CN102918149A - α-淀粉酶 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及α-淀粉酶，编码所述α-淀粉酶的核酸，和产生所述α-淀粉酶的方法，以及使用所述α-淀粉酶的方法。

Description

α-淀粉酶
涉及序列表
本发明包含计算机可读形式的序列表，其通过提述并入本文。
技术领域
本发明涉及α-淀粉酶，编码所述α-淀粉酶的核酸，产生所述α-淀粉酶的方法，和使用所述α-淀粉酶的方法。
背景技术
α-淀粉酶(α-1,4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶，3.2.1.1)构成一组酶，其催化淀粉和其他直链和支链1,4-糖苷寡糖和多糖的水解。
α-淀粉酶在数种已知应用中的工业使用由来已久，所述应用如去污剂、烘烤、酿造、淀粉液化和糖化，例如，在高果糖糖浆或乙醇的产生中。这些应用以及其他应用利用源自微生物的α-淀粉酶，特别是细菌α-淀粉酶。
最初使用的细菌α-淀粉酶之一是来自地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)的α-淀粉酶，亦称作TermamylTM。已对其彻底表征，并对于该酶已确定了晶体结构。碱性淀粉酶，如来源于芽孢杆菌属菌种(Bacillus sp.)菌株NCIB 12289，NCIB 12512，NCIB 12513和DSM 9375(公开于WO 95/26397)，构成可用于去污剂的特定的α-淀粉酶组。已对许多这些已知的细菌淀粉酶进行修饰以改善其在特定应用中的功能性。
TermamylTM和许多高效α-淀粉酶的活性需要钙。TermamylTM的晶体结构显示三个钙原子通过荷负电荷的氨基酸残基的络合而结合于α-淀粉酶结构。对钙的需求对于存在强螯合化合物存在的应用如去污剂中或从全谷粒产生乙醇过程(其中植物材料包含大量的天然螯合剂如植酸)中是不利的。
已知对钙不敏感性淀粉酶，例如公开于EP 1022334和WO 03/083054的α-淀粉酶，和具有公开于UNIPROT:Q03657的序列的环状芽孢杆菌(Bacilluscirculans)α-淀粉酶。
因此，提供具有减少的钙敏感性的α-淀粉酶会是有利的。
发明内容
本发明涉及α-淀粉酶，其包含钙敏感性α-淀粉酶的A-和C-结构域，和钙不敏感性α-淀粉酶的B-结构域或其部分。所述α-淀粉酶在强螯合剂存在下具有高稳定性和/或活性，并且还在多种工业应用中具有相当大改进的性能。
本发明还涉及包含本发明的α-淀粉酶的组合物，例如去污剂组合物。
此外，本发明涉及编码本发明的α-淀粉酶的核酸，包含这类核酸的质粒，包含这种质粒或核酸的宿主细胞，和用于产生所述α-淀粉酶的方法。
附图说明
图1显示具有SEQ ID NO:1-16，29和30的氨基酸序列的α-淀粉酶的比对。
发明详述
定义
A-、B-和C-结构域：α-淀粉酶的结构包含三个明显的结构域A、B和C，参见例如Machius等,1995,J.Mol.Biol.246:545-559。术语“结构域”抑制多肽的区，其本身形成整个分子的明显而独立的亚结构。α-淀粉酶包含携带活性位点的β/α-8桶(barrel)，其标为A-结构域，在β-折叠3和α-螺旋3之间有一定长度的环，其标为B-结构域，和C结构域，并在一些情况下还包含糖结合结构域(例如，WO 2005/001064;Machius等,见上)。
α-淀粉酶的结构域可通过结构分析如通过使用晶体学技术来确定。另一种用于确定α-淀粉酶的结构域的方法是通过将α-淀粉酶的氨基酸序列与已经确定结构域的另一种α-淀粉酶进行序列比对。例如，与以确定结构域的α-淀粉酶的B-结构域序列能够比对的序列可认为是该给定α-淀粉酶的B-结构域。
等位变体(allelic variant)：术语“等位变体”意指占据相同染色体基因座的基因的任何两种或更多种可选形式。等位变异通过突变天然地发生，并且可导致种群内的多态性。基因突变可以是沉默的(在编码的多肽中无变化)或可以编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位变体是由基因的等位变体编码的多肽。
α-淀粉酶(α-1,4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶，3.2.1.1)构成一组酶，其催化淀粉和其他直链和支链1,4-糖苷寡糖和多糖的水解。已知源自广泛选择的生物的α-淀粉酶，所述生物包括细菌，例如源自芽孢杆菌属(Bacillus)的菌种，例如，地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)；源自真菌菌种，例如米曲霉(Aspergillus oryzae)(TAKA淀粉酶)或黑曲霉(Aspergillus nigar)；源自植物例如大麦以及源自哺乳动物。
钙不敏感淀粉酶意指无需钙存在以供最适活性和/或维持活性构象/结构的α-淀粉酶。
钙敏感性淀粉酶意指需要钙存在以维持其结构和/或具有完整酶活性的α-淀粉酶。对于一些钙敏感性淀粉酶，已显示其在活性构象中含有络合于酸性氨基酸残基的钙原子。已知大量钙敏感性α-淀粉酶，且由于其有利的性质，已在产业上使用。钙敏感性α-淀粉酶对于导致络合于其结构中的钙原子的丧失的条件，如去污剂组合物和燃料物质(fuel mass)通常是敏感的。
钙敏感性通过将给定的α-淀粉酶在强螯合剂的存在下温育并分析该温育对α-淀粉酶的活性或稳定性的作用来确定。钙敏感性α-淀粉酶在络合剂的存在下会较不稳定，并通过所述温育丧失其活性的大部分或全部，而钙不敏感性淀粉酶在温育过程中不会丧失活性，或仅丧失小部分活性。螯合剂强度可使用本领结构域中已知的方法如描述于Nielsen等,2003,Anal.Biochem.314:227-234以及Nagarajan and Paine,1984,J.Am.Oil Chem.Soc.61(9):1475-1478(通过提述并入本文)的方法来衡量。可用于此种测定的强螯合剂的实例为EGTA(乙二醇四乙酸)，EDTA(乙二胺四乙酸)，DTPA(二亚乙基三胺五乙酸，diethylene triaminepentaacetic acid)，DTMPA(二亚乙基三胺五亚甲基膦酸，diethylenetriamine-penta-methylene phosphonic acid)和HEDP(1-羟基乙烷-1,1-二基二膦酸，1-hydroxyethan-1,1-diylbis(phosphonic acid))。可使用其他强螯合剂确定α-淀粉酶的钙敏感性。本领域普通技术人员能够决定用于测定钙敏感性的温度、pH和钙浓度。通常，使用比最佳温度高约5-10度的温度。
编码序列：术语“编码序列”意指直接指定多肽氨基酸序列的多核苷酸。编码序列的边界通常由开读框确定，所述开读框通常以ATG起始密码子或可供选择的起始密码子如GTG和TTG开始，并且以终止密码子如TAA、TAG和TGA结束。编码序列可以是基因组DNA、cDNA、合成的或重组的多核苷酸。
调控序列(control sequence)：术语“调控序列”意指包括编码本发明的α-淀粉酶的多核苷酸表达所必需的所有组分。各个调控序列对于编码所述α-淀粉酶的多核苷酸可以是天然的或外源的，或各个调控序列对于彼此可以是天然的或外源的。这些调控序列包括但不限于前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列和转录终止子。最低限度，调控序列包括启动子和转录和翻译的终止信号。调控序列可以和用于引入特异性限制位点的接头一起提供，所述特异性限制位点促进调控序列与编码α-淀粉酶的多核苷酸编码区的连接。
表达：术语“表达”包括涉及多肽产生的任何步骤，其包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。
表达载体：术语“表达载体”意指线性的或环状的DNA分子，其包含编码本发明的多肽的多核苷酸，并与供用于其表达的其他核苷酸可操作地连接。
宿主细胞：术语“宿主细胞”意指任何细胞类型，所述细胞类型对于用包含本发明的多核苷酸的核酸构建体或表达载体的转化、转染、转导等是易感的(susceptible)。术语“宿主细胞”涵盖由于在复制过程中发生的突变而与亲本细胞不完全相同的亲本细胞的任何后代。
改善的性质：术语“改善的性质”意指与其他α-淀粉酶相比得到改善的与α-淀粉酶相关的特征。此类改善的特征包括但不限于，改变的温度依存性活性概貌，热稳定性，pH活性，pH稳定性，底物特异性，产物特异性和化学稳定性。
核酸构建体：术语“核酸构建体”意指单链或双链的核酸分子，所述核酸分子分离自天然存在的基因，或将所述核酸分子以本来不存在于(nototherwise exist)自然界中的方式修饰以含有核酸的区段或所述核酸分子是合成的。当所述核酸构建体含有表达编码序列所需的调控序列时，术语核酸构建体与术语“表达盒”同义。
可操作地连接：术语“可操作地连接”意指这样的构型，其中将调控序列置于相对于多核苷酸序列的编码序列的适当位置，使得调控序列指导多肽的编码序列的表达。
亲本酶：术语“亲本”α-淀粉酶意指这样的α-淀粉酶，本发明的α-淀粉酶是通过对其进行修饰而产生的。所述亲本可为天然存在的(野生型)多肽，或其通过任何合适的方式制备的变体。举例而言，所述亲本蛋白可为具有修饰的或改变的氨基酸序列的天然存在的多肽的变体。亲本亦可为等位变体。
多肽片段：术语“多肽片段”意指从成熟多肽的氨基和/或羧基末端缺失了一个或多个(几个)氨基酸的多肽；其中所述片段具有α-淀粉酶活性。在一个方面，片段含有至少481个氨基酸残基，例如至少483个，至少486个和至少493个氨基酸残基。
同一性：两个氨基酸序列间或两个核苷酸序列间的相关性由参数”同一性”所描述。
就本发明而言，两个氨基酸序列之间的同一性程度使用如EMBOSS软件包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件组(The European Molecular Biology OpenSoftware Suite)，Rice等，2000，Trends in Genetics 16:276-277)的Needle程序，优选为3.0.0版或之后的版本中执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970，J.Mol.Biol.48：443-453)确定。所用的可选参数为缺口开放罚分(gap open penalty)10，缺口延伸罚分(gap extension penalty)0.5，和EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版)取代矩阵。使用标记为“最长同一性”的Needle输出(使用-nobrief选项获得)作为百分比同一性并计算如下：
(相同的残基×100)/(比对长度-比对中缺口总数)
就本发明而言，两个脱氧核糖核苷酸序列之间的同一性程度使用如EMBOSS软件包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件组(The European MolecularBiology Open Software Suite)，Rice等，2000，见上)的Needle程序，优选为3.0.0版或之后的版本中执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970，见上)确定。所用的可选参数为缺口开放罚分10，缺口延伸罚分0.5，和EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版)取代矩阵。使用标记为”最长同一性”的Needle输出(使用-nobrief选项获得)作为百分比同一性并计算如下：
(相同的脱氧核糖核苷酸×100)/(比对长度–比对中缺口总数)
亚序列：术语“亚序列(subsequence)”意指从成熟多肽编码序列的5′和/或3′端缺失了一个或多个(几个)核苷酸的多核苷酸序列；其中所述亚序列编码具有α-淀粉酶活性的多肽片段。
变体：术语“变体”意指具有α-淀粉酶活性的多肽，其包含改变，即在一个或多个(几个)位置取代、插入和/或缺失一个或多个(几个)氨基酸残基。取代意指将占据某位置的氨基酸用不同的氨基酸取代；缺失意指去除占据某位置的氨基酸；和插入意指在占据某位置的氨基酸邻接处或之后添加氨基酸，例如，1-5个氨基酸。
野生型：术语“野生型”α-淀粉酶意指由天然存在的微生物如见于自然界的细菌、酵母或丝状真菌表达的α-淀粉酶。
变体命名规则：
就本发明而言，除非另行指明，使用公开于SEQ ID NO:27中的杂合多肽(其具有如下序列：嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)α-淀粉酶(SEQ IDNO:4)的氨基酸1-104，接着是环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)α-淀粉酶(SEQ IDNO:13)的氨基酸103-208，接着是嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)α-淀粉酶(SEQ ID NO:4)的氨基酸211-515)以确定在其他α-淀粉酶中对应的氨基酸残基。将其他α-淀粉酶的氨基酸序列与公开于SEQ ID NO:27中的成熟多肽进行比对，并基于该比对，可以使用Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970，J.Mol.Biol.48：443-453)(如用EMBOSS软件包(EMBOSS：欧洲分子生物开放软件组(The European Molecular Biology Open Software Suite)，Rice等，2000，Trends in Genetics 16:276-277；http://emboss.org)的Needle程序执行，优选为3.0.0版或之后的版本)确定SEQ ID NO:27所公开的成熟多肽中任何氨基酸残基对应的氨基酸位置编号。
在另一个α-淀粉酶中对应氨基酸残基的鉴定可通过使用“ClustalW”(Larkin等,2007,Bioinformatics 23:2947-2948)进行的多个多肽序列的比对来确证。
当其他酶与SEQ ID NO:2的成熟多肽歧异到传统的基于序列的比较无法检测出其关系时(Lindahl和Elofsson,2000,J.Mol.Biol.295:613-615)，可使用其他配对序列比较算法。在基于序列的搜索中较高的敏感度可使用采用多肽家族的概率表现(probabilistic representation)(序型)搜索数据库的搜索程序来获得。例如，PSI-BLAST程序通过迭代的(iterative)数据库搜索过程来产生序型，并能够检测出较远的同源物(Atschul等,1997,Nucleic Acids Res.25:3389-3402)。当多肽的家族或超家族在蛋白质结构数据库中具有一个或多个(几个)代表时，甚至可达成更高的敏感度。程序如GenTHREADER(Jones 1999,J.Mol.Biol.287:797-815;McGuffin和Jones,2003,Bioinformatics 19:874-881)使用来自不同来源(PSI-BLAST、二级结构预测(secondary structure prediction)、结构比对序型(structural alignment profile)以及溶解势(solvation potential))的信息作为预测所查询序列(query sequence)结构折叠(structural fold)的神经网络的输入。类似地，Gough等,2000,J.Mol.Biol.313:903-919的方法可用于将未知结构的序列与存在于SCOP数据库中的超家族模型进行比对。这些比对可接着用于生成所述多肽的同源性模型，且上述模型可就其准确度使用多种为此目的开发的工具加以评价。
对于已知结构的蛋白质，可获取数种工具和资源以供找回(retrieve)和生成结构比对。例如，已将SCOP超家族的蛋白质进行了结构比对，且这些比对是可获取并可下载的。两个或更多蛋白质结构可使用多种算法，如距离比对矩阵(distance alignment matrix)(Holm和Sander，1998,Proteins 33:88-96)或组合延伸(combinatorial extension)(Shindyalov和Bourne,1998,Protein Eng.11:739-747)进行比对，且这些算法的实施可另外用于查询具有目标结构的结构数据库，以发现可能的结构同源物(例如Holm和Park,2000,Bioinformatics16:566-567)。这些结构比对可用于在相同结构超家族内的氨基酸中预测结构和功能上对应的氨基酸残基。这些信息，以及来源于同源性建模和概貌检索(profile search)的信息，可用于当将感兴趣的突变从一种蛋白移至近或远的同源物时，预测突变哪个残基。
在描述本发明的不同α-淀粉酶变体时，为了参照方便起见，采用了下面所述的命名法。在所有情况下，采用通用的IUPAC单字母或三字母氨基酸缩写。
取代。对于氨基酸取代，使用下述命名法：初始氨基酸，位置，取代氨基酸。相应地，在226位用丙氨酸取代苏氨酸命名为“Thr226Ala”或“T226A”。多重突变可以用加号(“+”)分开，例如，“Gly205Arg+Ser411Phe”或“G205R+S411F”，分别代表在205和411位用精氨酸(R)取代甘氨酸(G)，以及用苯丙氨酸(F)取代丝氨酸(S)。
缺失。对于氨基酸缺失，使用了如下命名法：初始氨基酸，位置*。相应地，在位置195缺失甘氨酸命名为“Gly195*”或“G195*”。多个缺失通过加法符(“+”)分开，例如，“Gly195*+Ser411*”或“G195*+S411*”。
插入。对于氨基酸插入，使用了如下的命名法：初始氨基酸，位置，初始氨基酸，新插入的氨基酸。因此，在位置195的甘氨酸之后插入赖氨酸命名为“Gly195GlyLys”或“G195GK”。多个氨基酸的插入命名为[初始氨基酸，位置，初始氨基酸，新插入的氨基酸#1，新插入的氨基酸#2；等等]。例如，在位置195的甘氨酸之后插入赖氨酸和丙氨酸记为“Gly195GlyLysAla”或“G195GKA”。
在此情况下，通过在插入的氨基酸残基前的氨基酸残基的位置号添加小写字母而对插入的氨基酸残基进行编号。因此，在上一例子中序列为：
  亲本:   变体:
  195   195  195a 195b
  G   G-    K-   A
多重改变。包含多重改变的变体由加法符号(“+”)分隔，例如“Arg170Tyr+Gly195Glu”或“R170Y+G195E”代表分别在位置170用酪氨酸取代精氨酸，和在位置195用谷氨酸取代甘氨酸。
不同的改变。当可在一个位置导入不同的改变时，所述不同改变由逗号分隔，例如“Arg170Tyr,Glu”代表在位置170用酪氨酸或谷氨酸取代精氨酸，因此“Tyr167Gly,Ala+Arg170Gly,Ala”指下述变体：
Tyr167Gly+Arg170Gly，Tyr167Gly+Arg170Ala，Tyr167Ala+Arg170Gly和Tyr167Ala+Arg170Ala。
α-淀粉酶
本发明的α-淀粉酶包含钙敏感性α-淀粉酶的A-结构域、钙不敏感性α-淀粉酶的B-结构域和钙敏感性α-淀粉酶的C-结构域。亲本α-淀粉酶可进一步包含糖结合模块。
钙敏感性淀粉酶
钙敏感性α-淀粉酶的实例包括下述α-淀粉酶：
1.解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)α-淀粉酶，其具有SEQ IDNO:1的氨基酸序列；
2.黄热芽孢杆菌(Bacillus flavothermus)淀粉酶，AMY1048，描述于WO2005/001064，其具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列；
3.地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)α-淀粉酶，其具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列，
4.嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)α-淀粉酶，其具有SEQID NO:4的氨基酸序列；
5.α-淀粉酶AA560，其来源于WO 00/60060中描述的芽孢杆菌属菌种DSM 12649，具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列；
6.α-淀粉酶，其来源于WO 95/26397中描述的芽孢杆菌属菌种菌株NCIB12512，具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列；
7.α-淀粉酶，其来源于WO 95/26397中描述的芽孢杆菌属菌种菌株NCIB12513,具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列；
8.α-淀粉酶SP707，其由Tsukamoto等,1988,Biochem.Biophys.Res.Comm.151:25-31描述，具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列；
9.α-淀粉酶TS-22，其具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列；
10.α-淀粉酶TS-23，其描述于J.Appl.Microbiology,1997,82:325-334(SWALL:q59222)，具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列；
11.α-淀粉酶，其来源于WO 97/00324中所述的芽孢杆菌属菌种KSM-AP1378(FERM BP-3048)，具有SEQ ID NO:11的氨基酸序列；
12.α-淀粉酶，其来源于WO 02/10356中所述的芽孢杆菌属菌种A 7-7，具有SEQ ID NO:12的氨基酸序列；
13.α-淀粉酶，其来源于嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)(Spezyme Xtra)，具有SEQ ID NO:29的氨基酸序列；
14.噬纤维菌属(Cytophaga)α-淀粉酶，其描述于Jeang等,2002,Appl.Environ.Microbiol.68:3651-3654，具有SEQ ID NO:30的氨基酸序列；
以及任何这些钙敏感性α-淀粉酶的杂合物和变体。
其他钙敏感性α-淀粉酶包括由EP 0252666(ATCC 27811)中所述的地衣芽孢杆菌菌株产生的α-淀粉酶，以及WO 91/00353和WO 94/18314中所述的α-淀粉酶。
所述钙敏感性α-淀粉酶可为两种或更多种钙敏感性α-淀粉酶的杂合物，如解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶和地衣芽孢杆菌α-淀粉酶之间的杂合物。
商业上可获得的钙敏感性α-淀粉酶为以下述商标出售的产品：OptithermTM和TakathermTM(可从Danisco获得)；MaxamylTM(可从Danisco获得)，Spezym AATM，Spezyme Delta AATM，Spezyme Fred和Spezyme Xtra(可从Danisco获得)，和KeistaseTM(可从Daiwa获得)，PURASTARTM ST 5000E，和PURASTARTM HPAM L(来自Genencor Int.)。
这些钙敏感性α-淀粉酶的A-、B-、C-和糖结合结构域提供于下表：
Figure BDA00002094921200101
钙不敏感性α-淀粉酶
钙不敏感性α-淀粉酶的实例包括下述：
1.环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)α-淀粉酶，其具有示于SEQ ID NO:13的序列；
2.KSM K-36α-淀粉酶，其具有示于SEQ ID NO:14的序列；
3.KSM K-38α-淀粉酶，其具有公开在SEQ ID NO:15的序列；
4.沃氏火球菌(Pyrococcus woesei)α-淀粉酶，其具有SEQ ID NO:16的氨基酸序列；
5.火球菌属(Pyrococcus)杂合α-淀粉酶，其描述于WO 03/083054，具有SEQ ID NO:31的氨基酸序列；
以及任何这些α-淀粉酶的杂合物和变体。
这些钙不敏感性α-淀粉酶的A-、B-、C-和糖结合结构域提供于下表：
Figure BDA00002094921200102
本发明的α-淀粉酶
本发明的α-淀粉酶包含钙敏感性α-淀粉酶的A-结构域、钙不敏感性α-淀粉酶的B-结构域和钙敏感性α-淀粉酶的C-结构域。
在一个实施方案中，所述A-结构域与SEQ ID NO:1的A-结构域具有至少60％序列同一性，例如，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或至少100％序列同一性。
在一个实施方案中，所述A-结构域与SEQ ID NO:2的A-结构域具有至少60％序列同一性，例如，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或至少100％序列同一性。
在一个实施方案中，所述A-结构域与SEQ ID NO:3的A-结构域具有至少60％序列同一性，例如，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或至少100％序列同一性。
在一个实施方案中，所述A-结构域与SEQ ID NO:4的A-结构域具有至少60％序列同一性，例如，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或至少100％序列同一性。
在一个实施方案中，所述A-结构域与SEQ ID NO:5的A-结构域具有至少60％序列同一性，例如，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或至少100％序列同一性。
在一个实施方案中，所述A-结构域与SEQ ID NO:6的A-结构域具有至少60％序列同一性，例如，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或至少100％序列同一性。
在一个实施方案中，所述A-结构域与SEQ ID NO:7的A-结构域具有至少60％序列同一性，例如，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或至少100％序列同一性。
在一个实施方案中，所述A-结构域与SEQ ID NO:8的A-结构域具有至少60％序列同一性，例如，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或至少100％序列同一性。
在一个实施方案中，所述A-结构域与SEQ ID NO:9的A-结构域具有至少60％序列同一性，例如，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或至少100％序列同一性。
在一个实施方案中，所述A-结构域与SEQ ID NO:10的A-结构域具有至少60％序列同一性，例如，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或至少100％序列同一性。
在一个实施方案中，所述A-结构域与SEQ ID NO:11的A-结构域具有至少60％序列同一性，例如，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或至少100％序列同一性。
在一个实施方案中，所述A-结构域与SEQ ID NO:12的A-结构域具有至少60％序列同一性，例如，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或至少100％序列同一性。
在一个实施方案中，所述A-结构域与SEQ ID NO:29的A-结构域具有至少60％序列同一性，例如，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或至少100％序列同一性。
在一个实施方案中，所述A-结构域与SEQ ID NO:30的A-结构域具有至少60％序列同一性，例如，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或至少100％序列同一性。
在一个实施方案中，所述B-结构域与SEQ ID NO:13的B-结构域具有至少60％序列同一性，例如，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或至少100％序列同一性。
在一个实施方案中，B-结构域与SEQ ID NO:14的B-结构域具有至少60％序列同一性，例如，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或至少100％序列同一性。
在一个实施方案中，B-结构域与SEQ ID NO:15的B-结构域具有至少60％序列同一性，例如，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或至少100％序列同一性。
在一个实施方案中，B-结构域与SEQ ID NO:16的B-结构域具有至少60％序列同一性，例如，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或至少100％序列同一性。
在一个实施方案中，B-结构域与SEQ ID NO:31的B-结构域具有至少60％序列同一性，例如，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或至少100％序列同一性。
在一个实施方案中，C-结构域与SEQ ID NO:1的C-结构域具有至少60％序列同一性，例如，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或至少100％序列同一性。
在一个实施方案中，C-结构域与SEQ ID NO:2的C-结构域具有至少60％序列同一性，例如，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或至少100％序列同一性。
在一个实施方案中，C-结构域与SEQ ID NO:3的C-结构域具有至少60％序列同一性，例如，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或至少100％序列同一性。
在一个实施方案中，C-结构域与SEQ ID NO:4的C-结构域具有至少60％序列同一性，例如，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或至少100％序列同一性。
在一个实施方案中，C-结构域与SEQ ID NO:5的C-结构域具有至少60％序列同一性，例如，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或至少100％序列同一性。
在一个实施方案中，C-结构域与SEQ ID NO:6的C-结构域具有至少60％序列同一性，例如，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或至少100％序列同一性。
在一个实施方案中，C-结构域与SEQ ID NO:7的C-结构域具有至少60％序列同一性，例如，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或至少100％序列同一性。
在一个实施方案中，C-结构域与SEQ ID NO:8的C-结构域具有至少60％序列同一性，例如，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或至少100％序列同一性。
在一个实施方案中，C-结构域与SEQ ID NO:9的C-结构域具有至少60％序列同一性，例如，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或至少100％序列同一性。
在一个实施方案中，C-结构域与SEQ ID NO:10的C-结构域具有至少60％序列同一性，例如，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或至少100％序列同一性。
在一个实施方案中，C-结构域与SEQ ID NO:11的C-结构域具有至少60％序列同一性，例如，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或至少100％序列同一性。
在一个实施方案中，C-结构域与SEQ ID NO:12的C-结构域具有至少60％序列同一性，例如，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或至少100％序列同一性。
在一个实施方案中，C-结构域与SEQ ID NO:29的C-结构域具有至少60％序列同一性，例如，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或至少100％序列同一性。
在一个实施方案中，C-结构域与SEQ ID NO:30的C-结构域具有至少60％序列同一性，例如，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或至少100％序列同一性。
α-淀粉酶可通过用钙不敏感性α-淀粉酶的B-结构域或其部分取代钙敏感性α-淀粉酶的B结构域或其部分来产生。所述α-淀粉酶亦可通过用钙敏感性α-淀粉酶的A-和C-结构域或其部分取代钙不敏感性α-淀粉酶的A-和C-结构域或其部分来产生。当产生杂合α-淀粉酶时，不应在两个剪接位点，即钙敏感性α-淀粉酶的序列与钙不敏感性α-淀粉酶的序列结合的两个位点缺失或插入任何氨基酸。
上标中提供的该敏感性和钙不敏感性淀粉酶的A-、B-和C-结构域的边界是灵活的，且对于所述序列可允许一定的自由度。因此，一般而言，可偏离所述结构域的精确边界多至20个氨基酸，例如，少于20个氨基酸，少于10个氨基酸，少于6个氨基酸和少于3个氨基酸。换言之，待用钙不敏感性α-淀粉酶的序列替代的钙敏感性α-淀粉酶的序列可在B-结构域边界的20个氨基酸内，例如少于10个氨基酸，在6个氨基酸内，和在3个氨基酸内。举例而言，所述边界相差一个氨基酸，两个氨基酸，三个氨基酸，四个氨基酸，五个氨基酸，六个氨基酸，七个氨基酸，八个氨基酸，九个氨基酸或十个氨基酸。
举例而言，对于解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶(SEQ ID NO:1)，其中B-结构域确定为氨基酸残基102-207，待用钙不敏感性α-淀粉酶的相应序列替代的序列起始于位置92-112范围内的位置并终止于在位置197-217范围内的位置，例如，起始于位置96-108范围内的位置并终止于在位置198-213范围内的位置或者起始于位置99-105范围内的位置并终止于在位置204-210范围内的位置。解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶的A和C-结构域分别确定为氨基酸残基1-101(A1)+208-396(A2)和397-483。本发明的α-淀粉酶可包含A1-结构域，其起始于位置1-5范围内的位置并终止于在位置91-111范围内的位置，例如起始于位置1-3范围内的位置并终止于在位置96-101范围内的位置或者起始于位置1-3范围内的位置并终止于在位置101-106范围内的位置。本发明的α-淀粉酶可包含A2和C-结构域，其起始于位置198-218范围内的位置并终止于在位置478-483范围内的位置，例如起始于位置203-208范围内的位置并终止于在位置480-483范围内的位置或者起始于位置208-213范围内的位置并终止于在位置480-483范围内的位置。
对于黄热芽孢杆菌α-淀粉酶(SEQ ID NO:2)，其中B-结构域确定为氨基酸残基106-211，待用钙不敏感性α-淀粉酶的相应序列替代的序列起始于位置96-116范围内的位置并终止于在位置198-218范围内的位置，例如，起始于位置100-112范围内的位置并终止于在位置202-214范围内的位置或者起始于位置103-109范围内的位置并终止于在位置205-212范围内的位置。黄热芽孢杆菌α-淀粉酶的A和C-结构域分别确定为氨基酸残基1-105(A1)+212-398(A2)和399-484。本发明的α-淀粉酶可包含A1-结构域，其起始于位置1-5范围内的位置并终止于在位置95-115范围内的位置，例如起始于位置1-3范围内的位置并终止于在位置100-105范围内的位置或者起始于位置1-3范围内的位置并终止于在位置105-110范围内的位置。本发明的α-淀粉酶可包含A2和C-结构域，其起始于位置202-222范围内的位置并终止于在位置481-484范围内的位置，例如起始于位置207-212范围内的位置并终止于在位置481-484范围内的位置或者起始于位置212-217范围内的位置并终止于在位置481-484范围内的位置。黄热芽孢杆菌α-淀粉酶进一步具有氨基酸485-586的糖结合结构域。所述糖结合结构域对于淀粉酶活性并不是必需的，并可全部或部分缺失。
对于地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(SEQ ID NO:3)，其中B-结构域确定为氨基酸残基104-207，待用钙不敏感性α-淀粉酶的相应序列替代的地衣芽孢杆菌的序列起始于位置94-144范围内的位置并终止于在位置194-214范围内的位置，例如，起始于位置98-110范围内的位置并终止于在位置198-210范围内的位置或者起始于位置101-107范围内的位置并终止于在位置201-207范围内的位置。地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的A和C-结构域分别确定为氨基酸残基1-103(A1)+208-396(A2)和397-483。本发明的α-淀粉酶可包含A1-结构域，其起始于位置1-5范围内的位置并终止于在位置93-113范围内的位置，例如起始于位置1-3范围内的位置并终止于在位置98-103范围内的位置或者起始于位置1-3范围内的位置并终止于在位置103-108范围内的位置。本发明的α-淀粉酶可包含A2和C-结构域，其起始于位置198-218范围内的位置并终止于在位置478-483范围内的位置，例如起始于位置203-208范围内的位置并终止于在位置480-483范围内的位置或者起始于位置208-213范围内的位置并终止于在位置480-483范围内的位置。
对于嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶(SEQ ID NO:4)，其中B-结构域确定为氨基酸残基105-210，待用钙不敏感性α-淀粉酶的相应序列替代的序列起始于位置95-115范围内的位置并终止于在位置197-213范围内的位置，例如，起始于位置99-111范围内的位置并终止于在位置201-213范围内的位置或者起始于位置102-108范围内的位置并终止于在位置204-210范围内的位置。嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的A和C-结构域分别确定为氨基酸残基1-104(A1)+211-396(A2)和397-483。本发明的α-淀粉酶可包含A1-结构域，其起始于位置1-5范围内的位置并终止于在位置94-114范围内的位置，例如起始于位置1-3范围内的位置并终止于在位置99-104范围内的位置或者起始于位置1-3范围内的位置并终止于在位置104-109范围内的位置。本发明的α-淀粉酶可包含A2和C-结构域，其起始于位置101-221范围内的位置并终止于在位置478-483范围内的位置，例如起始于位置206-211范围内的位置并终止于在位置480-483范围内的位置或者起始于位置211-216范围内的位置并终止于在位置480-483范围内的位置。嗜热淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶进一步具有氨基酸484-586的糖结合结构域。所述糖结合结构域对于淀粉酶活性并不是必需的，并可全部或部分缺失。
对于芽孢杆菌α-淀粉酶(SEQ ID NO:5)，其中B-结构域确定为氨基酸残基106-212，待用钙不敏感性α-淀粉酶的相应序列替代的序列起始于位置96-116范围内的位置并终止于在位置199-219范围内的位置，例如，起始于位置100-112范围内的位置并终止于在位置203-215范围内的位置或者起始于位置103-109范围内的位置并终止于在位置206-212范围内的位置。芽孢杆菌α-淀粉酶的A和C-结构域分别确定为氨基酸残基1-105(A1)+213-396(A2)和399-485。本发明的α-淀粉酶可包含A1-结构域，其起始于位置1-5范围内的位置并终止于在位置95-115范围内的位置，例如起始于位置1-3范围内的位置并终止于在位置100-105范围内的位置或者起始于位置1-3范围内的位置并终止于在位置105-110范围内的位置。本发明的α-淀粉酶可包含A2和C-结构域，其起始于位置203-223范围内的位置并终止于在位置482-485范围内的位置，例如起始于位置208-213范围内的位置并终止于在位置482-485范围内的位置或者起始于位置213-218范围内的位置并终止于在位置482-485范围内的位置。
对于芽孢杆菌α-淀粉酶(SEQ ID NO:6)，其中B-结构域确定为氨基酸残基106-212，待用钙不敏感性α-淀粉酶的相应序列替代的序列起始于位置96-116范围内的位置并终止于在位置199-219范围内的位置，例如，起始于位置100-112范围内的位置并终止于在位置203-215范围内的位置或者起始于位置103-109范围内的位置并终止于在位置206-212范围内的位置。芽孢杆菌α-淀粉酶的A和C-结构域分别确定为氨基酸残基1-105(A1)+213-398(A2)和399-485。本发明的α-淀粉酶可包含A1-结构域，其起始于位置1-5范围内的位置并终止于在位置95-115范围内的位置，例如起始于位置1-3范围内的位置并终止于在位置100-115范围内的位置或者起始于位置1-3范围内的位置并终止于在位置105-110范围内的位置。本发明的α-淀粉酶可包含A2和C-结构域，其起始于位置203-223范围内的位置并终止于在位置482-485范围内的位置，例如起始于位置208-213范围内的位置并终止于在位置482-485范围内的位置或者起始于位置213-218范围内的位置并终止于在位置482-485范围内的位置。
对于芽孢杆菌α-淀粉酶(SEQ ID NO:7)，其中B-结构域确定为氨基酸残基106-212，待用钙不敏感性α-淀粉酶的相应序列替代的序列起始于位置96-116范围内的位置并终止于在位置199-219范围内的位置，例如，起始于位置100-112范围内的位置并终止于在位置203-215范围内的位置或者起始于位置103-109范围内的位置并终止于在位置202-216范围内的位置。芽孢杆菌α-淀粉酶的A和C-结构域分别确定为氨基酸残基1-105(A1)+213-398(A2)和399-485。本发明的α-淀粉酶可包含A1-结构域，其起始于位置1-5范围内的位置并终止于在位置95-115范围内的位置，例如起始于位置1-3范围内的位置并终止于在位置100-105范围内的位置或者起始于位置1-3范围内的位置并终止于在位置105-110范围内的位置。本发明的α-淀粉酶可包含A2和C-结构域，其起始于位置203-223范围内的位置并终止于在位置482-485范围内的位置，例如起始于位置208-213范围内的位置并终止于在位置482-485范围内的位置或者起始于位置213-218范围内的位置并终止于在位置482-485范围内的位置。
对于SP707α-淀粉酶(SEQ ID NO:8)，其中B-结构域确定为氨基酸残基106-212，待用钙不敏感性α-淀粉酶的相应序列替代的序列起始于位置96-116范围内的位置并终止于在位置199-219范围内的位置，例如，起始于位置100-112范围内的位置并终止于在位置203-215范围内的位置或者起始于位置103-109范围内的位置并终止于在位置206-212范围内的位置。SP707α-淀粉酶的A和C-结构域分别确定为氨基酸残基1-105(A1)+213-398(A2)和399-485。本发明的α-淀粉酶可包含A1-结构域，其起始于位置1-5范围内的位置并终止于在位置95-115范围内的位置，例如起始于位置1-3范围内的位置并终止于在位置100-105范围内的位置或者起始于位置1-3范围内的位置并终止于在位置105-110范围内的位置。本发明的α-淀粉酶可包含A2和C-结构域，其起始于位置203-223范围内的位置并终止于在位置482-485范围内的位置，例如起始于位置208-213范围内的位置并终止于在位置482-485范围内的位置或者起始于位置213-218范围内的位置并终止于在位置482-485范围内的位置。
对于TS-22α-淀粉酶(SEQ ID NO:9)，其中B-结构域确定为氨基酸残基106-212，待用钙不敏感性α-淀粉酶的相应序列替代的序列起始于位置96-116范围内的位置并终止于在位置199-219范围内的位置，例如，起始于位置100-112范围内的位置并终止于在位置203-215范围内的位置或者起始于位置103-109范围内的位置并终止于在位置206-212范围内的位置。TS-22α-淀粉酶的A和C-结构域分别确定为氨基酸残基1-105(A1)+213-398(A2)和399-484。本发明的α-淀粉酶可包含A1-结构域，其起始于位置1-5范围内的位置并终止于在位置95-115范围内的位置，例如起始于位置1-3范围内的位置并终止于在位置100-105范围内的位置或者起始于位置1-3范围内的位置并终止于在位置105-110范围内的位置。本发明的α-淀粉酶可包含A2和C-结构域，其起始于位置203-223范围内的位置并终止于在位置481-484范围内的位置，例如起始于位置208-213范围内的位置并终止于在位置482-484范围内的位置或者起始于位置213-218范围内的位置并终止于在位置482-484范围内的位置。TS-22α-淀粉酶进一步具有氨基酸485-586的糖结合结构域。所述糖结合结构域对于淀粉酶活性并不是必需的，并可全部或部分缺失。
对于TS-23α-淀粉酶(SEQ ID NO:10)，其中B-结构域确定为氨基酸残基106-212，待用钙不敏感性α-淀粉酶的相应序列替代的序列起始于位置96-116范围内的位置并终止于在位置199-219范围内的位置，例如，起始于位置100-112范围内的位置并终止于在位置203-215范围内的位置或者起始于位置103-109范围内的位置并终止于在位置206-212范围内的位置。TS-23α-淀粉酶的A和C-结构域分别确定为氨基酸残基1-105(A1)+213-398(A2)和399-484。本发明的α-淀粉酶可包含A1-结构域，其起始于位置1-5范围内的位置并终止于在位置95-115范围内的位置，例如起始于位置1-3范围内的位置并终止于在位置100-105范围内的位置或者起始于位置1-3范围内的位置并终止于在位置105-110范围内的位置。本发明的α-淀粉酶可包含A2和C-结构域，其起始于位置203-223范围内的位置并终止于在位置482-484范围内的位置，例如起始于位置208-213范围内的位置并终止于在位置482-484范围内的位置或者起始于位置213-218范围内的位置并终止于在位置482-484范围内的位置。TS-23α-淀粉酶进一步具有氨基酸485-583的糖结合结构域。所述糖结合结构域对于淀粉酶活性并不是必需的，并可全部或部分缺失。
对于KSM-AP1378α-淀粉酶(SEQ ID NO:11)，其中B-结构域确定为氨基酸残基106-212，待用钙不敏感性α-淀粉酶的相应序列替代的序列起始于位置96-116范围内的位置并终止于在位置199-219范围内的位置，例如，起始于位置100-112范围内的位置并终止于在位置203-215范围内的位置或者起始于位置103-109范围内的位置并终止于在位置206-212范围内的位置。KSM-AP1378α-淀粉酶的A和C-结构域分别确定为氨基酸残基1-105(A1)+213-398(A2)和399-485。本发明的α-淀粉酶可包含A1-结构域，其起始于位置1-5范围内的位置并终止于在位置95-115范围内的位置，例如起始于位置1-3范围内的位置并终止于在位置100-105范围内的位置或者起始于位置1-3范围内的位置并终止于在位置105-110范围内的位置。本发明的α-淀粉酶可包含A2和C-结构域，其起始于位置203-223范围内的位置并终止于在位置482-485范围内的位置，例如起始于位置208-213范围内的位置并终止于在位置482-485范围内的位置或者起始于位置213-218范围内的位置并终止于在位置482-485范围内的位置。
对于芽孢杆菌SP7-7α-淀粉酶(SEQ ID NO:12)，其中B-结构域确定为氨基酸残基106-212，待用钙不敏感性α-淀粉酶的相应序列替代的序列起始于位置96-116范围内的位置并终止于在位置199-219范围内的位置，例如，起始于位置100-112范围内的位置并终止于在位置203-215范围内的位置或者起始于位置103-109范围内的位置并终止于在位置206-212范围内的位置。芽孢杆菌SP7-7α-淀粉酶的A和C-结构域分别确定为氨基酸残基1-105(A1)+213-398(A2)和399-485。本发明的α-淀粉酶可包含A1-结构域，其起始于位置1-5范围内的位置并终止于在位置95-115范围内的位置，例如起始于位置1-3范围内的位置并终止于在位置100-105范围内的位置或者起始于位置1-3范围内的位置并终止于在位置105-110范围内的位置。本发明的α-淀粉酶可包含A2和C-结构域，其起始于位置203-223范围内的位置并终止于在位置482-485范围内的位置，例如起始于位置208-213范围内的位置并终止于在位置482-485范围内的位置或者起始于位置213-218范围内的位置并终止于在位置482-485范围内的位置。
对于嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶(SEQ ID NO:29)，其中B-结构域确定为氨基酸残基105-210，待用钙不敏感性α-淀粉酶的相应序列替代的序列起始于位置95-115范围内的位置并终止于在位置197-213范围内的位置，例如，起始于位置99-111范围内的位置并终止于在位置201-213范围内的位置或者起始于位置102-108范围内的位置并终止于在位置204-210范围内的位置。嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的A和C-结构域分别确定为氨基酸残基1-104(A1)+211-396(A2)和397-483。本发明的α-淀粉酶可包含A1-结构域，其起始于位置1-5范围内的位置并终止于在位置94-114范围内的位置，例如起始于位置1-3范围内的位置并终止于在位置99-104范围内的位置或者起始于位置1-3范围内的位置并终止于在位置104-109范围内的位置。本发明的α-淀粉酶可包含A2和C-结构域，其起始于位置201-221范围内的位置并终止于在位置478-483范围内的位置，例如起始于位置206-211范围内的位置并终止于在位置480-483范围内的位置或者起始于位置211-216范围内的位置并终止于在位置480-483范围内的位置。嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶进一步具有氨基酸484-486的C端延伸。所述C端延伸对于淀粉酶活性并不是必需的，并可全部或部分缺失。
对于噬纤维菌属α-淀粉酶(SEQ ID NO:30)，其中B-结构域确定为氨基酸残基103-208，待用钙不敏感性α-淀粉酶的相应序列替代的序列起始于位置93-113范围内的位置并终止于在位置195-215范围内的位置，例如，起始于位置97-109范围内的位置并终止于在位置199-211范围内的位置或者起始于位置100-106范围内的位置并终止于在位置202-208范围内的位置。噬纤维菌属α-淀粉酶的A和C-结构域分别确定为氨基酸残基1-102(A1)+209-397(A2)和398-484。本发明的α-淀粉酶可包含A1-结构域，其起始于位置1-5范围内的位置并终止于在位置92-112范围内的位置，例如起始于位置1-3范围内的位置并终止于在位置97-102范围内的位置或者起始于位置1-3范围内的位置并终止于在位置102-107范围内的位置。本发明的α-淀粉酶可包含A2和C-结构域，其起始于位置199-219范围内的位置并终止于在位置479-484范围内的位置，例如起始于位置204-209范围内的位置并终止于在位置481-484范围内的位置或者起始于位置209-214范围内的位置并终止于在位置481-484范围内的位置。
对于环状芽孢杆菌α-淀粉酶(SEQ ID NO:13)，B-结构域确定为氨基酸残基103-208。本发明的α-淀粉酶可包含B-结构域，其起始于位置93-113范围内的位置并终止于在位置195-215范围内的位置，例如，起始于位置97-109范围内的位置并终止于在位置199-211范围内的位置或者起始于位置100-106范围内的位置并终止于在位置202-208范围内的位置。环状芽孢杆菌α-淀粉酶的A和C-结构域分别确定为氨基酸残基1-102(A1)+209-395(A2)和397-482。可由钙敏感性α-淀粉酶的相应序列替代的A1-结构域起始于位置1-5范围内的位置并终止于在位置92-112范围内的位置，例如起始于位置1-3范围内的位置并终止于在位置97-102范围内的位置或者起始于位置1-3范围内的位置并终止于在位置102-107范围内的位置。可由钙敏感性α-淀粉酶的相应序列替代的A2-结构域起始于位置199-219范围内的位置并终止于在位置385-405范围内的位置，例如起始于位置204-209范围内的位置并终止于在位置390-395范围内的位置或者起始于位置209-214范围内的位置并终止于在位置395-400范围内的位置。A1和A2结构域优选由钙敏感性α-淀粉酶的相应序列同时替代。可由钙敏感性α-淀粉酶的相应序列替代的C-结构域起始于位置386-406范围内的位置并终止于在位置477-482范围内的位置，例如起始于位置391-396范围内的位置并终止于在位置479-482范围内的位置或者起始于位置396-401范围内的位置并终止于在位置479-482范围内的位置。环状芽孢杆菌α-淀粉酶进一步具有氨基酸483-492的C端延伸。所述延伸对于淀粉酶活性并不是必需的，并可全部或部分缺失。
对于KSM-K36α-淀粉酶(SEQ ID NO:14)，B-结构域确定为氨基酸残基104-207。本发明的α-淀粉酶可包含B-结构域，其起始于位置93-113范围内的位置并终止于在位置195-215范围内的位置，例如，起始于位置97-109范围内的位置并终止于在位置199-211范围内的位置或者起始于位置100-106范围内的位置并终止于在位置202-208范围内的位置。环状芽孢杆菌α-淀粉酶的A和C-结构域分别确定为氨基酸残基1-103(A1)+208-393(A2)和394-480。可由钙敏感性α-淀粉酶的相应序列替代的A1-结构域起始于位置1-5范围内的位置并终止于在位置93-113范围内的位置，例如起始于位置1-3范围内的位置并终止于在位置98-103范围内的位置或者起始于位置1-3范围内的位置并终止于在位置103-108范围内的位置。可由钙敏感性α-淀粉酶的相应序列替代的A2-结构域起始于位置198-218范围内的位置并终止于在位置383-403范围内的位置，例如起始于位置203-208范围内的位置并终止于在位置388-393范围内的位置或者起始于位置208-213范围内的位置并终止于在位置395-400范围内的位置。A1和A2结构域优选由钙敏感性α-淀粉酶的相应序列同时替代。可由钙敏感性α-淀粉酶的相应序列替代的C-结构域起始于位置384-404范围内的位置并终止于在位置475-480范围内的位置，例如起始于位置389-394范围内的位置并终止于在位置477-480范围内的位置或者起始于位置394-399范围内的位置并终止于在位置477-480范围内的位置。
对于KSM-38α-淀粉酶(SEQ ID NO:15)，B-结构域确定为氨基酸残基104-207。本发明的α-淀粉酶可包含B-结构域，其起始于位置93-113范围内的位置并终止于在位置195-215范围内的位置，例如，起始于位置97-109范围内的位置并终止于在位置199-211范围内的位置或者起始于位置100-106范围内的位置并终止于在位置202-208范围内的位置。环状芽孢杆菌α-淀粉酶的A和C-结构域分别确定为氨基酸残基1-103(A1)+208-393(A2)和394-480。可由钙敏感性α-淀粉酶的相应序列替代的A1-结构域起始于位置1-5范围内的位置并终止于在位置93-113范围内的位置，例如起始于位置1-3范围内的位置并终止于在位置98-103范围内的位置或者起始于位置1-3范围内的位置并终止于在位置103-108范围内的位置。可由钙敏感性α-淀粉酶的相应序列替代的A2-结构域起始于位置198-218范围内的位置并终止于在位置383-403范围内的位置，例如起始于位置203-208范围内的位置并终止于在位置388-393范围内的位置或者起始于位置208-213范围内的位置并终止于在位置393-398范围内的位置。A1和A2结构域优选由钙敏感性α-淀粉酶的相应序列同时替代。可由钙敏感性α-淀粉酶的相应序列替代的C-结构域起始于位置384-404范围内的位置并终止于在位置475-480范围内的位置，例如起始于位置389-394范围内的位置并终止于在位置477-480范围内的位置或者起始于位置394-399范围内的位置并终止于在位置477-480范围内的位置。
对于沃氏火球菌α-淀粉酶(SEQ ID NO:16)，B-结构域确定为氨基酸残基110-171。本发明的α-淀粉酶可包含B-结构域，其起始于位置100-120范围内的位置并终止于在位置161-181范围内的位置，例如，起始于位置105-115范围内的位置并终止于在位置166-171范围内的位置或者起始于位置107-113范围内的位置并终止于在位置171-176范围内的位置。环状芽孢杆菌α-淀粉酶的A和C-结构域分别确定为氨基酸残基1-109(A1)+172-338(A2)和339-435。可由钙敏感性α-淀粉酶的相应序列替代的A1-结构域起始于位置1-5范围内的位置并终止于在位置99-119范围内的位置，例如起始于位置1-3范围内的位置并终止于在位置104-109范围内的位置或者起始于位置1-3范围内的位置并终止于在位置109-114范围内的位置。可由钙敏感性α-淀粉酶的相应序列替代的A2-结构域起始于位置161-181范围内的位置并终止于在位置328-348范围内的位置，例如起始于位置167-172范围内的位置并终止于在位置333-338范围内的位置或者起始于位置172-177范围内的位置并终止于在位置338-343范围内的位置。A1和A2结构域优选由钙敏感性α-淀粉酶的相应序列同时替代。可由钙敏感性α-淀粉酶的相应序列替代的C-结构域起始于位置329-349范围内的位置并终止于在位置430-435范围内的位置，例如起始于位置324-329范围内的位置并终止于在位置432-435范围内的位置或者起始于位置329-344范围内的位置并终止于在位置432-435范围内的位置。
对于火球菌属杂合α-淀粉酶(SEQ ID NO:31)，B-结构域确定为氨基酸残基110-171。本发明的α-淀粉酶可包含B-结构域，其起始于位置100-120范围内的位置并终止于在位置161-181范围内的位置，例如，起始于位置105-115范围内的位置并终止于在位置166-171范围内的位置或者起始于位置107-113范围内的位置并终止于在位置171-176范围内的位置。环状芽孢杆菌α-淀粉酶的A和C-结构域分别确定为氨基酸残基1-109(A1)+172-338(A2)和339-435。可由钙敏感性α-淀粉酶的相应序列替代的A1-结构域起始于位置1-5范围内的位置并终止于在位置99-119范围内的位置，例如起始于位置1-3范围内的位置并终止于在位置104-109范围内的位置或者起始于位置1-3范围内的位置并终止于在位置109-114范围内的位置。可由钙敏感性α-淀粉酶的相应序列替代的A2-结构域起始于位置161-181范围内的位置并终止于在位置328-348范围内的位置，例如起始于位置167-172范围内的位置并终止于在位置333-338范围内的位置或者起始于位置172-177范围内的位置并终止于在位置338-343范围内的位置。A1和A2结构域优选由钙敏感性α-淀粉酶的相应序列同时替代。可由钙敏感性α-淀粉酶的相应序列替代的C-结构域起始于位置329-349范围内的位置并终止于在位置430-435范围内的位置，例如起始于位置334-339范围内的位置并终止于在位置432-435范围内的位置或者起始于位置339-344范围内的位置并终止于在位置432-435范围内的位置。
在一个实施方案中，所述α-淀粉酶变体具有大于0.1，优选大于0.25，甚至更优选大于0.5并且最优选大于1的通过Phadebase活性测量的活性对通过G7-pNG测定测量的活性的比值。
Phadebas测定是使用交联的不可溶蓝色淀粉聚合物(P
Figure BDA00002094921200251
AmylaseTest，由Magle Life Sciences，Lund，Sweden供应)确定α-淀粉酶活性的测定。
G7-pNG测定是使用可溶性生色化合物对硝基苯基-α-D-麦芽六糖苷(p-nitrophenyl-alpha-D-maltoheptaoside)确定α-淀粉酶活性的测定。含有PNP-G7底物和α-葡糖苷酶的试剂盒由Boehringer-Mannheim(目录号1054635)制造。
为了使用Phadebas和G7-pNG测定确定淀粉酶活性，必需在测定中包括具有已知活性的参照淀粉酶，并相对于该已知参照确定活性。就本发明而言，所述参照α-淀粉酶当通过PHadebas和G7-pNG测定测量时视作具有相同活性，且为由NovozymesA/S以商品名
Figure BDA00002094921200252
出售的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶，其具有SEQ ID NO:3的序列。因此，所述参照α-淀粉酶具有的通过Phadebas测定测量的活性相对于通过G7-pNP测定测量的活性的比值为1。
对不溶性底物相对于对可溶性底物的比值通过对两种特别选定的底物测量活性并计算比值来确定。优选地，所述比值与对于钙不敏感性α-淀粉酶相比为至少1.5倍更高，例如至少2倍更高，至少2.5倍更高和至少3倍更高。
使用下文公开的确定Phadebas测定测得的活性对G7pNG测定测得的活性的比值的方法，发现具有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的环状芽孢杆菌α-淀粉酶具有大约0.014的比值。
本发明人发现可以将显著程度的钙敏感性归于钙敏感性α-淀粉酶的B-结构域，还发现通过将所述钙敏感性α-淀粉酶的整个B-结构域或部分B-结构域用源自钙不敏感性α-淀粉酶的B-结构域或部分B-结构域替换，可以保持钙敏感性α-淀粉酶的全部或至少某些有益的好性质。优选地，将钙敏感性α-淀粉酶的整个B-结构域用钙不敏感性α-淀粉酶的整个B-结构域替换。
本发明的α-淀粉酶与它们的亲本钙敏感性α-淀粉酶相比具有对钙损耗较不敏感的益处，但同时它们保留了亲本钙敏感性α-淀粉酶的性能特性。钙敏感性在钙损耗环境中和/或在酸性条件下在特定α-淀粉酶的活性和/或稳定性方面展现出来。钙损耗环境在许多已知的α-淀粉酶应用中存在，如在结合金属离子特别是钙离子的强螯合剂的存在下，例如，在去污剂中，其中由于对洗衣过程的有益作用而通常包括强螯合剂，或者在包括天然螯合剂如肌醇六磷酸或柠檬酸存在的植物材料的条件下。这些强螯合剂会与钙敏感性α-淀粉酶竞争钙离子并且会在某种程度上能够使钙敏感性α-淀粉酶丧失结合至其结构上的钙离子，导致钙敏感性的稳定性或活性降低。
酸性条件也可以影响钙敏感性α-淀粉酶的稳定性或活性。据信低pH可以导致钙敏感性α-淀粉酶中与钙离子配位的氨基酸残基的质子化，导致它们无法再结合钙，并且导致稳定性和/或活性的损失。α-淀粉酶暴露于酸性条件的应用的实例是在消化病症的治疗中使用α-淀粉酶，如WO 2006/136161中公开的，以及在饲料中使用。
如此，所述α-淀粉酶具有在强螯合剂存在下的改善的稳定性和/或活性和/或在低pH下改善的稳定性和/或活性。
α-淀粉酶可以进一步包含本领域已知的额外的取代、插入或缺失以改善α-淀粉酶的性质。
例如，依照WO 94/02597和WO 94/18314的教导(将它们通过提述并入本文)，可氧化的氨基酸残基可以用不可氧化的氨基酸残基取代从而改善氧化条件下，例如在漂白剂存在下的酶稳定性。
此外，可以缺失区域179-182中的两个氨基酸(使用SEQ ID NO:27编号)以改善稳定性/活性，如WO 96/23873中所述，将其通过提述并入本文。可以缺失在其他α-淀粉酶中相应位置处的两个氨基酸。
其他可以引入的有益取代公开于WO 99/23211，WO 01/66712和WO 2006/002643，将它们通过提述并入本文。
本发明的α-淀粉酶可在来源于所述钙不敏感性α-淀粉酶的B-结构域中进一步包含其他取代、插入或缺失。在所述钙不敏感性α-淀粉酶的B-结构域中合适的取代、插入或缺失的实例为对应于环状芽孢杆菌α-淀粉酶中的下述改变的改变：E179*，N180*，E185W，N186E和D189T (SEQ ID NO:13编号)，其对应于SEQ ID NO:27编号中的E181*，N182*，E187W，N188E和D191T。
在另一个实施方案中，本发明的α-淀粉酶包含取代Q150T。
在另一个实施方案中，本发明的α-淀粉酶包含取代T164V。
在另一个实施方案中，本发明的α-淀粉酶包含取代K184A。
在一个实施方案中，亲本钙敏感性α-淀粉酶是是具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的α-淀粉酶，其在去污剂中具有良好性能。钙敏感性α-淀粉酶的B-结构域可以例如用来自SEQ ID NO:13的钙不敏感性α-淀粉酶的B-结构域替换。该杂合物可进一步包含一种或多种下述改变：E183*,N184*,E189W，N190E,和D193T(SEQ ID NO:7编号)，其对应于SEQ ID NO:27编号中的E181*,N182*,E187W，N188E,和D191T。这些杂合物在去污剂中显示出良好的性能，并且在强螯合剂存在下具有改善的稳定性。
在另一个实施方案中，钙敏感性α-淀粉酶是SEQ ID NO:4的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶，其对于淀粉液化具有卓越的性质。这种α-淀粉酶的B-结构域可以例如用SEQ ID NO:13的环状芽孢杆菌的B-结构域替换，例如，SEQ IDNO:4中位置103-208的氨基酸残基可以用SEQ ID NO:13中位置103-208的氨基酸残基替换。该杂合物可以任选地包含一种或多种下述修饰：E181*,G182*,E187W，N188E,D191T,S299K,G301R,A302D,D405N,D428N,和P430D(SEQ ID NO:27编号)。
本发明的α-淀粉酶的其他实例包括：
一种杂合物，其中将WO 01/66712中公开的具有改变D183*+G184*+R118K+N195F+R320K+R458K(SEQ ID NO:5编号)的SEQ IDNO:5的变体的B-结构域用SEQ ID NO:13,SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:15的B-结构域替换。例如，SEQ ID NO:14的氨基酸107-204可以替换SEQ IDNO:5的所述变体的氨基酸109-208。在另一个实例中，SEQ ID NO:15的氨基酸104-209可以替换SEQ ID NO:5的所述变体的氨基酸106-213。
一种杂合物，其中WO 01/66712中公开的具有改变D183*+G184*+R118K+N195F+R320K+R458K(SEQ ID NO:5编号)的SEQ IDNO:5的变体的B-结构域用SEQ ID NO:14的B-结构域替换。例如，SEQ IDNO:14的氨基酸158-204可以替换SEQ ID NO:5的所述变体的氨基酸160-208。
一种杂合物，其中具有WO 06/066594中SEQ ID NO:2的氨基酸序列和取代G46A+T47I+G105A(SEQ ID NO:3编号)的杂合突变体α-淀粉酶LE399的B-结构域，用SEQ ID NO:13的B-结构域替换。例如，SEQ ID NO:13的氨基酸107-205可以替换LE399的氨基酸106-202。
一种杂合物，其中WO 06/002643中公开的具有突变M9L+K118R+G149A+G182T+D183*+G184*+G186A+N195F+M202L+T257I+Y295F+N299Y+R320K+M323T+A339S+E345R+R458K(SEQ ID NO:5编号)的SEQ ID NO:5的变体的B-结构域用SEQ ID NO:13的B-结构域替换。
一种杂合物，其中SEQ ID NO:8的SP707α-淀粉酶的B-结构域用SEQ IDNO:13的B-结构域替换。
多核苷酸
本发明还涉及编码本发明的多肽的分离的多核苷酸。
核酸构建体
本发明还涉及包含本发明的多核苷酸的核酸构建体，所述多核苷酸与一个或多个(几个)调控序列可操作地连接，所述调控序列在合适的宿主细胞中在与该调控序列相容的条件下指导编码序列的表达。
可以用许多方式操作多核苷酸以提供多肽的表达。依赖于表达载体，在将多核苷酸插入载体之前对其进行操作可能是理想的或必需的。使用重组DNA方法修饰多核苷酸的技术是本领结构域熟知的。
调控序列可为启动子序列，其由用于表达编码本发明多肽的多核苷酸的宿主细胞所识别的多核苷酸。启动子序列含有介导多肽的表达的转录调控序列。启动子可以是在所选宿主细胞中显示转录活性的任何多核苷酸，包括突变的、截短的和杂合的启动子，并且可以从编码与宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因获得。
用于在细菌宿主细胞中指导本发明的核酸构建体转录的合适启动子的实例是从下述获得的启动子：解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、嗜热脂肪芽孢杆菌产麦芽淀粉酶基因(amyM)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因、大肠杆菌lac操纵子、天蓝链霉菌琼脂糖酶基因(dagA)和原核β-内酰胺酶基因(Villa-Kamaroff等,1978,Proceedings of the NationalAcademy of Sciences USA 75:3727-3731)，以及tac启动子(DeBoer等,1983,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:21-25)。另外的启动子在Gilbert等,1980,ScientificAmerican,242:74-94中的″Useful proteins from recombinant bacteria″；和在Sambrook等,1989,见上文中描述。
用于指导本发明的核酸构建体在丝状真菌宿主细胞中转录的合适启动子的实例是从下列酶的基因获得的启动子：构巢曲霉乙酰胺酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、米曲霉TAKA淀粉酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶(WO 96/00787)、镶片镰孢淀粉葡糖苷酶(WO 00/56900)、镶片镰孢Daria(WO 00/56900)、镶片镰孢Quinn(WO 00/56900)、曼赫根毛霉(Rhizomucor miehei)脂肪酶、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶IV、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉β-木糖苷酶，以及NA2-tpi启动子(一种修饰的启动子，其包括在曲霉属中编码中性α-淀粉酶的基因，其中未翻译的前导序列由在曲霉属(Aspergilli)中编码丙糖磷酸异构酶的基因的未翻译的前导序列所替代；非限制性实例包括修饰的启动子，其包括在黑曲霉中编码中性α-淀粉酶的基因，其中未翻译的前导序列由在构巢曲霉或米曲霉中编码丙糖磷酸异构酶的基因的未翻译的前导序列所替代)；和它们的突变的、截短的和杂合的启动子。
在酵母宿主中，有用的启动子从如下酶的基因获得：酿酒酵母烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH1,ADH2/GAP)、酿酒酵母丙糖磷酸异构酶(TPI)、酿酒酵母金属硫蛋白(CUP1)和酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。对于酵母宿主细胞其它有用的启动子由Romanos等,1992,Yeast 8:423-488描述。
调控序列也可以是合适的转录终止子序列，其由宿主细胞识别以终止转录。所述终止子序列与编码所述多肽的多核苷酸的3’末端可操作地连接。在本发明中可以使用在所选宿主细胞中有功能的任何终止子。
对于丝状真菌宿主细胞优选的终止子从如下酶的基因获得：构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶和尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶。
对于酵母宿主细胞优选的终止子从如下酶的基因获得：酿酒酵母烯醇化酶、酿酒酵母细胞色素C (CYC1)和酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶。对于酵母宿主细胞其它有用的终止子由Romanos等,1992,见上文描述。
调控序列还可以是合适的前导序列，在转录时，其为对于宿主细胞的翻译重要的mRNA非翻译区。前导序列可操作地连接于编码多肽的多核苷酸的5’-末端。可使用在所选宿主细胞中有功能的任何前导序列。
对于丝状真菌宿主细胞优选的前导序列从如下酶的基因获得：米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶。
对于酵母宿主细胞合适的前导序列从如下酶的基因获得：酿酒酵母烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α因子和酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)。
调控序列也可以是聚腺苷酸化序列，其是与多核苷酸的3’末端可操作地连接的序列，并且在转录时，宿主细胞将其识别为将聚腺苷残基添加至转录的mRNA的信号。可使用在所选宿主细胞中有功能的任何聚腺苷酸化序列。
对于丝状真菌宿主细胞优选的聚腺苷酸化序列从如下酶的基因获得：米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶和黑曲霉α-葡糖苷酶。
对于酵母宿主细胞有用的聚腺苷酸化序列由Guo和Sherman,1995,Mol.Cellular Biol.15:5983-5990描述。
调控序列还可以是信号肽编码区，其编码与多肽的N端相连的信号肽，并且指导多肽进入细胞分泌途径。多核苷酸的编码序列5’端可固有地包含信号肽编码序列，其与编码多肽的编码序列的区段一起天然地连接在翻译阅读框中。可供选择的是，编码序列5’端可含有对于所述编码序列异源的信号肽编码序列。异源信号肽编码序列在编码序列不天然地含有信号肽编码序列时可为必需的。或者，外源信号肽编码序列可以简单地取代天然信号肽编码序列以增强多肽的分泌。然而，可使用指导表达的多肽进入所述宿主细胞的分泌途径的任何信号肽编码序列。
对于细菌宿主细胞有效的信号肽编码序列是从如下酶的基因获得的信号肽编码序列：芽孢杆菌属NCIB 11837产麦芽糖淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶(subtilisin)、地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT，nprS，nprM)和枯草芽孢杆菌prsA。另外的信号肽由Simonen和Palva,1993,Microbiological Reviews 57:109-137描述。
对于丝状真菌宿主细胞有效的信号肽编码序列是从如下酶的基因获得的信号肽编码序列：黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶、特异腐质霉纤维素酶、特异腐质霉内切葡聚糖酶V、疏棉状腐质霉脂肪酶和曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶。
对于酵母宿主细胞有用的信号肽从酿酒酵母α因子和酿酒酵母转化酶的基因获得。其它有用的信号肽编码序列由Romanos等,1992,见上文描述。
调控序列还可以是前肽编码序列，其编码位于多肽N端的前肽。所得多肽称为酶原(proenzyme)或前多肽(propolypeptide)(或在某些情况下称为酶原(zymogen))。前多肽通常是无活性的，并且能够通过前肽的催化或自催化切割从前多肽转化为活性多肽。可以从枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、嗜热毁丝霉漆酶(WO 95/33836)、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶和酿酒酵母α因子的基因获得前肽编码序列。
当信号肽和前肽序列二者均出现在多肽的N端时，将前肽序列置于紧接着(next to)多肽的N端，并且将信号肽序列置于紧接着前肽序列的N端。
同样理想的是添加调节序列，其允许相对于宿主细胞的生长来调节多肽的表达。调节系统的实例是引起基因表达响应化学或物理刺激物，包括调节化合物的存在而开启或关闭的那些系统。原核系统中的调节系统包括lac、tac和trp操纵基因系统。在酵母中，可使用ADH2系统或GAL1系统。在丝状真菌中，可以使用黑曲霉葡糖淀粉酶启动子、米曲霉TAKAα-淀粉酶启动子和米曲霉葡糖淀粉酶启动子。调节序列的其它实例是那些允许基因扩增的序列。在真核系统中，这些调节序列包括在氨甲蝶呤(methotrexate)存在下扩增的二氢叶酸还原酶基因，和以重金属(with heavy metal)扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况下，编码多肽的多核苷酸将与调节序列可操作地连接。
表达载体
本发明还涉及重组表达载体，所述重组表达载体包含本发明的多核苷酸、启动子和转录和翻译终止信号。多种核苷酸和调控序列可以结合在一起以产生重组表达载体，所述表达载体可以包括一个或多个(几个)方便的限制位点以允许在这些位点插入或取代编码多肽的多核苷酸。可供选择的是，可以通过在适当的用于表达的载体中插入包含所述多核苷酸的核酸构建体或序列来表达所述多核苷酸。在制备表达载体的过程中，将编码序列置于载体中，从而将该编码序列与适当的表达调控序列可操作地连接。
重组表达载体可以是任何载体(例如，质粒或病毒)，其能够方便地进行重组DNA步骤，并且能够产生多核苷酸的表达。载体的选择将通常依赖于载体与将引入该载体的宿主细胞的相容性。载体可以是线状或闭合环状质粒。
载体可以是自主复制载体，即，作为染色体外实体(entity)存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如，质粒、染色体外元件、微型染色体(minichromosome)或人工染色体。载体可以含有任何用于确保自复制的手段(means)。或者，载体可以是一种当被引入宿主细胞中时，整合到基因组中并且与整合了该载体的染色体一起复制的载体。此外，可以使用单独的载体或质粒或两个或更多个载体或质粒，其共同含有待引入宿主细胞基因组的完整DNA(total DNA)，或可以使用转座子(transposon)。
载体优选地含有一个或多个(几个)选择性标记，其允许简单选择经转化、转染、转导等的细胞。选择性标记是基因，其产物提供杀生物剂或病毒抗性、对重金属的抗性、对营养缺陷型的原养性(prototrophy to auxotrophs)等。
细菌选择性标记的实例是来自地衣芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌的dal基因，或赋予抗生素抗性的标记，所述抗生素抗性例如氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素或四环素抗性。对于酵母宿主细胞合适的标记是ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。用于丝状真菌宿主细胞的选择性标记包括但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(草铵膦(phosphinothricin)乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)(nitrate reductase)、pyrG(乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶)(orotidine-5’-phosphatedecarboxylase)、sC(硫酸腺苷酰转移酶)和trpC(邻氨基苯甲酸合酶(anthranilatesynthase))以及它们的等同物。优选用在曲霉属细胞中的是构巢曲霉或米曲霉的amdS和pyrG基因和吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)的bar基因。
载体优选含有元件，其允许载体整合入宿主细胞基因组或载体在细胞中独立于基因组的自主复制。
为了整合入宿主细胞基因组，载体可依赖编码多肽的多核苷酸的序列或用于通过同源或非同源重组整合入基因组的任何其它载体元件。或者，载体可以含有额外的多核苷酸，用于指导通过同源重组整合入宿主细胞基因组染色体中的精确位置。为了增加在精确位置整合的可能性，整合元件应含有足够数量的核酸，如100至10,000碱基对，400至10,000碱基对，和800至10,000碱基对，其与相应的目标序列具有高度序列同一性以增强同源重组的概率。整合元件可以是任何序列，其与宿主细胞基因组中的目标序列同源。此外，整合元件可以是非编码或编码的多核苷酸。另一方面，可以将载体通过非同源重组整合到宿主细胞的基因组中。
为了自主复制，载体可以进一步包含复制起点，其使载体能够在所述的宿主细胞中自主地复制。复制起点可以是介导自主复制的任何质粒复制子(replicator)，其在细胞中发挥功能。术语“复制起点”或“质粒复制子”意指能够使质粒或载体体内复制的多核苷酸。
细菌复制起点的实例是允许在大肠杆菌中复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177和pACYC184的复制起点，和允许在芽孢杆菌属中复制的质粒pUB110、pE194、pTA1060和pAMβ1的复制起点。
用于酵母宿主细胞中的复制起点的实例是2微米复制起点，ARS1,ARS4,ARS 1和CEN3的组合，和ARS4和CEN6的组合。
在丝状真菌细胞中有用的复制起点的实例是AMA1和ANS1(Gems等,1991,Gene 98:61-67；Cullen等,1987,Nucleic Acids Res.15:9163-9175；WO00/24883)。分离AMA1基因和构建包含该基因的质粒或载体能够根据公开于WO 00/24883中的方法完成。
可以将多于一个拷贝的本发明的多核苷酸插入宿主细胞以增加多肽的产生。多核苷酸拷贝数的增加可通过如下方法获得：将至少一个额外拷贝的序列整合入宿主细胞基因组，或将可扩增的选择性标记基因包括于多核苷酸，其中可通过在合适的选择剂(selectable agent)存在下培养细胞来选择含有选择性标记基因的扩增拷贝，且由此含有多核苷酸的额外拷贝的细胞。
用于连接上述元件以构建本发明的重组表达载体的方法是本领结构域技术人员熟知的(参见，例如，Sambrook等,1989,见上文)。
宿主细胞
本发明还涉及重组宿主细胞，其包含可操作地连接的本发明的多肽和一种或多种(几种)调控序列，所述调控序列指导本发明的多肽的产生。将包含多核苷酸的构建体或载体导入宿主细胞，使所述构建体或载体如前所述作为染色体整合体或者作为自复制的染色体外载体维持。术语“宿主细胞”包含由于复制过程中发生的突变而与亲本细胞不完全相同的亲本细胞的任何后代。宿主细胞的选择将在很大程度上依赖于编码多肽的基因及其来源。
宿主细胞可以是在本发明的多肽的重组产生中有用的任何细胞，例如，原核或真核细胞。
原核宿主细胞可以是任何革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。革兰氏阳性细菌包括但不限于，芽孢杆菌属(Bacillus)、梭菌属(Clostridium)、肠球菌属(Enterococcus)、地芽孢杆菌属(Geobacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、海洋芽孢杆菌属(Oceanobacillus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、链球菌属(Streptococcus)和链霉菌属(Streptomyces)。革兰氏阴性细菌包括但不限于，弯曲杆菌属(Campylobacter)、大肠杆菌(E.coli)、黄杆菌属(Flavobacterium)、梭杆菌属(Fusobacterium)、螺杆菌属(Helicobacter)、泥杆菌属(Ilyobacter)、奈瑟氏菌属(Neisseria)、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙门氏菌属(Salmonella)和脲原体属(Ureaplasma)。
细菌宿主细胞可以是任何芽孢杆菌属细胞，包括但不限于嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillusclausii)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)、灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)细胞。
细菌宿主细胞还可以是任何链球菌属细胞，包括但不限于，似马链球菌(Streptococcus equisimilis)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、乳房链球菌(Streptococcus uberis)和马链球菌兽瘟亚种(Streptococcus equi subsp.Zooepidemicus)细胞。
细菌宿主细胞还可以是任何链霉菌属细胞，包括但不限于，不产色链霉菌(Streptomyces achromogenes)、除虫链霉菌(Streptomyces avermitilis)、天蓝链霉菌(Streptomyces coelicolor)、灰色链霉菌(Streptomyces griseus)和浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)。
可通过如下方法实现将DNA引入到芽孢杆菌属细胞：例如原生质体转化(参见，例如，Chang和Cohen,1979,Mol.Gen.Genet.168:111-115)，使用感受态细胞(参见，例如，Young和Spizizen,1961,J.Bacteriol.81:823-829或Dubnau和Davidoff-Abelson,1971,J.Mol.Biol.56:209-221)，电穿孔(参见，例如，Shigekawa和Dower，1988,Biotechniques 6:742-751)或接合(参见，例如，Koehler和Thorne,1987，J.Bacteriol.169:5771-5278)。可通过如下方法实现将DNA引入到大肠杆菌细胞：例如原生质体转化(参见，例如，Hanahan,1983,J.Mol.Biol.166:557-580)或电穿孔(参见，例如，Dower等,1988,Nucleic Acids Res.16:6127-6145)。可通过如下方法实现将DNA引入到链霉菌属细胞：例如原生质体转化和电穿孔(参见，例如，Gong等,2004,Folia Microbiol.(Praha)49:399-405)，接合(参见，例如，Mazodier等,1989,J.Bacteriol.171:3583-3585)，或转导(参见，例如，Burke等,2001,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98:6289-6294)。可通过如下方法实现将DNA引入到假单胞菌属细胞：例如电穿孔(参见，例如，Choi等,2006,J.Microbiol.Methods 64:391-397)或接合(参见，例如，Pinedo和Smets,2005,Appl.Environ.Microbiol.71:51-57)。可通过如下方法实现将DNA引入到链球菌属细胞：例如天然感受态(natural competence)(参见，例如，Perry和Kuramitsu,1981,Infect.Immun.32:1295-1297)，原生质体转化(参见，例如，Catt和Jollick,1991,Microbios.68:189-207)，电穿孔(参见，例如，Buckley等,1999,Appl.Environ.Microbiol.65:3800-3804)或接合(参见，例如，Clewell,1981,Microbiol.Rev.45:409-436)。然而，可以使用本领结构域已知的将DNA引入宿主细胞的任何方法。
宿主细胞还可以是真核生物，如哺乳动物、昆虫、植物或真菌细胞。
宿主细胞可以是真菌细胞。“真菌”用在本文包括以下门：子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)和接合菌门(Zygomycota)(如由Hawksworth等,于Ainsworth and Bisby′s Dictionay of TheFungi,第8版,1995,CAB International,University Press,Cambridge,UK中所定义)以及卵菌门(Oomycota)(如Hawksworth等,1995,见上文,第171页中所引用)和所有有丝分裂孢子真菌(mitosporic fungi)(Hawksworth等,1995,见上文)。
真菌宿主细胞可以是酵母细胞。“酵母”用在本文包括产子囊酵母(ascosporogenous yeast)(内孢霉目(Endomycetales))、产担子酵母(basidiosporogenous yeast)和属于半知菌类(Fungi Imperfecti)(芽孢纲(Blastomycetes))的酵母。由于酵母的分类在未来可能改变，就本发明而言，将酵母定义为如Biology and Activities of Yeast(Skinner，F.A.,Passmore,S.M.,和Davenport,R.R.编,Soc.App.Bacteriol.Symposium Series No.9,1980)中所述。
酵母宿主细胞可以是假丝酵母属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)或西洋蓍霉属(Yarrowia)细胞，例如乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、卡尔酵母(Saccharomyces carlsbergensis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)、道格拉氏酵母(Saccharomyces douglasii)、克鲁弗酵母(Saccharomyces kluyveri)、诺地酵母(Saccharomyces norbensis)、卵形酵母(Saccharomyces oviformis)或解脂西洋蓍霉(Yarrowia lipolytica)细胞。
真菌宿主细胞可以是丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌门(Eumycota)和卵菌门的亚门(如由Hawksworth等,1995,见上文，所定义)的所有丝状形式。丝状真菌通常的特征在于由壳多糖(chitin)、纤维素、葡聚糖、壳聚糖(chitosan)、甘露聚糖和其它复杂多糖组成的菌丝体壁。通过菌丝延伸进行营养生长，而碳分解代谢是专性需氧的。相反，酵母例如酿酒酵母的营养生长通过单细胞菌体的出芽生殖(budding)进行，而碳分解代谢可以是发酵的。
丝状真菌宿主细胞可以是枝顶孢霉属(Acremonium)、曲霉属(Aspergillus)、短梗霉属(Aureobasidium)、烟管霉属(Bjerkandera)、拟蜡菌属(Ceriporiopsis)、金孢子菌属(Chrysosporium)、鬼伞属(Coprinus)、革盖菌属(Coriolus)、隐球菌属(Cyptococcus)、Filibasidium、镰孢属(Fusarium)、腐质霉属(Humicola)、梨孢菌属(Magnaporthe)、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、新考玛脂霉属(Neocallimastix)、脉孢菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)、平革菌属(Phanerochaete)、射脉菌属(Phlebia)、瘤胃壶菌属(Piromyces)、侧耳属(Pleurotus)、裂褶菌属(Schizophyllum)、踝节菌属(Talaromyces)、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)、栓菌属(Trametes)或木霉属(Trichoderma)细胞。
例如，丝状真菌宿主细胞可以是泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、日本曲霉(Aspergillusjaponicus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、黑刺烟管菌(Bjerkandera adusta)、干拟蜡菌(Ceriporiopsisaneirina)、Ceriporiopsis caregiea、Ceriporiopsis gilvescens、Ceriporiopsispannocinta、Ceriporiopsis rivulosa、Ceriporiopsis subrufa、虫拟蜡菌(Ceriporiopsissubvermispora)、Chrysosporium inops、嗜角质金孢子菌(Chrysosporiumkeratinophilum)、Chrysosporium lucknowense、Chrysosporium merdarium、毡金孢子菌(Chrysosporium pannicola)、Chrysosporium queenslandicum、热带金孢子菌(Chrysosporium tropicum)、Chrysosporium zonatum、灰盖鬼伞(Coprinuscinereus)、毛革盖菌(Coriolus hirsutus)、杆孢状镰孢(Fusarium bactridioides)、禾谷镰孢(Fusarium cerealis)、库威镰孢(Fusarium crookwellense)、大刀镰孢(Fusarium culmorum)、禾本科镰孢(Fusarium graminearum)、禾赤镰孢(Fusariumgraminum)、异孢镰孢(Fusarium heterosporum)、合欢木镰孢(Fusarium negundi)、尖镰孢(Fusarium oxysporum)、多枝镰孢(Fusarium reticulatum)、粉红镰孢(Fusarium roseum)、接骨木镰孢(Fusarium sambucinum)、肤色镰孢(Fusariumsarcochroum)、拟分枝孢镰孢(Fusarium sporotrichioides)、硫色镰孢(Fusariumsulphureum)、圆镰孢(Fusarium torulosum)、拟丝孢镰孢(Fusariumtrichothecioides)、镶片镰孢(Fusarium venenatum)、特异腐质霉(Humicolainsolens)、疏棉状腐质霉(Humicola lanuginosa)、米黑毛霉(Mucor miehei)、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)、粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)、产紫青霉(Penicillium purpurogenum)、黄孢平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、辐射射脉菌(Phlebia radiata)、刺芹侧耳(Pleurotus eryngii)、土生梭孢霉(Thielaviaterrestris)、长绒毛栓菌(Trametes villosa)、变色栓菌(Trametes versicolor)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、康宁木霉(Trichoderma koningii)、长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)、里氏木霉(Trichoderma reesei)或绿色木霉(Trichoderma viride)细胞。
可以将真菌细胞通过涉及原生质体形成、原生质体转化和细胞壁再生的方法以本身公知的方式转化。用于转化曲霉属和木霉属宿主细胞的合适方法在EP 238023和Yelton等,1984,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:1470-1474中描述。用于转化镰孢属菌种的合适方法由Malardier等,1989,Gene 78:147-156和WO 96/00787描述。可以使用由如下文献描述的方法转化酵母：Becker和Guarente,于Abelson,J.N.和Simon,M.I.编,Guide to Yeast Genetics andMolecular Biology,Methods in Enzymology,Volume 194,pp 182-187,AcademicPress,Inc.,New York；Ito等,1983,J.Bacteriol.153:163；和Hinnen等,1978,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75:1920。
产生方法
本发明还涉及产生本发明的多肽的方法，包括：(a)在有利于产生所述多肽的条件下培养细胞，所述细胞以其野生型形式产生所述多肽；和(b)回收所述多肽。在一个优选的方面，所述细胞是属[属名]。在一个更优选的方面，所述细胞是[属名种名]。在一个最优选的方面，所述细胞是[属名种名保藏号]。
本发明还涉及产生本发明的多肽的方法，包括：(a)在有利于产生所述多肽的条件下培养本发明的重组宿主细胞；和(b)回收所述多肽。
使用本领结构域已知的方法在适合于产生所述多肽的营养培养基中培养细胞。例如，可以通过在合适培养基中和允许表达和/或分离所述多肽的条件下进行的摇瓶培养，和实验室或工业发酵罐中的小规模或大规模发酵(包括连续、分批、补料分批或固态发酵)来培养细胞。使用本领结构域已知的方法在合适的营养培养基中进行培养，所述营养培养基包含碳源和氮源和无机盐。合适的培养基能够从商业供应商获得或可以根据公开的组成制备(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)。如果多肽分泌到营养培养基中，该多肽能够从所述培养基中直接回收。如果多肽不分泌，则其能够从细胞裂解物(lysate)回收。
可以使用本领结构域已知的对于所述多肽是特异性的方法来检测多肽。这些检测方法可包括特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。例如，酶测定(enzyme assay)可用于确定多肽的活性。
多肽可以使用本领结构域已知的方法回收。例如，多肽可以通过常规方法从营养培养基中回收，所述常规方法包括但不限于离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀。
多肽可以通过多种本领结构域已知的方法纯化以获得基本上纯的多肽，所述方法包括但不限于层析(例如，离子交换、亲和、疏水、层析聚焦和大小排阻)、电泳方法(例如，制备型(preparative)等电聚焦)、差示溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE或提取(参见，例如，Protein Purification,J.-C.Janson和Lars Ryden编,VCH Publishers,New York,1989)。
在可选的方面，不回收所述多肽，而是将表达所述多肽的本发明的宿主细胞用作多肽的来源。
植物
本发明还涉及植物，例如，转基因植物、植物部分或植物细胞，其包含本发明的分离的多核苷酸，从而以可回收的量表达和产生所述多肽。多肽可从植物或植物部分回收。或者，同样可以将含有所述多肽的植物或植物部分用于改进食品或饲料的质量，例如，改进营养价值、适口性(palatability)和流变性质(rheological properties)，或用于破坏抗营养因子。
转基因植物可以是双子叶的(双子叶植物)或单子叶的(单子叶植物)。单子叶植物的实例是草(grasses)，如草地早熟禾(meadow grass)(蓝草(blue grass)，早熟禾属(Poa))；饲用牧草(forage grass)如羊茅属(Festuca)、黑麦草属(Lolium)；寒地型牧草(temperate grass)，如Agrostis(翦股颖属)；和谷类，例如，小麦、燕麦、黑麦、大麦、稻(rice)、高粱和玉蜀黍(maize)(玉米)。
双子叶植物的实例是烟草(tobacco)，豆类(legumes)，如羽扇豆(lupins)，马铃薯，糖甜菜(sugar beet)，豌豆，豆(bean)和大豆(soybean)和十字花科的(cruciferous)植物(十字花科(family Brassicaceae))，如花椰菜(cauliflower)，油菜籽(rape seed)和紧密相关的模型生物体拟南芥(Arabidopsis thaliana)。
植物部分的实例是茎(stem)、愈伤组织(callus)、叶(leaf)、根(root)、果实(fruit)、种子(seed)和块茎(tuber)，以及包含这些部分的独立组织，例如，表皮(epidermis)、叶肉(mesophyll)、薄壁组织(parenchyme)、维管组织(vasculartissue)、分生组织(meristem)。具体的植物细胞区室(compartments)，如叶绿体(chloroplast)、质外体(apoplast)、线粒体(mitochondria)、液泡(vacuole)、过氧化物酶体(peroxisome)和细胞质(cytoplasm)也被认为是植物部分。此外，任何植物细胞，无论什么组织来源，都被认为是植物部分。同样地，植物部分，如分离以促进本发明的应用的具体组织和细胞也被认为是植物部分，例如胚(embryo)、胚乳(endosperm)、糊粉(aleurone)和种皮(seed coat)。
同样包含于本发明范围内的还有这些植物、植物部分和植物细胞的后代。
表达多肽的转基因植物或植物细胞可以依照本领结构域已知方法构建。简而言之，通过如下方法构建所述植物或植物细胞：将编码多肽的一个或多个(几个)表达构建体并入植物宿主基因组或叶绿体基因组，并且将所得的修饰植物或植物细胞繁殖为转基因植物或植物细胞。
表达构建体便利地是包含编码多肽的多核苷酸的核酸构建体，所述多核苷酸与在选择的植物或植物部分中表达该多核苷酸所需的适当的调节序列可操作地连接。此外，表达构建体可以包含对于鉴定宿主细胞有用的选择性标记，在所述宿主细胞中整合了表达构建体和将该构建体引入到所述植物中所必需的DNA序列(后者依赖于使用的DNA引入方法)。
调节序列的选择，例如启动子和终止子序列和任选地信号或转运序列的选择，举例来说，基于期望何时、何处以及如何表达多肽而确定。例如，编码多肽的基因的表达可以是组成型的或诱导型的，或可以是发育、阶段或组织特异性的，并且基因产物可以靶向特定的组织或植物部分例如种子或叶。调节序列由例如Tague等,1988,Plant Physiology 86:506所述。
对于组成性表达，可以使用35S-CaMV、玉米泛素1和稻肌动蛋白1启动子(Franck等,1980,Cell21:285-294,Christensen等,1992,Plant Mo.Biol.18:675-689；Zhang等,1991,Plant Cell3:1155-1165)。器官特异性启动子可以是例如来自贮藏库组织(storage sink tissue)例如种子、马铃薯块茎和果实的启动子(Edwards和Coruzzi,1990,Ann.Rev.Genet.24:275-303)，或来自代谢库组织(metabolic sink tissue)例如分生组织的启动子(Ito等,1994,Plant Mol.Biol.24:863-878)，种子特异性启动子诸如来自稻的谷蛋白(glutelin)、醇溶蛋白(prolamin)、球蛋白(globulin)或白蛋白(albumin)启动子(Wu等,1998,Plant Cell Physiol.39:885-889)，来自豆球蛋白(legumin)B4和蚕豆(Vicia faba)的未知的种子蛋白基因的蚕豆启动子(Conrad等,1998,J.of Plant Physiol.152:708-711)、来自种子油体蛋白(oil body protein)的启动子(Chen等,1998,Plant Cell Physiol.39:935-941)，来自欧洲油菜(Brassica napus)的贮藏蛋白napA启动子，或本技术领结构域公知的任何其他种子特异性的启动子，例如，在WO 91/14772中所描述的。此外，启动子可为叶特异性的启动子，如来自稻或番茄的rbcs启动子(Kyozuka等,1993,Plant Physiology 102:991-1000)，小球藻病毒(chlorella virus)腺嘌呤甲基转移酶(adenine methyltransferase)基因启动子(Mitra和Higgins,1994,Plant Mol.Biol.26:85-93)，或来自稻的aldP基因启动子(Kagaya等,1995,Mol.Gen.genet.248:668-674)，或伤口诱导的启动子，如马铃薯pin2启动子(Xu等,1993,Plant Mol.Biol.22:573-588)。同样地，所述启动子可通过非生物的处理诱导，所述非生物的处理诸如温度、干旱或盐度变化，或通过外源施加的激活所述启动子的物质诱导，例如乙醇、雌激素(oestrogens)、植物激素(plant hormones)如乙烯、脱落酸(abscisic acid)和赤霉酸(gibberellic acid)，和重金属。
启动子增强子元件也可以用于实现多肽在植物中的较高表达。例如，启动子增强子元件可以是内含子，其置于启动子和编码多肽的多核苷酸之间。例如Xu等,1993,见上，公开了使用稻肌动蛋白1基因的第一内含子以增强表达。
选择性标记基因和表达构建体的任何其它部分可以选自本领结构域内可用的那些。
将核酸构建体根据本领结构域已知的常规技术并入植物基因组，所述常规技术包括土壤杆菌属(Agrobacterium)介导的转化、病毒介导的转化、显微注射(microinjection)、粒子轰击、生物射弹转化和电穿孔(Gasser等,1990,Science 244:1293；Potrykus,1990,Bio/Technology 8:535；Shimamoto等,1989,Nature 338:274)。
目前，根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的基因转移(genetransfer)，是产生转基因双子叶植物的优选方法(为了参考，见Hooykas和Schilperoort,1992,Plant Mol.Biol.19:15-38)，而且它也可以用于转化单子叶植物，虽然对于这些植物其他的转化方法是常用的。目前，产生转基因单子叶植物的优选的方法，是用粒子(用转化DNA涂覆的微观的金或钨粒子)轰击胚愈伤组织(embryonic calli)或发育中的胚(developing embryos)(Christou,1992,Plant J.2:275-281；Shimamoto,1994,Current Opin.Biotech.5:158-162；Vasil等,1992,Bio/Technology 10:667-674)。转化单子叶植物的可供选择的方法是基于原生质体转化，如由Omirulleh等,1993,Plant Mol.Biol.21:415-428所描述的。其他用于依照本公开使用的转化方法包括那些描述于美国专利6,395,966和7,151,204的那些(通过提述并入本文)。
转化之后，根据本领结构域熟知的方法选择包含表达构建体的转化体并且再生成为完整植物。通常设计转化方法用于通过如下方法在再生期间或在后续世代中选择性消除选择基因：例如，使用带有两个独立的T-DNA构建体的共转化或通过特异性重组酶位点特异性地切除选择基因。
除了用根据本发明制备的构建体直接转化具体植物基因型之外，还可通过将具有构建体的植物与缺乏该构建体的第二植物杂交来制备转基因植物。例如，可将编码多肽的构建体通过杂交而引入特定植物品种，而根本无需直接转化该给定品种的植物。因此，本发明不仅涵盖从依照本发明经转化的细胞直接再生的植物，还包括此类植物的后代(progeny)。如用于本文，后代可指依照本发明制备的亲本植物任何世代的后裔(offspring)。此种后代可包含依据本发明制备的DNA构建体，或依据本发明制备的DNA构建体的一部分。杂交导致转基因通过将起始种系与供体植物种系交叉授粉而引入植物种系。此类步骤的非限制性实例进一步阐述于美国专利7,151,204号。
植物可通过回交转化方法生成。例如，植物包括称作回交转化的基因型、种系、近交体(inbred)或杂交体(hybrid)的植物。
可使用遗传标记以协助本发明的一种或多种转基因从一个遗传背景基因渗入(introgression)至另一个。标记协助的选择提供了相对于常规育种的优势，在于其可用于避免由表型变异导致的错误。进一步，遗传标记可在特定杂交的个体后代中提供有关良种种质相对程度的数据。例如，当具有所需性状但除此之外(otherwise)具有非农艺学所需的遗传背景的植物与良种亲本杂交时，可使用遗传标记来选择不仅具有该目标性状，还具有相对较大比例所需种质的后代。以此方式，使一种或多种性状基因渗入特定遗传背景所需的世代数得到最小化。
本发明还涉及产生本发明多肽的方法，包括：(a)在有助于产生所述多肽的条件下培养包含编码所述多肽的多核苷酸的转基因植物或植物细胞；和(b)回收所述多肽。
组合物
本发明还涉及包含α-淀粉酶和至少一种其他酶的组合物。所述其他酶可选自下组：β-淀粉酶，纤维素酶(β-葡糖苷酶、纤维二糖水解酶和内切葡聚糖酶)，葡糖淀粉酶，半纤维素酶(例如木聚糖酶)，异淀粉酶，异构酶，脂肪酶，肌醇六磷酸酶，蛋白酶，支链淀粉酶，和/或可与α-淀粉酶一同用于商业性工艺中的其他酶。其他酶亦可为第二α-淀粉酶。此类酶在本领结构域中在淀粉加工、糖转化、醇和其他有用的终产物的发酵、商业性去污剂和清洗助剂、污迹去除、织物处理或脱浆等方面是已知的。
使用α-淀粉酶的方法——产业应用
本发明的α-淀粉酶具有宝贵的性质，使其能用于多种产业应用。具体而言，所述α-淀粉酶可用于去污剂，特别是洗衣去污剂组合物和餐具洗涤去污剂组合物，硬表面清洁组合物，和用于使纺织品、织物或衣物脱浆，产生纸浆和纸，啤酒制备，乙醇产生和淀粉转化工艺。
α-淀粉酶可用于淀粉工艺，特别是淀粉转化，特别是淀粉液化(参见，例如美国专利号3,912,590，EP 063909，EP 252730，WO 96/28567和WO99/19467，其通过提述并入本文)。亦涵盖了用于淀粉转化目的的组合物，其除了本发明的α-淀粉酶之外还可包含AMG、支链淀粉酶和其他α-淀粉酶。
此外，所述α-淀粉酶特别有用于从淀粉或全谷粒产生增甜剂和乙醇(参见，例如美国专利号5,231,017，其通过提述并入本文)，如燃料、饮用和工业乙醇。
所述α-淀粉酶亦可用于使纺织品、织物和衣物脱浆(参见，例如WO95/21247，美国专利号4,643,736和EP 119920，其通过提述并入本文)，啤酒制备或酿造，以及纸浆和纸产生或相关工艺。
淀粉加工
粒状淀粉(granular starch)由微观颗粒(microscopic granule)组成，其在室温不溶于水。当将淀粉水浆料(aqueous starch slurry)加热时，所述颗粒泡胀(swell)并最终爆裂(burst)，将淀粉分子分散到溶液中。在该“糊化”工艺中，粘度急剧增加。因为在一般的工业工艺中固体水平为30-40％，所以必须将淀粉稀化(thin)或“液化”，使其可适于加工。该粘度的降低在目前的商业实践中主要是通过酶降解来得到的。
常规淀粉转化工艺，如液化和糖化工艺描述于例如美国专利号3,912,590，EP 252730和EP 063909，其通过提述并入本文。
在一个实施方案中，将淀粉降解为较低分子量糖组分如糖或脂肪替代物的转化工艺包括脱支步骤。
在将淀粉转化为糖的情况下，淀粉被解聚。此种解聚工艺由例如预处理步骤和两个或三个连续工艺步骤即液化工艺、糖化工艺和取决于所需的终产物任选的异构工艺组成。
当所需的最终糖产物为例如高果糖糖浆时，可将右旋糖糖浆转化为果糖。在糖化工艺之后，将pH增加至6-8范围的值，优选pH 7.5，且钙通过离子交换去除。然后将右旋糖糖浆使用例如固定化的葡糖异构酶转化为高果糖糖浆。
发酵产物的产生
一般而言，从全谷粒产生醇(乙醇)可分为四个主要步骤：磨制、液化、糖化和发酵。
磨制谷粒是为了打开其结构，并允许进一步加工。使用的两种工艺是湿法磨制和干法磨制。在干法磨制中，磨制整个种子并将其用于工艺的其他部分。湿法磨制使得胚芽和谷物粗粉(meal)(淀粉颗粒和蛋白)良好分开，并除了极少情况外，应用于同时产生糖浆的场合。
在液化工艺中，将淀粉颗粒溶解，即将其水解为主要为DP高于4的麦芽糊精。水解可通过酸处理或藉由α-淀粉酶以酶法进行。酸水解仅在有限的情况下使用。原料可为经磨制的全谷粒或淀粉工艺中的副产物(side stream)。
在通常的酶法液化过程中，长链淀粉由α-淀粉酶降解为支链和直链的较短单元(麦芽糊精)。酶法液化一般作为三步热浆工艺进行。将浆料加热至60-95℃(例如77-86℃，80-85℃或83-85℃)并添加酶。液化工艺在85℃进行1-2小时。pH通常为5.5至6.2。为了确保在这些条件下的最适酶稳定性，添加1mM钙(以提供约40ppm游离钙离子)。在此种处理之后，液化的淀粉会具有10-15的“右旋糖当量”(DE)。
接着将浆料在95-140℃，例如105-120℃进行喷射蒸煮(jet-cook)，冷却至60-95℃，并添加更多酶以获得最终水解。液化工艺在pH 4.5-6.5进行，通常在5至6的pH进行。经磨制和液化的谷粒亦称作醪。
将液化的含淀粉材料在糖化酶如葡糖淀粉酶的存在下糖化。糖化工艺可持续12小时至120小时(例如12至90小时，12至60小时和12至48小时)。
然而，通常在30至65℃(通常约60℃)的温度进行预糖化步骤约30分钟至2小时(例如30至90分钟)，然后在发酵过程中进行完全糖化，这称作同时糖化和发酵(SSF)。pH通常为4.2-4.8，例如4.5。在同时糖化和发酵(SSF)工艺中，对于糖化没有保持阶段，而是将酵母和酶一同添加。
在通常的糖化工艺中，将在液化中产生的麦芽糊精通过添加葡糖淀粉酶和脱支酶如异淀粉酶(美国专利号4,335,208)或支链淀粉酶而转化为右旋糖。在添加葡糖淀粉酶和脱支酶之前，将温度降至60℃。糖化工艺进行24-72小时。
在添加糖化酶之前，将pH降至4.5以下，同时保持较高温度(高于95℃)以失活液化用的α-淀粉酶。该工艺减少了称作“潘糖前体”的短寡糖的形成，所述物质无法通过脱支酶正常(properly)水解。通常，约0.2-0.5％的糖化产物是支化三糖潘糖(Glc pα1-6Glc pα1-4Glc)，其无法由支链淀粉酶降解。若来自液化的活性淀粉酶在糖化过程中保持存在(即无变性)，潘糖的量可高至1-2％，这是非常不理想的，因为这显著降低了糖化产量。
可发酵的糖(例如糊精，单糖特别是葡萄糖)由酶法糖化产生。这些可发酵的糖可进一步纯化和/或转化为有用的糖产物。此外，糖可在微生物发酵工艺中用作发酵原料以产生终产物，如醇(例如乙醇和丁醇)，有机酸(例如琥珀酸和乳酸)，糖醇(例如甘油)，抗坏血酸中间物(例如葡糖酸，2-酮-D-葡糖酸，2,5-二酮-D-葡糖酸和2-酮-L-古洛糖酸)，氨基酸(例如赖氨酸)，蛋白(例如抗体及其片段)。
在一个实施方案中，将在液化工艺步骤中获得的可发酵的糖用于产生醇，特别是乙醇。在乙醇产生中，通常使用SSF工艺，其中糖化酶和发酵生物(例如酵母)一同添加，然后在30-40℃的温度进行工艺。
用于发酵的生物会取决于所需的终产物。一般而言，若乙醇是所需的终产物，会使用酵母作为发酵生物。在一些优选实施方案中，乙醇产生微生物是酵母，且特别是酵母属如酿酒酵母的菌株(美国专利号4,316,956)。多种酿酒酵母在商业上可获得，并且包括但不限于FALI(Fleischmann′s Yeast)，SUPERSTART(Alltech)，FERMIOL(DSM Specialties)，RED STAR(Lesaffre)和Angel alcohol yeast(Angel Yeast Company,China)。该方法中采用的酵母引子(starter yeast)是在合适量的时间内有效产生商业上显著量的乙醇(例如在少于72小时内从具有25-40％DS的底物产生至少10％乙醇)的量。酵母细胞通常以约104至约1012，且优选约107至约1010活酵母计数每mL发酵液的量供应。在将酵母添加至醪之后，通常对其进行发酵约24-96小时，例如35-60小时。温度为约26-34℃，通常在约32℃，且pH为pH 3-6，例如约pH 4-5。
除了发酵微生物(例如酵母)之外，发酵物可包括营养物和其他酶，包括肌醇六磷酸酶。在发酵中使用酵母在本领结构域中是公知的。
在进一步的实施方案中，适当发酵微生物(如本领结构域中已知的)的使用可得到发酵终产物，例如甘油，1,3-丙二醇，葡糖酸，2-酮-D-葡糖酸，2,5-二酮-D-葡糖酸，2-酮-L-古洛糖酸，琥珀酸，乳酸，氨基酸，及其衍生物。更具体而言，当乳酸是所需的终产物时，可使用乳杆菌属菌种(干酪乳杆菌(L.casei))；当甘油或1,3-丙二醇是所需的终产物时，可使用大肠杆菌；而当2-酮-D-葡糖酸，2,5-二酮-D-葡糖酸和2-酮-L-古洛糖酸是所需的终产物时，Pantoea citrea可用作发酵微生物。上述列举的微生物仅为实例，且本领结构域技术人员会知道其他可用于获得所需终产物的发酵微生物。
用于从未经糊化的含淀粉处理产生发酵产物的工艺
本发明涉及从未进行含淀粉材料的糊化(即未烹制)的含淀粉材料产生发酵产物的工艺。发酵产物如乙醇，可不经液化含有含淀粉材料和水的含水浆料而产生。在一个实施方案中，本发明的工艺包括在起始糊化温度以下，优选在α-淀粉酶和/或糖源生成酶的存在下糖化(例如磨制的)含淀粉材料，例如粒状淀粉，以产生糖，其可由合适的发酵生物发酵为发酵产物。在该实施方案中，所述所需的发酵产物，例如乙醇，从未经糊化的(即未烹制的)、优选磨制的谷物谷粒如玉米产生。相应地，在第一个方面，本发明涉及用于从含淀粉材料产生发酵产物的工艺，其包括使用糖源生成酶和发酵生物在低于含淀粉材料的起始糊化温度以下同时糖化和发酵含淀粉材料。在一个实施方案中，亦存在蛋白酶。所述蛋白酶可为任何真菌淀粉酶或金属蛋白酶。发酵产物，例如乙醇，可任选地在发酵之后例如通过蒸馏来回收。通常淀粉酶，如葡糖淀粉酶，和/或其他糖源生成酶，和/或α-淀粉酶，在发酵过程中存在。葡糖淀粉酶和其他糖源生成酶的实例包括水解生淀粉的淀粉酶。α-淀粉酶的实例包括酸性α-淀粉酶，如酸性真菌α-淀粉酶。发酵生物的实例包括酵母，例如酿酒酵母的菌株。术语“起始糊化温度”意指淀粉糊化开始的最低温度。一般而言，在水中加热的淀粉在约50℃至75℃之间开始糊化。；糊化的确切温度取决于具体的淀粉，且可方便地由本领结构域技术人员确定。因此，所述起始糊化温度可随植物物种，随植物物种的具体品种，以及生长条件而变化。在本发明的上下文中，给定含淀粉材料的起始糊化温度可使用Gorinstein和Lii,1992,
Figure BDA00002094921200461
44(12):461-466所述的方法确定为在5％的淀粉颗粒中双折射丧失的温度。在起始工艺之前，可制备含淀粉材料如粒状淀粉的浆料，其具有按含淀粉材料计10-55w/w-％干固体，优选25-45w/w-％干固体，更优选30-40w/w-％干固体(DS)。所述浆料可含有水和/或工艺水，如釜馏物(逆流)、洗涤水(scrubber water)、蒸发器冷凝液或馏出物、来自蒸馏的侧线汽提器水(side-stripper water)或其他发酵产物设备(plant)的工艺水。因为本发明的方法在起始糊化温度以下进行因而不发生显著的粘度增加，所以如果需要，可使用高水平的釜馏物。在一个实施方案中，含水浆料包含约1至约70vol％，优选15-60vol％，特别是约30至50vol％的水和/或工艺水，如釜馏物(逆流)、洗涤水(scrubber water)、蒸发器冷凝液或馏出物、来自蒸馏的侧线汽提器水(side-stripper water)或其他发酵产物设备(plant)的工艺水，或其组合等。可通过优选以干磨或湿磨将其粒度减小到0.05至3.0mm，优选0.1至0.5mm来制备含淀粉材料。在进行本发明的工艺后，含淀粉材料的至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或者优选至少99％的干固体转化为可溶的淀粉水解物。本发明的该方面中的工艺在低于起始糊化温度的温度进行，这意指该温度通常在30至75℃，优选45至60℃的范围。在一个优选实施方案中，该工艺在25至40℃，如28至35℃，30℃至34℃，优选约32℃的温度进行。在一个实施方案中，进行该工艺从而使得糖水平，如葡萄糖水平保持在低水平，如6w/w-％以下，如约3w/w-％以下，如约w/w-％以下，如约1w/w-％以下，如约0.5w/w-％以下，或0.25w/w-％以下，如约0.1w/w-％以下。所述低水平的糖可通过简单的使用经调整量的酶和发酵生物来实现。本领结构域技术人员可方便地确定使用的酶和发酵生物的剂量数量。酶和发酵生物的使用量也可经选择以保持麦芽糖在发酵液中的低浓度。举例而言，麦芽糖水平可保持为约0.5w/w-％以下，或约0.2w/w-以下。本发明的方法可在约3至7，优选pH 3.5至6，或更优选pH 4至5的pH进行。在一个实施方案中，发酵持续6至120小时，特别是24至96小时。
用于从经糊化的含淀粉材料产生发酵产物的工艺
在该方面本发明涉及用于从含淀粉材料产生发酵产物特别是乙醇的工艺，该工艺包括液化步骤和顺序或同时进行的糖化和发酵步骤。因此，本发明涉及用于从含淀粉材料产生发酵产物的工艺，其包括下述步骤：
(a)在α-淀粉酶的存在下液化含淀粉材料，或；
(b)使用糖源生成酶糖化步骤(a)中获得的液化材料；
(c)使用发酵生物进行发酵。
在一个方面，支链淀粉酶如家族GH57支链淀粉酶亦用于液化步骤。在一个实施方案中，在液化之前、之中和/或之后添加蛋白酶如酸性真菌蛋白酶或金属蛋白酶。在一个实施方案中，所述金属蛋白酶来源于嗜热子囊菌属(Thermoascus)的菌株，例如橙橘嗜热子囊菌(Thermoascus aurantiacus)的菌株，例如橙橘嗜热子囊菌CGMCC No.0670。所述α-淀粉酶可为任何下文“α-淀粉酶”部分提及的α-淀粉酶。在一个实施方案中，所述糖源生成酶是来源于曲霉属例如黑曲霉(Aspergillus niger)或泡盛曲霉(Aspergillus awamori)的菌株，踝节菌属(Talaromyces)例如埃默森踝节菌(Talaromyces emersonii)的菌株，或阿太菌属(Athelia)例如罗耳阿太菌(Athelia rolfsii)的菌株；栓菌属(Trametes)优选瓣环栓菌(Trametes cingulata)的菌株；大纹饰孢菌属(Pachykytospora)例如纸质大纹饰孢菌(Pachykytosporapapyracea)的菌株；或白桩菇属(Leucopaxillus)例如大白桩菇(Leucopaxillus giganteus)的菌株；或隔孢伏革菌属(Peniophora)例如菌种红边隔孢伏革菌(Peniophora rufomarginata)的菌株，或其组合的糖源生成酶。糖化步骤(b)和发酵步骤(c)可顺序或同时进行。当工艺作为顺序糖化和发酵工艺进行时，支链淀粉酶和/或金属蛋白酶可在糖化和/或发酵过程中添加，当步骤(b)和(c)同时进行(SSF工艺)时，它们可在发酵之前或之中添加。支链淀粉酶和/或金属蛋白酶亦可有利地在液化之前(液化前处理)，即在步骤(a)之前或之中添加，和/或在液化之后(液化后处理)，即在步骤(a)之后添加。支链淀粉酶最有利地在液化之前或之中，即在步骤(a)之前或之中添加。发酵产物，如特别是乙醇，可任选地在发酵之后例如通过蒸馏回收。发酵生物优选为酵母，优选酿酒酵母的菌株。
在一个具体实施方案中，本发明的工艺进一步在步骤(a)之前包括下述步骤：
x)减小含淀粉材料的粒度，优选通过磨制(milling)(例如，使用锤式粉碎机(hammer mill))；
y)形成包含含淀粉材料和水的浆料。
在一个优选的实施方案中，粒度小于#7筛网，例如#6筛网。含水浆料可含有10-55w/w-％含淀粉材料的干固体(DS)，例如25-45或30-40w/w-％的干固体(DS)。将浆料加热到糊化温度以上，并可添加α-淀粉酶以起始液化(稀化(thinning))。在进行步骤(a)中的α-淀粉酶处理前，浆料可经喷射蒸煮(jet-cooked)以进一步使其糊化。液化可作为三步热浆方法来进行。在pH 4-6，优选4.5-5.5，将浆料加热至60-95℃，优选70-90℃，如优选80-85℃，并添加α-淀粉酶，以及任选地支链淀粉酶和/或蛋白酶，优选金属蛋白酶以起始液化(稀化)。在一个实施方案中，然后可将浆料在95-140℃，优选100-135℃，如105-125℃的温度喷射蒸煮约1-15分钟，优选约3-10分钟，特别是约5分钟左右。使浆料冷却至60-95℃并添加更多的α-淀粉酶和任选地支链淀粉酶变体和/或蛋白酶，优选金属蛋白酶以完成水解(二次液化)。液化工艺通常在pH 4.0-6.5，特别是在pH 4.5-6进行。糖化步骤(b)可使用本领结构域公知的条件进行。举例而言，完全的糖化工艺可持续长至约24至约72小时，然而，通常仅在30-65℃，通常约60℃的温度进行通常40-90分钟的预糖化，接着在同时发酵和糖化工艺(SSF工艺)中在发酵过程中进行完全糖化。糖化通常在20-75℃，优选40-70℃，通常约60℃的温度，在pH 4-5的pH，通常在约pH 4.5进行。最广泛用于发酵产物特别是乙醇产生中的工艺是同时糖化和发酵(SSF)工艺，其中对于糖化没有保持阶段，意思是发酵生物(如酵母)和酶可一起添加。SSF可通常在25℃至40℃，如28℃至35℃，如30℃至34℃，优选约32℃左右的温度进行。在一个实施方案中，发酵持续6至120小时，特别是24至96小时。
啤酒制备
α-淀粉酶亦可用于啤酒制备工艺和类似的发酵；所述α-淀粉酶通常在制醪工艺中添加。该工艺基本上类似于上述的磨制、液化、糖化和发酵工艺。
用釜馏物的淀粉浆料加工
将磨制的含淀粉材料与水和再循环的稀釜馏物合并，得到水浆料。该浆料可包含15至55％ds w/w(例如20至50％，25至50％，25至45％，25至40％，20至35％和30-36％ds)。在一些实施方案中，再循环的稀釜馏物(回流)在约10至70％v/v(例如10至60％，10至50％，10至40％，10至30％，10至20％，20至60％，20至50％，20至40％以及20至30％)的范围。
一旦将经磨制的含淀粉材料与水和回流合并，则不调整浆料的pH。此外，在将植酸和任选的α-淀粉酶添加至浆料之后，不调整pH。在一个实施方案中，浆料的pH会在约4.5至少于约6.0(例如pH 4.5至5.8，4.5至5.6，4.8至5.8，5.0至5.8，5.0至5.4，5.2至5.5和5.2至5.9)的范围。浆料的pH可为约4.5至5.2，取决于添加至浆料的稀釜馏物的量和包含所述稀釜馏物的材料的类型。举例而言，稀釜馏物的pH可为3.8至4.5。
在乙醇产生过程中，添加酸以在发酵池(beer well)中降低pH，以减少蒸馏之前微生物污染的风险。
在一些实施方案中，将肌醇六磷酸酶添加至浆料。在其他实施方案中，除了肌醇六磷酸酶外，将α-淀粉酶添加至浆料。在一些实施方案中，肌醇六磷酸酶和α-淀粉酶顺序添加至浆料。在其他实施方案中，肌醇六磷酸酶和α-淀粉酶同时添加。在一些实施方案中，将包含肌醇六磷酸酶和任选地包含α-淀粉酶的浆料温育(预处理)约5分钟至约8小时(例如，5分钟至6小时，5分钟至4小时，5分钟至2小时，和15分钟至4小时)的期间。在其他实施方案中，将浆料在约40至115℃(例如45至80℃，50至70℃，50至75℃，60至110℃，60至95℃，70至110℃，70至85℃和77至86℃)的范围的温度温育。
在其他实施方案中，将浆料在比含淀粉材料的淀粉糊化温度低约0至约30℃(例如0至25℃，0至20℃，0至15℃，0至10℃和0至5℃)的温度温育。在一些实施方案中，所述温度低于约68℃，低于约65℃，低于约62℃，低于约60℃，和低于约55℃。在一些实施方案中，温度高于约45℃，高于约50℃，高于约55℃和高于约60℃。在一些实施方案中，在淀粉糊化唯独以下的温度温育包含肌醇六磷酸酶和α-淀粉酶的浆料称作初级(1°)液化。
在一些实施方案中，经磨制的含淀粉材料是玉米或买罗高粱。所述浆料包含25至40％DS，pH在4.8至5.2的范围，且浆料用肌醇六磷酸酶和任选的α-淀粉酶在60至75℃的温度范围温育5分钟至2小时。
目前，认为用于液化工艺中的商业上可获得的微生物α-淀粉酶一般不够稳定到在高于约80℃的温度在低于pH 5.6的pH从使用完全磨碎的谷粒的干法磨制工艺产生液化淀粉物质。许多商业上可获得的α-淀粉酶的稳定性在低于约4.0的pH减少。
在另一种液化步骤中，将经温育或预处理的含淀粉材料在约4.0至5.5的pH，暴露于温度增加如约0至约45℃高于含淀粉材料的淀粉糊化温度(例如，70℃至120℃，70℃至110℃，和70℃至90℃)约2分钟至约6小时(例如2分钟至4小时，90分钟，140分钟和90至140分钟)，更优选1小时至2小时的一段时间。温度可通过短时间期间(例如1至15分钟)的常规高温喷射蒸煮系统来增加。然后淀粉可在约75℃至95℃(例如80℃至90℃和80℃至85℃)范围的温度进一步水解约15至150分钟(例如30至120分钟)的期间。在一个优选实施方案中，在这些工艺步骤中不调整pH，且液化醪的pH为约pH 4.0至pH 5.8(例如pH 4.5至5.8，4.8至5.4，和5.0至5.2)的范围。在一些实施方案中，将第二剂的热稳定性α-淀粉酶添加至次级液化步骤，但在其他实施方案中并不进一步添加α-淀粉酶的剂量。
所述温育和液化步骤可继以本领结构域中公知的糖化和发酵步骤。
蒸馏
任选地，在发酵之后，可通过例如蒸馏并任选地继以一个或多个工艺步骤来提取醇(例如乙醇)。
在一些实施方案中，通过本文中提供的方法产生的乙醇的产量为至少8％，至少10％，至少12％，至少14％，至少15％，至少16％，至少17％和至少18％(v/v)和至少23％v/v。根据本文中提供的工艺获得的乙醇可用作，例如燃料乙醇、饮用乙醇，即可饮用的中性酒(neutral spirits)或工业乙醇。
副产物
发酵剩余物质为谷粒，其通常以液体或干燥形式用作动物饲料。在进一步的实施方案中，终产物可包括发酵副产物如蒸馏干酒糟(DDG)和蒸馏干酒糟加上可溶物(DDGS)，其可例如用作动物饲料。
对于如何进行液化、糖化、发酵、蒸馏和乙醇回收的细节对于本领结构域技术人员是公知的。
根据本文中提供的工艺，糖化和发酵可同时或分别进行。
纸浆和纸产生
α-淀粉酶亦可用于从增强淀粉的废纸和纸板产生木素纤维素材料如纸浆、纸和纸板，特别是当重新制浆在高于7的pH且当淀粉酶通过降解增强的淀粉来协助废品材料的崩解时。α-淀粉酶可特别用于从淀粉上浆的打印纸产生造纸纸浆。所述工艺可如WO 95/14807中所述进行，包括下述步骤：
a)崩解纸以产生纸浆，
b)在步骤a)之前、之中或之后用淀粉降解酶处理，和
c)在步骤a)和b)之后从纸浆分离墨水颗粒。
α-淀粉酶对于改性淀粉也是非常有用的，其中酶法改性的淀粉与碱性填充剂如碳酸钙、高岭土和黏土一同用于造纸。用α-淀粉酶可在填充的存在下改性淀粉，因此允许更简单的整合工艺。
纺织品、织物和衣物的脱浆
α-淀粉酶亦可有用于纺织品、织物或衣物的脱浆。在纺织品加工工业中，α-淀粉酶传统上在脱浆工艺中用作助剂以协助含淀粉材料的去除，其在纺织中用作保护织品(weft)纱的上浆。在纺织之后上浆涂层(size coating)的完全去除对于确保对织品进行洗刷、漂白和染色的后续工艺中的最优结果是重要的。优选酶法淀粉降解，因为这不涉及对纤维材料的任何有害作用。为了减少加工成本和增加工厂处理量(mill throughput)，有时将脱浆工艺与洗涤和漂白步骤合并。在此种情况下，通常使用非酶助剂如碱或氧化剂以降解淀粉，因为传统的α-淀粉酶与高pH水平和漂白剂不是非常相容。淀粉上浆的非酶法降解因为使用的比较攻击性的化学品导致一些纤维损伤。相应地，应需要使用α-淀粉酶，因为其在碱性溶液中具有改善的性能。α-淀粉酶可单独使用或在对含纤维素织物或纺织品脱浆时与纤维素酶组合使用。
脱浆和漂白工艺在本领结构域中是公知的。举例而言，此种工艺描述于，例如WO 95/21247，美国专利号4,643,736，和EP 119920，其通过提述并入本文。
清洁工艺和去污剂组合物
α-淀粉酶可作为用于多种清洁和洗涤包括洗衣和餐具洗涤工艺的去污剂组合物的组分添加。举例而言，α-淀粉酶可用于WO 96/23874和WO 97/07202中所述的去污剂组合物。
α-淀粉酶可以以常规采用的浓度掺入去污剂。举例而言，本发明的α-淀粉酶可以以对应于0.00001-10mg(作为纯、活性酶蛋白计算)α-淀粉酶每升使用常规给药水平的去污剂的洗涤/餐具洗涤液的量掺入。
举例而言，所述去污剂组合物可配制为手动或机器洗衣去污剂组合物，包含适用于预处理沾污的织物的洗衣添加剂组合物，和漂洗添加的织物柔顺剂组合物，或配制为适用于一般家庭硬表面清洁操作的去污剂组合物，或配制用于手动或机器餐具洗涤操作。
去污剂组合物可进一步包含一种或多种其他酶，如脂肪酶、过氧化物酶、蛋白酶、其他淀粉分解酶例如其他α-淀粉酶、葡糖淀粉酶、产麦芽糖淀粉酶、CGT酶、纤维素酶、甘露聚糖酶(如来自Novozymes,Denmark的MannawayTM)、果胶酶、果胶酸裂合酶、角质酶和/或漆酶。
一般而言，所选酶的性质应与所选去污剂相容(即，最适pH，与其他酶和非酶成分相容等)，且所述酶应以有效量存在。
去污剂可通过添加含有一种或几种酶的不同添加剂，或通过添加包含所有这些酶的组合添加剂包含于去污剂组合物。去污剂添加剂，例如不同的添加剂或组合的添加剂，可配制为例如，颗粒、液体、浆料等。优选的去污剂添加剂配制物为颗粒，特别是无尘颗粒，液体，特别是稳定化的液体，或浆料。
可产生无尘颗粒，例如，如公开于美国专利号4,106,991和4,661,452，且其可任选地通过本领结构域已知方法涂覆。蜡状涂覆材料为具有1000至20000的摩尔质量的聚环氧乙烷产品(聚乙二醇，PEG)，具有16至50个环氧乙烷单元的乙氧化壬基酚；其中醇含有12至20个碳原子并具有15至80个环氧乙烷单元的乙氧化脂族醇；脂族醇；脂肪酸；和脂肪酸的甘油一酯、二酯和三酯。适用于通过流体床技术施用的薄膜形成涂覆材料的实例在GB1483591中给出。液体酶制备物可例如通过根据已确立的方法添加多元醇如丙二醇，糖或糖醇，乳酸或硼酸来稳定化。受保护的酶可根据EP 238216中公开的方法制备。
去污剂组合物可为任何方便的形式，例如，条(bar)，片，粉末，颗粒，糊剂或液体。液体去污剂可为水性的，通常含有多至约70％水和0至约30％有机溶剂，或非水性的。
所述去污剂组合物包含一种或多种表面活性剂，其可为非离子型的，包括半极性和/或阴离子和/或阳离子和/或两性离子型。表面活性剂通常以按重量计约0.1％至60％的水平存在。
当包含其中时，去污剂通常含有约1％至约40％阴离子型表面活性剂，如直链烷基苯磺酸，α-链烯基磺酸，烷基硫酸盐(脂族醇硫酸酯)，醇乙氧化硫酸酯，仲烷基磺酸，α-磺基脂肪酸甲酯，烷基或烯基琥珀酸或皂类。
当包含其中时，去污剂会通常含有约0.2％至约40％的非离子型表面活性剂，如醇乙氧化物，壬基酚乙氧化物，烷基聚糖苷，烷基二甲基胺氧化物，乙氧化脂肪酸单乙醇胺，脂肪酸单乙醇胺，多羟基烷基脂肪酸胺，或葡萄糖胺的N-酰基N-烷基衍生物(“glucamide”)。
去污剂可含有0至约65％去污剂助洗剂或络合剂如沸石，二磷酸盐，三磷酸盐，膦酸盐，碳酸盐，柠檬酸盐，氮三乙酸，乙二胺四乙酸，二乙三胺五乙酸，烷基或烯基琥珀酸，可溶性硅酸盐或层状硅酸盐(例如，来自Hoechst的SKS-6)。
去污剂可包含一种或多种聚合物。实例为羧甲基纤维素，聚乙烯基吡咯烷酮，聚乙二醇，聚乙烯醇，聚乙烯基吡啶-N-氧化物，聚乙烯基咪唑，聚碳酸酯，聚聚丙烯酸酯，马来酸-丙烯酸共聚物，和甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物。
去污剂可包含漂白系统，所述系统可包含H2O2源如过硼酸或过碳酸，其可与过酸形成漂白激活剂如四乙酰基乙二胺(tetraacetylethylenediamine)或壬酰氧苯磺酸。或者，所述漂白系统可包含例如胺、亚胺或砜类型的过氧酸。
去污剂组合物的酶可使用常规稳定剂例如多元醇如丙二醇或甘油，倘或糖醇，乳酸，硼酸或硼酸衍生物例如芳族硼酸酯，或苯基硼酸衍生物如4-甲酰基苯基硼酸来稳定化，且组合物可如例如WO 92/19708和WO 92/19709中所述配制。
去污剂亦可含有其他常规去污剂成分如例如织物调节剂包括黏土、泡沫增强剂、泡沫抑制剂、抗腐蚀剂、污物悬剂、抗污物重沉积剂、燃料、杀细菌剂、光学增亮剂、助水溶物、晦暗抑制剂或香料。
去污剂组合物可包含对应于0.01-100mg的酶蛋白每升洗液，优选0.055mg的酶蛋白每升洗液，特别是0.1-1mg的酶蛋白每升洗液的量存在的任何酶。
本文中所述的一种或多种α-淀粉酶还可组入WO 97/07202(通过提述并入本文)中公开的去污剂配制物。
本公开在下述实施例中包括进一步的细节，其不以任何方式旨在限制要求保护的范围。因此，下述实例提供说明，但并不限制要求保护的范围。
实施例
材料和方法
α-淀粉酶和变体的发酵
可以通过本领域公知的方法或如下进行发酵。
将携带相关表达质粒的枯草芽孢杆菌菌株在含相关抗生素的LB-琼脂平板上划线，并在37°C过夜生长。
将菌落转移至500ml摇瓶中补加相关抗生素(例如10mg/l氯霉素)的100mlBPX培养基中。
BPX培养基的组成：
Figure BDA00002094921200541
BAN是Novozymes销售的解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶产物。
培养物在37°C，270rpm振荡4-5天。
通过在4500rpm离心20-25分钟从发酵液去除细胞和细胞碎片。之后过滤上清以获得完全澄清的溶液。浓缩滤液并在UF-滤膜(10000截留膜)上洗涤，并将缓冲液改变为20mM乙酸(盐)pH 5.5。将UF-滤液施于S-琼脂糖F.F.上并以相同缓冲液中的0.2M NaCl分步洗脱而进行洗脱。将洗脱液针对10mM Tris,pH 9.0透析并施于Q-琼脂糖F.F.上并在6个柱体积中以0-0.3M NaCl的线性梯度洗脱。汇集包含活性(通过Phadebas测定法测量)的级分，将pH调至7.5，并通过用0.5％w/vol.的活性炭处理5分钟而去除残余颜色。
Phadebas测定法
也可通过使用
Figure BDA00002094921200551
片为底物的方法确定α-淀粉酶活性。Phadebas片(淀粉酶测试，由Magle Life Sciences,Lund,Sweden提供)包含交联的不可溶蓝色淀粉聚合物，其已经与牛血清白蛋白和缓冲物质混合并制成片状。
对于每个单次测量，将一片悬浮于含5ml 50mM Britton-Robinson缓冲液(50mM乙酸，50mM磷酸，50mM硼酸，0.1mM CaCl2，0.01％
Figure BDA00002094921200553
X100，用NaOH将pH调至目的值)的管中。此为底物溶液。将待测试的α-淀粉酶稀释于50mM Britton-Robinson缓冲液。此为淀粉酶溶液。测试在恒温，例如，在室温，37°C或50°C进行。不溶的蓝色淀粉聚合物通过α-淀粉酶水解得到可溶的蓝色片段。所得的蓝色溶液的吸光度，其在620nm处用分光光度法测量，是α-淀粉酶活性的函数。
在选择的温度将575微升底物溶液平衡5分钟。通过向底物溶液加入25微升淀粉酶溶液并在选择的温度在轻柔混合下将样品温育15分钟而开始水解。通过加入100微升1M NaOH而停止反应，并在混合后立即在冰浴上冷却。在500gav离心3分钟后，将200微升上清液转移至微量滴定板中，并读出在620nm处的吸光度数值(Aamyl)。如所述制备盲样(blind)，只是其中用25微升50mM Britton-Robison缓冲液代替25微升淀粉酶溶液。盲样在620nm处的吸光度为Ab。类似地，通过制成具有已知活性的一系列Termamyl稀释溶液并如上所述测量向溶液释放的蓝色而产生标准曲线。标准品在620nm的吸光度为As。标准曲线为As-Ab针对样品中的Termamyl活性的图线。可以通过比较Aamyl-Ab与Termamyl标准曲线而确定目的淀粉酶的活性。
重要的是在温育15分钟(测试时间)后测量的620nm吸光度为620nm处0.2-2.0吸光度单位。在这个吸光度范围内，活性和吸光度呈线性关系(Lambert-Beer定律)。因此必须调整酶(目的淀粉酶和标准物两者)的稀释度以符合这个标准。在特定的一组条件下(温度，pH，反应时间，缓冲液条件)，1mg给定的α-淀粉酶将水解定量的底物并产生蓝色。
G7-pNP淀粉酶测定法
还通过使用PNP-G7底物的方法确定α-淀粉酶活性。PNP-G7，其为对硝基苯基-α,D-麦芽七糖苷的缩写，是可以由内切淀粉酶切割的块状(blocked)寡糖。切割后，试剂盒中包括的α-葡糖苷酶消化底物以释放具有黄色因此能够通过可见光分光光度法在λ＝405nm (400-420nm)测量的游离PNP分子。包含PNP-G7底物和α-葡糖苷酶的试剂盒由Roche/Hitachi制造(目录号11876473)。来自这个试剂盒的G7-PNP底物包含22mmol/L 4,6-亚乙基-G7-PNP和52.4mmol/L HEPES(2-[4-2(-羟乙基)-1-哌嗪基]-乙磺酸)，pH 7.0)，并且α-葡糖苷酶包含52.4mmol/L HEPES，87mmol/L NaCl，12.6mmol/L MgCl2，0.075mmol/L CaCl2，>4kU/L α-葡糖苷酶)。
将待分析的淀粉酶样品在50mM EPPS(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪丙磺酸(Sigma,E9502))，0.01％
Figure BDA00002094921200561
X100，1mM CaCl2，pH 7.0中稀释。在使用前，通过将来自试剂盒的1mL含α-葡糖苷酶的试剂与0.2mL含4,6-亚乙基-G7-PNP的试剂混合而制成底物工作溶液。在PCR仪中温育样品后立即将样品在残余活性缓冲液(50mM EPPS，0.01％
Figure BDA00002094921200562
X100，1mM CaCl2，pH 7.0)中稀释10倍。通过将20微升稀释的酶样品转移至96孔微量滴定板并加入80微升底物工作溶液而进行测定。混合溶液并在室温预温育1分钟，每20秒测量OD 405nm处的吸收值，共历时5分钟。
时间依赖性吸收曲线的斜率(吸光度每分钟)与在给定条件下目的α-淀粉酶的比活性(活性每mg酶)成正比。淀粉酶样品应稀释至斜率低于0.4吸光度单位每分钟的水平。
Figure BDA00002094921200563
淀粉酶活性测定法
还可以通过使用
Figure BDA00002094921200564
底物的方法确定α-淀粉酶活性。Ultra淀粉酶测定试剂盒(E33651,Invitrogen,La Jolla,CA,USA)中的底物是玉米淀粉衍生物，DQTM淀粉，其是用FL染料标记达到淬灭荧光的程度的玉米淀粉。
将一个含有约1mg冻干底物的小瓶溶于100微升50mM乙酸钠(pH 4.0)中。将小瓶漩涡振荡20秒并在室温置于暗处，间歇混合直至溶解。然后加入900微升100mM乙酸(盐)，0.01％(w/v)
Figure BDA00002094921200567
X100，0.12mM CaCl2，pH 5.5，彻底漩涡振荡并在室温保存于暗处直至使用。通过在残余活性缓冲液(100mM乙酸(盐)，0.01％(w/v)X100，0.12mM CaCl2，pH 5.5)中稀释10倍得到浓度为100微克/ml的底物而制备底物工作溶液。温育后立即将酶在100mM乙酸(盐)，0.01％(W/v)
Figure BDA00002094921200571
X100，0.12mM CaCl2，pH 5.5中稀释至浓度为20ng酶蛋白/mL。
对于测定，将25微升底物工作溶液与25微升稀释酶在黑色384孔微量滴定板中混合10秒。在15分钟之内每分钟于25°C测量一次每孔中的荧光强度(激发：485nm，发射：555nm)，并计算荧光强度针对时间的图线的斜率作为Vmax。图线应该是线性的，并且已经调整了残余活性测定法使得稀释的参照酶溶液在活性测定的线性范围内。
实施例1：杂合物的制备
制备具有SEQ ID NO:7中所示序列的钙敏感α-淀粉酶和具有SEQ ID NO:13中所示序列的钙不敏感α-淀粉酶的下述杂合物。
杂合物1：去除SEQ ID NO:7的氨基酸残基106-215，并用SEQ ID NO:13的氨基酸残基103-211代替，得到SEQ ID NO:17，并引入下述改变：E182*，N183*，E188W，N189E和D192T(使用SEQ ID NO:17编号)，其与使用SEQID NO:27编号的E181*，N182*，E187W，N188E和D191T相对应。该杂合物的序列示于SEQ ID NO:18中。
杂合物2：去除SEQ ID NO:7的氨基酸残基106-214，并用SEQ ID NO:13的氨基酸残基103-210代替，得到SEQ ID NO:19，并引入下述改变：E182*，N183*，E188W，N189E和D192T(使用SEQ ID NO:19编号)，其与使用SEQID NO:27编号的E181*，N182*，E187W，N188E和D191T相对应。该杂合物的序列示于SEQ ID NO:20中。
杂合物3：去除SEQ ID NO:7的氨基酸残基106-213，并用SEQ ID NO:13的氨基酸残基103-209代替，得到SEQ ID NO:21，并引入下述改变：E182*，N183*，E188W，N189E和D192T(使用SEQ ID NO:21编号)，其与使用SEQID NO:27编号的E181*，N182*，E187W，N188E和D191T相对应。该杂合物的序列示于SEQ ID NO:22中。
实施例2：存在螯合剂时的稳定性
将酶样品在49°C在DTPA终浓度为1.5％的缓冲液pH 8.0(50mM EPPS，0.01％
Figure BDA00002094921200572
X100，pH 8.0)中温育1小时，并将参照样品在4°C温育1小时。此外，将酶样品在42°C在DTPA终浓度为1.5％的缓冲液pH 10.0(50mM EPPS，0.01％
Figure BDA00002094921200581
X100，pH 10.0)中温育1小时，并将参照样品在4°C温育1小时。
为了确定在含DTPA的缓冲液pH 8和pH 10中的淀粉酶稳定性，通过在5mM EPPS，0.01％
Figure BDA00002094921200582
X100，pH 8.0中稀释而将待测试的酶调整至0.25和0.5mg酶蛋白/mL。
将160微升稳定性缓冲液(50mM EPPS，0.01％X100，1.875％DTPA，pH 8.0或pH 10.0)和40微升淀粉酶溶液一式两份转移至96孔PCR微量滴定板中并将其内容物混合1分钟。每孔中DTPA的终浓度为1.5％。将来自每孔的20微升转移至置于4°C的新PCR微量滴定板中(参照样品)。在PCR仪中温育PCR MTP，当缓冲液具有pH 8.0时在49°C温育1小时(pH 8，49°C样品)，当缓冲液具有pH 10.0时在42°C温育1小时(pH 10，42°C样品)。
温育后立即如G7-pNP淀粉酶测定法中所述分析PCR板上样品的淀粉酶活性。应注意的是，为了降低测定中来自DTPA的干扰，在分析残余活性前将参照和pH 8，49°C样品/pH 10，42°C样品稀释至相同浓度。在相同的96孔板上确定参照样品和pH 8，49°C样品或pH 10，42°C样品的活性。残余活性计算为：100*Vmax(pH 8，42°C或pH 10，49°C样品)/Vmax(参照样品)。
Figure BDA00002094921200584
杂合物1、2和3非常稳定，在pH 8，49°C和pH 10，42°C温育1小时后具有100％残余活性。相比之下，具有缺失D183*+T184*的SEQ ID NO:7在这些条件下具有少于20％的残余活性，而SEQ ID NO:7和SP707具有甚至更低的残余活性。
实施例3：其它α-淀粉酶
制备下述α-淀粉酶：
杂合物4：去除SEQ ID NO:5的氨基酸残基106-212并用SEQ ID NO:13的氨基酸残基103-208替代，得到SEQ ID NO:23，并且引入下述改变：E182*，N183*，E188W，N189E和D192T(使用SEQ ID NO:23编号)，其与SEQ ID NO:27编号中的E181*，N182*，E187W，N188E和D191T相对应。该杂合物的序列示于SEQ ID NO:24中。
杂合物5：去除SEQ ID NO:8的氨基酸残基106-212并用SEQ ID NO:13的氨基酸残基103-208替代，得到SEQ ID NO:25，并且引入下述改变：E182*，N183*，E188W，N189E和D192T(使用SEQ ID NO:25编号)，其与SEQ ID NO:27编号中的E181*，N182*，E187W，N188E和D191T相对应。该杂合物的序列示于SEQ ID NO:26中。
如实施例2中所述，将杂合物4和5(SEQ ID NO:24和26)，具有改变E182*，N183*，E188W，N189E和D192T (使用SEQ ID NO:5编号，其与SEQ ID NO:27编号中的E181*，N182*，E187W，N188E和D191T相对应)的SEQ ID NO:5的变体，和SEQ ID NO:8的α-淀粉酶与DTPA温育。结果显示温育后杂合物4和5具有几乎为100％的残余活性，而其它α-淀粉酶在温育过程中损失了大部分活性。
实施例4：α-淀粉酶变体的稳定性
通过在pH 4.5和5.5及75°C和85°C的温度将参照α-淀粉酶及其α-淀粉酶变体与0.12mM CaCl2温育，然后施用
Figure BDA00002094921200591
底物(
Figure BDA00002094921200592
Ultra淀粉酶测定法试剂盒,E33651,Molecular Probes,Invitrogen,La Jolla,CA,USA)确定残余活性，来确定具有SEQ ID NO:28的氨基酸序列的参照α-淀粉酶(嗜热脂肪芽孢杆菌和环状芽孢杆菌α-淀粉酶的杂合物(SEQ ID NO:27)，具有改变E181*+G182*+E187W+N188E+D191T+D407N+D430N+P432D)及其α-淀粉酶变体的稳定性。
将纯化的酶样品在酶稀释缓冲液(10mM乙酸(盐)，0.01％
Figure BDA00002094921200593
X100，0.12mM CaCl2，pH 5.0)中稀释至0.5和1或5和10ppm(微克/ml)的工作浓度。将二十微升酶样品转移至48孔PCR MTP中，并向每孔加入180微升稳定性缓冲液(150mM乙酸(盐)，150mM MES，0.01％
Figure BDA00002094921200594
X100，0.12mM CaCl2，pH 4.5或5.5)并混合。使用两个酶浓度一式两份进行测定。在75°C或85°C温育前，取出40微升并保存在冰上作为参照样品。在PCR仪中温育30/45分钟(pH 4.5和75°C)，45/60分钟(pH 5.5和75°C)，5/10分钟(pH 4.5和85°C)和10分钟(pH 5.5和85°C)。
温育后将参照样品和PCR仪中的样品在残余活性缓冲液(100mM乙酸(盐)，0.01％
Figure BDA00002094921200601
X100，0.12mM CaCl2，pH 5.5)中稀释至20ng/ml，并将25微升稀释酶转移至黑色384-MTP中。如
Figure BDA00002094921200602
淀粉酶活性测定法部分所述使用
Figure BDA00002094921200603
底物确定残余活性。简言之，向包含稀释酶的每个孔加入25微升底物工作溶液(100微克/ml)。使用485-P nm的激发滤片和555nm的发射滤片在15分钟内每分钟确定荧光(荧光读数器是Polarstar，BMG)。对于每个设置将残余活性标准化至对照样品。
假设为对数衰减，使用下述公式计算半衰期(T1/2(min))：T1/2(min)＝T(min)*LN(0.5)/LN(％RA/100)，其中T是用分钟表示的测定温育时间，而％RA是测定中确定的％残余活性。
使用这个测定设置，如表1中所示，确定参照α-淀粉酶及其变体的半衰期。
表1
Figure BDA00002094921200611
Figure BDA00002094921200621
Figure BDA00002094921200631
Figure BDA00002094921200641
Figure BDA00002094921200651
Figure BDA00002094921200671
结果证明α-淀粉酶变体具有比参照α-淀粉酶显著更长的半衰期和更高的稳定性。
实施例5：使用α-淀粉酶变体产生乙醇
如下制备以名称LIQUOZYME
Figure BDA00002094921200672
由Novozymes销售的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶变体和实施例4中所述两种α-淀粉酶变体的三种小规模醪：将约54g玉米粉，约51g自来水，和约45g回流在250mL塑料瓶中混合至总浆料重量为150g。将玉米浆料的pH调至4.5。以2微克淀粉酶每克干固体向醪加入酶。对于液化，向瓶中加入α-淀粉酶并将瓶彻底混合，置于预热的85°C水浴中。将样品在pH 4.5在水浴中保持2小时，前30分钟每10分钟振荡一次，之后在2小时液化的其余时间，每30分钟振荡一次。然后在冰浴中冷却样品；将pH调至5.0，并加入0.75mL脲和0.45mL青霉素，使它们在醪中分别达到1000和3ppm的终浓度。然后用Spirizyme
Figure BDA00002094921200673
(由Novozymes销售的葡糖淀粉酶产物)使样品进行同时糖化和发酵(SSF)。
将五克醪的等分试样转移至预称重的锥形离心管中，每种醪使用5个重复实验。然后在32°C水浴中使用Spirizyme
Figure BDA00002094921200674
对于这些醪进行54小时的SSF。对于所有发酵，葡糖淀粉酶剂量为0.50AGU/g DS。测量SSF过程中的CO2重量损失，并在54小时的SSF后使用HPLC定量乙醇。下面的表2中提供了平均54小时HPLC SSF数据。
表2
54小时发酵后的乙醇产率/得率(yield)
Figure BDA00002094921200675
结果证明α-淀粉酶变体的使用使得乙醇相对于LIQUOZYME
Figure BDA00002094921200676
的得率显著提高。
实施例6：去污剂中的洗涤性能
为了评价α-淀粉酶在去污剂中的洗涤性能，进行了洗涤实验。使用MiniWash测定法测试实施例1的杂合物1、2和3的性能，并与具有含缺失D183*+T184*(SEQ ID NO:7编号)的SEQ ID NO:7的氨基酸序列的α-淀粉酶相比较。在此测试中，可以同时在几个酶剂量检查酶-去污剂溶液的洗涤性能。
Mini Wash测定法的说明
Mini Wash有多个烧杯，每个烧杯能容纳多至80ml酶-去污剂溶液。通过向测试系统加入CaCl2，MgCl2和NaHCO3而将水硬度调至10°dH。将织物样品，在本实施例中为CS-28，附接于设计的框以将织物浸入酶-去污剂溶液中，频率为每分钟浸入40次。在洗涤过程中控制酶-去污剂溶液的温度。洗涤后，用流动的自来水漂洗植物随后在暗处干燥。通过用ZEISS MCS 521VIS分光光度计测量460nm处的减少(remission)而评价酶-去污剂溶液的洗涤性能。
织物：
CS-28是技术上以大米淀粉污染的棉织物，可从Center For Test MaterialsBV，P.O.Box 120,3133KT Vlaardingen,the Netherlands获得。
在下面详明的实验条件下进行实验：
结果与讨论：
将α-淀粉酶的洗涤性能标准化至具有含缺失D183*+T184*的SEQ ID NO:7的氨基酸序列的α-淀粉酶的洗涤性能。
Figure BDA00002094921200682
Figure BDA00002094921200691
实施例7：杂合物的制备
制备下述杂合物。
杂合物6：去除具有取代M9L+R118K+G149A+G182T+G186A+D183*+G184*+N195F+M202L+V214V+T257I+Y295F+N299Y+R320K+M323T+A339S+E345R+R458K(使用SEQ ID NO:5编号)的SEQ ID NO:5的变体中的氨基酸残基106-213，并用SEQ ID NO:13的氨基酸残基103-209代替，并引入下述改变：E182*，N183*，E188W，N189E和D192T，其与使用SEQ ID NO:27编号的E181*，N182*，E187W，N188E和D191T相对应。该杂合物的序列示于SEQ IDNO:32中。
杂合物7：去除SEQ ID NO:8的变体中的氨基酸残基106-213(使用SEQID NO:8编号)，并用SEQ ID NO:13的氨基酸残基103-209代替。该杂合物的序列示于SEQ ID NO:33中。
杂合物8：去除SEQ ID NO:3的变体中的氨基酸残基104-208(所述变体为SEQ ID NO:3的氨基酸1-35由SEQ ID NO:1的氨基酸1-33替代，并且具有取代G48A+T49I+G107A+H156Y+A181T+N190F+I201F+A209V+Q264S(使用SEQID NO:3编号))，并用SEQ ID NO:13的氨基酸残基103-209代替，并引入下述改变：N102D，Q147T，E178*，N179*，K181A，E184W，N185E和D188T，其与使用SEQ ID NO:27编号的N105D，Q150T，E181*，N182*，K184A，E187W，N188E和D191T相对应。该杂合物的序列示于SEQ ID NO:34中。
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本发明进一步在下述段落中限定：
段1.一种分离的α-淀粉酶，其包含与亲本钙不敏感性α-淀粉酶的B-结构域具有至少80％序列同一性的氨基酸序列，所述α-淀粉酶进一步具有超过0.1，优选超过0.2，甚至更优选超过0.5，并且最优选超过1的较高的通过Phadebas测定测量的活性与通过G7-pNG测定的活性的比例。
段2.段1的α-淀粉酶，其与SEQ ID NO:13的氨基酸105-210的序列具有至少80％序列同一性。
段3.一种分离的α-淀粉酶，其包含钙敏感性α-淀粉酶的A-和C-结构域以及钙不敏感性α-淀粉酶的B-结构域。
段4.前述段落中任一项的α-淀粉酶，其进一步包含一个或多个取代、插入或缺失。
段5.段3的α-淀粉酶，其中所述钙敏感性α-淀粉酶是SEQ ID NO:7而钙不敏感性α-淀粉酶是SEQ ID NO:13，并且所述α-淀粉酶任选地还包含一个或多个下述改变：D183*+G184*,E189W，N190E,D193T,E189W+N190E+D193T,L217E,Y208M,R119D和W189E+L217E。
段6.段3的α-淀粉酶，其中所述钙敏感性α-淀粉酶是SEQ ID NO:4而钙不敏感性α-淀粉酶是SEQ ID NO:13，并且所述α-淀粉酶任选地还包含一个或多个下述改变：D181*+G182*,E187W，E187W+N188E+D191T,N188E,D191T，S299K,S299K+G301R+A302D+D405N+D428N+P430D,G301R,A302D,D405N+D428N和P430D。
段7.一种分离的α-淀粉酶，其包含与SEQ ID NOS:1-12,29和30中任一的A-结构域具有至少60％序列同一性的A-结构域，与SEQ ID NOS:13-16和31中任一的B-结构域具有至少60％序列同一性的B-结构域，和与SEQ IDNOS:1-12,29和30中任一的C-结构域具有至少60％序列同一性的C-结构域。
段8.段7的α-淀粉酶，其中所述A-结构域与SEQ ID NO:1的A-结构域具有至少60％序列同一性，例如，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或100％序列同一性。
段9.段7的α-淀粉酶，其中所述A-结构域与SEQ ID NO:2的A-结构域具有至少60％序列同一性，例如，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或100％序列同一性。
段10.段7的α-淀粉酶，其中所述A-结构域与SEQ ID NO:3的A-结构域具有至少60％序列同一性，例如，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或100％序列同一性。
段11.段7的α-淀粉酶，其中所述A-结构域与SEQ ID NO:4的A-结构域具有至少60％序列同一性，例如，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或100％序列同一性.
段12.段7的α-淀粉酶，其中所述A-结构域与SEQ ID NO:5的A-结构域具有至少60％序列同一性，例如，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或100％序列同一性.
段13.段7的α-淀粉酶，其中所述A-结构域与SEQ ID NO:6的A-结构域具有至少60％序列同一性，例如，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或100％序列同一性。
段14.段7的α-淀粉酶，其中所述A-结构域与SEQ ID NO:7的A-结构域具有至少60％序列同一性，例如，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或100％序列同一性。
段15.段7的α-淀粉酶，其中所述A-结构域与SEQ ID NO:8的A-结构域具有至少60％序列同一性，例如，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或100％序列同一性.
段16.段7的α-淀粉酶，其中所述A-结构域与SEQ ID NO:9的A-结构域具有至少60％序列同一性，例如，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或100％序列同一性.
段17.段7的α-淀粉酶，其中所述A-结构域与SEQ ID NO:10的A-结构域具有至少60％序列同一性，例如，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或100％序列同一性.
段18.段7的α-淀粉酶，其中所述A-结构域与SEQ ID NO:11的A-结构域具有至少60％序列同一性，例如，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或100％序列同一性。
段19.段7的α-淀粉酶，其中所述A-结构域与SEQ ID NO:12的A-结构域具有至少60％序列同一性，例如，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或100％序列同一性。
段20.段7的α-淀粉酶，其中所述A-结构域与SEQ ID NO:29的A-结构域具有至少60％序列同一性，例如，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或100％序列同一性。
段21.段7的α-淀粉酶，其中所述A-结构域与SEQ ID NO:30的A-结构域具有至少60％序列同一性，例如，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或100％序列同一性。
段22.段7-21中任一项的α-淀粉酶，其中所述A1-结构域与SEQ ID NO:1的在位置1-5范围中的位置开始并且在位置91-111范围中的位置结束的序列，例如，在位置1-3范围中的位置开始并且在位置96-101范围中的位置结束的序列，或在位置1-3范围中的位置开始并且在位置101-106范围中的位置结束的序列，特别是位置1-101的序列具有至少60％序列同一性，例如，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或100％序列同一性。
段23.段7-21中任一项的α-淀粉酶，其中所述A1-结构域与SEQ ID NO:2的在位置1-5范围中的位置开始并且在位置95-115范围中的位置结束的序列，例如，在位置1-3范围中的位置开始并且在位置100-105范围中的位置结束的序列，或在位置1-3范围中的位置开始并且在位置105-110范围中的位置结束的序列，特别是位置1-105的序列具有至少60％序列同一性，例如，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或100％序列同一性。
段24.段7-21中任一项的α-淀粉酶，其中所述A1-结构域与SEQ ID NO:3的在位置1-5范围中的位置开始并且在位置93-113范围中的位置结束的序列，例如，在位置1-3范围中的位置开始并且在位置98-103范围中的位置结束的序列，或在位置1-3范围中的位置开始并且在位置103-108范围中的位置结束的序列，特别是位置1-103的序列具有至少60％序列同一性，例如，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或100％序列同一性。
段25.段7-21中任一项的α-淀粉酶，其中所述A1-结构域与SEQ ID NO:4的在位置1-5范围中的位置开始并且在位置94-114范围中的位置结束的序列，例如，在位置1-3范围中的位置开始并且在位置99-104范围中的位置结束的序列，或在位置1-3范围中的位置开始并且在位置104-109范围中的位置结束的序列，特别是位置1-104的序列具有至少60％序列同一性，例如，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或100％序列同一性。
段26.段7-21中任一项的α-淀粉酶，其中所述A1-结构域与SEQ ID NO:5的在位置1-5范围中的位置开始并且在位置95-115范围中的位置结束的序列，例如，在位置1-3范围中的位置开始并且在位置100-105范围中的位置结束的序列，或在位置1-3范围中的位置开始并且在位置105-110范围中的位置结束的序列，特别是位置1-105的序列具有至少60％序列同一性，例如，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或100％序列同一性。
段27.段7-21中任一项的α-淀粉酶，其中所述A1-结构域与SEQ ID NO:6的在位置1-5范围中的位置开始并且在位置95-115范围中的位置结束的序列，例如，在位置1-3范围中的位置开始并且在位置100-105范围中的位置结束的序列，或在位置1-3范围中的位置开始并且在位置105-110范围中的位置结束的序列，特别是位置1-105的序列具有至少60％序列同一性，例如，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或100％序列同一性。
段28.段7-21中任一项的α-淀粉酶，其中所述A1-结构域与SEQ ID NO:7的在位置1-5范围中的位置开始并且在位置95-115范围中的位置结束的序列，例如，在位置1-3范围中的位置开始并且在位置100-105范围中的位置结束的序列，或在位置1-3范围中的位置开始并且在位置105-110范围中的位置结束的序列，特别是位置1-105的序列具有至少60％序列同一性，例如，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或100％序列同一性。
段29.段7-21中任一项的α-淀粉酶，其中所述A1-结构域与SEQ ID NO:8的在位置1-5范围中的位置开始并且在位置95-115范围中的位置结束的序列，例如，在位置1-3范围中的位置开始并且在位置100-105范围中的位置结束的序列，或在位置1-3范围中的位置开始并且在位置105-110范围中的位置结束的序列，特别是位置1-105的序列具有至少60％序列同一性，例如，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或100％序列同一性。
段30.段7-21中任一项的α-淀粉酶，其中所述A1-结构域与SEQ ID NO:9的在位置1-5范围中的位置开始并且在位置95-115范围中的位置结束的序列，例如，在位置1-3范围中的位置开始并且在位置100-105范围中的位置结束的序列，或在位置1-3范围中的位置开始并且在位置105-110范围中的位置结束的序列，特别是位置1-105的序列具有至少60％序列同一性，例如，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或100％序列同一性。
段31.段7-21中任一项的α-淀粉酶，其中所述A1-结构域与SEQ IDNO:10的在位置1-5范围中的位置开始并且在位置95-115范围中的位置结束的序列，例如，在位置1-3范围中的位置开始并且在位置100-105范围中的位置结束的序列，或在位置1-3范围中的位置开始并且在位置105-110范围中的位置结束的序列，特别是位置1-105的序列具有至少60％序列同一性，例如，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或100％序列同一性。
段32.段7-21中任一项的α-淀粉酶，其中所述A1-结构域与SEQ IDNO:11的在位置1-5范围中的位置开始并且在位置95-115范围中的位置结束的序列，例如，在位置1-3范围中的位置开始并且在位置100-105范围中的位置结束的序列，或在位置1-3范围中的位置开始并且在位置105-110范围中的位置结束的序列，特别是位置1-105的序列具有至少60％序列同一性，例如，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或100％序列同一性。
段33.段7-21中任一项的α-淀粉酶，其中所述A1-结构域与SEQ IDNO:12的在位置1-5范围中的位置开始并且在位置95-115范围中的位置结束的序列，例如，在位置1-3范围中的位置开始并且在位置100-105范围中的位置结束的序列，或在位置1-3范围中的位置开始并且在位置105-110范围中的位置结束的序列，特别是位置1-105的序列具有至少60％序列同一性，例如，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或100％序列同一性。
段34.段7-21中任一项的α-淀粉酶，其中所述A1-结构域与SEQ IDNO:29的在位置1-5范围中的位置开始并且在位置95-114范围中的位置结束的序列，例如，在位置1-3范围中的位置开始并且在位置99-104范围中的位置结束的序列，或在位置1-3范围中的位置开始并且在位置104-109范围中的位置结束的序列，特别是位置1-104的序列具有至少60％序列同一性，例如，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或100％序列同一性。
段35.段7-21中任一项的α-淀粉酶，其中所述A1-结构域与SEQ IDNO:30的在位置1-5范围中的位置开始并且在位置92-112范围中的位置结束的序列，例如，在位置1-3范围中的位置开始并且在位置97-102范围中的位置结束的序列，或在位置1-3范围中的位置开始并且在位置102-107范围中的位置结束的序列，特别是位置1-102的序列具有至少60％序列同一性，例如，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或100％序列同一性。
段36.段7-35中任一项的α-淀粉酶，其中所述B-结构域与SEQ ID NO:13的在位置93-113范围中的位置开始并且在位置195-215范围中的位置结束的序列，例如，在位置97-109范围中的位置开始并且在位置199-211范围中的位置结束的序列，或在位置100-106范围中的位置开始并且在位置202-208范围中的位置结束的序列，特别是位置103-208的序列具有至少60％序列同一性，例如，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或100％序列同一性。
段37.段7-35中任一项的α-淀粉酶，其中所述B-结构域与SEQ ID NO:14的在位置93-113范围中的位置开始并且在位置195-215范围中的位置结束的序列，例如，在位置97-109范围中的位置开始并且在位置199-211范围中的位置结束的序列，或在位置100-106范围中的位置开始并且在位置202-208范围中的位置结束的序列，特别是位置104-207的序列具有至少60％序列同一性，例如，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或100％序列同一性。
段38.段7-35中任一项的α-淀粉酶，其中所述B-结构域与SEQ ID NO:15的在位置93-113范围中的位置开始并且在位置195-215范围中的位置结束的序列，例如，在位置97-109范围中的位置开始并且在位置199-211范围中的位置结束的序列，或在位置100-106范围中的位置开始并且在位置202-208范围中的位置结束的序列，特别是位置104-207的序列具有至少60％序列同一性，例如，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或100％序列同一性。
段39.段7-35中任一项的α-淀粉酶，其中所述B-结构域与SEQ ID NO:16的在位置100-120范围中的位置开始并且在位置161-181范围中的位置结束的序列，例如，在位置105-115范围中的位置开始并且在位置166-171范围中的位置结束的序列，或在位置107-113范围中的位置开始并且在位置171-176范围中的位置结束的序列，特别是位置110-171的序列具有至少60％序列同一性，例如，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或100％序列同一性。
段40.段7-35中任一项的α-淀粉酶，其中所述B-结构域与SEQ ID NO:31的在位置100-120范围中的位置开始并且在位置161-181范围中的位置结束的序列，例如，在位置105-115范围中的位置开始并且在位置166-171范围中的位置结束的序列，或在位置107-113范围中的位置开始并且在位置171-176范围中的位置结束的序列，特别是位置110-171的序列具有至少60％序列同一性，例如，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或100％序列同一性。
段41.段7-40中任一项的α-淀粉酶，其中所述C-结构域与SEQ ID NO:1的C-结构域具有至少60％序列同一性，例如，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或100％序列同一性。
段42.段7-40中任一项的α-淀粉酶，其中所述C-结构域与SEQ ID NO:2的C-结构域具有至少60％序列同一性，例如，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或100％序列同一性。
段43.段7-40中任一项的α-淀粉酶，其中所述C-结构域与SEQ ID NO:3的C-结构域具有至少60％序列同一性，例如，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或100％序列同一性。
段44.段7-40中任一项的α-淀粉酶，其中所述C-结构域与SEQ ID NO:4的C-结构域具有至少60％序列同一性，例如，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或100％序列同一性。
段45.段7-40中任一项的α-淀粉酶，其中所述C-结构域与SEQ ID NO:5的C-结构域具有至少60％序列同一性，例如，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或100％序列同一性。
段46.段7-40中任一项的α-淀粉酶，其中所述C-结构域与SEQ ID NO:6的C-结构域具有至少60％序列同一性，例如，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或100％序列同一性。
段47.段7-40中任一项的α-淀粉酶，其中所述C-结构域与SEQ ID NO:7的C-结构域具有至少60％序列同一性，例如，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或100％序列同一性。
段48.段7-40中任一项的α-淀粉酶，其中所述C-结构域与SEQ ID NO:8的C-结构域具有至少60％序列同一性，例如，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或100％序列同一性。
段49.段7-40中任一项的α-淀粉酶，其中所述C-结构域与SEQ ID NO:9的C-结构域具有至少60％序列同一性，例如，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或100％序列同一性。
段50.段7-40中任一项的α-淀粉酶，其中所述C-结构域与SEQ ID NO:10的C-结构域具有至少60％序列同一性，例如，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或100％序列同一性。
段51.段7-40中任一项的α-淀粉酶，其中所述C-结构域与SEQ ID NO:11的C-结构域具有至少60％序列同一性，例如，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或100％序列同一性。
段52.段7-40中任一项的α-淀粉酶，其中所述C-结构域与SEQ ID NO:12的C-结构域具有至少60％序列同一性，例如，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或100％序列同一性。
段53.段7-40中任一项的α-淀粉酶，其中所述C-结构域与SEQ ID NO:29的C-结构域具有至少60％序列同一性，例如，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或100％序列同一性。
段54.段7-40中任一项的α-淀粉酶，其中所述C-结构域与SEQ ID NO:30的C-结构域具有至少60％序列同一性，例如，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或100％序列同一性。
段55.段7-54中任一项的α-淀粉酶，其中所述A2和C-结构域与SEQ IDNO:1的在位置198-218范围中的位置开始并且在位置478-483范围中的位置结束的序列，例如，在位置203-208范围中的位置开始并且在位置480-483范围中的位置结束的序列，或在位置208-213范围中的位置开始并且在位置480-483范围中的位置结束的序列，特别是位置208-483的序列具有至少60％序列同一性，例如，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或100％序列同一性。
段56.段7-54中任一项的α-淀粉酶，其中所述A2和C-结构域与SEQ IDNO:2的在位置202-222范围中的位置开始并且在位置479-484范围中的位置结束的序列，例如，在位置207-212范围中的位置开始并且在位置481-484范围中的位置结束的序列，或在位置212-217范围中的位置开始并且在位置481-484范围中的位置结束的序列，特别是位置212-484的序列具有至少60％序列同一性，例如，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或100％序列同一性。
段57.段7-54中任一项的α-淀粉酶，其中所述A2和C-结构域与SEQ IDNO:3的在位置198-218范围中的位置开始并且在位置478-483范围中的位置结束的序列，例如，在位置203-208范围中的位置开始并且在位置480-483范围中的位置结束的序列，或在位置208-213范围中的位置开始并且在位置480-483范围中的位置结束的序列，特别是位置208-483的序列具有至少60％序列同一性，例如，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或100％序列同一性。
段58.段7-54中任一项的α-淀粉酶，其中所述A2和C-结构域与SEQ IDNO:4的在位置201-221范围中的位置开始并且在位置478-483范围中的位置结束的序列，例如，在位置206-211范围中的位置开始并且在位置480-483范围中的位置结束的序列，或在位置211-216范围中的位置开始并且在位置480-483范围中的位置结束的序列，特别是位置211-483的序列具有至少60％序列同一性，例如，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或100％序列同一性。
段59.段7-54中任一项的α-淀粉酶，其中所述A2和C-结构域与SEQ IDNO:5的在位置193-223范围中的位置开始并且在位置482-485范围中的位置结束的序列，例如，在位置208-213范围中的位置开始并且在位置482-485范围中的位置结束的序列，或在位置213-218范围中的位置开始并且在位置482-485范围中的位置结束的序列，特别是位置213-485的序列具有至少60％序列同一性，例如，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或100％序列同一性。
段60.段7-54中任一项的α-淀粉酶，其中所述A2和C-结构域与SEQ IDNO:6的在位置203-223范围中的位置开始并且在位置482-485范围中的位置结束的序列，例如，在位置208-213范围中的位置开始并且在位置482-485范围中的位置结束的序列，或在位置213-218范围中的位置开始并且在位置482-485范围中的位置结束的序列，特别是位置213-485的序列具有至少60％序列同一性，例如，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或100％序列同一性。
段61.段7-54中任一项的α-淀粉酶，其中所述A2和C-结构域与SEQ IDNO:7的在位置203-223范围中的位置开始并且在位置482-485范围中的位置结束的序列，例如，在位置208-213范围中的位置开始并且在位置482-485范围中的位置结束的序列，或在位置213-218范围中的位置开始并且在位置482-485范围中的位置结束的序列，特别是位置213-485的序列具有至少60％序列同一性，例如，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或100％序列同一性。
段62.段7-54中任一项的α-淀粉酶，其中所述A2和C-结构域与SEQ IDNO:8的在位置203-223范围中的位置开始并且在位置482-485范围中的位置结束的序列，例如，在位置208-213范围中的位置开始并且在位置482-485范围中的位置结束的序列，或在位置213-218范围中的位置开始并且在位置482-485范围中的位置结束的序列，特别是位置213-485的序列具有至少60％序列同一性，例如，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或100％序列同一性。
段63.段7-54中任一项的α-淀粉酶，其中所述A2和C-结构域与SEQ IDNO:9的在位置203-223范围中的位置开始并且在位置481-484范围中的位置结束的序列，例如，在位置208-213范围中的位置开始并且在位置482-484范围中的位置结束的序列，或在位置213-218范围中的位置开始并且在位置482-484范围中的位置结束的序列，特别是位置213-484的序列具有至少60％序列同一性，例如，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或100％序列同一性。
段64.段7-54中任一项的α-淀粉酶，其中所述A2和C-结构域与SEQ IDNO:10的在位置203-223范围中的位置开始并且在位置482-484范围中的位置结束的序列，例如，在位置208-213范围中的位置开始并且在位置482-484范围中的位置结束的序列，或在位置213-218范围中的位置开始并且在位置482-484范围中的位置结束的序列，特别是位置213-484的序列具有至少60％序列同一性，例如，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或100％序列同一性。
段65.段7-54中任一项的α-淀粉酶，其中所述A2和C-结构域与SEQ IDNO:11的在位置203-223范围中的位置开始并且在位置482-485范围中的位置结束的序列，例如，在位置208-213范围中的位置开始并且在位置482-485范围中的位置结束的序列，或在位置213-218范围中的位置开始并且在位置482-485范围中的位置结束的序列，特别是位置213-485的序列具有至少60％序列同一性，例如，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或100％序列同一性。
段66.段7-54中任一项的α-淀粉酶，其中所述A2和C-结构域与SEQ IDNO:12的在位置203-223范围中的位置开始并且在位置482-485范围中的位置结束的序列，例如，在位置208-213范围中的位置开始并且在位置482-485范围中的位置结束的序列，或在位置213-218范围中的位置开始并且在位置482-485范围中的位置结束的序列，特别是位置213-485的序列具有至少60％序列同一性，例如，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或100％序列同一性。
段67.段7-54中任一项的α-淀粉酶，其中所述A2和C-结构域与SEQ IDNO:29的在位置201-221范围中的位置开始并且在位置478-483范围中的位置结束的序列，例如，在位置206-211范围中的位置开始并且在位置480-483范围中的位置结束的序列，或在位置211-216范围中的位置开始并且在位置480-483范围中的位置结束的序列，特别是位置211-483的序列具有至少60％序列同一性，例如，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或100％序列同一性。
段68.段7-54中任一项的α-淀粉酶，其中所述A2和C-结构域与SEQ IDNO:30的在位置199-219范围中的位置开始并且在位置479-484范围中的位置结束的序列，例如，在位置204-209范围中的位置开始并且在位置481-484范围中的位置结束的序列，或在位置209-214范围中的位置开始并且在位置481-484范围中的位置结束的序列，特别是位置209-484的序列具有至少60％序列同一性，例如，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或100％序列同一性。
段69.段1-68中任一项的α-淀粉酶，其与SEQ ID NOS:1-12,29和30中任一项的α-淀粉酶相比更加热稳定。
段70.段1-69中任一项的α-淀粉酶，其与SEQ ID NOS:1-12,29和30中任一项的α-淀粉酶相比具有减少的钙敏感性。
段71.一种去污剂组合物，其包含段1-70任一项的α-淀粉酶和表面活性剂。
段72.一种组合物，其包含段1-70中任一项的α-淀粉酶和一种或多种选自下组的酶：β-淀粉酶，纤维素酶(β-葡糖苷酶、纤维二糖水解酶和内切葡聚糖酶)，葡糖淀粉酶，半纤维素酶(例如木聚糖酶)，异淀粉酶，异构酶，脂肪酶，肌醇六磷酸酶，蛋白酶和支链淀粉酶。
段73.段1-70中任一项的α-淀粉酶用于洗涤和/或餐具洗涤的用途。
段74.段1-70中任一项的α-淀粉酶用于使纺织品脱浆的用途。
段75.段89.段1-70中任一项的α-淀粉酶用于产生烘烤产物的用途。
段76.段1-70中任一项的α-淀粉酶用于液化含淀粉材料的用途。
段77.一种产生液化的淀粉的方法，其包括用段1-70中任一项的α-淀粉酶液化含淀粉材料。
段78.一种产生发酵产物的方法，其包括
(a)用段1-70中任一项的α-淀粉酶液化含淀粉材料以产生液化醪；
(b)糖化该液化醪以产生可发酵的糖；和
(c)在发酵生物的存在下发酵可发酵的糖。
段79.段78的方法，其中所述含淀粉材料用α-淀粉酶和支链淀粉酶例如GH57支链淀粉酶液化。
段80.段79的方法，其中所述支链淀粉酶获得自嗜热球菌属(Thermococcus)，包括嗜热球菌属菌种AM4，嗜热球菌属菌种HJ21，Thermococcus barophilus，Thermococcus gammatolerans，热水嗜热球菌(Thermococcus hydrothermalis)，Thermococcus kodakarensis，海滨嗜热球菌(Thermococcus litoralis)和Thermococcus onnurineus的菌株；或得自火球菌属(Pyrococcus)的菌株，如Pyrococcus abyssi和激烈火球菌的菌株。
段81.段78-80中任一项的方法，进一步包括在液化之前、过程中和/或之后添加蛋白酶，如酸性真菌蛋白酶或金属蛋白酶。
段82.段81的方法，其中所述金属蛋白酶获得自嗜热子囊菌属(Thermoascus)的菌株，优选橙橘嗜热子囊菌(Thermoascus aurantiacus)的菌株，特别是橙橘嗜热子囊菌CGMCC No.0670。
段83.一种产生发酵产物的方法，包括将淀粉底物与段1-70中任一项的α-淀粉酶，葡糖淀粉酶和发酵生物接触。
段84.段78-83中任一项的方法，其中所述发酵产物选自下组：醇(例如乙醇和丁醇)，有机酸(例如琥珀酸和乳酸)，糖醇(例如甘油)，抗坏血酸中间物(例如葡糖酸，2-酮-D-葡糖酸，2,5-二酮-D-葡糖酸和2-酮-L-古洛糖酸)，氨基酸(例如赖氨酸)，蛋白(例如抗体及其片段)。
段85.一种核酸序列，其编码段1-70中任一项的α-淀粉酶。
段86.一种质粒，其包含段85的核酸序列。
段87.一种宿主细胞，其包含段85的核酸序列或段86的质粒。
段88.一种转基因植物、植物部分或植物细胞，其用段85的核酸序列转化。
段89.一种用于制备段1-70中任一项的α-淀粉酶的方法，包括下述步骤：
(a)在导致所述杂合α-淀粉酶表达的条件下培养段87的宿主细胞；和
(b)回收所述杂合α-淀粉酶。
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Claims (24)

1.一种分离的α-淀粉酶，其包含钙敏感性α-淀粉酶的A-和C-结构域，和钙不敏感性α-淀粉酶的B-结构域。
2.一种分离的α-淀粉酶，其包含与SEQ ID NOS:1-12、29和30中任一项的A-结构域具有至少60%序列同一性的A-结构域，与SEQ ID NOS:13-16和31中任一项的B-结构域具有至少60%序列同一性的B-结构域，和与SEQ IDNOS:1-12、29和30中任一项的C-结构域具有至少60%序列同一性的C-结构域。
3.权利要求2的α-淀粉酶，其中所述A-结构域与SEQ ID NO:4的A-结构域具有至少60%序列同一性，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。
4.权利要求1-3中任一项的α-淀粉酶，其中所述A1-结构域与SEQ IDNO:4中在位置1-5的范围中的位置开始并且在位置94-114的范围中的位置结束的序列，例如，在位置1-3的范围中的位置开始并且在位置99-104的范围中的位置结束的序列，或在位置1-3的范围中的位置开始并且在位置104-109的范围中的位置结束的序列，特别是位置1-104的序列具有至少60%序列同一性，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。
5.权利要求1-4中任一项的α-淀粉酶，其中所述B-结构域与SEQ IDNO:13中在位置93-113的范围中的位置开始并且在位置195-215的范围中的位置结束的序列，例如，在位置97-109的范围中的位置开始并且在位置199-211的范围中的位置结束的序列，或在位置100-106的范围中的位置开始并且在位置202-208的范围中的位置结束的序列，特别是位置103-208的序列具有至少60%序列同一性，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。
6.权利要求1-5中任一项的α-淀粉酶，其中所述C-结构域与SEQ ID NO:4的C-结构域具有至少60%序列同一性，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。
7.权利要求1-6中任一项的α-淀粉酶，其中所述A2和C-结构域与SEQ IDNO:4中在位置201-221的范围中的位置开始并且在位置478-483的范围中的位置结束的序列，例如，在位置206-211的范围中的位置开始并且在位置480-483的范围中的位置结束的序列，或在位置211-216的范围中的位置开始并且在位置480-483的范围中的位置结束的序列，特别是位置211-483的序列具有至少60%序列同一性，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。
8.权利要求1-7中任一项的α-淀粉酶，其与SEQ ID NOS:1-12、29和30中任一项的α-淀粉酶相比更加热稳定。
9.权利要求1-8中任一项的α-淀粉酶，其与SEQ ID NOS:1-12、29和30中任一项的α-淀粉酶相比具有减少的钙敏感性。
10.一种去污剂组合物，其包含权利要求1-9任一项的α-淀粉酶和表面活性剂。
11.一种组合物，其包含权利要求1-9中任一项的α-淀粉酶和一种或多种选自下组的酶：β-淀粉酶，纤维素酶(β-葡糖苷酶、纤维二糖水解酶和内切葡聚糖酶)，葡糖淀粉酶，半纤维素酶(例如木聚糖酶)，异淀粉酶，异构酶，脂肪酶，肌醇六磷酸酶，蛋白酶和支链淀粉酶。
12.权利要求1-9中任一项的α-淀粉酶用于洗涤和/或餐具洗涤的用途。
13.权利要求1-9中任一项的α-淀粉酶用于使纺织品脱浆的用途。
14.权利要求1-9中任一项的α-淀粉酶用于产生烘烤产物的用途。
15.权利要求1-9中任一项的α-淀粉酶用于液化含淀粉材料的用途。
16.一种产生液化的淀粉的方法，其包括用权利要求1-9中任一项的α-淀粉酶液化含淀粉材料。
17.一种产生发酵产物的方法，其包括
(a)用权利要求1-9中任一项的α-淀粉酶液化含淀粉材料以产生液化醪；
(b)糖化该液化醪以产生可发酵的糖；和
(c)在发酵生物的存在下发酵可发酵的糖。
18.一种产生发酵产物的方法，包括将淀粉底物与权利要求1-9中任一项的α-淀粉酶、葡糖淀粉酶和发酵生物接触。
19.权利要求17或18的方法，其中所述发酵产物选自下组：醇(例如乙醇和丁醇)，有机酸(例如琥珀酸和乳酸)，糖醇(例如甘油)，抗坏血酸中间物(例如葡糖酸，2-酮-D-葡糖酸，2,5-二酮-D-葡糖酸和2-酮-L-古洛糖酸)，氨基酸(例如赖氨酸)，蛋白(例如抗体及其片段)。
20.一种核酸序列，其编码权利要求1-9中任一项的α-淀粉酶。
21.一种质粒，其包含权利要求20的核酸序列。
22.一种宿主细胞，其包含权利要求20的核酸序列或权利要求21的质粒。
23.一种转基因植物、植物部分或植物细胞，其是用权利要求20的核酸序列转化的。
24.一种制备权利要求1-9中任一项的α-淀粉酶的方法，包括下述步骤：
(a)在导致杂合α-淀粉酶表达的条件下培养权利要求22的宿主细胞；和
(b)回收所述杂合α-淀粉酶。
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