MX2010013114A - Alfa-amilasas variantes de bacillus subtilis y metodos de uso de las mismas. - Google Patents

Abstract

Se proporcionan alfa-arnilasas de Bacillus subtilis (AmyE), variantes de las mismas, ácidos nucleicos que codifican las mismas, y células hospederas que comprenden los ácidos nucleicos. Se describen métodos para usar AmyE o variantes del mismo, incluyendo licuefacción y/o sacarificación de almidón. Tales métodos pueden proporcionar azúcares útiles para producción de etanol o producción de jarabe de almidón de alta fructosa. En algunos casos, las amilasas se pueden usar en un bajo pH, en la ausencia de calcio, y/o en la ausencia de una glucoamilasa.

Description

ALFA-???LASAS VARIANTES DE BACILLUS SUBTILIS Y METODOS DE USO DE LAS MISMAS Campo de la Invención Se proporcionan alfa-amilasas de Bacillus subtilis (AmyE) , variantes de las mismas, ácidos nucleicos que codifican las mismas y células hospederas que comprenden los ácido nucleicos. Se dan a conocer métodos para usar AmyE o variantes de la misma, que incluyen licuefacción y/o sacarificación del almidón. Estos métodos pueden producir azúcares útiles para la producción de etanol o la producción de jarabe de maíz con alto contenido de fructosa. En algunos casos, las amilasas se pueden usar en pH bajo, en ausencia de calcio, y/o en ausencia de una glucoamilasa .

Antecedentes de la Invención Granos, cereales y almidones vegetales, por ejemplo, almidón de maíz, se usan ampliamente en la manufactura industrial de productos tales como jarabes y biocombustibles . Por ejemplo, el jarabe de maíz con alto contenido de fructosa, (HFCS) es una forma procesada de jarabe de maíz que tiene un alto contenido de fructosa y edulcorante comparable al azúcar, haciendo el HFCS útil como un sustituto del azúcar en bebidas sin alcohol y otros alimentos procesados. La producción de HFCS representa actualmente una industria de Ref . :215628 mil millones de dólares. La producción de etanol como un biocombustible también es una industria que está creciendo.

Los jarabes y biocombustibles se pueden producir a partir de almidón mediante un proceso enzimático que cataliza la descomposición del almidón en glucosa. Este proceso enzimático implica típicamente una secuencia de reacciones catalizadas por enzimas: (1) Licuefacción: Las alfa (a) -amilasas (EC 3.2.1.1) primero catalizan la degradación de una suspensión de almidón, la cual puede contener 30-40% p/p de sólidos secos (ds) , a maltodextranos . Las a-amilasas son endohidrolasas que catalizan la escisión aleatoria de los enlaces OÍ-1 , 4-D-glucosídicos internos. Debido a que la licuefacción se conduce típicamente a altas temperaturas, por ejemplo, 90-100°C, las a-amilasas termoestables , tal como una a-amilasa de Bacillus sp . , se prefieren para esta etapa. Las a-amilasas usadas actualmente para esta etapa, por ejemplo, a-amilasas de B. licheniformis, B. amyloliquefaciens, y B. stearothermophilus (AmyS) , no producen cantidades significativas de glucosa. En cambio, el licuefacto resultante tiene un equivalente bajo de dextrosa (DE) y contiene maltosas y azúcares con altos grados de polimerización (DPn) . (2) Sacarificación: Las glucoamilasas y/o a-amilasas maltogénicas catalizan la hidrólisis de extremos no reductores de los maltodextranos formados después de la licuefacción, liberando D-glucosa, maltosa e isomaltosa. La sacarificación produce ya sea jarabes ricos en glucosa o con alto contenido de maltosa. En el primer caso, las glucoamilasas catalizan típicamente la sacarificación bajo condiciones ácidas a temperaturas elevadas, por ejemplo, 60°C, pH 4.3. Las glucoamilasas usadas en este proceso se obtienen típicamente de hongos, por ejemplo, glucoamilasa de Aspergillus niger usada en Optidex L400MR o glucoamilasa de Humicula grísea. Las enzimas de desramificación, tales como pululanasas, pueden ayudar a la sacarificación.

Las a-amilasas maltogénicas pueden catalizar alternativamente la sacarificación para formar jarabes con alto contenido de maltosa. Las -amilasas maltogénicas tienen típicamente un pH óptimo más alto y una temperatura óptima más baja que la glucoamilasa, y las amilasas maltogénicas requieren típicamente Ca2+ . Las -amilasas maltogénicas usadas actualmente para esta aplicación incluyen a-amilasas de B. subtilis , amilasas de plantas, y la a-amilasa de Aspergillus oryzae, el ingrediente activo de Clarase LMR . Las reacciones de sacarificación ejemplares usadas para producir varios productos se representan a continuación: Almidón Licuado 0.3 % D-glucosa 2.0 % maltosa 97.7 % otros oligosacáridos Sacarificación ~pH ~pH 5.5 Glucoamilasa y/o a-amilasa maltogén pululanasa 50 ppm Ca2+ ~60°C, 72 h ~55°C, 48 h Jarabe de glucosa Jarabe de maltosa >95% D-glucosa 4% D-glucosa 1.5% de maltosa 56% de maltosa 0.5% de isomaltosa 28% de maltotriosa 1.0% de otros oligosacáridos 12% otros oligosacáridos (3) Procesamiento adicional: Un punto de ramificación en el proceso ocurre después de la producción de un jarabe rico en glucosa, mostrado en el lado izquierdo de las rutas de reacción anteriores. Si el producto deseado final es un biocombustible , la levadura puede fermentar el jarabe rico en glucosa a etanol . Por otra parte, si el producto deseado final es un jarabe rico en fructosa, la glucosa isomerasa puede catalizar la conversión del jarabe rico en glucosa a fructosa .

La sacarificación es la etapa limitante de la velocidad en la producción de un jarabe rico en glucosa. La sacarificación ocurre típicamente en más de 48-72 horas, tiempo en el cual muchas glucoamilasas fúngicas pierden su actividad significativa. Además, aunque las alfa-amilasas maltogénicas y las glucoamilasas ambas pueden catalizar la sacarificación, las enzimas operan típicamente en diferentes pH y temperaturas óptimas, como se muestra anteriormente. Si ambas enzimas se usan secuencialmente, la diferencia en las condiciones de reacción entre las dos enzimas necesita ajustar el pH y la temperatura, lo cual reduce el proceso general y puede dar origen a la formación de agregados de amilosa insolubles.

Por consiguiente, existe una necesidad en el campo por un proceso mejorado para hacer productos industriales a partir del almidón. En particular, existe una necesidad por eficiencias mejoradas en una etapa de sacarificación.

Breve Descripción de la Invención Se describen composiciones y métodos que se refieren a una a-amilasa de Bacillus subtilis (AmyE) y polipéptidos relacionados. La -amilasa AmyE es única en que exhibe alta actividad específica abajo de pH 5.0, y aún a aproximadamente pH 4-4.5. Adicionalmente , el Ca2+ no afecta la estabilidad térmica de la AmyE, evitando la necesidad de agregar Ca2+ exógeno a la licuefacción del almidón o las reacciones de sacarificación. Estas características de los polipéptidos AmyE permiten que se realice la licuefacción y sacarificación en la misma mezcla de reacción (y opcionalmente en el mismo recipiente de reacción) sin necesidad de ajustar el pH de la mezcla de reacción entre la licuefacción y la sacarificación. En particular, no se tienen que ajustar las condiciones de reacción al usar una AmyE y una glucoamilasa, evitando una etapa y retrasos de tiempo entre la licuefacción y la sacarificación, junto con la formación potencial de agregados de amilosa insolubles. La AmyE puede, por lo tanto, ser usada. secuencial o simultáneamente con una glucoamilasa para licuar y/o sacarificar el almidón, y en un pH y concentración de Ca2+ que son óptimos para la glucoamilasa. La AmyE también exhibe actividad de glucoamilasa, reduciendo o eliminando la necesidad por un polipéptido adicional con actividad de glucoamilasa para realizar la sacarificación.

En un aspecto, se proporciona un método para licuar y sacarificar el almidón en un proceso de conversión de almidón, que comprende poner en contacto un substrato de almidón con un polipéptido AmyE para formar una mezcla de reacción para licuar y sacarificar el substrato de almidón en la mezcla de reacción para producir glucosa, en donde la licuefacción y la sacarificación se realizan en la misma mezcla de reacción sin un ajuste de pH.

En algunas modalidades, el sacarificado (es decir, la sacarificación) se realiza en ausencia de un polipéptido adicional que tiene actividad de glucoamilasa . En algunas modalidades, la licuefacción se realiza en un pH adecuado para la actividad de un polipéptido de glucoamilasa. En algunas modalidades, el pH es 5.0 o más bajo. En algunas modalidades, el pH es 4.5 o más bajo. En modalidades particulares, el pH es 4.0 o más bajo. En algunas modalidades, el calcio exógeno no se agrega a la mezcla de reacción. En algunas modalidades, la concentración de calcio en la mezcla de reacción es menor que 8 ppm.

En algunas modalidades, un polipéptido adicional que tiene actividad de glucoamilasa se agrega a la mezcla de reacción antes de poner en contacto el substrato de almidón con el polipéptido AmyE. En algunas modalidades, el polipéptido adicional que tiene actividad de glucoamilasa se agrega a la mezcla de reacción después de poner en contacto el substrato de almidón con el polipéptido AmyE. En algunas modalidades, el polipéptido adicional que tiene actividad de glucoamilasa se agrega a la mezcla de reacción simultáneamente al poner en contacto el substrato de almidón con el polipéptido AmyE.

En algunas modalidades, el método además comprende fermentar la glucosa producida por la licuefacción y sacarificación para producir un biocombustibie tal como un alcohol. En algunas modalidades, . el alcohol es etanol . En algunas modalidades, el alcohol es butanol . En algunas modalidades, por lo menos una porción de la sacarificación y fermentación ocurre en la misma mezcla de reacción simultáneamente, como en el caso de SSF.

En algunas modalidades, un proceso de fermentación en lotes se usa en un sistema cerrado, en donde la composición de la mezcla de reacción (que incluye el pH) se selecciona en el inicio de la fermentación y no se altera durante la fermentación. En otra modalidad, se usa un sistema de "de fermentación en lote de alimentación", en donde el substrato de almidón se agrega en incrementos conforme la fermentación progresa. En todavía otra modalidad, se usa un sistema de fermentación continuo, donde un medio de fermentación definido se agrega continuamente a un biorreactor, y una cantidad igual de mezcla de reacción acondicionada se remueve del procesamiento.

En algunas modalidades, la solución de almidón sacarificado se convierte a jarabe basado en fructosa-almidón (HFSS) , tal como HFCS . La conversión a HFSS se puede catalizar en un pH de aproximadamente 6.0 a aproximadamente 8.0, por ejemplo, pH 7.5, y el producto puede contener aproximadamente 40-45% de fructosa. En algunas modalidades, el método comprende además poner en contacto la glucosa producida por la licuefacción y la sacarificación con una glucosa isomerasa para producir fructosa (por ejemplo, en la forma de HFCS) . En algunas modalidades, el calcio exógeno no se agrega a la mezcla de reacción. En algunas modalidades, la concentración de calcio en la mezcla de reacción es menor que aproximadamente 8 ppm. En algunas modalidades, el método incluye además poner en contacto la glucosa producida por la licuefacción y la sacarificación con una glucosa isomerasa para producir fructosa sin reducir la cantidad de calcio en la mezcla de reacción.

En algunas modalidades, los polipéptidos AmyE se agregan a la mezcla de reacción en una cantidad de aproximadamente 0.03-1 kg por tonelada métrica de sólidos secos (ds) . En algunas modalidades, la mezcla de reacción es una suspensión espesa de almidón que tiene aproximadamente 20-35% de ds (p/p) . La reacción de sacarificación se puede realizar a una temperatura de aproximadamente 60 °C a aproximadamente 90°C, por ejemplo, 70°C a 85°C, o aún 10, 12, 14, 16, 18, o aún 20°C abajo de la temperatura de gelificación del almidón (es decir, aproximadamente 75°C) , y un pH de aproximadamente 4.0 a aproximadamente 6.0, por ejemplo, aproximadamente 4.2 a aproximadamente 4.8. En algunas modalidades, el producto de la reacción de sacarificación es un jarabe rico en glucosa. La concentración de glucosa puede alcanzar por lo menos aproximadamente 95% p/p de ds .

En algunas modalidades, los polipéptidos AmyE son cualquier polipéptido AmyE de origen natural, por ejemplo, los polipéptidos AmyE que tienen la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: l o SEQ ID NO : 3, o una secuencia de aminoácidos con por lo menos aproximadamente 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98%, 99%, de identidad de secuencia a SEQ ID NO: l o SEQ ID NO : 3, por ejemplo, como se mide con el algoritmo de alineación de secuencia BLAST. En modalidades particulares, el polipéptido AmyE usado en el método tiene por lo menos 80% de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1. En modalidades particulares, el polipéptido AmyE usado en el método tiene por lo menos 90% de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.

En algunas modalidades, el polipéptido AmyE usado en el método incluye una supresión del dominio de enlace al almidón C-terminal. En modalidades particulares, los polipéptido AmyE que tiene la supresión C-terminal tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, o una secuencia de aminoácidos con por lo menos aproximadamente 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98%, 99%, de identidad de secuencia SEQ ID NO: 2. En modalidades particulares, el polipéptido AmyE está truncado del residuo D425 (con referencia a SEQ ID NO: 1) .

En otro aspecto, se proporcionan variantes AmyE que tienen propiedades ventajosas. Las variantes AmyE pueden tener una propiedad o propiedades alteradas, comparadas con un polipéptido AmyE de tipo natural, por ejemplo una propiedad alterada con respecto a la actividad específica hacia el almidón, maltoheptaosa, y/o substratos de maltotriosa, especificidad de substrato, termoestabilidad, temperatura óptima, pH óptimo, pH y/o intervalo de temperatura, estabilidad oxidante, capacidad de reducir la viscosidad de una composición de almidón, o los similares. En algunos casos, la propiedad alterada de la variante AmyE se relaciona con actividad específica sobre una harina de maíz particular, maltotriosa, substrato de maltoheptaosa en un pH particular (por ejemplo, 4 o 5.8), estabilidad al calor en una temperatura particular, (por ejemplo, 60°C) , o rendimiento de limpieza en un pH particular (por ejemplo, 8 o pH 10) . La propiedad alterada se puede caracterizar por un Indice de Rendimiento (PI) , donde el PI es una relación de rendimiento de la variante AmyE comparada con una AmyE de tipo natural. En algunas modalidades, el PI es mayor que aproximadamente 0.5, mientras que en otras modalidades, el PI es de aproximadamente 1 o es mayor que 1.

En un aspecto, el polipéptido variante tiene una actividad de -amilasa y por lo menos una característica alterada que mejora el rendimiento de la enzima, el polipéptido variante comprende: una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 60% de identidad de secuencia de aminoácidos a un polipéptido a-amilasa precursor seleccionado de AmyE (SEQ ID NO: 1) o una variante truncada de AmyE (SEQ ID NO : 2), y una modificación en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste de 1, 2, 3, 4, 5 , 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76 , 77, 78, 79, 80, 81 82 , 83, 84, 85, 86, 87, 88, 39, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102 , 103 , 104 , 105, 106 , 107, 108, 109 110 , 111 , 112 , 113, 114, 115 , 116, 117, 118 , 119, 121, 122 123 , 124 , 125, 126, 127, 128 , 129, 130, 131 , 132, 134, 135 , 136 , 137 , 138, 139, 140, 141 , 142, 143, 144 , 145, 146 , 147 , 148 , 149 , 150, 151, 152, 153 , 154, 155, 156 , 157, 158, 159 , 160 , 161 , 162, 163, 164 165 , 166, 167 , 168 , 169, 170, 171 , 172 , 173 , 174 , 175, 176 177 , 178, 179, 180 , 181, 182 , 183 , 184 , 185 , 186, 187, 188, 189 , 190, 191, 192 , 193, 194 , 195 , 196 , 197 , 198, 199, 200, 201 , 202 , 203 , 204 , 205, 206, 207 , 208 , 209 , 210, 211, 212, 213 , 214, 215, 216 , 217, 218, 219 , 220 , 221 , 222, 223, 224 225 , 226, 227, 228 , 229, 230, 231 , 232 , 233 , 234 , 235, 236 237 , 238, 239, 240 , 241, 242 , 243 , 244 , 245 , 246, 247, 248 249 , 250, 251, 252 , 253, 254, 255 , 256 , 257 , 258, 259, 260 261 , 262 , 263 , 264 , 265, ' 267, 268 , 270 , 271 , 272 , 273, 274 275 , 276, 277, 278 , 279, 280, 281 , 282 , 283 , 284, 285, 286 287 , 288, 289, 290 , 291, 292, 293 , 294 , 295 , 296, 297, 298 299 , 300, 301, 302 , 303, 304 , 305 , 307 , 308 , 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424 y 425, en donde la modificación produce un polipéptido variante que tiene un índice de rendimiento (PI) mayor que 1.0 para por lo menos úna característica que mejora el rendimiento de la enzima.

En algunas modalidades, el polipéptido variante comprende una modificación en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 39, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 72, 73, 74, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 98, 99, 100, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 118, 119, 121, 124, 125, 126, 128, 129, 130, 131, 132, 134, 135, 136, 140, 141, 142, 143, 144, 147, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 162 , 163, 164 , 165, 166, 167, 168, 170, 171, ' 172, 175, 179, 180, 181, 184, 186, 187, 188, 189, 190, 192, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 207, 209, 211, 212, 213, 214, 217, 218, 219, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242 , 243 , 244 , 245, 246 , 247 , 248, 249, 250, 251, 252, 253 , 254 , 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 267, 268, 270, 271, 272 , 273 , 274 , 275, 276 , 277, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 297, 298 299, 300, 301, 302, 303, 304 , 305, 307, 308, 309, 310, 311 312 , 313 , 314 , 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322 , 324 325, 327, 328, 329, 330, 331, 332 , 333 , 334 , 335, 336, 337 338, 339, 340, 341, 342 , 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349 350, 351, 352, 353, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 371, 372 , 373 , 374 , 375 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386 387 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398 399 , 400, 401, 402 , 403 , 404 , 405, 406, 407, 408, 409, 410 411 , 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424 y 425, en donde la modificación produce un polipéptido variante que tiene un índice de rendimiento (PI) mayor que 0.5 de la expresión de la proteína, y un PI mayor que 1.1 para por lo menos una característica que mejora el rendimiento de la enzima.

En algunas modalidades, la una o más posiciones se seleccionan del grupo que consiste de l, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63 , 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86 , 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 98, 99, 100, 103, 104 , 105, 106, 107 , 108 , 109, 110, 111 , 112 , 113, 114, 115, 116 , 117, 118, 119 , 121 , 122, 124, 125 , 126 , 127, 128, 129, 130 , 131, 132, 134 , 135 , 136, 138, 139 , 140 , 141, 142 , 143, 144 , 145, 146, 147 , 148 , 149, 150, 151 , 152 , 153, 154, 155, 156 , 157, 158, 159 , 160 , 161, 162 , 163 , 164 , 165, 166, 167, 168 , 169, 170, 171 , 172 , 173 , 174 , 175 , 176 , 177 , 178, 179, 180 , 181, 183 , 184 , 185 , 186 , 187, 188 , 189 , 190, 191, 192, 193 , 19 , 195, 196 , 197 , 198, 199, 200 , 201 , 202 , 203 , 204, 205 , 206, 207, 208 , 209 , 210, 211, 212 , 213 , 214, 215, 216, 217 , 218, 219, 220 , 221 , 222, 223 , 224 , 225 , 226, 227, 228, 229 , 230, 231, 232 , 233 , 234, 235, 236 , 237 , 238, 239, 240, 241 , 242, 243, 244 , 245 , 246, 247, 248 , 249 , 250, 251, 252, 253 , 254, 255, 256 , 257 , 258, 259, 260 , 261 , 262 , 263, 264, 265 , 267, 268, 269 , 270 , 271, 272, 273 , 274 , 275, 276, 277, 278 , 279, 280, 281 , 282 , 283, 284 , 285 , 286 , 287, 288, 289, 290 , 291, 292, 293 , 294 , 295, 296, 297 , 298 , 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, y 425, las posiciones que no son completamente restrictivas para el rendimiento en ya sea el polipéptido precursor de longitud completa o truncado.

En algunas modalidades, la modificación es una sustitución de uno o más residuos de aminoácidos presentes en el polipéptido precursor a diferentes residuos de amino en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste de 1A, 1C, ID, 1E, 1F, 1G, 1H, 1K, 1M, 1N, 1Q, IR, 1S, IT, IV, 1 , 1Y, 2A, 2C, 2D, 2E, 2F, 2G, 2H, 21, 2K, 2L, 2M, 2N, 2P, 2Q, 2R, 2S, 2V, 2 , 2Y, 3C, 3D, 3E, 3F, 3G, 3H, 31, 3K, 3L, 3M, 3N, 3P, 3Q, 3R, 3S, 3V, 3W, 3Y, 4C, 4D, 4E, 4F, 4G, 4H, 41, 4K, 4L, 4M, 4N, 4Q, 4S, 4T, 4V, 4W, 4Y, 5A, 5C, 5D, 5E, 5F, 5G, 5H, 51, 5K, 5L, 5N, 5R, 5V, 5W, 5Y, 6C, 6D, 6E, 6H, 6K, 6L, 6M, 6N, 6P, 6Q, 6R, 6S, 6T, 6V, 6W, 7A, 7C, 7D, 7E, 7F, 7G, 7H, 71, 7L, 7 , 7N, 7P, 7Q, 7R, 7S, 7T, 7W, 7Y, 8A, 8C, 8E, 8F, 8G, 8H, 81, 8K, 8L, 8M, 8N, 8P, 8Q, 8R, 8T, 8V, 8W, 8Y, dA, 9C, 9D, 9E, 9F, 9H, 91, 9K, 9M, 9N, 9P, 9R, 9S, 9T, 9V, 9W, 9Y, 10A, 101, 10L, 10M, ION, 10P, 10Q IOS, 10V, 11A, 11F 11G, 11H, 11M, 11S, 11V, 11 , 11Y, 121, 12M, 12V, 13A, 13C 13D, 13E, 13F, 13G, 131, 13L, 13M, 13Q, 13T, 13V, 13W, 13Y 14C, 14F, 14G, 14M, 14N, 14S, 14T, 14V, 15A, 15F, 16A, 16D 16E, 16F, 16G, 16H, 161 , 16L, 16M, 16Q, 16S, 16T, 16V, 17A 17F, 171, 17M, 17Q, 17Y, 18A, 18C, 18D, 18E, 18G, 18H, 18M r 18N, 18Q, 18R, 18T, 19A, 19C, 19H, 19L, 19M, 19N, 19S, 19W , 19Y, 20A, 20C, 20D, 20F, 20G, 20H, 201, 20K, 20L, 20M, 20P , 20Q, 20R, 20S, 20T, 20V, 20W, 20Y, 21A, 21C, 21D, 21E, 21H , 211, 21K, 21L, 21M, 21N, 21Q, 21R, 21S, 21V, 221, 22M, 22Q , 22S, 22T, 22V, 23A, 23C, 23D, 23E, 23F, 23G, 23H, 231, 23L , 23M 23N, 23R, 23S, 23T, 23V, 23W, 23Y, 24A, 24C, 24D, 24F , 24G, 24L, 24N, 24P, 24Q, 24R, 24S, 24T, 24V, 24Y, 25A, 25C , 25D, 25E, 25F, 25G, 25H, 251, 25K, 25L, 25R, 25S, 25T, 25V , 25 , 25Y, 26A, 26F, 261, 26L, 26V, 27A, 27C, 27D, 27E, 27F , 27G, 27H, 271, 27L, 27M, 27N, 27P, 27Q, 27R, 27S, 27T, 27V , 27 , 27Y, 28A, 28C, 28F, 28G, 28H, 281, 28K, 28L, 28M, 28N , 28P, 28Q, 28R, 28S, 28T, 28V, 28W, 28Y, 29A, 29C, 29F, 29L , 29M, 29T, 29V, 30A, 30C, 30D, 30E, 30F, 30G, 301, 30K, 30L , 30M, 30N, 30P, 30Q, 30R, 30S, 30T, 30V, 30W, 30Y, 31A, 31C , 31E, 31F, 31G, 31H, 311, 31K, 31L, 31M 31N, 31Q, 31S, 31T , 31V, 31 , 31Y, 32D, 32F, 32G, 32H, 32K 32L, 32M, 32Q, 32S , 32T, 32V, 32Y, 33A, 33C, 33D, 33E, 33F 33H, 331, 33K, 33L, 33M, 33P, 33Q, 33S, 33T, 33 , 33Y, 34A, 34F, 341, 34P, 34 , 35A, 35C, 35F, 35G, 35H, 351, 35L, 35M, 35N, 35P, 35Q, 35R, 35S, 35V, 35W, 35Y, 36C, 36D, 36E, 36F, 36H, 361, 36K, 36L, 36M, 36N, 36Q, 36R, 36S, 36T, 36Y, 37L, 37M, 37N, 37V, 38A, 38C, 38D, 38E, 38H, 38L, 38M, 38N, 38P, 38V, 39A, 39C, 391, 39L, 39M, 39N, 39P, 39S, 39V, 40A, 40D, 40M, 40N, 40P, 40Q, 40T, 40V, 40W, 41A, 41C, 41E, 41G, 41N, 41S, 41V, 42A, 42L, 42M, 42P, 42V, 43A, 43G, 43H, 43L, 43M, 43Q, 43S, 43T, 43V, 44A, 44C, 44D, 44E, 44F, 44G, 44H, 441, 44K, 44L, 44M, 44N, 44P, 44R, 44S, 44T, 44V, 44W, 44Y, 45A, 45C, 45F, 45G, 45H, 451, 45L, 45M, 45N, 45P, 45Q, 45S, 45T, 45Y, 46A, 46C, 46D, 46E, 46F, 46H, 461, 46L, 46M, 46N, 46Q, 46R, 46S, 46T, 46V, 46W, 46Y, 47A, 47C, 47D, 47F, 47G, 47H, 471, 47K, 47L, 47N, 47P, 47R, 47S, 47T, 47V, 47Y, 48A, 48C, 48D, 48E, 48F, 48H, 481, 48K, 48L, 48N, 48P, 48S, 48T, 48V, 48W, 49A, 49C, 49D, 49F, 49G, 49H, 491, 49K, 49L, 49P, 49Q, 49R, 49S, 49T, 49V, 49W, 49Y, 50A, 50C, 50E, 50F, 50G, 50H, 501, 50K, 50L, 50M, 50N, 50P, 50R, 50S, 50T, 50V, 50W, 50Y, 51A, 51C, 51D, 51E, 51F, 51H, 511, 51K, 51L, 51M, 51N, 51P, 51Q, 51R, 51S, 51T, 51V, 51W, 52A, 52C, 52E, 52F, 52G, 52H, 521, 52K, 52L, 52M, 52N, 52P, 52Q, 52R, 52S, 52T, 52V, 52 , 52Y, 53A, 53C, 53E, 53F, 53G, 53H, 531, 53L, 53N, 53P, 53R, 53S, 53T, 53V, 53W, 53Y, 54A, 54C, 54D, 54F, 54G, 54H, 541, 54L, 54M, 54N, 54P, 54Q, 54R, 54T, 54V, 54W, 54Y, 55A, 55C, 55D, 55E, 55F, 55G, 55H, 551, 55N, 55P, 55Q, 55S, 55T, 55Y, 56A, 56D, 56E, 56F, 56G, 561, 56K, 56L, 56M, 56N, 56P, 56Q, 56R, 56T, 56V, 56W, 56Y, 57A, 57C, 57D, 57E, 57F, 57H, 571, 57K, 57L, 57M, 57Q, 57R, 57S, 57T, 57V, 57W, 57Y, 58A, 58F, 58H, 59A, 59C, 59D, 59E, 59F, 59G, 59H, 59K, 59L, 59N, 59P, 59R, 59S, 59T, 59V, 59W, 60A, 60C, 60D, 60E, 60G, 601, 60K, 60L, 60M, 60N, 60Q, 60R, 60T, 60V, 61C, 61D, 61E, 61F, 61M, 61S, 61T, 61V, 62A, 62C, 62D, 62F, 62G, 62H, 621, 62K, 62L, 62Q, 62S, 62T, 62V, 63A, 63C, 63D, 63F, 63G, 63H, 63K, 63M, 63N, 63R, 63S, 64A, 64G, 64H, 641, 64L, 64M, 64N, 64S, 64V, 64Y, 65A, 65C, 65E, 65H, 651, 65K, 65L, 65M, 65Q, 65R, 65S, 66D, 66E, 66F, 66G, 66H, 661, 66K, 66L, 66M, 66N, 66Q, 66R, 66T, 66V, 66W, 66Y, 67A, 67C, 67D, 67E, 67F, 67G, 671, 67K, 67L, 67N, 67P, 67Q, 67S, 67T, 67W, 68A, 68C, 68D, 68E, 68F, 68G, 68H, 681, 68L, 68M, 68N, 68P, 68R, 68S, 68T, 68V, 68 , 68Y, 69A, 69C, 69 , 69P, 69T, 69V, 70A, 70E, 70H, 70N, 70S, 71S, 72C, 72D, 72E, 72F, 72G, 72H, 721, 72K, 72L, 72P, 72Q, 72S, 72T, 72V, 72 , 72Y, 73A, 73C, 73E, 73F, 73H, 731, 73K, 73L, 73M, 73P, 73S, 73T, 73V, 73 , 74A, 74E, 74F, 74M, 74S, 74T, 74Y, 75A, 75C, 75D, 75E, 75P, 76A, 76D, 76E, 76F, 76G, 761 , 76L, 76M, 76P, 76Q, 76R, 76S, 76V, 76Y, 77A, 77C, 77D, 77G, 77H, 771 , 77K, 77L, 77R, 77S, 77T, 77V, 77 , 77Y, 78A, 78C, 78D, 78E, 78F, 78G, 78H, 781, 78K, 78L, 78M, 78N, 78P, 78R, 78S, 78T, 78V, 78W, 78Y, 79A, 79G, 79L, 79M, 79N, 79Q, 79S, 79T, 80A, 80L, 80M, 80W, 80Y, 81A, 81C, 81D, 81E, 81G, 81H, 811, 81L, 81M, 81N, 81Q, 81R, 81S, 81T, 81V, 81W, 81Y, 82A, 82D, 82F, 82G, 821, 82K, 82L, 82M 82Q 82R 82S 82T 82V 82W, 82Y, 83A, 83F, 831, 83L, 83T 83V 84A 84D 84E 84G 841, 84K, 84M, 84N, 84Q, 84S, 84T 84V 85D 85E 85F 85G 851, 85K, 85L, 85M, 85N, 85R, 85S 85T 85V 85W 86C 86D 86E, 86F, 86G, 861, 86K, 86L, 86M 86N 86Q 86R 86S 86V 86 , 86Y, 87F, 87G, 87T, 88A, 88C 88D 88F 88G 88H 881 88K, 88L, 88M, 88N, 88Q, 88R, 88S 88T 88V 88W 88Y 89A 89C, 89D, 89F, 89G, 89H, 891, 89K 89L 89M 89N 89P 89Q 89R, 89S, 89T, 89V, 89W, 89Y, 90C 90D 90E 90F 90G 90H 901 , 90K, 90L, 90M, 90N, 90Q, 90R 90S 90T 90V 90 91A 91C, 91D, 91E, 91F, 91H, 91K, 91L 91M 91N 91P 91Q 91R 91S, 91T, 91W, 91Y, 92L, 92N, 92T 92V 93A 93C 93D 93E 93F, 93G, 931, 93L, 93M, 93N, 93P 93Q 93R 93S 93T 93V 93 , 93Y, 94A, 94C, 941, 94M, 94T 95A 95F 95L 95M 95V 95Y, 96A, 96C, 961, 96L, 96M, 96P 96T 97A 97E 97M 97W 98C, 98G, 981, 98L, 98M, 98T, 98V 99A, 99C, 99E, 99F, 99G 991, 99L, 99M, 99N, 99P, 99S, 99T 100A, 100C, 100F, 100M, 100N, 100P, 100T, 100V, 100Y, 101A 102A, 102G, 102Q, 102S, 102W, 102Y, 103A, 103C, 1031, 103M 103N, 103S, 103V, 104A, 104C, 104S, 105C, 105D, 105E, 105F 105G, 105H, 105K, 105L, 105M, 105Q, 105R, 105T, 105V, 105W 105Y, 106A, 106C, 106E, 106F, 106H, 1061, 106K, 106L, 106M 106N, 106Q, 106R, 106S, 106T, 106V, 106 , 106Y, 107A, 107C 107E, 107F, 107G, 107H, 1071 , 107K, 107L, 107M, 107N, 107P 107Q, 107R, 107S, 107T, 107V, 107W, 108C, 108D, 108E, 108F 108G, 108H, 1081, 108K, 108L, 108N, 108P, 108R, 108S, 108T, 108V, 108 , 108Y, 109C, 109D, 109E, 109F, 109G, 109H, 1091, 109K, 109L, 109M, 109N, 109P, 109R, 109S, 109T, 109V, 109W, 109Y, 110L, 110M, 110V, 111A, 111C, 111E, 111F, 111G, 111H, 1111, 111K, 111L, 111M, 111N, 111P, 111Q, 111R, 111T, 111V, 111 , 111Y, 112A, 112C, 112D, 112E, 112F, 112G, 112H, 1121, 112K, 112L, 112M, 112P, H2Q, 112R, 112S, 112T, 112V, 112W, 112Y, 113A, 113D, 113F, 113G, 1131, 113K, 113L, 113M, 113N, 113P, 113Q, 113S, 113T, 113V, 113W, 113Y, 114F, 114L, 114P, 114T, 115A, 115C, 115F, 115G, 115H, 1151, 115L, 115M, 115N, 115Q, 115R, 115S, 115T, 115V, 115W, 115Y, 116A, 116D, 116E, 116F, 116G, 116H, 1161, 116L, 116N, 116Q, 116R, 116T, 116V, 116W, 116Y, 117F, 117L, 117N, 117Q, 117V, 117 , 117Y, 118A, 118C, 118D, 118E, 118F, 118G, 118H, 1181, 118K, 118L, 118M, 118N, H8Q, 118R, 118S, 118T, 118V, 118 , 118Y, 119A, 119C, 119D, 119E, 119F, 119G, 119H, 1191, 119K, 119L, 119M, H9Q, 119R, 119S, 119T, 119V, 119Y, 121A, 121M, 121N, 121S, 122R, 123E, 124A, 124C, 124D, 124E, 124F, 124G, 1241, 124K, 124M, 124Q, 124R, 124S, 124T, 124V, 124Y, 125A, 125D, 125E, 125F, 125G, 125H, 1251, 125K, 125L, 125M, 125N, 125P, 125Q, 125R, 125S, 125V, 125W, 125Y, 126A, 126C, 126D, 126F, 126G, 126H, 1261, 126K, 126L, 126N, 126P, 126R, 126S, 126T, 126V, 126W, 126Y, 127C, 127L, 127 , 127V, 128A, 128C, 128D, 128E, 128F, 128G, 128H, 1281, 128L, 128M, 128N, 128Q, 128R, 128S, 128T, 128V, 128Y, 129A, 129C, 129D, 129E, 129F, 129H, 1291, 129K, 129L, 129M, 129R, 129S, 129T, 129V, 129Y, 130A, 130C, 130D, 130F, 130G, 130H, 1301, 130K, 130L, 130M, 130P, 130R, 130T, 130V, 130Y, 131A, 131C, 131D, 131E, 131F, 131G, 131H, 1311, 131K, 131L, 131M, 131N, 131Q, 131R, 131T, 131V, 131W, 131Y, 132A, 132C, 132E, 132H, 1321, 132L, 132M, 132N, 132Q, 132S, 132W, 132Y, 134C, 134D, 134E, 134F, 134G, 1341, 134L, 134M, 134N, 134R, 134S, 134T, 134V, 134Y, 135A, 135C, 135E, 135M, 135N, 135Q, 135R, 136A, 136C, 136F, 136L, 136T, 136Y, 137C, 138A, 138C, 138F, 138H, 138N, 138R, 138W, 138Y, 139A, 139C, 139G, 139H, 139L, 139M, 139S, 140A, 140C, 140F, 140G, 141A, 141F, 141H, 141P, 141Q, 141S, 141T, 141V, 141Y, 142C, 142D, 142F, 142G, 142H, 1421, 142K, 142M, 142Q, 142R, 142S, 142T, 142W, 142Y, 143A, 143C, 143D, 143F, 143K, 143L, 143M, 143N, 143Q, 143R, 143S, 143W, 144G, 144S, 144T, 144V, 144W, 145 , 146A, 146E, 146M, 146T, 147C, 147F, 147H, 1471, 147L, 147N, 147P, 147Y, 148A, 148C, 148F, 148H, 148K, 148M, 148R, 148Y, 149S, 150A, 150H, 150N, 150S, 151A, 151C, 151D, 151E, 151F, 151G, 151H, 1511, 151K, 151L, 151M, 151Q, 151R, 151S, 151T, 151V, 151Y, 152A, 152C, 152D, 152E, 152F, 152G, 152H, 1521, 152K, 152L, 152M, 152N, 152P, 152Q, 152R, 152S, 152V, 152W, 152Y, 153A, 153C, 153D, 153E, 153F, 153G, 153H, 1531, 153K, 153L, 153M, 153N, 153P, 153R, 153S, 153T, 153V, 153W, 153Y, 154A, 154C, 1541, 154N, 154P, 154Q, 154S, 154T, 154Y, 155A, 155C, 155E, 155F, 155G, 155H, 1551, 155L, 155M, 155T, 155V, 155 , 156A, 156C, 156D, 156E, 156F, 156G, 156H, 1561, 156K, 156L, 156N, 156Q, 156R, 156T, 156V, 156W, 156Y, 157A, 157C, 157F, 157H, 1571, 157 , 157T, 157V, 158A, 158F, 158H, 1581, 158M, 158Q, 158S, 158T, 158V, 159A, 159C, 159E, 159F, 159G, 159H, 1591, 159L, 159M, 159N, 159R, 159S, 159T, 159V, 159W, 159Y, 160A, 160C, 160D, 160E, 160F, 160G, 160H, 1601, 160K, 160L, 160M, 160N, 160Q, 160S, 160T, 160V, 160W, 160Y, 161A, 161C, 161G, 161H, 161K, 161L, 161M, 161N, 161S, 162A, 162C, 162E, 162F, 1621, 162M, 162V, 163A, 163C, 163E, 163F, 163G, 163H, 1631, 163K, 163L, 163N, 163Q, 163R, 163S, 163T, 163V, 163W, 163Y, 164A, 164F, 164G, 164H, 1641, 164L, 164M, 164N, 164Q, 164S, 164T, 164V, 164W, 164Y, 165C, 165G, 1651, 165L, 165M, 165Q, 165S, 165T, 165V, 165W, 165Y, 166A, 166C, 166D, 166E, 166F, 166G, 166H, 1661, 166K, 166M, 166N, 166Q, 166R, 166S, 166T, 166V, 166W, 166Y, 167A, 167C, 167D, 167E, 167F, 167G, 167H, 1671, 167K, 167L, 167M, 167Q, 167R, 167S, 167T, 167V, 167W, 167Y, 168C, 168E, 168F, 168G, 1681, 168K, 168L, 168M, 168N, 168S, 168T, 168V, 168W, 168Y, 169L, 170C, 170G, 170V, 171A, 171C, 171E, 171F, 171G, 171H, 1711, 171L, 171M, 171N, 171Q, 171R, 171V, 172A, 172C, 172E, 172F, 172P, 1731, 173M, 173V, 173Y, 174D, 174E, 174G, 174H, 174L, 174Q, 174V, 174Y, 175H, 175M, 175 , 175Y, 176E, 176F, 1761, 176K, 176L, 176V, 176Y, 177C, 177G, 177 , 177Q, 177S, 178C, 178G, 178M, 178S, 178T, 179A, 179C, 179G, 179H, 1791, 179L, 179M, 179P, 179S, 179T, 179V, 179W, 179Y, 180A, 180D, 180M, 180N, 180Y, 181A, 181C, 181L, 181M, 181V, 182A, 183C, 183M, 184A, 184C, 184D, 184E, 184F, 184G, 184H, 1841, 184K, 184L, 184M, 184N, 184Q, 184R, 184S, 184T, 184V, 184 , 184Y, 185C, 185E, 185N, 185S, 185T, 186E, 187A, 187C, 187D, 187E, 187F, 187H, 1871, 187K, 187L, 187M, 187N, 187P, 187Q, 187R, 187S, 187T, 187V, 187 , 187Y, 188A, 188C, 188D, 188E, 188F, 188G, 1881, 188K, 188L, 188M, 188N, 188P, 188Q, 188R, 188T, 188V, 189F, 189 , 190A, 190C, 190E, 190F, 190H, 190K, 190L, 190M, 190Q, 190R, 190S, 190 , 190Y, 191A, 191L, 191T, 191Y, 192D, 192E, 192F, 192G, 1921, 192K, 192L, 192N, 192P, 192R, 192S, 192T, 192V, 193A, 1931, 193L, 193M, 1941 , 195A, 195C, 195D, 195F, 195G, 195H, 1951, 195K, 195L, 195M, 195N, 195Q, 195R, 195S, 195T, 195V, 195 , 195Y, 196A, 196C, 196D, 196E, 196F, 196G, 196H, 1961, 196K, 196L, 196M, 196Q, 196R, 196S, 196T, 196V, 196 , 196Y, 197A, 197C, 197F, 197L, 197S, 197T, 197V, 198A, 198C, 198G, 198H, 1981 , 198L, 198M, 198N, 198R, 198S, 198V, 199A, 199C, 199D, 199E, 199F, 199G, 199H, 1991, 199L, 199M, 199P, 199R, 199S, 199T, 199V, 199Y, 200A, 200C, 200D, 200E, 200F, 200G, 200H, 2001, 200 , 200L, 200M, 200N, 200P, 200Q, 200R, 200S, 200V, 200 , 200Y, 201A, 201C, 201D, 201E, 201F, 201G, 201H, 2011 , 201K, 201L, 201M, 201N, 201P, 201Q, 201R, 201T, 201V, 201W, 201Y, 202C, 202F, 202G, 2021, 202K, 202L, 202M, 202N, 202P, 202Q, 202R, 202S, 202T, 202V, 202Y, 203A, 203C, 203F, 203G, 2031 , 203 , 203L, 203N, 203P, 203Q, 203R, 203S, 203T, 203V, 203 , 203Y, 204A, 204C, 204E, 2041, 204L, 204M, 204T, 204V, 204 , 204Y, 205A, 205C, 205D, 205E, 205F, 205G, 205H, 2051, 205K, 205L, 205M, 205N, 205R, 205S, 205T, 205V, 205W, 205Y, 206F, 207A, 207C, 207M, 208K, 208?, 208R, 209C, 209F, 209L, 209M, 209T, 209V, 210F, 2101, 210V, 210W, 211A, 211C, 211D, 211E, 211G, 211H, 211M, 211P, 211S, 211T, 211W, 211Y, 212A, 212C, 212E, 212G, 212H, 212N, 212P, 212Q, 212S, 212T, 212Y, 213A, 213C, 213D, 213E, 213F, 213G, 213H, 2131, 213K, 213L, 213M, 213P, 213Q, 213R, 213T, 213V, 213Y, 214C, 214D, 214F, 214G, 2141 , 214K, 214L, 214M, 214N, 214Q, 214R, 214S, 214T, 214V, 214W, 214Y, 215A, 215C, 215H, 215T,. 216C, 216K, 217E, 217F, 217G, 2171, 217K, 217M, 217N, 217P, 217Q, 217R, 217S, 217T, 217V, 217Y, 218C, 218D, 218E, 218F, 218G, 218H, 2181, 218K, 218L, 218M, 218N, 218P, 218Q, 218R, 218S, 218T, 218V, 218W, 218Y, 219C, 219D, 219F, 219G, 219H, 2191, 219K, 219L, 219M, 219N, 219Q, 219R, 219S, 219T, 219V, 219 , 219Y, 220F, 221C, 221E, 221G, 2211, 221L, 221M, 221N, 221Q, 221R, 221S, 221T, 221V, 221Y, 222A, 222C, 222D, 222F, 222G, 2221, 222K, 222M, 222P, 222R, 222S, 222T, 222V, 223A, 223C, 223E, 223F, 223H, 2231, 223L, 223 , 223N, 223Q, 223V, 223W, 2241, 224L, 224V, 224Y, 225A, 225C, 225E, 225F, 225H, 2251, 225K, 225L, 225M, 225N, 225P, 225Q, 225S, 225T, 225V, 225W, 225Y, 226A, 226C, 226F, 2261, 226L, 226M, 226T, 227A, 227C, 227D, 227E, 227G, 227M, 227S, 228C, 228a,.. .228M, 22.8N, -228P, 228S, 228T, 228V, 229C, 229D, 229E, 229F, 229G, 229H, 229M, 229N, 229Q, 229R, 229T, 229V, 229Y, 230?, 230D, 230E, 230F, 230G, 230H, 2301, 230K, 230M, 230P, 230Q, 230R, 230S, 230V, 230Y, 231A, 231C, 231H, 231L, 231M, 231Q, 231W, 232A, 232C, 232M, 232N, 232Q, 232S, 232Y, 233A, 233C, 233D, 233E, 233F, 233G, 2331, 233K, 233L, 233M, 233N, 233P, 233Q, 233R, 233S, 233T, 233V, 233 , 233Y, 234A, 234C, 234D, 234E, 234F, 234G, 234H, 2341 , 234L, 234M, 234N, 234Q, 234R, 234T, 234V, 234W, 234Y, 235A, 235C, 235F, 235L, 235M, 235T, 236A, 236C, 236D, 236E, 236G, 236H, 2361, 236K, 236L, 236M, 236N, 236Q, 236S, 236T, 237A, 237C, 237D, 237E, 237F, 237G, 237H, 2371, 237K, 237L, 237P, 237Q, 237R, 237T, 237V, 237 , 237Y, 238C, 238D, 238E, 238F, 238G, 238H, 2381, 238K, 238L, 238M, 238N, 238Q, 238R, 238S, 238T, 238V, 238 , 238Y, 239A, 239E, 239F, 2391, 239M, 239T, 240A, 240C, 240D, 240E, 240F, 240G, 240H, 2401, 240L, 240M, 240N, 240Q, 240R, 240S, 240T, 240V, 240W, 240Y, 241A, 241C, 241D, 241E, 241F, 241G, 241H, 2411, 241K, 241L, 241M, 241P, 241Q, 241R, 241S, 241T, 241V, 241W, 241Y, 242A, 242C, 242D, 242E, 242F, 2421, 242K, 242L, 242M, 242Q, 242S, 242T, 242V, 242W, 242Y, 243A, 243C, 243D, 243E, 243F, 243G, 243H, 2431, 243K, 243L, 243M, 243Q, 243R, 243S, 243T, 243V, 243W, 243Y, 244A, 244F, 2441, 244M, 244T, 244V, 244W, 244Y, 245A, 245C, 245D, 245F, 245H, 2451, 245L, 245M, 245N, 245P, 245R, 245T, 245V, 245W, 245Y, 246A, 246C, 246D, 246E, 246F, 246G, 246H, 2461, 246K, 246L, 246P, 246Q, 246R, 246S, 246T, 246W, 246Y, 247A, 247D, 247E, 247F, 247G, 247H, 2471, 247L, 247M, 247N, 247P, 247Q, 247T, 247V, 247Y, 248A, 248C, 248E, 248F, 248G, 248H, 2481 , 248K, 248L, 248M, 248Q, 248R, 248S, 248T, 248V, 248W, 249A, 249C, 249E, 249F, 249H, 249L, 249 , 249P, 249S, 249V, 249Y, 250A, 250C, 250E, 250F, 250G, 250H, 2501, 250K, 250L, 250 , 250N, 250Q, 250R, 250T, 250V, 250W, 250Y, 251A, 251C, 251D, 251E, 251G, 2511, 251K, 251L, 251M, 251N, 251P, 251Q, 251R, 251V, 251Y, 252C, 252D, 252E, 252F, 252G, 252H, 2521, 252K, 252L, 252M, 252Q, 252R, 252S, 252T, 252V, 252W, 253C, 253E, 253F, 253G, 253H, 2531 , 253K, 253L, 253M, 253P, 253R, 253S, 253T, 253V, 253 , 253Y, 254A, 254F, 254G, 254H, 2541, 254K, 254L, 254N, 254P, 254R, 254T, 254V, 254W, 254Y, 255A, 255C, 255E, 255F, 255G, 2551, 255K, 255L, 255N, 255P, 255Q, 255R, 255S, 255T, 255V, 255W, 255Y, 256A, 256C, 2561, 256M, 256N, 256T, 257A, 257D, 257E, 257F, 257G, 257H, 2571, 257K, 257L, 257M, 257N, 257P, 257Q, 257R, 257T, 257V, 257 , 258C, 258D, 258E, 258F, 258G, 258H, 2581, 258K, 258L, 258M, 258N, 258Q, 258R, 258S, 258T, 258V, 258Y, 259A, 259E, 259G, 259H, 2591, 259K, 259L, 259M, 259P, 259Q, 259R, 259S, 259T, 259W, 259Y, 260A, 260C, 260D, 260E, 260F, 260G, 260H, 2601, 260L, 260M, 260N, 260Q, 260R, 260S, 260T, 260V, 260W, 260Y, 261A, 261C, 2611, 261M, 261N, 261Q, 261S, 261T, 261V, 262A, 262C, 2621, 262M, 262T, 263A, 263C, 263L, 263M, 263N, 263P, 263S, 263V, 264D, 264E, 264G, 264H, 2641, 264L, 264N, 264Y, 265A, 265C, 265F, 265M, 265T, 265Y, 267A, 267C, 267D, 267F, 267G, 267H, 267M, 267N, 267Q, 267T, 267V, 268M, 268Q, 268R, 268V, 268Y, 270C, 270F, 270G, 2701 , 270L, 270M, 270N, 270R, 270S, 270V, 270Y, 271F, 272G, 2721 , 272L, 272M, 272N, 272S, 272T, 272V, 273D, 273G, 2731, 273K, 273L, 273P, 273Q, 273R, 273S, 273T, 273V, 273W, 273Y, 274A, 274C, 274F, 274G, 274H, 2741, 274K, 274L, 274M, 274N, 274P, 274Q, 274R, 274S, 274T, 274V, 274 , 274Y, 275A, 275C, 275E, 275F, 275G, 275H, 2751, 275K, 275L, 275M, 275N, 275P, 275Q, 275R, 275S, 275T, 275V, 275W, 275Y, 276A, 276C, 276D, 276F, 276G, 276H, 2761, 276 , 276L, 276M, 276N, 276P, 276Q, 276R, 276S, 276T, 276V, 276W, 276Y, 277A, 277C, 277D, 277F, 277G, 277H, 2771, 277K, 277L, 277M, 277N, 277P, 277Q, 277R, 277S, 277T, 277V, 277W, 277Y, 278A, 278C, 278T, 279D, 279E, 279G, 279H, 2791, 279K, 279L, 279M, 279N, 279P, 279Q, 279R, 279S, 279V, 279W, 279Y, 280A, 280D, 280E, 280F, 280G, 280H, 280K, 280L, 280M, 280N, 280Q, 280R, 280S, 280T, 280Y, 281C, 281F, 281L, 282A, 282C, 282D, 282E, 282F, 282G, 282H, 2821, 282K, 282L, 282M, 282N, 282P, 282Q, 282R, 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298Q, 298R, 298S, 298V, 298 , 299C, 299D, 299E, 299F, 299G, 299H, 2991 , 299L, 299M, 299N, 299P, 299Q, 299V, 300A, 300C, 300F, 300H, 3001, 300K, 300L, 300M, 300N, 300Q, 300R, 300S, 300V, 300Y, 301C, 301D, 301F, 301H, 3011, 301K, 301L, 301M, 301Q, 301R, 301T, 301V, 302C, 302E, 302F, 302G, 302K, 302M, 302N, 302S, 302T, 303L, 303M, 303W, 303Y, 304C, 304E, 304G, 304L, 304N, 304Y, 305A, 305G, 3051, 305N, 305T, 305V, 307A, 307C, 307D, 307N, 307Q, 307T, 307V, 307Y, 308A, 308C, 308D, 308F, 308G, 308H, 3081, 308K, 308L, 308M, 308N, 308P, 308Q, 308R, 308S, 308T, 308V, 308W, 308Y, 309C, 309D, 309E, 309F, 309H, 3091, 309K, 309M, 309N, 309P, 309R, 309S, 309T, 309V, 309Y, 310A, 310D, 310E, 310F, 310H, 3101, 310L, 310M, 310N, 310P, 310Q, 310R, 310S, 310T, 310Y, 311A, 311C, 311D, 311E, 311F, 311H, 311K, 311L, 311M, 311N, 311P, 3HQ, 311R, 311S, 311T, 311V, 311W, 311Y, 312A, 312C, 312D, 312E, 312F, 312G, 312H, 3121, 312K, 312L, 312M, 312P, 312Q, 312R, 312S, 312T, 312V, 312W, 312Y, 313A, 313C, 313D, 313E, 313F, 313H, 3131, 313K, 313L, 313M, 313N, 313P, 313Q, 313R, 313S, 313T, 313V, 313W, 313Y, 314A, 314C, 314D, 314F, 314G, 314H, 314K, 314L, 314M, 314Q, 314R, 314S, 314T, 314W, 314Y, 315C, 315D, 315E, 315G, 315H, 3151, 315K, 315L, 315M, 315N, 315P, 315Q, 315T,' 315V, 316C, 316D, 316H, 3161, 316L, 316M, 316Y, 317A, 317C, 317D, 317E, 317F, 317G, 317H, 3171, 317K, 317L, 317N, 317Q, 317R, 317S, 317T, 317V, 317W, 317Y, 318D, 318F, 318H, 3181, 318K, 318L, 318M, 318N, 318R, 318S, 318T, 318V, 318 , 318Y, 319A, 319D, 319F, 319G, 319H, 319L, 319N, 319P, 319Q, 319S, 319V, 319W, 320A, 320C, 320D, 320F, 320G, 320H, 3201, 320K, 320L, 320M, 320N, 320P, 320Q, 320T, 320V, 320W, 320Y, 321A, 321C, 321D, 321E, 321F, 321G, 321H, 3211, 321K, 321L, 321M, 321N, 321P, 321R, 321S, 321T, 321V, 321 , 322L, 322M, 322V, 323A, 323C, 323H, 323N, 323R, 323S, 323T, 324A, 324C, 324E, 324F, 324G, 324H, 3241, 324K, 324L, 324M, 324N, 324P, 324Q, 324R, 324S, 324T, 324V, 324 , 324Y, 325A, 325C, 325D, 325F, 325G, 325H, 3251, 325K, 325L, 325M, 325N, 325P, 325T, 325V, 325W, 325Y, 326A, 326Q, 327C, 327D, 327F, 327G, 327H, 327K, 327N, 327P, 327R, 327T, 327V, 327Y, 328C, 328D, 328E, 328F, 328G, 328H, 3281, 328K, 328L, 328N, 328P, 328Q, 328R, 328S, 328T, 328V, 328W, 328Y, 329A, 329D, 329E, 329F, 329G, 329H, 329N, 329Q, 329R, 329S, 329T, 330A, 330C, 330H, 330L, 330M, 330S, 330W, 330Y, 331C, 331D, 331F, 331G, 3311, 331K, 331L, 331M, 331N, 331Q, 331R, 331S, 331T, 331V, 331Y, 332A, 332C, 332E, 332F, 332G, 3321 , 332K, 332L, 332M, 332Q, 332R, 332S, 332V, 332Y, 333C, 333D, 333F, 333G, 333H, 3331 , 333K, 333L, 333M, 333N, 333P, 333R, 333S, 333T, 333V, 333W, 333Y, 334C, 334D, 334F, 334G, 334H, 3341, 334L, 334M, 334N, 334Q, 334R, 334S, 334T, 334V, 334Y, 335A, 335L, 335M, 335Q, 335T, 335V, 336A, 336C, 336E, 336F, 336G, 336H, 3361, 336K, 336L, 336M, 336N, 336Q, 336R, 336S, 336V, 336 , 336Y, 337D, 337G, 337H, 337K, 337L, 337N, 337P, 337Q, 337R, 337S, 337V, 337W, 337Y, 338C, 338F, 338G, 3381, 338L, 338M, 338N, 338P, 338S, 338T, 339C, 339G, 3391, 339S, 339T, 339V, 340D, 340E, 340F, 340G, 340H, 3401, 340K, 340L, 340M, 340N, 340S, 340T, 340V, 340W, 341A, 3411, 341L, 341M, 341V, 341W, 341Y, 342A, 342D, 342E, 342F, 342G, 342K, 342L, 342M, 342N, 342R, 342S, 342V, 342Y, 343A, 343C, 343D, 343E, 343F, 343G, 343H, 3431, 343K, 343L, 343M, 343P, 343Q, 343S, 343T, 343V, 343W, 343Y, 344A, 344C, 344D, 344E, 344F, 344G, 344H, 3441, 344K, 344L, 344M, 344N, 344Q, 344R, 344S, 344T, 344W, 344Y, 345A, 345C, 345D, 345E, 345F, 345G, 345H, 3451, 345N, 345Q, 345S, 345T, 345V, 345W, 345Y, 346C, 346D, 346E, 346F, 346H, 3461, 346K, 346L, 346M, 346N, 346P, 346R, 346S, 346T, 346V, 346Y, 347A, 347C, 347D, 347E, 347F, 347H, 3471, 347K, 347L, 347M, 347N, 347P, 347Q, 347R, 347S, 347T, 347V, 347W, 347Y, 348C, 348F, 348G, 348H, 3481, 348K, 348M, 348N, 348P, 348R, 348S, 348T, 348V, 348W, 348Y, 349A, 349C, 349D, 349F, 349G, 349H, 3491, 349K, 349L, 349M, 349N, 349Q, 349R, 349S, 349T, 349V, 349W, 349Y, 350A, 350C, 350D, 350N, 350S, 351A, 351D, 351G, 351H, 351K, 351L, 351M, 351P, 351Q, 351R, 351S, 351T, 351V, 351 , 351Y, 352A, 352D, 352E, 352F, 352G, 352H, 3521, 352K, 352N, 352Q, 352R, 352T, 352V, 352 , 352Y, 353A, 353C, 353D, 353E, 353F, 353G, 3531, 353K, 353L, 353M, 353N, 353Q, 353R, 353T, 353V, 353W, 353Y, 354A, 354C, 354M, 354P, 354Q, 354S, 354T, 355C, 355D, 355E, 355F, 355G, 3551, 355K, 355L, 355M, 355N, 355T, 355V, 355 , 355Y, 356D, 356E, 356F, 356G, 356H, 3561, 356K, 356L, 356M, 356P, 356Q, 356T, 356 , 356Y, 357A, 357C, 357D, 357E, 357F, 357H, 3571, 357K, 357L, 357M, 357N, 357P, 357Q, 357R, 357S, 357T, 357V, 357 , 357Y, 358A, 358C, 358D, 358E, 358F, 358G, 358H, 3581, 358K, 358L, 358M, 358P, 358Q, 358R, 358S, 358T, 358V, 358W, 358Y, 359A, 359C, 359D, 359E, 359F, 359G, 359H, 3591, 359K, 359L, 359M, 359P, 359Q, 359R, 359S, 359T, 359V, 359 , 359Y, 360F, 360H, 360L, 360N, 360P, 360R, 360T, 360W, 361A, 361C, 361G, 361H, 361L, 361M, 361N, 361Q, 361S, 361T, 361V, 361W, 361Y, 362A, 362C, 362E, 362H, 3621, 362L, 362M, 362Q, 362S, 362T, 362V, 362Y, 363D, 363E, 363F, 363G, 363H, 363N, 363Q, 363R, 363S, 363V, 363W, 363Y, 364A, 364C, 364D, 364E, 364G, 3641, 364L, 364M, 364Q, 364S, 364T, 364V, 365A, 365C, 365D, 365F, 365G, 3651, 365K, 365L, 365M, 365N, 365R, 365S, 365T, 365V, 365W, 365Y, 366A, 366C, 366E, 366F, 366G, 366H, 366K, 366L, 366M, 366S, 366T, 366V, 367A, 367C, 367D, 367E, 367F, 367H, 3671, 367K, 367L, 367M, 367N, 367P, 367R, 367S, 367T, 367V, 367 , 367Y, 368D, 368F, 368G, 3681, 368K, 368L, 368M, 368N, 368P, 368Q, 368R, 368T, 368V, 368 , 368Y, 369A, 369C, 369D, 369E, 369F, 369G, 3691, 369K, 369L, 369M, 369N, 369P, 369Q, 369R, 369S, 369T, 369V, 369 , 369Y, 370A, 371A, 371C, 371F, 371G, 371H, 3711, 371L, 371M, 371N, 371Q, 371S, 371T, 371 , 371Y, 372A, 372C, 372G, 3721, 372L, 372M, 372N, 372Q, 372S, 372T, 373A, 373C, 373F, 373G, 3731, 373M, 373Q, 373S, 373T, 373V, 373W, 373Y, 374C, 374E, 374G, 3741 , 374L, 374M, 374N, 374S, 374T, 374V, 375A, 375C, 375D, 375F, 375G, 375H, 375L, 375M, 375Q, 375S, 375T, 375V, 375W, 375Y, 376C, 376D, 376E, 376F, 376G, 376H, 3761, 376L, 376M, 376N, 376P, 376Q, 376S, 376T, 376V, 377F, 377H, 3771, 377K, 377L, 377P, 377T, 377 , 377Y, 378A, 378C, 378D, 378E, 378F, 378G, 378H, 3781, 378K, 378L, 378M, 378N, 378P, 378Q, 378R, 378T, 378V, 378W, 378Y, 379A, 379D, 379G, 379H, 3791, 379K, 379L, 379Q, 379T, 379W, 379Y, 380A, 380C, 380D, 380E, 380F, 380G, 380H, 3801, 380L, 380M, 380N, 380P, 380Q, 380R, 380T, 380V, 380W, 380Y, 381A, 381G, 3811, 381K, 381N, 381P, 381Q, 381R, 381S, 381T, 381W, 381Y, 382A, 382C, 382D, 382F, 382G, 382H, 3821, 382K, 382L, 382M, 382N, 382P, 382Q, 382R, 382T, 382V, 382 , 382Y, 383A, 383C, 383E, 383F, 383G, 383H, 383L, 383N, 383P, 383Q, 383S, 383T, 383V, 383W, 383Y, 384A, 384D, 384F, 384G, 384H, 3841, 384K, 384L, 384P, 384Q, 384S, 384T, 384V, 384 , 385A, 385C, 385D, 385E, 385F, 385G, 385H, 3851, 385K, 385L, 385M, 385N, 385P, 385Q, 385R, 385S, 385V, 385 , 385Y, 386C, 386D, 386F, 386G, 386H, 3861, 386L, 386N, 386P, 386R, 386S, 386T, 386V, 386 , 386Y, 387A, 387D, 387E, 387G, 3871, 387L, 387N, 387Q, 387S, 388A, 388C, 388D, 388E, 388F, 388G, 388H, 3881, 388L, 388M, 388N, 388P, 388Q, 388R, 388S, 388T, 388V, 388 , 388Y, 389C, 389E, 389F, 389H, 3891, 389K, 389M, 389N, 389Q, 389S, 389T, 389V, 389 , 389Y, 390A, 390C, 390D, 390E, 390F, 390G, 390H, 3901, 390K , 390L, 390M, 390N, 390R, 390S, 390T, 390V, 390 , 390Y, 391E , 391F, 391G, 391H, 3911, 391K, 391L, 391N, 391P, 391R, 391S , 391T, 391V, 391W, 391Y, 392A, 392C, 392D, 392E, 392F, 392H , 392K, 392L, 392M, 392N, 392Q, 392R, 392S, 392V, 392Y, 393A , 393C, 393D, 393F, 393G, 393H, 3931, 393L, 393M, 393P, 393Q , 393S, 393T, 393V, 393W, 393Y, 394A, 394C, 394E, 394F, 394H , 3941, 394K, 394L, 394M, 394N, 394P, 394Q, 394R, 394S, 394T , 394V, 394W, 395A, 395C, 395E, 395F, 395G, 395H, 3951, 395K , 395L, 395M, 395N, 395P, 395Q, 395R, 395S, 395T, 395V, 395W , 395Y, 396A, 396C, 396D, 396E, 396G, 396M, 396P, 396S, 396T , 397A, 397C, 397D, 397E, 397F, 397G, 397H, 3971, 397L, 397M , 397P, 397R, 397S, 397T, 397V, 397W, 398C, 398D, 398E, 398F , 398G, 3981, 398L, 398M, 398N, 398P, 398Q, 398R, 398S, 398T , 398V, 398W, 398Y, 399A, 399C, 399D, 399E, 399F, 399H, 3991 , 399K, 399L, 399P, 399R, 399S, 399T, 399V, 399W, 399Y, 400C , 400D, 400E, 400F, 400G, 400H, 4001, 400K, 400L, 400M, 400N , 400P, 400Q, 400R, 400S, 400T, 400V, 400 , 400Y, 401A, 401C , 401D, 401E, 401F, 401H, 4011, 401K, 401L, 401M, 401N, 401P , 401Q, 401R, 401S, 401T, 401V, 401W, 401Y, 402A, 402C, 402D , 402E, 402F, 402G, 402H, 4021, 402K, 402L, 402M, 402N, 402P , 402Q, 402R, 402T, 402V, 402W, 402Y, 403A, 403C, 403E, 403G, 403H, 4031, 403M, 403N, 403Q, 403S, 403T, 403V, 403W, 403Y, 404D, 404E, 404F, 404G, 404H, 4041, 404L, 404M, 404N, 404P, 404R, 404T, 404V, 404W, 404Y, 405E, 405F, 405G, 405H, 4051, 405K, 405Q, 405S, 405T, 406D, 406F, 406L, 406T, 406Y, 407A, 407C, 407E, 407F, 407G, 407H, 4071, 407K, 407M, 407N, 407P, 407Q, 407R, 407S, 407T, 407V, 407W, 407Y, 408A, 408D, 408E, 408F, 408H, 4081, 408K, 408N, 408P, 408Q, 408S, 408T, 408V, 408Y, 409A, 409C, 409D, 409E, 409F, 409H, 4091, 409L, 409M, 409Q, 409R, 409T, 409V, 409 , 409Y, 410F, 410G, 4101, 410K, 410Q, 410S, 410T, 410V, 410 , 410Y, 411A, 411D, 411E, 411F, 411G, 411H, 4111, 411L, 411M, 411N, 411Q, 411R, 411S, 411V, 411W, 411Y, 412A, 412D, 412E, 412H, 4121, 412K, 412L, 412M, 412N, 412R, 412S, 412T, 412V, 412Y, 413C, 413E, 413F, 413G, 4131 , 413L, 413M, 413N, 413P, 413R, 413S, 413V, 413W, 413Y, 414A, 414C, 414E, 414F, 414G, 414H, 414L, 414M, 414N, 414P, 414Q, 414T, 414V, 414W, 415D, 415E, 415F, 415G, 415H, 4151, 415K, 415P, 415Q, 415R, 415V, 415W, 416F, 4161, 416L, 416P, 416Q, 416R, 416T, 416V, 416Y, 417A, 417C, 417D, 417F, 417G, 417H, 4171, 417K, 417M, 417N, 417P, 417Q, 417S, 417W, 417Y, 418C, 418D, 418E, 418F, 418H, 4181, 418K, 418N, 418Q, 418R, 418T, 418W, 418Y, 419C, 419D, 419E, 419F, 419G, 419H, 4191, 419L, 419P, 419Q, 419S, 419T, 419Y, 420D, 420E, 420F, 420G, 420H, 4201, 420K, 420L, 420M, 420N, 420Q, 420R, 420S, 420T, 420V, 420W, 420Y, 421A, 421C, 421G, 4211, 421L, 421M, 421S, 421T, 422A, 422F, 422G, 422H, 4221, 422M, 422N, 422Q, 422S, 422V, 422W, 422Y, 423A, 423D, 423G, 423H, 4231, 423K, 423P, 423Q, 423R, 423T, 423V, 423W, 424D, 424E, 424G, 4241, 424K, 424 , 424N, 424Q, 424R, 424S, 424T, 424V, 424 , 424Y, 425A, 4251, 425K, 425L, 425M, 425S, 425T, 425V, 425W y 425Y.

En algunas modalidades, la modificación es una sustitución de uno o más residuos de amino presentes en el polipéptido precursor a diferentes residuos de aminoácidos, en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste de 1A, ID, 1F, 1G, 1Y, 2A, 2E, 2F, 2G, 3G, 3H, 31, 3K, 3L, 4E, 4F, 4G, 41, 4K, 5G, 5K, 5L, 5V, 5W, 7D, 7E, 7H, 7N, 7Q, 8L, 8N, 8P, 8Q, 8R, 9K, 9M, 9N , 9P, 9R, HA, 11F, 11M, 11V, 121, 12M, 13A, 13D, 13Q, 14G, 14S, 14V, 15F, 16M, 16Q, 18G, 18N, 18R, 19H, 19W, 20A, 20D, 20G, 20H, 201, 20K, 20M, 20R, 20S, 20V, 20W, 20Y, 21E, 21M, 21Q, 21S, 21V, 221, 22T, 22V, 23A, 23D, 23E, 23F, 23H, 231, 23L, 23M, 23N, 23R, 23S, 23T, 23V, 23 , 23Y, 24C, 24F, 24G, 24R, 24S, 24T, 24V, 24Y, 25E, 25F, 25K, 25R, 25S, 25T, 25V, 25W, 25Y, 261, 26L, 27A, 27E, 27F, 27H, 271, 27L, 27P, 27Q, 27R, 27S, 27T, 27V, 27 , 27Y, 28C, 28G, 28H, 281, 28K, 28L, 28M, 28N, 28P, 28Q, 28R, 28V, 28 , 28Y, 29F, 29L, 29V, 30A, 30C, 30D, 30E, 30F, 30L, 30M, 30N, 30Q, 30R, 30S, 30T, 30V, 30W, 30Y, 31A, 31F, 31G, 31H, 311, 31K, 31L, 31M, 31N, 31Q, 31S, 31T, 31V, 31Y, 32G, 32S, 33A, 33D, 33E, 33H, 33Q, 33S, 34W, 35A, 35F, 35G, 35H, 351, 35L, 35M, 35N, 35Q, 35R, 35S, 35V, 35W, 36F, 36H, 361, 36L, 36S, 36T, 36Y, 37L, 37V, 39A, 39P, 39S, 39V, 42V, 43A, 43S, 43T, 43V, 44A, 44D, 44E, 44F, 44G, 44H, 441, 44K, 44N, 44R, 44S, 44T, 44Y, 45F, 45H, 451 , 45L, 45M, 45S, 45T, 46A, 46D, 46F, 46H, 46L, 46M, 46N, 46R, 47A, 47D, 47F, 47G, 47H, 471 , 47K, 47L, 47N, 47P, 47R, 47S, 47T, 47V, 47Y, 48A, 48E, 48F, 48H, 48N, 48P, 48 , 49A, 49F, 49G, 49H, 49K, 49L, 49Q, 49R, 49S, 49T, 49V, 49W, 49Y, 50E, 50F, 50H, 501, 50K, 50L, 50M, 50P, 50R, 50S, 50T, 50V, 50W, 50Y, 51D, 51E, 51F, 51H, 511, 51K, 51L, 51P, 51Q, 51R, 51S, 51T, 51V, 51W, 52E, 52F, 52G, 52H, 521, 52K, 52L, 52M, 52N, 52Q, 52R, 52S, 52T, 52V, 52W, 52Y, 53A, 53E, 53F, 53H, 531, 53L, 53P, 53R, 53S, 53T, 53V, 54A, 54C, 54F, 54G, 54H, 54L, 54N, 54P, 54R, 54T, 54W, 54Y, 55A, 55F, 55H, 55N, 55P, 55Q, 55S, 55T, 55Y, 56D, 56E, 56F, 56G, 561, 56K, 56L, 56P, 56Q, 56R, 56T, 56V, 56W, 56Y, 57A, 57E, 57H, 57M, 57Q, 57R, 57S, 57Y, 58F, 59A, 59C, 59F, 59H, 59N, 59P, 59R, 59S, 59T, 59W, 60L, 60N, 63H, 63N, 64A, 64S, 65A, 651, 65R, 66D, 66E, 66G, 66M, 66N, 66Q, 66R, 67A, 67F, 67G, 671, 67L, 67N, 67Q, 67T, 67W, 68D, 68F, 68H, 681, 68L, 68N, 68R, 68S, 68T, 68V, 68W, 69M, 69V, 72E, 72F, 72G, 72H, 721, 72K, 72Q, 72S, 72T, 72V, 72W, 72Y, 73F, 73M, 73W, 74M, 74T, 76A, 76L, 76M, 76P, 76Q, 76R, 76Y, 77A, 77D, 77K, 77L, 77R, 77Y, 78D, 78E, 78F, 78G, 78H, 781, 78K, 78L, 78P, 78R, 78S, 78T, 78W, 78Y, 79A, 79M, 79Q, 79S, 80M, 81E, 81G, 81H, 81L, 81M, 81N, 81Q, 81R, 81S, 81T, 81V, 81Y, 82D, 82F, 82G, 821, 82K, 82L, 82 , 82Q, 82R, 82S, 82T, 82Y, 83A, 83F, 83L, 84A, 84N, 84S, 84T, 85D, 85E, 85F, 85G, 851, 85K, 85R, 85S, 85T, 85V, 85W, 86D, 86E, 86F, 86G, 861, 86K, 86L, 86M, 86N, 86Q, 86R, 86S, 86V, 86W, 86Y, 87G, 88A, 88D, 88F, 88G, 88H, 88K, 88L, 88M, 88N 88Q, 88R, 88S, 88T, 88W, 88Y, 89D, 89F, 89G, 89H, 891, 89K 89L, 89M, 89N, 89P, 89Q, 89R, 89S, 89T, 89V, 89W, 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119S, 119T, 119Y, 121S, 124A, 124K, 124Q, 124R, 124S, 124T, 125A, 125D, 125F, 1251, 125K, 125Q, 125R, 125V, 125Y, 126A, 126C, 126D, 126F, 126G, 126H, 1261 , 126K, 126L, 126N, 126P, 126R, 126S, 126T, 126V, 126W, 126Y, 128A, 128C, 128E, 128F, 128G, 128H, 1281, 128L, 128M, 128N, 128Q, 128R, 128S, 128T, 128V, 129C, 129D, 129E, 130A, 130F, 130L, 130T, 130Y, 131A, 131C, 131D, 131F, 131G, 131H, 1311, 131K, 131L, 131N, 131Q, 131T, 131V, 131W, 131Y, 1321, 132N, 132S, 132 , 134E, 134F, 134L, 134M, 134R, 134Y, 135E, 136L, 140A, 141F, 141H, 142C, 142D, 142F, 142G, 142H, 1421, 142K, 142M, 142Q, 142R, 142S, 142T, 142W, 142Y, 143C, 143D, 143K, 143L, 143N, 143Q, 143S, 144T, 147F, 147L, 150H, 151C, 151D, 151E, 151G, 151H, 151K, 151L, 151M, 151Q, 151S, 151T, 152A, 152C, 152E, 152F, 152G, 152H, 1521, 152K, 152L, 152M, 152N, 152P, 152Q, 152R, 152S, 152V, 152W, 152Y, 153E, 153F, 153H, 153K, 153L, 153N, 153R, 153T, 153V, 153W, 153Y, 154A, 155M, 156A, 156F, 156G, 156K, 156L, 156Q, 156R, 156V, 156Y, 157F, 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196R, 196S, 196T, 196V, 196Y, 197L, 197V, 198A', 198C, 1981, 198L, 198V, 199C, 199D, 199E, 199F, 199H, 199R, 199S, 199T, 199Y, 2001, 200N, 200S, 200V, 201C, 201D, 201E, 201F, 201G, 201H, 2011, 201K, 201L, 201N, 201Q, 201R, 201T, 201V, 201W, 201Y, 202C, 202V, 203A, 203C, 203F, 203G, 2031, 203K, 203L, 203Q, 203R, 203S, 203T, 203V, 203W, 203Y, 2041, 204M, 204W, 204Y, 205A, 205C, 2051, 205L, 205M, 205N, 205V, 207A, 209L, 209V, 211H, 211S, 211T, 212G, 212N, 213A, 213E, 213F, 213G, 2131, 213K, 213L, 213M, 213P, 213Q, 213R, 213T, 213V, 214C, 214D, 214F, 214G, 2141 , 214K, 214L, 214M, 214N, 214Q, 214R, 214S, 214T, 214V, 214 , 214Y, 2171, 217Q, 217T, 218C, 218D, 218E, 218F, 218G, 218H, 2181, 218K, 218L, 218M, 218P, 218Q, 218R, 218S, 218T, 218V, 218W, 218Y, 219D, 219F, 219G, 219H, 2191, 219N, 219Q, 219S, 219T, 219V, 219Y, 221C, 221E, 221G, 221Q, 221S, 221V, 222F, 222T, 223H, 223L, 223M, 223W, 2241, 225E, 225F, 225N, 225P, 225Q, 225T, 225Y, 2261, 226L, 229D, 229E, 229N, 229T, 230A, 230D, 230E, 230F, 230H, 2301, 230K, 230M, 230Q, 230R, 230S, 230V, 230Y, 231H, 231W, 232S, 233A, 233D, 233E, 233F, 233G, 2331, 233K, 233L, 233M, 233N, 233Q, 233S, 233T, 233V, 233W, 233Y, 234A, 234F, 234G, 234H, 2341, 234L, 234M, 234N, 234Q, 234R, 234T, 234V, 234 , 234Y, 235L, 235M, 236A, 236G, 2361, 236L, 236M, 236N, 236Q, 237C, 237D, 237E, 237F, 237G, 237H, 2371 , 237K, 237L, 237R, 237T, 237V, 237W, 237Y, 238C, 238E, 238G, 238N, 238R, 238S, 238 , 2391, 239M, 240A, 240E, 240F, 240G, 240L, 240Q, 240R, 240T, 240V, 240Y, 241F, 241G, 241H, 2411, 241K, 241L, 241R, 241S, 241T, 241V, 241W, 241Y, 242A, 242C, 242D, 242F, 2421 , 242K, 242L, 242S, 242T, 242V, 242W, 242Y, 243D, 243E, 243F, 243G, 243H, 2431, 243K, 243L, 243M, 243Q, 243R, 243S, 243T, 243V, 243 , 243Y, 2441, 244M, 244V, 245C, 245F, 245H, 2451, 245L, 245M, 245N, 245P, 245R, 245T, 245V, 245W, 245Y, 246C, 246D, 246E, 246G, 2461, 246L, 246Q, 246 , 246Y, 247F, 247G, 247H, 2471, 247L, 247M, 247N, 247Q, 247T, 247V, 247Y, 248F, 248G, 248K, 248L, 248Q, 248R, 248S, 248T, 248V, 248 , 249A, 249C, 249F, 249L, 249M, 249V, 250C, 250E, 250F, 250G, 250H, 2501, 250K, 250L, 250M, 250T, 250V, 250W, 250Y, 251A, 251C, 251D, 251E, 251G, 251K, 251L, 251M, 251P, 251Q, 251V, 251Y, 252F, 252L, 252W, 253F, 2531, 253K, 253L, 253M, 253R, 253T, 253 , 253Y, 254A, 254F, 254G, 254H, 2541, 254L, 254N, 254T, 254V, 254Y, 255A, 255E, 2551, 255K, 255P, 255R, 255S, 255V, 256A, 256C, 2561, 257E, 2571, 257L, 257P, 258C, 258D, 258E, 258N, 258Q, 258R, 258S, 258V, 259A, 259G, 259H, 259K, 259Q, 259R, 259S, 259T, 259 , 260A, 260C, 260D, 260F, 260H, 260N, 260Q, 260R, 260S, 260Y, 261M, 2621, 263C, 263L, 263M, 263S, 263V, 264E, 264H, 2641, 264L, 264Y, 267A, 267C, 267N, 267T, 268M, 268Q, 270F, 270G, 270N, 270S, 270V, 271F, 272G, 272L, 272S, 272V, 273G, 2731, 273L, 273T, 273Y, 274F, 274G, 274H, 2741, 274K, 274L, 274M, 274N, 274P, 274Q, 274R, 274S, 274T, 274V, 274W, 274Y, 275F, 275G, 275H, 275K, 275P, 275Q, 275R, 275S, 275T, 275V, 276A, 276C, 276D, 276F, 276G, 276H, 2761, 276K, 276L, 276M, 276N, 276P, 276Q, 276R, 276S, 276T, 276Y, 277A, 277D, 277F, 277G, 277H, 2771 , 277K, 277L, 277N, 277P, 277Q, 277R, 277S, 277T, 277V, 277Y, 279H, 279K, 279L, 279M, 279N, 279Q, 279Y, 280F, 280Y, 281C, 281L, 282A, 282D, 2821, 282K, 282L, 282M, 282N, 282Q, 282T, 282 , 282Y, 283C, 283G, 283H, 283P, 283R, 283S, 283T, 283V, 283 , 284A, 284C, 284E, 284F, 284G, 284H, 2841, 284K, 284L, 284N, 284R, 284S, 284T, 284V, 284 , 284Y, 285E, 285M, 286C, 286L, 286M, 286V, 287A, 287C, 287E, 287H, 2871, 287K, 287L, 287M, 287Q, 287S, 287T, 287V, 288C, 2881, 288M, 288V, 289A, 290Y, 291C, 291G, 291L, 291S, 291T, 292A, 292C, 2921, 292L, 292T, 293C, 293V, 294C, 294G, 294S, 294T, 295A, 295G, 297D, 297E, 297F, 297G, 297H, 2971, 297K, 297L, 297M, 297N, 297P, 297Q, 297R, 297T, 297V, 297W, 298C, 298D, 298E, 298F, 298H, 2981, 298K, 298L, 298M, 298N, 298P, 298Q, 298R, 298S, 298V, 298W, 299C, 299G, 2991, 299N, 299V, 300H, 300M, 300R, 300V, 3011, 301K, 301L, 301M, 301T, 302T, 303M, 304L, 304Y, 305T, 305V, 307C, 307N, 308C, 308F, 308G, 308H, 3081, 308K, 308L, 308M, 308N, 308P, 308Q, 308R, 308S, 308T, 308V, 308 , 308Y, 309D, 309E, 309F, 309H, 309K, 309R, 309S, 310A, 311A, 311H, 311K, 311R, 312D, 312F, 312G, 312H, 3121, 312K, 312L, 312 , 312P, 312Q, 312R, 312S, 312T, 312V, 312W, 312Y, 313A, 313D, 313E, 313F, 313K, 313L, 313N, 313Q, 313R, 313S, 313W, 313Y, 314A, 314F, 314H, 314K, 314L, 314M, 314Q, 314R, 314S, 314T, 314W, 314Y, 315K, 315N, 315P, 315T, 316Y, 317A, 317C, 317E, 317F, 317H, 317K, 317L, 317R, 317S, 317T, 317V, 317W, 317Y, 318D, 318F, 318H, 3181, 318K, 318L, 318M, 318N, 318R, 318S, 318T, 318V, 318W, 318Y, 319G, 319L, 319N, 319Q, 319V, 319W, 320C, 320F, 320G, 3201, 320K, 320L, 320M, 320P, 320Q, 320T, 320V, 320Y, 321C, 321D, 321E, 321F, 321G, 321?, 3211, 321K, 321L, 321R, 321S, 321T, 321V, 321W, 322L, 322M, 322V, 324A, 324F, 324G, 324H, 3241, 324K, 324L, 324M, 324N, 324Q, 324R, 324S, 324T, 324V, 324W, 324Y, 325C, 325D, 325G, 325H, 3251, 325K, 325L, 325M, ¦325?, 325P, 325T, 325V, 327C, 327D, .327G, 327H, 327N, 327T, 328D, 328E, 328F, 328L, 328N, 328Q, 328Y, 329F, 329H, 329Q, 330W, 330Y, 331D, 331F, 331G, 3311, 331L, 331Q, 331S, 331T, 331V, 331Y, 332A, 332C, 332G, 332Q, 332S, 333C, 333G, 333H, 333K, 333L, 333M, 333R, 333S, 333W, 333Y, 334D, 334H, 3341, 334L, 334M, 334N, 334R, 334T, 335V, 336A, 336C, 336F, 336G, 3361, 336M, 336N, 336Q, 336R, 336V, 336W, 336Y, 337H, 337N, 337S, 337V, 337W, 337Y, 338G, 3381, 338L, 338M, 338S, 338T, 339C, 340F, 340H, 340K, 340L, 340M, 340N, 340S, 340T, 340V, 340W, 341A, 341L, 341Y, 342A, 342K, 342N, 342R, 342Y, 343A, 343D, 343E, 343F, 343H, 343K, 343L, 343M, 343Q, 343S, 343T, 343W, 343Y, 344A, 344D, 344E, 344F, 344G, 3441, 344K, 344L, 344M, 344N, 344Q, 344R, 344S, 344T, 344 , 344Y, 345C, 345E, 345F, 345G, 345H, 3451, 345N, 345Q, 345S, 345T, 345V, 346C, 346D, 346E, 3461, 346K, 346L, 346M, 346N, 346S, 346T, 346V, 346Y, 347D, 347F, 347H, 3471, 347K, 347L, 347M, 347Q, 347R, 347S, 347T, 347V, 347 , 348F, 348H, 3481, 348K, 348R, 348S, 348T, 348V, 348 , 348Y, 349A, 349F, 349G, 3491, 349K, 349M, 349N, 349R, 349S, 349V, 349W, 349Y, 350D, 351A, 351D, 351G, 351H, 351K, 351L, 351M, 351P, 351Q, 351R, 351T, 351V, 351W, 351Y, 352A, 352H, 352Q, 352T, 352Y, 353A, 353D, 353E, 353G, 3531, 353K, 353L, 353M, 353Q, 353V, 353 , 353Y, 355C, 355F, 3551, 355L, 355M, 355V, 355Y, 356D, 356F, 356G, 3561, 356K, 356L, 356P, 356Q, 356T, 356W, 356Y, 357A, 357H, 3571, 357K, 357L, 357N, 357Q, 357R, 357S, 357T, 357V, 357W, 357Y, 358C, 358D, 358F, 358G, 358H, 3581, 358K, 358L, 358M, 358Q, 358R, 358S, 358T, 358V, 358Y, 359D, 359E, 359H, 359L, 359M, 359P, 359Q, 359R, 359T, 359V, 359W, 360F, 360P, 360T, 361C, 361L, 361M, 361N, 361Q, 361S, 361T, 361V, 362A, 362C, 3621, 362L, 362V, 362Y, 363D, 363G, 363H, 363Q, 363R, 363S, 363V, 363 , 363Y, 364A, 364C, 364G, 3641, 364L, 364M, 364Q, 364S, 364T, 364V, 365C, 3651, 365K, 365L, 365N, 365R, 365S, 365V, 366A, 366K, 367L, 367M, 367N, 367R, 367S, 367T, 367W, 367Y, 368G, 3681, 368K, 368L, 368R, 368T, 368V, 368W, 369C, 369D, 369E, 369F, 369G, 3691, 369K, 369L, 369N, 369Q, 369S, 369T, 369V, 369Y, 371A, 371C, 371F, 3711, 371L, 371M, 371N, 371S, 371T, 371Y, 372A, 372C, 3721, 372L, 372N, 372S, 372T, 373A, 373C, 373F, 3731, 373M, 373T, 373V, 374C, 374G, 3741, 374M, 374S, 374T, 374V, 375A, 375C, 375D, 375F, 375H, 375L, 375M, 375Q, 375S, 375T, 375Y, 376G, 3761 , 376S, 376T, 376V, 377F, 377H, 377L, 377T, 377W, 377Y, 378C, 378E, 378F, 378G, 378H, 3781, 378K, 378L, 378M, 378N, 378Q, 378R, 378T, 378V, 378 , 378Y, 379A, 379G, 379H, 3791, 379 , 379L, 379Q, 379T, 379Y, 380C, 380E, 380F, 380G, 380H, 380L, 380M, 380N, 380P, 380Q, 380R, 380T, 380V, 380W, 380Y, 381G, 3811, 381Q, 381R, 381S, 381T, 381W, 381Y, 382A, 382C, 382F, 3821, 382K, 382Q, 382R, 382T, 382 , 382Y, 383A, 383F, 383L, 383P, 383Q, 383V, 384A, 384G, 384H, 3841, 384K, 384P, 384Q, 384V, 384 , 385C, 385F, 385H, 3851, 385K, 385L, 385N, 385P, 385Q, 385R, 385S, 385V, 385W, 385Y, 386D, 386F, 386G, 386H, 386L, 386N, 386R, 386S, 386T, 386V, 386W, 386Y, 3871, 387L, 388A, 388C, 388G, 388H, 388L, 388P, 388S, 388T, 388W, 388Y, 389C, 389F, 3891, 389M, 389Q, 389V, 390F, 3901, 390K, 390L, 390N, 390R, 390S, 390T, 390V, 390W, 390Y, 391F, 391K, 391N, 391P, 391R, 391T, 391W, 391Y, 392A, 392C, 392D, 392E, 392F, 392H, 392K, 392L, 392N, 392Q, 392R, 392S, 392V, 392Y, 393A, 393C, 393D, 393F, 393G, 393H, 3931, 393L, 393Q, 393S, 393T, 393V, 393W, 393Y, 394A, 394C, 394F, 394H, 3941, 394K, 394L, 394Q, 394V, 394W, 395F, 395G, 395H, 395K, 395L, 395Q, 395R, 395S, 395T, 395V, 395W, 395Y, 396C, 396D, 396S, 397C, 397D, 397F, 397G, 397H, 3971, 397L, 397P, 397S, 397T, 397V, 397 , 398C, 398G, 398N, 398S, 398T, 398V, 399C, 399F, 3991, 399K, 399L, 399R, 399S, 399T, 399V, 399W, 399Y, 400C, 400D, 400E, 400F, 400G, 400H, 4001, 400K, 400L, 400M, 400Q, 400R, 400S, 400T, 400V, 400W, 400Y, 401A, 401C, 401D, 401E, 401F, 4011, 401K 401L, 401M, 401N, 401Q, 401R, 401S, 401T, 401V, 401 , 401Y 402A, 402C, 402D, 402E, 402F, 402G, 402H, 4021, 402 , 402L 402M, 402N, 402P, 402Q, 402R, 402T, 402V, 402 , 402Y 403A 403C, 403H, 4031, 403M, 403V, 403W, 403Y, 404F, 404H 404M 404R, 404T, 404V, 404W, 404Y, 405G, 405Q, 405S, 405T 406L 406T, 407F, 407G, 407H, 4071, 407K, 407M, 407Q, 407R 407S 407T, 407V, 407W, 407Y, 408D, 408E, 408F, 408N, 408V 409C 409F, 4091, 409L, 409R, 409T, 409V, 409W, 409Y, 410V 411E 411F, 411M, 411Q, 411R, 411S, 411Y, 412N, 412T, 413C 413F 413G, 4131, 413L, 413P, 413R, 413S, 413V, 413W 413Y 414H 414L, 414N, 414Q, 414T, 414V, 414W, 415D, 415E 415G 4151 , 415R, 415V, 415W, 416F, 416L, 416Q, 416Y, 417A 417C , 417D , 417F, 417G, 417H, 4171, 417K, 417M, 417N, 417Q 418D , 418F , 418H, 4181, 418K, 418N, 418W, 418Y, 419E, 419F 419H , 4191 , 419L, 419S, 419T, 420D, 420E, 420F, 420G, 420H 4201 , 420K , 420L, 420Q, 420S, 420T, 420V, 420W, 420Y, 421C 421L , 421M , 421S, 421T, 422F, 4221, 422S, 422W, 423D, 4231 423Q , 423R , 423T, 424M, 424Q, 424R, 424V, 424Y, 425A, 4251, 425K, 425L, 425V, y 425Y.

En algunas modalidades, la sustitución cambia el residuo de aminoácido presente en la posición 153 a N, K o F, y el polipéptido variante exhibe capacidad incrementada para convertir maltosa y substratos de maltoheptaosa a glucosa comparado con el polipéptido precursor. En algunas modalidades, la sustitución cambia el residuo de aminoácido presente en la posición 153 a K, y el polipéptido variante exhibe capacidad incrementada para convertir un substrato DP7 a glucosa comparado con el polipéptido precursor.

En algunas modalidades, la sustitución se selecciona del grupo que consiste de L142F, L142G, L142Q, L142S, L142 , L142Y, A214I, A214V, S245Y, Q126F, Q126L, Q126P, Q126V, S131L y S254I, y en donde la sustitución mejora el rendimiento de licuefacción del almidón de los polipéptidos variantes comparado con el polipéptido precursor de SEQ ID NO: 1. En algunas modalidades, la sustitución se selecciona del grupo que consiste de W60L, W60M, W60N, I100F, I100M, S105M, S105W, G207A, T270A, T270E, T270L, T270N, T270V, y T279A, y en donde la sustitución mejora el rendimiento de licuefacción del almidón de los polipéptidos variantes comparados con el polipéptido precursor de SEQ ID NO: 2.

En algunas modalidades, la sustitución se selecciona del grupo que consiste de 052D, 052E, 0521, 052K, 052L, 052N, 052Q, 052R, 052V, 056D, 056E, 0561, 056K, 056L, 056N, 056Q, 056R, 056V, 089D, 089E, 0891, 089K, 089L, 089N, 089Q, 089R, 089V 152D 152E 1521 152K 152L 152N 152Q 152R 152V, 153D 153E 1531 153K 153L 153N 153Q 153R 153V 201D, 201E 2011 201K 201L 201N 201Q 201R 201V 251D 251E, 2511 251K 251L 251N 251Q 251R 251V 284D 284E 2841, 284K 284L 284N 284Q 284R 284V 297D 297E 2971 297K, 297L 297N 297Q 297R 297V 308D 308E 3081 308K 308L, 308N 308Q 308R 308V 321D 321E 3211 321K 321L 321N, 321Q 321R 321V 328D 328E 3281 328 328L 328N 328Q, 328R 328V 347D 347E 3471 347K 347L 347N 347Q 347R, 347V 357D 357E 3571 357K 357L 357N 357Q 357R 357V, 359D 359E 3591 359K 359L 359N 359Q 359R 359V 369D, 369E 3691 369K 369L 369N 369Q 369R 369V 385D 385E, 3851 385K 385L 385N 385Q 385R 385V 388D 388E 3881, 388K 388L 388N 388Q 388R 388V 391D 391E 3911 391K, 391L 391N 391Q 391R 391V 400D 400E 4001 400K 400L, 400N 400Q 400R 400V 416D 416E 4161 416K 416L 416N, 416Q 416R y 416V, las mutaciones que tienen valores PI >0.5 tanto para la proteína como la actividad.

En algunas modalidades, el polipéptido variante no incluye una modificación del residuo de aminoácido en una posición seleccionada del grupo que consiste de 75, 97, 101, 102, 120, 123, 133, 137, 182, 266, and 306, del polipéptido precursor. En algunas modalidades, el polipéptido variante no incluye una modificación del residuo de aminoácido en una posición seleccionada del grupo que consiste de 75 y 123, las cuales se determinan para ser completamente restrictivas para el rendimiento en el polipéptido precursor truncado. En algunas modalidades, el polipéptido variante no incluye una modificación del residuo de aminoácido en una posición seleccionada del grupo que consiste de 75, 97, 101, 102, 120, 133, 137, 182, 266 y 306, las cuales se determinan para ser completamente restrictivas para el rendimiento del polipéptido precursor de longitud completa.

En algunas modalidades, el polipéptido precursor tiene por lo menos 80% de identidad de secuencia de aminoácidos a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 o 2. En algunas modalidades, el polipéptido precursor tiene por lo menos 90% de identidad de secuencia de aminoácidos a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 o 2. En algunas modalidades, el polipéptido precursor tiene por lo menos 90% de identidad de secuencia de aminoácidos a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3. En algunas modalidades, la característica que mejora el rendimiento de la enzima se selecciona del grupo que consiste de estabilidad térmica incrementada, actividad específica incrementada y expresión de la proteína incrementada .

En algunas modalidades, la característica que mejora el rendimiento de la proteína se selecciona del grupo que consiste de estabilidad térmica incrementada, actividad específica incrementada y expresión de la proteína incrementada .

También se proporciona una composición de procesamiento de almidón que comprende un polipéptido AmyE (incluyendo una variante) y opcionalmente una glucoamilasa , una pululanasa, una ß-amilasa, una a-amilasa fúngica, una proteasa, una celulasa, una hemicelulasa, una lipasa, una cutinasa, una isoamilasa, o una combinación de las mismas. En modalidades particulares, la composición incluye un polipéptido adicional que tiene actividad de glucoamilasa.

También se proporciona una composición para hornear que comprende un polipéptido AmyE (incluyendo una variante) en una solución o en un gel . Un método para hornear comprende agregar la composición para hornear a una sustancia que se hornea, y hornear la sustancia. En un aspecto relacionado, un método para reducir la dureza del pan comprende agregar a una masa de pan una cantidad de polipéptido AmyE suficiente para reducir la dureza comparada con la cantidad de dureza observada con una masa de pan equivalente que carece de un polipéptido AmyE.

En otro aspecto, se proporciona una composición de limpieza, que comprende un polipéptido AmyE (incluyendo una variante) en una solución acuosa, y opcionalmente otra enzima, un detergente y/o un agente blanqueador. La solución de limpieza para lavar ropas, lavar platos, o limpiar otras superficies. En un método relacionado, los platos, ropa para lavar, u otras superficies se ponen en contacto con la composición de limpieza durante un tiempo suficiente para que el artículo se limpie.

En otro aspecto, se proporciona una composición desencoladora de materiales textiles, que comprende un polipéptido AmyE (incluyendo una variante) en una solución acuosa, y opcionalmente otra enzima. En un método relacionado, un material textil se pone en contacto con la composición desencoladora durante un tiempo suficiente para desencolar el material textil.

En otro aspecto, se proporcionan ácidos nucleicos que codifican variantes AmyE, vectores de expresión que comprenden estos polinucleótidos , y células hospederas que expresan variantes AmyE en todavía otro aspecto, se proporciona un ácido nucleico complementario a un ácido nucleico que codifica cualquiera de las variantes AmyE establecidas en este documento. Adicionalmente , se proporciona un ácido nucleico capaz de hibridarse con un ácido nucleico que codifica cualquiera de las variantes AmyE expuestos en este documento, o el complemento, de las mismas. En otro aspecto, se proporcionan composiciones y métodos que implican un ácido nucleico sintético que codifica cualquiera de las variantes AmyE establecidas en este documento, en donde los codones se optimizan opcionalmente para la expresión en un organismo hospedero particular .

Estos y otros aspectos y modalidades de las composiciones y métodos serán evidentes a partir de la siguiente descripción y las figuras acompañantes.

Breve Descripción de las Figuras La FIGURA 1 representa una alineación de secuencia entre la AmyE que tiene la secuencia de aminoácidos of SEQ ID NO: 1 (referida en este documento como "AmyE de longitud completa") y AmyE que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 (referida en este documento como "Amy31A"). Las diferencias en las secuencias de aminoácidos se muestran en negrita. Los residuos se numeran desde el primer aminoácido en la forma madura de las enzimas.

La FIGURA 2 representa el plásmido pME630-7, el cual comprende un polinucleótido (etiquetado "SAMY 425aa") que codifica AmyE-tr (SEQ ID NO: 2). El plásmido comprende un polinucleótido dentro del marco con el gen SAMY que codifica una secuencia de señal de -amilasa de B. licheniformis (etiquetada "pre LAT" ) .

La FIGURA 3 representa la actividad específica relativa de AmyE (SEQ ID NO: 1; "AmyE de longitud completa"), AmyE-tr (SEQ ID NO: 2; "AmyE truncada"), y la Amy31A (SEQ ID NO : 3) hacia un substrato de almidón de maíz insoluble etiquetado con Azul Brillante de Remazol (RBB) . La hidrólisis del substrato se catalizó durante 30 minutos a 50°C en pH 4.5, 5.0, o 5.6. La actividad enzimática se determinó por la absorbencia a 595 nm de la etiqueta RBB liberada.

La FIGURA 4A representa la viscosidad (µ???) de 15 g de substrato de almidón medida como una función de tiempo (minutos) en presencia de 0.7 mg de AmyE-tr (SEQ ID NO: 2) a pH de 4.5 o 5.8. La FIGURA 4B representa la viscosidad del substrato como una función de tiempo en presencia de 2.2 mg de AmyE (SEQ ID NO: 1) en pH de 4.5 o 5.8. La FIGURA 4C representa la viscosidad del substrato como una función de tiempo en presencia de 1.4 mg de Amy31A (SEQ ID NO : 3) en pH de 4.5 o 5.8. La FIGURA 4D representa la viscosidad del substrato como una función de tiempo en presencia de 4.1 mg de Amy31A en pH de 4.5 o 5.8.

La FIGURA 5A representa el análisis calorimétrico de exploración diferencial (DSC) de las funciones de capacidad de calor en exceso de AmyE (SEQ ID NO: 1; "AmyE de longitud completa") y AmyE-tr (SEQ ID NO: 2; AmyE truncada") en presencia o ausencia de Ca2+ 2 mM. La FIGURA 5B representa el análisis DSC de Amy31A (SEQ ID NO : 3) en presencia o ausencia de Ca2+ 2 mM. La FIGURA 5C representa el análisis DSC de oí-amilasa de Geobacillus stearothermophilus (AmyS) en presencia o ausencia de Ca2+ 2 mM.

La FIGURA 6 representa los resultados de la producción de glucosa de un substrato de maltosa por AmyE-tr (SEQ ID NO: 2) comparada con las variantes AmyE de posición Q153 y AmyS truncada (SEQ ID NO: 4) .

La FIGURA 7 representa los resultados de producción de glucosa de un substrato de maltoheptaosa por AmyE-tr (SEQ ID NO: 2) comparada con las variantes AmyE de posición Q153 y AmyS truncada (SEQ ID NO: 4) .

La FIGURA 8 representa los productos de descomposición detectados por el HPLC después de una incubación de 0 horas (panel superior) y 72 horas (panel de fondo) de la AmyE-tr con maltoheptaosa (DP7) .

La FIGURA 9 representa los productos de descomposición detectados por la HPLC después de una incubación de 0 horas, 2 horas, 4 horas y 24 horas (paneles desde la parte superior hasta el fondo) de AmyS con un substrato DP7.

La FIGURA 10 representa productos formados al incubar la variante AmyE-tr Q153K con maltoheptaosa (DP7) . Los rastros de la HPLC mostrados desde la parte superior al fondo corresponden al tiempo de 0 horas, 1 horas, 2 horas, 3 horas y 24 horas.

La FIGURA 11 muestra la formación de etanol por la AmyE truncada y la amilasa Spezyme XtraR en fermentación convencional en pH 4.3 y 5.8.

La FIGURA 12 muestra la hidrólisis de almidón granular insoluble (no cocido) en etanol por la AmyE de longitud completa (FL) y truncada (tr) comparada con AkAA sola o Stargen 002 en pH 4.3 y pH 5.8.

La FIGURA 13 muestra la formación de glucosa por la AmyE de B. subtilis de longitud completa, AmyE truncada y Amy 31A en comparación con AmyS en pH 4.5 y 5.6.

La FIGURA 14 muestra los resultados de la incubación de la AmyE de longitud completa con almidón crudo (harina de maíz) y la detección de oligosacáridos producidos a través del tiempo (0, 30, 90 minutos) por la detección de HPLC .

La FIGURA 15 muestra los valores de viscosidad pico y finales obtenidos en un ensayo de hidrólisis de almidón usando polipéptidos AmyE.

La FIGURA 16 muestra los resultados de un ensayo de envejecimiento del pan usando un polipéptido AmyE.

Breve Descripción de las Secuencias Las siguientes secuencias son referidas en la solicitud: La SEQ ID NO: 1: secuencias de aminoácidos AmyE de Bacillus subtilis de longitud completa. La secuencia de señal nativa no se muestra. 1 LTAPSIKSGT ILHAWNWSFN TLKHNMKDIH DAGYTAIQTS PINQVKEGNQ 51 GDKSMSNWYW LYQPTSYQIG NRYLGTEQEF KEMCAAAEEY GIKVIVDAVI 101 NHTTSDYAAI SNEVKSIPNW THGNTQIKNW SDRWDVTQNS LLGLYDWNTQ 151 NTQVQSYLKR FLDRALNDGA DGFRFDAAKH lELPDDGSYG SQFWPNITNT 201 SAEFQYGEIL QDSASRDAAY ANYMDVTASN YGHSIRSALK NRNLGVSNIS 251 HYASDVSADK LVTWVESHDT YANDDEESTW MSDDDIRLGW AVIASRSGST 301 PLFFSRPEGG GNGVRFPGKS QIGDRGSALF EDQAITAVNR FHNVMAGQPE 351 ELSNPNGNNQ IFMNQRGSHG WLANAGSSS VSINTATKLP DGRYDNKAGA 401 GSFQVNDGKL TGTINARSVA VLYPDDIAKA PHVFLENYKT GVTHSFNDQL 451 TITLRADANT TKAVYQINNG PETAFKDGDQ FTIGKGDPFG KTYTIMLKGT 501 NSDGVTRTEK YSFVKRDPAS AKTIGYQNPN HWSQVNAYIY KHDGSRVIEL 551 TGSWPGKPMT KNADGIYTLT LPADTDTTNA KVIFNNGSAQ VPGQNQPGFD 601 YVLNGLYNDS GLSGSLPH SEQ ID NO: 2: secuencia de aminoácidos AmyE de Bacillus subtilis truncada (AmyE-tr) . La secuencia de señal nativa no se muestra. 1 LTAPSIKSGT ILHAWNWSFN TLKHNMKDIH DAGYTAIQTS PINQVKEGNQ 51 GDKSMSNWYW LYQPTSYQIG NRYLGTEQEF KEMCAAAEEY GIKVIVDAVI 101 NHTTSDYAAI SNEVKSIPNW THGNTQIKNW SDRWDVTQNS LLGLYDWNTQ 151 NTQVQSYLKR FLDRALNDGA DGFRFDAAKH IELPDDGSYG SQFWPNITNT 201 SAEFQYGEIL QDSASRDAAY ANYMDVTASN YGHSIRSALK NRNLGVSNIS 251 HYASDVSADK LVTWVESHDT YANDDEESTW MSDDDIRLG AVIASRSGST 301 PLFFSRPEGG GNGVRFPGKS QIGDRGSALF EDQAITAVNR FHNVMAGQPE 351 ELSNPNGNNQ IFMNQRGSHG WLANAGSSS VSINTATKLP DGRYDNKAGA 401 GSFQVNDGKL TGTINARSVA VLYPD SEQ ID NO: 3: secuencia de aminoácidos de variante Amy31A de a-amilasa de Bacillus subtilis (UniProtKB/TrEMBL Acceso No. 082953) . La secuencia de señal nativa se muestra en negritas. 1 MFEKRFKTSL LPLFAGFLLL FHLVLSGPAA ANAETANKSN KVTASSVKNG 51 TILHAWNWSF NTLTQNMKDI RDAGYAAIQT SPINQVKEGN QGDKSMSNWY 101 LYQPTSYQI GNRYLGTEQE FKDMCAAAEK YGVKVIVDAV VNHTTSDYGA 151 ISDEIKRIPN WTHGNTQIK WSDRWDITQN ALLGLYDW T QNTEVQAYLK 201 GFLERALNDG ADGFRYDAAK HIELPDDGNY GSQFWPNITN TSAEFQYGEI 251 LQDSASRDTA YANYMNVTAS NYGHSIRSAL KNRILSVSNI SHYASDVSAD 301 KLVTWVESHD TYA DDEEST MSDDDIRLG AVIGSRSGS TPLFFSRPEG 351 GGNGVRFPGK SQIGDRGSAL FKDQAITAVN QFHNEMAGQP EELSNPNG N 401 QIFMNQRGSK GWLANAGSS SVTINTSTKL PDGRYDNRAG AGSFQVANGK 451 LTGTINARSA AVLYPDDIGN APHVFLENYQ TEAVHSFNDQ LTVTLRANAK 501 TTKAVYQINN GQETAFKDGD RLTIGKEDPI GTTYNVKLTG TNGEGASRTQ 551 EYTFVKKDPS QTNIIGYQNP DH GNVNAYI YKHDGGGAIE LTGSWPGKAM 601 TKNADGIYTL TLPANADTAD AKVIFNNGSA QVPGQNHPGF DYVQNGLYNN 651 SGLNGYLPH SEQ ID NO: 4: secuencia de proteínas a-amilasa de Geobacillus stearothermophilus truncada (AmyS) (amilasa Spezyme XtraMR) . La secuencia de señal se muestra en negritas. 1 MLTFHRI IRK GWMFLLAFLL TASLFCPTGQ HAKAAAPFNG TMMQYFEWYL 51 PDDGTL TKV ANEANNLSSL GITALWLPPA YKGTSRSDVG YGVYDLYDLG 101 EFNQKGTVRT KYGTKAQYLQ AIQAAHAAGM QVYADWFDH KGGADGTEWV 151 DAVEVNPSDR NQEISGTYQI QA TKFDFPG RGNTYSSFK R YHFDGVD 201 DESRKLSRIY KFIGKAWD E VDTENGNYDY LMYADLDMDH PEWTELKNW 251 GKWYVNTTNI DGFRLDAVKH IKFSFFPD L SYVRSQTGKP LFTVGEY SY 301 DINKLHNYIT KTNGTMSLFD APLHNKFYTA SKSGGAFDMR TL TNTLMKD 351 QPTLAVTFVD NHDTEPGQAL QSWVDPWFKP LAYAFILTRQ EGYPCVFYGD 401 YYGIPQYNIP SLKSKIDPLL IARRDYAYGT QHDYLDHSDI IGWTREGVTE 451 KPGSGLAALI TDGPGGSKWM YVGKQHAGKV FYDLTGNRSD TVTINSDGWG 501 EFKV GGSVS VWVPRKTT SEQ ID NO : 5: secuencia de nucleótidos que codifica la AmyE de SEQ ID NO : 1.

CTTACAGCACCGTCGATCAAAAGCGGAACCATTCTTCATGCATGGAATTGGTCGTTCAATA CGTTAAAACACAATATGAAGGATATTCATGATGCAGGATATACAGCCATTCAGACATCTCC GATTAACCAAGTAAAGGAAGGGAATCAAGGAGATAAAAGCATGTCGAACTGGTACTGGCTG TATCAGCCGACATCGTATCAAATTGGCAACCGTTACTTAGGTACTGAACAAGAATTTAAAG AAATGTGTGCAGCCGCTGAAGAATATGGCATAAAGGTCATTGTTGACGCGGTCATCAATCA TACCACCAGTGATTATGCCGCGATTTCCAATGAGGTTAAGAGTATTCCAAACTGGACACAT GGAAACACACAAATTAAAAACTGGTCTGATCGATGGGATGTCACGCAGAATTCATTGCTCG GGCTGTATGACTGGAATACACAAAATACACAAGTACAGTCCTATCTGAAACGGTTCTTAGA CAGGGCATTGAATGACGGGGCAGACGGTTTTCGATTTGATGCCGCCAAACATATAGAGCTT CCAGATGATGGCAGTTACGGCAGTCAATTTTGGCCGAATATCACAAATACATCAGCAGAGT TCCAATACGGAGAAATCCTTCAGGATAGTGCCTCCAGAGATGCTGCATATGCGAATTATAT GGATGTGACAGCGTCTAACTATGGGCATTCCATAAGGTCCGCTTTAAAGAATCGTAATCTG GGCGTGTCGAATATCTCCCACTATGCATCTGATGTGTCTGCGGACAAGCTAGTGACATGGG TAGAGTCGCATGATACGTATGCCAATGATGATGAAGAGTCGACATGGATGAGCGATGATGA TATCCGTTTAGGCTGGGCGGTGATAGCTTCTCGTTCAGGCAGTACGCCTCTTTTCTTTTCC AGACCTGAGGGAGGCGGAAATGGTGTGAGGTTCCCGGGGAAAAGCCAAATAGGCGATCGCG GGAGTGCTTTATTTGAAGATCAGGCTATCACTGCGGTCAATAGATTTCACAATGTGATGGC TGGACAGCCTGAGGAACTCTCGAACCCGAATGGAAACAACCAGATATTTATGAATCAGCGC GGCTCACATGGCGTTGTGCTGGCAAATGCAGGTTCATCCTCTGTCTCTATCAATACGGCAA CAAAATTGCCTGATGGCAGGTATGACAATAAAGCTGGAGCGGGTTCATTTCAAGTGAACGA TGGTAAACTGACAGGCACGATCAATGCCAGGTCTGTAGCTGTGCTTTATCCTGATGATATT GCAAAAGCGCCTCATGTTTTCCTTGAGAATTACAAAACAGGTGTAACACATTCTTTCAATG ATCAACTGACGATTACCTTGCGTGCAGATGCGAATACAACAAAAGCCGTTTATCAAATCAA TAATGGACCAGAGACGGCGTTTAAGGATGGAGATCAATTCACAATCGGAAAAGGAGATCCA TTTGGCAAAACATACACCATCATGTTAAAAGGAACGAACAGTGATGGTGTAACGAGGACCG AGAAATACAGTTTTGTTAAAAGAGATCCAGCGTCGGCCAAAACCATCGGCTATCAAAATCC GAATCATTGGAGCCAGGTAAATGCTTATATCTATAAACATGATGGGAGCCGAGTAATTGAA TTGACCGGATCTTGGCCTGGAAAACCAATGACTAAAAATGCAGACGGAATTTACACGCTGA CGCTGCCTGCGGACACGGATACAACCAACGCAAAAGTGATTTTTAATAATGGCAGCGCCCA AGTGCCCGGTCAGAATCAGCCTGGCTTTGATTACGTGCTAAATGGTTTATATAATGACTCG GGCTTAAGCGGTTCTCTTCCCCAT SEQ ID NO: 6: Secuencia de nucleótidos que codifica la AmyE-tr (SEQ ID NO: 2) .

CTTACAGCACCGTCGATCAAAAGCGGAACCATTCTTCATGCATGGAATTGGTCGTTCAATA CGTTAAAACACAATATGAAGGATATTCATGATGCAGGATATACAGCCATTCAGACATCTCC GATTAACCAAGTAAAGGAAGGGAATCAAGGAGATAAAAGCATGTCGAACTGGTACTGGCTG TATCAGCCGACATCGTATCAAATTGGCAACCGTTACTTAGGTACTGAACAAGAATTTAAAG AAATGTGTGCAGCCGCTGAAGAATATGGCATAAAGGTCATTGTTGACGCGGTCATCAATCA TACCACCAGTGATTATGCCGCGATTTCCAATGAGGTTAAGAGTATTCCAAACTGGACACAT GGAAACACACAAATTAAAAACTGGTCTGATCGATGGGATGTCACGCAGAATTCATTGCTCG GGCTGTATGACTGGAATACACAAAATACACAAGTACAGTCCTATCTGAAACGGTTCTTAGA CAGGGCATTGAATGACGGGGCAGACGGTTTTCGATTTGATGCCGCCAAACATATAGAGCTT CCAGATGATGGCAGTTACGGCAGTCAATTTTGGCCGAATATCACAAATACATCAGCAGAGT TCCAATACGGAGAAATCCTTCAGGATAGTGCCTCCAGAGATGCTGCATATGCGAATTATAT GGATGTGACAGCGTCTAACTATGGGCATTCCATAAGGTCCGCTTTAAAGAATCGTAATCTG GGCGTGTCGAATATCTCCCACTATGCATCTGATGTGTCTGCGGACAAGCTAGTGACATGGG TAGAGTCGCATGATACGTATGCCAATGATGATGAAGAGTCGACATGGATGAGCGATGATGA TATCCGTTTAGGCTGGGCGGTGATAGCTTCTCGTTCAGGCAGTACGCCTCTTTTCTTTTCC AGACCTGAGGGAGGCGGAAATGGTGTGAGGTTCCCGGGGAAAAGCCAAATAGGCGATCGCG GGAGTGCTTTATTTGAAGATCAGGCTATCACTGCGGTCAATAGATTTCACAATGTGATGGC TGGACAGCCTGAGGAACTCTCGAACCCGAATGGAAACAACCAGATATTTATGAATCAGCGC GGCTCACATGGCGTTGTGCTGGCAAATGCAGGTTCATCCTCTGTCTCTATCAATACGGCAA CAAAATTGCCTGATGGCAGGTATGACAATAAAGCTGGAGCGGGTTCATTTCAAGTGAACGA TGGTAAACTGACAGGCACGATCAATGCCAGGTCTGTAGCTGTGCTTTATCCTGAT SEQ ID NO: 7: Secuencia de nucleótidos que codifica la Amy31A de B . subtilis (SEQ ID NO: 3) .

TCTGTTAAAAACGGCACTATTCTGCATGCATGGAACTGGAGCTTTAACACGCTGACCCAGA ACATGAAAGATATTCGTGACGCGGGCTATGCTGCGATCCAAACCAGCCCTATCAACCAGGT CAAAGAAGGCAACCAAGGCGACAAATCCATGTCCAACTGGTACTGGCTGTATCAACCGACG TCCTATCAGATTGGCAACCGTTATCTGGGCACGGAGCAAGAGTTCAAAGACATGTGTGCTG CGGCTGAGAAATATGGTGTGAAAGTTATCGTGGACGCTGTGGTAAACCACACGACCTCTGA TTATGGTGCTATTAGCGACGAGATTAAACGTATTCCAAATTGGACCCATGGTAATACCCAG ATCAAAAATTGGAGCGACCGCTGGGACATTACCCAGAATGCGCTGCTGGGTCTGTATGACT GGAACACGCAAAACACCGAAGTACAGGCATATCTGAAGGGCTTCCTGGAACGCGCTCTGAA CGATGGTGCTGATGGTTTTCGCTACGACGCCGCAAAGCATATTGAGCTGCCGGATGACGGC AACTACGGTTCCCAATTCTGGCCGAACATCACCAACACCTCTGCCGAATTCCAGTACGGCG AGATCCTGCAAGACTCCGCGAGCCGTGACACCGCTTATGCCAACTATATGAACGTAACTGC CTCTAACTATGGCCATTCCATTCGTTCTGCGCTGAAAAATCGTATCCTGTCCGTGTCCAAT ATCTCCCACTATGCATCCGACGTTTCTGCTGACAAACTGGTAACTTGGGTCGAGTCTCACG ACACCTATGCAAATGATGACGAGGAGAGCACCTGGATGAGCGATGATGATATTCGTCTGGG TTGGGCGGTTATTGGTTCTCGCTCTGGTTCTACTCCGCTGTTCTTTAGCCGTCCGGAAGGT GGCGGCAATGGCGTTCGTTTCCCGGGTAAATCTCAAATTGGTGATCGTGGCTCTGCACTGT TTAAAGATCAAGCTATTACGGCGGTGAATCAGTTCCATAATGAGATGGCAGGTCAACCTGA AGAACTGTCCAATCCAAACGGTAACAACCAAATCTTCATGAACCAGCGTGGCAGCAAAGGC GTCGTCCTGGCGAACGCCGGTAGCTCTTCTGTTACCATCAACACGTCTACCAAACTGCCAG ACGGCCGCTATGATAACCGTGCGGGTGCTGGTTCCTTTCAGGTAGCCAACGGCAAGCTGAC GGGCACCATCAACGCTCGTTCTGCTGCTGTTCTGTACCCGGACGACATTGGCAACGCTCCG CACGTGTTCCTGGAGAATTACCAGACCGAAGCGGTACATAGCTTTAATGACCAGCTGACCG TCACTCTGCGTGCCAACGCAAAAACCACGAAAGCAGTCTATCAGATCAATAATGGTCAAGA AACTGCTTTCAAGGATGGCGACCGTCTGACTATTGGTAAGGAGGACCCGATTGGCACCACT TATAACGTTAAACTGACTGGCACCAATGGCGAGGGCGCTAGCCGCACTCAAGAGTATACGT TCGTAAAGAAAGACCCGTCTCAAACCAACATCATCGGTTACCAGAATCCTGACCACTGGGG TAATGTGAACGCTTACATCTATAAACATGATGGTGGCGGTGCTATCGAACTGACCGGCTCT TGGCCAGGTAAAGCCATGACGAAAAACGCGGATGGCATCTATACCCTGACCCTGCCGGCCA ATGCGGATACCGCAGATGCGAAGGTTATCTTCAATAACGGCTCCGCGCAGGTTCCGGGCCA AAACCATCCGGGCTTTGACTACGTACAAAATGGTCTGTATAACAACTCTGGCCTGAACGGT TACCTGCCGCAC SEQ ID NO : 8: Secuencia de nucleótidos que codifica la AmyS de Geobacillus stearother ophilus (SEQ ID NO: 4) .

GCCGCACCGTTTAACGGTACCATGATGCAGTATTTTGAATGGTACTTGCCGGATGATGGCA GGTTATGGACCAAAGTGGCCAATGAAGCCAACAACTTATCCAGCCTTGGCATCACCGCTCT TTGGCTGCCGCCCGCTTACAAAGGAACAAGCCGCAGCGACGTAGGGTACGGAGTATACGAC TTGTATGACCTCGGCGAATTCAATCAAAAAGGGACCGTCCGCACAAAATATGGAACAAAAG CTCAATATCTTCAAGCCATTCAAGCCGCCCACGCCGCTGGAATGCAAGTGTACGCCGATGT CGTGTTCGACCATAAAGGCGGCGCTGACGGCACGGAATGGGTGGACGCCGTCGAAGTCAAT CCGTCCGACCGCAACCAAGAAATCTCGGGCACCTATCAAATCCAAGCATGGACGAAATTTG ATTTTCCCGGGCGGGGCAACACCTACTCCAGCTTTAAGTGGCGCTGGTACCATTTTGACGG CGTTGACTGGGACGAAAGCCGAAAATTAAGCCGCATTTACAAATTCATCGGCAAAGCGTGG GATTGGGAAGTAGACACAGAAAACGGAAACTATGACTACTTAATGTATGCCGACCTTGATA TGGATCATCCCGAAGTCGTGACCGAGCTGAAAAACTGGGGGAAATGGTATGTCAACACAAC GAACATTGATGGGTTCCGGCTTGATGCCGTCAAGCATATTAAGTTCAGTTTTTTTCCTGAT TGGTTGTCGTATGTGCGTTCTCAGACTGGCAAGCCGCTATTTACCGTCGGGGAATATTGGA GCTATGACATCAACAAGTTGCACAATTACATTACGAAAACAAACGGAACGATGTCTTTGTT TGATGCCCCGTTACACAACAAATTTTATACCGCTTCCAAATCAGGGGGCGCATTTGATATG CGCACGTTAATGACCAATACTCTCATGAAAGATCAACCGACATTGGCCGTCACCTTCGTTG ATAATCATGACACCGAACCCGGCCAAGCGCTGCAGTCATGGGTCGACCCATGGTTCAAACC GTTGGCTTACGCCTTTATTCTAACTCGGCAGGAAGGATACCCGTGCGTCTTTTATGGTGAC TATTATGGCATTCCACAATATAACATTCCTTCGCTGAAAAGCAAAATCGATCCGCTCCTCA TCGCGCGCAGGGATTATGCTTACGGAACGCAACATGATTATCTTGATCACTCCGACATCAT CGGGTGGACAAGGGAAGGGGTCACTGAAAAACCAGGATCCGGGCTGGCCGCACTGATCACC GATGGGCCGGGAGGAAGCAAATGGATGTACGTTGGCAAACAACACGCTGGAAAAGTGTTCT ATGACCTTACCGGCAACCGGAGTGACACCGTCACCATCAACAGTGATGGATGGGGGGAATT CAAAGTCAATGGCGGTTCGGTTTCGGTTTGGGTTCCTAGAAAAACGACC SEQ ID NO: 9: secuencia de señal nativa de la AmyE de SEQ ID NO: 1.

MFAKRFKTSLLPLFAGFLLLFHLVLAGPAAASAETANKSNE SEQ ID NO: 10: Cebador PSTAMYE-F 5' CTTCTTGCTGCCTCATTCTGCAGCTTCAGCACTTACAGCACCGTCGATCAAAAGCGGAAC SEQ ID NO: 11: Cebador AMYENOPST-R 5' CTGGAGGCACTATCCTGAAGGATTTCTCCGTATTGGAACTCTGCTGATGTATTTGTG SEQ ID NO: 12: Cebador AMYENOPST-F 5' CACAAATACATCAGCAGAGTTCCAATACGGAGAAATCCTTCAGGATAGTGCCTCCAG SEQ ID NO: 13: Cebador HPAIAMYE-R 5' CAGGAAATCCGTCCTCTGTTAACTCAATGGGGAAGAGAACCGCTTAAGCCCGAGTC SEQ ID NO: 14: Cebador HPAIAMYE466 -R 5' CAGGAAATCCGTCCTCTGTTAACTCAATCAGGATAAAGCACAGCTACAGACCTGG SEQ ID NO: 15: Cebador AMYE SEQ-F1 5' TACACAAGTACAGTCCTATCTG SEQ ID NO: 16: Cebador AMYE SEQ-F2 5' CATCCTCTGTCTCTATCAATAC SEQ ID NO: 17: Variante BP-17 de Buttiauxiella fitasa NDTPASGYQV EKWILSRHG VRAPTKMTQT MRDVTPNTWP EWPVKLGYIT PRGEHLISLM GGFYRQKFQQ QGILSQGSCP TPNSIYVWAD VDQRTLKTGE AFLAGLAPQC GLTIHHQQNL EKADPLFHPV KAGTCSMDKT QVQQAVEKEA QTPIDNLNQH YIPFLALMNT TLNFSTSA C QKHSADKSCD LGLSMPSKLS IKDNGNKVAL DGAIGLSSTL AEIFLLEYAQ GMPQAA GNI HSEQE ASLL KLHNVQFDLM ARTPYIARHN GTPLLQAISN ALNPNATESK LPDISPDNKI LFIAGHDTNI ANIAGMLNMR WTLPGQPDNT PPGGALVFER LADKSGKQYV SVSMVYQTLE QLRSQTPLSL NQPAGSVQLK IPGCNDQTAE GYCPLSTFTR WSQSVEPGC QLQ Descripción Detallada de la Invención Las presentes composiciones y métodos se relacionan con una a-amilasa de Bacillus subtilis (AmyE) y variantes de la misma (referidas colectivamente como polipéptidos AmyE) , los cuales ofrecen ciertas ventajas comparados con otras o¡-amilasas. Por ejemplo, los polipéptidos AmyE exhiben alta actividad específica para substratos de almidón en un pH, permitiendo que los polipéptidos AmyE se usen para la licuefacción de almidón bajo condiciones que también son adecuadas para la sacarificación. Esto elimina la necesidad de ajustar el pH de una suspensión espesa de almidón entre la licuefacción y la sacarificación. Los polipéptidos AmyE también poseen actividad de glucoamilasa, que elimina o reduce la necesidad por el uso de una glucoamilasa separada para realizar la sacarificación. Además, los polipéptidos AmyE requieren poco o nada de calcio para la estabilidad térmica, eliminando la necesidad de remover subsecuentemente el calcio agregado antes de realizar la isomerización, eliminando en consecuencia por lo menos una etapa requerida para la producción de jarabe de maíz con alto contenido de fructosa.

Estas y otras características de las composiciones y métodos se describen con más detalle posteriormente . 1. Definiciones y Abreviaturas A menos que se defina de otra manera, todos los términos y abreviaturas se deben acordar con sus significados ordinarios como se entiende por una persona de experiencia ordinaria en el campo. Los siguientes términos y abreviaturas se definen para mayor claridad. 1.1. Definiciones Como se usa en este documento el término "almidón" se refiere a cualquier material comprendido de carbohidratos de polisacáridos complejos de plantas, comprendidos de amilosa y amilopectina con la fórmula (C6Hio05)x, en donde X puede ser cualquier número. En particular, el término se refiere a cualquier material basado en plantas que incluye pero no se limita a granos pastos, tubérculos y raíces y más específicamente trigo, cebada, maíz, centeno, arroz, sorgo, salvado, yuca, mijo, papa, camote y tapioca.

Como se usa en este documento el término "oligosacárido" se refiere a una molécula de carbohidrato compuesta de 3-20 monosacáridos .

Como se usa en este documento, una "amilasa" se refiere a una enzima capaz de catalizar la degradación del almidón. Generalmente, las -amilasas (EC 3.2.1.1; a-D- ( 1? ) -glucan-glucanohidrolasa) son enzimas de endoacción que escisan enlaces -D-(l?4) O-glicosídicos dentro de la molécula de almidón en una forma aleatoria. En contraste, las enzimas amilolíticas de exoacción, tales como ß-amilasas (EC 3.2.1.2; a-D- (1?4) -glucan-maltohidrolasa) , y algunas amilasas específicas de producto como a-amilasa maltogénica (EC 3.2.1.133) , escisan la molécula de almidón del extremo no reductor del substrato. Las ß-amilasas, a-glucosidasas (EC 3.2.1.20; a-D-glucósido-glucohidrolasa) , glucoamilasas (EC 3.2.1.3; a-D- (1?4) -glucan-glucohidrolasa) , y amilasas específicas de producto pueden producir malto-oligosacáridos de una longitud específica de almidón. Como se usa en este documento, las amilasas incluyen cualquiera/todas las amilasas, que incluyen glucoamilasas , a-amilasas, ß-amilasas y a-amilasas de tipo natural, tales como aquellas de Bacillus sp . , por ejemplo, B. licheniformis y B. subtilis, mientras que las -amilasas incluyen el subconjunto mencionado anteriormente de estas enzimas.

Como se usa en este documento, "variantes de a-amilasa", y frases similares, se refieren a variantes/mutantes de una a-amilasa de referencia, que incluye una sustitución, inserción y/o supresión de aminoácidos con respecto a la secuencia de aminoácidos precursora (de tipo natural; de referencia) de la a-amilasa de referencia. El término "variante" se usa intercambiablemente con el término "imitante" . La a-amilasa variante puede incluir mutaciones en la secuencia de señal con respecto a la secuencia de señal precursora. Además, la a-amilasa variante puede estar en la forma de una proteína de fusión que contiene una secuencia de señal a-amilasa heteróloga, tal como de B. licheniformis (LAT) .

Un "ácido nucleico/polinucleótido precursor" "ácido nucleico/polinucleótidos de tipo natural", o "ácido nucleico/polinucleótido de referencia" se refiere a una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido precursor y un ácido nucleico complementario del mismo.

Un "ácido nucleico/polinucleótido precursor" se refiere a una secuencia de ácidos nucleicos que codifican un polipéptido variante o un ácido nucleico complementario al mismo, o una secuencia de polinucleótidos que tiene por lo menos una sustitución, inserción o supresión base con respecto a una secuencia de polinucleótidos precursora o un ácido nucleico complementario al mismo. Donde se específica estos ácidos nucleicos pueden incluir aquellos que tienen un grado especificado de homología a una secuencia de referencia, o que son capaces de hibridarse con una secuencia de referencia, por ejemplo, bajo condiciones rigurosas [por ejemplo, 50°C y 0.2X SSC (IX SSC = NaCl 0.15 M, citrato de Na3 0.015 M, pH 7.0)] o condiciones sumamente rigurosas [por ejemplo, 65 °C y 0. IX SSC (IX SSC = NaCl 0.15 M, citrato de a3 0.015 M, pH 7.0)] . Un ácido nucleico variante se puede optimizar para reflejar el uso de un codón preferido para organismos hospederos especificados, tales como las levaduras metilotróficas (por ejemplo, Pichia, Hansenula, etcétera) u ongos filamentosos (por ejemplo, Trichoderma (por ejemplo, T. reesei) , etcétera) u otros hospederos de expresión (por ejemplo, Bacillus, Streptomyces, etcétera) .

Una "secuencia de señal" es una secuencia de aminoácidos unidos a la porción N-terminal de una proteína, que facilita la secreción de la proteína fuera de la célula. La "secuencia de señal", también se puede referir como una "secuencia líder" o una "pro-secuencia" .

Como se usa en este documento, la forma "inmadura" o "de longitud completa (FL) " de una amilasa incluye el péptido de señal. La forma inmadura puede incluir otras modificaciones postraduccionales .

Como se usa en este documento, la forma "madura" de una proteína extracelular (tal como una amilasa) carece de la secuencia de señal . La secuencia de señal se puede escindir durante el proceso de secreción. Alternativamente, un polipéptido se puede expresar en su forma madura, por ejemplo, como una proteína intracelular, o sintetizada en su forma madura .

Como se usa en este documento, una forma "truncada" de AmyE (es decir, "AmyE-tr") se refiere una polipéptido AmyE con una supresión de todo o parte del dominio de enlace al almidón C-terminal. En la AmyE-tr de SEQ ID NO: 2, por ejemplo, la AmyE de SEQ ID NO: 1 están truncado en el residuo D425. Una estructura de cristal de 2.5 Á de resolución de este AmyE-tr está disponible en Protein Databank No. de acceso 1BAG, el cual se da a conocer por Fujimoto y colaboradores, "Crystal structure of a catalytic-site mutant alpha-amilasa from B. subtilis complexed with maltopentaose" , J. Mol. Biol. 277: 393-407 (1998). Lal AmyE-tr se puede truncar en otras posiciones, por ejemplo, Y423, P424, D426 o 1427 de la AmyE de SEQ ID NO: 1, con la condición de que todo o parte del dominio de enlace al almidón C- terminal se remueva .

El término "recombinante", cuando se usa en referencia con una célula, ácido nucleico, proteína o vector de un sujeto, indica que el sujeto se ha modificado por la introducción de un ácido nucleico o proteína heteróloga o la alteración de un ácido nucleico o proteína nativa, o que la célula se deriva de una célula nativa, o que la célula se deriva de una célula modificada de esta manera. De este modo, por ejemplo, las células recombinantes expresan genes que no se encuentran dentro de la forma nativa (no recombinante) de la célula o expresan genes nativos que de otra manera se expresan anormalmente, bajo expresados o no expresado en lo absoluto .

Los términos "recuperado" , "aislado" y "separado" , se refiere a un compuesto, proteína, célula, ácido nucleico o aminoácido que se remueve de por lo menos un componente con el cual se asocia naturalmente y se encuentra en la naturaleza .

Como se usa en este documento, el término "purificado" se refiere a un material (por ejemplo, un polipéptido o polinucleótido aislado) que está en un estado relativamente puro, por ejemplo, por lo menos aproximadamente 90% puro, por lo menos aproximadamente 95% puro, por lo menos aproximadamente 98% puro, o aún por lo menos aproximadamente 99% puro.

Los términos "termostable" y "termoestabilidad" se refiere a la capacidad de una enzima de retener la actividad después de la exposición a una temperatura elevada. La termoestabilidad de una enzima, tal como unas enzimas de alfa-amilasas , se mide por su vida media (ti/2) proporcionada en minutos, horas, o días, durante lo cual la mitad de la actividad enzimática se pierde bajo condiciones definidas. La vida media se puede calcular al medir la actividad de la OÍ-amilasa residual después de la exposición a (es decir, estimulación por) una temperatura elevada.

Un "intervalo de pH" se refiere al intervalo de valores de pH bajo los cuales una enzima recibe actividad catalítica.

Como se usa en este documento, los términos "pH estable" y "estabilidad de pH" se relacionan con la capacidad de una enzima para retener la actividad sobre un amplio intervalo de valores de pH durante un período de tiempo predeterminado (por ejemplo, 15 minutos, 30 minutos, 1 hora, y los similares) .

Como se usa en este documento, el término "secuencia de aminoácidos" es sinónimo con los términos "polipéptido" , "proteína" y "péptido" , y se usan intercambiablemente. Donde esta secuencia de aminoácidos exhibe actividad, se puede referir como una "enzima" . El código de una letra o tres letras convencional para los residuos de aminoácidos se usa en este documento.

El término "ácido nucleico" abarca ADN, A , heteroduplexos , y moléculas sintéticas capaces de codificar un polipéptido. Los ácidos nucleicos pueden ser hebra individual o doble hebra, y pueden ser modificaciones químicas. Los términos "ácido nucleico" y "poliríucleótido" se usan intercambiablemente. Debido a que el código genético se degenera, más de un codón se puede usar para codificar un aminoácido particular y las presentes composiciones y métodos abarcan secuencias de nucleótidos que codifican una secuencia de aminoácidos particular, y las presentes composiciones y métodos abarcan secuencias de nucleótidos que codifican una secuencia de aminoácidos particular. A menos que se indique de otra manera, los ácidos nucleicos se escriben de izquierda a derecha en la orientación 5' a 3'; las secuencias de aminoácidos se escriben de izquierda a derecha en la orientación amino a carboxi, respectivamente.

El término "homólogo" se refiere a una secuencia de aminoácidos o nucleótidos que tienen un cierto grado de identidad a secuencias de aminoácidos o nucleótidos de referencia, o a otra característica estructural o funcional común especificada. Una secuencia homologa se toma para incluir una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o aún 99% idéntica a la secuencia sujeto, que usa herramientas de alineación de secuencia convencionales (por ejemplo, Clustal, BLAST, y las similares) . Típicamente, los homólogos incluirán los mismos residuos de sitio activo como la secuencia de aminoácidos sujeto a menos que se especifique de otra manera.

Como se usa en este documento, "hibridación" se refiere al proceso por el cual una hebra de base de ácido nucleico se parea con una hebra complementaria, como ocurre durante las técnicas de hibridación de tinción y técnicas PCR, Como se usa en este documento, una "secuencia degenerada" en un ácido nucleico contiene uno en el cual una pluralidad de secuencias de nucleótidos que codifica el mismo codón, es decir, debido a la degeneración del código genético. Las secuencias degeneradas se pueden seleccionar ara la expresión óptima de un polipéptido codificado en un organismo hospedero particular, por ejemplo, como una consecuencia de las preferencias de codón.

Como se usa en este documento, una molécula "sintética" se produce mediante, síntesis química o enzimática in vitro antes que por un organismo.

Como se usa en este documento, los términos "transformada" "establemente transformada" y "transgénica" , usados con referencia a una célula proponen que la célula tenga una secuencia de ácidos nucleicos no nativa (por ejemplo, heteróloga) integrada dentro de su genoma o llevada como un plásmido episomal que se mantiene a través de múltiples generaciones.

El término "introducida" en el contexto de insertar una secuencia de ácidos nucleicos dentro de una célula, propone "transfección" , "transformación" o "transducción" , como se conoce en el campo.

Una "cepa hospedera" o "célula hospedera" es un organismo dentro del cual un vector de expresión, fago, virus, u otro constructo de ADN que incluye un polinucleótido que codifica un polipéptido de interés (por ejemplo, una o¡-amilasa variante se ha introducido) . Cepas hospederas ejemplares son células bacterianas. El término "célula hospedera" incluye protoplastos creados de células, tales como aquellos de una Bacillus sp.

El término "heterólogo" con referencia a un polinucleótido o proteína se refiere a un polinucleótido o proteína que no ocurre naturalmente en una célula hospedera.

El término "endógeno" con referencia a un polinucleótido o proteína se refiere a un polinucleótido o proteína que ocurre naturalmente en la célula hospedera.

Como se usa en este documento el término "expresión" se refiere a un proceso por el cual un polipéptido se produce con base en la secuencia de ácidos nucleicos de un gen. El proceso incluye tanto trascripción como traducción.

Un "marcador selectivo" o "marcador seleccionable" se refiere a un gen capaz de ser expresado en un hospedero para facilitar la selección de células hospederas que llevan el gen. Ejemplos de marcadores seleccionables que incluyen pero no se limitan a antimicrobianos (por ejemplo, higromicina, bleomicina, o neomicina) y/o genes que confieren una ventaja metabólica, tal como una ventaja nutricional sobre la célula hospedera .

"Cultivo" se refiere al crecimiento de una población de células microbianas bajo condiciones adecuadas en un medio líquido o sólido. El cultivo incluye conversión fermentativa de un sustrato de almidón que contiene almidón granular a un producto final (típicamente en un recipiente reactor) .

"Fermentación" es la descomposición enzimática de sustancias orgánicas por microorganismos para producir compuestos orgánicos más simples. Mientras la fermentación ocurre generalmente bajo condiciones anaeróbicas no se propone que el término se limite solamente a condiciones anaeróbicas estrictas, ya que la fermentación también ocurre en la presencia de oxígeno.

Un "gen" se refiere a un segmento de ADN que se implica en la producción de un polipéptido, e incluye regiones de codificación, regiones que preceden y siguen las regiones de codificación y, secuencias de intervención (Intrones) entre segmentos de codificación individuales (exones) .

Un "vector" se refiere a una secuencia de polinucleótidos diseñada para producir ácidos nucleicos dentro de uno o más tipos de células. Los vectores incluyen vectores de clonación, vectores de expresión, vectores lanzadera, plásmidos, partículas en fago, casetes y los similares .

Un "vector de expresión" se refiere a un constructo de ADN que comprende una secuencia de ADN que codifica un polipéptido de interés, el cual se enlaza operablemente a una secuencia de control adecuada capaz de efectuar la expresión del ADN en un hospedero adecuado. Estas secuencias de control pueden incluir un promotor para efectuar la trascripción, una secuencia operadora opcional para controlar la trascripción, una secuencia que codifica sitios de enlace de ribosoma adecuados sobre el ARNm, con potenciadores y secuencias que controlan la terminación de la trascripción y traducción.

Un "promotor" es una secuencia reguladora que se implica en el enlace de la ARN polimerasa para realizar la trascripción de un gen. El promotor puede ser un promotor inducible o un promotor constitutivo. Un promotor ejemplar en el promotor a-amilasa de Bacillus licheniformis (AmyL) .

El término "operablemente enlazado" propone que los componentes especificados estén en una relación (que incluyen pero no se limita a yuxtaposición) que les permite funcionar de una manera propuesta. Por ejemplo, una secuencia reguladora se enlaza operablemente a una secuencia de codificación tal que la expresión de la secuencia de codificación está bajo el control de las secuencias reguladoras .

El término "bajo control transcripcional" propone que la trascripción de una secuencia de polinucleótidos , usualmente una secuencia de ADN, dependa de ser enlazado operablemente a un elemento lo cual contribuye a la iniciación de, o promueve la trascripción.

El término "bajo control traduccional" propone que la traducción de una secuencia de polinucleótidos, una secuencia de ARN, dentro de un polipéptido dependa de ser enlazado operablemente a un elemento lo cual contribuye a la iniciación de, o promueve la traducción.

Como se usa en este documento, "biológicamente activa" se refiere a una secuencia que tiene una actividad biológica especificada, tal como una actividad enzimática. En el caso de las presentes amilasas, la actividad es una actividad de oí-amilasa.

"Dureza del agua" es una medición de los minerales (por ejemplo, casi magnesio) presentes en el agua.

"Gelatinización" se refiere a la solubilización de una molécula de almidón mediante cocción para formar una suspensión viscosa.

Como se usa en este documento, el término "licuefacción" o "licuar" propone un proceso por el cual el almidón se convierte a dextrinas de peso molecular más bajo (es decir, más cortas) , las cuales son generalmente más solubles y menos viscosas que el material de almidón de partida. Este proceso implica la gelatinización de almidón simultáneamente con, o seguido con, la visión de AmyE o una variante del mismo.

Como se usa en este documento el término "licuefacción primaria" se refiere a una etapa de licuefacción cuando la temperatura de la suspensión espesa se eleva a o se acerca a su temperatura de gelatinización. Subsecuente a la elevación de la temperatura, la suspensión espesa se envía a través de un intercambiador de calor o chorro a temperaturas de aproximadamente 90-150°C, por ejemplo 100-110°C (200-300°F, por ejemplo, 220-235°F) . Subsecuente a la aplicación a una temperatura de intercambio de calor o chorro, la suspensión espesa se mantiene durante un período de 3-10 minutos en esa temperatura. Esa etapa de mantener la suspensión espesa a 90-150°C (200-300°F) es llamada licuefacción primaria.

Como se usa en este documento, el término "licuefacción secundaria" se refiere a la etapa de licuefacción subsecuente a la licuefacción primaria (calentar a 90-150°C (200-300°F) ) , cuando la suspensión espesa se deja enfriar a temperatura ambiente. Esta etapa de enfriamiento puede ser de 30 minutos a 180 minutos, por ejemplo 90 minutos a 120 minutos.

Como se usa en este documento, el término "minutos de licuefacción secundaria" se refiere al tiempo que ha transcurrido desde el inicio de la licuefacción secundaria, hasta que el tiempo en que el DE se mide.

"Sacarificación" se refiere generalmente a la conversión enzimática de maltodextranos formados después de la licuefacción a glucosa.

El término "grado de polimerización (DP) " se refiere al número (n) de unidades de anhidroglucopiranosa en un sacárido proporcionado. Ejemplos de DPI son los monosacáridos , tal como glucosa y fructosa. Ejemplos de DP2 son los disacáridos, tal como maltosa y sacarosa. Un DP>3 indica polímeros con un grado de polimerización de mayor que 3.

Con respecto a la conversión de almidón, los términos "producto final" o "producto final deseado" se refiere a moléculas derivadas de fuente de carbono especificadas, las cuales se convierten enzimáticamente de un sustrato de almidón .

Como se usa en este documento, el término "contenido de sólidos secos (ds)" se refiere a los sólidos totales en una suspensión expresa, expresado en % en peso seco.

El término "suspensión espesa" se refiere a una mezcla acuosa que contiene sólidos insolubles.

El término "almidón residual" se refiere al almidón restante (soluble e insoluble) en una composición después de la fermentación o hidrólisis enzimática de un sustrato que contiene almidón.

Como se usa en este documento "una etapa de reciclado" se refiere a reciclado de componentes en forma de masa, los cuales pueden incluir almidón residual, enzimas y/o microorganismos para fermentar sustratos que comprenden almidón .

El término "masa" se refiere a una mezcla acuosa que incluye una fuente de carbono fermentable (por ejemplo, carbohidratos) , los cuales se pueden usar para producir un producto fermentado, tal como un alcohol. Los términos "cerveza" y "masa" se usan intercambiablemente.

El término "vinaza" se refiere a una mezcla de sólidos no fermentados y agua, los cual representa el residuo después de la remoción de alcohol de una masa fermentada.

Los términos "destiladoras de granos secos (DDG) " y "destiladoras de granos secos con solubles (DDGS) " se refieren a un subproducto útil de la fermentación de granos.

Como se usa en este documento "microorganismo etanologénico" se refiere a un microorganismo con la capacidad de convertir una azúcar u oligosacárido a etanol . Los microorganismos etanologénicos son etanologénicos en virtud de su capacidad de expresar una o más enzimas que convierten individualmente o juntas el azúcar a etanol.

Como se usa en este documento el término "productor de etanol" o microorganismos que produce etanol" se refiere a cualquier organismo o célula que sea capaz de producir etanol de una hexosa o pentosa. Generalmente, las células productoras de etanol contienen un alcohol deshidrogenasa y una piruvato de carboxilasa. Ejemplos de microorganismos productores de etanol incluyen microorganismos fúngicos tal como levadura. Una levadura preferida incluye sepas de Sacchromyces, particularmente, S. cerevisiaes .

Con respecto a las enzimas de amilasa y sus sustratos, el término "que contiene" se refiere a la colocación de la enzima en proximidad suficientemente cercana al sustrato para permitir que la enzima la convierta en sustrato a un producto final. El contacto puede incluir mezclado.

El término "derivado de" "propone" "originado de" , "con base en", "obtenido de ", "obtenible de", o "aislado de", dependiente del contexto.

El término "conversión enzimática" se refiere generalmente a la modificación de un sustrato (por ejemplo, almidón) por la acción de enzimas (por ejemplo, amilasa) .

Como se . usa en este documento, el término "desintegración" se refiere a la hidrólisis de polisacáridos en una matriz de biopelícula que conecta y enlaza conjuntamente células microbianas individuales en la biopelícula, mediante lo cual las células microbianas se pueden liberar y remover de la biopelícula.

Una "muestra" es una pieza de material, tal como una tela, a la cual una mancha se puede aplicar para evaluar la eficiencia de limpieza de una composición.

Como se usa en este documento el término "actividad específica" se refiere al número de moles del sustrato convertido a producto por una preparación de enzimas por tiempo unitario bajo condiciones específicas. Actividad específica se expresa como unidades (U)/mg de proteínas.

Como . se usa en este documento, el término "biológicamente activo" se refiere a una molécula que exhibe una función biológica preseleccionada .

El término "producción" se refiere a la cantidad de producto final producido mediante un proceso, Por ejemplo, expresado en concentración, volumen, cantidad, o un porcentaje de material de partida.

"ATCC" se refiere a Recolección de Cultivo de Tipo Americano localizada en Manassas, Va. 20108 (ATCC) .

Como se usa en este documento, un "agente de precipitación" para propósitos de purificación, se refiere a un compuesto efectivo para precipitar un polipéptido, tal como AmyE o una variante del mismo, de la solución. La forma de precipitado puede ser, por ejemplo, cristalina, amorfa, o una mezcla de la misma.

"NRRL" se refiere a la Colección del Cultivo de Servicios de Investigación Agrícola, Centro Nacional para la Investigación de Utilización Agrícola (y previamente conocida como USDA Northern Regional Research Laboratory), Peoría, IL.

Como se usa en este documento, una "muestra" es una pieza de material, tal como una tela,, a la cual se le puede aplicar una tintura, o la cual tiene una tintura aplicada. El material puede ser, por ejemplo, telas hechas de algodón, poliéster o mezclas de fibras naturales y sintéticas. Alternativamente, el material puede ser papel, tal como un papel de filtro o nitrocelulosa, o una pieza de un material duro, tal como cerámica, metal, o vidrio. Tinturas ejemplares incluyen sangre, leche, tinta, pasto, te, vino, espinacas, caldo, chocolate, huevo, queso, arcilla, pigmento, aceite, o combinaciones de los mismos.

Como se usa en este documento, una "muestra más pequeña" es una pieza de la muestra que se ha cortado con un dispositivo perforador de un solo orificio, o un dispositivo por perforador de 96 orificios manufacturado a la medida, o equivalente, donde el patrón de perforador de múltiples orificios se iguala a las placas de micro título de 96 pocilios estándar, o de otra manera se ha removido de la muestra. La muestra puede ser de material textil, papel, metal, u otro material adecuado. La muestra más pequeña puede tener la mancha fija ya sea antes o después de que se coloca dentro del pocilio de una placa de micro título de 24, 48, o 96 pocilios.

Como se usa en este documento, el término "alimentos" abarca tanto alimentos preparados como ingredientes para un alimento, tal como harina, los cuales son capaces de proporcionar un beneficio a un preparador de alimentos de consumo. Los ingredientes alimenticios incluyen formulaciones que se pueden agregar a un alimento o producto alimenticio para los propósitos de, por ejemplo, acidificación o emulsificación . El ingrediente alimenticio puede estar en la forma de una solución o un sólido, dependiendo de uso y/o el modo de aplicación y/o el modo de administración.

Como se usa en este documento, el término "harina" se refiere a granos de cereal triturados o molidos por Sago o productos de tubérculos que se han molido o machacado. En algunas modalidades, la harina también puede contener componentes además de cereal molido o machacado o material vegetal, tal como un agente de fermentación. Los granos de cereal incluyen, trigo, avena, centeno, y cebada. Los productos de tubérculos incluyen harina de tapioca, harina de yuca y crema en polvo. La harina también incluye harina de maíz molida, harina de elote, harina de arroz, harina integral, harina de auto-aumento, harina de tapioca, harina de yuca, arroz molido, harina enriquecida y crema en polvo.

Como se usa en este documento, el término "materia prima" se refiere a granos y componentes de plantas que se trituran o se rompen. Por ejemplo, la cebada usada en la producción de cerveza en un grano que se ha molido grueso o triturado para obtener una consistencia apropiada para producir una masa para la fermentación. Una materia prima puede incluir cualquier de los tipos mencionados anteriormente de plantas y granos en formas trituradas o molidas gruesas.

Como se usa en este documento, el término "índice de rendimiento (PI)" se refiere a la relación de rendimiento de un polipéptido variante a un polipéptido precursor para una característica de rendimiento especificada. Dentro de este contexto, "mutaciones aceleradas" se refiere a las mutaciones que tiene un PI>1; "mutaciones neutras" se refiere a las mutaciones que tienen un PI>0.5; "mutaciones no deletéreas" se refiere a mutaciones que tienen un PI>0.05; y "mutaciones deletéreas" se refiere a mutaciones que tiene un PI<0.05.

Como se usa en este documento, los términos "glucoamilasa agregada (o adicional) o (péptido de glucoamilasa)" o polipéptido adicional que tiene actividad de glucoamilasa" se refiere aun enzima de glucoamilasa que no son los mismos polipéptidos como AmyE.

Las formas singulares "un" , "una" , "el" y "la" incluye referentes plurales a menos que el contexto lo dicte claramente de otra manera. De esta manera, por ejemplo, la referencia a "una enzima" incluye una pluralidad de estas enzimas y la referencia a "la formulación" incluye referencia a una o más formulaciones y equivalentes de las mismas conocidos por aquellas personas expertas en el campo, y así sucesivamente.

Los intervalos numéricos incluyen los números que definen el intervalo. Los encabezados son descriptivos y no se proponen como limitaciones. Todas las referencias citadas en este documento se incorporan a manera de referencia. 1.2 Abreviaturas Se aplican las siguientes abreviaturas a menos que se indique de otra manera: AE etoxilato de alcohol AEO etoxilato de alcohol AEOS etoxisulfato de alcohol AES etoxisulfato de alcohol AGU unidad de actividad de la glucoamilasa AkAA a-amilasa de Aspergillus kawachii AmyE -amilasa de Bacillus subtilis AmyS oí-amilasa de Geobacillus stearothermophilus AS sulfato de alcohol BAA -amilasa bacteriana cDNA ADN complementario CMC carboximetilcelulosa DE Equivalente de Dextrosa DI destilado, desionizado DNA ácido desoxirribonucleico DP3 grado de polimerización con tres unidades DPn grado de polimerización con subunidades n DS o ds sólidos secos DTMPA ácido dietiltriaminopentaacético EC comisión de enzimas para la clasificación de enzimas EDTA ácido etilendiatninotetraacético EDTMPA ácido etilendiaminotetrametilenfosfónico EO óxido de etileno F&HC cuidado de tela y doméstico GAU unidades de glucoamilasa HFCS jarabe de maíz con alto contenido de fructosa HFSS jarabe basado en almidón con alto contenido de fructosa IPTG isopropil ß-D-tiogalactosido LA Agar Luria LB Caldo Luria LU Unidades de Lipasa LIT residuo de leucina (L) en la posición 1 se reemplaza con un residuo de treonina (T) , donde los aminoácidos se designan por abreviaturas de una sola letra comúnmente conocidas en el campo .

MW peso molecular NCBI Centro Nacional para la Información de Biotecnología nm nanómetro NOBS nonanoiloxibenzensulfonato NTA ácido nitrilotriacético OD densidad óptica PCR reacciona en cadena de la polimerasa PEG polietilenglicol pl punto isoeléctrico ppm partes por millón PVA alcohol poli (vinílico) PVP poli (vinilpirrolidona) RAU Unidades de Amilasa de Referencia R A ácido ribonucleico SAS sulfatos de alcano secundarios IX SSC NaCl 0.15 M, ci.trato de sodio 0.015 M, pH 7.0 SSF sacarificación y fermentación simultáneas SSU unidad de almidón soluble, equivalente al polvo reductor de 1 mg de glucosa liberada por minuto TAED tetraacetiletilendiamina TNBS ácido trinitrobencensulfónico TrGA glucoamilasa de Trichoderma reesei w/v peso/volumen p/p peso/peso wt tipo natural µ]1? microlitro µ?p? microNewton x metro 2. Polipéptidos AmyE 2.1. Polipéptidos AmyE precursores La a-amilasa AmyE se refiere a una a-amilasa de origen natural (EC 3.2.1.1; 1 , 4 -a-D-glucan glucanohidrolasa) de B. subtilis, como es ejemplificado por SEQ ID NO: 1. Los polipéptidos relacionados tienen secuencias de aminoácidos que difieren de la secuencia de un AmyE de origen natural, por ejemplo, secuencias de aminoácidos que tienen por lo menos aproximadamente 85%, por lo menos aproximadamente 90%, por lo menos aproximadamente 91%, por lo menos aproximadamente 92%, por lo menos aproximadamente 93%, por lo menos aproximadamente 94%, por lo menos aproximadamente 95%, por lo menos aproximadamente 96%, por lo menos aproximadamente 97%, por lo menos aproximadamente 98%, o aún por lo menos aproximadamente 99% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1, como es medida con el algoritmo de alineación de secuencia BLAST con parámetros de igualación por omisión.

Otro polipéptido AmyE ejemplar es Amy31A que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 (Amy31A) . El Amy31A se describe por Ohdan y colaboradores, "Characteristics of two forms of alpha-amilasas and structural implication, " Appl. Environ. Microbiol . 65(10): 4652-58 (1999) and UniProtKB/TrEMBL No. de Acceso 082953 (SEQ ID NO: 3) . El Amy31A tiene aproximadamente 86% de identidad de secuencia al AmyE de SEQ ID NO: 1, usando el algoritmo BLAST. Los polipéptidos AmyE adicionales incluyen, pero no se limitan a, la AmyE que tiene la secuencia de aminoácidos descrita en NCBI Nos. De Acceso ABW75769, ABK54355, AAF14358, AAT01440, AAZ30064, NP_388186, AAQ83841 y BAA31528, los contenidos de los cuales se incorporan en este documento a manera de referencia .

La secuencia de aminoácidos AmyE representativa expuesta en SEQ ID NO: 1 es que d una forma madura, la cual carece de la secuencia de señal nativa. La forma madura de AmyE es referida en cualquier lugar como "AmyE de longitud completa" . Generalmente, la forma madura de AmyE es de mayor interés como una enzima, aunque puede ser deseable expresar la forma inmadura (con una secuencia de señal) para afectar la secreción de una célula hospedera. La secuencia de señal nativa de este AmyE es de 41 residuos de aminoácido en longitud y se muestra como SEQ ID NO: 9. Los 45 residuos de aminoácido N-terminal de SEQ ID NO: 3 son la secuencia de señal de Amy31A. Una alineación de secuencia entre AmyE (SEQ ID NO: 1) y Amy31A (sin la secuencia de señal) se representa en la FIGURA 1.

Los polipéptidos AmyE pueden tener una supresión del dominio de enlace al almidón C- terminal como se ejemplifica por el polipéptido AmyE truncado que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 (AmyE-tr) . Este polipéptido se trunca del residuo D425 (con referencia a SEQ ID NO: 1). Una estructura de cristal de 2.5 Á de resolución de AmyE-tr está disponible en Protein Datábanle No. de Acceso 1BAG, la cual se da a conocer por Fuj imoto y colaboradores (1998) "Crystal structure of a catalytic-site mutant alpha-amilasa from B. subtilis complexed with maltopentaose , " J. Mol. Biol . 277:393-407. La AmyE se puede truncar en otras posiciones, por ejemplo, Y423, P424, D426 o 1427 de la AmyE de SEQ ID NO: 1, con la condición de todo o parte del dominio de enlace al almidón C-terminal se remueva. Truncaciones similares se pueden hace a Amy31A y otros polipéptidos AmyE. 2.2. Variantes AmyE Las variantes AmyE comprenden por lo menos una modificación de aminoácidos comparada con la AmyE de origen natural de SEQ ID NO: 1, o comparada con SEQ ID NO: 2 (el polipéptido truncado) . Por consiguiente, los polipéptidos AmyE de SEQ ID NO : 1 o SEQ ID NO : 2 se pueden referir como "polipéptidos precursores", "enzimas precursoras", o "secuencias precursoras", de la cuales se derivan las variantes AmyE. Los residuos de aminoácido que no se modifican (es decir, las secuencias de aminoácidos contiguas restantes) pueden ser idénticas aquellas de SEQ ID NO: 3, o idénticas a aquellas de NCBI Nos. de Acceso ABW75769, ABK54355, AAF14358, AAT01440, AAZ30064, NP_388186, AAQ83841, y BAA31528. Alternativamente, las secuencias de aminoácidos restantes pueden tener un grado especificado de identidad de secuencia a una o más de estas secuencias como es medido usando, por ejemplo, una alineación BLAST de las secuencias de proteínas con parámetros de alineación por omisión. Por ejemplo las secuencias restantes pueden tener por lo menos aproximadamente 85%, por lo menos aproximadamente 90%, por lo menos aproximadamente 91%, por lo menos aproximadamente 92%, por lo menos aproximadamente 93%, por lo menos aproximadamente 94%, por lo menos aproximadamente 95%, por lo menos aproximadamente 96%, por lo menos aproximadamente 97%, por lo menos aproximadamente 98%, o aún por lo menos aproximadamente 99% de identidad de secuencia con la AmyE de SEQ ID NO: l o SEQ ID NO : 2.

Las variantes AmyE pueden tener una sola modificación de aminoácidos o pueden tener, por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 o más modificaciones de aminoácidos comparada con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: l o SEQ ID NO: 2. Las modificaciones incluyen sustituciones, inserciones, supresiones, combinaciones, de las mismas. En algunos casos, las modificaciones son a los residuos de aminoácidos que no se requieren para la función biológica. La selección de los residuos de aminoácido que se modifican se puede guiar por la homología de secuencia entre las secuencias AmyE. Generalmente, los aminoácidos que están bien conservados en la secuencia AmyE son más probables que sean requeridos para la actividad biológica. A la inversa, las posiciones de aminoácidos que varían entre las secuencias AmyE son menos probables que sean requeridas para la actividad biológica. Por ejemplo, los residuos de aminoácidos que difieren en la alineación entre AmyE y Amy31A, mostrados en fuente negrita en la FIGURA 1, se pueden modificar probablemente en una variante AmyE sin pérdida de la actividad biológica.

Las variantes AmyE preferidas tienen por lo menos actividad de 1 , -oí-D-glucan-glucanohidrolasa parcial, comparada con un AmyE de origen natural y por lo menos una propiedad alterada comparada con un AmyE de origen natural . La propiedad alterada puede ser con respecto a la actividad específica hacia el almidón, maltoheptaosa y/o substratos de maltotriosa, especificidad de substrato, termoestabilidad, temperatura óptima, pH óptimo, intervalo de pH y/o temperatura, estabilidad oxidante, capacidad para reducir la viscosidad de una composición de almidón, o los similares. En algunos casos, la propiedad alterada de la variante AmyE se relaciona con la actividad específica sobre una harina de maíz particular, maltotriosa, substrato de maltoheptaosa en un pH particular (por ejemplo, 4 o 5.8) , estabilidad al calor en una temperatura particular, (por ejemplo, 60°C) , o rendimiento de limpieza en un pH particular (por ejemplo, 8 o pH 10) . La propiedad alterada se puede caracterizar por un índice de rendimiento (PI) , donde el PI es una relación del rendimiento de la variante AmyE comparada con un AmyE de tipo natural. En algunas modalidades, el PI es mayor que aproximadamente 0.5, mientras que en otras modalidades, el PI es de aproximadamente l o es mayor que 1.

Residuos específicos se pueden sustituir para impartir propiedades benéficas sobre una variante AmyE resultante incluyen uno o más de lo siguiente: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, .97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 267, 268, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300., 301, 302, 303, 304, 305, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, y 425. Modificaciones en cualquiera de estas posiciones producen un polipéptido variante que tiene un índice de rendimiento (PI) mayor que 0.5 para la expresión de la proteína, y un PI mayor que uno para por lo menos una característica que mejora el rendimiento de la enzima.

Un subconjunto de residuos que se puede sustituir para impartir propiedades benéficas sobre una variante AmyE resultante incluye uno o más de lo siguiente: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 39, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 72, 73, 74, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 98, 99, 100, 103 , 104, 105, 106, 107, 108, 109 , 110, 111, 112 , 113, 114, 115, 116, 118, 119, 121, 124, 125 , 126, 128, 129 , 130, 131, 132, 134, 135, 136, 140, 141, 142 , 143 , 144 , 147 , 150, 151, 152 , 153 , 154, 155 , 156, 157, 158 , 159, 160, 162 , 163, 164, 165, 166, 167, 168, 170, 171, 172 , 175, 179, 180 , 181, 184 , 186, 187, 188, 189, 190, 192, 195 , 196, 197, 198 , 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 207, 209 , 211, 212, 213 , 214, 217, 218, 219, 221, 222, 223, 224, 225 , 226, 229, 230 , 231, 232, 233 , 234 , 235, 236 , 237, 238, 239 , 240, 241, 242 , 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251 , 252 , 253, 254 , 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263 , 264 , 267, 268 , 270, 271, 272, 273, 274 , 275, 276, 277, 279 , 280, 281, 282 , 283 , 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291 , 292 , 293 , 294 , 295, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304 , 305, 307, 308 , 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316 , 317 , 318, 319, 320 , 321, 322, 324, 325, 327, 328, 329, 330, 331 , 332, 333, 334 , 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343 , 344, 345, 346 , 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353 , 355, 356 , 357, 358, 359 , 360, 361, 362, 363 , 364 , 365 , 366 , 367 368 , 369, 371, 372 , 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380 381 , 382 , 383, 384 , 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392 393 , 394, 395, 396 , 397, 398, 399, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, y 425. Las modificaciones en cualquiera de estas posiciones producen un polipéptido variante que tiene un índice de rendimiento (PI) mayor que 0.5 para la expresión de la proteína, y un PI mayor que 1.1 para por lo menos una característica que mejora el rendimiento de la enzima.

En algunos casos, una o más posiciones se seleccionan del grupo que consiste de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 98, 99, 100, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 121, 122, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 134, 135, 136, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230 231 232 233 234 235, 236, 237, 238 239, 240 241, 242 243 244 , 245 246 247, 248, 249, 250 251, 252 253, 254 255 256, 257 258 259, 260, 261, 262 263 264 265, 267 268 269, 270 271 272, 273 , 274, 275 276 277 278, 279 280 281 282 283 284, 285, 286, 287 288, 289 290, 291 292 293 294 295 296, 297, 298, 299 300, 301 302, 303 304 305, 307 308 309, 310, 311 312 313 , 314 315, 316 317 318, 319 320 321 322, 323 324 325, 326 327, 328 329 330, 331 332 333 334, 335, 336 337, 338 339, 340 341 342, 343 344 345, 346, 347, 348 349, 350 351, 352 353 354, 355 356 357, 358, 359, 360 361, 362 363, 364 365 366, 367 368 369, 370, 371, 372 373 374 375, 376 377 378, 379 380 381, 382 383, 384 385, 386 387, 388 389 390, 391 392 393 394 395, 396 397, 398 399, 400 401 402, 403 404 405, 406, 407, 408 409, 410 411, 412 413 414 , 415 416 417, 418, 419, 420 421, 422 423, 424 y 425, las posiciones que no son completamente restrictivas para el rendimiento en ya sea el polipéptido precursor de longitud completa o truncado.

Algunas posiciones se determinaron para ser no totalmente restrictivas para el rendimiento en el contexto del polipéptido precursor AmyE truncado (es decir, 1, 2, 3, 4, 5, 8, 18, 20, 23, 24, 25, 27, 28, 30, 35, 44, 45, 47, 49, 50, 51, 52, 54, 56, 59, 68, 73, 76, 78, 85, 88, 89, 90, 91, 106, 107, 108, 109, 112, 115, 116, 118, 119, 124, 125, 126, 127, 131, 132, 134, 142, 143, 152, 153, 156, 160, 163, 166, 167, 184, 185, 187, 188, 190, 192, 195, 199, 200, 201, 202, 203, 212, 213, 214, 218, 219, 221, 222, 223, 233, 234, 238, 240, 241, 243, 245, 247, 248, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 257, 259, 260, 274, 275, 276, 277, 282, 283, 284, 287, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 317, 318, 319, 320, 321, 323, 324, 325, 327, 328, 331, 333, 344, 346, 347, 349, 357, 358, 359, 367, 368, 369, 378, 380, 382, 385, 386, 388, 390, 393, 395, 400, 401, 402, y 406), y algunas posiciones se determinaron para ser no totalmente restrictivas para el rendimiento en el contexto de el polipéptido precursor AmyE de longitud completa (es decir, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 19, 21, 22, 26, 27, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 45, 46, 48, 52, 53, 55, 57, 58, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 69, 70, 71, 72, 74, 77, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 86, 87, 88, 89, 92, 93, 94, 95, 96, 98, 99, 100, 103, 104, 105, 110, 111, 113, 114, 117, 121, 122, 126, 128, 129, 130, 131, 135, 136, 138, 139, 140, 141, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 154, 155, 157, 158, 159, 161, 162, 164, 165, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 183, 184, 186, 189, 191, 193, 194, 196, 197, 198, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 215, 216, 217, 220, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 235, 236, 237, 238, 239, 241, 242, 244, 246, 249, 256, 258, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 278, 279, 280, 281, 285, 286, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 307, 312, 315, 316, 322, 326, 329, 330, 332, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 348, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 379, 380, 381, 383, 384, 387, 389, 391, 392, 394, 396, 397, 398, 399, 402, 403, 404, 405, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425) .

En algunos casos, la modificación es una sustitución de uno o más residuos de amino presentes en el polipéptido precursor a diferentes residuos de aminoácidos, por ejemplo: 1A, 1C, ID, 1E, 1F, 1G, 1H, 1K, 1M, 1N, 1Q, IR, 1S, IT, IV, 1 , 1Y, 2A, 2C, 2D, 2E, 2F, 2G, 2H, 21, 2K, 2L, 2M, 2N, 2P, 2Q, 2R, 2S, 2V, 2W, 2Y, 3C, 3D, 3E, 3F, 3G, 3H,' 3I, 3K, 3L, 3M, 3N, 3P, 3Q, 3R, 3S, 3V, 3W, 3Y, 4C, 4D, 4E, 4F, 4G, 4H, 41, 4K, 4L, 4M, 4N, 4Q, 4S, 4T, 4V, 4W, 4Y, 5A, 5C, 5D, 5E, 5F, 5G, 5H, 51, 5K, 5L, 5N, 5R, 5V, 5 , 5Y, 6C, 6D, 6E, 6H, 6K, 6L, 6M, 6N, 6P, 6Q, 6R, 6S, 6T, 6V, 6W, 7A, 7C, 7D, 7E, 7F, 7G, 7H, 71, 7L, 7M, 7N, 7P, 7Q, 7R, 7S, 7T, 7 , 7Y, 8A, 8C, 8E, 8F, 8G, 8H, 81, 8K, 8L, 8M, 8N, 8P, 8Q, 8R, 8T, 8V, 8W, 8Y, 9A, 9C, 9D, 9E, 9F, 9H, 91, 9K, 9M, 9N, 9P, 9R, 9S, 9T, 9V, 9W, 9Y, 10A, 101, 10L, 10M, ION, 10P, 10Q, IOS, 10V, HA, 11F, 11G, 11H, 11M, US, 11V, 11 , 11Y, 121, 12M, 12V, 13A, 13C, 13D, 13E, 13F, 13G, 131, 13L, 13M, 13Q, 13T, 13V, 13W, 13Y, 14C, 14F, 14G, 14M, 14N, 14S, 14T, 14V, 15A, 15F, 16A, ' 16D, 16E, 16F, 16G, 16H, 161, 16L, 16M, 16Q, 16S, 16T, 16V, 17A, 17F, 171, 17M, 17Q, 17Y, 18A, 18C, 18D, 18E, 18G, 18H, 18M, 18N, 18Q, 18R, 18T, 19A, 19C, 19H, 19L, 19M, 19N, 19S, 19W, 19Y, 20A, 20C, 20D, 20F, 20G, 20H, 201, 20K, 20L, 20M, 20P, 20Q, 20R, 20S, 20T, 20V, 20 , 20Y, 21A, 21C, 21D, 21E, 21H, 211, 21K, 21L, 21M, 21N, 21Q, 21R, 21S, 21V, 221, 22M, 22Q, 22S, 22T, 22V, 23A, 23C, 23D, 23E, 23F, 23G, 23H, 231, 23L, 23M, 23N, 23R, 23S, 23T, 23V, 23W, 23Y, 24A, 24C, 24D, 24F, 24G, 24L, 24N, 24P, 24Q, 24R, 24S, 24T, 24V, 24Y, 25A, 25C, 25D, 25E, 25F, 25G, 25H, 251, 25K, 25L, 25R, 25S, 25T, 25V, 25W, 25Y, 26A, 26F, 261, 26L, 26V, 27A, 27C, 27D, 27E, 27F, 27G, 27H, 271 , 27L, 27M, 27N, 27P, 27Q, 27R, 27S, 27T, 27V, 27W, 27Y, 28A, 28C, 28F, 28G, 28H, 281, 28K, 28L, 28M, 28N, 28P, 28Q, 28R, 28S, 28T, 28V, 28W, 28Y, 29A, 29C, 29F, 29L, 29M, 29T, 29V, 30A, 30C, 30D, 30E, 30F, 30G, 301 , 30K, 30L, 30M, 30N, 30P, 30Q, 30R, 30S, 30T, 30V, 30W, 30Y, 31A, 31C, 31E, 31F, 31G, 31H, 311, 31K, 31L, 31M, 31N, 31Q, 31S, 31T, 31V, 31W, 31Y, 32D, 32F, 32G, 32H, 32K, 32L, 32M, 32Q, 32S, 32T, 32V, 32Y, 33A, 33C, 33D, 33E, 33F, 33H, 331, 33K, 33L, 33M, 33P, 33Q, 33S, 33T, 33W, 33Y, 34A, 34F, 341, 34P, 34W, 35A, 35C, 35F, 35G, 35H, 351, 35L, 35M, 35N, 35P, 35Q, 35 , 35S, 35V, 35 , 35Y, 36C, 36D, 36E, 36F, 36H, 361, 36K, 36L, 36M, 36N, 36Q, 36R, 36S, 36T, 36Y, 37L, 37M, 37N, 37V, 38A, 38C, 38D, 38E, 38H, 38L, 38M, 38N, 38P, 38V, 39A, 39C, 391, 39L, 39M, 39N, 39P, 39S, 39V, 40A, 40D, 40M, 40N, 40P, 40Q, 40T, 40V, 40W, 41A, 41C, 41E, 41G, 41N, 41S, 41V, 42A, 42L, 42M, 42P, 42V, 43A, 43G, 43H, 43L, 43M, 43Q, 43S, 43T, 43V, 44A, 44C, 44D, 44E, 44F, 44G, 44H, 441, 44K, 44L, 44M, 44N, 44P, 44R, 44S, 44T, 44V, 44W, 44Y, 45A, 45C, 45F, 45G, 45H, 451 , 45L, 45M, 45N, 45P, 45Q, 45S, 45T, 45Y, 46A, 46C, 46D, 46E, 46F, 46H, 461, 46L, 46M, 46N, 46Q, 46R, 46S, 46T, 46V, 46W, 46Y, 47A, 47C, 47D, 47F, 47G, 47H, 471, 47K, 47L, 47N, 47P, 47R, 47S, 47T, 47V, 47Y, 48A, 48C, 48D, 48E, 48F, 48H, 481, 48K, 48L, 48N, 48P, 48S, 48T, 48V, 48W, 49A, 49C, 49D, 49F, 49G, 49H, 491, 49K, 49L, 49P, 49Q, 49R, 49S, 49T, 49V, 49W, 49Y, 50A, 50C, 50E, 50F, 50G, 50H, 501, 50K, 50L, 50M, 50N, 50P, 50R, 50S, 50T, 50V, 50W, 50Y, 51A, 51C, 51D, 51E, 51F, 51H, 511, 51K, 51L, 51M, 51N, 51P, 51Q, 51R, 51S, 51T, 51V, 51W, 52A, 52C, 52E, 52F, 52G, 52H, 521, 52K, 52L, 52M, 52N, 52P, 52Q, 52R, 52S, 52T, 52V, 52W, 52Y, 53A, 53C, 53E, 53F, 53G, 53H, 531, 53L, 53N, 53P, 53R, 53S, 53T, 53V, 53W, 53Y, 54A, 54C, 54D, 54F, 54G, 54H, 541, 54L, 54M, 54N, 54P, 54Q, 54R, 54T, 54V, 54 , 54Y, 55A, 55C, 55D, 55E, 55F, 55G, 55H, 551, 55N, 55P, 55Q, 55S, 55T, 55Y, 56A, 56D, 56E, 56F, 56G, 561, 56K, 56L, 56M, 56N, 56P, 56Q, 56R, 56T, 56V, 56W, 56Y, 57A, 57C, 57D, 57E, 57F, 57H, 571, 57K, 57L, 57M, 57Q, 57R, 57S, 57T, 57V, 57W, 57Y, 58A, 58F, 58H, 59A, 59C, 59D, 59E, 59F, 59G, 59H, 59K, 59L, 59N, 59P, 59R, 59S, 59T, 59V, 59W, 60A, 60C, 60D, 60E, 60G, 601, 60K, 60L, 60M, 60N, 60Q, 60R, 60T, 60V, 61C, 61D, 61E, 61F, 61M, 61S, 61T, 61V, 62A, 62C, 62D, 62F, 62G, 62H, 621, 62K, 62L, 62Q, 62S, 62T, 62V, 63A, 63C, 63D, 63F, 63G, 63H, 63K, 63M, 63N, 63R, 63S, 64A, 64G, 64H, 641, 64L, 64M, 64N, 64S, 64V, 64Y, 65A, 65C, 65E, 65H, 651, 65K, 65L, 65M, 65Q, 65R, 65S, 66D, 66E, 66F, 66G, 66H, 661 , 66K, 66L, 66M, 66N, 66Q, 66R, 66T, 66V, 66W, 66Y, 67A, 67C, 67D, 67E, 67F, 67G, 671, 67K, 67L, 67N, 67P, 67Q, 67S, 67T, 67W, 68A, 68C, 68D, 68E, 68F, 68G, 68H, 681, 68L, 68M, 68N, 68P, 68R, 68S, 68T, 68V, 68W, 68Y, 69A, 69C, 69M, 69P, 69T, 69V, 70A, 70E, 70H, 70N, 70S, 71S, 72C, 72D, 72E, 72F, 72G, 72H, 721, 72K, 72L, 72P, 72Q, 72S, 72T, 72V, 72W, 72Y, 73A, 73C, 73E, 73F, 73H, 731, 73K, 73L, 73M, 73P, 73S, 73T, 73V, 73W, 74A, 74E, 74F, 74M, 74S, 74T, 74Y, 75A, 75C, 75D, 75E, 75P, 76A, 76D, 76E, 76F, 76G, 761, 76L, 76M, 76P, 76Q, 76R, 76S, 76V, 76Y, 77A, 77C, 77D, 77G, 77H, 771, 77K, 77L, 77R, 77S, 77T, 77V, 77W, 77Y, 78A, 78C, 78D, 78E, 78F, 78G, 78H, 781, 78K, 78L, 78M, 78N, 78P, 78R, 78S, 78T, 78V, 78W, 78Y, 79A, 79G, 79L, 79M, 79N, 79Q, 79S, 79T, 80A, 80L, 80M, 80W, 80Y, 81A, 81C, 81D, 81E, 81G, 81H, 811, 8ÍL, 81M, 81N, 81Q, 81R, 81S, 81T, 81V, 81 , 81Y, 82A, 82D, 82F, 82G, 821, 82K, 82L, 82M, 82Q, 82R, 82S, 82T, 82V, 82W, 82Y, 83A, 83F, 831, 83L, 83T, 83V, 84A, 84D, 84E, 84G, 841, 84K, 84M, 84N, 84Q, 84S, 84T, 84V, 85D, 85E, 85F, 85G, 851, 85K, 85L, 85M, 85N, 85R, 85S, 85T, 85V, 85W, 86C, 86D, 86E, 86F, 86G, 861, 86K, 86L, 86M 86N, 86Q, 86R, 86S, 86V, 86W, 86Y, 87F, 87G, 87T, 88A, 88C 88D, 88F, 88G, 88H, 881, 88K, 88L, 88M, 88N, 88Q, 88R, 88S 88T, 88V, 88W, 88Y, 89A, 89C, 89D, 89F, 89G, 89H, 891, 89K 89L, 89M, 89N, 89P, 89Q, 89R, 89S, 89T, 89V, 89W, 89Y, 90C 90D, 90E, 90F, 90G, 90H, 901, 90K, 90L, 90M, 90N, 90Q, 90R 90S, 90T, 90V, 90 , 91A, 91C, 91D, 91E, 91F, 91H, 91K, 91L 91M, 91N, 91P, 91Q, 91R, 91S, 91T, 91W, 91Y, 92L, 92N, 92T 92V, 93A, 93C, 93D, 93E, 93F, 93G, 931, 93L, 93M, 93N, 93P 93Q, 93R, 93S, 93T, 93V, 93 , 93Y, 94A, 94C, 941, 94M, 94T 95A, 95F, 95L, 95M, 95V, 95Y, 96A, 96C, 961, 96L, 96M, 96P 96T, 97A, 97E, 97M, 97 , 98C, 98G, 981, 98L, 98M, 98T, 98V 99A, 99C, 99E, 99F, 99G, 991, 99L, 99M, 99N, 99P, 99S, 99T 100A, 100C, 100F, 100M, 100N, 100P, 100T, 100V, 100Y, 101A 102A, 102G 102Q, 102S, 102W, 102Y, 103A, 103C, 1031, 103M 103N, 103S 103V, 104A, 104C, 104S, 105C, 105D, 105E, 105F 105G, 105H 105K, 105L, 105M, 105Q, 105R, 105T, 105V, 105 105Y, 106A 106C, 106E, 106F, 106H, 1061, 106K, 106L, 106M 106N, 106Q 106R, 106S, 106T, 106V, 106W, 106Y, 107A, 107C 107E, 107F 107G, 107H, 1071, 107K, 107L, 107M, 107N, 107P 107Q, 107R 107S, 107T, 107V, 107W, 108C, 108D, 108E, 108F 108G, 108H 1081, 108K, 108L, 108N, 108P, 108R, 108S, 108T 108V, 108W 108Y, 109C, 109D, 109E, 109F, 109G, 109H, 1091 109K, 109L 109M, 109N, 109P, 109R, 109S, 109T, 109V, 109 109Y, 110L 110M, 110V, 111A, 111C, 111E, 111F, 111G, 111H lili, 111K 111L, 111M, 111N, 111P, 111Q, 111R, 111T, 111V, 111W, 111Y, 112A, 112C, 112D, 112E, 112F, 112G, 112H, 1121, 112K, 112L, 112M, 112P, H2Q, 112R, 112S, 112T, 112V, 112W, 112Y, 113A, 113D, 113F, 113G, 1131, 113K, 113L, 113M, 113N, 113P, 113Q, 113S, 113T, 113V, 113W, 113Y, 114F, 114L, 114P, 114T, 115A, 115C, 115F, 115G, 115H, 1151, 115L, 115M, 115N, H5Q, 115R, 115S, 115T, 115V, 115W, 115Y, 116A, 116D, 116E, 116F, 116G, 116H, 1161, 116L, 116N, 116Q, 116R, 116T, 116V, 116W, 116Y, 117F, 117L, 117N, 117Q, 117V, 117 , 117Y, 118A, 118C, 118D, 118E, 118F, 118G, 118H, 1181, 118K, 118L, 118M, 118N, 118Q, 118R, 118S, 118T, 118V, 118 , 118Y, 119A, 119C, 119D, 119E, 119F, 119G, 119H, 1191, 119K, 119L, 119M, H9Q, 119R, 119S, 119T, 119V, 119Y, 121A, 121M, 121N, 121S, 122R, 123E, 124A, 124C, 124D, 124E, 124F, 124G, 1241, 124K, 124 , 124Q, 124R, 124S, 124T, 124V, 124Y, 125A, 125D, 125E, 125F, 125G, 125H, 1251, 125K, 125L, 125M, 125N, 125P, 125Q, 125R, 125S, 125V, 125W, 125Y, 126A, 126C, 126D, 126F, 126G, 126H, 1261, 126K, 126L, 126N, 126P, 126R, 126S, 126T, 126V, 126W, 126Y, 127C, 127L, 127 , 127V, 128A, 128C, 128D, 128E, 128F, 128G, 128H, 1281, 128L, 128M, 128N, 128Q, 128R, 128S, 128T, 128V, 128Y, 129A, 129C, 129D, 129E, 129F, 129H, 1291, 129K, 129L, 129M, 129R, 129S, 129T, 129V, 129Y, 130A, 130C, 130D, 130F, 130G, 130H, 1301, 130K, 130L, 130M, 130P, 130R, 130T, 130V, 130Y, 131A, 131C, 131D, 131E, 131F, 131G, 131H, 1311, 131K, 131L, 131M, 131N, 131Q, 131R, 131T, 131V, 131 , 131Y, 132A, 132C, 132E, 132H, 1321, 132L, 132M, 132N, 132Q, 132S, 132W, 132Y, 134C, 134D, 134E, 134F, 134G, 1341, 134L, 134M, 134N, 134R, 134S, 134T, 134V, 134Y, 135A, 135C, 135E, 135M, 135N, 135Q, 135R, 136A, 136C, 136F, 136L, 136T, 136Y, 137C, 138A, 138C, 138F, 138H, 138N, 138R, 138W, 138Y, 139A, 139C, 139G, 139H, 139L, 139M, 139S, 140A, 140C, 140F, 140G, 141A, 141F, 141H, 141P, 141Q, 141S, 141T, 141V, 141Y, 142C, 142D, 142F, 142G, 142H, 1421 , 142K, 142M, 142Q, 142R, 142S, 142T, 142W, 142Y, 143A, 143C, 143D, 143F, 143K, 143L, 143M, 143N, 143Q, 143R, 143S, 143W, 144G, 144S, 144T, 144V, 144 , 145W, 146A, 146E, 146M, 146T, 147C, 147F, 147H, 1471 , 147L, 147N, 147P, 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161S, 162A, 162C, 162E, 162F, 1621, 162M, 162V, 163A, 163C, 163E, 163F, 163G, 163H, 1631, 163K, 163L, 163N, 163Q, 163R, 163S, 163T, 163V, 163W, 163Y, 164A, 164F, 164G, 164H, 1641, 164L, 164M, 164N, 164Q, 164S, 164T, 164V, 164W, 164Y, 165C, 165G, 1651, 165L, 165M, 165Q, 165S, 165T, 165V, 165W, 165Y, 166A, 166C, 166D, 166E, 166F, 166G, 166H, 1661, 166K, 166M, 166N, 166Q, 166R, 166S, 166T, 166V, 166 , 166Y, 167A, 167C, 167D, 167E, 167F, 167G, 167H, 1671, 167K, 167L, 167M, 167Q, 167R, 167S, 167T, 167V, 167 , 167Y, 168C, 168E, 168F, 168G, 1681, 168K, 168L, 168M, 168N, 168S, 168T, 168V, 168W, 168Y, 169L, 170C, 170G, 170V, 171A, 171C, 171E, 171F, 171G, 171H, 1711 , 171L, 171M, 171N, 171Q, 171R, 171V, 172A, 172C, 172E, 172F, 172P, 1731, 173M, 173V, 173Y, 174D, 174E, 174G, 174H, 174L, 174Q, 174V, 174Y, 175H, 175M, 175 , 175Y, 176E, 176F, 1761, 176K, 176L, 176V, 176Y, 177C, 177G, 177M, 177Q, 177S, 178C, 178G, 178M, 178S, 178T, 179A, 179C, 179G, 179H, 1791, 179L, 179M, 179P, 179S, 179T, 179V, 179W, 179Y, 180A, 180D, 180M, 180N, 180Y, 181A, 181C, 181L, 181M, 181V, 182A, 183C, 183M, 184A, 184C, 184D, 184E, 184F, 184G, 184H, 1841, 184K, 184L, 184M, 184N, 184Q, 184R, 184S, 184T, 184V, 184W, 184Y, 185C, 185E, 185N, 185S, 185T, 186E, 187A, 187C, 187D, 187E, 187F, 187H, 1871, 187K, 187L, 187M, 187N, 187P, 187Q, 187R, 187S, 187T, 187V, 187 , 187Y, 188A, 188C, 188D, 188E, 188F, 188G, 1881, 188K, 188L, 188M, 188N, 188P, 188Q, 188R, 188T, 188V, 189F, 189W, 190A, 190C, 190E, 190F, 190H, 190K, 190L, 190M, 190Q, 190R, 190S, 190W, 190Y, 191A, 191L, 19IT, 191Y, 192D, 192E, 192F, 192G, 1921, 192K, 192L, 192N, 192P, 192R, 192S, 192T, 192V, 193A, 1931, 193L, 193M, 1941, 195A, 195C, 195D, 195F, 195G, 195H, 1951, 195K, 195L, 195M, 195N, 195Q, 195R, 195S, 195T, 195V, 195W, 195Y, 196A, 196C, 196D, 196E, 196F, 196G, 196H, 1961, 196K, 196L, 196M, 196Q, 196R, 196S, 196T, 196V, 196 , 196Y, 197A, 197C, 197F, 197L, 197S, 197T, 197V, 198A, 198C, 198G, 198H, 1981, 198L, 198 , 198N, 198R, 198S, 198V, 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213R, 213T, 213V, 213Y, 214C, 214D, 214F, 214G, 2141, 214K, 214L, 214M, 214N, 214Q, 214R, 214S, 214T, 214V, 214 , 214Y, 215A, 215C, 215H, 215T, 216C, 216K, 217E, 217F, 217G, 2171, 217K, 217M, 217N, 217P, 217Q, 217R, 217S, 217T, 217V, 217Y, 218C, 218D, 218E, 218F, 218G, 218H, 2181, 218K, 218L, 218M, 218N, -218P, 218Q, 218R, 218S, 218T, 218V, 218W, 218Y, 219C, 219D, 219F, 219G, 219H, 2191, 219K, 219L, 219M, 219N, 219Q, 219R, 219S, 219T, 219V, 219W, 219Y, 220F, 221C, 221E, 221G, 2211 , 221L, 221M, 221N, 221Q, 221R, 221S, 221T, 221V, 221Y, 222?, 222C, 222D, 222F, 222G, 2221 , 222K, 222M, 222P, 222R, 222S, 222?, 222V, 223A, 223C, 223E, 223F, 223H, 2231, 223L, 223?, 223?, 223Q, 223V, 223W, 2241, 224L, 224V, 224Y, 225A, 225C, 225?, 225F, 225H, 2251, 225K, 225L, 225M, 225N, 225P, 225Q, 225S, 225T, 225V, 225 , 225Y, 226A, 226C, 226F, 2261, 226L, 226?, 226T, 227A, 227C, 227D, 227E, 227G, 227M, 227S, 228C, 228D, 228M, 228N, 228P, 228S, 228T, 228V, 229C, 229D, 229?, 229F, 229G, 229H, 229M, 229N, 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298R, 298S, 298V, 298 , 299C, 299D, 299E, 299F, 299G, 299H, 2991, 299L, 299M, 299N, 299P, 299Q, 299V, 300A, 300C, 300F, 300H, 3001, 300K, 300L, 300 , 300N, 300Q, 300R, 300S, 300V, 300Y, 301C, 301D, 301F, 301H, 3011, 301K, 301L, 301M, 301Q, 301R, 301T, 301V, 302C, 302E, 302F, 302G, 302K, 302M, 302N, 302S, 302T, 303L, 303M, 303 , 303Y, 304C, 304E, 304G, 304L, 304N, 304Y, 305A, 305G, 3051, 305N, 305T, 305V, 307A, 307C, 307D, 307N, 307Q, 307T, 307V, 307Y, 308A, 308C, 308D, 308F, 308G, 308H, 3081, 308K, 308L, 308M, 308N, 308P, 308Q, 308R, 308S, 308T, 308V, 308W, 308Y, 309C, 309D, 309E, 309F, 309H, 3091, 309K, 309M, 309N, 309P, 309R, 309S, 309T, 309V, 309Y, 310A, 310D, 310E, 310F, 310H, 3101, 310L, 310M, 310N, 310P, 310Q, 310R, 310S, 310T, 310Y, 311A, 311C, 311D, 311E, 311F, 311H, 311K, 311L, 311M, 311N, 311P, 3HQ, 311R, 311S, 311T, 311V, 311W, 311Y, 312A, 312C, 312D, 312E, 312F, 312G, 312H, 3121, 312K, 312L, 312M, 312P, 312Q, 312R, 312S, 312T, 312V, 312 , 312Y, 313A, 313C, 313D, 313E, 313F, 313H, 3131, 313K, 313L, 313M, 313N, 313P, 313Q, 313R, 313S, 313T, 313V, 313W, 313Y, 314A, 314C, 314D, 314F, 314G, 314H, 314K, 314L, 314M, 314Q, 314R, 314S, 314T, 314W, 314Y, 315C, 315D, 315E, 315G, 315H, 3151, 315K, 315L, 315M, 315N, 315P, 315Q, 315T, 315V, 316C, 316D, 316H, 3161, 316L, 316M, 316Y, 317A, 317C, 317D, 317E, 317F, 317G, 317H, 3171, 317K, 317L, 317N, 317Q, 317R, 317S, 317T, 317V, 317W, 317Y, 318D, 318F, 318H, 3181, 318K, 318L, 318M, 318N, 318R, 318S, 318T, 318V, 318W, 318Y, 319A, 319D, 319F, 319G, 319H, 319L, 319N, 319P, 319Q, 319S, 319V, 319W, 320A, 320C, 320D, 320F, 320G, 320H, 3201, 320K, 320L, 320M, 320N, 320P, 320Q, 320T, 320V, 320 , 320Y, 321A, 321C, 321D, 321E, 321F, 321G, 321H, 3211, 321K, 321L, 321 , 321N, 321P, 321R, 321S, 321T, 321V, 321W, 322L, 322M, 322V, 323A, 323C, 323H, 323N, 323R, 323S, 323T, 324A, 324C, 324E, 324F, 324G, 324H, 3241, 324K, 324L, 324M, 324N, 324P, 324Q, 324R, 324S, 324T, 324V, 324W, 324Y, 325A, 325C, 325D, 325F, 325G, 325H, 3251, 325K, 325L, 325M, 325N, 325P, 325T, 325V, 325W, 325Y, 326A, 326Q, 327C, 327D, 327F, 327G, 327H, 327K, 327N, 327P, 327R, 327T, 327V, 327Y, 328C, 328D, 328E, 328F, 328G, 328H, 3281, 328K, 328L, 328N, 328P, 328Q, 328R, 328S, 328T, 328V, 328 , 328Y, 329A, 329D, 329E, 329F, 329G, 329H, 329N, 329Q, 329R, 329S, 329T, 330A, 330C, 330H, 330L, 330M, 330S, 330 , 330Y, 331C, 331D, 331F, 331G, 3311, 331K, 331L, 331M, 331N, 331Q, 331R, 331S, 331T, 331V, 331Y, 332A, 332C, 332E, 332F, 332G, 3321, 332K, 332L, 332M, 332Q, 332R, 332S, 332V, 332Y, 333C, 333D, 333F, 333G, 333H, 3331, 333K, 333L, 333M, 333N, 333P, 333R, 333S, 333T, 333V, 333W, 333Y, 334C, 334D, 334F, 334G, 334H, 3341, 334L, 334M, 334N, 334Q, 334R, 334S, 334T, 334V, 334Y, 335A, 335L, 335M, 335Q, 335T, 335V, 336A, 336C, 336E, 336F, 336G, 336H, 3361, 336K, 336L, 336M, 336N, 336Q, 336R, 336S, 336V, 336W, 336Y, 337D, 337G, 337H, 337K, 337L, 337N, 337P, 337Q, 337R, 337S, 337V, 337W, 337Y, 338C, 338F, 338G, 3381, 338L, 338M, 338N, 338P, 338S, 338T, 339C, 339G, 3391, 339S, 339T, 339V, 340D, 340E, 340F, 340G, 340H, 3401, 340K, 340L, 340M, 340N, 340S, 340T, 340V, 340W, 341A, 3411 , 341L, 341M, 341V, 341W, 341Y, 342A, 342D, 342E, 342F, 342G, 342K, 342L, 342M, 342N, 342R, 342S, 342V, 342Y, 343A, 343C, 343D, 343E, 343F, 343G, 343H, 3431 , 343K, 343L, 343M, 343P, 343Q, 343S, 343T, 343V, 343 , 343Y, 344A, 344C, 344D, 344E, 344F, 344G, 344H, 3441, 344K, 344L, 344M, 344N, 344Q, 344R, 344S, 344T, 344W, 344Y, 345A, 345C, 345D, 345E, 345F, 345G, 345H, 3451, 345N, 345Q, 345S, 345T, 345V, 345 , 345Y, 346C, 346D, 346E, 346F, 346H, 3461, 346K, 346L, 346M, 346N, 346P, 346R, 346S, 346T, 346V, 346Y, 347A, 347C, 347D, 347E, 347F, 347H, 3471, 347K, 347L, 347 , 347N, 347P, 347Q, 347R, 347S, 347T, 347V, 347 , 347Y, 348C, 348F, 348G, 348H, 3481, 348K, 348M, 348N, 348P, 348R, 348S, 348T, 348V, 348W, 348Y, 349A, 349C, 349D, 349F, 349G, 349H, 3491, 349K, 349L, 349M, 349N, 349Q, 349R, 349S, 349T, 349V, 349W, 349Y, 350A, 350C, 350D, 350N, 350S, 351A, 351D, 351G, 351H, 351K, 351L, 351M, 351P, 351Q, 351R, 351S, 351T, 351V, 351W, 351Y, 352A, 352D, 352E, 352F, 352G, 352H, 3521, 352K, 352N, 352Q, 352R, 352T, 352V, 352 , 352Y, 353A, 353C, 353D, 353E, 353F, 353G, 3531, 353K, 353L, 353M, 353N, 353Q, 353R, 353T, 353V, 353 , 353Y, 354A, 354C, 354M, 354P, 354Q, 354S, 354T, 355C, 355D, 355E, 355F, 355G, 3551, 355K, 355L, 355M, 355N, 355T, 355V, 355W, 355Y, 356D, 356E, 356F, 356G, 356H, 3561, 356K, 356L, 356M, 356P, 356Q, 356T, 356W, 356Y, 357A, 357C, 357D, 357E, 357F, 357H, 3571 , 357K, 357L, 357M, 357N, 357P, 357Q, 357R, 357S, 357T, 357V, 357 , 357Y, 358A, 358C, 358D, 358E, 358F, 358G, 358H, 3581, 358K, 358L, 358M, 358P, 358Q, 358R, 358S, 358T, 358V, 358W, 358Y, • 359A, 359C, 359D, 359E, 359F, 359G, 359H, 3591, 359K, 359L, 359M, 359P, 359Q, 359R, 359S, 359T, 359V, 359W, 359Y, 360F, 360H, 360L, 360N, 360P, 360R, 360T, 360 , 361A, 361C, 361G, 361H, 361L, 361M, 361N, 361Q, 361S, 361T, 361V, 361W, 361Y, 362A, 362C, 362E, 362H, 3621, 362L, 362M, 362Q, 362S, 362T, 362V, 362Y, 363D, 363E, 363F, 363G, 363H, 363N, 363Q, 363R, 363S, 363V, 363W, 363Y, 364A, 364C, 364D, 364E, 364G, 3641, 364L, 364M, 364Q, 364S, 364T, 364V, 365A, 365C, 365D, 365F, 365G, 3651, 365K, 365L, 365M, 365N, 365R, 365S, 365T, 365V, 365 , 365Y, 366A, 366C, 366E, 366F, 366G, 366H, 366K, 366L, 366M, 366S, 366T, 366V, 367A, 367C, 367D, 367E, 367F, 367H, 3671, 367K, 367L, 367M, 367N, 367P, 367R, 367S, 367T, 367V, 367W, 367Y, 368D, 368F, 368G, 3681, 368K, 368L, 368M, 368N, 368P, 368Q, 368R, 368T, 368V, 368W, 368Y, 369A, 369C, 369D, 369E, 369F, 369G, 3691, 369K, 369L, 369M, 369N, 369P, 369Q, 369R, 369S, 369T, 369V, 369W, 369Y, 370A, 371A, 371C, 371F, 371G, 371H, 3711, 371L, 371M, 371N, 371Q, 371S, 371T, 371W, 371Y, 372A, 372C, 372G, 3721, 372L, 372M, 372N, 372Q, 372S, 372T, 373A, 373C, 373F, 373G, 3731, 373M, 373Q, 373S, 373T, 373V, 373W, 373Y, 374C, 374E, 374G, 3741, 374L, 374M, 374N, 374S, 374T, 374V, 375A, 375C, 375D, 375F, 375G, 375H, 375L, 375M, 375Q, 375S, 375T, 375V, 375W, 375Y, 376C, 376D, 376E, 376F, 376G, 376H, 3761, 376L, 376M, 376N, 376P, 376Q, 376S, 376T, 376V, 377F, 377H, 3771, 377K, 377L, 377P, 377T, 377W, 377Y, 378A, 378C, 378D, 378E, 378F, 378G, 378H, 3781, 378K, 378L, 378M, 378N, 378P, 378Q, 378R, 378T, 378V, 378W, 378Y, 379A, 379D, 379G, 379H, 3791, 379K, 379L, 379Q, 379T, 379 , 379Y, 380A, 380C, 380D, 380E, 380F, 380G, 380H, 3801, 380L, 380M, 380N, 380P, 380Q, 380R, 380T, 380V, 380 , 380Y, 381A, 381G, 3811, 381K, 381N, 381P, 381Q, 381R, 381S, 381T, 381W, 381Y, 382A, 382C, 382D, 382F, 382G, 382H, 3821, 382K, 382L, 382M, 382N, 382P, 382Q, 382R, 382T, 382V, 382W, 382Y, 383A, 383C, 383E, 383F, 383G, 383H, 383L, 383N, 383P, 383Q, 383S, 383T, 383V, 383 , 383Y, 384A, 384D, 384F, 384G, 384H, 3841, 384K, 384L, 384P, 384Q, 384S, 384T, 384V, 384 , 385A, 385C, 385D, 385E, 385F, 385G, 385H, 3851, 385K, 385L, 385M, 385N, 385P, 385Q, 385R, 385S, 385V, 385W, 385Y, 386C, 386D, 386F, 386G, 386H, 3861, 386L, 386N, 386P, 386R, 386S, 386T, 386V, 386W, 386Y, 387A, 387D, 387E, 387G, 3871, 387L, 387N, 387Q, 387S, 388A, 388C, 388D, 388E, 388F, 388G, 388H, 3881, 388L, 388M, 388N, 388P, 388Q, 388R, 388S, 388T, 388V, 388W, 388Y, 389C, 389E, 389F, 389H, 3891, 389K, 389M, 389N, 389Q, 389S, 389T, 389V, 389W, 389Y, 390A, 390C, 390D, 390E, 390F, 390G, 390H, 3901 , 390K, 390L, 390M, 390N, 390R, 390S, 390T, 390V, 390W, 390Y, 391E, 391F, 391G, 391H, 3911, 391K, 391L, 391N, 391P, 391R, 391S, 391T, 391V, 391W, 391Y, 392A, 392C, 392D, 392E, 392F, 392?, 392?, 392L, 392M, 392N, 392Q, 392R, 392S, 392V, 392Y, 393?, 393C, 393D, 393F, 393G, 393H, 3931, 393L, 393M, 393P, 393Q, 393S, 393T, 393V, 393W, 393Y, 394A, 394C, 394E, 394F, 394?, 3941, 394K, 394L, 394M, 394N, 394P, 394Q, 394R, 394S, 394?, 394V, 394 , 395A, 395C, 395E, 395F, 395G, 395H, 3951 , 395?, 395L, 395M, 395N, 395P, 395Q, 395R, 395S, 395T, 395V, 395 , 395Y, 396A, 396C, 396D, 396E, 396G, 396M, 396P, 396S, 396?, 397A, 397C, 397D, 397E, 397F, 397G, 397H, 3971, 397L, 397?, 397P, 397R, 397S, 397T, 397V, 397W, 398C, 398D, 398?, 398F, 398G, 3981, 398L, 398 , 398N, 398P, 398Q, 398R, 398S, 398?, 398V, 398W, 398Y, 399A, 399C, 399D, 399E, 399F, 399?, 3991, 399K, 399L, 399P, 399R, 399S, 399T, 399V, 399W, 399?, 400C, 400D, 400E, 400F, 400G, 400H, 4001, 400K, 400L, 400?, 400?, 400P, 400Q, 400R, 400S, 400T, 400V, ¦400W, 400Y, 401A, 401C, 401D, 401E, 401F, 401H, 4011, 401K, 401L, 401M, 401N, 401P, 401Q, 401R, 401S, 401T, 401V, 401W, 401Y, 402A, 402C, 402D, 402E, 402F, 402G, 402H, 4021, 402K, 402L, 402M, 402?, 402?, 402Q, 402R, 402T, 402V, 402 , 402Y, 403A, 403C, 403?, 403G, 403H, 4031, 403M, 403N, 403Q, 403S, 403T, 403V, 403W, 403?, 404D, 404E, 404F, 404G, 404H, 4041, 404L, 404M, 404?, 404?, 404R, 404T, 404V, 404W, 404Y, 405E, 405F, 405G, 405?, 4051, 405K, 405Q, 405S, 405T, 406D, 406F, 406L, 406T, 406?, 407?, 407C, 407E, 407F, 407G, 407H, 4071, 407K, 407M, 407?, 407?, 407Q, 407R, 407S, 407T, 407V, 407W, 407Y, 408A, 408D, 408E, 408F, 408H, 4081, 408K, 408N, 408P, 408Q, 408S, 408T, 408V, 408Y, 409A, 409C, 409D, 409E, 409F, 409H, 4091, 409L, 409M, 409Q, 409R, 409T, 409V, 409W, 409Y, 410F, 410G, 4101, 410K, 410Q, 410S, 410T, 410V, 410W, 410Y, 411A, 411D, 411E, 411F, 411G, 411H, 4111, 411L, 411M, 411N, 411Q, 411R, 411S, 411V, 411W, 411Y, 412A, 412D, 412E, 412H, 4121, 412K, 412L, 412M, 412N, 412R, 412S, 412T, 412V, 412Y, 413C, 413E, 413F, 413G, 4131 , 413L, 413M, 413N, 413P, 413R, 413S, 413V, 413 , 413Y, 414A, 414C, 414E, 414F, 414G, 414H, 414L, 414M, 414N, 414P, 414Q, 414T, 414V, 414W, 415D, 415E, 415F, 415G, 415H, 4151, 4 5K, 415P, 415Q, 415R, 415V, 415W, 416F, 4161, 416L, 416P, 416Q, 416R, 416T, 416V, 416Y, 417A, 417C, 417D, 417F, 417G, 417H, 4171, 417K, 417M, 417N, 417P, 417Q, 417S, 417W, 417Y, 418C, 418D, 418E, 418F, 418H, 4181, 418K, 418N, 418Q, 418R, 418T, 418W, 418Y, 419C, 419D, 419E, 419F, 419G, 419H, 4191, 419L, 419P, 419Q, 419S, 419T, 419Y, 420D, 420E, 420F, 420G, 420H, 4201, 420K, 420L, 420M, 420N, 420Q, 420R, 420S, 420T, 420V, 420W, 420Y, 421A, 421C, 421G, 4211, 421L, 421M, 421S, 421T, 422A, 422F, 422G, 422H, 4221, 422M, 422N, 422Q, 422S, 422V, 422W, 422Y, 423A, 423D, 423G, 423H, 4231, 423K, 423P, 423Q, 423R, 423T, 423V, 423W, 424D, 424E, 424G, 4241, 424K, 424M, 424N, 424Q, 424R, 424S, 424T, 424V, 424W, 424Y, 425A, 4251, 425K, 425L, 425M, 425S, 425T, 425V, 425W y En algunos casos, la modificación es una sustitución de uno o más residuos de amino presentes en el polipéptido precursor a diferentes residuos de aminoácidos como es ejemplificado por: 1A, ID, 1F, 1G, 1H, 1K, 1M, 1N, 1Q, IR, is, IT, IV, 1W, 1Y, 2A, 2E, 2F, 2G, 2H, 21, 2P, 2Q, 2R, 2S, 2W, 3D, 3E, 3F, 3G, 3H, 31, 3K, 3L, 3M, 3N, 3P, 3Q, 3R, 3S, 3V, 3W, 3Y, 4D, 4E, 4F, 4G, 41, 4K, 4L, 4Q, 4S, 4T, 4V, 4W, 5A, 5D, 5E, 5F, 5G, 5K, 5L, 5V, 5 , 6D, 6H, 6K, 6L, 6P, 6Q, 6S, 6V, 6 , 7A, 7D, 7E, 7H, 7N, 7Q, 7R, 7S, 8A, 8C, 8E, 8F, 8G, 8H, 81, 8K, 8L, 8N, 8P, 8Q, 8R, 8T, 8V, 8 , 8Y, 9A, 9D, 9E, 9F, 9H, 91 9K, 9M, 9N, 9P, 9R, 9V, 9 , 9Y, 101, 10L, 10M, 10P , IOS, 10V, HA, 11F , 11M, 11V, 121, 12M, 13A, 13D, 13Q, 14G , 14S, 14T, 14V, 15F , 16M, 16Q, 18G, 18N, 18R, 19H, 19 , 20A , 20D, 20F, 20G, 2OH , 201, 20K, 20M, 20R, 20S, 20V, 20W, 20Y , 21E, 211, 21M, 21Q , 21S, 21V, 221 , 22T, 22V, 23A, 23D, 23E , 23F, 23G, 23H, 231 , 23L, 23M, 23N, 23R, 23S, 23T, 23V, 23W , 23Y, 24A, 24C, 24F , 24G, 24R, 24S, 24T, 24V, 24Y, 25E, 25F , 25K, 25L, 25R, 25S , 25T, 25V, 25W, 25Y, 261, 26L, 27A, 27E , 27F, 27G, 27H, 271 , 27L, 27P, 27Q, 27R, 27S, 27T, 27V, 27 , 27Y, 28A, 28C, 28G , 28H, 281, 28K, 28L, 28M, 28N, 28P, 28Q , 28R, 28S, 28V, 28W , 28Y, 29F, 29L, 29V, 30A, 30C, 30D, 30E , 30F, 30G, 30L, 30M , 30N, 30Q, 30R, 30S, 30T, 30V, 30W, 30Y , 31A, 31F, 31G, 31H , 311, 31K, 31L, 31M, 31N, 31Q, 31S, 31T , 31V, 31Y, 32G, 32S , 33A, 33D, 33E, 33H, 33Q, 33S, 34 , 35A , 35F, 35G, 35H, 351 , 35L, 35M, 35N, 35Q, 35R, 35S, 35V, 35W , 36F, 36H, 361, 36L , 36S, 36T, 36Y, 37L, 37V, 39A, 39P, 39S, 39V, 42V, 43A, 43S, 43T, 43V, 44A, 44D, 44E, 44F, 44G, 44H, 441, 44K, 44N, 44R, 44S, 44T, 44Y, 45F, 45H, 451, 45L, 45M, 45S, 45T, 46A, 46D, 46F, 46H, 46L, 46M, 46N, 46R, 47A, 47D, 47F, 47G, 47H, 471, 47K, 47L, 47N, 47P, 47R, 47S, 47T, 47V, 47Y, 48A, 48E, 48F, 48H, 48N, 48P, 48W, 49A, 49F, 49G, 49H, 49K, 49L, 49Q, 49R, 49S, 49T, 49V, 49W, 49Y, 50E, 50F, 50H, 501, 50K, 50L, 50M, 50P, 50R, 50S, 50T, 50V, 50W, 50Y, 51D, 51E, 51F, 51H, 511, 51K, 51L, 51P, 51Q, 51R, 51S, 51T, 51V, 51W, 52E, 52F, 52G, 52H, 521 , 52K, 52L, 52M, 52N, 52Q, 52R, 52S, 52T, 52V, 52W, 52Y, 53A, 53E, 53F, 53H, 531, 53L, 53P, 53R, 53S, 53T, 53V, 54A, 54C, 54F, 54G, 54H, 54L, 54N, 54P, 54R, 54T, 54W, 54Y, 55A, 55F, 55H, 55N, 55P, 55Q, 55S, 55T, 55Y, 56D, 56E, 56F, 56G, 561, 56K, 56L, 56P, 56Q, 56R, 56T, 56V, 56W, 56Y, 57A, 57E, 57H, 57M, 57Q, 57R, 57S, 57Y, 58F, 59A, 59C, 59F, 59H, 59N, 59P, 59R, 59S, 59T, 59W, 60L, 60 , 63H, 63N, 64A, 64S, 65A, 651, 65R, 66D, 66E, 66G, 66M, 66N, 66Q, 66R, 67A, 67F, 67G, 671, 67L, 67N, 67Q, 67T, 67 , 68D, 68F, 68H, 681, 68L, 68N, 68R, 68S, 68T, 68V, 68W, 69M, 69V, 72E, 72F, 72G, 72H, 721, 72K, 72Q, 72S, 72T, 72V, -72W, 72Y, 73F, 73M, 73W, 74 , 74T, 76A, 76L, 76M, 76P, 76Q, 76R, 76Y, 77A, 77D, 77K, 77L, 77R, 77Y, 78D, 78E, 78F, 78G, 78H, 781, 78 , 78L, 78P, 78R, 78S, 78T, 78W, 78Y, 79A, 79M, 79Q, 79S, 80M, 81E, 81G, 81H, 81L, 81M, 81N, 81Q, 81R, 81S, 81T, 81V, 81Y, 82D, 82F, 82G, 821, 82K, 82L, 82M, 82Q, 82R, 82S, 82T, 82Y, 83A, 83F, 83L, 84A, 84N, 84S, 84T, 85D, 85E, 85F, 85G, 851, 85K, 85R, 85S, 85T, 85V, 85W, 86D, 86E, 86G, 861, 86K, 86L, 86M, 86N 86Q, 86R, 86S, 86V, 86W, 87G, 88A, 88D, 88F, 88G, 88H 88K, 88L, 88M, 88N, 88Q, 88S, 88T, 88W, 88Y, 89D, 89F 89G, 89H, 891, 89K, 89L, 89N, 89P, 89Q, 89R, 89S, 89T 89V, 89W, 89Y, 90D, 90E, 90H, 901, 90K, 90M, 90N, 90R 90S, 90T, 90V, 90W, 91D, 91H, 91K, 91N, 91Q, 91R, 91S 92L, 92V, 93A, 93D, 93G, 93N, 93R, 93S, 93Y, 941, 95F, 95M, 961, 98C, 991, 100C, 100M, 100V, 103A, 103C, 103V 104A, 104S, 105C, 105D, 105E, 105F, 105G, 105M, 105W, 105Y 106E, 106H, 106N, 106Q, 106S, 106T, 106Y, 107A, 107C, 107E 107F, 107G, 107H, 1071, 107K, 107L, 107M, 107N, 107P, 107Q 107R, 107S, 107T, 107V, 107 , 108C, 108D, 108E, 108F, 108G 108H, 1081, 108K, 108L, 108N, 108P, 108R, 108S, 108T, 108V 108W, 108Y, 109D, 109H, 1091, 109K, 109L, 109N, 109R, 109S 109V, 109 , 109Y, 110V, 111C, 111E, 111F, 111G, 111H, 111K 111L, 111M, 111N, 111Q, 111R, HIT, 112A, 112D, 112E, 112H 112K, 112L, 112R, 112S, 112T, 112W, 112Y, 113A, 114L, 115A 115H, 1151, 115L, 115R, 115V, 115Y, 116A, 116F, 116G, 116H 1161, 116L, 116N, 116Q, 116R, 116T, 116V, 116W, 116Y, 118D 118F, 118G, 118H, 118 , 118L, 118M, 118N, 118Q, 118R, 118S 118T, 118V, 118 , 118Y, 119E, 119F, 1191, 119K, 119L, 119M 119Q, 119S, 119T, 119Y, 121S, 124A, 124K, 124Q, 124R, 124S 124T, 125A, 125D, 125F, 1251, 125K, 125Q, 125R, 125V, 125Y 126A, 126C, 126D, 126F, 126G, 126H, 1261, 126K, 126L, 126N 126P, 126R, 126S, 126T, 126V, 126W, 126Y, 128A, 128C, 128E, 128F, 128G, 128H, 1281, 128L, 128M, 128N, 128Q, 128R, 128S, 128T, 128V, 129C, 129D, 129E, 130A, 130F, 130L, 130T, 130Y, 131A, 131C, 131D, 131F, 131G, 131H, 1311, 131K, 131L, 131N, 131Q, 131T, 131V, 131W, 131Y, 1321, 132N, 132S, 132 , 134E, 134F, 134L, 134M, 134R, 134Y, 135E, 136L, 140A, 141F, 141H, 142C, 142D, 142F, 142G, 142H, 1421, 142K, 142M, 142Q, 142R, 142S, 142T, 142W, 142Y, 143C, 143D, 143K, 143L, 143N, 143Q, 143S, 144T, 147F, 147L, 150H, 151C, 151D, 151E, 151G, 151H, 151K, 151L, 151M, 151Q, 151S, 151T, 152A, 152C, 152E, 152F, 152G, 152H, 1521, 152K, 152L, 152M, 152N, 152P, 152Q, 152R, 152S, 152V, 152 , 152Y, 153E, 153F, 153H, 153K, 153L, 153N, 153R, 153T, 153V, 153W, 153Y, 154A, 155M, 156A, 156F, 156G, 156K, 156L, 156Q, 156R, 156V, 156Y, 157F, 157H, 158A, 1581, 158M, 158T, 158V, 159H, 1591, 159L, 159M, 160A, 160C, 160D, 160E, 160F, 160G, 160H, 1601, 160K, 160L, 160M, 160Q, 160S, 160T, 160V, 1621, 162M, 163A, 163E, 163F, 163G, 163H, 1631, 163K, 163L, 163N, 163Q, 163R, 163S, 163T, 163V, 163 , 163Y, 164G, 164H, 164L, 164N, 164S, 164T, 164V, 164W, 164Y, 165C, 1651, 165L, 165M, 165T, 165V, 166C, 1661, 166M, 166V, 167A, 167C, 167E, 167F, 167G, 1671, 167K, 167L, 167M, 167Q, 167R, 167S, 167T, 167V, 167 , 167Y, 168C, 168E, 168F, 168G, 168K, 168L, 168M, 168N, 168S, 168T, 168V, 168W, 168Y, 170C, 171E, 171H, 1711, 171M, 171N, 171Q, 171R, 172A, 175Y, 179A, 179C, 179G, 179H, 179S, 179W, 180M, 181V, 184D, 186E, 187E, 187F, 187H, 1871, 187K, 187M, 187Q, 187S, 187V, 187W, 188A, 188D, 188F, 188G, 1881, 188K, 188L, 188M, 188P, 188Q, 188R, 188T, 188V, 189F, 189W, 190H, 190K, 190Q, 190R, 190S, 192G, 192K, 192L, 192P, 192S, 192V, 195D, 195F, 195G, 195H, 195K, 195M, 195R, 195V, 195W, 196A, 196C, 196E, 196F, 196H, 1961, 196K, 196L, 196M, 196Q, 196R, 196S, 196T, 196V, 196Y, 197L, 197V, 198A, 198C, 1981, 198L, 198V, 199C, 199D, 199E, 199F, 199H, 199R, 199S, 199T, 199Y, 2001 , 200N, 200S, 200V, 201C, 201D, 201E, 201F, 201G, 201H, 2011, 201K, 201L, 201N, 201Q, 201R, 201T, 201V, 201W, 201Y, 202C, 202V, 203A, 203C, 203F, 203G, 2031, 203 , 203L, 203Q, 203R, 203S, 203T, 203V, 203W, 203Y, 2041, 204M, 204W, 204Y, 205A, 205C, 2051, 205L, 205M, 205N, 205V, 207A, 209L, 209V, 211H, 211S, 211T, 212G, 212N, 213A, 213E, 213F, 213G, 2131, 213K, 213L, 213M, 213P, 213Q, 213R, 213T, 213V, 214C, 214D, 214F, 214G, 2141, 214K, 214L, 214M, 214N, 214Q, 214R, 214S, 214T, 214V, 214W, 214Y, 2171, 217Q, 217T, 218C, 218D, 218E, 218F, 218G, 218H, 2181 , 218K, 218L, 218M, 218P, 218Q, 218R, 218S, 218T, 218V, 218W, 218Y, 219D, 219F, 219G, 219H, 2191, 219N, 219Q, 219S, 219T, 219V, 219Y, 221C, 221E, 221G, 221Q, " 221S, 221V, 222F, 222T, 223H, 223L, 223M, 223 , 2241, 225E, 225F, 225N, 225P, 225Q, 225T, 225Y, 2261, 226L, 229D, 229E, 229N, 229T, 230A, 230D, 230E, 230F, 230H, 2301, 230K, 230M, 230Q, 230R, 230S, 230V, 230Y, 231H, 231 , 232S, 233A, 233D, 233E, 233F, 233G, 2331, 233K, 233L, 233M, 233N, 233Q, 233S, 233T, 233V, 233W, 233Y, 234A, 234F, 234G, 234H, 2341, 234L, 234M, 234N, 234Q, 234R, 234T, 234V, 234W, 234Y, 235L, 235M, 236A, 236G, 2361, 236L, 236M, 236N, 236Q, 237C, 237D, 237E, 237F, 237G, 237H, 2371, 237K, 237L, 237R, 237T, 237V, 237W, 237Y, 238C, 238E, 238G, 238N, 238R, 238S, 238W, 2391, 239M, 240A, 240E, 240F, 240G, 240L, 240Q, 240R, 240T, 240V, 240Y, 241F, 241G, 241H, 2411, 241K, 241L, 241R, 241S, 241T, 241V, 241 , 241Y, 242A, 242C, 242D, 242F, 2421, 242K, 242L, 242S, 242T, 242V, 242W, 242Y, 243D, 243E, 243F, 243G, 243H, 2431, 243K, 243L, 243M, 243Q, 243R, 243S, 243T, 243V, 243W, 243Y, 2441, 244M, 244V, 245C, 245F, 245H, 2451, 245L, 245M, 245N, 245P, 245R, 245T, 245V, 245W, 245Y, 246C, 246D, 246E, 246G, 2461, 246L, 246Q, 246 , 246Y, 247F, 247G, 247H, 2471 , 247L, 247M, 247N, 247Q, 247T, 247V, 247Y, 248F, 248G, 248K, 248L, 248Q, 248R, 248S, 248T, 248V, 248 , 249A, 249C, 249F, 249L, 249M, 249V, 250C, 250E, 250F, 250G, 250H, 2501, 250K, 250L, 250M, 250T, 250V, 250W, 250Y, 251A, 251C, 251D, 251E, 251G, 251K, 251L, 251M, 251P, 251Q, 251V, 251Y, 252F, 252L, 252W, 253F, 2531, 253K, 253L, 253M, 253R, 253T, 253 , 253Y, 254A, 254F, 254G, 254H, 2541, 254L, 254N, 254T, 254V, 254Y, 255A, 255E, 2551, 255K, 255P, 255R, 255S, 255V, 256A, 256C, 2561, 257E, 2571, 257L, 257P, 258C, 258D, 258E, 258N, 258Q, 258R, 258S, 258V, 259A, 259G, 259H, 259K, 259Q, 259R, 259S, 259T, 259W, 260A, 260C, 260D, 260F, 260H, 260N, 260Q, 260R, 260S, 260Y, 261M, 2621, 263C, 263L, 263M, 263S, 263V, 264E, 264H, 2641 , 264L, 264Y, 267A, 267C, 267N, 267T, 268M, 268Q, 270F, 270G, 270N, 270S, 270V, 271F, 272G, 272L, 272S, 272V, 273G, 2731, 273L, 273T, 273Y, 274F, 274G, 274H, 2741, 274K, 274L, 274M, 274N, 274P, 274Q, 274R, 274S, 274T, 274V, 274W, 274Y, 275F, 275G, 275H, 275K, 275P, 275Q, 275R, 275S, 275T, 275V, 276A, 276C, 276D, 276F, 276G, 276H, 2761, 276K, 276L, 276M, 276N, 276P, 276Q, 276R, 276S, 276T, 276Y, 277A, 277D, 277F, 277G, 277H, 2771, 277K, 277L, 277N, 277P, 277Q, 277R, 277S, 277T, 277V, 277Y, 279H, 279K, 279L, 279M, 279N, 279Q, 279Y, 280F, 280Y, 281C, 281L, 282A, 282D, 2821, 282K, 282L, 282M, 282N, 282Q, 282T, 282W, 282Y, 283C, 283G, 283H, 283P, 283R, 283S, 283T, 283V, 283W, 284A, 284C, 284E, 284F, 284G, 284H, 2841, 284K, 284L, 284N, 284R, 284S, 284T, 284V, 284 , 284Y, 285E, 285 , 286C, 286L, 286M, 286V, 287A, 287C, 287E, 287H, 2871, 287K, 287L, 287M, 287Q, 287S, 287T, 287V, 288C, 2881, 288M, 288V, 289A, 290Y, 291C, 291G, 291L, 291S, 291T, 292A, 292C, 2921, 292L, 292T, 293C, 293V, 294C, 294G, 294S, 294T, 295A, 295G, 297D, 297E, 297F, 297G, 297H, 2971 , 297K, 297L, 297M, 297N, 297P, 297Q, 297R, 297T, 297V, 297 , 298C, 298D, 298E, 298F, 298H, 2981, 298K, 298L, 298M, 298N, 298P, 298Q, 298R, 298S, 298V, 298W, 299C, 299G, 2991, 299N, 299V, 300H, 300M, 300R, 300V, 3011, 301K, 301L, 301M, 301T, 302T, 303M, 304L, 304Y, 305T, 305V, 307C, 307N, 308C, 308F, 308G, 308H, 3081, 308K, 308L, 308M, 308N, 308P, 308Q, 308R, 308S, 308T, 308V, 308 , 308Y, 309D, 309E, 309F, 309H, 309K, 309R, 309S, 310A, 311A, 311H, 311K, 311R, 312D, 312F, 312G, 312H, 3121, 312 , 312L, 312M, 312P, 312Q, 312R, 312S, 312T, 312V, 312W, 312Y, 313A, 313D, 313E, 313F, 313K, 313L, 313N, 313Q, 313R, 313S, 313W, 313Y, 314A, 314F, 314H, 314K, 314L, 314M, 314Q, 314R, 314S, 314T, 314W, 314Y, 315K, 315N, 315P, 315T, 316Y, 317A, 317C, 317E, 317F, 317H, 317K, 317L, 317R, 317S, 317T, 317V, 317 , 317Y, 318D, 318F, 318H, 3181, 318K, 318L, 318M, 318N, 318R, 318S, 318T, 318V, 318W, 318Y, 319G, 319L, 319N, 319Q, 319V, 319W, 320C, 320F, 320G, 3201, 320K, 320L, 320M, 320P, 320Q, 320T, 320V, 320Y, 321C, 321D, 321E, 321F, 321G, 321H, 3211, 321K, 321L, 321R, 321S, 321T, 321V, 321W, 322L, 322M, 322V, 324A, 324F, 324G, 324H, 3241, 324K, 324L, 324M, 324N, 324Q, 324R, 324S, 324T, 324V, 324W, 324Y, 325C, 325D, 325G, 325H, 3251, 325K, 325L, 325M, 325N, 325P, 325T, 325V, 327C, 327D, 327G, 327H, 327N, 327T, 328D, 328E, 328F, 328L, 328N, 328Q, 328Y, 329F, 329H, 329Q, 330W, 330Y, 331D, 331F, 331G, 3311, 331L, 331Q, 331S, 331T, 331V, 331Y, 332A, 332C, 332G, 332Q, 332S, 333C, 333G, 333H, 333K, 333L, 333M, 333R, 333S, 333W, 333Y, 334D, 334H, 3341, 334L, 334M, 334N, 334R, 334T, 335V, 336A, 336C, 336F, 336G, 3361, 336M, 336N, 336Q, 336R, 336V, 336 , 336Y, 337H, 337N, 337S, 337V, 337W, 337Y, 338G, 3381, 338L, 338M, 338S, 338T, 339C, 340F, 340H, 340 , 340L, 340M, 340N, 340S, 340T, 340V, 340W, 341A, 341L, 341Y, 342A, 342K, 342N, 342R, 342Y, 343A, 343D, 343E, 343F, 343H, 343K, 343L, 343M, 343Q, 343S, 343T, 343W, 343Y, 344A, 344D, 344E, 344F, 344G, 3441, 344K, 344L, 344M, 344N, 344Q, 344R, 344S, 344T, 344 , 344Y, 345C, 345E, 345F, 345G, 345H, 3451, 345N, 345Q, 345S, 345T, 345V, 346C, 346D, 346E, 3461 , 346K, 346L, 346M, 346N, 346S, 346T, 346V, 346Y, 347D, 347F, 347H, 3471, 347K, 347L, 347M, 347Q, 347R, 347S, 347T, 347V, 347W, 348F, 348H, 3481, 348K, 348R, 348S, 348T, 348V, 348W, 348Y, 349A, 349F, 349G, 3491, 349K, 349M, 349N, 349R, 349S, 349V, 349W, 349Y, 350D, 351A, 351D, 351G, 351H, 351 , 351L, 351M, 351P, 351Q, 351R, 351T, 351V, 351W, 351Y, 352A, 352H, 352Q, 352T, 352Y, 353A, 353D, 353E, 353G, 353,1, 353K, 353L, 353M, 353Q, 353V, 353 , 353Y, 355C, 355F, 3551, 355L, 355M, 355V, 355Y, 356D, 356F, 356G, 3561, 356K, 356L, 356P, 356Q, 356T, 356W, 356Y, 357A, 357H, 3571, 357K, 357L, 357N, 357Q, 357R, 357S, 357T, 357V, 357W, 357Y, 358C, 358D, 358F, 358G, 358H, 3581, 358K, 358L, 358M, 358Q, 358R, 358S, 358T, 358V, 358Y, 359D, 359E, 359H, 359L, 359M, 359P, 359Q, 359R, 359T, 359V, 359 , 360F, 360P, 360T, 361C, 361L, 361M, 361N, 361Q, 361S, 361T, 361V, 362A, 362C, 3621, 362L, 362V, 362Y, 363D, 363G, 363H, 363Q, 363R, 363S, 363V, 363 , 363Y, 364A, 364C, 364G, 3641, 364L, 364M, 364Q, 364S, 364T, 364V, 365C, 3651, 365K, 365L, 365N, 365R, 365S, 365V, 366A, 366K, 367L, 367M, 367N, 367R, 367S, 367T, 367W, 367Y, 368G, 3681, 368K, 368L, 368R, 368T, 368V, 368 , 369C, 369D, 369E, 369F, 369G, 3691 , 369K, 369L, 369N, 369Q, 369S, 369T, 369V, 369Y, 371A, 371C, 371F, 3711, 371L, 371M, 371N, 371S, 371T, 371Y, 372A, 372C, 3721, 372L, 372N, 372S, 372T, 373A, 373C, 373F, 3731, 373M, 373T, 373V, 374C, 374G, 3741, 374M, 374S, 374T, 374V, 375A, 375C, 375D, 375F, 375H, 375L, 375M, 375Q, 375S, 375T, 375Y, 376G, 3761, 376S, 376T, 376V, 377F, 377H, 377L, 377T, 377W, 377Y, 378C, 378E, 378F, 378G, 378H, 3781, 378K, 378L, 378M, 378N, 378Q, 378R, 378T, 378V, 378W, 378Y, 379A, 379G, 379H, 3791, 379K, 379L, 379Q, 379T, 379Y, 380C, 380E, 380F, 380G, 380H, 380L, 380M, 380N, 380P, 380Q, 380R, 380T, 380V, 380W, 380Y, 381G, 3811, 381Q, 381R, 381S, 381T, 381W, 381Y, 382A, 382C, 382F, 3821, 382K, 382Q, 382R, 382T, 382W, 382Y, 383A, 383F, 383L, 383P, 383Q, 383V, 384A, 384G, 384H, 3841, 384K, 384P, 384Q, 384V, 384W, 385C, 385F, 385H, 3851, 385K, 385L, 385N, 385P, 385Q, 385R, 385S, 385V, 385W, 385Y, 386D, 386F, 386G, 386H, 386L, 386N, 386R, 386S, 386T, 386V, 386W, 386Y, 3871, 387L, 388A, 388C, 388G, 388H, 388L, 388P, 388S, 388T, 388W, 388Y, 389C, 389F, 3891, 389M, 389Q, 389V, 390F, 3901, 390K, 390L, 390N, 390R, 390S, 390T, 390V, 390 , 390Y, 391F, 391K, 391N, 391P, 391R, 391T, 391W, 391Y, 392A, 392C, 392D, 392E, 392F, 392H, 392K, 392L, 392N, 392Q, 392R, 392S, 392V, 392Y, 393A, 393C, 393D, 393F, 393G, 393H, 3931, 393L, 393Q, 393S, 393T, 393V, 393W, 393Y, 394A, 394C, 394F, 394H, 3941, 394K, 394L, 394Q, 394V, 394W, 395F, 395G, 395H, 395K, 395L, 395Q, 395R, 395S, 395T, 395V, 395W, 395Y, 396C, 396D, 396S, 397C, 397D, 397F, 397G, 397H, 3971, 397L, 397P, 397S, 397T, 397V, 397W, 398C, 398G, 398N, 398S, 398T, 398V, 399C, 399F, 3991, 399K, 399L, 399R, 399S, 399T, 399V, 399 , 399Y, 400C, 400D, 400E, 400F, 400G, 400H, 4001, 400K, 400L, 400M, 400Q, 400R, 400S, 400T, 400V, 400W, 400Y, 401A, 401C, 401D, 401E, 401F, 4011, 401K, 401L, 401M, 401N, 401Q, 401R, 401S, 401T, 401V, 401 , 401Y, 402A, 402C, 402D, 402E, 402F, 402G, 402H, 4021, 402 , 402L, 402M, 402N, 402P, 402Q,- 402R, 402T, 402V, 402 , 402Y, 403A, 403C, 403H, 4031, 403M, 403V, 403W, 403Y, 404F, 404H, 404M, 404R, 404T, 404V, 404W, 404Y, 405G, 405Q, 405S, 405T, 406L, 406T, 407F, 407G, 407H, 4071, 407K, 407M, 407Q, 407R, 407S, 407T, 407V, 407W, 407Y, 408D, 408E, 408F, 408N, 408V, 409C, 409F, 4091, 409L, 409R, 409T, 409V, 409W, 409Y, 410V, 411E, 411F, 411M, 411Q, 411R, 411S, 411Y, 412N, 412T, 413C, 413F, 413G, 4131 , 413L, 413P, 413R, 413S, 413V, 413 , 413Y, 414H, 414L, 414N, 414Q, 414T, 414V, 414W, 415D, 415E, 415G, 4151, 415R, 415V, 415W, 416F, 416L, 416Q, 416Y, 417A, 417C, 417D, 417F, 417G, 417H, 4171 , 417K, 417M, 417N, 417Q, 418D, 418F, 418H, 4181, 418K, 418N, 418W, 418Y, 419E, 419F, 419H, 4191, 419L, 419S, 419T, 420D, 420E, 420F, 420G, 420H, 4201, 420K, 420L, 420Q, 420S, 420T, 420V, 420 , 420Y, 421C, 421L, 421M, 421S, 421T, 422F, 4221 , 422S, 422 , 423D, 4231, 423Q, 423R, 423T, 424M, 424Q, 424R, 424V, 424Y, 425A, 4251, 425K, 425L, 425V y 425Y.

En algunos casos, la sustitución se selecciona de 052D, 052E, 0521, 052K, 052L, 052N, 052Q, 052R, 052V, 056D, 056E, 0561, 056K, 056L, 056N, 056Q, 056R, 056V, 089D, 089E, 0891, 089K, 089L, 089N, 089Q, 089R, 089V, 152D, 152E, 1521, 152K, 152L, 152N, 152Q, 152R, 152V, 153D, 153E, 1531, 153K, 153L, 153N, 153Q, 153R, 153V, 201D, 201E, 2011, 201K, 201L, 201N, 201Q, 201R, 201V, 251D, 251E, 2511, 251K, 251L, 251N, 251Q, 251R, 251V, 284D, 284E, 2841, 284K, 284L, 284N, 284Q, 284R, 284V, 297D, 297E, 2971, 297K, 297L, 297N, 297Q, 297R, 297V, 308D, 308E, 3081, 308K, 308L, 308N, 308Q, 308R, 308V, 321D, 321E, 3211, 321K, 321L, 321N, 321Q, 321R, 321V, 328D, 328E, 3281, 328K, 328L, 328N, 328Q, 328R, 328V 347D, 347E, 3471, 347K, 347L, 347N, 347Q, 347R, 347V, 357D 357E, 3571, 357K, 357L, 357N, 357Q, 357R, 357V, 359D, 359E 3591, 359K, 359L, 359N, 359Q, 359R, 359V, 369D, 369E, 3691 369K, 369L, 369N, 369Q, 369R, 369V, 385D, 385E, 3851, 385K 385L, 385N, 385Q, 385R, 385V, 388D, 388E, 3881, 388K, 388L 388N, 388Q, 388R, 388V, 391D, 391E, 3911, 391K, 391L, 391N 391Q, 391R, 391V, 400D, 400E, 4001, 400K, 400L, 400N, 400Q 400R, 400V, 416D, 416E, 4161, 416K 416L, 416N, 416Q, 416R y 416V, las mutaciones que tiene valores PI >0.5 tanto para la proteína como la actividad.

Las sustituciones que cambiaron el residuo del aminoácido presente en la posición 153 del polipéptido AmyE precursor a N, K o F exhibieron capacidad incrementada para convertir substratos de maltosa y maltoheptaosa a glucosa. Las sustituciones que cambiaron el residuo de aminoácido presente en la posición 153 del polipéptido AmyE precursor a K exhibieron capacidad incrementada para convertir un substrato DP7 a glucosa.

Las sustituciones L142F, L142G, L142Q, L142S, L142W, L142Y, A214I, A214V, S245Y, Q126F, Q126L, Q126P, Q126V, S131L y S254I, mejoraron el rendimiento de la licuefacción del almidón en el contexto del polipéptido AmyE dé longitud completa. Las sustituciones W60L, 60M, W60N, I100F, ,?????, S105M, S105W, G207A, T270A, T270E, T270L, T270N, T270V y T279A, mejoraron el rendimiento de la licuefacción del almidón en el contexto del polipéptido AmyE truncado.

Las sustituciones como una o más de las posiciones 052D, 052E, 0521, 052K, 052L, 052N, 052Q, 052R, 052V, 056D, 056E, 0561, 056K, 056L, 056N, 056Q, 056R, 056V, 089D, 089E, 0891, 089K, 089L, 089N, 089Q, 089R, 089V, 152D, 152E, 1521, 152K, 152L, 152N, 152Q, 152R, 152V, 153D, 153E, 1531 , 153K, 153L, 153N, 153Q, 153R, 153V, 201D, 201E, 2011, 201K, 201L, 201N, 201Q, 201R, 201V, 251D, 251E, 2511, 251K, 251L, 251N, 251Q, 251R, 251V, 284D, 284E, 2841, 284K, 284L, 284N, 284Q, 284R, 284V, 297D, 297E, 2971, 297K, 297L, 297N, 297Q, 297R, 297V, 308D, 308E, 3081, 308K, 308L, 308N, 308Q, 308R, 308V, 321D, 321E, 3211, 321K, 321L, 321N, 321Q, 321R, 321V, 328D, 328E, 3281, 328K, 328L, 328N, 328Q, 328R, 328V, 347D, 347E, 3471, 347K, 347L, 347N, 347Q, 347R, 347V, 357D, 357E, 3571, 357K, 357L, 357N, 357Q, 357R, 357V, 359D, 359E, 3591, 359K, 359L, 359N, 359Q, 359R, 359V, 369D, 369E, 3691, 369K, 369L, 369N, 369Q, 369R, 369V, 385D, 385E, 3851, 385K, 385L, 385N, 385Q, 385R, 385V, 388D, 388E, 3881, 388K, 388L, 388N, 388Q, 388R, 388V, 391D, 391E, 3911, 391K, 391L, 391N, 391Q, 391R, 391V, 400D, 400E, 4001, 400K, 400L, 400N, 400Q, 400R, 400V, 416D, 416E, 4161, 416K, 416L, 416N, 416Q, 416R y 416V, tienen valores PI >0.5 tanto para la proteína como la actividad, y se esperan que sean combinables para afectar varias propiedades de los polipéptidos AmyE.

Mientras que muchas posiciones de los polipéptidos AmyE se pueden mutar, las posiciones 75, 97, 101, 102, 120, 123, 133, 137, 182, 266 y 306, de los polipéptido AmyE fueron restrictivas, en el sentido de que las mutaciones en esta posición disminuyeron generalmente el rendimiento. En particular, las posiciones 75 y 123 se determinaron que son completamente restrictivas para el rendimiento en una versión truncada del polipéptido precursor, mientras que las posiciones 75, 97, 101, 102, 120, 133, 137, 182, 266 y 306 se determinaron que son restrictivas para el rendimiento en una versión de longitud completa del polipéptido precursor.

Observar que si bien muchas mutaciones se listan en el contexto de grupos grandes y subgrupos, cada mutación es una entidad separada y cualquiera o más de las mutaciones identificadas se pueden incluir o excluir de un subgrupo adicional de mutaciones. Por consiguiente, la composición y métodos incluyen variantes AmyE que tiene una o más variantes descritas en este documento, o combinaciones de las mismas. 3. Producción de Polipéptidos AmyE Una secuencia de ADN que codifica un polipéptido AmyE se puede expresar, en forma de enzimas, usando un vector de expresión que incluye típicamente secuencias de control que codifican un promotor adecuado, operador, sitio de enlace al ribosoma, señal de iniciación de traducción, y, opcionalmente, un gen represor o varios genes activadores.

Los vectores que comprenden los ácidos nucleicos que codifican la AmyE o variantes del mismo también se proporcionan. Se proporcionan células hospederas que comprenden los vectores. La célula hospedera puede expresar el polinucleótido que codifica la variante AmyE. El hospedero puede ser una Bacillus sp., por ejemplo, B. subtilis. 3.1 Polinucleotidos y Vectores Aspectos de las presentes composiciones y métodos incluyen polinucleotidos que codifican polipéptidos AmyE, así como también vectores y células hospederas útiles para expresar polipéptidos AmyE basados en estos polinucleotidos. Los ácidos nucleicos que codifican polipéptidos AmyE incluyen, pero no se limitan a, los polinucleotidos de SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6, los cuales codifican la AmyE de SEQ ID NO: 1 y AmyE-tr (SEQ ID NO: 2), respectivamente, y variantes de los mismos. Los polinucleotidos representativos adicionales incluyen aquel de SEQ ID NO: 7, el cual codifica Amy31A (SEQ ID NO: 3) . La AmyE dada a conocer en NCBI Nos. de Acceso ABK54355, AAF14358, AAT01440, AAZ30064, NP_388186, AAQ83841 y BAA31528 se codifican similarmente por los polinucleótidos dados a conocer en las bases de datos accesibles al público, las secuencias que se incorporan en este documento a manera de referencia. Los ácidos nucleicos pueden ser secuencias de ADN, ARNm, o ADNc. Los ácidos nucleicos incluyen además secuencias degeneradas que corresponden a cualquiera de los ácidos nucleicos mencionados anteriormente. Las secuencias degeneradas se pueden diseñar para la expresión óptima al usar codones preferidos por un organismo hospedero particular.

El vector de expresión recombinante que lleva la secuencia de ADN que codifica polipéptidos AmyE (incluyendo variantes) puede ser cualquier vector que se puede someter convenientemente a procedimientos de ADN recombinante, y la selección del vector dependerá frecuentemente de la célula hospedera dentro de la cual se va a introducir. De esta manera, el vector puede ser un vector autónomamente replicante, es decir, un vector que existe como una entidad, extracromosomal , la replicación del cual es independiente de la replicación cromosomal, por ejemplo, un plásmido, un bacteriófago o un elemento extracromosomal, minicromosoma o un cromosoma artificial. Alternativamente, el vector puede ser uno el cual, cuando se introduce en una célula hospedera, se integra dentro del genoma de la célula hospedera y se replica junto con el (los) cromosoma (s) dentro de los cuales se ha integrado. El gen integrado también se puede amplificar para crear múltiples copias del gen en el cromosoma mediante el uso de un constructo amplificable conducido por la selección de antibióticos u otro procedimiento selectivo, tal como un gen regulador esencial o mediante la complementación de un gen de ruta metabólica esencial.

Un vector de expresión incluye típicamente los componentes de un vector de clonación, por ejemplo, un elemento que permite la replicación autónoma del vector en el organismo hospedero seleccionado y uno o más marcadores fenotípicamente detectables para propósitos de selección. El vector de expresión comprende normalmente las secuencias de nucleótidos de control que codifican un promotor, operador, sitio de enlace al ribosoma, señal de iniciación de traducción y opcionalmente un gen represor o uno o más genes activadores. En un aspecto, todas las secuencias de señal usadas fijan como objetivo el material al medio de cultivo celular para la fácil recolección de enzimas y opcionalmente purificación. Los procedimientos usados para ligar el constructo de ADN que codifica una AmyE o variante del mismo, el promotor, combinador y otros elementos, respectivamente, y para insertarlos dentro de los vectores adecuados que contienen la información necesaria para la replicación, son bien conocidos por las personas expertas en el campo (véase por ejemplo, Sambrook y colaboradores, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2da ed., Cold Spring Harbor, 1989 y 3ra ed. , 2001) .

En el vector, la secuencia de ADN se debe conectar operablemente a una secuencia de promotor adecuada. El promotor puede ser cualquier secuencia de ADN que muestre actividad transcripcional en la célula hospedera de selección y se puede derivar de genes que codifican proteínas ya sea homologas o heterólogas a la célula hospedera. Los promotores adecuados para dirigir la transcripción de la secuencia de ADN que codifica un AmyE o variante del mismo, especialmente en un hospedero bacteriano, incluyen varios promotores derivados de Bacillus, tal como un promotor de a-amilasa derivado de B. subtilis, B. licheniformis, B. stearothermophilus, o B. amyloliquefaciens, el promotor del operón lac de E. coli, los promotores dagA o celA del gen de agarasa de promotores de Streptomyces coelicolor, y los promotores de los genes xylA y xylB de Bacillus subtilis, etcétera. Para la transcripción en un hospedero fúngico, los ejemplos de promotores útiles son aquellos derivados del gen que codifica la TAKA-amilasa de Aspergillus oryzae, proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei, -amilasa neutra de Aspergillus niger, -amilasa estable en ácido de A. niger, glucoamilasa de A. niger, lipasa de Rhizomucor miehei, proteasa alcalina de A. oryzae, triosa fosfato-isomerasa de oryzae, o acetamidasa denidulans. Cuando el gen que codifica la AmyE o variante de la misma se expresa en una especie bacteriana tal como E. coli, un promotor adecuado se puede seleccionar, por ejemplo, de un promotor de bacteriófago que incluye un promotor T7 y un promotor lambda fago. Los ejemplos de promotores adecuados para la expresión en una especie de levadura incluyen pero no se limitan a los promotores Gal 1 y Gal 10 de Saccharomyces cerevisiae y los promotores AOXl o A0X2 de Pichia pastoris .

El vector de expresión también puede comprender un terminador de transcripción adecuado y, en eucariotas, secuencias de poliadenilación conectadas operablemente a la secuencia de ADN que codifica la variante de a-amilasa. Las secuencias de terminación y poliadenilación se pueden derivar adecuadamente de las mismas fuentes como el promotor. El vector puede comprender además una secuencia de ADN que permite que el vector se replique en la célula hospedera en cuestión. Ejemplos de estas secuencias son los orígenes de la replicación de los plásmidos pUC19, pACYClW, pUBUO, pE194, pAMBl, pICatH y pIJ702.

El vector también puede comprender un marcador seleccionable, por ejemplo, un gen el producto del cual complementa un defecto en la célula hospedera, tal como los genes de dal de B. subtilis o B. licheniformis, o un gen el , cual confiere resistencia a antibióticos, por ejemplo, ampicilina, canamicina, cloranfenicol o resistencia a la tetraciclina . Adicionalmente, el vector puede comprender marcadores de selección de Aspergillus tal como amdS, argB, niaD y xxsC, un marcador que da origen a la resistencia a la higromicina, o la selección se puede lograr mediante la co-transformación como es conocida en el campo. Véase, por ejemplo, el documento WO 91/17243. 3.2 Expresión del Polipéptido AmyE y Organismos Hospederos Es generalmente ventajoso si el polipéptido AmyE se secreta dentro del medio de cultivo, cuando se expresa en una célula hospedera. Para este fin, el polipéptido AmyE puede comprender una secuencia de señal que permite la secreción de la enzima expresada dentro del medio de cultivo. La secuencia de señal se puede codificar por el mismo gen como la AmyE. Por ejemplo, la AmyE expuesto en SEQ ID NO: 1 se expresan naturalmente con una secuencia de señal y aminoácidos N-terminal adicionales que tienen la secuencia de MFAKRFKTSLLPLFAGFLLLFHLVLAGPAAASAETA KSNE (SEQ ID NO: 9) . La secuencia de señal puede ser alternativamente una secuencia de señal de B. subtilis sp . De un AmyE diferente o aún una proteína diferente. Además, la secuencia de señal puede ser de una especie diferente, por ejemplo, 23. licheniformis. La secuencia de señal se puede seleccionar para proporcionar la expresión óptima de la AmyE o variante de la misma en una célula hospedera particular, por ejemplo. La AmyE madura se puede producir como un resultado de la escisión proteolítica de las secuencias adicionales de la N-terminal que no son secuencias de señal. Por ejemplo, una secuencia de señal de 31 residuos de aminoácido de B. licheniformis ("secuencia líder LAT") se puede fusionar el marco con una secuencia AmyE . Por ejemplo, un ácido nucleico que codifica AmyE se enlaza operablemente a una secuencia de señal de B. licheniformis en el vector de expresión mostrado en la FIGURA 2.

Una célula aislada, ya sea que comprende un constructo de ADN o un vector de expresión, se usa ventajosamente como una célula hospedera en la producción recombinante de un AmyE o variante del mismo. La célula se puede transformar con el constructo de ADN que codifica la AmyE o variante del mismo, opcionalmente al integrar el constructo de AND (en una o más copias) en el cromosoma hospedero. Esta integración se considera generalmente que es una ventaja ya que la secuencia de AND es más probable que se mantenga estable en la célula. La integración de los constructos de ADN dentro del cromosoma hospedero se puede realizar de acuerdo con métodos convencionales, por ejemplo, mediante recombinación homologa o heteróloga. Alternativamente, la célula se puede transformar con un vector de expresión como se describe anteriormente en relación con los diferentes tipos de células hospederas .

Ejemplos de organismos hospederos bacterianos adecuados son especies bacterianas Gram positivas tal como Bacillaceae, incluyendo B. subtilis, B. licheniformis, B. lentus, B. brevis, B. stearothermophilus, B. alkalophilus, B. a yloliquefaciens, B. coagulans, B. lautus, B. megaterium, y B. thuringiensis; Streptomyces spp . , tal como S. murinus; especies bacterianas de ácido láctico que incluyen Lactococcus spp., tal como L. lactis; Lactobacillus spp., incluyendo L. reuteri; Leuconostoc spp.; Pediococcus spp.; y Streptococcus spp. Aún otros hospederos útiles incluyen Bacillus spp. A 7-7, por ejemplo. Alternativamente, las cepas de las especies bacterianas Gram negativas que pertenecen a Enterobacteriaceae , que incluyen E. coli, o a Pseudomonadaceae se pueden seleccionar como el organismo hospedero .

Un organismo hospedero de levadura adecuado se puede seleccionar de especies de levaduras biotecnológicamente relevante, tales como, pero no se limitan a, Pichia spp., Hansenula spp., Kluyveromyces spp., Yarrowinia spp., Saccharomyces spp., incluyendo S. cerevisiae, o especies que pertenecen a Schizosaccharomyces, tal como S. pombe . Una cepa de la especie de levadura metilotrófica de Pichia pastoris se puede usar como el organismo hospedero. Alternativamente, el organismo hospedero puede ser un Hansenula spp. Los organismos hospederos adecuados entre hongos filamentosos incluyen especies de Aspergillus, por ejemplo, A. niger, A. oryzae, A. tubigensis, A. awamori, o A. nidulans . Alternativamente, una cepa de Fusarium spp., por ejemplo, Fusarium oxysporum o Rhizomucor spp. , tal como R. miehei, se puede usar como el organismo hospedero. Otras levaduras adecuadas incluyen Thermomyces spp. y ucor spp. Las células fúngicas se pueden transformar mediante un proceso que implica la formación de protoplastos y la transformación de los protoplastos seguido por la regeneración de la pared celular de una manera conocida en el campo. Un procedimiento adecuado para transformar células hospederas de Aspergillus, por ejemplo, se describe en el documento EP 238023.

Un aspecto de las presentes composiciones y métodos es un método para producir una variante AmyE, el método que comprende cultivar una célula hospedera como se describe anteriormente bajo condiciones propicias para la producción de la variante y recuperación de la variante de las células y/o el medio e cultivo. El medio usado para cultivar las células puede ser cualquier medio convencional adecuado para desarrollar la célula hospedera en cuestión y obtener la expresión de la variante AmyE. Medios adecuados y componentes de medios son disponibles de proveedores comerciales o se pueden preparar de acuerdo con recetas publicadas, por ejemplo, como se describen en los catálogos de la Recolección de Cultivo de Tipo Americano (ATCC) . Los medios de cultivo ejemplares incluyen, pero no se limitan, aquellos para fermentaciones alimentadas por lotes realizadas en un termentador de tanque agitado de tres mil litros (3,000 L) .

El medio de crecimiento en ese caso puede consistir de sólidos remojados de maíz y harina de soya como fuentes de compuestos orgánicos, junto con sales orgánicas como una fuente de sodio, potasio, fosfato, magnesio y sulfato, así como también elementos trazas. Típicamente, una fuente de carbohidratos tal como glucosa también es parte del medio de inicial. Una vez que el cultivo se ha establecido por sí mismo y comienza a desarrollarse, el carbohidrato se mide dentro del tanque para mantener el cultivo como es conocido en el campo. Las muestras se remueven del termentador en intervalos regulares para medir el título de la enzima que usa, por ejemplo, un método de ensayo colorimétrico . El proceso de fermentación se detiene cuando la velocidad de producción de enzimas detiene el incremento de acuerdo con las mediciones.

Los polipéptidos AmyE secretados de las células hospederas se pueden recuperar convenientemente del medio de cultivo mediante procedimientos bien conocidos, que incluyen separar las células del medio por centrifugación o filtración, y precipitar los componentes proteínicos del medio por medio de una sal tal como sulfato de amonio, seguido por el uso de procedimientos cromatográficos tal como cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad, o las similares.

Las células hospederas se pueden cultivar bajo condiciones adecuadas que permiten la expresión de los polipéptidos AmyE . La expresión de las proteínas puede ser constitutiva tal que se producen continuamente o inducible, que requieren un estímulo para iniciar la expresión. En el caso de la expresión inducible la producción de proteínas se puede iniciar cuando sea requerido por la adición de una sustancia inducitora, por ejemplo, dexametasona, IPTG, o Sefarosa, al medio de cultivo, por ejemplo. Los polipéptidos también se pueden producir recombinantemente en un sistema sin células in vitro, tal como el sistema de reticulocitos de conejo TnTMR (Promega) .

Un hospedero para expresar unos polipéptidos AmyE se puede cultivar bajo condiciones aeróbicas en el medio apropiado para el hospedero. Se puede proporcionar agitación o una combinación de agitación y aireación, con la producción que ocurre a la temperatura apropiada para ese hospedero, por ejemplo, de aproximadamente 30?C a aproximadamente 75°C, dependiendo de las necesidades del hospedero y la producción de la variante a-amilasa deseadas. El cultivo puede ocurrir de aproximadamente 12 a aproximadamente 100 horas o mayor (y cualquier valor de hora entre las mismas) o más particularmente de 24 a 72 horas. Típicamente, el caldo de cultivo está en un pH de aproximadamente 5.5 a aproximadamente 8.0, nuevamente dependiendo de las condiciones del cultivo necesarias para la célula hospedera relativa a la producción de la variante AmyE .

La actividad amilolítica de la enzima expresada se puede determinar usando, por ejemplo, almidón de papa como substrato. Este método se basa en la descomposición del almidón de papa modificado por la enzima, y la reacción se sigue al mezclar las muestras de la solución de almidón/enzimas con una solución de yodo. Inicialmente , se forma un color azul negruzco, pero durante la descomposición del almidón el color azul se debilita y se vuelve gradualmente un café rojizo, el cual se comparar con un vidrio coloreado estándar.

Los polipéptidos AmyE se pueden expresar como una proteína de expresión que comprende secuencias en la N-y/o C-terminal de la forma madura de la AmyE que facilita la expresión, detección y/o purificación, por ejemplo, una secuencia de señal o una etiqueta de His. Esta secuencia incluye una secuencia de señal, la cual facilita la secreción y expresión de la AmyE en un organismo hospedero. Los residuos de aminoácidos adicionales se puede escindir de la N-terminal de un AmyE, después de la escisión de la secuencia de señal, como se planteó por Yang y colaboradores , "Nucleotide sequence of the amilasa gene from Bacillus subtilis," Nucleic Acids Res. 11: 237-49 (1983). 4. Purificación de Polipeptidos AmyEs En algunos casos, se pueden usar métodos convencionales a fin de preparar polipéptidos AmyE purificados. Después del crecimiento en un organismo hospedero en el cultivo, se obtiene un caldo de crecimiento (o "fermentación"), y las células microbianas y varios sólidos suspendidos, que incluyen materias primas de fermentación residuales, se remueven mediante técnicas de separación convencionales para obtener una solución de amilasa. La filtración, centrifugación, microfiltración, filtración de tambor giratorio en vacío, seguido por ultrafiltración, extracción o cromatografía, o los similares se usan generalmente.

Es generalmente deseable concentrar la solución que contiene la AmyE expresada o variante del mismo para optimizar la recuperación, puesto que el uso de soluciones no concentradas requiere un tiempo de incubación incrementado para recolector los precipitados que contienen enzima purificada. La solución se concentra usando técnicas convencionales hasta que el nivel de enzima deseado se obtenga. La concentración de la solución que contiene enzimas se pueden lograr mediante ' cualquiera de las técnicas planteadas anteriormente. En una modalidad, se usa la evaporación por vacío giratoria y/o ultrafiltración. Alternativamente, se puede usar la ultrafiltración .

La precipitación se puede realizar usando, por ejemplo, un agente de precipitación de haluro de metal. Los agentes de precipitación de haluro de metal incluyen: cloruros de metal alcalino, bromuros de metal alcalino y mezclas de dos o más de estos haluros de metal. El haluro de metal se puede seleccionar del grupo que consiste de cloruro de sodio, cloruro de potasio, bromuro de sodio, bromuro de potasio y mezclas de dos o más de estos haluros de metal . Los haluros de metal adecuados incluyen cloruro de sodio y cloruro de potasio, particularmente cloruro de sodio, los cuales se pueden usar adicionalmente como un conservador. La selección de condiciones de la precipitación para la recuperación máxima, que incluyen tiempo de incubación, pH, temperatura y concentración de la AmyE o variante de la misma, serán fácilmente evidentes para una persona de experiencia ordinaria en el campo después de la prueba de rutina.

Generalmente, por lo menos aproximadamente 5% p/v (peso/volumen) a aproximadamente 25% p/v de haluro de metal se agrega a la solución variante de enzimas concentrada, y usualmente por lo menos 8% p/v. Generalmente, no más de aproximadamente 25% p/v de haluro de metal se agregan a la solución variante de enzimas concentradas y usualmente no más de aproximadamente 20% p/v. La concentración óptima del agente de precipitación de haluro de metal dependerá, entre otros, en la naturaleza de la AmyE específica o variante de la misma y su concentración en solución.

Una alternativa para efectuar la precipitación de la enzima es el uso de compuestos orgánicos, los cuales se pueden agregar a la solución variante de enzimas concentrada. El agente de precipitación de compuesto orgánico puede incluir: ácido 4-hidroxibenzoico, sales de metal alcalino de ácido 4-hidroxibenzoico, ésteres de alquilo de ácido 4-hidroxibenzoico y mezclas de dos o más de estos compuestos orgánicos. La adición de los agentes de precipitación de compuesto orgánico puede tomar lugar antes de, simultáneamente con o subsecuente a la adición del agente de precipitación de haluro de metal, y la adición de ambos agentes de precipitación, compuesto orgánico y haluro de metal, se puede llevar a cabo secuencial o simultáneamente. Para descripciones adicionales, véase, por ejemplo, la Patente de E.U.A. No. 5,281,526 de Danisco A/S, por ejemplo.

Generalmente, los agentes de precipitación de compuesto orgánico se seleccionan del grupo que consiste de sales de metal alcalino de ácido 4-hidroxibenzoico, tal como sales de sodio o potasio, y ésteres de alquilo lineales o ramificados de ácido 4-hidroxibenzoico, en donde el grupo alquilo contiene de 1 a 12 átomos de carbono, y mezclas de dos o más de estos compuestos orgánicos. Los agentes de precipitación de compuesto orgánico por ejemplo pueden ser ésteres de alquilo lineales o ramificados de ácido 4-hidroxibenzoico, en donde el grupo alquilo contiene de 1 a 10 átomos de carbono, y mezclas de dos o más de estos compuestos orgánicos. Compuestos orgánicos adecuados incluyen ésteres de alquilo lineales de ácido 4-hidroxibenzoico, en donde el grupo alquilo contiene de 1 a 6 átomos de carbono, y mezclas de dos o más de estos compuestos orgánicos. Ésteres metílicos de ácido 4-hidroxibenzoico, éster propílico de ácido 4-hidroxibenzoico, éster butílico de ácido 4-hidroxibenzoico, éster etílico del ácido 4-hidroxibenzoico y mezclas de dos o más de estos compuestos orgánicos también se pueden usar. Compuestos orgánicos adicionales también incluyen pero no se limitan a, éster metílico de ácido 4-hidroxibenzoico (metil-PARABENO) y éster propílico del ácido 4-hidroxibenzoico (propil-PARABENO) , los cuales también son agentes conservadores de amilasa. Además de este agente de precipitación de compuesto orgánico proporciona la ventaja de alta flexibilidad de las condiciones de precipitación con respecto al pH, temperatura, concentración de enzima, concentración de agente de precipitación, y tiempo de incubación. Generalmente, por lo menos 0.01% p/v de agente de precipitación de compuesto orgánico se agrega a la solución variante de enzimas concentrada y usualmente por lo menos 0.02% p/v. Generalmente, no más de 0.3% p/v of de agente de precipitación de compuesto orgánico se agrega a la solución variante de enzimas concentrada y usualmente no más de 0.2% p/v.

La solución de enzima concentrada, que contiene el agente de precipitación de haluro de metal y, en un aspecto, el agente de precipitación de compuesto orgánico, se ajusta a un pH que dependerá necesariamente de la variante de enzima para ser purificado. Generalmente, el pH se ajusta a un nivel cercano al punto isoeléctrico (pl) de la amilasa. Por ejemplo, el pH se puede ajustar dentro de un intervalo de aproximadamente 2.5 unidades de pH abajo del pl a aproximadamente 2.5 unidades de pH arriba del pl . El pH se puede ajustar por consiguiente si el pl de la variante difiere del pl de tipo natural.

El tiempo de incubación necesario para obtener un precipitado de enzimas purificado depende del carácter de la enzima específica, la concentración de la enzima, y el (los) agente (s) de precipitación específico (s) y su (sus) concentración (es ) . Generalmente, el tiempo efectivo para precipitar la variante de enzima es entre aproximadamente 1 a aproximadamente 30 horas; usualmente no excede aproximadamente 25 horas. En presencia del agente de precipitación de compuesto orgánico, el tiempo de incubación aún se puede reducir a menor que aproximadamente 10 horas, y en la mayoría de casos aún aproximadamente 6 horas .

Generalmente, la temperatura durante la incubación es entre aproximadamente 4°C y aproximadamente 50°C. Usualmente, el método se lleva a cabo a una temperatura entre aproximadamente 10°C y aproximadamente 45°C, y particularmente entre aproximadamente 20°C y aproximadamente 40°C. La temperatura óptima para inducir la precipitación varía de acuerdo con las condiciones de solución y la enzima o agente(s) de precipitación (es) usado(s).

La recuperación general del precipitado de enzimas purificado, y la eficiencia con lo cual el proceso se conduce, se mejora al agitar la solución que comprende la enzima, el haluro de metal agregado y el compuesto orgánico agregado. La etapa de agitación se hace tanto durante la adición del haluro de metal como el compuesto orgánico, y la duración del período de incubación subsecuente. Métodos de agitación adecuados incluyen agitación mecánica, aireación vigorosa, o cualquier técnica similar.

La enzima purificada se puede purificar adicionalmente por técnicas convencionales de separación, tal como filtración, centrifugación, micro filtración, filtración por vacío giratoria, ultrafiltración, filtración por prensa, microfiltración de membrana cruzada, microfiltración de membrana de flujo cruzado, o los similares. La microfiltración de membrana cruzada puede ser un método usado. La purificación adicional del precipitado de enzimas purificado se puede obtener al lavar el precipitado con agua. Por ejemplo, el precipitado de enzimas purificado se puede lavar con agua que contiene el agente de precipitación de haluro de metal, por ejemplo, con agua que contiene el haluro de metal y los agentes de precipitación de compuesto orgánico .

Durante el cultivo, la enzima expresada se puede cumular en el caldo de cultivo. Para el aislamiento y purificación de la enzima expresada, el caldo de cultivo se puede centrifugar o filtrar para eliminar las células, y el líquido sin células resultante se puede usar para la purificación de la enzima. En una modalidad, el caldo sin células se somete a la salazón usando sulfato de amonio en una saturación de aproximadamente al 70%; la fracción de saturación-precipitación al 70% luego se disuelve en una solución amortiguadora y se aplica a una columna tal como una columna Sephadex G-100, y se eluye para recuperar la fracción activa de la enzima. Para purificación adicional, se puede usar un procedimiento convencional tal como cromatografía de intercambio iónico.

Las enzimas purificadas son útiles para todas las aplicaciones en las cuales las enzimas se usan generalmente. Por ejemplo, se pueden usar en detergentes para lavandería y removedores de manchas, en la industria alimenticia, en el procesamiento del almidón y orneado, y en composiciones farmacéuticas como auxiliares digestivos. Se pueden usar en un producto final que es ya sea líquida (solución, suspensión espesa) o sólido (granular, polvo) .

Alternativamente, el producto de enzimas se puede recuperar y se agrega un agente floculante al medio a fin de remover las células y los restos de células mediante filtración o centrifugación. Sin purificación adicional de la enzima.

Los polipéptido AmyE producidos y purificados mediante los métodos descritos anteriormente se pueden usar en una variedad de aplicaciones industriales útiles. Las enzimas poseen propiedades valiosas que facilitan las especificaciones relacionadas con el cuidado de telas y domésticos. (F&HC) . Por ejemplo, los polipéptidos AmyE se pueden usar como un componente en composiciones de lavado, de lavadoras de platos y detergentes de limpieza de superficies duras. Los polipéptidos AmyE también son útiles en la producción de edulcorantes y etanol de almidón, y/o para el desencolado textil. Los polipéptidos AmyE son particularmente útiles en procesos de conversión del almidón, que incluyen procesos de licuefacción y/o sacarificación del almidón, como se describe, por ejemplo, en el documento WO 2005/111203 y la Solicitud Publicada de E.U.S. No. 2006/0014265 (Danisco A/S) . Estos usos de los polipéptidos AmyE se describen con más detalle posteriormente. 5. Composiciones y Métodos de Uso de Polipéptidos AmyE 5.1. Composiciones y Métodos de Procesamiento del Almidón 5.1.1. Introducción Los polipéptidos AmyE se pueden usar para el procesamiento/conversión del almidón, lo cual es fundamental para producir edulcorantes, para producir alcohol para combustible o bebidas (es decir, alcohol potable) , para producir una bebida, para procesar azúcar de caña, o para producir compuestos orgánicos deseados. Por ejemplo, ácido cítrico, ácido itacónico, ácido láctico, ácido glucónico, cetonas, aminoácidos, antibióticos, enzimas, vitaminas, hormonas y los similares. La conversión del almidón implica generalmente la hidrólisis de una suspensión espesa de almidón gelatinizado granular en un hidrolizado de almidón soluble. Las convenciones de la conversión de almidón implica tres procesos enzimáticos consecutivos: un proceso de licuefacción, un proceso de sacarificación, y un proceso adicional para producir un producto deseado de la glucosa. Dependiendo del producto deseado, el proceso adicional puede ser isomerización, fermentación, y los similares. En el proceso para convertir almidón al jarabe de fructosa, el proceso adicional es isomerización., 5.1.2. Composiciones de almidón El almidón que se procesa puede ser obtenido de tubérculos, raíces, tallos, leguminosas, cereales o grano integral. Más específicamente, el almidón granular se puede obtener de maíces, mazorcas, trigo, cebada, centeno, sagú, yuca, tapioca, sorgo, arroz, chícharos, fríjol, plátano o papas. Se contemplan específicamente tipos tanto cerosos como 4 no cerosos de maíz y cebada. El almidón puede ser un almidón sumamente refinado de calidad, por ejemplo, por lo menos 90%, por lo menos 95%, por lo menos 97%, o por lo menos 99.5% puro. Alternativamente, el almidón puede ser un material que contiene almidón más crudo que comprende grano integral molido, que incluye fracciones no de almidón tal como residuos de germen y fibras. La materia prima, tal como grano integral, se muele para abrir la estructura y permitir el procesamiento adicional.

Son adecuados dos procesos de molienda: molienda húmeda y seca (trituración en seco) . En la molienda seca, los granos enteros se muelen y se usan. El grano molido seco puede incluir cantidades significativas de compuestos de carbohidratos no de almidón, además del almidón. Cuando este material heterogéneo se procesa por cocción a chorro, frecuentemente, se logra solo una gelatinización parcial del almidón. La molienda húmeda proporciona una buena separación del germen y harina (gránulos de almidón y proteínas) y se usa usualmente en la producción de jarabes. El proceso se puede conducir en un sistema de ultrafiltración donde el material retenido se mantiene bajo recirculación en presencia de enzimas, almidón crudo y agua, donde el material permeado es el hidrolizado de almidón soluble. El proceso también se puede conducir en un reactor de membrana continuo con membranas de ultrafiltración, donde el material retenido se mantiene bajo recirculación en presencia de enzimas, almidón crudo y agua, y donde el material permeado es el hidrolizado de almidón soluble. El proceso se puede conducir adicionalmente , en un reactor de membrana continuo con membranas de microfiltración y donde el material retenido se mantiene bajo recirculación en presencia de enzimas, almidón crudo y agua, y donde el material permeado es el hidrolizado de almidón soluble.

La suspensión espesa de almidón que se usa en cualquiera de los aspectos anteriores puede tener almidón granular con aproximadamente 20% a aproximadamente 55% de sólidos secos, almidón granula con aproximadamente 25% a aproximadamente 40% de sólidos secos, almidón granular con aproximadamente 30% a aproximadamente 35% de sólidos secos. La variante de enzima convierte el almidón soluble en un hidrolizado de almidón soluble del almidón granula en la cantidad de por lo menos 85%, por lo menos 86%, por lo menos 87%, por lo menos 88%, por lo menos 89%, por lo menos 90%, por lo menos 91 %, por lo menos 92%, por lo menos 93%, por lo menos 94%, por lo menos 95%, por lo menos 96%, por lo menos 97%, por lo menos 98%, o por lo menos 99%. 5.1.3. Licuefacción de Sacarificación Durante la etapa de licuefacción, las moléculas de almidón de cadena larga presentes en la suspensión espesa de almidón se degradan en moléculas ramificadas y lineales más cortas (maltodextrinas) por una a-amilasa. Las numerosas a-amilasas son comercialmente disponibles, que incluyen SPEZYME XtraMR (Genencor) y LiquozymeMr (Novozymes) .

El proceso de licuefacción se lleva a cabo generalmente a aproximadamente 105-110°C durante aproximadamente 5 a 10 minutos seguido por 1-2 horas a 95 °C. El pH de la licuefacción es típicamente entre aproximadamente 5.0 y aproximadamente 6.2, y usualmente arriba de 5.5. Para promover la estabilidad de la -amilasa bajo estas condiciones, se agrega típicamente 1 mM de calcio (40 ppm de iones de calcio libres) . Después de este tratamiento, la composición de almidón licuada contendrá grandemente dextrinas, y tendrá un "equivalente de dextrosa" (DE) de aproximadamente 10-15.

Después del proceso de licuefacción, las dextrinas se convierten típicamente, en una etapa de sacarificación separada, en dextrosa, mediante la adición de una glucoamilasa (por ejemplo, AMGMR) . Una enzima de desramificación, tal como una isoamilasa o una pululanasa (por ejemplo, PromozymeMr) también se puede agregar. Para preparar la etapa de sacarificación, el pH de la suspensión espesa se reduce típicamente a un valor abajo de aproximadamente 4.5, mientras que mantiene la temperatura a 95°C o más, tal que se desnaturaliza la oí-amilasa de licuefacción. La temperatura luego se reduce a aproximadamente 60 °C, y la glucoamilasa y una enzima de desramificación se agregan para afectar la producción de glucosa de las dextrinas. El proceso de sacarificación procede típicamente durante aproximadamente 24 a aproximadamente 72 horas. 5.1.4. Procesamiento Adicional de la Glucosa Producida mediante Sacarificación Después del proceso de sacarificación, el jarabe de dextrosa se puede convertir en jarabe con alto contenido de fructosa usando una glucosa isomerasa inmovilizada (tal como SweetzymeMr) , por ejemplo. En un aspecto, el hidrolizado de almidón soluble del proceso se somete a la conversión en jarabe basado en almidón con alto contenido de fructosa (HFSS) , tal como jarabe de maíz con alto contenido de fructosa (HFCS) . Esta conversión se puede lograr usando una glucosa isomerasa, particularmente una glucosa isomerasa in movilizada sobre un soporte sólido. Las isomerasas contempladas incluyeron los productos comerciales SweetzymeMr, IT (Novozymes A/S) ; G-zymeMr IMGI , y G-zyme G993MR, KetomaxMr, G-zyme G993MR, líquido G-zyme G993MR y GenSweetMR IGIMR. Mientras que el Ca2+ incrementa la estabilidad de las -amilasas convencionales, inhibe sumamente la actividad de la glucosa- isomerasa . De esta manera, el Ca2+ se remueve típicamente antes de la isomerización, por ejemplo, mediante el intercambio iónico, tal que el nivel de Ca2+ está abajo de 3-5 ppm. Este proceso es consumidor de tiempo y es costoso.

Alternativamente, la glucosa producida mediante sacarificación se usa para la fermentación para producir un producto de fermentación, por ejemplo, etanol, butanol, y otro compuesto descrito en este documento y conocido en el campo. Un proceso completo típico para producir etanol de material que contiene almidón mediante la fermentación comprende: (i) licuefacción del material que contiene almidón con una AmyE o variante de la misma; (ii) sacarificar la masa licuado obtenido; y (iii) fermentar el material obtenido en la etapa (ii) en presencia de un organismo de fermentación. Opcionalmente el proceso comprende además la recuperación del etanol. Durante la fermentación, el contenido de etanol alcanza por lo menos aproximadamente 7%, por lo menos aproximadamente 8%, por lo menos aproximadamente 9%, por lo menos aproximadamente 10% tal como por lo menos aproximadamente 11%, por lo menos aproximadamente 12%, por lo menos aproximadamente 13%, por lo menos aproximadamente 14%, por lo menos 15%, o por lo menos 16% de etanol.

Los procesos de sacarificación y fermentación se pueden llevar a cabo como un proceso de sacarificación y fermentación simultáneo (SSF) . Cuando la fermentación se lleva a cabo simultáneamente con la hidrólisis, la temperatura puede estar entre 30°C y 35°C, particularmente entre 31°C y 34°C. El proceso se puede conducir en un sistema de ultrafiltración donde el material retenido se mantiene bajo recirculación en presencia de enzimas, materia prima, levadura, nutrientes de levadura y agua donde el material permeado es un líquido que contiene etanol . También se contempla el proceso conducido en un reactor de membrana continuo con membranas de ultrafiltración y donde el material retenido se mantiene bajo recirculación en presencia de enzimas, materia prima, levadura, nutrientes de levadura y agua y donde el material permeado es un líquido que contiene etanol.

La glucosa producida mediante la sacarificación también se puede usar para la producción de un producto de fermentación tal como etanol, butanol, ácido cítrico, glutamato de monosodio, ácido glucónico, gluconato de sodio, gluconato de calcio, gluconato, glucon-delta-lactona, o eritorbato de sodio. 5.1.5. Ventajas de la ot-amilasa AmyE Los polipéptidos AmyE ofrecen varias desventajas cuando se usan en la hidrólisis del almidón, la cual los distingue de otras a-amilasas y permite la modernización de los métodos de hidrólisis del almidón. Primero, las dextrinas se pueden convertir en dextrosa por los polipéptidos AmyE bajo las mismas condiciones de reacción que son adecuadas para las glucoamilasas . Esto evita la necesidad de optimizar la mezcla de reacción (por ejemplo, suspensión espesa) pH y temperatura para una a-amilasa, y luego ajustar las condiciones de reacción para adaptarlas a un glucoamilasa, por ejemplo, al reducir el pH y/o la temperatura de la suspensión espesa. De esta manera, el uso de AmyE en la hidrólisis del almidón permite que la licuefacción y la sacarificación se realicen bajo las mismas condiciones de la suspensión espesa, eliminando en consecuencia una etapa en la hidrólisis del almidón.

En algunos casos, tanto la licuefacción como la sacarificación se pueden realizar en un pH individual entre aproximadamente 4-7, por ejemplo, aproximadamente 4-5, aproximadamente 4-6, aproximadamente 5-6, aproximadamente 5-7, y aproximadamente 6-7. Observar que el criterio del pH individual ignora cualquiera de los cambios menores del pH de la mezcla de reacción que ocurren durante la licuefacción o sacarificación, pero los cuales no implican a la adición de ácido o base para cambiar intencionalmente el pH de la mezcla de reacción. En algunos casos, tanto la licuefacción como la sacarificación se pueden realizar en un pH abajo del cual los procesos de licuefacción convencionales se realizan, por ejemplo, un pH de menor que aproximadamente 5.0, menor que aproximadamente 4.8, menor que aproximadamente 4.6, menor que aproximadamente 4.4, menor que aproximadamente 4.2, o aún un pH de aproximadamente 4.0. El uso de AmyE para la licuefacción también permite la inclusión de un porcentaje más alto de vinaza delgada en la composición de almidón usada para la licuefacción, por éjemplo, >50%, o aún >60% de la mezcla de reacción. En algunos casos, tanto la licuefacción como la sacarificación se pueden realizar en una temperatura de aproximadamente 20-105°C, por ejemplo, 60-85°C, o una temperatura que es de aproximadamente 10, 12, 14, 16, 18, o aún 20°C abajo de la temperatura de gelatinización del almidón (es decir, aproximadamente 75°C) . De manera importante, la licuefacción y la sacarificación se pueden realizar completamente sin un ajuste de pH de intervención. Alternativamente, donde el ajuste de pH es aún deseable entre la licuefacción y sacarificación, se puede realizar usando una cantidad reducida de ácido o base, comparado con la cantidad usada en un proceso convencional, introduciendo en consecuencia menos sal en la mezcla de reacción.

Además, los polipéptidos AmyE catalizan la descomposición de los azúcares complejos, tal como maltosa, maltotriosa, y maltoheptaosa , en la glucosa. Esta actividad enzimática se asocia convencionalmente con las glucoamilasas antes que con la a-amilasas. Esta actividad de los polipéptidos AmyE permite la hidrólisis del almidón a glucosa que se realiza ya sea en ausencia de una glucoamilasa separada, en presencia de una cantidad reducida de una glucoamilasa, s comparada con la cantidad requerida usando una a-amilasa convencional. De esta manera, el uso de polipéptidos AmyE en la hidrólisis del almidón permite que la licuefacción y la sacarificación se realicen simultáneamente si una enzima individual que funcione como tanto una o¡-amilasa como una glucoamilasa, eliminando en consecuencia o reduciendo la necesidad por enzimas separadas.

Los polipéptidos AmyE también requieren poco o nada de Ca2+ para la estabilidad, reduciendo o eliminando la necesidad de agregar Ca2+ a una reacción de licuefacción. Además, de evitar la etapa de agregar Ca2+, esto evita la necesidad de remover subsecuentemente Ca2+ de una suspensión espesa (por ejemplo, mediante intercambio iónico) antes de poner en contacto la suspensión espesa con una enzima tal como glucosa isomerasa, la cual es sensible a Ca2+. Evitando la remoción de Ca2+ se ahorra tiempo y costo y se incrementa la eficacia para producir un jarabe con alto contenido de fructosa.

Finalmente, los polipéptidos AmyE tienen una alta actividad hacia el almidón no gelatinizado, el cual puede ser recalcitrante a la actividad enzimática de las a-amilasas convencionales. Esto permite el uso de almidón molido en seco cocido a chorro para la licuefacción y sacarificación, donde el almidón molido en húmedo se prefiere generalmente para mejorar la eficacia de la inversión.

Se apreciará que la AmyE es adecuada para el uso en un proceso de licuefacción/sacarificación que está ligado a la fermentación, isomerización, o a cualquier otro proceso subsecuente, que incluye SSF. 5.1.6. Combinación de AmyE con Glucoamilasas y Otras Enzimas .

Los polipéptidos AmyE se pueden usar solos (por ejemplo, como únicamente la enzima amilolítica en el procesamiento de almidón) o se pueden combinar con otras a- o ß-amilasas, u otras enzimas para proporcionar un "cóctel" con un aspecto de actividad. Por ejemplo, el almidón se puede combinar en contacto con una o más enzimas seleccionadas del grupo que consiste de una a-amilasa fúngica (EC 3.2.1.1), una a-amilasa bacteriana, por ejemplo, una -amilasa de Bacillus o una o¡-amilasa no de Bacillus o una ß-amilasa (EC 3.2.1.2) . Otra enzima amilolítica o una enzima de desramificación, tal como una isoamilasa (EC 3.2.1.68) o unas pululanasas (EC 3.2.1.41) se pueden combinar con los polipéptidos AmyE. La isoamilasa hidroliza enlaces de ramificación OÍ- 1 , 6 -D-glucosídicos en amilopectina y ß-dextrinas límite y se puede distinguir de las pululanasas por la incapacidad de la isoamilasa de atacar el pululano y por la acción limitada de la isoamilasa sobre las a-dextrinas límite.

Las ß-amilasas son amilasas maltogénicas de exoacción, las cuales catalizan la hidrólisis de enlaces de 1,4-a-glucosídicos en amilosa, amilopectina, y polímeros de glucosa relacionados, liberando en consecuencia maltosa. Las ß-amilasas se han aislado de varias plantas y microorganismos (Fogarty y colaboradores, Progress in Industrial icrobiology, Vol . 15, páginas 112-115, 1979). Estas ß-amilasas son caracterizadas por tener temperaturas óptimas en el intervalo de 40°C a 65°C, y pH óptimo en el intervalo de aproximadamente 4.5 a aproximadamente 7.0. las ß-amilasas contempladas incluyen, pero no se limitan a, ß-amilasas de cebada Spezyme BBA 1500MR, Spezyme DBAMR, Optimalt MEMR, Optimalt BBAMR (Danisco A/S) ; y Novozym WBAMr (Novozymes A/S) .

Como se describe en este documento, los polipéptidos AmyE tienen actividad de glucoamilasa y se pueden usar en ausencia de una glucoamilasa separada. Alternativamente, las glucoamilasas se pueden agregar en una cantidad reducida comparada con aquella requerida para los métodos de hidrólisis del almidón convencionales. Preferiblemente, las glucoamilasas están presentes en una cantidad de no más de (es decir, menor que) 0.5 de unidad de actividad de glucoamilasa (AGU)/g DS (es decir, unidades de la actividad de glucoamilasa por gramo de sólidos secos), no más de 0.4 AGU/g DS, no más de 0.3 AGU/g DS, no más de 0.2 AGU/g DS, o aún no más de 0.1 AGU/g DS . Más generalmente, una glucoamilasa se puede agregar en una cantidad de 0.02-2.0 AGU/g DS o 0.1-1.0 AGU/g DS, aunque estos intervalos contemplan el uso de más glucoamilasa que es requerida en combinación con la AmyE. Debido a que lo los polipéptidos AmyE son activos en el mismo pH y temperatura como las glucoamilasas, los polipéptidos AmyE se pueden agregar antes o después de la adición de una glucoamilasa, o simultáneamente con una glucoamilasa, por ejemplo, por medio de un coctel que incluye tanto AmyE como una glucoamilasa. De esta manera, el orden y manera de adición de una a-amilasa y una glucoamilasa ya no es crítico, permitiendo una flexibilidad incrementada en los procesos de hidrólisis del almidón.

Las glucoamilasas (EC 3.2.1.3) se pueden derivar de un microorganismo o una planta. Existen varias glucoamilasas conocidas de origen fúngico y bacteriano. Las glucoamilasas bacterianas ejemplares son glucoamilasas de Aspergillus, en particular glucoamilasa Gl o G2 A. niger (Boel y colaboradores (1984), EMBO J. 3:1097-1102), o variantes de las mismas, tal como se da a conocer en los documentos WO 92/00381 y WO 00/04136; glucoamilasa de A. awamori (WO 84/02921); glucoamilasa de A. oryzae {Agrie. Biol . Chem. (1991) 55(4): 941-949), o variantes o fragmentos de las mismas. Las variantes de glucoamilasa de Aspergillus incluyen aquellas que potencial la estabilidad térmica: G137A y G139A (Chen y colaboradores (1996) Pro . Eng. 9:499-505); D257E y D293E/Q (Chen y colaboradores (1995) Prot. Eng. 8:575-582); N182 (Chen y colaboradores (1994) Biochem. J. 301:275-281); disulphide bonds, A246C (Fierobe y colaboradores (1996) Biochemistry, 35:8698-8704); and introduction of Pro residues in positions A435 and S436 (Li y colaboradores (1997) Protein Eng. 10:1199-1204). Otras glucoamilasas incluyen glucoamilasa de Trichoderma reesie (por ejemplo, SEQ ID NO: 3 de WO 2006/060062; TrGA) , glucoamilasas de Talaromyces, en particular derivadas de T. emersonii (WO 99/28448) , T. leycettanus (Patente de E.U.A. No. RE 32,153), T. duponti, o T. ther ophilus (Patente de E.U.A. No. 4,587,215). Las glucoamilasas bacterianas incluyen glucoamilasas del género Clostridium, en particular C. thermoamylolyticum (EP 135138) y C. thermohydrosulfuricum (WO 86/01831). Otras glucoamilasas adecuadas incluyen aquellas derivadas de Aspergillus oryzae, tal como una glucoamilasa que tiene 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, o aún 90% de homología a la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 2 en WO 00/04136. También son adecuadas glucoamilasas comerciales, tal como AMG 200L; AMG 300 L; SAN SUPERMR y AMG EMr (Novozymes) ; OPTIDEX 300Mr (Genencor División, Danisco US Inc.); AMIGASEMR y AMIGASE PLUSMr (de DSM) ; G-ZYME G900M (Enzyme Bio-Systems) ; y G-ZYME G990 ZRMR (glucoamilasa de A. niger y bajo contenido de proteasas) .

Las fitasas son enzimas capaces de descomponer el ácido fítico (fitato) encontrado en los granos y semillas de aceite. El fitato, así como también intermediarios en su degradación, se creen que estabilizan o de otra manera afectan adversamente las a-amilasas, reduciendo en consecuencia su eficiencia. Las fitasas que se pueden usar en combinación con a-amilasas variantes son capaces de hidrolizar el ácido fítico bajo condiciones definidas de las etapas de incubación y licuefacción. En algunas modalidades, la fitasa. es capaz de liberar por lo menos un fosfato inorgánico de un hexafosfato de inositol (ácido fítico) . Las fitasas se pueden agrupar de acuerdo con su preferencia para una posición específica del grupo de éster de fosfato en la molécula de fitato en la cual se inicia la hidrólisis, (por ejemplo, como 3-fitasas (EC 3.1.3.8) o como 6-fitasas (EC 3.1.3.26)). Un ejemplo típico de fitasa es mio-inositol-hexacifosfato-3 - fosfohidrolasa .

Las fitasas se pueden obtener de microorganismos tales como organismos fúngicos y bacterianos. Algunos de estos microorganismos incluyen, por ejemplo Aspergillus {por ejemplo, A. niger, A. terreus, A. ficum y A. fumigatus) , Myceliophthora (M. thermophila) , Talaromyces (T. thermophilus) Trichoderma spp (T. reesei) y Thermomyces (VIO 99/49740); También las fitasas son disponibles de la especie de Penicillium, por ejemplo, P. hordei (ATCC No. 22053) , P. piceum (ATCC No. 10519), o P. brevi -compactum (ATCC No. 48944). Véase, por ejemplo USP 6,475,762. Además, las fitasas son disponibles de Bacillus (por ejemplo, B. subtilis, Pseudomonas, Peniophora, E. coli, Citrobacter, Enterbacter y Buttiauxella (véase el documento O2006/043178) .

Son disponibles fitasas comerciales tales como NATUPHOSMR (BASF), RONOZYME® P (Novozymes A/S) , PHZYMEMR (Danisco A/S, Diversa) y FINASEMR (AB Enzymes) . El método para determinar la actividad de la fitasa microbiana y la definición de una unidad de fitasa se ha publicado por Engelen y colaboradores (1994) J. AOAC Int. 77:760 - 764. La fitasa puede ser una fitasa de tipo natural, una variante o fragmento de la misma.

Fitasas ejemplares se derivan de la especie de la bacteria Buttiauxiella. Buttiauxiella sp . incluye B. agrestis, B. brennerae, B. ferragutiase, B. gaviniae, B. izardii, B. noackiae, y B. warmboldiae. Las cepas de la especie Buttiauxella son disponibles de DSMZ, the Germán National Resource Center for Biological Material ( Inhoffenstrabe 7B, 38124 Braunschweig, DE) . La cepa Buttiauxella sp. Pl-29 depositada bajo el número de acceso NCIMB 41248 es un ejemplo de una cepa particularmente útil de la cual se puede obtener una fitasa. La fitasa puede ser BP de tipo natural, o variante de la misma (tal como BP-11) descrita en el documento O 06/043178, o una variante como se describe en la Publicación de Patente de E.U.A. No. US20080220498 , presentada el 6 de Marzo del 2007 (véase, por ejemplo, Tabla 1 y SEQ ID NO: 3) .

La fitasa también puede ser la variante BP-17 de Buttiauxiella, que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 17, mostrada posteriormente o una fitasa que tiene por lo menos 75%, por lo menos 80%, por lo menos 85%, por lo menos 88%, por lo menos 90%, por lo menos 91%, por lo menos 92%, por lo menos 93%, por lo menos 94%, por lo menos 95%, por lo menos 96%, por lo menos 97%, por lo menos 98% y aún por lo menos 99% de identidad de secuencia a la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 17.

La cantidad (dosificación) de fitasa usada en los procesos de incubación y/o licuefacción pueden estar en el intervalo de aproximadamente 0.001 a 50 FTU/g ds , (por ejemplo, en el intervalo de aproximadamente 0.01 a 25 FTU/g ds, aproximadamente 0.01 a 15 FTU/g ds, aproximadamente 0.01 a 10 FTU/g ds, aproximadamente 0.05 a 15 FTU/g ds, y aproximadamente 0.05 a 5.0 FTU/g.

Otras enzimas que se pueden usar en combinación con los polipéptidos AmyE incluyen lipasas, cutinasas, proteasas, celulasas/hemicelulasas , peroxidasa, pectinasa, pectina-liasas, lacasa, o combinaciones, de las mismas. En algunos casos se puede usar un dominio de enlace a carbohidratos del tipo dado a conocer en el documento O 98/22613. 5.2. Composiciones de Limpieza y de Lavavaj illas y Métodos Los polipéptidos AmyE se pueden formular en composiciones detergentes para el uso en la limpieza de platos y otras superficies duras. Estas composiciones pueden ser geles, polvos o líquidas. Las composiciones pueden incluir polipéptidos AmyE como las enzimas amiolíticas individuales en la composición. Alternativamente, la composición puede incluir otras/enzimas amilolíticas adicionales, otras enzimas de limpieza, y otros componentes, muchos de los cuales son comunes para composiciones de limpieza. La composición detergente de lavandería puede comprender adicionalmente una o más de otras enzimas, tal como una lipasa, una cutinasa, una proteasa, una celulasa, una peroxidasa, una pectinasa, una liasa de pectina y/o lacasa, o una combinación de los mismos.

Las composiciones detergentes para lavavaj illas incluyen generalmente uno o más tensioactivos , los cuales pueden ser aniónicos, no iónicos, catiónicos, anfotéricos o una mezcla de estos tipos. El detergente puede contener 0% a aproximadamente 90% en peso de un tensioactivo no iónico, tal como alcoholes de cadena recta propoxilados etoxilados con baja a nada de espumación.

Las composiciones detergentes líquidas pueden incluir propilenglicol . Los polipéptidos AmyE se pueden solubilizar en propilenglicol, por ejemplo, al hacerla circular en una solución de propilenglicol al 25% volumen/volumen que contiene 10% de cloruro de calcio.

Las composiciones detergentes para lavavaj illas pueden incluir sales constructoras de detergente de tipos inorgánicos y/u orgánicos. Los constructores de detergente se pueden subdividir en tipos que contienen fósforo y que no contienen fosforo. Las composiciones detergentes contienen usualmente de manera aproximada 1% a aproximadamente 90% de los constructores detergentes. Ejemplos de constructores detergentes alcalinos inorgánicos que contienen fósforo son sales solubles en agua, especialmente pirofosfatos de metal alcalino, ortofosfatos , y polifosfatos . Ejemplos de constructores detergentes alcalinos orgánicos que contienen fósforo son sales solubles en agua de fosfonatos. Ejemplos de constructores inorgánicos que no contienen fósforo son carbonatos, boratos y silicatos de metal alcalino solubles en agua, así como también los diversos tipos de silicatos de aluminio cristalinos o amorfos insolubles en agua, de los cuales las zeolitas son los mejores representantes conocidos.

Ejemplos de constructores orgánicos adecuados son el metal alcalino; amonio y amonio sustituido; citratos; succinatos; malonatos; sulfonatos de ácido graso; succinatos de carboximetoxi ; poliacetatos de amonio; carboxilatos; policarboxilatos ; aminopolicarboxilatos ; poliacetil carboxilatos; y polihidroxisulfonatos . Otros constructores orgánicos adecuados incluyen los polímeros y copolímeros de peso molecular más alto conocidos por tener propiedades constructoras, por ejemplo ácido poliacrílico apropiado, copolímeros dé ácido polimaléico y ácido poliacrílico/polimaléico, y sus sales.

Las composiciones de limpieza pueden contener agentes blanqueadores, por ejemplo, del tipo de cloro-bromo o el tipo de oxígeno. Ejemplos de blanqueadores de tipo de cloro/bromo inorgánicos son litio, sodio o hipoclorito de calcio, e hipobromito, así como también fosfato de trisodio clorado. Ejemplos de blanqueadores de tipo de cloro/bromo orgánicos son N-bromo- y N-cloro- imidas heterocíclicas tal como ácidos tricloroisocianúrico, tribromoisocianú ico , dibromoisocianúrico, y dicloroisocianúrico, y sales de los mismos con cationes de solubilización en agua tal como potasio y sodio. También son adecuados compuestos de hidantoína .

Las composiciones de limpieza pueden contener blanqueadores de oxígeno, por ejemplo en la forma de una persal inorgánica, opcionalmente con un precursor blanqueador o como un compuesto de peróxido ácido. Ejemplos típicos de compuestos blanqueadores de peróxido son perboratos de metal alcalino, tanto tetrahidratos como monohidratos , percarbonatos de metal alcalino, persilicatos y perfosfatos . Materiales activadores adecuados incluyen tetraacetiletilendiamina (TAED) y triacetato de glicerol. Sistemas de activación blanqueadores enzimáticos también pueden estar presentes, tal como perborato o percarbonato, triacetato de glicerol y perhidrolasa, como se da a conocer en el documento WO 2005/056783, por ejemplo.

Composiciones de limpieza pueden ser estabilizadas usando agentes estabilizantes convencionales para la(s) enzima (s), por ejemplo, un poliol tal como, por ejemplo, propilenglicol , una azúcar o un alcohol de azúcar, ácido láctico, ácido bórico o un derivado de ácido bórico (por ejemplo, un éster de borato aromático) . La composición de limpieza también puede contener otros ingredientes detergentes convencionales, por ejemplo, material desfloculante, material rellenador, depresores de espuma, agentes corrosión, agentes de suspensión de manchas, agentes secuestrantes, agentes de reposición anti -manchas, agentes deshidratantes, tintes, bactericidas, agentes fluorescentes, espesantes y perfumes .

Finalmente, los polipéptidos AmyE se pueden usar en detergentes para lavavaj illas convencionales, por ejemplo, en cualquiera de los detergentes descritos en las siguientes publicaciones de patente, con el entendimiento de que los polipéptidos AmyE se usan en lugar de, o además, las a-amilasas descritas en las siguientes patentes y solicitudes de patente publicadas: CA 2006687, GB 2200132, GB 2234980, GB 2228945, DE 3741617, DE 3727911, DE 4212166, DE 4137470, DE 3833047, DE 4205071, WO 93/25651, WO 93/18129, WO 93/04153, WO 92/06157, WO 92/08777, WO 93/21299, WO 93/17089, WO 93/03129, EP 481547, EP 530870, EP 533239, EP 554943, EP 429124, EP 346137, EP 561452, EP 318204, EP 318279, EP 271155, EP 271156, EP 346136, EP 518719, EP 518720, EP 518721, EP 516553, EP 561446, EP 516554, EP 516555, EP 530635, EP 414197, y las Patentes de E.U.A. Nos. 5,112,518; 5, 141, 664; y 5,240, 632.

Las composiciones detergentes que contienen polipéptido AmyE se pueden formular para operaciones de lavavaj illas a mano o de máquina . 5.3. Composiciones Detergentes para Lavandería y Métodos Los polipéptidos AmyE pueden ser un componente de una composición detergente para lavandería, por ejemplo, en la forma de un granulado no formador de polvo, un líquido estabilizado, una enzima protegida, o los similares. Los granulados no formadores de polvo se pueden producir, por ejemplo, como se describe en las Patentes de E.U.A. Nos. 4,106,991 y 4,661,452 y se pueden recubrir por métodos conocidos en el campo. Ejemplos de materiales de recubrimiento cerosos son productos de óxido de poli (etileno) ; (polietilenglicol, PEG) con pesos molares medios de 1,000 a 20,000; nonilfenoles etoxilados que tienen de 16 a 50 unidades de óxido de etileno; alcoholes grasos etoxilados en los cuales el alcohol contiene de 12 a 20 átomos de carbono y en los cuales hay 15 a 80 unidades de óxido de etileno; alcoholes grasos; ácidos grasos; y mono- y di- y triglicéridos de ácidos grasos. Ejemplos de materiales de recubrimiento formadores de película adecuados para la aplicación por las técnicas de lecho de fluido se describen en, por ejemplo, la patente de Gran Bretaña No. 1,483,591.

Preparaciones de enzima líquidas se pueden estabilizar al agregar un poliol tal como propilenglicol , una azúcar o alcohol de azúcar, ácido láctico o ácido bórico de acuerdo con los métodos establecidos. Otros estabilizadores de enzimas son conocidos en el campo. Las enzimas protegidas se pueden preparar de acuerdo con el método dado a conocer en los documentos US 5,879,920 (Danisco A/S) o EP 238216, por ejemplo. Los polioles se han reconocido por mucho tiempo como estabilizadores de proteínas así como también para mejorar la solubilidad de las proteínas. Véase, por ejemplo, Kaushik y colaboradores, J. Biol . Chem. 278: 26458-65 (2003) y referencias citadas en la misma; y M. Conti y colaboradores, J. Chromatography 757: 237-245 (1997) .

La composición detergente para lavandería puede estar en cualquier forma conveniente, por ejemplo, como geles, polvos, gránulos, pastas o líquidos. Un detergente líquido puede ser acuoso, que contiene típicamente hasta aproximadamente 70% de agua, y 0% a aproximadamente 30% de solvente orgánico, también puede estar en la forma de un tipo de gel compacto que contiene solo aproximadamente 30% de agua.

La composición detergente para lavandería incluye típicamente uno o más tensioactivos , los cuales pueden ser aniónicos, no iónicos (que incluyen . semi -polares) , catiónicos, o zwitteriónicos , o una combinación, de los mismos. Los tensioactivos están típicamente presentes en un nivel de 0.1% a 60% en peso. En algunos casos, el detergente contendrá usualmente 0% a aproximadamente 40% o a aproximadamente 50% de tensioactivos aniónico, tal como alquilbencensulfonato lineal; a-olefinsulfonato; sulfato de alquilo (sulfato de alcohol graso) (AS) ; etoxisulfato de alcohol (AEOS o AES) ; alcanosulfonatos secundarios (SAS) ; ésteres metílico de ácido graso Oí-sulfo; ácido alquil- o alquenilsuccínico ; o jabón. La composición también puede contener 0% a aproximadamente 40% de tensioactivo no iónico tal como etoxilato de alcohol (AEO o AE) , etoxilatos de alcohol carboxilados , etoxilato de nonilfenol, alquilpoliglicósido, alquildimetilaminóxido, monoetañolamida de ácido graso etoxilado, monoetanolamida de ácido graso, amida de ácido graso de polihidroxialquilo (como se describe en el documento WO 92/06154) , o derivados de N-acil-N-alquilo de glucosamina ( "glucamidas" ) .

La composición detergente para lavandería puede comprender adicionalmente una o más de otras enzimas, tal como una lipasa, una cutinasa, proteasa, una celulasa, una peroxidasa, una pectinasa, una pectina- liasa , una lacasa, y/u otra enzima amilolítica (por ejemplo, otra a-amilasa) , o una combinación, de las mismas. En algunos casos, la 2,6-ß-?-fructan-hidrolasa se puede incorporar en unas composiciones detergentes para lavandería y se pueden usar para la remoción/limpieza de biopelícula presente en textiles/lavandería doméstica y/o industrial.

El detergente para lavandería puede contener aproximadamente 1% a aproximadamente 65% de un constructor detergente o agente de complejo tal como zeolita, difosfato, trifosfato, fosfonato, citrato, ácido nitrilotriacético (NTA) , etilendiamintetraacético (EDTA) , dietilentriaminpentaacético (DTMPA) , ácido alquil- o alquenilsuccínico, silicatos solubles o silicatos en capas (por ejemplo, SKS-6 de Hoechst) . El detergente también puede ser no mejorado, es decir, esencialmente sin mejorador de detergente. Las enzimas se pueden usar en cualquier composición compatible con la estabilidad de la enzima. Las enzimas se pueden proteger contra componentes generalmente nocivos mediante formas conocidas de encapsulación, como mediante granulación o secuestración en hidrogeles, por ejemplo. Enzimas y específicamente alfa-amilasas ya sea con o sin los dominios de enlace al almidón no se limitan a aplicaciones de lavandería y de lavavaj illas , sino se pueden usar en limpiadores de superficie y producción de etanol de almidón o biomasa.

El detergente para lavandería puede comprender uno o más polímeros. Ejemplos incluyen carboximetilcelulosa (CMC), poli (vinilpirrolidona) (PVP) , polietilenglicol . (PEG) , alcohol poli (vinílico) (PVA) , policarboxilatos tales como poliacrilatos, copolímeros de ácido maleico/acrílico u copolímeros de lauril -metacrilato/ácido acrílico.

El detergente para lavandería puede contener un sistema blanqueador, el cual puede comprender una fuente de H202 tal como perborato o percarbonato combinado opcionalmente con un activador blanqueador de perácido, tal como TAED o nonanoiloxibencensulfonato (NOBS) . Alternativamente, el sistema blanqueador puede comprender peroxiácidos del tipo de amida, imida o sulfona, por ejemplo. El sistema blanqueador también puede ser un sistema blanqueador enzimático donde una perhidrolasa activa el peróxido, tal como aquel descrito en el documento WO 2005/056783.

Las enzimas de la composición detergente para lavandería que incluye polipéptidos AmyE se puede estabilizar usando agentes estabilizantes convencionales, por ejemplo, un poliol tal " como propilenglicol o glicerol; un azúcar o alcohol de azúcar; ácido láctico; ácido bórico o un derivado de ácido bórico, tal como un éster de borato . aromático; y la composición se puede formular como se describe, por ejemplo, en los documentos WO 92/19709 y WO 92/19708.

El detergente para lavandería también puede contener otros ingredientes detergentes convencionales tales como acondicionadores de telas que incluyen arcillas, refuerzos de espuma, supresores de jabonaduras, agentes anticorrosión, agentes de suspensión de manchas, agentes de sedimentación anti-manchas , tintes, bactericidas, abrillantadores ópticos, o perfume, por ejemplo. El pH (medido en solución acuosa en concentración de uso) es usualmente neutro o alcalino, por ejemplo, pH de aproximadamente 7.0 a aproximadamente 11.0, aunque los polipéptidos AmyE también trabajan en condiciones de pH bajo, como en el caso de la hidrólisis del almidón.

Uno o más polipéptidos AmyE pueden estar presentes en las composiciones de limpieza para lavandería en concentraciones empleadas en estas composiciones, por ejemplo, 0.00001-1.0 mg (calculada como proteína enzimática pura) de polipéptido AmyE por litro de licor de lavado. Composiciones detergentes ejemplares incluyen lo siguiente: (1) Una composición detergente formulada como un granulado que tiene una densidad en volumen de por lo menos 600 g/L que comprende alquilbencensulfonato lineal (calculado como ácido) de aproximadamente 7% a aproximadamente 12%; etoxisulfato de alcohol (por ejemplo, alcohol de 12 a 18 átomos de carbono, 1-2 óxido de etileno (EO) ) o sulfato de alquilo (por ejemplo, 16 a 18 átomos de carbono) de aproximadamente 1% a aproximadamente 4%; etoxilato de alcohol (por ejemplo, alcohol de 14 a 15 átomos de carbono, 7 EO) de aproximadamente 5% a aproximadamente 9%; carbonato de sodio (por ejemplo, Na2C03) de aproximadamente 14% a aproximadamente 20%; silicato soluble, de aproximadamente 2 a aproximadamente 6%; zeolita (por ejemplo, NaAlSi0 ) de aproximadamente 15% a aproximadamente 22%; sulfato de sodio (por ejemplo, Na2S04) de 0% a aproximadamente 6%; citrato de sodio/ácido cítrico (por ejemplo, C6H5Na307/C6H807) de aproximadamente 0% a aproximadamente 15%; perborato de sodio (por ejemplo, NaB03-H20) de aproximadamente 11% a aproximadamente 18%; TAED de aproximadamente 2% a aproximadamente 6%; carboximetilcelulosa (CMC) y de 0% a aproximadamente 2%; polímeros (por ejemplo, copolímero de ácido maleico/acrílico, PVP, PEG) 0-3%; enzimas (calculadas como enzima pura) 0.0001-0.1% de proteína; e ingredientes menores (supresores de jabonaduras, perfumes, abrillantador óptico, fotoblanqueador) 0-5%. (2) Una composición detergente formulada como un granulado que tiene una densidad en volumen de por lo menos 600 g/L que comprende alguilbencensulfonato lineal (calculado como ácido) de aproximadamente 6% a aproximadamente 11%; etoxisulfato de alcohol (por ejemplo, alcohol 12 a 18 átomos de carbono, 1-2 EO) o sulfato de alquilo (por ejemplo, 12 a 18 átomos de carbono) de aproximadamente 1% a aproximadamente 3%; etoxilato de alcohol (por ejemplo, 14 a 15 átomos de carbono, 7 EO) de aproximadamente 5% a aproximadamente 9%; carbonato de sodio (por ejemplo, Na2C03) de aproximadamente 15% a aproximadamente 21%; silicato soluble, de aproximadamente 1% a aproximadamente 4%; zeolita (por ejemplo, NaAlSi04) de aproximadamente 24% a aproximadamente 34%; sulfato de sodio (por ejemplo Na2S04) de aproximadamente 4% a aproximadamente 10%; citrato de sodio/ácido cítrico (por ejemplo, C6H5Na307/ C6H807) de 0% a aproximadamente 15%; carboximetilcelulosa (CMC) de 0% a aproximadamente 2%; polímeros (por ejemplo, copolímero de ácido maleico/acrílico, PVP, PEG) 1-6%; enzimas (calculado como proteína enzimática pura) 0.0001-0.1%; ingredientes menores (por ejemplo, supresores de jabonaduras, perfume) 0-5%. (3) Una composición detergente formulada como un granulado que tiene una densidad en volumen de por lo menos 600 g/L que comprende alquilbencensulfonato lineal (calculado como ácido) de aproximadamente 5% a aproximadamente 9%; etoxilato de alcohol (por ejemplo, alcohol de 12 a 15 átomo de carbono, 7 EO) de aproximadamente 7% a aproximadamente 14%; Jabón como ácido graso (por ejemplo, ácido grado de 16 a 22 átomos de carbono) de aproximadamente 1 a aproximadamente 3%; carbonato de sodio (como Na2C03) de aproximadamente 10% a aproximadamente 17%; silicato soluble, de aproximadamente 3% a aproximadamente 9%; zeolita (como NaAlSi04) de aproximadamente 23% a aproximadamente 33%; sulfato de sodio (por ejemplo, Na2S04) de 0% a aproximadamente 4%; perborato de sodio (por ejemplo, NaB03-H20) de aproximadamente 8% a aproximadamente 16%; TAED de aproximadamente 2% a aproximadamente 8%; fosfonato (por ejemplo, EDTMPA) de 0% a aproximadamente 1%; carboximetilcelulosa (CMC) de 0% a aproximadamente 2%; polímeros (por ejemplo, copolímeros de ácido maleico/acrílico, PVP, PEG) 0-3%; enzimas (calculado as proteína enzimática pura) 0.0001-0.1%; ingredientes menores (por ejemplo, supresores de jabonaduras, perfume, abrillantador óptico) 0-5%. (4) Una composición detergente formulada como un granulado que tiene una densidad en volumen de por lo menos 600 g/L que comprende alquilbencensulfonato lineal (calculado como ácido) de aproximadamente 8% a aproximadamente 12%; etoxilato de alcohol (por ejemplo, alcohol de 12 a 15 átomos de carbono, 7 EO) de aproximadamente 10% a aproximadamente 25%; carbonato de sodio (como Na2C03) de aproximadamente 14% a aproximadamente 22%; silicato soluble, de aproximadamente 1% a aproximadamente 5%; zeolita (por ejemplo, NaAlSi04) de aproximadamente 25% a aproximadamente 35%; sulfato de sodio (por ejemplo, Na2S04) de 0% a aproximadamente 10%; carboximetilcelulosa (CMC) de 0% a aproximadamente 2%; polímeros (por ejemplo, copolímero de ácido maleico/acrílico, PVP, PEG) 1-3%; enzimas (calculado como proteína enzimática pura) 0.0001-0.1%; e ingredientes menores (por ejemplo, supresores de jabonaduras, perfume) 0-5%. (5) Una composición detergente líquida" acuosa que comprende alquilbencensulfonato lineal (calculado como ácido) de aproximadamente 15% a aproximadamente 21%; etoxilato de alcohol (por ejemplo, alcohol de 12 a 15 átomos de carbono, 7' EO o alcohol de 12 a 15 átomos de carbono, 5 EO) de aproximadamente 12% a aproximadamente 18%; jabón como ácido graso (por ejemplo, ácido oleico) de aproximadamente 3% a aproximadamente 13%; ácido alquenilsuccínico (C12-i ) de 0% a aproximadamente 13%; aminoetanol de aproximadamente 8% a aproximadamente 18%; ácido cítrico de aproximadamente 2% a aproximadamente 8%; fosfonato de 0% a aproximadamente 3%; polímeros (por ejemplo, PVP, PEG) de 0% a aproximadamente 3%; borato (por ejemplo, B407) de 0% a aproximadamente 2%; etanol de 0% a aproximadamente 3%; propilenglicol de aproximadamente 8% a aproximadamente 14%; enzimas (calculado como proteína enzimática pura) 0.0001-0.1%; e ingredientes menores (por ejemplo, dispersantes, supresores de jabonaduras, perfume, abrillantador óptico) 0-5%. (6) Una composición detergente líquida estructurada acuosa que comprende alquilbencensulfonato lineal (calculado como ácido) de aproximadamente 15% a aproximadamente 21%; etoxilato de alcohol (por ejemplo, alcohol de 12 a 15 átomos de carbono, 7 EO, o alcohol de 12 a 15 átomos de carbono, 5 EO) 3-9%; jabón como ácido graso (por ejemplo, ácido oleico) de aproximadamente 3% a aproximadamente 10%; zeolita (como NaAlSi04) de aproximadamente 14% a aproximadamente 22%; citrato de potasio de aproximadamente 9% a aproximadamente 18%; borato (por ejemplo, B407) de 0% a aproximadamente 2%; carboximetilcelulosa (CMC) de 0% a aproximadamente 2%; polímeros (por ejemplo, PEG, PVP) de 0% a aproximadamente 3%; polímeros de anclaje (por ejemplo, copolímero lauril-metacrilato/ácido acrílico); relación molar 25:1, MW 3800) de 0% a aproximadamente 3%; glicerol de 0% a aproximadamente 5%; enzimas (calculado como proteína enzimática pura) 0.0001-0.1%; e ingredientes menores (por ejemplo, dispersantes, supresores de jabonaduras, perfume, abrillantador ópticos) 0-5% . (7) Una composición detergente formulada como un granulado que tiene una densidad en volumen de por lo menos 600 g/L que comprende sulfato de alcohol graso de aproximadamente 5% a aproximadamente 10%; monoetanolamida de ácido graso etoxilado de aproximadamente 3% a aproximadamente 9%; jabón como ácido graso 0-3%; carbonato de sodio (por ejemplo, Na2C03) de aproximadamente 5% a aproximadamente 10%; silicato soluble, de aproximadamente 1% a aproximadamente 4%; zeolita (por ejemplo, NaAlSi04) de aproximadamente 20% a aproximadamente 40%; sulfato de sodio (por ejemplo, Na2S04) de aproximadamente 2% a aproximadamente 8%; perborato de sodio (por ejemplo, NaB03-H20) de aproximadamente 12% a aproximadamente 18%; TAED de aproximadamente 2% a aproximadamente 7%; polímeros (por ejemplo, copolímeros de ácido maleico/acrílico, PEG) de aproximadamente 1% a aproximadamente 5%; enzimas (calculado como proteína enzimática pura) 0.0001-0.1%; e ingredientes menores (por ejemplo, abrillantador óptico, supresores de jabonaduras, perfume) 0-5%. (8) Una composición detergente formulada como un granulado que comprende alquilbencensulfonato lineal (calculado como ácido) de aproximadamente 8% a aproximadamente 14%; monoetanolamida de ácido graso etoxilado de aproximadamente 5% a aproximadamente 11%; jabón como ácido graso de 0% a aproximadamente 3%; carbonato de sodio (por ejemplo, Na2C03) de aproximadamente 4% a aproximadamente 10%; silicato soluble, de aproximadamente 1% a aproximadamente 4%; zeolita (por ejemplo, NaAlSi04) de aproximadamente 30% a aproximadamente 50%; sulfato de sodio (por ejemplo, Na2S04) de aproximadamente 3% a aproximadamente 11%; citrato de sodio (por ejemplo, C6H5Na307) de aproximadamente 5% a aproximadamente 12%; polímeros (por ejemplo, PVP, copolímeros de ácido maleico/acrílico, PEG) de aproximadamente 1% a aproximadamente 5%; enzimas (calculado como proteína enzimática pura) 0.0001-0.1%; e ingredientes menores (por ejemplo, supresores de jabonaduras, perfume) 0-5%. (9) Una composición detergente formulada como un granulado que comprende alquilbencensulfonato lineal (calculado como ácido) de aproximadamente 6% a aproximadamente 12%; tensioactivo no iónico de aproximadamente 1% a aproximadamente 4%; jabón como ácido graso de aproximadamente 2% a aproximadamente 6%; carbonato de sodio (por ejemplo, Na2C03) aproximadamente 14% a aproximadamente 22%; zeolita (por ejemplo, NaAlSi04) de aproximadamente 18% a aproximadamente 32%; sulfato de sodio (por ejemplo, Na2S0 ) de aproximadamente 5% a aproximadamente 20%; citrato de sodio (por ejemplo, C6H5Na307) de aproximadamente 3% a aproximadamente 8%; perborato de sodio (por ejemplo, NaB03-H20) de aproximadamente' 4% a aproximadamente 9%; activador de blanqueador (por ejemplo, NOBS o TAED) de aproximadamente 1% a aproximadamente 5%; carboximetilcelulosa (CMC) de 0% a aproximadamente 2%; polímeros (por ejemplo, policarboxilato o PEG) de aproximadamente 1% a aproximadamente 5%; enzimas (calculado como proteína enzimática pura) 0.0001-0.1%; e ingredientes menores (por ejemplo, abrillantador óptico, perfume) 0-5%. (10) Una composición detergente líquida acuosa que comprende alquilbencensulfonato lineal (calculado como ácido) de aproximadamente 15% a aproximadamente 23%; etoxisulfato de alcohol (por ejemplo, alcohol de 12 a 15 átomos de carbono, 2-3 EO) de aproximadamente 8% a aproximadamente 15%; etoxilato de alcohol (por ejemplo, alcohol de 12 a 15 átomos de carbono, 7 EO, o de 12 a 15 átomos de carbono, 5 EO) de aproximadamente 3% a aproximadamente 9%; jabón como ácido graso (por ejemplo, ácido laurico) de 0% a aproximadamente 3%; aminoetanol de aproximadamente 1% a aproximadamente 5%; citrato de sodio de aproximadamente 5% a aproximadamente 10%; hidrótropo (por ejemplo, toluensulfonato de sodio) de aproximadamente 2% a aproximadamente 6%; borato (por ejemplo, B40 ) de 0% a aproximadamente 2%; carboximetilcelulosa de 0% a aproximadamente 1%; etanol de aproximadamente 1% a aproximadamente 3%; propilenglicol de aproximadamente 2% a aproximadamente 5%; enzimas (calculado como proteína enzimática pura) 0.0001-0.1%; e ingredientes menores (por ejemplo, polímeros, dispersantes, perfume, abrillantador ópticos) 0-5%. (11) Una composición detergente líquida acuosa que comprende alquilbencensulfonato lineal (calculado como ácido) de aproximadamente 20% a aproximadamente 32%; etoxilato de alcohol (por ejemplo, alcohol de 12 a 15 átomos de carbono, 7 EO, o alcohol de 12 a 15 átomos de carbono, 5 EO) 6-12%; aminoetanol de aproximadamente 2% a aproximadamente 6%; ácido cítrico de aproximadamente 8% a aproximadamente 14%; borato (por ejemplo, B407) de aproximadamente 1% a aproximadamente 3%; polímero (por ejemplo, copolímero de ácido maleico/acrílico, polímero de anclaje, tal como copolímero lauril-metacrilato/ácido acrílico) de 0% a aproximadamente 3%; glicerol de aproximadamente 3% a aproximadamente 8%; enzimas (calculado como proteína enzimática pura) 0.0001-0.1%; e ingredientes menores (por ejemplo, hidrótropos, dispersantes, perfume, abrillantador ópticos) 0-5%. (12) Una composición detergente formulada como un granulado que tiene una densidad en volumen de por lo menos 600 g/L que comprende un tensioactivo no iónico (alquilbencensulfonato lineal, alquil-sulfato, a-olefinsulfonato, ásteres metílicos de ácido a-sulfo graso, alcanosulfonatos , jabón) de aproximadamente 25% a aproximadamente 40%; tensioactivo no iónico (por ejemplo, etoxilato de alcohol) de aproximadamente 1% a aproximadamente 10%; carbonato de sodio (por ejemplo, Na2C03) de aproximadamente 8% a aproximadamente 25%; silicato solubles, aproximadamente 5% a aproximadamente 15%; sulfato de sodio (por ejemplo, a2S04) de 0% a aproximadamente 5%; zeolita (NaAlSi04) de aproximadamente 15% a aproximadamente 28%; perborato de sodio (por ejemplo, NaB03'H20) de 0% a aproximadamente 20%; activador de blanqueador (TAED o NOBS) aproximadamente de 0% a aproximadamente 5%; enzimas (calculado como proteína enzimática pura) 0.0001-0.1%; ingredientes menores (por ejemplo, perfume, abrillantador ópticos) 0-3%. (13) Composiciones detergentes como se describen en las composiciones 1)-12) supra, en donde todo o parte del alquilbencensulfonato lineal se reemplaza por alquil-sulfato (Ci2-C18) . (14) Una composición detergente formulada como un granulado que tiene una densidad en volumen de por lo menos 600 g/L que comprende alquil-sulfato (Ci2-Ci8) de aproximadamente 9% a aproximadamente 15%; etoxilato de alcohol de aproximadamente 3% a aproximadamente 6%; amida de ácido graso de polihidroxialquilo aproximadamente 1% a aproximadamente 5%; zeolita (por ejemplo, NaAlSi04) de aproximadamente 10% a aproximadamente 20%; disilicato en capas (por ejemplo, SK56 de Hoechst) de aproximadamente 10% a aproximadamente 20%; carbonato de sodio (por ejemplo, Na2C03) de aproximadamente 3% a aproximadamente 12%; silicato soluble, de 0% a aproximadamente 6%; citrato de sodio de aproximadamente 4% a aproximadamente 8%; percarbonato de sodio de aproximadamente 13% a aproximadamente 22%; TAED de aproximadamente 3% a aproximadamente 8%; polímeros (por ejemplo, policarboxilatos y PVP) de 0% a aproximadamente 5%; enzimas (calculado como proteína enzimática pura) 0.0001-0.1%; e ingredientes menores (por ejemplo, abrillantador óptico, fotoblanqueador, perfume, supresores de jabonaduras) 0-5% . (15) Una composición detergente formulada como un granulado que tiene una densidad en volumen de por lo menos 600 g/L que comprende alquil -sulfato (Ci2-Ci8) de aproximadamente 4% a aproximadamente 8%; etoxilato de alcohol de aproximadamente 11% a aproximadamente 15%; jabón de aproximadamente 1% a aproximadamente 4%; zeolita MAP o zeolita A de aproximadamente 35% a aproximadamente 45%; carbonato de sodio (como Na2C03) de aproximadamente 2% a 1 aproximadamente 8%; silicato soluble, de 0% a aproximadamente 4%; percarbonato de sodio de aproximadamente 13% a aproximadamente 22%; TAED 1-8%; carboximetilcelulosa (CMC) de 0% a aproximadamente 3%; polímeros (por ejemplo, policarboxilatos y PVP) de 0% a aproximadamente 3%; enzimas (calculado como proteína enzimática pura) 0.0001-0.1%; e ingredientes menores (por ejemplo, abrillantador óptico, fosfonato, perfume) 0-3%. (16) Formulaciones detergentes como se describen en 1) -15) supra, las cuales contienen un perácido estabilizado o encapsulado, ya sea como un componente adicional o como un sustituto para sistemas blanqueadores ya especificados. (17) Composiciones detergentes como se describen supra en 1) , 3) , 7) , 9) y 12) , en donde el perborato se reemplaza por percarbonato. (18) Composiciones detergentes como se describen supra en 1), 3), 7), 9), 12), 14) y 15), el cual contiene adicionalmente un catalizador de manganeso. (19) Composición detergente formulada como un líquido detergente no acuoso que comprende un tensioactivo no iónico líquido tal como, por ejemplo, alcohol primario alcoxilado lineal, un sistema mejorador (por ejemplo, fosfato), una(s) enzima (s), y un álcali. El detergente también puede comprender un tensioactivo aniónico y/o un sistema blanqueador.

Las composiciones detergentes para lavandería que contienen polipéptido-AmyE se pueden formular como composiciones detergentes para lavandería de mano o de máquina, que incluyen composiciones aditivas para lavandería adecuadas para el pretratamiento de telas manchadas y composiciones suavizantes de telas con enjuague adicionado, o se pueden formular como composiciones detergente para uso en operaciones de limpieza de superficies duras domésticas generales .

Las composiciones detergentes pueden incluir 2,6-ß-?-fructan-hidrolasa, una o más enzimas a-amilasa adicionales, y una o más de otras enzimas de limpieza, tal como una proteasa, lipasa, cutinasa, carbohidrasa, celulasa, peptinasa, mananasa, arabinasa, galactanasa, xilanasa, oxidasa, lacasa, y/o peroxidasa, y/o combinaciones de las mismas. En general, las propiedades de la(s) enzima (s) seleccionada (s) debe ser compatible con el detergente seleccionado, (por ejemplo, pH-óptimo, compatibilidad con otros ingredientes enzimáticos y no enzimáticos, etcétera), y la(s) enzima (s) debe estar presente en cantidades efectivas.

Un aditivo detergente, es decir, un aditivo separado o un aditivo combinado, se pueden formular como un granulado, líquido, suspensión espesa, etcétera. Las formulaciones de aditivo detergentes granuladas adecuadas incluyen granulados no formadores de polvo.

Se contempla que en las composiciones detergentes, los polipéptidos AmyE se pueden agregar en una cantidad que corresponde a aproximadamente 0.01 a aproximadamente 100 mg de proteína enzimática por litro de licor de lavado, particularmente de manera aproximada 0.05 a aproximadamente 5.0 mg de proteína enzimática por litro de licor de lavado, o aún más particularmente en 0.1 a aproximadamente 1.0 mg de proteína enzimática por litro de licor de lavado. 5.4. Enzimas para el Uso en Combinación con Polipéptidos AmyE Como se describe, anteriormente, las composiciones de limpieza que contienen polipéptido AmyE pueden incluir una o más enzimas adicionales, tal como una proteasa, lipasa, cutinasa, cutinasa, carbohidrasa, celulasa, pectinasa, mananasa, arabinasa, galactanasa, xilanasa, oxidasa, lacasa, y/o peroxidasa, 2, d-ß-D-f uctan-hidrolasa, enzimas a-amilasa adicionales y combinaciones de las mismas. En general, las propiedades de la(s) enzima (s) seleccionada (s) debe ser compatible con el detergente seleccionado, (por ejemplo, pH óptimo, compatibilidad con otros ingredientes enzimáticos y no enzimáticos, etcétera), y la(s) enzima(s) debe estar presente en cantidades efectivas. Enzimas ejemplares se describen, posteriormente. Muchas de estas enzimas también se pueden usar en combinación con polipéptidos AmyE en composiciones diferentes a las composiciones de limpieza.

Proteasas : las proteasas adecuadas incluyen aquellas de origen animal, vegetal o microbiano. También son adecuados imitantes químicamente modificados o diseñados de proteínas. La proteasa puede ser una serina proteasa o una metaloproteasa, por ejemplo, una proteasa microbiana alcalina o una proteasa similar a tripsina. Ejemplos de proteasas alcalinas son subtilisinas , especialmente aquellas derivadas de Bacillus sp., por ejemplo, subtilisina Novo, subtilisina Carlsberg, subtilisina 309 {véase, por ejemplo, Patente de E.U.A. No. 6,287,841), subtilisina 147, y subtilisina 168 {véase, por ejemplo, el documento WO 89/06279). Ejemplos de proteasas similares a tripsina son tripsina (por ejemplo, de origen porcino o bovino) , y proteasas de Fusarium {véase, por ejemplo, los documentos WO 89/06270 y WO 94/25583) . Ejemplos de proteasas útiles también incluyen pero no se limitan a las variantes descritas en los documentos WO 92/19729 y WO 98/20115. Enzimas de proteasa comercialmente disponibles adecuadas incluyen AlcalaseMR, SavinaseMr, PrimaseMr, Duralase™, EsperaseMR, y KannaseMR (Novo Nordisk A/S) ; MaxataseMR, MaxacalWJ?, Maxapera™, Properasem, PurafectMR, Purafect OxPMR, FN2MR, y FN3MR (Danisco A/S) .

Lipasas : lipasas adecuadas incluyen aquellas de origen bacteriano o fúngico. Se incluyen mutantes químicamente modificados o diseñados de proteínas. Ejemplos de lipasas útiles incluyen, pero no se limitan a, lipasas de Jíumicola {Thermomyces sinónimo) , por ejemplo H. lanuginosa (T. lanuginosus) (véase, por ejemplo, los documentos EP 258068 y EP 305216) y H. insolens (véase, por ejemplo, el documento WO 96/13580) ; una lipasa de Pseudomonas (por ejemplo, de P. alcaligenes o P. pseudoalcaligen.es; véase, por ejemplo, el documento EP 218 272) , P. cepacia (véase, por ejemplo, el documento EP 331 376) , P. stutzeri (véase, por ejemplo, GB 1,372,034), P. fluorescens, cepa Pseudomonas sp . SD 705 (véase, por ejemplo, el documento WO 95/06720 y WO 96/27002) , P. wisconsinensis (véase, por ejemplo, el documento WO 96/12012) ; una lipasa de Bacillus (por ejemplo, de 23. subtilis ; véase, por ejemplo, Dartois y colaboradores Biochemica Biophysica Acta, 1131: 253-360 (1993)), B . stearothermophilus (véase, por ejemplo, JP 64/744992) , o B. pumilus (véase, por ejemplo, el documento WO 91/16422) . Variantes de lipasa adicionales contempladas para el uso en las formulaciones incluyen aquellas descritas, por ejemplo, en: los documentos WO 92/05249, WO 94/01541, WO 95/35381, WO 96/00292, WO 95/30744, WO 94/25578, WO 95/14783, WO 95/22615, WO 97/04079, WO 97/07202, EP 407225, y EP 260105. Algunas enzimas de lipasa comercialmente disponibles incluyen LipolaseMr y LipolaseMr Ultra (Novo Nordisk A/S) .

Poliesterasas : poliesterasas adecuadas incluyen, pero no se limitan a, aquellas descrita en el documento WO 01/34899 (Danisco A/S) y WO 01/14629 (Danisco A/S) , y se pueden incluir en cualquier combinación con otras enzimas planteadas en este documento.

Amilasas: las composiciones se pueden combinar con otras a-amilasas, tal como una a-amilasa. No variante. Estas pueden incluir amilasas comercialmente disponibles, tal como, pero no se limitan a DuramylMR, TermamylMR, FungamylMr y BANMR (Novo Nordisk A/S) , RapidaseMr, y PurastarMR (Danisco A/S) .

Celulasas : las celulasas se pueden agregar a las composiciones. Las celulasas adecuadas incluyen aquellas de origen bacteriano o fúngico. Se incluyen mutantes químicamente modificados o diseñados de proteínas. Las celulasas adecuadas incluyen celulasas de los géneros Bacillus, Pseudomonas, Humicola, Fusarium, Thielavia, Acremonium, por ejemplo, celulasas fúngicas producidas de Humicola insolens, Myceliophthora thermophila y Fusarium oxysporum dadas a conocer en las Patentes de E.U.A. Nos. 4,435,307; 5,648,263; 5,691,178; 5,776,757; y el documento WO 89/09259, por ejemplo. Celulasas ejemplares contempladas para el uso que tienen el beneficio del cuidado del color para los materiales textiles. Ejemplos de estas celulasas son celulasas descritas en los documentos EP 0495257; EP 531 372; WO 99/25846 (Danisco A/S), WO 96/34108 (Danisco A/S), WO 96/11262; WO 96/29397; y WO 98/08940, por ejemplo. Otros ejemplos son variantes de celulosa, tales como aquellas descritas en los documentos WO 94/07998; WO 98/12307; WO 95/24471; PCT/DK98/00299 ; EP 531 315; Patentes de E.U.A. Nos. 5,457,046; 5,686,593; y 5,763,254. Celulasas comercialmente disponibles incluyen CelluzymeMR y CarezymeMR (Novo Nordisk A/S) ; ClazinaseMR y PuradaxMR HA (Danisco A/S) ; y KAC-500(B)MR (Kao Corporation) .

Peroxidasas/Oxidasas : peroxidasas/oxidasas contempladas para el uso en las composiciones incluyen aquellas de origen de plantas, bacterianas o fúngicas. Se incluyen mutantes químicamente modificados o diseñados de proteínas. Ejemplos de peroxidasas útiles incluyen peroxidasas de Coprinus, por ejemplo, de C. cinereus , y variantes de las mismas como aquellas descritas en los documentos -WO 93/24618, O 95/10602, y WO 98/15257. Peroxidasas comercialmente disponibles incluyen GuardzymeMR (Novo Nordisk A/S) , por ej emplo . 5.5. Ensayos para Medir el Rendimiento de Limpieza de los Polipéptidos AmyE Ensayos ejemplares para medir el rendimiento de limpieza de los polipéptidos AmyE se describen posteriormente y en los ejemplos adjuntos. Un ensayo estándar que se puede usar para someter a prueba la eficacia de una composición de limpieza que comprende polipéptidos AmyE implica una prueba de muestra. Las muestras que tienen manchas de "resistencia" conocida sobre varios tipos de material son comercialmente disponibles (EMPA, St . Gallen, Suiza; wfk- -Testgewebe GmbH, Krefeld Alemania; or Center for Test Materials, Vlaardingen, Los Países Bajos) y/o se pueden hacer por el profesional (Morris y Prato, Textile Research Journal 52(4): 280-286 (1982)). Las muestras pueden comprender, por ejemplo, una tela que contiene algodón que contiene una mancha hecha por sangre/leche/tinta (BMI) , espinaca, pasto, o chocolate/leche/hollín. Una mancha BMI se puede fijar al algodón con 0.0003% a 0.3% de peróxido de hidrógeno, por ejemplo. Otras combinaciones incluyen pasto o espinaca fijas con 0.001% a 1% de glutaraldehído , gelatina y mancha de Coomassie fija con 0.001% a 1% de glutaraldehído, o chocolate, leche y hollín fijas con 0.001% a 1% glutaraldehído .

La muestra también se puede agitar durante la incubación con cualquiera de los polipéptidos AmyE y/o formulación detergente. Los datos de rendimiento de lavado son dependientes en la orientación de las muestras en los pocilios (horizontal contra vertical) , particularmente en la placa de 96 pocilios. Esto indicaría que el mezclado fue insuficiente durante el período de incubación. Aunque existe una variedad de manera para asegurar la agitación suficiente para la incubación, un soporte de placas en la dual la placa de microtítulo se intercala entre dos placas de aluminio se puede construir. Esto puede ser tan simple como la colocación, por ejemplo, de un sellador de placas adhesivo sobre los pocilios luego de sujetar las dos placas de aluminio a la placa de 96 pocilios con cualquier tipo de pinzas comercialmente disponibles, apropiadas. Luego se puede montar en un agitador de incubadora comercial. La agitación del agitador a aproximadamente 400 rpm de por resultado un mezclado muy eficiente, mientras que se evita eficientemente la fuga o contaminación cruzada por el soporte.

Se puede usar ácido trinitrobencensulfónico (TNBS) para cuantificar la concentración de grupos amino en el licor de lavado. Esto puede servir como una medida de la cantidad de proteína que se removió de la muestra {véase, por ejemplo, Cayot y Tainturier, Anal. Biochem. 249: 184-200 (1997)). Sin embargo, si un detergente o una muestra de enzima conduce a la formación de fragmentos de péptido inusualmente pequeños (por ejemplo, de la presencia de peptidasas en la muestra) , entonces se obtendrá una señal TNBS más grande, es decir, más "ruidosa" .

Otro medio para medir el rendimiento de lavado de sangre/leche/tinta que se basa en la liberación de tinta que se puede cuantificar al medir la absorbencia de licor de lavado. La absorbencia de puede medir en cualquier longitud de onda entre 350 y 800 nm, por ejemplo, 410 nm o 620 nm. El licor de lavado también se puede examinar para determinar el rendimiento del lavado en manchas que contienen pasto, espinaca, gelatina o tinción de Coomassie. Las longitudes de onda adecuadas para estas manchas incluyen 670 nm para espinaca y pasto y 620 nm para gelatina o Coomassie. Por ejemplo, una alícuota de licor de lavado (típicamente 100-150 µ?? de una microplaca de 96 pocilios, por ejemplo) se remueve y se reemplaza en una cubeta o microplaca de múltiples pocilios. Esta luego se coloca en un espectrofotómetro y la absorbencia se lee en una longitud de onda apropiada. El sistema también se puede usar para determinar una enzima adecuada y/o composición de detergente para el lavado de platos, por ejemplo, usando una mancha de sangre/leche/tinta sobre un substrato adecuado, tal como tela, plástico o cerámica.

En un ejemplo, una manca BMI se fija al algodón al aplicar 0.3% de peróxido de hidrógeno a la muestra de BMI/algodón durante 30 minutos a 25°C o al aplicar 0.03% de peróxido de hidrógeno a la muestra de BMI/algodón durante 30 minutos a 60°C. Las muestras más pequeñas de aproximadamente 6.3.4 mi (0.25 pulgadas) se cortan de la muestra de BMI/algodón y se colocan en los pocilios de una placa de microtítulo de 96 pocilios. Dentro de cada pocilio, se coloca una mezcla conocida de una composición detergente y una enzima, tal como una proteína variante. Después de colocar un sellador de placa adhesivo sobre la parte superior de la placa de microtítulo, la placa de microtítulo se sujeta a una placa de aluminio y se agita sobre un agitador orbital a aproximadamente 250 rpm durante aproximadamente 10 a 60 minutos. Al final de este tiempo, los sobrenadantes se transfieren a los pocilios en una nueva placa de microtítulo y se mide la absorbencia de la tinta a 620 nm. Esto se puede probar similarmente con manchas de espinaca o manchas de pasto fijas al algodón al aplicar 0.01% de glutaraldehído a la muestra de espinaca/algodón o a la muestra de pasto/algodón durante 30 minutos a 25°C. Lo mismo se puede hacer con manchas de chocolate, leche y/u hollín. 5.6. Composiciones de Desencolado de material Textiles y Métodos También se contemplan composiciones y métodos para tratar telas (por ejemplo, para desencolar un material textil) usando uno o más polipéptidos AmyE. Los polipéptidos AmyE se pueden usar en cualquier método para tratar telas conocido en el campo (véase, por e emplo, la Patente de E.U.A. No. 6,077,316) . Por ejemplo, el tacto y apariencia de una tela se puede mejorar usando un método que implica poner en contacto la tela con unos polipéptidos AmyE en solución, opcionalmente bajo presión.

Los polipéptidos AmyE se pueden aplicar durante o después de la tejedura de materiales textiles, durante la etapa de desencolado, o una o más etapas de procesamiento de telas adicionales. Durante la tejedura de los materiales textiles, los hilos se exponen a resistencia mecánica considerable. Antes de la tejedura sobre telares mecánicos, las hebras de urdimbre se recubren frecuentemente con almidón dimensionado o derivados de almidón a fin de incrementar su resistencia a la tensión y de evitar la descomposición. Los polipéptidos AmyE se pueden aplicar para remover este almidón de dimensionamiento o derivados de almidón. Después de que los textiles se han tejido, una tela puede proceder a una etapa de desencolado. Esto se puede seguir por una o más etapas de procesamiento de telas adicionales. El desencolado es el acto de remover el encolado de los materiales textiles. Después de la tejedura, el recubrimiento de encolado se debe remover antes del procesamiento adicional de la tela a fin de asegurar un resultado homogéneo y a prueba de lavada. Los polipéptidos AmyE luego se pueden usar en un método para desencolar la tela, que comprende hidrólisis enzimática del encolado por la acción de los polipéptidos AmyE.

Los polipéptidos AmyE se - pueden usar solos o con otros reactivos químicos de desencolado y/o enzimas de desencolado para desencolar las telas que incluyen telas que contiene algodón. Los polipéptidos AmyE se pueden usar adicionalmente en composiciones y métodos para producir una apariencia de lavado con piedras en la tela de mezclilla teñida con índigo y prendas. Para la manufactura de ropas, la tela se puede cortar y coser en ropas o prendas, las cuales se terminan más tarde. En particular, para la manufactura de jeans de mezclilla, se han desarrollado métodos de acabado enzimáticos diferentes. El acabado de la prende de mezclilla se inicia normalmente con una etapa de desencolado enzimático, durante el cual las prendas se someten a la acción de enzimas amilolíticas para proporcionar suavidad a la tela y hacen al algodón más accesible a las etapas de acabado enzimáticos subsecuente. Los polipéptidos AmyE se pueden usar en métodos para terminar prendas de mezclilla (por ejemplo, un "proceso de biolapidación" ) , desencolado enzimático y proporcionar suavidad a las telas, y/o proceso de acabado. 5.7. Composiciones y Métodos para Horneado y Preparación de Alimentos Los polipéptidos AmyE se pueden usar en composiciones y métodos para horneado y preparación de alimentos. Para el uso comercial y doméstico de la harina para horneado y producción de alimentos, es importante mantener un nivel apropiado de actividad de la a-amilasa en la harina. Un nivel de actividad que es muy alto puede dar por resultado un producto que es pegajoso y/o pastoso y no vendible. A la inversa, la harina con actividad de a-amilasa insuficiente no puede contener suficiente azúcar para la función de la lavadura apropiada, dando por resultado un pan desmenuzable , seco. Por consiguiente, los polipéptidos AmyE, solos o en combinación con otra(s) a-amilasa (s) , se pueden agregar a la harina para aumentar el nivel de la actividad de la a-amilasa endógena en la harina. Como se describe en este documento, los polipéptidos AmyE tienen una temperatura óptima en el intervalo de 30-90°C, 50-80°C, 55-75°C, o aún 60-70°C, lo cual los hace bien adecuados para aplicaciones de horneado y preparación de alimentos. La temperatura óptima de diferentes variantes AmyE se puede medir, por ejemplo, en una solución al 1% de almidón soluble en pH 5.5, o usando otros métodos descritos en este documento o conocidos en el campo.

Además del uso de granos y otros productos de plantas en el horneado los granos tales como cebada, avena, y trigo, así como también componentes de plantas, tal como maíz, lúpulos, y arroz, se usan para la elaboración de cerveza tanto comercial como doméstica. Los componentes usados en la elaboración de cerveza pueden ser no malteados o pueden ser malteados, es decir, parcialmente germinados, dando por resultado un incremento en los niveles de enzimas, que incluyen -amilasa. Para la elaboración de cerveza exitosa, los niveles adecuados de la actividad enzimática de la a-amilasa son necesarios para asegurar los niveles apropiados de azúcares para la fermentación. Los polipéptidos AmyE solos o en combinación con otra(s) -amilasa (s) , se puede agregar al extracto de malta o masa para mejorar la conversión del almidón. Como se describe en cualquier lugar en este documento, los polipéptidos AmyE exhiben actividad de glucoamilasa , permitiendo que la glucosa se genere de granos que contienen almidón sin el uso de una glucoamilasa adicional, o con una cantidad reducida de amilasa comparada con aquella requerida usando otras a-amilasas.

Los polipéptidos AmyE se pueden agregar adicionalmente solos o en combinación con otras amilasas para evitar o retardar el envejecimiento, es decir la firmeza de la migaja, de los productos horneados. La cantidad de polipéptido AmyE usado para la amilasa anti-envej ecimiento estará típicamente en el intervalo de 0.01-10 mg de la proteína enzimática por kg de harina, por ejemplo, 1-10 mg/kg. Las amilasas antienvejecimiento adicionales que se pueden usar en combinación con los polipéptidos AmyE incluyen una endoamilasa, por ejemplo, una endoamilasa bacteriana de de Bacillus . La amilasa adicional también puede ser una a-amilasa maltogénica (EC 3.2.1.133), por ejemplo, de Bacillus. La NovamylMr es una oí-amilasa maltogénica adecuada de la cepa B. stearothermophilus NCIB 11837 y se describe por Christophersen y colaboradores (1997) Starch, 50:39-45. Otros ejemplos de endoamilasas anti -envej ecimiento incluyen a-amilasas bacterianas derivadas de Bacillus, tales como B. lichenifor is o B. amyloliquefaciens y exoamilasas, tal como ß-amilasa, por ejemplo, de fuentes de plantas, tal como fríjol de soya, o de fuentes microbianas, tal como Bacillus .

Las composiciones de horneado que comprenden polipéptidos AmyE pueden incluir adicionalmente una fosfolipasa. La fosfolipasa puede tener actividad Ai o A2 para remover el ácido graso de los fosfolípidos , formando un liso-fosfolípido. La fosfolipasa puede o no tener la actividad de lipasa, es decir actividad sobre los triglicéridos . Típicamente tiene una temperatura óptima en el intervalo de 30-90°C, por ejemplo, 30-70°C. Las fosfolipasas agregadas pueden ser de origen animal, por ejemplo, de páncreas, por ejemplo, páncreas de bovino o porcino, veneno de víbora o veneno de abeja. Alternativamente, la fosfolipasa puede ser de origen microbiano, por ejemplo, de hongos filamentosos, levadura o bacterias, tal como el género o especie Aspergillus, A. niger; Dictyostelium, D. discoideum; Mucor, M. javanicus, M. mucedo, M. subtilissimus ; Neurospora, N. crassa; Rhizomucor, R. pusillus; Rhizopus, R. arrhizus, R. japonicus, R. stolonifer; Sclerotinia , S. libertiana; Trichophyton, T. rubrum; Whetzelinia, W. sclerotiorum; Bacillus , B. megaterium, B. subtilis ; Citrobacter, C. freundii ; Enterobacter, E. aerogenes, E. cloacae; Edwardsiella , E. tarda; Etwinia, E. herbicola ; Escherichia , E. coli; Klebsiella, K. pneumoniae; Proteus, P. vulgaris ; Providencia, P. stuartii ; Salmonella , S. typhimurium; Serratia , S. liquefasciens, S. marcescens ; Shigella , S. flexneri ; Streptomyces, S. violeceoruber; Yersinia , Y. enterocolitica ; Fusarium, F. oxysporum, cepa DSM 2672), por ej emplo .

Una fosfolipasa se puede agregar en una cantidad que mejore la suavidad del pan durante el período inicial después del horneado, particularmente las primeras 24 horas. La cantidad de fosfolipasa estará en el intervalo de 0.01-10 mg de la proteína enzimática por kg de harina, ejemplo, 0.1-5 mg/kg. La actividad de la fosfolipasa estará generalmente en el intervalo de 20-1,000 de Unidad de Lipasa (LU) /kg de harina, donde una unidad de Lipasa se define como la cantidad de enzima requerida para liberar 1 µ??? de ácido butírico por minuto a 30°C, pH 7.0, con goma arábiga como emulsionante y tributirina como substrato.

Las composiciones de la masa incluyen generalmente harina de trigo y/u otros tipos de harina, almidón tal como harina de maíz, almidón de maíz, harina de centeno, harina de avena, harina de soya, harina de sorgo, harina de papa, o almidón de papa. La masa puede ser fresca, congelada o pre-horneada . La masa puede ser una masa fermentada o una masa que se somete a fermentación. La masa se puede fermentar en varias formas, tal como al agregar agentes de fermentación químicos, por ejemplo, bicarbonato de sodio o al agregar un termentador, es decir, masa de fermentación. La masa también puede fermentarse al agregar un cultivo de levadura adecuado, tal como un cultivo de Saccharomyces cerevisiae (levadura de panadero) , por ejemplo, una cepa comercialícente disponible de 1S. cerevisiae .

La masa puede comprender además ingredientes de masa convencionales, por ejemplo, proteínas, tal como un polvo de leche, gluten y soya; huevos (ya se huevos enteros, yemas de huevo o claras de huevo); un oxidante, tal como ácido ascórbico, bromato de potasio, yodato de potasio, azodicarbonamida (ADA) o persulfato de amonio; un aminoácido tal como L-cisteína; un azúcar; o una sal, tal como cloruro de sodio, acetato de calcio, sulfato de sodio o sulfato de calcio. La masa puede comprender además grasa, por ejemplo, triglicéridos , tal como grasa granulada o manteca vegetal, y/o un emulsionante tal como mono- o diglicéridos , ásteres de ácido diacetil tartárico de mono o diglicéridos, ésteres de azúcar de ácidos grasos, ésteres de poliglicerol de ácidos grasos, ésteres de ácido láctico de monoglicéridos , ésteres de ácido acético de monoglicéridos, estearatos de polioxietileno, o lisolecitina . La masa también se puede hacer sin la adición de emulsionantes.

Opcionalmente , una enzima adicional se puede usar conjuntamente con la amilasa anti -enve ecimiento y la fosfolipasa. La enzima adicional puede ser una segunda amilasa (es decir, adicional) , tal como una amiloglucosidasa , una ß-amilasa, una ciclodextrina glucanotransferasa ; una peptidasa, en particular una exopeptidasa; una transglutaminasa ; una lipasa; una celulasa; una hemicelulasa , en particular una pentosanasa tal como xilanasa; a proteasa; una proteína disulfuro- isomerasa, por ejemplo, una proteína disulfuro- isomerasa como se describe en el documento O 95/00636; una glucanotransferasa; una enzima de ramificación (enzima de ramificación 1, 4 -a-glucano) ; una 4-o¡-glucanotransferasa (dextrina-glicosiltransferasa) ; o una oxidoreductasa, por ejemplo, una peroxidasa, una lacasa, una glucosa-oxidasa, una piranosa-oxidasa, una lipoxigenasa, una L-aminoácido-oxidasa o una carbohidrato-oxidasa . La enzima adicional puede ser de cualquier origen, que incluyen de mamífero y plantas, y particularmente de origen microbiano (bacteriano, de levadura o fúngicos) y se puede obtener mediante técnicas convencionales usadas en el campo.

La xilanasa es típicamente de origen microbiano, por ejemplo, derivado de una bacteria u hongo, tal como una cepa de Aspergillus, en particular de A. aculeatus, A. niger (por ejemplo, el documento WO 91/19782) , A. awamori (por ejemplo, el documento WO 91/18977), o A. tubigensis (por ejemplo, el documento WO 92/01793); de una cepa de Trichoderma, por ejemplo, T. reesei, o de una cepa de Humicola, por ejemplo, H. insolens (por ejemplo, el documento WO 92/17573) . PentopanMr y Novozym 384MR son preparaciones de xilanasa comercialmente disponibles producidas de Trichoderma reesei. La amiloglucosidasa puede ser una amiloglucosidasa de A. niger (tal como AMGMR) . Otros productos de amilasa útiles incluyen GrindamylMR A 1000 o A 5000 (disponibles de Grindsted Products, Dinamarca) y AmilasaMr H o AmilasaMR P (disponible de Gist-Brocades , los países bajos). La glucosa-oxidasa puede ser una glucosa-oxidasa fúngica, en particular una glucosa-oxidasa de Aspergillus niger (tal como Gluzyme ) . Una proteasa ejemplar es NeutraseMR. Una lipasa ejemplar se puede derivar de cepas de Thermomyces (Humicola) , Rhizomucor, Candida, Aspergillus, Rhizopus, o Pseudomonas, en particular de Thermomyces lanuginosus (Humicola lanuginosa) , Rhizomucor iehei, Candida antárctica, Aspergillus niger, Rhizopus delemar o Rhizopus arrhizus o Pseudomonas cepacia. La lipasa puede ser Lipasa A o Lipasa B derivada de Candida antárctica como se describe en el documento WO 88/02775, por ejemplo, o la lipasa se puede derivar de Rhizomucor miehei como se describe en el documento EP 238,023, por ejemplo, o Humicola lanuginosa, descrito en el documento EP 305,216, por ejemplo, o Pseudomonas cepacia como se describe en el documento EP 214,761 y WO 89/01032, por ejemplo.

La preparación de enzimas que contienen polipéptido AmyE puede estar opcionalmente en la forma de un granulado o polvo aglomerado. La preparación puede tener una distribución de tamaño de partícula reducido con más de 95% (en peso) de las partículas en el intervalo de 25 a 500 µp?. Los granulados y los polvos aglomerados se pueden preparar mediante métodos convencionales, por ejemplo, al rociar polipéptidos AmyE sobre un portador en un granulador del lecho fluido el portador puede consistir de núcleos particulados que tienen un tamaño de particulados que tienen un tamaño de partícula adecuado. El portador puede ser soluble o insoluble, por ejemplo, una sal (tal como NaCl o sulfato de sodio), un azúcar (tal como sacarosa o lactosa) , un alcohol de azúcar (tal como sorbitol) , almidón, arroz, sémola de maíz o soya.

Las partículas que comprenden polipéptidos AmyE también se pueden encapsular usando un lípido de grado alimenticio, el cual puede ser cualquier compuesto naturalmente orgánico que es insoluble en agua pero es soluble en solventes orgánicos no polares tal como hidrocarburo o éter dietílico. Los lípidos de grado alimenticio adecuados incluyen, pero no se limitan a, triglicéridos ya sea en la forma de grasas o aceites, los cuales están ya sea saturados o insaturados . Ejemplos de ácidos grasos y combinaciones de los mismos los cuales constituyen los triglicéridos saturados incluyen, pero no se limitan a, butírico (derivado de la grasa de leche) , palmítico (derivado de la grasa de animales y plantas) , y/o esteárico (derivado de grasas de grasas de animales y plantas). Ejemplos de ácidos grasos y combinaciones de los mismos los cuales constituyen los triglicéridos insaturados, incluyen, pero no se limitan a, palmitoléico (derivados de grasas de animales y plantas) , oleico (derivados de grasas de animales y plantas) linoleicos (derivados de aceites de planta) , y/o linolénico (derivados de aceite de semilla de lino) . Otros lípidos de grado alimenticio adecuados incluyen, pero no se limitan a, monoglicéridos y glicéridos derivados de los triglicéridos planteados anteriormente planteados anteriormente, fosfolípidos y glicolípidos .

El lípido de grado alimenticio, particularmente en la forma líquida, se pone en contacto con una forma en polvo de polipéptidos AmyE en tal forma que el material lipídico cubre (envuelve) por lo menos una porción de la superficie de por lo menos una mayoría, por ejemplo, 100% de las partículas de polipéptido AmyE. Las ventajas de envolver las partículas de polipéptido AmyE son dos veces. Primera, el lípido de grado alimenticio protege a la enzima de la desnaturalización térmica durante el proceso de horneado para esas enzimas que son lábiles al calor. Consecuentemente, mientras que los polipéptidos AmyE se estabilizan y se protegen durante las etapas de proporción y horneado, se liberan de recubrimiento protector en el producto horneado final, donde hidrolizan los enlaces glucosídicos en los poliglucanos . El vehículo de suministro cargado también proporciona una liberación sostenida de la enzima activa dentro del artículo horneado. Es decir, después del proceso de horneado, los polipéptidos AmyE activos se liberan continuamente del recubrimiento protector a una velocidad que contrarresta, y por lo tanto reduce, la velocidad de envejecimiento.

En general, la cantidad de lípido aplicado a las partículas de polipéptido AmyE pueden variar de un pequeño porcentaje del peso total de la a-amilasa a muchas veces ese peso, dependiendo de la naturaleza del lípido, la manera en la cual se aplica a las partículas, la composición de la mezcla de masa que se trata, y la severidad de la operación de mezclado de la masa involucrado.

La enzima envuelta en lípido se agrega a los ingredientes usados para preparar un artículo horneado en una cantidad efectiva para prolongar la vida de anaquel del artículo horneado. El panadero computa la cantidad de a-amilasa envuelta, preparada como se plantea anteriormente, ,que será requerida para lograr el efecto anti -envejecimiento deseado. La cantidad de la a-amilasa envuelta requerida se calcula con base en la concentración de enzimas envueltas y en la proporción de la a-amilasa a la harina especificada. Una amplia gama de concentraciones se ha descubierto que es efectiva, aunque, se ha planteado, mejoras observables en el anti -envejecimiento que no corresponden linealmente con la concentración de a-amilasa, pero arriba de ciertos niveles mínimos, incrementos grandes en una concentración de a-amilasa produce poca mejora adicional. La concentración de a-amilasa usada actualmente en una producción de panadería particular podría ser mucho más alta que el necesario mínimo a fin de proporcionar al panadero con alguna seguridad contra errores inadvertidos en la medición por el panadero. El límite más bajo de la concentración de enzimas se determina por el efecto anti -envejecimiento mínimo que el panadero desea lograr.

Un método para preparar un artículo horneado puede comprender: (a) preparar partículas de polipéptido AmyE recubiertas con lípido, en donde sustancialmente el 100 por ciento de las partículas se recubren; (b) mezclar una masa que contiene harina; (c) agregar la a-amilasa recubierta con lípidos a la masa antes de que el mezclado se complete y termine el mezclado antes de que el recubrimiento de lípidos se remueva de la a-amilasa; (d) fermentar la masa; y (e) hornear la masa para proporcionar el artículo horneado, en donde el a-amilasa se inactiva durante las etapas de mezclado, fermentación y horneado y está activa en el artículo horneado. Los polipéptidos AmyE envueltos se pueden agregar a la masa durante el ciclo de mezclado, por ejemplo, cerca del final del ciclo de mezclado para permitir una distribución suficiente por toda la masa; sin embargo, la etapa de mezclado se termina antes de que el recubrimiento protector se retire de la(s) partícula (s) .

En algunos casos, la -amilasa bacteriana (BAA) se puede agregar a las partículas recubiertas con lípido que comprenden polipéptidos AmyE. La BAA reduce el pan a una masa gomosa debido a su termoestabilidad excesiva y actividad retenida en la barra completamente horneada de pan; sin embargo, cuando la BAA se incorpora en las partículas recubiertas con lípido, se obtiene una protección anti-envejecimiento adicional sustancial, aún en niveles de dosificación de BAA muy bajos.

Varias modificaciones y variaciones se pueden hacer a las composiciones y métodos. Todas las referencias citadas en este documento se incorporan a manera de referencia en su totalidad para todos los propósitos.

EJEMPLOS En la descripción anterior y los ejemplos que siguen, aplican las siguientes abreviaturas: % en peso (por ciento en peso) ; °C (grados centígrados) ; H20 (agua) ; dH20 (agua desionizada) ; dIH20 (agua desionizada, filtración Milli-Q) ; g o gm (gramos) ; pg (microgramos) ; mg (miligramos) ; kg (kilogramos) ; uL y µ? (microlitros ) ; mL y mi (mililitros) ; mm (milímetros) ; ]im. (micrómetro) ; M (molar) ; m (milimolar) ; µ? (micromolar) ; U (unidades) ; M (peso molecular) ; seg (segundos); min(s) (minuto/minutos) ; hr(s) (hora/horas) ; DO (oxígeno disuelto) ; W/V (peso a volumen) ; P/P (peso a peso) ; V/V (volumen a volumen); IKA (IKA Works Inc. 2635 North Chase Parkway SE, Wilmington, NC) ; Genencor (Danisco US Inc, Genencor División, Palo Alto, CA) ; Ncm (centímetro Newton) y ETOH (etanol) , eq (equivalentes) ; N (Normal) ; ds o DS (contenido de sólidos secos) , SAPU (unidad de proteasa de ácido espectrofotométrico, en donde en 1 SAPU es la cantidad de la actividad enzimática proteasa que libera un micromol de tirosina por minuto de un substrato de caseína bajo condiciones del ensayo) y GAU (unidad de glucoamilasa, la cual se define como la cantidad de enzima que producirá 1 g de azúcar de reducción calculada como glucosa por hora de un substrato de almidón soluble en pH .2 y 60°C) .

Ejemplo 1 Construcción del plásmido y expresión de la proteína El siguiente método general se usó para la construcción de plásmidos y la expresión de la proteína. 1.1. Construcción del Plásmido Ácido nucleicos que codifican la AmyE de SEQ ID NO: 1 o una variante AmyE truncada C-terminal, la AmyE-tr (SEQ ID NO: 2) , se clonó en el vector de expresión pHPLT de B. subtilis, descrito en la Patente de E.U.A. No. 5,024,943. La FIGURA 2 representa el vector que comprende un ácido nucleico que codifica AmyE-tr.

El vector pHPLT contuvo el promotor LAT de B . licheniformis ("Plat"), una secuencia que codifica el péptido de señal LAT ( "preLAT" ) , seguido por los sitios de restricción PstI y Hpal para la clonación. "ori-pUB" es el origen de replicación de pUBUO; "reppUB" es el gen de replicasa de pUBUO, "neo" es el gen de resistencia a la neomicina/canamicina de pUBUO; "bleo" es el marcador de resistencia a la bleomicina, "Tlat" es el terminador transcripcional de la amilasa de B. licheniformis . Estas y otras características del plásmido pUBUO se describen por McKenzie y colaboradores, Plasmid 15(2) : 93-103 (1986) .

Los constructos de plásmido para la expresión de AmyE y AmyE-tr se ensamblaron usando la secuencia de codificación AmyE descrita por Yang y colaboradores, "Nucleotide sequence of the amilasa gene from Bacillus subtilis," Nucí. Acids Res. 11(2): 237-49 (1983). El plásmido pME629.5 contiene el ácido nucleico que codifica la AmyE de longitud completa de SEQ ID NO: 1. El gen tiene tres supresiones base en la secuencia que codifica el dominio de enlacé al almidón, comparada con la secuencia descrita por Yang y colaboradores El plásmido pME630.7, mostrado en la FIGURA 2, contuvo la secuencia AmyE truncada (es decir, AmyE-tr) . La AmyE-tr está truncada en la posición D425 de SEQ ID NO: 1. La AmyE-tr se diseñó con base en una estructura de cristal de una variante AmyE que careció del domino de en lace al almidón, como se describe por Fuj imoto y colaboradores, "Crystal structure of a catalytic-site mutant alpha-amilasa from Bacillus subtilis complexed with maltopentaose" , J". Mol. Biol. 277: 393-407(1998). Véase también, RCSB Protein Data Bank® No. de Acceso 1BAG, "Alpha-Amilasa From Bacillus Subtilis Complexed With Maltopentaose".

Para la construcción de plásmido de expresión, el ácido nucleico que codifica el polipéptido AmyE se amplificó por PCR usando HerculaseM (Stratagene, La Jolla, CA, EUA) y se purificó usando una columna proporcionada en un kit de purificación PCR Qiagen QIAquikMR (Qiagen, Valencia, CA, EUA) , y se resuspendió en 50 µ?> de agua purificada Milli-Q . 50 pL del ADN purificado se digirió secuencialmente con Hpal (Roche) y PstI (Roche) , y los fragmentos de ADN resultantes se resuspendieron en 30 de agua purificada Milli-QMR. 10-20 ng/pL de ADN se clonaron en el plásmido pHPLT usando los sitios de clonación PstI y Hpal. Las mezclas de ligación se transformaron directamente en células B. subtilis competentes (genotipo: AaprE, AnprE, degUHy32 oppA, AspoIIE3501 , amyE: : xylRPxylAcomK-phleo) . Estas células de B. subtilis tuvieron un gen de competencia (comK) colocado bajo el control de un promotor inducible por xilosa. La competencia para el enlace y la captación de ADN se indujo por la adición de xilosa. Debido a que el gen amyE en el plásmido precursor tiene dos sitios PstI, se realizó una reacción de fusión por PCR para remover estos "sitios antes de la clonación. La fusión de PCR se realizó después de dos reacciones separadas. Se usaron los siguientes cebadores para hacer el constructo pHPLT usando los sitios Hpal y PstI: SEQ ID NO: 10: Cebador PSTAMYE-F' 5 ' -CTTCTTGCTGCCTCATTCTGCAGCTTCAGCACTT-ACAGCACCGTCGATCAAAAGCGGAAC- 3 ' SEQ ID NO: 11: Cebador AMYENOPST-R' 5 ' -CTGGAGGCACTATCCTGAAGGATTTCTCCGTATTG-GAACTCTGCTGATGTATTTGTG-3 ' SEQ ID NO: 12: Cebador AMYENOPST-F' 5 ' -CACAAATACATCAGCAGAGTTCCAATACGGAGAAA- TCCTTCAGGATAGTGCCTCCAG-3 ' SEQ ID NO: 13: Cebador HPAIAMYE-R' 5 ' -CAGGAAATCCGTCCTCTGTTAACTCAATGGGGAAGA-GAACCGCTTAAGCCCGAGTC- 3 ' SEQ ID NO: 14: Cebador HPAIAMYE-R' 5 ' -CAGGAAATCCGTCCTCTGTTAACTCAATCAGGATAA- AGCACAGCTACAGACCTGG- 3 ' SEQ ID NO: 15: Cebador AMYE SEQ-F' 5 ' -TACACAAGTACAGTCCTATCTG- 3 ' SEQ ID NO: 16: Cebador AMYE SEQ-F' 5 ' -CATCCTCTGTCTCTATCAATAC- 3 ' Los plásmidos pME629.5 y pME630.7 expresan AmyE con una secuencia de señal de 31 residuos, la cual se escinde postraduccionalmente . Los 10 aminoácidos N-terminales subsecuentes se procesan separadamente como es propuesto por Yang y colaboradores (1983) . El pME629.5 codifica la AmyE "de longitud completa" y el pME630.7 codifica la AmyE "truncada". 1.2. Expresión de la proteína Transformantes bacterianos que alojan constructos que codifican la AmyE de longitud completa y polipéptidos truncados se seleccionaron en el agar Luria (LA) con 10 µg/mL de neomicina, almidón insoluble al 1% y se incubaron durante toda la noche a 37°C. Los transformantes que muestran un aclaramiento (o halo) alrededor de la colonia se seleccionaron para estudios adicionales. Los pre-cultivos de cada uno de los transformantes se desarrollaron durante 8 horas en LB con 10 µ9/p? de neomicina. 30 µL de cada pre-cultivo se agregaron en un matraz de 250 mL llenado con 30 mL de medios de cultivación (descritos posteriormente) suplementados con 10 ug/mL de neomicina y CaCl2 5 mM. El medio de cultivación fue un medio semi -definido enriquecido con base en solución amortiguadora MOPs, con urea como la fuente de nitrógeno principal, la glucosa como la fuente de carbono principal, y se suplemento con soytone al 1% para el crecimiento de células resistentes. Los matraces de agitación se incubaron durante 60-65 horas a 37°C, con mezclado a 250 rpm. Los cultivos se cosecharon mediante centrifugación a 5,000 rpm durante 20 minutos en tubos cónicos. Puesto que las proteínas tanto AmyE de longitud completa como AmyE truncadas se expresaron en altos niveles, los sobrenadantes del cultivo se usaron para ensayos subsecuentes sin purificación adicional .

Ejemplo 2 Ensayos Comunes Los siguientes ensayos se usaron en los ejemplos descritos posteriormente. Las desviaciones de los protocolos proporcionados posteriormente se indican en los ejemplos individuales. En estos experimentos, se usó un espectrofotómetro para medir la absorbencia de los productos formados después de la terminación de las reacciones. 2.1. Ensayo de la actividad de la La actividad de la amilasa se midió espectrofotométricamente . Almidón de maíz insoluble covalentemente enlazado con la etiqueta Remazol Brilliant Blue R ("RBB-corn starch" , Sigma S7776) se usó como un substrato. 75 ]ih de suspensión espesa al 2% (wt ds) de almidón de maíz se RBB en acetato de sodio 50 mM, pH 4.5, 5.0 o 5.6, se agregó a 10 L de 100 ug/mL de enzimas y se mezcló completamente. La mezcla luego se incubó a 50 °C durante 30 minutos. Las muestras luego se colocaron sobre hielo y se removió el substrato mediante centrif gación a 4,100 rpm durante 20 minutos usando una centrífuga de mesa. La cantidad de producto se determinó al medir la cantidad de tinte azul liberado del almidón. La densidad óptica (OD) del tinte se midió en triplicado a 595 nm. 2.2. Ensayo de medición de la viscosidad Se usó un viscosímetro para medir la viscosidad de un substrato de almidón de maíz en presencia de una amilasa en pH 4.5 y 5.8. Un lote de suspensión espesa de substrato de almidón de maíz con 30% ds se hizo recientemente usando ácido sulfúrico para disminuir el pH a ya sea 4.5 o 5.8. Para cada reacción, 50 g de suspensión espesa (15 g ds) se pesó y se calentó durante 10 minutos a 70 °C. En la adición de la a-amilasa, la temperatura se incrementó inmediatamente de 70 °C a 85 °C, y la reacción se agitó a 75 rpm. Una vez que la temperatura de la suspensión espesa y la mezcla de enzimas alcanzó 85°C, la viscosidad se supervisó durante 30 minutos adicionales. 2.3. Calorimetría de exploración diferencial (DSC) para medir la estabilidad térmica La función de la capacidad de calor en exceso de la AmyE o una variante de la misma se midió en presencia o ausencia de cloruro de calcio 2 mM usando un microcalorímetro de alto rendimiento de exploración ultrasensible (VP-Capillary DSC; MicroCal, Inc., Northampton, MA, EUA) . Aproximadamente 500 µL de 0.5 mg/mL de AmyE o una variante de la misma se escanearon arriba de un intervalo de temperatura de 30-120°C. La oí-amilasa de Geobacillus stearothermophilus truncada (AmyS) se usó como un control. La secuencia de aminoácidos de AmyS, que incluye una secuencia de señal de 34 aminoácidos, se muestra en SEQ ID NO: 4. La misma muestra luego se volvió a escanear para verificar la reversibilidad del proceso. La solución amortiguadora usada fue acetato de sodio 10 mM, pH 5.5. Se usó una velocidad de escaneo de 200°C/horas para minimizar cualquier producto artificial que resulta de la agregación. El punto medio térmico (Tm) de las curvas DSC se usó como un indicador de la estabilidad térmica. El error estándar en todas las mediciones Tm fue menor que 1%. 2.4. Ensayo de Bradford en placas de microtítulo de 96 pocilios Se determinó una concentración de proteínas en los sobrenadantes de muestra usando el Reactivo de Tinte Bradford QuickStartMR (Bio-Rad, Hercules, CA, EUA) . Las muestras se obtuvieron al filtrar los caldos de los cultivos desarrollados en las placas de microtítulo (MTPs) durante 3 días a 37°C con agitación a 280 rpm y se humidificaron por aireación. 10 del material filtrado del cultivo se combinaron con 200 ]iL de Reactivo de Tinte Bradford QuickStartMR en un pocilio de una segunda MTP. Después del mezclado minucioso, la MTP se incubó durante por lo menos 10 minutos a temperatura ambiente. Se removieron las burbujas de aire y se midió la OD (densidad óptica) a 595 nm. Para determinar la concentración de proteínas, la lectura de fondo (de los pocilios no inoculados) se sustrajo de las lecturas de la muestra. 2.5. Formación de glucosa por medio de la medición HPLC Hidrólisis de maltosa y maltoheptaosa Se prepar.aron soluciones de maltosa o maltoheptaosa al 0.5% en acetato de sodio 50 mM, pH 4.5 o 5.6, o en ácido málico 50 mM pH 5.6, como se especifica para cada experimento. Todas las muestras de enzimas se diluyeron inicialmente a 1 mg/mL. Las mezclas de reacción se prepararon al diluir la enzima usando las soluciones de substrato apropiadas para proporcionar una concentración de enzimas final de 1 ppm, y luego se transfirieron 200 µ??? de alícuotas a tubos con tapa roscada estéril y se colocaron en una incubadora a 37 °C. Las reacciones se detuvieron en los tiempos indicados al diluirse 10 veces en hidróxido de sodio 10 mM.

Hidrólisis del almidón insoluble Para medir la hidrólisis del almidón granular insoluble, AmyE purificada o variante de la misma (24.5g/L) se diluyeron a una concentración final de 20.4 ppm en solución amortiguadora de ácido málico, pH 5.6. La proteína luego se agregó a una solución de harina de maíz al 5% preparada en solución amortiguadora de ácido málico, pH 5.6 , a una concentración final de 1 ppm, y la mezcla se incubó en un agitador a 32 °C. Las muestras se removieron periódicamente y se diluyeron 10 veces en NaOH 50 mM para enfriar rápido la reacción .

Método de detección HPLC La formación de glucosa y otros productos de descomposición de los substratos se analizaron por el HPLC usando un sistema Agilent 1100 LC equipado con una columna Dionex PA-1 y un detector electroquímico. Se inyectaron 10 µL de muestras y se aplicó un gradiente de NaOH y acetato de sodio a 1.0 mL/minuto a 25 °C. La distribución de sacáridos se determinó de estándares previamente corridos. Los perfiles de elución se obtuvieron durante 45 minutos. La cuantificación de la glucosa producida (reportada como g/L) se obtuvo usando el estándar de referencia de glucosa autentificada (Sigma, MO, EUA) para convertir el área pico para los azúcares a concentraciones de azúcar actuales. 2.6. Formación de glucosa usando substratos de maltosa y maltoheptaosa La descomposición de maltosa o maltoheptaosa a glucosa se sometió a ensayo por la HPLC. Se hizo una solución de maltosa y maltoheptaosa al 0.5% en una solución amortiguadora de acetato de sodio 50 mM en pH 4.5 y pH 5.6. Todas las muestras de enzimas se diluyeron a 1 mg/mL de materias primas purificadas. 1 mg/mL de la muestra de enzima se diluyó adicionalmente a la solución de maltosa para proporcionar una concentración final de 1 ug/mL de enzima. 200 ]ih de alícuotas luego se agregaron a tubos con tapa roscada estériles y se colocaron en una incubadora a 37 °C. Las reacciones se detuvieron después de 2, 5, y 8 días por la adición de hidróxido de sodio. La formación de glucosa y la descomposición de la maltosa se analizaron por la HPLC contra estándares auténticos, usando los métodos descritos en el Ejemplo 2.5. 2.7 Ensayo Triple Se realizaron ensayos de azúcares, glucosa y yodo de reducción total estándares se paradamente para caracterizar los productos de la digestión de amilopectina . Se preparó un substrato de amilopectina de maíz al 2.2% (p/p) en solución amortiguadora de acetato de sodio 55 mM pH 5.8 al hervir la mezcla con agitación durante 30 minutos y luego al enfriarla a temperatura ambiente . Cien µ? de substrato se colocaron en pocilios de una placa de microtítulo de poliestireno de enlace de medio de 96 pocilios y 10 µ? de sobrenadantes de cultivo diluidos de variantes AmyE se agregaron a la misma. Las placas se sellaron (Nunc, cat . # 236366) y se colocaron inmediatamente en una incubadora de agitación iEMS y se incubaron a 50°C durante 10 minutos, 1150 rpm. Se determinaron las reacciones de amilasa por la vía de la adición de 20 µ? de NaOH 0.5 N con el mezclado.

La glucosa total presente en las reacciones de amilasa se determinó en una placa de micro título al mezclar 20 µ? de la mezcla de reacción con 50 µ? de 5.8 mg/ml de sal 2,2'-Azino-bis (ácido 3-etilbenzotiazolin-6-sulfónico) de diamonio (Sigma, A1888) en solución amortiguadora de fosfato de potasio a 50 mM pH 6.8, que contiene Tween 80 al 0.05% v/v seguido por la visión de 30 µ? de solución que contiene 0.33 U/ml de peroxidasa de rábano picante de tipo VI (Sigma, P8375) , 3.33 U/ml de OxiGo (Glucosa oxidasa, Genencor) preparada en la misma solución reguladora. La placa de micro título se colocó inmediatamente en un lector de placas Spectramax, se agitó durante 5 segundos y la densidad óptica se supervisó a 405 nm a intervalos de 9 segundos durante el período de tiempo de 60-180 segundos.

El análisis de yodo de las reacciones de amilasa se realizó al mezclar una dilución 1:4 (en agua) de la muestra de reacción de amilasa con 80 µ? de reactivo Lugols (5 g de yodo, 10 g de yoduro de potasio disuelto en 100 mi de agua) diluida 1:20 en agua en una placa de micro título de poliestireno . La densidad óptica a 580 nm se determinó usando un lector de placas Spectramax. Se usó Microsoft Excel para ensamblar los datos adquiridos del software Softmax Pro (lector de placas) .

Los resultados de yodo se reportaron como OD580 total; la amilos de longitud de cadena/residual es una función de la OD total, por lo tanto la actividad de la amilasa es inversamente proporcional a la OD total. Los azucares de reducción totales se reportan como OD440 total y son proporcionales a la OD por lo tanto la actividad de la amilasa es directamente proporcional a la OD. La glucosa total se reporta como una velocidad cinética en el ensayo de glucosa y es directamente proporcional. La OD y las velocidades se reportan en vez de convertirse a cantidades conocidas usando curvas estándares construidas de glucosa. Las relaciones se reportan usando datos sin analizar y son por lo tanto menos unitarios. Los tres tipos de datos se combinaron gráficamente, como una relación de yodo dividida por la relación de azucares de reducción totales a glucosa. 2.8 Ensayo de viscometría de alto rendimiento para la determinación de la velocidad de reducción de viscosidad.

Se desarrolló un ensayo de viscometría de alto rendimiento usando el rotor molecular comercialmente disponible CCVJ (9- (2-carboxi-2-cianovinil) julolidina) . Un rotor molecular es una especie fluorescente cuyo rendimiento cuántico (el número de fotones emitidos dividido por el número de fotones absorbidos) es dependiente en el volumen libre del micro medio ambiente, lo cual se relaciona a su vez con la viscosidad. Para estas moléculas, la rotación intramolecular es el modo preferido de relajación del estado excitado. La rotación intramolecular se inhibe en una manera proporcionada a la viscosidad del micro medio ambiente, el balance de energía que se disipa a través de la relajación radioactiva (emisión fluorescente) .

Para medir la velocidad de la reducción de viscosidad debido a la actividad enzimática, el rotor molecular CCVJ se incorporó dentro de una suspensión amortiguada de amilopectina de maíz como sigue. Se preparó una solución madre 100 mM de CCVJ al agregar 186 µ? de sulfóxido de dimetilo a un frasquito que contiene 5 mg de CCVJ liofilizado (Sigma Aldrich Corporation, St. Louis, MO) . La solución madre de CCVJ se almacenó en la oscuridad a temperatura ambiente y se verificó para precipitación antes del uso. 90 g de amilopectina de maíz (MP Biomedicals LLC, Solón, OH) se agregaron a 2,850 mL de agua destilada. Esto se calentó hasta que hirvió con agitación constante, bajo las condiciones las cuales gelatinizaron y disolvieron gradualmente la amilopectina. La suspensión uniformemente viscosa, resultante de amilopectina gelificada se removió de la fuente de calor y se agitó continuamente conforme se regreso a temperatura ambiente, en cuyo punto 150 mL de solución amortiguadora de acetato de sodio 1 M pH 5.8 (preparada previamente al titular i molar de acetato de sodio con ácido acético 1 M) seguido por 150 µ? de Tween-80 (Sigma Aldrich Corporation, St . Louis, MO) . Cuando el Tween-80 se disolvió completamente, se agregaron y se disolvieron 150 µ? de la solución madre CCVJ 100 mM, en cuyo punto la amilopectina/reactivo CCVJ se completaron y estuvieron listos para el uso. El reactivo se almacenó en un vidrio claro a temperatura ambiente con agitación constante durante los tres días que tomo completar la gasificación de viscometría.

Para el ensayo, todas las tareas de manejo de líquidos se ejecutaron por un robot Biomek FXP equipado con una cabeza de múltiples canales que permitió el pipeteo simultaneo de todos los 96 pocilios de una placa de micro título de 96 pocilios. 60 µ? del reactivo de amilopectina/CCVJ se agregaron a cada pocilio de una placa de micro título de 96 pocilios de poliestireno no tratada negra (Corning Incorporated, Corning, NY) . 30 µ? de una muestra de enzimas se pipetearon en la parte superior de esta y la placa de micro título se leyó inmediatamente sobre un fluorómetro Spectramax M2e (Molecular Devices Corporation, Sunnyvale, CA) que se ajustó como sigue: modo de fluorescencia de lectura superior; longitud de onda de excitación de 435 nanómetros (nm) ; longitud de emisión 495 nm; longitud de onda de corte 455 nm; modo de lectura cinética con intervalo de lectura de 24 segundos; agitación de 15 segundos antes de la lectura inicial, agitación de 3 segundos entre lecturas; 192 segundos de tiempo de lectura total con un periodo de retraso de 20 segundos (eliminación de cada calculo de velocidad cinética de los primeros 9 puntos de datos recolectados .

En este ensayo, la velocidad de la reducción de viscosidad se midió en términos de la velocidad de la caída en la señal fluorescente. Las velocidades cinéticas de la reducción de señal fluorescente se calcularon automáticamente como "Vmax (mili unidades por minuto)" por el software Softmax Pro que viene empacado con instrumentos Spectramax. 2.9 Ensayo de viscometría de alto rendimiento para la determinación de la viscosidad pos-licuefacción.

Para medir la reducción en la viscosidad postlicuefacción debido a la actividad enzimática, el rotor molecular CCVJ se incorporó dentro de una suspensión amortiguada de harina de maíz como sigue. Una solución madre 2 de 10 mM de CCVJ se preparó al agregar 186 µ? de sulfóxido de dimetilo a un frasquito que contiene 5 mg de CCVJ liofilizado (Sigma Aldrich Corporation, St. Louis, MO) . La solución madre CCVJ se almacenó en la oscuridad a temperatura ambiente y se verificó para precipitación antes del uso. La harina de maíz orgánica (Azure Farm, Dufur, OR) se hizo pasar a través de una criba de 600 micrómetros, luego se horneó a 95 grados C por 16 horas y se regresó a temperatura ambiente. Una suspensión espesa de harina de maíz al 20% (p/p) , pH 5.8 se preparó en lotes de 2 kg al combinar 1520 g de agua destilada, 80 niL de solución amortiguadora de acetato de sodio 1 M pH 5.6 (preparada previamente al titular 1 molar de acetato de sodio con 1 molar de ácido acético) , 80 µ? de Tween-80 (Sigma Aldrich Corporation, St . Louis, MO) , 80 µ? de la solución madre CCVJ 100 mM, y 400 g de harina de maíz orgánica tamizada. La suspensión se agitó vigorosa y continuamente durante media hora usando una barra de agitación magnética, en cuyo punto el pH se verificó y se confirmó para ser 5.8. La solución se agitó vigorosa y continuamente para mantener la harina de maíz uniformemente dispersada, mientras que 90 µ? de suspensión espesa se agregaron a cada pocilio de una placa de micro título de 96 pocilios de poliestireno no tratada negra (Corning Incorporated, Corning, NY) usando una pipeta de múltiples canales con puntas de 200-µ1 recortadas a un diámetro interior de aproximadamente 2.3 milímetros, de terminados por un calibre vernier (Mitutoyo Corporation, Kure , Hiroshima, Japan) . Para cada pocilio de la placa de mico título, 10 µ? de la muestra de enzimas se pipetearon sobre la parte superior de la suspensión espesa de harina de maíz, después de lo cual la placa se selló con sellador adhesivo (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA) y se intercalaron estrechamente entre las placas de metal pre-equilibradas en un horno de alta temperatura ajustados a 80 grados C. La placa se incubó durante una hora, después de los cual la placa se removió a temperatura ambiente y se dejó durante toda la noche a temperatura ambiente. Al siguiente día, el sellador de placas se removió y la placa se leyó sobre un fluorómetro Spectramax 2e (Molecular Devices Corporation, Sunnyvale, CA) que ajustó como sigue: modo de fluorescencia de lectura superior; longitud de onda de excitación 435 nanómetros (nm) ; longitud de onda de emisión 495 nm; longitud de onda de corte 495 nm . En este ensayo, una disminución en la señal fluorescente correspondió a una disminución en la densidad de la harina de maíz . gelat inizada , la cual a su vez correspondió a un incremento en la licuefacción debido a la actividad enzimática.

Ejemplo 3 Actividad específica y pH óptimo La actividad específica y el pH óptimo de la AmyE de longitud completa (SEQ ID NO: 1), AmyE-tr (SEQ ID NO: 2), y variantes, de las mismas, se midieron usando los ensayos descritos en el Ejemplo 2.1. Las actividades específicas se determinaron al determinar espectrofotométricamente la cantidad tinte liberado de un sustrato de almidón de maíz RBB durante 30 minutos a 50 °C y pH 4.5, 5.0 y 6.6. La FIGURA 3 muestra que la AmyE-tr y Amy31A tienen actividades específicas más altas en pH 4.5, comparado con el pH 5 o 5.6. La AmyE muestra una actividad específica más alta en pH 5 que en pH 5.6.

Ej emplo 4 Reducción de la viscosidad de un sustrato de almidón de maíz La capacidad de AmyE, AmyE-tr, y variantes de las mismas, de reducir la viscosidad de un sustrato de almidón de maíz se determinó usando el método de ensayo descrito en el Ejemplo 2.2. La viscosidad se midió como una función de tiempo en pH 4.5 y 5.8 para cada enzima. La FIGURA 4A y la FIGURA 4B, respectivamente, muestran que la AmyE-tr y AmyE redujeron la viscosidad de sustrato tanto en pH 4.5 como 5.8. Las viscosidades pico fueron las mismas, mientras que se observó una viscosidad final más baja en pH 5.8. La FIGURA 4C y la FIGURA 4D, respec ivamente, muestran que la Amy31A tiene un mejor rendimiento en pH 4.5 que pH 5.8.

Ejemplo 5 Estabilidad térmica Las estabilidades térmicas de AmyE , AmyE-tr, y variantes, de las mismas, se midió en presencia y ausencia de Ca2+ para determinar si Ca2+ contribuyó a la estabilidad de las enzimas, usando la calorimetría de exploración diferencial (DSC) como se describe en el Ejemplo 2.3. La DSC que el proceso de desplegamiento térmico fue irreversible. La FIGURA 5A muestra los perfiles de desplegamiento DSC para la AmyE y AmyE-tr, con y sin Ca2+ 2 mM . La FIGURA 5B muestra los perfiles de desplegamiento DSC para la variante Amy31A de longitud completa. La ausencia de cualquier efecto de calcios sobre los puntos de fusión térmicos sugiere que ni la AmyE, AmyE-tr, tampoco la Amy31A se enlaza a Ca2+ o se estabilizan por el Ca2+ en el intervalo de concentración mM. Se obtuvieron resultados contrastantes para la a-amilasa de G. stearothermophilus (AmyS) , como se muestra en la FIGURA 5C. La Tabla 1 resume la temperatura de fusión de las enzimas sometidas a prueba. La adición de Ca2+ no cambió significativamente la estabilidad térmica de AmyE, AmyE-tr, o Amy31A, mientras que Ca2+ incrementó significativamente la estabilidad de la AmyS.

Tabla 1. Resumen de las mediciones DSC ?„ Tm (°C) Sin CaCl2 Con CaCl2 2 mM ??, adicionado Muestra AmyE truncada 74.6 74.5 ¦0.1 AmyE de 76.4 76 ¦0.4 longitud completa variante 74.8 74.4 -0.4 Amy31A AmyS 100 107.3 7.3 Ejemplo 6 Conversión de maltosa y maltoheptaosa a glucosa Se sometió a prueba la capacidad de la AmyE-tr (SEQ ID NO: 2) y seis variantes AmyE de la posición Q153 (C, F, I, K, N, y V) de AmyE-tr para convertir sustrato de maltosa y maltoheptaosa a glucosa a pH 5.6, usando el ensayo de formación de glucosa descrito en el Ejemplo 2.3. La glucosa generada se midió después de 1 , 2, y 3 días. La AmyE-tr y variantes AmyE se usaron en 1 ppm. La AmyS truncada (SEQ ID NO: 4) se usó para comparación en una dosis similar.

La FIGURA 6 representa los resultados de la producción de glucosa de un sustrato de maltosa. La producción e maltosa por AmyS fue mínima, mientras que la AmyE-tr ya las variantes de la posición Q153 produjeron cantidades significativas de glucosa. La variante Q153N fue el mejor productor de glucosa bajo estas condiciones. Estos resultados confirman que la AmyE y una variante AmyE producen eficientemente glucosa de maltosa .

La FIGURA 7 los resultados de la producción de glucosa de un sustrato de maltoheptaosa . Como fue el caso con la maltosa como un sustrato, la AmyS convirtió la maltoheptaosa a glucosa con pobre eficiencia. Por el contrario, la AmyE-tr y las variantes de la posición Q153 convirtieron la maltoheptaosa a glucosa muy eficientemente con variantes Q153K y F que muestran la conversión más grande por el día 3. Este ejemplo demuestra que la AmyE y una variante AmyE producen eficientemente glucosa de oligosacáridos complejos.

Ej em lo 7 Conversión de maltoheptaosa a glucosa Se sometió a prueba la capacidad de la AmyE-tr (SEQ ID NO: 2), AmyS, y variante AmyE Q153K para convertir maltoheptaosa (DP7) a glucosa (DPI ) . Los productos de las reacciones se analizaron usando el método de HPLC descrito en el Ejemplo 2.2. Los perfiles de elusión representativos se muestran en la FIGURA 8-FIGURA 10.

La FIGURA 8 muestra que la AmyE-tr convierte DP7 predominantemente a DPI y cantidades residuales de maltosa (DP2) después de una incubación de 72 horas. Port el contrario, la FIGURA 9 muestra que la AmyS convierte DP7 a oligosacáridos más pequeños a través del tiempo, produciendo una mezcla de oligosacáridos DP5 , DP4 , DP3 , DP2 y DPI. La FIGURA 10 representa un curso de tiempo de la conversión de DP7 a oligosacáridos más pequeños en presencia de la variante AmyE Q153K. Los niveles significativos de DPI, DP2 , y DP3 se detectaron en tan poco como una 1 hora. Por 3 horas, la variante Q153K convirtió DP7 predominantemente a DPI . Estos resultados muestran que la AmyE y una variante de la misma pueden producir eficientemente glucosa (DPI) de un sustrato d DP7.

Ejemplo 8 Generación y expresión de variantes posicionales Este ejemplo se refiere a la generación y expresión de una biblioteca de variantes posicionales. 8.1 Generación de bibliotecas posicionales.

El plásmido pME630.7 (FIGURA 2, Ejemplo 1) se usó para generar bibliotecas posicionales en 150 residuos de aminoácidos diferentes de AmyE-tr. La Tabla 1 lista cada residuo por lo cual se hizo una biblioteca posicional. Los residuos se enumeran con base en su posición en SEQ ID NO : 2.

El aminoácido listado en cada posición es el residuo que se presenta en la AmyE de SEQ ID NO: 2 (es decir, el residuo de tipo natural) .

Tabla 1 No. de NumeraResiduo No. de NumeraResiduo No. de NumeraResiVarianción de de tipo Varianción de de tipo Varianción de duo de te SEQ ID silte SEQ ID silte SEQ ID tipo NO: 2 vestre NO: 2 vestre NO: 2 silvestre 18 47 E 68 195 P 118 319 K 19 49 N 69 199 N 119 320 S 20 50 Q 70 200 T 120 321 Q 21 51 G 71 201 S 121 323 G 22 52 D 72 202 A 122 324 D 23 54 S 73 203 E 123 325 R 24 56 S 74 212 D 124 327 S 25 59 Y 75 213 S 125 328 A 26 68 Q 76 214 A 126 331 E 27 73 Y 77 218 A 127 333 Q 28 75 G 78 219 A 128 344 V 29 76 T 79 221 A 129 346 A 30 78 Q 80 222 N 130 347 G 31 85 A 81 223 Y 131 349 H 32 88 E 82 233 H 132 357 G 33 89 E 83 234 S 133 358 N 34 90 Y 84 238 A 134 359 N 35 91 G 85 240 K 135 367 G 36 106 D 86 241 N 136 368 S 37 107 Y 87 243 N 137 369 H 38 108 A 88 245 G 138 378 S No. de NumeraResiduo No. de NumeraResiduo No. de NumeraResiVarianción de de tipo Varianción de de tipo Varianción de duo de te SEQ ID silte SEQ ID silte SEQ ID tipo NO: 2 vestre NO: 2 vestre NO: 2 silvestre 39 109 A 89 247 S 139 380 S 40 112 N 90 248 N 140 382 S 41 115 K 91 250 S 141 385 T 42 116 S 92 251 H 142 386 A 43 118 P 93 252 Y 143 388 K 44 119 N 94 253 A 144 390 P 45 123 G 95 254 S 145 393 R 46 124 N 96 255 D 146 395 D 47 125 T 97 257 S 147 400 A 48 126 Q 98 259 D 148 401 G 49 127 I 99 260 K 149 402 S 50 131 s 100 274 D 150 406 N La biblioteca posicional para cada uno de los 150 residuos listados en la Tabla 1 contuvo aproximadamente 16 variantes de sustitución de aminoácidos. Las bibliotecas consistieron de células B. sübtilis transformadas que contienen plásmidos de expresión que codifican las secuencias de variante AmyE en las 150 posiciones descritas. Cada variante se confirmó por el análisis de secuenciación de ADN antes de la evaluación de la actividad de la proteína. Los clones individuales se cultivaron como se describe anteriormente para obtener las diferentes variantes AmyE para la caracterización funcional. 8.2 Expresión de la proteína Los transformantes de B. subtilis que contienen las variantes de sustitución AmyE se cultivaron en placas de 96 pocilios durante 8 horas en LB (caldo Luria) con 10 g/ml de neomicina, y 30 µ? de este pre-cultivo se agregaron a un matraz de 250 mL llenado con 30 mL de medio de cultivación (descrito posteriormente) suplementado con 25 ppm de cloranfenicol y 5 CaCl2 5 mM. Los matraces se incubaron durante 60-65 horas a 37° con mezclado rotacional constante a 250 rpm. Los cultivos se cosecharon mediante centrifugación a 5,000 rpm durante 20 minutos en tubos cónicos . Los sobrenadante de cultivo se usaron para ensayos. El medio de cultivación fue un medio semi-definido enriquecido con base en solución amortiguadora MOPs, con urea como la fuente de nitrógeno principal, glucosa como la fuente de carbono principal, y suplementada con soytone al 1% para el crecimiento celular vigoroso.

E emplo 9 Ensayo de la hidrólisis del almidón para medir la actividad específica y la estabilidad térmica Las variantes de posición AmyE se evaluaron usando un ensayo de hidrólisis del almidón para medir la actividad específica y la estabilidad térmica. Las variantes AmyE también se sometieron a ensayo usando un ensayo de muestra de limpieza para medir el rendimiento de la remoción de manchas. La estabilidad del pH de las variantes AmyE se evaluó al medir la actividad de la amilasa sobre un sustrato de maltoheptaosa . El termo estabilidad de cada una de las variantes AmyE se determinó al medir la actividad de la amilasa sobre un sustrato de maltotriosa antes y después del estrés térmico. 9.1 Determinación de la actividad específica y la estabilidad térmica Se usó un ensayo de hidrólisis del almidón para medir la actividad específica y la estabilidad de la AmyE y las variantes AmyE. Se usaron condiciones que imitan estrechamente las aplicaciones de mundo en la limpieza y procesamiento de granos. La actividad se define como extremos de reducción generados por la descomposición enzimática de la harina de maíz. Los extremos de reducción se determinaron usando un ensayo PAHBAH (hidracida de ácido p-hidroxibenzóico) , descrito posteriormente. La estabilidad se define como actividad sostenida a 80 °C.

Equipo: Agitador calentador Inheco Variomag Teleshake 95 con un adaptador de placas de PCR (Hamilton Company, Reno NV) ; dispensador automatizado Thermo Electron Multidrop (Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA) ; incubadora iEMS (Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA) ; dispensador de disco de agitación V&P Scientific (modelo VP722B) ; placa de PCR de falda completa Axygen PCR-96-FS-C (Axygen Scientific, Inc., Union City, CA) ,· termocicladores Tetrad (MJ Research, Waltham, MA) , controladores de líquido Biomek® FX (Beckman Coulter, Fullerton, CA) .

Hidrólisis del almidón: Harina de Maíz Orgánico Azure Faros (Norco, CA, EUA) se tamizó para obtener la fracción <600 mieras, se horneó 4 horas a 80°C, luego se dejo equilibrar durante toda la noche a temperatura ambiente. La harina de maíz seca preparada se envío dentro de placas de PCR Axygen usando la unidad VP722B como un dispensador volteador de polvo. La masa de harina suministrada a cada pocilio se determinó que es aproximadamente 5 mg. 100 L de acetato de sodio 50 mM de pH 5.6 (para una suspensión final de pH -5.8) se agregaron a cada pocilio y se mezclaron. Los sobrenadantes del cultivo donde AmyE y variantes AmyE se diluyeron a aproximadamente 20 µg/mL en solución amortiguadora de dilución (agua + 0.005% T een-80 al 0.005%) . 10 pL de sobrenadante diluyó se transfirió a placas de reacción de 8 minutos y 30 minutos y se mezclaron una vez al pipetear la muestra arriba y abajo. Una alícuota de 50 \iL de aceite mineral ligero se trasfirió a cada pocilio. Las placas se transfirieron a unidades Inheco pre-calentadas a 80 °C. En varios puntos de tiempo después de la incubación, la reacción de la hidrólisis del almidón se detuvo por la adición de 10 yL de NaOH 4 N a cada pocilio. Los productos de reacción de la hidrólisis del almidón se analizaron por el ensayo PAHBAH.

Ensayo PAHBAH : Alícuotas de 80 de NaOH 0.05 N se agregaron a todos los pocilios de una placa de PCR vacía (una "placa de reacción PAHBAH"), seguido por 20 de reactivo PAHBAH ( (hidracida de ácido p-hidroxibenzóico al 5% p/v (Sigma # H9882, St. Luois, MO, EUA) , se disolvieron en HCL 0.5 N) . Las soluciones se mezclaron al pipetear arriba y abajo. 100 de los sobrenadantes de reacción de la hidrólisis del almidón se agregaron a cada pocilio de la placa de reacción PAHBAH. Las placas se sellaron y se colocaron en un termociclador, se programo durante 2 minutos a 95 °C, y luego se enfriaron a 20 °C. Las muestras de 80 yL de las mezclas de reacción PAHBAH desarrolladas se transfirieron a una nueva placa, y se midió la absorbencia a 405 nm en un espectrofotometro. 9.2 Determinación del RenddLmiento de la Remoción de Manchas El rendimiento de remoción de manchas de AmyE y las variantes AmyE se . determinó usando micro muestras de manchas de almidón de arroz CS-28. Micro muestras de 6.35 mm (½ pulgadas) de diámetro circular se obtuvieron de CFT Vlaardingen (Países Bajos) . Dos micromuestras se colocaron dentro de cada pocilio de una placa de micro título de 96 pocilios.

Las muestras de caldo de cultivo filtradas se sometieron a prueba en una concentración apropiada mediante la dilución con una muestra de NaCl 10 nm, CaCl2 0.1 mM, Tween-80 al 0.005% a 20x la concentración final en la prueba de 44 rendimiento. La concentración final de enzimas fue de aproximadamente 0.025-0.10 ppm. El rendimiento de la amilasa se midió tanto en pH 8 como en pH 10.

Ya sea 190 µ? de (A) una solución amortiguadora que contiene HEPES 25 mM (Sigma, H7523) , CaCl2 2 mM, Tween-80 al 0,005%, pH 8.0, o (B) una solución amortiguadora que contiene CAPS 25 mM (Sigma, C2632) , CaCl2 mM, Tween-80 al 0.005%, pH 10.0 se agregaron a cada pocilio de las placas que contienen las micro muestras. 10 µ? de muestras de amilasa diluidas se agregaron a cada pocilio para proporcionar un volumen total de 200 µ?/pocillo. La placa se cubrió con un sello de placa y se colocó en una incubadora iEMS durante 60 minutos a 40°C con agitación a 1,150 rpm. Después de la incubación bajo las condiciones apropiadas, 100 µ? de solución de cada pocilio se removieron y se colocaron dentro de una placa de micro título nueva, y la absorbencia se midió a 480 nm en un espectrofotómetro . Los "controles en blanco" que contienen 2 micromuestras por pocilio y detergente pero sin muestras de amilasa, también se incluyeron en la prueba.

Calculo del rendimiento de la hidrólisis del almidón de arroz CS-28: El valor de absorbencia obtenida se corrigió para el valor del control en blanco. La absorbencia resultante, "???488," fue una medida para la actividad de la amilasa. Para cada AmyE o variante AmyE, el índice de rendimiento se calculó al dividir la actividad de la variante por la actividad enzimática de tipo natural. El índice de rendimiento representa de esta manera una comparación del rendimiento de la variante (valor actual) y la enzima de referencia AmyE estándar (valor teórico) en la misma concentración de proteínas. Además, los valores teóricos se calcularon, usando los parámetros de„- la ecuación de Langmuir de la enzima AmyE estándar.

Las variantes con diferencias de rendimiento sobre la enzima de tipo natural se caracterizaron por un índice de rendimiento (PI) . Un PI mayor que 1 (PI > 1) identificó una mejor variante comparada con el estándar, por ejemplo, de tipo natural, mientras que un PI de 1 (PI = 1) identifico una variante que se desempeña lo mismo como la estándar. Un PI menor que 1 (PI < 1) identificó una variante que se desempeña peor que la estándar. 9.3 Determinación de la Estabilidad del pH Un ensayo de la actividad de la amilasa que usa maltoheptaosa como un sustrato se usó para determinar _la estabilidad del pH de la AmyE y las variantes AmyE. La actividad de la alfa amilasa se midió al supervisar la producción de glucosa al pH 5.8 y pH 4, usando un ensayo cinético colorimétrico acoplado a enzimas. Las reacciones enzimáticas se llevaron a cabo en placas de micro título de 96 pocilios de poliestireno de fondo plano a temperatura ambiente. Para el ensayo conducido en pH 5.8, 5 µL· de sobrenadante del cultivo 5x diluido de AmyE o variantes AmyE en Tween-20 al 0.005% (p/v) en agua se mezclaron con 45 µ? de solución amortiguadora que contiene acetato de sodio, pH 5.8, CaCl2, Tween-20, peroxidasa de rábano picante (Sigma-Aldrich, cat . # 8375) y glucosa oxidasa (OxyGoMR Genencor División, Danisco US Inc.) . 50 µ? de volumen final contuvieron 50 mM, 2.6 mM, 0.005% (p/v), 20 U/ml y 50 U/ml de cada componente, respectivamente. Las reacciones se iniciaron por la adición de 50 µ? de solución amortiguadora que contiene acetato de sodio 50 mM , pH 5.8, 5.4 mg/ml de sal 2 , 2 ' -Azino-bis (ácido 3-et i lbenzot iazol in- 6 - sul fónico ) de diamonio (Sigma-Aldrich, cat. # A1888) y maltoheptaosa 10 mM (Sigma-Aldrich, cat. # M7753), se siguió por 5 segundos de mezclado. La formación de color en la reacción se superviso a 405 nm en intervalos de 9 segundos durante 240 segundos usando un espectrofotómetro SpectraMAX 250 (Molecular Devices, Union City, CA) . La actividad enzimática se reportó como la velocidad de formación de color durante el intervalo de 120-240 segundos de supervisión. Para el ensayo conducido en pH 4.0, el método como se describe anteriormente se repitió exactamente excepto usando la solución amortiguadora a pH 4.0 y 20 µL de muestras de AmyE o variante AmyE con 30 L de solución amortiguadora que contiene peroxidasa/glucosa oxidasa, ajustando la concentración de los componentes apropiadamente. 9.4 Determinación de la Termoestabilidad La termoestabilidad de la AmyE y variantes AmyE se midió al determinar la actividad de la amilasa en el sustrato de la maltotriosa en pH 5.8, supervisando la producción de glucosa usando un ensayo simétrico colorimétrico acoplado a enzimas. El método de ensayo usado en este punto fue el mismo como se describe anteriormente usando el sustrato de mal toheptaosa . Se usaron 20 pL de muestra de sobrenadantes de cultivo diluidos de AmyE o variantes AmyE, y la formación de color se supervisó durante el intervalo de 60-80 segundos de las reacciones. Además, 80 µ?,. de muestras de cultivos diluidos luego se transfirieron a nuevas placas, se ajustaron con selladores de placas, y se incubaron durante 30 minutos a 60°C con 650 rpm de agitación sobre un dispositivo iEMS (Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA) . Las placas se enfriaron sobre hielo durante 4 minutos luego 200 L de muestras se sometieron a ensayo para la actividad sobre el sustrato de maltotriosa como se describe anteriormente. Como el ensayo anterior, para cada AmyE o variante AmyE, el índice de rendimiento se calculó al dividir la actividad de la variante por la actividad enzimática de tipo natural. El índice de rendimiento comparó el rendimiento de la variante (valor actual) y la enzima de referencia AmyE estándar (valor teórico) en la misma concentración de proteínas.

Ej em lo 10 Rendimiento relativo de las variantes posicionales AmyE Usando los procedimientos en el Ejemplo 9, el rendimiento o actividad relativo de AmyE - 1 r se comparó con las variantes AmyE generadas como se describen en el Ejemplo 6. Se evaluó un total de 142 variantes posicionales que tienen seis o más miembros.

Definiciones: Aplican las siguientes definiciones. índice de rendimiento (PI) : relación de rendimiento de la variante a la proteína precursora.

Mutaciones espontáneas: PI > 1 Mutaciones neutras: PI > 0.5 Mutaciones no perjudiciales: PI > 0.05 Mutaciones perjudiciales: PI = 0.05 Posiciones Completamente Restrictivas: Mutaciones no neutras para la proteína y la actividad.

Posiciones no Totalmente Restrictivas: Por lo menos una mutación neutra para una de las propiedades sometidas a prueba.

Posiciones no Restrictivas: = 20% de mutaciones neutras para por lo menos una propiedad.

La Tabla 2 resume los resultados de las clasificaciones de evaluación de sitio de AmyE y variantes AmyE. En la Tabla 2, la Columna 1 indica la posición de aminoácidos investigada. La Columna 2 muestra el aminoácido en esa posición en la enzima de tipo natural. La Columna 3 indica el número de variantes en la posición que se investigó en este estudio. Las Columnas subsecuentes proporcionan el número de variantes, seguido por el porcentaje (%) de las mutaciones Neutras identificadas por cada ensayo realizado. Las propiedades sometidas a prueba fueron como sigue: Columnas 4 y 5 (harina de arroz ddG) , actividad específica en el sustrato de harina de arroz; Columnas 6 y 7 (DP3 ddG), hidrólisis de la maltotriosa en pH 5.8; Columnas 8 y 9 (DP7 pH 4 ddG), hidrólisis de la maltoheptaosa en pH 4; Columnas 10 y 11 (DP7 pH 5.8 ddG) hidrólisis de la maltoheptaosa en pH 5.8; Columnas 12 y 13 (DP3 HS ddG), estabilidad térmica (30 minutos a 60 °C) usando el ensayo de hidrólisis de la maltotriosa; columnas 14 y 15 (Limpio pH 8 ddG) , ensayo de micro muestra de manchas de almidón de arroz en pH 8; Columnas 16 y 17 (Limpio pH 10 ddG) , ensayo de micro muestras de manchas de almidón de arroz en pH 10. Los 150 sitios evaluados en la AmyE truncada contuvieron dos posiciones completamente restrictivas, es decir, 75 y 123. Los 295 sitios evaluados en la AmyE de longitud completa contuvieron 10 posiciones completamente restrictivas, es decir, 75, 97, 101, 102, 120, 133, 137, 182, 266 y 306.

O Ul ISZ ? o H-1 o s? o EJEMPLO 11 Formación de etanol por AmyE En este ejemplo, se condujeron experimentos para probar el desempeño de AmyE truncado en fermentación de etanol convencional en producto de licuefacción de Illinois River Energy (IRE) (31% DS) usando un ensayo de fermentación de etanol convencional. Brevemente, lotes de 31% de producto de licuefacción DS Illinois River Energy (IRE) con urea 400 ppm se prepararon y el pH de un lote se ajusta a 4.3 y el otro se ajusta a pH 5.8 con H2S04 5 N. 100 g sustrato se usó por matraz (125 mi Erlenmeyer) . Las enzimas se dosificaron como se indica. Las fermentaciones se inocularon con 0.2 mi de 10% (p/v) levadura Roja de Etanol Red Star (prehidratado -45 min en agua DI) . Los matraces se incubaron a 32 °C con barras de agitación a 320 rpm durante 48h de fermentación. La cantidad de etanol producido se midió por análisis HPLC . El desempeño de AmyE truncado (SEQ ID NO: 2) se comparó con amilasa Spezyme® Xtra (SEQ ID NO: 4) en pH 4.3 y pH 5.8. AmyE truncado y amilasa Spezyme® Xtra se dosificaron en 0.2 mg/gDS.

Como se muestra en la FIG. 11, el rendimiento de etanol final producido por AmyE truncado en pH 5.8 es 12.0% (v/v) . AmyE truncado en pH 4.3 proporcionó un rendimiento de etanol final de 7.3% (v/v) . Los rendimientos de etanol finales en la presencia de amilasa Spezyme® Xtra fueron 2.7% (v/v) en pH 4.3 y 3.9% (v/v) en pH 5.8.

EJEMPLO 12 Comparación de formación de etanol por AmyE y otras a- amilasas En este ejemplo, se condujeron experimentos para comparar la capacidad de Amy E de longitud completa (SEQ ID NO: 1) y AmyE truncado (SEQ ID NO: 2) para hidrolizar almidón granular insoluble (sin cocinar) en etanol en pH 4.3 y pH 5.8, usando la fermentación de etanol en ensayo de maíz molido entero descrito en el Ejemplo 11.

Usando este ensayo, el rendimiento de formación de etanol de AmyE de longitud completa y truncado se comparó con amilasa alfa A. kawachii (AkAA, GC626), dosificado en 1.5 SSU/g (una unidad de la unidad de almidón soluble SSU de actividad de enzima es equivalente a la potencia reducida de 1 mg de la glucosa liberada por minuto de la hidrólisis de sustrato de almidón de papa soluble (4%ds) a pH 4.5 y 50°C) y STARGEN™ 002 (alfa amilasa Aspergillus kawachi expresada en Trichoderma reesei y una glucoamilasa de Trichoderma reesei que trabaja sinérgicamente para hidrolizar sustrato de almidón en gránulos a glucosa), dosificado en 0.5 GAU/g,. donde una Unidad de Glucoamilasa (GAU) es la cantidad de enzima que producirá 1 µ? de azúcar reducida, calculada como glucosa por hora a partir de un sustrato de almidón soluble (4% ds) a pH 4.2 y 60°C. Las definiciones de SSU and GAU se describen en mayor detalle en la Pat . E.U.A. No. 7,037,704. Ambas, AmyE de longitud completa y AmyE truncada se dosificaron a 0.2 mg/gDS .

La FIG. 12 muestra los resultados observados cuando se compara el desempeño de estas enzimas, a pH 4.3 y 5.8, y se reporta como rendimiento de etanol final producido. Cuando se prueba a pH 5.8, AmyE tanto de longitud completa como truncada se desempeña muy comparable a Stargen™ 002, con AmyE de longitud completa que supera los rendimientos de etanol observados por Stargen™ 002 a pH 4.3. La AmyE truncada cuando se prueba a pH 5.8 se desempeña muy comparablemente a Stargen™ 002 probada al mismo pH . En comparación, la alga amilasa A. kawachii se desempeña muy pobremente a pH tanto 4.2 como pH 5.8.

EJEMPLO 13 Formación de glucosa por alfa amilasas de Bacillus subtilis En este ejemplo, se condujeron experimentos para determinar la capacidad de las alfa amilasas de Bacillus subtilis para convertir maltosa a glucosa a pH 4.5 y 5.6 usando el ensayo de formación de glucosa descrito en el Ejemplo 2. Las reacciones se analizaron después de 2, 5 y 8 días.

Como se muestra en FIG. 13, la AmyE de longitud completa de B. subtilis (SEQ ID NO: 1) , AmyE truncada (SEQ ID NO: 2), y a-amilasa Amy 31A variante (SEQ ID NO: 3) convierten efectivamente maltosa a glucosa, mientras que la a-amilasa truncada de Geobacillus stearothermophilus, AmyS (SEQ ID NO: 4), sólo muestra una cantidad mínima de formación de glucosa bajo estas condiciones .

EJEMPLO 14 Acción de AmyE en Almidón Puro En este ejemplo, se condujeron experimentos para determinar la capacidad de AmyE de longitud completa (SEQ ID NO: 1), para hidrolizar almidón granular insoluble (sin cocinar) . El método HPLC usado para la detección de sacáridos producidos de almidón insoluble es como sigue.

Se diluyó Amy E purificado (24.5 g/L) hasta una concentración final de 20.4 ppm en solución amortiguadora de ácido málico, pH 5.6. La proteína se agregó entonces a una solución de harina de maíz al 5% en solución amortiguadora de ácido málico, pH 5.6 hasta una concentración final de 1 ppm. La mezcla se incubó entonces en un agitador a 32°C. Las muestras se removieron periódicamente y diluyeron en NaOH 50mM para apagar la reacción. Se inyectaron muestras de 10 ih en u 2 sistema HPLC (Agilent 1000) habilitado con detección electroquímica. Se usó una columna PA1 con un gradiente de NaOH y Na-acetato corrido a 25°C. La distribución se determinó a partir de estándares de corrida previos.

Resultados: La incubación de almidón puro con 1 ppm enzima AmyE de longitud completa lleva a una liberación dependiente del tiempo de numerosos oligosacáridos (DP2, 3,4,5,6,7) así como glucosa (DPI) . La apariencia de estos productos de degradación se cuantificó por análisis HPLC de puntos de tiempo de digestión. Los datos para muestras de 0, 30 y 90 minutos se muestran en la FIG. 14. Se observaron resultados comparables de la enzima AmyE truncada (datos no mostrados) .

Ejemplo 15 Bibliotecas de posición en AmyE de longitud completa Se generaron bibliotecas de posición en 295 sitios <en AmyE de longitud completa (SEQ ID NO: 1) por Geneart (Geneart GmbH, Josef-Engert-strasse 11, D-93053 Regensburg, Alemania). La Tabla 3 enlista cada residuo para el cual se hizo una colección de posición SEQ ID NO: 1.

Tabla 3. Bibliotecas de posición generadas en Amy-E de longitud completa Número de Número de residuo en residuo en AmyE de Residuo AmyE de Residuo No . de longitud de tipo No. de longitud de tipo Variante completa natural Variante completa natural 1 6 I 24 37 I 2 7 K 25 38 Q 3 9 G 26 39 T 4 10 T 27 40 s 5 11 I 28 41 P 6 12 L 29 42 I 7 13 H 30 43 N 8 14 A 31 45 V 9 15 W 32 46 K 10 16 N 33 48 G 11 17 W 34 52 D 12 19 F 35 53 K 13 21 T 36 55 M 14 22 L 37 57 N 15 26 M 38 58 W 16 27 K 39 60 W 17 29 I 40 61 L 18 30 H 41 62 Y 19 31 D 42 63 Q 20 32 A 43 64 P 21 33 G 44 65 T 22 34 Y 45 66 s 23 36 A 46 67 Y Número de Número de residuo en residuo en AmyE de Residuo AmyE de Residuo No. de longitud de tipo No. de longitud de tipo Variante completa natural Variante completa natural 47 69 I 70 98 A 48 70 G 71 99 V 49 71 N 72 100 I 50 72 R 73 101 N 51 74 L 74 102 H 52 75 G 75 103 T 53 77 E 76 104 T 54 79 E 77 105 S 55 80 F 78 110 I 56 81 K 79 111 s 57 82 E 80 113 E 58 83 M 81 114 V 59 84 C 82 117 I 60 86 A 83 120 w 61 87 A 84 121 T 62 88 E 85 122 H 63 89 E 86 126 Q 64 92 I 87 128 K 65 93 K 88 129 N 66 94 V 89 130 W 67 95 I 90 131 S 68 96 V 91 133 R 69 97 D 92 135 D Número de Número de residuo en residuo en AmyE de Residuo AmyE de Residuo No . de longitud de tipo No. de longitud de tipo Variante completa natural Variante completa natural 93 136 V 116 167 N 94 137 T 117 168 D 95 138 Q 118 169 G 96 139 N 119 170 A 97 140 S 120 171 D 98 141 L 121 172 G 99 144 L 122 173 F 100 145 y 123 174 R 101 146 D 124 175 F 102 147 w 125 176 D 103 148 N 126 177 A 104 149 T 127 178 A 105 150 Q 128 179 K 106 151 N 129 180 H 107 154 V 130 181 I 108 155 Q 131 182 E 109 157 Y 132 183 L 110 158 L 133 184 P 111 159 K 134 186 D 112 161 F 135 189 Y 113 162 L 136 191 S 114 164 R 137 193 F 115 165 A 138 194 W Número de Número de residuo en residuo en AmyE de Residuo AmyE de Residuo No . de longitud de tipo No . de longitud de tipo Variante completa natural Variante completa natural 139 196 N 162 231 Y 140 197 I 163 232 G 141 198 T 164 235 I 142 204 F 165 236 R 143 205 Q 166 237 S 144 206 Y 167 238 A 145 207 G 168 239 L 146 208 E 169 241 N 147 209 I 170 242 R 148 210 L 171 244 L 149 211 Q 172 246 V 150 215 s 173 249 I 151 216 R 174 256 V 152 217 D 175 258 A 153 220 Y 176 260 K 154 223 Y 177 261 L 155 224 M 178 262 V 156 225 D 179 263 T 157 226 V 180 264 W 158 227 T 181 265 V 159 228 A 182 266 E 160 229 S 183 267 S 161 230 N 184 268 H Número de Número de residuo en residuo en AmyE de Residuo AmyE de Residuo No. de longitud de tipo No . de longitud de tipo Variante completa natural Variante completa natural 185 269 D 208 300 T 186 270 T 209 301 P 187 271 Y 210 302 L 188 272 A 211 303 F 189 273 N 212 304 F 190 278 S 213 305 S 191 279 T 214 306 R 192 280 w 215 307 P 193 281 M 216 312 N 194 285 D 217 315 R 195 286 I 218 316 F 196 288 L 219 322 I 197 289 G 220 326 G 198 290 W 221 329 L 199 291 A 222 330 F 200 292 V 223 332 D 201 293 I 224 334 A 202 294 A 225 335 I 203 295 S 226 336 T 204 296 R 227 337 A 205 297 S 228 338 V 206 298 G 229 339 N 207 299 S 230 340 R Número de Número de residuo en residuo en AmyE de Residuo AmyE de Residuo No . de longitud de tipo No . de longitud de tipo Variante completa natural Variante completa natural 231 341 F 254 373 L 232 342 H 255 374 A 233 343 N 256 375 N 234 344 V 257 376 A 235 345 M 258 377 G 236 348 Q 259 379 S 237 350 E 260 380 S 238 351 E 261 381 V 239 352 L 262 383 I 240 353 S 263 384 N 241 354 N 264 387 T 242 355 P 265 389 L 243 356 N 266 391 D 244 360 Q 267 392 G 245 361 I 268 394 Y 246 362 F 269 396 N 247 363 M 270 397 K 248 364 N 271 398 A 249 365 Q 272 399 G 250 366 R 273 402 S 251 370 G 274 403 F 252 371 V 275 404 Q 253 372 V 276 405 V Número de residuo en AmyE de Residuo No . de longitud de tipo Variante completa natural 277 407 D 278 408 G 279 409 K 280 410 L 281 411 T 282 412 G 283 413 T 284 414 I 285 415 N 286 416 A 287 417 R 288 418 S 289 419 V 290 420 A 291 421 V 292 422 L 293 423 Y 294 424 P 295 425 D Se generaron veinte colecciones en las posiciones 27, 30, 45, 52, 75, 88, 89, 126, 131, 167, 184, 223, 238, 241, 260, 307, 312, 344, 380 y 402 en tanto AmyE de longitud completa como AmyE-tr. Los transformantes de B. subtilís que contienen las variantes de sustitución de AmyE de longitud completa se cultivaron como se describe en el Ejemplo 8. Se usaron sobrenadantes de cultivo para los ensayos.

Ejemplo 16 Desempeño de variantes AmyE Usando los procedimientos descritos en los Ejemplos 8 y 9, el desempeño o actividad relativa de AmyE de longitud completa y AmyE truncada se comparó con las variantes generadas en AmyE de longitud completa y Amy E truncada. La Tabla 4 resume los resultados de las selecciones de evaluación de sitio de variantes AmyE de longitud completa y la Tabla 5 resume los resultados de las selecciones de evaluación de sitio de variantes AmyE truncadas. La Columna 1 muestra el aminoácido en la enzima de tipo natural. La Columna 2 indica la variante en la posición que se investigó en este estudio. Las columnas posteriores muestran los valores de índice de desempeño de las variantes para las propiedades probadas. Las propiedades probadas fueron como sigue: determinación de proteína por ensayo Bradford (expresión), velocidad de reducción de viscosidad (viscosidad pico) , reducción en viscosidad post-licuefacción (viscosidad final), grado de polimerización (yodo), extremos reducidos generados (extremos reducidos), glucosa total presente (glucosa), hidrólisis de maltheptaosa a pH 5.8 (DP7 pH 5.8), estabilidad al calor (30 min a 60°C) usando hidrólisis de mal toheptahosa a pH 5.8 (DP7 pH 5.8 calentado) , hidrólisis de maltoheptaosa a pH 4 (DP7 pH 4) , estabilidad al calor (30 min a 60°C) usando hidrólisis de maltotriosa a pH 5.8 (DP3 HS), actividad específica en sustrato de harina de maíz por 30 min (harina de maíz 30 min) , ensayo de micromuestra de teñido de almidón de arroz a pH 8 (Limpieza pH 8) , y ensayo de micromuestra de teñido de almidón de arroz a pH 10 (limpieza, pH 10) . El índice de desempeño (Pi) se define como la relación de desempeño de la variante para una proteína precursora .

Tabla 4. Valores del índice de desempeño promedio para variantes de longitud completa AmyE 5 10 15 5 10 5 10 5 10 15 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 15 5 10 5 10 5 10 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 10 5 10 10 5 10 10 5 10 5 10 15 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 15 5 10 5 10 15 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 I 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 10 5 10 5 10 5 10 5 10 15 5 10 15 5 10 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 15 5 10 5 10 15 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 10 5 10 5 10 10 15 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 " 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 15 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 10 5 10 5 10 5 10 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 10 \ 15 Tabla 5. índices de desempeño promedio de variantes truncadas AmyE para las propiedades probadas 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 15 5 10 15 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 Con base en los datos de desempeño relativas de variantes AmyE para las propiedades descritas en las Tablas 2, 4, y 5, las posiciones truncadas y de longitud completa AmyE se clasificaron como sigue: Posiciones completamente restrictivas: sin mutaciones neutras para cualquier propiedad probada.

Posiciones no completamente restrictivas: al menos una mutación neutra para una de las propiedades probadas.

Posiciones no restrictivas: > 20% de mutaciones neutras para al menos una propiedad.

La Tabla 6 muestra laas posiciones no completamente restrictivas y la identidad del residuo de aminoácido de tipo natural en cada posición en las variantes truncadas AmyE, junto con el % de mutaciones neutras para cada propiedad. Todas de las posiciones enlistadas pueden mutarse para alterar el desempeño en la manera deseada para cualquiera de las propiedades probadas. La Tabla 7 muestra las posiciones no completamente restrictivas y los residuos de aminoácido de tipo natural en cada posición en las variantes AmyE de longitud completa, con el % de mutaciones neutras para cada propiedad. De nuevo, todas de las posiciones enlistadas pueden mutarse para alterar el desempeño de la manera deseada para cualquiera de las propiedades probadas .

Tabla 6. Posiciones no completamente restrictivas en AmyE truncado 5 15 15 10 15 15 15 15 15 15 15 10 Tabla 7. Posiciones no completamente restrictivas en AmyE de longitude completa 15 5 5 10 5 10 5 10 5 10 5 5 10 5 5 5 5 5 10 5 5 5 10 5 15 Como será evidente de la descripción anterior, ciertas posiciones pueden mutarse en polipéptidos AmyE para alterar una o más propiedades sin sustancialmente de manera adversa afectar cualquier propiedad. Estas mutaciones colectivamente se refieren como mutaciones combinables para propiedades de superficie. Tales posiciones son buenos candidatos para hacer mutaciones sencillas, y combinaciones de mutaciones, ya que se toleran generalmente para manipulación. Por otro lado, las mutaciones en esta posición imparten propiedades distinguibles en las variantes AmyE resultantes, indicando que son importantes para la estructura y/o función de la enzima. Las posiciones correspondientes en otras amilasas precursoras, incluyendo o¡-amilasa diferente a AmyE puede mutarse de manera similar. En algunos casos, donde la posición correspondiente en otras amilasas precursoras incluye un residuo de aminoácido diferente, puede mutarse para incluir un residuo de aminoácido encontrado en un polipéptido AmyE de tipo natural. Las posiciones son como sigue : 052D, 052E, 0521, 052K, 052L, 052N, 052Q, 052R, 052V, 056D, 056E, 0561, 056K, 056L, 056N, 056Q, 056R, 056V, 089D, 089E, 0891, 089K, 089L, 089N, 089Q, 089R, 089V, 152D, 152E, 1521, 152K, 152L, 152N, 152Q, 152R, 152V, 153D, 153E, 1531, 153K, 153L, 153N, 153Q, 153R, 153V, 201D, 201E, 2011, 201K, 201L, 201N, 201Q, 201R, 201V, 251D, 251E, 2511, 251K, 251L, 251N, 251Q, 251R, 251V, 284D, 284E, 2841, 284K, 284L, 284N, 284Q, 284R, 284V, 297D, 297E, 2971, 297K, 297L, 297N, 297Q, 297R, 297V, 308D, 308E, 3081, 308K, 308L, 308N, 308Q, 308R, 308V, 321D, 321E, 3211, 321K, 321L, 321N, 321Q, 321R, 321V, 328D, 328E, 3281, 328K, 328L, 328N, 328Q, 328R, 328V, 347D, 347E, 3471, 347K, 347L, 347N, 347Q, 347R, 347V, 357D, 357E, 3571, 357K, 357L, 357N, 357Q, 357R, 357V, 359D, 359E, 3591, 359K, 359L, 359N, 359Q, 359R, 359V, 369D, 369E, 3691, 369K, 369L, 369N, 369Q, 369R, 369V, 385D, 385E, 3851, 385K, 385L, 385N, 385Q, 385R, 385V, 388D, 388E, 3881, 388K, 388L, 388N, 388Q, 388R, 388V, 391D, 391E, 3911, 391 , 391L, 391M, 391Q, 391R, 391V, 400D, 400E, 4001, 400K, 400L, 400N, 400Q, 400R, 400V, 416D, 416E, 4161, 416K, 416L, 416N, 416Q, 416R, y 416V.

Las mutaciones en todas estas mutaciones tienen valores PI >0.5 para tanto proteína como actividad, demostrando que las posiciones pueden mutarse sin destruir la expresión o desempeño de la proteína.

Ejemplo 17 Licuefacción en el Viscosímetro La reducción de viscosidad de harina de maíz debido a la acción de la a-amilasa se vigiló usando un instrumento HAAKE Viscotester 550. La mezcla espesa del sustrato se hace fresca diariamente en modo de lote con sólidos secos de harina de maíz al 30%. El pH se ajustó hasta 5.8 usando ácido sulfúrico. 50 g de la mezcla espesa (15 g de sólidos secos) se pesan y pre-incuban, con agitación, durante 10 minutos para calentarse 7 hasta 70°C. Durante la adición de a amilasa la temperatura se eleva inmediatamente desde 70°C hasta 85°C con una velocidad de rotación de 75 rpm. Una vez que la temperatura de la mezcla espesa y mezcla de enzima alcanza 85°C, su temperatura se mantiene constante y la viscosidad se vigila durante unos 30 minutos adicionales. La viscosidad se midió a lo largo de la corrida y se reporta en u m.

El AmyE de tipo natural (de longitud completa o truncado) y diversas variantes, del mismo, se dosificaron en desde alrededor de 0.25 hasta 1.5 mg/50 g de mezcla espesa de harina de maíz y la viscosidad se registra.

Una gráfica típica de la viscosidad de la mezcla espesa con el tiempo se muestra en la FIG 15, en la cual el AmyE de longitud completa de tipo natural, y las variantes de longitud completa AmyE I100F y W60M se comparan. En otros casos, sólo la viscosidad del pico y final de la mezcla espesa se tabulan. Los resultados para AmyE de longitud completa, de tipo natural, y las variantes L142F, L142G, L142Q, L142S, L142W, L142Y, A214I, A214V, S245Y, Q126F, Q126L, Q126P, Q126V, S131L, y S254I, hechas en el fondo de AmyE de longitud completa, se muestran en las Tablas 8 y 9. Los resultados para AmyE truncado, de tipo natural, y las variantes W60L, W60M, W60N, I100F, I100M, S105M, S105W, G207A, T270A, T270E, T270L, T270N, T270V, y T279A, hechas en el fondo truncado de AmyE, se muestran en la Tabla 10.

Tabla 8. Pico y viscosidad final obtenida usando AmyE variante y tipo natural truncado (bolsa de harina de maíz F) Tabla 9. Pico y viscosidad final obtenida usando AmyE variante y tipo natural truncado (bolsa de harina de maíz G) dosis (mg) Viscosidad pico Viscosidad final TN 0.60 33600 890 L142F 0.45 28000 700 L142G 0.30 25300 2620 L142Q 0.30 26300 4320 L142S 0.25 31200 11200 L142Y 0.60 28600 570 dosis (mg) Viscosidad pico Viscosidad final A214I 0.60 25200 780 Q126F 0.50 32400 2020 S254I 0.60 32500 1320 Tabla 10. Pico y viscosidad final obtenida usando AmyE variante y tipo natural truncado (bolsa de harina de maíz H) Desempeño mejorado en el ensayo de viscosímetro se puede identificar usando una serie de criterios, esto es, viscosidad pico disminuida, viscosidad final disminuida, o una dosis de enzima disminuida requerida para producir viscosidades pico o final similares relativas a la dosis requerida para una enzima de referencia (control) . El texto en negrita destacado en las Tablas 8-10 indica el criterio en el cial cada variante demuestra desempeño mejorado comparado con el control de tipo natural respectivo.

Ejemplo 18 Te moestabilidad de AmyE de longitud completa, variantes AmyE-tr y AmyE usando Calorimetría de Barrido Diferencial Las curvas de capacidad de calor de exceso se midieron usando un microcalorímetro de alto rendimiento de exploración ultrasensible, VP-Cap DSC (MicroCal, Inc., Northampton, MA, EUA) . El procedimiento estándar para medidas DSC y la teoría de la técnica se publican previamente (Freiré, E. (1995) Ddifferencial Scanning Clorimetry Methods . Mol. Biol . 41:191-218) . Aproximadamente 500 yi de 0.5 mg/ml de variantes AmyE-tr, o AmyE truncado se exploraron sobre un intervalo de temperatura de 30-120°C. La misma muestra luego se volvió a escanear para checar la reversibilidad del proceso. La solución amortiguadora usada fue acetato de sodio 10 mM, pH 4.0 o pH 5.8. Una velocidad de exploración 200°C/hr se usó para minimizar cualquier artefacto que puede resultar de la suma. El punto medio térmico (Tm) de las curvas DSC se usó como un indicador de la estabilidad térmica. La Tabla 11 muestra los valores Tm de variantes AmyE truncado tipo natural y AmyE truncado probados en pH 4.0 y pH 5.8.

Ejemplo 19 Descomposición de Pan El siguiente ejemplo se refiere al uso de polipéptidos AmyE para reducer la descomposición de pan.

?. Ensayos de Recetas para Hornear Los ensayos para hornear se llevaron a cabo con una receta de masa y bizcocho de pan blanco estándar para pan tostado de E.U. La masa de bizcocho se prepara de 1400 g de harina "Gold Medal" de General Mills, E.U., 800 g de agua, 40 g de aceite de colza, 7,5 g GRINDSTED™ SSL P55 Veg, 10 g emulsionante DIMODAN™ PH200 y 60 g de levadura comprimida. El bizcocho se mezcla durante 1 min. en baja velocidad y posteriormente 3 min. en velocidad 2 en un mezclador espiral Hobart . El bizcocho se fermenta posteriormente durante 3 horas en 25°C, 85% RH.

Posteriormente, 600 g de harina "Gold Medal", 18 g de levadura comprimida, 5 g de propionato de calcio, 160 g de sacarosa, 5 g de propionato de calcio, 432 g de agua y ácido ascórbico (60 ppm concentración final) y ADA (azodicarbonamida ; 40 ppm concentración final) se agregan al bizcocho. La masa resultante se mezcla durante 1 min. en baja velocidad y luego 2 min. en alta velocidad en un mezclador Diosna. Luego 30 g de sal se agrega a la masa.

La masa se reposa durante 5 min. a temperatura ambiente, y luego 550 g de piezas de masa se escalan, moldean en laminadora Glimek con la configuración 1:4, 2:4, 3:15, 4:12 y el ancho de 8 en ambos lados y transfieren a una forma de horneado. Después de 65 min. de pruebas en 43 °C en RH 95% las masas se hornean durante 26 min. a 200°C en un horno MIWE .

B. Protocolo para Evaluación de Firmeza, Elasticidad y Cohesión La firmeza, elasticidad y cohesión se determinan al analizar rebanadas de pan por Análisis de Perfil de Textura usando un Analizador de Textura de Stable Micro Systems, UK. El cálculo de firmeza y elasticidad se da de acuerdo a un estándar preestablecido suministrado por Stable Micro System, UK. La sonda usada es de aluminio de 50 mm redonda.

El pan se rebana con el ancho de 12.5 mm. Las rebanadas se sellan hacia fuera a una pieza circular con un diámetro de 45 mm e individualmente medido.

Los siguientes ajustes se usan: Velocidad de Pre Prueba: 2 mm/s, Velocidad de Prueba: 2 mm/s, Velocidad de Prueba Posterior: 10 mm/s, Distancia de Prueba de Ruptura: 1%, Distancia: 40%, Fuerza: 0.098 N, Tiempo: 5.00 seg, Cuenta: 5, Célula de Carga: 5 kg, Tipo de Activador: Auto -0.01 N.

El modo de compresión es una modificación a uno usado en el Método estándar AACC 74-09. La muestra se comprime dos veces en la prueba.

C. Protocolo para Evaluación de Firmeza La firmeza se determinó en compresión 40% durante la primera compresión. La figura es la fuerza necesaria para comprimir la rebanada a 40% del espesor total. Entre más bajo el valor, más suave el pan. La firmeza se expresó como una presión, por ejemplo, en hPa.

D. Propiedades de Manipulación Mejoradas de Productos Alimenticios Tratados con Polipéptidos de Variante AmyE El pan se horneó con 0.4 mg/kg de AmyE tr y la firmeza del pan se probó de acuerdo al protocolo establecido arriba en diversos momentos después del horneado. La firmeza del pan se probó. Como un control, la firmeza del pan horneado sin ninguna enzima también se mide.

La Figura 16 muestra los resultados de un ensayo para hornear en el cual la firmeza del pan tratado con AmyE tr se compare con la firmeza del pan sin enzima. Un incremento reducido en la firmeza del día 1 hasta el día 14 en el pan horneado con AmyE tr indica que la enzima tiene efecto antienvejecimiento y puede mejorar el mantenimiento fresco del pan.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (25)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones .

1. Un método para licuación y sacarificación de almidón en un proceso de conversión de almidón, caracterizado porque comprende poner en contacto un sustrato de almidón con un polipéptido AmyE para formar una mezcla de reacción para licuefacción y sacarificación del sustrato de almidón en la mezcla de reacción para producir glucosa, en donde la licuefacción y sacarificación se realizan en la misma mezcla de reacción sin un ajuste de pH.

2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la sacarificación se realiza en la ausencia de un polipéptido adicional que tiene actividad de glucoamilasa .

3. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la licuefacción se realiza a un pH adecuado para la actividad de un polipéptido de glucoamilasa.

4. El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque el pH es 5.0 o menor.

5. El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque el pH es 4.5 o menor.

6. El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque el pH es 4.0 o menor.

7. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque un polipéptido adicional que tiene actividad de glucoamilasa se agrega a la mezcla de reacción antes de poner en contacto el sustrato de almidón con el polipéptido AmyE.

8. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque un polipéptido adicional que tiene actividad de glucoamilasa se agrega a la mezcla de reacción depués de poner en contacto el sustrato de almidón con el polipéptido AmyE.

9. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque un polipéptido adicional que tiene actividad de glucoamilasa se agrega a la mezcla de reacción simultáneamente al poner en contacto el sustrato de almidón con el polipéptido AmyE.

10. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque además comprende fermentar la glucosa producida por la licuefacción y sacarificación para producir un alcohol.

11. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el alcohol es etanol.

12. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque al menos una porción de la sacarificación y fermentación ocurre en la misma mezcla de reacción simultáneamente.

13. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque además comprende poner en contacto la glucosa producida por la licuefacción y sacarificación con una glucosa isomerasa para producir fructosa.

14. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el calcio exógeno no se agrega a la mezcla de reacción.

15. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la concentración de calcio en la mezcla de reacción es menor que alrededor de 8 ppm.

16. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque además comprende poner en contacto la glucosa producida por la licuefacción y sacarificación con una glucosa isomerasa para producir fructosa sin reducir la cantidad de calcio en la mezcla de reacción.

17. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el polipéptido AmyE tiene al menos 80% de identidad de secuencia de aminoácido con la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO: 1.

18. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el polipéptido AmyE tiene al menos 90% de identidad de secuencia de aminoácido con la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO: 1.

19. El método de conformidad . con la reivindicación 1, caracterizado porque el polipéptido AmyE incluye una eliminación del dominio enlazado de almidón C-terminal.

20. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el polipéptido AmyE es un polipéptido variante que tiene actividad de a-amilasa y al menos una característica alterada que mejora el desempeño de la enzima, el polipéptido variante comprende: una secuencia de aminoácido que tiene al menos 60% de identidad de secuencia de aminoácido a un polipéptido de a-amilasa precursor seleccionado de AmyE (SEQ ID NO: 1) o una variante truncada de AmyE (SEQ ID NO: 2) , y una modificación en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89 , 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112 , 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162 , 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170 , 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193 , 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214 , 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252 , 253 , 254 , 255 , 256 , 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 267, 268, 270, 271, 272 , 273, 274, 275, 276 , 277 , 278, 279, 280, 281, 282 , 283 , 284 , 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 307, 308, 309, 310, 311, 312 , 313 , 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340 341, 342, 343, 344 , 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373 , 374, 375, 376 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398 , 399, 400 401, 402 , 403, 404 , 405, 406 , 407, 408, 409, 410, 411, 412 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, y 425. en donde la modificación produce un polipéptido variante que tiene un índice de desempeño (PI) mayor que 1.0 para al menos una característica que mejora el desempeño de enzima.

21. El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque la modificación es una sustitución de uno o más residuos de amino presentes en el polipéptido precursor para diferenciar los residuos de aminoácido, en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste de 1A, 1C, ID, 1E, 1F, 1G, 1H, 1K, 1M, 1N, 1Q, IR, is, IT, IV, 1 , 1Y, 2A, 2C, 2D, 2E, 2F, 2G, 2H, 21, 2K, 2L, 2M, 2N, 2P, 2Q, 2R, 2S, 2V, 2W, 2Y, 3C, 3D, 3E, 3F, 3G, 3H, 31, 3K, 3L, 3M, 3N, 3P, 3Q, 3R, 3S, 3V, 3 , 3Y, 4C, 4D, 4E, 4F, 4G, 4H, 41, 4K, 4L, 4 , 4N, 4Q, 4S, 4T, 4V, 4W, 4Y, 5A, 5C, 5D, 5E, 5F, 5G, 5H, 51, 5K, 5L, 5N, 5R, 5V, 5W, 5Y, 6C, 6D, 6E, 6H, 6K, 6L, 6 , 6N, 6P, 6Q, 6R, 6S, 6T, 6V, 6 , 7A, 7C, 7D, 7E, 7F, 7G, 7H, 71, 7L, 7M, 7N, 7P, 7Q, 7R, 7S, 7T, 7W, 7Y, 8A, 8C, 8E, 8F, 8G, 8H, 81, 8K, 8L, 8M, 8N, 8P, 8Q, 8R, 8T, 8V, 8 , 8?, 9A, 9C, 9D, 9E, 9F, 9H, 91, 9K, 9M, 9N, 9P, 9R, 9S, 9T, 9V, 9W, 9Y, 10A, 101, 10L, , 10M, ION, 10P, 10Q, IOS, 10V, 11A, 11F, 11G, 11H, 11M, US, 11V, 11W, 11Y, 121, 12M, 12V, 13A, 13C, 13D, 13E, 13F, 13G, 131, 13L, 13M, 13Q, 13T, 13V, 13W, 13Y, 14C, 14F, 14G, 14M, 14N, 14S, 14T, 14V, 15A, 15F, · 16A, 16D, 16E, 16F, 16G, 16H, 161, 16L, 16M, 16Q, 16S, 16T, 16V, 17A, 17F, 171, 17M, 17Q, 17Y, 18A, 18C, 18D, 18E, 18G, 18H, 18M, 18N, 18Q, 18R, 18T, 19A, 19C, 19H, 19L, 19M, 19N, 19S, 19W, 19Y, 20A, 20C, 20D, 20F, 20G, 20H, 201, 20K, 20L, 20M, 20P, 20Q, 20R, 20S, 20T, 20V, 20W, 20Y, 21A, 21C, 21D, 21E, 21H, 211 , 21K, 21L, 21M, 21N, 21Q, 21R, 21S, 21V, 221 , 22M, 22Q, 22S, 22T, 22V, 23A, 23C, 23D, 23E, 23F, 23G, 23H, 231, 23L, 23M, 23N, 23R, 23S, 23T, 23V, 23W, 23Y, 24A, 24C, 24D, 24F, 24G, 24L, 24N, 24P, 24Q, 24R, 24S, 24T, 24V, 24Y, 25A, 25C, 25D, 25E, 25F, 25G, 25H, 251, 25K, 25L, 25R, 25S, 25T, 25V, 25 , 25Y, 26A, 26F, 261, 26L, 26V, 27A, 27C, 27D, 27E, 27F, 27G, 27H, 271, 27L, 27M, 27N, 27P, 27Q, 27R, 27S, 27T, 27V, 27 , 27Y, 28A, 28C, 28F, 28G, 28H, 281, 28K, 28L, 28M, 28N, 28P, 28Q, 28R, 28S, 28T, 28V, 28W, 28Y, 29A, 29C, 29F, 29L, 29M, 29T, 29V, 30A, 30C, 30D, 30E, 30F, 30G, 301, 30K, 30L, 30M, 30N, 30P, 30Q, 30R, 30S, 30T, 30V, 30 , 30Y, 31A, 31C, 31E, 31F, 31G, 31H, 311, 31K, 31L, 31M, 31N, 31Q, 31S, 31T, 31V, 31W, 31Y, 32D, 32F, 32G, 32H, 32K, 32L, 32M, 32Q, 32S, 32T, 32V, 32Y, 33A, 33C, 33D, 33E, 33F, 33H, 331, 33K, 33L, 33M, 33P, 33Q, 33S, 33T, 33W, 33Y, 34A, 34F, 341, 34P, 34W, 35A, 35C, 35F, 35G, 35H, 351, 35L, 35M, 35N, 35P, 35Q, 35R, 35S, 35V, 35W, 35Y, 36C, 36D, 36E, 36F, 36H, 361, 36K, 36L, 36M, 36N, 36Q, 36R, 36S, 36T, 36Y, 37L, 37M, 37N, 37V, 38A, 38C, 38D, 38E, 38H, 38L, 38M, 38N, 38P, 38V, 39A, 39C, 391, 39L, 39M, 39N, 39P, 39S, 39V, 40A, 40D, 40M, 40N, 40P, 40Q, 40T, 40V, 40W, 41A, 41C, 41E, 41G, 41N, 41S, 41V, 42A, 42L, 42M, 42P, 42V, 43A, 43G, 43H, 43L, 43M, 43Q, 43S, 43T, 43V, 44A, 44C, 44D, 44E, 44F, 44G, 44H, 441, 44K, 44L, 44M, 44N, 44P, 44R, 44S, 44T, 44V, 44 , 44Y, 45A, 45C, 45F, 45G, 45H, 451, 45L, 45M, 45N, 45P, 45Q, 45S, 45T, 45Y, 46A, 46C, 46D, 46E, 46F, 46H, 461 , 46L, 46M, 46N, 46Q, 46R, 46S, 46T, 46V, 46W, 46Y, 47A, 47C, 47D, 47F, 47G, 47H, 471, 47K, 47L, 47N, 47P, 47R, 47S, 47T, 47V, 47Y, 48A, 48C, 48D, 48E, 48F, 48H, 481, 48K, 48L, 48N, 48P, 48S, 48T, 48V, 48 , 49A, 49C, 49D, 49F, 49G, 49H, 491, 49K, 49L, 49P, 49Q, 49R, 49S, 49T, 49V, 49W, 49Y, 50A, 50C, 50E, 50F, 50G, 50H, 501, 50K, 50L, 50M, 50N, 50P, 50R, 50S, 50T, 50V, 50W, 50Y, 51A, 51C, 51D, 51E, 51F, 51H, 511, 51K, 51L, 51M, 51N, 51P, 51Q, 51R, 51S, 51T, 51V, 51W, 52A, 52C, 52E, 52F, 52G, 52H, 521, 52K, 52L, 52M, 52N, 52P, 52Q, 52R, 52S, 52T, 52V, 52W, 52Y, .53A, 53C, 53E, 53F, 53G, 53H, 531, 53L, 53N, 53P, 53R, 53S, 53T, 53V, 53 , 53Y, 54A, 54C, 54D, 54F, 54G, 54H, 541, 54L, 54M, 54N, 54P, 54Q, 54R, 54T, 54V, 54 , 54Y, 55A, 55C, 55D, 55E, 55F, 55G, 55H, 551, 55N, 55P, 55Q, 55S, 55T, 55Y, 56A, 56D, 56E, 56F, 56G, 561, 56K, 56L, 56M, 56N, 56P, 56Q, 56R, 56T, 56V, 56 , 56Y, 57A, 57C, 57D, 57E, 57F, 57H, 571, 57K, 57L, 57M, 57Q, 57R, 57S, 57T, 57V, 57W, 57Y, 58A, 58F, 58H, 59A, 59C, 59D, 59E, 59F, 59G, 59H, 59K, 59L, 59N, 59P, 59R, 59S, 59T, 59V, 59W, 60A, 60C, 60D, 60E, 60G, 601, 60K, 60L, .60 , 60N, 60Q, 60R, 60T, 60V, 61C, 61D, 61E, 61F, 61M, 61S, 61T, 61V, 62A, 62C, 62D, 62F, 62G, 62H, 621, 62K, 62L, 62Q, 62S, 62T, 62V, 63A, 63C, 63D, 63F, 63G, 63H, 63K, 63M, 63N, 63R, 63S, 64A, 64G, 64H, 641, 64L, 64M, 64N, 64S, 64V, 64Y, 65A, 65C, 65E, 65H, 651, 65K, 65L, 65M, 65Q, 65R, 65S, 66D, 66E, 66F, 66G, 66H, 661, 66K, 66L, 66 , 66N, 66Q, 66R, 66T, 66V, 66 , 66Y, 67A, 67C, 67D, 67E, 67F, 67G, 671, 67 , 67L, 67N, 67P, 67Q, 67S, 67T, 67W, 68A, 68C, 68D, 68E, 68F, 68G, 68H, 681, 68L, 68M, 68N, 68P, 68R, 68S, 68T, 68V, 68W, 68Y, 69A, 69C, 69M, 69P, 69T, 69V, 70A, 70E, 70H, 70N, 70S, 71S, 72C, 72D, 72E, 72F, 72G, 72H, 721, 72K, 72L, 72P, 72Q, 72S, 72T, 72V, 72W, 72Y, 73A, 73C, 73E, 73F, 73H, 731, 73K, 73L, 73M, 73P, 73S, 73T, 73V, 73 , 74A, 74E, 74F, 74M, 74S, 74T, 74Y, 75A, 75C, 75D, 75E, 75P, 76A, 76D, 76E, 76F, 76G, 761, 76L, 76M, 76P, 76Q, 76R, 76S, 76V, 76Y, 77A, 77C, 77D, 77G, 77H, 771 , 77K, 77L, 77R, 77S, 77T, 77V, 77W, 77Y, 78A, 78C, 78D, 78E, 78F, 78G, 78H, 781, 78K, 78L, 78M, 78N, 78P, 78R, 78S, 78T, 78V, 78W, 78Y, 79A, 79G, 79L, 79M, 79N, 79Q, 79S, 79T, 80A, 80L, 80M, 80 , 80Y, 81A, 81C, 81D, 81E, 81G, 81H, 811, 81L, 81M, 81N, 81Q, 81R, 81S, 81T, 81V, 81W, 81Y, 82A, 82D, 82F, 82G, 821, 82K, 82L, 82M, 82Q, 82R, 82S, 82T, 82V, 82W, 82Y, 83A, 83F, 831, 83L, 83T, 83V, 84A, 84D, 84E, 84G, 841, 84 , 84M, 84N, 84Q, 84S, 84T, 84V, 85D, 85E, 85F, 85G, 851, 85K, 85L, 85M, 85N, 85R, 85S, 85T, 85V, 85 , 86C, 86D, 86E, 86F, 86G, 861, 86K, 86L, 86M, 86N, 86Q, 86R, 86S, 86V, 86 , 86Y, 87F, 87G, 87T, 88A, 88C, 88D, 88F, 88G, 88H, 881, 88K, 88L, 88M, 88N, 88Q, 88R, 88S, 88T, 88V, 88W, 88Y, 89A, 89C, 89D, 89F, 89G, 89H, 891, 89K, 89L, 89M, 89N, 89P, 89Q, 89R, 89S, 89T, 89V, 89W, 89Y, 90C, 90D, 90E, 90F, 90G, 90H, 901, 90K, 90L, 90M, 90N, 90Q, 90R, 90S, 90T, 90V, 90W, 91A, 91C, 91D, 91E, 91F, 91H, 91K, 91L, 91M, 91N, 91P, 91Q, 91R, 91S, 91T, 91W, 91Y, 92L, 92N, 92T, 92V, 93A, 93C, 93D, 93E, 93F, 93G, 931, 93L, 93M, 93N, 93P, 93Q, 93R, 93S, 93T, 93V, 93 , 93Y, 94A, 94C, 941, 94M, 94T, 95A, 95F, 95L, 95M, 95V, 95Y, 96A, 96C, 961, 96L, 96 , 96P, 96T, 97A, 97E, 97M, 97W, 98C, 98G, 981, 98L, 98M, 98T, 98V, 99A, 99C, 99E, 99F, 99G, 991, 99L, 99M, 99N, 99P, 99S, 99T, 100A, 100C, 100F, 100M, 100N, 100P, 100T, 100V 100Y, 101A, 102A, 102G, 102Q, 102S, 102W, 102Y, 103A, 103C 1031, 103M, 103N, 103S, 103V, 104A, 104C, 104S, 105C, 105D 105E, 105F, 105G, 105H, 105K, 105L, 105M, 105Q, 105R, 105T 105V, 105W, 105Y, 106A, 106C, 106E, 106F, 106H, 1061, 106K 106L, 106M, 106N, 106Q, 106R, 106S, 106T, 106V, 106W, 106Y , 107A, 107C, 107E, 107F, 107G, 107H, 1071, 107K, 107L, 107M , 107N, 107P, 107Q, 107R, 107S, 107T, 107V, 107W, 108C, 108D , 108E, 108F, 108G, 108H, 1081, 108K, 108L, 108N, 108P, 108R , 108S, 108T, 108V, 108W, 108Y, 109C, 109D, 109E, 109F, 109G , 109H, 1091, 109K, 109L, 109M, 109N, 109P, 109R, 109S, 109T , 109V, 109W, 109Y, 110L, 110M, 110V, 111A, 111C, 111E, 111F , 111G, 111H, 1111, 111K, 111L, 111M, 111N, 111P, 111Q, 111R , 111T, 111V, 111W, 111Y, 112A, 112C, 112D, 112E, 112F, 112G , 112H, 1121, 112K, 112L, 112M, 112P, 112Q, 112R, 112S, 112T , 112V, 112W, 112Y, 113A, 113D, 113F, 113G, 1131, 113K, 113L , 113M, 113N, 113P, H3Q, 113S, 113T, 113V, 113W, 113Y, 114F , 114L, 114P, 114T, 115A, 115C, 115F, 115G, 115H, 1151 , 115L , 115M, 115N, 115Q, 115R, 115S, 115T, 115V, 115 , 115Y, 116A , 116D, 116E, 116F, 116G, 116H, 1161, 116L, 116N, 116Q, 116R , 116T, 116V, 116 , 116Y, 117F, 117L, 117N, H7Q, 117V, 117W , 117Y, 118A, 118C, 118D, 118E, 118F, 118G, 118H, 1181, 118K, 118L, 118M, 118N, 118Q, 118R, 118S, 118T, 118V, 118W, 118Y, 119A, 119C, 119D, 119E, 119F, 119G, 119H, 1191, 119K, 119L, 119M, 119Q, 119R, 119S, 119T, 119V, 119Y, 121A, 121M, 121N, 121S, 122R, 123E, 124A, 124C, 124D, 124E, 124F, 124G, 1241, 124K, 124 , 124Q, 124R, 124S, 124T, 124V, 124Y, 125A, 125D, 125E, 125F, 125G, 125H, 1251, 125K, 125L, 125M, 125N, 125P, 125Q, 125R, 125S, 125V, 125W, 125Y, 126A, 126C, 126D, ,126F, 126G, 126H, 1261, 126K, 126L, 126N, 126P, 126R, 126S, 126T, 126V, 126W, 126Y, 127C, 127L, 127M, 127V, 128A, 128C, 128D, 128E, 128F, 128G, 128H, 1281, 128L, 128 , 128N, 128Q, 128R, 128S, 128T, 128V, 128Y, 129A, 129C, 129D, 129E, 129F, 129H, 1291, 129K, 129L, 129M, 129R, 129S, 129T, 129V, 129Y, 130A, 130C, 130D, 130F, 130G, 130H, 1301, 130K, 130L, 130M, 130P, 130R, 130T, 130V, 130Y, 131A, 131C, 131D, 131E, 131F, 131G, 131H, 1311, 131K, 131L, 131M, 131N, 131Q, 131R, 131T, 131V, 131W, 131Y, 132A, 132C, 132E, 132H, 1321, 132L, 132M, 132N, 132Q, 132S, 132W, 132Y, 134C, 134D, 134E, 134F, 134G, 1341, 134L, 134M, 134N, 134R, 134S, 134T, 134V, 134Y, 135A, 135C, 135E, 135M, 135N, 135Q, 135R, 136A, 136C, 136F, 136L, 136T, 136Y, 137C, 138A, 138C, 138F, 138H, 138N, 138R, 138W, 138Y, 139A, 139C, 139G, 139H, 139L, 139M, 139S, 140A, 140C, 140F, 140G, 141A, 141F, 141H, 141P, 141Q, 141S, 141T, 141V, 141Y, 142C, 142D, 142F, 142G, 142H, 1421, 142K, 142M, 142Q, 142R, 142S, 142T, 142 , 142Y, 143A, 143C, 143D, 143F, 143K, 143L, 143M, 143N, 143Q, 143R, 143S, 143W, 144G, 144S, 144T, 144V, 144 , 145W, 146A, 146E, 146M, 146T, 147C, 147F, 147H, 1471, 147L, 147N, 147P, 147Y, 148A, 148C, 148F, 148H, 148K, 148M, 148R, 148Y, 149S, 150A, 150H, 150N, 150S, 151A, 151C, 151D, 151E, 151F, 151G, 151H, 1511, 151K, 151L, 151M, 151Q, 151R, 151S, 151T, 151V, 151Y, 152A, 152C, 152D, 152E, 152F, 152G, 152H, 1521, 152K, 152L, 152M, 152N, 152P, 152Q, 152R, 152S, 152V, 152W, 152Y, 153A, 153C, 153D, 153E, 153F, 153G, 153H, 1531, 153K, 153L, 153M, 153N, 153P, 153R, 153S, 153T, 153V, 153 , 153Y, 154A, 154C, 1541, 154N, 154P, 154Q, 154S, 154T, 154Y, 155A, 155C, 155E, 155F, 155G, 155H, 1551, 155L, 155M, 155T, 155V, 155W, 156A, 156C, 156D, 156E, 156F, 156G, 156H, 1561, .156K, 156L, 156N, 156Q, 156R, 156T, 156V, 156W, 156Y, 157A, 157C, 157F, 157H, 1571, 157M, 157T, 157V, 158A, 158F, 158H, 1581, 158M, 158Q, 158S, 158T, 158V, 159A, 159C, 159E, 159F, 159G, 159H, 1591, 159L, 159M, 159N, 159R, 159S, 159T, 159V, 159W, 159Y, 160A, 160C, 160D, 160E, 160F, 160G, 160H, 1601, 160K, 160L, 160M, 160N, 160Q, 160S, 160T, 160V, 160W, 160Y, 161A, 161C, 161G, 161H, 161K, 161L, 161M, 161N, 161S, 162A, 162C, 162E, 162F, 1621, 162M, 162V, 163A, 163C, 163E, 163F, 163G, 163H, 1631, 163K, 163L, 163N, 163Q, 163R, 163S, 163T, 163V, 163 , 163Y, 164A, 164F, 164G, 164H, 1641 , 164L, 164M, 164N, 164Q, 164S, 164T, 164V, 164W, 164Y, 165C, 165G, 1651, 165L, 165M, 165Q, 165S, 165T, 165V, 165W, 165Y, 166A, 166C, 166D, 166E, 166F, 166G, 166H, 1661, 166K, 166M, 166N, 166Q, 166R, 166S, 166T, 166V, 166W, 166Y, 167A, 167C, 167D, 167E, 167F, 167G, 167H, 1671, 167K, 167L, 167M, 167Q, 167R, 167S, 167T, 167V, 167W, 167Y, 168C, 168E, 168F, 168G, 1681, 168K, 168L, 168M, 168N, 168S, 168T, 168V, 168 , 168Y, 169L, 170C, 170G, 170V, 171A, 171C, 171E, 171F, 171G, 171H, 1711, 171L, 171M, 171N, 171Q, 171R, 171V, 172A, 172C, 172E, 172F, 172P, 1731, 173M, 173V, 173Y, 174D, 174E, 174G, 174H, 174L, 174Q, 174V, 174Y, 175H, 175M, 175 , 175Y, 176E, 176F, 1761, 176K, 176L, 176V, 176Y, 177C, 177G, 177M, 177Q, 177S, 178C, 178G, 178M, 178S, 178T, 179A, 179C, 179G, 179H, 1791, 179L, 179M, 179P, 179S, 179T, 179V, 179 , 179Y, 180A, 180D, 180M, 180N, 180Y, 181A, 181C, 181L, 181M, 181V, 182A, 183C, 183M, 184A, 184C, 184D, 184E, 184F, 184G, 184H, 1841 , 184K, 184L, 184M, 184N, 184Q, 184R, 184S, 184T, 184V, 184W, 184Y, 185C, 185E, 185N, 185S, 185T, 186E, 187A, 187C, 187D, 187E, 187F, 187H, 1871, 187K, 187L, 187M, 187N, 187P, 187Q, 187R, 187S, 187T, 187V, 187 , 187Y, 188A, 188C, 188D, 188E, 188F, 188G, 1881 , 188K, 188L, 188M, 188N, 188P, 188Q, 188R, 188T, 188V, 189F, 189W, 190A, 190C, 190E, 190F, 190H, 190K, 190L, 190M, 190Q, 190R, 190S, 190W, 190Y, 191A, 191L, 191T, 191Y, 192D, 192E, 192F, 192G, 1921, 192K, 192L, 192N, 192P, 192R, 192S, 192T, 192V, 193A, 1931, 193L, 193M, 1941 , 195A, 195C, 195D, 195F, 195G, 195H, 1951, 195K, 195L, 195M, 195N, 195Q, 195R, 195S, 195T, 195V, 195 , 195Y, 196A, 196C, 196D, 196E, 196F, 196G, 196H, 1961, 196K, 196L, 196M, 196Q, 196R, 196S, 196T, 196V, 196W, 196Y, 197A, 197C, 197F, 197L, 197S, 197T, 197V, 198A, 198C, 198G, 198H, 1981, 198L, 198M, 198N, 198R, 198S, 198V, 199A, 199C, 199D, 199E, 199F, 199G, 199H, 1991, 199L, 199 , 199P, 199R, 199S, 199T, 199V, 199Y, 200A, 200C, 200D, 200E, 200F, 200G, 200H, 2001, 200K, 200L, 200M, 200N, 200P, 200Q, 200R, 200S, 200V, 200W, 200Y, 201A, 201C, 201D, 201E, 201F, 201G, 201H, 2011, 201K, 201L, 201M, 201N, 201P, 201Q, 201R, 201T, 201V, 201W, 201Y, 202C, 202F, 202G, 2021, 202K, 202L, 202M, 202N, 202P, 202Q, 202R, 202S, 202T, 202V, 202Y, 203A, 203C, 203F, 203G, 2031, 203K, 203L, 203N, 203P, 203Q, 203R, 203S, 203T, 203V, 203W, 203Y, 204A, 204C, 204E, 2041, 204L, 204M, 204T, 204V, 204W, 204Y, 205A, 205C, 205D, 205E, 205F, 205G, 205H, 2051, 205K, 205L, 205M, 205N, 205R, 205S, 205T, 205V, 205 , 205Y, 206F, 207A, 207C, 207M, 208K, 208N, 208R, 209C, 209F, 209L, 209M, 209T, 209V, 210F, 2101, 210V, 210 , 211A, 211C, 211D, 211E, 211G, 211H, 211M, 211P, 211S, 211T, 211W, 211Y, 212A, 212C, 212E, 212G, 212H, 212N, 212P, 212Q, 212S, 212T, 212Y, 213A, 213C, 213D, 213E, 213F, 213G, 213H, 2131, 213K, 213L, 213M, 213P, 213Q, 213R, 213T, 213V, 213Y, 214C, 214D, 214F, 214G, 2141, 214K, 214L, 214M, 214N, 214Q, 214R, 214S, 214T, 214V, 214 , 214Y, 215A, 215C, 215H, 215T, 216C, 216K, 217E, 217F, 217G, 2171, 217K, 217M, 217N, 217P, 217Q, 217R, 217S, 217T, 217V, 217Y, 218C, 218D, 218E, 218F, 218G, 218H, 2181, 218K, 218L, 218M, 218N, 218P, 218Q, 218R, 218S, 218T, 218V, 218W, 218Y, 219C, 219D, 219F, 219G, 219H, 2191, 219K, 219L, 219M, 219N, 219Q, 219R, 219S, 219T, 219V, 219W, 219Y, 220F, 221C, 221E, 221G, 2211, 221L, 221M, 221N, 221Q, 221R, 221S, 221T, 221V, 221Y, 222A, 222C, 222D, 222F, 222G, 2221, 222K, 222M, 222P, 222R, 222S, 222T, 222V, 223A, 223C, 223E, 223F, 223H, 2231, 223L, 223M, 223N, 223Q, 223V, 223 , 2241, 224L, 224V, 224Y, 225A, 225C, 225E, 225F, 225H, 2251, 225K, 225L, 225M, 225N, 225P, 225Q, 225S, 225T, 225V, 225W, 225Y, 226A, 226C, 226F, 2261 , 226L, 226M, 226T, 227A, 227C, 227D, 227E, 227G, 227M, 227S, 228C, 228D, 228M, 228N, 228P, 228S, 228T, 228V, 229C, 229D, 229E, 229F, 229G, 229H, 229M, 229N, 229Q, 229R, 229T, 229V, 229Y, 230A, 230D, 230E, 230F, 230G, 230H, 2301, 230K, 230M, 230P, 230Q, 230R, 230S, 230V, 230Y, 231A, 231C, 231H, 231L, 231M, 231Q, 231W, 232A, 232C, 232M, 232N, 232Q, 232S, 232Y, 233A, 233C, 233D, 233E, 233F, 233G, 2331, 233K, 233L, 233M, 233N, 233P, 233Q, 233R, 233S, 233T, 233V, 233W, 233Y, 234A, 234C, 234D, 234E, 234F, 234G, 234H, 2341, 234L, 234M, 234N, 234Q, 234R, 234T, 234V, 234W, 234Y, 235A, 235C, 235F, 235L, 235M, 235T, 236A, 236C, 236D, 236E, 236G, 236H, 2361, 236K, 236L, 236M, 236N, 236Q, 236S, 236T, 237A, 237C, 237D, 237E, 237F, 237G, 237H, 2371, 237K, 237L, 237P, 237Q, 237R, 237T, 237V, 237W, 237Y, 238C, 238D, 238E, 238F, 238G, 238H, 2381, 238K, 238L, 238M, 238N, 238Q, 238R, 238S, 238T, 238V, 238 , 238Y, 239A, 239E, 239F, 2391, 239M, 239T, 240A, 240C, 240D, 240E, 240F, 240G, 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251E, 251G, 2511, 251K, 251L, 251M, 251N, 251P, 251Q, 251R, 251V, 251Y, 252C, 252D, 252E, 252F, 252G, 252H, 2521, 252K, 252L, 252M, 252Q, 252R, 252S, 252T, 252V, 252W, 253C, 253E, 253F, 253G, 253H, 2531, 253K, 253L, 253M, 253P, 253R, 253S, 253T, 253V, 253W, 253Y, 254A, 254F, 254G, 254H, 2541, 254K, 254L, 254N, 254P, 254R, 254T, 254V, 254 , 254Y, 255A, 255C, 255E, 255F, 255G, 2551, 255K, 255L, 255N, 255P, 255Q, 255R, 255S, 255T, 255V, 255W, 255Y, 256A, 256C, 2561, 256M, 256N, 256T, 257A, 257D, 257E, 257F, 257G, 257H, 2571, 257K, 257L, 257M, 257N, 257P, 257Q, 257R, 257T, 257V, 257W, 258C, 258D, 258E, 258F, 258G, 258H, 2581, 258K, 258L, 258M, 258N, 258Q, 258R, 258S, 258T, 258V, 258Y, 259A, 259E, 259G, 259H, 2591, 259K, 259L, 259M, 259P, 259Q, 259R, 259S, 259T, 259W, 259Y, 260A, 260C, 260D, 260E, 260F, 260G, 260H, 2601, 260L, 260M, 260N, 260Q, 260R, 260S, 260T, 260V, 260 , 260Y, 261A, 261C, 2611, 261M, 261N, 261Q, 261S, 261T, 261V, 262A, 262C, 2621, 262 , 262T, 263A, 263C, 263L, 263M, 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297D, 297E, 297F, 297G, 297H, 2971, 297K, 297L, 297M, 297N, 297P, 297Q, 297R, 297T, 297V, 297W, 297Y, 298C, 298D, 298E, 298F, 298H, 2981, 298K, 298L, 298M, 298N, 298P, 298Q, 298R, 298S, 298V, 298 , 299C, 299D, 299E, 299F, 299G, 299H, 2991, 299L, 299M, 299N, 299P, 299Q, 299V, 300A, 300C, 300F, 300H, 3001, 300K, 300L, 300M, 300N, 300Q, 300R, 300S, 300V, 300Y, 301C, 301D, 301F, 301H, 3011, 301K, 301L, 301M, 301Q, 301R, 301T, 301V, 302C, 302E, 302F, 302G, 302K, 302M, 302N, 302S, 302T, 303L, 303M, 303 , 303Y, 304C, 304E, 304G, 304L, 304N, 304Y, 305A, 305G, 3051, 305N, 305T, 305V, 307A, 307C, 307D, 307N, 307Q, 307T, 307V, 307Y, 308A, 308C, 308D, 308F, 308G, 308H, 3081, 308K, 308L, 308M, 308N, 308P, 308Q, 308R, 308S, 308T, 308V, 308 , 308Y, 309C, 309D, 309E, 309F, 309H, 3091, 309K, 309M, 309N, 309P, 309R, 309S, 309T, 309V, 309Y, 310A, 310D, 310E, 310F, 310H, 3101, 310L, 310M, 310N, 310P, 310Q, 310R, 310S, 310T, 310Y, 311A, 311C, 311D, 311E, 311F, 311H, 311K, 311L, 311M, 311N, 311P, 311Q, 311R, 311S, 311T, 311V, 311W, 311Y, 312A, 312C, 312D, 312E, 312F, 312G, 312H, 3121, 312K, 312L, 312M, 312P, 312Q, 312R, 312S, 312T, 312V, 312 , 312Y, 313A, 313C, 313D, 313E, 313F, 313H, 3131, 313K, 313L, 313M, 313N, 313P, 313Q, 313R, 313S, 313T, 313V, 313W, 313Y, 314A, 314C, 314D, 314F, 314G, 314H, 314K, 314L, 314M, 314Q, 314R, 314S, 314T, 314 , 314Y, 315C, 315D, 315E, 315G, 315H, 3151, 315K, 315L, 315M, 315N, 315P, 315Q, 315T, 315V, 316C, 316D, 316H, 3161, 316L, 316M, 316Y, 317A, 317C, 317D, 317E, 317F, 317G, 317H, 3171, 317K, 317L, 317N, 317Q, 317R, 317S, 317T, 317V, 317W, 317Y, 318D, 318F, 318H, 3181, 318K, 318L, 318M, 318N, 318R, 318S, 318T, 318V, 318W, 318Y, 319A, 319D, 319F, 319G, 319H, 319L, 319N, 319P, 319Q, 319S, 319V, 319W, 320A, 320C, 320D, 320F, 320G, 320H, 3201, 320K, 320L, 320M, 320N, 320P, 320Q, 320T, 320V, 320W, 320Y, 321A, 321C, 321D, 321E, 321F, 321G, 321H, 3211 , 321K, 321L, 321M, 321N, 321P, 321R, 321S, 321T, 321V, 321 , 322L, 322M, 322V, 323A, 323C, 323H, 323N, 323R, 323S, 323T, 324A, 324C, 324E, 324F, 324G, 324H, 3241, 324K, 324L, 324M, 324N, 324P, 324Q, 324R, 324S, 324T, 324V, 324W, 324Y, 325A, 325C, 325D, 325F, 325G, 325H, 3251, 325K, 325L, 325M, 325N, 325P, 325T, 325V, 325W, 325Y, 326A, 326Q, 327C, 327D, 327F, 327G, 327H, 327K, 327N, 327P, 327R, 327T, 327V, 327Y, 328C, 328D, 328E, 328F, 328G, 328H, 3281, 328K, 328L, 328N, 328P, 328Q, 328R, 328S, 328T, 328V, 328W, 328Y, 329A, 329D, 329E, 329F, 329G, 329H, 329N, 329Q, 329R, 329S, 329T, 330A, 330C, 330H, 330L, 330M, 330S, 330W, 330Y, 331C, 331D, 331F, 331G, 3311, 331K, 331L, 331M, 331N, 331Q, 331R, 331S, 331T, 331V, 331Y, 332A, 332C, 332E, 332F, 332G, 3321, 332K, 332L, 332M, 332Q, 332R, 332S, 332V, 332Y, 333C, 333D, 333F, 333G, 333H, 3331, 333K, 333L, 333M, 333N, 333P, 333R, 333S, 333T, 333V, 333W, 333Y, 334C, 334D, 334F, 334G, 334H, 3341, 334L, 334M, 334N, 334Q, 334R, 334S, 334T, 334V, 334Y, 335A, 335L, 335 , 335Q, 335T, 335V, 336A, 336C, 336E, 336F, 336G, 336H, 3361, 336K, 336L, 336M, 336N, 336Q, 336R, 336S, 336V, 336W, 336Y, 337D, 337G, 337H, 337K, 337L, 337N, 337P, 337Q, 337R, 337S, 337V, 337W, 337Y, 338C, 338F, 338G, 3381, 338L, 338M, 338N, 338P, 338S, 338T, 339C, 339G, 3391, 339S, 339T, 339V, 340D, 340E, 340F, 340G, 340H, 3401 , 340 , 340L, 340M, 340N, 340S, 340T, 340V, 340 , 341A, 3411, 341L, 341M, 341V, 341 , 341Y, 342A, 342D, 342E, 342F, 342G, 342K, 342L, 342M, 342N, 342R, 342S, 342V, 342Y, 343A, 343C, 343D, 343E, 343F, 343G, 343H, 3431, 343K, 343L, 343M, 343P, 343Q, 343S, 343T, 343V, 343W, 343Y, 344A, 344C, 344D, 344E, 344F, 344G, 344H, 3441 , 344K, 344L, 344M, 344N, 344Q, 344R, 344S, 344T, 344W, 344Y, 345A, 345C, 345D, 345E, 345F, 345G, 345H, 3451, 345N, 345Q, 345S, 345T, 345V, 345 , 345Y, 346C, 346D, 346E, 346F, 346H, 3461, 346K, 346L, 346M, 346N, 346P, 346R, 346S, 346T, 346V, 346Y, 347A, 347C, 347D, 347E, 347F, 347H, 3471, 347K, 347L, 347M, 347N, 347P, 347Q, 347R, 347S, 347T, 347V, 347W, 347Y, 348C, 348F, 348G, 348H, 3481, 348K, 348M, 348N, 348P, 348R, 348S, 348T, 348V, 348W, 348Y, 349A, 349C, 349D, 349F, 349G, 349H, 3491, 349K, 349L, 349M, 349N, 349Q, 349R, 349S, 349T, 349V, 349W, 349Y, 350A, 350C, 350D, 350N, 350S, 351A, 351D, 351G, 351H, 351K, 351L, 351M, 351P, 351Q, 351R, 351S, 351T, 351V, 351W, 351Y, 352A, 352D, 352E, 352F, 352G, 352H, 3521, 352K, 352N, 352Q, 352R, 352T, 352V, 352W, 352Y, 353A, 353C, 353D, 353E, 353F, 353G, 3531, 353K, 353L, 353M, 353N, 353Q, 353R, 353T, 353V, 353W, 353Y, 354A, 354C, 354M, 354P, 354Q, 354S, 354T, 355C, 355D, 355E, 355F, 355G, 3551, 355 , 355L, 355M, 355N, 355T, 355V, 355W, 355Y, 356D, 356E, 356F, 356G, 356H, 3561, 356K, 356L, 356M, 356P, 356Q, 356T, 356W, 356Y, 357A, 357C, 357D, 357E, 357F, 357H, 3571, 357K, 357L, 357M, 357N, 357P, 357Q, 357R, 357S, 357T, 357V, 357W, 357Y, 358A, 358C, 358D, 358E, 358F, 358G, 358H, 3581, .358K, 358L, 358M, 358P, 358Q, 358R, 358S, 358T, 358V, 358 , 358Y, 359A, 359C, 359D, 359E, 359F, 359G, 359H, 3591, 359K, 359L, 359M, 359P, 359Q, 359R, 359S, 359T, 359V, 359W, 359Y, 360F, 360H, 360L, 360N, 360P, 360R, 360T, 360W, 361A, 361C, 361G, 361H, 361L, 361M, 361N, 361Q, 361S, 361T, 361V, 361 , 361Y, 362A, 362C, 362E, 362H, 3621, 362L, 362M, 362Q, 362S, 362T, 362V, 362Y, 363D, 363E, 363F, 363G, 363H, 363N, 363Q, 363R, 363S, 363V, 363W, 363Y, 364A, 364C, 364D, 364E, 364G, 3641, 364L, 364M, 364Q, 364S, 364T, 364V, 365A, 365C, 365D, 365F, 365G, 3651, 365K, 365L, 365M, 365N, 365R, 365S, 365T, 365V, 365W, 365Y, 366A, 366C, 366E, 366F, 366G, 366H, 366K, 366L, 366M, 366S, 366T, 366V, 367A, 367C, 367D, 367E, 367F, 367H, 3671, 367K, 367L, 367M, 367N, 367P, 367R, 367S, 367T, 367V, 367W, 367Y, 368D, 368F, 368G, 3681, 368K, 368L, 368M, 368N, 368P, 368Q, 368R, 368T, 368V, 368W, 368Y, 369A, 369C, 369D, 369E, 369F, 369G, 3691, 369K, 369L, 369M, 369N, 369P, 369Q, 369R, 369S, 369T, 369V, 369W, 369Y, 370A, 371A, 371C, 371F, 371G, 371H, 3711, 371L, 371M, 371N, 371Q, 371S, 371T, 371W, 371Y, 372A, 372C, 372G, 3721 , 372L, 372M, 372N, 372Q, 372S, 372T, 373A, 373C, 373F, 373G, 3731, 373M, 373Q, 373S, 373T, 373V, 373W, 373Y, 374C, 374E, 374G, 3741, 374L, 374M, 374N, 374S, 374T, 374V, 375A, 375C, 375D, 375F, 375G, 375H, 375L, 375M, 375Q, 375S, 375T, 375V, 375W, 375Y, 376C, 376D, 376E, 376F, 376G, 376H, 3761, 376L, 376M, 376N, 376P, 376Q, 376S, 376T, 376V, 377F, 377H, 3771, 377K, 377L, 377P, 377T, 377W, 377Y, 378A, 378C, 378D, 378E, 378F, 378G, 378H, 3781, 378K, 378L, 378M, 378N, 378P, 378Q, 378R, 378T, 378V, 378W, 378Y, 379A, 379D, 379G, 379H, 3791, 379K, 379L, 379Q, 379T, 379W, 379Y, 380A, 380C, 380D, 380E, 380F, 380G, 380H, 3801, 380L, 380M, 380N, 380P, 380Q, 380R, 380T, 380V, 380W, 380Y, 381A, 381G, 3811, 381K, 381N, 381P, 381Q, 381R, 381S, 381T, 381W, 381Y, 382A, 382C, 382D, 382F, 382G, 382H, 3821, 382K, 382L, 382M, 382N, 382P, 382Q, 382R, 382T, 382V, 382W, 382Y, 383A, 383C, 383E, 383F, 383G, 383H, 383L, 383N, 383P, 383Q, 383S, 383T, 383V, 383 , 383Y, 384A, 384D, 384F, 384G, 384H, 3841, 384K, 384L, 384P, 384Q, 384S, 384T, 384V, 384W, 385A, 385C, 385D, 385E, 385F, 385G, 385H, 3851, 385K, 385L, 385M, 385N, 385P, 385Q, 385R, 385S, 385V, 385W, 385Y, 386C, 386D, 386F, 386G, 386H, 3861, 386L, 386N, 386P, 386R, 386S, 386T, 386V, 386W, 386Y, 387A, 387D, 387E, 387G, 3871, 387L, 387N, 387Q, 387S, 388A, 388C, 388D, 388E, 388F, 388G, 388H, 3881, 388L, 388M, 388N, 388P, 388Q, 388R, 388S, 388T, 388V, 388W, 388Y, 389C, 389E, 389F, 389H, 3891, 389K, 389 , 389N, 389Q, 389S, 389T, 389V, 389 , 389Y, 390A, 390C, 390D, 390E, 390F, 390G, 390H, 3901, 390K, 390L, 390M, 390N, 390R, 390S, 390T, 390V, 390W, 390Y, 391E, 391F, 391G, 391H, 3911, 391K, 391L, 391N, 391P, 391R, 391S, 391T, 391V, 391W, 391Y, 392A, 392C, 392D, 392E, 392F, 392H, 392K, 392L, 392M, 392N, 392Q, 392R, 392S, 392V, 392Y, 393A, 393C, 393D, 393F, 393G, 393H, 3931, 393L, 393M, 393P, 393Q, 393S, 393T, 393V, 393 , 393Y, 394A, 394C, 394E, 394F, 394H, 3941, 394K, 394L, 394M, 394N, 394P, 394Q, 394R, 394S, 394T, 394V, 394W, 395A, 395C, 395E, 395F, 395G, 395H, 3951 , 395K, 395L, 395M, 395N, 395P, 395Q, 395R, 395S, 395T, 395V, 395W, 395Y, 396A, 396C, 396D, 396E, 396G, 396M, 396P, 396S, 396T, 397A, 397C, 397D, 397E, 397F, 397G, 397H, 3971, 397L, 397M, 397P, 397R, 397S, 397T, 397V, 397W, 398C, 398D, 398E, 398F, 398G, 3981, 398L, 398M, 398N, 398P, 398Q, 398R, 398S, 398T, 398V, 398 , 398Y, 399A, 399C, 399D, 399E, 399F, 399H, 3991 , 399K, 399L, 399P, 399R, 399S, 399T, 399V, 399 , 399Y, 400C, 400D, 400E, 400F, 400G, 400H, 4001, 400K, 400L, 400M, 400?, 400P, 400Q, 400R, 400S, 400T, 400V, 400 , 400Y, 401A, 401C, 401D, 401E, 401F, 401H, 4011 , 401K, 401L, 401M, 401N, 401P, 401Q, 401R, 401S, 401T, 401V, 401W, 401Y, 402A, 402C, 402D, 402E, 402F, 402G, 402H, 4021, 402K, 402L, 402M, 402N, 402?, 402Q, 402R, 402T, 402V, 402W, 402Y, 403A, 403C, 403E, 403G, 403H, 4031, 403M, 403N, 403Q, 403S, 403T, 403V, 403 , 403?, 404D, 404E, 404F, 404G, 404H, 4041, 404L, 404M, 404N, 404?, 404R, 404T, 404V, 404 , 404Y, 405E, 405F, 405G, 405H, 4051, 405K, 405Q, 405S, 405T, 406D, 406F, 406L, 406T, 406Y, 407?, 407C, 407E, 407F, 407G, 407H, 4071, 407K, 407M, 407N, 407?, 407Q, 407R, 407S, 407T, 407V, 407W, 407Y, 408A, 408D, 408?, 408F, 408H, 4081, 408K, 408N, 408P, 408Q, 408S, 408T, 408V, 408Y, 409A, 409C, 409D, 409E, 409F, 409H, 4091, 409L, 409?, 409Q, 409R, 409T, 409V, 409W, 409Y, 410F, 410G, 4101, 410K, 410Q, 410S, 410T, 410V, 410W, 410Y, 411A, 411D, 411E, 411F, 411G, 411H, 4111, 411L, 411M, 411N, 411Q, 411R, 411S, 411V, 411W, 411Y, 412A, 412D, 412E, 412H, 4121, 412K, 412L, 412M, 412N, 412R, 412S, 412T, 412V, 412Y, 413C, 413E, 413F, 413G, 4131, 413L, 413M, 413N, 413P, 413R, 413S, 413V, 413 , 413Y, 414A, 414C, 414E, 414F, 414G, 414H, 414L, 414M, 414N, 414P, 414Q, 414T, 414V, 414W, 415D, 415E, 415F, 415G, 415H, 4151, 415K, 415P, 415Q, 415R, 415V, 415 , 416F, 4161, 416L, 416P, 416Q, 416R, 416T, 416V, 416Y, 417A, 417C, 417D, 417F, 417G, 417H, 4171, 417K, 417M, 417N, 417P, 417Q, 417S, 417 , 417Y, 418C, 418D, 418E, 418F, 418H, 4181, 418K, 418N, 418Q, 418R, 418T, 418W, 418Y, 419C, 419D, 419E, 419F, 419G, 419H, 4191, 419L, 419P, 419Q, 419S, 419T, 419Y, 420D, 420E, 420F, 420G, 420H, 4201, 420K, 420L, 420M, 420N, 420Q, 420R, 420S, 420T, 420V, 420W, 420Y, 421A, 421C, 421G, 4211, 421L, 421M, 421S, 421T, 422A, 422F, 422G, 422H, 4221 , 422M, 422N, 422Q, 422S, 422V, 422W, 422Y, 423A, 423D, 423G, 423H, 4231, 423K, 423P, 423Q, 423R, 423T, 423V, 423W, 424D, 424E, 424G, 4241, 424K, 424M, 424N, 424Q, 424R, 424S, 424T, 424V, 424 , 424Y, 425A, 4251, 425 , 425L, 425M, 425S, < 425T, 425V, 425 , y 425Y.

22. El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque la modificación es una sustitución del residuo de aminoácido presente en la posición 153 hasta N, K o F, y el polipéptido variante muestra capacidad incrementada para convertir los sustratos de maltosa y maltoheptaosa a glucosa comparada con el polipéptido precursor.

23. El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque la modificación es una sustitución seleccionada del grupo que consiste de L142F, L142G, L142Q, L142S, L142W, L142Y, A214I, A214V, S245Y, Q126F, Q126L, Q126P, Q126V, S131L, y S254I.

24. El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque la modificación es una sustitución seleccionada del grupo que consiste de W60L, W60M, W60N, I100F, I100M, S105M, S105 , G207A, T270A, T270E, T270L, T270N, T270V, y T279A.

25. Un método para reducir la dureza del pan caracterizado porque comprende agregar a una masa de pan una cantidad de polipéptido AmyE suficiente para reducir la dureza comparada con la cantidad de dureza observada con una masa de pan equivalente que carece de un polipéptido AmyE.