ES2269020T3 - Variantes dee amilasa. - Google Patents

Abstract

Variante de una a-amilasa madre, que presenta al menos un 80% de identidad con la secuencia de aminoácidos SEC ID N°. 1, en la que la variante comprende una deleción de aminoácidos equivalente a R179 y G180 de la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID N°3, dicha variante teniendo actividad alfa-amilasa y exhibiendo al menos una de las siguientes propiedades con respecto a dicha alfa-amilasa madre:termostabilidad aumentada; estabilidad aumentada a la oxidación; y dependencia de Ca2+ reducida.

Description

Variantes de amilasa.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a variantes de \alpha-amilasa con propiedades mejoradas con respecto a la enzima madre (p. ej. mejorada estabilidad a la oxidación y/o térmica y/o dependencia del ión calcio reducida), y por lo tanto con un rendimiento en el lavado de la ropa y/o de la vajilla mejorados (y/o desencolado textil). La invención también se refiere a los constructos de ADN que codifican las variantes, y a vectores y células que albergan los constructos de ADN. La invención adicionalmente se refiere a métodos para producir las variantes de la amilasa, y a aditivos de detergentes y composiciones de detergentes comprendiendo las variantes de la amilasa. Además, la invención se refiere al uso de las variantes de la amilasa para el desencolado textil y para la producción de suavizantes y etanol a partir de almidón.

Antecedentes de la invención

Las enzimas de la \alpha-amilasa han sido usadas industrialmente durante varios años y para una variedad de objetivos diferentes, el más importante siendo la licuefacción del almidón, el desencolado textil, la modificación del almidón en el papel y la industria de la pasta, y para la fabricación de la cerveza y la cocción. Otro uso de \alpha-amilasas que está volviéndose muy importante es la eliminación de manchas amidáceas durante el lavado de la ropa o de la vajilla.

En los últimos años se ha intentado construir variantes de la \alpha-amilasa con propiedades mejoradas con respecto a los usos específicos tales como la licuefacción del almidón y el desencolado textil.

Por ejemplo, US 5,093,257 expone \alpha-amilasas quiméricas que comprenden una parte N-terminal de una \alpha-amilasa de B. stearothermophilus y una parte C-terminal de una \alpha-amilasa de B. licheniformis. Las \alpha-amilasas quiméricas destacan por tener propiedades únicas, tales como una termostabilidad diferente, en comparación con su \alpha-amilasa madre. No obstante, todas las \alpha-amilasas quiméricas específicamente descritas demostraron tener una actividad enzimática disminuida en comparación con sus \alpha-amilasas madres.

EP 252 666 describe amilasas híbridas de la fórmula general Q-R-L, en las que Q es un residuo del polipéptido N-terminal de 55 a 60 residuos de aminoácidos que es al menos un 75% homólogo a los 57 residuos de aminoácidos N-terminales de una \alpha-amilasa especifica de B. amyloliquefaciens, R es un polipéptido especifico, y L es un polipéptido C-terminal comprendiendo de 390 a 400 residuos de aminoácidos que son al menos un 75% homólogos a los 395 residuos de aminoácidos C-terminales de una \alpha-amilasa de B. licheniformis especificada.

Suzuki et al. (1989) describen \alpha-amilasas quiméricas, en las que las regiones especificadas de una \alpha-amilasa de B. amyloliquefaciens han sido sustituidas por las regiones correspondientes de una \alpha-amilasa de B. licheniformis. Las \alpha-amilasas quiméricas fueron construidas con el propósito de identificar las regiones responsables de la termostabilidad. Se encontró que tales regiones incluían 177-186 residuos de aminoácidos y 255-270 residuos de aminoácidos de la \alpha-amilasa de B. amyloliquefaciens. Las alteraciones de los residuos de aminoácidos en las \alpha-amilasas quiméricas no parecieron afectar a las propiedades de las enzimas aparte de su termostabilidad.

WO 91/00353 expone mutantes de la \alpha-amilasa que difieren de su \alpha-amilasa madre al menos en un residuo de aminoácido. Se ha establecido que los mutantes de la \alpha-amilasa descritos en dicha solicitud de patente muestran propiedades mejoradas para la aplicación en la degradación del almidón y/o el desencolado textil debido a sus sustituciones de aminoácidos. Algunos mutantes presentan estabilidad mejorada, pero no se resaltaron o indicaron mejoras en la actividad enzimática. Los únicos mutantes ejemplificados son obtenidos a partir de una \alpha-amilasa madre de B. licheniformis y llevan una de las siguientes mutaciones: H133Y o H133Y + T1491. Otra mutación sugerida es A111T.

FR 2,676,456 expone mutantes de la \alpha-amilasa de B. licheniformis, donde un residuo de aminoácido en la proximidad de His 133 y/o un residuo de aminoácido en la proximidad de Ala 209 han sido sustituidos por un residuo de aminoácido más hidrofóbico. Se ha resaltado que las \alpha-amilasas mutantes resultantes tienen una termostabilidad mejorada y son útiles en la industria textil, del papel, en la fabricación de la cerveza y en la licuefacción del almidón.

EP 285 123 expone un método para realizar la mutagénesis aleatoria de una secuencia de nucleótidos. Como un ejemplo de tal secuencia se menciona una secuencia de nucleótidos que codifica una \alpha-amilasa de B. stearothermophilus. Al mutarse, se obtiene una variante de \alpha-amilasa con actividad mejorada a bajos valores de pH.

En ninguna de las referencias anteriores se menciona o incluso se sugiere que los mutantes de la \alpha-amilasa puedan ser construidos con propiedades mejoradas con respecto a la industria de los detergentes.

EP 525 610 se refiere a enzimas mutantes con estabilidad mejorada hacia tensoactivos iónicos (tensioactivos). Las enzimas mutantes han sido producidas sustituyendo un residuo de aminoácido en la parte de la superficie de la enzima madre por otro residuo de aminoácido. La única enzima mutante específicamente descrita en EP 525 610 es una proteasa. La amilasa está mencionada como un ejemplo de una enzima que puede obtener una estabilidad mejorada hacia tensoactivos iónicos, pero el tipo de amilasa, su origen o mutaciones específicas no están especificados.

WO 94/02597 expone mutantes de la \alpha-amilasa que muestran estabilidad y actividad mejoradas en presencia de agentes oxidantes. En las \alpha-amilasas mutantes, uno o más residuos de la metionina han sido sustituidos por residuos de aminoácidos diferentes de Cys y Met. Se ha establecido que los mutantes de la \alpha-amilasa son útiles como aditivos de detergentes y/o de lavavajillas al igual que para el desencolado textil.

WO 94/18314 expone mutantes de la \alpha-amilasa oxidativamente estables, incluidas las mutaciones en la posición M197 de \alpha-amilasa de B. licheniformis.

EP 368 341 describe el uso de pululanasa y otras enzimas amilolíticas opcionalmente en combinación con una \alpha-amilasa para el lavado de la ropa y de la vajilla.

Un objeto de la presente invención es el de proporcionar variantes de la \alpha-amilasa que - con respecto a su \alpha-amilasa madre - posean propiedades mejoradas importantes, entre otras. En relación con el rendimiento del lavado de la ropa y/o de la vajilla de las variantes en cuestión, p. ej. termoestabilidad aumentada, estabilidad aumentada hacia la oxidación, dependencia reducida de ión Ca^{2+} y/o estabilidad mejorada o actividad en la región del pH de relevancia, p. ej., en el lavado de la ropa o lavado de la vajilla. Tales variantes de \alpha-amilasas tienen la ventaja, entre otras, de poder ser empleadas en una dosificación inferior que su \alpha-amilasa madre. Además, las variantes de la \alpha-amilasa pueden ser capaces de eliminar manchas amidáceas que no pueden, o sólo con dificultad, ser eliminadas por enzimas de detergente de la \alpha-amilasa conocida hoy.

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Breve descripción de la invención

Un objetivo del trabajo subyacente a la presente invención fue el de mejorar, si posible, la estabilidad de, entre otras, las \alpha-amilasas particulares que son obtenibles a partir de cepas de Bacillus y que ellas mismas han sido seleccionadas en base a su rendimiento de eliminación del almidón en medios alcalinos (como en soluciones de detergentes como se emplea normalmente en el lavado de la ropa o de la vajilla) con respecto a las muchas \alpha-amilasas comercialmente disponibles habitualmente. Con respecto a esto, los presentes inventores han encontrado sorprendentemente que de hecho es posible mejorar las propiedades de los tipos mencionados antes (véase arriba) de esta \alpha-amilasa madre por modificación judicial de uno o más residuos de aminoácidos en varias regiones de la secuencia de aminoácidos de la \alpha-amilasa madre. La presente invención se basa en estos resultados.

En consecuencia, en un primer aspecto la presente invención se refiere a variantes de una \alpha-amilasa madre, la \alpha-amilasa madre en cuestión presenta al menos el 80% de identidad con la secuencia de aminoácidos SEC ID No. 3, donde la variante comprende una deleción de al menos dos aminoácidos equivalentes a R179 y G180 de la secuencia de aminoácidos mostrada han sido eliminados en la SEC ID nº. 3, dicha variante teniendo actividad \alpha-amilasa y presentando un mínimo de las siguientes propiedades con respecto a dicha \alpha-amilasa madre: termostabilidad aumentada; estabilidad aumentada hacia la oxidación; y dependencia de Ca^{2+} reducida.

Una variante de \alpha-amilasa de la invención debe cumplir la condición de ser una variante que no tenga una secuencia de aminoácidos idéntica a la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID nº. 1. en la SEC ID nº. 2. en la SEC ID nº. 3 o en la SEC ID nº. 7.

Las secuencias de ADN que codifican las tres primeras secuencias de aminoácidos de la \alpha-amilasa en cuestión están mostradas en la SEC ID nº. 4 (que codifica la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID nº. 1). La SEC ID nº. 5 (que codifica la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID nº. 2) y la SEC ID nº. 6 (que codifica la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID nº. 3).

Las secuencias de aminoácidos de las \alpha-amilasas madres de la SEC ID nº. 1 y de la SEC ID nº. 2, y las secuencias de ADN correspondientes (SEC ID nº. 4 y SEC ID nº. 5. respectivamente) están también descritas en WO 95/26397 (según los mismos Nos. de SEC ID que en esta aplicación).

Las variantes según la invención tienen ellas mismas actividad \alpha-amilasa y presentan al menos una de las siguientes propiedades con respecto a la \alpha-amilasa madre:

termostabilidad aumentada, es decir retención satisfactoria de la actividad enzimática a una temperatura superior a la adecuada para el uso con la enzima madre:

estabilidad a la oxidación aumentada, es decir resistencia aumentada a la degradación por oxidantes (tales como oxígeno, blanqueadores de la oxidación y similares);

dependencia de Ca^{2+} reducida, es decir la capacidad para funcionar de manera satisfactoria en presencia de una concentración de Ca^{2+} inferior que en el caso de la \alpha-amilasa madre. Las \alpha-amilasas con tal dependencia de Ca^{2+} reducida son muy deseables para el uso en composiciones de detergentes, puesto que tales composiciones normalmente contienen cantidades relativamente grandes de sustancias (tales como fosfatos, EDTA y similares) que enlazan iones calcio fuertemente.

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Ejemplos de otras mejoras deseables o modificaciones de propiedades (con respecto a la \alpha-amilasa madre en cuestión) que pueden ser conseguidas con una variante según la invención son:

estabilidad aumentada y/o actividad \alpha-amilolítica a valores de pH neutros hasta relativamente altos, p. ej. a valores de pH en la gama de 7-10.5, así como en la gama de 8.5-10.5;

actividad \alpha-amilolítica aumentada a temperaturas relativamente altas, p. ej. temperaturas en la gama de 40-70ºC;

aumento o reducción del punto isoeléctrico (pl) para relacionar mejor el valor del pl para la variante de \alpha-amilasa en cuestión con el pH del medio (p. ej. un medio de lavado de la ropa, medio de lavado de la vajilla o medio de desencolado textil) en el cual se debe emplear la variante (vide infra); y

unión mejorada de un tipo particular de sustrato, especificidad mejorada hacia un sustrato, y/o especificidad mejorada con respecto al seccionamiento (hidrólisis) del sustrato.

Una secuencia de aminoácidos está considerada como un X% homóloga a la \alpha-amilasa madre si una comparación de las secuencias de aminoácidos respectivas, realizada por medio de algoritmos conocidos, tal como aquella descrita por Lipman y Pearson en Science 227 (1985) p. 1435, revela una identidad de un X%. El programa informático GAP del paquete GCG, versión 7.3 (Junio 1993), puede ser usado de manera adecuada, utilizando valores preestablecidos para penalizaciones de huecos [Genetic Computer Group (1991) Programme Manual for the GCG Package, version 7, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711].

En el contexto de la presente invención, "rendimiento mejorado" según se usa en conexión con el lavado de la ropa y de la vajilla pretende significar, como ya se ha indicado arriba, una eliminación mejorada de manchas amidáceas, es decir manchas que contienen almidón, durante el lavado de la ropa o de la vajilla, respectivamente. El rendimiento puede ser determinado en los experimentos de lavado de la ropa y de la vajilla convencionales y la mejora puede ser evaluada como una comparación con el rendimiento de la \alpha-amilasa madre en cuestión. Un ejemplo de una "mini prueba de lavado de la vajilla" a pequeña escala donde se puede usar un indicador del rendimiento del lavado de la vajilla está descrito en la sección experimental, más abajo.

Será entendido que una variedad de diferentes características de una variante de \alpha-amilasa, incluyendo la actividad específica, especificidad del sustrato, K_{m} (la denominada "constante de Michaelis" en la ecuación de Michaelis-Menten), V_{max} [el nivel máximo (valor de meseta) de la conversión de un sustrato dado determinado en base a la ecuación de Michaelis-Menten], pl, pH óptimo, temperatura óptima, termoactivación, estabilidad hacia agentes oxidantes o tensioactivos (p. ej. en detergentes), etc., tomados solos o en combinación, pueden contribuir al rendimiento mejorado. El experto en la materia será consciente de que el rendimiento de la variante, no puede por separado, ser predicho en base a las características anteriores, sino que tendría que estar acompañado por pruebas de rendimiento del lavado de la ropa y/o de la vajilla.

En otros aspectos la invención se refiere a un constructo de ADN que comprende una secuencia de ADN que codifica una variante de \alpha-amilasa de la invención, un vector de expresión recombinante que lleva el constructo de ADN, una célula que está transformada con el constructo de ADN o el vector, así como un método para producir una variante de \alpha-amilasa para el cultivo de tal célula bajo condiciones propicias para la producción de la variante de \alpha-amilasa, tras lo cual la variante de \alpha-amilasa es recuperada del cultivo.

En otro aspecto la invención se refiere a un método de preparación de una variante de una \alpha-amilasa madre que en virtud de sus propiedades mejoradas según el modo descrito anteriormente presenta un rendimiento mejorado del lavado de la ropa y/o de la vajilla en comparación con la \alpha- amilasa madre. Este método comprende

a)

construir una población de células conteniendo genes que codifican variantes de dicha \alpha-amilasa madre,

b)

seleccionar la población de células por la actividad \alpha-amilasa bajo condiciones que simulan al menos una condición del lavado de la ropa y/o de la vajilla,

c)

aislar una célula de la población que contiene un gen que codifica una variante de dicha \alpha-amilasa madre con actividad mejorada en comparación con la \alpha-amilasa madre según las condiciones seleccionadas en la fase b),

d)

cultivar la célula aislada en la fase c) bajo unas condiciones adecuadas en un medio de cultivo apropiado, y

e)

recuperar la variante de \alpha-amilasa obtenida del cultivo en la fase d).

La invención también se refiere a una variante (que es una variante según la invención) preparada por éste método.

En el presente contexto, el término "simulando al menos una condición de lavado de la ropa y/o de la vajilla" se destina a indicar una simulación de, p. ej., la temperatura o pH predominante durante el lavado de la ropa o de la vajilla, o de la composición química de una composición de detergente para ser usada en el tratamiento del lavado de la ropa o de la vajilla. El término "composición química" se destina a incluir uno, o una combinación de dos o más, constituyentes de la composición de detergente en cuestión. Los constituyentes de varias composiciones detergentes diferentes están catalogados adicionalmente más abajo.

La "población de células" a la que se hace referencia en la fase a) puede de manera adecuada ser construida mediante la donación de una secuencia de ADN que codifica una \alpha-amilasa madre y someter el ADN a una mutagénesis sitio dirigida o aleatoria como se describe en este caso.

En el presente contexto el término "variante" se usa de forma intercambiable con el término "mutante". El término "variante" se destina a incluir \alpha-amilasas híbridas, es decir \alpha-amilasas comprendiendo partes de al menos dos enzimas \alpha-amilolíticas diferentes. Así, tal híbrido puede ser construido, p. ej., a partir de: una o más partes cada una derivando de una variante como ya se ha definido arriba; o una o más partes cada una derivando de una variante como ya se ha definido arriba, y una o más partes cada una derivando de una \alpha-amilasa madre sin modificar. Con respecto a esto, la invención también se refiere a un método para producir tal \alpha-amilasa híbrida con un rendimiento del lavado de la ropa y/o de la vajilla mejorado en comparación con cualquiera de su enzimas constituyentes (es decir en comparación con cualquiera de las enzimas que contribuyen una parte al híbrido), dicho método comprendiendo:

a)

recombinar in vivo o in vitro la zona de codificación N-terminal de un gen de la \alpha-amilasa o ADNc correspondiente de una de las \alpha-amilasas constituyentes por la zona de codificación C-terminal de un gen de \alpha-amilasa o ADNc correspondiente de otra \alpha-amilasa constituyente para formar recombinantes,

b)

seleccionar recombinantes que producen una \alpha-amilasa híbrida con un rendimiento de lavado de la ropa y/o de la vajilla mejorado en comparación con cualquiera de sus \alpha-amilasas constituyentes,

c)

cultivar recombinantes seleccionados en la fase b) bajo condiciones adecuadas en un medio de cultivo apropiado, y

d)

recuperar la \alpha-amilasa híbrida obtenida del cultivo en la fase c).

En otros aspectos la invención se refiere al uso de una variante de \alpha-amilasa de la invención [incluida cualquier variante o híbrido preparado por uno de los métodos anteriormente mencionados] como una enzima para detergente, en particular para el lavado de la ropa o de la vajilla, a un aditivo detergente y una composición de detergente que comprende la variante de \alpha-amilasa, y al uso de una variante de \alpha-amilasa de la invención para el desencolado textil.

La mutagénesis aleatoria puede ser usada para generar variantes según la invención, y la invención también se refiere a un método de preparación de una variante de una \alpha-amilasa madre, dicho método comprende

(a)

someter una secuencia de ADN que codifica la \alpha-amilasa madre a una mutagénesis aleatoria,

(b)

expresar la secuencia de ADN mutada obtenida en la fase (a) en una célula huésped, y

(c)

seleccionar células huéspedes que expresan una enzima mutada amilolítica con propiedades mejoradas según el modo descrito anteriormente (p. ej. propiedades tales como dependencia del calcio disminuida, estabilidad a la oxidación aumentada, termoestabilidad aumentada, y/o actividad mejorada a pH relativamente alto) en comparación con la \alpha-amilasa madre.

Descripción detallada de la invención Nomenclatura

En la presente descripción y reivindicaciones, los códigos de una sola letra convencionales para nucleótidos y los códigos de una y tres letras convencionales son usados para residuos de aminoácidos. Para mayor facilidad de referencia, las variantes de la \alpha-amilasa de la invención están descritas usando la nomenclatura siguiente:

Aminoácido(s) original(es):posición(es):aminoácido(s) substituido(s)

Según esta nomenclatura, y a modo de ejemplo, la sustitución de alanina por asparraguina en la posición 30 está mostrada como:

Ala 30 Asn o A30N

una eliminación de alanina en la misma posición está mostrada como:

Ala 30* o A30*

y la inserción de un residuo de aminoácido adicional, tal como lisina, está mostrada como:

Ala 30 Ala Lys o A30AK

Una eliminación de una extensión consecutiva de residuos de aminoácidos, ejemplificados por los residuos de aminoácidos 30-33, está indicada como (30-33)*.

Donde una \alpha-amilasa específica contiene una "eliminación" (es decir carece de un residuo de aminoácido) en comparación con otras \alpha-amilasas y se hace una inserción en tal posición, esto se indica como:

\text{*}36 Asp o *36D

para la inserción de un ácido aspártico en la posición 36

Las mutaciones múltiples son separadas por más signos, e.d.:

Ala 30 Asp + Glu 34 Ser o A30N+E34S

representando mutaciones en las posiciones 30 y 34 (donde la alanina y el ácido glutámico se reemplazan, es decir son sustituidos por asparraguina y serina, respectivamente).

Cuando uno o más residuos de aminoácidos alternativos pueden ser insertados en una posición dada esto se indica como:

A30N, E o

A30N o A30E

Además, cuando una posición adecuada para la modificación está identificada en la presente sin ninguna modificación específica sugerida, debe entenderse que cualquier otro residuo de aminoácido puede ser sustituido por el residuo de aminoácido presente en esta posición (es decir cualquier residuo de aminoácido - diferente de aquel normalmente presente en la posición en cuestión - elegido entre A, R, N, D, C, Q, E, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y y V). Así, por ejemplo, cuando una modificación (sustitución) de una metionina en la posición 202 está mencionada, pero no especificada, debe entenderse que cualquiera de los demás aminoácidos puede ser sustituido por la metionina, es decir cualquier otro aminoácido elegido entre A, R, N, D, C, Q, E, G, H, I, L, K, F, P, S, T, W, Y y V.

La \alpha-amilasa madre

Como ya se ha indicado, una variante de \alpha-amilasa de la invención es preparada de forma muy adecuada en base a una \alpha-amilasa madre con una de las secuencias de aminoácidos mostradas en la SEC ID nº. 1, SEC ID nº. 2. SEC ID nº. 3 y SEC ID nº. 7. respectivamente (véase abajo).

Las \alpha-amilasas madres con las secuencias de aminoácidos mostradas en la SEC ID nº. 1 y la SEC ID nº. 2. respectivamente, son obtenibles de cepas alcalifílicas de Bacillus (cepa NCIB 12512 y cepa NCIB 12513, respectivamente), las cuales están descritas con detalle en EP 0 277 216 B1. La preparación, purificación y secuenciación de estas dos \alpha-amilasas madres está descrita en WO 95/26397 [véase la sección experimental en la presente (vide infra)].

La \alpha-amilasa madre con la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID nº. 3 es obtenible a partir de Bacillus stearothermophilus y está descrita en, entre otros, J. Bacteriol. 166 (1986) págs. 635-643.

La \alpha-amilasa madre con la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID nº. 7 (que es la misma secuencia que la numerada 4 en la Fig. 1) es obtenible a partir de una "Bacillus sp. #707" y está descrita por Tsukamoto et al. en Biochem. Biophvs. Res. Commun. 151 (1988) págs. 25-31.

Aparte de las variantes mencionadas arriba las \alpha-amilasas madres con las secuencias de aminoácidos mostradas en SEC ID nº. 1, SEC ID nº. 2. SEC ID nº. 3 y SEC ID nº. 7, respectivamente, otras variantes interesantes según la invención incluyen variantes de \alpha-amilasas madres que tienen secuencias de aminoácidos que presentan un alto grado de homología, tal como al menos el 80% de homología, de preferencia al menos el 85% de homología, y más preferiblemente al menos el 90% de homología, p. ej. > 95% de homología, con al menos una de las últimas cuatro secuencias de aminoácidos.

Como se ha indicado anteriormente, otros criterios adicionales para identificar la \alpha-amilasa madre adecuada son a) que la \alpha-amilasa presente una reacción cruzada inmunológica con un anticuerpo desarrollado contra una \alpha-amilasa teniendo una de las secuencias de aminoácidos mostradas en la SEC ID No. 1, SEC ID No. 2, SEC ID No. 3 y SEC ID No. 7, respectivamente, y/o b) que la \alpha-amilasa sea codificada por una secuencia de ADN que se hibride con la misma sonda que una secuencia de ADN que codifica una \alpha-amilasa que tenga una de las secuencias de aminoácidos mostradas en la SEC ID No. 1, SEC ID No. 2, SEC ID No. 3 y SEC ID No. 7, respectivamente.

Como se ha mencionado anteriormente, con respecto a la determinación del grado de homología de los polipéptidos (como las enzimas), las comparaciones de la secuencia de aminoácidos pueden ser realizadas usando algoritmos conocidos, tales como los descritos por Lipman y Pearson (1985).

Los ensayos para la reactividad cruzada inmunológica puede ser realizada usando un anticuerpo desarrollado contra, o reactivo con, al menos un epítopo de la \alpha-amilasa que tiene una secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID No. 1, o de la \alpha-amilasa que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID No. 3, o de la \alpha-amilasa que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID No. 7.

El anticuerpo, que puede ser sea monoclonal o sea policlonal, puede ser producido por métodos conocidos en la técnica, p. ej. como se describe por Hudson et al. (1989). Ejemplos de técnicas de ensayo adecuadas bien conocidas en la técnica incluyen Western Blotting y Ensayo de Inmunodifusión Radial, p. ej. como se describe por Hudson et al. (1989).

La sonda de oligonucleótidos para el uso en la identificación de \alpha-amilasas madres adecuadas en base a la hibridación de la sonda [criterio b) anterior] puede, a modo de ejemplo, ser preparada de forma adecuada en base a la secuencia de aminoácidos completa o parcial de una \alpha-amilasa que tiene una de la secuencias mostradas en la SEC ID No.1, SEC ID No. 2, SEC ID No. 3 y SEC ID No. 7, respectivamente, o en base a la secuencia de nucleótidos completa o parcial correspondiente a la misma.

Las condiciones adecuadas para evaluar la hibridación implican el remojo previamente en 5xSSC y la prehibridación durante 1 h a \sim40ºC en una solución del 20% de formamida, 5xsolución de Denhardt, 50nM de fosfato de sodio, pH 6.8, y 50 \mug de ADN de timo de cordero desnaturalizado, seguido de la hibridación en la misma solución suplementada con 1001tM de ATP durante 18h a \sim40ºC, o usando otros métodos descritos por, p. ej., Sambrook et al. (1989).

Influencia de mutaciones en propiedades particulares

A partir de los resultados obtenidos por los presentes inventores resulta que los cambios en una propiedad particular, p. ej. termoestabilidad o estabilidad a la oxidación, expuesta por una variante con respecto a la \alpha-amilasa madre en cuestión pueden hasta una extensión considerable ser correlacionados con el tipo de y posicionamiento de mutación(es)
(sustituciones, eliminaciones o inserciones del aminoácido) en la variante. Debe entenderse, no obstante, que la observación de que una mutación o modelo particular de mutaciones conduce a cambios en una propiedad no excluye de ninguna manera la posibilidad de que la(s) mutación(es) en cuestión pueda(n) también influir en otras propiedades.

Estabilidad a la oxidación: Con respecto al aumento de la estabilidad a la oxidación de una variante de \alpha-amilasa con respecto a su \alpha-amilasa madre, parece ser particularmente deseable que al menos uno, y, preferiblemente múltiples, residuo(s) aminoácido oxidables del genitor haya(n) sido eliminado(s) o sustituido(s) (es decir sustituido(s) por) un residuo de aminoácido diferente que sea menos susceptible a la oxidación que el residuo de aminoácido original oxidable.

Particularmente, los residuos de aminoácidos oxidables pertinentes al respecto son cisteína, metionina, triptófano y tirosina. Así, por ejemplo, en el caso de las \alpha-amilasas madres que contienen cisteína se anticipa que la eliminación de residuos de cisteína, o la sustitución de los mismos por residuos de aminoácidos menos oxidables, será relevante para obtener variantes con estabilidad a la oxidación mejorada con respecto a la \alpha-amilasa madre.

En el caso de las \alpha-amilasas madres mencionadas arriba con las secuencias de aminoácidos mostradas en SEC ID nº. 1, SEC ID nº. 2 y SEC ID nº. 7, respectivamente, todas ellas sin residuos de cisteína pero con un contenido de metionina significante, la eliminación o sustitución de los residuos de metionina es particularmente pertinente para alcanzar una estabilidad a la oxidación mejorada de las variantes resultantes. Así, la eliminación o sustitución [p. ej. por treonina (T), o por uno de los otros aminoácidos catalogados arriba] de uno o más de los residuos de metionina en las posiciones M9, M10, M105, M202, M208, M261, M309, M382, M430 y M440 de las secuencias de aminoácidos mostradas en la SEC ID nº. 1, SEC ID nº. 2 y SEC ID nº. 7, y/o en la posición M323 de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID nº. 2 (o la eliminación o sustitución de los residuos de metionina en las posiciones equivalentes en la secuencia de otra \alpha-amilasa que reúne uno de los demás criterios para una \alpha-amilasa madre anteriormente mencionada) parece ser particularmente eficaz con respecto al aumento de la estabilidad a la oxidación.

En el caso de la \alpha-amilasa madre con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID nº. 3, los residuos de aminoácidos pertinentes que pueden ser eliminados o sustituidos con el propósito de mejorar la estabilidad a la oxidación incluyen el único residuo de la cisteína (C363) y - por analogía con las secuencias mostradas en la SEC ID nº. 1 y SEC ID nº. 3 - los residuos de la metionina localizados en las posiciones M8, M9, M96, M200, M206, M284, M307, M311, M316 y M438.

Con respecto a esto, el término "posición equivalente" se refiere a una posición que, en base a una alineación de la secuencia de aminoácidos de la \alpha-amilasa madre en cuestión con la secuencia de aminoácidos de la \alpha-amilasa de "referencia" en cuestión (por ejemplo la secuencia mostrada en la SEC ID nº. 1) para conseguir la yuxtaposición de residuos/regiones del aminoácido que son comunes para ambos, corresponde de forma más cercana a (p. ej. está ocupada por el mismo residuo de aminoácido que) una posición particular en la secuencia de referencia en cuestión.

Las mutaciones particularmente interesantes con respecto a la modificación (mejora) de la estabilidad a la oxidación de las \alpha-amilasas con las secuencias de aminoácidos mostradas en SEC ID nº. 1, SEC ID nº. 2 y SEC ID nº. 7, respectivamente, son una o más de las siguientes sustituciones de metionina (o equivalentes de la misma en las secuencias de aminoácidos de otras \alpha-amilasas que reúnen los requisitos de una \alpha-amilasa madre en el contexto de la invención): M202A, R, N, D, Q, E, G, H, I, L, K, F, P, S, T, W, Y, V. Otras sustituciones adicionales de la metionina relevantes en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID nº. 2 son: M323A, R, N, D, Q, E, G, H, I, L, K, F, P, S, T, W, Y, V.

Las mutaciones particularmente interesantes con respecto a la modificación (mejora) de la estabilidad a la oxidación de la \alpha-amilasa con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID nº. 3 son una o más de las siguientes sustituciones de metionina: M200A, R, N, D, Q, E, G, H, I, L, K, F, P, S, T, W, Y, V; M311A, R, N, D, Q, E, G, H, I, L, K, F, P, S, T, W, Y, V; y M316A, R, N, D, Q, E, G, H, I, L, K, F, P, S, T, W, Y, V.

Termoestabilidad: Con respecto al aumento de la termoestabilidad de una variante de \alpha-amilasa con respecto a su \alpha-amilasa madre, parece ser particularmente deseable eliminar al menos uno, y preferiblemente dos o incluso tres, de los siguientes residuos de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID nº. 1 (o sus equivalentes): F180; R181; G182; T183; G184 y K185. Los residuos de aminoácidos correspondientes particularmente relevantes (y equivalentes) en las secuencias de aminoácidos mostradas en la SEC ID nº. 2, la SEC ID nº. 3 y la SEC ID nº. 7, respectivamente, son: F180; R181; G182; D183; G184 y K185 (SEC ID nº. 2); F178; R179; G180. 1181; G182 y K183 (SEC ID nº. 3); y F180; R181; G182; H183; G184 y K185 (SEC ID nº. 7).

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Las eliminaciones de los pares particularmente interesantes de este tipo son las siguientes:

	R181* + G182*; y T183* + G184*	(SEC ID nº. 1);
	R181* + G182*; y D183* + G184*	(SEC ID nº. 2);
	R179* + G180*; y I181* + G182*	(SEC ID nº. 3); y
	R181* + G182*; y H183* + G184*	(SEC ID nº. 7).

(o equivalentes de estas eliminaciones de estos pares en otra \alpha-amilasa que reúne los requisitos de una \alpha-amilasa madre en el contexto de la presente invención).

Otras mutaciones que parecen ser importantes en cuanto a la termoestabilidad son sustituciones de uno o más de los residuos de aminoácidos de P260 a 1275 en la secuencia mostrada en la SEC ID nº. 1 (o equivalentes de los mismos en otra \alpha-amilasa madre en el contexto de la invención), así como la sustitución del residuo de lisina en la posición 269.

Ejemplos de mutaciones específicas que parecen ser importantes en cuanto a la termoestabilidad de una variante de \alpha-amilasa con respecto a la \alpha-amilasa madre en cuestión son una o más de las siguientes sustituciones en la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID nº. 1 (o equivalentes de la misma en otra \alpha-amilasa madre en el contexto de la invención): K269R; P260E; R124P; M105F, I, L, V; M208F, W, Y; L2171; V206I, L, F.

Para la \alpha-amilasa madre con la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID nº. 2, otras mutaciones adicionales importantes (equivalentes) son, correspondientemente, una o más de las sustituciones: M105F, I, L, V; M208F, W, Y; L2171; V2061, L, F; y K269R.

Para la \alpha-amilasa madre con la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID nº. 3, las mutaciones adicionales importantes (equivalentes) son, correspondientemente, una o ambas de las sustituciones: M206F, W, Y; y L2151.

Para la \alpha-amilasa madre con la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID nº. 7, las mutaciones adicionales importantes (equivalentes) son, correspondientemente, una o más de las sustituciones: M105F, I, L, V; M208F, W, Y; L2171; y K269R.

Otros ejemplos adicionales de mutaciones que parecen importantes, entre otras, para conseguir una termoestabilidad mejorada de una variante de \alpha-amilasa con respecto a la \alpha-amilasa madre en cuestión son una o más de las siguientes sustituciones en las secuencias de aminoácidos mostradas en la SEC ID nº. 1, SEC ID nº. 2 y SEC ID nº. 7 (o equivalentes de las mismos en otra \alpha-amilasa madre en el contexto de la invención): A354C + V479C; L351C + M430C; N457D, E + K385R; L355D, E + M430R, K; L355D, E + I411 R, K; y N457D, E.

Dependencia de Ca^{2+}: El cuanto a la consecución de una dependencia de Ca^{2+} reducida de una variante de \alpha-amilasa con respecto a su \alpha-amilasa madre [es decir con respecto a la obtención de una variante que muestra actividad amilolítica satisfactoria en presencia de una concentración inferior del ión calcio en el medio extraño que es necesario para la enzima madre, y que, por ejemplo, en consecuencia es menos sensible que el genitor a las condiciones reductoras del ión calcio tales como las que se obtienen en medios que contienen agentes complexantes del calcio (tales como ciertos constructores de detergentes)], parece ser particularmente deseable incorporar una o más de las siguientes sustituciones en las secuencias de aminoácidos mostradas en la SEC ID nº. 1, SEC ID nº. 2 y SEC ID nº. 7 (o una sustitución equivalente en otra \alpha-amilasa madre en el contexto de la invención): Y243F, K108R, K179R, K239R, K242R, K269R, D163N, D188N, D192N, D199N, D205N, D207N, D209N, E190Q, E194Q y N106D.

En el caso de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID nº. 3, las sustituciones particularmente deseables parecen, correspondientemente (de forma equivalente), ser uno o más de los siguientes: K107R, K177R, K237R, K240R, D162N, D186N, D190N, D197N, D203N, D205N, D207N, E188Q y E192Q.

Al igual que las sustituciones mencionadas arriba de los residuos D por los residuos N, o de los residuos E por los residuos Q, otras sustituciones pertinentes en el contexto para reducir la dependencia de Ca^{2+} son la sustitución de los residuos D y/o E en cuestión por cualquier otro residuo de aminoácido.

Además las sustituciones que parecen ser importantes en el contexto de conseguir una dependencia de Ca^{2+} reducida son sustituciones de pares de los residuos de aminoácidos presentes en: las posiciones 113 y 151, y las posiciones 351 y 430, en las secuencias de aminoácidos mostradas en la SEC ID nº. 1, SEC ID nº. 2 y SEC ID nº. 7; y en: las posiciones 112 y 150, y las posiciones 349 y 428, en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID nº. 3 (o sustituciones de pares equivalentes en otra \alpha-amilasa madre en el contexto de la invención), es decir sustituciones de pares de los siguientes residuos de aminoácidos:

\quad

G113 + N151 (en relación con SEC ID No.1); A113 + T151 (en relación con SEC ID nº. 2 y SEC ID nº. 7); y G112 + T150 (en relación con SEC ID nº. 3); y

\quad

L351 + M430 (en relación con SEC ID No.1, SEC ID nº. 2 y SEC ID nº. 7); y L349 + 1428 (en relación con SEC ID nº. 3).

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Las sustituciones de pares particularmente interesantes de este tipo con respecto a la consecución de una dependencia de Ca^{2+} reducida son las siguientes:

\quad

G113T + N151I (con respecto a la SEC ID No.1); A113T + T151I (con respecto a la SEC ID nº. 2 y la SEC ID nº. 7); y G112T + T150I (con respecto a la SEC ID nº. 3); y

\quad

L351C + M430C (con respecto a la SEC ID No.1, SEC ID nº. 2 y SEC ID nº. 7); y L349C + I428C (con respecto a la SEC ID nº. 3).

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Con respecto a la las sustituciones relevantes para la dependencia de Ca^{2+}, algunas de las sustituciones que parecen importantes en la estabilización de la conformación enzimática, y que están contempladas pueden conseguirlo, p. ej., aumentando la resistencia de la unión o retención del ión calcio en o dentro de un centro de unión al calcio dentro de la enzima \alpha-amilolítica, son una o más de las siguientes sustituciones en las secuencias de aminoácidos mostradas en SEC ID nº. 1, SEC ID nº. 2 y SEC ID nº. 7 (o una sustitución equivalente en otra \alpha-amilasa madre en el contexto de la invención): G304W, F, Y, R, I, L, V, Q, N; G305A, S, N, D, Q, E, R, K; y H408Q, E.

Las sustituciones correspondientes (equivalentes) en la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID nº. 3 son: G302W, F, Y, R, I, L, V, Q, N; y G303A, S, N, D, Q, E, R, K.

Otras mutaciones que parecen ser importantes en el contexto de la consecución de una dependencia de Ca^{2+} reducida son eliminaciones de pares de aminoácidos (es decir eliminación de dos aminoácidos) en las posiciones seleccionadas entre R181;G182;T183 y G184 en la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID No.1 (o posiciones equivalentes en la secuencia de aminoácidos de otra \alpha-amilasa que reúne los requisitos de una \alpha-amilasa madre en el contexto de la invención). Tales eliminaciones de pares son por lo tanto las siguientes:

	R181* + G182*; T183* + G184*; R181* + T183*; G182* + T183*;
	G182* + G184*; y R181* + G184*	(SEC ID nº. 1);

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	R181* + G182*; D183* + G184*; R181* + D183*; G182* + D183*;
	G182* + G184*; y R181* + G184*	(SEC ID nº. 2);

\vskip1.000000\baselineskip

	R179* + G180*; 1181* + G182*; R179* + 1181*; G180* + 1181*;
	G180* + G182*; y R179* + G182*	(SEC ID nº. 3); y

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	R181* + G182*; H183* + G184*; R181* + H183*; G182* + H183*;
	G182* + G184*; y R181* + G184*	(SEC ID nº. 7);

(o equivalentes de estas eliminaciones de pares en otra \alpha-amilasa que reúne los requisitos de una \alpha-amilasa madre en el contexto de la presente invención).

Punto isoeléctrico (pl): Los resultados preliminares indican que el rendimiento del lavado, p. ej. el rendimiento del lavado de la ropa, de una \alpha-amilasa es óptimo cuando el pH de la solución de lavado (medio de lavado) es próximo al valor pl para la \alpha-amilasa en cuestión. Por lo tanto será deseable, en caso de ser apropiado, producir una variante de \alpha-amilasa con un punto isoeléctrico (valor pl) que está mejor relacionado con el pH de un medio (tal como un medio de lavado) en el que la enzima debe ser empleada que el punto isoeléctrico de la \alpha-amilasa madre en cuestión.

Con respecto a la disminución del punto isoeléctrico, las mutaciones preferidas en la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID nº. 1 incluyen una o más de las siguientes sustituciones: Q86E, R124P, S154D, T183D, V222E, P260E, R310A, Q346E, Q391 E, N437E, K444Q y R452H. Las combinaciones apropiadas de estas sustituciones en el contexto de la disminución del punto isoeléctrico incluyen: Q391 E + K444Q; y Q391 E + K444Q + S154D.

Correspondientemente, las mutaciones preferidas en la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID nº. 3 con respecto a la disminución del punto isoeléctrico incluyen una o más de las sustituciones: L85E, S153D, I181D, K220E, P258E, R308A, P344E, Q358E y S435E.

Con respecto al aumento del punto isoeléctrico, las mutaciones preferidas en la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID nº. 2 incluyen una o más de las siguientes sustituciones: E86Q, L; D154S; D183T, I; E222V, K; E260P; A310R; E346Q, P; E437N, S; y H452R.

En la sección experimental más abajo, la construcción de varias variantes está descrita según la invención.

Las variantes de la \alpha-amilasa de la invención, aparte de tener una o más propiedades mejoradas como se ha mencionado anteriormente, preferiblemente serán tales que éstas tengan una velocidad de hidrólisis del almidón más alta a bajas concentraciones del sustrato que la de la \alpha-amilasa madre. De forma alternativa, una variante de \alpha-amilasa de la invención preferiblemente será una con un V_{max} mayor y/o una K_{m} inferior que la para la \alpha-amilasa madre cuando se evalúa bajo las mismas condiciones. En el caso de una \alpha-amilasa híbrida, la "\alpha-amilasa madre" para ser usada para la comparación debería ser aquella con las enzimas constituyentes de mejor rendimiento.

V_{max} y K_{m} (parámetros de la ecuación Michaelis-Menten) pueden ser determinados por procedimientos bien conocidos.

Métodos de preparación de variantes de \alpha-amilasa

Diferentes métodos para introducir mutaciones en genes son conocidos en la técnica. Después de una breve discusión sobre la clonación de secuencias de ADN que codifican la \alpha-amilasa, se han discutido métodos para generar mutaciones en sitios específicos dentro de la secuencia de codificación de la \alpha-amilasa.

Clonación de una secuencia de ADN que codifica una \alpha-amilasa

La secuencia de ADN que codifica una \alpha-amilasa madre puede ser aislada de cualquier célula o microorganismo que produzca la \alpha-amilasa en cuestión, usando varios métodos bien conocidos en la técnica. Primero, un ADN genómico y/o genoteca de ADNc debería ser construida usando ADN cromosómico o ARN mensajero del organismo que produce la \alpha-amilasa para ser estudiada. Luego, si la secuencia de aminoácidos de la \alpha-amilasa es conocida las sondas de oligonucleótidos homólogas marcadas, pueden ser sintetizadas y usadas para identificar los clones que codifican la \alpha-amilasa a partir de una librería genómica obtenida a partir del organismo en cuestión. De forma alternativa, una sonda de oligonucleótidos marcada que contiene homólogos de secuencias a un gen de la \alpha-amilasa conocido podría ser usada como una sonda para identificar clones que codifican la \alpha-amilasa, usando condiciones de hibridación y de lavado de astringencia inferior.

Otro método para identificar los clones que codifican la \alpha-amilasa implican insertar fragmentos de ADN genómico en un vector de expresión, tal como un plásmido, transfomar bacterias \alpha-amilasa-negativas con la resultante biblioteca de ADN genómico, y luego disponer en placas las bacterias transformadas en agar conteniendo un sustrato para \alpha-amilasa, de ese modo permitiendo identificar la expresión de clones que expresan la \alpha-amilasa.

De forma alternativa, la secuencia de ADN que codifica la enzima puede ser preparada sintéticamente por métodos estándares establecidos, p. ej. el método de la fosfoamidita descrito por S.L. Beaucage y M.H. Caruters (1981) o el método descrito por Mattes et al. (1984). En el método de la fosfoamidita, los oligonucleótidos son sintetizados, p. ej. en un sintetizador de ADN automático, purificados, hibridados, ligados y clonados en vectores apropiados.

Finalmente, la secuencia de ADN puede ser de origen mezclado genómico y sintético, de origen mezclado sintético y ADNc o de origen mezclado genómico y ADNc, preparado para ligar fragmentos de origen sintético, genómico o ADNc (según convenga, los fragmentos correspondientes a varias partes de la secuencia de ADN entera), conforme a técnicas estándar. La secuencia de ADN puede también ser preparada por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) usando cebadores específicos, por ejemplo según está descrito en US 4,683,202 o R.K. Saiki et al. (1988).

Mutagénesis sitio-dirigida

Una vez aislada una secuencia de ADN que codifica la \alpha-amilasa, e identificados los sitios deseables para la mutación, se pueden introducir mutaciones usando oligonucleótidos sintéticos. Estos oligonucleótidos contienen secuencias de nucleótidos que flanquean los sitios de mutación deseados; los nucleótidos mutantes son insertados durante la síntesis de oligonucleótidos. En un método específico, un espacio monocatenario de ADN, que conectan la secuencia de codificación de \alpha-amilasa, es creada en un vector que lleva el gen de la \alpha-amilasa. Luego el nucleótido sintético, que alberga la mutación deseada, es hibridado a una parte homóloga del ADN monocatenario. El espacio restante es luego rellenado con ADN polimerasa I (fragmento Klenow) y el constructo es ligado usando una T4 ligasa. Un ejemplo específico de este método está descrito en Morinaga et al. (1984). 4,760,025 expone la introducción de oligonucleótidos que codifican mutaciones múltiples mediante la realización de alteraciones menores del casette. No obstante, una variedad incluso superior de mutaciones puede ser introducida a cada vez por el método de Morinaga, porque una multitud de oligonucleótidos, de varias longitudes, pueden ser introducidos.

Otro método de introducción de mutaciones en secuencias de ADN que codifican la \alpha-amilasa está descrito en Nelson y Long (1989). Implica la generación en 3 fases de un fragmento de la PCR que contiene la mutación deseada introducida usando una cadena de ADN sintetizada químicamente como uno de los cebadores en las reacciones de la PCR. Del fragmento generado por reacción en cadena de la polimerasa, un fragmento de ADN que lleva la mutación puede ser aislado por seccionamiento con endonucleasas de restricción y reinsertado en un plásmido de
expresión.

Mutagénesis aleatoria

La mutagénesis aleatoria se realiza de manera adecuada bien como una mutagénesis aleatoria localizada o región-específica en al menos tres partes del gen que se traduce en la secuencia de aminoácidos mostrada en cuestión, o dentro del gen entero.

Para la mutagénesis región-específica aleatoria y con el propósito de mejorar la termoestabilidad, las posiciones del codón siguientes, en particular, pueden ser determinadas de forma apropiada (usando abreviaturas del aminoácido de una sola letra y la numeración de los residuos de aminoácidos en la secuencia en cuestión):

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En la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID nº. 1:

120-140 = VEVNRSNRNQETSGEYAIEAW

178-187 = YKFRGTGKAW

264-277 = VAEFWKNDLGAIEN

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En la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID nº. 2:

120-140 = VEVNPNNRNQEISGDYTIEAW

178-187 = YKFRGDGKAW

264-277 = VAEFWKNDLGALEN

\vskip1.000000\baselineskip

En la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID nº. 3:

119-139 = VEVNPSDRNQEISGTYQIQAW

176-185 = YKFRGIGKAW

262-275 = VGEYWSYDINKLHN

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En la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID nº. 7:

120-140 = VEVNPNNRNQEVTGEYTIEAW

178-187 = YKFRGHGKAW

264-277 = VAEFWKNDLGAIEN

\newpage

Con el propósito de conseguir una dependencia Ca^{2+} reducida, las posiciones del codón siguientes, en particular, pueden ser determinadas de forma apropiada:

En la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID nº. 1:

178-209 = YKFRGTGKAWDWEVDTENGNYDYLMYADVDMD

237-246 = AVKHIKYSFT

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En la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID nº. 2:

178-209 = YKFRGDGKAWDWEVDSENGNYDYLMYADVDMD

237-246 = AVKHIKYSFT

\vskip1.000000\baselineskip

En la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID nº. 7:

178-209 = YKFRGHGKAWDWEVDTENGNYDYLMYADIDMD

237-246 = AVKHIKYSFT

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Con el propósito de conseguir una unión mejorada de un sustrato (es decir una unión mejorada de una especie de carbohidrato - tal como la amilosa o amilopectina - que es un sustrato para enzimas \alpha-amilolíticas) por una variante de \alpha-amilasa, una especificidad del sustrato modificada (p. ej. más alta) y/o una especificidad modificada (p. ej. más alta) con respecto al seccionamiento (hidrólisis) del sustrato, resulta que las posiciones del codón siguientes para la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID nº. 1 (o las posiciones del codón equivalentes para otras \alpha-amilasa madres en el contexto de la invención) pueden ser determinadas de forma particular y apropiada:

En la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID No. 1:

15-20 = WYLPND

52-58 = SQNDVGY

72-78 = KGTVRTK

104-111 = VMNHKGGA

165-174 = TDWDQSRQLQ

194-204 = ENGNYDYLMYA

234-240 = RIDAVKH

332-340 = HDSQPGEAL

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La mutagénesis aleatoria de una secuencia de ADN que codifica una \alpha-amilasa madre para ser realizada conforme a la fase a) del método descrito anteriormente de la invención puede convenientemente ser realizada usando cualquier método conocido en la técnica. Por ejemplo, la mutagénesis aleatoria puede ser realizada usando un agente mutagenizante físico o químico adecuado, usando un oligonucleótido adecuado, o sometiendo la secuencia de ADN a mutagénesis generada por PCR. Además, la mutagénesis aleatoria puede ser realizada usando cualquier combinación de estos agentes mutagenizantes.

El agente mutagenizante puede, p. ej., ser uno que induzca transiciones, transversiones, inversiones, aleatorizaciones, eliminaciones, y/o inserciones.

Ejemplos de un agente mutagenizante físico o químico adecuado para el presente objetivo incluye irradiación ultravioleta (UV), hidroxilamina, N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina (MNNG), O-metil hidroxilamina, ácido nitroso, etil metano sulfonato (EMS), bisulfito de sodio, ácido fórmico, y análogos de nucleótidos.

Cuando tales agentes son usados, la mutagénesis es normalmente realizada incubando la secuencia de ADN que codifica la enzima madre para ser mutagenizada en presencia del agente mutagenizante de elección bajo unas condiciones adecuadas para que se produzca la mutagénesis, y seleccionando el ADN mutado con las propiedades deseadas.

Cuando la mutagénesis se realizada usando un oligonucleótido, el oligonucleótido puede ser dopado o inoculado con los tres nucleótidos no genitores durante la síntesis de los oligonucleótidos en las posiciones que son para cambiar. El dopaje o inoculación puede ser realizado de modo que se eviten los codones para los aminoácidos indeseados. El oligonucleótido dopado o inoculado puede ser incorporado en el ADN que codifica la enzima amilolítica por cualquier técnica publicada, usando p. ej. PCR, LCR o cualquier ADN-polimerasa y ligasa.

Cuando se utiliza la mutagénesis generada por PCR, sea un gen tratado o sea uno no tratado químicamente que codifica una enzima \alpha-amilasa madre es sometido a PCR bajo condiciones que aumentan la desincorporación de nucleótidos (Deshler 1992; Leung et al., Technique, Vol.1, 1989, pp. 11-15).

Una cepa mutágena de E. coli (Fowler et al., Molec. Gen. Genet., 133, 1974, págs. 179-191), S. cereviseae o cualquier otro organismo microbiano puede ser usado para la mutagénesis aleatoria del ADN que codifica la enzima amilolítica p. ej. transformando un plásmido que contiene la enzima madre en la cepa mutágena, sometiendo a crecimiento la cepa mutágena con el plásmido y aislando el plásmido mutado de la cepa mutágena. El plásmido mutado puede posteriormente ser transformado en el organismo de expresión.

La secuencia de ADN para ser mutagenizada puede convenientemente estar presente en una librería genómica o de ADNc obtenida a partir del organismo que expresa la enzima amilolítica madre. De forma alternativa, la secuencia de ADN puede estar presente en un vector adecuado tal como un plásmido o un bacteriófago, que como tal puede ser incubado con o por lo contrario ser expuesto al agente mutagenizante. El ADN para ser mutagenizado puede también estar presente en una célula huésped bien integrándose en el genoma de dicha célula o estando presente en un vector contenido en la célula. Finalmente, el ADN para ser mutagenizado puede estar en forma aislada. Se entenderá que la secuencia de ADN para ser sometida a mutagénesis aleatoria es preferiblemente una secuencia de ADNc o de ADN genómico.

En algunos casos puede ser conveniente amplificar la secuencia de ADN mutada antes de que la fase de expresión (b) o la fase de selección (c) sean realizadas. Tal amplificación puede ser realizada conforme a métodos conocidos en la técnica, el método actualmente preferido siendo la amplificación generada por PCR usando cebadores oligonucleótidos preparados en base a la secuencia de ADN o de aminoácidos de la enzima madre.

Después de la incubación con o de la exposición al agente mutagenizante, el ADN mutado es expresado por el cultivo de una célula huésped adecuada que lleva la secuencia de ADN bajo condiciones que permiten que tenga lugar la expresión. La célula huésped usada para este propósito puede ser una que haya sido transformada con la secuencia de ADN mutada, opcionalmente presente en un vector, o una que fuera llevada en la secuencia de ADN que codifica la enzima madre durante el tratamiento de mutagénesis. Ejemplos de células huéspedes adecuadas son las siguientes: bacterias gram-positivas tales como Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus brevis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus circulans, Bacillus lautus, Bacillus megaterium, Bacillus thuringiensis, Streptomyces lividans o Streptomyces murinus; y bacterias gram-negativas tales como E. coli.

La secuencia de ADN mutada puede además comprender una secuencia de ADN que codifica las funciones que permiten la expresión de la secuencia de ADN mutada.

Mutagénesis aleatoria localizada: la mutagénesis aleatoria puede ventajosamente estar localizada en una parte de la \alpha-amilasa madre en cuestión. Esto puede, p. ej., ser ventajoso cuando ciertas regiones de la enzima han sido identificadas por ser de importancia particular para una propiedad dada de la enzima, y cuando se modifican se prevé que resulten en una variante con propiedades mejoradas. Tales regiones pueden normalmente ser identificadas cuando la estructura terciaria de la enzima madre ha sido dilucidada y relacionada con la función de la enzima.

La mutagénesis localizada aleatoria se realiza convenientemente usando las técnicas de la mutagénesis generada por PCR como se ha descrito anteriormente o cualquier otra técnica adecuada conocida en la técnica.

De forma alternativa, la secuencia de ADN que codifica la parte de la secuencia de ADN para ser modificada puede ser aislada, p. ej. siendo insertada en un vector adecuado, y dicha parte puede posteriormente ser sometida a mutagénesis usando cualquiera de los métodos de mutagénesis mencionados anteriormente.

Con respecto a la fase de selección en el método de la invención mencionado anteriormente, esto puede ser realizado convenientemente usando un ensayo de filtro basado en el principio siguiente:

Un microorganismo capaz de expresar la enzima mutada amilolítica de interés es incubado en un medio adecuado y bajo condiciones adecuadas para que la enzima sea segregada, el medio estando provisto de un filtro doble con un primer filtro de unión a proteínas y en la parte superior de un segundo filtro presentando una capacidad de unión a proteínas baja. El microorganismo está localizado en el segundo filtro. Después de la incubación, el primer filtro que comprende enzimas segregadas a partir de los microorganismos es separado del segundo filtro que comprende los microorganismos. El primer filtro es cribado por la actividad enzimática deseada y se identifican las colonias microbianas correspondientes presentes en el segundo filtro.

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El filtro usado para unir la actividad enzimática puede ser cualquier filtro de unión a proteínas p. ej. nilón o nitrocelulosa. El filtro superior que lleva las colonias del organismo de expresión puede ser cualquier filtro que no tenga o que tenga baja afinidad a proteínas de unión p. ej. acetato de celulosa o Durapore^{TM}. El filtro puede ser pretratado con cualquiera de las condiciones para ser usadas para la selección o puede ser tratado durante la detección de la actividad enzimática.

La actividad enzimática puede ser detectada por un tinte, fluorescencisa, precipitación, indicador de pH, absorbancia por IR o cualquier otra técnica conocida para la detección de actividad enzimática.

El compuesto de detección puede ser inmovilizado por cualquier agente de inmovilización p. ej. agarosa, agar, gelatina, poliacrilamida, almidón, papel del filtro, tela; o cualquier combinación de agentes de inmovilización.

La actividad de la \alpha-amilasa es detectada por amilopectina marcada por Cibacron Red, que es inmovilizado en agarosa. Para la selección de variantes con estabilidad térmica aumentada y a un pH alto, el filtro con variantes de \alpha-amilasa unidas es incubado en un tampón a pH 10.5 y 60º o 65ºC durante un tiempo especifico, enjuagado brevemente en agua desionizada y colocado en la matriz de amilopectina-agarosa para detectar la actividad. Se ve la actividad residual como una lisis de Cibacron Red por degradación de la amilopectina. Las condiciones son elegidas por ser tales que la actividad debida a la \alpha-amilasa con la secuencia de aminoácidos mostrada pueda apenas ser detectada en la SEC ID No.1. Las variantes estabilizadas muestran, según las mismas condiciones, una intensidad del color aumentada debida a la liberación aumentada de Cibacron Red.

Para seleccionar variantes con una actividad óptima a una temperatura inferior y/o con una gama de temperatura más amplia, el filtro con las variantes unidas es colocado directamente en la placa del sustrato de amilopectina-Cibacron Red e incubado a la temperatura deseada (p. ej. 4ºC, 10ºC o 30ºC) durante un tiempo especifico. Después de este periodo, la actividad debida a la \alpha-amilasa con la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID No.1 puede apenas ser detectada, mientras que las variantes con actividad óptima a una temperatura inferior muestra un aumento de la lisis de la amilopectina. Antes de la incubación en la matriz de amilopectina, la incubación en todos los tipos de medios deseados - p. ej. soluciones que contienen Ca^{2+}, detergentes, EDTA u otros aditivos pertinentes - puede llevarse a cabo para cribar la dependencia cambiada o la reacción de las variantes en cuestión con tales aditivos.

Métodos de preparación de \alpha-amilasas híbridas

Como una alternativa a la mutagénesis sitio específica, las variantes de la \alpha-amilasa que son híbridos de al menos dos \alpha-amilasas constituyentes pueden ser preparadas combinando las partes pertinentes de los genes respectivos en cuestión.

Las enzimas de origen natural pueden ser genéticamente modificadas por mutagénesis aleatoria o sitio dirigida según el modo descrito anteriormente. De forma alternativa, parte de una enzima puede ser sustituida por una parte de otra para obtener una enzima quimérica. Esta sustitución puede ser conseguida bien por técnicas de empalme de genes convencionales in vitro o por recombinación in vivo o por combinaciones de ambas técnicas. Cuando se usan técnicas del empalme de genes convencionales in vitro, una parte deseada de la secuencia de codificación del gen de la \alpha-amilasa puede ser eliminada usando enzimas de restricción sitio específicas apropiadas; la parte eliminada de la secuencia de codificación puede luego ser sustituida por la inserción de una parte deseada de una secuencia de codificación de la \alpha-amilasa diferente de manera que se produce una secuencia de nucleótidos quiméricos que codifica una \alpha-amilasa nueva. De forma alternativa, los genes de la \alpha-amilasa pueden ser fusionados, p. ej. usando el método de extensión por solapamiento por PCR descrito por Higuchi et al. 1988.

Las técnicas de la recombinación in vivo dependen del hecho de que segmentos de ADN diferentes con regiones altamente homólogas (identidad de secuencias de ADN) pueden recombinarse, es decir romperse e intercambiar ADN, y establecer enlaces nuevos en las regiones homólogas. En consecuencia, cuando las secuencias de codificación para dos enzimas amilasas diferentes pero homólogas se utilizan para transformar una célula huésped, la recombinación de secuencias homólogas in vivo resultará en la producción de secuencias del gen quimérico. La traducción de estas secuencias de codificación por la célula huésped resultarán en la producción de un producto del gen de amilasa quimérico. Las técnicas de recombinación in vivo específicas están descritas en US 5,093,257 y EP 252 666.

De forma alternativa, la enzima híbrida puede ser sintetizada por métodos químicos estándares conocidos en la técnica. Por ejemplo, ver Hunkapiller et al. (1984). En consecuencia, los péptidos que tienen las secuencias de aminoácidos apropiadas pueden ser sintetizados completamente o en parte y las enzimas unidas para formar enzimas híbridas (variantes) de la invención.

Expresión de variantes de \alpha-amilasa

Según la invención, una secuencia de ADN que codifica la \alpha-amilasa mutada producida por los métodos anteriormente descritos, o por unos métodos alternativos cualquiera conocidos en la técnica, puede ser expresada, en forma enzimática, usando un vector de expresión que normalmente incluye las secuencias de control que codifican un promotor, operador, centro de unión del ribosoma, señal de iniciación de la traducción, y, opcionalmente, un gen represor o varios genes activadores.

El vector de expresión recombinante que lleva la secuencia de ADN que codifica una variante de \alpha-amilasa de la invención puede ser cualquier vector que puede convenientemente ser sometido a procedimientos de ADN recombinante, y la elección del vector dependerá frecuentemente de la célula huésped en la que se tenga que introducir. Así, el vector puede ser un vector de replicación autónoma, es decir un vector que existe como una entidad extracromosómica, cuya replicación es independiente de la replicación cromosómica, p. ej. un plásmido, un bacteriófago o un elemento extracromosómico, minicromosoma o un cromosoma artificial. De forma alternativa, el vector puede ser uno que, al introducirse en una célula huésped, se integra en el genoma de la célula huésped y se replica con el (los) cromosoma(s)
en el (los) que se ha integrado.

En el vector, la secuencia de ADN debería estar operativamente conectada a una secuencia del promotor adecuada. El promotor puede ser cualquier secuencia de ADN que muestre actividad transcripcional en la célula huésped de elección y puede ser derivado de genes que codifican proteínas bien homólogas o heterólogas a la célula huésped. Ejemplos de promotores adecuados para dirigir la transcripción de la secuencia de ADN que codifica una variante de \alpha-amilasa de la invención, especialmente en un huésped bacteriano, son el promotor del operón lac de E. coli, los promotores dagA del gen de la agarasa de Streptomyces coelicolor, promotores del gen de la \alpha-amilasa de Bacillus licheniformis (amyL), los promotores del gen de la \alpha-amilasa maltogénico de Bacillus stearothermophilus (amyM), los promotores de la \alpha-amilasa de Bacillus amyloliquefaciens (amyQ), los promotores de los genes xylA y xylB de Bacillus subtilis etc. para la transcripción en un huésped fúngico, los ejemplos de promotores útiles son los derivados del gen que codifica la amilasa TAKA de A. oryzae, la proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei, la amilasa neutra de A. Niger, la \alpha-amilasa estable en ácido de A. Niger, la glucoamilasa de A. Niger, la lipasa de Rhizomucor miehei, la proteasa alcalina de A. oryzae, la triosa fosfato isomerasa de A. oryzae o la acetamidasa de A. nidulans.

El vector de expresión de la invención puede también comprender un terminador de la transcripción adecuado y, en eucariotas, secuencias de poliadenilación operativamente conectadas a la secuencia de ADN que codifica la variante de \alpha-amilasa de la invención. Las secuencias de terminación y de poliadenilación pueden de manera adecuada derivar de las mismas fuentes que el promotor.

El vector puede además comprender una secuencia de ADN que permita que el vector se replique en la célula huésped en cuestión. Ejemplos de tales secuencias son los orígenes de replicación de los plásmidos pUC19, pACYC177, pUB110, pE194, pAMB1 y pIJ702.

El vector puede también comprender un marcador seleccionable, p. ej. un gen cuyo producto implementa una falta en la célula huésped, tal como los genes dal de B. subtilis o B. licheniformis, o uno que confiere resistencia antibiótica tal como resistencia a la ampicilina, la canamicina, el cloranfenicol o la tetraciclina. Además, el vector puede comprender marcadores de selección de Aspergillus tales como amdS, argB, niaD y sC, un marcador que de lugar a la resistencia a la higromicina, o bien la selección puede ser realizada por cotransformación, p. ej. como se describe en WO 91117243.

Mientras que la expresión intracelular puede ser ventajosa en algunos aspectos, p. ej. cuando se usan ciertas bacterias como las células huéspedes, es generalmente preferido que la expresión sea extracelular.

Los procedimientos adecuados para construir vectores de la invención que codifican una variante de \alpha-amilasa, y conteniendo el promotor, terminador y otros elementos, respectivamente, son conocidos por los expertos en la técnica [ver, por ejemplo, Sambrook et al. (1989)].

La célula de la invención, que comprende sea un constructo de ADN o sea un vector de expresión de la invención tal y como se ha definido anteriormente, es ventajosamente usada como una célula huésped en la producción recombinante de una variante de \alpha-amilasa de la invención. La célula puede ser transformada con el constructo de ADN de la invención que codifica la variante, integrando convenientemente el constructo de ADN (en una o más copias) en el cromosoma huésped. Esta integración es generalmente considerada como una ventaja puesto que la secuencia de ADN es más probable que sea mantenida de forma estable en la célula. La integración de los constructos de ADN en el cromosoma huésped puede ser realizada según los métodos convencionales, p. ej. por recombinación homóloga o heteróloga. De forma alternativa, la célula puede ser transformada con un vector de expresión según el modo descrito anteriormente en relación con los diferentes tipos de células huéspedes.

La célula de la invención puede ser una célula de un organismo superior tal como un mamífero o un insecto, pero es preferiblemente una célula microbiana, p. ej. una célula bacteriana o una fúngica (incluyendo de levadura).

Ejemplos de bacterias adecuadas son las bacterias gram-positivas tales como Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus brevis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus circulans, Bacillus lautus, Bacillus megaterium, Bacillus thuringiensis, o Streptomyces lividans o Streptomyces murinus o bacterias gram negativas tales como E. coli. La transformación de las bacterias puede, por ejemplo, efectuarse por transformación del protoplasto o usando células competentes en cierto modo conocido per se.

El organismo de levadura puede ser seleccionado de forma favorable de unas especies de Saccharomyces o Schizosaccharomyces, p. ej. Saccharomyces cerevisiae. El hongo filamentoso puede ventajosamente pertenecer a unas especies de Aspergillus, p. ej. Aspergillus oryzae o Aspergillus niger. Las células micóticas pueden ser transformadas por un proceso que implica la formación del protoplasto y la transformación de los protoplastos seguido de la regeneración de la pared celular en cierto modo conocido per se. Un procedimiento adecuado para la transformación de células huéspedes de Aspergillus está descrito en EP 238 023.

En otro aspecto adicional, la presente invención se refiere a un método para producir una variante de \alpha-amilasa de la invención, dicho método comprende el cultivo de una célula huésped según el modo descrito anteriormente bajo condiciones propicias para la producción de la variante y la recuperación de la variante de las células y/o del medio de cultivo.

El medio usado para cultivar las células puede ser cualquier medio convencional adecuado para hacer crecer la célula huésped en cuestión y obtener la expresión de la variante de \alpha-amilasa de la invención. Los medios adecuados están disponibles por proveedores comerciales o pueden ser preparados según recetas publicadas (p. ej. como se describe en catálogos de la American Type Culture Collection).

La variante de \alpha-amilasa segregada a partir de las células huéspedes puede convenientemente ser recuperadas del medio de cultivo por procedimientos bien conocidos, incluyendo la separación de las células del medio por centrifugado o filtración, y precipitación de los componentes proteínicos del medio mediante una sal tal como sulfato de amonio, seguido del uso de procedimientos cromatográficos tales como cromatografía de intercambio fónico, cromatografía de afinidad, o similar.

Aplicaciones industriales

Debido a su actividad a valores de pH alcalino, las variantes de \alpha-amilasa de la invención son bien adecuadas para el uso en una variedad de procesos industriales. En particular, encuentran aplicaciones potenciales como un componente en composiciones para el lavado de la ropa, lavado de la vajilla y detergentes de limpieza de superficies duras (véase abajo), pero pueden también ser útiles para la producción de edulcorantes y etanol a partir del almidón. Las condiciones para los procesos convencionales de conversión del almidón y los procesos de licuefacción y/o de sacarificación están descritos, por ejemplo, en US 3,912,590, EP 252,730 y EP 63,909.

Algunas áreas de aplicación de las variantes de \alpha-amilasa de la invención están perfiladas más abajo.

Aplicaciones relacionadas con el papel: las variantes de \alpha-amilasa de la invención poseen propiedades valiosas en la producción de materiales lignocelulósicos, tales como pasta, papel y cartón, a partir de papel usado reforzado con almidón y cartón usado, especialmente cuando se produce la rerreducción a pasta a un pH superior a 7, y cuando las amilasas pueden facilitar la desintegración del material de desecho a través de la degradación del almidón de refuerzo.

Las variantes de \alpha-amilasa de la invención son bien adecuadas para el uso en los procesos de desentintado/de reciclaje de fabricación del papel del papel impreso revestido de almidón o conteniendo almidón. Es normalmente deseable eliminar la tinta de imprenta para producir papel nuevo de alta luminosidad; ejemplos de cómo las variantes de invención pueden ser usadas de esta manera están descritos en PCT/DK94/00437.

Las variantes de \alpha-amilasa de la invención pueden también ser muy útiles para modificar el almidón cuando el almidón enzimáticamente modificado se usa para la fabricación de papel junto con rellenos alcalinos tales como carbonato cálcico, caolín y arcillas. Con variantes de \alpha-amilasa alcalina de la invención se puede modificar el almidón en presencia del relleno, permitiendo así un proceso integrado más simple.

Desencolado textil: Las variantes de \alpha-amilasa de la invención son también bien adecuadas para el uso en el desencolado textil. En la industria del tratamiento textil, las \alpha-amilasas son generalmente usadas como auxiliares en el proceso de desencolado para facilitar la eliminación de cola conteniendo almidón que ha servido como revestimiento protector en los hilos de la trama durante el tejido.

La eliminación completa del revestimiento de cola después del tejido es importante para asegurar resultados óptimos en procesos posteriores donde el tejido es descrudado, blanqueado y teñido. La degradación del almidón enzimático es preferida porque no daña las fibras del tejido o tela.

Para reducir los costes del tratamiento y aumentar el rendimiento del triturador, el tratamiento de desencolado es a veces combinado con fases de descrudado y de blanqueamiento. En tales casos, auxiliares no enzimáticos tales como agentes alcali u oxidantes son normalmente usados para romper el almidón, puesto que las \alpha-amilasas tradicionales no son muy compatibles con niveles de pH altos y blanqueadores. La descomposición no enzimática de la cola de almidón conduce a algún daño en la fibra debido a los productos químicos usados más bien agresivos.

Las variantes de \alpha-amilasa de la invención que presentan un rendimiento de la degradación del almidón mejorado a niveles de pH relativamente altos y en la presencia de agentes de oxidación (blanqueamiento) son así bien adecuados para el uso en procesos de desencolado según el modo descrito anteriormente, en particular para la sustitución de agentes de desencolado no enzimáticos usados habitualmente. La variante de \alpha-amilasa puede ser usada sola, o en combinación con una celulasa al desencolar la tela o tejido con celulosa.

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Fabricación de la cerveza: las variantes de \alpha-amilasa de la invención son también consideradas muy útiles en los procesos de fabricación de la cerveza; en tales procesos las variantes normalmente son añadidas durante el proceso de maceración.

Aplicaciones en aditivos de detergentes v composiciones de detergentes para el lavado de la ropa o de la vajilla

Debido al lavado mejorado y/o el rendimiento del lavado de la vajilla que frecuentemente será una consecuencia de mejoras en las propiedades como se ha mencionado anteriormente, las variantes de \alpha-amilasa numerosas (incluyendo híbridos) de la invención son particularmente bien adecuadas para incorporarse en composiciones de detergentes, p. ej. composiciones de detergentes destinadas para el rendimiento en el margen de pH de 7-13, particularmente el margen de pH de 8-11. Según la invención, la variante de \alpha-amilasa puede ser añadida como un componente de una composición de detergente. Como tal, se puede incluir en la composición de detergente en forma de un aditivo de detergente.

Asimismo, otro aspecto de la invención se refiere a un aditivo de detergente que comprende una variante de \alpha-amilasa según la invención. Las enzimas pueden ser incluidas en una composición de detergente añadiendo aditivos separados que contienen una o más enzimas, o añadiendo un aditivo combinado comprendiendo todas estas enzimas. Un aditivo de detergente según la invención, es decir un aditivo separado o un aditivo combinado, puede ser formulado, p. ej., como un granulado, líquido, pasta, etc. las formulaciones de la enzima preferidas para aditivos de detergentes son granuladas (en particular granulados no pulverulentos), líquidas (en particular líquidos estabilizados), mezclas o enzimas protegidas (vide infra).

La composición de detergente así como el aditivo de detergente puede adicionalmente comprender una o más enzimas usadas de forma convencional en detergentes, tales como proteasas, lipasas, enzimas amilolíticas, oxidasas (incluidas las peroxidasas), o celulasas.

Se ha descubierto que mejoras sustanciales en el rendimiento del lavado de la ropa y/o de la vajilla puede ser obtenido cuando la \alpha-amilasa es combinada con otra enzima amilolítica, tal como una pululanasa, una iso-amilasa, una bet\alpha-amilasa, una amiloglucosidasa o una CTGasa. Ejemplos de enzimas amilolíticas comercialmente disponibles adecuadas para el objetivo dado son AMG^{TM}, Novamyl^{TM} y Promozyme^{TM}, todos ellos disponibles por Novo Nordisk A/S, Bagsvaerd, Dinamarca. En consecuencia, una forma de realización particular de la invención se refiere a un aditivo de detergente que comprende una variante de \alpha-amilasa de la invención en combinación con al menos otra enzima amilolítica (p. ej. elegida entre las anteriormente mencionadas).

Los granulados no pulverulentos pueden ser producidos, p. ej., como se describe en US 4,106,991 y US 4,661,452, y pueden opcionalmente ser revestidos por métodos conocidos en la técnica; detalles adicionales en cuanto al revestimiento están proporcionados más abajo. Cuando se debe emplear una combinación de enzimas de detergentes diferentes, las enzimas pueden ser mezcladas antes o después de la granulación.

Las preparaciones enzimáticas líquidas pueden, por ejemplo, ser estabilizadas añadiendo un poliol tal como propilenoglicol, un azúcar o alcohol de azúcar, ácido láctico o ácido bórico según los métodos establecidos. Otros estabilizadores de la enzima son bien conocidos en la técnica. Las enzimas protegidas pueden ser preparadas según el método descrito en EP 238 216.

Como ya se ha indicado, otro aspecto adicional de la invención se refiere a una composición de detergente, p. ej. para el lavado de la ropa, para el lavado de la vajilla o para la limpieza de superficies duras, comprendiendo una variante de \alpha-amilasa (también híbrida) de la invención, y un tensioactivo.

La composición de detergente según la invención puede estar en cualquier forma conveniente, p. ej. en polvo, gránulos o líquido. Un detergente líquido puede ser acuoso, normalmente conteniendo hasta un 90% de agua y 0-20% de solvente orgánico, o no acuoso, p. ej. como se describe en la patente EP 120,659.

Composiciones de detergentes

Cuando una variante de la \alpha-amilasa de la invención es empleada como un componente de una composición de detergente (p. ej. una composición de detergente para el lavado de la ropa, o una composición de detergente para el lavado de la vajilla), se puede incluir, por ejemplo, en la composición de detergente en forma de un granulado no pulverulento, un líquido estabilizado, o una enzima protegida. Como se ha mencionado anteriormente, los granulados no pulverulentos pueden ser producidos, p. ej., como se ha descrito en US 4,106,991 y 4,661,452 (ambos de Novo Industri A/S) y pueden opcionalmente ser revestidos por métodos conocidos en la técnica. Ejemplos de materiales de revestimiento de cera son productos de óxido poli(etileno) (polietilenoglicol, PEG) con pesos moleculares medios de 1000 a 20000; nonilfenoles etoxilados conteniendo de 16 a 50 unidades del óxido de etileno; alcoholes etoxilados grasos donde el alcohol contiene de 12 a 20 átomos de carbono y los cuales comprenden de 15 a 80 unidades de óxido de etileno; alcoholes grasos; ácidos grasos; y mono- y di- y triglicéridos de ácidos grasos. Ejemplos de materiales de revestimiento que forman películas adecuadas para la aplicación mediante técnicas de lecho fluidificado están proporcionados en GB 1483591.

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Enzimas añadidas en forma de preparaciones enzimáticas líquidas pueden, como se ha indicado anteriormente, ser estabilizadas por, p. ej., la adición de un poliol tal como propilenoglicol, un azúcar o alcohol de azúcar, ácido láctico o ácido bórico según los métodos establecidos. Otros estabilizadores de la enzima son bien conocidos en la
técnica.

Enzimas protegidas para la inclusión en una composición de detergente de la invención pueden ser preparadas, tal y como se menciona arriba, según el método descrito en EP 238,216.

La composición de detergente según la invención puede ser de cualquier forma conveniente, p. ej. en polvo, gránulos, pasta o líquido. Un detergente líquido puede ser acuoso, normalmente conteniendo hasta un 70% de agua y un 0-30% de solvente orgánico, o no acuoso.

La composición de detergente comprende uno o más tensioactivos, cada uno de ellos puede ser aniónico, no iónico, catiónico, o anfotérico (zwitteriónico). El detergente normalmente contiene un 0-50% de tensioactivo aniónico tal como alquilobencenosulfonato lineal (LAS), alfa-olefinsulfonato (AOS), alquil sulfato (sulfato de alcohol graso) (AS), etoxisulfato de alcohol (AEOS o AES), alcanosulfonatos secundarios (SAS), alfa-sulfo metil ésteres de ácidos grasos, ácido alquil- o alquenilsuccínico, o jabón. Puede también contener un 0-40% de tensioactivo no iónico tal como etoxilato de alcohol (AEO o AE), propoxilato de alcohol, etoxilatos de alcohol carboxilados, etoxilato de nonilfenol, alquilpoliglicósido, óxido de alquildimetilamina, monoetanolamida de ácidos grasos etoxilada, monoetanolamida de ácidos grasos, o polihidroxi alquil amida de ácidos grasos (p. ej. como se describe en WO 92/06154).

La composición de detergente puede adicionalmente comprender una o más enzimas, tales como pululanasa, esterasa, lipasa, cutinasa, proteasa, celulasa, peroxidasa, u oxidasa, p. ej., lacasa.

Normalmente el detergente contiene un 1-65% de un constructor de detergente (aunque algunos detergentes para el lavado de la vajilla pueden contener hasta el 90% de un constructor de detergente) o agente complejante tal como zeolita, difosfato, trifosfato, fosfonato, citrato, ácido nitrilotriacético (NTA), ácido etilenodiaminatetraacético (EDTA), ácido dietilenotriaminopentaacético (DTMPA), ácido alquil- o alquenilsuccínico, silicatos solubles o silicatos estratificados (p. ej. SKS-6 de Hoechst).

Los constructores de detergentes pueden ser subdivididos en tipos con fósforo y sin fósforo. Ejemplos de constructores de detergentes alcalinos inorgánicos con fósforo incluyen las sales hidrosolubles, especialmente los pirofosfatos de metal alcalino, ortofosfatos, polifosfatos y fosfonatos. Ejemplos de constructores inorgánicos sin fósforo incluyen los carbonatos de metal alcalino hidrosolubles, boratos y silicatos, así como disilicatos estratificados y los distintos tipos de silicatos cristalinos insolubles en agua o de alumino amorfos de los cuales las zeolitas son los representantes más conocidos.

Ejemplos de constructores orgánicos adecuados incluyen metal alcalino, amonio o sales amónicas sustituidas de succinatos, malonatos, malonatos de ácidos grasos, sulfonatos de ácidos grasos, carboximetoxi succinatos, poliacetatos, carboxilatos, policarboxilatos, aminopolicarboxilatos y poliacetil carboxilatos.

El detergente puede también ser no construido, es decir esencialmente libre de constructor de detergente.

El detergente puede comprender uno o más polímeros. Ejemplos son carboximetilcelulosa (CMC; normalmente en forma de la sal sódica), poli(vinilpirrolidona) (PVP), polietilenoglicol (PEG), alcohol polivinílico (PVA), policarboxilatos tales como poliacrilatos, polimaleatos, copolímeros de ácido maléico/acrílico y copolímeros de lauril metacrilato/ácido acrílico.

La composición de detergente puede contener blanqueadores del tipo cloro/bromo o del tipo oxígeno. Los blanqueadores pueden ser revestidos o encapsulados. Ejemplos de blanqueadores de tipo clorina/bromina inorgánicos son hipoclorito de litio, sodio o calcio o hipobromito al igual que fosfato de trisodio clorurado. El sistema blanqueador puede también comprender una fuente de H2O2 tal como perborato o percarbonato que puede combinarse con un activador del blanqueo formador de perácido tal como tetraacetiletilenodiamina (TAED) o nonanoiloxibencenosulfonato (NOBS).

Ejemplos de blanqueadores de tipo clorina/bromina orgánicos son N-bromo heterocíclico y N-cloro imidas tales como ácidos tricloroisocianúricos, tribromoisocianúricos, dibromoisocianúricos y dicloroisocianúricos, y sales derivadas con cationes de solubilización del agua tales como potasio y sodio. Compuestos de hidantoina son también adecuados. El sistema blanqueador puede también comprender peroxiácidos, p. ej., del tipo amida, imida, o sulfona.

En detergentes para el lavado de la vajilla los blanqueadores de oxígeno son preferidos, por ejemplo en forma de una persal inorgánica, preferiblemente con un precursor blanqueador o como un compuesto de peroxi ácido. Ejemplos típicos de compuestos blanqueadores de peróxido adecuados son perboratos de metal alcalino, tanto tetrahidratos como monohidratos, percarbonatos de metal alcalino, persilicatos y perfosfatos. Materiales activadores preferidos son TAED o NOBS.

Las enzimas de la composición de detergente de la invención pueden ser estabilizadas usando agentes convencionales estabilizantes, p. ej. un poliol tal como propilenoglicol o glicerol, un azúcar o alcohol de azúcar, ácido láctico, ácido bórico, o un derivado de ácido bórico tal como, p. ej., un éster de borato aromático, y la composición puede ser formulada como se describe en, p. ej., WO 92/19709 y WO 92/19708. Las enzimas de la invención pueden también ser estabilizadas añadiendo inhibidores enzimáticos reversibles, p. ej., del tipo de la proteína (como se describe en EP 0 544 777 B1) o del tipo del ácido borónico.

El detergente puede también contener otros ingredientes de detergentes convencionales tales como, p. ej., acondicionadores del tejido incluyendo arcillas, material desfloculante, activadores de la espuma/depresores de la espuma (en los depresores de la espuma de detergentes para el lavado de la vajilla), supresores de la espuma, agentes anticorrosivos, agentes de suspensión de la suciedad, agentes de antirredeposición de la suciedad, tintes, agentes deshidratantes, bactericidas, blanqueadores ópticos, o perfume.

El pH (medido en una solución acuosa a la concentración de uso) normalmente será neutro o alcalino, p. ej. en la gama de 7-11.

Las formas particulares de composiciones de detergente para el lavado de la ropa dentro del campo de la invención incluyen:

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1) Una composición de detergente formulada como un granulado con una densidad en masa de al menos 600 g/l comprendiendo

1

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2) Una composición de detergente formulada como un granulado con una densidad en masa de al menos 600 g/l comprendiendo

2

3) Una composición de detergente formulada como un granulado con una densidad en masa de al menos 600 g/l comprendiendo

3

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4) Una composición de detergente formulada como un granulado con una densidad en masa de al menos 600 g/l comprendiendo

5

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5) Una composición de detergente líquido acuosa comprendiendo

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6) Una composición de detergente líquido acuosa estructurada comprendiendo

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7) Una composición de detergente formulada como un granulado con una densidad en masa de al menos 600 gil comprendiendo

9

8) Una composición de detergente formulada como un granulado comprendiendo

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9) Una composición de detergente formulada como un granulado que comprende

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10) Una composición de detergente líquido acuosa que comprende

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11) Una composición de detergente líquido acuoso comprendiendo

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12) Una composición de detergente formulada como un granulado con una densidad en masa de al menos 600 gil comprendiendo

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13) Formulaciones de detergentes como se describe en 1) - 12) donde todo o parte del alquilobencenosulfonato lineal es sustituido por (C_{12}-C_{18})alquilo sulfato.

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14) Una composición de detergente formulada como un granulado con una densidad en masa de al menos 600 g/l comprendiendo

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15) Una composición de detergente formulada como un granulado que tiene una densidad en masa de al menos 600 gil que comprende

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16) Formulaciones de detergentes como se describe en 1) - 15) que contienen un perácido estabilizado o encapsulado, bien como un componente adicional o como un sustituto para sistemas blanqueadores ya especificados.

17) Composiciones de detergentes como se describe en 1), 3), 7), 9) y 12) donde el perborato es sustituido por percarbonato.

18) Composiciones de detergentes como se describe en 1), 3), 7), 9), 12), 14) y 15) que adicionalmente contienen un catalizador de manganeso. El catalizador de manganeso puede, p. ej., ser uno de los compuestos descritos en "Efficient manganese catalysts for low- temperature bleaching", Nature 369,1994, págs. 637-639.

19) Composición de detergente formulada como un líquido de detergente no acuoso que comprende un tensioactivo líquido no iónico como, p. ej., alcohol primario alcoxilado lineal, un sistema constructor (p. ej. fosfato), enzima y alcali.

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El detergente puede también comprender un tensioactivo aniónico y/o un sistema blanqueador.

Formas particulares de composiciones de detergente para el lavado de la vajilla dentro del campo de la invención incluyen:

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1) Composición en polvo para el lavado automático de la vajilla

21

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2) Composición en polvo para el lavado automático de la vajilla

22

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3) Composición en polvo para el lavado automático de la vajilla

23

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4) Composición en polvo para el lavado automático de la vajilla

24

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5) Composición en polvo para el lavado automático de la vajilla

25

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6) Composición en polvo y líquida para el lavado de la vajilla con sistema tensioactivo de limpieza

26

27

7) Composición líquida no acuosa para el lavado automático de la vajilla

28

8) Composición líquida no acuosa para el lavado de la vajilla

29

9) Composición líquida tixotrópica para el lavado automático de la vajilla

30

10) Composición líquida para el lavado automático de la vajilla

31

32

11) Composición líquida para el lavado automático de la vajilla con partículas blanqueadoras protegidas

33

11) Composiciones para el lavado automático de la vajilla como se describe en 1), 2), 3), 4), 6) y 10), donde el perborato es sustituido por percarbonato.

12) Composiciones para el lavado automático de la vajilla como se describe en 1) - 6) que adicionalmente contienen un catalizador de manganeso. El catalizador de manganeso puede, p. ej., ser uno de los compuestos descritos en "Efficient manganese catalysts for low-temperature bleaching", Nature 369, 1994, págs. 637-639.

Una variante de \alpha-amilasa de la invención puede ser incorporada en concentraciones empleadas de forma convencional en los detergentes. Está actualmente contemplado que, en la composición de detergente según la invención, la variante de \alpha-amilasa puede ser añadida en una cantidad correspondiente a 0.00001-1 mg (calculado como proteína enzimática pura) de \alpha-amilasa por litro de solución de lavado de la ropa/de la vajilla.

La presente invención está posteriormente descrita con referencia al dibujo anexo, donde:

Fig. 1 es una alineación de las secuencias de aminoácidos de cuatro \alpha-amilasas madres en el contexto de la invención. Los números del extremo izquierdo designan las secuencias de aminoácidos respectivas como sigue:

1:

la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID nº. 1;

2:

la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID nº. 2;

3:

la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID nº. 3; y

4:

la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID nº. 7.

Los números en el extremo derecho de la figura dan el número total corriente de aminoácidos para cada una de las secuencias en cuestión.

Debe ser notado que para la secuencia numerada 3 (correspondiente a la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID nº. 3), la alineación resulta en "espacios" en las posiciones correspondientes al aminoácido nº. 1 y al aminoácido nº. 175, respectivamente, en las secuencias numeradas 1 (SEC ID nº. 1), 2 (SEC ID nº. 2) y 4 (SEC ID nº. 7).

Fig. 2 es un mapa de restricción del plásmido pTVB106.

Fig. 3 es un mapa de restricción del plásmido pPM103.

Fig. 4 es un mapa de restricción del plásmido pTVB112.

Fig. 5 es un mapa de restricción del plásmido pTVB114.

Sección experimental

La preparación, purificación y secuenciación de las \alpha-amilasas madres que tienen las secuencias de aminoácidos mostradas en la SEC ID nº. 1 y la SEC ID nº. 2 (de cepas de Bacillus NCIB 12512 y NCIB 12513, respectivamente) están descritas en WO 95/26397. Los valores de pl y los pesos moleculares de estas dos \alpha-amilasas madres (dadas en WO 95/26397) son los siguientes:

\underline{SEC \ ID \ N^{o}. \ 1}:

pl aproximadamente 8.8-9.0 (determinado por isoelectroenfoque en placas PAG de LKB Ampholine^{TM}); peso molecular aproximadamente 55 kD (determinado por SDS-PAGE).

\underline{SEC \ ID \ N^{o}. \ 2}:

pl aproximadamente 5.8 (determinado por isoelectroenfoque en placas PAG de LKB Ampholine^{TM}); peso molecular aproximadamente 55 kD (determinado por SDS-PAGE).

Purificación de variantes de \alpha-amilasa de la invención

La construcción y expresión de las variantes según la invención se describe en el ejemplo 2, abajo. La purificación de variantes de la invención está ilustrada aquí con referencia a las variantes de las secuencias de aminoácidos mostradas en SEC ID Nº. 1 y SEC ID Nº. 2, respectivamente:

Purificación de variantes de la SEC ID Nº. 1 (pl aprox. 9.0): el líquido de fermentación que contiene la variante de \alpha-amilasa expresada es filtrado, y se añade sulfato amónico a una concentración de 15% de saturación. El líquido es luego aplicado sobre una columna hidrofóbica (Toyopearl butil/TOSOH). La columna es lavada con 20 mM de tampón de ácido dimetil-glutárico, pH 7.0. La \alpha-amilasa es unida de forma muy segura, y es eluida con 25% p/p 2-propanol en 20 mM de tampón de ácido dimetilglutárico, pH 7.0. Después de la elución, el 2-propanol es quitado por evaporación y el concentrado es aplicado en un intercambiador catiónico (S-Sepharose^{TM} FF, Pharmacia, Suecia) equilibrado con 20 mM de tampón de ácido dimetilglutárico, pH 6.0.

La amilasa es eluida usando un gradiente lineal de 0-250 mM de NaCl en el mismo tampón. Después de la diálisis contra 10 mM de tampón de borato/KCl, pH 8.0, la muestra es ajustada a pH 9.6 y aplicada a un intercambiador aniónico (Q-Sepharose^{TM} FF, Pharmacia) equilibrado con 10 mM de tampón de borato/KCl, pH 9.6. La amilasa es eluida usando un gradiente lineal de 0-250 mM de NaCl. El pH es ajustado a 7.5. La \alpha-amilasa es pura según ha sido juzgado por rSDS-PAGE. Todos los tampones contienen 2 mM de CaCl_{2} para estabilizar la amilasa.

Purificación de variantes de la SEC ID nº. 2 (pl aprox. 5.8): el líquido de fermentación que contiene la variante de \alpha-amilasa expresada es filtrado, y se añade sulfato amónico a una concentración del 15% de saturación. El líquido es luego aplicado sobre una columna hidrofóbica (Toyopearl butil/TOSOH). La amilasa unida es eluida con un gradiente lineal de 15%-0% p/p de sulfato amónico en 10 mM de tampón tris, pH 8.0. Después de la diálisis del eluato contra 10 mM de tampón de borato/KCl, pH 8.0, el líquido es ajustado a pH 9.6 y aplicado en un intercambiador aniónico (Q-Sepharose^{TM} FF, Pharmacia) equilibrado con el mismo tampón. La amilasa es eluida en fases usando 150 mM de NaCl.

Después de la elución la muestra de amilasa es dializada contra el mismo tampón, pH 8.0, para eliminar el NaCl. Después de la diálisis, el pH es ajustado a 9.6 y la amilasa es unida una vez más en el intercambiador aniónico. La amilasa es eluida usando un gradiente lineal de 0-250 mM de NaCl. El pH es ajustado a 7.5. La amilasa es pura según está juzgado por rSDS-PAGE. Todos los tampones contienen 2 mM de CaCl_{2} para estabilizar la amilasa.

Determinación de la actividad \alpha-amilasa

La actividad \alpha-amilasa está determinada por un método que utiliza comprimidos de Phadebas® como sustrato. Comprimidos de Phadebas (prueba de Phadebas® Amylase, suministrada por Pharmacia Diagnostic) contienen un polímero entrecruzado de almidón insoluble de color azul que ha sido mezclado con albúmina de suero bovino y una sustancia del tampón y dispuesta en comprimidos. Para la determinación de cada medición individual un comprimido es suspendido en un tubo conteniendo 5 ml de tampón 50 mM Britton-Robinson (50 mM ácido acético, 50 mM ácido fosfórico, 50 mM ácido bórico, 0.1 mM CaCl_{2}, pH ajustado al valor de interés con NaOH). La prueba es realizada al baño maría a la temperatura de interés. La \alpha-amilasa que debe evaluarse es diluida en x ml de 50 mM tampón Britton-Robinson. 1 ml de esta solución de la \alpha-amilasa es añadida a 5 ml de tampón 50 mM Britton-Robinson. El almidón es hidrolizado por la \alpha-amilasa dando fragmentos azules solubles. La absorbancia de la solución azul resultante, medida espectrofotométricamente a 620 nm, es una función de la actividad de la \alpha-amilasa.

Es importante que la absorbancia medida a 620 nm después de 15 minutos de incubación (tiempo de prueba) esté en la gama de 0.2 a 2.0 unidades de absorbancia a 620 nm. En esta gama de absorbancia hay linealidad entre actividad y absorbancia (ley de Lambert-Beer). La dilución de la enzima debe en consecuencia ser ajustada para ajustarse a este criterio.

Bajo un grupo especifico de condiciones (temp., pH, tiempo de reacción, condiciones del tampón) 1 mg de una \alpha-amilasa dada hidrolizará una cantidad determinada de sustrato y se producirá un color azul. La intensidad del color es medida a 620 nm. La absorbancia medida es directamente proporcional a la actividad específica (actividad/mg de proteína \alpha-amilasa pura) de la \alpha-amilasa en cuestión según el grupo dado de condiciones. Así evaluando diferentes \alpha-amilasas de interés (incluyendo una \alpha-amilasa de referencia, en este caso la \alpha-amilasa madre en cuestión) bajo condiciones idénticas, la actividad específica de cada una de las \alpha-amílasas a una temperatura dada y a un pH dado puede ser comparado directamente, y la proporción de la actividad específica de cada una de las \alpha-amilasas de interés con respecto a la actividad específica de la \alpha-amilasa de referencia puede ser determinada.

Mini ensayo de lavado de la vajilla

El siguiente mini ensayo de lavado de la vajilla fue usado: una suspensión de material amidáceo fue hervido y enfriado a 20ºC. La suspensión del almidón enfriada fue aplicada en placas pequeñas de vidrio individuales identificadas (aprox. 2 x 2 cm) y secadas a una temperatura de aprox. 140ºC en una cámara secadora. Las placas individuales fueron luego pesadas. Para objetivos del ensayo, una solución de detergente tipo Europeo estándar para el lavado automático de la vajilla (5 g/l) con una temperatura de 55ºC fue preparada. Se dejó un tiempo de disolución del detergente de 1 minuto, tras lo cual la \alpha-amilasa en cuestión fue añadida a la solución de detergente (contenida en un vaso de precipitación equipado con agitación magnética) para dar una concentración enzimática de 0.5 mg/l. A la vez, las placas de vidrio pesadas, sujetadas en ganchos de soporte pequeños, fueron sumergidas en una posición sustancialmente vertical en la solución de \alpha-amilasa/detergente, que fue luego agitada durante 15 minutos a 55ºC. Las placas de vidrio fueron luego eliminadas de la solución de \alpha-amilasa/detergente, enjuagadas con agua destilada, secadas a 60ºC en una cámara secadora y vueltas a pesar. El rendimiento de la \alpha-amilasa en cuestión [expresado como un índice con respecto a una \alpha-amilasa de referencia elegida (índice 100) - en el ejemplo más abajo (ejemplo 1) la \alpha-amilasa madre con la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID Nº. 1] fue luego determinada a partir de la diferencia en peso de las placas del vidrio antes y después del tratamiento, de la siguiente manera:

Índice = \frac{\text{pérdida de peso para placa tratada con} \ \alpha-amilasa}{\text{pérdida de peso para placa tratada con referencia}} \cdot 100

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Los ejemplos siguientes ilustran adicionalmente la presente invención. No están destinados a ser de ninguna manera limitadores del objetivo de la invención como se reivindica.

Ejemplo 1 Mini prueba de lavado de la vajilla de variantes de \alpha-amilasa madre con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID Nº. 1

La mini prueba de lavado de la vajilla descrita anteriormente fue realizada a pH 10.5 con la \alpha-amilasa madre con la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID Nº. 1 y las variantes siguientes de la misma (cuya construcción y purificación está descrita más abajo): T183* + G184*; Y243F; y K269R. La prueba dio los resultados siguientes:

Genitor (SEC ID Nº. 1)

índice: 100

T183* + G184*

índice: 120

Y243F

índice: 120

K269R

índice: 131

Está claro que cada una de las variantes evaluadas T183* + G184* (que presentan, entre otras cosas, mayor termoestabilidad que la \alpha-amilasa madre), Y243F (que presenta una dependencia del ión calcio inferior que la \alpha-amilasa madre) y K269R (que presenta una dependencia del ión calcio inferior y una mayor estabilidad a pH alto que la \alpha-amilasa madre) presentan un rendimiento del lavado de la vajilla significativamente mejorado con respecto a la \alpha-amilasa madre.

Ejemplo 2 Construcción de variantes de las \alpha-amilasas madres con las secuencias de aminoácidos mostradas en la SEC ID Nº. 1 y SEC ID Nº. 2, respectivamente

Cebadores: los cebadores del ADN empleados en la construcción de las variantes como se describe abajo incluyen lo siguiente [todos los cebadores del ADN están escritos en sentido de 5' a 3' (izquierda a derecha); P denota un 5' fosfato]:

34

A: Construcción de variantes de la \alpha-amilasa madre con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID Nº. 1

Descripción del plásmido pTVB106: la \alpha-amilasa madre con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID Nº. 1 y las variantes de las mismas están expresadas a partir de un gen llevado por un plásmido, SF16, mostrado en Fig. 2. El plásmido, pTVB106, contiene un origen de replicación obtenido a partir del plásmido pUB110 (Gryczan et al., 1978) y el gen cat que confiere resistencia hacia el cloranfenicol.

La secreción de la amilasa es ayudada por la secuencia señal del Termamyl^{TM} que se fusiona precisamente, es decir codón No.1 de la proteína madura, al gen que codifica la \alpha-amilasa madre que tiene el nucleótido y la secuencia de aminoácidos (proteína madura) mostrada en la SEC ID Nº. 4 y la SEC ID Nº. 1, respectivamente. El promotor de Termamyl inicia la transcripción del gen.

El plásmido pTVB106 es similar al pDN1528 (ver solicitud de patente danesa accesible al público nº. 1155/94). Algunos sitios de restricción únicos están indicados en el mapa plásmido en la Fig. 2, incluyendo BstBI, BamHI, BstEII, EcoNI, DrdI, AflIII, DraIII, XmaI, SalI y BglII.

Construcción de la variante M202T: El método de mutagénesis de extensión por solapamiento por PCR se utiliza para construir esta variante (Higuchi et al., 1988). Un fragmento de ADN de aproximadamente 350 bp de pTVB106 es amplificado en una reacción por PCR A usando cebadores #7113 y cebador mutagénico #6778. En una reacción por PCR similar B, un fragmento de ADN de aproximadamente 300 bp es amplificado usando los cebadores Y296 y #6779. El fragmento de ADN completo que abarca el centro de mutación (M202) desde el cebador #7113 hasta el cebador Y296 es amplificado en PCR C usando estos cebadores y fragmentos de ADN purificados a partir de las reacciones A y B.

ADN de PCR C es digerido con las endonucleasas de restricción BstEII y AflIII, y el fragmento de 480 bp es ligado con el plásmido pTVB106 digerido con las mismas enzimas y transformado en una cepa de Bacillus subtilis baja en proteasas y baja en amilasas (p. ej. la cepa SHA273 mencionada en WO 92/11357).

Otras variantes M202 son construidas de una manera similar.

Construcción de variantes T183* + G184* y R181* + G182*: El método de mutagénesis de extensión por solapamiento por PCR se utiliza para construir estas variantes (Higuchi et al., 1988). Los oligonucleótidos mutagénicos son sintetizados usando una mezcla (partes iguales) de C y G en una posición; dos mutaciones diferentes pueden en consecuencia ser construidas por este procedimiento. Un fragmento de ADN de aproximadamente 300 bp de pTVB106 es amplificado en una reacción A por PCR usando los cebadores #7113 y el cebador mutagénico #7449. En una reacción B por PCR similar, un fragmento de ADN de aproximadamente 400 bp es amplificado usando los cebadores Y296 y #3811. El fragmento de ADN completo que abarca el centro de mutación (aminoácidos 181-184) desde el cebador #7113 hasta el cebador Y296 es amplificado por PCR C usando aquellos cebadores y fragmentos de ADN purificados a partir de las reacciones A y B.

El ADN de PCR C es digerido con las endonucleasas de restricción BstEII y AflIII y el fragmento de 480 bp es ligado con el plásmido pTVB106 digerido con las mismas enzimas y transformado en una cepa de B. subtilis baja en proteasas y baja en amilasas (p. ej. la cepa SHA273 mencionada en WO 92/11357). La secuenciación del ADN plásmido de estos transformantes identifica las dos mutaciones correctas: Es decir R181* + G182* y T183* + G184*.

Construcción de la variante R124P: Se utiliza el método de mutagénesis de extensión de solapamiento por PCR para construir esta variante de modo similar a la construcción de la variante M202T (véase arriba). La reacción A por PCR (con los cebadores #3810 y B1) genera un fragmento de aproximadamente 500 bp, y la reacción B por PCR (cebadores 7450 y Y296) genera un fragmento de aproximadamente 550 bp. La reacción C por PCR basada en el producto de las reacciones A y B por PCR y los cebadores B1 y Y296 es digerida con las endonucleasas de restricción BstEII y AflIII, y el fragmento resultante de 480 bp que abarca la posición del aminoácido 124 es subclonado en pTVB106 digerido con las mismas enzimas y transformado en B. Subtilis tal y como se ha descrito anteriormente.

Construcción de la variante R124P + T183* + G184*: Para la construcción de la variante que combina las mutaciones R124P y T183* + G184*, se utilizaron dos sitios de restricción EcoNI (uno localizado en la posición 1.774 kb, es decir entre la mutación R124P y la mutación T183* + G184*, y uno localizado en la posición 0.146 kb). El fragmento EcoNI de aproximadamente 1630 bp del plásmido tipo pTVB106 que contiene la mutación T183* + G184* fue subclonado en la parte del vector (fragmento de ADN de aproximadamente 3810 bp que contiene el origen de replicación) de otro plásmido tipo pTVB106 que contiene la mutación R124P digerida con la misma enzima. La transformación en Bacillus subtilis se efectuó tal y como se ha descrito anteriormente.

Construcción de las variantes G182* + G184*; R181* + T183*: Y243F; K269R; y L351C + M430C

Estas variantes fueron construidas de la manera siguiente:

Un vector de la mutagénesis específica que contiene una mayor parte de la zona de codificación para la secuencia de aminoácidos mostrada fue preparado en la SEC.ID Nº. 1. Las características importantes de este vector (que se denomina pPM103) incluyen un origen de replicación derivado del plásmido pUC, el gen cat que confiere resistencia hacia el cloranfenicol y una versión con una mutación por desplazamiento del marco de lectura del gen bla, cuya versión tipo salvaje normalmente confiere resistencia a la ampicilina (fenotipo amp^{R}). Esta versión mutada del gen bla resulta en un fenotipo amps. El plásmido pPM103 está mostrado en la Fig. 3, y el origen de replicación de E. coli, la versión 5'-truncada del gen de amilasa SF16, y ori, bla, cat y los sitios de restricción seleccionados están indicados en el plásmido.

Las mutaciones son introducidas en el gen de interés como se describe por Deng y Nickoloff [Anal. Biochem. 200 (1992), págs. 81-88], excepto porque los plásmidos con el "cebador de selección" (#6616) incorporado son seleccionados en base al fenotipo amp^{R} de células de E. coli transformadas que contienen un plásmido con un gen bla reparado en vez de usar la selección por digestión de enzimas de restricción destacada por Deng y Nickoloff. Los productos químicos y enzimas usados para la mutagénesis fueron obtenidos con el kit de mutagénesis Chameleon^{TM} deStratagene (número de fabricación 200509).

Después de verificar la secuencia de ADN en los plásmidos de la variante, el gen truncado conteniendo la alteración deseada es subclonado del plásmido tipo pPM103 en pTVB106 como un fragmento BstBI-SalI de aproximadamente 1440 bp y transformado en Bacillus subtilis para la expresión de la enzima de la variante.

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Para la construcción de la variante de eliminación de pares G182* + G184*, se usó el cebador de la mutagénesis siguiente:

P CTC TGT ATC GAC TTC CCA GTC CCA AGC TTT TGT CCT GAA TTT ATA TAT TTT GTT TTG AAG

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Para la construcción de la variante de eliminación de pares R181* + T183*, se usó el cebador de la mutagénesis siguiente:

P CTC TGT ATC GAC TTC CCA GTC CCA AGC TTT GCC TC GAA TTT ATA TAT TTT GTT TTG AAG

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Para la construcción de la variante de sustitución Y243F, se usó el cebador de la mutagénesis siguiente:

P ATG TGT AAG CCA ATC GCG AGT AAA GCT AAA TTT TAT ATG TTT CAC TGC ATC

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Para la construcción de la variante de sustitución K269R, se usó el cebador de la mutagénesis siguiente:

P GC ACC AAG GTC ATT TCG CCA GAA TTC AGC CAC TG

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Para la construcción de la variante de sustitución de pares L351C + M430C, se usaron simultáneamente los cebadores de la mutagénesis siguientes:

1) P TGT CAG AAC CAA CGC GTA TGC ACA TGG TTT AAA CCA TTG

2) P ACC ACC TGG ACC ATC GCT GCA GAT GGT GGC AAG GCC TGA ATT

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Construcción de la variante L351C + M430C + T183* + G184*: Esta variante fue construida combinando la mutación de sustitución de pares L351C + M430C y la mutación de eliminación de pares T183* + G184* mediante la subclonación de un fragmento HindIII-AfIII de aproximadamente 1430 bp conteniendo L351C + M430C en un plásmido tipo pTVB106 (con las mutaciones T183* + G184*) digeridas con las mismas enzimas.

Construcción de la variante Y243F + T183* + G184*: Esta variante fue construida combinando la mutación Y243F y la mutación T183* + G184* mediante la subclonación de un fragmento DrdI de aproximadamente 1148 bp conteniendo T183* + G184* en un plásmido tipo pTVB106 (con la mutación Y243) digerido con la misma enzima.

Los transformantes de Bacillus subtilis fueron seleccionados por su actividad \alpha-amilasa en placas de agar con almidón y la presencia de las mutaciones correctas fue controlada por la secuenciación del ADN.

Construcción de la variante Y243F + T183* + G184* + L351C + M430C: La mutación de sustitución de pares L351C + M430C fue subclonada como un fragmento XmaI-SalI de aproximadamente 470 bp en un vector tipo pTVB106 (conteniendo Y243F.+ T183* + G184*) digerido con las mismas enzimas.

Construcción de variante Y243F + T183* + G184* + L351C + M430C + Q391 E + K444Q: un vector tipo pPM103 conteniendo las mutaciones Y243F + T183* + G184* + L351C + M430C fue construido mediante la substitución de la versión truncada de SF16 en pPM103 con el fragmento BstB1-Sa/I de aproximadamente 1440 bp del vector tipo pTVB106 que contiene las cinco mutaciones en cuestión. Las mutaciones Q391 E y K444Q fueron introducidas simultáneamente en el vector tipo pPM103 (conteniendo Y243F + T183* + G184* + L351C + M430C) mediante el uso de los dos cebadores de la mutagénesis siguientes de modo similar a la mutagénesis previamente descrita en pPM103:

P GGC AAA AGT TTG ACG TGC CTC GAG AAG AGG GTC TAT

P TTG TCC CGC TTT ATT CTG GCC AAC ATA CAT CCA TTT

B: Construcción de variantes de la \alpha-amilasa madre con la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID Nº. 2

Descripción del plásmido pTVB112: un vector, denominado pTVB112, para ser usado para la expresión en B. subtilis de la \alpha-amilasa con la secuencia de aminoácidos mostrada fue construida en la SEC ID Nº. 2. Este vector es muy similar al pTVB106 excepto porque el gen que codifica la \alpha-amilasa madura de la SEC ID Nº. 2 está insertado entre los sitios PstI y HindIII en pTVB106. Así, la expresión de esta \alpha-amilasa (SEC ID nº. 2) está también dirigida por el promotor amyL y la secuencia señal. El plásmido pTVB112 está mostrado en la Fig. 4.

Construcción de la variante D183* + G184*: la construcción de esta variante fue conseguida usando el método de mutagénesis de extensión por solapamiento por PCR al que se ha hecho referencia anteriormente (véase arriba). Los cebadores #8573 y 81 fueron usados en la reacción A de la PCR, y los cebadores #8569 y #8570 fueron usados en la reacción B de la PCR. Los fragmentos purificados de la reacción A y la reacción B y los cebadores 1 B y #8570 fueron usados en la reacción C de la PCR, dando como resultado un fragmento de ADN de aproximadamente 1020 bp. Este fragmento fue digerido con las endonucleasas de restricción PstI y MluI, y subclonado en el vector de expresión y transformado en B. subtilis.

Construcción de variantes adicionales: Por analogía con la construcción (véase arriba) del plásmido pPM103 usado en la producción de mutantes de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº. 1, un plásmido (denominado pTVB114: mostrado en Fig. 5) fue construido para la mutagénesis continua en la variante D183* + G184* (SEQ.ID Nº. 2). Las mutaciones fueron introducidas en pTVB114 (SEC ID nº. 2; D183*+G184*) de modo similar al de pPM103 (SEC ID nº. 1).

Para la construcción de las variantes de eliminación de pares R181* + D183* y R181* + G182*, se elegió alterar los aminoácidos flanqueantes en la variante D183* + G184* en vez de eliminar los aminoácidos específicos en el gen del tipo salvaje para la SEC ID nº. 2. El cebador de la mutagénesis siguiente fue usado para la mutagénesis con pTVB114 como molde:

PCC CAA TCC CAA GCT TTA CCA (T/C)CG AAC TTG TAG ATA CG

La presencia de una mezcla de dos bases (T/C) en una posición permite la presencia dos aminoácidos flanqueantes de supresión diferentes en base a un cebador de la mutagénesis. La secuenciación del ADN de los plásmidos resultantes verifica la presencia de una mutación o la otra. El gen mutado de interés es subclonado como un fragmento PstI-DraIII en pTVB112 digerido con las mismas enzimas y transformado en B. subtilis.

Para la construcción de G182* + G184* y R181* + G184*, se usó el cebador de la mutagénesis siguiente con pTVB114 como molde:

PCC CAA TCC CAA GCT TTA TCT C(C/G)G AAC TTG TAG ATA CG

Como antes, la presencia de una mezcla de dos bases (C/G) en una posición permite la presencia de dos aminoácidos flanqueantes de eliminación diferentes en base a un cebador de la mutagénesis. La secuenciación del ADN de los plásmidos resultantes verifica la presencia de una mutación o la otra. El gen mutado de interés es subclonado como un fragmento PstI-DraIII en pTVB112 digerido con las mismas enzimas y transformado en B. subtilis.

Para la construcción de D183* + G184* + M202L se usó el cebador de la mutagénesis siguiente:

PGA TCC ATA TCG ACG TCT GCA TAC AGT AAA TAA TC

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Para la construcción de D183* + G184* + M202I se usó el cebador de la mutagénesis siguiente:

PGA TCC ATA TCG ACG TCT GCA TAA ATT AAA TAA TC

Ejemplo 3 Determinación de la estabilidad a la oxidación de las variantes de sustitución M202 de las \alpha-amilasas madres que tienen las secuencias de aminoácidos mostradas en la SEC ID Nº. 1 y SEC ID Nº. 2 A: estabilidad a la oxidación de las variantes de la secuencia en la SEC ID Nº. 1

Las mediciones fueron hechas usando soluciones de las variantes respectivas en 50 mM de tampón Britton-Robinson (50 mM de ácido acético, 50 mM de ácido fosfórico, 50 mM de ácido bórico, 0.1 mM de CaCl_{2}, pH ajustado al valor de interés con NaOH), pH 9.0, al cual se añadió el peróxido de hidrógeno (en el tiempo T = 0) para dar una concentración final de 200 mM H_{2}O_{2}. Las soluciones fueron luego incubadas a 40ºC al baño maría.

Tras la incubación durante 5, 10, 15 y 20 minutos después de la adición de peróxido de hidrógeno, la actividad de la \alpha-amilasa residual fue medida usando el ensayo Phadebas anteriormente descrito. La actividad residual en las muestras fue medida usando 50 mM de tampón Britton-Robinson, pH 7.3, a 37ºC (ver publicación analítica Novo AF207-1/1, disponible bajo pedido a Novo Nordisk A/S). El descenso en la actividad fue medido con respecto a una solución de la referencia correspondiente de la misma enzima a 0 minutos que no fue incubada con peróxido de hidrógeno (100% actividad).

El porcentaje de actividad inicial como función de tiempo está mostrado en la tabla a continuación para la enzima madre (SEC ID nº. 1) y para las variantes en cuestión.

46

Todas las variantes de sustitución M202 evaluadas muestran claramente estabilidad significativamente mejorada a la oxidación con respecto a la \alpha-amilasa madre (SEC ID Nº. 1).

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B: Estabilidad a la oxidación de variantes de la secuencia en la SEC ID Nº. 2

Las mediciones fueron realizadas según el modo descrito anteriormente usando la \alpha-amilasa madre en cuestión (SEC ID nº. 2), la variante M202L + D183* + G184* (designada L en la tabla a continuación) y la variante M2021 + D183* + G184* (designada I en la tabla a continuación), respectivamente. En este caso, se emplearon los tiempos de incubación (después de la adición de peróxido de hidrógeno) de 5,10,15 y 30 minutos. Como en la tabla anterior, el porcentaje de la actividad inicial como función de tiempo está mostrado en la tabla a continuación para la enzima madre y para las variantes en cuestión.

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Las dos variantes evaluadas "sustitución + eliminación de pares" (ambas comprendiendo una sustitución M202) claramente presenta estabilidad significativamente mejorada a la oxidación con respecto a la \alpha-amilasa madre (SEC ID nº. 2).

Ejemplo 4 Determinación de la termoestabilidad de las variantes de las \alpha-amilasas madres con las secuencias de aminoácidos mostradas en la SEC ID Nº. 1 y SEC ID Nº. 2 A: Termoestabilidad de las variantes de eliminación de pares de la secuencia en la SEC ID Nº. 1

Las mediciones fueron realizadas usando soluciones de las variantes respectivas en 50 mM de tampón Britton-Robinson (véase arriba), pH 9.0. Las soluciones fueron incubadas a 65ºC al baño maría, y se retiraron muestras tras la incubación en los períodos de tiempo indicados. La actividad de la \alpha-amilasa residual de cada muestra retirada fue medida usando el ensayo Phadebas, según el modo descrito anteriormente. El descenso en la actividad fue medido con respecto a una solución de referencia correspondiente de la misma enzima a 0 minutos sin ser incubada (100% de actividad).

El porcentaje de actividad inicial como función de tiempo está mostrado en la tabla a continuación para la enzima madre (SEC ID nº. 1) y para las variantes de supresión de pares en cuestión siguientes:

Variante 1: R181* + G182*

Variante 2: R181* + T183*

Variante 3: G182* + G184*

Variante 4: T183* + G184*

Variante 5: T183* + G184* + R124P

48

Es evidente que todas las variantes de eliminación de pares evaluadas presentan termoestabilidad significativamente mejorada con respecto a la \alpha-amilasa madre (SEC ID nº. 1), y que la termoestabilidad de la variante 5, que además de la mutación de la eliminación de pares de la variante 4 comprende la sustitución R124P, es marcadamente superior a la de las demás variantes. Puesto que los resultados calorimétricos para la variante de sustitución R124P (que comprende sólo la sustitución R124P) revela una termoestabilización de aproximadamente 7ºC de la misma con respecto a la \alpha-amilasa madre, resulta que los termoestabilizantes de la mutación R124P y la eliminación de pares, respectivamente, se refuerzan entre sí.

B: Termoestabilidad de las variantes de eliminación de pares de la secuencia en la SEC ID Nº. 2

Las mediciones correspondientes fueron realizadas para la enzima madre (SEC ID Nº. 2) y para las variantes de eliminación de pares siguientes:

Variante A: D183* + G184*

Variante B: R181* + G182*

Variante C: G182* + G184*

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De nuevo, es evidente que las variantes de eliminación de pares en cuestión presentan termoestabilidad significativamente mejorada con respecto a la \alpha-amilasa madre (SEC ID Nº. 2).

C: Termoestabilidad de una variante multi-combinación de la secuencia en la SEC ID Nº. 1

Las mediciones correspondientes comparativas fueron también hechas para las variantes siguientes de la secuencia de aminoácidos mostradas en la SEC ID Nº. 1:

Variante 4: T183* + G184*

Variante 6: L351C + M430C

Variante 7: Y243F

Variante 8: Q391E + K444Q

Variante 9: T183* + G184* + L351C + M430C + Y243F + Q391E + K444Q

50

De nuevo, resulta que el efecto termoestabilizante de las mutaciones múltiples, cada una de las cuales tiene un efecto termoestabilizante, es - al menos cualitativamente - acumulativo.

Ejemplo 5 Afinidad de unión al calcio de las variantes de la \alpha-amilasa según la invención

El despliegue de amilasas por exposición al calor o a desnaturalizantes tales como hidrocloruro de guanidina viene acompañado por una reducción en la fluorescencia. La pérdida de iones calcio conduce a un despliegue, y la afinidad de una serie de \alpha-amilasas al calcio puede ser medida por mediciones de la fluorescencia antes y después de la incubación de cada \alpha-amilasa (p. ej. a una concentración de 10 \mug/ml) en un tampón (p. ej. 50 mM HEPES, pH 7) con concentraciones diferentes de calcio (p. ej. en la gama de 1 \muM-100 mM) o de EGTA (p. ej. en la gama de 1-1000 \muM) [EGTA = 1-di(2-aminoetoxi)etano-N,N,N', ácido N'-tetraacético] para un periodo temporal suficientemente largo (tal como 22 horas a 55ºC).

La fluorescencia F medida está compuesta por contribuciones que forman las formas plegadas y desplegadas de la enzima. La ecuación siguiente puede ser derivada para describir la dependencia de F en la concentración del calcio ([Ca]):

F =[Ca]/(K_{diss} + [Ca])(\alpha_{N} - \beta_{N} log([Ca])+K_{diss}/(K_{diss}+[Ca])(\alpha_{U} - \beta_{U} log([Ca])

donde \alpha_{N} es la fluorescencia de la forma nativa (plegada) de la enzima, \beta_{N} es la dependencia lineal de \alpha_{N} en el logaritmo de la concentración del calcio (como se ha observado experimentalmente), \alpha_{U} es la fluorescencia de la forma desplegada y \beta_{U} es la dependencia lineal de \alpha_{U} en el logaritmo de la concentración de calcio. K_{diss} es la constante de unión al calcio aparente para un proceso de equilibrio tal y como sigue:

\hskip3.8cm

K_{diss}

N - Ca \longleftrightarrow U + Ca

\hskip0.5cm

(N = enzima nativa; U = enzima desplegada)

\newpage

De hecho, el despliegue se desarrolla extremadamente lenta y es irreversible. El nivel de despliegue es uno dependiente de la concentración de calcio, y la dependencia de una \alpha-amilasa dada proporciona una medida de la afinidad de unión al Ca de la enzima. Definiendo un grupo estándar de condiciones de la reacción (p. ej. 22 horas a 55ºC), se puede hacer una comparación significativa de K_{diss} con \alpha-amilasas diferentes. Las curvas de disociación del calcio para las \alpha-amilasas en general pueden ajustarse a la ecuación anterior, permitiendo la determinación de los valores correspondientes de K_{diss}.

Los siguientes valores para K_{diss} fueron obtenidos para las \alpha-amilasas madres con las secuencias de aminoácidos mostradas en la SEC ID Nº. 1 y SEC ID Nº. 2, y para las variantes de la \alpha-amilasa indicadas según la invención (la \alpha-amilasa madre siendo indicada entre paréntesis):

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Es evidente a partir de lo anterior que la afinidad de la unión al calcio de las últimas enzimas \alpha-amilolíticas se reduce en una dirección descendente a partir de la tabla anterior, es decir que la variante de eliminación de pares D183* + G184* (SEC ID Nº. 2) se une al calcio con más fuerza (es decir tiene una dependencia del calcio mínima) mientras que la \alpha-amilasa madre de la SEC ID Nº. 1 se une al calcio con menos fuerza (es decir tiene una dependencia de calcio máxima).

Referencias citadas en la especificación

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<110> Novozymes A/S

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<120> Variantes de amilasa

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<130> 4318.215-EP

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<160> 7

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<170> PatentIn Version 3.3

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<210> 1

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<211> 485

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<212> PRT

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<213> cepa NCIB12512 de Bacillus

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<400> 1

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52

53

54

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<210> 2

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<211> 485

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<212> PRT

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<213> cepa NCIB 12513 de Bacillus

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<400> 2

55

56

57

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<210> 3

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<211> 514

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<212> PRT

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<213> Bacillus stearothermophilus

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<400> 3

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58

59

60

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<210> 4

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<211> 1455

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<212> ADN

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<213> cepa NCIB 12512

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<400> 4

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61

62

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<210> 5

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<211> 1455

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<212> ADN

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<213> cepa NCIB 12513 de Bacillus

\newpage

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<400> 5

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63

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<210> 6

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<211> 1548

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<212> ADN

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<213> Bacillus stearothermophilus

\newpage

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<400> 6

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64

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<211> 485

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<212> PRT

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<213> Bacillus sp. #707

\newpage

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<400> 7

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65

67

Claims (23)

1. Variante de una \alpha-amilasa madre, dicha \alpha-amilasa madre presenta al menos un 80% de identidad con las secuencias de aminoácidos SEC ID Nº. 3, en las que la variante comprende la deleción de los aminoácidos equivalentes a R179 y G180 de la secuencia de aminoácidos mostrada ha sido eliminada en la SEC ID Nº. 3, dicha variante teniendo actividad \alpha-amilasa y presentando al menos una de las siguientes propiedades con respecto a dicha \alpha-amilasa madre: termostabilidad aumentada; estabilidad aumentada a la oxidación; y dependencia de Ca^{2+} reducida.

2. Variante según la reivindicación 1, donde al menos un residuo de aminoácido oxidable de dicha \alpha-amilasa madre ha sido eliminado o ha sido sustituido por un residuo de aminoácido diferente que es menos susceptible a la oxidación que dicho residuo de aminoácido oxidable.

3. Variante según la reivindicación 2, donde dicho residuo de aminoácido oxidable está seleccionado del grupo formado por metionina, triptófano, cisteína y tirosina.

4. Variante según la reivindicación 3, donde el residuo de metionina ha sido reemplado por treonina.

5. Constructo de ADN que comprende una secuencia de ADN que codifica una variante de \alpha-amilasa según cualquiera de las reivindicaciones 1-4.

6. Vector de expresión recombinante que lleva el constructo de ADN según la reivindicación 5.

7. Célula huésped que está transformada con un constructo de ADN según la reivindicación 5 o un vector según la reivindicación 6.

8. Célula según la reivindicación 7, que es un microorganismo.

9. Célula según la reivindicación 8, que es una bacteria o un hongo.

10. Célula según la reivindicación 8, que es una bacteria gram-positiva como Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus brevis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus circulans, Bacillus lautus, Bacillus thuringiensis o Streptomyces lividans o Streptomyces murinus, o una bacteria gram-negativa como E. coli.

11. Método para producir una variante de \alpha-amilasa según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, donde una célula según cualquiera de las reivindicaciones 7-10 es cultivada bajo condiciones propicias para la producción de la variante de \alpha-amilasa, y la variante de \alpha-amilasa es posteriormente recuperada del cultivo.

12. Uso de una variante de \alpha-amilasa según cualquiera de las reivindicaciones 1-4 para el lavado de la ropa y/o de la vajilla.

13. Aditivo de detergente que comprende una variante de \alpha-amilasa según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, opcionalmente en forma de un granulado no pulverulento, líquido estabilizado o enzima protegida.

14. Aditivo de detergente según la reivindicación 13, que comprende 0.02-200 mg de proteína enzimática por gramo de aditivo.

15. Aditivo de detergente según la reivindicación 13 o 14, que adicionalmente comprende otra enzima tal como una proteasa, una lipasa, una peroxidasa, otra enzima amilolítica y/o una celulasa.

16. Composición de detergente que comprende una variante de \alpha-amilasa según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, y un tensioactivo.

17. Composición de detergente según la reivindicación 16, que adicionalmente comprende otra enzima tal como una proteasa, una lipasa, una peroxidasa, otra enzima amilolítica y/o una celulasa.

18. Composición de detergente para el lavado manual o automático de la vajilla que comprende una variante de \alpha-amilasa según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, y un tensioactivo.

19. Composición de detergente para el lavado de la vajilla según la reivindicación 18, que adicionalmente comprende otra enzima tal como una proteasa, una lipasa, una peroxidasa, otra enzima amilolítica y/o una celulasa.

20. Composición para el lavado manual o automático de la ropa que comprende una variante de \alpha-amilasa según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, y un tensioactivo.

21. Composición para el lavado de la ropa según la reivindicación 20, que adicionalmente comprende otra enzima tal como una proteasa, una lipasa, una peroxidasa, una enzima amilolítica y/o una celulasa.

22. Uso de una variante de \alpha-amilasa según cualquiera de las reivindicaciones 1-4 para el desencolado textil.

23. Uso de una variante de \alpha-amilasa según cualquiera de las reivindicaciones 1-4 para la producción de suavizantes y etanol a partir del almidón.