CN115135768A - 发酵方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种发酵方法，该发酵方法包括在搅拌下使淀粉水解产物与葡糖淀粉酶接触。以及允许沉降形成多相溶液。该多相溶液的第一相包含糖类组分，该糖类组分基于存在的总碳水化合物计占约30重量％至约80重量％(例如，30重量％至70重量％，30重量％至60重量％)。该方法还包括引流第一相以将第一相与第二相分离以形成包含该第一相的第一部分的发酵液。该方法还包括发酵该发酵液，直到该发酵液中葡萄糖的浓度为40g/L或更低。该方法包括将该第一相的第二部分添加到该发酵液中以将该发酵液中葡萄糖的浓度保持在约1g/L至约20g/L的范围内。

Description

发酵方法
背景技术
商业上大规模使用发酵方法来生产有机分子，诸如乙醇、柠檬酸和乳酸。在那些方法中，将碳水化合物喂予到能够将其代谢为期望发酵产物的微生物。同时选择碳水化合物和微生物，使得微生物能够有效地消化碳水化合物以形成以良好产率所期望的产物。在这些方法中使用遗传工程微生物变得更加常见，以便优化产率和工艺变量，或使特定碳水化合物能够被代谢。
发明内容
本公开的各种示例提供了一种发酵方法。所述方法包括在搅拌下使淀粉水解产物与葡糖淀粉酶接触。所述方法还包括停止所述搅拌以允许沉降形成多相溶液。所述多相溶液的第一相包含糖类组分，并且具有基于所述第一相中存在的总碳水化合物计约30重量％至约60重量％的葡萄糖，并且所述多相溶液的第二相包含比所述第一相更高的总悬浮固体量。所述方法还包括在形成之后引流所述第一相以将所述第一相与所述第二相分离。所述方法还包括将至少所述第一相加热至至少70℃的温度。形成发酵液并且包括所述第一相的第一部分。最初，所述发酵液中葡萄糖的浓度通常在约55g/L至约95g/L的范围内(例如在补料分批发酵中，其可在约55g/L至约95g/L，或约60g/L至约70g/L的范围内，并且在分批发酵中，其可在约60g/L至约95g/L或约70g/L至约90g/L的范围内)。所述方法还包括用微生物发酵所述发酵液以产生发酵产物，直到葡萄糖的浓度为40g/L或更低。然后，所述方法还包括使所述发酵液与葡糖淀粉酶接触。然后，所述方法还包括将所述第一相的第二部分添加到所述发酵液中以将所述发酵液中葡萄糖的浓度保持在约1g/L至约20g/L的范围内。在一些优选示例中，所述发酵产物基本上不含乙醇。
本公开的各种示例提供了一种发酵方法。所述方法包括在使淀粉水解产物与葡糖淀粉酶接触之前使所述淀粉水解产物与α-淀粉酶接触。在添加葡糖淀粉酶之前，所述淀粉水解产物具有在约8至约13范围内的右旋糖当量数。所述方法还包括在搅拌下使所述淀粉水解产物与葡糖淀粉酶接触。所述方法还包括停止搅拌足够量的时间以允许沉降形成多相溶液。所述多相溶液的第一相包含糖类组分，所述糖类组分具有基于所述第一相中存在的总碳水化合物计约30重量％至约60重量％的葡萄糖，并且所述多相溶液的第二相包含比所述第一相更高的总悬浮固体量。沉降进行约5小时至约13小时范围内的时间。所述方法还包括引流所述第一相以将所述第一相与所述第二相分离。所述方法还包括将至少所述第一相加热至至少70℃的温度。形成发酵液并且包括所述第一相的第一部分。最初，所述发酵液中葡萄糖的浓度通常在约55g/L至约95g/L，或约60g/L至约70g/L的范围内，并且在分批发酵中，其可在约60g/L至约95g/L或约70g/L至约90g/L的范围内。所述方法还包括用具有一个或多个丙酮酸脱羧酶基因缺失或破坏的酵母菌株发酵所述发酵液，使得所述菌株中的丙酮酸脱羧酶活性基本上被消除以基本上不产生乙醇。然而，酵母可产生至少50g/L、60g/L、70g/L、80g/L或90g/L的发酵产物，所述发酵产物包含乳酸、柠檬酸、丙二酸、羟基丁酸、己二酸、赖氨酸、酮-戊二酸、戊二酸、3-羟基-丙酸、琥珀酸、苹果酸、富马酸、衣康酸、粘康酸、甲基丙烯酸和乙酸、它们的衍生物、它们的盐或它们的混合物，直到所述发酵液中葡萄糖的浓度为40g/L或更低。发酵产物优选地包含乳酸和其盐，以及乳酸和其盐。然后，所述方法还包括使所述第一相与所述发酵液中的葡糖淀粉酶接触，以及将所述第一相的第二部分添加到所述发酵液中以将葡萄糖的浓度保持在约1g/L至约20g/L的范围内。在此时段期间，当葡萄糖在1g/L至约20g/L的范围内时，并且随着发酵进行并且如果发酵产物为有机酸，则通常通过添加氢氧化钙(石灰)将pH保持在4至5(例如4.2至4.6、4.3至4.5)，以及优选地在约4.4的pH下。一旦添加足够量的石灰，就允许发酵pH自由下降至期望的最终pH。所添加的石灰的量通过发酵结束时预期的发酵产物浓度(例如乳酸和其盐)和期望的游离酸的水平来确定。在一些优选示例中，所述发酵产物基本上不含乙醇。
本公开的各种示例提供了一种发酵方法。所述方法包括在搅拌下使淀粉水解产物与葡糖淀粉酶接触。所述方法还包括停止所述搅拌以允许沉降形成多相溶液。所述多相溶液的第一相包含糖类组分，并且具有基于所述第一相中存在的总碳水化合物计约30重量％至约60重量％的葡萄糖，并且所述多相溶液的第二相包含比所述第一相更高的总悬浮固体量。所述方法还包括在形成之后引流所述第一相以将所述第一相与所述第二相分离。所述方法还包括将至少所述第一相加热至至少70℃的温度。形成发酵液并且包括所述第一相的第一部分。最初，所述发酵液中葡萄糖的浓度通常在约55g/L至约95g/L，或约60g/L至约70g/L的范围内，并且在分批发酵中，其可在约60g/L至约95g/L或约70g/L至约90g/L的范围内。所述方法还包括用微生物发酵所述发酵液，直到所述发酵液中葡萄糖的浓度为40g/L或更低。然后，所述方法还包括使所述发酵液与葡糖淀粉酶接触。在一些优选示例中，所述发酵产物基本上不含乙醇。
本公开的各种示例提供了一种发酵方法。所述方法包括在使淀粉水解产物与葡糖淀粉酶接触之前使所述淀粉水解产物与α-淀粉酶接触。在添加葡糖淀粉酶之前，所述淀粉水解产物具有在约8至约13范围内的右旋糖当量数。所述方法还包括在搅拌下使所述淀粉水解产物与葡糖淀粉酶接触。所述方法还包括停止搅拌足够量的时间以允许沉降形成多相溶液。所述多相溶液的第一相包含糖类组分，所述糖类组分具有基于所述第一相中存在的总碳水化合物计约30重量％至约60重量％的葡萄糖，并且所述多相溶液的第二相包含比所述第一相更高的总悬浮固体量。沉降进行约5小时至约13小时范围内的时间。所述方法还包括引流所述第一相以将所述第一相与所述第二相分离。所述方法还包括将至少所述第一相加热至至少70℃的温度。形成发酵液并且包括所述第一相的第一部分。最初，所述发酵液中葡萄糖的浓度通常在约55g/L至约95g/L，或约60g/L至约70g/L的范围内，并且在分批发酵中，其可在约60g/L至约95g/L或约70g/L至约90g/L的范围内。所述方法还包括用具有一个或多个丙酮酸脱羧酶基因缺失或破坏的酵母菌株发酵所述发酵液，使得所述菌株中的丙酮酸脱羧酶活性基本上被消除以基本上不产生乙醇。然而，酵母可产生至少40g/L、50g/L、60g/L、70g/L、80g/L或90g/L的发酵产物，所述发酵产物包含乳酸、柠檬酸、丙二酸、羟基丁酸、己二酸、赖氨酸、酮-戊二酸、戊二酸、3-羟基-丙酸、琥珀酸、苹果酸、富马酸、衣康酸、粘康酸、甲基丙烯酸和乙酸、它们的衍生物、它们的盐或它们的混合物，直到所述发酵液中葡萄糖的浓度为40g/L或更低。然后，所述方法还包括使所述发酵液与葡糖淀粉酶接触。在一些优选示例中，所述发酵产物基本上不含乙醇。
具体实施方式
在整个文件中，以范围格式表示的值应以灵活的方式解释为不仅包括明确列举为该范围限值的数值，而且包括该范围内所涵盖的所有单个数值或子范围，如同明确列举了每个数值和子范围一样。例如，“约0.1％至约5％”或“约0.1％至5％”的范围应解释为不仅仅包括约0.1％至约5％，而且包括指定范围内的单个值(例如，1％、2％、3％和4％)和子范围(例如，0.1％至0.5％，1.1％至2.2％，3.3％至4.4％)。除非另外指出，否则陈述“约X至Y”具有与“约X至约Y”相同的含义。同样，除非另外指出，否则陈述“约X、Y或约Z”具有与“约X、约Y或约Z”相同的含义。
在本文件中，除非上下文另有明确规定，否则术语“一个”、“一种”或“该”用于包括一个或多于一个。除非另外指出，否则术语“或”用于指非排他性的“或”。陈述“A和B中的至少一者”具有与“A、B或A和B”相同的含义。另外，应当理解，本文所采用的并且没有另外定义的措词或术语仅是出于描述的目的，而不是限制的目的。章节标题的任何使用均旨在帮助阅读文件，而不应理解为限制性的；与章节标题相关的信息可以出现在该特定章节之内或之外。
如本文所用，术语“约”可允许值或范围有一定程度的可变性，例如，在相对于规定值或范围的规定限值的10％以内、5％以内或1％以内，并且包括确切的规定值或规定范围。
如本文所用，术语“基本上”是指大多数或大部分，如同至少约90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％、99.99％，或至少约99.999％或以上，或100％。
根据本公开的各种示例，发酵方法包括使淀粉水解产物组合物经受第一部分糖化过程以产生两相或多相溶液。两相的第一相包含足够量的葡萄糖以开始发酵和足够量的糖类(例如，葡萄糖的低聚物或聚合物)，使得其稍后可在第二发酵过程，诸如同时糖化和发酵(SSF)过程中使用。作为整体的发酵过程或方法通常被分类为分批或分批补料过程。
淀粉是广泛可用且廉价的糖类/碳水化合物来源。其可从多种植物来源获得，诸如玉米、小麦、稻、大麦、马铃薯、木薯等。许多生物体(例如，微生物)不能直接代谢淀粉，或缓慢且不高效地代谢淀粉。因此，在将淀粉进料到发酵过程之前处理淀粉可能是有帮助的，以便至少部分地将其分解成微生物可容易地发酵的合适量的葡萄糖。
例如，将淀粉水解至任何合适的程度以形成包含主要包含葡萄糖(例如，右旋糖)的糖类组分的混合物。然而，完全水解成葡萄糖可能是困难的，并且混合物可能包括其他糖类，诸如果糖、麦芽糖、异麦芽糖、泛糖以及其他DP3和DP4(例如，葡萄糖的低聚物)。在各种示例中，存在的主要类型的单糖为葡萄糖。
在本发明的发酵方法中，将淀粉水解产物加工成至少部分地被液化并进行部分糖化。发酵方法中的该操作可包括使淀粉水解产物与淀粉酶接触，该淀粉酶是催化淀粉水解的酶。用于该操作的合适的淀粉酶的示例为α-淀粉酶(根据EC 3.2.1.1分类)。α淀粉酶用于水解来自淀粉的至少一些糖类，并且开始使淀粉更易于进一步加工。这可进一步通过加热淀粉水解产物(例如，使淀粉水解产物中存在的蛋白质变性并使淀粉水解产物展开)来辅助。例如，通常将淀粉水解产物加热至至少约80℃、至少约100℃、在约80℃至约130℃、小于约80℃、85℃、90℃、95℃、100℃、105℃、110℃、115℃、120℃、125℃或约130℃，或大于约80℃、85℃、90℃、95℃、100℃、105℃、110℃、115℃、120℃、125℃或约130℃的范围内的温度。
在暴露于α-淀粉酶之后，包含淀粉水解产物的溶液的右旋糖当量数通常在约1至约15、约8至约13、小于约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或约15或大于约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或约15的范围内。如本文所理解的，右旋糖当量是糖产品中存在的还原糖量的量度，表示为相对于右旋糖的干基百分比。
通过使淀粉水解产物与葡糖淀粉酶接触，使淀粉水解产物进行进一步部分糖化。葡糖淀粉酶是外切淀粉酶，其从糖苷链的非还原末端裂解1,4-α-糖苷键，释放d-葡萄糖，从而增加可发酵糖的含量并减少水解产物中的不可发酵糊精。使淀粉水解产物与葡糖淀粉酶接触伴随着搅拌淀粉水解产物(例如，通过混合或以其他方式剪切水解产物)。以形成多相溶液(例如，两相溶液)的方式进行淀粉水解产物的糖化。第一相包含从淀粉水解的葡萄糖和其他糖类。第二相包含来自淀粉水解产物的废物，诸如蛋白质、脂质等。在容器中，第二相位于容器的顶部，并且第一相位于容器的底部。
形成多相溶液需要充分平衡搅拌淀粉水解产物，然后控制允许搅拌的溶液沉降以最终形成多相溶液的时间量。此外，控制搅拌和沉降的时间还可有助于控制基于第一相中存在的总碳水化合物计存在的葡萄糖的重量百分比。搅拌和沉降各自允许发生的时间可取决于若干因素，包括在其中进行沉降和搅拌的容器的体积。例如，搅拌可在约3小时至约10小时、约5小时至约8小时、小于约4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时或约10小时或大于约3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时或约10小时的范围内的时间内发生。作为另一示例，沉降可在约5小时至约13小时、约6小时至约10小时、小于7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时或约13小时或大于约5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时或约13小时的范围内的时间内发生。在一些示例中，沉降比搅拌发生更长的时间。
在形成多相溶液之后，第一相通常具有基于第一相中存在的总碳水化合物计在约30重量％至约70重量％、约30重量％至约60重量％、约40重量％至约50重量％、小于约31重量％、32重量％、33重量％、34重量％、35重量％、36重量％、37重量％、38重量％、39重量％、40重量％、41重量％、42重量％、43重量％、44重量％、45重量％、46重量％、46重量％、48重量％、49重量％、50重量％、51重量％、52重量％、53重量％、54重量％、55重量％、56重量％、57重量％、58重量％、59重量％或约60重量％，或大于约30重量％、31重量％、32重量％、33重量％、34重量％、35重量％、36重量％、37重量％、38重量％、39重量％、40重量％、41重量％、42重量％、43重量％、44重量％、45重量％、46重量％、46重量％、48重量％、49重量％、50重量％、51重量％、52重量％、53重量％、54重量％、55重量％、56重量％、57重量％、58重量％、59重量％或约60重量％的范围内的葡萄糖的重量百分比。为了实现葡萄糖的期望重量百分比，通常将多相溶液(或至少多相溶液的第一相)加热至至少约70℃、至少约80℃、至少约100℃、在约70℃至约130℃、约80℃至约130℃、小于约75℃、80℃、85℃、90℃、95℃、100℃、105℃、110℃、115℃、120℃、125℃或约130℃或大于约70℃、75℃、80℃、85℃、90℃、95℃、100℃、105℃、110℃、115℃、120℃、125℃或约130℃的范围内的温度。将多相溶液加热至这些温度有助于使葡糖淀粉酶失活以防止第一相具有比期望的葡萄糖重量百分比。
由于存在于其中的脂质、蛋白质或它们的混合物，第二相具有比第一相更高的悬浮固体的总量。在第二相中测量的悬浮固体的总量通常为至少1000ppm、至少1300ppm、至少3000ppm、在约1000ppm至约5000ppm、约2500ppm至约3500ppm或大于约1000ppm、1100ppm、1200ppm、1300ppm、1400ppm、1500ppm、1600ppm、1700ppm、1800ppm、1900ppm、2000ppm、2100ppm、2200ppm、2300ppm、2400ppm、2500ppm、2600ppm、2700ppm、2800ppm、2900ppm、3000ppm、3100ppm、3200ppm、3300ppm、3400ppm、3500ppm、3600ppm、3700ppm、3800ppm、3900ppm、4000ppm、4100ppm、4200ppm、4300ppm、4400ppm、4500ppm、4600ppm、4700ppm、4800ppm、4900ppm或约5000ppm的范围内。可使用直列式浊度计测量总悬浮固体值。相反，第一相具有比第二相更低的总悬浮固体数。例如，第一相具有小于3000ppm、小于2000ppm、小于1000ppm、小于500ppm、小于100ppm、小于50ppm、在约1ppm至约3000ppm或约50ppm至约500ppm的范围内的总悬浮固体数。使用CEM AVC-80微波分析仪烘箱校准通过直列式浊度计测定的总悬浮固体数。
使用微波分析仪，将水解产物的样品从其所在的容器下游的管道中取出。该部分与滤纸接触。将样品和滤纸与连接到抽吸器的1000mL真空烧瓶顶部的布氏漏斗接触。通过滤纸抽吸250mL水。将保留的固体置于微波分析仪中，以获得最终重量值。通过将最终重量乘以1,000,000并将产物除以最初收集的样品体积(mL)来计算总悬浮固体量。该方法可用于计算在过程期间的任何点处的总悬浮固体的量，并且可用于校准直列式浊度计以加快测定总悬浮固体数。
在第一相与第二相之间存在足够的分离之后，各相彼此分离。分离通常例如通过从容器的底部引流第一相而发生。引流离开容器中的第二相。第二相可被丢弃，用作潜在的原料，或被送至乙醇发酵装置，或位于其中的剩余淀粉水解产物可用于产生高右旋糖当量溶液，该溶液又可用于产生乙醇或甚至用于产生具有至少95的高右旋糖当量数的溶液。通常，第二相可具有与第一相基本上相同的葡萄糖浓度。然而，一旦热处理第一相，第二相中葡萄糖的浓度就可继续增加。另选地，可将第二相重新用作动物饲料。在各种示例中，分离不包括从第二相中过滤第一相。
第一相与第二相之间的分离可以是透明的，或者可存在梯度，使得在两相之间可以不存在明显的界面。监测第二相中的任一个是否与第一相分离的方法是测量从容器中引流的溶液的总量悬浮固体。用于测量它的直列式浊度计装置(例如，OPTEK CONTROL 4000)通常位于容器中的出口处或稍下游。停止分离以使总悬浮固体量为至少2000ppm、至少3000ppm、在约1000ppm至约5000ppm、约1300ppm至约1500ppm或大于约1000ppm、1100ppm、1200ppm、1300ppm、1400ppm、1500ppm、1600ppm、1700ppm、1800ppm、1900ppm、2000ppm、2100ppm、2200ppm、2300ppm、2400ppm、2500ppm、2600ppm、2700ppm、2800ppm、2900ppm、3000ppm、3100ppm、3200ppm、3300ppm、3400ppm、3500ppm、3600ppm、3700ppm、3800ppm、3900ppm、4000ppm、4100ppm、4200ppm、4300ppm、4400ppm、4500ppm、4600ppm、4700ppm、4800ppm、4900ppm或约5000ppm的范围内的溶液的流动最小化。溶解固体的总量(诸如这些)表明可存在第二相。避免将大量第二相与第一相混合具有若干益处，包括限制与发酵产物形成的阿拉伯糖醇和其他非预期副产物的量，这还可有助于防止发酵罐中的过度发泡问题，或其通常可有助于防止发酵罐或其部件(例如，管道和热交换器)中的结垢问题。
可将第一相储存任何合适的时间量以用作发酵液的组分。这可允许第一相用于这样的应用，其中用于进行发酵的设施距制备第一相的设施有一定距离，或者当不希望立即进行发酵时。另外，因为将第一相的葡萄糖重量百分比控制在中等水平，所以基本上减轻了不期望的副产物诸如异麦芽糖的形成。例如，第一相中异麦芽糖的量通常小于约1.0g/L、0.75g/L、0.50g/L、0.10g/L或0.05g/L的异麦芽糖。低量的异麦芽糖可使其不必向第一相或随后向发酵液中添加潜在昂贵的酶诸如转葡糖苷酶来分解不期望的异麦芽糖。
在分离第一相之后，将第一相的至少第一部分添加到其他组分中以形成发酵培养基或发酵液，其通常包括水和营养物，诸如蛋白质(或其他氮源)、维生素和盐，它们对于细胞功能是必需的或期望的。其他组分也可存在于发酵液或培养基中，诸如缓冲剂、发酵产物(其倾向于随着发酵进展而积累)和其他代谢物。在发酵产物为有机酸的情况下，通常用碱(诸如氢氧化钙或碳酸钙、氨或氢氧化铵、氢氧化钠或氢氧化钾)缓冲发酵液，以保持微生物功能良好的pH。例如，pH通常保持在约2.0至约7.0、约3.0至约6.0、约3.5至约4.5、约2.5至约3.5、约3.0至4.0、小于约2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.7或约7或大于约2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.7或约7.0的范围内。
发酵方法中使用的微生物是可将葡萄糖发酵成期望发酵产物的微生物。合适的发酵产物的示例可包括有机酸或氨基酸、它们的衍生物或它们的盐。有机酸和氨基酸的合适示例可包括乳酸、柠檬酸、丙二酸、羟基丁酸、己二酸、赖氨酸、酮-戊二酸、戊二酸、3-羟基-丙酸、琥珀酸、苹果酸、富马酸、衣康酸、粘康酸、甲基丙烯酸和乙酸、它们的衍生物、它们的盐或它们的混合物。在一些示例中，发酵方法产生小于约3g/L的乙醇或不产生乙醇。在一些示例中，在产生乙醇的情况下，该产生可通过发酵液的污染(例如，不期望的微生物的生长)发生。
可用于发酵方法中的微生物的合适示例包括真菌、细菌或它们的混合物。真菌可包括丝状真菌或酵母。如果使用酵母，则优选其作为Crabtree阴性酵母。然而，合适的酵母的示例通常包括酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyceslactis)、马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)、解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)、库德里阿兹威毕赤酵母(Pichia kudriavzevii)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)或它们的混合物。细菌的合适示例通常包括链球菌属(Streptococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、芽孢杆菌属(Bacillus)、埃希氏菌属(Escherichia)、沙门氏菌属(Salmonella)、奈瑟氏球菌属(Neisseria)、醋杆菌属(Acetobactor)、节杆菌属(Arthrobacter)、曲霉菌属(Aspergillus)、双歧杆菌属(Bifdobacterium)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、假单胞菌属(Pseudomanas)或它们的混合物。
相对于期望的发酵产物来选择所使用的特定微生物。微生物可以是天然存在的，或可以是突变体或重组菌株。重组菌株通常包括内源、异源、外源或它们的组合的基因或多肽。如本文所用，如果遗传物质诸如基因、启动子和终止子(i)对于细胞是天然的，(ii)存在于与遗传物质存在于野生型细胞中的位置相同的位置，和(iii)在其天然启动子和其天然终止子的调节控制下，则“内源”是指该遗传物质对于细胞是“内源的”。术语“异源”是指来自与所提及的生物体不同的来源或在存在所提及的分子的情况下的分子(例如，多肽或核酸)或活性。因此，与所提及的生物体异源的基因或蛋白质是在该生物体的天然形式中未发现的基因或蛋白质。例如，在第一真菌物种中发现并被外源引入作为宿主生物的第二真菌物种中的特定葡糖淀粉酶(GA)基因对于第二真菌生物是“异源的”。作为另一示例，来自由其天然形式修饰的真菌物种的特定葡糖淀粉酶基因与影响基因功能的一个或多个核苷酸变化是“异源的”。微生物也可具有缺失的基因。例如，可通过破坏或缺失天然丙酮酸脱羧酶(PDC)基因对一些微生物进行基因修饰以消除乙醇产生。该酵母可被命名为“PDC阴性工程化酵母”或“PDC阴性酵母”。所有异源核酸也是外源的。出于本申请的目的，如果遗传物质诸如基因、启动子和终止子(i)对于细胞是非天然的和/或(ii)对于细胞是天然的，但存在于与该遗传物质存在于野生型细胞中的位置不同的位置和/或(iii)在非天然启动子和/或非天然终止子的调节控制下，则其对于细胞是“外源的”。出于本发明的目的，天然遗传物质的额外拷贝被认为是“外源的”，即使此类额外拷贝存在于与该遗传物质存在于野生型宿主菌株中的基因座相同的基因座。如本文关于代谢途径所用的“天然”是指在野生型宿主菌株中存在并具有活性的代谢途径。如果遗传物质具有与存在于野生型宿主细胞的基因组中的遗传组分(例如，外源遗传组分与内源遗传组分相同)相同的序列(除了不影响功能的个体对个体突变之外)，则出于本申请的目的，遗传物质诸如基因、启动子和终止子是“天然的”。
外源遗传组分可具有天然或非天然序列。具有天然序列的外源遗传组分包含与天然细胞的基因组中存在的遗传组分相同的序列(例如，外源遗传组分与内源性遗传组分相同)。然而，外源组分存在于宿主细胞基因组中与内源组分不同的位置。例如，可将与内源基因相同的外源基因插入酵母细胞中，从而产生具有非天然(增加的)基因拷贝数的修饰细胞。具有非天然序列的外源遗传组分包含在天然细胞的基因组中未发现的序列。例如，可将来自特定物种的外源基因插入另一物种的酵母细胞中。外源基因以功能性方式整合到宿主细胞基因组中，这意味着其能够在宿主细胞中产生活性蛋白质。然而，在各种示例中，可将外源基因作为稳定地保持在宿主细胞质中的载体的一部分引入到细胞中。在其他示例中，外源遗传组分可在天然位置，但可对其启动子或终止子进行修饰。在一些示例中，工程化微生物可用于不能产生乙醇或至少产生最少量的乙醇(例如，小于约3g/L的乙醇)的发酵方法中。
在发酵方法中，任选地将第一相添加到发酵液中至少两次(例如，将第一相的第一部分添加到发酵液中，然后添加发酵液的第二部分)。发酵液通常位于容器诸如发酵容器中。以该方式，发酵方法可以是分批补料发酵。另外，将葡糖淀粉酶添加到发酵液中。在进行发酵以达到期望的葡萄糖浓度之前添加第一相的第一部分。第一相的第一部分可包括发酵液中葡萄糖的浓度，其通常在约55g/L至约95g/L的范围内(例如在补料分批发酵中，其可在约55g/L至约95g/L或约60g/L至约70g/L的范围内，并且在分批发酵中，其可在约60g/L至约95g/L或约70g/L至约80g/L的范围内)。发酵液可包含含有葡萄糖和本文所述的其他组分的水，所述其他组分在初始发酵步骤中在发酵液中发酵以产生发酵产物，直到发酵液含有约50g/L或更低的葡萄糖、40g/L或更低的葡萄糖、约30g/L或更低的葡萄糖、约15g/L或更低的葡萄糖、约10g/L或更低的葡萄糖、约1g/L至约40g/L的葡萄糖、约1g/L至约30g/L的葡萄糖或约15g/L低约30g/L的葡萄糖。
关于添加到发酵液中的第一相中存在的葡萄糖的量，发现在发酵液中期望葡萄糖的最小初始量以确保发酵过程可启动并在发酵过程期间不中断地继续操作。然而，该量低于使用右旋糖当量数为至少95的糖类组分作为原料的发酵过程中通常使用的量。此外，保持相对较低的葡萄糖初始浓度可有助于防止发酵液中的污染。这是因为具有相对有限量的可用葡萄糖可限制微生物培养物中的初始生长。在控制微生物生长的情况下，除预期微生物以外的微生物物种不太可能以任何显著数量生长。这又有助于限制非预期或不需要的发酵产物的产物。
在将第一相的第一部分添加到发酵液中之后，添加第一相的第二部分。在添加第二部分之前继续发酵，使得存在的葡萄糖的量(g/L)降低。尽管存在的葡萄糖的量可在发酵期间的某些点增加(例如，至50g/L或更高)。以这种方式添加第一相的第二部分以将发酵液中葡萄糖的浓度保持在约1g/L至约25g/L、约2g/L至约20g/L、约5g/L至约25g/L、约8g/L至约12g/L、约13g/L至约17g/L、小于约2g/L、3g/L、4g/L、5g/L、6g/L、7g/L、8g/L、9g/L、10g/L、11g/L、12g/L、13g/L、14g/L、15g/L、16g/L、17g/L、18g/L、19g/L、20g/L、21g/L、22g/L、23g/L、24g/L或约25g/L或大于约1g/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L、6g/L、7g/L、8g/L、9g/L、10g/L、11g/L、12g/L、13g/L、14g/L、15g/L、16g/L、17g/L、18g/L、19g/L、20g/L、21g/L或约22g/L的范围内。
可将第一相的第二部分添加到在相同的部分糖化过程中产生的第一部分中。然而，在一些示例中，可将来自一个部分糖化过程的第一相的第一部分添加到来自另一个部分糖化过程的第一相的第二部分中。
发酵在针对微生物和期望发酵产物定制的条件下进行。尽管条件可根据特定微生物和期望发酵产物而变化，但合适的条件通常包括约20℃、约30℃至约50℃、小于约20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃或约50℃或大于约20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃或约50℃的温度。通常，将发酵液混合。混合可通过将气体鼓泡到发酵液中或另选地通过直接机械搅拌或通过其他方法进行。
可使用可变速率添加系统将第一相的第一部分、第一相的第二部分或两者添加到发酵液中。该系统可以是期望的，因为其不会在发酵批次中引入会对酶活性产生不利影响的暂时高浓度的葡萄糖。这种系统的示例包括变速泵或可操作地连接到泵的计量阀(诸如节流阀)，所述泵或阀可以用于随时间改变引入到发酵液中的水解产物的量。在一示例中，淀粉水解产物的添加在约4小时至约30小时，例如约5小时至约24小时的时间段内进行，并且在一些情况下为了优化产物产量、酶用量和生产成本，进行约10至约20小时。
在一些示例中，发酵方法可在有氧、微氧或厌氧条件下进行。“微氧”意味着将一些氧喂予到发酵，并且微生物足够快地吸收氧，使得溶解氧浓度平均小于在大气空气下发酵至少五小时的饱和氧浓度的约2％。此外，微氧发酵的平均氧传递速率通常在约3mmol L-1h-1至约80mmol L-1h-1、约10mmol l-1h-1至约60mmol l-1h-1、约25至约45mmol l-1h-1、小于约3mmol l-1h-1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75或约80mmol l-1h-1或大于约3mmol l-1h-1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75或约80mmol l-1h-1的范围内。根据各种示例，该方法中的氧传递速率可与本文所述的任何有机酸、氨基酸、它们的衍生物或它们的盐的产生速率成比例。
在一示例中，在添加第一相的第一部分、第一相的第二部分或两者的淀粉水解产物期间，通过实时监测系统监测葡萄糖浓度。实时监测系统包括直接监测葡萄糖浓度的系统和间接监测葡萄糖浓度的系统。通常直接监测葡萄糖浓度的实时监测系统的示例包括基于红外(IR)光谱的系统、近红外(NIR)光谱系统、傅里叶变换红外(FTIR)系统、基于折射率的系统、基于酶的自动测量系统(诸如由YSI Life Sciences系统销售的YSI2950Biochemistry Analyzer)、基于高效液相色谱(HPLC)的系统、基于气相色谱(GC)的系统以及本领域技术人员已知的其他实时监测系统。
另外，可以通过确定具体发酵过程中的典型碳分布并将发酵液中存在的葡萄糖浓度与发酵所显示的另一个参数(例如，发酵液中存在的葡萄糖水平与二氧化碳释放速率和来自发酵容器的废气流中存在的二氧化碳量的测量值之间的相关性)相关联，来开发间接监测/测量发酵过程的葡萄糖浓度的实时监测系统。通过使用质谱仪或其他合适的仪器技术来测量废气流的组分，可以容易地测量二氧化碳。在一示例中，通过使用红外光谱的实时监测系统监测葡萄糖浓度。在另一示例中，通过使用近红外光谱的实时监测系统监测葡萄糖浓度。在一个示例中，实时监测系统与控制引入到发酵液中的淀粉水解产物的引入的设备连接以便于将发酵液中的葡萄糖浓度保持在期望浓度。在另一个示例中，通过实时监测系统监测葡萄糖浓度，并且控制系统利用测量的葡萄糖浓度的值来控制淀粉水解产物(和任选地酶)引入到发酵液中。
在将第一相的第二部分以及第一相的任何另外的部分添加到发酵液中之后，可允许发酵进行直到产生最终的发酵液。在一示例中，在已经添加期望的量的第一相之后，允许发酵进行直到基于最终发酵液的体积计葡萄糖浓度处于低于5g/L，或低于1g/L，或低于0.5g/L的浓度。
存在可用于提取发酵产物的各种回收方法。当发酵方法使用石膏回收方法时，如下所述，使用的合适的阳离子包括钙。在石膏回收方法中，制备有机酸发酵产物(包括羟基羧酸)。在发酵期间，使用通常以石灰形式使用的氢氧化钙将发酵液的pH保持在期望水平。一旦发酵完成，可能期望通过添加硫酸来对发酵液进行酸化来提高有机酸的回收率，从而增加从发酵液中回收的酸的百分比。来自石灰和硫酸的离子反应形成硫酸钙(石膏)，然后可通过沉淀容易地将其从发酵液中除去。
另选地，氨或氢氧化铵是经济和丰富的。氢氧化铵具有不仅提供pH缓冲，而且为发酵提供另外的生物可利用氮源的优点。使用氢氧化铵控制pH的发酵的示例包括用于制造柠檬酸、赖氨酸或其他氨基酸的发酵方法。另外，氢氧化铵通常用于发酵过程中，所述发酵过程通常将铵掺入发酵产物(诸如氨基酸)或生物质(诸如氨基酸或柠檬酸)，并且本领域技术人员已知的其他过程可耐受最终产物规格或方法中的铵，其中发酵产物通常通过使用离子交换、结晶或液-液萃取(诸如柠檬酸、琥珀酸或富马酸，以及本领域技术人员已知的其他过程)来回收。
氢氧化钠和氢氧化钾易于获得。它们通常将在发酵期间仅需要相对较小的pH控制的发酵过程中使用。
从发酵液中回收发酵产物。完成该过程的方式将取决于具体产物。然而，一般来讲，通常通过过滤步骤或离心步骤将微生物与液相分离，并通过例如蒸馏、萃取、结晶、膜分离、渗透、反渗透或其他合适的技术回收产物。有机酸通常需要使用酸诸如硫酸来酸化含有有机酸(和其盐)的流体以回收有机酸。
本发明的过程提供了以优异的产率和纯度在生产规模水平上制备发酵产物的能力。在一示例中，进行分批过程以产生多批至少25,000加仑的最终发酵液。
工作实施例
可通过参考以举例说明方式提供的以下实施例来更好理解本发明的各个实施例。本发明不限于本文给定的实施例。
工作实施例1：水解产物制备
该过程不需要特定的葡糖淀粉酶产物。所描述的工作实施例在糖化步骤中使用购自Novozymes(Bagsvaerd Denmark)的Extenda Go，以及在发酵步骤中使用购自DuPont INC(Wilmington,DE)的Distillase SSF。
淀粉水解产物包括淀粉浆料，在这种情况下是来自Blair Nebraska的Cargill'sWet Corn Mill的玉米淀粉。通过称为液化的方法，用α-淀粉酶和热处理淀粉浆料，并且然后给予时间将淀粉浆料液化成8至13右旋糖当量(D.E.)水解产物。
将液化的水解产物冷却并在线调节pH，因为将其转移到单独的罐中用于称为糖化的过程。在冷却和pH调节完成后，添加第一种葡糖淀粉酶，最佳温度和pH是酶依赖性的。添加的酶的实际量将取决于设备尺寸和酶本身的活性，在该实施例中为0.025％(酶的体积/糖化罐的体积)。然而，所述方法的糖化步骤进行最少13小时，其中15小时显示良好的性能。一旦添加葡糖淀粉酶并且完全填充糖化罐，将材料搅拌4小时，然后停止搅拌。在此期间，基于存在的总碳水化合物计，反应中的葡萄糖浓度增加到大约15重量％至25重量％。在不搅拌的情况下，持续释放葡萄糖，直到基于存在的总碳水化合物计，其在40重量％至60重量％之间。当总反应时间大于13小时并且基于存在的总碳水化合物计葡萄糖浓度在40重量％至60重量％之间时，认为反应完成，如果该材料已经转化超过80重量％的葡萄糖，则该材料不应用于发酵过程。
一旦满足4小时搅拌，随后9小时至11小时沉降，13小时至15小时总反应时间和40重量％至60重量％葡萄糖(基于存在的总碳水化合物计)的最低要求，就将部分糖化的水解产物(基于存在的总碳水化合物计，完全糖化通常意味着>95重量％的葡萄糖)转移到存储装置。在不搅拌的情况下在糖化的时间段期间，罐中的不溶性固体朝向容器的顶部漂浮。转移至存储装置以不干扰混合物上层的方式通过容器的底部进行。在转移期间，用直列式浊度计监测材料。浊度测量结果与总悬浮固体相关。一旦测量的总悬浮固体达到3000ppm，就停止转移至淀粉水解产物存储装置，并且将糖化罐中的剩余材料引导到另选的储罐，在该储罐中将其计量加入到设施乙醇发酵过程中。如上文关于直列式浊度计所描述测量总悬浮固体量。将进入存储装置的材料在其到达储罐之前在线加热至至少75℃，以便通过使葡糖淀粉酶失活来防止进一步转化。此时，淀粉水解产物可以与任何商业玉米糖浆产品类似的方式储存或运输。
工作实施例2：补料分批发酵方法
发酵液包括水以及使细胞生长所需的足够营养物。发酵液还含有消泡剂以控制发酵中的发泡。
将容量为约1,000,000L(约290,000加仑)的发酵罐用发酵液的组分以及待添加的70％的总水解产物部分填充至体积操作容量的72％。用于细胞生长和发酵的葡萄糖源是工作实施例1中描述的淀粉水解产物。将温度控制在适合于发酵宿主生物体的值，在这种情况下为34℃。然后用合适的发酵微生物(在这种情况下为经工程化用于产生乳酸的酵母)接种发酵罐。在发酵期间，通过添加氢氧化钙将pH保持在3.1以上。
随着发酵进行，葡萄糖以一定的产率转化为乳酸。通过近红外光谱系统(NIR)(Brueker-Matrix F模型)监测葡萄糖浓度。当如通过NIR所测量葡萄糖降低到小于40g/L时，以0.0.36％至0.032％(酶溶液体积/发酵液体积)的剂量添加如上所述的第二种葡糖淀粉酶。该葡糖淀粉酶的浓度足以进行48小时发酵。较长的批次将需要较少的葡糖淀粉酶，较短的批次需要较多的葡糖淀粉酶。
然后使发酵进一步进行，直到葡萄糖浓度达到10g/L。然后以控制的速率将剩余的30％的总水解产物逐渐添加到发酵罐中，以将葡萄糖保持在8g/L与12g/L之间，如通过NIR所测量。
一旦添加100％的目标右旋糖，就停止水解产物进料并且进行发酵直到葡萄糖降低至0.3g/L以下。如通过适当校准的Shodex SZ5532 Sugar HPLC方法所测量，剩余的碳水化合物特征为大约0.3g/L异麦芽糖、0.2g/L麦芽糖和0.12g/L的潘糖。
工作实施例3：分批发酵方法
发酵液包括水以及使细胞生长所需的足够营养物。发酵液还含有消泡剂以控制发酵中的发泡。
将发酵罐用发酵液的组分以及待添加的100％的总水解产物部分填充至体积操作容量的81％。用于细胞生长和发酵的葡萄糖源是实施例1中描述的淀粉水解产物。将温度控制在适合于发酵宿主生物体的值，在这种情况下为34℃。然后用合适的发酵微生物(在这种情况下为经工程化用于产生乳酸的酵母)接种发酵罐。通过添加氢氧化钙将pH保持在3.1以上。
随着发酵进行，葡萄糖以一定的产率转化为乳酸。通过近红外光谱系统(NIR)(Brueker-Matrix F模型)监测葡萄糖浓度。当如通过NIR所测量葡萄糖已经降低到小于40g/L时，以0.032％至0.36％(酶溶液体积/发酵液体积)的剂量添加如上所述的第二种葡糖淀粉酶。该酶的浓度足以进行48小时发酵。较长的批次将需要较少，较短的批次需要较多。
进行发酵直到葡萄糖降低至0.3g/L以下。如通过适当校准的Shodex SZ5532Sugar HPLC方法所测量，剩余的碳水化合物特征为大约0.3g/L异麦芽糖、0.2g/L麦芽糖和0.12g/L的潘糖。
已经采用的术语和表达被用作描述而非限制的术语，并且不旨在使用这样的术语和表达排除所示出和描述的特征或其部分的任何等同物，但是应当认识到，在本发明的实施例的范围内，各种修改形式是可能的。因此，应当理解，尽管本发明已经由具体实施例和任选特征具体地公开，但是本领域普通技术人员可以采取本文公开的概念的修改形式和变型形式，并且这些修改形式和变型形式被认为在本发明的实施例的范围内。
工作实施例4：水解产物制备
该过程不需要特定的葡糖淀粉酶产物。所描述的工作实施例在糖化步骤中使用购自Novozymes(Bagsvaerd Denmark)的Extenda Go，以及在发酵步骤中使用购自DuPont INC(Wilmington,DE)的Distillase SSF。
淀粉水解产物包括淀粉浆料，在这种情况下是来自Blair Nebraska的Cargill'sWet Corn Mill的玉米淀粉。通过称为液化的方法，用α-淀粉酶和热处理淀粉浆料，并且然后给予时间将淀粉浆料液化成8至13右旋糖当量(D.E.)水解产物。
将液化的水解产物冷却并在线调节pH，因为将其转移到单独的罐中用于称为糖化的过程。在该实施例中，将水解产物冷却至68℃至71℃。在冷却和pH调节完成后，添加第一种葡糖淀粉酶。添加的酶的实际量将取决于设备尺寸和酶本身的活性，在该实施例中为0.025％(酶的体积/糖化罐的体积)。然而，所述方法的糖化步骤进行最少13小时，其中15小时显示良好的性能。一旦添加葡糖淀粉酶并且完全填充糖化罐，将材料搅拌4小时，然后停止搅拌。在此期间，基于存在的总碳水化合物计，反应中的葡萄糖浓度增加到大约15重量％至25重量％。在不搅拌的情况下，持续释放葡萄糖，直到基于存在的总碳水化合物计，其在40重量％至60重量％之间。当总反应时间大于13小时并且基于存在的总碳水化合物计葡萄糖浓度在40重量％至60重量％之间时，认为反应完成。在该步骤期间使用68℃至71℃温度范围有助于防止转化反应达到不期望的>80重量％的右旋糖浓度。
一旦满足4小时搅拌，随后9小时至11小时沉降，13小时至15小时总反应时间和40重量％至60重量％葡萄糖(基于存在的总碳水化合物计)的最低要求，就将部分糖化的水解产物(基于存在的总碳水化合物计，完全糖化通常意味着>95重量％的葡萄糖)转移到存储装置。在不搅拌的情况下在糖化的时间段期间，罐中的不溶性固体朝向容器的顶部漂浮。转移至存储装置以不干扰混合物上层的方式通过容器的底部进行。在转移期间，用直列式浊度计监测材料。浊度测量结果与总悬浮固体相关。一旦测量的总悬浮固体达到3000ppm，就停止转移至淀粉水解产物存储装置，并且将糖化罐中的剩余材料引导到另选的储罐，在该储罐中将其计量加入到设施乙醇发酵过程中。如上文关于直列式浊度计所描述测量总悬浮固体量。将进入存储装置的材料在其到达储罐之前在线加热至至少75℃，以便通过使葡糖淀粉酶失活来防止进一步转化。此时，淀粉水解产物可以与任何商业玉米糖浆产品类似的方式储存或运输。
工作实施例5：补料分批发酵方法
发酵液包括水以及使细胞生长所需的足够营养物。发酵液还含有消泡剂以控制发酵中的发泡。
将容量为约1,000,000L(约290,000加仑)的发酵罐用发酵液的组分以及待添加的70％的总水解产物部分填充至体积操作容量的72％。用于细胞生长和发酵的葡萄糖源是工作实施例1中描述的淀粉水解产物。将温度控制在适合于发酵宿主生物体的值，在这种情况下为34℃。然后用合适的发酵微生物(在这种情况下为经工程化用于产生乳酸的酵母)接种发酵罐。随着发酵进行，通过添加氢氧化钙，将pH保持在4至5(例如4.2至4.6，4.3至4.5)，并且通常在约4.4的pH下。一旦添加足够量的石灰，就允许发酵pH自由下降至期望的最终pH，在该实施例中为3.1。所添加的石灰的量通过发酵结束时预期的乳酸浓度和期望的游离酸水平来确定。
随着发酵进行，葡萄糖以一定的产率转化为乳酸。通过近红外光谱系统(NIR)(Brueker-Matrix F模型)监测葡萄糖浓度。当如通过NIR所测量葡萄糖降低到小于40g/L时，以0.0.36％至0.032％(酶溶液体积/发酵液体积)的剂量添加如上所述的第二种葡糖淀粉酶。添加酶，同时pH仍然控制在4.4pH下。该葡糖淀粉酶的浓度足以进行48小时发酵。较长的批次将需要较少的葡糖淀粉酶，较短的批次需要较多的葡糖淀粉酶。
然后使发酵进一步进行，直到葡萄糖浓度达到10g/L。然后以控制的速率将剩余的30％的总水解产物逐渐添加到发酵罐中，以将葡萄糖保持在8g/L与12g/L之间，如通过NIR所测量。
一旦添加100％的目标右旋糖，就停止水解产物进料并且进行发酵直到葡萄糖降低至0.3g/L以下。如通过适当校准的Shodex SZ5532 Sugar HPLC方法所测量，剩余的碳水化合物特征为大约0.3g/L异麦芽糖、0.2g/L麦芽糖和0.12g/L的潘糖。
示例性实施例
提供以下示例性实施例，其编号不应解释为指定重要性级别：
实施例1提供了一种发酵方法，所述方法包括：
(a)在搅拌下使淀粉水解产物与葡糖淀粉酶接触；
(b)停止所述搅拌以允许沉降形成多相溶液，所述多相溶液的第一相包含糖类组分，所述糖类组分基于所述第一相中存在的总碳水化合物计占约30重量％至约80重量％(例如30重量％至70重量％、30重量％至60重量％)，并且所述多相溶液的第二相包含比所述第一相更高的总悬浮固体量；
(c)引流所述第一相以将所述第一相与所述第二相分离以形成包含所述第一相的第一部分的发酵液；
(d)将至少所述第一相加热至至少70℃的温度；
(e)用微生物发酵所述发酵液以在所述发酵液中产生发酵产物，直到所述发酵液中葡萄糖的浓度为40g/L或更低；
(f)使所述发酵液与葡糖淀粉酶接触；以及
(g)将所述第一相的第二部分添加到所述发酵液中以将所述发酵液中葡萄糖的浓度保持在约1g/L至约20g/L的范围内。
实施例2提供了根据实施例1所述的发酵方法，所述发酵方法还包括：
(h)在根据(a)使所述淀粉水解产物与所述葡糖淀粉酶接触之前使所述淀粉水解产物与α-淀粉酶接触。
实施例3提供了根据实施例1所述的发酵方法，其中在(a)之后，包含所述淀粉水解产物的溶液具有在约1至约15范围内的右旋糖当量数。
实施例4提供了根据实施例1或2中任一项所述的发酵方法，其中在(a)之后，包含所述淀粉水解产物的溶液具有在约8至约13范围内的右旋糖当量数。
实施例5提供了根据实施例1至4中任一项所述的发酵方法，其中在(a)处在搅拌下使所述淀粉水解产物与所述葡糖淀粉酶接触还包括将所述淀粉水解产物加热至至少80℃的温度。
实施例6提供了根据实施例1至5中任一项所述的发酵方法，其中在(a)处在搅拌下使所述淀粉水解产物与所述葡糖淀粉酶接触还包括将所述淀粉水解产物加热至至少100℃的温度。
实施例7提供了根据实施例1至6中任一项所述的发酵方法，其中在(a)处在搅拌下使所述淀粉水解产物与所述葡糖淀粉酶接触还包括将所述淀粉水解产物加热至约80℃至约130℃范围内的温度。
实施例8提供了根据实施例1至7中任一项所述的发酵方法，其中在(a)处所述搅拌包括搅动。
实施例9提供了根据实施例1至8中任一项所述的发酵方法，其中在(a)处所述搅拌进行约3小时至约10小时范围内的时间。
实施例10提供了根据实施例1至9中任一项所述的发酵方法，其中在(a)处所述搅拌进行约5小时至约8小时范围内的时间。
实施例11提供了根据实施例1至10中任一项所述的发酵方法，其中在(b)处所述沉降进行约5小时至约13小时范围内的时间。
实施例12提供了根据实施例1至11中任一项所述的发酵方法，其中在(b)处所述沉降进行约6小时至约10小时范围内的时间。
实施例13提供了根据实施例1至12中任一项所述的发酵方法，其中在(b)处所述沉降进行比搅拌更长的时间量。
实施例14提供了根据实施例1至13中任一项所述的发酵方法，其中所述第二相包含蛋白质、脂质或它们的混合物。
实施例15提供了根据实施例1至14中任一项所述的发酵方法，其中在(g)处将所述第一相的第二部分添加到所述发酵液中在产生所述发酵产物时发生。
实施例16提供了根据实施例1至15中任一项所述的发酵方法，其中所述第二相中的所述悬浮固体的总量为至少1000ppm。
实施例17提供了根据实施例1至16中任一项所述的发酵方法，其中所述第二相的总悬浮固体量为至少3000ppm。
实施例18提供了根据实施例1至17中任一项所述的发酵方法，其中所述第一相的总悬浮固体量小于约3000ppm。
实施例19提供了根据实施例1至18中任一项所述的发酵方法，其中所述第一相的总悬浮固体量小于约1000ppm。
实施例20提供了根据实施例1至19中任一项所述的发酵方法，其中所述第一相的总悬浮固体量小于所述第二相的总悬浮固体量。
实施例21提供了根据实施例1至20中任一项所述的发酵方法，其中当在包含所述多相溶液的罐下游的管道中测量的所述悬浮固体的总量为至少1000ppm时，在(c)处停止引流。
实施例22提供了根据实施例1至21中任一项所述的发酵方法，其中当在包含所述多相溶液的罐下游的管道中测量的所述悬浮固体的总量为至少1300ppm时，在(c)处停止引流。
实施例23提供了根据实施例1至22中任一项所述的发酵方法，其中当在包含所述多相溶液的罐下游的管道中测量的所述悬浮固体的总量在约1000ppm至约5000ppm的范围内时，在(c)处停止引流。
实施例24提供了根据实施例1至23中任一项所述的发酵方法，其中当在包含所述多相溶液的罐下游的管道中测量的所述悬浮固体的总量在约1300ppm至约1500ppm的范围内时，在(c)处停止引流。
实施例25提供了根据实施例1至24中任一项所述的发酵方法，其中在(c)处在所述第一相包含小于3000ppm的总悬浮固体量的点处停止引流。
实施例26提供了根据实施例1至25中任一项所述的发酵方法，其中所述糖类组分包括葡萄糖。
实施例27提供了根据实施例1至26中任一项所述的发酵方法，其中在(d)处将所述第一相加热至至少70℃包括将所述第一相加热至至少80℃。
实施例28提供了根据实施例1至27中任一项所述的发酵方法，其中在(d)处将所述第一相加热至至少70℃包括加热至约80℃至约130℃范围内的温度。
实施例29提供了根据实施例1至28中任一项所述的发酵方法，其中在(c)处引流所述第一相以将所述第一相与所述第二相分离以形成所述发酵液包括从罐的底部引流所述第一相。
实施例30提供了根据实施例1至29中任一项所述的发酵方法，所述发酵方法还包括：
(i)在(c)之后收集用作动物饲料的所述第二相，收集用于乙醇发酵装置的所述第二相原料，加工所述第二相以产生右旋糖当量数为至少95的溶液，或它们的组合。
实施例31提供了根据实施例1至30中任一项所述的发酵方法，其中所述微生物包括真菌、细菌或它们的混合物。
实施例32提供了根据实施例31所述的发酵方法，其中所述真菌包括酵母。
实施例33提供了根据实施例32所述的发酵方法，其中所述酵母包括酿酒酵母、乳酸克鲁维酵母、马克斯克鲁维酵母、解脂耶氏酵母、库德里阿兹威毕赤酵母、粟酒裂殖酵母或它们的混合物。
实施例34提供了根据实施例31至33中任一项所述的发酵方法，其中所述细菌包括链球菌属、乳杆菌属、芽孢杆菌属、埃希氏菌属、沙门氏菌属、奈瑟氏球菌属、醋杆菌属、节杆菌属、曲霉菌属、双歧杆菌属、棒状杆菌属、假单胞菌属或它们的混合物。
实施例35提供了根据实施例1至34中任一项所述的发酵方法，其中所述微生物为工程化微生物。
实施例36提供了根据实施例35所述的发酵方法，其中所述工程化微生物为PDC阴性并且不能产生乙醇的酵母。
实施例37提供了根据实施例1至36中任一项所述的发酵方法，其中在(e)处发酵所述发酵液以产生所述发酵产物，并且其中所述发酵液中所述葡萄糖的浓度为15g/L或更低，并且在(f)处添加葡糖淀粉酶。
实施例38提供了根据实施例1至37中任一项所述的发酵方法，其中在(e)处发酵所述发酵液以产生所述发酵产物，并且其中所述发酵液中所述葡萄糖的浓度为1g/L或更低，并且在(f)处添加葡糖淀粉酶。
实施例39提供了根据实施例1至38中任一项所述的发酵方法，其中在(e)处发酵所述发酵液以产生所述发酵产物，并且其中包含所述第一相的所述第一部分的所述发酵液中所述葡萄糖的浓度在约0.1g/L至约40g/L的范围内，并且在(f)处添加葡糖淀粉酶。
实施例40提供了根据实施例1至39中任一项所述的发酵方法，其中在(e)处发酵包含所述第一相的所述第一部分的所述发酵液以产生所述发酵产物，并且其中所述葡萄糖的浓度在约3g/L至约25g/L的范围内，并且在(f)处添加葡糖淀粉酶。
实施例41提供了根据实施例1至40中任一项所述的发酵方法，其中在(g)处将所述第一相的所述第二部分添加到所述发酵液中以将所述葡萄糖的浓度保持在约8g/L至约12g/L的范围内。
实施例42提供了根据实施例1至41中任一项所述的发酵方法，其中所述发酵产物包含小于约3g/L的乙醇。
实施例43提供了根据实施例1至42中任一项所述的发酵方法，其中所述发酵产物基本上不含乙醇。
实施例44提供了根据实施例1至43中任一项所述的发酵方法，其中当所述发酵液中所述葡萄糖的浓度为0.5g/L或更低时，在(g)之后停止所述发酵。
实施例45提供了根据实施例1至44中任一项所述的发酵方法，其中当所述发酵液中所述葡萄糖的浓度为0.3g/L或更低时，在(g)之后停止所述发酵。
实施例46提供了根据实施例1至45中任一项所述的发酵方法，其中当所述发酵液中所述葡萄糖的浓度在约0g/L至约0.5g/L的范围内时，在(g)之后停止所述发酵。
实施例47提供了根据实施例1至46中任一项所述的发酵方法，其中当所述发酵液中所述葡萄糖的浓度在约0.2g/L至约0.4g/L的范围内时，在(g)之后停止所述发酵。
实施例48提供了根据实施例1至47中任一项所述的发酵方法，其中所述方法在所述第一相中产生小于约1.5g/L的异麦芽糖。
实施例49提供了根据实施例1至48中任一项所述的发酵方法，其中所述方法在所述第一相中产生小于0.05g/L的异麦芽糖。
实施例50提供了根据实施例1至49中任一项所述的发酵方法，其中所述发酵产物包含有机酸或氨基酸、它们的衍生物或它们的盐。
实施例51提供了根据实施例1至49中任一项所述的发酵方法，其中发酵产物所述有机酸或氨基酸包括乳酸、柠檬酸、丙二酸、羟基丁酸、己二酸、赖氨酸、酮-戊二酸、戊二酸、3-羟基-丙酸、琥珀酸、苹果酸、富马酸、衣康酸、粘康酸、甲基丙烯酸和乙酸、它们的衍生物、它们的盐或它们的混合物。
实施例52提供了根据实施例1至51中任一项所述的发酵方法，其中所述方法在(e)、(g)或两者处在所述发酵液中产生至少90g/L的发酵产物。
实施例53提供了根据实施例1至52中任一项所述的发酵方法，其中所述方法在(e)、(g)或两者处在所述发酵液中产生至少120g/L的发酵产物。
实施例54提供了根据实施例1至53中任一项所述的发酵方法，其中所述方法在(e)、(g)或两者处在所述发酵液中产生约100g/L至约130g/L的发酵产物。
实施例55提供了根据实施例1至54中任一项所述的发酵方法，其中所述方法在(e)、(g)或两者处在所述发酵液中产生约90g/L至约150g/L的发酵产物。
实施例56提供了根据实施例1至55中任一项所述的发酵方法，其中通过实时监测系统监测葡萄糖浓度，其中所述实时监测系统与控制所述第一相的所述第一部分、所述第一相的所述第二部分或两者的引入的设备连接。
实施例57提供了根据实施例1至56中任一项所述的发酵方法，其中所述方法不将转葡糖苷酶添加到所述第一相、发酵液或两者中。
实施例58提供了根据实施例1至57中任一项所述的发酵方法，所述发酵方法还包括：
(j)从所述发酵液中过滤所述微生物并回收所述发酵产物。
实施例59提供了根据实施例1至58中任一项所述的发酵方法，其中当所述发酵液中葡萄糖的浓度为40g/L或更低时进行步骤(f)。
实施例60提供了根据实施例1至59中任一项所述的发酵方法，其中以顺序次序进行步骤(a)至步骤(g)。
实施例61提供了一种发酵方法，所述方法包括：
(a)在使淀粉水解产物与葡糖淀粉酶接触之前使所述淀粉水解产物与α-淀粉酶接触，其中所述淀粉水解产物具有在约8至约13范围内的右旋糖当量数；
(b)在搅拌下使所述淀粉水解产物与葡糖淀粉酶接触；
(c)停止搅拌足够量的时间以允许沉降形成多相溶液，所述多相溶液的第一相包含糖类组分，所述糖类组分基于所述第一相中存在的总碳水化合物计占约30重量％至约80重量％(例如30重量％至70重量％、30重量％至60重量％)，并且所述多相溶液的第二相包含比所述第一相更高的总悬浮固体量，其中沉降进行约5小时至约13小时范围内的时间；
(d)引流所述第一相以将所述第一相与所述第二相分离以形成包含所述第一相的第一部分的发酵液；
(e)将至少所述第一相加热至至少70℃的温度；
(f)用PDC阴性工程化酵母发酵所述发酵液以产生至少90g/L的发酵产物，所述发酵产物包含乳酸、柠檬酸、丙二酸、羟基丁酸、己二酸、赖氨酸、酮-戊二酸、戊二酸、3-羟基-丙酸、琥珀酸、苹果酸、富马酸、衣康酸、粘康酸、甲基丙烯酸和乙酸、它们的衍生物、它们的盐或它们的混合物，其中葡萄糖的浓度为40g/L或更低；
(g)使所述第一相与葡糖淀粉酶接触；以及
(h)将所述第一相的第二部分添加到所述发酵液中以将葡萄糖的浓度保持在约1g/L至约20g/L的范围内。
实施例62提供了一种发酵方法，所述方法包括：
(a)在搅拌下使淀粉水解产物与葡糖淀粉酶接触；
(b)停止所述搅拌以允许沉降形成多相溶液，所述多相溶液的第一相包含糖类组分，所述糖类组分基于所述第一相中存在的总碳水化合物计占约30重量％至约80重量％(例如30重量％至70重量％、30重量％至60重量％)，并且所述多相溶液的第二相包含比所述第一相更高的总悬浮固体量；
(c)引流所述第一相以将所述第一相与所述第二相分离以形成包含所述第一相的第一部分的发酵液；
(d)将至少所述第一相加热至至少70℃的温度；
(e)用微生物发酵所述发酵液以在所述发酵液中产生发酵产物，并且其中所述发酵液中葡萄糖的浓度为40g/L或更低；以及
(f)使所述发酵液与葡糖淀粉酶接触。
实施例63提供了根据实施例62所述的方法，所述方法还包括：
(g)将所述第一相的第二部分添加到所述发酵液中以将所述发酵液中葡萄糖的浓度保持在约1g/L至约20g/L的范围内。
实施例64提供了根据实施例62或63中任一项所述的发酵方法，所述发酵方法还包括：
(h)在根据(a)使所述淀粉水解产物与所述葡糖淀粉酶接触之前使所述淀粉水解产物与α-淀粉酶接触。
实施例65提供了根据实施例62所述的发酵方法，其中在(a)之后，包含所述淀粉水解产物的溶液具有在约1至约15范围内的右旋糖当量数。
实施例66提供了根据实施例62至65中任一项所述的发酵方法，其中在(a)之后，包含所述淀粉水解产物的溶液具有在约8至约13范围内的右旋糖当量数。
实施例67提供了根据实施例62至66中任一项所述的发酵方法，其中在(a)处在搅拌下使所述淀粉水解产物与所述葡糖淀粉酶接触还包括将所述淀粉水解产物加热至至少80℃的温度。
实施例68提供了根据实施例62至67中任一项所述的发酵方法，其中在(a)处在搅拌下使所述淀粉水解产物与所述葡糖淀粉酶接触还包括将所述淀粉水解产物加热至至少100℃的温度。
实施例69提供了根据实施例62至68中任一项所述的发酵方法，其中在(a)处在搅拌下使所述淀粉水解产物与所述葡糖淀粉酶接触还包括将所述淀粉水解产物加热至约80℃至约130℃范围内的温度。
实施例70提供了根据实施例62至69中任一项所述的发酵方法，其中在(a)处所述搅拌包括搅动。
实施例71提供了根据实施例62至70中任一项所述的发酵方法，其中在(a)处所述搅拌进行约3小时至约10小时范围内的时间。
实施例72提供了根据实施例62至71中任一项所述的发酵方法，其中在(a)处所述搅拌进行约5小时至约8小时范围内的时间。
实施例73提供了根据实施例62至72中任一项所述的发酵方法，其中在(b)处所述沉降进行约5小时至约13小时范围内的时间。
实施例74提供了根据实施例62至73中任一项所述的发酵方法，其中在(b)处所述沉降进行约6小时至约10小时范围内的时间。
实施例75提供了根据实施例62至74中任一项所述的发酵方法，其中在(b)处所述沉降进行比搅拌更长的时间量。
实施例76提供了根据实施例62至75中任一项所述的发酵方法，其中所述第二相包含蛋白质、脂质或它们的混合物。
实施例77提供了根据实施例63至76中任一项所述的发酵方法，其中在(g)处将所述第一相的第二部分添加到所述发酵液中在产生所述发酵产物时发生。
实施例78提供了根据实施例62至77中任一项所述的发酵方法，其中所述第二相中的所述悬浮固体的总量为至少1000ppm。
实施例79提供了根据实施例62至78中任一项所述的发酵方法，其中所述第二相的总悬浮固体量为至少3000ppm。
实施例80提供了根据实施例62至79中任一项所述的发酵方法，其中所述第一相的总悬浮固体量小于约3000ppm。
实施例81提供了根据实施例62至80中任一项所述的发酵方法，其中所述第一相的总悬浮固体量小于约1000ppm。
实施例82提供了根据实施例62至81中任一项所述的发酵方法，其中所述第一相的总悬浮固体量小于所述第二相的总悬浮固体量。
实施例83提供了根据实施例62至82中任一项所述的发酵方法，其中当在包含所述多相溶液的罐下游的管道中测量的所述悬浮固体的总量为至少1000ppm时，在(c)处停止引流。
实施例84提供了根据实施例62至83中任一项所述的发酵方法，其中当在包含所述多相溶液的罐下游的管道中测量的所述悬浮固体的总量为至少1300ppm时，在(c)处停止引流。
实施例85提供了根据实施例62至84中任一项所述的发酵方法，其中当在包含所述多相溶液的罐下游的管道中测量的所述悬浮固体的总量在约1000ppm至约5000ppm的范围内时，在(c)处停止引流。
实施例86提供了根据实施例62至85中任一项所述的发酵方法，其中当在包含所述多相溶液的罐下游的管道中测量的所述悬浮固体的总量在约1300ppm至约1500ppm的范围内时，在(c)处停止引流。
实施例87提供了根据实施例62至86中任一项所述的发酵方法，其中在(c)处在所述第一相包含小于3000ppm的总悬浮固体量的点处停止引流。
实施例88提供了根据实施例62至87中任一项所述的发酵方法，其中所述糖类组分包括葡萄糖。
实施例89提供了根据实施例62至88中任一项所述的发酵方法，其中在(d)处将所述第一相加热至至少70℃包括将所述第一相加热至至少80℃。
实施例90提供了根据实施例62至89中任一项所述的发酵方法，其中在(d)处将所述第一相加热至至少70℃包括加热至约80℃至约130℃范围内的温度。
实施例91提供了根据实施例62至90中任一项所述的发酵方法，其中在(c)处引流所述第一相以将所述第一相与所述第二相分离以形成所述发酵液包括从罐的底部引流所述第一相。
实施例92提供了根据实施例62至91中任一项所述的发酵方法，所述发酵方法还包括：
(i)在(c)之后收集用作动物饲料的所述第二相，收集用于乙醇发酵装置的所述第二相原料，加工所述第二相以产生右旋糖当量数为至少95的溶液，或它们的组合。
实施例93提供了根据实施例62至92中任一项所述的发酵方法，其中所述微生物包括真菌、细菌或它们的混合物。
实施例94提供了根据实施例93所述的发酵方法，其中所述真菌包括酵母。
实施例95提供了根据实施例94所述的发酵方法，其中所述酵母包括酿酒酵母、乳酸克鲁维酵母、马克斯克鲁维酵母、解脂耶氏酵母、库德里阿兹威毕赤酵母、粟酒裂殖酵母或它们的混合物。
实施例96提供了根据实施例93至95中任一项所述的发酵方法，其中所述细菌包括链球菌属、乳杆菌属、芽孢杆菌属、埃希氏菌属、沙门氏菌属、奈瑟氏球菌属、醋杆菌属、节杆菌属、曲霉菌属、双歧杆菌属、棒状杆菌属、假单胞菌属或它们的混合物。
实施例97提供了根据实施例62至96中任一项所述的发酵方法，其中所述微生物为工程化微生物。
实施例98提供了根据实施例97所述的发酵方法，其中所述工程化微生物为PDC阴性并且不能产生乙醇的酵母。
实施例99提供了根据实施例62至98中任一项所述的发酵方法，其中所述发酵其中在(e)处发酵所述发酵液以产生所述发酵产物，并且其中所述发酵液中所述葡萄糖的浓度为15g/L或更低，并且在(f)处添加葡糖淀粉酶。
实施例100提供了根据实施例62至99中任一项所述的发酵方法，其中在(e)处发酵所述发酵液以产生所述发酵产物，并且其中所述发酵液中所述葡萄糖的浓度为15g/L或更低，并且在(f)处添加葡糖淀粉酶。
实施例101提供了根据实施例62至100中任一项所述的发酵方法，其中在(e)处发酵所述发酵液以产生所述发酵产物，并且其中包含所述第一相的所述第一部分的所述发酵液中所述葡萄糖的浓度在约0.1g/L至约30g/L的范围内，并且在(f)处添加葡糖淀粉酶。
实施例102提供了根据实施例62至101中任一项所述的发酵方法，其中在(e)处发酵包含所述第一相的所述第一部分的所述发酵液以产生所述发酵产物，并且其中所述葡萄糖的浓度在约3g/L至约30g/L的范围内，并且在(f)处添加葡糖淀粉酶。
实施例103提供了根据实施例63至102中任一项所述的发酵方法，其中在(g)处将所述第一相的所述第二部分添加到所述发酵液中以将所述葡萄糖的浓度保持在约8g/L至约12g/L的范围内。
实施例104提供了根据实施例62至103中任一项所述的发酵方法，其中所述发酵产物包含小于约3g/L的乙醇。
实施例105提供了根据实施例62至104中任一项所述的发酵方法，其中所述发酵产物基本上不含乙醇。
实施例106提供了根据实施例62至105中任一项所述的发酵方法，其中当所述发酵液中所述葡萄糖的浓度为0.5g/L或更低时，在(g)之后停止所述发酵。
实施例107提供了根据实施例62至106中任一项所述的发酵方法，其中当所述发酵液中所述葡萄糖的浓度为0.3g/L或更低时，在(g)之后停止所述发酵。
实施例108提供了根据实施例62至107中任一项所述的发酵方法，其中当所述发酵液中所述葡萄糖的浓度在约0g/L至约0.5g/L的范围内时，在(g)之后停止所述发酵。
实施例109提供了根据实施例62至108中任一项所述的发酵方法，其中当所述发酵液中所述葡萄糖的浓度在约0.2g/L至约0.4g/L的范围内时，在(g)之后停止所述发酵。
实施例110提供了根据实施例62至109中任一项所述的发酵方法，其中所述方法在所述第一相中产生小于约0.5g/L的异麦芽糖。
实施例111提供了根据实施例62至110中任一项所述的发酵方法，其中所述方法在所述第一相中产生小于0.05g/L的异麦芽糖。
实施例112提供了根据实施例62至111中任一项所述的发酵方法，其中所述发酵产物包含有机酸或氨基酸、它们的衍生物或它们的盐。
实施例113提供了根据实施例62至112中任一项所述的发酵方法，其中发酵产物所述有机酸或氨基酸包括乳酸、柠檬酸、丙二酸、羟基丁酸、己二酸、赖氨酸、酮-戊二酸、戊二酸、3-羟基-丙酸、琥珀酸、苹果酸、富马酸、衣康酸、粘康酸、甲基丙烯酸和乙酸、它们的衍生物、它们的盐或它们的混合物。
实施例114提供了根据实施例62至113中任一项所述的发酵方法，其中所述方法在(e)、(g)或两者处在所述发酵液中产生至少90g/L的发酵产物。
实施例115提供了根据实施例62至114中任一项所述的发酵方法，其中所述方法在(e)、(g)或两者处在所述发酵液中产生至少120g/L的发酵产物。
实施例116提供了根据实施例62至115中任一项所述的发酵方法，其中所述方法在(e)、(g)或两者处在所述发酵液中产生约100g/L至约130g/L的发酵产物。
实施例117提供了根据实施例62至116中任一项所述的发酵方法，其中所述方法在(e)、(g)或两者处在所述发酵液中产生约90g/L至约150g/L的发酵产物。
实施例118提供了根据实施例63至117中任一项所述的发酵方法，其中通过实时监测系统监测葡萄糖浓度，其中所述实时监测系统与控制所述第一相的所述第一部分、所述第一相的所述第二部分或两者的引入的设备连接。
实施例119提供了根据实施例62至118中任一项所述的发酵方法，其中所述方法不将转葡糖苷酶添加到所述第一相、发酵液或两者中。
实施例120提供了根据实施例62至119中任一项所述的发酵方法，所述发酵方法还包括：
(j)从所述发酵液中过滤所述微生物并回收所述发酵产物。
实施例121提供了根据实施例62至120中任一项所述的发酵方法，其中当所述发酵液中葡萄糖的浓度为40g/L或更低时进行步骤(f)。
实施例122提供了根据实施例62至121中任一项所述的发酵方法，其中以顺序次序进行步骤(a)至步骤(g)。
实施例123提供了一种发酵方法，所述方法包括：
(a)在使淀粉水解产物与葡糖淀粉酶接触之前使所述淀粉水解产物与α-淀粉酶接触，其中所述淀粉水解产物具有在约8至约13范围内的右旋糖当量数；
(b)在搅拌下使所述淀粉水解产物与葡糖淀粉酶接触；
(c)停止搅拌足够量的时间以允许沉降形成多相溶液，所述多相溶液的第一相包含糖类组分，所述糖类组分基于所述第一相中存在的总碳水化合物计占约30重量％至约80重量％(例如30重量％至70重量％、30重量％至60重量％)，并且所述多相溶液的第二相包含比所述第一相更高的总悬浮固体量，其中沉降进行约5小时至约13小时范围内的时间；
(d)引流所述第一相以将所述第一相与所述第二相分离以形成包含所述第一相的第一部分的发酵液；
(e)将至少所述第一相加热至至少70℃的温度；
(f)用PDC阴性工程化酵母发酵所述发酵液以产生至少90g/L的发酵产物，所述发酵产物包含乳酸、柠檬酸、丙二酸、羟基丁酸、己二酸、赖氨酸、酮-戊二酸、戊二酸、3-羟基-丙酸、琥珀酸、苹果酸、富马酸、衣康酸、粘康酸、甲基丙烯酸和乙酸、它们的衍生物、它们的盐或它们的混合物，直到葡萄糖的浓度为40g/L或更低；以及
(g)使所述第一相与葡糖淀粉酶接触。
实施例124提供了一种发酵产物，所述发酵产物根据实施例1至123中任一项所述的方法形成。

Claims (127)

1.一种发酵方法，所述方法包括：
(a)在搅拌下使淀粉水解产物与葡糖淀粉酶接触；
(b)停止所述搅拌以允许沉降形成多相溶液，所述多相溶液的第一相包含糖类组分，所述糖类组分基于所述第一相中存在的总碳水化合物计占约30重量％至约80重量％(例如30重量％至70重量％、30重量％至60重量％)，并且所述多相溶液的第二相包含比所述第一相更高的总悬浮固体量；
(c)引流所述第一相以将所述第一相与所述第二相分离以形成包含所述第一相的第一部分的发酵液；
(d)将至少所述第一相加热到至少70℃的温度；
(e)用微生物发酵所述发酵液以在所述发酵液中产生发酵产物，直到所述发酵液中葡萄糖的浓度为40g/L或更低；
(f)使所述发酵液与葡糖淀粉酶接触；以及
(g)将所述第一相的第二部分添加到所述发酵液中以将所述发酵液中葡萄糖的浓度保持在约1g/L至约20g/L的范围内。
2.根据权利要求1所述的发酵方法，所述发酵方法还包括：
(h)在根据(a)使所述淀粉水解产物与所述葡糖淀粉酶接触之前使所述淀粉水解产物与α-淀粉酶接触。
3.根据权利要求1所述的发酵方法，其中在(a)之后，包含所述淀粉水解产物的溶液具有在约1至约15范围内的右旋糖当量数。
4.根据权利要求1或2中任一项所述的发酵方法，其中在(a)之后，包含所述淀粉水解产物的溶液具有在约8至约13范围内的右旋糖当量数。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的发酵方法，其中在(a)处在搅拌下使所述淀粉水解产物与所述葡糖淀粉酶接触还包括将所述淀粉水解产物加热到至少80℃的温度。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的发酵方法，其中在(a)处在搅拌下使所述淀粉水解产物与所述葡糖淀粉酶接触还包括将所述淀粉水解产物加热到至少100℃的温度。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的发酵方法，其中在(a)处在搅拌下使所述淀粉水解产物与所述葡糖淀粉酶接触还包括将所述淀粉水解产物加热到约80℃至约130℃范围内的温度。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的发酵方法，其中在(a)处所述搅拌包括搅动。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的发酵方法，其中在(a)处所述搅拌进行约3小时至约10小时范围内的时间。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的发酵方法，其中在(a)处所述搅拌进行约5小时至约8小时范围内的时间。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的发酵方法，其中在(b)处所述沉降进行约5小时至约13小时范围内的时间。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的发酵方法，其中在(b)处所述沉降进行约6小时至约10小时范围内的时间。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的发酵方法，其中在(b)处所述沉降进行比搅拌更长的时间量。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的发酵方法，其中所述第二相包含蛋白质、脂质或它们的混合物。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的发酵方法，其中在(g)处将所述第一相的第二部分添加到所述发酵液中在产生所述发酵产物时发生。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的发酵方法，其中所述第二相中的所述悬浮固体的总量为至少1000ppm。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的发酵方法，其中所述第二相的总悬浮固体量为至少3000ppm。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的发酵方法，其中所述第一相的总悬浮固体量小于约3000ppm。
19.根据权利要求1至18中任一项所述的发酵方法，其中所述第一相的总悬浮固体量小于约1000ppm。
20.根据权利要求1至19中任一项所述的发酵方法，其中所述第一相的总悬浮固体量小于所述第二相的总悬浮固体量。
21.根据权利要求1至20中任一项所述的发酵方法，其中当在包含所述多相溶液的罐下游的管道中测量的所述悬浮固体的总量为至少1000ppm时，在(c)处停止引流。
22.根据权利要求1至21中任一项所述的发酵方法，其中当在包含所述多相溶液的罐下游的管道中测量的所述悬浮固体的总量为至少1300ppm时，在(c)处停止引流。
23.根据权利要求1至22中任一项所述的发酵方法，其中当在包含所述多相溶液的罐下游的管道中测量的所述悬浮固体的总量在约1000ppm至约5000ppm的范围内时，在(c)处停止引流。
24.根据权利要求1至23中任一项所述的发酵方法，其中当在包含所述多相溶液的罐下游的管道中测量的所述悬浮固体的总量在约1300ppm至约1500ppm的范围内时，在(c)处停止引流。
25.根据权利要求1至24中任一项所述的发酵方法，其中在(c)处在所述第一相包含小于3000ppm的总悬浮固体量的点处停止引流。
26.根据权利要求1至25中任一项所述的发酵方法，其中所述糖类组分包括葡萄糖。
27.根据权利要求1至26中任一项所述的发酵方法，其中在(d)处将所述第一相加热到至少70℃包括将所述第一相加热到至少80℃。
28.根据权利要求1至27中任一项所述的发酵方法，其中在(d)处将所述第一相加热到至少70℃包括加热到约80℃至约130℃范围内的温度。
29.根据权利要求1至28中任一项所述的发酵方法，其中在(c)处引流所述第一相以将所述第一相与所述第二相分离以形成所述发酵液包括从罐的底部引流所述第一相。
30.根据权利要求1至29中任一项所述的发酵方法，所述发酵方法还包括：
(i)在(c)之后收集用作动物饲料的所述第二相，收集用于乙醇发酵装置的所述第二相原料，加工所述第二相以产生右旋糖当量数为至少95的溶液，或它们的组合。
31.根据权利要求1至30中任一项所述的发酵方法，其中所述微生物包括真菌、细菌或它们的混合物。
32.根据权利要求31所述的发酵方法，其中所述真菌包括酵母。
33.根据权利要求32所述的发酵方法，其中所述酵母包括酿酒酵母、乳酸克鲁维酵母、马克斯克鲁维酵母、解脂耶氏酵母、库德里阿兹威毕赤酵母、粟酒裂殖酵母或它们的混合物。
34.根据权利要求31至33中任一项所述的发酵方法，其中所述细菌包括链球菌属、乳杆菌属、芽孢杆菌属、埃希氏菌属、沙门氏菌属、奈瑟氏球菌属、醋杆菌属、节杆菌属、曲霉菌属、双歧杆菌属、棒状杆菌属、假单胞菌属或它们的混合物。
35.根据权利要求1至34中任一项所述的发酵方法，其中所述微生物为工程化微生物。
36.根据权利要求35所述的发酵方法，其中所述工程化微生物为PDC阴性的酵母。
37.根据权利要求1至36中任一项所述的发酵方法，其中在(e)处发酵所述发酵液以产生所述发酵产物，并且其中所述发酵液中所述葡萄糖的浓度为15g/L或更低，并且在(f)处添加葡糖淀粉酶。
38.根据权利要求1至37中任一项所述的发酵方法，其中在(e)处发酵所述发酵液以产生所述发酵产物，并且其中所述发酵液中所述葡萄糖的浓度为1g/L或更低，并且在(f)处添加葡糖淀粉酶。
39.根据权利要求1至38中任一项所述的发酵方法，其中在(e)处发酵所述发酵液以产生所述发酵产物，并且其中包含所述第一相的所述第一部分的所述发酵液中所述葡萄糖的浓度在约0.1g/L至约40g/L的范围内，并且在(f)处添加葡糖淀粉酶。
40.根据权利要求1至39中任一项所述的发酵方法，其中在(e)处发酵包含所述第一相的所述第一部分的所述发酵液以产生所述发酵产物，并且其中所述葡萄糖的浓度在约3g/L至约25g/L的范围内，并且在(f)处添加葡糖淀粉酶。
41.根据权利要求1至40中任一项所述的发酵方法，其中在(g)处将所述第一相的所述第二部分添加到所述发酵液中以将所述葡萄糖的浓度保持在约8g/L至约12g/L的范围内。
42.根据权利要求1至41中任一项所述的发酵方法，其中所述发酵产物包含小于约3g/L的乙醇。
43.根据权利要求1至42中任一项所述的发酵方法，其中所述发酵产物基本上不含乙醇。
44.根据权利要求1至43中任一项所述的发酵方法，其中当所述发酵液中所述葡萄糖的浓度为0.5g/L或更低时，在(g)之后停止所述发酵。
45.根据权利要求1至44中任一项所述的发酵方法，其中当所述发酵液中所述葡萄糖的浓度为0.3g/L或更低时，在(g)之后停止所述发酵。
46.根据权利要求1至45中任一项所述的发酵方法，其中当所述发酵液中所述葡萄糖的浓度在约0g/L至约0.5g/L的范围内时，在(g)之后停止所述发酵。
47.根据权利要求1至46中任一项所述的发酵方法，其中当所述发酵液中所述葡萄糖的浓度在约0.2g/L至约0.4g/L的范围内时，在(g)之后停止所述发酵。
48.根据权利要求1至47中任一项所述的发酵方法，其中所述方法在所述第一相中产生小于约1.5g/L的异麦芽糖。
49.根据权利要求1至48中任一项所述的发酵方法，其中所述方法在所述第一相中产生小于0.05g/L的异麦芽糖。
50.根据权利要求1至49中任一项所述的发酵方法，其中所述发酵产物包含有机酸或氨基酸、它们的衍生物或它们的盐。
51.根据权利要求1至49中任一项所述的发酵方法，其中发酵产物为有机酸或氨基酸、以及它们的衍生物、它们的盐或它们的混合物，所述有机酸或氨基酸包括乳酸、柠檬酸、丙二酸、羟基丁酸、己二酸、赖氨酸、酮-戊二酸、戊二酸、3-羟基-丙酸、琥珀酸、苹果酸、富马酸、衣康酸、粘康酸、甲基丙烯酸和乙酸。
52.根据权利要求1至51中任一项所述的发酵方法，其中所述方法在(e)、(g)或两者处在所述发酵液中产生至少90g/L的发酵产物(例如，至少90g/L的乳酸或其盐)。
53.根据权利要求1至52中任一项所述的发酵方法，其中所述方法在(e)、(g)或两者处在所述发酵液中产生至少120g/L的发酵产物(例如，至少120g/L乳酸或其盐)。
54.根据权利要求1至53中任一项所述的发酵方法，其中所述方法在(e)、(g)或两者处在所述发酵液中产生约100g/L至约130g/L的发酵产物。
55.根据权利要求1至54中任一项所述的发酵方法，其中所述方法在(e)、(g)或两者处在所述发酵液中产生约90g/L至约150g/L的发酵产物。
56.根据权利要求1至55中任一项所述的发酵方法，其中通过实时监测系统监测葡萄糖浓度，其中所述实时监测系统与控制所述第一相的所述第一部分、所述第一相的所述第二部分或两者的引入的设备连接。
57.根据权利要求1至56中任一项所述的发酵方法，其中所述方法不将转葡糖苷酶添加到所述第一相、发酵液或两者中。
58.根据权利要求1至57中任一项所述的发酵方法，所述发酵方法还包括：
(j)从所述发酵液中过滤所述微生物并回收所述发酵产物。
59.根据权利要求1至58中任一项所述的发酵方法，其中当所述发酵液中葡萄糖的浓度为40g/L或更低时进行步骤(f)。
60.根据权利要求1至59中任一项所述的发酵方法，其中以顺序次序进行步骤(a)至步骤(g)。
61.一种发酵方法，所述方法包括：
(a)在使淀粉水解产物与葡糖淀粉酶接触之前使所述淀粉水解产物与α-淀粉酶接触，其中所述淀粉水解产物具有在约8至约13范围内的右旋糖当量数；
(b)在搅拌下使所述淀粉水解产物与葡糖淀粉酶接触；
(c)停止搅拌足够量的时间以允许沉降形成多相溶液，所述多相溶液的第一相包含糖类组分，所述糖类组分基于所述第一相中存在的总碳水化合物计占约30重量％至约80重量％(例如30重量％至70重量％、30重量％至60重量％)，并且所述多相溶液的第二相包含比所述第一相更高的总悬浮固体量，其中沉降进行约5小时至约13小时范围内的时间；
(d)引流所述第一相以将所述第一相与所述第二相分离以形成包含所述第一相的第一部分的发酵液；
(e)将至少所述第一相加热到至少70℃的温度；
(f)用PDC阴性工程化酵母发酵所述发酵液以产生发酵产物，所述发酵产物包含乳酸、柠檬酸、丙二酸、羟基丁酸、己二酸、赖氨酸、酮-戊二酸、戊二酸、3-羟基-丙酸、琥珀酸、苹果酸、富马酸、衣康酸、粘康酸、甲基丙烯酸和乙酸、它们的衍生物、它们的盐或它们的混合物，其中葡萄糖的浓度为40g/L或更低；
(g)使所述第一相与葡糖淀粉酶接触；
(h)将所述第一相的第二部分添加到所述发酵液中以将葡萄糖的浓度保持在约1g/L至约20g/L的范围内；以及
(i)产生至少90g/L的所述发酵产物。
62.一种发酵方法，所述方法包括：
(a)在搅拌下使淀粉水解产物与葡糖淀粉酶接触；
(b)停止所述搅拌以允许沉降形成多相溶液，所述多相溶液的第一相包含糖类组分，所述糖类组分基于所述第一相中存在的总碳水化合物计占约30重量％至约80重量％(例如30重量％至70重量％、30重量％至60重量％)，并且所述多相溶液的第二相包含比所述第一相更高的总悬浮固体量；
(c)引流所述第一相以将所述第一相与所述第二相分离以形成包含所述第一相的第一部分的发酵液；
(d)将至少所述第一相加热到至少70℃的温度；
(e)用微生物发酵所述发酵液以在所述发酵液中产生发酵产物，并且其中所述发酵液中葡萄糖的浓度为40g/L或更低；以及
(f)使所述发酵液与葡糖淀粉酶接触。
63.根据权利要求62所述的方法，所述方法还包括：
(g)将所述第一相的第二部分添加到所述发酵液中以将所述发酵液中葡萄糖的浓度保持在约1g/L至约20g/L的范围内。
64.根据权利要求62或63中任一项所述的发酵方法，所述发酵方法还包括：
(h)在根据(a)使所述淀粉水解产物与所述葡糖淀粉酶接触之前使所述淀粉水解产物与α-淀粉酶接触。
65.根据权利要求62所述的发酵方法，其中在(a)之后，包含所述淀粉水解产物的溶液具有在约1至约15范围内的右旋糖当量数。
66.根据权利要求62至65中任一项所述的发酵方法，其中在(a)之后，包含所述淀粉水解产物的溶液具有在约8至约13范围内的右旋糖当量数。
67.根据权利要求62至66中任一项所述的发酵方法，其中在(a)处在搅拌下使所述淀粉水解产物与所述葡糖淀粉酶接触还包括将所述淀粉水解产物加热到至少80℃的温度。
68.根据权利要求62至67中任一项所述的发酵方法，其中在(a)处在搅拌下使所述淀粉水解产物与所述葡糖淀粉酶接触还包括将所述淀粉水解产物加热到至少100℃的温度。
69.根据权利要求62至68中任一项所述的发酵方法，其中在(a)处在搅拌下使所述淀粉水解产物与所述葡糖淀粉酶接触还包括将所述淀粉水解产物加热到约80℃至约130℃范围内的温度。
70.根据权利要求62至69中任一项所述的发酵方法，其中在(a)处所述搅拌包括搅动。
71.根据权利要求62至70中任一项所述的发酵方法，其中在(a)处所述搅拌进行约3小时至约10小时范围内的时间。
72.根据权利要求62至71中任一项所述的发酵方法，其中在(a)处所述搅拌进行约5小时至约8小时范围内的时间。
73.根据权利要求62至72中任一项所述的发酵方法，其中在(b)处所述沉降进行约5小时至约13小时范围内的时间。
74.根据权利要求62至73中任一项所述的发酵方法，其中在(b)处所述沉降进行约6小时至约10小时范围内的时间。
75.根据权利要求62至74中任一项所述的发酵方法，其中在(b)处所述沉降进行比搅拌更长的时间量。
76.根据权利要求62至75中任一项所述的发酵方法，其中所述第二相包含蛋白质、脂质或它们的混合物。
77.根据权利要求63至76中任一项所述的发酵方法，其中在(g)处将所述第一相的第二部分添加到所述发酵液中在产生所述发酵产物时发生。
78.根据权利要求62至77中任一项所述的发酵方法，其中所述第二相中的所述悬浮固体的总量为至少1000ppm。
79.根据权利要求62至78中任一项所述的发酵方法，其中所述第二相的总悬浮固体量为至少3000ppm。
80.根据权利要求62至79中任一项所述的发酵方法，其中所述第一相的总悬浮固体量小于约3000ppm。
81.根据权利要求62至80中任一项所述的发酵方法，其中所述第一相的总悬浮固体量小于约1000ppm。
82.根据权利要求62至81中任一项所述的发酵方法，其中所述第一相的总悬浮固体量小于所述第二相的总悬浮固体量。
83.根据权利要求62至82中任一项所述的发酵方法，其中当在包含所述多相溶液的罐下游的管道中测量的所述悬浮固体的总量为至少1000ppm时，在(c)处停止引流。
84.根据权利要求62至83中任一项所述的发酵方法，其中当在包含所述多相溶液的罐下游的管道中测量的所述悬浮固体的总量为至少1300ppm时，在(c)处停止引流。
85.根据权利要求62至84中任一项所述的发酵方法，其中当在包含所述多相溶液的罐下游的管道中测量的所述悬浮固体的总量在约1000ppm至约5000ppm的范围内时，在(c)处停止引流。
86.根据权利要求62至85中任一项所述的发酵方法，其中当在包含所述多相溶液的罐下游的管道中测量的所述悬浮固体的总量在约1300ppm至约1500ppm的范围内时，在(c)处停止引流。
87.根据权利要求62至86中任一项所述的发酵方法，其中在(c)处在所述第一相包含小于3000ppm的总悬浮固体量的点处停止引流。
88.根据权利要求62至87中任一项所述的发酵方法，其中所述糖类组分包括葡萄糖。
89.根据权利要求62至88中任一项所述的发酵方法，其中在(d)处将所述第一相加热到至少70℃包括将所述第一相加热到至少80℃。
90.根据权利要求62至89中任一项所述的发酵方法，其中在(d)处将所述第一相加热到至少70℃包括加热到约80℃至约130℃范围内的温度。
91.根据权利要求62至90中任一项所述的发酵方法，其中在(c)处引流所述第一相以将所述第一相与所述第二相分离以形成所述发酵液包括从罐的底部引流所述第一相。
92.根据权利要求62至91中任一项所述的发酵方法，所述发酵方法还包括：
(i)在(c)之后收集用作动物饲料的所述第二相，收集用于乙醇发酵装置的所述第二相原料，加工所述第二相以产生具有右旋糖当量数为至少95的溶液，或它们的组合。
93.根据权利要求62至92中任一项所述的发酵方法，其中所述微生物包括真菌、细菌或它们的混合物。
94.根据权利要求93所述的发酵方法，其中所述真菌包括酵母。
95.根据权利要求94所述的发酵方法，其中所述酵母包括酿酒酵母、乳酸克鲁维酵母、马克斯克鲁维酵母、解脂耶氏酵母、库德里阿兹威毕赤酵母、粟酒裂殖酵母或它们的混合物。
96.根据权利要求93至95中任一项所述的发酵方法，其中所述细菌包括链球菌属、乳杆菌属、芽孢杆菌属、埃希氏菌属、沙门氏菌属、奈瑟氏球菌属、醋杆菌属、节杆菌属、曲霉菌属、双歧杆菌属、棒状杆菌属、假单胞菌属或它们的混合物。
97.根据权利要求62至96中任一项所述的发酵方法，其中所述微生物为工程化微生物。
98.根据权利要求97所述的发酵方法，其中所述工程化微生物为PDC阴性的酵母。
99.根据权利要求62至98中任一项所述的发酵方法，其中所述发酵其中在(e)处发酵所述发酵液以产生所述发酵产物，并且其中所述发酵液中所述葡萄糖的浓度为15g/L或更低，并且在(f)处添加葡糖淀粉酶。
100.根据权利要求62至99中任一项所述的发酵方法，其中在(e)处发酵所述发酵液以产生所述发酵产物，并且其中所述发酵液中所述葡萄糖的浓度为15g/L或更低，并且在(f)处添加葡糖淀粉酶。
101.根据权利要求62至100中任一项所述的发酵方法，其中在(e)处发酵所述发酵液以产生所述发酵产物，并且其中包含所述第一相的所述第一部分的所述发酵液中所述葡萄糖的浓度在约0.1g/L至约30g/L的范围内，并且在(f)处添加葡糖淀粉酶。
102.根据权利要求62至101中任一项所述的发酵方法，其中在(e)处发酵包含所述第一相的所述第一部分的所述发酵液以产生所述发酵产物，并且其中所述葡萄糖的浓度在约3g/L至约30g/L的范围内，并且在(f)处添加葡糖淀粉酶。
103.根据权利要求63至102中任一项所述的发酵方法，其中在(g)处将所述第一相的所述第二部分添加到所述发酵液中以将所述葡萄糖的浓度保持在约8g/L至约12g/L的范围内。
104.根据权利要求62至103中任一项所述的发酵方法，其中所述发酵产物包含小于约3g/L的乙醇。
105.根据权利要求62至104中任一项所述的发酵方法，其中所述发酵产物基本上不含乙醇。
106.根据权利要求62至105中任一项所述的发酵方法，其中当所述发酵液中所述葡萄糖的浓度为0.5g/L或更低时，在(g)之后停止所述发酵。
107.根据权利要求62至106中任一项所述的发酵方法，其中当所述发酵液中所述葡萄糖的浓度为0.3g/L或更低时，在(g)之后停止所述发酵。
108.根据权利要求62至107中任一项所述的发酵方法，其中当所述发酵液中所述葡萄糖的浓度在约0g/L至约0.5g/L的范围内时，在(g)之后停止所述发酵。
109.根据权利要求62至108中任一项所述的发酵方法，其中当所述发酵液中所述葡萄糖的浓度在约0.2g/L至约0.4g/L的范围内时，在(g)之后停止所述发酵。
110.根据权利要求62至109中任一项所述的发酵方法，其中所述方法在所述第一相中产生小于约0.5g/L的异麦芽糖。
111.根据权利要求62至110中任一项所述的发酵方法，其中所述方法在所述第一相中产生小于0.05g/L的异麦芽糖。
112.根据权利要求62至111中任一项所述的发酵方法，其中所述发酵产物包含有机酸或氨基酸、它们的衍生物或它们的盐。
113.根据权利要求62至112中任一项所述的发酵方法，其中发酵产物所述有机酸或氨基酸包括乳酸、柠檬酸、丙二酸、羟基丁酸、己二酸、赖氨酸、酮-戊二酸、戊二酸、3-羟基-丙酸、琥珀酸、苹果酸、富马酸、衣康酸、粘康酸、甲基丙烯酸和乙酸、它们的衍生物、它们的盐或它们的混合物。
114.根据权利要求62至113中任一项所述的发酵方法，其中所述方法在(e)、(g)或两者处在所述发酵液中产生至少90g/L的发酵产物。
115.根据权利要求62至114中任一项所述的发酵方法，其中所述方法在(e)、(g)或两者处在所述发酵液中产生至少120g/L的发酵产物。
116.根据权利要求62至115中任一项所述的发酵方法，其中所述方法在(e)、(g)或两者处在所述发酵液中产生约100g/L至约130g/L的发酵产物。
117.根据权利要求62至116中任一项所述的发酵方法，其中所述方法在(e)、(g)或两者处在所述发酵液中产生约90g/L至约150g/L的发酵产物。
118.根据权利要求63至117中任一项所述的发酵方法，其中通过实时监测系统监测葡萄糖浓度，其中所述实时监测系统与控制所述第一相的所述第一部分、所述第一相的所述第二部分或两者的引入的设备连接。
119.根据权利要求62至118中任一项所述的发酵方法，其中所述方法不将转葡糖苷酶添加到所述第一相、发酵液或两者中。
120.根据权利要求62至119中任一项所述的发酵方法，所述发酵方法还包括：
(j)从所述发酵液中过滤所述微生物并回收所述发酵产物。
121.根据权利要求62至120中任一项所述的发酵方法，其中当所述发酵液中葡萄糖的浓度为40g/L或更低时进行步骤(f)。
122.根据权利要求62至121中任一项所述的发酵方法，其中以顺序次序进行步骤(a)至步骤(f)。
123.一种发酵方法，所述方法包括：
(a)在使淀粉水解产物与葡糖淀粉酶接触之前使所述淀粉水解产物与α-淀粉酶接触，其中所述淀粉水解产物具有在约8至约13范围内的右旋糖当量数；
(b)在搅拌下使所述淀粉水解产物与葡糖淀粉酶接触；
(c)停止搅拌足够量的时间以允许沉降形成多相溶液，所述多相溶液的第一相包含糖类组分，所述糖类组分基于所述第一相中存在的总碳水化合物计占约30重量％至约80重量％(例如30重量％至70重量％、30重量％至60重量％)，并且所述多相溶液的第二相包含比所述第一相更高的总悬浮固体量，其中沉降进行约5小时至约13小时范围内的时间；
(d)引流所述第一相以将所述第一相与所述第二相分离以形成包含所述第一相的第一部分的发酵液；
(e)将至少所述第一相加热到至少70℃的温度；
(f)用PDC阴性工程化酵母发酵所述发酵液以产生包含浓度为至少50g/L、60g/L、70g/L、80g/L或90g/L的乳酸、其盐或其混合物的发酵产物，直到葡萄糖的浓度为40g/L或更低；以及
(g)使所述发酵液与葡糖淀粉酶接触；
(h)任选地将所述第一相的第二部分添加到所述发酵液中；以及
(h)产生至少90g/L(例如，至少100g/L、至少110g/L、至少120g/L、至少125g/L)的乳酸、其盐或其混合物。
124.根据权利要求123所述的发酵，其中在步骤(g)期间添加碱，例如石灰(氢氧化钙)以保持期望的pH，例如4至5、4.2至4.6，或4.3至4.5的pH。
125.根据权利要求1至60和权利要求62至122中任一项所述的发酵方法，其中步骤(a)期间的温度为60℃至75℃，例如65℃至75℃、66℃至73℃、67℃至72℃、68℃至71℃。
126.根据权利要求61、123和124中任一项所述的发酵方法，其中步骤(b)期间的温度为60℃至75℃，例如65℃至75℃、66℃至73℃、67℃至72℃、68℃至71℃。
127.一种发酵产物，所述发酵产物根据权利要求1至126中任一项所述的方法形成。
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