammensetzung, formuliert als ein Granulat mit einer Schüttdichte von mindestens 600 g/l, umfassend

(C₁₂-C₁₈)-Alkylsulfat	9–15%
Alkoholethoxylat	3–6%
Polyhydroxyalkylfettsäureamid	1–5%
Zeolith (als NaAlSiO₄)	10–20%
Schicht-Disilicat (z. B. SK56 von Hoechst)	10–20%
Natriumcarbonat (als Na₂CO₃)	3–12%
Lösliches Silicat (als Na₂O, 2SiO₂)	0–6%
Natriumcitrat	4–8%
Natriumpercarbonat	13–22%
TAED	3–8%
Polymere (z. B. Polycarboxylate und PVP)	0–5%
Enzyme (berechnet als reines Enzymprotein)	0,0001–0,1%
Geringfügige Bestandteile (z. B. optische Aufheller, Photobleiche, Duftstoff, Seifenschaumsuppressoren)	0–5%

15) Eine Detergenszusammensetzung, formuliert als ein Granulat mit einer Schüttdichte von mindestens 600 g/l, umfassend

(C₁₂-C₁₈)-Alkylsulfat	4–8%
Alkoholethoxylat	11–15%
Seife	1–4%
Zeolith MAP oder Zeolith A	35–45%
Natriumcarbonat (als Na₂CO₃)	2–8%
Lösliches Silicat (als Na₂O, 2SiO₂)	0–4%
Natriumpercarbonat	13–22%
TAED	1–8%
Carboxymethylcellulose	0–3%
Polymere (z. B. Polycarboxylate und PVP)	0–3%
Enzyme (berechnet als reines Enzymprotein)	0,0001–0,1%
Geringfügige Bestandteile (z. B. optische Aufheller, Phosphonat, Duftstoff)	0–3%

16) Detergensformulierungen, wie beschrieben in 1) bis 15), welche ein stabilisiertes oder eingekapseltes Persäure enthalten, entweder als ein zusätzlicher Bestandteil oder als ein Ersatz für bereits spezifizierte Bleichsysteme.
17) Detergenszusammensetzungen, wie beschrieben in 1), 3), 7), 9) und 12), wobei Perborat durch Percarbonat ersetzt ist.
18) Detergenszusammensetzungen, wie beschrieben in 1), 3), 7), 9), 12), 14) und 15), welche zusätzlich einen Mangankatalysator enthalten. Der Mangankatalysator kann z. B. eine der Verbindungen sein, die in „Efficient manganese catalysts for low-temperature bleaching", Nature 369, 1994, S. 637–639 beschrieben sind.
19) Detergenszusammensetzung, formuliert als eine nicht-wässrige Detergensflüssigkeit, umfassend ein flüssiges, nicht-ionisches Tensid, wie z. B. geradkettiger alkoxylierter primärer Alkohol, ein Bildnersystem (z. B. Phosphat), Enzym und Alkali. Das Detergens kann auch anionisches Tensid und/oder ein Bleichsystem umfassen.

Die erfindungsgemäße Cellulase kann in herkömmlich angewendeten Konzentrationen in Detergenzien enthalten sein. Es wird gegenwärtig angenommen, dass in der erfindungsgemäßen Detergenszusammensetzung die Cellulase in einer Menge, entsprechend 0,00001–1 mg (berechnet als reines Enzymprotein) an Cellulase pro Liter an Waschflotte zugefügt werden kann.
Zellstoff- und Papieranwendungen
In der Papier herstellenden Zellstoffindustrie kann die der Erfindung entsprechende Enzymzubereitung wie folgt vorteilhaft angewendet werden:

– Zum Entrinden: Vorbehandlung mit der erfindungsgemäßen Enzymzubereitung kann die Cambiumschicht vor dem Entrinden in mechanischen Trommeln abbauen, resultierend in vorteilhaften Energieeinsparungen.
– Zur Verfaserung: Behandlung eines cellulosehaltige Fasern enthaltenden Materials mit der erfindungsgemäßen Enzymzubereitung vor dem Fertigmahlen oder Mahlen kann in einer Reduktion des Energieverbrauchs aufgrund des hydrolysierenden Effektes der Cellulase auf die Zwischenfaseroberflächen resultieren. Verwendung der Enzymzubereitung der Erfindung kann in verbesserter Energieeinsparung resultieren, wie verglichen zu der Verwendung von bekannten Enzymen, seitdem angenommen wird, dass die Enzymzusammensetzung der Erfindung eine höhere Fähigkeit besitzen kann, Faserwände zu penetrieren.
– Zur Fasermodifikation, d. h. Verbesserung von Fasereigenschaften, wo teilweise Hydrolyse über die Faserwand notwendig ist, welches tiefer penetrierende Enzyme erfordert (z. B. um grobe Fasern flexibler zu machen). Tiefenbehandlung von Fasern war soweit für Hochertragszellstoffe, z. B. mechanische Zellstoffe oder Mischungen von wiederverwerteten Zellstoffen, nicht möglich. Dies wurde der Natur der Faserwandstruktur zugeschrieben, die den Durchtritt von Enyzmmolekülen aufgrund von physikalischer Beschränkung der Porenmatrix der Faserwand vorbeugt. Es wird angenommen, dass die Enzymzusammensetzung der Erfindung zum Penetrieren in die Faserwand fähig ist.
– Zur Verbesserung der Entwässerung. Die Fähigkeit zur Entwässerung von Papiererzeugungszellstoffen kann durch Behandlung des Zellstoffs mit hydrolysierenden Enzymen, z. B. Cellulasen, verbessert werden. Verwendung der erfindungsgemäßen Enzymzubereitung kann wirksamer sein, z. B. in einem höheren Grad an Auflockerungsbündeln von stark hydrierten Mikrofibrillen in der Fraktion des feinen Holzmehls (bestehend aus Fasertrümmern) resultieren, die die Entwässerungsrate durch Blockierung von Hohlräumen zwischen den Fasern und dem Drahtgewebe der Papiermaschine beschränkt. Die Canadian standard freeness (CSF) steigt an und der Schopper-Riegler-Entwässerungsindex nimmt ab, wenn Zellstoff einer Cellulosebehandlung unterzogen wird, siehe z. B. US-Patent 4,923,565 ; TAPPI T227, SCALA C19:65.
– Zur Zwischenfaserbindung. Hydrolytische Enzyme werden angewendet in der Herstellung von Papiererzeugungszellstoffen zum Verbessern der Zwischenfaserbindung. Die Enzyme spülen die Faseroberflächen von Unreinheiten, z. B. cellulosehaltigen Trümmern, wodurch die Fläche exponierter Cellulose mit Anhaftung an die Faserwand erhöht wird, wodurch die Faser-zu-Faser-Wasserstoffbindungskapazität verbessert wird. Dieses Verfahren wird auch als Enthornung (dehornification) bezeichnet. Das mit einer Cellulase enthaltenden erfindungsgemäßen Enzymzubereitung hergestellte Papier und Pappe können eine verbesserte Stärke oder eine flächenbezogene Masse, eine glattere Oberfläche und eine verbesserte Bedruckbarkeit haben. Von diesen Verbesserungen wird angenommen, dass sie ein Ergebnis der verbesserten Penetrierbarkeit des/der modifiziert(en)/derivatisiert(en) Enzym(e) ist/sind.
– Zur enzymatischen Druckfarbenentfernung. Von der teilweisen Hydrolyse von Recyclingpapier während oder nach dem Zellstoffaufschluss durch Verwendung von hydrolysierenden Enzymen, wie Cellulasen, ist bekannt, dass sie die Entfernung und das Agglomerieren von Druckfarbenteilchen ermöglicht. Verwendung der erfindungsgemäßen Enyzmzubereitung kann eine wirksamere Loslösung der Druckfarbe von der Oberflächenstruktur aufgrund einer besseren Durchdringung der Enzymmoleküle in die fibrilläre Matrix der Faserwand ergeben, wodurch die Oberfläche aufgeweicht wird, wodurch Druckfarbenpartikel wirksam losgelöst werden. Die Agglomerierung von losgelösten Druckfarbenteilchen wird auch aufgrund einer wirksameren Hydrolyse von cellulosehaltigen Fragmenten, die an Druckfarbenteilchen, die aus den Fasern stammen, angeheftet gefunden wurden, verbessert.

Die Behandlung von lignocellulosehaltigem Zellstoff kann z. B. wie beschrieben in WO 91/14819 , WO 91/14822 , WO 92/17573 und WO 92/18688 durchgeführt werden.
Textilanwendungen
In einer anderen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung der erfindungsgemäßen Enzymzubereitung in dem Bio-Polishing-Verfahren. Bio-Polishing ist eine spezielle Behandlung der Garnoberfläche, welches die Stoffqualität in Bezug auf Handhabe und Erscheinung ohne Verlust der Benetzbarkeit des Stoffes verbessert. Die wichtigsten Effekte des Bio-Polishing können charakterisiert werden durch weniger Fussel und Pillbildung, erhöhten Glanz/Schimmer, verbesserte Stoffhandhabe, erhöhte Wasseraufnahmefähigkeit. Bio-Polishing findet normalerweise in der Feuchtverarbeitung der Erzeugung von gestrickten und gewobenen Stoffen statt. Feuchtverarbeitung umfasst solche Schritte wie z. B. Entschlichten, Auswaschen, Bleichen, Waschen, Färben/Bedrucken und Appretur. Während jedes dieser Schritte wird der Stoff mehr oder weniger mechanischen Maßnahmen unterzogen. Nachdem die Textilien gestrickt oder gewoben wurden, schreitet der Stoff im Allgemeinen zu einer Entschlichtungsstufe fort, gefolgt von einer Auswaschungsstufe, etc. Entschlichten ist der Vorgang des Entfernens der Schlichte von Textilien. Vor dem Weben auf mechanischen Webstühlen werden Kettfäden oft mit Schlichtestärke oder Stärkederivativen beschichtet, um ihre Reißfestigkeit zu erhöhen. Nach dem Weben muss die Schlichtebeschichtung vor einem weiteren Verfahren des Stoffes entfernt werden, um ein homogenes und waschbeständiges Ergebnis zu gewährleisten. Es ist bekannt, dass, um die Effekte des Bio-Polishings zu erreichen, eine Kombination von cellulytischer und mechanischer Einwirkung erforderlich ist. Es ist auch bekannt, dass „Superweichheit" („super-softness") erreichbar ist, wenn die Behandlung mit Cellulase mit einer herkömmlichen Behandlung mit Weichmachern kombiniert wird. Es wird in Betracht gezogen, dass die Verwendung der Enzymzubereitung der Erfindung zum Bio-Polishing von cellulosehaltigen Stoffen vorteilhaft ist, z. B. ein gründlicheres Polishing erreicht werden kann. Bio-Polishing ist erhältlich durch Anwenden des Verfahrens, z. B. beschrieben in WO 93/20278 .
Stone-Washing
Es ist bekannt, dass ein „stone-washed" Aussehen (lokalisierte Abnutzung der Farbe) in gefärbten Stoffen, insbesondere in Denimstoff oder Jeans, entweder durch Waschen des Denim oder Jeansstoffes, das aus solchem Stoff hergestellt ist, in der Gegenwart von Bimssteinen, um die gewünschte lokalisierte Aufhellung der Farbe des Stoffes bereitzustellen, oder durch enzymatisches Behandeln des Stoffes, insbesondere mit cellulytischen Enzymen. Die Enzymbehandlung kann entweder alleine, wie offenbart in US 4,832,864 , zusammen mit einer geringeren Menge an Bimsstein, als in dem üblichen Verfahren notwendig ist, oder zusammen mit Perlit, wie offenbart in WO 95/09225 , ausgeführt werden.
Bestimmung der cellulytischen Aktivität
Cellulytische Enzyme hydrolysieren CMC, wodurch die Viskosität des Inkubationsgemisches reduziert wird. Die resultierende Reduktion der Viskosität kann durch ein Vibrationsviskosimeter (z. B. MIVI 3000 von Sofraser, Frankreich) bestimmt werden. Bestimmung der cellulytischen Aktivität, gemessen in S-CEVU, kann entsprechend dem nachstehend beschriebenen Test bestimmt werden:
Der S-CEVU-Test quantifiziert die Menge an katalytischer Aktivität, die in einer Probe vorliegt, durch Messen der Fähigkeit der Probe, die Viskosität einer Lösung von Carboxymethylcellulose (CMC) zu reduzieren. Der Test wird ausgeführt bei 40°C; pH 7,5; 0,1 M Phosphatpuffer; Zeit 30 min; unter Verwendung eines relativen Enzymstandards zum Reduzieren der Viskosität des CMC-Substrats (Carboxymethylcellulose Herkules 7 LFD); Enzymkonzentration ungefähr 0,15 S-CEVU/ml.
Weiterhin ist ein Savi U (Einheit) definiert als die Menge an Enzym, die zum Ausbilden von 1 μM Glucoseäquivalenten pro Minute fähig ist.
Die Erfindung ist weiterhin veranschaulicht durch die folgenden, nicht beschränkenden Beispiele.
BEISPIEL 1
Identifikation der Verwandtschaft mit alkalischen Cellulasen aus Humicola insolens, DSM 1800
Der Ochterlony-Immundiffusionstest wurde zur Identifikation der Verwandtschaft der Stämme Acremonium sp., CBS 265.95, Acremonium sp., CBS 478.94, Acremonium persicinum, CBS 169.65, Acremonium acremonium, AHU 9519 und Cephalosporium sp., CBS 535.71 mit alkalischen Cellulasen aus Humicola insolens, DSM 1800 verwendet.
Antiseren wurden vom Antragsteller gegen den Humicola insolens-, DSM 1800, -Stamm erzeugt und in Verdünnungen von 1 bis 1/16 verwendet. Blöcke von Pilzen, gewachsen auf amorphem Cellulose-Agar-Medium, wurden in Wells von 0,9% Bacto-Agar-PEST (phosphatgepufferte Saline), eingestellt durch NaOH auf pH 7,4, enthaltend 0,5 ml Tween 20 pro Liter an PEST, eingefügt. Um die durch Pilzcellulase induzierten Blöcke wurden andere Wells mit anderen Verdünnungen von Antiseren (von 1 bis 1/16) gefüllt. Kleine Petrischalen wurden in größere Schalen mit durchnässter Einlage eingefügt, um gegen Austrocknen zu schützen, und bei 37°C über Nacht inkubiert.
Keiner der Blöcke, die Acremonium sp., CBS 265.95, Acremonium sp., CBS 478.94, Acremonium persicinum, CBS 169.65, Acremonium acremonium, AHU 9519 und Cephalosporium sp., CBS 535.71 enthielten, bildeten Präzipitationsbögen mit den Antiseren.
BEISPIEL 2
Bestimmung von alkalischer Cellulaseaktivität auf amorpher Cellulose
Materialien und Methoden
Substratzubereitung: 20 g säuregetränkte AVICEL^® Stammlösung (siehe nachstehend für eine Zubereitung, die für einen Monat gelagert werden kann) wurde für 20 Minuten bei 5000 UpM zentrifugiert, der Überstand wurde abgegossen und das Sediment in 30 ml Puffer resuspendiert. Dann wurde die Suspension für 20 Minuten bei 5000 UpM zentrifugiert, der Überstand abgegossen und das Sediment in einer Gesamtmenge von 30 g in Puffer resuspendiert. Dies entspricht einer Substratkonzentration von 10 g AVICEL/1.
Puffer: 0,1 M Barbital bei pH 8,5 oder 0,1 M Glycin bei pH 10,0.
Enzymlösung:
Die Enzyme wurden auf eine Aktivität von 0,2–1 S-CEVU/ml bei pH 8,5 oder pH 10,0 verdünnt.
Reagenzien:
2% NaOH, PHBAH-Reagens: 1,5 g p-Hydroxybenzoesäurehydrazid und 5,0 g Natriumtatrat wurden in 100 ml 2% NaOH gelöst.
Das Substrat, der Puffer und die Enzymlösung wurden auf eine Substratendkonzentration von 4,00 g/l gemischt.
Zubereitung der säuregetränkten Cellulose:
Materialien:

5 g Avicel^® (Art. 2331 Merck)
150 ml 85% Ortho-Phosphorsäure (Art. 573 Merck)
400 ml Aceton (Art. 14 Merck)
1,3 l entionisiertes Wasser (Milli Q)
1 l Becherglas
1 l Glasfiltertrichter
2 l Saugflasche
Ultra-Turrax-Homogenisator

Verfahrensweise:
Aceton und Phosphorsäure wurden auf Eis gekühlt. 5 g Avicel^® wurde mit Wasser befeuchtet, dann wurde 150 ml eiskalte 85% Ortho-Phosphorsäure hinzugefügt, und die Mischung wurde unter schwachem Rühren für 1 h in ein Eisbad gestellt.
100 ml eiskaltes Aceton wurden unter Rühren hinzugefügt, gefolgt von Überführen der Mischung in einen Glasfiltertrichter, gefolgt von Waschen mit 3 × 100 ml eiskaltem Aceton und Absaugen nach jedem Waschen.
Der Filterkuchen wurde mit 2 × 500 ml Wasser gewaschen und so trocken wie möglich nach jedem Waschen abgesaugt.
Der Filterkuchen wurde auf ein Gesamtvolumen von 300 ml resuspendiert und zu Homogenität verschnitten (unter Verwendung des Ultra-Turrax-Homogenisators).
Das resultierende Produkt wurde in einem Kühlschrank gelagert.
Die Substrat-/Pufferlösung wurde für 5 min auf 40°C vorgewärmt. Dann wurde die Enzymlösung hinzugefügt und die Lösung wurde für 5 Sekunden gevortext, gefolgt von einer Inkubation von 20 Minuten bei 40°C. Die Reaktion wurde durch Hinzufügen von 500 μl 2% NaOH-Lösung, gefolgt von Vortexen für 5 Sekunden gestoppt. Die Proben wurden für 20 Minuten bei 5000 UpM zentrifugiert. 1000 μl des Überstands wurden aus dem Teströhrchen in neue Teströhrchen überführt und 500 μl PHBAH-Reagens wurden hinzugefügt, gefolgt von Kochen für 10 Minuten. Die Teströhrchen wurden in Eiswasser abgekühlt. Die Absorption der Proben wurde in einem Spektrophotometer bei 410 nm gemessen.
Standard-Glucosekurve:
Eine 300 mg/l enthaltende Stammlösung wurde jeweils auf 5, 10, 15 und 25 mg/l verdünnt. 1000 μl der verdünnten Standards wurde mit 500 μl PHBAH-Reagens vermischt und wie die anderen Proben behandelt, siehe obenstehend.
Definition:
Ein Savi U (Einheit) ist definiert als die Menge an Enzym, die zur Bildung von 1 μM Glucoseäquivalenten pro Minute fähig ist.
Bestimmung der Aktivität: Die Freisetzung von reduzierendem Glucoseäquivalent wurde berechnet unter Verwendung der Standardkurve.
Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle gezeigt.
Der in der nachstehenden Tabelle erwähnte Stamm wurde in Schüttelkolben in einem Substrat wachsen gelassen, bestehend aus:

Rofec (von Roquette) 10 g/l

NH₄NO₃ 10 g/l

KH₂PO₄ 10 g/l

Solcafloc 40 g/l

MgSO₄·7H₂O 0,75 g/l

Pluronic 100% 0,1 ml

Wasser ad 1000 ml

Die Aktivität wurde in S-CEVU/ml gemessen.

Enzymzusammensetzungen (Stamm)	S-CEVU/ml	Savi U/ml pH 8,5	Savi U/ml pH 10
Acremonium sp., CBS 265.95	55	4,4	2,2
Acremonium sp., CBS 478.94	22	2,5	1,9
Cephalosporium sp., CBS 535.71	116	3,8	2,3
Acremonium persicinum, CBS 169.65	63	3,5	2,1
Acremonium acremonium, AHU 9519	23	-	-

VERGLEICHSBEISPIEL 3
Zubereitung von alkalischem Cellulasepulver
Erfindungsgemäße Cellulasepulverzubereitungen wurden durch Kultivierung der jeweiligen folgenden Acremonium-Stämme zubereitet: A. brachypenium, CBS 866.73, A. dichromosporum, CBS 683.73/ATCC 32181, A. obclavatum, CBS 311.74, A. pinkertoniae, CBS 157.70, A.
roseogriseum, CBS 134.56, A. incoloratum, CBS 146.62/ATCC 14613 und A. furatum, CBS 299.70H.
Jede Cellulasezubereitung wurde wie folgt zubereitet: Eine YPG-Agarschrägfläche wurde als Saat-Kulturmedium verwendet. Ein Agarstück mit auf einer Agarplatte gewachsenen Sporen wurde in einen 500-ml-Erlenmeyer-Kolben mit 2 Barrieren, enthaltend 100 ml Kulturmedium, angeimpft. Kultivierung für 48 Stunden bei 27°C.
3 ml dieser Impfkultur wurden dann in ein Hauptkulturmedium, bestehend aus 4% Weizenkleie und 0,1% Tween 80, bei pH 6,7, wieder in 100 ml Gesamtflüssigkeit in 500 ml Erlenmeyer-Schüttelkolben angeimpft. Kultivierung für 5 Tage bei 27°C auf einem Schütteltisch. 25 Schüttelkolben wurden verwendet und die Filtrate der Brühe wurden durch Glassinterfilter gesammelt, um eine Adsorption an cellulosehaltiges Material zu verhindern.
Das Filtrat wurde auf 1/5 des Originalvolumens in einer Amicon-Ultrafiltrationseinheit mit einer Membran mit einem Ausschluss bei 10 kD konzentriert und gefriergetrocknet.

Die Aktivität wurde in S-CEVU/mg gemssen. TABELLE (Aktivität)

Enzymzusammensetzungen (Stamm)	S-CEVU/mg
Acremonium brachypenium, CBS 866.73	48
Acremonium dichromosporum, CBS 683.73	62
Acremonium obclavatum, CBS 311.74	693
Acremonium pinkertoniae, CBS 157.70	550
Acremonium roseogriseum, CBS 134.56	38
Acremonium incoloratum, CBS 146.62	132
Acremonium furatum, CBS 299.70H	82

BEISPIEL 4 Leistung der Cellulase aus Acremonium-Stämmen in Detergenszusammensetzungen Materialien und Methoden

Apparat:	Terg-o-tometer
Flüssigkeitsvolumen:	100 ml
Rühren:	150 Bewegungen/min mit vertikalem Rührer
Spülzeit:	10 min in laufendem Leitungswasser
Waschtemperatur:	40°C
Waschflotte:	6,5 g/l Waschmittelpuder, europäischer Art (Ariel Color, handelsübliche Enzyme wurden bereits in dem Waschmittelpulver durch Erhitzen auf 85°C in einem Mikrowellenofen und durch Beibehalten dieser Temperatur für 10 min inaktiviert).
pH:	10,0
Wasserhärte:	2 mM CaCl₂
Waschzeit:	30 min
Wiederholungen:	6
Textil:	2 Stoffproben von gealtertem Schwarz 100% Baumwolle 5 × 6 cm
Trocknen:	maschinelles Trocknen

Beurteilung:
Wenn die Oberflächenfibrillen und Fasern, die aus dem Garn herausragen, durch Cellulasen entfernt werden, erscheint die Oberfläche des schwarzen Stoffes dunkler und frei von Fussel. Ein Teststoffstreifen ordnet die Stoffproben relativ zueinander ein. Ihnen wird eine Nummer gegeben, startend mit 1 für die „hässlichste" und bis zu 18 für die „schönste" Stoffprobe.
Stoffproben mit Werten über 12 haben eine stark verbesserte Oberflächenerscheinung.
Stoffproben mit Werten über 6 haben eine klar sichtbare verbesserte Oberflächenerscheinung.
Ergebnisse:
Für jeden getesteten Stamm wurden drei unterschiedliche Cellulasedosierungen getestet und verglichen mit einer Blindprobe:

S-CEVU/1

Stamm 0 50 100 250

Acremonium sp., CBS 478.94 2,0 12,3 14,0 15,0

Acremonium sp., CBS 265.95 2,0 3,0 9,7 9,0
Die Daten zeigen, dass insbesondere Acremonium sp., CBS 478.94, aber auch Acremonium sp., CBS 265.95 sehr gute Farbaufklarung in der handelsüblichen Waschmittelmatrix ergeben.
VERGLEICHSBEISPIEL 5

Leistung der Cellulase aus Acremonium-Stämmen, gemessen als Entfernung von Oberflächenfibrillen und Fasern, die aus dem Garn herausstehen, eines Textils, das cellulosehaltige Fasern enthält Materialien und Methoden

Apparat:	Terg-o-tometer
Flüssigkeitsvolumen:	100 ml
Rühren:	150 Bewegungen/min mit vertikalem Rührer
Spülzeit:	5 min in Leitungswasser
Waschtemperatur:	40°C
Waschflotte:	0,05 M Phosphatpuffer
pH:	7,0
Waschzeit:	30 min
Wiederholungen:	2
Textil:	2 Stoffproben von gealtertem Schwarz 100% Baumwolle 5 × 6 cm
Trocknen:	maschinelles Trocknen

Bewertung:
Wenn die Oberflächenfibrillen und Fasern, die aus dem Garn herausstehen, durch Cellulasen entfernt werden, erscheint die Oberfläche des schwarzen Stoffes dunkler und frei von Fussel. Ein Teststoffstreifen ordnet die Stoffproben relativ zueinander ein. Ihnen wird eine Nummer gegeben, startend mit 1 für die „hässlichste" und bis zu 18 für die „schönste" Stoffprobe.
Stoffproben mit Werten über 12 haben eine stark verbesserte Oberflächenerscheinung.
Für jeden getesteten Stamm wurden zwei unterschiedliche Acremonium-Cellulasedosierungen getestet und mit einer Blindprobe verglichen:

S-CEVU/1

Stamm 0 200 500 1000 2500

A. furatum, CBS 299.70H 5,5 13,0 n. t. 18,0 n. t.

A. incoloratum, CBS 146.62 5,5 n. t. 13,0 n. t. 16,0
Die Daten zeigen, dass insbesondere die Cellulase aus Acremonium furatum, CBS 299.70H, aber auch aus Acremonium incoloraturn, CBS 146.62 (ATCC 14613) sehr gute Farbaufklarung unter den Testbedingungen ergibt.
In weiteren Tests zeigen auch Cellulasen aus Acremonium obclavatum, CBS 311.74, Acremonium brachypenium, CBS 866.73, und Acremonium pinkertoniae, CBS 157.70, Farbaufklarung unter den Testbedingungen.
VERGLEICHSBEISPIEL 6
Klonierung und Expression einer Familie-5-Cellulase aus Acremonium sp., CBS 265.95 Eine Bibliothek aus Acremonium sp., CBS 265.95, bestehend aus ungefähr 10⁶ einzelnen Klonen in 50 Pools wurde in E. coli wie beschrieben hergestellt.
DNA wurde aus 100 einzelnen Klonen aus der Bibliothek isoliert und einer Analyse auf cDNA-Insertion unterzogen. Die Insertionshäufigkeit wurde als > 99% festgestellt. DNA aus einigen der Pools wurde in Hefe transformiert, und 50–100 Platten, enthaltend 250–500 Hefekolonien, wurden aus jedem Pool erhalten.
Endoglucanase-positive Kolonien wurden auf Agarplatten mit AZCL-HE-Cellulose identifiziert und isoliert. cDNA-Inserts wurden direkt aus den Hefekolonien vervielfältigt und charakterisiert, wie beschrieben in dem obenstehenden Materialien und Methoden-Abschnitt. Die jeweiligen N-terminalen und C-terminalen DNA-Sequenzen der Endoglucanase kodierenden cDNA sind jeweils in SEQ ID NO: 1 und 2 gezeigt.
Die cDNA ist erhältlich aus dem Plasmid in DSM 10076.
Die isolierten Hefeklone wurden gleichzeitig auf AZCL-β-Glucan, AZCL-Xyloglucan oder AZCL-HE-Cellulose enthaltenden Agarplatten getestet und positiv auf AZCL-HE-Cellulose und AZCL-β-Glucan gefunden.
Die Gesamt-DNA wurde aus einer Hefekolonie isoliert und Plasmid-DNA wurde durch Transformation von E. coli, wie obenstehend beschrieben, gesichert. Um die Endoglucanase in Aspergillus zu exprimieren, wurde die DNA mit HindIII/XbaI verdaut, größenfraktioniert im Gel, und ein dem Glucanasegen entsprechendes Fragment wurde aufgereinigt. Das Gen wurde anschließend in mit HindIII/XbaI verdauten pHD414 ligiert, resultierend in dem Plasmid pA2C346.
Nach Vervielfältigung der DNA in E. coli wurde das Plasmid pA2C346, wie obenstehend beschrieben, in Aspergillus oryzae transformiert.
Test der A. oryzae-Transformanden
Jeder der Transformanden wurde, wie obenstehend beschrieben, auf Endoglucanaseaktivität getestet. Einige der Transformanden hatten Endoglucanaseaktivität, die wesentlich größer war als der Aspergillus oryzae-Hintergrund. Dies demonstriert eine wirksame Expression der Endoglucanase in Aspergillus oryzae.
Die Endoglucanase wurde als eine Familie-5-Cellulase bestimmt (Bestimmung der Familie basierte auf der Offenbarung in Henrissat, B. et al. in Biochem. J., Bd. 293, S. 781–788, (1993)) mit einer pilzartigen CBD (Cellulose-Bindungsdomäne) am N-Terminus. Pilzartige CBDs sind beschrieben durch Gilkes, Henrissat, Kilburn, Miller und Warren in Microbiolgical Reviews, Bd. 55, S. 303–315 (1991).
VERGLEICHSBEISPIEL 7
Klonierung und Expression einer Familie-7-Cellulase aus Acremonium sp., CBS 265.95 Eine Bibliothek aus Acremonium sp., CBS 265.95, bestehend aus ungefähr 10⁶ einzelnen Klonen in 50 Pools wurde in E. coli wie beschrieben hergestellt.
Klonierung und Expression wurden wie in Beispiel 6 beschrieben ausgeführt, wobei das resultierende Plasmid pA2C347 ist.
Die isolierten Hefeklone wurden gleichzeitig auf AZCL-β-Glucan, AZCL-Xyloglucan oder AZCL-HE-Cellulose enthaltenden Agarplatten getestet und als positiv auf allen AZCL-HE-Cellulose-, AZCL-Xyloglucan- und AZCL-β-Glucan-Substraten gefunden.
Die DNA-Sequenz der Endoglucanase kodierenden cDNA ist gezeigt in SEQ ID NO: 3.
Die cDNA ist erhältlich aus dem Plasmid in DSM 9969.
Die Endoglucanase wurde als eine Familie-7-Cellulase bestimmt (Bestimmung der Familie basierte auf der Offenbarung in Henrissat, B. et al. in Biochem. J., Bd. 293, S. 781–788, (1993)).
Das Molekulargewicht (MW) der in Aspergillus oryzae exprimierten Endoglucanase wurde bestimmt auf 58 kD im SDS-PAGE.
BEISPIEL 8
Klonierung und Expression einer Familie-7-Cellulase aus Acremonium sp., CBS 478.94
Eine Bibliothek aus Acremonium sp., CBS 478.94, bestehend aus ungefähr 10⁶ einzelnen Klonen in 50 Pools wurde in E. coli wie beschrieben hergestellt.
Klonierung und Expression wurden wie in Beispiel 6 beschrieben ausgeführt, wobei das resultierende Plasmid pA2C349 ist.
Die isolierten Hefeklone wurden gleichzeitig auf AZCL-β-Glucan, AZCL-Xyloglucan oder AZCL-HE-Cellulose enthaltenden Agarplatten getestet und für positiv auf allen Substraten gefunden: AZCL-HE-Cellulose, AZCL-Xyloglucan und AZCL-β-Glucan.
Die DNA-Sequenz der Endoglucanase kodierenden cDNA ist in SEQ ID NO: 4 gezeigt. Diese Sequenz zeigte etwa für 945 Basen 66% Identität mit der DNA, die für die Fusarium oxysporum EG I kodiert,, siehe Sheppard et al., 1994, Family C endoglucanase.
Die cDNA ist erhältlich aus dem Plasmid in DSM 9977.
Die Endoglucanase wurde als eine Familie-7-Cellulase bestimmt (Bestimmung der Familie basierte auf der Offenbarung in Henrissat, B. et al. in Biochem. J., Bd. 293, S. 781–788, (1993)).
Das Molekulargewicht (MW) der in Aspergillus oryzae exprimierten Endoglucanase wurde bestimmt auf 60 kD im SDS-PAGE.
BEISPIEL 9
Klonierung und Expression einer neuen Cellulase aus Acremonium sp., CBS 478.94
Eine Bibliothek aus Acremonium sp., CBS 478.94, bestehend aus ungefähr 10⁶ einzelnen Klonen in 50 Pools wurde in E. coli wie beschrieben hergestellt.
Klonierung und Expression wurden wie in Beispiel 6 beschrieben ausgeführt, wobei das resultierende Plasmid pA2C359 ist.
Die isolierten Hefeklone wurden gleichzeitig auf AZCL-β-Glucan, AZCL-Xyloglucan oder AZCL-HE-Cellulose enthaltenden Agarplatten getestet und nur für zwei Substrate als positiv gefunden: AZCL-HE-Cellulose und AZCL-Xyloglucan.
Die DNA-Sequenz der Endoglucanase kodierenden cDNA ist in SEQ ID NO: 5 gezeigt.
Die cDNA ist aus dem Plasmid in DSM 10077 erhältlich.
Der N-Terminus zeigte Homologie zu pilzartigen CBDs, wie beschrieben durch Gilkes, Henrissat, Kilburn, Miller und Warren in Microbiological Reviews, Bd. 55, S. 303–315 (1991).
BEISPIEL 10
Klonierung und Expression einer Familie-5-Cellulase aus Acremonium sp., CBS 478.94
Eine Bibliothek aus Acremonium sp., CBS 478.94, bestehend aus ungefähr 10⁶ einzelnen Klonen in 50 Pools wurde in E. coli wie beschrieben hergestellt.
Klonierung und Expression wurden wie in Beispiel 6 beschrieben ausgeführt, wobei das resultierende Plasmid pA2C363 ist.
Die isolierten Hefeklone wurden gleichzeitig auf AZCL-β-Glucan, AZCL-Xyloglucan oder AZCL-HE-Cellulose enthaltenden Agarplatten getestet und als positiv auf zwei Substraten gefunden: AZCL-HE-Cellulose und AZCL-β-Glucan.
Die DNA-Sequenz der Endoglucanase kodierenden cDNA ist in SEQ ID NO: 6 gezeigt.
Die cDNA ist erhältlich aus dem Plasmid in DSM 10079.
Die Endoglucanase wurde als eine Familie-5-Cellulase bestimmt (Bestimmung der Familie basierte auf der Offenbarung in Henrissat, B. et al. in Biochem. 1, Bd. 293, S. 781–788, (1993)) mit einer pilzartigen CBD (Cellulose-Bindungsdomäne) an dem N-Terminus. Pilzartige CBDs sind beschrieben durch Gilkes, Henrissat, Kilburn, Miller und Warren in Microbiolgical Reviews, Bd. 55, S. 303–315 (1991).
Das Molekulargewicht (MW) der in Aspergillus oryzae exprimierten Endoglucanase wurde auf 60 kD im SDS-PAGE bestimmt.
Mehr als 50% relative Aktivität wurde unter Verwendung von CMC als Substrat in dem pH-Bereich zwischen 6,5 bis 10 erhalten.
BEISPIEL 11
Klonierung und Expression einer Cellulase aus Acremonium sp., CBS 478.94
Eine Bibliothek aus Acremonium sp., CBS 478.94, bestehend aus ungefähr 10⁶ einzelnen Klonen in 50 Pools wurde in E. coli wie beschrieben hergestellt.
Klonierung und Expression wurden wie in Beispiel 6 beschrieben ausgeführt, wobei das resultierende Plasmid pA2C369 ist.
Die isolierten Hefeklone wurden gleichzeitig auf AZCL-β-Glucan, AZCL-Xyloglucan oder AZCL-HE-Cellulose enthaltenden Agarplatten getestet und auf zwei Substraten als positiv gefunden: AZCL-HE-Cellulose und AZCL-Xyloglucan.
Die partielle N-terminale DNA-Sequenz der Endoglucanase kodierenden cDNA ist in SEQ ID NO: 7 gezeigt.

Die cDNA ist erhältlich aus dem Plasmid in DSM 10084. BEISPIEL 12 Leistung von klonierter Cellulase aus Acremonium sp., gemessen als Entfernung von Oberflächenfibrillen und Fasern, die aus dem Garn herausragen, eines cellulosehaltigen Fasern enthaltenden Textils

Enzym:	Die in Beispiel 10 beschriebene Endoglucanase
Apparat:	Terg-o-tometer
Flüssigkeitsvolumen:	100 ml
Rührung:	150 Bewegungen/min mit vertikalem Rührer
Spülzeit:	5 min in Leitungswasser
Waschtemperatur:	40°C
Wasserhärte:	I) 0°dH II) 1 mM CaCl₂ = ca. 6°dH
Waschflotte:	I) 0,05 M Phosphatpuffer, pH 7,0 II) 6,5 g/l Ariel Color, pH 10,0, handelsübliche Enzyme im Waschmittel wurden bereits durch Erhitzen auf 85°C im Mikrowellenofen und durch Beibehalten dieser Temperatur für 10 min inaktiviert.
Waschzeit:	I) 30 min II) 20 min
Wiederholungen:	I) 2 Zyklen II) 3 Zyklen
Textilien zur Bewertung:	2 Stoffproben von gealtertem Schwarz 100% Baumwolle 5 × 6 cm
Trocknen:	maschinelles Trocknen

Bewertung:
Wenn die Oberflächenfibrillen und Fasern, die aus dem Garn herausstehen, durch Cellulase entfernt werden, erscheint die Oberfläche des schwarzen Stoffes dunkler und frei von Fussel. Ein Teststoffstreifen reiht die Stoffproben relativ zueinander ein. Ihnen sind Nummern gegeben, startend mit 1 für die „hässlichste" und bis zu 18 für die „schönste" Stoffprobe. Stoffproben mit Werten über 11 haben eine stark verbesserte Oberflächenerscheinung. Stoffproben mit Werten über 6 haben eine klar sichtbar verbesserte Oberflächenerscheinung.
Zwei unterschiedliche Dosierungen wurden getestet und mit einer Blindprobe verglichen. Daten als Stoffstreifenauswertungseinheiten auf vorgealterter schwarzer Baumwolle. Die Daten zwischen Puffer und Waschmittel können nicht direkt miteinander verglichen werden, da sie sich auf unterschiedliche Experimente mit unterschiedlichen Waschzeiten und unterschiedlicher Anzahl an Wiederholungen beziehen.

S-CEVU/1: 0 100 400 500 1000 2500

I) Phosphatpuffer, pH 7 2,5 n. t. n. t. 14,3 n. t. 16,8

II) Ariel Color, pH 10 2,0 6,0 11,3 n. t. 11,7 n. t.

n. t. = nicht getestet

Die Daten zeigen, dass die getestete Endoglucanase (kodiert durch die aus dem Plasmid in Saccharomyces cerevisiae, DSM 10079, erhältliche DNA-Sequenz) gute Farbaufklarung in Puffer als auch Detergens ergibt.
REFERENZEN

Ali, B. R. S. et al., "Cellulases and hemicellulases of the anaerobic fungus Piromyces constitute a multiprotein cellulose-binding complex and are encoded by multigene families", FEMS Microbiol. Lett. (1995), Bd. 125, Nr. 1, S. 15–21.
Altshul et al., Bull. Math. Bio. Bd. 48: 603–616, 1986.
Becker, D. M. & Guarante, L. 1991. Methods Enzymol. 194: 182–187.
Dalbøge, H. und Heldt-Hansen, H. P., "A novel method for efficient expression cloning of fungal enzyme genes", Mol. Gen. Genet. (1994), Bd. 243, S. 253–260.
Gilkes, Henrissat, Kilburn, Miller und Warren in Microbiological Reviews, Bd. 55, S. 303–315, (1991).
Needleman, S. B. und Wunsch, C. D., Journal of Molecular Biology, 48: 443–453, 1970.
Gonzáles, R., et al., "Cloning, sequence analysis and yeast expression of the egl1 gene from Trichoderma longibrachiatum", Appl. Microbiol. Biotechnol. (1992), Bd. 38, S. 370–375.
Gubler, U. & Hoffman, B. J. 1983. Gene 25: 263–269.
Henikoff und Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 89: 10915–10919, 1992.
Henrissat, B. und Bairoch, A. in Biochem. J. Bd. 293, S. 781–788, (1993)).
Rev. Microbiol. (1990), Bd. 44, S. 219–248.
Henrissat, B., "Cellulases and their interaction with cellulose", Cellulose (1994), Bd. 1, S. 169–196.
Higuchi R., Krummel B. und Saiki R. K. (1988). A general method of in vitro preparation and specific mutagenesis of DNA fragments: study of protein and DNA interactions. Nucl. Acids Res. 16: 7351–7367.
Kang, M. G., Park, H. M., Kim, Y. S, Lee, J. R., Kim, Y. K., Lee, Y. H.: Abstract from 94th General Meeting, American Society Microbiology, K-112, 1994. Purification and some properties of carboxymethyl cellulase from alkalophilic Cephalosporium sp RYM 202.
Peberdy, J. F.: Penicillium and Acremonium, (1987), S. 2–4, Plenum Press, New York.
Penttilä, M. et al, (1986) Homology between cellulase genes of Trichoderma reesei: complete nucleotide sequence of the endoglucanase I gene. Gene 45:253–263.
Saloheimo, M. et al, (1988) EGIII, a new endoglucanase from Trichoderma reesei: the characterization of both gene and enzyme. Gene 63:11–21.
Sambrook, J., Fritsch, E. F. & Maniatis, T. 1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, NY.
Saloheimo, A., et al., "A novel, small endoglucnase gene, eg5, from Trichoderma reesei isolated by expression in yeast", Molecular Microbiology (1994), Bd. 13(2), S. 219–228.
Sanger, F., Nicklen, S. & Coulson, A. R. 1977. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 74: 5463–5467.
Sheppard, P. O., et al., "The use of conserved cellulase family-specific sequences to clone Cellulase homologue cDNAs from Fusarium oxysporum, Gene, (1994), Bd. 15, S. 163–167.
van Arsdell, J. N. et al, (1987) Cloning, characterization, and expression in Saccharomyces cerevisiae of endoglucanase I from Trichoderma reesei, Bio/Technology 5: 60–64.
Xue, G. et al., "Cloning and expression of multiple cellulase cDNAs from the anaerobic rumen fungus Neocallimastix pairiciarum in E. coli, J. Gen. Microbiol. (1992), Bd. 138, S. 1413–1420.
Xue, G. et al., "A novel polysaccharide hydrolase cDNA (celD) from Neocallimasix patriciarum encoding three multi-functional catalytical domains with high endoglucanase, cellobiohydrolase and xylanase activities", J. Gen. Microbiol. (1992), Bd. 138, S. 2397–2403.
Zhou, L. et al., "Intronless celB from the anaerobic fungus Neocallimastix pariciarum encodes a modular family A endoglucanase", Biochem. J. (1994), Bd. 297, S. 359–364.
Methods in Enzymology, 1988, Bd. 160, S. 200–391 (Hrsg. Wood, W. A. und Kellogg, S. T.).
T. -M. Enveri, "Microbial Cellulases" in W. M. Fogarty, Microbial Enzymes and Biotechnology, Applied Science Publishers, 183–224 (1983).
Begun, P. und Hubert, J-P., "The biological degradation of cellulose", FEMS Microbiology Reviews 13 (1994) 25–58.
Internationale Patentveröffentlichung WO 93/11249 .
Internationale Patentveröffentlichung WO 94/14953 .
Internationale Patentveröffentlichung WO 95/02043 .
Ford et al., Protein Expression and Purification 2: 95–107, 1991.
Cunningham und Wells, Science 244, 1081–1085, 1989.
de Vos et al., Science 255: 306–312, 1992.
Smith et al., J. Mol. Biol. 224: 899–904, 1992.
Wlodaver et al., FEBS Lett. 309: 59–64, 1992.
N. Axelsen et al., A Manual of Quantitative Immunoelectrophoresis, Blackwell Scientific Publications, 1973, Kapitel 2, 3, 4 und 23.

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Enzymzusammensetzung mit cellulolytischer Aktivität unter alkalischen Bedingungen, die aus dem Bakterienstamm Acremonium sp., CBS 478.94, herstellbar ist.
Enzymzusammensetzung nach Anspruch 1, die eine relative Aktivität bei pH 10 von mindestens 50% verglichen zu der Aktivität bei pH 8,5 besitzt, wobei die Aktivität in Savi U-Einheiten auf einem säuregetränkten Cellulosesubstrat gemessen wird.
Enzymzusammensetzung nach Anspruch 2, die in Gegenwart von geradkettigem Natriumalkylbenzolsulfonat, Natriumpolyoxyethylenalkylsulfat, Natriumdodecylsulfat, Natrium-α-Olefinsulfonat, Natriumalkylsulfonat und α-Sulfofettsäureestern stabil ist.
Verfahren zur Herstellung einer Enzymzusammensetzung mit cellulolytischer Aktivität unter alkalischen Bedingungen, wobei das Verfahren das Kultivieren des Bakterienstamms Acremonium sp., CBS 478.94 in einem geeigneten Nährmedium, und das Rückgewinnen der Enzymzusammensetzung aus dem resultierenden Medium umfasst.
Detergenzzusammensetzung, die die Enzymzusammensetzung nach einem der Ansprüche 1–3 und mindestens einen Bestandteil ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Tensiden, Sequestrierungsmitteln, anorganischen Salzen, zusätzlichen Enzymen, Enzymaktivatoren oder -beschleunigern, chlorbindenden oder reduzierenden Mitteln, Bleichmitteln, Bleichaktivatoren, Lösungsmitteln, Duftstoffen, Antioxidantien, Pigmenten und Wasser umfasst.
Verfahren, zur Bereitstellung einer lokalisierten Variation der Farbintensität von gefärbten Stoffen, wobei der Stoff mit der Enzymzusammensetzung nach einem der Ansprüche 1–3 behandelt wird.
Verfahren zur Entwässerung einer wässrigen Suspension von Papierzellstoff, wobei der Papierzellstoff mit der Enzymzusammensetzung nach einem der Ansprüche 1–3 behandelt wird.
Verfahren zur Druckfarbenentfernung von Recyclingpapier, wobei das Papier mit der Enzymzusammensetzung nach einem der Ansprüche 1–3 behandelt wird.