CN113528489A - α-淀粉酶变体 - Google Patents

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CN113528489A CN202110788301.5A CN202110788301A CN113528489A CN 113528489 A CN113528489 A CN 113528489A CN 202110788301 A CN202110788301 A CN 202110788301A CN 113528489 A CN113528489 A CN 113528489A
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Abstract

本发明涉及α‑淀粉酶变体。本发明还涉及编码这些变体的多核苷酸；包括这些多核苷酸的核酸构建体、载体、以及宿主细胞；以及使用这些变体的方法。

Description

α-淀粉酶变体
本申请是申请日2015年6月12日、申请号201580029878.0、发明名称“α-淀粉酶变体”的发明专利申请的分案申请。
对序列表的引用
本申请包括计算机可读形式的序列表，将其通过引用结合在此。
技术领域
本发明涉及α-淀粉酶变体、编码这些变体的多核苷酸、产生这些变体的方法以及使用这些变体的方法。
背景技术
α-淀粉酶(α-1,4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶，E.C.3.2.1.1)构成一组酶，这些酶催化淀粉以及其他直链和支链1,4-糖苷寡糖和多糖的水解。
α-淀粉酶是用于洗涤剂组合物中的关键酶并且对于衣物洗涤或餐具洗涤期间去除淀粉污溃，其用途已经变得日益重要。
一些洗涤剂，特别是餐具洗涤洗涤剂，包含漂白系统、漂白活化剂、和漂白催化剂，而这些成分由于分子的氧化而均在极大的程度上破坏α-淀粉酶的稳定性。因此，重要的是找到这样的α-淀粉酶变体，它们在包含不同漂白剂的洗涤剂中都具有稳定性，具有高洗涤性能、污溃去除作用和/或活性。
本领域已知通过将位置197(使用来自地衣芽孢杆菌的淀粉酶来编号)的甲硫氨酸用例如亮氨酸来取代,从而针对漂白剂和漂白剂引起的氧化作用,将α-淀粉酶稳定化。例如,这已经在WO 199418314中被披露。然而，这些现有技术中的氧化作用稳定的α-淀粉酶具有缺点，就是α-淀粉酶活性被减小。
因此，本发明的目的是提供α-淀粉酶变体，所述变体在洗涤剂、特别是在餐具洗涤剂和其他包含漂白剂或漂白系统的洗涤剂中显示高水平的稳定性并且同时相比具有现有技术方案中的M197L取代的亲本α-淀粉酶，具有改进的α-淀粉酶活性。另外的目的是提供具有高性能，特别是高洗涤性能、特别是高餐具洗涤性能的α-淀粉酶变体。
本发明提供了相比其亲本具有改进的稳定性并且相比其具有M197L的亲本(在本发明的亲本淀粉酶中对应于M202L)具有改进的活性的α-淀粉酶变体。
发明内容
本发明涉及分离的α-淀粉酶变体，该α-淀粉酶变体包括a)在对应于SEQ ID NO:1的成熟多肽的位置R181、G182、D183和G184的两个或更多个位置的缺失，和b)在对应于SEQID NO:1的成熟多肽的位置Y198、Y200、L201、Y203和A204的一个或多个位置的取代，以及c)在对应于SEQ ID NO:1的成熟多肽的位置M202的位置的用任一其他氨基酸对甲硫氨酸的取代，其中该变体与SEQ ID NO:1或2的成熟多肽具有至少80％，例如至少90％，但是小于100％序列一致性，并且其中该变体具有α-淀粉酶活性。
本发明还涉及包含这些变体的洗涤剂组合物，编码这些变体的分离的多核苷酸；包含这些多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞；以及产生这些变体的方法。
本发明还涉及这些变体在清洁过程中的用途。
本发明还涉及通过将以下项引入亲本α-淀粉酶来改进α-淀粉酶活性的方法:a)在对应于SEQ ID NO:1的成熟多肽的位置R181、G182、D183和G184的两个或更多个位置的缺失，和b)在对应于SEQ ID NO:1的成熟多肽的位置Y198、Y200、L201、Y203和A204的一个或多个位置的取代，以及c)在对应于SEQ ID NO:1的成熟多肽的位置M202的位置的用任一其他氨基酸对甲硫氨酸的取代，其中所得变体与SEQ ID NO:1或2的成熟多肽具有至少80％，例如至少90％，但是小于100％序列一致性。
定义
α-淀粉酶：如在此使用的术语“α-淀粉酶”是指能够催化淀粉降解的酶。通常，α-淀粉酶(E.C.3.2.1.1，α-D-(1->4)-葡聚糖葡聚糖水解酶)是裂解随机顺序的淀粉分子内的α-D(1->4)O-糖苷键的内作用酶。
如在此使用的术语“淀粉”是指由植物的复杂多糖糖类构成、由直链淀粉和支链淀粉组成且分子式为(C6H10O5)X(其中X是任何数字)的任何材料。具体而言，该术语是指基于植物的材料，例如大米、大麦、小麦、玉米、黑麦、马铃薯、等。
α-淀粉酶活性：术语“α-淀粉酶活性”意指α-1,4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶(E.C.3.2.1.1)的活性，这些酶构成一组催化淀粉和其他直链和支链1,4-糖苷低聚糖和多糖水解的酶。出于本发明的目的，根据方法中所述的程序测定α-淀粉酶活性。在一方面，本发明的变体具有SEQ ID NO:1或2的成熟多肽的至少20％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、或至少100％的α-淀粉酶活性。
SEQ ID NO:1：
Figure BDA0003159978670000031
SEQ ID NO:2：
Figure BDA0003159978670000032
等位基因变体：术语“等位基因变体”意指占据同一染色体基因座的基因的两种或更多种可替代形式中的任一种。等位基因变异由突变天然产生，并且可以导致群体内多态性。基因突变可以是沉默的(在所编码的多肽中没有改变)或可编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位基因变体是由基因的等位基因变体编码的多肽。
cDNA：术语“cDNA”意指可以通过从得自真核或原核细胞的成熟的、剪接的mRNA分子进行反转录而制备的DNA分子。cDNA缺乏可以存在于对应基因组DNA中的内含子序列。早先的初始RNA转录本是mRNA的前体，其在呈现为成熟的剪接的mRNA之前要经一系列的步骤进行加工，包括剪接。
编码序列：术语“编码序列”意指直接指明变体的氨基酸序列的多核苷酸。编码序列的边界一般由开放阅读框架决定，该开放阅读框架从起始密码子(如ATG、GTG或TTG)开始并且以终止密码子(如TAA、TAG或TGA)结束。编码序列可以是基因组DNA、cDNA、合成DNA或其组合。
对应于：如在此使用的术语“对应于”是指用来确定一个序列中的特定氨基酸(其中参考了特定氨基酸序列)的方式。例如出于本发明的目的，当参考特定氨基酸位置时，技术人员会能够将另一氨基酸序列与所述已经被参考的氨基酸序列进行比对，从而确定哪一个特定氨基酸可能是在所述另一氨基酸序列中是感兴趣的。在此将另一氨基酸序列与例如在SEQ ID NO:1中列出的序列，或任一在此处列举的序列的比对在其他地方已经被描述。可以使用替代性的比对方法，这些方法为技术人员所熟知。
控制序列：术语“控制序列”意指对于表达编码本发明的变体的多核苷酸所必需的核酸序列。每个控制序列对于编码该变体的多核苷酸来说可以是原生的(即，来自相同基因)或者外源的(即，来自不同基因)，或者相对于彼此是原生的或外源的。这些调控序列包括但不局限于前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列和转录终止子。至少，控制序列包括启动子，以及转录和翻译终止信号。出于引入有利于将这些控制序列与编码变体的多核苷酸的编码区连接的特异性限制酶切位点的目的，这些控制序列可以提供有多个接头。
洗涤剂组合物：如在此使用的术语“洗涤剂组合物”是指适合用于洗涤剂领域内、例如用于衣物洗涤和餐具洗涤的组合物。洗涤剂组合物可以是液体形式或粉状形式，并且可以适用于手洗或自动化洗涤两者。因此，包括上下文另有说明，术语“洗涤剂组合物”包括颗粒状或粉状的全效或重垢洗涤剂，尤其是所谓的重垢液(HDL)类型；液体细薄织物洗涤剂；手洗餐具洗涤剂或轻垢餐具洗涤剂，尤其是高泡沫型的那些；机洗餐具洗涤剂，包括用于居家及机构使用的多种片型、颗粒型、液体型以及冲洗助剂型；液体清洁和消毒剂，包括抗菌洗手液类型、清洁棒、皂棒、漱口液、义齿清洁剂、汽车或地毯清洁剂、浴室清洁剂；洗发香波和护发素；沐浴凝胶、沐浴露；金属洗涤剂；以及清洁助剂，如漂白剂添加剂和“去污棒”或预处理类型。就预期用于弄脏的物体清洁的洗涤介质中的混合物而言，使用术语“洗涤剂组合物”和“洗涤剂配制品”。在一些实施例中，就洗涤织物和/或衣服而言，使用该术语(例如，“衣物洗涤剂”)。在替代性实施例中，该术语是指例如用于清洁餐具、刀具等的那些的其他洗涤剂(例如“餐具洗涤洗涤剂”)。它并不意图使本发明限于任何特定的洗涤剂配制品或组合物。术语“洗涤剂组合物”不旨在限于包含表面活性剂的组合物。其意图是，除了如在此描述的变体以外，该洗涤剂组合物可以包括：例如表面活性剂、助洗剂、螯合剂(chelator)或螯合试剂(chelating agent)、漂白系统或漂白组分、聚合物、织物调理剂、增泡剂、抑泡剂、染料、香料、晦暗抑制剂、光学增亮剂、杀细菌剂、杀真菌剂、污垢悬浮剂、防腐蚀剂、酶抑制剂或稳定剂、酶激活剂、一种或多种转移酶、水解酶、氧化还原酶、上蓝剂和荧光染料、抗氧化剂、和/或增溶剂。
表达：术语“表达”包括涉及变体产生的任何步骤，包括但不局限于，转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰以及分泌。
表达载体：术语“表达载体”意指线性或环状DNA分子，该分子包括编码变体的多核苷酸并且该多核苷酸可操作地与提供用于其表达的控制序列相连接。
片段：术语“片段”意指具有从成熟多肽的氨基和/或羧基端缺失的一个或多个(例如，若干个)氨基酸的多肽；其中该片段具有α-淀粉酶活性。在一方面，一个片段包含至少480个氨基酸残基、至少481个氨基酸残基或至少482个氨基酸残基。
高严格条件：术语“高严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2X SSC、0.2％SDS，在65℃下洗涤三次，每次15分钟。
宿主细胞：术语“宿主细胞”意指易于用包含本发明的多核苷酸的核酸构建体或表达载体转化、转染、转导等的任何细胞类型。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间发生的突变而与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。
改进的特性：术语“改进的特性”意指一种与变体相关的特征，该特征相比于亲本或相比于SEQ ID NO:1或2的成熟多肽得到了改进。此类改进的性质包括但不局限于：催化效率、催化速率、化学稳定性、氧化稳定性、pH活性、pH稳定性、比活性、在贮存条件下的稳定性、底物结合、底物裂解、底物特异性、底物稳定性、表面性质、热活性、和热稳定性、以及改进的洗涤性能。可以在这些变体中改进的另一种特性是在洗涤剂组合物中的稳定性，即洗涤剂稳定性。给定变体的洗涤剂稳定性(或残余活性)可以通过在洗涤剂标准溶液中孵育该变体来确定，该洗涤剂标准溶液优选包含螯合剂例如EDTA、EGTA、DTPA、DTMPA、MGDA、EDDS、或HEDP。
优选地，本发明的变体相比现有技术中的氧化作用稳定的α-淀粉酶具有改进的α-淀粉酶活性。
洗涤性能：在本发明背景下，使用术语“洗涤性能”作为酶在例如衣物或硬表面清洁如餐具洗涤期间去除存在于待清洁的物体上的淀粉或含淀粉污渍的能力。可以通过计算如在于此的定义中描述的所谓的δ反射值(ΔRem)量化洗涤性能。
改进的洗涤性能：在此将术语“改进的洗涤性能”定义为变体酶例如通过增加的污渍去除而相对于亲本淀粉酶的洗涤性能或相对于现有技术中的α-淀粉酶展现出淀粉酶变体的洗涤性能的改变。术语“洗涤性能”包括通常清洁例如硬表面清洁，如在餐具洗涤中，但还包括在纺织品如衣物上的洗涤性能，并且还包括工业清洁和机构清洁。可以通过比较如在于此的定义中描述的所谓的δ反射值(ΔRem)测量改进的洗涤性能，其中变体的ΔRem与亲本α-淀粉酶的ΔRem相比较。
低温：“低温”是5℃-35℃，优选5℃-30℃更优选5℃-25℃，更优选5℃-20℃，最优选5℃-15℃并且特别是5℃-10℃的温度。在一个优选实施例中，“低温”是10℃-35℃，优选10℃-30℃，更优选10℃-25℃，最优选10℃-20℃，并且特别是10℃-15℃的温度。
δ反射值(Delta remission value，ΔRem)：在此将术语“δ反射”或“δ反射值”定义为测试材料在460nm处的反射率或反射测量值的结果，该测试材料是例如小块布样CS-28(测试材料BV中心(Center for Testmaterials BV)，邮政信箱120，3133KT弗拉尔丁恩(Vlaardingen)，荷兰)或硬表面。将该小块布样与作为背景的至少一个其他小块布样一起测量，该其他小块布样是在相同条件下洗涤的。δ反射是用淀粉酶洗涤的测试材料的反射值减去未用淀粉酶洗涤的测试材料的反射值。
分离的：术语“分离的”意指处于自然界中不存在的形式或环境中的物质。分离的物质的非限制性实例包括(1)任何非天然存在的物质，(2)包括但不局限于任何酶、变体、核酸、蛋白质、肽或辅因子的任何物质，该物质至少部分地从与其本质相关的一种或多种或所有天然存在的成分中去除；(3)相对于天然发现的物质通过人工修饰的任何物质；或(4)通过相对于与其天然相关联的其他组分增加该物质的量而修饰的任何物质(例如，编码该物质的基因的多个拷贝；比与编码该物质的基因天然相关联的启动子更强的启动子的使用)。分离的物质可以存在于发酵液样品中。
免疫交叉反应性：如在此处使用的术语“具有与抗体的免疫交叉反应性的多肽”是指与针对SEQ ID NO:1或2的多肽产生的抗体结合的任一多肽。当不必须具有如SEQ ID NO:1或2列出的序列的多肽与抗体结合并由此提供了交叉反应性时，这就表明了该多肽可能具有与SEQ ID NO:1或2的多肽相似的特征。可以通过ELISA方法进行交叉反应性的确定，ELISA方法包括步骤(i)将感兴趣的多肽附着到ELISA-平板上；(ii)添加针对SEQ ID NO:1或2的多肽产生的抗体；(iii)添加结合针对SEQ ID NO:1或2的多肽产生的抗体的第二标记抗体；和(iv)测量来自结合的第二抗体的信号。可以使用其他确定免疫交叉反应性的方法并且这些方法在本领域技术人员的知识范围内。
低严格条件：术语“低严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和25％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2X SSC、0.2％SDS，在50℃下洗涤三次，每次15分钟。
成熟多肽：术语“成熟多肽”意指在翻译和任何翻译后修饰如N末端加工、C末端截短、糖基化作用、磷酸化作用等之后处于其最终形式的多肽。在一方面，成熟多肽是SEQ IDNO:1的氨基酸1至485。
在本领域中已知的是，宿主细胞可以产生由相同多核苷酸表达的两种或更多种不同成熟多肽(即，具有不同的C-末端和/或N-末端氨基酸)的混合物。
成熟多肽编码序列：术语“成熟多肽编码序列”意指编码具有α-淀粉酶活性的成熟多肽的多核苷酸。
中严格条件：术语“中严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和35％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2X SSC、0.2％SDS，在55℃下洗涤三次，每次15分钟。
中-高严格条件：术语“中-高严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA以及35％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2X SSC、0.2％SDS，在60℃下洗涤三次，每次15分钟。
核酸构建体：术语“核酸构建体”意指单链或双链的核酸分子，该核酸分子是从天然存在的基因中分离的，或以本来不存在于自然界中的方式被修饰成包含核酸的区段，或是合成的，该核酸分子包括一个或多个控制序列。
可操作地连接：术语“可操作地连接”意指以下的构造，其中，控制序列相对于多核苷酸的编码序列安置在适当位置，从而使得该控制序列指导该编码序列的表达。
亲本或亲本α-淀粉酶：术语“亲本”或“亲本α-淀粉酶”意指进行改变以产生本发明的酶变体的α-淀粉酶。亲本可以是天然存在(野生型)的多肽，例如像SEQ ID NO:1的α-淀粉酶或其变体或片段例如像SEQ ID NO:2的淀粉酶。
序列一致性：两个氨基酸序列之间或者两个核苷酸序列之间的关联度通过参数“序列一致性”来描述。
出于本发明的目的，使用如在EMBOSS包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件(The European Molecular Biology Open Software Suite)，赖斯(Rice)等人，2000，遗传学趋势(Trends Genet.)16:276-277)(优选5.0.0版或更新版本)的尼德尔(Needle)程序中所实施的尼德尔曼-翁施(Needleman-Wunsch)算法(尼德尔曼(Needleman)和翁施(Wunsch)，1970，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)48:443-453)来确定两个氨基酸序列之间的序列一致性。所使用的参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5，和EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。尼德尔标注的“最长的一致性”的输出(使用-非简化选项获得)被用作百分比一致性，并且计算如下：
(一致的残基x100)/(比对长度-比对中的空位总数)
出于本发明的目的，使用如在EMBOSS包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件，赖斯(Rice)等人，2000，见上文)(优选5.0.0版或更新版本)的尼德尔程序中所实施的尼德尔曼-翁施算法(尼德尔曼(Needleman)和翁施(Wunsch)，1970，见上文)来确定两个脱氧核糖核苷酸序列之间的序列一致性。所使用的参数是空位开放罚分10，空位延伸罚分0.5，以及EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版)取代矩阵。尼德尔标注的“最长的一致性”的输出(使用-非简化选项获得)被用作百分比一致性，并且计算如下：
(一致的脱氧核糖核苷酸x100)/(比对长度-比对中的空位总数)
变体：术语“变体”意指在一个或多个(例如，若干个)位置包括改变(即，取代、插入和/或缺失)的具有α-淀粉酶活性的一个多肽。取代意指将占据某位置的氨基酸用不同的氨基酸替代；缺失意指去除占据某位置的氨基酸；而插入意指在邻接并紧接着占据某位置的氨基酸之后添加氨基酸。本发明的变体具有SEQ ID NO:1或2的成熟多肽的至少20％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、或至少100％的α-淀粉酶活性。
非常高严格条件：术语“非常高严格条件”是指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2X SSC、0.2％SDS，在70℃下洗涤三次，每次15分钟。
非常低严格条件：术语“非常低严格条件”是指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和25％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2X SSC、0.2％SDS，在45℃下洗涤三次，每次15分钟。
野生型α-淀粉酶：术语“野生型”α-淀粉酶意指由天然存在的微生物(如在自然界中发现的细菌、古生菌、酵母或丝状真菌)表达的一种α-淀粉酶。
织物：术语“织物”涵盖任何纺织材料。因此，其意图是，该术语涵盖衣服，连同织物、纱线、纤维、非织造材料、天然材料、合成材料以及任何其他纺织材料。
纺织品：术语“纺织品”是指织造织物，连同适于转化为或用作纱线、织造、针织以及非织造织物的短纤维和长丝。该术语涵盖从天然以及合成(例如制造的)纤维制成的纱线。术语“纺织材料”是纤维、纱线中间体、纱线、织物以及制自纤维的产品(例如，衣服以及其他物品)的通用术语。
非织物洗涤剂组合物：术语“非织物洗涤剂组合物”包括非纺织品表面洗涤剂组合物，包括但不局限于用于硬表面清洁的组合物，例如餐具洗涤洗涤剂组合物、口服洗涤剂组合物、义齿洗涤剂组合物以及个人清洁组合物。
酶的有效量：术语“酶的有效量”是指在特定应用中，例如在定义的洗涤剂组合物中达到所需的酶活性所必需的酶量。此类有效量可以由本领域的普通技术人员容易地确定并且基于多种因素，如使用的具体酶、清洁应用、洗涤剂组合物的特定组成以及是否需要液体或干燥(例如，颗粒状、棒状)组合物等。术语变体的“有效量”指达成期望水平的酶活性(例如在限定的去污剂组合物中达成期望水平的酶活性)的前述金属变体的量。在一个实例中，蛋白酶变体的有效量是α-淀粉酶，例如α-淀粉酶变体的同等有效量。在另一个实例中，蛋白酶变体的有效量不同于α-淀粉酶，例如α-淀粉酶变体的有效量，例如，蛋白酶变体的有效量可以多于或少于α-淀粉酶，例如α-淀粉酶变体的有效量。
水硬度：如在此使用的术语“水硬度”或“硬度(degree of hardness)”或“dH”或“°dH”是指德国硬度(degree of hardness)。一度被定义为10毫克氧化钙/升水。
相关洗涤条件：在此使用术语“相关洗涤条件”指示在洗涤剂细分市场中实际用于家用的条件，具体是洗涤温度、时间、洗涤力学、洗涤剂浓度、洗涤剂类型以及水硬度。
污溃去除酶：如在此所用，术语“污溃去除酶”描述辅助从织物或硬质表面去除污溃或污垢的酶。污溃去除酶作用于特异性底物，例如蛋白酶作用于蛋白，淀粉酶作用于淀粉，脂肪酶和角质酶作用于脂质(脂肪和油)，果胶酶作用于果胶，而半纤维素酶作用于半纤维素。污渍通常是具有不同组分的复杂混合物的沉积物，这导致材料自身局部变色或这在物体上留下粘性表面，该粘性表面可以吸引溶解于洗涤液中的污物从而导致弄脏的区域变色。当酶对存在于污渍中的其特定底物起作用时，该酶降解或部分降解其底物，从而帮助在洗涤过程中去除与底物相关的污物和污渍组分。
减少的量：在这种情境下，术语“减少的量”意指该组分的量小于将在参考过程中另外在相同条件下使用的量。在一个优选实施例中，该量被减少例如至少5％，如至少10％、至少15％、至少20％或如另外在此所述的。
低洗涤剂浓度：术语“低洗涤剂浓度”系统包括其中小于约800ppm的洗涤剂组分存在于洗涤水中的洗涤剂。亚洲(例如，日本)洗涤剂典型地被认为是低洗涤剂浓度系统。
中等洗涤剂组合物：术语“中等洗涤剂浓度”系统包括其中在约800ppm和约2000ppm之间的洗涤剂组分存在于洗涤水中的洗涤剂。北美洲洗涤剂通常被认为是中洗涤剂浓度系统。
高洗涤剂浓度：术语“高洗涤剂浓度”系统包括其中大于约2000ppm的洗涤剂组分存在于洗涤水中的洗涤剂。欧洲洗涤剂通常被认为是高洗涤剂浓度系统。
液体衣物洗涤剂组合物：如在此使用的术语“液体衣物洗涤剂组合物”是指洗涤剂组合物，该洗涤剂组合具物有稳定化的液体形式且用于洗涤织物的方法中。因此，该洗涤剂组合物被配制为流体形式。
粉状衣物洗涤剂组合物：如在此使用的术语“粉状衣物洗涤剂组合物”是指洗涤剂组合物，该洗涤剂组合物具有固体形式、例如颗粒状、非尘颗粒状或粉状，用于洗涤织物的方法中。
液体餐具洗涤洗涤剂组合物：如在此使用的术语“液体餐具洗涤洗涤剂组合物”是指洗涤剂组合物，该洗涤剂组合物具有稳定化的液体形式且用于餐具洗涤。餐具洗涤可以是任何种类的餐具洗涤，例如手动餐具洗涤和例如自动化餐具洗涤(ADW)。
粉状餐具洗涤洗涤剂组合物：如在此使用的术语“粉状餐具洗涤洗涤剂组合物”是指洗涤剂组合物，该洗涤剂组合物具有固体形式、例如颗粒状、粉状或紧凑单元，并且用于餐具洗涤。一种粉状餐具洗涤洗涤剂组合物典型地用于自动化餐具洗涤中，但是用途不局限于ADW，并且其还可以旨在被用于任何其他种类的餐具洗涤中，例如手动餐具洗涤。
编码的多核苷酸：如在此使用的术语“编码的多核苷酸”是指编码具有α-淀粉酶活性的成熟多肽的多核苷酸。
变体命名规则
出于本发明的目的，使用在SEQ ID NO:1中披露的成熟多肽来确定另一种α-淀粉酶中的相应氨基酸残基。将另一种α-淀粉酶的氨基酸序列与SEQ ID NO:1中披露的成熟多肽进行比对，并且基于该比对，使用如在EMBOSS包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件，赖斯等人，2000，遗传学趋势16:276-277)(优选5.0.0版或更新版本)的尼德尔程序中所实施的尼德尔曼-翁施算法(尼德尔曼和翁施，1970，分子生物学杂志48:443-453)来确定与SEQ ID NO:1中所披露的成熟多肽中的任何氨基酸残基相对应的氨基酸位置编号。所使用的参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5，和EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。
在另一种α-淀粉酶中的对应的氨基酸残基的识别可通过采用几种计算机程序与多种多肽序列进行比对来确定，这些计算机程序包括但不局限于MUSCLE(对数预期的多序列比较；版本3.5或更新的版本；埃德加(Edgar)，2004，核酸研究(Nucleic AcidsResearch)32:1792-1797)，MAFFT(版本6.857或更新的版本；加藤(Katoh)与库玛(Kuma)，2002，核酸研究30:3059-3066；加藤等人，2005，核酸研究33:511-518；加藤与淘(Toh)，2007，生物信息学(Bioinformatics)23:372-374；加藤等人，2009，分子生物学方法(Methods in Molecular Biology)537:39-64；加藤与淘，2010，生物信息学26:1899-1900)，以及采用ClustalW的EMBOSS EMMA(1.83或更新的版本；托马森(Thompson)等人，1994，核酸研究22:4673-4680)，应用其各自的默认参数。
当其他酶与SEQ ID NO:1的成熟多肽相背离使得传统的基于序列的比较方法不能检测其相互关系时(林达尔(Lindahl)和埃洛弗松(Elofsson)，2000，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)295:613-615)，可应用其他成对序列比较算法。在基于序列的搜索中的更大灵敏度可以使用搜索程序来获得，这些搜索程序利用多肽家族的概率表示(谱(profile))来搜索数据库。例如，PSI-BLAST程序通过一个迭代数据库搜索过程来产生多个特征曲线并且能够检测远距离同源物(阿特休尔(Atschul)等人，1997，核酸研究25:3389-3402)。当多肽的家族或超家族在蛋白质结构数据库中具有一个或多个代表时，甚至可达成更高的敏感度。程序如GenTHREADER(琼斯(Jones)，1999，分子生物学杂志287:797-815；麦古芬(McGuffin)和琼斯，2003，生物信息学19:874-881)利用来自不同来源(PSI-BLAST、二级结构预测、结构比对谱、以及溶剂化势)的信息作为预测查询序列的结构折叠的神经网络的输入。类似地，高夫(Gough)等人，2000，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)313:903-919的方法可以用于比对未知结构的序列与存在于SCOP数据库中的超家族模型。这些比对可接着用于生成所述多肽的同源性模型，且上述模型可就其准确度使用多种为此目的开发的工具加以评价。
对于已知结构的蛋白质，可获取数种工具和资源以供找回(retrieve)和生成结构比对。例如，蛋白的SCOP超家族已经在结构上进行比对，并且那些比对是可访问的并且可下载的。使用多种算法(例如距离比对矩阵(赫尔姆(Holm)和桑德尔(Sander)，1998，蛋白杂志(Proteins)33:88-96)或者组合扩展(辛迪亚洛夫(Shindyalov)和伯恩(Bourne)，1998，蛋白质工程学11:739-747))可以比对两个或更多个蛋白结构，并且可以另外地利用这些算法的实施来随所感兴趣的结构查询结构数据库以便发现可能的结构同源物(例如，赫尔姆和帕克(Park)，2000，生物信息学16:566-567)。
在描述本发明的变体中，以下所述的命名法适于引用方便。采用已接受的IUPAC单字母或三字母氨基酸缩写。
取代：对于氨基酸取代，使用以下命名法：初始氨基酸、位置、取代氨基酸。因此，在位置226处的苏氨酸被丙氨酸取代表示为“Thr226Ala”或者“T226A”。在给定位置的氨基酸可以用任何其他氨基酸取代的情况下，将其表示为T226ACDEFGHIKLMNPQRSWVY。因此，这意味着位置226处的苏氨酸可以被选自A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、W、V或Y的组的一个氨基酸取代。同样地，在给定位置的氨基酸可以被选自特定的氨基酸组的一个氨基酸取代的情况下，例如在位置226处的苏氨酸可以被酪氨酸、苯丙氨酸或组氨酸中的任一个取代的情况下，将其表示为T226YFH。给定位置的不同改变还可以由一个逗号(“，”)分开，例如“Arg170Tyr,Glu”或“R170Y,E”代表位置170处的精氨酸被酪氨酸或谷氨酸取代。因此，“Tyr167Gly,Ala+Arg170Gly,Ala”命名了以下变体：“Tyr167Gly+Arg170Gly”、“Tyr167Gly+Arg170Ala”、“Tyr167Ala+Arg170Gly”以及“Tyr167Ala+Arg170Ala”。
多个改变由加号(“+”)分开，例如，“Gly205Arg+Ser411Phe”或“G205R+S411F”代表分别在位置205和位置411处甘氨酸(G)被精氨酸(R)取代，并且丝氨酸(S)被苯丙氨酸(F)取代。
缺失：对于氨基酸缺失，使用以下命名法：初始氨基酸、位置、*。因此，在位置195处的甘氨酸缺失表示为“Gly195*”或者“G195*”。多个缺失由加号(“+”)分开，例如“Gly195*+Ser411*”或“G195*+S411*”。
插入：对于氨基酸插入，使用以下命名法：初始氨基酸、位置、初始氨基酸、插入氨基酸。因此，在位置195处的甘氨酸之后插入赖氨酸被表示为“Gly195GlyLys”或“G195GK”。多个氨基酸的插入被表示为[原始氨基酸、位置、原始氨基酸、插入的氨基酸#1、插入的氨基酸#2等]。例如，在位置195处的甘氨酸之后插入赖氨酸和丙氨酸被表示为“Gly195GlyLysAla”或“G195GKA”。
在此类情况下，通过将小写字母添加至在所插入的一个或多个氨基酸残基之前的氨基酸残基的位置编号中来对所插入的一个或多个氨基酸残基进行编号。在以上实例中，该序列因此将是：
<u>亲本：</u> <u>变体：</u>
195 195 195a 195b
G G-K-A
多个改变：包括多个改变的变体由加号(“+”)分开，例如“Arg170Tyr+Gly195Glu”或者“R170Y+G195E”代表在位置170和位置195处的精氨酸和甘氨酸分别被酪氨酸和谷氨酸取代。除非由上下文另外声明，术语“改变”、术语“突变”、术语“变异”、和术语“修饰”可以可互换地使用并且构成相同含义和目的。
具体实施方式
本发明涉及分离的α-淀粉酶变体，该α-淀粉酶变体包括a)在对应于SEQ ID NO:1的成熟多肽的位置R181、G182、D183和G184的两个或更多个位置的缺失，和b)在对应于SEQID NO:1的成熟多肽的位置Y198、Y200、L201、Y203和A204的一个或多个位置的取代，以及c)在对应于SEQ ID NO:1的成熟多肽的位置M202的位置的用任一其他氨基酸对甲硫氨酸的取代，其中该变体与SEQ ID NO:1或2的成熟多肽具有至少80％，例如至少90％，但是小于100％序列一致性，并且其中该变体具有α-淀粉酶活性。在另一个实施例中，该变体与SEQID NO:3的成熟多肽具有至少80％，例如至少90％，但是小于100％序列一致性。在另一个实施例中，该变体与SEQ ID NO:4的成熟多肽具有至少80％，例如至少90％，但是小于100％序列一致性。在另一个实施例中，该变体与SEQ ID NO:5的成熟多肽具有至少80％，例如至少90％，但是小于100％序列一致性。在另一个实施例中，该变体与SEQ ID NO:6的成熟多肽具有至少80％，例如至少90％，但是小于100％序列一致性。在另一个实施例中，该变体与SEQID NO:7的成熟多肽具有至少80％，例如至少90％，但是小于100％序列一致性。在另一个实施例中，该变体与SEQ ID NO:8的成熟多肽具有至少80％，例如至少90％，但是小于100％序列一致性。
如在此使用的术语“用任一其他氨基酸的取代”是指用十九种替代性的天然存在的氨基酸取代原来在具体位置上存在的氨基酸，即当原来存在的氨基酸是A，“任一其他氨基酸”可以是以下项中的任一个：R、N、D、C、E、Q、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y、或V。任一其他氨基酸不局限于天然存在的氨基酸并且还可以是非天然存在的氨基酸。
在一个实施例中，改变b)是在跨越氨基酸位置199-204的环中的插入。该插入可以选自以下列表，该列表包括：D199DX、Y200YX、L201LX、M202MX、Y203YX、A204AX，其中X表示任一氨基酸。
在一个实施例中，改变b)选自Y198FLYHQ、Y200FLSYCWPHQRIMTNKVADEG、L201FLSYCWPHQRIMTNKVADEG、Y203FLSYCWPHQRIMTNKVADEG、A204IMTSRVAG中的一个或多个并且改变c)选自M202FLSYCWPHQRIMTNKVADEG中的任一个。
在优选的实施例中，本发明涉及包括在位置198-204(使用SEQ ID NO:1来编号)上的氨基酸序列的变体,该序列选自以下列表，该列表由以下各项组成：YDYLLFA、YDWLLYA、YDWLLFA、YDWLLPA、YDYLLIA、YDYLLNA、YDYLLPA、YDYQLYA、YDPLLYA、YDYLLTA、YDYLLWA、YDNLLYA、YDQLLLA、YDQLLYA、YDWLLWA、YDYLLVA、YDQLLPA、YDQLLWA、YDYLLHA、YDYLLLA、YDYLLSA、YDYPLYA、YDYQPAA、YDELLYA、YDKLLPA、YDQLLNA、YDYELYA、YDYHLYA、YDYLLDA、YDYLPRA、YDYQLLA、YDYQLPA、YDYQLQA、YDDLLYA、YDKLLYA、YDWLLHA、YDWLLTA、YDWLPSA、YDWQLYA、YDYGLYA、YDYLLEA、YDYLLQA、YDYPLPA、YDYRLYA、YDIELSA、YDQLLIA、YDQLLSA、YDWLGYA、YDWLLAA、YDWQLHA、YDWWLPA、YDYELLA、YDYLFTA、YDYLLKA、YDYLYSA、YDYQLFA、YDYQYYA、YDYTLYA、YDYYLYA、YDIELWA、YDIELYA、YDNLLNA、YDNLLPA、YDPLLHA、YDQLLVA、YDQLPYA、YDWLLRA、YDWLWYA、YDWWLGA、YDYHLIA、YDYQHYA、YDYQLGA、YDYQLIA、YDYWLPA、YDELLWA、YDHLLNA、YDIELLA、YDIELNA、YDIELRA、YDILLYA、YDKLLWA、YDLPLYA、YDNLLLA、YDPLLAA、YDPLLPA、YDQHLPA、YDQLLEA、YDQLLQA、YDQLNYA、YDQLPFA、YDQLPNA、YDQLPRA、YDTLLLA、YDTLLYA、YDVLLYA、YDWLLKA、YDWLLLA、YDWLLNA、YDWLLQA、YDWLLVA、YDWLPPA、YDWLPTA、YDWPWYA、YDWWLWA、YDYHLFA、YDYHPSA、YDYLLNT、YDYLLYT、YDYLPFA、YDYLPSA、YDYLVSA、YDYLYPA、YDYLYRA、YDYPLFA、YDYPLSA、YDYPLTA、YDYPQYA、YDYQLTA、YDYQLWA、YDYQNYA、YDYQPRA、YDYQSHA、YDYREYA、YDYRLPA、YDYRNSA、YDYRPRA、YDYTQYA、YDYVLYA、YDYWLSA、YDDLLSA、YDELLDA、YDELLPA、YDELLTA、YDEQLEA、YDEQLYA、YDGLPHA、YDIELFA、YDIELKA、YDIELPA、YDKLLNA、YDKPPSA、YDLLLFA、YDLPLLA、YDNLLKA、YDPLKFA、YDPLLEA、YDPLLFA、YDPLLKA、YDPLLWA、YDPPLPA、YDPPLYA、YDPTLPA、YDPTQYA、YDQELPA、YDQLDHA、YDQLEYA、YDQLLDA、YDQLLFA、YDQLLNT、YDQLLYS、YDQLLYT、YDQLPSA、YDQLWYA、YDQQLVA、YDTLLWA、YDTPLFA、YDTPLYA、YDWELYA、YDWHLYA、YDWLHSA、YDWLLEA、YDWLLIA、YDWLLSA、YDWLNYA、YDWLPFA、YDWLPRA、YDWLQPA、YDWLQYA、YDWLWGA、YDWPLHA、YDWQLRA、YDWQLTA、YDWSLPA、YDWSLYA、YDWWLYA、YDYELEA、YDYELNA、YDYGLAA、YDYHEWA、YDYHLPA、YDYHLSA、YDYHQYA、YDYHTSA、YDYLFQA、YDYLHLA、YDYLIEA、YDYLLFT、YDYLLRA、YDYLLYG、YDYLPDA、YDYLPQA、YDYLPWA、YDYLQEA、YDYPGYA、YDYPHSA、YDYPLLA、YDYPLNA、YDYPNYA、YDYPSRA、YDYPWYA、YDYQEYA、YDYQLAA、YDYQLKA、YDYQLPT、YDYQPTA、YDYQPYA、YDYQQYA、YDYQWYA、YDYRLFA、YDYRPSA、YDYRTFA、YDYRTSA、YDYRTYA、YDYSLYA、YDYSVYA、YDYTPRA、YDYWLFA、YDYWLGA、YDYWLWA、YDYWLYA、YDDLLLA、YDDLLNA、YDDLPFA、YDEHLHA、YDELLFA、YDELLSA、YDELQIA、YDEWPYA、YDGLLSA、YDHLLYA、YDIELHA、YDIELKT、YDIELTA、YDIEVSA、YDIPLYA、YDIRGYA、YDIRNYA、YDIRTKA、YDIWLYA、YDKLPHA、YDKLQYA、YDKPLSA、YDLLLVA、YDNHLPA、YDNHLYA、YDNLGYA、YDNLLIA、YDNLLVA、YDNLLWA、YDNLPRA、YDNQLYA、YDNRLYA、YDPHRHA、YDPLHVA、YDPLLDA、YDPLLLA、YDPLQYA、YDPPQFA、YDPQLIA、YDQELYA、YDQLFSA、YDQLKYA、YDQLLAA、YDQLLHA、YDQLNNA、YDQLPAA、YDQLPPA、YDQLQNA、YDQLWGT、YDQLWPA、YDQLYPA、YDQNLYA、YDQPLPA、YDQQLQA、YDQTLYA、YDQWLHA、YDQWLTA、YDRLLPA、YDSELYA、YDTLIRA、YDTLLKA、YDTLLNA、YDTPLNA、YDTPLPA、YDTPQIA、YDTRLYA、YDTSLPA、YDTTLPA、YDTWKYA、YDVLLPA、YDVLNTA、YDWELIA、YDWHLPA、YDWHQYA、YDWHSHA、YDWHTQA、YDWLHHA、YDWLHYA、YDWLNWA、YDWLPAA、YDWLPGA、YDWLPIA、YDWLQVA、YDWLTPA、YDWLTQA、YDWNLSA、YDWNWYA、YDWPGYA、YDWPLIA、YDWPLVA、YDWPLYA、YDWPTYA、YDWQLIA、YDWQLLA、YDWQLNA、YDWWLDA、YDYDLYA、YDYEKYA、YDYELIA、YDYELPA、YDYELTA、YDYELWA、YDYGWPA、YDYGWYA、YDYHENA、YDYHHEA、YDYHIEA、YDYHLQA、YDYHPRA、YDYHTIA、YDYHTPA、YDYHTYA、YDYLFPA、YDYLHWA、YDYLIRA、YDYLNDA、YDYLNPA、YDYLNQA、YDYLPEA、YDYLPHA、YDYLPIA、YDYLPLA、YDYLPTA、YDYLQNA、YDYLQRA、YDYLRQA、YDYLWGA、YDYLWLA、YDYLWPA、YDYPEPA、YDYPIDA、YDYPIRA、YDYPLAA、YDYPLQA、YDYPPRA、YDYPQHA、YDYPSYA、YDYPTAA、YDYPTDA、YDYQHRA、YDYQHSA、YDYQIYA、YDYQLEA、YDYQLLT、YDYQNPA、YDYQQNA、YDYQQSA、YDYQTVA、YDYQWPA、YDYQYRA、YDYRHTA、YDYRLNA、YDYRQYA、YDYRRSA、YDYRSDA、YDYSGYA、YDYSNYA、YDYSTFA、YDYTEYA、YDYTLSA、YDYTQSA、YDYWLEA、YDYWLGT、YDYWLHA、YDYWLLA、YDYWLTA、YDYWPEA、YDYWPRA、YDYYLRA。
在优选的实施例中,改变b)和/或c)选自Y200H、Y200Q、M202L、Y203N、Y203L、A204S、Y200H+M202L、Y200Q+M202L、M202L+Y203N、M202L+Y203L、M202L+A204S、Y200H+M202L+Y203N、Y200H+M202L+Y203L、Y200H+M202L+A204S、Y200Q+M202L+Y203N、Y200Q+M202L+Y203L、Y200Q+M202L+A204S、Y200H+M202L+Y203N+A204S、Y200H+M202L+Y203L+A204S、Y200Q+M202L+Y203N+A204S、Y200Q+M202L+Y203L+A204S中的一个或多个。
在另一个优选的实施例中，改变b)和/或c)包括选自以下列表的取代或由其组成，该列表由以下各项组成：Y200H、Y200Q、M202L、Y203N、Y203L、A204S；或者包括选自以下项的插入或由其组成：M202MG或M202GG。
在一个优选的实施例中，缺失a)选自以下列表，该列表由以下各项组成：R181*+G182*、R181*+D183*、R181*+G184*、G182*+D183*、G182*+G184*和D183*+G184*、优选地D183*+G184*。
在一个优选实施例中，缺失a)以及改变b)和c)选自以下列表，该列表由以下各项组成：R181*+G182*+Y200H+M202L、R181*+G182*+Y200Q+M202L、R181*+G182*+M202L+Y203N、R181*+G182*+M202L+Y203L、R181*+G182*+M202L+A204S、R181*+G182*+Y200H+M202L+Y203N、R181*+G182*+Y200H+M202L+Y203L、R181*+G182*+Y200H+M202L+A204S、R181*+G182*+Y200Q+M202L+Y203N、R181*+G182*+Y200Q+M202L+Y203L、R181*+G182*+Y200Q+M202L+A204S、R181*+G182*+Y200H+M202L+Y203N+A204S、R181*+G182*+Y200H+M202L+Y203L+A204S、R181*+G182*+Y200Q+M202L+Y203N+A204S、R181*+G182*+Y200Q+M202L+Y203L+A204S。R181*+D183*+Y200H+M202L、R181*+D183*+Y200Q+M202L、R181*+D183*+M202L+Y203N、R181*+D183*+M202L+Y203L、R181*+D183*+M202L+A204S、R181*+D183*+Y200H+M202L+Y203N、R181*+D183*+Y200H+M202L+Y203L、R181*+D183*+Y200H+M202L+A204S、R181*+D183*+Y200Q+M202L+Y203N、R181*+D183*+Y200Q+M202L+Y203L、R181*+D183*+Y200Q+M202L+A204S、R181*+D183*+Y200H+M202L+Y203N+A204S、R181*+D183*+Y200H+M202L+Y203L+A204S、R181*+D183*+Y200Q+M202L+Y203N+A204S、R181*+D183*+Y200Q+M202L+Y203L+A204S。G182*+G184*+Y200H+M202L、G182*+G184*+Y200Q+M202L、G182*+G184*+M202L+Y203N、G182*+G184*+M202L+Y203L、G182*+G184*+M202L+A204S、G182*+G184*+Y200H+M202L+Y203N、G182*+G184*+Y200H+M202L+Y203L、G182*+G184*+Y200H+M202L+A204S、G182*+G184*+Y200Q+M202L+Y203N、G182*+G184*+Y200Q+M202L+Y203L、G182*+G184*+Y200Q+M202L+A204S、G182*+G184*+Y200H+M202L+Y203N+A204S、G182*+G184*+Y200H+M202L+Y203L+A204S、G182*+G184*+Y200Q+M202L+Y203N+A204S、G182*+G184*+Y200Q+M202L+Y203L+A204S。D183*+G184*+Y200H+M202L、D183*+G184*+Y200Q+M202L、D183*+G184*+M202L+Y203N、D183*+G184*+M202L+Y203L、D183*+G184*+M202L+A204S、D183*+G184*+Y200H+M202L+Y203N、D183*+G184*+Y200H+M202L+Y203L、D183*+G184*+Y200H+M202L+A204S、D183*+G184*+Y200Q+M202L+Y203N、D183*+G184*+Y200Q+M202L+Y203L、D183*+G184*+Y200Q+M202L+A204S、D183*+G184*+Y200H+M202L+Y203N+A204S、D183*+G184*+Y200H+M202L+Y203L+A204S、D183*+G184*+Y200Q+M202L+Y203N+A204S、和D183*+G184*+Y200Q+M202L+Y203L+A204S。
在另一个实施例中，改变a)和变异b)选自以下列表，该列表由以下各项组成：N195F+M202L+R181*+G182*、N195F+M202L+R181*+D183*、N195F+M202L+R181*+G184*、N195F+M202L+G182*+D183*、N195F+M202L+D183*+G184*、N195Y+M202L+R181*+G182*、N195Y+M202L+R181*+D183*、N195Y+M202L+R181*+G184*、N195Y+M202L+G182*+D183*和N195Y+M202L+D183*+G184*。
在另一个实施例中，改变a)和改变b)选自以下列表，该列表由以下各项组成：N195F+M202L+R181*+G182*、N195F+M202L+R181*+D183*、N195F+M202L+R181*+G184*、N195F+M202L+G182*+D183*、N195F+M202L+D183*+G184*、N195Y+M202L+R181*+G182*、N195Y+M202L+R181*+D183*、N195Y+M202L+R181*+G184*、N195Y+M202L+G182*+D183*和N195Y+M202L+D183*+G184*。
在另一个实施例中，改变a)和变异b)选自以下列表，该列表由以下各项组成：R181*+G182*+N195F+Y200H+M202L+Y203N、R181*+G182*+N195F+Y200Q+M202L+A204S、R181*+G182*+N195F+M202L+Y203L、G182*+G184*+N195F+Y200H+M202L+Y203N、G182*+G184*+N195F+Y200Q+M202L+A204S、G182*+G184*+N195F+M202L+Y203L、G182*+D183*+N195F+Y200H+M202L+Y203N、G182*+D183*+N195F+Y200Q+M202L+A204S、G182*+D183*+N195F+M202L+Y203L、R181*+D184*+N195F+Y200H+M202L+Y203N、R181*+D184*+N195F+Y200Q+M202L+A204S、R181*+D184*+N195F+M202L+Y203L。
在另一个实施例中，改变a)和改变b)选自以下列表，该列表由以下各项组成：R181*+G182*+N195F+Y200H+M202L+Y203N、R181*+G182*+N195F+Y200Q+M202L+A204S、R181*+G182*+N195F+M202L+Y203L、G182*+G184*+N195F+Y200H+M202L+Y203N、G182*+G184*+N195F+Y200Q+M202L+A204S、G182*+G184*+N195F+M202L+Y203L、G182*+D183*+N195F+Y200H+M202L+Y203N、G182*+D183*+N195F+Y200Q+M202L+A204S、G182*+D183*+N195F+M202L+Y203L、R181*+D184*+N195F+Y200H+M202L+Y203N、R181*+D184*+N195F+Y200Q+M202L+A204S、R181*+D184*+N195F+M202L+Y203L。
在另一个实施例中，改变b)是在所述位置中的两个或更多个，例如所述位置中的三个或更多个、所述位置中的四个或更多个、所述位置中的五个或更多个、所述位置中的六个或更多个、所述位置中的七个或更多个、所述位置中的八个或更多个、或所述位置中的九个或更多个。
在另一个实施例中，改变的数目是2-20个，例如，2-10个或2-5个，如2、3、4、5、6、7、8、9或10个改变。
在另一个实施例中，该变体与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％的一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但是小于100％序列一致性。
在另一个实施例中，该变体与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％的一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但是小于100％序列一致性。
在另一个实施例中，该变体与SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％的一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但是小于100％序列一致性。
在另一个实施例中，该变体与SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％的一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但是小于100％序列一致性。
在另一个实施例中，该变体与SEQ ID NO:5的氨基酸序列具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％的一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但是小于100％序列一致性。
在另一个实施例中，该变体与SEQ ID NO:6的氨基酸序列具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％的一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但是小于100％序列一致性。
在另一个实施例中，该变体与SEQ ID NO:7的氨基酸序列具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％的一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但是小于100％序列一致性。
在另一个实施例中，该变体与SEQ ID NO:8的氨基酸序列具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％的一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但是小于100％序列一致性。
在另一个实施例中，该变体与SEQ ID NO:9的氨基酸序列具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％的一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但是小于100％序列一致性。
在另一个实施例中，该变体与SEQ ID NO:10的氨基酸序列具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％的一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但是小于100％序列一致性。
在另一个实施例中，该变体与SEQ ID NO:11的氨基酸序列具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％的一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但是小于100％序列一致性。
在另一个实施例中，该变体与SEQ ID NO:12的氨基酸序列具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％的一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但是小于100％序列一致性。
在另一个实施例中，该变体与SEQ ID NO:13的氨基酸序列具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％的一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但是小于100％序列一致性。
在另一个实施例中，该变体与SEQ ID NO:14的氨基酸序列具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％的一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但是小于100％序列一致性。
在另一个实施例中，该变体与SEQ ID NO:15的氨基酸序列具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％的一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但是小于100％序列一致性。
在另一个实施例中，该变体与SEQ ID NO:16的氨基酸序列具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％的一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但是小于100％序列一致性。
在另一个实施例中，该变体与SEQ ID NO:17的氨基酸序列具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％的一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但是小于100％序列一致性。
在另一个实施例中，该变体与SEQ ID NO:18的氨基酸序列具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％的一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但是小于100％序列一致性。
在另一个实施例中，该变体与SEQ ID NO:19的氨基酸序列具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％的一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但是小于100％序列一致性。
在另一个实施例中，该变体与SEQ ID NO:20的氨基酸序列具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％的一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但是小于100％序列一致性。
在另一个实施例中，该变体与SEQ ID NO:21的氨基酸序列具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％的一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但是小于100％序列一致性。
在另一个实施例中，该变体与SEQ ID NO:22的氨基酸序列具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％的一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但是小于100％序列一致性。
在另一个实施例中，该变体与SEQ ID NO:23的氨基酸序列具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％的一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但是小于100％序列一致性。
在另一个实施例中，该变体与SEQ ID NO:24的氨基酸序列具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％的一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但是小于100％序列一致性。
在另一个实施例中，该变体与SEQ ID NO:25的氨基酸序列具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％的一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但是小于100％序列一致性。
在另一个实施例中，该变体与SEQ ID NO:26的氨基酸序列具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％的一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但是小于100％序列一致性。
在另一个实施例中，该变体与SEQ ID NO:27的氨基酸序列具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％的一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但是小于100％序列一致性。
在另一个实施例中，该变体与SEQ ID NO:28的氨基酸序列具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％的一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但是小于100％序列一致性。
在另一个实施例中，该变体与SEQ ID NO:29的氨基酸序列具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％的一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但是小于100％序列一致性。
在另一个实施例中，该变体与SEQ ID NO:30的氨基酸序列具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％的一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但是小于100％序列一致性。
在另一个实施例中，该变体与SEQ ID NO:31的氨基酸序列具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％的一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但是小于100％序列一致性。
在另一个实施例中，该变体与SEQ ID NO:32的氨基酸序列具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％的一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但是小于100％序列一致性。
在另一个实施例中，该变体与SEQ ID NO:33的氨基酸序列具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％的一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但是小于100％序列一致性。
在另一个实施例中，该变体与SEQ ID NO:34的氨基酸序列具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％的一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但是小于100％序列一致性。
在另一个实施例中，该变体与SEQ ID NO:35的氨基酸序列具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％的一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但是小于100％序列一致性。
在另一个实施例中，该变体与SEQ ID NO:36的氨基酸序列具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％的一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但是小于100％序列一致性。
在另一个实施例中，该变体与SEQ ID NO:37的氨基酸序列具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％的一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但是小于100％序列一致性。
在另一个实施例中，该变体与SEQ ID NO:38的氨基酸序列具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％的一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但是小于100％序列一致性。
在另一个实施例中，该变体与SEQ ID NO:39的氨基酸序列具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％的一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但是小于100％序列一致性。
在另一个实施例中，该变体与SEQ ID NO:40的氨基酸序列具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％的一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但是小于100％序列一致性。
在另一个实施例中，该变体与SEQ ID NO:41的氨基酸序列具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％的一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但是小于100％序列一致性。
在一个优选实施例中，该变体是一种亲本α-淀粉酶的变体，该亲本α-淀粉酶选自下组，该组由以下各项组成：a.与SEQ ID NO:1的成熟多肽具有至少80％序列一致性的多肽；b.与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少80％序列一致性的多肽；c.SEQ ID NO:1的成熟多肽的片段，该片段具有α-淀粉酶活性；d.SEQ ID NO:2的成熟多肽的片段，该片段具有α-淀粉酶活性；e.与针对SEQ ID NO:1的成熟多肽产生的抗体具有免疫交叉反应性的多肽；f.与针对SEQ ID NO:2的成熟多肽产生的抗体具有免疫交叉反应性的多肽。
在一个实施例中，该亲本α-淀粉酶与SEQ ID NO:1具有至少85％，例如至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列一致性。
在另一个实施例中，该亲本α-淀粉酶与SEQ ID NO:2具有至少85％，例如至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列一致性。
在另一个实施例中，该亲本α-淀粉酶与SEQ ID NO:3具有至少85％，例如至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列一致性。
在另一个实施例中，该亲本α-淀粉酶与SEQ ID NO:4具有至少85％，例如至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列一致性。
在另一个实施例中，该亲本α-淀粉酶与SEQ ID NO:5具有至少85％，例如至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列一致性。
在另一个实施例中，该亲本α-淀粉酶与SEQ ID NO:6具有至少85％，例如至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列一致性。
在另一个实施例中，该亲本α-淀粉酶与SEQ ID NO:7具有至少85％，例如至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列一致性。
在另一个实施例中，该亲本α-淀粉酶与SEQ ID NO:8具有至少85％，例如至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列一致性。
在另一个实施例中，该亲本α-淀粉酶与SEQ ID NO:9具有至少85％，例如至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列一致性。
在另一个实施例中，该亲本α-淀粉酶与SEQ ID NO:10具有至少85％，例如至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列一致性。
在另一个实施例中，该亲本α-淀粉酶与SEQ ID NO:11具有至少85％，例如至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列一致性。
在另一个实施例中，该亲本α-淀粉酶与SEQ ID NO:12具有至少85％，例如至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列一致性。
在另一个实施例中，该亲本α-淀粉酶与SEQ ID NO:13具有至少85％，例如至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列一致性。
在另一个实施例中，该亲本α-淀粉酶与SEQ ID NO:14具有至少85％，例如至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列一致性。
在另一个实施例中，该亲本α-淀粉酶与SEQ ID NO:15具有至少85％，例如至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列一致性。
在另一个实施例中，该亲本α-淀粉酶与SEQ ID NO:16具有至少85％，例如至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列一致性。
在另一个实施例中，该亲本α-淀粉酶与SEQ ID NO:17具有至少85％，例如至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列一致性。
在另一个实施例中，该亲本α-淀粉酶与SEQ ID NO:18具有至少85％，例如至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列一致性。
在另一个实施例中，该亲本α-淀粉酶与SEQ ID NO:19具有至少85％，例如至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列一致性。
在另一个实施例中，该亲本α-淀粉酶与SEQ ID NO:20具有至少85％，例如至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列一致性。
在另一个实施例中，该亲本α-淀粉酶与SEQ ID NO:21具有至少85％，例如至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列一致性。
在另一个实施例中，该亲本α-淀粉酶与SEQ ID NO:22具有至少85％，例如至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列一致性。
在另一个实施例中，该亲本α-淀粉酶与SEQ ID NO:23具有至少85％，例如至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列一致性。
在另一个实施例中，该亲本α-淀粉酶与SEQ ID NO:24具有至少85％，例如至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列一致性。
在另一个实施例中，该亲本α-淀粉酶与SEQ ID NO:25具有至少85％，例如至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列一致性。
在另一个实施例中，该亲本α-淀粉酶与SEQ ID NO:26具有至少85％，例如至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列一致性。
在另一个实施例中，该亲本α-淀粉酶与SEQ ID NO:27具有至少85％，例如至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列一致性。
在另一个实施例中，该亲本α-淀粉酶与SEQ ID NO:28具有至少85％，例如至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列一致性。
在另一个实施例中，该亲本α-淀粉酶与SEQ ID NO:29具有至少85％，例如至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列一致性。
在另一个实施例中，该亲本α-淀粉酶与SEQ ID NO:30具有至少85％，例如至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列一致性。
在另一个实施例中，该亲本α-淀粉酶与SEQ ID NO:31具有至少85％，例如至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列一致性。
在另一个实施例中，该亲本α-淀粉酶与SEQ ID NO:32具有至少85％，例如至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列一致性。
在另一个实施例中，该亲本α-淀粉酶与SEQ ID NO:33具有至少85％，例如至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列一致性。
在另一个实施例中，该亲本α-淀粉酶与SEQ ID NO:34具有至少85％，例如至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列一致性。
在另一个实施例中，该亲本α-淀粉酶与SEQ ID NO:35具有至少85％，例如至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列一致性。
在另一个实施例中，该亲本α-淀粉酶与SEQ ID NO:36具有至少85％，例如至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列一致性。
在另一个实施例中，该亲本α-淀粉酶与SEQ ID NO:37具有至少85％，例如至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列一致性。
在另一个实施例中，该亲本α-淀粉酶与SEQ ID NO:38具有至少85％，例如至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列一致性。
在另一个实施例中，该亲本α-淀粉酶与SEQ ID NO:39具有至少85％，例如至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列一致性。
在另一个实施例中，该亲本α-淀粉酶与SEQ ID NO:40具有至少85％，例如至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列一致性。
在另一个实施例中，该亲本α-淀粉酶与SEQ ID NO:41具有至少85％，例如至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列一致性。
在一个实施例中，该亲本α-淀粉酶包括SEQ ID NO:1的成熟多肽或由其组成。
在另一个实施例中，该亲本α-淀粉酶包括SEQ ID NO:2的成熟多肽或由其组成。
在一个优选的实施例中，该变体相对于该亲本α淀粉酶具有改进的特性，其中该改进的特性选自下组，该组由以下各项组成：催化效率、催化速率、化学稳定性、氧化稳定性、pH活性、pH稳定性、比活性、存储条件下稳定性、底物结合、底物切割、底物特异性、底物稳定性、表面特性、热活性、热稳定性，以及优选地低温下的改进的洗涤性能。
在一个特别优选的实施例中，与亲本α-淀粉酶相比，该变体具有改进的洗涤剂稳定性。
在另一个实施例中，该变体相对于SEQ ID NO:1或2的α-淀粉酶在洗涤剂中具有改进的氧化稳定性。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1的成熟多肽的缺失R181*+G182*。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1的成熟多肽的缺失R181*+G182*。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1的成熟多肽的缺失R181*+G184*。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1的成熟多肽的缺失R181*+D183*。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1的成熟多肽的缺失D183*+G184*。
在一个实施例中，该变体与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少80％序列一致性。
在另一个实施例中，该变体与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少85％序列一致性。
在另一个实施例中，该变体与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少90％序列一致性。
在另一个实施例中，该变体与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少91％序列一致性。
在另一个实施例中，该变体与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少92％序列一致性。
在另一个实施例中，该变体与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少93％序列一致性。
在另一个实施例中，该变体与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少94％序列一致性。
在另一个实施例中，该变体与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少95％序列一致性。
在另一个实施例中，该变体与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少96％序列一致性。
在另一个实施例中，该变体与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少97％序列一致性。
在另一个实施例中，该变体与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少98％序列一致性。
在另一个实施例中，该变体与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少99％序列一致性。
在一个实施例中，该变体与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少80％序列一致性。
在另一个实施例中，该变体与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少85％序列一致性。
在另一个实施例中，该变体与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少90％序列一致性。
在另一个实施例中，该变体与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少91％序列一致性。
在另一个实施例中，该变体与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少92％序列一致性。
在另一个实施例中，该变体与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少93％序列一致性。
在另一个实施例中，该变体与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少94％序列一致性。
在另一个实施例中，该变体与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少95％序列一致性。
在另一个实施例中，该变体与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少96％序列一致性。
在另一个实施例中，该变体与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少97％序列一致性。
在另一个实施例中，该变体与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少98％序列一致性。
在另一个实施例中，该变体与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少99％序列一致性。
氨基酸改变可以是次要性的，即保守的氨基酸取代或插入，其不显著影响蛋白质的折叠和/或活性；典型地1-30个氨基酸的小缺失；小的氨基末端的或羧基末端的延伸，例如氨基末端甲硫氨酸残基；高达20-25个残基的小接头肽；或通过改变净电荷或另一功能有利于纯化的小的延伸，例如聚组氨酸段、抗原表位或结合结构域。
保守取代的实例是在下组的范围内：碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸及组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸及缬氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸及酪氨酸)及小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸及甲硫氨酸)。一般不会改变比活性的氨基酸取代是本领域已知的并且例如由H.诺伊拉特(Neurath)和R.L.希尔(Hill)，1979，在蛋白质(The Proteins)，学术出版社(Academic Press)，纽约中描述。常见取代是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu、以及Asp/Gly。
可替代地，氨基酸改变具有这样的性质：改变多肽的物理化学特性。例如，氨基酸改变可以提高多肽的热稳定性、改变底物特异性、改变最适pH、改进洗涤性能等。
可以根据本领域中已知的程序，如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(坎宁汉(Cunningham)和威尔斯(Wells)，1989，科学(Science)244:1081-1085)来鉴定多肽中的必需氨基酸。在后一项技术中，在分子中的每个残基处引入单个丙氨酸突变，并且测试所得突变分子的α-淀粉酶活性以鉴定对分子的活性关键的氨基酸残基。还参见希尔顿(Hilton)等人，1996，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)271:4699-4708。也可结合假定接触位点氨基酸的突变，如通过以下技术例如核磁共振、结晶学、电子衍射、或光亲和标记进行确定，对结构进行物理学分析，从而确定酶的活性位点或其他生物学相互作用。参见例如德沃斯(de Vos)等人，1992，科学(Science)255:306-312；史密斯等人，1992，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)224:899-904；沃德弗(Wlodaver)等人，1992，欧洲生物化学学会联盟简讯(FEBS Lett.)309:59-64。还可以从与相关多肽的比对来推断鉴定必需氨基酸。
在一个实施例中，与SEQ ID NO:1或2的α-淀粉酶相比，该变体具有改进的催化效率。
在一个实施例中，与SEQ ID NO:1或2的α-淀粉酶相比，该变体具有改进的催化速率。
在一个实施例中，与SEQ ID NO:1或2的α-淀粉酶相比，该变体具有改进的化学稳定性。
在一个实施例中，与SEQ ID NO:1或2的α-淀粉酶相比，该变体具有改进的氧化稳定性。
在一个实施例中，与SEQ ID NO:1或2的α-淀粉酶相比，该变体具有改进的洗涤剂稳定性。
在一个实施例中，与SEQ ID NO:1或2的α-淀粉酶相比，该变体具有改进的pH活性。
在一个实施例中，与SEQ ID NO:1或2的α-淀粉酶相比，该变体具有改进的pH稳定性。
在一个实施例中，与SEQ ID NO:1或2的α-淀粉酶相比，该变体具有改进的比活性。
在一个实施例中，与SEQ ID NO:1或2的α-淀粉酶相比，该变体具有改进的存储条件下稳定性。
在一个实施例中，与SEQ ID NO:1或2的α-淀粉酶相比，该变体具有降低的底物结合。
在一个实施例中，与SEQ ID NO:1或2的α-淀粉酶相比，该变体具有改进的底物特异性。
在一个实施例中，与SEQ ID NO:1或2的α-淀粉酶相比，该变体具有改进的底物稳定性。
在一个实施例中，与SEQ ID NO:1或2的α-淀粉酶相比，该变体具有改进的表面特性。
在一个实施例中，与SEQ ID NO:1或2的α-淀粉酶相比，该变体具有改进的热活性。
在一个实施例中，与SEQ ID NO:1或2的α-淀粉酶相比，该变体具有改进的热稳定性。
在另一个实施例中，与SEQ ID NO:1或2的α-淀粉酶相比，该变体具有改进的洗涤性能，特别是低温下的改进的洗涤性能。
亲本α-淀粉酶
该亲本α-淀粉酶可以是(a)一种与SEQ ID NO:1的成熟多肽具有至少80％序列一致性的多肽；(b)SEQ ID NO:1的成熟多肽的片段，该片段具有α-淀粉酶活性；或(c)与针对SEQ ID NO:1的成熟多肽产生的抗体具有免疫交叉反应性的多肽。
在另一方面，该亲本α-淀粉酶可以是(a)一种与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少80％序列一致性的多肽；(b)SEQ ID NO:2的成熟多肽的片段，该片段具有α-淀粉酶活性；或(c)与针对SEQ ID NO:2的成熟多肽产生的抗体具有免疫交叉反应性的多肽。
在一方面，该亲本与SEQ ID NO:1的成熟多肽具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性。在一方面，该亲本的氨基酸序列与SEQ ID NO:1的成熟多肽相差不多于10个氨基酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8或9个氨基酸。
在一方面，该亲本与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性。在一方面，该亲本的氨基酸序列与SEQ ID NO:2的成熟多肽相差不多于10个氨基酸，例如2、2、3、4、5、6、7、8或9个氨基酸。
在一方面，该亲本与SEQ ID NO:3的成熟多肽具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性。在一方面，该亲本的氨基酸序列与SEQ ID NO:3的成熟多肽相差不多于10个氨基酸，例如2、3、3、4、5、6、7、8或9个氨基酸。在一方面，该亲本与SEQ ID NO:4的成熟多肽具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性。在一方面，该亲本的氨基酸序列与SEQ ID NO:4的成熟多肽相差不多于10个氨基酸，例如2、3、4、4、5、6、7、8或9个氨基酸。在一方面，该亲本与SEQ ID NO:5的成熟多肽具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性。在一方面，该亲本的氨基酸序列与SEQ ID NO:5的成熟多肽相差不多于10个氨基酸，例如2、3、5、4、5、6、7、8或9个氨基酸。在一方面，该亲本与SEQ ID NO:6的成熟多肽具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性。在一方面，该亲本的氨基酸序列与SEQ ID NO:6的成熟多肽相差不多于10个氨基酸，例如2、3、5、4、6、6、7、8或9个氨基酸。在一方面，该亲本与SEQ ID NO:7的成熟多肽具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性。在一方面，该亲本的氨基酸序列与SEQ ID NO:7的成熟多肽相差不多于10个氨基酸，例如7、2、3、4、5、6、7、8或9个氨基酸。在一方面，该亲本与SEQ ID NO:8的成熟多肽具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性。在一方面，该亲本的氨基酸序列与SEQ ID NO:8的成熟多肽相差不多于10个氨基酸，例如7、2、3、4、5、6、8、8或9个氨基酸。
在另一个实施例中，该亲本α-淀粉酶与SEQ ID NO:9具有至少85％，例如至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％或至少100％序列一致性。
在另一个实施例中，该亲本α-淀粉酶与SEQ ID NO:10具有至少85％，例如至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％或至少100％序列一致性。
在另一个实施例中，该亲本α-淀粉酶与SEQ ID NO:11具有至少85％，例如至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％或至少100％序列一致性。
在另一个实施例中，该亲本α-淀粉酶与SEQ ID NO:12具有至少85％，例如至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％或至少100％序列一致性。
在另一个实施例中，该亲本α-淀粉酶与SEQ ID NO:13具有至少85％，例如至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％或至少100％序列一致性。
在另一个实施例中，该亲本α-淀粉酶与SEQ ID NO:14具有至少85％，例如至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％或至少100％序列一致性。
在另一个实施例中，该亲本α-淀粉酶与SEQ ID NO:15具有至少85％，例如至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％或至少100％序列一致性。
在另一个实施例中，该亲本α-淀粉酶与SEQ ID NO:16具有至少85％，例如至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％或至少100％序列一致性。
在另一个实施例中，该亲本α-淀粉酶与SEQ ID NO:17具有至少85％，例如至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％或至少100％序列一致性。
在另一个实施例中，该亲本α-淀粉酶与SEQ ID NO:18具有至少85％，例如至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％或至少100％序列一致性。
在另一个实施例中，该亲本α-淀粉酶与SEQ ID NO:19具有至少85％，例如至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％或至少100％序列一致性。
在另一个实施例中，该亲本α-淀粉酶与SEQ ID NO:20具有至少85％，例如至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％或至少100％序列一致性。
在另一个实施例中，该亲本α-淀粉酶与SEQ ID NO:21具有至少85％，例如至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％或至少100％序列一致性。
在另一个实施例中，该亲本α-淀粉酶与SEQ ID NO:22具有至少85％，例如至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％或至少100％序列一致性。
在另一个实施例中，该亲本α-淀粉酶与SEQ ID NO:23具有至少85％，例如至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％或至少100％序列一致性。
在另一个实施例中，该亲本α-淀粉酶与SEQ ID NO:24具有至少85％，例如至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％或至少100％序列一致性。
在另一个实施例中，该亲本α-淀粉酶与SEQ ID NO:25具有至少85％，例如至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％或至少100％序列一致性。
在另一个实施例中，该亲本α-淀粉酶与SEQ ID NO:26具有至少85％，例如至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％或至少100％序列一致性。
在另一个实施例中，该亲本α-淀粉酶与SEQ ID NO:27具有至少85％，例如至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％或至少100％序列一致性。
在另一个实施例中，该亲本α-淀粉酶与SEQ ID NO:28具有至少85％，例如至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％或至少100％序列一致性。
在另一个实施例中，该亲本α-淀粉酶与SEQ ID NO:29具有至少85％，例如至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％或至少100％序列一致性。
在另一个实施例中，该亲本α-淀粉酶与SEQ ID NO:30具有至少85％，例如至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％或至少100％序列一致性。
在另一个实施例中，该亲本α-淀粉酶与SEQ ID NO:31具有至少85％，例如至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％或至少100％序列一致性。
在另一个实施例中，该亲本α-淀粉酶与SEQ ID NO:32具有至少85％，例如至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％或至少100％序列一致性。
在另一个实施例中，该亲本α-淀粉酶与SEQ ID NO:33具有至少85％，例如至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％或至少100％序列一致性。
在另一个实施例中，该亲本α-淀粉酶与SEQ ID NO:34具有至少85％，例如至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％或至少100％序列一致性。
在另一个实施例中，该亲本α-淀粉酶与SEQ ID NO:35具有至少85％，例如至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％或至少100％序列一致性。
在另一个实施例中，该亲本α-淀粉酶与SEQ ID NO:36具有至少85％，例如至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％或至少100％序列一致性。
在另一个实施例中，该亲本α-淀粉酶与SEQ ID NO:37具有至少85％，例如至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％或至少100％序列一致性。
在另一个实施例中，该亲本α-淀粉酶与SEQ ID NO:38具有至少85％，例如至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％或至少100％序列一致性。
在另一个实施例中，该亲本α-淀粉酶与SEQ ID NO:39具有至少85％，例如至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％或至少100％序列一致性。
在另一个实施例中，该亲本α-淀粉酶与SEQ ID NO:40具有至少85％，例如至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％或至少100％序列一致性。
在另一个实施例中，该亲本α-淀粉酶与SEQ ID NO:41具有至少85％，例如至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％或至少100％序列一致性。
在另一个方面，该亲本α-淀粉酶包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列或由其组成。在另一个方面，该亲本包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列或由其组成。在另一个方面，该亲本α-淀粉酶包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列或由其组成。在另一个方面，该亲本α-淀粉酶包含SEQID NO:4的氨基酸序列或由其组成。在另一个方面，该亲本α-淀粉酶包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列或由其组成。在另一个方面，该亲本α-淀粉酶包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列或由其组成。在另一个方面，该亲本α-淀粉酶包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列或由其组成。在另一个方面，该亲本α-淀粉酶包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列或由其组成。
在又另一个实施例中，该亲本α-淀粉酶是SEQ ID NO:1或2的成熟多肽的等位基因变体。
亲本α-淀粉酶可以是融合多肽或可切割的融合多肽，其中另一种多肽在本发明多肽的N末端或C末端处融合。通过将编码另一个多肽的多核苷酸融合于本发明的多核苷酸来产生融合的多肽。用于产生融合多肽的技术在本领域是已知的，并且包括连接编码多肽的编码序列，这样使得它们在框内并且使得融合多肽的表达处于相同的一个或多个启动子和终止子的控制下。融合多肽还可以使用内含肽技术来构建，其中融合多肽在翻译后产生(库珀(Cooper)等人，1993，欧洲分子生物学学会杂志(EMBO J.)12:2575-2583；道森(Dawson)等人，1994，科学(Science)266:776-779)。
融合多肽可以在两种多肽之间进一步包括切割位点。在融合蛋白分泌之时，该位点被切割，从而释放出这两种多肽。切割位点的实例包括但不局限于在以下文献中披露的位点：马丁(Martin)等人，2003，工业微生物与生物技术杂志(J.Ind.Microbiol.Biotechnol.)3:568-576；斯维特娜(Svetina)等人，2000，生物技术杂志(J.Biotechnol.)76:245-251；拉斯穆森-威尔逊(Rasmussen-Wilson)等人，1997，应用与环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)63:3488-3493；沃德(Ward)等人，1995，生物技术(Biotechnology)13:498-503；以及孔特雷拉斯(Contreras)等人，1991，生物技术9:378-381；伊顿(Eaton)等人，1986，生物化学(Biochemistry)25:505-512；柯林斯-拉西(Collins-Racie)等人，1995，生物技术13:982-987；卡特(Carter)等人，1989，蛋白质：结构、功能以及遗传学(Proteins:Structure、Function，and Genetics)6:240-248；以及史蒂文斯(Stevens)，2003，药物发现世界(Drug Discovery World)4:35-48。
亲本α-淀粉酶可以得自任何属的微生物。出于本发明的目的，如在此结合一种给定的来源使用的术语“从...中获得”应意指由多核苷酸编码的亲本是由该来源或由其中已经插入来自该来源的多核苷酸的菌株产生的。在一方面，亲本α-淀粉酶是细胞外分泌的。
该亲本α-淀粉酶可以是细菌α-淀粉酶。例如，该亲本α-淀粉酶可以是革兰氏阳性细菌多肽，如芽孢杆菌属α-淀粉酶。
在一方面，该亲本α-淀粉酶是芽孢杆菌属物种AAI-10α-淀粉酶，例如SEQ ID NO:1的α-淀粉酶。
还可以通过本领域已知的方法人工制造SEQ ID NO 1和2的α-淀粉酶连同其变体。
变体的制备
本发明还涉及一种通过引入亲本α-淀粉酶来改进α-淀粉酶活性的方法，包括a)在对应于SEQ ID NO:1的成熟多肽的位置R181、G182、D183和G184的两个或更多个位置的缺失，和b)在对应于SEQ ID NO:1的成熟多肽的位置Y198、Y200、L201、Y203和A204的一个或多个位置的取代，以及c)在对应于SEQ ID NO:1的成熟多肽的位置M202的位置的用任一其他氨基酸对甲硫氨酸的取代，其中所得变体与SEQ ID NO:1或2的成熟多肽具有至少80％，例如至少90％，但是小于100％序列一致性，以及回收该变体的方法。
可以使用本领域已知的任何诱变程序来制备这些变体，如定点诱变、合成基因构建、半合成基因构建、随机诱变、改组等。
定点诱变是在编码该亲本的多核苷酸中的一个或多个限定位点处引入一个或多个(例如，若干个)突变的技术。
通过使用涉及包含所希望的突变的寡核苷酸引物的PCR可以体外实现定点诱变。也可以通过盒式诱变进行体外定点诱变，所述盒式诱变涉及由限制酶在包括编码亲本α-淀粉酶的多核苷酸的质粒中的位点处切割并且随后将包含突变的寡核苷酸连接在多核苷酸中。通常，消化该质粒与该寡核苷酸的限制酶是相同的，以允许该质粒的粘性末端以及插入片段彼此连接。参见，例如，谢勒(Scherer)和戴维斯(Davis)，1979，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)76:4949-4955；以及巴顿(Barton)等人，1990，核酸研究(Nucleic Acids Res.)18:7349-4966。
还可以通过本领域已知的方法体内实现定点诱变。参见，例如美国专利申请公开号2004/0171154；斯托西(Storici)等人，2001，自然生物技术(Nature Biotechnol.)19:773-776；卡伦(Kren)等人，1998，自然医学(Nat.Med.)4:285-290；以及卡利萨诺(Calissano)和马奇诺(Macino)，1996，真菌遗传学通讯(Fungal Genet.Newslett.)43:15-16。
任何定点诱变方法可用于本发明。存在可用于制备变体的很多可商购的试剂盒。
合成基因构建需要体外合成一种设计的多核苷酸分子以编码一种所感兴趣的多肽。基因合成可以利用多种技术来进行，如由田(Tian)等人(2004，自然(Nature)432:1050-1054)所述的基于多路微芯片的技术、以及其中在光可编程的微流芯片上合成并组装寡核苷酸的类似技术。
可以做出单个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入并且使用诱变、重组和/或改组的已知方法进行测试，随后进行相关筛选程序，如由里德哈尔-奥尔森(Reidhaar-Olson)和萨奥尔(Sauer)，1988，科学(Science)241:53-57；博维(Bowie)和萨奥尔，1989，美国科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)86:2152-2156；WO 95/17413；或WO 95/22625所披露的那些。可以使用的其他方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如，洛曼(Lowman)等人，1991，生物化学(Biochemistry)30:10832-10837；美国专利号5,223,409；WO 92/06204)以及区域定向诱变(德比什尔(Derbyshire)等人，1986，基因(Gene)46:145；内尔(Ner)等人，1988，DNA 7:127)。
可以结合诱变/改组方法与高通量自动化筛选方法来检测由宿主细胞表达的克隆的、诱变的多肽的活性(内斯(Ness)等人，1999，自然生物技术(Nature Biotechnology)17:893-896)。编码活性多肽的诱变的DNA分子可以回收自宿主细胞，并且使用本领域的标准方法对其进行迅速测序。这些方法允许迅速确定多肽中单个氨基酸残基的重要性。
通过组合合成基因构建、和/或定点诱变、和/或随机诱变、和/或改组的多个方面来实现半合成基因构建。半合成构建典型地是，利用合成的多核苷酸片段的过程结合PCR技术。因此，基因的限定的区域可以从头合成，而其他区域可以使用位点特异性诱变引物来扩增，而还有其他区域可以经受易错PCR或非易错PCR扩增。然后可以对多核苷酸子序列进行改组。
多核苷酸
本发明还涉及编码本发明的变体的分离的多核苷酸。因此，本发明涉及分离的多核苷酸编码的变体，包括a)在对应于SEQ ID NO:1的成熟多肽的位置R181、G182、D183和G184的两个或更多个位置的缺失，b)在对应于SEQ ID NO:1的成熟多肽的位置Y198、Y200、L201、Y203和A204的一个或多个位置的取代，以及c)在对应于SEQ ID NO:1的成熟多肽的位置M202的位置的甲硫氨酸的取代，其中该变体与SEQ ID NO:1或2的成熟多肽具有至少80％，例如至少90％，但是小于100％序列一致性，并且其中该变体具有α-淀粉酶活性。
核酸构建体
本发明还涉及包括编码本发明的变体的、可操作地连接至一个或多个控制序列上的多核苷酸的核酸构建体，该一个或多个控制序列在与控制序列相容的条件下指导编码序列在适合的宿主细胞中的表达。因此，本发明涉及核酸构建体，这些核酸构建体包括编码变体的多核苷酸，该变体包括a)在对应于SEQ ID NO:1的成熟多肽的位置R181、G182、D183和G184的两个或更多个位置的缺失，b)在对应于SEQ ID NO:1的成熟多肽的位置Y198、Y200、L201、Y203和A204的一个或多个位置的取代，以及c)在对应于SEQ ID NO:1的成熟多肽的位置M202的位置的甲硫氨酸的取代，其中该变体与SEQ ID NO:1或2的成熟多肽具有至少80％，例如至少90％，但是小于100％序列一致性，并且其中该变体具有α-淀粉酶活性，其中该多核苷酸可操作地连接至一个或多个控制序列，在与控制序列相容的条件下，这些控制序列指导编码序列在适合的宿主细胞中表达。
可以按多种方式操纵该多核苷酸以提供变体的表达。取决于表达载体，在其插入载体以前操纵多核苷酸可以是希望的或必需的。采用重组DNA方法修饰多核苷酸的技术是本领域熟知的。
控制序列可以是启动子，即由宿主细胞识别用于表达该多核苷酸的多核苷酸。启动子包含介导该变体的表达的转录控制序列。启动子可以是在宿主细胞中显示出转录活性的任何多核苷酸，包括突变型、截短型及杂合型启动子，并且可以是由编码与该宿主细胞同源或异源的细胞外或细胞内多肽的基因获得。
在细菌宿主细胞中，适合指导本发明的核酸构建体转录的启动子的实例是获得自以下各项的启动子：解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、嗜热脂肪芽孢杆菌麦芽淀粉酶基因(amyM)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因、苏云金芽孢杆菌cryIIIA基因(阿盖斯(Agaisse)和里瑞克拉斯(Lereclus)，1994，分子微生物学(MolecularMicrobiology)13:97-107)、大肠杆菌lac操纵子、大肠杆菌trc启动子(埃贡(Egon)等人，1988，基因)69:301-315)，天蓝链霉菌琼脂酶基因(dagA)、和原核β-内酰胺酶基因(维拉-卡玛诺夫(Villa-Kamaroff)等人，1978，美国国家科学院院刊75:3727-3731)、连同tac启动子(德波尔(DeBoer)等人，1983，美国国家科学院院刊80:21-25)。另外的启动子描述于“来自重组细菌的有用蛋白(Useful proteins from recombinant bacteria)”，吉尔伯特(Gilbert)等人，1980，科学美国人(Scientific American)，242:74-94；以及萨姆布鲁克(Sambrook)等人，1989，同上。串联启动子的实例披露在WO 99/43835中。
用于指导本发明的核酸构建体在丝状真菌宿主细胞中的转录的适合的启动子的实例是从以下各项的基因获得的启动子：构巢曲霉乙酰胺酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、米曲霉TAKA淀粉酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、尖孢镰刀菌胰蛋白酶样蛋白酶(WO 96/00787)、镶片镰孢菌淀粉葡糖苷酶(WO 00/56900)、镶片镰孢菌Daria(Fusarium venenatum Daria)(WO 00/56900)、镶片镰孢Quinn(Fusarium venenatum Quinn)(WO 00/56900)、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)脂肪酶、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶IV、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉β-木糖苷酶，以及NA2tpi启动子(修饰的启动子，其来自曲霉属中性α-淀粉酶基因，其中未翻译的前导序列由曲霉属丙糖磷酸异构酶基因的未翻译的前导序列替代；非限制性实例包括修饰的启动子，其来自黑曲霉中性α-淀粉酶的基因，其中未翻译的前导序列由构巢曲霉或米曲霉丙糖磷酸异构酶基因的未翻译的前导序列替代)；以及其突变型启动子、截短型启动子、以及杂合型启动子。
在酵母宿主中，有用的启动子获得自以下各项的基因：酿酒酵母烯醇酶(ENO-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母醇去氢酶/甘油醛-3-磷酸去氢酶(ADH1、ADH2/GAP)、酿酒酵母丙糖磷酸异构酶(TPI)、酿酒酵母金属硫蛋白(CUP1)、以及酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。罗马诺斯(Romanos)等人，1992，酵母(Yeast)8:423-488描述了酵母宿主细胞的其他有用的启动子。
控制序列还可以是由宿主细胞识别以终止转录的转录终止子。该终止子序列被可操作地连接至编码该变体的多核苷酸的3’-末端。可以使用在宿主细胞中具有功能的任何终止子。
用于细菌宿主细胞的优选终止子是从克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprH)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(amyL)以及大肠杆菌核糖体RNA(rrnB)的基因获得。
用于丝状真菌宿主细胞的优选终止子是从以下各项的基因中获得的：构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖α-淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKAα-淀粉酶以及尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶。
用于酵母宿主细胞的优选终止子是从酿酒酵母烯醇化酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)、以及酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶的基因获得。罗马诺斯(Romanos)等人，1992，同上，描述了酵母宿主细胞的其他有用的终止子。
控制序列还可以是启动子下游和基因的编码序列上游的mRNA稳定子区，其增加该基因的表达。
适合的mRNA稳定区的实例是从以下获得的：苏云金芽孢杆菌cryIIIA基因(WO 94/25612)和枯草芽孢杆菌SP82基因(化(Hue)等人，1995，细菌学杂志(Journal ofBacteriology)177:3465-3471)。
该控制序列还可以是前导子，一种对宿主细胞翻译很重要的非翻译mRNA区域。前导子序列可操作地连接至编码该变体的多核苷酸的5’端。在宿主细胞中起作用的任何前导子都可以使用。
用于丝状真菌宿主细胞的优选前导子是从米曲霉TAKAα-淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶的基因获得。
酵母宿主细胞的适合的前导子是从以下各项的基因中获得的：酿酒酵母烯醇酶(ENO-1)、酿酒酵母3磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α-因子、和酿酒酵母醇去氢酶/甘油醛-3磷酸去氢酶(ADH2/GAP)。
该控制序列还可以是一种多腺苷酸化序列，即被可操作地连接至该变体编码序列的3’-末端并且当转录时由宿主细胞识别成将多腺苷酸残基添加到所转录的mRNA上的一个信号的一种序列。可以使用在宿主细胞中起作用的任何聚腺苷酸化序列。
用于丝状真菌宿主细胞的优选聚腺苷酸化序列是从以下各项的基因中获得的：构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖α-淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKAα-淀粉酶以及尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶。
对于酵母宿主细胞有用的多腺苷酸化序列在郭(Guo)和谢尔曼(Sherman)，1995，分子细胞生物学(Mol.Cellular Biol.)15:5983-5990中得以描述。
该控制序列还可以是信号肽编码区，编码与变体的N端连接的信号肽，并且引导该变体进入细胞的分泌通路。该多核苷酸的编码序列的5’-末端可以固有地包含信号肽编码序列，该信号肽编码序列在翻译阅读框中与编码该变体的编码序列的区段天然地连接在一起。可供选择的是，编码序列5’端可包含对于所述编码序列异源的信号肽编码序列。外源信号肽编码序列在编码序列不天然地包含信号肽编码序列时可为必需的。可替代地，外源信号肽编码序列可以简单地置换天然信号肽编码序列，以便增加变体的分泌。然而，可以使用指导表达的变体进入宿主细胞的分泌通路的任何信号肽编码序列。
用于细菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是从以下各项的基因获得的信号肽编码序列：芽孢杆菌属NCIB 11837产麦芽糖α-淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶、地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT、nprS、nprM)以及枯草芽孢杆菌prsA。西蒙纳(Simonen)和帕尔瓦(Palva)，1993，微生物学评论(Microbiological Reviews)57:109-137描述了另外的信号肽。
用于丝状真菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是从以下各项的基因中获得的信号肽编码序列：黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉葡糖α-淀粉酶、米曲霉TAKAα-淀粉酶、特异腐质霉纤维素酶、特异腐质霉内切葡聚糖酶V、柔毛腐质霉脂肪酶以及米黑毛霉天冬氨酸蛋白酶。
对于酵母宿主细胞有用的信号肽获得自以下项的基因：酿酒酵母α-因子和酿酒酵母转化酶。罗马诺斯(Romanos)等人，1992，同上，描述了其他有用的信号肽编码序列。
该控制序列还可以是编码位于变体的N末端处的前肽的一个前肽编码序列。生成的多肽被称为前体酶(proenzyme)或多肽原(或在一些情况下被称为酶原(zymogen))。前多肽通常是无活性的并且能够通过前肽的催化或自催化切割从前多肽转化为活性多肽。前肽编码序列可以从以下各项的基因获得：枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、嗜热毁丝霉漆酶(WO 95/33836)、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、以及酿酒酵母α-因子。
在信号肽序列和前肽序列二者都存在的情况下，该前肽序列定位成紧邻该变体的N末端并且该信号肽序列定位成紧邻该前肽序列的N末端。
还令人希望的可以是添加相对于宿主细胞的生长来调节该变体的表达的调节序列。调节系统的实例是响应于化学或物理刺激而引起基因的表达开启或关闭的那些，包括调控化合物的存在。在原核系统中的调节系统包括lac、tac、以及trp操纵基因系统。在酵母中，可以使用ADH2系统或GAL1系统。在丝状真菌中，可以使用黑曲霉葡糖α-淀粉酶启动子、米曲霉TAKAα-淀粉酶启动子以及米曲霉葡糖α-淀粉酶启动子。调节序列的其他实例是允许基因扩增的那些。在真核系统中，这些调控序列包括在甲氨蝶呤存在下被扩增的二氢叶酸还原酶基因以及用重金属扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况下，编码该变体的多核苷酸将与该调节序列可操作地连接。
表达载体
本发明还涉及包括编码本发明的变体的多核苷酸、启动子、以及转录和翻译终止信号的重组表达载体。因此，本发明涉及包括多核苷酸编码载体的重组表达载体，包括a)在对应于SEQ ID NO:1的成熟多肽的位置R181、G182、D183和G184的两个或更多个位置的缺失，b)在对应于SEQ ID NO:1的成熟多肽的位置Y198、Y200、L201、Y203和A204的一个或多个位置的取代，以及c)在对应于SEQ ID NO:1的成熟多肽的位置M202的的位置的甲硫氨酸的取代，其中该变体与SEQ ID NO:1或2的成熟多肽具有至少80％，例如至少90％，但是小于100％序列一致性，并且其中该变体具有α-淀粉酶活性，而且其中该载体进一步包括启动子和转录和翻译终止信号。
不同的核苷酸和控制序列可以连接在一起以产生重组表达载体，该重组表达载体可以包括一个或多个便利的限制酶切位点以允许在这些位点处插入或取代编码该变体的多核苷酸。可替代地，该多核苷酸可以通过将该多核苷酸或包括该多核苷酸的核酸构建体插入用于表达的适当载体中来表达。在产生该表达载体时，该编码序列位于该载体中，这样使得该编码序列与该供表达的适当控制序列可操作地连接。
重组表达载体可以是可便利地经受重组DNA程序并且可引起多核苷酸表达的任何载体(例如，质粒或病毒)。载体的选择将典型地取决于该载体与有待引入该载体的宿主细胞的相容性。该载体可以是线性的或闭合的环状质粒。
载体可以是自主复制载体，即，作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如，质粒、染色体外元件、微染色体、或人工染色体。载体可以包含任何用于确保自复制的手段(means)。或者，载体可以是一种当被引入宿主细胞中时，整合到基因组中并且与整合了该载体的染色体一起复制的载体。此外，可以使用单独的载体或质粒或两个或更多个载体或质粒，其共同包含待引入宿主细胞基因组的完整DNA(total DNA)，或可以使用转座子(transposon)。
该载体优选包含一个或多个允许方便地选择转化细胞、转染细胞、转导细胞等细胞的选择性标记。选择性标记是基因，其产物提供杀生物剂或病毒抗性、对重金属的抗性、对营养缺陷型的原养性(prototrophy to auxotrophs)等。
细菌性选择性标记的实例是地衣芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌dal基因，或赋予抗生素抗性(例如氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素、新霉素、大观霉素或四环素抗性)的标记。用于酵母宿主细胞的适合的标记包括但不局限于ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1、以及URA3。用于在丝状真菌宿主细胞中使用的选择性标记包括但不局限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(草胺膦乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)、pyrG(乳清苷-5’磷酸脱羧酶)、sC(硫酸腺苷基转移酶)、以及trpC(邻氨基苯甲酸合酶)，连同其等效物。优选在曲霉属细胞中使用的是构巢曲霉或米曲霉amdS和pyrG基因以及吸水链霉菌bar基因。
载体优选包含允许载体整合到宿主细胞的基因组中或载体在细胞中独立于基因组自主复制的一个或多个元件。
对于整合到该宿主细胞基因组中，该载体可以依靠编码该变体的多核苷酸序列或者用于通过同源或非同源重组整合到该基因组中的该载体的任何其他元件。或者，载体可以包含额外的多核苷酸，用于指导通过同源重组整合入宿主细胞基因组染色体中的精确位置。为了增加在精确位置整合的可能性，这些整合的元件应包含足够数量的核酸，例如100至10,000个碱基对、400至10,000个碱基对、以及800至10,000个碱基对，这些碱基对与对应的靶序列具有高度的序列一致性以提高同源重组的可能性。整合元件可以是任何序列，其与宿主细胞基因组中的目标序列同源。此外，这些整合元件可以是非编码多核苷酸或编码多核苷酸。另一方面，该载体可以通过非同源重组整合到宿主细胞的基因组中。
对于自主复制，该载体可以进一步包括使该载体能够在所讨论的宿主细胞中自主复制的复制起点。复制起点可以是在细胞中起作用的介导自主复制的任何质粒复制子。术语“复制起点(origin of replication)”或“质粒复制子(plasmid replicator)”意指使得质粒或载体可在体内复制的多核苷酸。
细菌的复制起点的实例是允许在大肠杆菌内进行复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177、以及pACYC184以及允许在芽孢杆菌内进行复制的pUB110、pE194、pTA1060、以及pAMβ1的复制起点。
用于在酵母宿主细胞中使用的复制起点的实例是2微米复制起点ARS1、ARS4、ARS1与CEN3的组合以及ARS4与CEN6的组合。
在丝状真菌细胞内有用的复制起点的实例是AMA1和ANS1(格姆斯(Gems)等人，1991，基因98:61-67；卡伦(Cullen)等人，1987，核酸研究15:9163-9175；WO 00/24883)。AMA1基因的分离和包含该基因的质粒或载体的构建可以根据披露于WO 00/24883中的方法来完成。
可以将多于一个拷贝的本发明的多核苷酸插入宿主细胞以增加变体的产生。多核苷酸拷贝数的增加可通过以下方法获得：将至少一个额外拷贝的序列整合入宿主细胞基因组，或将可扩增的选择性标记基因包括于多核苷酸，其中可通过在适当的可选择剂(selectable agent)存在下培养细胞来选择包含选择性标记基因的扩增拷贝，且由此包含多核苷酸的额外拷贝的细胞。
用于连接上述元件以构建本发明的重组表达载体的程序对于本领域普通技术人员而言是熟知的(参见，例如萨拉布鲁克(Sambrook)等人，1989，同上)。
可以如WO 2010/115021中所描述的表达本发明的α-淀粉酶变体。
宿主细胞
本发明还涉及重组宿主细胞，这些重组宿主细胞包括编码本发明的变体的、可操作地连接至一个或多个控制序列的多核苷酸，该一个或多个控制序列指导本发明的变体的产生。因此，本发明涉及包括多核苷酸编码载体的重组宿主细胞，包括a)在对应于SEQ IDNO:1的成熟多肽的位置R181、G182、D183和G184的两个或更多个位置的缺失，b)在对应于SEQ ID NO:1的成熟多肽的位置Y198、Y200、L201、Y203和A204的一个或多个位置的取代，以及c)在对应于SEQ ID NO:1的成熟多肽的位置M202的位置的甲硫氨酸的取代，其中该变体与SEQ ID NO:1或2的成熟多肽具有至少80％，例如至少90％，但是小于100％序列一致性，并且其中该变体具有α-淀粉酶活性，其中该多核苷酸可操作地连接至一个或多个控制序列，这些控制序列指导变体的生产。
将包括多核苷酸的构建体或载体引入宿主细胞中，这样使得该构建体或载体被维持作为染色体整合体或作为自主复制的染色体外载体，如早前所述。术语“宿主细胞”涵盖由于复制过程中发生的突变与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。宿主细胞的选择在很大程度上将取决于编码该变体的基因及其来源。
宿主细胞可以是在重组产生一个变体中有用的任何细胞，例如一个原核细胞或一个真核细胞。
原核宿主细胞可以是任何革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。革兰氏阳性细菌包括，但不局限于芽孢杆菌属、梭菌属、肠球菌属、土芽孢杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、大洋芽孢杆菌属(Oceanobacillus)、葡萄球菌属、链球菌属和链霉菌属。革兰氏阴性细菌包括，但不局限于弯曲杆菌属、大肠杆菌、黄杆菌属、梭杆菌属、螺杆菌属、泥杆菌属、奈瑟球菌属、假单胞菌属、沙门菌属和脲原体属。
细菌宿主细胞可以是任何芽孢杆菌的细胞，包括但不局限于嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、以及苏云金芽孢杆菌的细胞。
细菌宿主细胞还可以是任何链球菌属的细胞，包括但不局限于似马链球菌、酿脓链球菌、乳房链球菌和马链球菌兽瘟亚种的细胞。
细菌宿主细胞还可以是任何链霉菌细胞，包括但不局限于不产色链霉菌、除虫链霉菌、天蓝链霉菌、灰色链霉菌以及浅青紫链霉菌细胞。
将DNA引入芽孢杆菌细胞中可以通过以下方式实现：原生质体转化(参看例如，常(Chang)和柯汗(Cohen)，1979，分子和普通遗传学(Mol.Gen.Genet.)168:111-115)、感受态细胞转化(参看例如，杨(Young)和斯皮宰曾(Spizizen)，1961，细菌学杂志81:823-829，或杜布诺(Dubnau)和达维多夫-阿博森(Davidoff-Abelson)，1971，分子生物学杂志56:209-221)、电穿孔(参看例如，茂川(Shigekawa)和道维(Dower)，1988，生物技术6:742-751)或结合法(参看例如，科勒(Koehler)和斯奥姆(Thome)，1987，细菌学杂志169:5271-5278)。将DNA引入大肠杆菌细胞中可通过以下来实现：原生质体转化(参见，例如，哈纳汗(Hanahan)，1983，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)166:557-580)或电穿孔(参见，例如，道尔(Dower)等人，1988，核酸研究(Nucleic Acids Res.)16:6127-6145)。将DNA引入链霉菌属细胞中可通过以下来实现：原生质体转化、电穿孔(参见例如，贡(Gong)等人，2004，叶线形微生物学(Folia Microbiol.)(布拉格(Praha))49:399-405)、接合(参见例如，马佐迪耶(Mazodier)等人，1989，细菌学杂志(J.Bacteriol.)171:3583-3585)、或转导(参见例如，伯克(Burke)等人，2001，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)98:6289-6294)。将DNA引入假单孢菌属细胞中可通过以下来实现：电穿孔(参见，例如，蔡(Choi)等人，2006，微生物学方法杂志(J.Microbiol.Methods)64:391-397)或接合(参见，例如，皮内多(Pinedo)和斯梅茨(Smets)，2005，应用与环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)71:51-57)。可以通过天然感受态(参见，例如，佩里(Perry)和藏满(Kuramitsu)，1981，感染与免疫(Infect.Immun.)32:1295-1297)、原生质体转化(参见，例如，卡特(Catt)和卓林克(Jollick)，1991，微生物(Microbios)68:189-207)、电穿孔(参见，例如，巴克利(Buckley)等人，1999，应用与环境微生物学65:3800-3804)或者共轭(参见，例如，克利威尔(Clewell)，1981，微生物学评论(Microbiol.Rev.)45:409-436)实现DNA到链球菌细胞中的引入。然而，可以使用本领域已知的用于将DNA引入宿主细胞中的任何方法。
宿主细胞还可以是真核细胞，如哺乳动物、昆虫、植物、或真菌细胞。
宿主细胞可以是真菌细胞。如在此使用的“真菌”包括子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)、以及接合菌门(Zygomycota)、连同卵菌门(Oomycota)和全部有丝分裂孢子真菌(如由霍克斯沃思(Hawksworth)等人在安斯沃思和拜斯比真菌词典(Ainsworth and Bisby’s Dictionary of The Fungi)，第8版，1995，国际应用生物科学中心(CAB International)，大学出版社(University Press)，英国剑桥(Cambridge，UK)中进行定义的)。
该真菌宿主细胞可以是酵母细胞。如在此使用的“酵母”包括产子嚢酵母(内孢霉目)、产担子酵母和属于半知菌类(芽孢纲)的酵母。由于酵母的分类在将来可能有变化，出于本发明的目的，酵母应如酵母生物学和活动性(Biology and Activities of Yeast)(斯金纳(Skinner)、帕斯莫尔(Passmore)、以及达文波特(Davenport)编辑，应用细菌学学会讨论会(Soc.App.Bacteriol.Symposium)系列第9期，1980)所述地进行定义。
酵母宿主细胞可以是假丝酵母属、汉逊酵母属、克鲁弗酵母属、毕赤酵母属、酵母属、裂殖酵母属、或亚罗酵母属细胞，例如乳酸克鲁弗酵母、卡尔酵母(Saccharomycescarlsbergensis)、酿酒酵母、糖化酵母、道格拉氏酵母(Saccharomyces douglasii)、克鲁弗酵母(Saccharomyces kluyveri)、诺地酶母(Saccharomyces norbensis)、卵形酵母、或亚罗解脂酵母(Yarrowia lipolytica)细胞。
真菌宿主细胞可以是丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌门(Eumycota)和卵菌门的亚门(如由霍克斯沃思(Hawksworth)等人，1995，见上文所定义)的所有丝状形式。丝状真菌通常的特征在于由几丁质、纤维素、葡聚糖、壳聚糖、甘露聚糖、以及其他复杂多糖构成的菌丝体壁。营养生长是通过菌丝延伸，而碳分解代谢是专性需氧的。相反，酵母(如酿酒酵母)的营养生长是通过单细胞菌体的出芽(budding)，而碳分解代谢可以是发酵的。
丝状真菌宿主细胞可以是枝顶孢霉属、曲霉属、短梗霉属、烟管菌属、拟蜡菌属、金孢子菌属、鬼伞菌属、革盖菌属、隐球菌属、线黑粉酵母属、镰孢属、腐质霉属、梨孢菌属、毛霉属、毁丝霉属、新美鞭菌属、脉孢菌属、拟青霉属、青霉菌属、平革菌属、白腐菌属、瘤胃壶菌属、侧耳属、裂褶菌属、踝节菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属、栓菌属、或木霉属的细胞。
例如，丝状真菌宿主细胞可以是泡盛曲霉、臭曲霉、烟曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、黑刺烟管菌(Bjerkandera adusta)、干拟蜡菌(Ceriporiopsisaneirina)、卡内基拟蜡菌(Ceriporiopsis caregiea)、浅黄拟蜡孔菌(Ceriporiopsisgilvescens)、潘诺希塔拟蜡菌(Ceriporiopsis pannocinta)、环带拟蜡菌(Ceriporiopsisrivulosa)、微红拟蜡菌(Ceriporiopsis subrufa)、虫拟蜡菌(Ceriporiopsissubvermispora)、狭边金孢子菌(Chrysosporium inops)、嗜角质金孢子菌、卢克诺文思金孢子菌(Chrysosporium lucknowense)、粪状金孢子菌(Chrysosporiummerdarium)、租金孢子菌、昆士兰金孢子菌、热带金孢子菌、褐薄金孢子菌(Chrysosporium zonatum)、灰盖鬼伞(Coprinus cinereus)、毛革盖菌(Coriolus hirsutus)、杆孢状镰孢、谷类镰孢、库威镰孢、大刀镰孢、禾谷镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖镰孢、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰孢、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰孢、镶片镰孢、特异腐质霉、柔毛腐质霉、米黑毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙链孢菌、产紫青霉菌、黄孢原毛平革菌、射脉菌(Phlebia radiata)、刺芹侧耳(Pleurotus eryngii)、土生梭孢壳、长域毛栓菌(Trametesvillosa)、变色栓菌(Trametes versicolor)、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉或绿色木霉细胞。
可以将真菌细胞通过涉及原生质体形成、原生质体转化、以及细胞壁再生的方法以本身已知的方式转化。用于转化曲霉属和木霉属宿主细胞的适合程序在EP 238023，约尔顿(Yelton)等人，1984，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)81:1470-1474，和克里斯滕森(Christensen)等人，1988，生物/技术(Bio/Technology)6:1419-1422中描述。用于转化镰孢属物种的适合方法由马拉迪尔(Malardier)等人，1989，基因(Gene)78:147-156、以及WO 96/00787描述。可以使用由如以下文献描述的程序转化酵母：贝克尔(Becker)和瓜伦特(Guarente)，在阿贝尔森(Abelson)，J.N.和西蒙(Simon)，M.I.编，酵母遗传学与分子生物学指南，酶学方法(Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology,Methodsin Enzymology)，第194卷，第182-187页，学术出版社有限公司(Academic Press,Inc.)，纽约；伊藤(Ito)等人，1983，细菌学杂志(J.Bacteriol.)153:163；以及哈尼恩(Hinnen)等人，1978，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)75:1920。
产生方法
本发明还涉及产生变体的方法，这些方法包括：(a)在适于表达该变体的条件下培养本发明的宿主细胞；和(b)回收该变体。因此，本发明涉及生产变体的方法，该方法包括a)在对应于SEQ ID NO:1的成熟多肽的位置R181、G182、D183和G184的两个或更多个位置的缺失，b)在对应于SEQ ID NO:1的成熟多肽的位置Y198、Y200、L201、Y203和A204的一个或多个位置的取代，以及c)在对应于SEQ ID NO:1的成熟多肽的位置M202的位置的甲硫氨酸的取代，其中该变体与SEQ ID NO:1或2的成熟多肽具有至少80％，例如至少90％，但是小于100％序列一致性，并且其中该变体具有α-淀粉酶活性，其中该方法包括：(a)在适于表达该变体的条件下培养表达该变体的宿主细胞；和(b)回收该变体。
所述宿主细胞使用本领域已知的方法在适合于产生所述变体的营养培养基中培养。例如，可以通过摇瓶培养，或者在适合的培养基中并在允许该变体表达和/或分离的条件下在实验室或工业发酵罐中进行小规模或大规模发酵(包括连续发酵、分批发酵、分批给料发酵或固态发酵)来培养该细胞。该培养是使用本领域中已知的程序，在一种适合营养培养基中发生，该培养基包含碳和氮来源及无机盐。适合的培养基可从商业供应商获得或可以根据公开的组成(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)制备。如果变体分泌到营养培养基中，该变体能够从所述培养基中直接回收。如果变体不分泌，则其能够从细胞裂解物(lysate)回收。
可以使用本领域已知的对这些变体特异的方法检测这些变体。这些检测方法包括但不局限于，特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。例如，可以使用酶测定来确定该变体的活性。
可以使用本领域已知的方法来回收该变体。例如，可以通过多种常规程序从该营养培养基中回收该变体，这些常规程序包括但不局限于收集、离心、过滤、萃取、喷雾干燥、蒸发、或沉淀。
可以通过本领域已知的多种程序来纯化该变体，以获得基本上纯的变体，这些程序包括，但不局限于色谱法(例如，离子交换色谱、亲和色谱、疏水作用色谱、色谱聚焦、以及尺寸排阻色谱)、电泳程序(例如，制备型等电点聚焦)、有差别的溶解(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE、或萃取(参见，例如蛋白纯化(Protein Purification)，詹森(Janson)和赖登(Ryden)编辑，VCH出版社(VCH Publishers)，纽约，1989)。
在一个替代方面，没有回收该变体，而是将表达该变体的本发明的宿主细胞用作该变体的来源。
组合物
本发明还涉及包含本发明的一种变体的组合物。因此，本发明涉及包括变体的组合物，包括a)在对应于SEQ ID NO:1的成熟多肽的位置R181、G182、D183和G184的两个或更多个位置的缺失，b)在对应于SEQ ID NO:1的成熟多肽的位置Y198、Y200、L201、Y203和A204的一个或多个位置的取代，以及c)在对应于SEQ ID NO:1的成熟多肽的位置M202的的位置的甲硫氨酸的取代，其中该变体与SEQ ID NO:1或2的成熟多肽具有至少80％，例如至少90％，但是小于100％序列一致性，并且其中该变体具有α-淀粉酶活性。
优选地，所述组合物富含此种变体。术语“富集”意指组合物的醹-淀粉酶活性已经增加，例如具有1.1的富集因子。
所述组合物可包含变体作为主要酶组分，例如单组分组合物。可替代地，该组合物可以包括多种酶活性，如氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、卤素过氧化物酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果胶分解酶、肽谷氨酰胺酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶或木聚糖酶。额外的酶可以通过例如属于以下属或种的微生物产生：曲霉属，例如棘孢曲霉、泡盛曲霉、臭曲霉、烟曲霉、日本曲霉、构桌曲霉、黑曲霉或米曲霉；镰孢属，例如杆孢状镰孢、禾谷镰孢、库威镰孢、大刀镰孢、禾本科镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖镰孢、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰孢或镶片镰孢；腐质霉属，例如特异腐质霉或疏棉状腐质霉；或木霉属，例如哈次木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉或绿色木霉。
该组合物可以根据本领域已知的方法制备，并可以是液体或干燥组合物的形式。例如，组合物可以处于颗粒或微颗粒的形式。可以根据本领域已知的方法将变体稳定化。
洗涤剂组合物
在一个实施例中，本发明针对以下洗涤剂组合物，这些洗涤剂组合物包括与一种或多种另外的清洁组合物组分组合的本发明的α-淀粉酶变体。因此，本发明涉及包括变体的洗涤剂组合物，包括a)在对应于SEQ ID NO:1的成熟多肽的位置R181、G182、D183和G184的两个或更多个位置的缺失，b)在对应于SEQ ID NO:1的成熟多肽的位置Y198、Y200、L201、Y203和A204的一个或多个位置的取代，以及c)在对应于SEQ ID NO:1的成熟多肽的位置M202的的位置的甲硫氨酸的取代，其中该变体与SEQ ID NO:1或2的成熟多肽具有至少80％，例如至少90％，但是小于100％序列一致性，并且其中该变体具有α-淀粉酶活性，并且该洗涤剂组合物进一步包括一种或多种另外的清洁组合物组分。
另外的组分的选择是在业内熟知的，并且包括传统的成分，包括下面说明的示例性的非限制性组分。对于织物护理，组分的选择可以包括以下考虑：有待清洁的织物的类型、污渍的类型和/或程度、进行清洁时的温度、以及洗涤剂产品的配制。尽管根据具体的功能性对以下提及的组分由通用标题进行分类，但是这并不被解释为限制，因为如将被普通技术人员所理解，一种组分可以包括另外的功能性。
本发明的酶的浓度
在本发明的一个实施例中，可以将本发明的多肽以对应于以下的量用于餐具洗涤组合物中：每升的洗涤液0.001-200mg的蛋白，例如0.005-100mg的蛋白，优选0.01-50mg的蛋白，更优选0.05-20mg的蛋白，甚至更优选0.1-10mg的蛋白。
可以使用常规稳定剂稳定本发明的清洁剂组合物的一种或多种酶，这些常规稳定剂例如是多元醇，例如丙二醇或甘油、糖或糖醇、乳酸、硼酸或硼酸衍生物，例如芳香族硼酸酯，或苯基硼酸衍生物，例如4-甲酰苯基硼酸，并且可以如在例如WO92/19709和WO92/19708中所述配置该组合物。
本发明的多肽还可以结合到WO 97/07202中所披露的洗涤剂配制品中，通过引用将其结合在此。
表面活性剂
该餐具洗涤组合物包括至少一种非离子表面活性剂。适合的非离子表面活性剂包括但不局限于低泡非离子(LFNI)表面活性剂。因为它们向自动餐具洗涤组合物赋予的改进的水膜作用(尤其来自玻璃器皿)，LFNI表面活性剂最典型地用于自动餐具洗涤组合物中。它们还可以涵盖非硅、磷酸盐或非磷酸盐聚合材料，这些材料已知使在自动餐具洗涤中遇到的食物污垢消泡。该LFNI表面活性剂可以具有相对低的浊点和高亲水亲油平衡(HLB)。针对整个全系列水温中的起泡的最优控制，水中1％溶液的浊点典型地低于约32℃，可替代地更低，例如，0℃。如果需要的话，可以使用具有以上特性的可生物降解的LFNI表面活性剂。
LFNI表面活性剂可以包括但不局限于：烷氧基化的表面活性剂，尤其是由伯醇衍生的乙氧基化物，及其与更复杂的表面活性剂(如聚氧丙烯/聚氧乙烯/聚氧丙烯反向嵌段聚合物)的共混物。符合要求的适合的嵌段聚氧乙烯-聚氧丙烯聚合化合物可以包括基于以下的那些：乙二醇、丙二醇、甘油、三羟甲基丙烷和乙二胺、及其混合物。由引发剂化合物与单反应性氢原子(如C12-)的顺序乙氧基化和丙氧基化制成的聚合化合物是脂肪醇，一般不在自动餐具洗涤组合物中提供令人满意的泡沫控制。然而，某些由BASF-Wyandotte公司，怀恩多特，密歇根州命名为PLURONIC(R)和TETRONIC(R)的嵌段聚合表面活性剂化合物适用于自动餐具洗涤组合物。该LFNI表面活性剂任选地可以按重量计包括高达约15％的量的氧化丙烯。可以通过美国专利号4,223,163中所描述的工艺制备其他LFNI表面活性剂。该LFNI表面活性剂还可以源自直链脂肪醇，该直链脂肪醇包含从约16至约20碳原子(C16-C20醇)，可替代地Ci8醇，在从约6至约15摩尔，或从约7至约12摩尔，和可替代地从约7至约9摩尔的氧化乙烯/摩尔醇的平均值下缩合。相对于平均值，这样衍生的乙氧基化的非离子表面活性剂可以具有窄的乙氧基化物分布。
在某些实施例中，具有低于30℃浊点的LFNI表面活性剂按重量计可以以从约0.01％至约60％、或从约0.5％至约10％的量存在，并且可替代地，以按重量计从约1％至约5％的组合物的量存在。
在优选的实施例中，该表面活性剂是具有以下相转变温度的非离子表面活性剂或非离子表面活性剂系统，如在蒸馏水中的1％浓度下测量的，在40℃和70℃之间，优选地在45℃和65℃之间。“非离子表面活性剂系统”本文中意指两种或更多种非离子表面活性剂的混合物。本文中优选使用的是非离子表面活性剂系统。比单非离子表面活性剂，它们在产品中似乎具有改进的清洁和整理性质和稳定性。适合的非离子表面活性剂包括：i)通过以下制备的乙氧基非离子表面活性剂：单羟基化的烷醇或烷基酚与6至20个碳原子反应，其中优选地至少12摩尔，具体优选地至少16摩尔，并且还更优选至少20摩尔氧化乙烯/摩尔醇或烷基酚；ii)具有从6至20个碳原子和至少一个乙氧基和丙氧基基团的醇烷氧基化的表面活性剂。本文中使用优选的是表面活性剂i)和ii)的混合物。
另一个适合的非离子表面活性剂是由以下化学式代表的环氧封端的聚(烷氧基化)醇：
R1O[CH2CH(CH3)O]x[CH2CH2O]y[CH2CH(OH)R2](I)
其中R1是具有从4至18个碳原子的直链的或支链的脂肪烃基团；R2是具有从2至26个碳原子的直链的或支链的脂肪烃基团；x是具有从0.5至1.5，更优选地约1的平均值的整数；并且y是具有至少15，更优选地至少20的值的整数。优选地，具有化学式I的表面活性剂在末端环氧单元[CH2CH(OH)R2]中具有至少约10个碳原子。具有化学式I的适合的表面活性剂是Olin公司的POLY-TERGENT(R)SLF-18B非离子表面活性剂，例如，如由Olin公司1994年10月13日公开的WO 94/22800中所描述的。
优选地本文中的非离子表面活性剂和/或系统具有少于360秒的德拉夫斯润湿时间，优选地少于200秒，更优选地少于100秒并且尤其是少于60秒，如通过德拉夫斯润湿方法所测量的(使用以下条件的标准方法ISO 8022：在25℃的温度下，3-g钩、5-g棉绞纱、按重量计0.1％水溶液)。氧化胺表面活性剂在本发明中作为抗再沉淀表面活性剂也是有用的，这些抗再沉淀表面活性剂包括具有以下化学式的直链的和支链的化合物：
Figure BDA0003159978670000531
其中R3选自以下各项：烷基、羟烷基、酰氨基丙基和烷基苯基基团、或其混合物，其包含从8至26个碳原子，优选地8至18个碳原子；R4为包含从2至3个碳原子(优选地2个碳原子)的亚烷基或羟基亚烷基基团，或其混合物；X是从0至5，优选地从0至3；并且每个R5为包含从1至3个碳原子(优选地1至2个碳原子)的烷基或羟基烷基基团，或包含从1至3个(优选地1个)环氧乙烷基基团的一个聚氧化乙烯基团。R5基团可以，例如通过氧原子或氮原子彼此连接以形成环状结构。
这些氧化胺表面活性剂具体包括C10-C18烷基二甲基氧化胺和C8-C18烷氧基乙基二羟基乙基氧化胺。此类材料的实例包括二甲基辛胺氧化物、二乙基癸胺氧化物、双-(2-羟乙胺)十二烷胺氧化物、二甲基癸胺氧化物、二丙基十四烷胺氧化物、甲基乙基十六烷胺氧化物、十二烷基酰胺丙基二甲胺氧化物、十六烷基二甲胺氧化物、十八烷基二甲胺氧化物、牛脂二甲胺氧化物和二甲基-2-羟基十八烷胺氧化物。优选的是C10-C18烷基二甲胺氧化物、和C10-C18酰胺烷基二甲胺氧化物。表面活性剂并且尤其是非离子型表面活性剂按重量计可以按从0至10％，优选地从0.1％至10％，并且最优选地从0.25％至6％的量存在。
磺化聚合物
按组合物的重量计，将该聚合物(如果使用的话)以从约0.1％至约20％，优选地从1％至约15％，更优选地从2％至10％的任何适合的量来使用。磺化/羧化的聚合物特别适用于袋中所包含的组合物。
本文描述的适合的磺化/羧化的聚合物可以具有以下的重量平均分子量：小于或等于约100,000Da、或小于或等于约75,000Da、或小于或等于约50,000Da、或从约3,000Da至约50,000，优选地从约5,000Da至约45,000Da。
如本文所指出的，该磺化/羧化的聚合物可以包括(a)源自具有通式(I)的至少一种羧酸单体的至少一种结构单元：
Figure BDA0003159978670000532
其中R1至R4独立地是氢、甲基、羧酸基团或CH2COOH，并且其中可以将该羧酸基团进行中和；(b)任选地，源自具有通式(II)的至少一种非离子单体的一种或多种结构单元：
Figure BDA0003159978670000541
其中R5是氢、C1至C6烷基、或C1至C6羟烷基，并且X是芳香族的(其中当X是芳香族的时，R5是氢或甲基)抑或者X具有通式(III)：
Figure BDA0003159978670000542
其中R6是(独立于R5)氢、C1至C6烷基、或C1至C6羟烷基，并且Y是O或N；和源自具有通式(IV)的至少一种磺酸单体的至少一种结构单元：
Figure BDA0003159978670000543
其中R7是包括至少一个sp2键的基团，A是O、N、P、S或酰胺或酯键，B是单或多环芳基基团或脂肪烃基团，每个t独立地是0或1，并且M+是阳离子。在一方面，R7是C2至C6烯烃。在另一方面，R7是乙烯、丁烯或丙烯。
优选的羧酸单体包括以下各项中的一种或多种：丙烯酸、马来酸、衣康酸、异丁烯酸、或丙烯酸的乙氧基化物酯，更优选的是丙烯酸和甲基丙烯酸。优选的磺化的单体包括以下各项中的一种或多种：(甲基)烯丙基磺酸钠、磺酸乙烯酯、苯基(甲基)烯丙基酯磺酸钠、或2-丙烯酰胺-甲基丙磺酸。优选的非离子单体包括以下中的一种或多种：(甲基)丙烯酸甲酯、(甲基)丙烯酸乙酯、(甲基)丙烯酸叔丁酯、甲基(甲基)丙烯酰胺、乙基(甲基)丙烯酰胺、(甲基)丙烯酸叔丁酯、苯乙烯、或[α]-甲基苯乙烯。
优选地，该聚合物包括以下水平的单体：按重量计从约40％至约90％，优选地从约60％至约90％的一种或多种羧酸单体的聚合物；按重量计从约5％至约50％，优选地从约10％至约40％的一种或多种磺酸单体的聚合物；和按重量计任选地从约1％至约30％，优选地从约2％至约20％的一种或多种非离子单体的聚合物。特别优选的聚合物包括按重量计约70％至约80％的至少一种羧酸单体的聚合物和按重量计从约20％至约30％的至少一种磺酸单体的聚合物。
该羧酸优选地是(甲基)丙烯酸。该磺酸单体优选地是以下各项之一：2-丙烯酰胺甲基-1-丙磺酸、2-甲基丙烯酰基氨基-2-甲基-1-丙磺酸、3-甲基丙烯酰基氨基-2-羟基丙磺酸、芳基磺酸、甲芳基磺酸、烯丙氧基苯磺酸、甲烯丙氧基苯磺酸、2-羟基-3-(2-丙烯基氧基)丙磺酸、2-甲基-2-丙烯-l-磺酸、苯乙烯磺酸、乙烯磺酸、丙烯酸3-磺丙酯、甲基丙烯酸3-磺丙酯、丙烯酸磺甲酯、甲基丙烯酸磺甲酯、及其水溶性盐。该不饱和磺酸单体最优选地是2-丙烯酰氨基-2-丙磺酸(AMPS)。
优选的可商购的聚合物包括：由阿尔科化学公司(Alco Chemical)提供的Alcosperse 240、Aquatreat AR 540和Aquatreat MPS；由Rohm&Haas公司提供的Acumer3100、Acumer 2000、Acusol 587G和Acusol 588G；由BF Goodrich公司提供的Goodrich K-798、K-775和K-797；和由ISP技术公司提供的ACP1042。特别优选的聚合物是由Rohm&Haas公司提供的Acusol 587G和Acusol588G。
在聚合物中，所有或一些羧酸或磺酸基团可以按中和形式存在，即，一些或所有酸基团中的羧酸和/或磺酸的酸性氢原子可以被金属离子，优选地碱金属离子并且具体地被钠离子替换。
助水溶物(hydrotropes)
助水溶剂是以下化合物，该化合物在水性溶液中溶解疏水化合物(或相反地，在非极性环境中的极性物质)。一般地，助水溶物具有亲水和疏水两种特征(所谓的两亲性质，如由表面活性剂已知的)。然而，助水溶剂的分子结构一般不利于自发性自聚集，参见例如通过霍奇登(Hodgdon)和卡勒(Kaler)(2007)，胶体&界面科学新见(Current Opinion inColloid&Interface Science)12:121-128的综述。助水溶剂并不显示临界浓度，高于该浓度就会发生如对表面活性剂而言所发现的自聚集以及脂质形成胶束、薄层或其他很好地定义的中间相。相反，许多助水溶物显示连续类型的聚集过程，其中聚集物的大小随着浓度增加而增长。然而，很多助水溶剂改变了包含极性和非极性特征的物质的系统(包括水、油、表面活性剂、和聚合物的混合物)的相行为、稳定性和胶体特性。助水溶物常规地在从药学(pharma)、个人护理、食品到技术应用的各个产业中应用。助水溶剂在洗涤剂组合物中的使用允许例如更浓的表面活性剂配制品(如在通过除去水而压缩液体洗涤剂的过程中)而不引起不希望的现象，例如相分离或高粘度。
洗涤剂可以包含按重量计0-10％，例如按重量计0-5％，例如约0.5至约5％、或约3％至约5％的助水溶剂。可以利用本领域中已知的用于在洗涤剂中使用的任何助水溶物。助水溶剂的非限制性实例包括苯磺酸钠、对甲苯磺酸钠(STS)、二甲苯磺酸钠(SXS)、枯烯磺酸钠(SCS)、伞花烃磺酸钠、氧化胺、醇和聚乙二醇醚、羟基萘甲酸钠、羟基萘磺酸钠、乙基己基磺酸钠及其组合。
助洗剂和共助洗剂
洗涤剂组合物可以包含按重量计约0-65％，例如约5％至约50％的洗涤剂助洗剂或共助洗剂、或其混合物。在餐具洗涤去污剂中，增洁剂的水平一般为40％-65％，特别是50％-65％。增洁剂和/或共增洁剂(co-builder)可以特别是与Ca和Mg形成水溶性络合物的螯合剂。可以利用本领域已知的用于ADW洗涤剂的任何助洗剂和/或共助洗剂。助洗剂的非限制性实例包括沸石、二磷酸盐(焦磷酸盐)、三磷酸盐例如三磷酸钠(STP或STPP)、碳酸盐例如碳酸钠、可溶性硅酸盐例如硅酸钠、层状硅酸盐(例如，来自赫斯特公司(Hoechst)的SKS-6)、乙醇胺例如2-氨基乙-1-醇(MEA)、二乙醇胺(DEA，也称为2,2’-亚氨基二乙-1-醇)、三乙醇胺(TEA，也称为2,2’,2”-次氮基三乙-1-醇)、以及羧甲基菊粉(CMI)、及其组合。
该洗涤剂组合物还可以包含按重量计0-50％，例如约5％至约30％的洗涤剂共助洗剂。洗涤剂组合物可以只包括共助洗剂，或结合助洗剂，例如沸石助洗剂。共助洗剂的非限制性实例包括聚丙烯酸酯的均聚物或其共聚物，例如聚(丙烯酸)(PAA)或共聚(丙烯酸/马来酸)(PAA/PMA)。另外的非限制性实例包括柠檬酸盐，螯合剂，例如氨基羧酸盐、氨基多羧酸盐和膦酸盐，以及烷基-或烯基琥珀酸。另外的具体实例包括2,2’,2”-次氨基三乙酸(NTA)、乙二胺四乙酸(EDTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、亚氨基二丁二酸(IDS)、乙二胺-N,N’-二丁二酸(EDDS)、甲基甘氨酸二乙酸(MGDA)、谷氨酸-N,N-二乙酸(GLDA)、1-羟基乙烷-1,1-二膦酸(HEDP)、乙二胺四(亚甲基膦酸)(EDTMPA)、二亚乙基三胺五(亚甲基膦酸)(DTMPA或DTPMPA)、N-(2-羟乙基)亚氨基二乙酸(EDG)、天冬氨酸-N-单乙酸(ASMA)、天冬氨酸-N,N-二乙酸(ASDA)、天冬氨酸-N-单丙酸(ASMP)、亚氨基二丁二酸(iminodisuccinicacid)(IDA)、N-(2-磺甲基)-天冬氨酸(SMAS)、N-(2-磺乙基)-天冬氨酸(SEAS)、N-(2-磺甲基)-谷氨酸(SMGL)、N-(2-磺乙基)-谷氨酸(SEGL)、N-甲基亚氨基二乙酸(MIDA)、α-丙氨酸-N,N-二乙酸(α-ALDA)、丝氨酸-N,N-二乙酸(SEDA)、异丝氨酸-N,N-二乙酸(ISDA)、苯丙氨酸-N,N-二乙酸(PHDA)、邻氨基苯甲酸-N,N-二乙酸(ANDA)、磺胺酸-N,N-二乙酸(SLDA)、牛磺酸-N,N-二乙酸(TUDA)以及磺甲基-N,N-二乙酸(SMDA)、N-(2-羟乙基)-亚乙基二胺-N,N’,N”-三乙酸盐(HEDTA)、二乙醇甘氨酸(DEG)、二亚乙基三胺五(亚甲基膦酸)(DTPMP)、氨基三(亚甲基膦酸)(ATMP)、及其组合和盐。其他示例性助洗剂和/或共助洗剂描述于例如WO09/102854、US 5977053中。
漂白系统
无机和有机漂白剂是用于此处的适合的清洁活性物。无机漂白剂包括过氧化氢合物盐例如过硼酸盐、过碳酸盐、过磷酸盐、过硫酸盐和过硅酸盐。无机过氧化氢合物盐正常为碱金属盐。无机过氧化氢合物盐可以不加另外保护地作为晶状固体被包括在内。可替代地，该盐可以加包衣。
碱金属过碳酸盐，特别是过碳酸钠是优选地用于此处的过氧化氢合物。过碳酸盐最优选地以有包衣形式并入产物，以提供产物中的稳定性。提供产物中的稳定性的适合的包衣材料包括水溶性碱性金属硫酸盐和碳酸盐的混合盐。此类的包衣连同包衣工艺已经被在前的GB 1,466,799描述过。混合盐包衣材料与过碳酸盐的重量比范围为1:200至1:4，更优选地为1:99至1:9，并且最优选地为1:49至1:19。优选地，混合盐是硫酸钠和碳酸钠的混合盐，其通式为Na2S04.n.Na2CO3，其中n为0.1-3，优选地n为0.3-1.0并且更优选地n为0.2-0.5。
另一种提供产物中的稳定性的适合的包衣材料包括硅酸钠(其中SiO2:Na20比率为1.8:1至3.0:1，优选地为1.8:1至2.4:1)和/或偏硅酸钠，优选地按无机过氧化氢合物盐的重量计的从2％到10％的SiO2的水平(正常为从3％至5％)进行应用。镁硅酸盐也可以被包括在包衣中。包含硅酸盐和硼酸盐或硼酸或其他无机物的包衣也是适合的。
在本发明的范围内，包含蜡、油或脂肪皂的其他包衣也能有利地使用。
过氧基单过硫酸钾是在此具有效用的另一种无机过氧化氢合物盐。典型的有机漂白剂是有机过氧酸，包括二酰基和四酰基过氧化物，尤其是二过氧十二烷二酸、二过氧十四烷二酸、和二过氧十六烷二酸。过氧化二苯甲酰是此处优选的有机过氧酸。单-或二过壬二酸、单-和二过十三烷二酸和N-邻苯二甲酰氨基过氧化己酸在此处也是适合的。二酰基过氧化物，尤其是过氧化二苯甲酰应该优选地以颗粒的形式存在，该颗粒具有重均直径为从约0.1到约100微米，优选地从约0.5到约30微米，更优选地从约1到约10微米。优选地，至少约25％，更优选地至少约50％，甚至更优选地至少约75％，最优选地至少约90％的颗粒小于10微米，优选地小于6微米。在上述粒度范围内的二酰基过氧化物，相比更大的二酰基过氧化物颗粒，还被发现能提供更好的污渍去除能力，尤其是从塑料餐具上的污渍去除能力，而使在用于自动餐具洗涤机期间的不希望的沉积和膜形成最小化。因此优选的二酰基过氧化物粒度允许配制者用低水平的二酰基过氧化物获得好的污渍去除能力，这减少了沉积和膜形成。相反地，当二酰基过氧化物粒度增加，需要用更多二酰基过氧化物来获得好的污渍去除能力，这增加了在餐具洗涤过程中会遇到的在表面的沉积和膜形成。
另外典型的有机漂白剂包括过氧酸，具体的实例是烷基过氧酸和芳基过氧酸。优选的代表是(a)过氧苯甲酸和其环取代的衍生物，例如烃基过氧苯甲酸，但是还有过氧-[α]-萘甲酸和一过氧邻笨二甲酸镁，(b)脂族或取代的脂族过氧酸，例如过氧月桂酸、过氧硬脂酸、[ε]-苯二甲酰亚氨基过氧己酸[苯二甲酰亚氨基过氧己酸(PAP)]、邻-羧基苯曱酰氨基过氧己酸、N-壬酰氨基过氧己二酸和N-壬酰氨基过氧琥珀酸酯；和(c)脂族和芳代脂族过氧二羧酸，例如1,12-双过氧羧酸、1,9-双过氧壬二酸、双过氧癸二酸、双过氧十三烷二酸、双过氧邻苯二曱酸、2-癸基双过氧丁烷-l,4-二酸、N,N-对苯二酰基二(6-氨基过氧己酸)。
漂白活性剂
漂白活化剂典型地为增强60℃或更低温度下的清洁过程中的漂白作用的有机过酸前体。适合在此处使用的漂白活性剂包括以下化合物，在过水解条件下，其给出优选具有1至10个碳原子，特别是2至4个碳原子的脂族过氧羧酸，和/或任选地取代的过氧苯曱酸。适合的物质带有指定碳原子数的O-酰基和/或N-酰基和/或任选地取代的苯曱酰基。优选为多酰基化亚烷基二胺，具体地是四乙酰基乙二胺(TAED)、酰化的三嗪衍生物，具体地是l,5-二乙酰基-2,4-二氧六氢-l,3,5-三嗪(DADHT)、酰化的甘脲，具体地是四乙酰基甘脲(TAGU)、N-酰基酰亚胺，具体地是N-壬酰基琥珀酰亚胺(NOSI)、酰化的羟基苯磺酸酯，具体地是正壬酰基-或异壬酰基羟基苯磺酸酯(正-或异-NOBS)、羧酸酐，具体地是邻苯二曱酸酐、酰化的多羟基醇，具体地是乙酸甘油酯、乙二醇二乙酸酯和2,5-二乙酰氧基-2,5-二氢呋喃以及还有三乙基乙酰基柠檬酸酯(TEAC)。若被包括在本发明的组合物中，漂白活性剂按组合物的重量计为从约0.1％至约10％，优选地从约0.5％至约2％的水平。
漂白催化剂(Bleach catalyst)
此处优选使用的漂白催化剂包括三氮杂环壬烷合锰及相关复合物(US-A-4246612，US-A-5227084)、二吡啶胺合Co、Cu、Mn和Fe及相关复合物(US-A-5114611)、以及戊胺醋酸酯合钴(III)及相关复合物(US-A-4810410)。适合此处使用的漂白催化剂的完整描述可见于WO 99/06521，第34页，第26行至第40页，第16行。若被包括在本发明的组合物中，漂白催化剂按组合物的重量计为从约0.1％至约10％，优选地从约0.5％至约2％的水平。
氧化还原酶，例如氧化酶、氧合酶、过氧化氢酶、过氧化物酶像卤代-、氯代-、溴代-、木质素、或锰过氧化物酶、双加氧酶、或漆酶(酚氧化酶、多酚氧化酶)，根据本发明还可以被用于增强漂白效果。有利地，优选地与酶相互作用的有机化合物、特别优选地芳族化合物被另外添加至其中，从而增强相关氧化还原酶(增强剂)的活性或如果在氧化酶和污渍之间的氧化还原电位有大的差异，用来确保电子流(介质)。
硅酸盐
优选的硅酸盐是硅酸钠例如二硅酸钠、偏硅酸钠和结晶层状硅酸盐。若存在，硅酸盐按组合物的重量计为从约1％至约20％，优选地从约5％至约15％的水平。
金属护理剂
金属护理剂可以防止或减少金属的锈蚀、腐蚀或氧化，这些金属包括铝、不锈钢和非铁金属，如银和铜。适合的实例包括以下各项的一个或多个：
(a)苯并三唑类，包括苯并三唑或双-苯并三唑及其取代衍生物。苯并三唑衍生物是其中芳环上可获得的取代位点被部分或完全取代的那些化合物。适合的取代基包括线性或支链Ci-C20-烷基基团和羟基、硫、苯基或卤素(如氟、氯、溴和碘)的取代基。
(b)选自下组的金属盐和络合物，该组由以下各项组成：锌、锰、钛、锆、铪、钒、钴，镓和铯盐和/或络合物，这些金属处于氧化态II、III、IV、V或VI之一。在一方面，适合的金属盐和/或金属络合物可以选自下组，该组由以下各项组成：Mn(II)硫酸盐、Mn(II)柠檬酸盐、Mn(II)硬脂酸盐、Mn(II)乙酰丙酮化物、K^TiF6、K^ZrF6、CoSO4、Co(NOs)2和Ce(NOs)3、锌盐，例如，硫酸锌、水锌矿、或乙酸锌；(c)硅酸盐，包括硅酸钠或硅酸钾、二硅酸钠、硅酸钠、结晶层状硅酸盐及其混合物。
WO 94/26860和WO 94/26859中披露了用作银/铜腐蚀抑制剂的另外适合的有机和无机氧化还原活性物质。优选地，本发明的组合物按重量计包括从0.1％至5％的金属护理剂的组合物，优选地该金属护理剂是锌盐。
酶
洗涤剂添加剂连同洗涤剂组合物可以包括一种或多种额外的酶，例如蛋白酶、脂肪酶、角质酶、淀粉酶、糖酶、纤维素酶、果胶酶、甘露聚糖酶、阿拉伯糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶、氧化酶，例如漆酶、和/或过氧化物酶。
一般而言，一种或多种所选酶的特性应与选定的洗涤剂相容(即，最适pH，与其他酶和非酶成分的相容性，等等)，并且该一种或多种酶应以有效量存在。
纤维素酶
适合的纤维素酶包括细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰的或蛋白质工程处理的突变体。适合的纤维素酶包括来自芽孢杆菌属、假单胞菌属、腐质霉属、镰孢属、梭孢壳属、枝顶孢属的纤维素酶，例如，从在US 4,435,307、US 5,648,263、US 5,691,178、US 5,776,757以及WO 89/09259中披露的特异腐质霉、嗜热毁丝霉(Myceliophthorathermophila)和尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)产生的真菌纤维素酶。
尤其适合的纤维素酶是具有颜色护理益处的碱性或中性纤维素酶。此类纤维素酶的实例是描述于EP 0 495 257、EP 0 531 372、WO 96/11262、WO 96/29397、WO 98/08940中的纤维素酶。其他实例是例如描述于WO 94/07998、EP 0 531 315、US 5,457,046、US 5,686,593、US 5,763,254、WO 95/24471、WO 98/12307以及WO 99/001544中的那些纤维素酶变体。
其他纤维素酶是具有以下序列的内切-β-1,4-葡聚糖酶，该序列与WO 2002/099091的SEQ ID NO:2的位置1至位置773的氨基酸序列具有至少97％一致性，或家族44木葡聚糖酶，该木葡聚糖酶具有以下序列，该序列与WO 2001/062903的SEQ ID NO:2的位置40-559具有至少60％一致性。
可商购的纤维素酶包括CelluzymeTM和CarezymeTM(诺维信公司(Novozymes A/S))、Carezyme PremiumTM(诺维信公司)、CellucleanTM(诺维信公司)、CellucleanClassicTM(诺维信公司)、CellusoftTM(诺维信公司)、WhitezymeTM(诺维信公司)、ClazinaseTM和Puradax HATM(杰能科国际公司(Genencor International Inc.))以及KAC-500(B)TM(花王株式会社(Kao Corporation))。
蛋白酶
适合的蛋白酶包括细菌、真菌、植物、病毒或动物来源的那些，例如植物或微生物来源。优选微生物来源。包括经化学修饰的或蛋白质工程改造的变体。它可以是碱性蛋白酶，例如丝氨酸蛋白酶或金属蛋白酶。丝氨酸蛋白酶可以例如是S1家族(如胰蛋白酶)或S8家族(如枯草杆菌蛋白酶)。金属蛋白酶可以例如是来自例如家族M4的嗜热菌蛋白酶或其他金属蛋白酶，例如来自M5、M7或M8家族的那些。
术语“枯草杆菌酶”是指根据斯艾森(Siezen)等人，蛋白质工程学(ProteinEngng.)4(1991)719-737和斯艾森等人，蛋白质科学(Protein Science)6(1997)501-523的丝氨酸蛋白酶亚组。丝氨酸蛋白酶是特征为在活性位点具有与底物形成共价加合物的丝氨酸的蛋白酶的一个亚组。枯草杆菌酶可以划分为6个亚部，即，枯草杆菌蛋白酶家族、嗜热蛋白酶家族、蛋白酶K家族、羊毛硫抗生素肽酶家族、Kexin家族和Pyrolysin家族。
枯草杆菌酶的实例是源自芽孢杆菌属的那些，例如描述于US 7262042和WO 09/021867中的迟缓芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短小芽孢杆菌和吉氏芽孢杆菌；和描述于WO 89/06279中的枯草杆菌蛋白酶迟缓(lentus)、枯草杆菌蛋白酶诺和(Novo)、枯草杆菌蛋白酶嘉士伯(Carlsberg)、地衣芽孢杆菌、枯草杆菌蛋白酶BPN’、枯草杆菌蛋白酶309、枯草杆菌蛋白酶147和枯草杆菌蛋白酶168以及描述于(WO 93/18140)中的蛋白酶PD138。其他有用的蛋白酶可以是描述于WO 92/175177、WO 01/016285、WO 02/026024以及WO 02/016547中的那些。胰蛋白酶样蛋白酶的实例是胰蛋白酶(例如猪或牛来源的)和镰孢菌蛋白酶(描述于WO 89/06270、WO 94/25583和WO 05/040372中)，以及衍生自纤维单胞菌(Cellumonas)的胰凝乳蛋白酶(描述于WO 05/052161和WO 05/052146中)。
进一步优选的蛋白酶是来自迟缓芽孢杆菌DSM 5483的碱性蛋白酶(如在例如WO95/23221中所述)、及其变体(在WO 92/21760、WO 95/23221、EP1921147以及EP 1921148中描述的)。
金属蛋白酶的实例是如描述于WO 07/044993(杰能科国际公司(Genencor Int.))中的中性金属蛋白酶，例如来源于解淀粉芽孢杆菌的那些。
有用的蛋白酶的实例是于以下各项中的变体：WO 92/19729、WO 96/034946、WO98/20115、WO 98/20116、WO 99/011768、WO 01/44452、WO 03/006602、WO 04/03186、WO 04/041979、WO 07/006305、WO 11/036263、WO 11/036264，尤其是在以下位置的一个或多个中具有取代的变体：3、4、9、15、27、36、57、68、76、87、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、106、118、120、123、128、129、130、160、167、170、194、195、199、205、206、217、218、222、224、232、235、236、245、248、252以及274，使用BPN’编号。更优选地，这些枯草杆菌酶变体可以包含以下突变：S3T、V4I、S9R、A15T、K27R、*36D、V68A、N76D、N87S,R、*97E、A98S、S99G,D,A、S99AD、S101G,M,R S103A、V104I,Y,N、S106A、G118V,R、H120D,N、N123S、S128L、P129Q、S130A、G160D、Y167A、R170S、A194P、G195E、V199M、V205I、L217D、N218D、M222S、A232V、K235L、Q236H、Q245R、N252K、T274A(使用BPN’编号)。
适合的可商购蛋白酶包括以下列商品名出售的那些：
Figure BDA0003159978670000611
DuralaseTm、DurazymTm、
Figure BDA0003159978670000612
Ultra、
Figure BDA0003159978670000613
Ultra、
Figure BDA0003159978670000614
Ultra、
Figure BDA0003159978670000615
Ultra、
Figure BDA0003159978670000616
和
Figure BDA0003159978670000617
(诺维信公司)，以下列商品名出售的那些：
Figure BDA0003159978670000618
Figure BDA0003159978670000619
Purafect
Figure BDA00031599786700006110
PreferenzTm、Purafect
Figure BDA00031599786700006111
Purafect
Figure BDA00031599786700006112
Purafect
Figure BDA00031599786700006113
EffectenzTm、
Figure BDA00031599786700006114
以及
Figure BDA00031599786700006115
(丹尼斯克/杜邦公司(Danisco/DuPont))、AxapemTm(吉斯特布罗卡德斯公司(Gist-Brocases N.V.))、BLAP(序列示于US 5352604的图29中)及其变体(汉高股份(Henkel AG))以及来自花王株式会社(Kao)的KAP(嗜碱芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶)。
Figure BDA00031599786700006116
由Novozymes A/S在市场上销售。它是来自迟缓芽孢杆菌(B.Lentus)的枯草溶菌素309，并且与BAALKP仅在一个位置(N87S)上有差异。
脂肪酶和角质酶
适合的脂肪酶和角质酶包括细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰的或蛋白质工程化的变体酶。实例包括来自嗜热真菌属的脂肪酶，例如如描述于EP 258068和EP 305216中的来自疏绵状嗜热丝孢菌(早先命名为疏棉状腐质霉)；来自腐质霉属的角质酶，例如特异腐质霉(WO 96/13580)；来自假单胞菌属的菌株的脂肪酶(这些中的一些现在改名为伯克霍尔氏菌属)，例如产碱假单胞菌或类产碱假单胞菌(EP 218272)、洋葱假单胞菌(EP331376)、假单胞菌属菌株SD705(WO 95/06720&WO 96/27002)、威斯康星假单胞菌(P.wisconsinensis)(WO 96/12012)；GDSL-型链霉菌属脂肪酶(WO 10/065455)；来自稻瘟病菌的角质酶(WO 10/107560)；来自门多萨假单胞菌的角质酶(US 5,389,536)；来自褐色嗜热裂孢菌(Thermobifida fusca)的脂肪酶(WO 11/084412)；嗜热脂肪土芽孢杆菌脂肪酶(WO 11/084417)；来自枯草芽孢杆菌的脂肪酶(WO 11/084599)；以及来自灰色链霉菌(WO11/150157)和始旋链霉菌(S.pristinaespiralis)的脂肪酶(WO 12/137147)。
其他实例是脂肪酶变体，例如描述于EP 407225、WO 92/05249、WO 94/01541、WO94/25578、WO 95/14783、WO 95/30744、WO 95/35381、WO 95/22615、WO 96/00292、WO 97/04079、WO 97/07202、WO 00/34450、WO 00/60063、WO 01/92502、WO 07/87508以及WO 09/109500中的那些。
优选的商业化脂肪酶产品包括LipolaseTM、LipexTM；LipolexTM和LipocleanTM(诺维信公司)，Lumafast(最初来自杰能科公司(Genencor))以及Lipomax(最初来自吉斯特-博克德斯公司(Gist-Brocades))。
再其他实例是有时称为酰基转移酶或过水解酶的脂肪酶，例如与南极假丝酵母(Candida antarctica)脂肪酶A具有同源性的酰基转移酶(WO10/111143)、来自耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)的酰基转移酶(WO 05/56782)、来自CE 7家族的过水解酶(WO 09/67279)以及耻垢分枝杆菌过水解酶的变体(特别是来自亨斯迈纺织品染化有限公司(Huntsman Textile Effects Pte Ltd)的商业产品Gentle Power Bleach中所用的S54V变体)(WO 10/100028)。
另外的淀粉酶
可以与本发明的酶酶制剂一起使用的适合的淀粉酶可以是α-淀粉酶、支链淀粉酶或葡糖淀粉酶并且可以具有细菌或真菌起源。包括经化学修饰的或蛋白质工程改造的变体。淀粉酶包括例如获得自芽孢杆菌属的α-淀粉酶，例如GB 1,296,839中更详细描述的地衣芽孢杆菌具体株系的α-淀粉酶。
适合的淀粉酶包括具有WO 95/10603中的SEQ ID NO:2的淀粉酶或其与SEQ IDNO:3具有90％序列一致性的变体。优选的变体描述于WO 94/02597、WO 94/18314、WO 97/43424以及WO 99/019467的SEQ ID NO:4中，例如在一个或多个以下位置中具有取代的变体：15、23、105、106、124、128、133、154、156、178、179、181、188、190、197、201、202、207、208、209、211、243、264、304、305、391、408以及444。
不同的适合的淀粉酶包括具有WO 02/010355中的SEQ ID NO:6的淀粉酶或其与SEQ ID NO:6具有90％序列一致性的变体。SEQ ID NO:6的优选变体是在位置181和182中具有缺失并且在位置193中具有取代的那些。
其他适合的淀粉酶是包括示于WO 2006/066594的SEQ ID NO:6中的来源于解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶的残基1-33和示于WO 2006/066594的SEQ ID NO:4中的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的残基36-483的杂合α-淀粉酶或其具有90％序列一致性的变体。这一杂合α-淀粉酶的优选变体是在以下位置中的一个或多个中具有取代、缺失或插入的那些：G48、T49、G107、H156、A181、N190、M197、I201、A209以及Q264。包括示于WO 2006/066594的SEQ ID NO:6中的来源于解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶的残基1-33和SEQ ID NO:4的残基36-483的杂合α-淀粉酶的最优选变体是具有以下取代的那些：M197T；H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S；或G48A+T49I+G107A+H156Y+A181T+N190F+I201F+A209V+Q264S。
适合的另外的淀粉酶是具有WO 99/019467中的SEQ ID NO:6的淀粉酶或其与SEQID NO:6具有90％序列一致性的变体。SEQ ID NO:6的优选变体是在以下位置中的一个或多个中具有取代、缺失或插入的那些：R181、G182、H183、G184、N195、I206、E212、E216以及K269。特别优选的淀粉酶是在位置R181和G182或位置H183和G184中具有缺失的那些。
可以使用的另外的淀粉酶是具有WO 96/023873的SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQID NO:2或SEQ ID NO:7的那些或其与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ IDNO:7具有90％序列一致性的变体。使用WO 96/023873的SEQ ID 2用于编号，SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:7的优选变体是在以下位置中的一个或多个中具有取代、缺失或插入的那些：140、181、182、183、184、195、206、212、243、260、269、304以及476。更优选的变体是在选自181、182、183和184的两个位置，例如181和182、182和183、或位置183和184具有缺失的那些。SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:7的最优选的淀粉酶变体是在位置183和184中具有缺失并且在位置140、195、206、243、260、304以及476的一个或多个中具有取代的那些。
可以使用的其他淀粉酶是具有WO 08/153815中的SEQ ID NO:2、WO 01/66712中的SEQ ID NO:10的淀粉酶或其与WO 08/153815的SEQ ID NO:2具有90％序列一致性或与WO01/66712中的SEQ ID NO:10具有90％序列一致性的变体。WO 01/66712中的SEQ ID NO:10的优选变体是在以下位置中的一个或多个中具有取代、缺失或插入的那些：176、177、178、179、190、201、207、211以及264。
另外的适合的淀粉酶是具有WO 09/061380中的SEQ ID NO:2的淀粉酶或其与SEQID NO:2具有90％序列一致性的变体。SEQ ID NO:2的优选变体是在以下位置中的一个或多个中具有C-末端的截短和/或取代、缺失或插入的那些：Q87、Q98、S125、N128、T131、T165、K178、R180、S181、T182、G183、M201、F202、N225、S243、N272、N282、Y305、R309、D319、Q320、Q359、K444以及G475。SEQ ID NO:2的更优选变体是在一个或多个以下位置中具有取代的那些：Q87E,R、Q98R、S125A、N128C、T131I、T165I、K178L、T182G、M201L、F202Y、N225E,R、N272E,R、S243Q,A,E,D、Y305R、R309A、Q320R、Q359E、K444E以及G475K和/或位置R180和/或S181或T182和/或G183的缺失。SEQ ID NO:2的最优选的淀粉酶变体是具有以下取代的那些：N128C+K178L+T182G+Y305R+G475K；N128C+K178L+T182G+F202Y+Y305R+D319T+G475K；S125A+N128C+K178L+T182G+Y305R+G475K；或S125A+N128C+T131I+T165I+K178L+T182G+Y305R+G475K，其中这些变体是C-末端截短的并且任选地进一步在位置243处包括取代和/或在位置180和/或位置181处包括缺失。
其他适合的淀粉酶是具有WO 01/66712中的SEQ ID NO:12的α-淀粉酶或与SEQ IDNO:12具有至少90％序列一致性的变体。优选的淀粉酶变体是在WO 01/66712中的SEQ IDNO:12的以下位置中的一个或多个中具有取代、缺失或插入的那些：R28，R118，N174；R181，G182，D183，G184，G186，W189，N195，M202，Y298，N299，K302，S303，N306，R310，N314；R320，H324，E345，Y396，R400，W439，R444，N445，K446，Q449，R458，N471，N484。特别优选的淀粉酶包括具有D183和G184的缺失并且具有R118K、N195F、R320K及R458K的取代的变体，以及另外在选自下组的一个或多个位置中具有取代的变体：M9、G149、G182、G186、M202、T257、Y295、N299、M323、E345以及A339，最优选的是另外在所有这些位置中具有取代的变体。
其他实例是例如描述于WO 2011/098531、WO 2013/001078及WO 2013/001087中的那些淀粉酶变体。
可商购的淀粉酶是DuramylTM、特妙淀粉酶TM、FungamylTM、StainzymeTM、StainzymePlusTM、NatalaseTM、Liquozyme X及BANTM(来自诺维信公司)，以及RapidaseTM、PurastarTM/EffectenzTM、Powerase、Preferenz S100、Preferenz S110及Preferenz S1000(来自杰能科国际有限公司/杜邦公司(Genencor International Inc./DuPont))。
过氧化物酶/氧化酶
过氧化物酶包括由国际生物化学与分子生物学联合会(IUBMB)命名委员会陈述的酶分类EC 1.11.1.7，或源自其中的展示出过氧化物酶活性的任何片段。
适合的过氧化物酶包括植物、细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰的或蛋白质工程处理的突变体。有用的过氧化物酶的实例包括来自拟鬼伞属，例如来自灰盖拟鬼伞(C.cinerea)的过氧化物酶(EP 179,486)，及其变体，如在WO 93/24618、WO 95/10602以及WO 98/15257中描述的那些。
过氧化物酶还包括卤代过氧化物酶，例如氯过氧化物酶、溴过氧化物酶以及展示出氯过氧化物酶或溴过氧化物酶活性的化合物。根据其对卤素离子的特异性将卤代过氧化物酶加以分类。氯过氧化物酶(E.C.1.11.1.10)催化从氯根离子形成次氯酸盐。
在一个实施例中，该卤代过氧化物酶是氯过氧化物酶。优选地，该卤代过氧化物酶是钒卤代过氧化物酶，即含钒酸盐的卤代过氧化物酶，任选地其中该含钒酸盐的卤代过氧化物酶与氯离子来源组合。
已经从许多不同真菌，特别是从暗色丝孢菌(dematiaceous hyphomycete)真菌组中分离出了卤代过氧化物酶，比如卡尔黑霉属(Caldariomyces)(例如煤卡尔黑霉(C.fumago))、链格孢属、弯孢属(例如疣枝弯孢(C.verruculosa)和不等弯孢(C.inaequalis))、内脐蠕孢属、细基格孢属以及葡萄孢属。
还已经从细菌，如假单胞菌属(例如，吡咯假单胞菌(P.pyrrocinia))和链霉菌属(例如，金色链霉菌(S.aureofaciens))中分离出了卤代过氧化物酶。
在一个优选实施例中，该卤代过氧化物酶可源自弯孢属物种，特别是疣枝弯孢(Curvularia verruculosa)或不等弯孢，如如描述于WO 95/27046中的不等弯孢CBS102.42或描述于WO 97/04102中的疣枝弯孢CBS 147.63或疣枝弯孢CBS 444.70；或可源自如描述于WO 01/79459中的Drechslera hartlebii，如描述于WO 01/79458中的盐沼小树状霉(Dendryphiella salina)、如描述于WO 01/79461中的Phaeotrichoconis crotalarie或如描述于WO 01/79460中的Geniculosporium物种。
根据本发明的氧化酶具体包括由酶分类EC 1.10.3.2囊括的任何漆酶或源自其中的展示出漆酶活性的片段、或展示出类似活性的化合物，例如儿茶酚氧化酶(EC1.10.3.1)、邻氨基苯酚氧化酶(EC 1.10.3.4)或胆红素氧化酶(EC 1.3.3.5)。
优选的漆酶是微生物来源的酶。这些酶可以源自植物、细菌或真菌(包括丝状真菌和酵母)。
来自真菌适合的实例包括源自以下项的菌株的漆酶：曲霉属(Aspergillus)，脉孢菌属(Neurospora)，例如粗糙脉孢菌(N.crassa)，柄孢壳属(Podospora)，葡萄孢属(Botrytis)，金钱菌属(Collybia)，层孔菌属(Fomes)，香菇属(Lentinus)，侧耳属(Pleurotus)，栓菌属(Trametes)，例如，长绒毛栓菌和变色栓菌，丝核菌属(Rhizoctonia)，例如，立枯丝核菌(R.solani)，鬼伞属(Coprinus)，例如，灰盖鬼伞(C.cinereus)、毛头鬼伞(C.comatus)、费赖斯鬼伞(C.friesii)、和褶纹鬼伞(C.plicatilis)，小脆柄菇属(Psathyrella),例如，P.condelleana，斑褶菇属(Panaeolus)，例如，蝶形斑褶菇(P.papilionaceus)，毁丝霉属(Myceliophthora)，例如，嗜热毁丝霉(M.thermophila)，柱顶孢属(Schytalidium)，例如，S.thermophilum，多孔菌属(Polyporus)，例如，匹斯特斯多孔菌(P.pinsitus)，射脉菌属(Phlebia)，例如，射脉菌(P.radita)(WO 92/01046)，或拟革盖菌属(Coriolus)，例如，毛革盖菌(C.hirsutus)(JP 2238885)。
来自细菌的适合实例包括可源自芽孢杆菌属的菌株的漆酶。
优选的是源自拟鬼伞属或毁丝霉属的漆酶；特别是源自灰盖拟鬼伞的漆酶，如WO97/08325中所披露的；或来自嗜热毁丝霉，如WO 95/33836中所披露的。
该一种或多种洗涤剂酶可以通过添加包含一种或多种酶的单独的添加剂，或通过添加包括所有这些酶的组合添加剂而被包括于洗涤剂组合物中。本发明的洗涤剂添加剂，即单独的或组合的添加剂，可以配制成例如颗粒、液体、浆液等，优选的洗涤剂添加剂剂型为颗粒，特别是无粉尘颗粒；液体，特别是稳定化液体；或者浆液。
非尘颗粒可以例如如在US 4,106,991和4,661,452中所披露而产生，并且可以任选地通过本领域已知的方法进行涂层。蜡状包衣材料的实例是平均分子量为1,000至20,000的聚(环氧乙烷)产品(聚乙二醇，PEG)；包含16到50个环氧乙烷单位的乙氧基化的壬基酚；乙氧基化脂肪醇，其中，醇含12到20个碳原子且其中存在15到80个环氧乙烷单位；脂肪醇；脂肪酸；和脂肪酸的单-、二-和三酸甘油酯。适合于流化床技术应用的成膜包覆材料的实例提供于GB 1483591。液体酶制品可以例如通过根据已确立的方法添加多元醇(如丙二醇)、糖或糖醇、乳酸或硼酸而稳定化。受保护的酶可以根据EP 238,216中披露的方法来制备。
辅料
还可以利用本领域中已知的用于在ADW洗涤剂中使用的任何洗涤剂组分。其他任选的洗涤剂组分包括防腐剂、防缩剂、抗污垢再沉积剂、抗皱剂、杀细菌剂、粘合剂、腐蚀抑制剂、崩解剂(disintegrant)/崩解试剂(disintegration agent)、染料、酶稳定剂(包括硼酸、硼酸盐、CMC和/或多元醇如丙二醇)、织物整理剂(包括粘土)、填充剂/加工助剂、荧光增白剂/光学增亮剂、增泡剂、泡沫(泡)调节剂、香料、污垢助悬剂、软化剂、抑泡剂、晦暗抑制剂以及芯吸剂，单独抑或组合使用。可以使用本领域中已知用于ADW洗涤剂中的任何成分。此类成分的选择完全在普通技术人员的技术范围内。
分散剂
本发明的洗涤剂组合物还可以包含分散剂。具体而言，粉状洗涤剂可以包含分散剂。适合的水溶性有机材料包括均聚合或共聚合的酸或其盐，其中聚羧酸包括至少两个羧基，这两个羧基被不超过两个碳原子彼此分开。适合的分散剂例如描述于粉状洗涤剂，表面活性剂科学系列(Surfactant Science Series)，第71卷中，马塞尔·德克尔公司(MarcelDekker)。
染料转移抑制剂
本发明的洗涤剂组合物还可以包括一种或多种染料转移抑制剂。适合的聚合物染料转移抑制剂包括但不局限于聚乙烯吡咯烷酮聚合物、多胺N-氧化物聚合物、N-乙烯吡咯烷酮与N-乙烯基咪唑的共聚物、聚乙烯噁唑烷酮以及聚乙烯咪唑或其混合物。当存在于主题组合物中时，染料转移抑制剂可以按组合物重量计的以下水平存在：从约0.0001％至约10％、从约0.01％至约5％或甚至从约0.1％至约3％。
荧光增白剂
本发明的洗涤剂组合物还将优选地包含额外的组分，这些组分可以给正清洁的物品着色，例如荧光增白剂或光增亮剂。其中增亮剂优选以约0.01％至约0.5％的水平存在。在本发明的组合物中可以使用适合用于在衣物洗涤剂组合物中使用的任何荧光增白剂。最常用的荧光增白剂是属于以下类别的那些：二氨基芪-磺酸衍生物、二芳基吡唑啉衍生物和二苯基-联苯乙烯基衍生物。二氨基芪-磺酸衍生物类型的荧光增白剂的实例包括以下的钠盐：4,4'-双-(2-二乙醇氨基-4-苯胺基-均-三嗪-6-基氨基)芪-2,2'-二磺酸盐、4,4'-双-(2,4-二苯胺基-均-三嗪-6-基氨基)芪-2.2'-二磺酸盐、4,4'-双-(2-苯胺基-4-(N-甲基-N-2-羟基-乙基氨基)-均-三嗪-6-基氨基)芪-2,2'-二磺酸盐、4,4'-双-(4-苯基-1,2,3-三唑-2-基)芪-2,2'-二磺酸盐以及5-(2H-萘并[1,2-d][1,2,3]三唑-2-基)-2-[(E)-2-苯基乙烯基]苯磺酸钠。优选的荧光增白剂是可从汽巴–嘉基股份有限公司(Ciba-Geigy AG)(巴塞尔，瑞士)获得的天来宝(Tinopal)DMS和天来宝CBS。天来宝DMS是4,4'-双-(2-吗啉代-4-苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)芪-2,2'-二磺酸盐的二钠盐。天来宝CBS是2,2'-双-(苯基-苯乙烯基)-二磺酸盐的二钠盐。还优选荧光增白剂，是可商购的Parawhite KX，由派拉蒙矿物与化学(Paramount Minerals and Chemicals)，孟买，印度供应。适合用于在本发明中使用的其他荧光剂包括1-3-二芳基吡唑啉和7-烷氨基香豆素。
适合的荧光增亮剂水平包括从约0.01wt％、从0.05wt％、从约0.1wt％或甚至从约0.2wt％的较低水平至0.5wt％或甚至0.75wt％的较高水平。
污物释放聚合物
本发明的洗涤剂组合物还可以包括一种或多种污物释放聚合物，这些聚合物帮助从织物(如棉布和基于聚酯的织物)移除污物，特别是从基于聚酯的织物移除疏水性污物。污垢释放聚合物可以例如是非离子型或阴离子型对苯二甲酸基聚合物、聚乙烯基己内酰胺和相关共聚物、乙烯基接枝共聚物、聚酯聚酰胺，参见例如粉状洗涤剂，表面活性剂科学系列第71卷第7章，马塞尔·德克尔公司(Marcel Dekker，Inc.)。另一种类型的污垢释放聚合物是包括核心结构和连接至该核心结构的多个烷氧基化基团的两亲性烷氧基化油污清洁聚合物。核心结构可以包括聚烷基亚胺结构或聚烷醇胺结构，如WO2009/087523中详细描述的(将其通过引用而特此结合)。此外，随机接枝共聚物是适合的污垢释放聚合物。适合的接枝共聚物更详细地描述于WO2007/138054、WO 2006/108856和WO 2006/113314中(将其通过引用而特此结合)。其他污垢释放聚合物是取代的多糖结构，尤其是取代的纤维素结构，例如改性纤维素衍生物，例如EP 1867808或WO 2003/040279中描述的那些(将二者都通过引用而特此结合)。适合的纤维素聚合物包括纤维素、纤维素醚、纤维素酯、纤维素酰胺及其混合物。适合的纤维素聚合物包括阴离子改性的纤维素、非离子改性的纤维素、阳离子改性的纤维素、兼性离子改性的纤维素及其混合物。适合的纤维素聚合物包括甲基纤维素、羧甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、酯羧甲基纤维素及其混合物。
抗再沉积剂
本发明的洗涤剂组合物还可以包括一种或多种抗再沉积剂，例如羧甲基纤维素(CMC)、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚氧乙烯和/或聚乙二醇(PEG)、丙烯酸的均聚物、丙烯酸和马来酸的共聚物、和乙氧基化的聚乙亚胺。以上在污垢释放聚合物下描述的纤维素基聚合物还可以用作抗再沉积剂。
流变改性剂
本发明的洗涤剂组合物还可以包括一种或多种流变改性剂、结构剂或增稠剂，不同于降粘剂。流变改性剂选自下组，该组由以下各项组成：非聚合物结晶、羟基功能材料、聚合物流变改性剂，它们为液体洗涤剂组合物的水性液相基质赋予剪切稀化特征。可以通过本领域已知的方法修饰和调整洗涤剂的流变学和粘度，例如如在EP 2169040中所示。
其他适合的辅料包括但不局限于防缩剂、抗皱剂、杀细菌剂、粘合剂、载体、染料、酶稳定剂、织物软化剂、填充剂、泡沫调节剂、助水溶剂、香料、色素、抑泡剂、溶剂以及用于液体洗涤剂的结构剂和/或结构弹性剂。
洗涤剂产品的配制品
本发明的洗涤剂组合物可以处于任何常规形式，例如棒、均匀的片剂、具有两个或更多个层的片剂、具有一个或多个室的袋、规则的或压缩的粉、颗粒、膏、凝胶、或规则压缩的或浓缩的液体。
袋可以被配置为单个或多个的室。可以是适合于容纳组合物的任何形式、形状和材料，例如不允许在接触水之前从袋中释放组合物。该袋由水溶性薄膜制成，它包含了一个内部体积。可以将所述内体积分为袋的室。优选的膜是形成膜或片的聚合材料，优选是聚合物。优选的聚合物、共聚物或其衍生物选自聚丙烯酸酯、和水溶性丙烯酸酯共聚物、甲基纤维素、羧甲基纤维素、糊精钠、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、麦芽糊精、聚甲基丙烯酸酯，最优选地是聚乙烯醇共聚物以及羟丙基甲基纤维素(HPMC)。优选地，在膜中的聚合物(例如PVA)的水平是至少约60％。优选的平均分子量将典型地是约20,000至约150,000。膜还可以是共混组合物，该共混组合物包括可水解降解并且水可溶的聚合物共混物，例如聚乳酸和聚乙烯醇(已知在贸易参考M8630下，如由美国印第安纳州的MonoSol LLC公司销售)加增塑剂，像甘油、乙二醇、丙二醇、山梨醇及其混合物。这些袋可以包含由该水溶性薄膜分隔的一种固体洗衣清洁组合物或部分组分和/或一种液体清洁组合物或部分组分。用于液体组分的室在组成上可以与包括固体的室不同：US 2009/0011970A1。
可以由水可溶的袋中或片剂的不同层中的室来将洗涤剂成分物理地彼此分开。因此，可以避免组分间的不良的存储相互作用。在洗涤溶液中，每个室的不同溶解曲线还可以引起选择的组分的延迟溶解。
非单位剂量的液体或凝胶洗涤剂可以是水性的，典型地包括按重量计至少20％并且高达95％的水，例如高达约70％的水、高达约65％的水、高达约55％的水、高达约45％的水、高达约35％的水。包括但不局限于链烷醇、胺、二醇、醚以及多元醇的其他类型的液体可以被包括在水性液体或凝胶中。含水液体或凝胶洗涤剂可以包含从0-30％的有机溶剂。
颗粒洗涤剂配制品
如描述于WO 09/092699、EP 1705241、EP 1382668、WO 07/001262、US 6472364、WO04/074419或WO 09/102854中的，可以配制颗粒洗涤剂。其他有用的洗涤剂配制品描述于以下各项中：WO 09/124162、WO 09/124163、WO 09/117340、WO 09/117341、WO 09/117342、WO09/072069、WO 09/063355、WO 09/132870、WO 09/121757、WO 09/112296、WO 09/112298、WO09/103822、WO 09/087033、WO 09/050026、WO 09/047125、WO 09/047126、WO 09/047127、WO09/047128、WO 09/021784、WO 09/010375、WO 09/000605、WO 09/122125、WO 09/095645、WO09/040544、WO 09/040545、WO 09/024780、WO 09/004295、WO 09/004294、WO 09/121725、WO09/115391、WO 09/115392、WO 09/074398、WO 09/074403、WO 09/068501、WO 09/065770、WO09/021813、WO 09/030632以及WO 09/015951。
WO 2011025615、WO 2011016958、WO 2011005803、WO 2011005623、WO2011005730、WO 2011005844、WO 2011005904、WO 2011005630、WO 2011005830、WO2011005912、WO 2011005905、WO 2011005910、WO 2011005813、WO 2010135238、WO2010120863、WO 2010108002、WO 2010111365、WO 2010108000、WO 2010107635、WO2010090915、WO 2010033976、WO 2010033746、WO 2010033747、WO 2010033897、WO2010033979、WO 2010030540、WO 2010030541、WO 2010030539、WO 2010024467、WO2010024469、WO 2010024470、WO 2010025161、WO 2010014395、WO 2010044905、
WO 2010145887、WO 2010142503、WO 2010122051、WO 2010102861、WO2010099997、WO 2010084039、WO 2010076292、WO 2010069742、WO 2010069718、WO2010069957、WO 2010057784、WO 2010054986、WO 2010018043、WO 2010003783、WO2010003792、
WO 2011023716、WO 2010142539、WO 2010118959、WO 2010115813、WO2010105942、WO 2010105961、WO 2010105962、WO 2010094356、WO 2010084203、WO2010078979、WO 2010072456、WO 2010069905、WO 2010076165、WO 2010072603、WO2010066486、WO 2010066631、WO 2010066632、WO 2010063689、WO 2010060821、WO2010049187、WO 2010031607、WO 2010000636。
用途
本发明还涉及用于使用α-淀粉酶变体的方法。因此，本发明涉及使用变体的方法，包括a)在对应于SEQ ID NO:1的成熟多肽的位置R181、G182、D183和G184的两个或更多个位置的缺失，b)在对应于SEQ ID NO:1的成熟多肽的位置Y198、Y200、L201、Y203和A204的一个或多个位置的取代，以及c)在对应于SEQ ID NO:1的成熟多肽的位置M202的位置的甲硫氨酸的取代，其中该变体与SEQ ID NO:1或2的成熟多肽具有至少80％，例如至少90％，但是小于100％序列一致性，并且其中该变体具有α-淀粉酶活性。
本发明的α-淀粉酶变体可用于洗涤剂组合物、衣物洗涤、餐具洗涤和/或低温清洁过程以及硬表面清洁(ADW、洗车、工业表面)。本发明的α-淀粉酶变体在餐具洗涤洗涤剂组合物中特别有用，因为它们针对漂白剂引起的氧化作用是稳定的并且具有改进的活性。
在洗涤剂中的用途。可以将本发明的多肽添加至洗涤剂组合物中并且因此变成洗涤剂组合物的组分，具体地是一种餐具洗涤洗涤剂组合物的组分。
本发明的去污剂组合物可例如配制为手洗或机洗洗衣去污剂组合物，包括适用于预处理有污溃的织物的洗衣添加组合物，和漂洗添加的织物软化剂剂组合物，或配制为用于一般家用硬表面清洁操作的去污剂组合物，或配制为供手洗或机洗的洗碟操作。
洗涤剂组合物可以进一步配制为单位剂量形式或为肥皂条或洗衣条，
在一个具体方面，本发明提供了一种洗涤剂添加剂，包含如在此描述的本发明的一种多肽。
方法
淀粉酶表达：可以如WO 2010115021或US 6,623,948中所披露的表达本发明的α-淀粉酶变体。
菌株：例如枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌，这些菌株在质粒上的或整合在芽孢杆菌属染色体上(例如在Pel或Amy基因座中)的表达盒中携带淀粉酶。
培养基：例如，LB、TY、培养基-16
培养基16
·甘油-5％w/v
·胰蛋白胨-0.5％w/v
·牛肉膏-0.5％w/v
·硝酸钠-1％w/v
·Na2HPO4-1.7％w/v
·KH2PO4-0.4％w/v
·NH4Cl-0.1％w/v
·NaCl-0.05％w/v
·调节pH至7并且高压杀菌。
就在接种前分开高压杀菌并且添加
·1.47％CaCl2-0.4ml用于100ml培养基
·2.465％MgSO4.7H2O-0.4ml用于100ml培养基
·1.39％FeSO4-0.04ml用于100ml培养基
·0.2％Na2MoO4.2H2O-0.04ml用于100ml培养基
·维生素混合液(包含0.25％硫胺素和0.25％抗坏血酸)-0.4ml的维生素混合液用于100ml培养基
·微量元素(包含0.5％MnCl2.4H2O、0.2％ZnCl2和0.1％CuSO4.5H2O)-0.04ml的微量元素溶液用于100ml培养基
SEQ ID NO:2的变体的构建
野生型淀粉酶如US 6,623,948中所描述进行分离并克隆进枯草芽孢杆菌的pel基因座，这样使得包括上Pel基因座的上游片段和包括下Pel基因座的下游片段，这样使得该淀粉酶在枯草芽孢杆菌中转化时将通过双交叉替换整合到Pel基因座中。
上片段进一步包括：三联启动子系统(如WO 99/43835中所述)，该三联启动子系统由来自地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)、和苏云金芽孢杆菌cryIIIA启动子(包括控制淀粉酶表达的稳定化序列)的启动子组成；以及用以指导到细胞外的输出的地衣芽孢杆菌淀粉酶信号的信号序列。下游片段进一步包括用于在包含氯霉素的培养基上进行选择的cat基因。
通过大引物诱变方法，使用编码所希望的氨基酸变化的诱变寡核苷酸，并且克隆到关于上述参照淀粉酶的表达盒中，来引入在序列ID no 2中的双缺失R181*+G182*、和N195F突变。通过淀粉酶基因的DNA测序确认该序列。
淀粉酶的生产和纯化
在培养基-16中，在37℃下，可以将淀粉酶表达克隆在180rpm下发酵72小时，并且将该发酵液在13131g下离心25分钟，以去除细胞块，并且然后使用0.7微米的玻璃滤器GF-F(沃特曼(Whatman))使用tarsons过滤组件进行过滤。
可以通过以下24孔板蛋白质纯化方法从上清液中纯化出参照淀粉酶和变体淀粉酶：要将3ml的在milli Q水中的丁基toyopearl树脂的50％浆体添加到24孔滤板的每个孔中，并且使该板经受真空以装填该塔板。应通过添加8mL的平衡缓冲液(50mM HEPES，pH 8.0+1M硫酸铵+1mM CaCl2)平衡该树脂，并且然后可以将8ml的淀粉酶样品添加至滤板的孔中并在板混合器上在350rpm下孵育8min。可以通过真空去除未结合部分，并且将树脂通过4个循环的以下行为来洗涤：添加8mL的平衡缓冲液(50mM HEPES，pH 8.0+1M硫酸铵+1mMCaCl2)，随后混合并孵育，并且最后通过真空去除洗涤缓冲液。
可以通过添加洗脱缓冲液(50mM HEPES，pH 8.0+1mM CaCl2)将该淀粉酶洗脱，进行混合并且孵育，之后通过真空将淀粉酶溶液收集在收集盘中。
测量淀粉分解活性(α-淀粉酶活性)的测定
EnzChek测定
可以通过以下EnzCheck测定确定淀粉酶活性或残余淀粉酶活性。该底物是一种玉米淀粉衍生物，DQTM淀粉(玉米淀粉BODIPY FL轭合物)，它是用
Figure BDA0003159978670000731
FL(4,4-二氟-5,7-二甲基-4-硼杂-3a,4a-二氮杂-s-引达省-3-丙酸)染料标记以使得荧光被淬灭的玉米淀粉。包含大约1mg冻干底物的一个小瓶溶解于100μL的50mM乙酸钠(pH 4.0)中。将小瓶涡旋20秒并且在室温下、黑暗中保持，并偶尔混合直到溶解为止。然后添加950μL 10mM乙酸钠、0.01％(w/V)
Figure BDA0003159978670000732
X100((聚乙二醇对-(1,1,3,3-四甲基丁基)-苯基醚(C14H22O(C2H4O)n(n＝9-10))，pH 5.0，充分涡旋并且在室温下、黑暗中储存直到准备使用为止。从1mL的此溶液中，通过与5mL 50mM HEPES、0.01％(w/V)Triton X100、1mM CaCl2，pH 7.0混合来制备该底物工作溶液。
将包括酶的洗涤剂在50mM HEPES、0.01％Triton X100、1mM CaCl2，pH 7.0中稀释至15ng酶蛋白/ml(6826.7倍稀释)的浓度。
为了测定，在一个黑色384孔微量滴定板中，将25μL底物工作溶液与25μL稀释酶混合10秒。在每个孔中在25℃每两分钟测量一次荧光强度(激发：485nm，发射：555nm)持续30分钟，并且将Vmax计算作为荧光强度相对于时间的曲线的斜率。曲线应是线性的，并且要调整残余活性测定以使得稀释的参照酶溶液在活性测定的线性范围内。
在一些实例中，对于测定存在来自不具有淀粉酶的洗涤剂的显著干扰。在此类情况下，可以使用可替代的淀粉酶测定。可以通过向处于两种水平的洗涤剂添加已知量的淀粉酶，并且然后测量两种样品的活性，来测试洗涤剂对淀粉酶测定的干扰。如果在所测量活性中的差异对应于在所添加淀粉酶之间的水平中的差异，那么可以使用该测定来确定储存后淀粉酶的残余活性。
PNP-G7测定
可以通过使用了PNP-G7底物的方法来确定α-淀粉酶活性。PNP-G7是4,6-亚乙基(G7)-对-硝基苯基(G1)-α,D-麦芽七糖苷的缩写，它是可由内切淀粉酶如α-淀粉酶切割的一种嵌段低聚糖。裂解之后，试剂盒中所包括的α-葡糖苷酶进一步消化水解底物以释放游离PNP分子，该分子具有黄颜色并且因而可通过可见分光光度法在λ＝405nm(400-420nm)处测量。包含PNP-G7底物和α-葡糖苷酶的试剂盒由罗氏/日立公司(Roche/Hitachi)制造(目录号11876473)。
试剂：
来自这个试剂盒的G7-PNP底物包含22mM 4,6-亚乙基-G7-PNP和52.4mM HEPES(2-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]-乙磺酸)，pH 7.0)。
α-葡糖苷酶试剂包含52.4mM HEPES、87mM NaCl、12.6mM MgCl2、0.075mM CaCl2、>4kU/Lα-葡糖苷酶。
通过将1mLα-葡糖苷酶试剂与0.2mL G7-PNP底物混合，产生底物工作溶液。此底物工作溶液在使用之前立即制成。
稀释缓冲液：50mM EPPS、0.01％(w/v)Triton X100(聚乙二醇对-(1,1,3,3-四甲基丁基)-苯基醚(C14H22O(C2H4O)n(n＝9-10)))、1mM CaCl2，pH 7.0。
程序：
将有待分析的淀粉酶样品稀释于稀释缓冲液中以确保稀释样品中的pH是7。通过将20μl稀释酶样品转移至96孔微量滴定板并且添加80μl底物工作溶液来执行测定。将溶液混合并且在室温预孵育1分钟并且在OD 405nm在5分钟范围内每20秒测量吸收。
在一组给定条件下，时间相关吸收曲线的斜率(每分钟的吸光度)与所讨论的α-淀粉酶的比活性(活性/mg酶)成正比例。淀粉酶样品应稀释至其中斜率低于0.4吸光度单位/分钟的水平。
百分点(pp)的确定
相对于亲本，变体的残余活性(稳定性)的改进百分点(pp)被计算为变体的残余活性和亲本的残余活性之间的差异，即，变体的残余活性减去亲本的残余活性。
Amylazyme活性测定：
α-淀粉酶活性还可通过使用了Amylazyme底物(来自麦格酶公司(Megazyme)，爱尔兰(Ireland))的方法来确定。Amylazyme片剂包括互联直链淀粉聚合物，这些聚合物呈不溶于水的球状微球形式。将一种蓝色染料共价结合至这些微球。微球中的互联直链淀粉聚合物以与α-淀粉酶活性成比例的速度降解。当α-淀粉酶降解了直链淀粉聚合物时，释放的蓝色染料是可溶于水的并且染料浓度可通过在650nm下测量吸光度来确定。蓝色的浓度与样品中的α-淀粉酶活性成比例。
将有待分析的淀粉酶样品稀释于具有所需pH的活性缓冲液中。将一个底物片剂悬浮于5mL活性缓冲液中并且在磁力搅拌器上混合。在混合底物期间，将150μl转移至微量滴定板(MTP)。将30μl稀释淀粉酶样品添加至150μl底物并且混合。37℃下孵育15分钟。通过添加30μl 1M NaOH并且混合来停止反应。在4000xg下离心MTP 5分钟。将100μl转移至新MTP并且测量620nm下的吸光度。
淀粉酶样品应稀释成使得650nm下的吸光度在0与2.2之间，并且在活性测定的线性范围内。
Phadebas活性测定
α-淀粉酶活性还可通过使用Phadebas底物(例如来自麦戈尔生命科学(MagleLife Sciences)，隆德(Lund)，瑞典(Sweden))的方法来确定。Phadebas片剂包括互联淀粉聚合物，这些聚合物呈不溶于水的球状微球形式。将一种蓝色染料共价结合至这些微球。微球中的互联淀粉聚合物以与α-淀粉酶活性成比例的速度降解。当α-淀粉酶降解了直链淀粉聚合物时，释放的蓝色染料是可溶于水的并且染料浓度可通过在650nm下测量吸光度来确定。蓝色的浓度与样品中的α-淀粉酶活性成比例。
将有待分析的淀粉酶样品稀释于具有所需pH的活性缓冲液中。将一个底物片剂悬浮于5mL活性缓冲液中并且在磁力搅拌器上混合。在混合底物期间，将150μl转移至微量滴定板(MTP)。将30μl稀释淀粉酶样品添加至150μl底物并且混合。37℃下孵育15分钟。通过添加30μl 1M NaOH并且混合来停止反应。在4000xg下离心MTP 5分钟。将100μl转移至新MTP并且测量620nm下的吸光度。
淀粉酶样品应稀释成使得650nm下的吸光度在0与2.2之间，并且在活性测定的线性范围内。
还原糖活性测定
α-淀粉酶活性还可通过使用例如玉米淀粉底物的还原糖测定来确定。通过与p-羟基苯甲酸酰肼(PHBAH)反应来确定用α-淀粉酶水解淀粉中的α-1,4-糖苷键所形成的多个还原端。与PHBAH反应之后，可通过405nm下的吸光度来测量还原端的数量并且还原端的浓度与样品中的α-淀粉酶活性成比例。
使玉米淀粉底物(3mg/mL)在milliQ水中蒸煮5分钟来溶解并且在测定之前冷却。关于终止液，制备一种Ka-Na-酒石酸盐/NaOH溶液(K-Na-酒石酸盐(默克(Merck)8087)50g/l，NaOH 20g/l)并且通过将p-羟基苯甲酸酰肼(PHBAH，西格玛(Sigma)H9882)添加至Ka-Na-酒石酸盐/NaOH溶液至15mg/mL来新鲜制备终止液。
在PCR-MTP中，将50μl活性缓冲液与50μl底物混合。添加50μl稀释酶并且混合。在PCR机器中在所需温度孵育5分钟。通过添加75μl终止液(Ka-Na-酒石酸盐/NaOH/PHBAH)来停止反应。在PCR机器中在95℃孵育10分钟。将150μl转移至新MTP并且测量405nm下的吸光度。
淀粉酶样品应稀释成使得405nm下的吸光度在0与2.2之间，并且在活性测定的线性范围内。
使用自动机械应力测定的α-淀粉酶的洗涤性能
为了评定α-淀粉酶在洗涤剂基础组合物中的洗涤性能，可以使用自动机械应力测定(AMSA)进行洗涤实验。使用AMSA测试，可以检査大量小体积酶洗涤剂溶液的洗涤性能。AMSA板具有许多用于测试溶液的缝和盖子，盖子将待洗涤的纺织品小块布样对所有缝开口强力挤压。在洗涤时间期间，板、测试溶液、纺织品和盖子剧烈振动从而使测试溶液与纺织品接触并以规则、周期性摆动方式施加机械应力。关于进一步描述，参见WO 02/42740，尤其是第23-24页的“具体方法实施例”段落。
洗涤性能总体描述
制备一种测试溶液，该测试溶液包含水(6°dH)、0.79g/l洗涤剂(例如，如下文描述的标准洗涤剂J)和处于浓度0或0.2mg酶蛋白/L的本发明的酶。添加带有淀粉污渍的织物(来自测试材料中心BV的CS-28，邮箱120，3133KT，弗拉尔丁恩，荷兰)并且将它们在15℃和30℃洗涤20分钟，或可替代地在15℃和40℃洗涤20分钟，如在实例中详细说明的那样。在流动自来水下彻底漂洗并且在黑暗中干燥之后，随后测量带有污渍的织物的光强度值作为洗涤性能的量度。具有0mg酶蛋白/L的测试用作空白并且对应于来自洗涤剂的贡献。优选地，在洗涤步骤期间施加机械作用，例如以将洗涤溶液与织物一起振摇、转动或搅拌的形式施加。AMSA洗涤性能实验在以下详细说明的实验条件下进行：
表A：实验条件
洗涤剂 液体标准洗涤剂J(参见表B)
洗涤剂剂量 0.79g/L
测试溶液体积 160μL
pH 按原来的情况
洗涤时间 20分钟
温度 15℃或30℃
水硬度 6°dH
测试中的酶浓度 0.2mg酶蛋白/L
测试材料 CS-28(大米淀粉棉)
表B：标准洗涤剂J
化合物 化合物的含量(％w/w) 活性组分％(％w/w)
LAS 5.15 5.00
AS 5.00 4.50
AEOS 14.18 10.00
可可脂肪酸 1.00 1.00
AEO 5.00 5.00
MEA 0.30 0.30
MPG 3.00 3.00
乙醇 1.50 1.35
DTPA(作为Na5盐) 0.25 0.10
柠檬酸钠 4.00 4.00
甲酸钠 1.00 1.00
氢氧化钠 0.66 0.66
H<sub>2</sub>O，离子交换 58.95 58.95
通过将CaCl2、MgCl2、以及NaHCO3(Ca2+:Mg2+:HCO3 -＝2:1:4.5)添加到测试系统中将水硬度调节至6°dH。在洗涤之后，将纺织品用自来水沖洗并干燥。
表C：实验条件
洗涤剂 液体标准洗涤剂A(参见表D)
洗涤剂剂量 3.33g/L
测试溶液体积 160μL
pH 按原来的情况
洗涤时间 20分钟
温度 15℃或40℃
水硬度 15°dH
测试中的酶浓度 0.2mg酶蛋白/L
测试材料 CS-28(大米淀粉棉)
表D：标准洗涤剂A
化合物 化合物的含量(％w/w) 活性组分％(％w/w)
LAS 12.00 11.60
AEOS，SLES 17.63 4.90
大豆脂肪酸 2.75 2.48
可可脂肪酸 2.75 2.80
AEO 11.00 11.00
氢氧化钠 1.75 1.80
乙醇/丙-2-醇 3.00 2.70/0.30
MPG 6.00 6.00
甘油 1.71 1.70
TEA 3.33 3.30
甲酸钠 1.00 1.00
柠檬酸钠 2.00 2.00
DTMPA 0.48 0.20
PCA 0.46 0.18
苯氧基乙醇 0.50 0.50
H<sub>2</sub>O，离子交换 33.64 33.64
通过将CaCl2、MgCl2、以及NaHCO3(Ca2+:Mg2+:HCO3-＝4:1:7.5)添加至测试系统中，将水硬度调节至15°dH。在洗涤之后，将纺织品用自来水沖洗并干燥。
表E：实验条件
Figure BDA0003159978670000771
Figure BDA0003159978670000781
表F：标准洗涤剂X
化合物 化合物的含量(％w/w) 活性组分％(％w/w)
LAS 16.50 15.00
AEO* 2.00 2.00
碳酸钠 20.00 20.00
硅酸二钠 12.00 9.90
沸石A 15.00 12.00
硫酸钠 33.50 33.50
PCA 1.00 1.00
*将标准洗涤剂X混合，不含AEO。在洗涤之前，将AEO单独地添加。
通过将CaCl2、MgCl2、以及NaHCO3(Ca2+:Mg2+:HCO3 -＝2:1:4.5)添加到测试系统中将水硬度调节至12°dH。在洗涤之后，将纺织品用自来水沖洗并干燥。
标准洗涤剂1和2
Figure BDA0003159978670000782
Figure BDA0003159978670000791
洗涤性能可以被测量为亮度，表达为当用白光照亮时从样品反射的光的强度。当样品受到污染时，反射光的强度低于干净样品的反射光的强度。因此，反射光的强度可以用于测量洗涤性能。
使用专业平板扫描仪(Kodak iQsmart，柯达(Kodak))进行颜色测量，该扫描仪用于捕获所洗涤纺织品的图像。
为了从扫描图像中提取光强度的值，将来自图像的24位像素值转化为红色、绿色和蓝色(rgb)的值。通过将rgb值作为向量相加在一起并然后考虑所得向量的长度可以计算强度值(Int)：
Figure BDA0003159978670000792
纺织品：
纺织品样品CS-28(棉花上的大米淀粉)获得自试验材料
BV中心，邮箱120，3133KT，弗拉尔丁恩，荷兰。
用于自动餐具洗涤的自动机械应力测定(AMSA)
进行洗涤实验，以便评估所选α-淀粉酶变体在餐具洗涤洗涤剂组合物中的洗涤性能。可以使用自动机械应力测定(AMSA)测试本申请的α-淀粉酶变体。使用AMSA，可以检査许多小体积酶洗涤剂溶液的洗涤性能。AMSA板具有许多用于测试溶液的槽，以及盖子，盖子将待洗涤的三聚氰胺瓦片对槽开口强力挤压。在洗涤过程中，板、测试溶液、三聚氰胺瓦片和盖子剧烈振动从而使测试溶液与玷污的三聚氰胺瓦片接触并以规则、周期性摆动方式施加机械应力。关于进一步描述，参见WO 02/42740，尤其是第23-24页的“具体方法实施例”段落。
可以在根据以下一个或多个表指定的实验条件下进行实验：
Figure BDA0003159978670000793
Figure BDA0003159978670000801
通过将CaCl2、MgCl2、以及NaHCO3(Ca2+:Mg2+＝4:1:10)添加到测试系统中将水硬度调节至17°dH。在洗涤之后，将三聚氰胺瓦片用自来水沖洗并干燥。
将酶变体的性能作为用该特定α-淀粉酶洗涤的三聚氰胺瓦片的颜色的亮度来测量。亮度也可以表示为在白光照射样品时从样品反射的光的强度。当样品受到污染时，反射光的强度低于干净样品的反射光的强度。因此，反射光的强度可以用于测量蛋白酶的洗涤性能。
使用专业平板扫描仪(Kodak iQsmart(柯达(Kodak))，Midtager29，DK-2605
Figure BDA0003159978670000802
丹麦)进行颜色测量，该扫描仪用于捕获所洗涤三聚氰胺瓦片的图像。
为了从扫描的图像中提取光强度值，使用专门设计的软件应用程序(诺维信颜色矢量分析仪(Novozymes Colour Vector Analyzer))。该程序从图像中检索24位像素值并将其转化成红、绿和蓝色的值(RGB)。通过将RGB值作为向量相加在一起并然后考虑所得向量的长度可以计算强度值(Int)：
Figure BDA0003159978670000811
纺织品：
带有淀粉的标准三聚氰胺瓦片(例如DM-77和DM-78)可以获得自测试材料BV中心，邮政信箱120，3133KT弗拉尔丁恩，荷兰。
Terg-O-tometer(TOM)洗涤测定
Tergo-To-Meter(TOM)是一种中等规模标准洗涤系统，它可以应用于同时测试12种不同洗涤条件。TOM基本上是大型的具有多达12个开放金属烧杯淹没至其中的温度受控的水浴。每个烧杯构成一个小的顶部加载型洗涤机器并且在实验期间，它们中的每一者将包含特定洗涤剂/酶系统的溶液并且对弄脏的和未弄脏的织物测试其性能。通过旋转搅拌臂获得机械应力，该旋转搅拌臂搅拌在每个烧杯内的液体。因为TOM杯子不含盖子，所以有可能在TOM实验期间收回样品并且在洗涤期间在线分析信息。
TOM标准洗涤系统主要用于清洁剂和酶的中等规模测试，在例如US或LA/AP洗涤条件下。在一个TOM实验中，如压载物与污物的比率和织物与洗涤液的比率的因素可以变化。因此，TOM提供了在小规模实验(如AMSA和微型洗涤)与在顶部加载型洗衣机中的更费时的全规模实验之间的联系。
设备：水浴具有12个钢制烧杯并且每个烧杯1个旋转臂，每个烧杯的容量是500或1200mL的洗涤剂溶液。温度范围是从5℃至80℃。水浴应当用去离子水填充。转动速度可以设定到高达70至120转/分钟。
TOM洗涤性能
通过添加CaCl2、MgCl2和NAHCO3将水硬度调节至下述强度。如下所述，在一个桶中制备具有所希望的量的洗涤剂、温度和水硬度的洗涤溶液。洗涤剂在磁搅拌10min期间溶解。
在Terg-O-Tometer中，根据以下设置设定水浴中的温度和转速(rpm)。当根据设置调节温度(公差是+/-0.5℃)时，将洗涤溶液根据下文描述的量添加至TOM烧杯中。
在烧杯中以120rpm进行搅拌。将2个大米淀粉小块布样(CS-28)和污垢压载物添加至每个烧杯中并且根据下文所述的时间进行洗涤。将小块布样在冷自来水中冲洗5min。将小块布样于黑暗中静置干燥过夜。
纺织品：纺织品样品CS-28(棉花上的大米淀粉)获得自测试材料BV中心，邮政信箱120，3133KT弗拉尔丁恩，荷兰。
污垢压载物：污垢压载物(棉花/聚酯上的大米淀粉)(EMPA 162)获得自测试材料BV中心，邮政信箱120，3133KT弗拉尔丁恩，荷兰。Bistro肉汁(063KC)、Frij巧克力奶昔、Heinz意大利面条(113KC)、Herseys双层巧克力获得自Warwick Equest有限公司，55单元，康塞特商业园(Consett Business Park)，康塞特，达勒姆郡，DH8 6BN，英国
实验条件TOM
Figure BDA0003159978670000821
洗涤剂和测试材料可以如下：
Figure BDA0003159978670000822
将洗涤性能作为所洗涤纺织品颜色的亮度来测量，表示为反射值。使用Macbeth7000 Color Eye分光光度计进行反射测量。测量每个干小块布样。由于存在来自背景的干扰风险，在测量反射期间将小块布样置于4层织物的顶部。在460nm处测量反射。不包括UV滤光片。计算小块布样的反射的平均结果。
实例
实例1：确定具有α-淀粉酶活性的变体
当使用SEQ ID NO:1来编号时，设计在跨越氨基酸位置198-204的环中的多个取代的文库，使用SEQ ID NO:2作为起始点，通过Slonomics技术产生的淀粉酶DNA，并且淀粉酶表达盒被转化进枯草芽孢杆菌中以提供文库。使用Enzcheck底物表达显著量的淀粉酶活性的克隆被分离并且取代的组合通过测序来鉴定。表G示出SEQ.ID NO 2的变体的氨基酸198-204的氨基酸序列(使用SEQ ID NO:1来编号)
表G：氨基酸198-204的氨基酸序列(使用SEQ ID NO:1来编号)
Figure BDA0003159978670000831
Figure BDA0003159978670000841
实例2：淀粉酶活性测试
在上述的pNP-G7测定中测试产生的变体从而确定结合至抗体后的淀粉酶活性。
将抗体稀释于磷酸盐缓冲盐水(PBS)(0.010M磷酸盐缓冲液pH 7.4，0.0027M KCl，0.14M NaCl)缓冲液中至浓度为10μg/ml。用抗体将maxisorp微量滴定板包衣：通过向每个孔中添加100μl稀释的抗体(10μg/ml)并且在室温下(RT)孵育1h，随后以800rpm混合。孵育后，用3x200μl磷酸盐缓冲盐水和0.05％Tween(PBST)(0.010M磷酸盐缓冲液pH 7.4，0.0027M KCl，14M NaCl，0.05％Tween 20)缓冲液洗涤(使用Bio-Tek ELx405ELISA洗涤器)微量滴定板。
将据有淀粉酶变体培养液的微量滴定板旋转并将上清液转移至新的微量滴定板上并且在PBST缓冲液中稀释4x。将100μl稀释的上清液转移至抗体包衣的maxisorp微量滴定板上并且在室温下孵育1h并且以800rpm混合。孵育后，在PBST缓冲液(3x200μl，ELISA洗涤器)中洗涤微量滴定板。
在测量在405nm的吸光度之前通过添加100μl pNP-G7底物至所有孔中并且混合1分钟来测量结合至抗体上的淀粉酶变体的淀粉酶活性。斜率(吸光度每分钟)被确定并且只使用了曲线的线性范围。
将结果与对照样品相比，并且比对照样品具有更高活性的样品在pNP-G7底物上，在测试条件下显示出改进的比活性。
表H：比活性测定的结果
Figure BDA0003159978670000851
在此描述并且要求保护的本发明不局限于在此披露的特定方面的范围，因为这些方面旨在作为本发明若干方面的说明。预期任何等效方面都处于本发明的范围内。实际上，除在此所示和描述的那些之外，本发明的不同修改对于本领域普通技术人员而言从前述描述将变得清楚。这样的实施例也旨在落入所附权利要求的范围内。在有冲突的情况下，以包括定义的本披露为准。
序列表
<110> 诺维信公司（Novozymes A/S）
<120> α-淀粉酶变体
<130> 12706-WO-PCT
<160> 41
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 485
<212> PRT
<213> 芽孢杆菌属物种
<400> 1
His His Asp Gly Thr Asn Gly Thr Ile Met Gln Tyr Phe Glu Trp Asn
1 5 10 15
Val Pro Asn Asp Gly Gln His Trp Asn Arg Leu His Asn Asn Ala Gln
20 25 30
Asn Leu Lys Asn Ala Gly Ile Thr Ala Ile Trp Ile Pro Pro Ala Trp
35 40 45
Lys Gly Thr Ser Gln Asn Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr
50 55 60
Asp Leu Gly Glu Phe Asn Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly
65 70 75 80
Thr Lys Ala Glu Leu Glu Arg Ala Ile Arg Ser Leu Lys Ala Asn Gly
85 90 95
Ile Gln Val Tyr Gly Asp Val Val Met Asn His Lys Gly Gly Ala Asp
100 105 110
Phe Thr Glu Arg Val Gln Ala Val Glu Val Asn Pro Gln Asn Arg Asn
115 120 125
Gln Glu Val Ser Gly Thr Tyr Gln Ile Glu Ala Trp Thr Gly Phe Asn
130 135 140
Phe Pro Gly Arg Gly Asn Gln His Ser Ser Phe Lys Trp Arg Trp Tyr
145 150 155 160
His Phe Asp Gly Thr Asp Trp Asp Gln Ser Arg Gln Leu Ala Asn Arg
165 170 175
Ile Tyr Lys Phe Arg Gly Asp Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Asp
180 185 190
Thr Glu Asn Gly Asn Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Val Asp Met
195 200 205
Asp His Pro Glu Val Ile Asn Glu Leu Asn Arg Trp Gly Val Trp Tyr
210 215 220
Ala Asn Thr Leu Asn Leu Asp Gly Phe Arg Leu Asp Ala Val Lys His
225 230 235 240
Ile Lys Phe Ser Phe Met Arg Asp Trp Leu Gly His Val Arg Gly Gln
245 250 255
Thr Gly Lys Asn Leu Phe Ala Val Ala Glu Tyr Trp Lys Asn Asp Leu
260 265 270
Gly Ala Leu Glu Asn Tyr Leu Ser Lys Thr Asn Trp Thr Met Ser Ala
275 280 285
Phe Asp Val Pro Leu His Tyr Asn Leu Tyr Gln Ala Ser Asn Ser Ser
290 295 300
Gly Asn Tyr Asp Met Arg Asn Leu Leu Asn Gly Thr Leu Val Gln Arg
305 310 315 320
His Pro Ser His Ala Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Thr Gln Pro
325 330 335
Gly Glu Ala Leu Glu Ser Phe Val Gln Gly Trp Phe Lys Pro Leu Ala
340 345 350
Tyr Ala Thr Ile Leu Thr Arg Glu Gln Gly Tyr Pro Gln Val Phe Tyr
355 360 365
Gly Asp Tyr Tyr Gly Ile Pro Ser Asp Gly Val Pro Ser Tyr Arg Gln
370 375 380
Gln Ile Asp Pro Leu Leu Lys Ala Arg Gln Gln Tyr Ala Tyr Gly Arg
385 390 395 400
Gln His Asp Tyr Phe Asp His Trp Asp Val Ile Gly Trp Thr Arg Glu
405 410 415
Gly Asn Ala Ser His Pro Asn Ser Gly Leu Ala Thr Ile Met Ser Asp
420 425 430
Gly Pro Gly Gly Ser Lys Trp Met Tyr Val Gly Arg Gln Lys Ala Gly
435 440 445
Glu Val Trp His Asp Met Thr Gly Asn Arg Ser Gly Thr Val Thr Ile
450 455 460
Asn Gln Asp Gly Trp Gly His Phe Phe Val Asn Gly Gly Ser Val Ser
465 470 475 480
Val Trp Val Lys Arg
485
<210> 2
<211> 483
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 2
His His Asp Gly Thr Asn Gly Thr Ile Met Gln Tyr Phe Glu Trp Asn
1 5 10 15
Val Pro Asn Asp Gly Gln His Trp Asn Arg Leu His Asn Asn Ala Gln
20 25 30
Asn Leu Lys Asn Ala Gly Ile Thr Ala Ile Trp Ile Pro Pro Ala Trp
35 40 45
Lys Gly Thr Ser Gln Asn Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr
50 55 60
Asp Leu Gly Glu Phe Asn Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly
65 70 75 80
Thr Lys Ala Glu Leu Glu Arg Ala Ile Arg Ser Leu Lys Ala Asn Gly
85 90 95
Ile Gln Val Tyr Gly Asp Val Val Met Asn His Lys Gly Gly Ala Asp
100 105 110
Phe Thr Glu Arg Val Gln Ala Val Glu Val Asn Pro Gln Asn Arg Asn
115 120 125
Gln Glu Val Ser Gly Thr Tyr Gln Ile Glu Ala Trp Thr Gly Phe Asn
130 135 140
Phe Pro Gly Arg Gly Asn Gln His Ser Ser Phe Lys Trp Arg Trp Tyr
145 150 155 160
His Phe Asp Gly Thr Asp Trp Asp Gln Ser Arg Gln Leu Ala Asn Arg
165 170 175
Ile Tyr Lys Phe Arg Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Asp Thr Glu
180 185 190
Phe Gly Asn Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Val Asp Met Asp His
195 200 205
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Gly Glu Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Ser Ser Glu Asn Gly Asn
180 185 190
Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Val Asp Tyr Asp His Pro Asp Val
195 200 205
Val Ala Glu Thr Lys Lys Trp Gly Ile Trp Tyr Ala Asn Glu Leu Ser
210 215 220
Leu Asp Gly Phe Arg Ile Asp Ala Ala Lys His Ile Lys Phe Ser Phe
225 230 235 240
Leu Arg Asp Trp Val Gln Ala Val Arg Gln Ala Thr Gly Lys Glu Met
245 250 255
Phe Thr Val Ala Glu Tyr Trp Gln Asn Asn Ala Gly Lys Leu Glu Asn
260 265 270
Tyr Leu Asn Lys Thr Ser Phe Asn Gln Ser Val Phe Asp Val Pro Leu
275 280 285
His Phe Asn Leu Gln Ala Ala Ser Ser Gln Gly Gly Gly Tyr Asp Met
290 295 300
Arg Arg Leu Leu Asp Gly Thr Val Val Ser Arg His Pro Glu Lys Ala
305 310 315 320
Val Thr Phe Val Glu Asn His Asp Thr Gln Pro Gly Gln Ser Leu Glu
325 330 335
Ser Thr Val Gln Thr Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr Ala Phe Ile Leu
340 345 350
Thr Arg Glu Ser Gly Tyr Pro Gln Val Phe Tyr Gly Asp Met Tyr Gly
355 360 365
Thr Lys Gly Thr Ser Pro Lys Glu Ile Pro Ser Leu Lys Asp Asn Ile
370 375 380
Glu Pro Ile Leu Lys Ala Arg Lys Glu Tyr Ala Tyr Gly Pro Gln His
385 390 395 400
Asp Tyr Ile Asp His Pro Asp Val Ile Gly Trp Thr Arg Glu Gly Asp
405 410 415
Ser Ser Ala Ala Lys Ser Gly Leu Ala Ala Leu Ile Thr Asp Gly Pro
420 425 430
Gly Gly Ser Lys Arg Met Tyr Ala Gly Leu Lys Asn Ala Gly Glu Thr
435 440 445
Trp Tyr Asp Ile Thr Gly Asn Arg Ser Asp Thr Val Lys Ile Gly Ser
450 455 460
Asp Gly Trp Gly Glu Phe His Val Asn Asp Gly Ser Val Ser Ile Tyr
465 470 475 480
Val Gln Lys
<210> 11
<211> 515
<212> PRT
<213> 芽孢杆菌属物种
<400> 11
Ala Ala Pro Phe Asn Gly Thr Met Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr Leu
1 5 10 15
Pro Asp Asp Gly Thr Leu Trp Thr Lys Val Ala Asn Glu Ala Asn Asn
20 25 30
Leu Ser Ser Leu Gly Ile Thr Ala Leu Trp Leu Pro Pro Ala Tyr Lys
35 40 45
Gly Thr Ser Arg Ser Asp Val Gly Tyr Gly Val Tyr Asp Leu Tyr Asp
50 55 60
Leu Gly Glu Phe Asn Gln Lys Gly Ala Val Arg Thr Lys Tyr Gly Thr
65 70 75 80
Lys Ala Gln Tyr Leu Gln Ala Ile Gln Ala Ala His Ala Ala Gly Met
85 90 95
Gln Val Tyr Ala Asp Val Val Phe Asp His Lys Gly Gly Ala Asp Gly
100 105 110
Thr Glu Trp Val Asp Ala Val Glu Val Asn Pro Ser Asp Arg Asn Gln
115 120 125
Glu Ile Ser Gly Thr Tyr Gln Ile Gln Ala Trp Thr Lys Phe Asp Phe
130 135 140
Pro Gly Arg Gly Asn Thr Tyr Ser Ser Phe Lys Trp Arg Trp Tyr His
145 150 155 160
Phe Asp Gly Val Asp Trp Asp Glu Ser Arg Lys Leu Ser Arg Ile Tyr
165 170 175
Lys Phe Arg Gly Ile Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Asp Thr Glu
180 185 190
Asn Gly Asn Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Leu Asp Met Asp His
195 200 205
Pro Glu Val Val Thr Glu Leu Lys Ser Trp Gly Lys Trp Tyr Val Asn
210 215 220
Thr Thr Asn Ile Asp Gly Phe Arg Leu Asp Ala Val Lys His Ile Lys
225 230 235 240
Phe Ser Phe Phe Pro Asp Trp Leu Ser Asp Val Arg Ser Gln Thr Gly
245 250 255
Lys Pro Leu Phe Thr Val Gly Glu Tyr Trp Ser Tyr Asp Ile Asn Lys
260 265 270
Leu His Asn Tyr Ile Met Lys Thr Asn Gly Thr Met Ser Leu Phe Asp
275 280 285
Ala Pro Leu His Asn Lys Phe Tyr Thr Ala Ser Lys Ser Gly Gly Thr
290 295 300
Phe Asp Met Arg Thr Leu Met Thr Asn Thr Leu Met Lys Asp Gln Pro
305 310 315 320
Thr Leu Ala Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Thr Glu Pro Gly Gln
325 330 335
Ala Leu Gln Ser Trp Val Asp Pro Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr Ala
340 345 350
Phe Ile Leu Thr Arg Gln Glu Gly Tyr Pro Cys Val Phe Tyr Gly Asp
355 360 365
Tyr Tyr Gly Ile Pro Gln Tyr Asn Ile Pro Ser Leu Lys Ser Lys Ile
370 375 380
Asp Pro Leu Leu Ile Ala Arg Arg Asp Tyr Ala Tyr Gly Thr Gln His
385 390 395 400
Asp Tyr Leu Asp His Ser Asp Ile Ile Gly Trp Thr Arg Glu Gly Val
405 410 415
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420 425 430
Gly Gly Ser Lys Trp Met Tyr Val Gly Lys Gln His Ala Gly Lys Val
435 440 445
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450 455 460
Asp Gly Trp Gly Glu Phe Lys Val Asn Gly Gly Ser Val Ser Val Trp
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485 490 495
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Ala Trp Pro
515
<210> 12
<211> 486
<212> PRT
<213> 芽孢杆菌属物种
<400> 12
Thr Phe Ala Gly Asp Asn Gly Thr Met Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr
1 5 10 15
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Asp Leu Gly Glu Phe Asn Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly
65 70 75 80
Thr Lys Ala Gln Leu Gln Ser Ala Ile Thr Ser Leu His Asn Asn Gly
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Tyr Phe Asp Gly Val Asp Trp Asp Gln Ser Arg Gln Leu Ser Gly Lys
165 170 175
Ile Tyr Gln Ile Gln Gly Thr Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Asp
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Ser Glu Asn Gly Asn Tyr Asp Tyr Leu Met Gly Ala Asp Ile Asp Tyr
195 200 205
Asp His Pro Asp Val Gln Thr Glu Val Lys Asn Trp Gly Lys Trp Phe
210 215 220
Val Asn Thr Leu Asn Leu Asp Gly Val Arg Leu Asp Ala Val Lys His
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Ile Lys Phe Asp Tyr Met Ser Ser Trp Leu Ser Ser Val Lys Ser Thr
245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
Leu Phe Asp Val Pro Leu His Met Asn Phe Gln Ala Ala Ala Asn Gly
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Asn His Pro Ile Gln Ala Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Thr Glu
325 330 335
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340 345 350
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355 360 365
Tyr Gly Asp Tyr Tyr Gly Ile Pro Ser Gln Ser Val Ser Ala Lys Ser
370 375 380
Thr Trp Leu Asp Lys Gln Leu Ser Ala Arg Lys Ser Tyr Ala Tyr Gly
385 390 395 400
Thr Gln His Asp Tyr Leu Asp Asn Gln Asp Val Ile Gly Trp Thr Arg
405 410 415
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420 425 430
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435 440 445
Gly Gln Val Phe Lys Asp Ile Thr Gly Asn Arg Thr Asp Thr Val Thr
450 455 460
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Ser Ile Trp Val Lys Gln
485
<210> 13
<211> 484
<212> PRT
<213> 芽孢杆菌属物种
<400> 13
Asn Thr Ala Pro Ile Asn Glu Thr Met Met Gln Tyr Phe Glu Trp Asp
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Leu Pro Asn Asp Gly Thr Leu Trp Thr Lys Val Lys Asn Glu Ala Ala
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Asn Leu Ser Ser Leu Gly Ile Thr Ala Leu Trp Leu Pro Pro Ala Tyr
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Asp Leu Gly Glu Phe Asn Gln Lys Gly Thr Ile Arg Thr Lys Tyr Gly
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Thr Lys Thr Gln Tyr Ile Gln Ala Ile Gln Ala Ala Lys Ala Ala Gly
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Asn Thr Thr Asn Ile Asp Gly Phe Arg Leu Asp Ala Val Lys His Ile
225 230 235 240
Lys Tyr Ser Phe Phe Pro Asp Trp Leu Thr Tyr Val Arg Asn Gln Thr
245 250 255
Gly Lys Asn Leu Phe Ala Val Gly Glu Phe Trp Ser Tyr Asp Val Asn
260 265 270
Lys Leu His Asn Tyr Ile Thr Lys Thr Asn Gly Ser Met Ser Leu Phe
275 280 285
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325 330 335
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340 345 350
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355 360 365
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370 375 380
Ile Asp Pro Leu Leu Ile Ala Arg Arg Asp Tyr Ala Tyr Gly Thr Gln
385 390 395 400
Arg Asp Tyr Ile Asp His Gln Asp Ile Ile Gly Trp Thr Arg Glu Gly
405 410 415
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420 425 430
Pro Gly Gly Ser Lys Trp Met Tyr Val Gly Lys Lys His Ala Gly Lys
435 440 445
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450 455 460
Ala Asp Gly Trp Gly Glu Phe Lys Val Asn Gly Gly Ser Val Ser Ile
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Trp Val Ala Lys
<210> 14
<211> 485
<212> PRT
<213> 噬纤维菌属物种
<400> 14
Ala Ala Thr Asn Gly Thr Met Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr Val Pro
1 5 10 15
Asn Asp Gly Gln Gln Trp Asn Arg Leu Arg Thr Asp Ala Pro Tyr Leu
20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
Gly Glu Leu Lys Ser Ala Val Asn Thr Leu His Ser Asn Gly Ile Gln
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100 105 110
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Thr Ser Gly Glu Tyr Asn Ile Gln Ala Trp Thr Gly Phe Asn Phe Pro
130 135 140
Gly Arg Gly Thr Thr Tyr Ser Asn Phe Lys Trp Gln Trp Phe His Phe
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Asp Gly Thr Asp Trp Asp Gln Ser Arg Ser Leu Ser Arg Ile Phe Lys
165 170 175
Phe Arg Gly Thr Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Ser Ser Glu Asn
180 185 190
Gly Asn Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Ile Asp Tyr Asp His Pro
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Val Gly Leu Asp Gly Tyr Arg Leu Asp Ala Val Lys His Ile Lys Phe
225 230 235 240
Ser Phe Leu Lys Asp Trp Val Asp Asn Ala Arg Ala Ala Thr Gly Lys
245 250 255
Glu Met Phe Thr Val Gly Glu Tyr Trp Gln Asn Asp Leu Gly Ala Leu
260 265 270
Asn Asn Tyr Leu Ala Lys Val Asn Tyr Asn Gln Ser Leu Phe Asp Ala
275 280 285
Pro Leu His Tyr Asn Phe Tyr Ala Ala Ser Thr Gly Gly Gly Tyr Tyr
290 295 300
Asp Met Arg Asn Ile Leu Asn Asn Thr Leu Val Ala Ser Asn Pro Thr
305 310 315 320
Lys Ala Val Thr Leu Val Glu Asn His Asp Thr Gln Pro Gly Gln Ser
325 330 335
Leu Glu Ser Thr Val Gln Pro Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr Ala Phe
340 345 350
Ile Leu Thr Arg Ser Gly Gly Tyr Pro Ser Val Phe Tyr Gly Asp Met
355 360 365
Tyr Gly Thr Lys Gly Thr Thr Thr Arg Glu Ile Pro Ala Leu Lys Ser
370 375 380
Lys Ile Glu Pro Leu Leu Lys Ala Arg Lys Asp Tyr Ala Tyr Gly Thr
385 390 395 400
Gln Arg Asp Tyr Ile Asp Asn Pro Asp Val Ile Gly Trp Thr Arg Glu
405 410 415
Gly Asp Ser Thr Lys Ala Lys Ser Gly Leu Ala Thr Val Ile Thr Asp
420 425 430
Gly Pro Gly Gly Ser Lys Arg Met Tyr Val Gly Thr Ser Asn Ala Gly
435 440 445
Glu Ile Trp Tyr Asp Leu Thr Gly Asn Arg Thr Asp Lys Ile Thr Ile
450 455 460
Gly Ser Asp Gly Tyr Ala Thr Phe Pro Val Asn Gly Gly Ser Val Ser
465 470 475 480
Val Trp Val Gln Gln
485
<210> 15
<211> 486
<212> PRT
<213> 芽孢杆菌属物种
<400> 15
Asp Thr Val Asn Asn Gly Thr Leu Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr Ala
1 5 10 15
Pro Asn Asp Gly Asn His Trp Asn Arg Leu Arg Thr Asp Ala Glu Asn
20 25 30
Leu Ala Gln Lys Gly Ile Thr Ser Val Trp Ile Pro Pro Ala Tyr Lys
35 40 45
Gly Thr Thr Gln Asn Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr Asp
50 55 60
Leu Gly Glu Phe Asn Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly Thr
65 70 75 80
Lys Ala Gln Leu Lys Ser Ala Ile Asp Ala Leu His Lys Lys Asn Ile
85 90 95
Asp Val Tyr Gly Asp Val Val Met Asn His Lys Gly Gly Ala Asp Tyr
100 105 110
Thr Glu Thr Val Thr Ala Val Glu Val Asp Pro Ser Asn Arg Asn Val
115 120 125
Glu Val Ser Gly Asp Tyr Glu Ile Ser Ala Trp Thr Gly Phe Asn Phe
130 135 140
Pro Gly Arg Gly Asp Ser Tyr Ser Asn Phe Lys Trp Lys Trp Tyr His
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Phe Asp Gly Thr Asp Trp Asp Glu Gly Arg Lys Leu Asn Arg Ile Tyr
165 170 175
Lys Phe Arg Gly Ile Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Ser Ser Glu
180 185 190
Asn Gly Asn Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Leu Asp Phe Asp His
195 200 205
Pro Asp Val Ala Asn Glu Met Lys Lys Trp Gly Thr Trp Tyr Ala Asn
210 215 220
Glu Leu Asn Leu Asp Gly Phe Arg Leu Asp Ala Val Lys His Ile Asp
225 230 235 240
His Glu Tyr Leu Arg Asp Trp Val Asn His Val Arg Gln Gln Thr Gly
245 250 255
Lys Glu Met Phe Ala Val Ala Glu Tyr Trp Gln Asn Asp Ile Gln Thr
260 265 270
Leu Asn Asn Tyr Leu Ala Lys Val Asn Tyr Asn Gln Ser Val Phe Asp
275 280 285
Ala Pro Leu His Tyr Asn Phe His Tyr Ala Ser Lys Gly Asn Gly Asn
290 295 300
Tyr Asp Met Arg Asn Ile Leu Lys Gly Thr Val Val Ala Asn His Pro
305 310 315 320
Thr Leu Ala Val Thr Leu Val Glu Asn His Asp Ser Gln Pro Gly Gln
325 330 335
Ser Leu Glu Ser Val Val Ser Pro Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr Ala
340 345 350
Phe Ile Leu Thr Arg Ala Glu Gly Tyr Pro Ser Val Phe Tyr Gly Asp
355 360 365
Tyr Tyr Gly Thr Lys Gly Asn Ser Asn Tyr Glu Ile Pro Ala Leu Lys
370 375 380
Asp Lys Ile Asp Pro Ile Leu Thr Ala Arg Lys Asn Tyr Ala Tyr Gly
385 390 395 400
Thr Gln Arg Asp Tyr Phe Asp His Pro Asp Val Ile Gly Trp Thr Arg
405 410 415
Glu Gly Asp Ser Val His Ala Asn Ser Gly Leu Ala Thr Leu Ile Ser
420 425 430
Asp Gly Pro Gly Gly Ala Lys Trp Met Asp Val Gly Lys Asn Asn Ala
435 440 445
Gly Glu Ile Trp Tyr Asp Ile Thr Gly Asn Gln Thr Asn Thr Val Thr
450 455 460
Ile Asn Lys Asp Gly Trp Gly Gln Phe Gln Val Ser Gly Gly Ser Val
465 470 475 480
Ser Ile Tyr Val Gln Arg
485
<210> 16
<211> 480
<212> PRT
<213> 芽孢杆菌属物种
<400> 16
Asp Gly Leu Asn Gly Thr Met Met Gln Tyr Tyr Glu Trp His Leu Glu
1 5 10 15
Asn Asp Gly Gln His Trp Asn Arg Leu His Asp Asp Ala Ala Ala Leu
20 25 30
Ser Asp Ala Gly Ile Thr Ala Ile Trp Ile Pro Pro Ala Tyr Lys Gly
35 40 45
Asn Ser Gln Ala Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr Asp Leu
50 55 60
Gly Glu Phe Asn Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly Thr Lys
65 70 75 80
Ala Gln Leu Glu Arg Ala Ile Gly Ser Leu Lys Ser Asn Asp Ile Asn
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Val Tyr Gly Asp Val Val Met Asn His Lys Met Gly Ala Asp Phe Thr
100 105 110
Glu Ala Val Gln Ala Val Gln Val Asn Pro Thr Asn Arg Trp Gln Asp
115 120 125
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130 135 140
Gly Arg Asn Asn Ala Tyr Ser Asp Phe Lys Trp Arg Trp Phe His Phe
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Asn Gly Val Asp Trp Asp Gln Arg Tyr Gln Glu Asn His Ile Phe Arg
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Phe Ala Asn Thr Asn Trp Asn Trp Arg Val Asp Glu Glu Asn Gly Asn
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Tyr Asp Tyr Leu Leu Gly Ser Asn Ile Asp Phe Ser His Pro Glu Val
195 200 205
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Asn Tyr Asn Phe Tyr Arg Ala Ser Gln Gln Gly Gly Ser Tyr Asp Met
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355 360 365
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370 375 380
Leu Asp Ala Arg Gln Asn Tyr Ala Tyr Gly Thr Gln His Asp Tyr Phe
385 390 395 400
Asp His Trp Asp Val Val Gly Trp Thr Arg Glu Gly Ser Ser Ser Arg
405 410 415
Pro Asn Ser Gly Leu Ala Thr Ile Met Ser Asn Gly Pro Gly Gly Ser
420 425 430
Lys Trp Met Tyr Val Gly Arg Gln Asn Ala Gly Gln Thr Trp Thr Asp
435 440 445
Leu Thr Gly Asn Asn Gly Ala Ser Val Thr Ile Asn Gly Asp Gly Trp
450 455 460
Gly Glu Phe Phe Thr Asn Gly Gly Ser Val Ser Val Tyr Val Asn Gln
465 470 475 480
<210> 17
<211> 485
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 17
His His Asn Gly Thr Asn Gly Thr Met Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr
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Leu Pro Asn Asp Gly Asn His Trp Asn Arg Leu Asn Ser Asp Ala Ser
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Asn Leu Lys Ser Lys Gly Ile Thr Ala Val Trp Ile Pro Pro Ala Trp
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Lys Gly Ala Ser Gln Asn Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr
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65 70 75 80
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His Phe Asp Gly Val Asp Trp Asp Gln Ser Arg Arg Leu Asn Asn Arg
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Ile Tyr Lys Phe Arg Gly His Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Asp
180 185 190
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245 250 255
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275 280 285
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420 425 430
Gly Pro Gly Gly Ser Lys Arg Met Tyr Ala Gly Leu Lys Asn Ala Gly
435 440 445
Glu Thr Trp Tyr Asp Ile Thr Gly Asn Arg Ser Asp Thr Val Lys Ile
450 455 460
Gly Ser Asp Gly Trp Gly Glu Phe His Val Asn Asp Gly Ser Val Ser
465 470 475 480
Ile Tyr Val Gln Lys
485
<210> 18
<211> 485
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 18
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35 40 45
Lys Gly Thr Ser Gln Asn Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr
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65 70 75 80
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85 90 95
Val Gln Val Tyr Gly Asp Val Val Met Asn His Lys Gly Gly Ala Asp
100 105 110
Ala Thr Glu Asn Val Leu Ala Val Glu Val Asn Pro Asn Asn Arg Asn
115 120 125
Gln Glu Ile Ser Gly Asp Tyr Thr Ile Glu Ala Trp Thr Lys Phe Asp
130 135 140
Phe Pro Gly Arg Gly Asn Thr Tyr Ser Asp Phe Lys Trp Arg Trp Tyr
145 150 155 160
His Phe Asp Gly Val Asp Trp Asp Gln Ser Arg Gln Phe Gln Asn Arg
165 170 175
Ile Tyr Lys Phe Arg Gly Asp Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Asp
180 185 190
Ser Glu Phe Gly Asn Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Tyr Asp Met
195 200 205
Asp His Pro Glu Val Val Asn Glu Leu Arg Arg Trp Gly Glu Trp Tyr
210 215 220
Thr Asn Thr Leu Asn Leu Asp Gly Phe Arg Ile Asp Ala Val Lys His
225 230 235 240
Ile Lys Phe Ser Phe Thr Arg Asp Trp Leu Thr His Val Arg Asn Ala
245 250 255
Thr Gly Lys Gly Met Pro Ala Val Ala Glu Phe Trp Lys Asn Asp Leu
260 265 270
Gly Ala Leu Glu Asn Tyr Leu Asn Lys Thr Asn Trp Asn His Ser Val
275 280 285
Phe Asp Val Pro Leu His Tyr Asn Leu Tyr Asn Ala Ser Asn Gly Gly
290 295 300
Gly Asn Tyr Asp Met Ala Lys Leu Leu Asn Gly Thr Val Val Gln Lys
305 310 315 320
His Pro Met His Ala Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Ser Gln Pro
325 330 335
Asn Glu Ser Leu Glu Ser Phe Val Gln Glu Trp Phe Lys Pro Leu Ala
340 345 350
Tyr Ala Leu Ile Leu Thr Arg Glu Gln Gly Tyr Pro Ser Val Phe Tyr
355 360 365
Gly Asp Tyr Tyr Gly Ile Pro Thr His Ser Val Pro Ala Met Lys Ala
370 375 380
Lys Ile Asp Pro Ile Leu Glu Ala Arg Gln Asn Phe Ala Tyr Gly Pro
385 390 395 400
Gln His Asp Tyr Leu Asp His Pro Asp Val Ile Gly Trp Thr Arg Glu
405 410 415
Gly Asp Ser Ser His Pro Lys Ser Gly Leu Ala Thr Leu Ile Thr Asp
420 425 430
Gly Pro Gly Gly Ser Lys Arg Met Tyr Ala Gly Leu Lys Asn Ala Gly
435 440 445
Glu Thr Trp Tyr Asp Ile Thr Gly Asn Arg Ser Asp Thr Val Lys Ile
450 455 460
Gly Ser Asp Gly Trp Gly Glu Phe His Val Asn Asp Gly Ser Val Ser
465 470 475 480
Ile Tyr Val Gln Lys
485
<210> 19
<211> 485
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 19
His His Asn Gly Thr Asn Gly Thr Met Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr
1 5 10 15
Leu Pro Asn Asp Gly Asn His Trp Asn Arg Leu Arg Asp Asp Ala Ala
20 25 30
Asn Leu Lys Ser Lys Gly Ile Thr Ala Val Trp Ile Pro Pro Ala Trp
35 40 45
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50 55 60
Asp Leu Gly Glu Phe Asn Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly
65 70 75 80
Thr Arg Asn Gln Leu Gln Ala Ala Val Thr Ser Leu Lys Asn Asn Gly
85 90 95
Ile Gln Val Tyr Gly Asp Val Val Met Asn His Lys Gly Gly Ala Asp
100 105 110
Gly Thr Glu Ile Val Asn Ala Val Glu Val Asn Arg Ser Asn Arg Asn
115 120 125
Gln Glu Thr Ser Gly Glu Tyr Ala Ile Glu Ala Trp Thr Lys Phe Asp
130 135 140
Phe Pro Gly Arg Gly Asn Asn His Ser Ser Phe Lys Trp Arg Trp Tyr
145 150 155 160
His Phe Asp Gly Thr Asp Trp Asp Gln Ser Arg Gln Leu Gln Asn Lys
165 170 175
Ile Tyr Lys Phe Arg Gly Thr Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Asp
180 185 190
Thr Glu Asn Gly Asn Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Val Asp Met
195 200 205
Asp His Pro Glu Val Ile His Glu Leu Arg Asn Trp Gly Val Trp Tyr
210 215 220
Thr Asn Thr Leu Asn Leu Asp Gly Phe Arg Ile Asp Ala Val Lys His
225 230 235 240
Ile Lys Tyr Ser Phe Thr Arg Asp Trp Leu Thr His Val Arg Asn Thr
245 250 255
Thr Gly Lys Pro Met Phe Ala Val Ala Glu Phe Trp Lys Asn Asp Leu
260 265 270
Gly Ala Ile Glu Asn Tyr Leu Asn Lys Thr Ser Trp Asn His Ser Val
275 280 285
Phe Asp Val Pro Leu His Tyr Asn Leu Tyr Asn Ala Ser Asn Ser Gly
290 295 300
Gly Tyr Tyr Asp Met Arg Asn Ile Leu Asn Gly Ser Val Val Gln Lys
305 310 315 320
His Pro Thr His Ala Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Ser Gln Pro
325 330 335
Gly Glu Ala Leu Glu Ser Phe Val Gln Gln Trp Phe Lys Pro Leu Ala
340 345 350
Tyr Ala Leu Val Leu Thr Arg Glu Gln Gly Tyr Pro Ser Val Phe Tyr
355 360 365
Gly Asp Tyr Tyr Gly Ile Pro Thr His Gly Val Pro Ala Met Lys Ser
370 375 380
Lys Ile Asp Pro Leu Leu Gln Ala Arg Gln Thr Phe Ala Tyr Gly Pro
385 390 395 400
Gln His Asp Tyr Leu Asp His Pro Asp Val Ile Gly Trp Thr Arg Glu
405 410 415
Gly Asp Ser Ser Ala Ala Lys Ser Gly Leu Ala Ala Leu Ile Thr Asp
420 425 430
Gly Pro Gly Gly Ser Lys Arg Met Tyr Ala Gly Leu Lys Asn Ala Gly
435 440 445
Glu Thr Trp Tyr Asp Ile Thr Gly Asn Arg Ser Asp Thr Val Lys Ile
450 455 460
Gly Ser Asp Gly Trp Gly Glu Phe His Val Asn Asp Gly Ser Val Ser
465 470 475 480
Ile Tyr Val Gln Lys
485
<210> 20
<211> 485
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 20
His His Asp Gly Thr Asn Gly Thr Ile Met Gln Tyr Phe Glu Trp Asn
1 5 10 15
Val Pro Asn Asp Gly Gln His Trp Asn Arg Leu His Asn Asn Ala Gln
20 25 30
Asn Leu Lys Asn Ala Gly Ile Thr Ala Ile Trp Ile Pro Pro Ala Trp
35 40 45
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65 70 75 80
Thr Lys Ala Glu Leu Glu Arg Ala Ile Arg Ser Leu Lys Ala Asn Gly
85 90 95
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165 170 175
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Gly Ala Leu Glu Asn Tyr Leu Ser Lys Thr Asn Trp Thr Met Ser Ala
275 280 285
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305 310 315 320
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325 330 335
Gly Glu Ala Leu Glu Ser Phe Val Gln Gly Trp Phe Lys Pro Leu Ala
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Gly Asp Tyr Tyr Gly Ile Pro Ser Asp Gly Val Pro Ser Tyr Arg Gln
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Gln Ile Asp Pro Leu Leu Lys Ala Arg Gln Gln Tyr Ala Tyr Gly Pro
385 390 395 400
Gln His Asp Tyr Ile Asp His Pro Asp Val Ile Gly Trp Thr Arg Glu
405 410 415
Gly Asp Ser Ser Ala Ala Lys Ser Gly Leu Ala Ala Leu Ile Thr Asp
420 425 430
Gly Pro Gly Gly Ser Lys Arg Met Tyr Ala Gly Leu Lys Asn Ala Gly
435 440 445
Glu Thr Trp Tyr Asp Ile Thr Gly Asn Arg Ser Asp Thr Val Lys Ile
450 455 460
Gly Ser Asp Gly Trp Gly Glu Phe His Val Asn Asp Gly Ser Val Ser
465 470 475 480
Ile Tyr Val Gln Lys
485
<210> 21
<211> 484
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 21
Asn Thr Ala Pro Ile Asn Glu Thr Met Met Gln Tyr Phe Glu Trp Asp
1 5 10 15
Leu Pro Asn Asp Gly Thr Leu Trp Thr Lys Val Lys Asn Glu Ala Ala
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Asn Leu Ser Ser Leu Gly Ile Thr Ala Leu Trp Leu Pro Pro Ala Tyr
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His Phe Asp Gly Thr Asp Trp Asp Glu Ser Arg Lys Leu Asn Arg Ile
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Tyr Lys Phe Arg Ser Thr Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Asp Thr
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195 200 205
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290 295 300
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305 310 315 320
Pro Ser Leu Ala Val Thr Leu Val Asp Asn His Asp Thr Gln Pro Gly
325 330 335
Gln Ser Leu Gln Ser Trp Val Glu Pro Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr
340 345 350
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355 360 365
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370 375 380
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405 410 415
Asp Ser Ser Ala Ala Lys Ser Gly Leu Ala Ala Leu Ile Thr Asp Gly
420 425 430
Pro Gly Gly Ser Lys Arg Met Tyr Ala Gly Leu Lys Asn Ala Gly Glu
435 440 445
Thr Trp Tyr Asp Ile Thr Gly Asn Arg Ser Asp Thr Val Lys Ile Gly
450 455 460
Ser Asp Gly Trp Gly Glu Phe His Val Asn Asp Gly Ser Val Ser Ile
465 470 475 480
Tyr Val Gln Lys
<210> 22
<211> 486
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 22
Asp Thr Val Asn Asn Gly Thr Leu Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr Ala
1 5 10 15
Pro Asn Asp Gly Asn His Trp Asn Arg Leu Arg Thr Asp Ala Glu Asn
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Lys Ala Gln Leu Lys Ser Ala Ile Asp Ala Leu His Lys Lys Asn Ile
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Pro Gly Arg Gly Asp Ser Tyr Ser Asn Phe Lys Trp Lys Trp Tyr His
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Phe Asp Gly Thr Asp Trp Asp Glu Gly Arg Lys Leu Asn Arg Ile Tyr
165 170 175
Lys Phe Arg Gly Ile Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Ser Ser Glu
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Asn Gly Asn Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Leu Asp Phe Asp His
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Pro Asp Val Ala Asn Glu Met Lys Lys Trp Gly Thr Trp Tyr Ala Asn
210 215 220
Glu Leu Asn Leu Asp Gly Phe Arg Leu Asp Ala Val Lys His Ile Asp
225 230 235 240
His Glu Tyr Leu Arg Asp Trp Val Asn His Val Arg Gln Gln Thr Gly
245 250 255
Lys Glu Met Phe Ala Val Ala Glu Tyr Trp Gln Asn Asp Ile Gln Thr
260 265 270
Leu Asn Asn Tyr Leu Ala Lys Val Asn Tyr Asn Gln Ser Val Phe Asp
275 280 285
Ala Pro Leu His Tyr Asn Phe His Tyr Ala Ser Lys Gly Asn Gly Asn
290 295 300
Tyr Asp Met Arg Asn Ile Leu Lys Gly Thr Val Val Ala Asn His Pro
305 310 315 320
Thr Leu Ala Val Thr Leu Val Glu Asn His Asp Ser Gln Pro Gly Gln
325 330 335
Ser Leu Glu Ser Val Val Ser Pro Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr Ala
340 345 350
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355 360 365
Tyr Tyr Gly Thr Lys Gly Asn Ser Asn Tyr Glu Ile Pro Ala Leu Lys
370 375 380
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385 390 395 400
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405 410 415
Glu Gly Asp Ser Ser Ala Ala Lys Ser Gly Leu Ala Ala Leu Ile Thr
420 425 430
Asp Gly Pro Gly Gly Ser Lys Arg Met Tyr Ala Gly Leu Lys Asn Ala
435 440 445
Gly Glu Thr Trp Tyr Asp Ile Thr Gly Asn Arg Ser Asp Thr Val Lys
450 455 460
Ile Gly Ser Asp Gly Trp Gly Glu Phe His Val Asn Asp Gly Ser Val
465 470 475 480
Ser Ile Tyr Val Gln Lys
485
<210> 23
<211> 485
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 23
His His Asn Gly Thr Asn Gly Thr Met Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr
1 5 10 15
Leu Pro Asn Asp Gly Asn His Trp Asn Arg Leu Asn Ser Asp Ala Ser
20 25 30
Asn Leu Lys Ser Lys Gly Ile Thr Ala Val Trp Ile Pro Pro Ala Trp
35 40 45
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Asp Leu Gly Glu Phe Asn Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly
65 70 75 80
Thr Arg Ser Gln Leu Gln Ala Ala Val Thr Ser Leu Lys Asn Asn Gly
85 90 95
Ile Gln Val Tyr Gly Asp Val Val Met Asn His Lys Gly Gly Ala Asp
100 105 110
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115 120 125
Gln Glu Val Thr Gly Glu Tyr Thr Ile Glu Ala Trp Thr Arg Phe Asp
130 135 140
Phe Pro Gly Arg Gly Asn Thr His Ser Ser Phe Lys Trp Arg Trp Tyr
145 150 155 160
His Phe Asp Gly Val Asp Trp Asp Gln Ser Arg Arg Leu Asn Asn Arg
165 170 175
Ile Tyr Lys Phe Arg Gly His Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Asp
180 185 190
Thr Glu Asn Gly Asn Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Ile Asp Met
195 200 205
Asp His Pro Glu Val Val Asn Glu Leu Arg Asn Trp Gly Val Trp Tyr
210 215 220
Thr Asn Thr Leu Gly Leu Asp Gly Phe Arg Ile Asp Ala Val Lys His
225 230 235 240
Ile Lys Tyr Ser Phe Thr Arg Asp Trp Ile Asn His Val Arg Ser Ala
245 250 255
Thr Gly Lys Asn Met Phe Ala Val Ala Glu Phe Trp Lys Asn Asp Leu
260 265 270
Gly Ala Ile Glu Asn Tyr Leu Gln Lys Thr Asn Trp Asn His Ser Val
275 280 285
Phe Asp Val Pro Leu His Tyr Asn Leu Tyr Asn Ala Ser Lys Ser Gly
290 295 300
Gly Asn Tyr Asp Met Arg Asn Ile Phe Asn Gly Thr Val Val Gln Arg
305 310 315 320
His Pro Ser His Ala Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Ser Gln Pro
325 330 335
Glu Glu Ala Leu Glu Ser Phe Val Glu Glu Trp Phe Lys Pro Leu Ala
340 345 350
Tyr Ala Leu Thr Leu Thr Arg Glu Gln Gly Tyr Pro Ser Val Phe Tyr
355 360 365
Gly Asp Tyr Tyr Gly Ile Pro Thr His Gly Val Pro Ala Met Arg Ser
370 375 380
Lys Ile Asp Pro Ile Leu Glu Ala Arg Gln Lys Tyr Ala Tyr Gly Ala
385 390 395 400
Gln His Asp Tyr Phe Asp His His Asp Ile Val Gly Trp Thr Arg Glu
405 410 415
Gly Asp Ser Ser Val Ala Asn Ser Gly Leu Ala Ala Leu Ile Thr Asp
420 425 430
Gly Pro Gly Gly Ala Lys Arg Met Tyr Val Gly Arg Gln Asn Ala Gly
435 440 445
Glu Thr Trp His Asp Ile Thr Gly Asn Arg Ser Glu Pro Val Val Ile
450 455 460
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465 470 475 480
Ile Tyr Val Gln Arg
485
<210> 24
<211> 485
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 24
His His Asn Gly Thr Asn Gly Thr Met Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr
1 5 10 15
Leu Pro Asn Asp Gly Asn His Trp Asn Arg Leu Arg Ser Asp Ala Ser
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Lys Gly Ala Ser Gln Asn Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
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His Phe Asp Gly Val Asp Trp Asp Gln Ser Arg Lys Leu Asn Asn Arg
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Ile Tyr Lys Phe Arg Gly Asp Gly Lys Gly Trp Asp Trp Glu Val Asp
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Thr Glu Phe Gly Asn Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Ile Asp Met
195 200 205
Asp His Pro Glu Val Val Asn Glu Leu Arg Asn Trp Gly Val Trp Tyr
210 215 220
Thr Asn Thr Leu Gly Leu Asp Gly Phe Arg Ile Asp Ala Val Lys His
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Ile Lys Tyr Ser Phe Thr Arg Asp Trp Ile Asn His Val Arg Ser Ala
245 250 255
Thr Gly Lys Asn Met Phe Ala Val Ala Glu Phe Trp Lys Asn Asp Leu
260 265 270
Gly Ala Ile Glu Asn Tyr Leu Asn Lys Thr Asn Trp Asn His Ser Val
275 280 285
Phe Asp Val Pro Leu His Tyr Asn Leu Tyr Asn Ala Ser Lys Ser Gly
290 295 300
Gly Asn Tyr Asp Met Arg Gln Ile Phe Asn Gly Thr Val Val Gln Lys
305 310 315 320
His Pro Met His Ala Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Ser Gln Pro
325 330 335
Glu Glu Ala Leu Glu Ser Phe Val Glu Glu Trp Phe Lys Pro Leu Ala
340 345 350
Tyr Ala Leu Thr Leu Thr Arg Glu Gln Gly Tyr Pro Ser Val Phe Tyr
355 360 365
Gly Asp Tyr Tyr Gly Ile Pro Thr His Gly Val Pro Ala Met Lys Ser
370 375 380
Lys Ile Asp Pro Ile Leu Glu Ala Arg Gln Lys Tyr Ala Tyr Gly Arg
385 390 395 400
Gln His Asp Tyr Phe Asp His His Asp Ile Val Gly Trp Thr Arg Glu
405 410 415
Gly Asp Ser Ser Val Ala Asn Ser Gly Leu Ala Ala Leu Ile Thr Asp
420 425 430
Gly Pro Gly Gly Ala Lys Arg Met Tyr Val Gly Arg Gln Asn Ala Gly
435 440 445
Glu Thr Trp His Asp Ile Thr Gly Asn Arg Ser Glu Pro Val Val Ile
450 455 460
Asn Ser Glu Gly Trp Gly Glu Phe His Val Asn Gly Gly Ser Val Ser
465 470 475 480
Ile Tyr Val Gln Arg
485
<210> 25
<211> 485
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 25
His His Asn Gly Thr Asn Gly Thr Met Met Gln Tyr Phe Glu Trp His
1 5 10 15
Leu Pro Asn Asp Gly Asn His Trp Asn Arg Leu Arg Asp Asp Ala Ser
20 25 30
Asn Leu Arg Asn Arg Gly Ile Thr Ala Ile Trp Ile Pro Pro Ala Trp
35 40 45
Lys Gly Thr Ser Gln Asn Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr
50 55 60
Asp Leu Gly Glu Phe Asn Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly
65 70 75 80
Thr Arg Ser Gln Leu Glu Ser Ala Ile His Ala Leu Lys Asn Asn Gly
85 90 95
Val Gln Val Tyr Gly Asp Val Val Met Asn His Lys Gly Gly Ala Asp
100 105 110
Ala Thr Glu Asn Val Leu Ala Val Glu Val Asn Pro Asn Asn Arg Asn
115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
His Phe Asp Gly Val Asp Trp Asp Gln Ser Arg Gln Phe Gln Asn Arg
165 170 175
Ile Tyr Lys Phe Arg Gly Asp Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Asp
180 185 190
Ser Glu Asn Gly Asn Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Val Asp Met
195 200 205
Asp His Pro Glu Val Val Asn Glu Leu Arg Arg Trp Gly Glu Trp Tyr
210 215 220
Thr Asn Thr Leu Asn Leu Asp Gly Phe Arg Ile Asp Ala Val Lys His
225 230 235 240
Ile Lys Tyr Ser Phe Thr Arg Asp Trp Leu Thr His Val Arg Asn Ala
245 250 255
Thr Gly Lys Glu Met Pro Ala Val Ala Glu Phe Trp Lys Asn Asp Leu
260 265 270
Gly Ala Leu Glu Asn Tyr Leu Asn Lys Thr Asn Trp Asn His Ser Val
275 280 285
Phe Asp Val Pro Leu His Tyr Asn Leu Tyr Asn Ala Ser Asn Gly Gly
290 295 300
Gly Asn Tyr Asp Met Ala Lys Leu Leu Asn Gly Thr Val Val Gln Lys
305 310 315 320
His Pro Met His Ala Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Ser Gln Pro
325 330 335
Gly Glu Ser Leu Glu Ser Phe Val Gln Glu Trp Phe Lys Pro Leu Ala
340 345 350
Tyr Ala Leu Ile Leu Thr Arg Glu Gln Gly Tyr Pro Ser Val Phe Tyr
355 360 365
Gly Asp Tyr Tyr Gly Ile Pro Thr His Ser Val Pro Ala Met Lys Ala
370 375 380
Lys Ile Asp Pro Ile Leu Glu Ala Arg Gln Asn Phe Ala Tyr Gly Ala
385 390 395 400
Gln His Asp Tyr Phe Asp His His Asp Ile Val Gly Trp Thr Arg Glu
405 410 415
Gly Asp Ser Ser Val Ala Asn Ser Gly Leu Ala Ala Leu Ile Thr Asp
420 425 430
Gly Pro Gly Gly Ala Lys Arg Met Tyr Val Gly Arg Gln Asn Ala Gly
435 440 445
Glu Thr Trp His Asp Ile Thr Gly Asn Arg Ser Glu Pro Val Val Ile
450 455 460
Asn Ser Glu Gly Trp Gly Glu Phe His Val Asn Gly Gly Ser Val Ser
465 470 475 480
Ile Tyr Val Gln Arg
485
<210> 26
<211> 485
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 26
His His Asp Gly Thr Asn Gly Thr Ile Met Gln Tyr Phe Glu Trp Asn
1 5 10 15
Val Pro Asn Asp Gly Gln His Trp Asn Arg Leu His Asn Asn Ala Gln
20 25 30
Asn Leu Lys Asn Ala Gly Ile Thr Ala Ile Trp Ile Pro Pro Ala Trp
35 40 45
Lys Gly Thr Ser Gln Asn Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr
50 55 60
Asp Leu Gly Glu Phe Asn Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly
65 70 75 80
Thr Lys Ala Glu Leu Glu Arg Ala Ile Arg Ser Leu Lys Ala Asn Gly
85 90 95
Ile Gln Val Tyr Gly Asp Val Val Met Asn His Lys Gly Gly Ala Asp
100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
His Phe Asp Gly Thr Asp Trp Asp Gln Ser Arg Gln Leu Ala Asn Arg
165 170 175
Ile Tyr Lys Phe Arg Gly Asp Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Asp
180 185 190
Thr Glu Asn Gly Asn Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Val Asp Met
195 200 205
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210 215 220
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225 230 235 240
Ile Lys Phe Ser Phe Met Arg Asp Trp Leu Gly His Val Arg Gly Gln
245 250 255
Thr Gly Lys Asn Leu Phe Ala Val Ala Glu Tyr Trp Lys Asn Asp Leu
260 265 270
Gly Ala Leu Glu Asn Tyr Leu Ser Lys Thr Asn Trp Thr Met Ser Ala
275 280 285
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290 295 300
Gly Asn Tyr Asp Met Arg Asn Leu Leu Asn Gly Thr Leu Val Gln Arg
305 310 315 320
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325 330 335
Gly Glu Ala Leu Glu Ser Phe Val Gln Gly Trp Phe Lys Pro Leu Ala
340 345 350
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355 360 365
Gly Asp Tyr Tyr Gly Ile Pro Ser Asp Gly Val Pro Ser Tyr Arg Gln
370 375 380
Gln Ile Asp Pro Leu Leu Lys Ala Arg Gln Gln Tyr Ala Tyr Gly Ala
385 390 395 400
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405 410 415
Gly Asp Ser Ser Val Ala Asn Ser Gly Leu Ala Ala Leu Ile Thr Asp
420 425 430
Gly Pro Gly Gly Ala Lys Arg Met Tyr Val Gly Arg Gln Asn Ala Gly
435 440 445
Glu Thr Trp His Asp Ile Thr Gly Asn Arg Ser Glu Pro Val Val Ile
450 455 460
Asn Ser Glu Gly Trp Gly Glu Phe His Val Asn Gly Gly Ser Val Ser
465 470 475 480
Ile Tyr Val Gln Arg
485
<210> 27
<211> 484
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 27
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1 5 10 15
Leu Pro Asn Asp Gly Thr Leu Trp Thr Lys Val Lys Asn Glu Ala Ala
20 25 30
Asn Leu Ser Ser Leu Gly Ile Thr Ala Leu Trp Leu Pro Pro Ala Tyr
35 40 45
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65 70 75 80
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195 200 205
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210 215 220
Asn Thr Thr Asn Ile Asp Gly Phe Arg Leu Asp Ala Val Lys His Ile
225 230 235 240
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245 250 255
Gly Lys Asn Leu Phe Ala Val Gly Glu Phe Trp Ser Tyr Asp Val Asn
260 265 270
Lys Leu His Asn Tyr Ile Thr Lys Thr Asn Gly Ser Met Ser Leu Phe
275 280 285
Asp Ala Pro Leu His Asn Asn Phe Tyr Thr Ala Ser Lys Ser Ser Gly
290 295 300
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305 310 315 320
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325 330 335
Gln Ser Leu Gln Ser Trp Val Glu Pro Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr
340 345 350
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355 360 365
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405 410 415
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465 470 475 480
Tyr Val Gln Arg
<210> 28
<211> 486
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 28
Asp Thr Val Asn Asn Gly Thr Leu Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr Ala
1 5 10 15
Pro Asn Asp Gly Asn His Trp Asn Arg Leu Arg Thr Asp Ala Glu Asn
20 25 30
Leu Ala Gln Lys Gly Ile Thr Ser Val Trp Ile Pro Pro Ala Tyr Lys
35 40 45
Gly Thr Thr Gln Asn Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr Asp
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Leu Gly Glu Phe Asn Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly Thr
65 70 75 80
Lys Ala Gln Leu Lys Ser Ala Ile Asp Ala Leu His Lys Lys Asn Ile
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Ser Ile Tyr Val Gln Arg
485
<210> 29
<211> 485
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 29
His His Asn Gly Thr Asn Gly Thr Met Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr
1 5 10 15
Leu Pro Asn Asp Gly Asn His Trp Asn Arg Leu Asn Ser Asp Ala Ser
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35 40 45
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115 120 125
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405 410 415
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435 440 445
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Ile Trp Val Lys Gln
485
<210> 30
<211> 485
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 30
His His Asn Gly Thr Asn Gly Thr Met Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr
1 5 10 15
Leu Pro Asn Asp Gly Asn His Trp Asn Arg Leu Arg Ser Asp Ala Ser
20 25 30
Asn Leu Lys Asp Lys Gly Ile Ser Ala Val Trp Ile Pro Pro Ala Trp
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65 70 75 80
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115 120 125
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His Phe Asp Gly Val Asp Trp Asp Gln Ser Arg Lys Leu Asn Asn Arg
165 170 175
Ile Tyr Lys Phe Arg Gly Asp Gly Lys Gly Trp Asp Trp Glu Val Asp
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195 200 205
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245 250 255
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Gly Ala Ile Glu Asn Tyr Leu Asn Lys Thr Asn Trp Asn His Ser Val
275 280 285
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290 295 300
Gly Asn Tyr Asp Met Arg Gln Ile Phe Asn Gly Thr Val Val Gln Lys
305 310 315 320
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325 330 335
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355 360 365
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405 410 415
Gly Asp Ser Ala His Ala Gly Ser Gly Leu Ala Thr Val Met Ser Asp
420 425 430
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435 440 445
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450 455 460
Asn Ser Ala Gly Asn Gly Thr Phe Pro Cys Asn Gly Gly Ser Val Ser
465 470 475 480
Ile Trp Val Lys Gln
485
<210> 31
<211> 485
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 31
His His Asn Gly Thr Asn Gly Thr Met Met Gln Tyr Phe Glu Trp His
1 5 10 15
Leu Pro Asn Asp Gly Asn His Trp Asn Arg Leu Arg Asp Asp Ala Ser
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35 40 45
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His Phe Asp Gly Val Asp Trp Asp Gln Ser Arg Gln Phe Gln Asn Arg
165 170 175
Ile Tyr Lys Phe Arg Gly Asp Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Asp
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Ser Glu Phe Gly Asn Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Tyr Asp Met
195 200 205
Asp His Pro Glu Val Val Asn Glu Leu Arg Arg Trp Gly Glu Trp Tyr
210 215 220
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Gly Asn Tyr Asp Met Ala Lys Leu Leu Asn Gly Thr Val Val Gln Lys
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435 440 445
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450 455 460
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Ile Trp Val Lys Gln
485
<210> 32
<211> 485
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 32
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195 200 205
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210 215 220
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245 250 255
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Gly Ala Ile Glu Asn Tyr Leu Asn Lys Thr Ser Trp Asn His Ser Val
275 280 285
Phe Asp Val Pro Leu His Tyr Asn Leu Tyr Asn Ala Ser Asn Ser Gly
290 295 300
Gly Tyr Tyr Asp Met Arg Asn Ile Leu Asn Gly Ser Val Val Gln Lys
305 310 315 320
His Pro Thr His Ala Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Ser Gln Pro
325 330 335
Gly Glu Ala Leu Glu Ser Phe Val Gln Gln Trp Phe Lys Pro Leu Ala
340 345 350
Tyr Ala Leu Val Leu Thr Arg Glu Gln Gly Tyr Pro Ser Val Phe Tyr
355 360 365
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385 390 395 400
Gln His Asp Tyr Leu Asp Asn Gln Asp Val Ile Gly Trp Thr Arg Glu
405 410 415
Gly Asp Ser Ala His Ala Gly Ser Gly Leu Ala Thr Val Met Ser Asp
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Gly Pro Gly Gly Ser Lys Thr Met Tyr Val Gly Thr Ala His Ala Gly
435 440 445
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Asn Ser Ala Gly Asn Gly Thr Phe Pro Cys Asn Gly Gly Ser Val Ser
465 470 475 480
Ile Trp Val Lys Gln
485
<210> 33
<211> 485
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223>
合成构建体
<400> 33
His His Asp Gly Thr Asn Gly Thr Ile Met Gln Tyr Phe Glu Trp Asn
1 5 10 15
Val Pro Asn Asp Gly Gln His Trp Asn Arg Leu His Asn Asn Ala Gln
20 25 30
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130 135 140
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145 150 155 160
His Phe Asp Gly Thr Asp Trp Asp Gln Ser Arg Gln Leu Ala Asn Arg
165 170 175
Ile Tyr Lys Phe Arg Gly Asp Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Asp
180 185 190
Thr Glu Asn Gly Asn Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Val Asp Met
195 200 205
Asp His Pro Glu Val Ile Asn Glu Leu Asn Arg Trp Gly Val Trp Tyr
210 215 220
Ala Asn Thr Leu Asn Leu Asp Gly Phe Arg Leu Asp Ala Val Lys His
225 230 235 240
Ile Lys Phe Ser Phe Met Arg Asp Trp Leu Gly His Val Arg Gly Gln
245 250 255
Thr Gly Lys Asn Leu Phe Ala Val Ala Glu Tyr Trp Lys Asn Asp Leu
260 265 270
Gly Ala Leu Glu Asn Tyr Leu Ser Lys Thr Asn Trp Thr Met Ser Ala
275 280 285
Phe Asp Val Pro Leu His Tyr Asn Leu Tyr Gln Ala Ser Asn Ser Ser
290 295 300
Gly Asn Tyr Asp Met Arg Asn Leu Leu Asn Gly Thr Leu Val Gln Arg
305 310 315 320
His Pro Ser His Ala Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Thr Gln Pro
325 330 335
Gly Glu Ala Leu Glu Ser Phe Val Gln Gly Trp Phe Lys Pro Leu Ala
340 345 350
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355 360 365
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385 390 395 400
Gln His Asp Tyr Leu Asp Asn Gln Asp Val Ile Gly Trp Thr Arg Glu
405 410 415
Gly Asp Ser Ala His Ala Gly Ser Gly Leu Ala Thr Val Met Ser Asp
420 425 430
Gly Pro Gly Gly Ser Lys Thr Met Tyr Val Gly Thr Ala His Ala Gly
435 440 445
Gln Val Phe Lys Asp Ile Thr Gly Asn Arg Thr Asp Thr Val Thr Ile
450 455 460
Asn Ser Ala Gly Asn Gly Thr Phe Pro Cys Asn Gly Gly Ser Val Ser
465 470 475 480
Ile Trp Val Lys Gln
485
<210> 34
<211> 484
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 34
Asn Thr Ala Pro Ile Asn Glu Thr Met Met Gln Tyr Phe Glu Trp Asp
1 5 10 15
Leu Pro Asn Asp Gly Thr Leu Trp Thr Lys Val Lys Asn Glu Ala Ala
20 25 30
Asn Leu Ser Ser Leu Gly Ile Thr Ala Leu Trp Leu Pro Pro Ala Tyr
35 40 45
Lys Gly Thr Ser Gln Ser Asp Val Gly Tyr Gly Val Tyr Asp Leu Tyr
50 55 60
Asp Leu Gly Glu Phe Asn Gln Lys Gly Thr Ile Arg Thr Lys Tyr Gly
65 70 75 80
Thr Lys Thr Gln Tyr Ile Gln Ala Ile Gln Ala Ala Lys Ala Ala Gly
85 90 95
Met Gln Val Tyr Ala Asp Val Val Phe Asn His Lys Ala Gly Ala Asp
100 105 110
Gly Thr Glu Phe Val Asp Ala Val Glu Val Asp Pro Ser Asn Arg Asn
115 120 125
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130 135 140
Phe Pro Gly Arg Gly Asn Thr Tyr Ser Ser Phe Lys Trp Arg Trp Tyr
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His Phe Asp Gly Thr Asp Trp Asp Glu Ser Arg Lys Leu Asn Arg Ile
165 170 175
Tyr Lys Phe Arg Ser Thr Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Asp Thr
180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
Asn Thr Thr Asn Ile Asp Gly Phe Arg Leu Asp Ala Val Lys His Ile
225 230 235 240
Lys Tyr Gln Phe Phe Pro Asp Trp Leu Thr Tyr Val Arg Asn Gln Thr
245 250 255
Gly Lys Asn Leu Phe Ala Val Gly Glu Phe Trp Ser Tyr Asp Val Asn
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Lys Leu His Asn Tyr Ile Thr Lys Thr Asn Gly Ser Met Ser Leu Phe
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290 295 300
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305 310 315 320
Pro Ser Leu Ala Val Thr Leu Val Asp Asn His Asp Thr Gln Pro Gly
325 330 335
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340 345 350
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355 360 365
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385 390 395 400
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405 410 415
Asp Ser Ala His Ala Gly Ser Gly Leu Ala Thr Val Met Ser Asp Gly
420 425 430
Pro Gly Gly Ser Lys Thr Met Tyr Val Gly Thr Ala His Ala Gly Gln
435 440 445
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450 455 460
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465 470 475 480
Trp Val Lys Gln
<210> 35
<211> 486
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 35
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1 5 10 15
Pro Asn Asp Gly Asn His Trp Asn Arg Leu Arg Thr Asp Ala Glu Asn
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165 170 175
Lys Phe Arg Gly Ile Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Ser Ser Glu
180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
Glu Leu Asn Leu Asp Gly Phe Arg Leu Asp Ala Val Lys His Ile Asp
225 230 235 240
His Glu Tyr Leu Arg Asp Trp Val Asn His Val Arg Gln Gln Thr Gly
245 250 255
Lys Glu Met Phe Ala Val Ala Glu Tyr Trp Gln Asn Asp Ile Gln Thr
260 265 270
Leu Asn Asn Tyr Leu Ala Lys Val Asn Tyr Asn Gln Ser Val Phe Asp
275 280 285
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Ile Asn Ser Ala Gly Asn Gly Thr Phe Pro Cys Asn Gly Gly Ser Val
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Ser Ile Trp Val Lys Gln
485
<210> 36
<211> 485
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 36
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Asn Ala Asp Gly Trp Gly Asn Phe Ser Val Asn Gly Gly Ser Val Ser
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Ile Trp Val Asn Lys
485
<210> 37
<211> 485
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 37
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Leu Pro Asn Asp Gly Asn His Trp Asn Arg Leu Arg Ser Asp Ala Ser
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195 200 205
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Ile Lys Tyr Ser Phe Thr Arg Asp Trp Ile Asn His Val Arg Ser Ala
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Gly Ala Ile Glu Asn Tyr Leu Asn Lys Thr Asn Trp Asn His Ser Val
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Gly Asn Tyr Asp Met Arg Gln Ile Phe Asn Gly Thr Val Val Gln Lys
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Asn Ala Asp Gly Trp Gly Asn Phe Ser Val Asn Gly Gly Ser Val Ser
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Ile Trp Val Asn Lys
485
<210> 38
<211> 485
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 38
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Leu Pro Asn Asp Gly Asn His Trp Asn Arg Leu Arg Asp Asp Ala Ser
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His Phe Asp Gly Val Asp Trp Asp Gln Ser Arg Gln Phe Gln Asn Arg
165 170 175
Ile Tyr Lys Phe Arg Gly Asp Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Asp
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210 215 220
Thr Asn Thr Leu Asn Leu Asp Gly Phe Arg Ile Asp Ala Val Lys His
225 230 235 240
Ile Lys Tyr Ser Phe Thr Arg Asp Trp Leu Thr His Val Arg Asn Ala
245 250 255
Thr Gly Lys Glu Met Phe Ala Val Ala Glu Phe Trp Lys Asn Asp Leu
260 265 270
Gly Ala Leu Glu Asn Tyr Leu Asn Lys Thr Asn Trp Asn His Ser Val
275 280 285
Phe Asp Val Pro Leu His Tyr Asn Leu Tyr Asn Ala Ser Asn Ser Gly
290 295 300
Gly Asn Tyr Asp Met Ala Lys Leu Leu Asn Gly Thr Val Val Gln Lys
305 310 315 320
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325 330 335
Gly Glu Ser Leu Glu Ser Phe Val Gln Glu Trp Phe Lys Pro Leu Ala
340 345 350
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355 360 365
Gly Asp Tyr Tyr Gly Ile Pro Thr His Ser Val Pro Ala Met Lys Ala
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435 440 445
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450 455 460
Asn Ala Asp Gly Trp Ala Asn Phe Ser Val Asn Gly Gly Ser Val Ser
465 470 475 480
Ile Trp Val Lys Arg
485
<210> 39
<211> 485
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 39
His His Asn Gly Thr Asn Gly Thr Met Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr
1 5 10 15
Leu Pro Asn Asp Gly Asn His Trp Asn Arg Leu Arg Asp Asp Ala Ala
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165 170 175
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Gly Tyr Tyr Asp Met Arg Asn Ile Leu Asn Gly Ser Val Val Gln Lys
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485
<210> 40
<211> 485
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 40
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485
<210> 41
<211> 484
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 41
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100 105 110
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130 135 140
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145 150 155 160
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165 170 175
Tyr Lys Phe Arg Ser Thr Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Asp Thr
180 185 190
Glu Asn Gly Asn Tyr Asp Tyr Leu Met Phe Ala Asp Leu Asp Met Asp
195 200 205
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210 215 220
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245 250 255
Gly Lys Asn Leu Phe Ala Val Gly Glu Phe Trp Ser Tyr Asp Val Asn
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275 280 285
Asp Ala Pro Leu His Asn Asn Phe Tyr Thr Ala Ser Lys Ser Ser Gly
290 295 300
Tyr Phe Asp Met Arg Tyr Leu Leu Asn Asn Thr Leu Met Lys Asp Gln
305 310 315 320
Pro Ser Leu Ala Val Thr Leu Val Asp Asn His Asp Thr Gln Pro Gly
325 330 335
Gln Ser Leu Gln Ser Trp Val Glu Pro Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr
340 345 350
Ala Phe Ile Leu Thr Arg Gln Glu Gly Tyr Pro Cys Val Phe Tyr Gly
355 360 365
Asp Tyr Tyr Gly Ile Pro Lys Tyr Asn Ile Pro Gly Leu Lys Ser Lys
370 375 380
Ile Asp Pro Leu Leu Ile Ala Arg Arg Asp Tyr Ala Tyr Gly Thr Gln
385 390 395 400
Arg Asp Tyr Ile Asp His Gln Asp Ile Ile Gly Trp Thr Arg Glu Gly
405 410 415
Ile Asp Thr Lys Pro Asn Ser Gly Leu Ala Ala Leu Ile Thr Asp Gly
420 425 430
Pro Gly Gly Ser Lys Trp Met Tyr Val Gly Lys Lys His Ala Gly Lys
435 440 445
Val Phe Tyr Asp Leu Thr Gly Asn Arg Ser Asp Thr Val Thr Ile Asn
450 455 460
Ala Asp Gly Trp Gly Glu Phe Lys Val Asn Gly Gly Ser Val Ser Ile
465 470 475 480
Trp Val Ala Lys

Claims (28)

1.一种α-淀粉酶变体，包括：
a)在对应于SEQ ID NO:1的成熟多肽的位置R181、G182、D183和G184的两个或更多个位置的缺失，以及
b)在对应于SEQ ID NO:1的成熟多肽的位置Y198、Y200、L201、Y203和A204的一个或多个位置的取代，以及
c)在对应于SEQ ID NO:1的成熟多肽的位置M202的位置的甲硫氨酸的取代，
其中该变体与SEQ ID NO:1或2的成熟多肽具有至少80％，例如至少90％，但是小于100％序列一致性，并且其中该变体具有α-淀粉酶活性。
2.如权利要求1所述的变体，其中取代b)选自Y198FLHQ、Y200FLSCWPHQRIMTNKVADEG、L201FSYCWPHQRIMTNKVADEG、Y203FLSCWPHQRIMTNKVADEG、A204IMTSRVG中的一个或多个。
3.如权利要求1或2所述的变体，其中取代c)是M202FLSYCWPHQRITNKVADEG中的任一个。
4.如前述权利要求中任一项所述的变体，其中取代b)和/或c)选自Y200H、Y200Q、M202L、Y203N、Y203L、A204S、Y200H+M202L、Y200Q+M202L、M202L+Y203N、M202L+Y203L、M202L+A204S、Y200H+M202L+Y203N、Y200H+M202L+Y203L、Y200H+M202L+A204S、Y200Q+M202L+Y203N、Y200Q+M202L+Y203L、Y200Q+M202L+A204S、Y200H+M202L+Y203N+A204S、Y200H+M202L+Y203L+A204S、Y200Q+M202L+Y203N+A204S、Y200Q+M202L+Y203L+A204S中的一个或多个。
5.如前述权利要求中任一项所述的变体，该变体包括选自以下列表的改变，该列表由以下各项组成：R181*+G182*+Y200H+M202L、R181*+G182*+Y200Q+M202L、R181*+G182*+M202L+Y203N、R181*+G182*+M202L+Y203L、R181*+G182*+M202L+A204S、R181*+G182*+Y200H+M202L+Y203N、R181*+G182*+Y200H+M202L+Y203L、R181*+G182*+Y200H+M202L+A204S、R181*+G182*+Y200Q+M202L+Y203N、R181*+G182*+Y200Q+M202L+Y203L、R181*+G182*+Y200Q+M202L+A204S、R181*+G182*+Y200H+M202L+Y203N+A204S、R181*+G182*+Y200H+M202L+Y203L+A204S、R181*+G182*+Y200Q+M202L+Y203N+A204S、R181*+G182*+Y200Q+M202L+Y203L+A204S、R181*+D183*+Y200H+M202L、R181*+D183*+Y200Q+M202L、R181*+D183*+M202L+Y203N、R181*+D183*+M202L+Y203L、R181*+D183*+M202L+A204S、R181*+D183*+Y200H+M202L+Y203N、R181*+D183*+Y200H+M202L+Y203L、R181*+D183*+Y200H+M202L+A204S、R181*+D183*+Y200Q+M202L+Y203N、R181*+D183*+Y200Q+M202L+Y203L、R181*+D183*+Y200Q+M202L+A204S、R181*+D183*+Y200H+M202L+Y203N+A204S、R181*+D183*+Y200H+M202L+Y203L+A204S、R181*+D183*+Y200Q+M202L+Y203N+A204S、R181*+D183*+Y200Q+M202L+Y203L+A204S、G182*+G184*+Y200H+M202L、G182*+G184*+Y200Q+M202L、G182*+G184*+M202L+Y203N、G182*+G184*+M202L+Y203L、G182*+G184*+M202L+A204S、G182*+G184*+Y200H+M202L+Y203N、G182*+G184*+Y200H+M202L+Y203L、G182*+G184*+Y200H+M202L+A204S、G182*+G184*+Y200Q+M202L+Y203N、G182*+G184*+Y200Q+M202L+Y203L、G182*+G184*+Y200Q+M202L+A204S、G182*+G184*+Y200H+M202L+Y203N+A204S、G182*+G184*+Y200H+M202L+Y203L+A204S、G182*+G184*+Y200Q+M202L+Y203N+A204S、G182*+G184*+Y200Q+M202L+Y203L+A204S、D183*+G184*+Y200H+M202L、D183*+G184*+Y200Q+M202L、D183*+G184*+M202L+Y203N、D183*+G184*+M202L+Y203L、D183*+G184*+M202L+A204S、D183*+G184*+Y200H+M202L+Y203N、D183*+G184*+Y200H+M202L+Y203L、D183*+G184*+Y200H+M202L+A204S、D183*+G184*+Y200Q+M202L+Y203N、D183*+G184*+Y200Q+M202L+Y203L、D183*+G184*+Y200Q+M202L+A204S、D183*+G184*+Y200H+M202L+Y203N+A204S、D183*+G184*+Y200H+M202L+Y203L+A204S、D183*+G184*+Y200Q+M202L+Y203N+A204S、D183*+G184*+Y200Q+M202L+Y203L+A204S、N195F+M202L+R181*+G182*、N195F+M202L+R181*+D183*、N195F+M202L+R181*+G184*、N195F+M202L+G182*+D183*、N195F+M202L+D183*+G184*、N195Y+M202L+R181*+G182*、N195Y+M202L+R181*+D183*、N195Y+M202L+R181*+G184*、N195Y+M202L+G182*+D183*、N195Y+M202L+D183*+G184*、R181*+G182*+N195F+Y200H+M202L+Y203N、R181*+G182*+N195F+Y200Q+M202L+A204S、R181*+G182*+N195F+M202L+Y203L、G182*+G184*+N195F+Y200H+M202L+Y203N、G182*+G184*+N195F+Y200Q+M202L+A204S、G182*+G184*+N195F+M202L+Y203L、G182*+D183*+N195F+Y200H+M202L+Y203N、G182*+D183*+N195F+Y200Q+M202L+A204S、G182*+D183*+N195F+M202L+Y203L、R181*+D184*+N195F+Y200H+M202L+Y203N、R181*+D184*+N195F+Y200Q+M202L+A204S、和R181*+D184*+N195F+M202L+Y203L。
6.如前述权利要求中任一项所述的变体，其中这些改变由选自以下列表的改变组成，该列表由以下各项组成：R181*+G182*+Y200H+M202L、R181*+G182*+Y200Q+M202L、R181*+G182*+M202L+Y203N、R181*+G182*+M202L+Y203L、R181*+G182*+M202L+A204S、R181*+G182*+Y200H+M202L+Y203N、R181*+G182*+Y200H+M202L+Y203L、R181*+G182*+Y200H+M202L+A204S、R181*+G182*+Y200Q+M202L+Y203N、R181*+G182*+Y200Q+M202L+Y203L、R181*+G182*+Y200Q+M202L+A204S、R181*+G182*+Y200H+M202L+Y203N+A204S、R181*+G182*+Y200H+M202L+Y203L+A204S、R181*+G182*+Y200Q+M202L+Y203N+A204S、R181*+G182*+Y200Q+M202L+Y203L+A204S、R181*+D183*+Y200H+M202L、R181*+D183*+Y200Q+M202L、R181*+D183*+M202L+Y203N、R181*+D183*+M202L+Y203L、R181*+D183*+M202L+A204S、R181*+D183*+Y200H+M202L+Y203N、R181*+D183*+Y200H+M202L+Y203L、R181*+D183*+Y200H+M202L+A204S、R181*+D183*+Y200Q+M202L+Y203N、R181*+D183*+Y200Q+M202L+Y203L、R181*+D183*+Y200Q+M202L+A204S、R181*+D183*+Y200H+M202L+Y203N+A204S、R181*+D183*+Y200H+M202L+Y203L+A204S、R181*+D183*+Y200Q+M202L+Y203N+A204S、R181*+D183*+Y200Q+M202L+Y203L+A204S、G182*+G184*+Y200H+M202L、G182*+G184*+Y200Q+M202L、G182*+G184*+M202L+Y203N、G182*+G184*+M202L+Y203L、G182*+G184*+M202L+A204S、G182*+G184*+Y200H+M202L+Y203N、G182*+G184*+Y200H+M202L+Y203L、G182*+G184*+Y200H+M202L+A204S、G182*+G184*+Y200Q+M202L+Y203N、G182*+G184*+Y200Q+M202L+Y203L、G182*+G184*+Y200Q+M202L+A204S、G182*+G184*+Y200H+M202L+Y203N+A204S、G182*+G184*+Y200H+M202L+Y203L+A204S、G182*+G184*+Y200Q+M202L+Y203N+A204S、G182*+G184*+Y200Q+M202L+Y203L+A204S、D183*+G184*+Y200H+M202L、D183*+G184*+Y200Q+M202L、D183*+G184*+M202L+Y203N、D183*+G184*+M202L+Y203L、D183*+G184*+M202L+A204S、D183*+G184*+Y200H+M202L+Y203N、D183*+G184*+Y200H+M202L+Y203L、D183*+G184*+Y200H+M202L+A204S、D183*+G184*+Y200Q+M202L+Y203N、D183*+G184*+Y200Q+M202L+Y203L、D183*+G184*+Y200Q+M202L+A204S、D183*+G184*+Y200H+M202L+Y203N+A204S、D183*+G184*+Y200H+M202L+Y203L+A204S、D183*+G184*+Y200Q+M202L+Y203N+A204S、D183*+G184*+Y200Q+M202L+Y203L+A204S、N195F+M202L+R181*+G182*、N195F+M202L+R181*+D183*、N195F+M202L+R181*+G184*、N195F+M202L+G182*+D183*、N195F+M202L+D183*+G184*、N195Y+M202L+R181*+G182*、N195Y+M202L+R181*+D183*、N195Y+M202L+R181*+G184*、N195Y+M202L+G182*+D183*、N195Y+M202L+D183*+G184*、R181*+G182*+N195F+Y200H+M202L+Y203N、R181*+G182*+N195F+Y200Q+M202L+A204S、R181*+G182*+N195F+M202L+Y203L、G182*+G184*+N195F+Y200H+M202L+Y203N、G182*+G184*+N195F+Y200Q+M202L+A204S、G182*+G184*+N195F+M202L+Y203L、G182*+D183*+N195F+Y200H+M202L+Y203N、G182*+D183*+N195F+Y200Q+M202L+A204S、G182*+D183*+N195F+M202L+Y203L、R181*+D184*+N195F+Y200H+M202L+Y203N、R181*+D184*+N195F+Y200Q+M202L+A204S、和R181*+D184*+N195F+M202L+Y203L。
7.如前述权利要求中任一项所述的变体，该变体包括在对应于SEQ ID NO:1的位置198-204的位置的氨基酸序列，该氨基酸序列选自以下列表，该列表由以下各项组成：YDYLLFA、YDWLLYA、YDWLLFA、YDWLLPA、YDYLLIA、YDYLLNA、YDYLLPA、YDYQLYA、YDPLLYA、YDYLLTA、YDYLLWA、YDNLLYA、YDQLLLA、YDQLLYA、YDWLLWA、YDYLLVA、YDQLLPA、YDQLLWA、YDYLLHA、YDYLLLA、YDYLLSA、YDYPLYA、YDYQPAA、YDELLYA、YDKLLPA、YDQLLNA、YDYELYA、YDYHLYA、YDYLLDA、YDYLPRA、YDYQLLA、YDYQLPA、YDYQLQA、YDDLLYA、YDKLLYA、YDWLLHA、YDWLLTA、YDWLPSA、YDWQLYA、YDYGLYA、YDYLLEA、YDYLLQA、YDYPLPA、YDYRLYA、YDIELSA、YDQLLIA、YDQLLSA、YDWLGYA、YDWLLAA、YDWQLHA、YDWWLPA、YDYELLA、YDYLFTA、YDYLLKA、YDYLYSA、YDYQLFA、YDYQYYA、YDYTLYA、YDYYLYA、YDIELWA、YDIELYA、YDNLLNA、YDNLLPA、YDPLLHA、YDQLLVA、YDQLPYA、YDWLLRA、YDWLWYA、YDWWLGA、YDYHLIA、YDYQHYA、YDYQLGA、YDYQLIA、YDYWLPA、YDELLWA、YDHLLNA、YDIELLA、YDIELNA、YDIELRA、YDILLYA、YDKLLWA、YDLPLYA、YDNLLLA、YDPLLAA、YDPLLPA、YDQHLPA、YDQLLEA、YDQLLQA、YDQLNYA、YDQLPFA、YDQLPNA、YDQLPRA、YDTLLLA、YDTLLYA、YDVLLYA、YDWLLKA、YDWLLLA、YDWLLNA、YDWLLQA、YDWLLVA、YDWLPPA、YDWLPTA、YDWPWYA、YDWWLWA、YDYHLFA、YDYHPSA、YDYLLNT、YDYLLYT、YDYLPFA、YDYLPSA、YDYLVSA、YDYLYPA、YDYLYRA、YDYPLFA、YDYPLSA、YDYPLTA、YDYPQYA、YDYQLTA、YDYQLWA、YDYQNYA、YDYQPRA、YDYQSHA、YDYREYA、YDYRLPA、YDYRNSA、YDYRPRA、YDYTQYA、YDYVLYA、YDYWLSA、YDDLLSA、YDELLDA、YDELLPA、YDELLTA、YDEQLEA、YDEQLYA、YDGLPHA、YDIELFA、YDIELKA、YDIELPA、YDKLLNA、YDKPPSA、YDLLLFA、YDLPLLA、YDNLLKA、YDPLKFA、YDPLLEA、YDPLLFA、YDPLLKA、YDPLLWA、YDPPLPA、YDPPLYA、YDPTLPA、YDPTQYA、YDQELPA、YDQLDHA、YDQLEYA、YDQLLDA、YDQLLFA、YDQLLNT、YDQLLYS、YDQLLYT、YDQLPSA、YDQLWYA、YDQQLVA、YDTLLWA、YDTPLFA、YDTPLYA、YDWELYA、YDWHLYA、YDWLHSA、YDWLLEA、YDWLLIA、YDWLLSA、YDWLNYA、YDWLPFA、YDWLPRA、YDWLQPA、YDWLQYA、YDWLWGA、YDWPLHA、YDWQLRA、YDWQLTA、YDWSLPA、YDWSLYA、YDWWLYA、YDYELEA、YDYELNA、YDYGLAA、YDYHEWA、YDYHLPA、YDYHLSA、YDYHQYA、YDYHTSA、YDYLFQA、YDYLHLA、YDYLIEA、YDYLLFT、YDYLLRA、YDYLLYG、YDYLPDA、YDYLPQA、YDYLPWA、YDYLQEA、YDYPGYA、YDYPHSA、YDYPLLA、YDYPLNA、YDYPNYA、YDYPSRA、YDYPWYA、YDYQEYA、YDYQLAA、YDYQLKA、YDYQLPT、YDYQPTA、YDYQPYA、YDYQQYA、YDYQWYA、YDYRLFA、YDYRPSA、YDYRTFA、YDYRTSA、YDYRTYA、YDYSLYA、YDYSVYA、YDYTPRA、YDYWLFA、YDYWLGA、YDYWLWA、YDYWLYA、YDDLLLA、YDDLLNA、YDDLPFA、YDEHLHA、YDELLFA、YDELLSA、YDELQIA、YDEWPYA、YDGLLSA、YDHLLYA、YDIELHA、YDIELKT、YDIELTA、YDIEVSA、YDIPLYA、YDIRGYA、YDIRNYA、YDIRTKA、YDIWLYA、YDKLPHA、YDKLQYA、YDKPLSA、YDLLLVA、YDNHLPA、YDNHLYA、YDNLGYA、YDNLLIA、YDNLLVA、YDNLLWA、YDNLPRA、YDNQLYA、YDNRLYA、YDPHRHA、YDPLHVA、YDPLLDA、YDPLLLA、YDPLQYA、YDPPQFA、YDPQLIA、YDQELYA、YDQLFSA、YDQLKYA、YDQLLAA、YDQLLHA、YDQLNNA、YDQLPAA、YDQLPPA、YDQLQNA、YDQLWGT、YDQLWPA、YDQLYPA、YDQNLYA、YDQPLPA、YDQQLQA、YDQTLYA、YDQWLHA、YDQWLTA、YDRLLPA、YDSELYA、YDTLIRA、YDTLLKA、YDTLLNA、YDTPLNA、YDTPLPA、YDTPQIA、YDTRLYA、YDTSLPA、YDTTLPA、YDTWKYA、YDVLLPA、YDVLNTA、YDWELIA、YDWHLPA、YDWHQYA、YDWHSHA、YDWHTQA、YDWLHHA、YDWLHYA、YDWLNWA、YDWLPAA、YDWLPGA、YDWLPIA、YDWLQVA、YDWLTPA、YDWLTQA、YDWNLSA、YDWNWYA、YDWPGYA、YDWPLIA、YDWPLVA、YDWPLYA、YDWPTYA、YDWQLIA、YDWQLLA、YDWQLNA、YDWWLDA、YDYDLYA、YDYEKYA、YDYELIA、YDYELPA、YDYELTA、YDYELWA、YDYGWPA、YDYGWYA、YDYHENA、YDYHHEA、YDYHIEA、YDYHLQA、YDYHPRA、YDYHTIA、YDYHTPA、YDYHTYA、YDYLFPA、YDYLHWA、YDYLIRA、YDYLNDA、YDYLNPA、YDYLNQA、YDYLPEA、YDYLPHA、YDYLPIA、YDYLPLA、YDYLPTA、YDYLQNA、YDYLQRA、YDYLRQA、YDYLWGA、YDYLWLA、YDYLWPA、YDYPEPA、YDYPIDA、YDYPIRA、YDYPLAA、YDYPLQA、YDYPPRA、YDYPQHA、YDYPSYA、YDYPTAA、YDYPTDA、YDYQHRA、YDYQHSA、YDYQIYA、YDYQLEA、YDYQLLT、YDYQNPA、YDYQQNA、YDYQQSA、YDYQTVA、YDYQWPA、YDYQYRA、YDYRHTA、YDYRLNA、YDYRQYA、YDYRRSA、YDYRSDA、YDYSGYA、YDYSNYA、YDYSTFA、YDYTEYA、YDYTLSA、YDYTQSA、YDYWLEA、YDYWLGT、YDYWLHA、YDYWLLA、YDYWLTA、YDYWPEA、YDYWPRA、YDYYLRA。
8.如前述权利要求中任一项所述的变体，其中缺失a)选自以下列表，该列表由以下各项组成：R181*+G182*、R181*+D183*、R181*+G184*、G182*+D183*、G182*+G184*、和D183*+G184*、优选地R181*+G182*。
9.如前述权利要求中任一项所述的变体，其中改变b)是所述位置中的两个或更多个，例如所述位置中的三个或更多个、所述位置中的四个或更多个、所述位置中的五个或更多个、所述位置中的六个或更多个。
10.如前述权利要求中任一项所述的变体，其中改变的数目是2-20个，例如，2-10个和2-5个，如2、3、4、5、6、7、8、9或10个改变。
11.如前述权利要求中任一项所述的变体，该变体与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％的一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％，但是小于100％序列一致性。
12.如前述权利要求中任一项所述的变体，该变体与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％的一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％，但是小于100％序列一致性。
13.如前述权利要求中任一项所述的变体，该变体是选自下组的亲本α-淀粉酶的变体，该组由以下各项组成：
a.与SEQ ID NO:1的成熟多肽具有至少80％序列一致性的多肽；
b.与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少80％序列一致性的多肽；
c.SEQ ID NO:1的成熟多肽的片段，该片段具有α-淀粉酶活性；
d.SEQ ID NO:2的成熟多肽的片段，该片段具有α-淀粉酶活性；
e.与针对SEQ ID NO:1的成熟多肽产生的抗体具有免疫交叉反应性的多肽；
f.与针对SEQ ID NO:2的成熟多肽产生的抗体具有免疫交叉反应性的多肽。
14.如前述权利要求中任一项所述的变体，其中该亲本α-淀粉酶与SEQ ID NO:1具有至少85％，例如至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％的一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列一致性。
15.如前述权利要求中任一项所述的变体，其中该亲本α-淀粉酶与SEQ ID NO:2具有至少85％，例如至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％的一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列一致性。
16.如前述权利要求中任一项所述的变体，其中该亲本α-淀粉酶包括SEQ ID NO:1的成熟多肽或由其组成。
17.如前述权利要求中任一项所述的变体，其中该亲本α-淀粉酶包括SEQ ID NO:2的成熟多肽或由其组成。
18.如前述权利要求中任一项所述的变体，该变体相对于该亲本具有改进的特性，其中该改进的特性选自下组，该组由以下各项组成：催化效率、催化速率、化学稳定性、氧化稳定性、pH活性、pH稳定性、比活性、存储条件下稳定性、底物结合、底物切割、底物特异性、底物稳定性、表面特性、热活性、热稳定性、以及优选地在低温下改进的洗涤性能。
19.如前述权利要求中任一项所述的变体，其中与SEQ ID NO:1或2的α-淀粉酶相比，该变体具有改进的α-淀粉酶活性。
20.包括如权利要求1-19中任一项所述的变体α-淀粉酶的洗涤剂组合物。
21.包括如权利要求1-19中任一项所述的变体α-淀粉酶的餐具洗涤组合物。
22.根据权利要求1-19中任一项所述的变体α-淀粉酶的用途，用于清洁过程如衣物或硬质表面清洁，包括自动化餐具洗涤。
23.一种编码如权利要求1-19中任一项所述的变体的分离的多核苷酸。
24.一种包括如权利要求23所述的多核苷酸的核酸构建体。
25.一种包括如权利要求23所述的多核苷酸的表达载体。
26.一种包括如权利要求23所述的多核苷酸的宿主细胞。
27.一种生产α-淀粉酶变体的方法，该方法包括：
a)在适于表达该变体的条件下培养如权利要求26所述的宿主细胞；和
b)回收该变体。
28.一种用于获得α-淀粉酶变体的方法，该方法包括向与SEQ ID NO:1具有至少80％序列一致性的亲本α-淀粉酶引入以下各项：
a)在对应于SEQ ID NO:1的成熟多肽的位置R181、G182、D183和G184的两个或更多个位置的缺失，以及
b)在对应于SEQ ID NO:1的成熟多肽的位置Y198、Y200、L201、Y203和A204的一个或多个位置的取代，以及
c)在对应于SEQ ID NO:1的成熟多肽的位置M202的位置的甲硫氨酸的取代，
其中该变体与SEQ ID NO:1或2的成熟多肽具有至少80％，例如至少90％，但是小于100％序列一致性，其中该变体具有α-淀粉酶活性；和回收该变体。
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