ES2221934T3 - Nuevas enzimas lipoliticas. - Google Patents

Abstract

SE REVELAN UNAS NOVEDOSAS ENZIMAS LIPOLITICAS CAPACES DE ELIMINAR UNA CONSIDERABLE CANTIDAD DE GRASA DE UN RETAL MANCHADO DE GRASA EN UN LAVADO DE CICLO UNICO. LAS ENZIMAS LIPOLITICAS PREFERIDAS SON VARIANTES DE LA LIPASA DE HUMICOLA LANUGINOSA QUE PUEDE SER PREPARADA POR TECNICAS RECOMBINANTES DE ADN. LAS ENZIMAS SE UTILIZAN CON EXITO EN COMPOSICIONES DETERGENTES.

Description

Nuevas enzimas lipolíticas.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a nuevas enzimas lipolíticas que son capaces de eliminar una cantidad sustancial de materia grasa durante un lavado de un ciclo.

Antecedentes de la invención

Durante varios años las enzimas lipolíticas han sido usadas como enzimas detergentes, es decir, para eliminar manchas lipídicas o grasas de la ropa y otros textiles. Por ejemplo, se han sugerido varias lipasas microbianas como enzimas detergentes. Ejemplos de tales lipasas comprenden una lipasa Humicola lanuginosa, p. ej. descrita en EP 258 068 y EP 305 216, una lipasa Rhizomucor miehei, p. ej. como se describe en EP 238 023 y Boel, et al., Lipids 23, 701-706, 1988, enzimas lipolíticas Absidia sp. (WO 96/13578), una lipasa Candida, por ejemplo una lipasa C. antarctica, p. ej. la lipasa C. antarctica A o B descritas en EP 214 761, una lipasa Pseudomonas, por ejemplo una lipasa Ps. alcaligenes y Ps. pseudoalcaligenes, p. ej. como se describe en EP 218 272, una lipasa Ps. cepacia, p. ej. como se describe en EP 331 376, una lipasa Pseudomonas sp. como la descrita en WO95/14783, una lipasa Bacillus, p. ej. una lipasa B. subtilis (Dartois et al., 1993), una lipasa B. stearothermophilus (JP 64/744992) y una lipasa B. pumilus (EP 91 00664).

Además, se han descrito varias lipasas clonadas, que incluyen la lipasa Penicillium camembertii descrita por Yamaguchi, S. et al., 1991, la lipasa Geotricum candidum (Schimada, Y. et al., 1989, Schrag, J.D et al (1991) Nature 351, p.761), y varias lipasas Rhizopus, como una lipasa R. delemar (R.D. Joerger y M.J.Hass (1993), Lipids 28 p. 81-88), una lipasa R. niveus (W. Kugimiia et al. (1992), Biosci. Biotech. Biochem. 5, p. 716-719), R. javinicus (W. Uyttenbroeck et al. (1993) Biol. chem. Hoppe-Seyler 374, p. 245-254) y una R. oryzae (Haas, M.J., Allen, J. y Berka, T.R. (1991) Gene 109, p.107-113) que tiene una secuencia sustancialmente idéntica a las otras lipasas Rhizopus.

Otros tipos de enzimas lipolíticas que se han sugerido como enzimas detergentes comprenden las denominadas cutinasas, p. ej. derivadas de Pseudomonas mendocina, como se describe en WO 88/09367, o una cutinasa derivada de Fusarium solani pisi (p. ej. descrita en WO 90/09446).

En los últimos años se han intentado preparar variantes de lipasas con mejores propiedades para objetivos detergentes. Por ejemplo, WO 92/05249 expone variantes de lipasas con propiedades mejoradas, en las que determinadas características de enzimas lipasa de tipo salvaje han sido cambiadas por modificaciones específicas, es decir dirigidas al sitio, de sus secuencias de aminoácidos. Más específicamente, se han descrito variantes de lipasas, en las que uno o más residuos de aminoácidos de la denominada zona de contacto lipídica de la lipasa madre han sido modificados.

WO 94/01541 describe variantes de lipasa con propiedades mejoradas, en las que un residuo aminoácido que ocupa una posición fundamental con respecto al sitio activo de la lipasa ha sido modificado.

EP 407 225 expone variantes de lipasa con una resistencia mejorada a las enzimas proteolíticas, las cuales han sido preparadas por modificaciones de aminoácidos definidas específicamente.

EP 260 105 describe hidrolasas en las que ha sido sustituido un residuo aminoácido dentro de 15 \ring{A} desde el sitio activo.

WO 95/35381 expone variantes de lipasa Pseudomonas sp., en particular variantes de lipasa P. glumae y P. pseudoalcaligenes, que han sido modificadas para aumentar la hidrofobicidad en la superficie de la enzima.

WO 96/00292 expone variantes de lipasa Pseudomonas sp., en particular variantes de lipasa P. glumae y P. pseudoalcaligenes, que han sido modificadas para mejorar la compatibilidad de la enzima con agentes tensioactivos aniónicos,

WO 95/30744 expone lipasas mutantes, como la lipasas Pseudomonas sp. que han sido modificadas para obtener una resistencia aumentada a los agentes tensioactivos.

WO 94/25578 expone lipasas mutantes que comprenden al menos una sustitución de metionina correspondiente a la posición 21 en la lipasa P. pseudoalcaligenes, en particular a leucina, serina o alanina.

Todas las variantes de lipasas anteriormente mencionadas han sido construidas usando mutagénesis dirigida y dando como resultado una modificación de residuos de aminoácidos específicos, los cuales han sido elegidos o bien basándose en su tipo o bien basándose en su ubicación en la estructura secundaria o terciaria de la lipasa madre.

Un enfoque alternativo para construir mutantes o variantes de una proteína dada se basa en la mutagénesis aleatoria. Por ejemplo, US 4,898,331 y WO 93/01285 describen este tipo de técnicas.

WO 95/22615 expone variantes de enzimas lipolíticas que tienen un rendimiento en el lavado mejorado, las variantes siendo preparadas por n método que implica someter una secuencia de ADN que codifica la enzima lipolítica madre a mutagénesis aleatoria y seleccionar las variantes con una dependencia menor al calcio y/o una tolerancia mejorada a un detergente o a uno o más componentes detergentes en comparación con la enzima lipolítica madre.

WO 95/09909 expone, entre otras cosas, lipasas o mutantes de lipasas modificadas químicamente que tienen un pl más elevado que la enzima modificada correspondiente.

Un inconveniente de todas las enzimas lipolíticas detergentes descritas hasta ahora es que ejercen su mejor efecto de eliminación de grasa después de más de un ciclo de lavado, supuestamente porque las enzimas lipolíticas conocidas, cuando se depositan sobre las manchas e grasa que deben ser eliminadas, son más activas durante un periodo determinado del proceso de secado que durante el propio proceso de lavado (Gormsen et al., in Proceedings of the 3rd World Conference on Detergents, AOCS press, 1993, pp 198-20). Esto tiene la consecuencia práctica de que son necesarios al menos dos ciclos de lavado (separados por un periodo suficiente de secado) para obtener una eliminación sustancial de las manchas de grasa.

Se han descrito algunas enzimas lipolítica que supuestamente son capaces de eliminar la materia grasa durante el primer ciclo de lavado. Así, WO 94/03578 expone una composición de detergente que, además de varios componentes detergentes, contiene una enzima que se supone capaz de exhibir una actividad lipolítica sustancial durante el ciclo principal de un proceso de lavado. Ejemplos de enzimas lipolíticas que supuestamente exhiben la actividad anterior comprenden cutinasas específicas de tallos, como la cutinasa Fusarium solani pis, Fusarium roseum culmorum, Rhizoctonia solani y Alternarla brassicicola. No obstante, cuando se evalúan bajo condiciones de lavado reales ninguna de estas enzimas es capaz de eliminar cantidades sustanciales de una mancha de grasa durante un proceso de lavado de un ciclo (ver los ejemplos posteriores).

Por tanto, existe la necesidad de enzimas lipolíticas que bajo condiciones de lavado reales sean capaces de eliminar cantidades sustanciales de materia grasa durante un ciclo de lavado.

Resumen de la invención

Los presentes inventores han identificado y construido ahora sorprendentemente una nueva clase de enzimas lipolíticas que son capaces de eliminar cantidades sustanciales de una materia grasa durante un ciclo de lavado llevado a cabo bajo condiciones de lavado reales. La presente invención se basa en este descubrimiento.

En consecuencia, en un primer aspecto la invención se refiere a una enzima lipolítica que, cuando está presente en la composición de detergente A y/o B definida aquí, es capaz de eliminar al menos un 15% más de grasa de una muestra de una mancha de manteca de cerdo que la misma composición de detergente sin la enzima, en un ensayo de lavado de un ciclo que comprende el sometimiento de 7 muestras de algodón con manchas de manteca de cerdo (9 X 9 cm) por vaso de precipitación a un lavado de un ciclo en un Terg-O-to-Meter (TOM) con termostato, cada vaso de precipitación contiendo 1000 ml de agua con 3.2mM de Cae^{2+}/Mg^{2+} (en una proporción de 5:1) y 5 g/l de dicha composición de detergente, pH 10, y comprendiendo 12500 LU/l de la enzima lipolítica, el tratamiento de lavado siendo realizado durante 20 minutos a una temperatura de 30ºC, seguido de un aclarado durante 15 minutos con agua corriente del grifo y un secado tendido durante la noche a temperatura ambiente, y una posterior extracción y cuantificación de la materia grasa en las muestras mediante extracción Soxhlet.

La composición de detergente A y/o B y el ensayo de lavado de un ciclo están mejor descritos en la sección de Materiales y Métodos incluida aquí.

La presente invención constituye la primera demostración real del sorprendente hecho de que es posible desarrollar (identificar y/o crear) enzimas lipolíticas de primer lavado. Así, lo que hasta ahora se consideraba imposible (basándose en varios años de intensa investigación por parte de varios equipos de investigadores en todo el mundo (como se refleja por el número de solicitudes de esperanzadas patentes depositadas en este campo, tal y como se ha mencionado anteriormente)) ahora se ha mostrado como algo posible.

Los presentes inventores han desarrollado métodos muy convenientes y satisfactorios para crear enzimas lipolíticas de primer lavado.

En consecuencia, en un segundo aspecto importante la invención se refiere a un método para preparar una enzima lipolítica mutada de primer lavado, el cual comprende al menos las fases siguientes:

(a) sometimiento a mutagénesis de una secuencia de ADN que codifica una enzima lipolítica madre, convenientemente mutagénesis aleatoria, para formar una variedad de secuencias de ADN mutadas;

(b) expresión de las secuencias de ADN mutadas en células huésped;

(c) selección de las células huésped que expresan una enzima lipolítica mutada con una menor dependencia al calcio y/o una tolerancia mejorada a un detergente o a un componente de detergente en comparación con la enzima lipolítica madre; y

(d) selección de una enzima lipolítica mutada entre aquellas que resultan de la fase (c) la cual, cuando está presente en la composición de detergente A y/o B en una concentración de 12500 LU/l, es capaz de eliminar al menos un 15% más de grasa de una muestra de una mancha de manteca de cerdo que la misma composición de detergente sin la enzima, en el ensayo de lavado de un ciclo anteriormente descrito.

En otro aspecto, la invención se refiere a un método para preparar una enzima lipolítica mutada de primer lavado, el cual comprende al menos las fases siguientes:

(a) construcción de secuencias de ADN mutadas mediante la combinación de una secuencia de ADN que codifica una primera enzima lipolítica madre y una secuencia de ADN que codifica una segunda enzima lipolítica madre, y opcionalmente otras secuencias de ADN que codifican una tercera (y opcionalmente más) enzimas lipolíticas madre, las secuencias de ADN siendo lo bastante homólogas para permitir que tenga lugar una recombinación entre partes de las secuencias completas de ADN,

(b) expresión de las secuencias de ADN mutadas resultantes en células huésped, y

(c) selección de una enzima lipolítica mutada codificada por una secuencia de ADN mutada que, cuando está presente en la composición de detergente A o B en una concentración de 12500 LU/l, es capaz de eliminar al menos un 15% más de grasa de una muestra de una macha de manteca de cerdo que la misma composición de detergente sin la enzima, en el lavado de un ciclo anteriormente descrito.

En una forma de realización preferida, los métodos según el segundo y el tercer aspecto de la invención están combinados, es decir, una enzima lipolítica mutada que es resultado del método del segundo aspecto es usada como enzima madre en el método según el tercer aspecto.

En otro aspecto, la invención se refiere a una construcción de ADN que comprende una secuencia de ADN que codifica una enzima lipolítica de primer lavado, tal y como se ha definido anteriormente.

En otro aspecto más, la invención se refiere a un vector de expresión recombinante que incluye la construcción del ADN, a una célula transformada con la construcción del ADN o el vector, así como a un método para la producción de una enzima lipolítica de primer lavado mediante el cultivo de dicha célula bajo condiciones propicias para la producción de la enzima, después del cual la enzima es recuperada del cultivo.

En unos aspectos finales, la invención se refiere al uso de una enzima lipolítica de primer lavado como enzima detergente, en particular para el lavado o el lavado de la vajilla, y a un aditivo de detergente y a una composición de detergente que incluyen la enzima.

Breve descripción de los dibujos

La Fig.1 muestra el plásmido pYESHL,

La Fig. 2 el plásmido pAO1,

La Fig. 3 el plásmido pAHL,

Las Figs 4 y 5 una ilustración gráfica de un método de mutagénesis por PCR,

La Fig. 6 el plásmido pJSO37;

La Fig. 7 la construcción del plásmido pDM177,

La Figura 8 la construcción del vector de Aspergillus pCaHj485

La Figura 9 muestra la secuencia original de la lipasa Absidia reflexa ATTC 44896. La codificación triple para la primera serina de los aminoácidos del NL127 maduro, así como el codón de parada están subrayados.

La Figura 10 muestra la secuencia de Absidia reflexa ATTC 44896 en el contexto del vector de expresión pTiKO5 de una levadura.

La Figura 11 muestra la secuencia señal del factor de acoplamiento \alpha1.

Definiciones y antecedentes sobre la estructura de la lipasa Definiciones de los términos usados en la presente solicitud

En el presente contexto el término "enzima lipolítica" indica una enzima clasificada con el Número de Clasificación de Enzimas E.C. 3.1.1 (Hidrolasas de éster carboxílico) según las "Recommendations (1992) of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology (IUBMB)". Por tanto, las enzimas lipolíticas exhiben actividad hidrolítica hacia al menos uno de los tipos de enlaces de éster presentes en al menos uno de los siguientes lípidos: mono-, di- y triglicéridos, fosfolípidos (todas las clases), tioésteres, ésteres de colesterol, ésteres de cera, cutina, suberina, ésteres sintéticos, etc. (cf. los diferentes tipos de enlaces de éster mencionados en el contexto de las E.C. 3.1.1).

En consecuencia, la enzima lipolítica puede ser, p. ej. lo que de forma convencional se ha denominado una lipasa, una fosfolipasa, una esterasa o una cutinasa. El término "enzima lipolítica" abarca enzimas de origen natural, así como enzimas que, en comparación con una enzima de origen natural, han sido modificadas, p. ej. mediante la modificación de uno o más residuos de aminoácidos de la enzima o mediante modificación química. En el presente contexto una enzima lipolítica del segundo tipo se denomina una variante.

En el presente contexto la capacidad de la enzima para eliminar una cantidad sustancial de materia grasa durante el lavado de un ciclo se denomina también como efecto de primer lavado, efecto de lavado de un ciclo, efecto durante el lavado, y similares. De forma análoga, las enzimas lipolíticas de la invención, que son capaces de llevar a cabo la eliminación de una cantidad sustancial de materia grasa durante un lavado de un ciclo, se denominan enzimas lipolíticas de primer lavado, enzimas lipolíticas durante el lavado, enzimas lipolíticas de lavado de un ciclo, y similares.

En el presente contexto, el término "composición de detergente A y/o B", usado para definir la capacidad de una enzima lipolítica de la invención dada para eliminar manteca de cerdo, indica que la enzima lipolítica tiene la capacidad indicada para eliminar manteca de cerdo cuando está presente en una o ambas composiciones de detergente A y B.

En el presente contexto, el término "enzima madre" incluye una enzima de origen natural, así como una variante de dicha enzima. En consecuencia, el término se utiliza para identificar el material de partida que va a ser modificado según el método de la invención con el fin de preparar enzimas lipolíticas de primer lavado, sin tener en cuenta si dicho material de partida es una enzima de origen natural o una variante de dicha enzima.

El término "una variedad de secuencias mutadas", usado en relación al método según el segundo aspecto, se entiende que indica al menos dos, aunque preferiblemente un número mucho mayor de secuencias diferentes, por ejemplo al menos 10, al menos 50, al menos 100, o al menos 1000 secuencias resultado de la mutagénesis.

El término "mutagénesis aleatoria" debe entenderse de la manera convencional, es decir, para indicar una introducción de una o más mutaciones en posiciones aleatorias de la enzima madre o una introducción de residuos de aminoácidos aleatorios en posiciones o regiones seleccionadas de la enzima madre. La mutagénesis aleatoria va normalmente acompañada por una selección que permite seleccionar enzimas lipolíticas mutadas que, en comparación con la enzima madre, tienen mejores propiedades. Las técnicas adecuadas para introducir mutaciones aleatorias y para la selección de propiedades mejoradas se discutirán en detalle más adelante.

El término "rendimiento satisfactorio en el lavado", usado en referencia a las enzimas lipolíticas descritas aquí, indica que la enzima tiene un rendimiento mejorado cuando es evaluada en un ensayo de lavado adecuado o en un ensayo de lavado relacionado (como los ensayos descritos en Materiales y Métodos y en el Ejemplo 5 más adelante) en comparación con las enzimas lipolíticas comercialmente disponibles (Lumafast y Lipomax de Genencor, Lipolase y Lipolase Ultra de Novo Nordisk y Liposam de Showa Denko). El rendimiento mejorado puede referirse a la capacidad de eliminación de manchas lipídicas y/o a una dependencia menor al calcio, a una tolerancia mejorada a un detergente o a un componente detergente, a una hidrofobicidad aumentada, a una especificidad del substrato interesante, o similares.

En el presente contexto, el término "menor dependencia al calcio", usado en relación a la selección de enzimas lipolíticas mutadas, en particular enzimas lipolíticas que exhiben actividad enzimática hacia substratos de lipasa con cadenas de hidrocarburo (parte ffa) de una longitud que excede aprox. 6-8 átomos C, significa que la enzima lipolítica mutada requiere cantidades inferiores de Ca^{2+} para exhibir el mismo grado de actividad y/o estabilidad que la enzima madre, al ser evaluada en condiciones similares. En otras palabras, la estabilidad y/o actividad de la enzima aumenta en ausencia de calcio en comparación con la de la enzima madre. La estabilidad puede, p. ej., ser evaluada mediante la determinación de la actividad residual durante preincubación bajo condiciones de Ca libre y/o DSC (Calorimetría por análisis diferencial) en ausencia/presencia de Ca^{2+} libre. Preferiblemente, la enzima lipolítica mutada de la invención es sustancialmente independiente de la presencia de calcio para exhibir actividad enzimática, en particular con un pH superior a 8.

El término "tolerancia mejorada a un detergente o a un componente de detergente", usado en relación a la selección de enzimas lipolíticas mutadas, significa que la enzima lipolítica mutada es activa en concentraciones más altas del detergente o del componente de detergente que la enzima lipolítica madre.

En el presente contexto, el término "detergente" indica una mezcla de ingredientes detergentes normalmente usados para el lavado o el lavado de la vajilla. De forma análoga, un "componente de detergente" indica un componente o ingrediente que normalmente se encuentra en detergentes o composiciones de lavado de la vajilla, algunos ejemplos específicos se dan en la sección más abajo titulada "Composiciones detergentes".

Antecedentes sobre la estructura de la enzima lipolítica y definición de la terminología de la estructura

Se ha determinado la estructura 3D de varias enzimas lipolíticas. Se ha descubierto que las estructuras tienen un motivo común en el núcleo de la proteína consistente en una lámina \beta central, una de las cadenas finalizando en un codo nucleófilo que incluye el residuo de serina activo (Ollis et al, 1992). Las enzimas lipolíticas comprenden una zona de contacto lipídica, que es una superficie con una hidrofobicidad aumentada que interactúa con el substrato lipídico en o durante la hidrólisis.

Para las enzimas lipolíticas que contienen una tapa, la zona de contacto lipídica normalmente se forma cuando la enzima es activada por el substrato (y la tapa es desplazada de ese modo). Para las enzimas lipolíticas que no contienen una tapa generalmente hay poco o ningún movimiento sustancial correspondiente que lleve a la creación de la zona de contacto lipídica. El substrato lipídico es un conglomerado de moléculas sencillas de substrato lipídico. La zona de contacto lipídica contiene un área de enlace a la cual se une una molécula sencilla del substrato lipídico antes de la hidrólisis. Este área de enlace contiene un injerto hidrofóbico de enlace de acilo y el denominado núcleo aislado de la hidrólisis, que está situado alrededor del sitio activo Ser, y en el cual se cree que tiene lugar la hidrólisis del substrato lipídico. La zona de contacto lipídica incluye uno o más elementos de la estructura secundaria de la proteína, es decir, secuencias de bucle, cuyos residuos de aminoácidos entran en contacto, se enlazan y/o interactúan con el substrato durante la hidrólisis cuando la enzima lipolítica es activada.

La zona de contacto lipídica puede ser reconocida, p. ej. en una estructura tridimensional de la enzima lipolítica en cuestión creada mediante programas informáticos adecuados. La zona de contacto lipídica puede ser identificada buscando en la estructura las características relevantes que definen la zona, incluyendo una zona situada encima de los residuos del sitio activo y que contiene una estructura de tapa (para las enzimas lipolíticas que contienen una tapa) que al abrirse crea una superficie hidrofóbica que contiene un núcleo aislado hidrofóbico de enlace estrecho. La conformación de la enzima lipolítica H. lanuginosa inactiva y activada, respectivamente, se muestra en las Figs. 1 y 2 de WO 92/05249.

En cuanto a los residuos de aminoácidos, la zona de contacto lipídica de la enzima lipolítica H. lanuginosa se define por los residuos de aminoácidos 21-25, 36-38, 56-62, 81-98, 110-116, 144-147, 172-174, 199-213 y 248-269. Estos residuos han sido identificados basándose en simulaciones informáticas de modelos de la interacción entre la enzima lipolítica y un substrato lipídico. Para las enzimas lipolíticas que tienen sustancialmente la misma estructura que la enzima lipolítica H. lanuginosa, p. ej. las enzimas lipolíticas producidas por Rhizomucor miehei, por Rhizopus oryzae, por Penicillium camembertii y por Absidia sp. (cf. la sección anterior "Antecedentes de la invención"), la zona de contacto lipídica está constituida por residuos de aminoácidos que ocupan posiciones homólogas a las antes mencionadas para la enzima H. lanuginosa. Las posiciones homólogas pueden ser identificadas mediante la alineación de las secuencias de aminoácidos relevantes (p. ej. usando el programa UWGCG GAP) para buscar grupos de secuencias similares, aunque puede ser más conveniente comparar las estructuras o modelos de estructuras de las enzimas relevantes. Más específicamente, la zona de contacto lipídica de estas enzimas está constituida por los siguientes residuos (la numeración usada se refiere al residuo aminoácido en la enzima madura, cuya secuencia se deduce por las referencias descritas en la sección "Antecedentes de la invención" más arriba, a menos que se indique de otro modo):

Penicillium camembertii: 21-25, 36-38, 56-62, 81-98, 109-115, 143-146, 172-174, 198-212, 247-280;

Rhizopus oryzae: 29-33, 39-41, 57-62, 81-98, 109-115, 143-146, 175-177, 202-216, 245-269.

Rhizomucor miehei: 29-33, 39-41, 56-61, 80-97, 108-114, 142-145, 174-176, 201-215, 245-269;

Absidia sp. lipase: 29-33, 39-41, 56-61, 80-97, 108-114, 142-145, 171-173, 198-212, y 239-263, la numeración se basa en que la enzima madura tiene la secuencia N-terminal siguiente: SSKQDYR. La secuencia completa se deduce de (SEC ID Nº 98).

Como una alternativa, o además de la identificación basada en la homología de la zona de contacto lipídica, la zona de contacto lipídica puede ser identificada mediante:

a) el cálculo del vector hidrofóbico de la estructura molecular en 3-D de la enzima activada;

b) la realización de un corte perpendicular al vector a través del átomo de Ca (átomo C\alpha) del segundo residuo aminoácido después del sitio activo de serina en la secuencia lineal;

c) inclusión de todos los residuos con al menos un átomo en el lado del corte hacia el cual apunta el vector; y

d) selección de entre estos residuos, aquellos que tienen al menos un átomo dentro de 5 \ring{A}ngström de la superficie de la proteína.

El vector hidrofóbico es calculado a partir de la estructura de la proteína mediante la suma de todos los vectores de residuos para los residuos que tienen una accesibilidad a la superficie (Lee et al., Mol. Biol. 55, págs. 379-400 (1971)) de al menos un 15%. El punto de inicio del vector del residuo se define como el átomo CA del residuo y su dirección es a través del centro de masa de la cadena lateral. La magnitud de cada vector de residuo se define como la energía libre relativa de transferencia de los residuos entre agua y un solvente más hidrofóbico (ver, p. ej., Creighton, Protein, W. Freeman & Co., p. 151 (1984)). La accesibilidad a la superficie de cada residuo es calculada usando el programa Connolly (Lee et al., op. cit.).

Usando el método anterior y/o la alineación de varias secuencias, que es evidente en Svendsen et al, Biochimica et Biofisica Acta, 1259 (1995) 9-17, se han identificado las siguientes zonas de contacto lipídicas de enzimas lipolíticas aisladas de varias Pseudomonas sp. (la numeración usada se refiere a los residuos de aminoácidos de la enzima madura, como se presenta en la publicación anteriormente mencionada (Svendsen et al. (1995)):

Lipasa Pseudomonas cepacia: 15-36, 110-167, 209-266, 281-304;

Lipasa Pseudomonas pseudoalcaligenes: 15-35, 106-163, 200-232, 250-271;

Pseudomonas glumae: 15-36, 110-167, 209-266, 281-304;

Lipasa Pseudomonas mendocina (SD702): 19-39, 111-166, 213-244, 258-279 (la secuencia es evidente en WO 95/14783),

Lipasa Pseudomonas sp.(Liposam®): 17-37, 109-161, 208-239, 253-274 (SEC ID Nº 99).

Lipasa Pseudomonas wisconsinensis: 13-34, 106-161, 200-242, 250-270 (la secuencia es evidente en WO96/
12012))

La zona de contacto lipídica para enzimas lipolíticas que no contienen una estructura de tapa puede ser determinada a partir de la topología del núcleo, evaluada en una estructura o modelo de estructura tridimensional de la enzima lipolítica. De esta forma, la zona de contacto lipídica de la enzima lipolítica Fusarium solani pisi ha sido determinada en los residuos de aminoácidos 40-50, 78-91, 119-121, 147-154, 171-193 (según la evaluación basada en la enzima madura).

Algunas enzimas lipolíticas también comprenden una estructura de bucle en la superficie, es decir, una tapa, que forma parte de la zona de contacto lipídica. La estructura de bucle de la superficie cubre la serina activa cuando la enzima lipolítica está en forma inactiva. Cuando la enzima es activada, la estructura de bucle de la superficie cambia para exponer el residuo activo de serina. La estructura de bucle de la superficie tiene una superficie interna predominantemente hidrofóbica encarada al núcleo aislado de enlace y una superficie externa predominantemente hidrofílica.

Ejemplos de enzimas lipolíticas que tienen una estructura de bucle en la superficie son aquellas producidas por Humicola lanuginosa, Rhizomucor miehei, Rhizopus sp., Penicillium camembertii y Absidia sp., varias Pseudomonas sp., como Ps. cepacia, Ps. aeroginosa, Ps fragi (ver la sección "Antecedentes de la invención" más arriba), Candida rugosa (Grochulski.P et al (1993) J. Biol. Chem. 268, P. 12843) y la lipasa pancreática humana descrita en Winkler et al., Nature 343, págs. 771-74 (1990).

La estructura de bucle de la superficie de la enzima lipolítica producida por Humicola lanuginosa DSM 4109 está definida por los residuos aminoácidos en las posiciones 82-96. La estructura de bucle de la superficie de las enzimas lipolíticas con, sustancialmente, la misma estructura tridimensional (ver arriba) está definida por los residuos de aminoácidos que ocupan las posiciones homólogas a las de la enzima lipolítica H. lanuginosa, es decir 81-98 (para la lipasa Penicillium camembertii), 82-99 (para Rhizopus oryzae), 80-97 (para Rhizomucor miehei), 80-97 (para la lipasa Absidae sp).

La estructura de bucle de la superficie de varias enzimas lipolíticas representativas producidas por Pseudomonas sp. son: Ps. glumae: 135-155, Ps. cepacia 135-155, Ps pseudoalcaligenes 132-152), Pseudomonas sp lipasa (SD705)) (Liposam®) 129-149; mostradas en la SEC ID Nº 99.

Descripción detallada de la invención La enzima lipolítica de primer lavado de la invención

Preferiblemente, la enzima lipolítica de la invención es capaz de efectuar una capacidad de eliminación de manteca de cerdo mayor incluso que la antes mencionada. En consecuencia, en una forma de realización preferida la composición de detergente A y/o B que incluye la enzima lipolítica de la invención es capaz de eliminar al menos un 15%, o al menos un 20% más de manteca de cerdo que la composición de detergente A y/o B, respectivamente, que no incluye la enzima lipolítica, al ser evaluada en el ensayo de lavado de un ciclo descrito aquí en una concentración de 12500 LU/l. En una forma de realización más preferida, la enzima lipolítica es aquella que, cuando está presente en la composición de detergente A y/o B permite que la composición de detergente elimine al menos un 25% o al menos un 30% o un 35% o un 40% o un 50% más de manteca de cerdo que la composición de detergente A y/o B sin la enzima lipolítica, al ser evaluada en el ensayo de lavado de un ciclo descrito en la presente.

La concentración de enzima lipolítica usada en el ensayo de lavado de un ciclo descrito anteriormente (es decir 12500 LU/l) puede ser considerada alta para aplicaciones prácticas, pero ha sido elegida para los objetivos del ensayo con el fin de minimizar la variación analítica. Una concentración más realista es 1250 LU/l, que en una forma de realización alternativa puede ser usada para definir la capacidad de eliminación de manteca de cerdo de una enzima lipolítica de la invención. En consecuencia, en otra forma de realización la enzima lipolítica es aquella que es capaz de eliminar al menos un 15%, o al menos un 20% más de manteca de cerdo que la composición de detergente A y/o B que no incluye la enzima lipolítica, al ser usada en el ensayo de lavado de un ciclo descrito aquí en una concentración de 1250 LU/l. En una forma de realización más preferida incluso, la enzima lipolítica, cuando está presente en la composición de detergente A y/o B en una concentración de 1250 LU/l, permite que la composición de detergente elimine al menos un 25% o al menos un 30% o un 35% más de manteca de cerdo que la composición de detergente A y/o B sin la enzima lipolítica, al ser usada en un ensayo de lavado de un ciclo como el descrito en la presente.

En las formas de realización preferidas, la enzima lipolítica de primer lavado de la invención es capaz de eliminar:

- cuando está presente en la composición de detergente A en una concentración de 1250 LU/l, al menos un 15% más de manteca de cerdo de una muestra de una mancha de manteca de cerdo que la composición de detergente A sin la enzima,

- cuando está presente en Detergente A en una concentración de 12500 LU/l, al menos un 40% más de manteca de cerdo de una muestra de una mancha de manteca de cerdo que la Composición de detergente A sin la enzima,

- cuando está presente en la composición de Detergente B en una concentración de 1250 LU/l, al menos un 15% más de manteca de cerdo de una muestra de una mancha de grasa que la composición de Detergente B sin la enzima,

- cuando está presente en la composición de Detergente B en una concentración de 12500 LU/l, al menos un 15% más de manteca de cerdo de una muestra de una mancha de manteca de cerdo que la composición de Detergente B sin la enzima,

al ser evaluadas en un ensayo de lavado de un ciclo como se describe en la presente.

En el ejemplo 5 de la presente invención, se muestra una comparación entre la capacidad de eliminación de grasa de las enzimas lipolíticas de la invención y la de las enzimas lipolíticas descritas en WO 94/03578, que se suponía que tenían un efecto durante el lavado. Se puede observar que las enzimas de la invención eliminaron sustancialmente más manteca de cerdo en un lavado de un ciclo que las enzimas de la técnica precedente. La comparación entre las enzimas se hizo usando el mismo ensayo.

Mientras que la enzima lipolítica de la invención puede ser de cualquiera de los tipos anteriormente mencionados de enzimas lipolíticas, por ejemplo una hidrolasa que expone actividad hacia ésteres y/o enlaces de fosfolípido, se prefiere particularmente que la enzima sea una enzima lipolítica que muestre actividad hacia enlaces de ésteres en mono-, di y/o triglicéridos y/o que muestre actividad hacia la cutina. Este tipo de enzimas se considera generalmente muy interesante como enzimas detergentes.

En la sección Materiales y Métodos y en el Ejemplo 5 más abajo, se dan los ensayos adecuados para la identificación de enzimas lipolíticas de primer lavado. Estos ensayos pueden ser usados para identificar enzimas lipolíticas de primer lavado de origen natural. Más específicamente, con el objetivo de identificar una enzima lipolítica de primer lavado de origen natural según la invención, las posibles enzimas son recuperadas de organismos adecuados que se supone que producirán enzimas lipolíticas, por ejemplo organismos que están relacionados de forma taxonómica con aquellos dados en la sección "Antecedentes de la Invención" anterior, o los que se discutirán más adelante en la sección "Enzimas lipolíticas madre", o de organismos que se encuentran en un ambiente que requiere que el organismo produzca enzimas lipolíticas para sobrevivir. Posteriormente, las enzimas recuperadas serán sometidas a los ensayos de las enzimas lipolíticas de primer lavado descritos aquí.

Aunque la enzima lipolítica de primer lavado de la invención puede ser una nueva enzima de origen natural (identificada según su rendimiento en el primer lavado) se prefiere actualmente que la enzima sea una enzima modificada, es decir, una enzima que ha sido preparada sometiendo una enzima lipolítica madre a mutagénesis y/o a modificación química para dar como resultado una enzima lipolítica modificada con una actividad de primer lavado. La enzima lipolítica madre puede ser una enzima con una actividad de primer lavado (la cual puede por tanto ser mejorada por mutagénesis o modificación química) o puede no tener actividad de primer lavado, tal y como se define aquí. En una forma de realización se considera una ventaja que la enzima madre tenga un rendimiento de lavado satisfactorio en sí misma o incluso un rendimiento de primer lavado, esta propiedad siendo luego mejorada por la o las mutaciones. Las enzimas madre con un rendimiento de lavado satisfactorio (pero no necesariamente de primer lavado) pueden ser seleccionadas usando el ensayo descrito en el ejemplo 6 más adelante.

La modificación química de residuos de aminoácidos de la enzima madre puede p. ej. realizarse según los principios descritos en WO 95/09909 cuyo contenido está incorporado aquí como referencia. Por ejemplo, la modificación química puede realizarse acoplando un ligando de amina (como un azúcar aminado, un alcohol aminado o una glucosamina aminada o formas isoméricas de los mismos) al grupo carboxilo del ácido glutámico o a los residuos de ácido aspártico en la enzima. La modificación química puede ser realizada por métodos conocidos en la técnica, como los descritos en WO 95/09909. La modificación química puede hacerse en grupos ácidos eliminando las cargas
negativas.

La mutagénesis de la enzima lipolítica madre se hace preferiblemente para mejorar la afinidad de enlace del substrato de la enzima madre. Más específicamente, se ha descubierto que una afinidad de enlace del substrato mejorada puede dar como resultado la obtención de una actividad de primer lavado. Actualmente se contempla que una afinidad de enlace del substrato mejorada puede lograrse haciendo la superficie de la enzima madre menos negativa. En consecuencia, la mutagénesis puede ser realizada sustituyendo al menos un residuo de aminoácido neutral situado en la superficie de la enzima madre por un residuo de aminoácido cargado positivamente, eliminando un residuo de aminoácido cargado negativamente situado en la superficie de la enzima madre, o sustituyendo un residuo de aminoácido cargado negativamente situado en la superficie de la enzima madre por un residuo de aminoácido neutral (incluyendo los hidrofóbicos) o cargado positivamente. Los residuos de aminoácidos situados en la superficie de la enzima pueden ser identificados usando el programa Conolly mencionado en la sección de Definiciones anterior. En una forma de realización preferida, la mutagénesis se realiza eliminando el residuo de aminoácido D y/o E, y/o insertando, convenientemente por sustitución, R, K, W, F, Y, I, L. Una prueba adecuada para comprobar la afinidad de enlace del substrato mejorada se describe en el ejemplo 11 más adelante.

El efecto de primer lavado de los cambios anteriores de superficie negativa a positiva puede ser mejorado y/o estabilizado mediante la introducción de cambios que optimizan la estructura o la estabilidad. Así, por ejemplo, la introducción de un residuo de prolina en la superficie de la enzima puede ocasionar una estabilidad proteolítica y/o térmica aumentada; la introducción de residuos de aminoácidos hidrofílicos, p. ej. Glu y/o Asp, puede aumentar la estabilidad de detergencia aniónica, y la introducción de residuos de aminoácidos hidrofóbicos puede aumentar la adsorción/afinidad de la enzima. La introducción del tipo anterior de residuos de aminoácidos puede ser realizada simplemente insertando los residuos de aminoácidos en una situación adecuada en la superficie de la enzima o bien sustituyendo el o los residuos de aminoácidos situados en dicha posición o posiciones.

Actualmente se cree que una enzima lipolítica de primer lavado según la invención es una variante de una enzima lipolítica madre que comprende al menos una mutación, aunque normalmente más mutaciones, preferiblemente situadas en la superficie de la enzima. La variante puede comprender más mutaciones, como por ejemplo al menos 2, 3, 4 ó 5 mutaciones, p. ej. en la gama de 1-20, 1-15, 1-12, 1-10, 1-9, 1-8, 1-7, 1-6, 1-5 ó 1-4 mutaciones, o cualquier número de mutaciones que no perjudique la actividad enzimática de la enzima.

Se ha descubierto que las mutaciones dentro y fuera de la zona de contacto lipídica de la lipasa madre de H. lanuginosa descrita aquí pueden ser importantes para conseguir una actividad de primer lavado. En consecuencia, la enzima lipolítica de primer lavado de la invención que incluye una mutación puede ser construida a partir de una enzima lipolítica madre mediante la modificación de al menos un residuo de aminoácido fuera de la zona de contacto lipídica de la enzima madre y/o mediante la adición de al menos un residuo de aminoácido fuera de dicha zona, y/o mediante la modificación de al menos un residuo de aminoácido dentro de la zona de contacto lipídica de la enzima madre y/o mediante la adición de al menos un residuo de aminoácido dentro de dicha zona.

En consecuencia, en otra forma de realización la enzima lipolítica de la invención es una que ha sido preparada a partir de la enzima madre por modificación, eliminación o sustitución de al menos un residuo de aminoácido en la zona de contacto lipídica de la enzima madre o mediante la adición de al menos un residuo de aminoácido en dicha zona. En otra forma de realización la enzima lipolítica es una que ha sido preparada a partir de la enzima madre por modificación, eliminación o sustitución de al menos un residuo aminoácido fuera de la zona de contacto lipídica o por adición de al menos un residuo aminoácido en dicha zona, dicho residuo aminoácido preferiblemente estando localizado en la superficie de la enzima madre. Las mutaciones dentro o fuera de la zona de contacto lipídica son preferiblemente llevadas a cabo para mejorar la afinidad de enlace del substrato de la enzima modificada resultante, convenientemente mediante la eliminación de las cargas negativas tal y como se ha descrito anteriormente.

Aunque la mutagénesis dirigida siguiendo los principios anteriores (y en combinación con la evaluación de las variantes de enzima resultantes según su actividad de primer lavado) puede ser usada para la creación de enzimas lipolíticas de primer lavado, actualmente se prefiere usar otros métodos de creación de enzimas lipolíticas de primer lavado. Se ha descubierto el interés particular de la mutagénesis aleatoria, en particular de la mutagénesis aleatoria localizada, así como de la recombinación in vivo de genes homólogos, para tales objetivos - estos métodos están descritos con mayor detalle más abajo.

Enzima lipolítica de primer lavado modificada en una parte no estructural de sus términales C o N

Sorprendentemente se ha descubierto que es posible conferir un efecto de primer lavado a una enzima lipolítica madre o realzar significativamente el efecto de primer lavado de una enzima lipolítica madre mediante la aplicación de al menos una adición de un péptido N-terminal y/o C-terminal en o dentro de una parte no estructural de la enzima madre en su forma madura, o mediante la introducción de otros cambios en una parte no estructural del extremo C-terminal y/o N-terminal de la enzima madre madura.

En consecuencia, en otra forma de realización muy preferida, la enzima lipolítica de primer lavado de la invención es una variante de una enzima lipolítica madre que, en comparación con la enzima madre, ha sido modificada en o dentro de una parte no estructural del extremo N y/o C-terminal de la enzima madre.

En el presente contexto, el término "modificado" indica que i) se ha aplicado una adición apropiada de un péptido en la enzima madre o ii) uno o más residuos de aminoácidos dentro de la parte no estructural de la parte C-terminal y/o N-terminal de la enzima madre madura han sido eliminados o sustituidos por otros residuos aminoácidos, o iii) la enzima madre ha sido modificada por una combinación de i) o ii). En el presente contexto, las enzimas lipolíticas de primer lavado de la invención que han sido modificadas de esta manera pueden ser denominadas una enzima modificada de la invención.

En el presente contexto, el término "adición de un péptido" indica que una extensión de uno o más residuos de aminoácidos consecutivos ha sido añadida a uno o a ambos extremos N- y/o C-terminal de la enzima madre (es decir, fundido al primer y/o al último residuo aminoácido de la enzima madre) o insertada dentro de la parte no estructural de los extremos N- y/o C-terminal de la enzima madre. La enzima modificada puede comprender una adición de un péptido en el extremo N-terminal o en el extremo C-terminal o bien en ambos extremos N- y C-terminal de la enzima lipolítica madre. Si una adición de un péptido es aplicada tanto en el terminal N como en el C de la enzima madre, la adición del péptido en cualquiera de los terminales puede tener la misma secuencia de aminoácidos o una secuencia de aminoácidos diferente. Múltiples copias de adiciones de péptidos iguales o diferentes pueden ser insertadas o añadidas.

El término "una adición de un péptido apropiada" se utiliza para indicar que la adición del péptido usada es capaz de efectuar un rendimiento de primer lavado o un rendimiento de primer lavado mejorado. La "idoneidad" de la adición del péptido puede ser comprobada mediante un análisis comparativo del rendimiento de primer lavado de una enzima modificada en la cual se ha aplicado la adición del péptido y de la enzima madre correspondiente, respectivamente. El rendimiento de lavado puede, p. ej., ser determinado por el ensayo de lavado de un ciclo descrito en la sección de Materiales y Métodos.

Actualmente se contempla que el rendimiento de primer lavado mejorado efectuado por la adición de un péptido es, al menos en parte, debido a una afinidad aumentada de la enzima lipolítica modificada a su substrato lipídico (aunque ésta puede no ser la única razón). En consecuencia, en una forma de realización preferida la adición del péptido es aquella que confiere una afinidad aumentada de la enzima modificada a su substrato lipídico.

El término "enzima madura" se usa según su significado convencional, es decir, para indicar la forma activa de la enzima resultante tras la expresión y el tratamiento postraduccional (para eliminar las pro y/o pre-secuencias) por el organismo productor en cuestión.

Cuando la enzima es un enzima segregada, la enzima madura normalmente tendrá la forma de la enzima resultante después de la secreción. Más específicamente esto significa que las secuencias pre y pro-péptidas, si están presentes, han sido eliminadas de la enzima inicialmente traducida, es decir, de la enzima no procesada.

El término "parte no estructural" indica la parte del extremo N y C-terminal, respectivamente, que está fuera del primer o último elemento estructural, respectivamente, como una estructura de hélice \alpha o de lámina \beta de la enzima madura plegada. La parte no estructural puede ser identificada fácilmente en una estructura tridimensional o en un modelo de la enzima en cuestión. Normalmente, la parte no estructural comprende el primer o el último residuo de alrededor de 1-20 residuos de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos que constituye la enzima.

Para enzimas que tienen una estructura tridimensional similar a la de la enzima lipolítica H. lanuginosa, la inserción puede hacerse en la parte de dicha enzima que corresponde a una "parte no estructural" de la enzima lipolítica H. lanuginosa. La parte no estructural de la enzima lipolítica H. lanuginosa normalmente comprende el primer o el último residuo de alrededor de 1-20 residuos de aminoácidos de la enzima madura.

Actualmente se cree que la capacidad de la adición del péptido de proporcionar el efecto de primer lavado deseado depende de, p. ej., la identidad de la enzima madre que va a ser modificada, la estructura (incluyendo la longitud) de la adición del péptido, el impacto de la adición del péptido en la estructura de la enzima lipolítica completa, la naturaleza o funcionalidad de los residuos de aminoácidos de la adición del péptido, etc. Un requisito previo para que la adición del péptido sea capaz de proporcionar el efecto deseado es, por supuesto, que la enzima modificada que contiene la adición del péptido se pueda expresar en un organismo huésped adecuado. Las consideraciones generales siguientes pueden ser importantes para el diseño de una adición de un péptido adecuada:

Longitud de la adición de un péptido: Se ha descubierto que adiciones de péptidos que contienen cantidades variables de residuos de aminoácidos son capaces de proporcionar el efecto de primer lavado deseado y, por tanto, no es posible especificar un número exacto de residuos de aminoácidos que deben estar presentes en la adición del péptido usada según la presente invención. Se considera que el límite superior del número de residuos de aminoácidos está determinado, entre otras cosas, por el impacto de la adición del péptido en la expresión, la estructura y/o la actividad de la enzima modificada resultante. Se cree que la adición del péptido puede comprender un número sustancial de residuos de aminoácidos, no obstante, sin necesidad de todos estos residuos de aminoácidos, contribuye al efecto de primer lavado deseado (aunque la adición del péptido contenga un número sustancial de residuos de aminoácidos, sólo un número pequeño es necesario para proporcionar la función deseada, este pequeño número puede ser denominado parte funcional de la adición del péptido). La consideración principal en relación al límite inferior del número de residuos de aminoácidos de la adición del péptido normalmente es que el número debería ser suficiente para proporcionar el efecto de primer lavado deseado.

La adición del péptido puede así comprender un único residuo aminoácido o una cadena de aminoácidos de entre 2 y 500 aminoácidos, o de 1 a 200, o de 2 a 100, preferiblemente de 2 a 50, o 3 a 50, incluso más preferiblemente de 7 a 45 y aún más preferiblemente entre 1 y 15, o entre 1 y 10 ó 1 y 7, especialmente entre 4 y 10, o 4 y 7 aminoácidos.

Estabilidad: La adición del péptido debería preferiblemente ser elegida para proporcionar una enzima lipolítica modificada con una adición de un péptido estable y una estabilidad estructural aceptable de la enzima madre. Por ejemplo, una adición de un péptido que en sí misma forma un elemento estructural, como una hélice \alpha o una lámina \beta, puede estabilizar la enzima modificada resultante y por tanto puede ser usada en el contexto de la presente invención. En la técnica se conocen secuencias péptidas capaces de formar tales estructuras. De forma alternativa, una estabilidad estructural mejorada puede ser proporcionada por la introducción de puentes de cisteína en la enzima lipolítica modificada de la invención. Por ejemplo, se puede establecer un puente de cisteína entre la adición del péptido y la parte madura de la enzima, si al menos uno de los residuos de aminoácidos de la adición del péptido es un residuo de cisteína situado de forma que es capaz de formar una unión covalente con un residuo de cisteína en la parte madura de la enzima. Si no hay presente una cisteína adecuada en la enzima madura, una cisteína puede ser insertada en una posición adecuada de dicha enzima madre, reemplazando convenientemente un aminoácido de la enzima madre que se considere sin importancia para la actividad.

Además, puede ser deseable que al menos uno de los residuos de aminoácidos de la adición del péptido se elija con el fin de hacer la adición del péptido menos susceptible a la degradación proteolítica por enzimas proteolíticas de la célula huésped usada para expresar la enzima lipolítica modificada. Por ejemplo, la adición del péptido puede comprender al menos uno, y preferiblemente al menos dos, residuos de prolina. Preferiblemente, la adición del péptido comprende 1-5, o 1-4 ó 1-3 o dos o un residuo de prolina. El o los residuos de prolina están preferiblemente situados en el sitio de corte proteolítico o cerca del mismo. De forma alternativa, la adición del péptido puede ser una que proporcione un bucle de proteasa estable a la lipasa modificada, p. ej. como se describe en EP 407 225 o WO 93/11254.

Naturaleza de los residuos de aminoácidos de la adición del péptido: Como se ha mencionado antes y sin limitarse a ninguna teoría, actualmente se cree que el rendimiento mejorado puede deberse al menos parcialmente a una mayor afinidad de la enzima lipolítica modificada al substrato dependiendo de la adición del péptido. En particular, se cree que se pueden obtener interacciones electroestáticas favorables entre la superficie lipídica cargada negativamente y los residuos de aminoácidos cargados positivamente y/o hidrofóbicos presentes en la enzima modificada. En consecuencia, se prefiere particularmente que la enzima modificada de la invención comprenda una adición de un péptido con al menos una carga positiva, o al menos 2, 3, 4 o más cargas positivas o, expresado de forma diferente, en las que un número sustancial de residuos de aminoácidos de la adición del péptido están cargados positivamente y/o son hidrofóbicos.

Análogamente, y con el objetivo de reducir la carga negativa en un extremo no estructural de la enzima madre, se prefiere eliminar al menos uno, dos o más residuos de aminoácidos cargados negativamente de una parte no estructural N-terminal o C-terminal de la enzima madre elegida, en particular de la parte de la lipasa madre que está construida por los primeros o últimos residuos aminoácidos 1-5 N-terminal o C-terminal, por ejemplo 1-4, o 1-3 ó 1-2. El residuo aminoácido cargado negativamente puede ser extraído o sustituido por un residuo aminoácido hidrofóbico, neutral o cargado positivamente. Por ejemplo, el residuo aminoácido cargado negativamente que debe ser eliminado puede ser E o D, el cual puede ser sustituido por cualquiera de los residuos de aminoácidos cargados positivamente R, K o H, los residuos de aminoácidos neutrales S, T, G o Q, o los residuos de aminoácidos hidrofóbicos A, 1, F W o L. De forma similar, un residuo aminoácido neutral de una parte no estructural N-terminal o C-terminal de la enzima madre puede ser sustituido por un residuo aminoácido cargado positivamente o hidrofóbico, tal como se ha definido anteriormente.

En consecuencia, la enzima lipolítica modificada de la invención además o como una alternativa de la extensión N-terminal y/o C-terminal, puede comprender una mutación en el extremo no estructural C-terminal y/o N-terminal de la enzima madre, mutación la cual implica la eliminación o sustitución de un residuo aminoácido cargado negativamente de dicha parte no estructural por un residuo aminoácido cargado positivamente o neutral o por un residuo aminoácido hidrofóbico.

Si una adición de un péptido está presente tanto en el terminal N como en el C de la enzima madre, la adición del péptido en o dentro de cada uno de los terminales puede tener la misma secuencia de aminoácidos o una diferente.

Prueba de idoneidad de la adición del péptido: el efecto de usar una adición de un péptido dada, p. ej., diseñada basándose en los principios anteriores, puede ser evaluado mediante la construcción de una enzima lipolítica modificada que contiene la adición del péptido y examinando las propiedades de la enzima resultante según su actividad de primer lavado. La adición del péptido puede ser generalizada de la siguiente manera.

El primer residuo (contado desde el residuo externo) se denomina "a", el segundo se denomina "b", el tercero "c", etc. Así, en caso de una adición N-terminal, el primer residuo aminoácido se denomina "a", en caso de una adición C-terminal, el último residuo aminoácido se denomina "a".

En una forma de realización importante de la invención la adición de un péptido consiste en de 1 a 7 aminoácidos. Esta adición de un péptido, que puede ser aplicada en el terminal N y/o en el terminal C de la enzima madre, puede ser denominada como:

a (adición de un péptido de un aminoácido)

a-b (adición de un péptido de dos aminoácidos)

a-b-c (adición de un péptido de tres aminoácidos)

a-b-c-d (adición de un péptido de cuatro aminoácidos)

a-b-c-d-e (adición de un péptido de cinco aminoácidos)

a-b-c-d-e-f (adición de un péptido de seis aminoácidos)

a-b-c-d-e-f-g (adición de un péptido de siete aminoácidos)

Cada letra define un residuo de aminoácido.

a, b, c, d, e, f y g pueden ser independientemente cualquier aminoácido, incluyendo Alanina (A), Valina (V), Leucina (L), Isoleucina (1), Prolina (P), Fenilalanina (F), Triptófano (W), Metionina (M), Glicina (G), Serina (S), Treonina (T), Cisteína (C), Tirosina (Y), Asparraguina (N), Glutamina (Q), Ácido aspártico (D), Ácido glutámico (E), Lisina (K), Arginina (R), y Histidina (H).

En formas de realización específicas a, b, c, d, e, f, y g son independientemente uno de los aminoácidos siguientes:

a:	Leu, Ile, Val, Trp, Phe, Ser, Arg, Cys, o Lys,
b:	Leu, Ile, Val, Trp, Phe Ser, Pro, Arg, Lys, Cys o His,
c:	Leu, Ile, Val, Trp, Phe, Ser, Pro, Arg, Cys, o Lys.
d:	Leu, Ile, Val, Trp, Phe Ser, Pro, Arg, Cys, o Lys.
e:	Leu, Ile, Val, Trp, Phe, Pro, Arg, Lys, Ala, Glu, Cys, o Asp,
f:	Leu, Ile, Val, Trp, Phe, Pro, Arg, Lys, Ala, Glu, Cys, o Asp,
g:	Leu, Ile, Val, Trp, Phe, Pro, Arg, Lys, Cys, o Met.

En una forma de realización preferida al menos uno, por ejemplo uno, dos, tres o cuatro de a, b, c, d, e, f, o g es un aminoácido cargado positivamente, es decir Arg (R) o Lys (K) o un aminoácido hidrofóbico, es decir Leu, Ile, Val, Trp o Phe.

Como se ha mencionado antes, y dependiendo de la célula huésped elegida, generalmente se cree que es importante que la adición del péptido comprenda al menos un residuo de prolina con el objetivo de proteger la enzima lipolítica modificada de la degradación proteolítica durante el procesamiento de la enzima por la célula huésped elegida. Puede ser deseable que el residuo de prolina ocupe la posición dos (es decir b) y/o tres (es decir c) de la adición del péptido o una posición cercana al punto de corte deseado (es decir el punto donde se cree que se produce el procesamiento por la célula huésped en cuestión). En consecuencia, en una forma de realización, b y opcionalmente c de la adición del péptido son Pro.

En otra forma de realización de la invención a-b son SP (Ser-Pro), A-P o Q-P. Si la adición del péptido contiene más residuos aminoácidos, p. ej. entre 4 y 7 aminoácidos, la adición del péptido tiene la fórmula general SPcd, SPcde, SPcdef, SPcdefg o APcd, APcde, APcdef, Ap-cdefg o QPcd, QPcde, QPcdef, QPcdefg. En cada una de estas fórmulas c, d, e, f, y g pueden ser cualquier aminoácido. No obstante, se prefiere el grupo de aminoácidos anteriormente mencionado.

En otra forma de realización a-b comprenden al menos un aminoácido positivo (es decir Arg y Lys) o un residuo aminoácido hidrofóbico (es decir Leu, Ile, Val, Trp y Phe).

Específicamente, la adición del péptido aplicada a la enzima lipolítica madre puede ser ventajosamente uno de los siguientes residuos de aminoácidos o péptidos:

Arg (R), o Lys (K), o Leu (L), o Ile (1), o

Val (V), o Trp (W) o Phe (F), o

Arg-Pro (RP), o

Lys-Lys (KK), o

Arg-Lys (RK), o

Lys-Arg (KR), o

Arg-Arg (RR), o

Arg-Arg-Pro (RRP), o

Arg-Pro-Val-Ser-Gln-Asp (RPVSQD)

Ser-Pro-Ile-Arg-Met (SPIRM), o

Ser-Pro-Ile-Arg-Ala-Arg (SPIRAR), o

Ser-Pro-Ile-Arg-Pro-Arg (SPIRPR) o

Ser-Pro-Ile-Arg-Glu-Arg (SPIRER), o

Ser-Pro-Ile-Arg-Lys (SPIRK), o

Ser-Pro-Ile-Lys-Lys (SPIKK), o

Ser-Pro-Ile-Arg-Arg-Pro (SPIRRP), o

Ser-Pro-Pro-Arg-Arg (SPPRR), o

Ser-Pro-Iso-Pro-Arg (SPIPR), o

Ser-Pro-Arg-Pro-Arg (SPRPR), o

Ser-Pro-Ile-Arg (SPIR), o

Ser-Pro-Ile-Arg-Arg (SPIRR), o

Ser-Cys-ile-Arg-Arg, (SCIRR), o

Ser-Pro-Ile-Arg-Pro-Arg-Pro (SPIRPRP), o

Ser-Cys-Ile-Arg-Pro-Arg-Pro (SCPIRPRP), o

Ser-Pro-Arg-Arg-Pro-Arg-Thr (SPRRPRT), o

Ser-Pro-Phe-Arg-Pro-Lys-Leu (SPFRPKL), o

Ser-Pro-Pro-Arg-Arg-Pro (SPPRRP), o

Ser-Pro-Ile-Arg-Arg-GIu (SPIRRE), o

Ser-Pro-Pro-Arg-Pro-Pro (SPPRPP), o

Ser-Pro-Pro-Arg-Pro-Arg (SPPRPR), o

Ser-Pro-Pro-Trp-Trp-Pro (SPPWWP), o

Ser-Pro-Pro-Trp-Arg-Pro (SPPWRP), o

Ser-Pro-Pro-Arg-Trp-Pro (SPPRWP), o

Ser-Pro-Pro-Arg-Trp-Pro (SPPRWP), o

Ser-His-Trp-Arg-Arg-Trp (SHWRRW), o

Ser-His-Trp-Arg-Lys (SHWRK), o

Ser-His-Trp-Arg-Arg (SHWRR), o

Thr-Ala-Ile-Arg-Pro-Arg-Lys (TAIRPRK),

Ser-Thr-Arg-Arg-Pro-Arg-Pro (STRRPRP),

GIy-Pro-Ile-Arg-Pro-Arg-Pro (GPIRPRP), o

Leu-Pro-Phe-Arg-Gln-Arg-Pro (LPFRQRP), o

Ser-Arg-Ser-Arg-His-Asn-AIa (SRSRHNA), o

Ile-Pro-Ile-Arg-Pro-Arg-Arg (IPIRPRR), o

Ser-Thr-Arg-Arg-Pro-Arg-Pro (STRRPRP), o

Thr-Ala-lle-Arg-Pro-Arg-Lys (TAIRPRK), o

Trp-Arg-Trp-Arg-Trp-Arg (WRWRWR), o

GIn-Pro-Ile-Arg-Arg (QPIRR), o

Ser-His-Trp-Gln-Gln (SHWQQ), o

Ser-Ala-Leu-Arg-Pro-Arg-Lys (SALRPRK).

También se contempla según la invención adiciones que comprenden más de 7 aminoácidos, por ejemplo de 8 a 15 aminoácidos. Estos péptidos pueden ser generalizados como:

a-b-c-d-e-f-g-h (péptido de 8 aminoácidos)

a-b-c-d-e-f-g-h-i (péptido de 9 aminoácidos)

a-b-c-d-e-f-g-h-i-j (péptido de 10 aminoácidos)

a-b-c-d-e-f-g-h-i-j-k (péptido de 11 aminoácidos)

a-b-c-d-e-f-g-h-i-j-k-l (péptido de 12 aminoácidos)

a-b-c-d-e-f-g-h-i j-k-l-m-(péptido de 13 aminoácidos)

a-b-c-d-e-f-g-h-i-j-k-l-m-n(péptido de 14 aminoácidos)

a-b-c-d-e-f-g-h-i-j-k-l-m-n-o (péptido del5 aminoácidos).

De a a o pueden ser cualquiera de los veinte aminoácidos anteriormente mencionados.

La extensión a-g puede ser tal y como se ha definido anteriormente en relación a una adición de un péptido que comprende de 1 a 7 residuos de aminoácidos.

h, i, j, k, 1, m, n, o pueden ser, como se ha mencionado anteriormente, cualquier aminoácido, preferiblemente cualquiera de los aminoácidos siguientes:

Arg, Lys, Ala, Val, Trp, Ile, Phe, Ser o Pro.

Ejemplos específicos de tales adiciones se enumeran a continuación:

Arg-Pro-Arg-Pro-Arg-Pro-Arg-Pro (RPRPRPRP), o

Ser-Ser-Thr-Arg Arg-Ala-Ser-Pro-Ile-Lys-Lys (SSTRRASPIKK), o

Ala-Trp-Trp-Pro-Ser-Pro-lle-Arg-Pro-Arg-Pro (AWWPSPIRPRP), o

Ala-Pro-Pro-Pro-Arg-Pro-Arg-Pro-Arg-Pro-Arg-Pro (APPPRPRPRPRP), o

Ala-Pro-Pro-Pro-Arg-Thr-Arg-Pro-Arg-Pro-Arg-Ser (APPPRTRPRPRS), o

Ser-Pro-Lys-Arg-Lys-Pro-Arg-Pro (SPKRKPRP), o

Ser-GIn-Arg-lle-Lys-GIn-Arg-Ile-Lys (SQRIKQRIK), o

Ser-Pro-Pro-Pro-Arg-Pro-Arg-Pro (SPPPRPRP), o

Ser-Pro-lle-Arg-Pro-Arg-Pro-Arg-Pro-Arg SPIRPRPRPR, o

Ser-Pro-lle-Arg-Lys-Ala-Trp-Trp-Pro (SPIRKAWWP), o

Ala-Pro-Pro-Pro-Lys-Ala-Ser-Pro-Arg-Gln-Arg-Pro (APPPKASPRQRP), o

Ser-Pro-Ile-Arg-Pro-Arg-Pro-Ser-Pro-Ile-Arg-Pro-Arg-Pro-Arg (SPIRPRPSPIRPRP), o

Ser-Pro-Pro-Arg-Trp-Pro-Arg-Arg (SPPRWPRR), o

Ser-Pro-Pro-Arg-Trp-Pro-Arg-Trp (SPPRWPRW), o

Ser-Pro-Pro-Arg-Trp-Pro-Trp-Arg (SPPRWPWR), o

Ser-Pro-Pro-Trp-Arg-Pro-Arg-Arg (SPPWRPRR), o

Ser-Pro-Pro-Trp-Trp-Pro-Arg-Trp (SPPWWPRW, o

Ser-Pro-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg (SPPWWPWR), o

Ser-Pro-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Trp (SPPWWPWVV), o

Ser-Pro-Pro-Trp-Pro-Arg-pro-Arg-Pro (SPPWPRPRP), o

Ala-Pro-Pro-Pro Arg-Pro Arg-Leu-Leu-Pro-lle-Ser (APPPRPRLLPIS), o

Ala-Pro-Pro-Pro-Thr-Arg-Gln-Arg-Gln-Ser-Pro (APPPTRQRQSP), o

Ala-Pro-Pro-Pro-Arg-Thr-lle-Pro-Arg-Ser-Ser-Pro (APPPRTIPRSSP).

En cualquiera de las adiciones de péptidos arriba especificadas (tanto si comprenden de 1 a 7 o de 1 a 15 residuos de aminoácidos) en las que la posición "a" es Ser, Ala, Arg, Lys o Pro; Ser puede ser reemplazado por Ala, Arg, Lys o Pro; Ala por Ser, Arg, Lys o Pro; y Arg, Lys o Pro por Ala o Ser.

Debe enfatizarse que la adición del péptido anterior puede darse en el N-terminal y/o en el C-terminal. Los ejemplos de enzimas lipolíticas modificadas con una adición de un péptido tanto en el N- como en el C-terminal comprenden todas las combinaciones de las adiciones de péptidos específicamente mencionadas arriba. Dos ejemplos específicos de éstas son la adición N-terminal SPIRPRP junto con la adición C-terminal RRP o RR.

Además de las adiciones de péptidos anteriormente especificadas, se ha descubierto que una adición de un péptido adecuada puede estar compuesta o comprender simplemente una parte o la secuencia completa propéptida normalmente asociada a la enzima lipolítica madre en cuestión. Así, por ejemplo en relación con las variantes de la enzima lipolítica de primer lavado de H. Lanuginosa, una adición de un péptido adecuada puede comprender o estar compuesta por SPIRR - es decir parte de la secuencia propéptida normal de la secuencia de la enzima lipolítica de H. Lanuginosa.

Si la adición de un péptido es insertada en la parte no estructural de la enzima madre, ésta puede reemplazar uno o varios de los residuos de aminoácidos de dicha parte no estructural. Por ejemplo, la adición de un péptido puede reemplazar uno o más residuos de aminoácidos que ocupen los primeros, p. ej. 1-5, residuos de aminoácidos del extremo N-terminal y/o los últimos, p. ej. 1-5, aminoácidos de la enzima (es decir, los residuos de aminoácidos 1-5 del extremo C-terminal). Por ejemplo, la adición de un péptido puede reemplazar residuos de aminoácidos 1 y/o 2 y/o 3 y/o 4, y/o 5, etc. de cualquiera de los extremos de la enzima madre.

Cuando la enzima madre es una variante de la lipasa H. lanuginosa, la cual comprende modificaciones de aminoácidos en su parte estructural madura, es particularmente interesante combinar cualquiera de las adiciones de péptidos anteriores (aplicadas en el N-terminal) con una eliminación del primer residuo de aminoácido de la enzima madre madura, es decir el 1 E.

Métodos para la aplicación de una adición de un péptido a una enzima lipolítica madre

Aunque una enzima lipolítica de primer lavado de la invención puede ser obtenida añadiendo (fundiendo o insertando) una adición de un péptido sintético producido en la enzima lipolítica madre en cuestión, actualmente se prefiere que la enzima modificada de la invención se prepare mediante i) la modificación de la secuencia nucleótida, preferiblemente el ADN, que codifica la enzima madre con el fin de codificar la adición del péptido deseado aplicada al extremo/s N y/o C-terminal de la enzima madre (p. ej. insertando una secuencia de ácido nucleico (preferiblemente ADN) que codifica la adición del péptido en el sitio relevante de la secuencia de ácidos nucleicos (preferiblemente ADN) que codifica la enzima madre), ii) la expresión de la secuencia de ácido nucleico modificada resultante (preferiblemente ADN) en un sistema de expresión adecuado, y iii) recuperación de la enzima modificada resultante.

En el presente contexto, el término "aplicado a" indica que la adición se funde al extremo N y/o C-terminal (p. ej. al primer o al último residuo aminoácido) de la enzima madura o se inserta en una parte no estructural del extremo N-terminal y/o C-terminal de la enzima madura.

Muchas enzimas son expresadas como "prepro-enzimas", es decir, como enzimas consistentes en la enzima madura, un péptido señal secretor (es decir, un prepéptido) y un propéptido. La prepro-enzima es procesada intracelularmente para ser segregada en el medio de fermentación, desde el cual la enzima madura puede ser aislada y/o purificada. La adición de un péptido a la enzima madre puede llevarse a cabo mediante la aplicación de secuencias de ácidos nucleicos que codifican la adición del péptido deseada corriente arriba (para adiciones de un péptido N-terminal) y/o corriente abajo (para adiciones de un péptido C-terminal) en la secuencia de ADN que codifica la enzima madre.

La inserción debería ser realizada de tal manera que la enzima modificada deseada (es decir, la que tiene la adición o adiciones de péptidos deseadas) es expresada y segregada por la célula huésped después de la transcripción, traducción, y procesamiento de la enzima. El término "procesamiento" significa en este contexto la eliminación del pre y el pro-péptido (excepto, por supuesto, cuando el pro-péptido es idéntico a la adición del péptido deseado, lo cual se tratará más abajo).

Las secuencias corriente abajo (que codifican una adición C-terminal) pueden ser insertadas entre la secuencia de ADN que codifica la enzima madre y el codón de terminación. No obstante, si la secuencia de ADN no procesada comprende una secuencia de ADN que codifica un pro-péptido en el extremo C-terminal, la inserción/adición de la secuencia de ADN que codifica la adición del péptido también puede tener lugar entre las secuencias de ADN que codifican el pro-péptido y la enzima madura, respectivamente.

En la mayoría de los casos es posible extender la enzima madre corriente arriba mediante la inserción de una secuencia de ADN que codifica la adición del péptido, entre la secuencia de ADN que codifica el pro-péptido o el prepéptido (si no hay presente una prosecuencia) y la secuencia de ADN que codifica la enzima madura.

La secuencia de ADN que codifica la adición del péptido en cuestión deberá ser elegida, por supuesto, de tal manera que coincida con las preferencias del codón del sistema de expresión destinado a la producción de la enzima lipolítica de primer lavado de la invención.

La inserción/adición de una secuencia de ADN que codifica la adición del péptido puede llevarse a cabo mediante cualquier técnica estándar conocida por los expertos en la técnica en el campo de la biología molecular, cf., p. ej. Sambrook et al., 1989). Se incluyen, p. ej., la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) usando cebadores específicos, por ejemplo los descritos en la patente US 4,683,202 o R.K. Saiki et al., (1988), Science, 239, 487-491. Cómo se proporciona la expresión y secreción de la o las secuencias de ADN adyacentes se describirá posteriormente.

En relación a la presente invención se ha descubierto que algunas células huésped pueden ser menos adecuadas para la producción de una enzima lipolítica de primer lavado que incluye una adición o adiciones de péptidos, por el hecho de que parte o toda la adición o adiciones de péptidos pueden ser cortadas durante el proceso postraduccional u otro proceso realizado por la célula huésped. En consecuencia, el término "sistema de expresión adecuado" indica un sistema de expresión (célula huésped y opcionalmente vector de expresión) que permite la producción de al menos una parte de la enzima lipolítica de primer lavado intacta deseada comprendiendo la adición del péptido, es decir un sistema de expresión que no elimina, p. ej. como parte del proceso postraduccional u otro proceso por la célula huésped elegida, parte o toda la adición del péptido (produciendo de ese modo la enzima sin la adición de péptido deseada). Expresado de forma diferente, el sistema de expresión (que incluye la célula huésped, las condiciones de cultivo y/o las condiciones de recuperación) es preferiblemente seleccionado de modo que, como mucho, se produce un procesamiento parcial de la pre-, pro- o prepro-forma de la enzima lipolítica, dando como resultado que al menos un 5%, o al menos un 10%, o al menos un 15%, o al menos un 20%, o al menos un 25%, o al menos un 50%, o al menos un 75% de las moléculas de la enzima producida comprenden la adición de péptido deseada, p. ej. la pro-secuencia completa o una parte sustancial de la misma. Normalmente, el sistema de expresión usado está desprovisto o tiene reducida una o más actividades proteolíticas que ejercen el procesamiento postraduccional no deseado. La elección del sistema de expresión y por tanto de la célula huésped dependerá de la enzima lipolítica que vaya a ser producida, tal y como se discutirá con más detalle posteriormente.

Aunque se debe cuidar la selección de un sistema de expresión apropiado para producir una enzima lipolítica de primer lavado de la invención que comprende una adición de péptido en su terminal N y/o C (en particular cuando se usa una secuencia de ADN modificada para su producción), se ha descubierto que, cuando la adición de un péptido es el propéptido o parte del mismo normalmente asociado con la enzima lipolítica madre en cuestión, la adición del péptido (que constituye por tanto parte o la secuencia del propéptido completa) puede ser aplicada mediante la expresión de una secuencia de ADN que codifica la enzima lipolítica madre en cuestión en un sistema de expresión que es incapaz de procesar el polipéptido traducido de la manera habitual, y de este modo da lugar a la producción de una enzima que comprende una parte o el propéptido completo o una secuencia peptídica similar asociada a la proteína madura antes de su procesamiento. En este caso, el propéptido o secuencia peptídica similar constituye la adición del péptido. El pro-péptido o secuencia peptídica similar puede ser heterólogo u homólogo a la enzima madre y puede estar presente tanto en el terminal N como en el C de la enzima madre.

En consecuencia, si una extensión adecuada de aminoácidos ya está codificada en la prepro-forma de la enzima madre y esta extensión de aminoácidos es cortada durante el procesamiento de la enzima por un sistema de expresión dado, la adición del péptido puede ser aplicada cambiando el sistema de expresión huésped por un sistema en el que dicho procesamiento de dicha extensión de aminoácidos no se produzca, o modificando la secuencia de genes para eliminar el procesamiento postraduccional, p. ej. saturando la o las enzimas de procesamiento con una o más copias de un péptido de tipo pro- (por ejemplo una de las adiciones de péptidos mostradas aquí), o cambiando la secuencia pro-peptídica, p. ej. para eliminar un sitio de procesamiento postraduccional. En este caso la señal pre-peptídica secretora será cortada durante o después de la secreción, dando por resultado una enzima modificada que consiste en la enzima madre que comprende el pro-péptido o parte del mismo o una secuencia péptida similar codificada por la secuencia de ADN correspondiente, es decir una enzima lipolítica que está extendida en su extremo N-terminal o en el C-terminal.

En otras palabras, la enzima lipolítica de primer lavado de la invención que comprende una adición de un péptido puede ser diseñada y/o producida por un método que comprende:

el cultivo de una célula huésped transformada con una secuencia de ADN que codifica la enzima lipolítica madre incluyendo sus (pre)pro secuencias, bajo condiciones adecuadas para la producción de enzimas, comprendiendo al menos una parte o la pro(pre)-secuencia completa, la célula huésped siendoincapaz o ineficiente en el procesamiento de la pro-enzima que va a ser expresada en la enzima madura, y la recuperación y opcionalmente la purificación de la enzima modificada resultante.

La secuencia de ADN que codifica la enzima lipolítica madre puede estar presente en un vector de expresión, cuando es transformado en la célula huésped.

La célula huésped puede ser de un origen diferente al de la enzima madre, p. ej. de un género distinto del que se deriva la enzima madre, o puede tener otra maquinaria de procesamiento postraduccional que la fuente de la enzima madre. Se ha descubierto que las células de levadura son particularmente útiles para la aplicación de adiciones de péptidos (en forma de propéptido o una parte del mismo) en enzimas lipolíticas madre micóticas filamentosas, en particular en variantes de enzimas lipolíticas de H. Lanuginosa, debido al diferente sistema de procesamiento de las células de levadura en comparación con las células micóticas filamentosas. Ejemplos de células de levadura adecuadas para este objetivo son las células derivadas de una cepa de Saccharomyces sp., en particular Saccharomyces cerevisiae, o una cepa de Hansenula sp.

En una forma de realización alternativa y muy preferida, la enzima lipolítica de primer lavado de la invención que comprende una adición de péptido ha sido diseñada y/o producida por un método que comprende las fases siguientes:

a) sometimiento de una secuencia de ADN que codifica la enzima lipolítica madre con una adición de péptido a mutagénesis aleatoria localizada en la adición del péptido o en una parte no estructural del extremo C-terminal o N-terminal de la enzima madre,

b) expresión de la secuencia de ADN mutada obtenida en el paso a) en una célula huésped,

c) selección de células huésped que expresen una enzima lipolítica mutada con un rendimiento mejorado en comparación con la enzima lipolítica madre,

d) selección de una enzima lipolítica mutada de entre aquellas que resultan de la fase c) la cual, cuando está presente en la composición de detergente A y/o B con 12500 LU/l de detergente, es capaz de eliminar al menos un 15% más de manteca de cerdo de una muestra de una mancha de manteca de cerdo, que la misma composición de detergente sin la enzima, en un ensayo de lavado de un ciclo como el que se describe en la presente.

Mediante este enfoque se han creado varias enzimas lipolíticas de primer lavado muy ventajosas con adiciones de péptido diferentes. La adición del péptido presente en la secuencia de ADN que va a ser mutagenizada puede estar constituida o comprender la prosecuencia o una parte de la misma normalmente asociada a la enzima lipolítica madre, o puede ser cualquier otra adición peptídica, p. ej. una de las adiciones peptídicas ilustradas arriba. Cada una de las fases a)-d) puede ser realizada tal y como se describe en las secciones más abajo tituladas "Mutagénesis aleatoria" y "Mutagénesis aleatoria localizada".

La enzima lipolítica madre

La enzima lipolítica madre que va a ser modificada según la invención puede ser de cualquier origen. Así, la enzima puede ser de origen mamífero, vegetal, vertebrado o cualquier otro origen. No obstante, actualmente se prefiere que la enzima sea de origen microbiano por el hecho de que se ha descubierto que varias cepas microbianas producen enzimas particularmente útiles para objetivos detergentes.

Más específicamente, la enzima lipolítica madre puede ser derivada de un hongo, es decir una levadura o un hongo filamentoso. Por ejemplo, la enzima puede ser derivada de un hongo filamentoso de la clase de Plectomycetes, preferiblemente del orden de Eurotiales y más preferiblemente de la familia de tipo Eremascaceae, Monoascaceae, Pseudoeurotiaceae y Trichocomaceae, esta última incluyendo géneros como Emericella, Aspergillus, Penicillium, Eupenicillium, Paecilomyces, Talaromyces, Thermoascus y Sclerocleista. Más específicamente, la enzima madre puede ser una que se pueda derivar de una cepa de una Humicola sp., p. ej. H. brevispora, H. lanuginosa, H. brevis var. thermoidea y H. insolens (US 4,810,414), una cepa de una Rhizomucor sp., p. ej. Rh. miehei (EP 238023), una cepa de una Rhizopus sp., p. ej. R. delemar (Hass et al., (1991), Gene 109, 107-113), R. niveus (Kugimiya et al., (1992) Biosci.Biotech. Biochem 56, 716-719) o R. oryzae, una cepa de una Candida sp., p. ej. C. cylindracea (también llamada C. rugosa) o C. antarctica (WO 88/02775) o C. antarctica lipasa A o B (EP 214 761), una cepa de una Fusarium sp., p. ej. F. oxysporum (EP 130,064) o F. solani pisi (WO 90/09446) o variantes de la misma (WO 94/14964), F. solani pisi (GB 2 296 011), una cepa de una Venturia spp., p. ej. V. inaequalis, una cepa de una Colletotrichum spp., p. ej. C. gloeosporioides, o C. lagenarium, una cepa de Geotricum, p. ej. G. candidum (Schimada et al., (1989), J.Biochem., 106, 383-388), una cepa de Aspergillus, p. ej. A. Niger, o una variante de enzima lipolítica Aspergillus sp. (EP 167,309), o una cepa de una Penicillium spp., p. ej. P. spinulosum o P. camembertii (Yamaguchi et al., (1991)), Gene 103, 61-67).

En el presente contexto, "forma derivable" no sólo indica una enzima producida por una cepa del organismo en cuestión, sino también una enzima codificada por una secuencia de ADN aislada de dicha cepa y producida en un organismo huésped transformado con dicha secuencia de ADN. Además, el término indica una enzima que es codificada por una secuencia de ADN de origen sintético y/o de ADNc y que tiene las características de identificación de la enzima en cuestión. Finalmente, el término abarca variantes de la enzima, p. ej. que tienen una o más mutaciones en comparación con la enzima de origen natural, o enzimas homólogas que pueden ser enzimas de origen natural producidas por otras cepas u organismos, las cuales, p. ej. pueden ser aisladas mediante hibridación a sondas oligonucleótidas preparadas basándose en la secuencia de aminoácidos o de ADN de cualquiera de las enzimas anteriores (las condiciones de hibridación implican preremojo en 5xSSC y prehibridación durante 1 h a \sim40ºC en una solución de formamida al 20%, 5xsolución de Denhardt, 50 mM de fosfato sódico, pH 6.8, y 50 g de ADN de timo de ternero ultrasónico desnaturalizado, seguido de hibridación en la misma solución completada con 100 M ATP durante 18h a \sim40ºC, u otros métodos descritos por Sambrook et al., 1989) o las cuales son immunológicamente de reacción cruzada con dichas enzimas (p. ej. como se determina en el método de Hudson et al., 1989).

Particularmente interesante como enzima lipolítica madre es una derivable de una cepa de H. lanuginosa, p. ej. la cepa H. lanuginosa DSM 4109, p. ej. la forma madura de la enzima descrita en EP 305 216 o una variante de la misma como se describe en WO 92/05249, WO 94/01541, WO 94/14951, WO 94/25577, PCT/DK94/00079 (todas de Novo Nordisk A/S), las cuales son incorporadas en la presente como referencia.

A lo largo de toda la presente solicitud el nombre Humicola lanuginosa ha sido usado para identificar una enzima madre preferida, es decir, la mencionada inmediatamente arriba. No obstante, en los últimos años H. lanuginosa también ha sido denominada Thermomyces lanuginosus (una especie introducida por primera vez por Tsiklinsky en 1989) ya que el hongo muestra similitud morfológica y fisiológica con Thermomyces lanuginosus. En consecuencia, se entenderá que siempre que se hace referencia a H. lanuginosa, este término podría ser reemplazado por Thermomyces lanuginosus. El ADN que codifica parte del gen ribosomal 18S de Thermomyces lanuginosus (o H. lanuginosa) ha sido secuenciado. La secuencia resultante 18S fue comparada con otras secuencias 18S en la base de datos GenBank y también se realizó un análisis filogenético usando parsimonia (PAUP, Versión 3.1.1, Smithsonian Institution, 1993). Esto asigna claramente el Termomyces lanuginosus a la clase de Plectomycetes, probablemente al orden Eurotiales. Según el navegador Entrez Browser en el NCBI (National Center for Biotechnology Information), esto relaciona el Thermomyces lanuginosus a familias como Eremascaceae, Monoascaceae, Pseudoeurotiaceae y Trichocomaceae, ésta última incluyendo géneros como Emericella, Aspergillus, Penicillium, Eupenicillium, Paecilomyces, Talaromyces, Thermoascus y Sclerocleista.

La enzima lipolítica madre que va a ser modificada según la presente invención puede ser derivada de una bacteria. Por ejemplo, la secuencia de ADN que codifica la enzima lipolítica madre se puede derivar de una cepa de Pseudomonas spp., como Ps. cepacia, Ps. alcaligenes, Ps. pseudoalcaligenes, Ps. mendocina (también denominada Ps. putida), Ps. syringae, Ps. aeroginosa, Ps. wisconsinensis (WO 96/12012) o Ps. fragi, una cepa de Bacillus spp., p. ej. B. subtilis o B. pumilus o una cepa de Streptomyces sp., p. ej. S. scabies.

En relación a las lipasas Pseudomonas sp. se ha descubierto que las lipasas de los organismos siguientes tienen un alto grado de homología, por ejemplo al menos un 60% de homología, al menos un 80% de homología o al menos un 90% de homología, y por tanto se considera que pertenecen a la misma familia de lipasas: Ps. TCC21808, la lipasa Pseudomonas sp. comercialmente disponible como Liposam®, Ps. aeruginosa EF2, Ps. aeruginosa PAC1R, Ps. aeruginosa PAO1, Ps. aeruginosa TE3285, Ps. sp. 109, Ps. pseudoalcaligenes MI, Ps. glumae, Ps. cepacia DSM3959, Ps. cepacia M-12-33, Ps. sp. KWI-56, Ps. putida 1E03458, Ps. putida 1E012049 (Gilbert, E. J., (1993), Pseudomonas lipases: Biochemical properties and molecular cloning. Enzyme Microb. Technol., 15, 634-645). La especie Pseudomonas cepacia ha sido recientemente reclasificada como Burkholderia cepacia, aunque es denominada Ps. cepacia en la presente solicitud.

Algunos ejemplos específicos de éstas comprenden una enzima lipolítica de Pseudomonas, p. ej. Ps. fragi, Ps. stutzeri, Ps. cepacia y Ps. fluorescens (WO 89/04361), o Ps. plantarii o Ps. gladioli (US 4,950,417) o Ps. alcaligenes y Ps. pseudoalcaligenes (EP 218 272, EP 331 376, o WO 94/25578 (que describe variantes de la enzima lipolítica Ps. pseudoalcaligenes con la mutación M21S, M21L o M21A), las variantes de Pseudomonas sp. descritas en EP 407 225, o una enzima lipolítica Pseudomonas sp., como la enzima lipolítica Ps. mendocina descrita en WO 88/09367 y US 5,389,536 o variantes de las mismas, como las descritas en US 5,352,594.

Otros ejemplos específicos comprenden una enzima lipolítica de Bacillus, como la enzima lipolítica de B. subtilis (Dartois et al., (1993) Biochemica et Biophysica acta 1131, 253-260) o B. stearothermophilus (JP 64/7744992) o B. pumilus (WO 91/16422) y una enzima lipolítica de Chromobacterium (especialmente una derivable de C. viscosum).

Ejemplos específicos de enzimas lipolíticas fácilmente disponibles comercialmente que pueden servir como enzimas lipolíticas madre según la invención comprenden Lipolase®,Lipolase® Ultra (disponibles por Novo Nordisk A/S).

Ejemplos de otras enzimas lipolíticas específicamente contempladas por ser modificables según la invención son Lumafast®, es decir una enzima lipolítica Ps. mendocina y Lipomax®, es decir una enzima lipolítica Ps. alcaligenes, una lipasa Fusarium solani (cutinasa) de Unilever, una lipasa de Bacillus sp. de Solvay enzymes (US 5427936, EP 528828); y Liposam®, (una lipasa Ps. mendocina de Showa Denko) y otras lipasas de Pseudomonas sp. descritas en WO 95/06720 que han sida secuenciadas y se ha descubierto que tienen la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID Nº 99.

Debe enfatizarse que la enzima lipolítica madre que va a ser modificada según la invención puede ser cualquiera de las enzimas lipolíticas arriba mencionadas y cualquier variante, modificación, o truncamiento de las mismas. Ejemplos de tales enzimas madres que son específicamente contempladas comprenden las enzimas descritas en WO 92/05249, WO 94/01541, WO 94/14951, WO 94/25577, WO 95/22615 y variantes de lipasas creadas por ingeniería genética de una proteína como se describe en EP 407 225; una lipasa Ps. mendocina creada por ingeniería genética de una proteína como se describe en US 5,352,594; una variante de cutinasa como se describe en WO 94/14964; una variante de una enzima lipolítica de Aspergillus como se describe en la patente EP 167,309; y la lipasa de Pseudomonas sp. descrita en WO 95/06720.

Variantes específicas de la enzima lipolítica H. Lanuginosa de primer lavado

Para facilitar la referencia, las variantes específicas de la invención se describen usando la siguiente nomenclatura: Aminoácido/s originale/s:posición/es:aminoácido/s sustituidos.

Según esta nomenclatura, por ejemplo, la sustitución de ácido aspártico por valina en la posición 96 se muestra como:

Asp 96 Val o D96V

una eliminación de ácido aspártico en la misma posición se muestra como:

Asp 96 * o D96*

y una inserción de un residuo de aminoácido adicional como lisina se muestra como:

Asp 96 ValLys o D96VK

Las mutaciones múltiples se separan por signos de suma, i.e.:

Asp 96 Val + Glu 87 Lys o D96V+E87K

que representan mutaciones en las posiciones 96 y 87 que sustituyen ácido aspártico y ácido glutámico por valina y lisina, respectivamente.

Cuando uno o más residuos de aminoácidos alternativos pueden ser insertados en una posición se indica como D96V,N o D96V o D96N.

Además, cuando una posición adecuada para una modificación es identificada aquí sin ninguna modificación específica sugerida, debe entenderse que cualquier residuo aminoácido puede ser sustituido por el residuo aminoácido presente en la posición. Así, por ejemplo, cuando se menciona una modificación de un ácido aspártico en la posición 96, pero no se especifica, debe entenderse que el ácido aspártico puede ser eliminado o sustituido por cualquier otro aminoácido, i.e. cualquier R,N,A,C,Q,E,G,H,I,L,K,M,F,P,S,T,W,Y,V u otro residuo de aminoácido insertado en esa posición.

Finalmente, cuando una mutación de la enzima lipolítica madre H. lanuginosa es identificada aquí, se entiende que comprende una mutación de un residuo de aminoácido que ocupa una posición homóloga en una enzima lipolítica que tiene sustancialmente la misma estructura o una estructura o una secuencia de aminoácidos que puede ser alineada con la de la enzima H. lanuginosa (p. ej. las enzimas lipolíticas Rhizopus oryzae, Rhizomucor miehei, Absídia sp. y Penicillium camembertii mencionadas aquí). La posición homóloga puede ser fácilmente identificada mediante la comparación de las estructuras.

Las variantes de la enzima lipolítica H. Lanuginosa pueden estar caracterizadas por ser una combinación de al menos dos variantes madre diferentes que se han descubierto o que indican independientemente un buen rendimiento de lavado o, de lo contrario, propiedades interesantes del modo descrito anteriormente. El buen rendimiento de lavado puede p. ej. ser determinado como se describe en el ejemplo 6. La combinación entre las variantes madre puede ser aleatoria o específica. En relación con la presente invención se ha descubierto que se obtienen resultados particularmente interesantes cuando las variantes madre que se combinan contienen una mutación en al menos una, aunque preferiblemente en más de las posiciones siguientes: 1, 2, 3, 4, 5, 19, 49, 53, 56, 57, 59, 62, 83, 85, 90, 94, 96, 97, 99, 101, 102, 111, 116, 126, 127, 137, 167, 170, 181, 187, 210, 221, 225, 234, 239, 249, 252 256, 263, 264, 267, por ejemplo al menos una o preferiblemente más de las mutaciones siguientes:

E1K, El S, V2G, S3T, Q4P, D5E, A19T, A49P,Y53C, E56K, D57G, G59V, D62R, S83T, S85F, 190F, N94K, F95L, D96A, D96H, D96L, L97M, E99K, N1O1S, D102Y, D111N, S116P, Q126R, K127C, D137G, D167G, S170P, F181L, V187A, E210K, E210V, W221 L, W221A, G225P, D234R, D234Y, E239C, Q249R, I252L, P256T, G263A, L264Q, T267R.

Se entenderá que las mutaciones anteriores o las posiciones mutadas pueden estar presentes en la misma enzima lipolítica madre, aunque preferiblemente en varias de las enzimas lipolíticas madre diferentes que van a ser combinadas. En particular, se ha descubierto que una enzima lipolítica de primer lavado de H. lanuginosa de la invención puede ser una combinación de al menos dos de las siguientes variantes madre de enzimas lipolíticas H. Lanuginosa o parte de estas variantes:

(a) E56R+D57L+190F+D96L+E99K

(b) E56R+D57L+V60M+D62N+S83T+D96P+D102E

(c) D57G+N94K+D96L+L97M

(d) E87K+G91A+D96R+I100V+E129K+K237M+1252L+P256T+G263A+L264Q

(e) E56R+D57G+S58F+D62C+T64R+E87G+G91A+F95L+D96P+K981

(f) E210K

(g) S83T+N94K+D96N

(h) E87K+D96V

(i) N94K+D96A

(j) E87K+G91A+D96A

(k) D167G+E210V

(1) S83T+G91A+Q249R

(m) E87K+G91A

(n) S83T+E87K+G91A+N94K+D96N+D111 N

(o) N73D+E87K+G91A+N941+D96G

(p) L67P+176V+S83T+E87N+190N+G91A+D96A+K98R

(q) S83T+E87K+G91A+N92H+N94K+D96M

(s) S85P+E87K+G91A+D96L+L97V

(t) E87K+190N+G91A+N94S+D96N+I100T

(u) 134V+S54P+F80L+S85T+D96G+R108W+G109V+D111G+S116P+L124S+V132M+V140Q+V141A+F142
S+H145R+N 162T+1166V+F181P+F183S+R205G+A243T+D254G+F262L,

(v) N94K, D96A, Q249R,

(w) E87K, G91A, D96W, D102N

Métodos adecuados para combinar variantes madre diferentes están descritos más adelante en la sección titulada "Combinación de secuencias de ADN que codifican enzimas lipolíticas". Un método particularmente adecuado es el que se describe en la sección de Materiales y Métodos en la presente invención.

En otra forma de realización, la enzima lipolítica de primer lavado de la invención es una variante de la enzima lipolítica de H. lanuginosa (cuya secuencia de aminoácidos se muestra en EP305216) la cual comprende una mutación en al menos una, aunque preferiblemente en más de las posiciones siguientes: 1, 2, 3, 4, 5, 19, 49, 53, 56, 57, 59, 62, 83, 85, 90, 94, 96, 97, 99, 101, 102, 111, 116, 126, 127, 137, 167, 170, 181, 187, 210, 221, 225, 234, 239, 249, 252 256, 263, 264, 267, por ejemplo al menos una o preferiblemente más de las mutaciones siguientes, E1K, E1S, V2G, S3T, Q4P, D5E, A19T, A49P, Y53C, E56K, D57G, G59V, D62R, S83T, S85F, 190F, N94K, F95L, D96A, D96H, D96L, L97M, E99K, NIOIS, D102Y, D111N, S116P, Q126R, K127C, D137G, D167G, S170P, F181 L, V187A, E210K, E210V, W221L, W221A, G225P, D234R, D234Y, E239C, Q249R, I252L, P256T, G263A, L264Q, T267R

En una forma de realización más específica, la enzima lipolítica de primer lavado de la invención es una variante de una enzima lipolítica H. lanuginosa, en la que al menos uno de los residuos de aminoácidos siguientes ha sido sustituido por otro residuo aminoácido:

A49, G59, S85, 190, S116, Q126, D137, S170 o W221.

Aunque los residuos de aminoácidos arriba identificados pueden ser reemplazados por cualquier otro de los 19 residuos de aminoácidos posibles, se prefiere que el residuo aminoácido sea reemplazado de la forma siguiente:

A49P, G59V, S85F, 190F, S116P, Q126R, D137G, S170P o W221L o por un residuo aminoácido que pertenece al mismo grupo de carga (cf. la definición de abajo) que el del residuo aminoácido insertado, p. ej. A49T en lugar de A49P. Si un residuo aminoácido cargado negativamente es reemplazado, p. ej. D137, se prefiere que sea reemplazado por un residuo aminoácido que pertenezca a un grupo de carga positiva o a un grupo neutral, p. ej. D137G,N,K, tal y como se define abajo:

Grupo de carga negativa: D,E

Grupo de carga positiva: K,R,H

Grupo neutral: I,C,S,T,P,W,M,G,A,P,N,Y,Q,L,V

Se contempla que una variante que comprende una mutación en las posiciones siguientes es capaz de exhibir actividad de primer lavado o un rendimiento de lavado mejorado:

D57X+N94(K o R)+D96X+L97X+Q249(K o R)

N94(K o R)+D96X+L97X+Q249(K o R)

N94(K o R)+D96X+Q249(K o R)

D137X+D167X+E210X+W221X

D137X+D167X+E21OX

190X+D96X+E99X+V187X

190X+D96X+E99X

I90(F o W o Y)+D96X+E99X

E56X+D57X+D62X+S85X+D96X+D102X+E210XN94(K o R)+F95L+D96X+D234X,

donde X, puede ser cualquier residuo de aminoácido y puede ser idéntico, idéntico en pares o diferente.

Una variante de enzima lipolítica de H. Lanuginosa de la invención puede comprender las mutaciones siguientes:

D57G+N94K+D96L+Q249R

D57G+N94K+D96L+S116P+Q249R

D57G+G59V+N94K+D96L+Q249R

D57G+N94K+D96L+S116P+S170P+Q249R

D57G+G59V+N94K+D96L+S170P+Q249R

D57G+N94K+D96L+S 170P+Q249R

D167G+E210V+Q249R

E56K+D167G+E210V

D137G+D167G+E210V+Q249R

D167G+E210V+W221L+Q249R

D57G+N94K+F95L+D96H,L+Q249R

D57G+N94K+D96L+E210K

D57G+G59V+N94K+D96L+S116P+S170P+Q249R

S3R+D137G+D167G+E210V+W221L

D137G+D167G+E210V+W221L+N233R

S3R+190F+D96L+E99K+V187A+Q249R

I90F+D96L+E99K+V187A+D233R

I90F+D96L+E99K+V187A+D234Y

I90F+D96L+E99K+V187A+T231R

I90F+D96L+E99K+V187A

D62R+190F+D96L+E99K+V187A

I90F+D96L+E99K+V187A+N200R+R209A

I90F+D96L+E99K+V187A+T199R+N200R+R209A

D57G+D62R+N94K+D96L+Q249R

D57G+N94K+D96L+N200R+R209A+Q249R

D57G+N94K+D96L+T199R+N200R+Q249R

I90F+D96L+E99K+V187A+T199R

D57G+N94K+D96L+T199R+R209A+Q249R

I90F+D96L+E99K+V187A+Q249R

I90F+D96L+E99K+V187A+P253R

I90F+D96L+E99K+D137G+D167G+V187A+Q249R

I90F+D96L+E99K+D137G+V187A+Q249R

D96L+E99K+V187A+Q249R

V2P+N94K+D96L+Q249R

V2W+S3R+N94K+D96L+Q249R

V2R+S3R+N94K+D96L+Q249R

V2R+S3R+N94K+D96L+Q249R

V2 R+S3W+N94K+D96L+Q249R

V2W+S3R+N94K+D96L+Q249R

N94K+D96L+Q249R

V2G+S3T+D57G+N94K+D96L+L97M+Q249R

V2G+S3T+Q4P+D5E+D57G+N94K+D96L+L97M+Q249R

V2G+D5Q+L6M+D57G+N94K+D96L+L97M+Q249R

Las variantes siguientes son particularmente interesantes:

D57G+G59V+N94K+D96L+L97M+S116P+S170P+Q249R

A49P+D167G+E210V

E56K+D57G+D62R+S83T+S85F+D96L+D102Y+E210K

D57G+N94K+D96L+L97M+Q249R

D137G+D167G+E210V+W221L

N94K+F95L+D96H+N101S+F181L+D234Y+I252L+P256T+G263A+L264Q

190F+D96L+E99K+V187A

N94K+D96A+Q249R

A19P+D167G+E210V+W221L

N94K+D96L+L97M+Q249R

D57G+N94K+D96L+Q249R

I90F+D96L+E99K+D137G+V187A

N94K+D96L+E99K+Q249R

N94K+D96L+E99K+T231R+N233R+D234R+Q249R

N94K+D96L+E99K+D111N+F211A+G225P+Q249R+T267R

N94K+D96L+E99K+D111N+F211A+G225P+T231R+N233R+D234R+Q249R+ T267R

E1K+N94K+D96L+E99K+Q249R

N94K+D96L+K223R+Q249R

N94K+D96L+E99K+N233R

N94K+D96L+E99K+T231R+N233R+Q249R

N94K+D96L+E99K+N233R+Q249R

N94K+D96L+E99K+D234R+Q249R

La variante de la invención puede ventajosamente comprender una mutación adicional en la posición E1, la mutación siendo una eliminación de E1 o una sustitución de E por cualquier otro residuo aminoácido, en particular P o S.

Además, las variantes específicas anteriores pueden comprender cualquiera de las extensiones peptídicas N-terminal o C-terminal discutidas aquí, ejemplos específicos son SPIRR, TAIRPRK, SPIRPRP, SPPRRP, RP, GPIRPRP, SRSRHNA, SALRPRK, STRRPRP, SPRRPRT, APPPRPRPLLPIS, SPIRK, SPPRPRP, WP, SPPPRPRP, SPIRRP, APPPRPRPRPR o SPIRPR. Una extensión N-terminal es p. ej. aplicada al residuo aminoácido El de la lipasa madre madura o es aplicada al residuo aminoácido 2-20, por ejemplo 2, 3, 4 ó 5 de la enzima madre madura, el residuo E1 (y opcionalmente más residuos de aminoácidos de la parte no estructural de la enzima madre, p. ej. residuos de aminoácidos dentro de la parte 2-20 N-terminal de la enzima madre madura) siendo eliminado. Además, la adición de un péptido puede ser aplicada de modo que uno o más de los últimos residuos de aminoácidos de las extensiones peptídicas mencionadas aquí sustituye a los residuos aminoácidos de la enzima madre madura que ocupan la posición 1, y opcionalmente 2, y otras posiciones. Por ejemplo, la extensión peptídica "``SPPRRP''" puede ser aplicada sustituyendo E1 de la lipasa madre madura de H. lanuginosa por la última "P" de la adición del péptido y substituyendo el propéptido de tipo salvaje "SPIRR" por "SPPRR".

Cuando no se van a realizar sustituciones en la parte N-terminal de la enzima madre madura, la adición N-terminal puede ser aplicada bien como resultado de las variantes que se han expresado en S. cerevisiae (si la extensión N-terminal es idéntica a (una parte de) el propéptido de la enzima madre, o más preferiblemente mediante la modificación relevante de la parte de la secuencia de ADN que codifica la enzima madre, la cual codifica la (pre)pro secuencia u otra secuencia corriente abajo del codón que codifica el residuo aminoácido 1 de la enzima madre madura.

Las variantes de la invención más preferidas actualmente comprenden:

SPIRPRP+D57G+N94K+D96L+Q249R

SPPRRP+I90F+D96L+E99K+D137G+V187A

SPIRPRP+N94K+D96L+L97M+Q249R

SPPPRPRP+N94K+D96L+L97M+Q249R

SPIRPRP+D57G+N94K+D96L+L97M+Q249R

SPPRRP+I90F+D96L+E99K+V187A

SPIRPRP+D137G+D 167G+E21V+W221L

E1SPIRPRP+I90F+D96L+E99K+V187A

E1SRKRKRK+I90F+D96L+E99K+V187A

E1SPRIKPRIK+I90F+D96L+E99K+V187A

E1SPPRRP+D62R+I90F+D96L+E99K+V187A

E1SPPRRP+I90F+D96L+E99K+V187A+N200R+R209A

E1SPPRRP+I90F+D96L+E99K+V187A+T199R+N200R+R209A

E1SPIRPRP+D57G+D62R+N94K+D96L+Q249R

E1SPIRPRP+D57G+N94K+D96L+N200R+R209A+Q249R

E1SPIRPRP+D57G+N94K+D96L+T199R+N200R+Q249R

E1SPPRRP+I90F+D96L+E99K+V187A+T199R

E1SPIRPRP+D57G+N94K+D96L+T199R+R209A+Q249R

E1SPIRPRP+I90F+D96L+E99K+V187A+Q249R

E1SPPRRP+I90F+D96L+E99K+V187A+P253R

E1SPPRRP+I90F+D96L+E99K+D137G+D167G+V187A+Q249R

E1SPPRRP+I90F+D96L+E99K+D137G+V187A+Q249R

E1SPPRRP+D96L+E99K+V187A+Q249R

E1SPPRPR+V2P+N94K+D96L+Q249R

E1SPPWWP+V2W+S3R+N94K+D96L+Q249R

E1SPPWRP+V2R+S3R+N94K+D96L+Q249R

E1SPPRWP+V2R+S3R+N94K+D96L+Q249R

E1SPPWWP+V2R+S3W+N94K+D96L+Q249R

E1SPPRWP+V2W+S3R+N94K+D96L+Q249R

E1SPPRWP+V2R+S3W+N94K+D96L+Q249R

E1SPPRWP+N94K+D96L+Q249R

E1SPPRRP+N94K+D96L+Q249R

E1APPPRPRPRPRP+V2G+S3T+D57G+N94K+D96L+L97M+Q249R

E1APPPRTRPRPRS+V2G+S3T+Q4P+D5E+D57G+N94K+D96L+L97M+Q249R

E1APPPKASPRQRP+V2G+D5Q+L6M+D57G+N94K+D96L+L97M+Q249R

SCIRR+N94K+D96L+E239C+Q249R

E1SPPRRP+D57G+N94K+D96L+Y53C+K127C+Q249R

E1SPPRRPR+V2R+S3P+N94K+D96L+Q249R

E1SPPWPRP+V2R+S3P+N94K+D96L+Q249R

E1SPPRRP+N94K+D96L+E99K

E1SPPRRP+N94K+D96L+E99K+Q249R

E1SPPCGRRP+N94K+D96L+E239C+Q249R

E1SPCRPRP+N94K+D96L+E239C+Q249R

SPPCRRRP+N94K+D96L+E239C+Q249R

y las variantes descritas en los Ejemplos posteriores. Cuando una extensión N-terminal está presente en las variantes específicas anteriores, la nomenclatura "E1...." indica que E en la posición 1 ha sido reemplazado por el último residuo aminoácido de la adición del péptido enumerado como "E1", los residuos restantes habiendo sido fundidos al residuo aminoácido que ocupa la posición 1. Por ejemplo, "EISPPEQP" indica que el residuo aminoácido El ha sido reemplazado por "P" y que los residuos restantes "``SPPEQ''" han sido fundidos a E1P. En la práctica, este tipo de variantes se construyen convenientemente reemplazando residuos de aminoácidos (-5)-(-1) de la enzima madre no procesada por los residuos de aminoácidos relevantes de la extensión del péptido y reemplazando E1 por el residuo aminoácido relevante, las sustituciones siendo realizadas mediante la introducción de las mutaciones relevantes en la secuencia de ADN correspondiente, y posteriormente produciendo la variante resultante en un sistema de expresión que permite que al menos una parte de las variantes expresadas mantengan su extensión N-terminal (como se describe posteriormente aquí). Donde no se indican sustituciones de E1, la adición del péptido N-terminal es simplemente fundida al residuo aminoácido que ocupa la posición 1 de la enzima madre madura.

Las variantes anteriores han sido inicialmente construidas usando los métodos de mutagénesis aleatoria y/o de redistribución de genes de la invención y posteriormente caracterizadas con respecto a las mutaciones introducidas de ese modo. Es evidente que un método alternativo de construcción de estas variantes podría basarse en mutagénesis dirigida usando sondas oligonucleótidas adecuadas según los métodos conocidos en la técnica.

Se contempla que el buen rendimiento de lavado/actividad de primer lavado se mantendrá cuando una de las mutaciones específicas individuales anteriores sea reemplazada por una mutación de un residuo aminoácido que pertenezca al mismo grupo de carga que la mutación antes sugerida. Por ejemplo, la mutación N94K puede ser reemplazada por N94R, H, la "G" en la mutación D137G o D167G puede ser reemplazada por uno de los otros residuos de aminoácidos que pertenecen al grupo neutral, etc. Además, puede ser ventajoso reemplazar un residuo aminoácido del grupo neutral por uno que pertenezca al grupo de carga positiva, p. ej. la "G" en D137G y D167G, respectivamente, puede ser reemplazada por K, R o H dando como resultado las mutaciones D137K,R,H y D167K, R,H, respectivamente.

Como se ha mencionado anteriormente la enzima lipolítica de H. lanuginosa está estructuralmente muy relacionada con otras enzimas lipolíticas, como las que se pueden derivar de Rhizomucor miehei, Penicillium camembertii, Absidia sp. y las diversas Rhizopus sp. descritas aquí. En consecuencia, se cree que las modificaciones correspondientes a las anteriormente mencionadas en las lipasas de H. lanuginosa e introducidas en posiciones homólogas en otra enzima lipolítica estructuralmente relacionada, también serán funcionales con respecto al rendimiento de primer lavado. En consecuencia, en otro aspecto, la invención se refiere a una variante de una enzima lipolítica madre de primer lavado que tiene una secuencia de aminoácidos o una estructura tridimensional que puede ser alineada con la secuencia o estructura de aminoácidos de la lipasa de H. lanuginosa (con p. ej. al menos un 20% de identidad de secuencia, lo que permite espacios o una similitud de proteína global de al menos un 50%, o al menos un 60% o un 70% usando el programa UWGGG GAP o una similitud "estructural"), cuya secuencia de aminoácidos ha sido modificada para introducir mutaciones correspondiente a las de la lipasa de H. lanuginosa anteriormente mencionadas y/o para introducir residuos de aminoácidos que se encuentran en la lipasa de tipo salvaje de H. lanuginosa en la enzima lipolítica madre en cuestión. Los residuos de aminoácidos o las posiciones que van a ser modificadas en las lipasas estructural o secuencialmente homólogas pueden ser identificadas a partir de una alineación de la estructura/secuencia relevante con la de la lipasa de H. lanuginosa. Este tipo de variantes pueden ser construidas por un método de construcción de variantes de enzimas lipolíticas de primer lavado preparadas a partir de una enzima lipolítica madre que expone homología estructural y/o secuencial con la lipasa de H. lanuginosa tales enzimas lipolíticas están identificadas arriba), dicho método comprende la alineación de la secuencia de la enzima madre en cuestión con la de la lipasa de H. lanuginosa o una variante de primer lavado de la misma, o superponiendo la estructura de la enzima madre en cuestión con la de la lipasa de H. lanuginosa o una variante, identificando la o las posiciones en la enzima madre que son homólogas a las posiciones de la lipasa de H. lanuginosa o de una variante que se cree esencial para conseguir la actividad de primer lavado (cf las mutaciones descritas arriba), y sustituyendo el residuo aminoácido que ocupa la posición relevante según t, y que producen la variante de enzima resultante.

Clonación de una secuencia de ADN que codifica una enzima lipolítica madre

La secuencia de ADN que codifica una enzima lipolítica madre a partir de la cual se crea una enzima lipolítica de primer lavado según la presente invención puede ser aislada de cualquier célula o microorganismo que produzca la enzima madre en cuestión usando los métodos conocidos en la técnica.

Por ejemplo, la secuencia de ADN puede ser aislada estableciendo una biblioteca genómica o de ADNc de un organismo que se supone que alberga la secuencia, y seleccionando los clones positivos mediante procedimientos convencionales. Ejemplos de tales procedimientos son la hibridación de sondas oligonucleótidas preparadas basándose en la secuencia de aminoácidos o de ADN de la enzima madre (si la información de las secuencia está disponible) o de una enzima lipolítica relacionada (si la información de la secuencia en relación a la enzima madre no está disponible) según técnicas estándares (cf. Sambrook et al., 1989), y/o la selección de clones que expresan actividad lipolítica, y/o la selección de clones que producen una proteína que es reactiva con un anticuerpo preparado contra una enzima lipolítica madre.

Un método preferido de aislamiento de una secuencia de ADN que codifica una enzima lipolítica madre que va a ser modificada según la invención, a partir de una biblioteca genómica o de ADNc, es el uso de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) usando sondas oligonucleótidas degeneradas preparadas basándose en la secuencia de ADN o de aminoácidos de la enzima madre. Por ejemplo, la PCR puede ser realizada usando las técnicas descritas en la patente US Nº. 4,683,202 o en R.K. Saiki et al. (1988).

De forma alternativa, la secuencia de ADN que codifica la enzima madre puede ser preparada sintéticamente por métodos estándares establecidos, p. ej. por el método de la fosfoamidita descrito por Beaucage y Caruthers (1981), o el método descrito por Mattes et al. (1984). Según el método de la fosfoamidita, los oligonucléotidos son sintetizados, p. ej. en un sintetizador de ADN automático, purificados, recocidos, ligados y clonados en vectores apropiados.

Finalmente, la secuencia de ADN que codifica la enzima madre puede ser preparada a partir de ADN de origen genómico y sintético mezclado, sintético y ADNc mezclado o ADNc y genómico mezclado, preparado ligando fragmentos de ADNc de origen sintético y de origen genómico (como sea apropiado), los fragmentos correspondiendo a varias partes de la secuencia completa de ADN que codifica la enzima madre, según las técnicas estándar.

Métodos de construcción de variantes de enzimas lipolíticas de primer lavado

Como se verá claramente en la breve descripción de la invención, los presentes inventores han desarrollado un método muy eficaz para crear enzimas lipolíticas capaces de eliminar una cantidad sustancial de materia grasa durante el ensayo de un ciclo de lavado, tal y como se describe aquí.

Así, en una forma de realización muy preferida la enzima lipolítica de la invención es una variante de una enzima lipolítica madre de origen natural que es el resultado de un proceso que comprende al menos las fases siguientes:

(a) expresión de una variedad de secuencias de ADN mutadas, originadas a partir de una enzima lipolítica madre, en células huésped adecuadas;

(b) selección de las células huésped que expresan una enzima lipolítica mutada que tiene una menor dependencia al calcio y/o una tolerancia mejorada a un detergente o a un componente detergente en comparación con la enzima lipolítica madre; y

(c) selección de una enzima lipolítica mutada entre aquellas que resultan de la fase (b) las cuales, cuando están presentes en la composición de detergente A o B en una concentración de 12500 LU/l, es capaz de eliminar al menos un 15% más de manteca de cerdo de una muestra de una mancha de manteca de cerdo, que la misma composición de detergente sin la enzima, en un ensayo de lavado de un ciclo como se describe en la presente.

La variedad de secuencias de ADN mutadas a las que se hace referencia en la fase (a) puede ser obtenida convenientemente sometiendo una secuencia de ADN que codifica la enzima lipolítica madre a mutagénesis con el fin de formar secuencias de ADN mutadas. Aunque la mutagénesis puede ser realizada por cualquier método adecuado, como mutagénesis dirigida, actualmente se prefiere que la mutagénesis se realice como mutagénesis aleatoria. Así, usando la mutagénesis aleatoria es posible crear un número mucho más alto de secuencias de ADN mutadas que lo que sería posible usando la mutagénesis dirigida. La mutagénesis aleatoria se explica con más detalle abajo en la sección titulada "Mutagénesis aleatoria". En esta sección también se describe cómo una o varias de las fases (a)-(c) del método pueden ser repetidas una o varias veces con el objetivo de realizar mejoras sucesivas.

Por ejemplo, la enzima lipolítica mutada seleccionada en la primera ronda de las fases (a)-(c) es sometida a una segunda ronda del método en la que la fase de selección (b) implica la selección en condiciones más rigurosas que las usadas en la fase de selección (b) de la primera ronda, seleccionando de este modo enzimas lipolíticas mutadas con una menor dependencia al calcio y/o una tolerancia mejorada a un detergente o a un componente detergente en comparación con la enzima lipolítica mutada que resulta de la primera ronda.

Mutagénesis aleatoria

La mutagénesis aleatoria de la secuencia de ADN que codifica la enzima lipolítica madre (o la adición de un péptido) realizada según la fase a) del método anterior puede convenientemente llevarse a cabo usando cualquier método conocido en la técnica.

Por ejemplo, la mutagénesis aleatoria puede realizarse usando un agente de mutagenización físico o químico adecuado, usando un oligonucleótido adecuado, o sometiendo la secuencia de ADN a mutagénesis generada por PCR. Además, la mutagénesis aleatoria puede realizarse usando cualquier combinación de estos agentes de mutagenización.

El agente de mutagenización puede, p. ej., ser uno que induce transiciones, transversiones, inversiones, aleatorizaciones, eliminaciones, y/o inserciones.

Ejemplos de un agente de mutagenización físico o químico adecuado para el presente objetivo incluyen irradiación ultravioleta (UV), hidroxilamina, N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina (MNNG), O-metil hidroxilamina, ácido nitroso, etil metano sulfonato (EMS), bisulfito de sodio, ácido fórmico, irradiación gamma, 1-metil-3-nitro-1-nitrosoguanidina (NTG), y nucleótidos análogos.

Cuando se usa este tipo de agentes la mutagénesis normalmente se lleva a cabo mediante la incubación de la secuencia de ADN que codifica la enzima madre que va a ser mutagenizada en presencia del agente de mutagenización elegido, bajo las condiciones adecuadas para que tenga lugar la mutagénesis, y la selección del ADN mutado con las propiedades deseadas.

Cuando la mutagénesis se realiza usando un oligonucleótido, el oligonucleótido puede ser dopado o ensartado con los tres nucleótidos no madre, durante la síntesis del oligonucleótido en las posiciones que quieren ser cambiadas. El dopaje o ensartado puede realizarse de tal modo que se evitan los codones de aminoácidos indeseados, reduciéndose la cantidad o evitando completamente los nucleótidos que resultan de estos codones. Se pueden utilizar los conocimientos del estado de la técnica y programas informáticos para calcular la mezcla óptima de nucleótidos para un aminoácido preferido dado. El oligonucleótido dopado o ensartado puede ser incorporado en el ADN que codifica la enzima lipolítica mediante cualquier técnica publicada usando p. ej. PCR, LCR (reacción en cadena de la ligasa) o cualquier ADN de polimerasa y ligasa.

Cuando se usa una mutagénesis generada por PCR, un gen tratado o no tratado químicamente que codifica una enzima lipolítica madre es sometido a PCR bajo unas condiciones que aumentan la no incorporación de nucleótidos (Deshler 1992, Leung et al. 1989).

Una cepa mutágena de E. coli (Fowler et al. 1974), S. cerevisiae o cualquier otro organismo microbiano puede ser usada para la mutagénesis aleatoria del ADN que codifica la enzima lipolítica, por ej. transformando un plásmido que contiene la enzima madre en la cepa mutágena, haciendo crecer la cepa mutágena con el plásmido y aislando el plásmido mutado de la cepa mutágena. El plásmido mutado puede posteriormente ser transformado en el organismo de expresión.

La secuencia de ADN que va a ser mutagenizada puede convenientemente estar presente en una biblioteca genómica o de ADNc preparada a partir de un organismo que expresa la enzima lipolítica madre. De forma alternativa, la secuencia de ADN puede estar presente en un vector adecuado, como un plásmido o un bacteriófago, el cual puede ser incubado como tal con el agente de mutagenización o en caso contrario expuesto al mismo. El ADN que va a ser mutagenizado puede también estar presente en una célula huésped, estando integrado en el genoma de dicha célula o bien estando presente en un vector albergado en la célula. Finalmente, el ADN que va a ser mutagenizado puede estar en forma aislada. La secuencia de ADN que va a ser sometida a mutagénesis aleatoria es preferiblemente un ADNc o una secuencia de ADN genómico.

En algunos casos, la secuencia de ADN mutada puede ser convenientemente amplificada antes de llevar a cabo la expresión o selección. Esta amplificación puede ser realizada según los métodos conocidos en la técnica, el método actualmente preferido es la amplificación generada por PCR usando sondas oligonucleótidas preparadas basándose en el ADN o en la secuencia de aminoácidos de la enzima madre.

Tras la incubación con el agente de mutagenización o la exposición al mismo, el ADN mutado es expresado mediante el cultivo de una célula huésped adecuada que incluye la secuencia de ADN, bajo condiciones que permiten que tenga lugar la expresión. La célula huésped usada para este propósito puede ser una que haya sido transformada con la secuencia de ADN mutada, opcionalmente presente en un vector, o una que incluya la secuencia de ADN que codifica la enzima madre durante el tratamiento de mutagénesis. Ejemplos de células huéspedes adecuadas se dan más abajo. Se prefiere particularmente el uso de una célula de levadura como célula huésped, en particular cuando la enzima lipolítica madre es derivada de un hongo, por ejemplo un hongo filamentoso o una levadura. La secuencia de ADN mutada puede además comprender una secuencia de ADN que codifica funciones que permiten la expresión de la secuencia de ADN mutada.

Se entenderá que el criterio de selección mencionado en la fase (b) del método de la invención ha sido cuidadosamente elegido. En consecuencia, y sin limitarse a ninguna teoría, la selección de una menor dependencia al calcio con pH alcalino (pH superior a 7) se cree que tiene como resultado variantes con un rendimiento mejorado general, ya que la necesidad de calcio puede ser considerada como un factor de limitación para una actividad óptima, en particular la mayoría de las condiciones de lavado se caracterizan por el hecho de que la concentración de iones de calcio libre es deliberadamente reducida por los agentes quelantes en la matriz detergente (constructores).

El detergente o componente detergente al cual la variante tiene una mejor tolerancia puede ser de cualquier tipo, p. ej. de la forma descrita más abajo. Preferiblemente, el componente de detergente es un agente tensioactivo no iónico, aniónico, catiónico, de ion bipolar o anfotérico. Ejemplos de agentes tensioactivos no iónicos comprenden un etoxilato de alcohol, ejemplos de agentes tensioactivos aniónicos comprenden LAS, alquil sulfato, alcohol etoxi sulfato, y similares. La elección del detergente, p. ej., depende de la debilidad inherente (en relación a las tolerancias detergentes) de la enzima lipolítica madre.

En relación a las enzimas lipolíticas de Humicola lanuginosa y enzimas homólogas (como las enzimas lipolíticas de Penicillium, Rhizomucor, Rhizopus y Absidia sp.), se considera que una tolerancia mejorada a un agente tensioactivo no iónico como un etoxilato de alcohol, un ejemplo comercialmente disponible del mismo es Dobanol® 25-7, puede ser indicativa de un rendimiento de lavado mejorado. En relación a las enzimas lipolíticas de tipo Pseudomonas, por ejemplo P. pseudoalcaligenes, P. cepacia, se considera que una tolerancia mejorada a un agente tensioactivo aniónico como un alquil sulfato (un ejemplo comercialmente disponible del mismo es NEODOL 45) o LAS (un ejemplo comercialmente disponible del mismo es Nansa 1169/P) puede ser indicativa de un rendimiento de lavado mejorado.

La selección de la fase (b) se realiza convenientemente mediante el uso de un ensayo de filtro basado en el principio siguiente:

Un microorganismo capaz de expresar la enzima lipolítica mutada de interés es incubado en un medio adecuado y bajo condiciones adecuadas para que la enzima sea segregada, el medio estando provisto de un filtro doble que comprende un primer filtro de enlace de proteínas y encima del mismo un segundo filtro que expone una baja capacidad de enlace de proteínas. El microorganismo se sitúa en el segundo filtro. Tras la incubación, el primer filtro que comprende las enzimas segregadas de los microorganismos es separado del segundo filtro que comprende los microorganismos. El primer filtro es sometido a una selección de la actividad enzimática deseada y las colonias microbianas correspondientes presentes en el segundo filtro son identificadas.

De forma alternativa, el segundo filtro que incluye las colonias puede ser usado directamene en la placa de selección. Esto hace más fácil escoger las colonias correctas y en algunos casos ofrece una señal más fuerte. El uso de un solo filtro, ya sea de enlace de proteínas o sin enlace de proteínas, es suficiente en muchos casos.

El filtro usado para enlazar la actividad enzimática puede ser cualquier filtro de enlace de proteínas p. ej. nilón o nitrocelulosa. El filtro superior que incluye las colonias del organismo de expresión puede ser cualquier filtro que tenga ninguna o poca afinidad a las proteínas de enlace p. ej. acetato de celulosa o Durapore(tm). El filtro puede ser pretratado con cualquiera de las condiciones para ser usado para la selección, o puede ser tratado durante la detección de la actividad enzimática.

La actividad enzimática puede ser detectada por un colorante, por fluorescencia, precipitación, indicador del pH, absorbencia IR o cualquier otra técnica conocida para la detección de la actividad enzimática.

El compuesto de detección puede ser inmovilizado por cualquier agente de inmovilización p. ej. agarosa, ágar, gelatina, poliacrilamida, almidón, papel de filtro, tela, o cualquier combinación de agentes de inmovilización.

La actividad lipolítica puede ser detectada por Verde Brillante, Rodamina B o Negro Sudán en combinación con un lípido p. ej. aceite de oliva o manteca de cerdo. El criterio de selección para la identificación de variantes de enzimas lipolíticas madre con un rendimiento de lavado mejorado puede ser p. ej. EGTA, EDTA, agentes tensoactivos no iónicos y/o aniónicos, pH alcalino, o cualquier composición de detergente en combinación con uno de los detectores anteriores de la actividad enzimática.

Tras la selección de la fase (b), las enzimas lipolíticas que tienen las propiedades deseadas (es decir según se definen por el criterio de selección) son aisladas y sus capacidad de primer lavado son evaluadas en el ensayo de lavado de un ciclo descrito en la sección de Materiales y Métodos.

Si la actividad de primer lavado de la enzima no es suficientemente buena después de una ronda del tratamiento anterior, la enzima puede ser modificada, p. ej. por mutagénesis dirigida o aleatoria, con el objetivo de mejorar la actividad de primer lavado de la enzima, p. ej. según cualquiera de los principios dados más arriba para la modificación de las lipasas con el objetivo de conseguir un rendimiento de primer lavado.

De forma más conveniente, las células huésped producidas en la fase (b) pueden ser sometidas a más rondas de mutagénesis, tal y como se ha definido anteriormente en las fases (a)-(b) y opcionalmente (c), usando convenientemente criterios de selección más rigurosos que los empleados en el tratamiento de mutagénesis previo. Las rondas adicionales de mutagénesis pueden ser aleatorias, aleatorias localizadas o dirigidas, con el fin de introducir mutaciones ventajosas previamente identificadas, en particular D96L, Q249R, E87K, D254K, E210K, o introducir mutaciones aleatorias en regiones seleccionadas, p. ej. la zona de contacto lipídica, en particular mutaciones aleatorias con oligonucléotidos dopados o ensartados para la introducción de residuos de aminoácidos positivos y/o hidrofóbicos, o introducir cualquiera de las otras mutaciones específicas mencionadas aquí. De forma alternativa, los genes que codifican enzimas lipolíticas madre homólogas diferentes pueden ser combinados de manera aleatoria con el objetivo de obtener una variante nueva que incluye una o más mutaciones de cada variante. Esto se describe con más detalle abajo en la sección titulada "Combinación de secuencias de ADN que codifican enzimas lipolíticas".

Las células huéspedes seleccionadas en las fases (b) o (c) pueden ser usadas directamente para la producción de la variante de la enzima lipolítica. De forma alternativa, el ADN que codifica la variante puede ser aislado de la célula huésped e insertado en otra célula huésped adecuada, usando de forma conveniente el procedimiento descrito abajo en la sección titulada "Expresión de una variante de la invención", en la que también se enumeran células huésped adecuadas.

Mutagénesis aleatoria localizada

Según la invención, la mutagénesis aleatoria puede ventajosamente estar localizada en una parte de la enzima lipolítica madre en cuestión. Esto puede ser ventajoso, p. ej., cuando una región determinada de la enzima ha sido identificada como de particular importancia para una propiedad de la enzima dada, y que, cuando es modificada, se espera que dé como resultado una variante con propiedades mejoradas. Esta región puede normalmente ser identificada cuando se determina la estructura terciaria de la enzima madre y se relaciona con la función de la enzima.

Un área de interés particular para la modificación de residuos de aminoácidos localizados en la superficie de la enzima madre dentro o fuera de la zona de contacto lipídica, es la parte de la enzima lipolítica que está en contacto con el substrato lipídico y que comprende p. ej. la región de la tapa, el injerto hidrofóbico o cualquier parte de estas estructuras. Otra área de interés para las enzimas lipolíticas de la invención es la que contiene una adición de un péptido u otra modificación dentro de una parte no estructural del extremo N-terminal o C-terminal de la enzima madre madura.

La mutagénesis aleatoria localizada se realiza usando convenientemente técnicas de mutagénesis generada por PCR del modo descrito anteriormente o cualquier otra técnica adecuada conocida en la técnica. Especialmente para mutagenizar adiciones de péptidos grandes, puede ser relevante emplear mutagénesis generada por PCR (p. ej. como se describe en Deshler 1992 o Leung et al., 1989), en la que se usa una o más sondas oligonucleótidas adecuadas que se sitúan a los lados del área que va a ser mutagenizada. Para la mutagénesis de adiciones de péptidos más cortos, es más preferible llevar a cabo una mutagénesis aleatoria localizada usando oligonucléotidos dopados o ensartados. El dopaje o ensartado se usa, p. ej., para evitar codones de residuos de aminoácidos no deseados o para aumentar la probabilidad de un tipo particular de residuo aminoácido, por ejemplo un residuo aminoácido cargado positivamente o hidrofóbico, introducido en una posición deseada.

De forma alternativa, la secuencia de ADN que codifica la parte de la secuencia de ADN que va a ser modificada puede ser aislada, p. ej. siendo insertada en un vector adecuado, y dicha parte puede posteriormente ser sometida a mutagénesis usando cualquiera de los métodos de mutagénesis mencionados anteriormente.

Particularmente interesante es el hecho de que la secuencia de ADN sometida a mutagénesis aleatoria comprende una parte o constituye una parte de la secuencia de ADN que codifica la zona de contacto lipídica o la región de la tapa de la enzima lipolítica madre. La mutagénesis aleatoria localizada puede ser realizada en una o varias de estas regiones yio en una o varias de las regiones que constituyen la zona de contacto lipídica, y es preferiblemente realizada en al menos dos de las regiones. Enzimas lipolíticas madre particularmente interesantes para la modificación según este aspecto de la invención incluyen la enzima lipolítica de H. lanuginosa que puede ser obtenida de la cepa DSM 4109 o una variante o análoga de la misma, una enzima lipolítica madre derivada de Penicillium camembertii, una enzima lipolítica madre derivada de Rhizopus oryzae, una enzima lipolítica madre derivada de Rhizomucor miehei, una enzima lipolítica madre derivada de una enzima lipolítica Absidia sp., una enzima lipolítica madre derivada de un Pseudomonas sp., preferiblemente perteneciente a la familia Ps. aeroginosa, por ejemplo la lipasa Pseudomonas cepacia, la lipasa Pseudomonas pseudoalcaligenes, la lipasa Pseudomonas glumae, la Pseudomonas mendocina, la lipasa Pseudomonas wisconsinensis, o Pseudomonas sp. (SD705) (Liposam®) mostrada en la SEC ID Nº 99.

Las zonas de contacto lipídicas y las regiones de la tapa están identificadas en la sección de Definiciones anterior.

La mutagénesis aleatoria localizada puede realizarse usando oligonucléotidos dopados, los cuales son dopados en la dirección de L, I, V, F, W, A (residuos aminoácidos hidrofóbicos) o K,R (residuos aminoácidos positivos), por ejemplo bajo condiciones que aseguran aproximadamente un 90-93% de tipo salvaje y aproximadamente un 7-10% mutante. Ejemplos específicos de regímenes de dopaje adecuados se dan en la sección de ejemplos más adelante.

Recombinación in vivo

Según una forma de realización preferida de la invención, una secuencia de ADN que codifica una enzima lipolítica de primer lavado puede ser construida mediante un método que, como una fase importante, implica la combinación de secuencias de ADN seleccionadas que codifican diferentes enzimas lipolíticas madre o partes de dichas secuencias de ADN.

Preferiblemente, las secuencias de ADN que van a ser combinadas son derivadas de genes que codifican enzimas lipolíticas con un lavado y/o un rendimiento de lavado de la vajilla satisfactorio (p. ej. como se identifica en el ejemplo 6). El objetivo de la combinación de las secuencias de ADN es que los mejores elementos de cada "enzima madre" se combinen en una misma variante de enzima.

En el presente contexto el término "rendimiento de lavado satisfactorio" indica que las enzimas madre son capaces de eliminar manchas de grasa durante uno o varios ciclos de lavado cuando están presentes en un detergente adecuado. Preferiblemente, la enzima madre en cuestión tiene un mejor rendimiento de lavado que la Lipolase(TM).

La combinación de secuencias de ADN se puede realizar por cualquier método adecuado conocido en la técnica. Por ejemplo, cuando las secuencias de ADN que van a ser combinadas comprenden fragmentos homólogos, la combinación se logra preferiblemente mediante el cruce de homólogos, p. ej. usando métodos convencionales como en US 5, 093, 257, o mediante la redistribución de genes (Stemmer (1994), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 91, 10747-10751; Stemmer (1994), Nature, vol. 370, 389-391; Smith (1994), Nature vol 370, p. 324-25), WO 95/17413. La redistribución de genes significa la recombinación de una o varias secuencias nucleótidas entre dos o más secuencias de ADN homólogas, lo que da como resultado secuencias de ADN con varios nucleótidos intercambiados.

Particularmente interesante es un método de redistribución de genes in vivo basado en el procedimiento siguiente:

a) formación de al menos un vector de expresión circular que comprende una secuencia de ADN que codifica una enzima lipolítica madre o una parte sustancial de la misma,

b) apertura de dicho vector de expresión circular dentro de la secuencia de ADN que codifica la enzima lipolítica o parte de la misma,

c) preparación de al menos un fragmento de ADN que comprende una secuencia de ADN homóloga por lo menos a una parte de la zona de codificación de la enzima en al menos uno de los vectores de expresión circulares,

d) introducción de al menos uno de dichos vectores abiertos, junto con al menos uno de dichos fragmentos homólogos de ADN que cubren toda la longitud de las secuencias de ADN que codifican dicha enzima lipolítica o una parte de la misma, en una célula huésped recombinante,

e) cultivo de dicha célula huésped recombinante de levadura bajo condiciones propicias para que tenga lugar la recombinación entre los fragmentos de ADN homólogos, y

f) selección de las variantes de enzimas lipolíticas positivas con un rendimiento de lavado mejorado.

El vector usado en la fase a) anterior puede ser un vector de expresión de levadura que puede ser transformado y expresado en una célula huésped recombinante de levadura. Ejemplos de tales vectores de expresión comprenden vectores de expresión de levadura construidos a partir de pYES 2.0 (Invitrogene), por ejemplo el pJSO37 que comprende el gen de lipasa Humicola lanuginosa de tipo salvaje.

La apertura del vector en la fase b) puede ser realizada mediante cualquier técnica convencional conocida en la técnica, y puede por ejemplo realizarse abriendo el vector dentro del gen de lipasa mediante el corte de un solo sitio o mediante el "espaciamiento" del vector (es decir, el corte de p. ej. dos sitios, lo que da como resultado el corte de una pequeña parte del gen).

La preparación de los fragmentos homólogos de ADN en la fase c) puede realizarse amplificando las secuencias homólogas de ADN (p. ej. comprendiendo una o más mutaciones en el gen lipolítico y comprendiendo un plásmido o un vector) mediante cualquier método adecuado, por ejemplo un método de amplificación por PCR estándar descrito en US 4,683,202 o Saiki et al., (1988), Science 239, 487-491).

Los vectores pueden ser introducidos en la célula huésped recombinante (en la fase d) mediante transformación. En el caso de la célula huésped recombinante de una cepa de Sacaromices cerevisiae, como Sacaromices cerevisiae YNG318 (descrita abajo), la transformación puede ser realizada como se describe en Sambrooks et al., (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor, NY, USA).

La selección de variantes de enzimas lipolíticas positivas puede, p. ej., ser realizada mediante el método de selección descrito en relación a la mutagénesis aleatoria anterior.

Se puede realizar más de un ciclo de las fases a) a f) antes de llevar a cabo una selección de una variante de enzima lipolítica de primer lavado usando las condiciones de selección definidas más arriba.

Según el método de redistribución, significativamente más de dos secuencias de ADN pueden ser redistribuidas. Al mismo tiempo puede ser redistribuido cualquier número de fragmentos de ADN diferentes y enzimas lipolíticas homólogas incluido en los plásmidos adecuados.

Las secuencias de ADN que van a ser combinadas pueden ser genes completos de los cuales al menos una parte exhibe una homología suficiente con respecto a los otros genes para permitir que tenga lugar la recombinación de los genes. De forma alternativa, las secuencias de ADN pueden ser genes parciales, los cuales cuando son combinados pueden originar un gen funcional capaz de expresar una enzima lipolítica.

Cuando las secuencias de ADN que van a ser combinadas son muy homólogas o parcialmente idénticas, se puede realizar una combinación controlada, p. ej. en el caso de una combinación de dos secuencias de ADN, para combinar la parte N-terminal de una de las secuencias con la parte C-terminal de la otra (que corresponde a la parte restante de la primera secuencia) o para combinar otras partes relevantes de los genes respectivos en cuestión.

Las enzimas de origen natural pueden ser genéticamente modificadas mediante mutagénesis aleatoria, aleatoria localizada o dirigida, del modo descrito anteriormente, antes de ser sometidas a la redistribución de genes. De forma alternativa, una parte de una enzima puede ser reemplazada por una parte de otra, con el fin de obtener una enzima quimérica. Esta sustitución puede conseguirse por técnicas convencionales de empalme de genes in vitro o por recombinación in vivo o por una combinación de ambas técnicas. Cuando se usan técnicas convencionales de empalme de genes in vitro, una parte deseada del gen de la enzima lipolítica puede ser eliminada usando enzimas de restricción apropiadas específicas de un sitio; la parte eliminada de la secuencia de codificación puede luego ser reemplazada mediante la inserción de una parte deseada de una secuencia de codificación diferente de la enzima lipolítica, de modo que se produce una secuencia nucleótida quimérica que codifica una enzima lipolítica nueva. De forma alternativa, los genes de la enzima lipolítica pueden ser fundidos, p. ej. usando el método de adición por superposición por PCR descrito por Higuchi et al. 1988. Las técnicas de recombinación in vivo dependen del hecho de que segmentos de ADN diferentes con regiones altamente homólogas (identidad de la secuencia de ADN) puedan recombinarse, es decir, romperse e intercambiar el ADN, y establecer enlaces nuevos en las regiones homólogas. En consecuencia, cuando las secuencias de codificación de dos o más enzimas lipolíticas diferentes pero homólogas se utilizan para transformar una célula huésped, la recombinación de secuencias homólogas in vivo dará como resultado la producción de secuencias de genes quiméricos. La traducción de estas secuencias de codificación por la célula huésped dará como resultado la producción de un producto de un gen quimérico de la enzima lipolítica. Técnicas de recombinación in vivo específicas están descritas en US 5,093,257 y EP 252 666.

Con el objetivo de permitir que tenga lugar una recombinación homóloga, es deseable que las enzimas lipolíticas comprendan partes que sean al menos un 60% homólogas. Particularmente se prefiere que las enzimas enteras sean al menos un 60% homólogas. Las enzimas que se van a combinar pueden ser variantes diferentes de la misma enzima madre, p. ej. variantes derivadas de la enzima lipolítica H. lanuginosa descrita aquí, o variantes derivadas de las enzimas lipolíticas Ps. alcaligenes o Ps. Pseudoalcaligenes, a las que se hace referencia más arriba, o variantes derivadas de la enzima lipolítica F. solani pisi (cf arriba), o variantes derivadas de la enzima lipolítica P. mendocina o la lipasa Pseudomonas sp. (Liposam) (cf. arriba). Se entenderá que la recombinación aleatoria puede ser realizada entre enzimas lipolíticas de origen natural y una o más variantes de dicha enzima, entre enzimas de origen natural diferentes, entre variantes de enzimas de origen natural (las variantes pueden ser variantes de la misma enzima madre o de enzimas diferentes), o entre cualquier combinación de enzimas de origen natural y variantes de enzimas de origen natural, siempre que las secuencias de ADN correspondientes sean capaces de recombinarse. Cuando las secuencias de ADN que se van a combinar son variantes de una enzima madre, estas variantes pueden convenientemente ser preparadas por mutagénesis, en particular por el método de mutagénesis aleatoria descrito arriba.

En una forma de realización alternativa, la enzima híbrida puede ser sintetizada por métodos químicos estándares conocidos en la técnica. Por ejemplo, ver Hunkapiller et al. (1984). En consecuencia, los péptidos que tienen las secuencias de aminoácidos anteriormente descritas pueden ser sintetizados completamente o en parte y unidos para formar las enzimas híbridas de la invención.

En una forma de realización muy preferida, las enzimas lipolíticas de primer lavado de la invención son construidas por un método que comprende: sometimiento de una enzima lipolítica madre a mutagénesis, en particular a mutagénesis aleatoria, para formar una variedad de secuencias de ADN mutadas, expresión de las secuencias de ADN mutadas en un huésped adecuado y selección de las células huéspedes que produzcan una enzima lipolítica mutada con una menor dependencia al calcio y/o una tolerancia mejorada a un detergente o a un componente de detergente, sometimiento de la secuencia de ADN que codifica la enzima lipolítica mutada seleccionada por recombinación in vivo, en particular por redistribución de genes o por PCR sexual, con una o más secuencias de ADN mutadas preparadas de una manera similar a partir de la misma enzima lipolítica madre, expresión de las secuencias de ADN mutadas y recombinadas en un huésped adecuado, opcionalmente selección de las células huéspedes que produzcan una enzima lipolítica mutada con una menor dependencia al calcio y/o una tolerancia mejorada a un detergente o a un componente de detergente, opcionalmente repetición de uno o ambos procedimientos anteriores de mutagénesis y de recombinación in vivo una o más veces usando criterios de selección más rigurosos, y finalmente selección de una secuencia de ADN recombinada que codifica una enzima lipolítica que expone actividad de primer lavado tal y como se define en la presente invención.

Además, se entenderá que una enzima lipolítica de primer lavado de la invención que comprende una adición de un péptido así como mutaciones en una parte estructural de la enzima madre puede ser construida por un método que implica mutagénesis localizada, en particular mutagénesis aleatoria localizada, en la parte de la secuencia de ADN que codifica la adición del péptido y en partes seleccionadas de la secuencia de ADN que codifican la parte madura de la enzima lipolítica madre, es decir, una combinación del método de mutagénesis aleatoria según el segundo aspecto de la invención, realizado en una parte estructural de la enzima madre, y mutagénesis aleatoria en una parte no estructural del extremo N-terminal y/o C-terminal y/o en una adición de un péptido aplicada a la parte N-terminal y/o C-terminal.

Se entenderá que la recombinación in vivo y los métodos de mutagénesis descritos aquí pueden ser aplicados a cualquiera de las enzimas lipolíticas madre mencionadas en la sección "Enzimas lipolíticas madre" en la presente invención. Las enzimas lipolíticas madre particularmente preferidas son las derivadas de Humicola lanuginosa y de Pseudomonas sp., como Ps. alcaligenes y Ps. pseudoalcaligenes.

Expresión de una enzima lipolítica de la invención

Una secuencia de ácido nucleico aislada que codifica una enzima lipolítica de primer lavado de la invención puede ser manipulada de una variedad de formas para proporcionar la expresión de la enzima. La manipulación de la secuencia de ácido nucleico que codifica una enzima lipolítica de primer lavado antes de su inserción en un vector puede ser deseable o necesaria dependiendo del vector de expresión. Las técnicas de modificación de secuencias de ácidos nucleicos utilizando métodos de donación se conocen bien en la técnica.

El término "secuencias de control" está definido aquí comprendiendo todos los componentes que son necesarios o ventajosos para la expresión de la secuencia de codificación de la secuencia de ácido nucleico. Cada secuencia de control puede ser nativa o extraña de la secuencia de ácido nucleico que codifica la enzima lipolítica. Tales secuencias de control comprenden, pero sin limitarse a éstas, una guía, una secuencia de poliadenilación, una secuencia propeptídica, un promotor, una secuencia señal, y un terminador de transcripción. Como mínimo, las secuencias de control comprenden un promotor, y señales de parada transcripcional y traduccional. Las secuencias de control pueden estar provistas de conectores con el objetivo de introducir sitios de restricción específicos que faciliten la ligadura de las secuencias de control con la zona de codificación de la secuencia de ácido nucleico que codifica la enzima lipolítica. La secuencia de control puede ser una secuencia promotora apropiada, una secuencia de ácido nucleico que es reconocida por una célula huésped para la expresión de la secuencia de ácido nucleico. La secuencia promotora contiene secuencias de control de transcripción y de traducción que intervienen en la expresión de la enzima lipolítica de primer lavado. El promotor puede ser cualquier secuencia de ácido nucleico que muestre actividad transcripcional en la célula huésped elegida y se puede obtener a partir de genes que codifican polipéptidos extracelulares o intracelulares, homólogos o heterólogos a la célula huésped. Ejemplos de promotores adecuados para dirigir la transcripción de las construcciones de ácido nucleico de la presente invención, especialmente en una célula huésped bacteriana, son los promotores obtenidos del operón E. coli lac, del gen de agarasa Streptomyces coelicolor (dagA), del gen de B. subtilis levansucrase (sacB) o del gen de proteasa alcalina, el gen de alfa-amilasa B. licheniformis (amyM), el gen de amilasa maltogénica B. stearothermophilus (amyM), el gen de alfa-amilasa B. amiloliquefaciens (amyQ), el gen B. licheniformis penicillinase (penP), los genes B. subtilis xylA y xylB, el gen de xilosidasa B. pumilus, y el gen procariótico beta-lactamasa o triptófano (Villa-Kamaroff et al., 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75:3727-3731), así como el gen tac (DeBoer et al., 1983, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 80:21-25). Otros promotores están descritos en "Useful proteins from recombinant bacteria" en Scientific American, 1980, 242:74-94; y en Sambrook et al., 1989, supra. Ejemplos de promotores adecuados para dirigir la transcripción de las construcciones de ácido nucleico de la presente invención en una célula huésped micótica filamentosa son los promotores obtenidos de los genes que codifican una amilasa TAKA de A.oryzae, una isomerasa de fosfato triosa de A. oryzae, una proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei, una alfa-amilasa neutral de A. Niger, una alfa-amilasa de ácido estable de A. Niger, una glucoamilasa (glaA) de A. Niger o de A. awamori, una lipasa de Rhizomucor miehei, una proteasa alcalina de A. oryzae, una isomerasa de fosfato triosa de A. oryzae, una acetamidasa de A. nidulans, una proteasa de tipo tripsina de Fusarium oxysporum (como se describe en la patente U.S. Nº. 4,288,627, que se incorpora aquí como referencia), o el promotor ADH-3 (McKnight et al., (1985), The EMBO J. 4, 2093-3099) e híbridos de los mismos. Promotores particularmente preferidos para ser usados en células huéspedes micóticas filamentosas son los promotores amilasa TAKA y glaA. En un huésped de levadura, los promotores de genes glicolíticos de levadura (Hitzeman et al., (1980), J. Biol. Chem. 255, 12073-12080; Alber y Kawasaki, (1982), J. Mol. Appl. Gen. 1, 419-434) o de genes de alcohol dehidrogenasa (Young et al., en Genetic Engineering of Microorganisms for Chemicals (Hollaen-der et al, eds.), Plenum Press, New York, 1982), o los promotores TPI1 (US 4,599,311) o ADH2-4c (Russell et al., (1983), Nature 304, 652-654). Se obtienen promotores útiles del gen de enolasa S. cerevisiae (ENO-1), el gen de galactoquinasa S. cerevisiae (GAL1), los genes alcohol dehidrogenasa/gliceraldehído-3-fosfato dehidrogenasa de S. cerevisiae (ADH2/GAP), y el gen 3-fosfoglicerato quinasa de S.cerevisiae. Otros promotores útiles para células huéspedes de levadura se describen en Romanos et al., 1992, Yeast 8:423-488.

La secuencia de control puede ser también una secuencia de terminación de transcripción adecuada, una secuencia reconocida por una célula huésped para terminar la transcripción. La secuencia de terminación está operativamente conectada al 3' terminal de la secuencia de ácido nucleico que codifica la enzima lipolítica modificada. La secuencia de terminación puede ser nativa de la secuencia de ácido nucleico que codifica la enzima lipolítica o puede ser obtenida por fuentes extrañas. Cualquier terminador que sea funcional en la célula huésped elegida puede ser usado en la presente invención. Los terminadores preferidos para células huéspedes micóticas filamentosas se obtienen de genes que codifican una amilasa TAKA de A. oryzae, una glucoamilasa de A. Niger, una antranilato sintasa de A. nidulans, una alfa-glucosidasa de A. Niger y una proteasa de tipo tripsina de Fusarium oxysporum. Los terminadores preferidos para células huéspedes de levadura se obtienen de genes que codifican una enolasa de S. cerevisiae, citocromo de S. cerevisiae C (CYC1), o gliceraldehído-3-fosfato dehidrogenasa de S.cerevisiae. Otros terminadores útiles para células huéspedes de levadura se describen en Romanos et al., 1992, supra.

La secuencia de control puede ser también una secuencia guía adecuada, una región no traducida de un ARNm que es importante para la traducción por la célula huésped. La secuencia guía está operativamente conectada al 5' terminal de la secuencia de ácido nucleico que codifica la enzima lipolítica. La secuencia guía puede ser nativa de la secuencia de ácido nucleico que codifica la enzima lipolítica o puede ser obtenida de fuentes extrañas. Cualquier secuencia guía que sea funcional en la célula huésped elegida puede ser usada en la presente invención. Las guías preferidas para células huéspedes micóticas filamentosas se obtienen de genes que codifican una amilasa TAKA de A. oryzae y una isomerasa de fosfato de triosa de A. oryzae. Las guías adecuadas para células huéspedes de levadura se obtienen del gen de enolasa de S. cerevisiae (ENO-1), el gen de fosfoglicerato-cinasa de S. cerevisiae, el factor alfa de S. cerevisiae, y los genes alcohol dehidrogenasa/gliceraldehído-3-fosfato dehidrogenasa (ADH2/GAP) de S. cerevisiae.

La secuencia de control puede ser también una secuencia de poliadenilación, una secuencia que está operativamente conectada al 3' terminal de la secuencia de ácido nucleico y que, cuando es transcrita, es reconocida por la célula huésped como una señal para añadir residuos de poliadenosina al ARNm transcrito. La secuencia de poliadenilación puede ser nativa de la secuencia de ácido nucleico que codifica la enzima lipolítica o puede ser obtenida de fuentes extrañas. Cualquier secuencia de poliadenilación que sea funcional en la célula huésped elegida puede ser usada en la presente invención. Las secuencias de poliadenilación preferidas para células huéspedes micóticas filamentosas se obtienen de los genes que codifican una amilasa TAKA de A. oryzae, una glucoamilasa de A. Niger, una antranilato sintasa de A. nidulans, y una alfa-glucosidasa de A. Niger. Secuencias de poliadenilación útiles para las células huéspedes de levadura se describen en Guo y Sherman, 1995, Molecular Cellular Biology 15:5983-5990. Las secuencias de poliadenilación se conocen bien en la técnica de las células huésped mamíferas.

La secuencia de control puede ser también una zona de codificación del péptido señal, que codifica una secuencia de aminoácidos conectada al terminal amino de la enzima lipolítica de primer lavado, la cual puede dirigir la enzima lipolítica de primer lavado expresada hacia la vía secretora de la célula. La zona de codificación del péptido señal puede ser nativa de la enzima lipolítica de primer lavado de la invención o puede ser obtenida de fuentes extrañas. El extremo 5' de la secuencia de codificación de la secuencia de ácido nucleico puede contener intrínsecamente una zona de codificación del péptido señal conectada de forma natural en el marco de lectura de traducción al segmento de la zona de codificación que codifica la enzima lipolítica de primer lavado segregada. De forma alternativa, el extremo 5' de la secuencia de codificación puede contener una zona de codificación del péptido señal que es extraña a la parte de la secuencia de codificación que codifica la enzima lipolítica de primer lavado segregada. La zona de codificación del péptido señal extraña puede ser necesaria en el lugar donde la secuencia de codificación normalmente no contiene una zona de codificación del péptido señal. De forma alternativa, la zona de codificación del péptido señal extraña puede simplemente reemplazar la zona de codificación del péptido señal natural con el objetivo de obtener una mejor secreción de la enzima lipolítica en comparación con la zona de codificación del péptido señal natural normalmente asociada a la secuencia de codificación. La zona de codificación del péptido señal puede ser obtenida a partir de una glucoamilasa o un gen de amilasa de una especie de Aspergillus, una lipasa o un gen de proteinasa de una especie de Rhizomucor, el gen del \alpha-factor de Sacaromices cerevisiae, una amilasa o un gen de proteasa de una especie de Bacillus, o el gen de preproquimosina de ternero. Una zona de codificación del péptido señal eficaz para las células huéspedes bacterianas es la zona de codificación del péptido señal obtenida del gen de amilasa maltogénica de Bacillus NCIB 11837, el gen de alfa-amilasa de B. stearothermophilus, el gen de subtilisina de B. licheniformis, el gen beta-lactamasa de B. licheniformis, los genes de proteasas neutrales de B. Stearothermophilus (nprT, nprS, nprM), y el gen PrsA de B. subtilis. Otros péptidos señal están descritos en Simonen y Palva, 1993, Microbiological Reviews 57:109-137. Una zona de codificación del péptido señal eficaz para células huéspedes micóticas filamentosas es la zona de codificación del péptido señal obtenida de un gen de amilasa TAKA de A. oryzae, un gen de amilasa neutral de A. Niger, el gen de proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei, el gen de celulasa de H. lanuginosa, o el gen de lipasa de Rhizomucor miehei. Los péptidos señal útiles para células huéspedes de levadura se obtienen de los genes del a-factor de S. cerevisiae y de S. cerevisiae invertasa. Otras regiones de codificación del péptido señal útiles están descritas en Romanos et al., 1992, supra. No obstante, cualquier zona de codificación del péptido señal capaz de dirigir la enzima expresada hacia la vía secretora de una célula huésped elegida puede ser usada en la presente invención.

Las construcciones de ácido nucleico de la presente invención pueden también comprender una o más secuencias de ácidos nucleicos que codifican uno o más factores que son ventajosos para la expresión de la enzima lipolítica de primer lavado, p. ej., un activador (p. ej., un factor de transacción), una chaperona y una proteasa de procesamiento. Lo ácidos nucleicos que codifican uno o más de estos factores no están necesariamente en tándem con la secuencia de ácido nucleico que codifica la enzima lipolítica de primer lavado. Un activador es una proteína que activa la transcripción de una secuencia de ácido nucleico que codifica una enzima lipolítica de primer lavado (Kudla et al., 1990, EMBO Journal 9:1355-1364; Jarai and Buxton, 1994, Current Genetics 26:2238-244; Verdier, 1990, Yeast 6:271-297). La secuencia de ácido nucleico que codifica un activador puede ser obtenida por los genes que codifican NprA (nprA) de B. stearothermophilus, la proteína activadora heme 1 (hapl) de S. cerevisiae, la proteína que metaboliza la galactosa 4 (Gal4) de S. cerevisiae, y la proteína de regulación de amonio de A. nidulans (areA). Para otros ejemplos ver Verdier, 1990, supra and MacKenzie et al., 1993, Journal of General Microbiology 139:2295-2307. Una chaperona es una proteína que ayuda a otro polipéptido a plegarse adecuadamente (Hartl et al., 1994, TIBS 19:20-25; Bergeron et al., 1994, TIBS 19:124-128; Demolder et al., 1994, Journal of Biotechnology 32:179-189; Craig, 1993, Science 260:1902-1903; Gething and Sambrook, 1992, Nature 355:33-45; Puig and Gilbert, 1994, Journal of Biological Chemistry 269:7764-7771; Wang and Tsou, 1993, The FASEB Journal 7:1515-11157; Robinson et al., 1994, BiolTechnology 1:381-384). La secuencia de ácidos nucleicos que codifica una chaperona puede ser obtenida por los genes que codifican las proteínas GroE de B. subtilis, la proteina disulfuro isomerasa de A. oryzae, calnexina de S. cerevisiae, BiP/GRP78 de S. cerevisiae, y Hsp70 de S. cerevisiae. Para otros ejemplos ver Gething and Sambrook, 1992, supra, and Hartl et al., 1994, supra. Cualquier factor que sea funcional en la célula huésped elegida puede ser usado en la presente invención.

También puede ser deseable añadir secuencias reguladoras que permiten la regulación de la expresión de la enzima lipolítica de primer lavado en relación al crecimiento de la célula huésped. Ejemplos de sistemas reguladores son los que hacen que la expresión del gen se active o desactive en respuesta a un estímulo químico o físico, incluyendo la presencia de un compuesto regulador. Los sistemas reguladores en los sistemas procarióticos comprenden los sistemas operadores lac, tac, y trp. En las levaduras puede usarse el sistema ADH2 o el sistema GAL1. En los hongos filamentosos, pueden usarse como secuencias reguladoras el promotor de alfa-amilasa TAKA, el promotor de glucoamilasa de A. Niger, y el promotor de glucoamilasa de A. oryzae. Otros ejemplos de secuencias reguladoras son aquellas que permiten la amplificación de genes. En los sistemas eucarióticos, comprenden el gen de dihidrofolato-reductasa, el cual es amplificado en presencia de metotrexato, y los genes de metalotioneína, que son amplificados con metales pesados. En estos casos, la secuencia de ácido nucleico que codifica la enzima lipolítica de primer lavado estaría situada en tándem con la secuencia reguladora.

Vectores de expresión

La presente invención también se refiere a vectores de expresión recombinantes que comprenden una secuencia de ácido nucleico de la presente invención, un promotor, y señales de parada transcripcional y traduccional. Las distintas secuencias de ácido nucleico y de control anteriormente descritas pueden ser unidas para producir un vector de expresión recombinante que puede comprender uno o más sitios de restricción convenientes para permitir la inserción o sustitución de la secuencia de ácido nucleico que codifica la enzima lipolítica de primer lavado en dichos sitios. De forma alternativa, la secuencia de ácido nucleico de la presente invención puede ser expresada insertando la secuencia de ácido nucleico o una construcción de ácido nucleico que comprende la secuencia dentro de un vector apropiado para la expresión. Al crear el vector de expresión, la secuencia de codificación está localizada en el vector de modo que la secuencia de codificación está operativamente conectada a las secuencias de control apropiadas para la expresión y posiblemente para la secreción.

El vector de expresión recombinante puede ser cualquier vector que pueda ser convenientemente sometido a procedimientos de ADN recombinante y que pueda llevar a cabo la expresión de la secuencia de ácido nucleico. La elección del vector normalmente dependerá de la compatibilidad del vector con la célula huésped en la cual el vector debe ser introducido. Los vectores pueden ser plásmidos lineales o circulares cerrados. El vector puede ser un vector de replicación autónoma, es decir, un vector que existe como una entidad extracromosomal, y cuya replicación es independiente de la replicación cromosómica, p. ej., un plásmido, un elemento extracromosomal, un minicromosoma o un cromosoma artificial. El vector puede contener cualquier medio para asegurar la autorreplicación. De forma alternativa, el vector puede ser uno que, una vez introducido en la célula huésped, se integre en el genoma y se replique junto con el o los cromosomas en los que se ha integrado. El sistema vector puede ser un único vector o plásmido o dos o más vectores o plásmidos que juntos contienen el ADN total que debe ser introducido en el genoma de la célula huésped, o un transposón.

Los vectores de la presente invención preferiblemente contienen uno o más marcadores seleccionables que permiten una selección fácil de las células transformadas. Un marcador seleccionable es un gen cuyo producto proporciona un biocido o resistencia vírica, resistencia a metales pesados, prototrofia a auxótrofos, y similares. Ejemplos de marcadores seleccionables bacterianos son los genes dal de B. subtilis o B. licheniformis, o los marcadores que confieren resistencia antibiótica, por ejemplo resistencia a ampicilina, canamicina, cloranfenicol o tetraciclina. Un marcador mamífero frecuentemente usado es el gen de dihidrofolato-reductasa. Marcadores adecuados para células huéspedes de levadura son ADE2, HIS3, LEU2, LYS2, MET3, TRP1, y URA3. Un marcador seleccionable para ser usado en una célula huésped micótica filamentosa puede ser seleccionado del grupo que incluye, pero sin limitarse, amdS (acetamidasa), argB (ornitina carbamoiltransferasa), bar (fosfinotricina acetiltransferasa), hygB (higromicina fosfotransferasa), niaD (nitrato reductasa), pyrG (orotidina-5'-fosfato-descarboxilasa), sC (sulfato adeniltransferasa), trpC (antranilato sintasa), y marcadores de resistencia al glufosinato, así como equivalentes de otras especies. Para el uso en una célula de Aspergillus se prefieren los marcadores amdS y pirG de A. nidulans o A. oryzae y el marcador bar de Streptomyces higroscopicus. Además, la selección puede ser realizada por co-transformación, p. ej., como se describe en WO 91/17243, donde el marcador seleccionable está en un vector separado.

Los vectores de la presente invención preferiblemente contienen un elemento o elementos que permiten una integración estable del vector en el genoma de la célula huésped o la replicación autónoma del vector en la célula independientemente del genoma de la célula.

Los vectores de la presente invención pueden integrarse en el genoma de la célula huésped en el momento de ser introducidos en una célula huésped. Para la integración, el vector puede depender de la secuencia de ácido nucleico que codifica la enzima lipolítica de primer lavado o de cualquier otro elemento del vector para una integración estable del vector en el genoma por recombinación homóloga o no homóloga. De forma alternativa, el vector puede contener secuencias de ácido nucleico adicionales para dirigir la integración mediante recombinación homóloga en el genoma de la célula huésped. Las secuencias de ácido nucleico adicionales permiten que el vector se integre en el genoma de la célula huésped en un lugar o lugares precisos en el o los cromosomas. Para aumentar la probabilidad de integración en un lugar preciso, los elementos de integración deberían contener preferiblemente un número suficiente de ácidos nucleicos, por ejemplo de 100 a 1,500 pares de bases, preferiblemente de 400 a 1,500 pares de bases, y más preferiblemente de 800 a 1,500 pares de bases, altamente homólogos con la secuencia objetivo correspondiente con el fin de mejorar la probabilidad de recombinación homóloga. Los elementos de integración pueden ser cualquier secuencia que no sea homóloga a la secuencia objetivo en el genoma de la célula huésped. Además, los elementos de integración pueden ser secuencias de ácidos nucleicos de no codificación o de codificación. Por otra parte, el vector puede integrarse en el genoma de la célula huésped por recombinación no homóloga. Estas secuencias de ácidos nucleicos pueden ser cualquier secuencia que sea homóloga a una secuencia objetivo en el genoma de la célula huésped y, además, pueden ser secuencias de no codificación o de codificación.

Para la replicación autónoma, el vector puede además comprender un origen de replicación que permita que el vector se replique de manera autónoma en la célula huésped en cuestión. Ejemplos de orígenes de replicación bacterianos son los orígenes de replicación de los plásmidos pBR322, pUC19, pACYC177, pACYC184, pUB110, pE194, pTA1060, y pAM\beta1. Ejemplos de orígenes de replicación para su uso en una célula huésped de levadura son el origen de replicación de 2 micras, la combinación de CENE y ARS4, y la combinación de CEN3 y ARS1. El origen de replicación puede ser uno que tenga una mutación que hace que su funcionamiento sea sensible a la temperatura en la célula huésped (ver, p. ej., Ehrlich, 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75:1433).

Más de una copia de una secuencia de ácido nucleico que codifica una enzima lipolítica de primer lavado de la presente invención puede ser inserta en la célula huésped con el fin de amplificar la expresión de la secuencia de ácido nucleico. Una amplificación estable de la secuencia de ácido nucleico puede obtenerse integrando al menos una copia adicional de la secuencia en el genoma de la célula huésped usando métodos bien conocidos en la técnica y seleccionando los transformantes.

Los procedimientos usados para ligar los elementos anteriormente descritos con el fin de construir los vectores de expresión recombinantes de la presente invención son conocidos por los expertos en la técnica (ver, p. ej., Sambrook et al., 1989, supra).

Células huésped

La presente invención también se refiere a células huésped recombinantes que comprenden una secuencia de ácido nucleico de la invención, las cuales son usadas ventajosamente para la producción recombinante de las enzimas lipolíticas de primer lavado. La célula es preferiblemente transformada con un vector que comprende una secuencia de ácido nucleico de la invención seguido de la integración del vector en el cromosoma huésped.

"Transformación" significa la introducción de un vector que comprende una secuencia de ácido nucleico de la presente invención en una célula huésped, de modo que el vector se mantiene como un integrante cromosómico o como un vector extracromosomal autoreplicante. La integración se considera generalmente una ventaja, ya que es más probable que la secuencia de ácido nucleico se mantenga estable en la célula. La integración del vector en el cromosoma huésped puede producirse por recombinación homóloga o no homóloga del modo descrito anteriormente.

La elección de una célula huésped dependerá en gran medida del gen que codifica la enzima lipolítica de primer lavado y su fuente. Además, la elección de la célula huésped dependerá a menudo del sistema enzimático proteolítico de la célula huésped y de su impacto en la producción de una enzima lipolítica de primer lavado de la invención. En consecuencia, puede ser deseable usar una célula huésped que sea deficiente en una o más enzimas proteolíticas u otro medio de procesamiento de enzimas. Las células huésped deficientes en proteasa de células bacterianas y micóticas (hongos filamentosos y levaduras) son bien conocidas en la técnica. Cuando la enzima lipolítica de primer lavado de la invención comprende una adición de un péptido, puede ser ventajoso que el huésped sea una cepa reducida o deficiente en una o más exoproteasas capaces de romper la enzima lipolítica modificada en un sitio cercano a la adición del péptido o en una proteasa capaz de romperse dentro de la adición del péptido. Por ejemplo, la célula huésped puede ser reducida o deficiente en una tripeptidil-aminopeptidasa (TPAP) (ver p. ej. WO 96/14404 de Novo Nordisk A/S), una dipeptidil-aminopeptidasa (DPAP), y/o una proteasa Kex2 o una proteasa de tipo Kex2 y, en consecuencia, que no sea capaz de romperse en sitios di-básicos como Arg-Arg (RR).

Otros ejemplos de células huésped comprenden células huéspedes deficientes o reducidas en proteasa alcalina, células huéspedes deficientes en proteinasa aspártica (EP 429 490), y células huéspedes deficientes en enzimas proteolíticas, como las células huésped descritas en WO 93/00925, WO 92/17595, EP 341 215, EP 574 347, y PCT/DK96/00111.

La célula huésped puede ser un microorganismo unicelular o un microorganismo no unicelular. Células unicelulares útiles son células bacterianas como las bacterias gram positivas que incluyen, pero sin limitarse, una célula Bacillus, p. ej., B. subtilis, B. licheniformis, B. lentus, B. brevis, B. stearothermophilus, B. alkalofilus, B. amiloliquefaciens, B. coagulans, B. circulans, B. lautus, B. megaterium, y B. thuringiensis; o una célula Streptomyces, p. ej., S. lividans o S. murinus, o bacterias gram negativas como E. coli y Pseudomonas sp. (especialmente cuando se va a producir una enzima lipolítica bacteriana, como una enzima Pseudomonas sp.). La transformación de una célula huésped bacteriana puede ser efectuada, por ejemplo, mediante la transformación del protoplasto (ver, p. ej., Chang y Cohen, 1979, Molecular General Genetics 168:111-115), usando células competentes (ver, p. ej., Young y Spizizin, 1961, Journal of Bacteriology 81:823-829, o Dubnar y Davidoff-Abelson, 1971, Journal of Molecular Biology 56:209-221), por electroporación (ver, p. ej., Shigekawa y Dower, 1988, Biotechniques 6:742-751), o por conjugación (ver, p. ej., Koehler y Thorne, 1987, Journal of Bacteriology 169:5771-5278).

La célula huésped puede ser una eucariota, y preferiblemente es un hongo, es decir una célula de levadura o una célula micótica filamentosa, especialmente para la producción de una enzima lipolítica modificada de origen eucariótico.

"Levadura" como se utiliza en este caso incluye la levadura ascosporogenous (Endomycetales), la levadura basidiosporogeneus, y la levadura que pertenece al Fungi Imperfecti (Blastomycetes 22). Las levaduras ascosporogenous están divididas en las familias Spermophthoraceae y Saccharomicetaceae. Ésta última está compuesta por cuatro subfamilias: Schizosaccharomicoideae (p. ej., del género Schizosaccharomyces), Nadsonioideae, Lipomycoideae, y Saccharomycoideae (p. ej., de los géneros Pichia, Kluyveromyces y Saccharomyces). Las levaduras basidiosporogenous comprenden los géneros Leucosporidim, Rhodosporidium, Sporidiobolus, Filobasidium, y Filobasidiella. Las levaduras que pertenecen a los Hongos Imperfecti están divididas en dos familias, Sporobolomycetaceae (p. ej., géneros Sorobolomyces y Bullera) y Cryptococcaceae (p. ej., género Candida). Puesto que la clasificación de las levaduras puede cambiar en el futuro, para los objetivos de esta invención, levadura se define de la forma descrita en "Biology and Activities of Yeast" (Skinner, F.A., Passmore, S.M., y Davenport, R.R., eds, Soc. App. Bacteriol. Symposium Series No. 9, 1980. La biología de las levaduras y la manipulación genética de las levaduras se conocen bien en la técnica (ver, p. ej., Biochemistry and Genetics of Yeast, Bacil, M., Horecker, B.J., y Stopani, A.O.M., editors, 2ª edición, 1987; The Yeasts, Rose, A.H., and Harrison, J.S., editors, 2ª edición, 1987; y The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, Strathern et al., editors, 1981). En relación a la presente invención, el uso de células de levadura que normalmente tienen un sistema de procesamiento enzimático proteolítico distinto al de, p. ej., las bacterias y los hongos filamentosos, puede tener un uso particular para la preparación de las enzimas lipolíticas modificadas que, además de la adición del péptido, comprenden una parte o todas las prosecuencias naturales de la enzima lipolítica madre en cuestión. Cuando la célula huésped micótica es una célula de levadura (p. ej. usada en la aplicación de una adición de un péptido (en forma de parte o toda la prosecuencia de la enzima madre)), la célula huésped de levadura puede ser una célula de una especie de Candida, Kluyveromyces, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Pichia, o Yarrowia, por ejemplo una célula de S. cerevisiae, una S.s carlsbergensis, una célula de S. diastaticus, una célula de S. douglasii, una célula de S. kluyveri, una célula de S. norbensis, o una célula de
S. oviformis.

"Hongos" como se utiliza en este caso comprenden los hongos phyla Ascomycota, Basidiomycota, Chytridiomycota, y Zygomycota (tal y como se define en Hawksworth et al., In, Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungi, 8ª edición, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, UK) así como el hongo Oomycota (como se cita en Hawkswort et al., 1995, supra, página 171) y todos los hongos mitospóricos (Hawkswort et al., 1995, supra). Grupos representativos de Ascomycota comprenden, p. ej., Neurospora, Eupenicillium (=Penicillium), Emericella (=Aspergillus), Eurotium =Aspergillus), y las levaduras reales citadas arriba. Ejemplos de Basidiomycota comprenden hongos, royas y tizones. Grupos representativos de Chytridiomycota comprenden, p. ej., Allomyces, Blastocladiella, Coelomomyces, y hongos acuáticos. Grupos representativos de Oomycota comprenden, p. ej., los hongos acuáticos Saprolegniomycetous (mohos de agua) como Achlya. Ejemplos de hongos mitospóricos comprenden Aspergillus, Penicillium, Candida, y Alternaria. Grupos representativos de Zygomycota comprenden, p. ej., Rhizopus y Mucor.

"Hongos filamentosos" comprenden todas las formas filamentosas de la subdivisión Eumycota y Oomycota (tal y como se define en Hawkswort et al., 1995, supra). Los hongos filamentosos están caracterizados por un micelio vegetativo compuesto por quitina, celulosa, glucano, quitosana, manana, y otros polisacáridos complejos. El crecimiento vegetativo por alargamiento hifal y el catabolismo del carbono es necesariamente aeróbico. Por el contrario, el crecimiento vegetativo por levaduras como Saccharomyces cerevisiae mediante el injerto de un talo unicelular y el catabolismo del carbono puede ser fermentativo.

En una forma de realización preferida, la célula huésped micótica es una célula micótica filamentosa. En una forma de realización más preferida, la célula huésped micótica filamentosa es una célula de una especie de, pero sin limitarse a éstas, Acremonium, Aspergillus, Fusarium, Humicola, Myceliophthora, Mucor, Neurospora, Penicillium, Thielavia, Tolypocladium, y Trichoderma. En una forma de realización aún más preferida, la célula huésped micótica filamentosa es una célula de Aspergillus. En otra forma de realización aún más preferida, la célula huésped micótica filamentosa es una célula de Fusarium. En una forma de realización más preferida, la célula huésped micótica filamentosa es una célula de A. oryzae, una célula de A. Niger, una célula de A. foetidus, o una célula de A. japonicus. En otra forma de realización más preferida, la célula huésped micótica filamentosa es una célula de Fusarium oxysporum o una célula de F. graminearum.

Las células micóticas pueden ser transformadas por un proceso que implica la formación de protoplastos, la transformación de los protoplastos, y la regeneración de la membrana celular de un modo conocido per se. Procedimientos adecuados para la transformación de células huésped de Aspergillus están descritos en EP 238 023 y Yelton et al., 1984, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 81:1470-1474. Un método adecuado de transfomación de especies de Fusarium está descrito en Malardier et al., 1989, Gene 78:147-156 o en WO 96/00787. Las levaduras pueden ser transformadas usando los procedimientos descritos en Becker and Guarente, In Abelson, J.N. and Simon, M.I., editors, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Volume 194, pp 182-187, Academic Press, Inc., New York; Ito et al., 1983, Journal of Bacteriology 153:163; y Hinnen et al., 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75:1920. Las células mamíferas pueden ser transformadas mediante absorción directa usando el método de precipitación de fosfato de calcio de Graham and Van der Eb (1978, Virology 52:546).

Métodos de producción

La presente invención también se refiere a métodos para producir una enzima lipolítica de primer lavado de la invención que comprende (a) el cultivo de una célula huésped transformada con una secuencia de ADN que codifica la enzima bajo condiciones propicias para la expresión de la enzima lipolítica de primer lavado; y (b) recuperación de la enzima lipolítica de primer lavado.

Las células huéspedes pueden ser cultivadas en un medio nutritivo adecuado para la producción de la enzima lipolítica de primer lavado usando los métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, la célula puede ser cultivada por cultivo en frascos de agitación, fermentación a pequeña escala o a gran escala (incluyendo fermentaciones continuas, discontinuas, por alimentación discontinua, o en estado sólido) en el laboratorio o en fermentadores industriales, en un medio adecuado y bajo condiciones que permiten que la enzima lipolítica modificada sea expresada y/o aislada. El cultivo se desarrolla en un medio nutritivo adecuado que comprende fuentes de nitrógeno y carbono y sales inorgánicas, usando procedimientos conocidos en la técnica (ver, p. ej., las referencias sobre bacterias y levaduras; Bennett, J.W. and LaSure, L., editors, More Gene Manipulations in Fungi, Academic Press, CA, 1991). Los medios adecuados están disponibles por proveedores comerciales o pueden ser preparados de acuerdo con las composiciones publicadas (p. ej., en los catálogos de la American TIPO Culture Collection). Si la enzima lipolítica de primer lavado es segregada en el medio nutritivo, la enzima lipolítica puede ser recuperada directamente del medio. Si la enzima lipolítica de primer lavado no es segregada, es recuperada de los lisatos de la célula.

La enzima lipolítica de primer lavado resultante puede ser recuperada por métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, la enzima lipolítica de primer lavado puede ser recuperada del medio nutritivo por procedimientos convencionales que incluyen, pero no se limitan a, centrifugado, filtración, extracción, pulverización en seco, evaporación o precipitación.

La enzima lipolítica de primer lavado recuperada puede luego ser adicionalmente purificada mediante una variedad de procedimientos cromatográficos, p. ej., cromatografía de intercambio fónico, cromatografía de permeación en gel, cromatografía de afinidad, o similares. Las enzimas lipolíticas de primer lavado de la presente invención pueden ser purificadas por una variedad de procedimientos conocidos en la técnica que incluyen, pero no se limitan a, cromatografía (p. ej., de intercambio iónico, de afinidad, hidrofóbica, cromatoenfoque, y por exclusión de tamaño), procedimientos electroforéticos (p. ej., isoelectroenfoque preparatorio (IEF), solubilidad diferencial (p. ej., precipitación de sulfato amónico), o extracción (ver, p. ej., Protein Purification, J.-C. Janson and Lars Ryden, editors, VCH Publishers, New York, 1989).

Según la invención, se contempla igualmente la aplicación, en la enzima lipolítica de primer lavado, de uno o más aminoácidos cargados que permiten la purificación eficaz de la enzima modificada. Las técnicas para realizar esto son conocidas por los expertos en la técnica de la biología molecular.

La célula huésped, las condiciones de cultivo y/o las condiciones de recuperación son preferiblemente seleccionadas de tal modo que, como mucho, se produzca un procesamiento parcial de la pre, pro o preproforma de la enzima madre, dando como resultado el hecho de que al menos un 5%, o al menos un 10%, o al menos un 15%, o al menos un 20%, o al menos un 25%, o al menos un 50% o al menos un 75% de las moléculas enzimáticas modificadas producidas comprende, p. ej. la pre-secuencia deseada entera o una parte sustancial de la misma.

Composición enzimática de la invención

En otro aspecto, la invención se refiere a una composición enzimática que comprende una enzima lipolítica de primer lavado de la invención.

Tal como se define aquí, una enzima "sustancialmente pura" es una enzima que está esencialmente libre de otros contaminantes homólogos (originados de la misma fuente que la enzima lipolítica de primer lavado), p. ej., con al menos aproximadamente un 20% de pureza, preferiblemente al menos aproximadamente un 40% de pureza, más preferiblemente aproximadamente un 60% de pureza, aún más preferiblemente aproximadamente un 80% de pureza, más preferiblemente aproximadamente un 90% de pureza, y aún más preferiblemente aproximadamente un 95% de pureza, determinada por SDS-PAGE.

Cuando la enzima lipolítica de primer lavado de la invención comprende una adición de un péptido, se ha descubierto que no todas las moléculas de la enzima lipolítica de primer lavado expresadas por una célula huésped dada son procesadas en el mismo sitio de disociación. Esto tiene la consecuencia de que el producto de la enzima lipolítica de primer lavado, recuperado de la fermentación por dichas células huésped, comprende una parte con la longitud total de la adición del péptido y una o más partes diferentes con sólo una parte de la adición del péptido. Los inventores han descubierto que éste no influye significativamente en el rendimiento de lavado. En consecuencia, aun cuando no toda la enzima lipolítica de la composición enzimática de la invención puede haber retenido la longitud total de la adición del péptido, la composición enzimática es aún capaz de ejercer un efecto de primer lavado. En realidad, se ha descubierto que siempre que al menos aproximadamente un 5% de la cantidad total de la enzima lipolítica de primer lavado de la invención que contiene la adición del péptido contenga la adición del péptido intacta, como se ha descrito antes, esto puede considerarse suficiente para proporcionar el efecto de primer lavado deseado. La parte restante de las moléculas de la enzima lipolítica de primer lavado puede entonces contener una adición del péptido más corta que la que se pretendía (p. ej. como consecuencia de que uno o más residuos de aminoácidos han sido cortados durante el procesamiento de la enzima por el organismo huésped). Por tanto, la composición enzimática de la invención sólo necesita comprender al menos aproximadamente un 5%, preferiblemente al menos aproximadamente un 10%, o al menos aproximadamente un 25%, mejor al menos aproximadamente un 50%, especialmente al menos aproximadamente un 75% de la enzima lipolítica de primer lavado con la adición en su longitud total.

Dicha composición enzimática puede además comprender una enzima seleccionada del grupo de las proteasas, celulasas, peroxidasas, cutinasas, amilasas y/o lipasas y, cuando esté destinada al lavado, también los ingredientes normalmente usados en composiciones detergentes.

Descripción del detergente Sistema tensioactivo

Las composiciones detergentes según la presente invención comprenden un sistema tensioactivo en el que los agentes tensioactivos pueden ser seleccionados entre agentes tensioactivos no iónicos y/o aniónicos y/o catiónicos y/o anfolíticos y/o de ion bipolar y/o semi-polar.

Los agentes tensioactivos normalmente están presentes en un nivel del 0.1% al 60% en peso.

El agente tensioactivo está preferiblemente formulado para ser compatible con los componentes enzimáticos presentes en la composición. En composiciones líquidas o en gel, el agente tensioactivo está formulado más preferiblemente de manera que promueve, o al menos no degrada, la estabilidad de cualquier enzima en estas composiciones.

Los sistemas tensioactivos preferidos para el uso según la presente invención comprenden como agente tensioactivo uno o varios de los agentes tensioactivos no iónicos y/o aniónicos descritos aquí.

Los agentes tensioactivos detergentes no iónicos normalmente consisten en un polialcoxileno de solubilización en agua o un grupo mono- o di-alcanolamida en combinación química con un grupo hidrofóbico orgánico derivado de, por ejemplo, alquilfenoles, en los que el grupo alquilo contiene de aproximadamente 6 a aproximadamente 12 átomos de carbono, dialquilfenoles, en los que cada grupo alquilo contiene de 6 a 12 átomos de carbono, alcoholes alifáticos primarios, secundarios o terciarios (o derivados de los mismos tapados con alquilo), que tienen preferiblemente de 8 a 20 átomos de carbono, ácidos monocarboxílicos, que tienen de 10 a aproximadamente 24 átomos de carbono en el grupo alquilo, y polioxipropilenos. También son comunes las mono- y dialcanolamidas de ácidos grasos en las que el grupo alquilo del radical de ácido graso contiene de 10 a aproximadamente 20 átomos de carbono y el grupo alquiloil tiene de 1 a 3 átomos de carbono. Opcionalmente, en cualquiera de los derivados mono- y dialcanolamida puede haber una mitad de polioxialquileno que une estos últimos grupos y la parte hidrofóbica de la molécula. En todos los agentes tensioactivos que contienen polialcoxilenos, la mitad de polialcoxileno preferiblemente consiste en de 2 a 20 grupos de óxido de etileno o en óxido de etileno y grupos de óxido de propileno.

Los condensados de óxido de polietileno, polipropileno y polibutileno de alquil fenoles son adecuados para ser usados como agente tensioactivo no fónico en los sistemas tensioactivos de la presente invención, siendo preferidos los condensados de óxido de polietileno. Estos compuestos comprenden los productos de condensación de los alquil fenoles que tienen un grupo alquilo que contiene de aproximadamente 6 a aproximadamente 14 átomos de carbono, preferiblemente de aproximadamente 8 a aproximadamente 14 átomos de carbono, en una configuración de cadena recta o de cadena ramificada con el óxido de alquileno. En una forma de realización preferida, el óxido de etileno está presente en una cantidad igual a de aproximadamente 2 a aproximadamente 25 moles, más preferiblemente de aproximadamente 3 a aproximadamente 15 moles de óxido de etileno por mol de alquil fenol.

Agentes tensioactivos no iónicos de este tipo comercialmente disponibles comprenden Igepal™ CO-630, comercializado por GAF Corporation; y Triton™ X-45, X-114, X-100 y X-102, todos comercializados por Rohm & Haas Company. Estos agentes tensioactivos se denominan de forma habitual alquilfenol alcoxilatos (p. ej., alquil fenol etoxilatos).

Los productos de condensación de alcoholes alifáticos primarios y secundarios con de aproximadamente 1 a aproximadamente 25 moles de óxido de etileno son adecuados para ser usados como agentes tensioactivos no fónicos en los sistemas tensioactivos no fónicos de la presente invención. La cadena de alquilo del alcohol alifático puede ser recta o ramificada, primaria o secundaria, y generalmente contiene de aproximadamente 8 a aproximadamente 22 átomos de carbono. Se prefieren los productos de condensación de alcoholes que tienen un grupo alquilo que contiene de aproximadamente 8 a aproximadamente 20 átomos de carbono, más preferiblemente de aproximadamente 10 a aproximadamente 18 átomos de carbono, y con de aproximadamente 2 a aproximadamente 10 moles de óxido de etileno por mol de alcohol. Aproximadamente de 2 a aproximadamente 7 moles de óxido de etileno y más preferiblemente de 2 a 5 moles de óxido de etileno por mol de alcohol están presentes en dichos productos de condensación. Ejemplos de agentes tensioactivos no fónicos de este tipo comercialmente disponibles comprenden Tergitol™ 15-S-9 (el producto de condensación del alcohol lineal C_{11}-C_{15} con 9 moles de óxido de etileno), Tergitol™ 24-L-6 NMW (el producto de condensación del alcohol primario C_{12}-C_{14} con 6 moles de óxido de etileno, con una distribución estrecha del peso molecular), ambos comercializado por la Union Carbide Corporation; Neodol™ 45-9 (el producto de condensación del alcohol lineal C_{14}-C_{15}, con 9 moles de óxido de etileno), Neodol™ 23-3 (el producto de condensación del alcohol lineal C_{12}-C_{13} con 3.0 moles de óxido de etileno), Neodol™ 45-7 (el producto de condensación del alcohol lineal C_{14}-C_{15} con 7 moles de óxido de etileno), Neodol™ 45-5 (el producto de condensación del alcohol lineal C_{14}-C_{15} con 5 moles de óxido de etileno) comercializado por Shell Chemical Company, Kyro™ EOB (el producto de condensación del alcohol C_{13}-C_{15} con 9 moles de óxido de etileno), comercializado por The Procter & Gamble Company, y Genapol LA 050 (el producto de condensación del alcohol C_{12}-C_{14} con 5 moles de óxido de etileno) comercializado por Hoechst. La gama preferida de HLB en estos productos es de 8-11 y más preferiblemente de 8-10.

La composición de detergente de la invención puede comprender un material no fónico, que son los alcoholes alifáticos alcoxilados que contienen al menos 25 grupos de óxido de alquileno, preferiblemente al menos 50 grupos de óxido de alquileno, y más preferiblemente al menos 80 grupos de óxido de alquileno.

También son útiles como agentes tensioactivos no iónicos del sistema tensioactivo de la presente invención, los alquilpolisacáridos descritos en US 4,565,647, que tienen un grupo hidrofóbico que contiene de aproximadamente 6 a aproximadamente 30 átomos de carbono, preferiblemente de aproximadamente 10 a aproximadamente 16 átomos de carbono, y un grupo hidrofílico polisacárido, p. ej. un poliglicósido, que contiene de aproximadamente 1.3 a aproximadamente 10, preferiblemente de aproximadamente 1.3 a aproximadamente 3, más preferiblemente de aproximadamente 1.3 a aproximadamente 2.7 unidades sacáridas. Cualquier sacárido de reducción que contenga 5 ó 6 átomos de carbono puede ser usado, p. ej., glucosa, galactosa y mitades de galactosil pueden ser substituidas por las mitades de glucosil (opcionalmente el grupo hidrofóbico está fijado a las posiciones 2, 3, 4, etc. dando así una glucosa o galactosa en contraposición a un glucósido o una galactosida). Los enlaces intersacáridos pueden estar, p. ej., entre la posición uno de las unidades sacáridas adicionales y las posiciones 2, 3, 4, y/o 6 en las unidades sacáridas precedentes.

Otro agente tensioactivo no iónico útil es un glucósido de un ácido urónico, una sal de ácido urónico o una lactona de ácido urónico o ácido poliurónico con una cadena recta o ramificada saturada o una cadena alifática insaturada de 6 a 24 átomos de carbono, opcionalmente conteniendo un radical aromático, cicloalifático, mezcla aromático-alifático o polialquiloxialquil, como se describe en WO 95/10524.

Las alquilpoliglucosidas preferidas tienen la fórmula

R^{2}O(C_{n}H_{2n}O)t(glicosil) _{x}

donde R^{2} está seleccionado del grupo que se compone de alquilo, alquilfenilo, hidroxialquilo, hidroxialquilfenilo, y sus mezclas derivadas en las que los grupos alquilo contienen de aproximadamente 10 a aproximadamente 18, preferiblemente de aproximadamente 12 a aproximadamente 14 átomos de carbono; n es 2 o 3, preferiblemente 2; t es de 0 a aproximadamente 10, preferiblemente 0; y x es de aproximadamente 1.3 a aproximadamente 10, preferiblemente de aproximadamente 1.3 a aproximadamente 3, más preferiblemente de aproximadamente 1.3 a aproximadamente 2.7. El glicosil es preferiblemente derivado de glucosa. Para preparar estos compuestos, el alcohol o el alquilpolietoxi alcohol es formado primero y luego es reaccionado con glucosa, o una fuente de glucosa, para formar el glucósido (fijación en la posición 1). Las unidades adicionales de glicosil pueden después ser fijadas entre la posición 1 y las unidades de glicosil precedentes en las posiciones 2, 3, 4 y/o 6, preferiblemente de forma predominante en la

\hbox{posición
2.}

Los productos de condensación de óxido de etileno con una base hidrofóbica formados por la condensación de óxido de propileno con propilenoglicol son también adecuados para ser usados como sistemas adicionales de agentes tensioactivos no iónicos de la presente invención. La parte hidrofóbica de estos compuestos preferiblemente tiene un peso molecular de aproximadamente 1500 a aproximadamente 1800 y exhibirá insolubilidad al agua. La adición de mitades de polioxietileno a esta parte hidrofóbica tiende a aumentar la solubilidad al agua del conjunto de la molécula, y el carácter líquido del producto se mantiene hasta que el contenido de polioxietileno es aproximadamente de un 50% del peso total del producto de condensación, lo que corresponde a una condensación de hasta aproximadamente 40 moles de óxido de etileno. Ejemplos de compuestos de este tipo comprenden algunos de los agentes tensioactivos Pluronic™ comercialmente disponibles comercializados por BASF.

También son adecuados para ser usados como agentes tensioactivos no iónicos de los sistemas tensioactivos de la presente invención, los productos de condensación de óxido de etileno con el producto siendo resultado de la reacción de óxido de propileno y etilenodiamina. La mitad hidrofóbica de estos productos consiste en el producto de reacción de etilenodiamina y el óxido de propileno en exceso, y generalmente tiene un peso molecular de aproximadamente 2500 a aproximadamente 3000. Esta mitad hidrofóbica está condensada con óxido de etileno hasta que el producto de condensación contiene de aproximadamente un 40% a aproximadamente un 80% en peso de polioxietileno y tiene un peso molecular de aproximadamente 5,000 a aproximadamente 11,000. Ejemplos de este tipo de agente tensioactivo no iónico comprenden determinados compuestos Tetronic™ comercialmente disponibles comercializados por BASF.

Para el uso como agente tensioactivo no iónico de los sistemas tensioactivos de la presente invención se prefieren los condensados de óxido de polietileno de alquil fenoles, los productos de condensación de alcoholes alifáticos primarios y secundarios con aproximadamente de 1 a aproximadamente 25 moles de óxido de etileno, los alquilpolisacáridos y mezclas de los mismos. Los más preferidos son los etoxilatos de alquil fenol C_{8}-C_{14} con de 3 a 15 grupos etoxi y los etoxilatos de alcohol C_{8}-C_{18} (preferiblemente de media C_{10}) que tienen de 2 a 10 grupos etoxi, y sus mezclas derivadas. Los agentes tensioactivos no fónicos especialmente preferidos son los agentes tensioactivos de polihidroxi amida de ácidos grasos de la fórmula

R_{2} ---

\delm{C}{\delm{\dpara}{O}}

---

\delm{N}{\delm{\para}{R ^{1} }}

--- Z,

donde R^{1} es H, o R^{1} es hidrocarbil C_{1-4}, 2-hidroxi etil, 2-hidroxi propil o una mezcla de los mismos, R^{2} es hidrocarbil C_{5-31}, y Z es un polihidroxihidrocarbilo que tiene una cadena de hidrocarbilo lineal con al menos 3 hidroxilos directamente conectados a la cadena, o un derivado alcoxilado de los mismos. Preferiblemente, R^{1} es metilo, R^{2} es alquil C_{11-15} recto o alquil C_{16-18} o una cadena de alquenilo, como alquilo de coco o mezclas derivadas, y Z se deriva de un azúcar de reducción como glucosa, fructosa, maltosa, lactosa, en una reacción de aminación reductiva.

Un sistema tensioactivo no iónico que comprende un agente tensioactivo no iónico alcoxilado que tiene un grado medio de alcoxilación de al menos 6 y una aldobionamida de estructura ANR_{1}R_{2}, donde A es una mitad de azúcar que es un ácido aldobiónico, salvo porque no contiene el grupo OH que normalmente se extiende desde el grupo carbonil en el ácido aldónico. NR_{1}R_{2} está fijado donde normalmente se encuentra el grupo hidroxilo en el ácido aldobiónico. R_{1}R_{2}, que puede ser igual o diferente, es un átomo de hidrógeno, un radical de hidrocarburo alifático, un radical aromático, un radical cicloalifático, un éster aminoácido o una éter de amina. R_{1} y R_{2} no pueden ser ambos átomos de hidrógeno, como se describe en WO 95/2770.

Otros denominados compuestos detergentes no iónicos comprenden óxidos de amina terciaria de cadena larga, óxidos de fosfina terciaria de cadena larga y dialquil sulfóxidos.

Los agentes tensioactivos aniónicos especialmente preferidos comprenden agentes tensioactivos de alquil sulfato alcoxilado, que son sales hidrosolubles o ácidos de la fórmula RO(A)_{m}SO_{3}M, donde R es un alquilo C_{10}-C_{24} insustituido o un grupo hidroxialquilo que tiene un componente de alquilo C_{10}-C_{24}, preferiblemente un alquilo o hidroxialquilo C_{12}-C_{20}, más preferiblemente un alquilo o hidroxialquilo C_{12}-C_{18}, A es etoxi o una unidad propoxi, M es superior a 0, normalmente entre aproximadamente 0.5 y aproximadamente 6, más preferiblemente entre aproximadamente 0.5 y aproximadamente 3, y M es H o un catión que puede ser, por ejemplo, un catión metálico (p. ej., sodio, potasio, litio, calcio, magnesio, etc.), amonio o un catión de amonio sustituido. Los alquil sulfatos etoxilados, así como los alquil sulfatos propoxilados están contemplados aquí. Ejemplos específicos de cationes de amonio sustituidos comprenden cationes de metil, dimetil, trimetil amonio y cationes de amonio cuaternario como cationes de tetrametil amonio y de dimetil piperdinio, y aquellos derivados de alquilaminas, como etilamina, dietilamina, trietilamina, mezclas derivadas y similares. Algunos ejemplos de agentes tensioactivos son polietoxilato de alquil C_{12}-C_{18} (1.0) sulfato (C_{12}-C_{18}E(1.0)M), polietoxilato de alquil C_{12}-C_{18} (2.25) sulfato (C_{12}-C_{18}(2.25)M, y polietoxilato de alquil C_{12}-C_{18} (3.0) sulfato (C_{12}-C_{18}E(3.0)M), y polietoxilato de alquil C_{12}-C_{18} (4.0) sulfato (C_{12}-C_{18}E(4.0)M), donde M es convenientemente seleccionado entre sodio y potasio. Los agentes tensioactivos aniónicos adecuados para ser usados son los agentes tensioactivos de alquil éster sulfonato que incluyen ésteres lineales de ácidos carboxílicos C_{8}-C_{20} (es decir, ácidos grasos) que son sulfonatados con SO_{3} gaseoso según "The Journal of the American Oil Chemists Society", 52 (1975), págs. 323-329. Materiales de inicio adecuados comprenden sustancias grasas naturales como las derivadas de sebo, aceite de

\hbox{palma, etc.}

El agente tensioactivo de alquil éster sulfonato preferido, especialmente para aplicaciones de lavandería, comprende agentes tensioactivos de alquil éster sulfonato de la fórmula estructural:

R^{3} ---

\delm{C}{\delm{\para}{SO _{3} M}}

H ---

\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}}

--- OR^{4}

donde R^{3} es un hidrocarbil C_{8}-C_{20}, preferiblemente un alquilo, o combinaciones derivadas, R^{4} es un hidrocarbil C_{1}-C_{6}, preferiblemente un alquilo, o combinaciones derivadas, y M es un catión que forma una sal hidrosoluble con el de alquil éster sulfonato. Cationes adecuados de formación de sal comprenden metales como sodio, potasio, y litio, y cationes de amonio sustituido o insustituido, como monoetanolamina, dietonolamina, y trietanolamina. Preferiblemente, R^{3} es un alquilo C_{10}-C_{16}, y R^{4} es metilo, etilo o isopropilo. Especialmente preferidos son los metil éster sulfonatos donde R^{3} es un alquilo C_{10}-C_{16}.

Otros agentes tensioactivos aniónicos adecuados comprenden los agentes tensioactivos de alquil sulfato que son sales hidrosolubles o ácidos de la fórmula ROSO_{3}M, donde R preferiblemente es un hidrocarbilo C_{10}-C_{24}, preferiblemente un alquilo o hidroxialquilo que tiene un componente de alquilo C_{10}-C_{20}, más preferiblemente un alquilo o hidroxialquilo C_{12}-C_{18}, y M es H o un catión, p. ej., un catión de metal alcalino (p. ej. sodio, potasio, litio), o amonio o amonio sustituido (p. ej. cationes de metil, dimetil y trimetil amonio y cationes de amonio cuaternario como tetrametil amonio y cationes de dimetil piperdinio y cationes de amonio cuaternario derivados de alquilaminas como etilamina, dietilamina, trietilamina, y sus mezclas derivadas, y similares). Habitualmente, las cadenas de alquilo C_{12}-C_{16} son preferidas para el lavado a temperaturas bajas (p. ej. por debajo de aproximadamente 50ºC) y las cadenas de alquilo C_{16}-C_{18} son preferidas para el lavado a temperaturas más altas (p. ej. por encima de aproximadamente 50ºC).

Otros agentes tensioactivos aniónicos útiles para objetivos detergentes pueden también incluirse en las composiciones de detergente de lavado de la presente invención. Éstos pueden incluir sales (incluyendo, por ejemplo, sodio, potasio, amonio, y sales de amonio sustituidas, como sales de mono- di- y trietanolamina) de jabón, alcanosulfonatos C_{8}-C_{22} primarios o secundarios, olefinsulfonatos C_{8}-C_{24}, ácidos policarboxílicos sulfonatados preparados por sulfonación del producto pirolizado de citratos de metal alcalinotérreos, p. ej. como se describe en GB 1,082,179, alquilpoliglicoletersulfatos C_{8}-C_{24} (conteniendo hasta 10 moles de óxido de etileno); glicerol alquil sulfonatos, glicerol sulfonatos de ácilos grasos, glicerol sulfatos de oleil graso, alquil fenol sulfatos de éter de óxido de etileno, sulfonatos de parafina, alquil fosfatos, isetionatos, como los isetionatos de acilo, ésteres isetionatos de ácidos alcoxi carboxílicos (como se describe en WO95/14661), N-acil tauratos, alquil succinamatos y sulfosuccinatos, monoésteres de sulfosuccinatos (especialmente monoésteres C_{12}-C_{18} saturados e insaturados) y diésteres de sulfosuccinatos (especialmente diésteres C_{6}-C_{12} saturados e insaturados), sarcosinatos de acilo, oleoil sarcosinato, sulfatos de alquilpolisacáridos como los sulfatos alquilpoliglucósidos (los compuestos no fónicos no sulfatados descritos más abajo), alquil sulfatos primarios ramificados, y polietoxi alquil carboxilatos como los de la fórmula RO(CH_{2}CH_{2}O)_{k}-CH_{2}C00-M+, donde R es un alquilo C_{8}-C_{22}, k es un número entero de 1 a 10, y M es una sal soluble que forma un catión. Los ácidos resínicos y los ácidos resínicos hidrogenados son también adecuados, como por ejemplo resina, resina hidrogenada y los ácidos resínicos y ácidos resínicos hidrogenados presentes o derivados del aceite de resina. El alquilbenceno sulfonato es muy preferido, en particular el alquil benceno sulfonato lineal (LAS) donde el grupo alquilo contiene preferiblemente de 10 a 18 átomos de carbono.

Otros ejemplos están descritos en "Surface Active Agents and Detergents" (Vol. 1 y II por Schwartz, Perrry y Berch). Una variedad de este tipo de agentes tensioactivos está también descrita de forma general en US 3,929,678, (de la columna 23, línea 58, a la columna 29, línea 23).

Cuando se incluyen, las composiciones de detergente de lavado de la presente invención normalmente comprenden de aproximadamente un 1% a aproximadamente un 40%, preferiblemente de aproximadamente un 3% a aproximadamente un 20% en peso de estos agentes tensioactivos aniónicos.

Las composiciones de detergente de lavado de la presente invención pueden contener también agentes tensioactivos catiónicos, anfolíticos, de ion bipolar, y semi polar, así como agentes tensioactivos no iónicos y/o aniónicos distintos de los ya descritos aquí.

Agentes tensioactivos detergentes catiónicos adecuados para su uso en composiciones de detergente de lavado de la presente invención son aquellos que tienen un grupo hidrocarbil de cadena larga. Ejemplos de tales agentes tensioactivos catiónicos comprenden los agentes tensioactivos de amonio como halogenuros de alquiltrimetilamonio, y los agentes tensioactivos que tienen la fórmula:

[R^{2}(OR^{3})_{y}][R^{4}(OR^{3})_{y}]_{2}R^{5}N+X-

donde R^{2} es un alquilo o un grupo alquil bencilo que tiene de aproximadamente 8 a aproximadamente 18 átomos de carbono en la cadena de alquilo, cada R^{3} está seleccionado del grupo que se compone de -CH_{2}CH_{2}, -CH_{2}CH(CH_{3}), -CH_{2}CH(CH_{2}OH), -CH_{2}CH_{2}CH_{2} y sus mezclas derivadas; cada R^{4} está seleccionado del grupo que se compone de alquilo C_{1}-C_{4}, hidroxialquilo C_{1}-C_{4}, estructuras de anillos de bencilo formadas uniendo los dos grupos R^{4}, -CH_{2}CHOHCHOHCOR^{6}CHOHCH_{2}OH, donde R^{6} es cualquier hexosa o polímero de hexosa con un peso molecular inferior a aproximadamente 1000, e hidrógeno cuando y no es 0; R^{5} es igual que R^{4} o es una cadena de alquilo donde el número total de átomos de carbono o R^{2} más R^{5} no es más de aproximadamente 18; cada y es de 0 a aproximadamente 10 y la suma de los valores y es de 0 a aproximadamente 15; y X es cualquier anión compatible.

Agentes tensioactivos catiónicos especialmente preferidos son compuestos de amonio cuaternario solubles en agua útiles en la presente composición, que tienen la fórmula:

(i)R_{1}R_{2}R_{3}R_{4}N^{+}X^{-}

donde R^{1} es alquilo C_{8}-C_{16}, cada uno de R^{2}, R^{3} y R^{4} es independientemente alquilo C_{1}-C_{4}, hidroxialquilo C_{1}-C_{4}, bencilo, y -(C_{2}H_{40})_{X}H, donde x tiene un valor de 2 a 5, y X es un anión. No más de uno de R^{2}, R^{3} o R^{4} debería ser bencilo.

La longitud preferida de la cadena de alquilo para R^{1} es C_{12}-C_{15}, particularmente donde el grupo alquilo es una mezcla de longitudes de cadena derivadas de coco o de grasa de avellana de palma o derivada sintéticamente por una construcción de olefina o por síntesis de alcoholes OXO.

Los grupos preferidos para R^{2}R^{3} y R^{4} son grupos metilo e hidroxietilo y el anión X puede ser seleccionado de haluro, metosulfato, acetato e iones de fosfato. Ejemplos de compuestos de amonio cuaternario adecuados de la fórmula (i) para ser usados aquí son:

cloruro o bromuro de trimetil amonio de coco;

cloruro o bromuro de metil dihidroxietil amonio de coco;

cloruro de decil trietil amonio;

cloruro o bromuro de decil dimetil hidroxietil amonio;

cloruro o bromuro de dimetil hidroxietil amonio C_{12-15};

cloruro o bromuro de dimetil hidroxietil amonio de coco;

metil sulfato de miristil trimetil amonio;

cloruro o bromuro de lauril dimetil bencil amonio;

cloruro o bromuro de lauril dimetil (etenoxi)_{4} amonio;

ésteres de colina (compuestos de fórmula (i) donde R^{1} es

alquilo CH_{2} --- CH_{2} --- O ---

\delm{C}{\delm{\dpara}{O}}

--- C_{12-14} y R_{2}R_{3}R_{4} son metilo).

di-alquil imidazolinas [compuestos de fórmula (i)].

Otros agentes tensioactivos catiónicos útiles aquí están descritos también en US 4,228,044 y en EP 000 224.

Cuando se incluyen, las composiciones de detergente de lavado de la presente invención normalmente comprenden del 0.2% a aproximadamente el 25%, preferiblemente de aproximadamente el 1% a aproximadamente el 8% en peso de estos agentes tensioactivos catiónicos.

Los agentes tensioactivos anfolíticos son también adecuados para el uso en las composiciones detergentes de lavado de la presente invención. Estos agentes tensioactivos pueden describirse en general como derivados alifáticos de aminas secundarias o terciarias, o derivados alifáticos de aminas heterocíclicas secundarias y terciarias en las que el radical alifático puede ser de cadena recta o ramificada. Uno de los sustituyentes alifáticos contiene al menos aproximadamente 8 átomos de carbono, normalmente de aproximadamente 8 a aproximadamente 18 átomos de carbono, y al menos uno contiene un grupo aniónico de solubilización en agua, p. ej. carboxi, sulfonato, sulfato. Ver US 3,929,678 (columna 19, líneas 18-35) para ejemplos de agentes tensioactivos anfolíticos.

Cuando se incluyen, las composiciones de detergente de lavado de la presente invención normalmente comprenden del 0.2% a aproximadamente el 15%, preferiblemente de aproximadamente el 1% a aproximadamente el 10% en peso de estos agentes tensioactivos anfolíticos.

Los agentes tensioactivos bipolares son también adecuados para ser usados en composiciones de detergente de lavado. Estos agentes tensioactivos pueden describirse en general como derivados de aminas secundarias y terciarias, derivados de aminas heterocíclicas secundarias y terciarias, o derivados de amonio cuaternario, compuestos de fosfonio cuaternario o sulfonio terciario. Ver US 3,929,678 (de la columna 19, línea 38 a la columna 22, línea 48) para ejemplos de agentes tensioactivos bipolares.

Cuando se incluyen, las composiciones de detergente de lavado de la presente invención normalmente comprenden del 0.2% a aproximadamente el 15%, preferiblemente de aproximadamente el 1% a aproximadamente el 10% en peso de estos agentes tensioactivos bipolares.

Los agentes tensioactivos no iónicos semi-polares son una categoría especial de agentes tensioactivos no fónicos que comprenden óxidos de amina hidrosolubles que contienen una mitad de alquilo, de aproximadamente 10 a aproximadamente 18 átomos de carbono, y 2 mitades seleccionadas del grupo que consiste en grupos alquilo y grupos hidroxialquilo, que contienen de aproximadamente 1 a aproximadamente 3 átomos de carbono; óxidos de fosfina solubles en agua que contienen una mitad de alquilo de aproximadamente 10 a aproximadamente 18 átomos de carbono, y 2 mitades seleccionadas del grupo que consiste en grupos alquilo y grupos hidroxialquilo que contienen de aproximadamente 1 a aproximadamente 3 átomos de carbono; y sulfóxidos hidrosolubles que contienen una mitad de alquilo de aproximadamente 10 a aproximadamente 18 átomos de carbono, y una mitad seleccionada del grupo 1 que consiste en grupos alquilo y grupos hidroxialquilo de aproximadamente 1 a aproximadamente 3 átomos de carbono.

Los agentes tensioactivos detergentes no iónicos semi-polares comprenden los agentes tensioactivos de óxido de amina que tienen la fórmula:

R^{3}(O

\uelm{R}{\uelm{\para}{O}}

^{4})_{x}N(R^{5})2

donde R^{3} es un grupo alquilo, hidroxialquilo, o alquil fenil o mezclas derivadas, que contienen de aproximadamente 8 a aproximadamente 22 átomos de carbono; R^{4} es un grupo alquileno o hidroxialquileno que contiene de aproximadamente 2 a aproximadamente 3 átomos de carbono o mezclas derivadas; X es de 0 a aproximadamente 3; y cada R^{5} es un grupo alquilo o hidroxialquilo que contiene de aproximadamente 1 a aproximadamente 3 átomos de carbono o un grupo de óxido de polietileno que contiene de aproximadamente 1 aproximadamente 3 grupos de óxido de etileno. Los grupos R^{5} pueden estar unidos entre sí, p. ej., a través de un átomo de oxígeno o de nitrógeno, para formar una estructura anular.

Estos agentes tensioactivos de óxido de amina comprenden en particular óxidos de dimetil alquil amina C_{10}-C_{18} y óxidos de alcoxi etil dihidroxi etil amina C_{8}-C_{12}.

Cuando se incluyen, las composiciones de detergente de lavado de la presente invención normalmente comprenden del 0.2% a aproximadamente el 15%, preferiblemente de aproximadamente el 1% a aproximadamente el 10% en peso de estos agentes tensioactivos no iónicos semi-polares.

Sistema constructor

Las composiciones según la presente invención pueden comprender además un sistema constructor. Cualquier sistema constructor convencional es conveniente para ser usado en la presente, incluyendo materiales de aluminosilicato, silicatos, policarboxilatos y ácidos grasos, materiales como tetraacetato de etilenodiamina, secuestrantes de metales iónicos como aminopolifosfonatos, particularmente ácido etilenodiamina tetrametileno fosfónico y ácido dietilentriamina pentametilenofosfónico. Los constructores de fosfato también pueden ser usados aquí, p. ej. pirofosfatos, ortofosfatos o polifosfatos.

Constructores adecuados pueden ser un material de intercambio fónico inorgánico, comúnmente un material de aluminosilicato hidratado inorgánico, más en particular una zeolita sintética hidratada, por ejemplo una zeolita hidratada A, X, B, HS o MAP. Otro material constructor inorgánico adecuado es el silicato estratificado, p. ej. SKS-6 (Hoechst). SKS-6 es un silicato estratificado cristalino consistente en silicato de sodio (Na_{2}-Si_{2}O_{5}).

Policarboxilatos adecuados que contienen un grupo carboxi comprenden ácido láctico, ácido glicólico y derivados de éter de los mismos, tal y como se describe en BE 831,368, BE 821,369 y BE 821,370. Los policarboxilatos que contienen dos grupos carboxi comprenden las sales hidrosolubles de ácido succínico, ácido malónico, ácido (etilenodioxi) diacético, ácido maleico, ácido diglicólico, ácido tartárico, ácido tartrónico y ácido fumárico, así como los éter carboxilatos descritos en DE 2,446,686, DE 2,446,487, US 3,935,257 y los sulfinil carboxilatos descritos en BE 840,623. Los policarboxilatos que contienen tres grupos carboxi comprenden, en particular, citratos hidrosolubles, aconitratos y citraconatos, así como derivados de succinato como los carboximetiloxisuccinatos descritos en GB 1,379,241, los lactoxisuccinatos descritos en la solicitud NL 7205873, y los materiales de oxipolicarboxilato como 2-oxa-1,1,3-propano tricarboxilatos descritos en GB 1,387,447.

Los policarboxilatos que contienen cuatro grupos carboxi comprenden los oxi-disuccinatos descritos en GB
1,261,829, los 1,1,2,2,-etano tetracarboxilatos, los 1,1-,3,3-propano tetracarboxilatos que contienen sustituyentes sulfo comprenden los derivados de sulfosuccinato descritos en GB 1,398,421 y GB 1,398,422 y en US 3,936,448, y los citratos pirolizados sulfonatados descritos en GB 1,082,179, mientras que los policarboxilatos que contienen sustituyentes de fosfona están descritos en GB 1,439,000.

Los policarboxilatos alicíclicos y heterocíclicos comprenden cis,cis-cis-ciclopentano-tetracarboxilatos, pentacarboxilatociclopentadieno, cis, cis, cis-tetrahidrofurano-tetracarboxilatos, cis-tetrahidrofuran-2,5-dicarboxilatos, tetrahidrofuran-2,2,5,5,-tetracarboxilatos, hexano-1,2,3,4,5,6-hexacarboxilatos y derivados de carboximetil de alcoholes polihídricos como sorbitol, manitol y xílitol. Los policarboxilatos aromáticos comprenden ácido melítico, ácido piromelítico y los derivados de ácido ftálico descritos en GB 1,425,343. De los anteriores, los policarboxilatos preferidos son los hidroxicarboxilatos que contienen hasta tres grupos carboxi por molécula, más en particular los citratos.

Los sistemas constructores preferidos para ser usados en las presentes composiciones comprenden una mezcla de un constructor de aluminosilicato insoluble en agua como la zeolita A o de un silicato estratificado (SKS-6), y un agente quelante de carboxilato hidrosoluble como el ácido cítrico.

Un quelante adecuado para ser incluido en las composiciones detergentes según la invención es el ácido etilenodiamina-N,N'-disuccínico (EDDS) o las sales de metal alcalinas, de metal alcalinotérreas, de amonio o de amonio sustituido del mismo o mezclas derivadas. Los compuestos preferidos de EDDS son la forma ácida libre y la sal de sodio o magnesio derivada. Ejemplos de tales sales de sodio preferidas de EDDS comprenden Na_{2}EDDS y Na_{4}EDDS. Ejemplos de tales sales de magnesio preferidas de EDDS comprenden MgEDDS y Mg_{2}EDDS. Las sales de magnesio son las más preferidas para ser incluidas en las composiciones según la invención.

Los sistemas constructores preferidos comprenden una mezcla de un constructor de aluminosilicato insoluble en agua como una zeolita A, y un agente quelante de carboxilato soluble en agua, como el ácido cítrico.

Otros materiales constructores que pueden formar parte del sistema constructor para ser usado en composiciones granulosas comprenden materiales inorgánicos, como carbonatos de metal alcalino, bicarbonatos, silicatos, y materiales orgánicos como los fosfonatos orgánicos, los amino polialquileno fosfonatos y los amino policarboxilatos.

Otras sales orgánicas hidrosolubles adecuadas son los ácidos horno- o co-poliméricos o sus sales, donde el ácido policarboxílico comprende al menos dos radicales de carboxilo separados uno del otro por no más de dos átomos de carbono.

Polímeros de este tipo están descritos en GB-A-1,596,756. Ejemplos de tales sales son los poliacrilatos de PM 2000-5000 y sus copolímeros con anhídrido maleico, tales copolímeros tienen un peso molecular de 20,000 a 70,000, especialmente aproximadamente 40,000.

Las sales constructoras de detergencia están normalmente incluidas en cantidades del 5% al 80% en peso de la composición. Los niveles preferidos del constructor para detergentes líquidos son del 5% al 30%.

Enzimas

Las composiciones detergentes preferidas comprenden, además de la enzima de la invención, otras enzimas que proporcionan beneficios en el rendimiento de limpieza y/o en el cuidado de los tejidos. Tales enzimas comprenden proteasas, lipasas, cutinasas, amilasas, celulasas, peroxidasas, oxidasas (p. ej. lacasas).

Proteasas: Cualquier proteasa adecuada para ser usada en soluciones alcalinas puede ser usada. Las proteasas adecuadas comprenden las de origen animal, vegetal o microbiano. Se prefiere el origen microbiano. Los mutantes modificados química o genéticamente están incluidos. La proteasa puede ser una proteasa serina, preferiblemente una proteasa microbiana alcalina o una proteasa de tipo tripsina. Ejemplos de proteasas alcalinas son las subtilisinas, especialmente aquellas derivadas de Bacillus, p. ej., subtilisina Novo, subtilisina Carlsberg, subtilisina 309, subtilisina 147 y subtilisina 168 (descritas en WO 89/06279). Ejemplos de proteasas de tipo tripsina son la tripsina (p. ej. de origen porcino o bovino) y la proteasa de Fusarium descrita en WO 89/06270. Enzimas proteasas preferidas disponibles comercialmente comprenden las que se venden con el nombre comercial Alcalase, Savinase, Primase, Durazym, y Esperase por Novo Nordisk A/S (Dinamarca), aquellas vendidas con el nombre comercial Maxatase, Maxacal, Maxapem y Properase por Gist-Bro-cades/Genencor, aquellas vendidas con el nombre comercial Purafect y Purafect OXP por Genencor International, y las vendidas con el nombre comercial Opticlean y Optimase por Solvay Enzimes. Las enzimas proteasas pueden ser incorporadas en las composiciones según la invención en un nivel del 0.0001% al 2% de proteína enzimática en peso de la composición, en particular en un nivel del 0.001% al 0.1% de proteína enzimática en peso de la composición.

Lipasas: Cualquier lipasa adecuada para ser usada en soluciones alcalinas puede ser usada. Las lipasas adecuadas comprenden las de origen bacteriano o micótico y los mutantes de lipasa modificados química o genéticamente. Ejemplos de lipasas útiles comprenden una lipasa de Humicola lanuginosa, p. ej., como se describe en EP 258 068 y EP 305 216, y mutantes de la misma como se describen en WO 92/05249, WO 94/25577 y WO 95/22615, una lipasa de Rhizomucor miehei, p. ej., como se describe en EP 238 023, una lipasa de Candida, como una C. antarctica, p. ej., la lipasa de C. antarctica A o B descrita en EP 214 761, una lipasa de Pseudomonas como una lipasa P. alcaligenes y P. pseudoalcaligenes, p. ej., como se describe en EP 218 272, o cualquier mutante de dichas lipasas Pseudomonas, una lipasa P. cepacia, p. ej., como se describe en EP 331 376, una lipasa P. stutzeri, p. ej., como se describe en BP 1,372,034, una lipasa P. fluorescens, una lipasa de Bacillus p. ej., una lipasa B. subtilis (Dartois et al., (1993), Biochemica et Biophysica acta 1131, 253-260), una lipasa B. stearothermophilus (JP 64/744992) y una lipasa B. pumilus (WO 91/16422). Además, varias lipasas clonadas pueden ser útiles, incluyendo la lipasa Penicillium camembertii descrita en Yamaguchi et al., (1991), Gene 103, 61-67), la lipasa Geotricum candidum (Schimada, Y. et al., (1989), J. Biochem., 106, 383-388), y varias lipasas Rhizopus como una lipasa R. delemar (Hass, M.J et al., (1991), Gene 109, 117-113), una lipasa R. niveus (Kugimiia et al., (1992), Biosci. Biotech. Biochem. 56, 716-719) y una lipasa R. oryzae.

Otros tipos de enzimas lipolíticas, como las cutinasas, también pueden ser útiles, p. ej., una cutinasa derivada de Pseudomonas mendocina como se describe en WO 88/09367, o una cutinasa derivada de Fusarium solani Disi (p. ej. la descrita en WO 90/09446). Lipasas especialmente adecuadas son las lipasas como M1 Lipase™, Lumafast™ y Lipomax™ (Gist-Broca-des/Genencor), Lipolase™ y Lipolase Ultra™ (Novo Nordisk A/S), y Lipase P "Amano" (Amano Pharmaceutical Co. Ltd.).

Las lipasas se incorporan normalmente en la composición detergente en un nivel del 0.0001% al 2% de proteína enzimática en peso de la composición de detergente, en particular en un nivel del 0.001% al 0.1% de proteína enzimática en peso de la composición.

Amilasas: Cualquier amilasa (a y/o b) adecuada para ser usada en soluciones alcalinas puede ser usada. Las amilasas adecuadas comprenden aquellas de origen bacteriano o micótico. Los mutantes modificados química o genéticamente están incluidos. Las amilasas comprenden, por ejemplo, \alpha-amilasas obtenidas de una cepa especial de B. licheniformis, descrita en más detalle en GB 1,296,839. Amilasas comercialmente disponibles son Duramyl™, Termamyl™, Fungamyl™ y BAN™ (disponibles por Novo Nordisk A/S) y Rapidase™ y Maxamyl™, (disponibles por (Gist-Brocades/Genencor).

Las amilasas normalmente son incorporadas en la composición de detergente en un nivel del 0.0001% al 2% de proteína enzimática en peso de la composición de detergente, en particular en un nivel del 0.001% al 0.1% de proteína enzimática en peso de la composición.

Celulasas: Cualquier celulasa adecuada para ser usada en soluciones alcalinas puede ser usada. Las celulasas adecuadas comprenden las de origen bacteriano o micótico. Los mutantes modificados química o genéticamente están incluidos. Las celulasas adecuadas están descritas en US 4,435,307, que expone celulasas micóticas producidas a partir de Humicola insolens. Celulasas especialmente adecuadas son las celulasas que tienen beneficios en el cuidado del color. Ejemplos de tales celulasas son las celulasas descritas en la solicitud de patente europea publicada Nº 0495257. Celulasas comercialmente disponibles son Celluzyme®, producida por una cepa de Humicola insolens, (novo Nordisk A/S), y KAC-500(B)® (Kao Corporation).

Dichas celulasas están normalmente incorporadas en la composición de detergente en un nivel del 0.0001% al 2% de proteína enzimática en peso de la composición de detergente, en particular en un nivel del 0.001% al 0.1% de proteína enzimática en peso de la composición.

Peroxidasas/oxidasas: Se pueden usar enzimas peroxidasas y/o oxidasas, como la lacasa, las primeras en combinación con fuentes de peróxido de hidrógeno, p. ej., percarbonato, perborato, o persulfato, para soluciones de blanqueamiento, es decir para prevenir la transferencia de tintes textiles desde los tejidos teñidos hacia otros tejidos cuando dichos tejidos son lavados juntos en una solución de lavado, preferiblemente junto con un agente intensificador como se describe en p. ej. WO 94/12621 y WO 95/01426. Enzimas adecuadas de este tipo comprenden las de origen vegetal, bacteriano o micótico. Los mutantes modificados química o genéticamente están incluidos.

Dichas enzimas peroxidasas y/o oxidasas pueden ser incorporadas en la composición de detergente en un nivel del 0.0001% al 2% de proteína enzimática en peso de la composición de detergente, en particular en un nivel del 0.001% al 0.1% de proteína enzimática en peso de la composición.

Mezclas de las enzimas anteriormente mencionadas se incluyen en la presente, en particular una mezcla de una proteasa, una amilasa, una lipasa y/o una celulasa.

Ingredientes detergentes opcionales

Agentes blanqueadores: Otros ingredientes detergentes opcionales que pueden ser incluidos en las composiciones detergentes de la presente invención comprenden blanqueadores de peróxido como perborato de sodio-agua (1/1), PB1, perborato de sodio-agua (1/4), PB4, y carbonato de sodio-peróxido de hidrógeno 2/3, percarbonato, con un tamaño de partícula de 400-800 micras. Si se incluyen, los blanqueadores de peróxido normalmente estarán presentes en niveles de aproximadamente el 1% a aproximadamente el 25%.

Otros blanqueadores basados en peróxido que pueden ser usados son los ácidos percarboxílicos y sus sales derivadas. Ejemplos adecuados de esta clase de agentes comprenden monoperoxiftalato hexahidrato de magnesio, la sal de magnesio del ácido metacloroperbenzoico, el ácido 4-nonilamino-4-oxoperoxibutírico y el ácido diperoxidodecanedioico. Estos agentes blanqueadores están descritos en US 4,483,781, US 740,446, EP 0 133 354 y US 4,412,934. Los agentes blanqueadores especialmente preferidos también comprenden el ácido 6-nonilamino-6-oxoperoxicaproico, como se describe en US 4,634,551.

Los agentes blanqueadores que pueden ser usados aquí pueden también ser otros blanqueadores conocidos en la técnica para el uso en composiciones detergentes.

Una composición de detergente líquido no acuoso puede comprender un material peroxiácido p. ej. peroxiácidos consistentes en N,N'-Di(4-Percarboxibenzoil)etilenodiamina (PCBED), ácido N,N'-Tereftaloil-di(6-aminopercarboxicaproico) (TPCAP), N,N'-Di(4-percarboxibenzoil)piperazina (PCBPIP), N,N'-Di(4-Percarboxibenzoil)-1,4-diaminociclohexano (PCBHEX), N,N'-Di(4-Percarboxibenzoil)-1,4.butanodiamina (PCBBD), N,N'-Di(4-Percarboxianilina)-tereftalato (DPCAT), ácido N,N,N'N'-1,2,4,5-tetracarboxibenzoil-di(6-aminopercarboxicaproico) (DiPAP), N,N'-Di(percarboxiadipoil)fenilenodiamina (DPAPD),N,N'-Succinoil-di(4-percarboxi)anilina (SDPCA), análogo C^{3} del ácido N,N'-Tereftaloil-di-(8-amino peroxioctanoico) (TPOCT) como se describe en WO 95/06104.

Otra categoría de este tipo de agentes blanqueadores que pueden ser usados comprende los blanqueadores halogenados. Ejemplos de blanqueadores de liberación de hipohalita comprenden, por ejemplo, ácido tricloro-isocianúrico y los dicloroisocianuratos de sodio y de potasio y N-cloro y N-bromo alcanosulfonamidas. Estos materiales son normalmente añadidos en un 0.5-10% en peso del producto acabado, preferiblemente en un 1-5% en peso.

Otro tipo de agentes blanqueadores particularmente interesantes basados en peroxidasa incluyen los blanqueadores fotoactivados como las ftalocianinas sulfonatadas de zinc y/o de aluminio. Estos materiales pueden ser depositados sobre el substrato durante el proceso de lavado. Ante la irradiación de luz, en presencia de oxígeno, por ejemplo al tender la ropa fuera para secarse a la luz diurna, el complejo de ftalocianina sulfonatada es activado y, en consecuencia, el substrato es blanqueado. Complejos de ftalocianina de zinc preferidos y un proceso de blanqueamiento fotoactivado están descritos en US 4,033,718. Normalmente, las composiciones detergentes contienen aproximadamente del 0.025% a aproximadamente el 1.25%, en peso, de ftalocianina de zinc sulfonatada.

Los agentes blanqueadores basados en peróxido pueden ser usados en combinación con activadores del blanqueamiento como tetraacetiletilenodiamina (TAED), nonanoiloxibenzeno-sulfonato (NOBS, descrito en US 4,412,934), 3,5,5-trimetilhexanoiloxobenzenosulfonato (ISO-NOBS, descrito en EP 120 591) o pentaacetilglucosa (PAG), los cuales son perhidrolizados para formar un perácido como la especie de blanqueador activo, lo que produce un efecto blanqueador mejorado. Además, unos activadores del blanqueamiento muy adecuados son

6-octanamidocaproiloxibenzenosulfonato,

6-nonanamidocaproil)oxibenzenosulfonato y

6-decanamidocaproiloxibenzenosulfonato o mezclas derivadas.

También son activadores adecuados los ésteres de citrato acilados como los descritos en la solicitud de patente europea Nº. 91870207.7.

Otros agentes blanqueadores útiles, incluyendo los peroxiácidos y los sistemas blanqueadores que comprenden activadores del blanqueamiento y compuestos blanqueadores de peroxígeno para un uso en composiciones de limpieza según la invención, se describen en la solicitud USSN 08/136,626.

El peróxido de hidrógeno puede también ser generado en la solución de detergente añadiendo un sistema enzimático (es decir una enzima y un substrato para la misma) que es capaz de generar peróxido de hidrógeno al principio o durante el lavado y/o el proceso de aclarado. Estos sistemas enzimáticos están descritos en la publicación de la Solicitud de patente EP0537381.

La liberación de perácido de una fuente de un blanqueador de peroxígeno puede ser activada usando una lipasa según la invención. Los componentes necesarios para el sistema de hidrólisis enzimática es el substrato precursor del perácido: un diacil peróxido R_{1}-CO-O-O-CO-R, donde R y R_{1} pueden ser alquilo saturado o insaturado, un grupo arilo o un alcarilo. La lipasa reacciona con el substrato y libera perácidos durante el lavado.

Las sales cuaternarias de imina pueden ser usadas como catalizadores del blanqueamiento junto con un compuesto de peroxígeno, como se describe en WO 95/13352.

Los sistemas blanqueadores basados en peróxido también pueden comprender un catalizador de manganeso. El catalizador de manganeso puede, p. ej., ser uno de los compuestos descritos en "Efficient manganese catalysts for low temperature bleaching", Nature 369, 1994, págs. 637-639.

Supresores de espuma: Otro ingrediente opcional es un supresor de espuma, ilustrado por siliconas y mezclas de sílice-silicona. Las siliconas pueden ser generalmente representadas por materiales de polisiloxano alquilado, mientras que el sílice es normalmente usado en formas finamente divididas ilustradas por aerogeles y xerogeles de sílice y sílices hidrofóbicos de varios tipos. Estos materiales pueden ser incorporados como granulados en los que el supresor de espuma puede ser liberado ventajosamente incorporado en un soporte impermeable detergente, hidrosoluble o hidrodispersable, sustancialmente no tensioactivo. De forma alternativa el supresor de espuma puede ser disuelto o dispersado en un soporte líquido y aplicado por pulverización sobre uno o varios de los otros componentes.

Un agente de control de espuma de silicona preferido está descrito en US 3,933,672. Otros supresores de espuma particularmente útiles son los supresores de espuma de silicona autoemulsificante, descritos en DE 2,646,126. Un ejemplo de un compuesto de este tipo es DC-544, comercialmente disponible por Dow Corning, que es un copolímero de siloxano-glicol. Un agente de control de espuma especialmente preferido es el sistema supresor de espuma que comprende una mezcla de aceites de silicona y 2-alquilalcanoles. Un 2-alquilalcanol adecuado es 2-butil-octanol que es comercialmente disponible con el nombre comercial Isofol 12 R.

Este sistema supresor de espuma está descrito en la solicitud de patente europea Nº. 0593841.

Agentes de control de espuma de silicona especialmente preferidos están descritos en la publicación de la solicitud de patente europea Nº. 0573699. Dichas composiciones pueden comprender una mezcla de sílice/silicona en combinación con sílice pirógeno no poroso como Aerosil^{R}.

Los supresores de espuma anteriormente descritos se emplean normalmente en niveles del 0.001% al 2% en peso de la composición, preferiblemente del 0.01% al 1% en peso.

Otros componentes: Se pueden emplear otros componentes usados en composiciones detergentes, como agentes de suspensión de la suciedad, agentes de liberación de la suciedad, blanqueadores ópticos, abrasivos, bactericidas, inhibidores de la decoloración, agentes colorantes, y/o perfumes encapsulados o no encapsulados.

Materiales de encapsulación especialmente adecuados son las cápsulas solubles en agua que consisten en una matriz de polisacárido y compuestos polihidroxi como los descritos en GB 1,464,616.

Otros materiales de encapsulación hidrosolubles adecuados comprenden dextrinas derivadas de ésteres de ácido de almidón no gelatinizado de ácidos dicarboxílicos sustituidos, tal y como se describe en US 3,455,838. Estas dextrinas de ésteres de ácido son preferiblemente preparadas a partir de almidones tales como maíz ceroso, sorgo ceroso, sagú, tapioca y patata. Ejemplos adecuados de dichos materiales de encapsulación comprenden N-Lok fabricados por National Starch. El material de encapsulación N-Lok consiste en un almidón de maíz modificado y glucosa. El almidón es modificado mediante la adición de grupos sustituidos monofuncionales como anhídrido de ácido octenil succínico.

Los agentes antirredeposición y de suspensión de la suciedad adecuados aquí comprenden derivados de celulosa como metilcelulosa, carboximetilcelulosa e hidroxietilcelulosa, y ácidos policarboxílicos homo- o co-poliméricos o sus sales. Los polímeros de este tipo comprenden los poliacrilatos y copolímeros de ácidos anhídrido maleicos-acrílicos, p. ej. Sokalan CP5, previamente mencionados como constructores, así como copolímeros de anhídrido maleico con etileno, metilvinil éter o ácido metacrílico, el anhídrido maleico constituyendo al menos un 20% de los moles del copolímero. Estos materiales normalmente se usan en niveles del 0.5% al 10% en peso, más preferiblemente del 0.75% al 8%, más preferiblemente del 1% al 6% en peso de la composición.

Los blanqueadores ópticos preferidos son de carácter aniónico, algunos ejemplos de los cuales son disodio 4,4'-bis-(2-dietanolamino-4-anilino-s-triazin-6-ilamino)estilbeno-2:2' disulfonato, disodio 4,-4'-bis-(2-morfolino-4-anilino-s-triazin-6-ilamino-estilbeno-2:2'-disulfonato, disodio 4,4'-bis-(2,4-dianilino-s-triazin-6-ilamino)estilbeno-2:2'-disulfonato, monosodio 4',4''-bis-(2,4-dianilino-s-triazin-6 ilamino)estilbeno-2-sulfonato, disodio 4,4'-bis-(2-anilino-4-(N-metill-N-2-hidroxietilamino)-s-triazin-6-ilamino)estilbeno-2,2'-disulfonato, disodio 4,4'-bis-(4-fenil-2,1,3-triazol-2-il)-estilbeno-2,2'-disulfonato, disodio 4,4'bis(2-anilino-4-(1-metil-2-hidroxietilamino)-s-triazin-6-ilamina)estilbeno-2,2'disulfonato, sodio 2(estilbil-4''-(nafto-1',2':4,5)-1,2,3,-triazola-2''-sulfonato y 4,4'-bis(2-sulfostiril)bife-
nil.

Otros materiales poliméricos útiles son los polietileno glicoles, particularmente los de peso molecular 1000-10000, más en particular 2000 a 8000 y más preferiblemente aproximadamente 4000. Éstos se usan en niveles del 0.20% al 5% más preferiblemente del 0.25% al 2.5% en peso. Estos polímeros y las sales de policarboxilato horno- o copoliméricas previamente mencionadas son valiosas para mejorar el mantenimiento de la blancura, la deposición de ceniza en el tejido y el rendimiento de limpieza de suciedad arcillosa proteínica y oxidable en presencia de impurezas de metales de transición.

También puede ser usado un polímero de injerto como el descrito en WO 95/22593.

Agentes de liberación de la suciedad útiles para las composiciones de la presente invención son de forma convencional los copolímeros o terpolímeros de ácido tereftálico con etilenoglicol y/o unidades de propilenoglicol en varias disposiciones. Ejemplos de tales polímeros están descritos en US 4,116,885, US 4,711,730 y EP 0 272 033. Un polímero particularmente preferido según la EP 0 272 033 tiene la fórmula:

(CH_{3} (PEG)_{43})_{\text{0.75}} (POH)_{\text{0.25}} [T-PO)_{\text{2.8}}(T-PEG)_{\text{0.4}}]T(POH)_{\text{0.25}} ((PEG)_{43}CH_{3})_{\text{0.75}}

donde PEG es -(OC_{2}H_{4})O-, PO es (OC_{3}H_{6}O) y T es (pcOC_{6}H_{4}CO).

También son muy útiles los poliésteres modificados como copolímeros aleatorios de dimetil tereftalato, dimetil sulfoisoftalato, etilenoglicol y 1-2 propano diol, los grupos terminales consisten principalmente en sulfobenzoato y secundariamente en monoésteres de etilenoglicol y/o propanodiol. El objetivo es obtener un polímero cubierto en ambos extremos por grupos de sulfobenzoato, "primariamente", en el presente contexto la mayor parte de dichos copolímeros estarán cubiertos en los extremos por grupos de sulfobenzoato. No obstante, algunos copolímeros no estarán cubiertos completamente, y en consecuencia sus grupos terminales podrán consistir en monoéster de etilenoglicol y/o propano 1-2 diol, consistiendo "secundariamente" en tales especies.

Los poliésteres seleccionados aquí contienen aproximadamente un 46% en peso de ácido dimetil tereftálico, aproximadamente un 16% en peso de propano-1.2 diol, aproximadamente un 10% en peso de etileno glicol, aproximadamente un 13% en peso de ácido dimetil sulfobenzoico y aproximadamente un 15% en peso de ácido sulfoisoftálico, y tienen un peso molecular de aproximadamente 3.000. Los poliésteres y su método de preparación están descritos con detalle en EP 311 342.

Agentes suavizantes: Agentes suavizantes del tejido pueden también ser incorporados en las composiciones de detergente de lavado según la presente invención. Estos agentes pueden ser inorgánicos u orgánicos en tipo. Los agentes suavizantes inorgánicos están ilustrados por las arcillas de esmectita descritas en GB-A-1 400898 y en US 5,019,292. Los agentes suavizantes del tejido orgánicos comprenden aminas terciarias insolubles en agua como las descritas en GB-Al 514 276 y EP 0 011 340, y su combinación con sales de amonio mono cuaternarias C_{12}-C_{14} se describe en EP 026 528 y con amidas de cadena larga se describe en EP 0 242 919. Otros ingredientes orgánicos útiles de los sistemas suavizantes del tejido comprenden materiales de óxido de polietileno de alto peso molecular como los descritos en EP 0 299 575 y 0 313 146.

Los niveles de arcilla de esmectita están normalmente en la gama del 5% al 15%, más preferiblemente del 8% al 12% en peso, el material siendo añadido como un componente seco mezclado con el resto de la formulación. Agentes suavizantes del tejido orgánicos como las aminas terciarias insolubles en agua o materiales de amidas de cadena larga se incorporan en niveles del 0.5% al 5% en peso, normalmente del 1% la 3% en peso, mientras que los materiales de óxido de polietileno de alto peso molecular y los materiales catiónicos hidrosolubles se añaden en niveles del 0.1% al 2%, normalmente del 0.15% al 1.5% en peso. Estos materiales son normalmente añadidos a la parte de pulverización seca de la composición, aunque en algunos ejemplos puede ser más conveniente añadirlos como una mezcla seca granulosa, o pulverizarlos como un líquido fundido sobre los otros componentes sólidos de la composición.

Agentes poliméricos de inhibición de la transferencia de tintes: Las composiciones detergentes según la presente invención pueden comprender también del 0.001% al 10%, preferiblemente del 0.01% al 2%, más preferiblemente del 0.05% al 1% en peso de agentes poliméricos de inhibición de la transferencia de tintes. Dichos agentes poliméricos de inhibición de la transferencia de tintes son normalmente incorporados a las composiciones detergentes con el objetivo de inhibir la transferencia de tintes desde tejidos teñidos a otros tejidos lavados conjuntamente. Estos polímeros tienen la capacidad de complejar o adsorber los tintes fugitivos que salen durante el lavado de los tejidos teñidos antes de que dichos tintes tengan la oportunidad de fijarse a otros artículos en el lavado.

Agentes poliméricos de inhibición de la transferencia de tintes especialmente adecuados son los polímeros de N-óxido de poliamina, los copolímeros de N-vinilpirrolidona y N-vinilimidazol, los polímeros de polivinilpirrolidona, poliviniloxazolidonas y polivinilimidazolas o mezclas derivadas. La adición de tales polímeros también mejora el rendimiento de las enzimas según la invención.

La composición de detergente según la invención puede ser en forma líquida, de pasta, geles, barras o granulosa. Se pueden producir granulados no espolvoreados, p. ej., como se describe en US 4,106,991 y 4,661,452 (ambas de Novo Industri A/S) los cuales pueden opcionalmente ser revestidos por métodos conocido en la técnica. Ejemplos de materiales de revestimiento cerosos son los productos de óxido de poli(etileno) (polietilenoglicol, PEG) con pesos moleculares medios de 1000 a 20000; nonilfenoles etoxilados que tienen de 16 a 50 unidades de óxido de etileno; alcoholes grasos etoxilados en los que el alcohol contiene de 12 a 20 átomos de carbono y en los cuales hay de 15 a 80 unidades de óxido de etileno; alcoholes grasos; ácidos grasos; y mono- y di y triglicéridos de ácidos grasos. Ejemplos de materiales de revestimiento que forman una película adecuados para ser aplicados por técnicas de lecho fluidificado se dan en GB 1483591.

Las composiciones granulosas según la presente invención puede también estar en "forma compacta", es decir, pueden tener una densidad relativamente más alta que los detergentes granulosos convencionales, es decir, de 550 a 950 g/l; en este caso, las composiciones detergentes granulosas según la presente invención contendrán una cantidad inferior de "sal de relleno inorgánica", en comparación con los detergentes granulosos convencionales; sales de relleno típicas son las sales de metales alcalinotérreos de sulfatos y cloruros, normalmente sulfato de sodio; un detergente "compacto" normalmente no comprende más de un 10% de sal de relleno. Las composiciones líquidas según la presente invención pueden también estar en "forma concentrada", en este caso, las composiciones detergentes líquidas según la presente invención contendrán una cantidad inferior de agua, en comparación con los detergentes líquidos convencionales. Normalmente, el contenido de agua de un detergente líquido concentrado será inferior al 30%, más preferiblemente inferior al 20%, más preferiblemente inferior al 10% en peso de las composiciones detergentes.

Las composiciones de la invención pueden ser formuladas, por ejemplo, como composiciones de detergente de lavado a mano y a máquina, incluyendo composiciones de aditivos de lavado y composiciones adecuadas para ser usadas en el pre-tratamiento de tejidos teñidos, composiciones suavizantes del tejido que se añaden en el enjuague, y composiciones para un uso general en el hogar en operaciones de limpieza de superficies duras y de lavado de la vajilla.

Formas particulares de composiciones de detergente de lavado que entran dentro de la invención comprenden:

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1) Una composición de detergente formulada como un granulado que tiene una densidad aparente de al menos 600 g/l que comprende

1

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(Tabla pasa a página siguiente)

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2) Una composición de detergente formulada como un granulado que tiene una densidad aparente de al menos 600 g/l que comprende

2

3) Una composición de detergente formulada como un granulado que tiene una densidad aparente de al menos 600 g/l que comprende

3

4) Una composición de detergente formulada como un granulado que tiene una densidad aparente de al menos 600 g/l que comprende

4

5) Una composición de detergente líquido acuoso que comprende

5

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6) Una composición de detergente líquido acuoso estructurado que comprende

6

7) Una composición de detergente formulada como un granulado que tiene una densidad aparente de al menos 600 g/l que comprende

7

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8) Una composición de detergente formulada como un granulado que comprende

8

9) Una composición de detergente formulada como un granulado

9

10) Una composición de detergente formulada como un granulado

11

11) Una composición de detergente formulada como un granulado

12

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12) Una composición de detergente formulada como un granulado

14

13) Una composición de detergente formulada como un granulado

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14) Una composición de detergente formulada como un granulado

17

15) Una composición de detergente formulada como un granulado

18

16) Una composición de detergente formulada como un granulado

19

17) Una composición de detergente formulada como un granulado

20

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18) Una composición de detergente formulada como un granulado

21

19) Una composición de detergente formulada como un granulado

22

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20) Una composición de detergente formulada como un granulado

23

21) Una composición de detergente formulada como un granulado

24

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22) Una composición de detergente formulada como un granulado

25

23) Una composición de detergente formulada como un granulado que comprende

27

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24) Una composición de detergente líquido acuoso que comprende

28

25) Una composición de detergente líquido acuoso que comprende

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26) Una composición de detergente formulada como un líquido concentrado.

31

27) Una composición de detergente formulada como un líquido concentrado.

33

28) Una composición de detergente formulada como un granulado que tiene una densidad aparente de al menos 600 g/l que comprende

34

29) Una composición de detergente formulada como un granulado

36

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30) Una composición de detergente formulada como un granulado

37

Las composiciones específicas siguientes pretenden ejemplificar las composiciones de la presente invención, pero no pretenden necesariamente limitar o definir de ningún modo el objetivo de la invención.

En las composiciones detergentes, las identificaciones abreviadas de los componentes tienen los siguientes significados:

LAS:

Alquil benceno sulfonato C_{12} de sodio lineal

TAS:

Alquil sulfato de sodio de sebo

XYAS:

Alquil sulfato de sodio C_{1x}-C_{1y}

SS:

Agente tensioactivo secundario de jabón de fórmula ácido 2-butil octanoico.

25EY:

Un alcohol C_{12}-C_{15} primario lineal predominantemente condensado con una media de Y moles de óxido de etileno.

45EY:

Un alcohol C_{14}-C_{15} primario lineal predominantemente condensado con una media de Y moles de óxido de etileno.

XYEZS:

Alquil sulfato de sodio C_{1x}-C_{1y} condensado con una media de Z moles de óxido de etileno por mol.

No iónico:

Alcohol graso C_{13}-C_{15} etoxilado/propoxilado mezclado con un grado medio de etoxilación de 3.8 y un grado medio de propoxilación de 4.5 vendido con el nombre comercial Plurafax LF404 por BASF Gmbh.

CFAA:

alquil N-metil glucamida C_{12}-C_{14}

TFAA:

Alquil N-metil glucamida C_{16}-C_{18}

Silicato:

Silicato de sodio amorfo (SiO_{2}:Na_{2}O proporción = 2.0)

NaSKS-6:

Silicato estratificado cristalino de fórmula d-Na_{2}Si_{2}O_{5}

Carbonato:

Carbonato de sodio anhidro

Fosfato:

Tripolifosfato de sodio

MA/AA:

Copolímero de ácido maleico/acrílico 1:4, peso molecular medio aproximadamente 80,000.

Poliacrilato:

Homopolímero de poliacrilato con un peso molecular medio de 8,000, vendido con el nombre comercial PA30 por BASF Gmbh

Zeolita A:

Aluminosilicato de sodio hidratado de fórmula Na_{12}(AlO_{2}SiO_{2})_{12}.27H_{2}O con un tamaño de partícula primaria en un rango de 1 a 10 micrómetros.

Citrato:

Citrato trisódico dihidrato

Cítrico:

Ácido cítrico

Perborato:

Blanqueador de perborato de sodio anhidro monohidrato, fórmula empírica NaBO_{2}.H_{2}O_{2}

PB4:

Perborato de sodio anhidro tetrahidrato

Percarbonato:

Blanqueador de percarbonato de sodio anhidro con la fórmula empírica 2Na_{2}CO_{3}.3H_{2}O_{2}

TAED:

Tetraacetil etileno diamina

CMC:

Carboximetilcelulosa de sodio

DETPMP:

Dietilenotriamina de ácido penta (metileno fosfónico), comercializado por Monsanto bajo el nombre comercial Dequest 2060

PVP:

Polímero de polivinilpirrolidona

EDDS:

Ácido etilenodiamina-N,N'disuccínico, [S,S] isómero en forma de la sal sódica

Supresor de espuma:

25% de cera de parafina, punto de fusión 50ºC, 17% de sílice hidrofóbico, 58% de aceite de parafina

Espuma granulosa:

12% de silicona/sílice, 18% de alcohol de estearilo, 70% de almidón en forma granulosa

Sulfato:

sulfato de sodio anhidro

HMWPEO:

óxido de polietileno de alto peso molecular

TAE 25:

Etoxilato de alcohol de sebo (25)

Composición 1

Una composición granulosa de limpieza de tejidos según la invención puede ser preparada como sigue:

Alquil benceno sulfonato C_{12} de sodio lineal	6.5
Sulfato de sodio	15.0
Zeolita A	26.0
Nitrilotriacetato de sodio	5.0
Enzima de la invención	0.1
PVP	0.5
TAED	3.0
Ácido bórico	4.0
Perborato	18.0
Sulfonato de fenol	0.1
Otros	hasta 100

Composición 2

Una composición granulosa de limpieza de tejidos compacta (densidad 800/l) según la invención puede ser preparada como sigue:

45AS	8.0
25E3S	2.0
25E5	3.0

(Continuación)

25E3	3.0
TFAA	2.5
Zeolita A	17.0
NaSKS-6	12.0
Ácido cítrico	3.0
Carbonato	7.0
5 MA/AA	5.0
CMC	0.4
Enzima de la invención	0.1
TAED	6.0
Percarbonato	22.0
EDDS	0.3
Supresor de espuma granuloso	3.5
agua/otros	hasta 100%

Composición 3

Composiciones granulosas para la limpieza de tejidos según la invención, que son especialmente útiles para el lavado de tejidos teñidos, fueron preparadas como sigue:

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Composición 4

Composiciones granulosas para la limpieza de tejidos según la invención, que proporcionan capacidad de "Reblandecimiento mediante lavado", pueden ser preparadas como sigue:

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Composición 5

Composiciones líquidas para la limpieza de tejidos de servicio pesados según la invención pueden ser preparadas como sigue:

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Composición 6

Una composición de detergente formulada como un granulado

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Composición 7

Una composición de detergente que contiene decolorante formulada como un granulado

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Composición 8

Una composición de detergente no-decolorante formulada como un granulado

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Composición 9

Una composición de detergente formulada como un granulado

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Composición 10

Una composición de detergente formulada como un granulado

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48

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Composición 11

Una composición de detergente formulada como un granulado

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Composición 12

Una composición de detergente formulada como un granulado

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Composición 13

Una composición de detergente formulada como un granulado

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Composición 14

Una composición de detergente formulada como un granulado

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Composición 15

Una composición de detergente en polvo

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Composición 16

Un agente de lavado líquido acuoso

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Composición 17

Una composición de detergente líquida

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Composición 18

Una composición de detergente formulada como detergente líquido no acuoso

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Composición 19

Una composición de detergente formulada como un detergente líquido no acuoso

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Composición 20

Una composición de detergente formulada como detergentes acuosos liq.

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Composición 21

Una composición de detergente líquida que comprende

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Composición 22

Una composición de detergente líquida acuosa

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Composición para lavavajillas

La composición de detergente para lavavajillas comprende un agente tensioactivo que puede ser aniónico, no-iónico, catiónico, anfotérico o una mezcla de estos tipos. El detergente contendrá el 0-90% de agentes tensioactivos no-iónicos tales como alcoholes etoxilados de cadena lineal propoxilada poco o no espumosos.

La composición del detergente puede contener sales constructoras de detergente de tipos inorgánicos y/o orgánicos. Los constructores del detergente pueden ser subdivididos en tipos que contienen fósforo y tipos que no contienen fósforo. La composición del detergente normalmente contiene el 1-90% de constructores de detergentes.

Los ejemplos de constructores de detergentes alcalinos inorgánicos que contienen fósforo, si existen, comprenden las sales hidrosolubles especialmente pirofosfatos de metal alcalino, ortofosfatos, polifosfatos, y fosfonatos. Los ejemplos de constructores inorgánicos que no contienen fósforo, si existen, comprenden carbonatos de metal alcalino hidrosolubles, boratos y silicatos así como los distintos tipos de alumino silicatos cristalinos o amorfos insolubles en agua cuyos representantes más conocidos son las zeolitas.

Los ejemplos de constructores orgánicos adecuados comprenden el metal alcalino, amonio y amonio sustituido, citratos, succinatos, malonatos, sulfonatos de ácidos grasos, carboximetoxi succinatos, poliacetatos de amonio, carboxilatos, policarboxilatos, aminopolicarboxilatos, poliacetil carboxilatos y polihidroxsulfonatos.

Otros constructores orgánicos adecuados comprenden los polímeros y copolímeros de peso molecular más elevado conocidos por tener propiedades constructoras, por ejemplo ácido poliacrílico apropiado, copolímeros del ácido polimaleico y poliacrílico/polimaleico y sus sales.

La composición de detergente para lavavajillas puede contener decolorantes del tipo clorina/bromina o del tipo del oxígeno. Los ejemplos de decolorantes inorgánicos del tipo de clorina/bromina son litio, hipoclorito e hipobromito de sodio o de calcio así como fosfato clorurado de trisodio. Los ejemplos de decolorantes orgánicos del tipo de clorina/bromina son imidas heterocíclicas de N-bromo y N-cloro como ácidos tricloroisocianúricos, tribromoisocianúricos, dibromoisocianúricos y dicloroisocianúricos, y sales derivadas con cationes de solubilización en agua como potasio y sodio. También son adecuados los compuestos de hidantoína.

Los decolorantes de oxígeno son preferidos, por ejemplo en forma de una persal inorgánica, preferiblemente con un precursor de la decoloración o como un compuesto de ácido peroxídico. Ejemplos típicos de compuestos de decolorante de peróxido adecuados son perboratos de metal alcalino, tanto tetrahidratos como monohidratos, percarbonatos de metal alcalino, persilicatos y perfosfatos. Materiales activadores preferidos son tetraacetiletilendiamina y triacetato de glicerol.

La composición de detergente para lavavajillas de la invención puede ser estabilizada usando agentes estabilizantes convencionales para la(s) enzima(s), p.ej. un poliol como p.ej.propilenoglicol, un azúcar o un alcohol de azúcar, ácido láctico, ácido bórico, o un derivado de ácido bórico, p.ej. un éster de borato aromático.

La composición de detergente para lavavajillas puede también comprender otras enzimas, en particular una amilasa, una proteasa y/o una celulasa.

La composición de detergente para lavavajillas de la invención puede también contener otros ingredientes de detergentes convencionales, p.ej. material desfloculante, material de relleno, depresores de espuma, agentes anticorrosivos, agentes de supensión de la suciedad, agentes aislantes, agentes de redisposición antisuciedad, agentes deshidratantes, tintes, bactericidas, fluorescentes, espesantes y perfumes.

La primera enzima de lavado lipolítica de la invención puede ser incorporada en concentraciones empleadas de forma convencional en detergentes. Actualmente se contempla que, en la composición de detergente de la invención, la enzima lipolítica puede ser añadida en una cantidad correspondiente a 0.00001-1 mg (calculado como proteína enzimática pura) de enzima lipolítica por litro de solución de lavado.

A continuación se ejemplifican unas composiciones para lavavajillas específicamente preferidas:

1) Composición en polvo para lavavajillas automático

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2) Composición en polvo para lavavajillas automático

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3) Composición en polvo para lavavajillas automático

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4) Composición en polvo para lavavajillas automático

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5) Composición en polvo para lavavajillas automático

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6) Composición en polvo y líquida para lavavajillas con sistema de limpieza tensioactivo

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7) Composición líquida no acuosa para lavavajillas automático

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8) Composición líquida no acuosa para lavavajillas

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9) Composición líquida tixotrópica para lavavajillas automático

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10) Composición líquida para lavavajillas automático

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11) Composición líquida para lavavajillas automático que contiene partículas decolorantes protegidas

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11) Composiciones para lavavajillas automático según se describe en 1), 2), 3), 4), 6) y 10), en las que el perborato se reemplaza por percarbonato.

12) Composiciones para lavavajillas automático según se describe en 1)-6) que adicionalmente contienen un catalizador de manganeso. El catalizador de manganeso puede, p. ej., ser uno de los compuestos descritos en "Efficient manganese catalyst for low-temperature bleaching", Nature 369, 1994, págs. 637-639.

Además, la primera enzima lipolítica de lavado según la invención puede ser usada en composiciones suavizantes:

La enzima lipolítica de la invención puede ser usada en suavizantes para tejidos, p.ej. como se describe en Surfactant and Consumer Products, Ed. por J. Falbe, 1987, págs 295-296; Tenside Surfactants Detergents, 30 (1993), 6, págs 394-399; JAOCS, vol. 61 (1984), 2, págs 367-376; EP 517 762; EP 123 400; WO 92/19714; WO 93/19147; US 5,082,578; EP 494 769; EP 544 493; EP 543 562; US 5,235,082; EP 568 297; EP 570 237.

Materiales y métodos Actividad de lipasa (LU)

Un substrato para lipasa fue preparado por emulsión de tributirato de glicerina (MERCK) usando goma arábiga como emulsionante. La actividad de lipasa se evalúa a pH 7 usando un método de comprobación del pH. Una unidad de actividad de lipasa (LU) está definida como la cantidad requerida para liberar un micromol de ácido graso por minuto.

Cepas y plásmidos

Humicola Lanuginosa DSM 4109 disponible de Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroderweg lb, D-3300 Braunschweig, república federal de Alemania (EP 305,216)

Saccharomyces cerevisiae YNG318: MATa Dpep4[cir^{+}] ura3-52, leu2-D2, his 4-539

Aspergillus oryzae IFO 4177

A. oryzae A1560-T40, un derivado careciente de proteasa de A. orvzae IFO 4177 (WO 91/17243).

A. oryzae JaL 125: Aspergillus oryzae IFO 4177 disponible en Institute for Fermention, Osaka; 17-25 Juso Hammachi 2-Chome Yodogawa-ku, Osaka, Japón, que tiene el gen de proteasa alcalina llamado "alp" (descrito por Murakami K et al., (1991), Agric. Biol. Chem. 55, P. 2807-2811) eliminado por un método de sustitución de genes de una fase (descrito por G. May en "Applied Molecular Genetics of Filamentous Fungi" (1992), P. 1-25. Eds. J. R. Kinghorn y G. Turner; Blackie Academic and Professional), usando el gen A. oryzae pirG como marcador.

Absidia Reflexa ATTC 44896 está disponible de ATCC (American Type Culture Collection, 12301, Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852. EEUU) como Absidia Reflexa ATTC 44896 y de IFO (Institute for Fermentation, 17-85 Juso-horrmachi 2-chomee, Yodogawa-ku, Osaka 532, Japón) como Absidia reflexa

IFO 5874 según se describe en WO 96/113578 (Novo Nordisk A/S).

Célula de levadura YPH499 (Stratagene)

E.coli DH10B (Gibco)

pTiK04: construido a partir de pJSO37 que incluye el gen lipasa de Ab reflexa NL 127 maduro con una extensión de codificación de SPIRR hacia el inicio del gen de lipasa.

pTiK05: Como pTiK04 sin la extensión SPIRR

pTiK06: pTik04 con la secuencia de señal de MF\alpha1

pTiK07: pTik05 con la secuencia de señal de MF\alpha1

pYESHL es un vector transportador de levadura/E. Coli que expresa y segrega un nivel bajo de la enzima lipolítica de H. lanuginosa en levadura. Más específicamente pYESHL es un derivado de pYES2 donde el promotor de GAL1 fue cortado y el gen de la enzima lipolítica de H. lanuginosa y el promotor de TPI (isomerasa de triosa fosfato) de S. cerevisiae (Alber, T. y Kawasaki, G., J.Mol.Appl. Genet 1, 419-434 (1982) fueron donadas entre los sitios de Sphl y xbal. Un mapa de restricción de pYESHL está mostrado en la Fig. 1.

PJSO37 (plásmido de expresión de S. cerevisiae)(J.S.Okkels, (1996)'' Una eliminación del promotor de URA3 en un vector pYES vector aumenta el nivel de expresión de una lipasa fúngida en Saccharomyces cerevisiae. Recombinant DNA Biotechnology III: The Integration of Biological and Engineering Sciences, vol. 782 of the Annals of the New York Academy of Sciences). Más específicamente, el plásmido de expresión pJSO37, es derivado de pYES 2.0 mediante el reemplazo del promotor de GAL1 inducible de pYES 2.0 con el promotor de TPI (isomerasa de triosa fosfato) expresado de forma constitutiva a partir de Saccharomyces cerevisiae (Albert y Karwasaki, (1982), J. Mol. Appl Genet., 1, 419-434), y la eliminación del promotor de URA3. Un mapa de restricción de pJSO37 está mostrado en la Fig. 6.

pYES 2.0 (Invitrogen Corp., Reino Unido)

p960 plásmido de expresión de A. oryzae (descrito en EP 305 216)

pUC19 (Yanish-Perron et al. (1985) Gene 33, 103-119)

pHD414 (vector de expresión de Aspergillus siendo un derivado del plásmido

p775 descrito en EP 238 023). La construcción de pHD414 está posteriormente descrita en WO 93/11249).

PJVi245 (ver figura 8)

pCaHj383 (ver figura 8)

pCaHj385 (ver figura 8)

Ensayo de filtro de calcio bajo Procedimiento

1) Proporcionar placas de réplicas de SC Ura (útiles para seleccionar cepas que llevan el vector de expresión) con un primer filtro de unión de proteínas (membrana Nylon) y un segundo filtro de unión bajo de proteínas (acetato de celulosa) en la parte superior.

2) Extender las células de levadura que contienen un gen de enzima lipolítica madre o una enzima lipolítica mutada en cuestión en el filtro doble e incubar durante 2 ó 3 días a 30ºC.

3) Mantener las colonias en el filtro superior transfiriendo el filtro superior a una placa nueva.

4) Cambiar el filtro de unión de proteínas a una placa de Petri vacía.

5) Verter una solución de agarosa que comprende una emulsión de aceite de oliva (2% P.V.A.:Aceite de oliva=3:1), Verde Brillante (indicador,0.004%), 100 mM de un tampón tris de pH9 y EGTA (concentración final de 5mM) en el filtro inferior para identificar las colonias que expresan actividad lipolítica en forma de puntos azul
verdoso.

6) Identificar las colonias halladas en el paso 5) que tengan una dependencia reducida de calcio en comparación con la enzima lipolítica madre.

Ensayo del filtro de Dobanol®25-7

La selección de una tolerancia mejorada en un componente de detergente se realiza usando un ensayo de filtro correspondiente al anteriormente descrito salvo por el hecho de que la solución definida en 5) comprende además el 0.02% de Dobanol®25-7.

Un ensayo de selección alternativo es el siguiente

1) Proporcionar placas de SC Ura (útiles para seleccionar cepas que llevan un vector de expresión) con, en primer lugar, un filtro de unión de proteínas (p. ej. nylon) seguido de un filtro de unión no-proteínico (p. ej. Acetato de celulosa) en la parte superior.

2) Extender células de levadura que contengan un gen de lipasa madre o un gen de lipasa mutada en el filtro e incubar durante 3 ó 4 días a 30ºC.

3) Tener las colonias en el filtro superior transfiriendo el filtro superior a una placa nueva.

4) Cambiar el filtro de unión de proteínas a una placa de Petri que contiene:

Una solución de agarosa que comprende una emulsión de aceite de oliva (2% P.V.A.:Aceite de oliva=2:1), Verde Brillante (indicador, 0.004%), 100 mM de tampón tris de pH10 y el detergente o componente de detergente, p.ej. placas de PCS. El filtro de unión de proteínas debería tener el lado de la colonia enfrente de la placa de selección.

5) Identificar las colonias que expresan actividad de lipasa en forma de puntos azul verdoso hallados en la fase 4)

De forma alternativa, el filtro de unión no-proteínico (o un filtro de unión de proteínas) que lleva las colonias de levadura puede ser usado directamente en la placa de selección.

Construcción de mutagenizadas aleatorias mutagenizadas a) Racionales y matemáticas detrás del diseño de mutagenizadas aleatorias mutagenizadas

Los racionales globales para la mutagénesis aleatoria es imitar la evolución natural en la que una baja mutagénesis continua es acoplada a una selección continua de un mejor mutante que es posteriormente mutagenizado. De forma similar, los últimos estudios de evolución in vitro descritos en el texto han sido realizados con unas series de mutagénesis consecutivas con un aumento de la presión de selección (para una revisión ver Joyce 1992). Hemos adaptado este hecho usando el gen de tipo salvaje (wt) en las primeras series de la mutagénesis. Unas variantes mejoradas son posteriormente usadas en las siguientes series de la mutagénesis (para mejorar mediante fases pequeñas). Hemos realizado la selección bajo condiciones de lavado correlacionadas que son suficientes para hallar la actividad enzimática de wt o la actividad mejorada de las variantes. Esto significa que aumentamos la astringencia de la selección cuanto mejores son las variantes aisladas.

Para aumentar el número de cambios y para aumentar la posibilidad de hallar variantes mejoradas, también se han realizado mutagénesis aleatorias localizadas. Se seleccionaron unas regiones importantes deducidas de la estructura de la lipolasa y de los resultados de mutagénesis dirigida. Por ej. toda la zona de contacto lipídica fue considerada importante para la mejora, especialmente la región de tapa y las regiones de contacto de tapa. La zona de contacto lipídica corresponde a 7 regiones del gen que han sido mutadas. También se han realizado combinaciones de las regiones.

b) Mutagénesis aleatoria de todo un gen de codificación de enzimas lipolíticas

El plásmido pYESHL es tratado con 12 M de ácido fórmico durante 20 min. a temperatura ambiente. El gen de codificación de enzimas lipolíticas resultante es ampliado a partir del plásmido tratado de ácido fórmico usando PCR bajo condiciones mutagénicas (0.5 mM de MnCl_{2} y 1/5 de la cantidad normal de ATP, ver p.ej. Leung et al., 1989. Se espera que este tratamiento dé una amplia gama de mutaciones puesto que el ácido fórmico produce principalmente transversiones y la PCR produce mutaciones, principalmente transiciones.

Los fragmentos de PCR resultantes son clonados bien por recombinación doble (Muhlrad et al., 1992) in vivo en el vector transportador o por digestión y ligadura en el vector transportador y transformación de E. coli.

Ocho clones seleccionados de forma aleatoria fueron secuenciados y se descubrió que contenían un promedio de 2-3 mutaciones-transversiones y transiciones.

Usando este método se realizaron siete bibliotecas que contenían de 10,000 a 140,000 clones.

c) Mutagénesis aleatoria localizada

Se sintetiza un cebador mutagénico (oligonucleótido) que corresponde a la parte de la secuencia de ADN que será mutagenizada salvo el(los) nucleótido(s) que corresponde(n) a un(os) codón(es) de aminoácidos que serán mutagenizados. Posteriormente, el cebador mutagénico resultante se usa en una reacción de PCR con un cebador opuesto adecuado. El fragmento de PCR resultante es purificado y digerido y clonado en el vector transportador. De forma alternativa y si fuera necesario, el fragmento de PCR resultante se usa en una segunda reacción de PCR como un cebador con un segundo cebador opuesto adecuado para permitir la digestión y clonación de la región mutagenizada en el vector transportador. Las reacciones de PCR se realizan en condiciones normales.

Al sintetizar los oligonucléotidos usados para la mutagénesis aleatoria localizada, el cálculo del nivel de impurificaciones es importante para estimar la frecuencia de la mutagénesis. La frecuencia de los cambios de nucleótidos puede ser calculada usando la fórmula de distribución Binomial:

191

donde N = el número de oligonucleótidos impurificados; p = la fracción de ningún nucleótido de wt; i = número de cambios de nucleótidos; P(i) = la probabilidad del número i de cambios. Es difícil calcular el número exacto de cambios de aa a partir del número de cambios de nucleótidos, porque la tercera posición en un codón para la mayoría de los aa puede ser dos o los cuatro nucleótidos sin cambiar los aa. Lo mismo sucede en la primera y segunda posición para tres aa con 6 codones. Para estimar el número de cambios de aa es más apropiada una simulación MonteCarlo. Por ejemplo, el programa llamado RAMHA ejecuta una simulación de este tipo (descrita en Siderovski y Mak 1993). Este programa simula la síntesis de p.ej. 10,000 oligonucleótidos con la impurificación deseada y calcula la frecuencia de 0 a n cambios de aa.

Un ejemplo de impurificación

La relación entre impurificación y cambios de aa en una región de 13 codones es (calculada mediante una simulación MonteCarlo):

82

El posible número de combinaciones de cambios de aa para 13 aa puede ser calculado usando la fórmula:

820

De esto se deriva que cuando se realiza la selección p. ej de 100,000 colonias de una biblioteca impurificada al 10% en 13 codones que proporcionan la distribución mostrada en la tabla anterior, esto significará una selección de aproximadamente 13,000 con un cambio de aa (13%). Existen, no obstante, sólo 260 posibles cambios de aa, por lo tanto se seleccionará un gran número del mismo cambio de aa. Una impurificación más alta de p.ej. el 15% (en la tabla anterior) dará menos cambios de aa (aproximadamente 3%), no obstante, los dos cambios de aa también serán reducidos de un grado (10%) y no permitirán una selección de 31200 combinaciones posibles con una capacidad de selección de alrededor de 100.000.

Finalmente, los cambios de aa están sesgados desde el origen del aminoácido wt. P.ej. sólo requiere un cambio de nucleótidos para cambiar Glu a Ala, y tres de Glu a Phe. Esto significa que la probabilidad es inferior para los cambios de aa que requieren 2 ó 3 cambios de nucleótidos que para esto requiere un cambio de nucleótidos. En consecuencia, en algunos casos hemos permitido más de un aa en posiciones en las que conocemos que es posible. Siempre hemos elegido GIC en la posición tercera de los codones con cuatro o seis codones. Esto disminuye el sesgado del codón de wt y también disminuye la posibilidad de parar el codón (del 4.7% al 3.1% si se revuelve completamente). Para un cálculo de la probabilidad de si el tamaño de una agrupación dada contiene los mutantes de sustitución más probables y menos probables, ver Palzkill et al. 1994.

Cálculo de la distribución de poblaciones en la selección de bibliotecas ampliadas

Otra consideración puede tenerse en cuenta. La mayor parte de las bibliotecas presentadas aquí están ampliadas en E. coli antes de transformarse en levadura. Esto significa que hay una probabilidad de realizar una selección del mismo clon ampliado más de una vez-ver cuadro I.

821

Estrategias Anti-terminación

Con el objetivo de evitar que las proteínas se trunquen prematuramente, se deberían evitar mutaciones sin sentido en los codones con un potencial para formar codones de parada. Para codones que pueden ser sustituidos con codones alternativos sin el potencial para formar codones de parada, se pueden utilizar las siguientes estrategias:

Gly: GGA	GG(G,C,T)
Leu: TT(A,G)	CTN
Arg: (A,C)GA	(A,C)GG o CG(C,T)
Ser: TC(A,G)	TC(C,T) o AG(C,T)

El aa siguiente puede, no obstante, sólo ser especificado con codones que muestran un potencial de codón de parada: Cys, Glu, Lys, Gln, Trp, y Tyr. En consecuencia sólo la impurificación puede ser diseñada para circunvenir la colocación aleatoria de codones de parada de producción de nucleótidos. Por ejemplo:

Glu (similar para Lys y Gin)): (90%G/5%C,A) (90%A/3.3%C,G,T) (90%A/3.3%C,G,T). No TAA o TAG = STOP.

Tyr (similar para Cys): (90%T/3.3%A,C,G) (90%N3.3%C,G,T) (90%C/10%T). No TAG o TAA = STOP.

Trp: (90%T/3.3%A,C,G) (90%G/5%C,T) (90%G15%C,T). No TGA o TAA = STOP.

Por supuesto, una estrategia de este tipo anulará algunos cambios de a.a. Usando estas estrategias el número de proteínas truncadas prematuras disminuirá espectacularmente.

Recombinación in vivo de variantes de lipasa de Humicola lanuginosa (redistribución de genes)

Las secuencias de ADN de varias variantes de lipasa de Humicola lanuginosa pueden ser recombinadas in vivo en la misma mezcla.

Los vectores se preparan a partir de las variantes de la lipasa mediante una ligadura en el vector de expresión de levadura pJSO37. Se cortan todos los vectores con Nrul.

El fragmento de ADN de todas las secuencias homólogas de ADN Se prepara mediante la amplificación de la PCR usando unos métodos estándar.

Los fragmentos de ADN y los vectores abiertos son mezclados y transformados en Sacaromices cerevisiae de levadura YNG318 mediante unos métodos estándar. La célula huésped de recombinación es cultivada y seleccionada según el modo descrito anteriormente. Los transformantes que aparecen son aislados y se evalúa un rendimiento de lavado mejorado usando uno de los métodos de ensayo de filtro anteriormente descritos.

Los transformantes positivos son variantes con un rendimiento de lavado mejorado que resultan de la redistribución de genes de secuencias de ADN homólogas.

Mutagénesis in vitro dirigida de un gen de enzimas lipolíticas

Un enfoque que puede ser usado para introducir mutaciones en el gen de enzimas lipolíticas está descrito en Nelson & Long, Analytical Biochemistry, 180, 147-151 (1989). Esto implica la generación en 3 fases de un fragmento de PCR (reacción en cadena de la polimerasa) que contiene la mutación deseada introducida usando una cadena de ADN sintetizada químicamente como uno de los cebadores en las reacciones de PCR. La construcción de un fragmento de PCR puede ser realizada según unos métodos conocidos en la técnica. A partir del fragmento de PCR generado, se puede aislar un fragmento de ADN que lleva la mutación mediante la disociación con enzimas de restricción y puede ser reinsertado en el plásmido de expresión. En las Figuras 4 y 5 el método está también resumido.

Un método alternativo para la construcción de variantes de una enzima de H. lanuginosa lipolítica implica el uso del equipo comercial, Chameleon bicatenario, equipo de mutagénesis dirigida según las instrucciones del fabricante.

El gen que codifica la enzima lipolítica en cuestión está insertado en el plásmido pHD414. Según las instrucciones del fabricante el sitio Scal del gen de ampicilina de pHD414 es cambiado a un sitio Mlul usando el cebador siguiente:

Cebador 3: AGAAATCGGGTATCCTTTCAG

El vector pHD414 que comprende el gen lipolítico en cuestión es posteriormente usado como un molde para ADN polimerasa y oligos 7258 y 7770 cuyas secuencias están descritas en los ejemplos que siguen. La mutación deseada (p. ej. en el N-terminal del gen lipolítico) es introducida en el gen lipolítico en cuestión añadiendo unos oligos apropiados que comprenden la mutación deseada. Cuando una adición peptídica N-terminal es aplicada ésta puede ser realizada mutando codones de la secuencia de ADN que codifica la parte pro o prepro de la enzima lipolítica madre.

Las reacciones de la PCR se realizan de acuerdo con las recomendaciones del fabricante.

La secuenciación del ADN fue realizada usando el modelo de secuencias de ADN 373A de Applied Biosystems ABI según el protocolo en el kit de ABI Dye Terminator Cycle Sequencing.

Expresión de la enzima lipolítica de Humicola lanuginosa en Aspergillus oryzae

La clonación de la enzima lipolítica de H. lanuginosa se describe en EP 305 216. Ésta describe también la expresión y caracterización de la enzima en A. oryzae. El plásmido de expresión usado se denomina p960.

El plásmido de expresión usado en esta aplicación es idéntico a p960, salvo para modificaciones inferiores sólo 3' a la zona de codificación de lipasa. Las modificaciones fueron realizadas de la siguiente manera: p960 fue digerido con las enzimas de restricción Nrul y BamHI. Entre estos dos sitios el fragmento de BamHI/NheI del plásmido pBR322, en el que el fragmento NheI fue rellenado con polimerasa Klenow y donado, creando de ese modo el plásmido pAO1 (figura 2), el cual contiene sitios únicos de BamHI y NheI. Entre estos fragmentos de BamHI/XbaI de sitios únicos, se clonó desde p960 para dar PAHL (figura 3).

Transformación de Aspergillus oryzae (procedimiento general) Transformación de Aspergillus otyzae (procedimiento general)

Se inoculan 100 ml de YPD (Sherman et al., (1981), Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory) con esporas de A. oryzae y se incuban con agitación durante aproximadamente 24 horas. El micelio es recogido por filtración a través de un miracloth y lavado con 200 ml de MgSO_{4} 0.6 M. El micelio es suspendido en 15 ml de MgSO_{4} 1.2 M, NaH_{2}PO_{4} 10 mM, pH 5.8. La suspensión es enfriada en hielo y se añade 1 ml de tampón que contiene 120 mg de Novozym® 234, lote 1687. Después de 5 minutos, se añade 1 ml de 12 mg/ml de BSA (Sigma tipo H25) y se incuba con agitación suave continua durante 1.5-2.5 horas a 37ºC hasta que se visualiza un gran número de protoplastos en una muestra observada bajo el microscopio.

La suspensión es filtrada a través de un miracloth, el producto filtrado es transferido a un tubo estéril, cubriéndose con 5 ml de Sorbito) 0.6M, tris-HCI 100 mM, pH 7.0. El centrifugado se realiza durante 15 min. a 1000 g y los protoplastos son recogidos desde la parte superior del amortiguador de MgSO_{4}. 2 volúmenes de STC (Sorbito) 1.2M, tris-HCI 10 mM, pH 7.5, CaCl_{2} 10 mM) son agregados a la suspensión de protoplastos y la mezcla es centrifugada durante 5 min. a 1000 g. El granulado de protoplasto es resuspendido en 3 ml de STC y regranulado. Esto se repite. Finalmente, los protoplastos son resuspendidos en 0.2-1 ml de STC.

Se mezclan 100 \mul de suspensión de protoplastos con 5-25 \mug de p3SR2 (un plásmido que lleva genes amdS de A. nidulans descrito en Hynes et al., Mol. y Cel. Biol., Vol. 3, No. 8, 1430-1439, Aug. 1983) en 10 \mul de STC. La mezcla se deja a temperatura ambiente durante 25 min. Se añade 0.2 ml de PEG 4000 al 60% (BDH 29576), CaCl_{2} 10 mM y tris-HCI 10 mM, pH 7.5 y se mezcla cuidadosamente (dos veces) y finalmente se agregan 0.85 ml de la misma solución y se mezcla cuidadosamente. La mezcla se deja a temperatura ambiente durante 25 min., se centrifuga a 2.500 g durante 15 min. y el granulado es resuspendido en 2 ml de sorbitol 1.2M. Después de otra sedimentación, los protoplastos son esparcidos en placas mínimas (Cove, (1966), Biochem. Biophys. Acta 113, 51-56) que contienen Sacarosa 1.0M, pH 7.0, acetamida 10 mM como fuente de nitrógeno y CsCl 20 mM para inhibir el crecimiento residual. Tras la incubación durante 4-7 días a 37ºC se recogen las esporas, se suspenden en agua estéril y se extienden para colonias individuales. Este procedimiento se repite y se almacenan las esporas de una colonia individual después del segundo reaislamiento como un transformante definido.

Transformación de A. oryzae A1560-T40

El plásmido que lleva una secuencia de ADN que codifica una variante de la invención se transforma en Aspergillus oryzae A1560-T40, un derivado deficiente de proteasa de A. oryzae IFO 4177, usando una selección de acetamida por cotransformación con pToC 90 que contiene el gen amdS de A. nidulans como un fragmento Xba 1 de 2.7 kb (Corrick et al. (1987), GENE 53, 63-71) en un vector pUC 19 (Yannisch-Perron et al. (1985), GENE 33, 103-119). La transformación se realiza según se describe en EP 238 023.

Fermentación de flujo discontinuo

La fermentación discontinua se realiza en un medio que comprende maltodextrina como fuente de carbono, urea como fuente de nitrógeno y extracto de levadura. La fermentación discontinua se realiza mediante la inoculación de un cultivo de un frasco de agitación de células huéspedes de A. oryzae en cuestión en un medio que comprende el 3.5% de la fuente de carbono y el 0.5% de la fuente de nitrógeno. Después de 24 horas de cultivo a un pH 5.0 y 34ºC se inicia la alimentación continua de fuentes de nitrógeno y carbono adicionales. La fuente de carbono es mantenida como el factor de limitación y se asegura que haya oxígeno en exceso. El cultivo por flujo discontinuo es continuado durante 4 días, tras los cuales las enzimas pueden ser recuperadas por centrifugado, ultrafiltración, filtración clara y filtración de gérmenes. Se puede realizar una purificación adicional por métodos cromatográficos de intercambio aniónico conocidos en la técnica.

Purificación de variantes de enzimas lipolíticas de H. lanuqinosa expresadas en S. cerevisiae

El caldo de fermentación es filtrado de forma estéril y se añade acetato de amonio (92 g) al filtrado (1400 ml) para dar una solución 0.8M de acetato de amonio. La solución se añade a una columna Toyopearl Butyl (XK 16/10). La columna es lavada con acetato de amonio 0.8M y la enzima lipolítica eluida en H_{2}O a una velocidad de flujo de 5 ml/min. Se recogen 10 ml de fracciones y las fracciones que contienen enzimas lipolíticas son agrupadas según su actividad en el ensayo de titración estándar de lipasa. Las agrupaciones que contienen lipasa son filtradas y el pH es ajustado a pH 8.5, añadiéndose a una columna Q-Sepharose (HPQ XK 26/10). La columna es lavada con 200 ml de tris-HCI 0.1 M, pH 8.5 y la enzima lipolítica eluida en un gradiente lineal de 0 a 0.3M NaCI en 400 ml de tris-HCI 0.1 M, pH 8.5 con un caudal de 5 ml/min. Se recogen 10 ml de fracciones y las fracciones que contienen lipasa son agrupadas según su actividad en el ensayo de valoración estándar de lipasa. Se agrupan las fracciones que contienen actividad de lipasa y cuya absorción A280/A260 nm es superior a 1.7.

Purificación de variantes de enzimas lipolíticas de H. lanuginosa sin adición peptídica y A. oryzae expresado

Se centrifuga el sobrenadante de fermentación del cultivo de A. oryzae y se esparcen los fragmentos celulares. Se filtra el sobrenadante a través de un filtro millipore 0.45 \mu. Posteriormente se precipita con sulfato amónico saturado al 60% . El precipitado se disuelve en agua y se añade el acetato de amonio sólido a una concentración final de 0.8 M. La solución es aplicada en una columna Butyl Toyopearl pre-equilibrada con acetato de amonio 0.8 M. La enzima ligada es eluida con un gradiente usando agua y etanol al 50% como eluyente.

Las fracciones que contienen actividad enzimática son luego agrupadas y se ajusta la conductancia hasta menos de 5 mSi y el pH se ajusta a 8.5.

Las agrupaciones que contienen actividad son luego aplicadas sobre una columna de intercambio aniónico (p. ej. Q Separose® de alto rendimiento) pre-equilibrada con un tampón tris-acetato de 25 mM, pH 8.5. La actividad ligada es eluida con el mismo gradiente de sal lineal usando el mismo tampón y 0.5M de cloruro sódico. Las fracciones que contienen alta actividad enzimática lipolítica son agrupadas. Las fracciones que contienen actividad de lipasa y cuya absorción A280/A260 nm es superior a 1.7 son agrupadas.

Ensayo para la evaluación del efecto de primer lavado

El rendimiento de lavado de las enzimas lipolíticas fue evaluado en una prueba de lavado de un ciclo realizada en un Terg-O-Tometro (TOM) con termostato, seguida de un secado en línea.

Las condiciones experimentales fueron las siguientes:

Solución de lavado: 1000 ml por vaso de precipitación

Muestras: 7 muestras de algodón (9 x 9 cm) por vaso de precipitación.

Mancha: Manteca de cerdo coloreada con rojo Sudán (Sigma) (0.75 mg de rojo

Sudán/g de manteca de cerdo). Se aplicaron 50 µL de manteca de cerdo/rojo

Sudán calentados a 70ºC en el centro de cada muestra. Tras la aplicación de la mancha, las muestras fueron calentadas en un horno durante 25 minutos a 75ºC. Se almacenó hasta el día siguiente a temperatura ambiente.

Agua: 3.2 mM de Ca^{2+}/Mg^{2+} (en una proporción de 5:1)

Detergente: 5 g/l de Composición de Detergente A o Detergente B. pH ajustado artificialmente a 10 por NaOH.

Composición de detergente A

0.300 g/l de alquilsulfato (AS; C_{14-16})

0.650 g/l de etoxilato de alcohol (AEO; C_{12-14}, 6E0)

1.750 g/l de Zeolita P

0.145 g/l de Na_{2}CO_{3}

0.020 g/l de Sokalan CP5

0.050 g/l de CMC (carboxi-metil-celulosa)

Mezclado en 3.2 mM de Ca^{2+}/Mg^{2+} (5:1) en agua Milli-Q, pH 10.2

Composición de detergente B

igual a la Composición de Detergente A pero conteniendo además los siguientes decolorantes:

0.900 g/l de peroxihidrato de carbonato sódico

0.300 g/l de TAED (tetra-acetil-etileno-diamina)

Concentración de enzima lipolítica (en Composición de Detergente A así como B): 0 y 1250 ó 12500 LU/l

Tiempo de lavado: 20 minutos

Temperatura de lavado: 30ºC

Enjuague: 15 minutos en agua corriente del grifo

Secado: Hasta el día siguiente bajo condiciones ambientes (aprox. 20ºC, 30-40% RH).

Evaluación: La reflectancia fue medida a 460 nm. Después, la materia grasa fue extraída de las muestras con cloroformo en un aparato Soxhlet destinado a la extracción, destilación del solvente y determinación de la cantidad de materia grasa dejada en las muestras gravimétricamente. La cantidad de material graso puede de forma alternativa ser determinada por cromatografía de capa fina(TLC)/Detector de ionización de llamas (FID)].

El porcentaje de manteca de cerdo extraída se determina como:

1)% de eliminación definido como:

[(grasa restante en muestras lavadas con detergente sin enzima lipolítica) menos (grasa restante en muestras lavadas con detergente con enzima lipolítica)])] dividido por (grasa restante en muestras lavadas con detergente sin enzima lipolítica) y multiplicado por 100%, o

2) reflectancia delta (dR) definida como:

(R(muestras lavadas en detergente con lipasa)-R(muestras lavadas en detergente sin lipasa).

La reflectancia (que puede también ser denominada remisión) se mide en un aparato Elrepho 2000 de Datacolor que ilumina la muestra con 2 blitzlambs de xenón y mide la cantidad de luz reflejada de modo que si es totalmente blanco corresponde al 100% de reflexión y si es totalmente negro al 0% reflexión.

Medios y substratos

YPD: 10 g de extracto de levadura, 20 g de peptona, H_{2}O a 810 ml. Se somete a autoclave, se añaden 90 ml de glucosa al 20% (filtrada de forma estéril).

Medio LB: 10 g de bacto-triptona, 5 g de extracto de bacto-levadura, 10 g de NaCl en 1 litro de agua.

Medio FG4: 3% de harina de soja, 3% de maltodextrina, 1% de peptona, pH ajustado a 7.0 con NaOH 4 M.

Placas de SC Ura: 10% de 10 x sales basales sin aminoácidos, 0.5% de ácidos de casamino, 0.02% de treonina, 0.01% de triptófano, 2% de glucosa, 1.5% de agar. 10 x sales basales sin aminoácidos: 60g de NaOH, 66.8g de base nitrogenada de levadura sin aminoácidos (Difco), y 100g de ácido succínico en 1 litro de agua.

Litex agarosa HSB 2000 (CAT NO: F90472)

Agente reactivo de BG: 4 mg/ml de verde brillante (BG) disuelto en agua

Substrato 1:

10 ml de aceite de oliva (Sigma CAT NO. 0-1500)

20 ml de alcohol polivinílico al 2% (alcohol polivinílico)

El substrato es homogenizado durante 15-20 minutos.

Detergente PCS

10 g/l:
SDS	0.52 g
Dobanol 25-3	0.60 g
Dobanol 25-1	0.58 g
NaBO_{3}H_{2}O	1.50 g

Se añade 1 litro de tampón tris 0.1 M (pH 9), y se diluye adicionalmente con el tampón tris hasta la concentración doble de la concentración deseada en las placas de PCS.

Placas de PCS

Solución para hacer placas de PCS

Verde brillante (agente reactivo de BG)	10 ml
Substrato 1	24 ml
PCS detergente	500 ml
Agarosa al 2% (en tampón tris (pH 9)	500 ml

Substrato de lipasa (catálogo de Sigma No. 800-1)

Verde brillante (Merck, art. No. 1.01310)

Ejemplos Ejemplo 1 Construcción de variantes de enzimas lipolíticas aleatorias

Las bibliotecas mutagenizadas aleatorias de todo el gen de la enzima lipolítica de H. lanuginosa y de sus aminoácidos (aa) 91-97 y 206-211 fueron preparadas según se describe en Materiales y Métodos más arriba.

Las regiones de los aminoácidos 91-97 y 206-211 fueron elegidas para la primera serie de las mutagénesis localizadas puesto que se ha hallado que estas regiones son importantes para el rendimiento del lavado. La región 91-97 es una parte de la región de tapa de la enzima y la región 206-211 constituye parte de la división hidrofóbica de la enzima.

Se sintetizó un oligonucleótido para cada una de estas regiones que comprenden el 93% de los nucleótidos de tipo salvaje y el 2.33% de cada uno de los otros tres nucleótidos en codones de aminoácidos que se deseaba mutagenizar. Cuando se daba la posibilidad sin cambiar el aminoácido, el tercer nucleótido (la base de oscilación) en los codones fue sintetizado con 50%G/50%C para dar una probabilidad más grande de cambios en los aminoácidos con uno o dos codones. La composición del oligonucleótido mutagénico de la región 91-97 está mostrado en la
Tabla 1.

Usando este oligonucleótido se obtiene una frecuencia de mutación calculada de aproximadamente 65-70% en la biblioteca para un cambio de aminoácidos que haya sido introducido en la enzima lipolítica genitora. La frecuencia de mutación para dos o más cambios de aminoácidos que hayan sido introducidos son inferiores al 35%. Esta frecuencia de mutación baja es elegida para asegurar que los cambios de aminoácidos observados en los clones positivos estén implicados en la mejora de la enzima y no sólo en los cambios "neutrales" debidos a una frecuencia de mutación elevada.

Los cebadores mutagénicos fueron usados en una reacción de PCR con un cebador opuesto adecuado. Los fragmentos de la PCR resultantes fueron purificados y en el caso de la región 206-211 digeridos y clonados en el vector transportador. En el caso de la región 91-97 el fragmento resultante de la PCR fue usado en una segunda reacción PCR como un cebador con un segundo cebador opuesto adecuado. Esta fase fue necesaria para poder digerir y clonar la región mutagenizada en el vector transportador.

Las bibliotecas de la región 91-97 y de la región 206-211 han sido preparadas de manera que contengan de 10,000 a 80,000 clones/biblioteca. Muchas colonias fueron positivas (más del 90%) al ser controladas bajo condiciones en las que la lipasa madre es positiva, es decir, muestra actividad de lipasa. La reacción positiva fue determinada en un ensayo de filtro con 2.5 mM de Ca (en lugar de 5 mM de EGTA).

450,000 colonias fueron seleccionadas de las diferentes bibliotecas usando el Dobanol®25-7 y ensayos bajos en calcio descritos en Materiales y Métodos más arriba. 25 positivos bajos en calcio de la biblioteca de aa 91-97 (región de la tapa) y doce positivos de Dobanol®25-7 de todas las bibliotecas de genes fueron aislados. Catorce positivos bajos en calcio de la mutagénesis de los aa 91-97 fueron ordenados.

Las otras tres mutaciones (en el codón 83, 103, 145), fuera de la región mutagenizada, pueden ser explicadas por desincorporación de PCR, aunque la mutación de S83T es una transversión que es bastante inusual para las desincorporaciones de la PCR.

Secuencia

830

Tabla 1: Ilustración de la construcción de oligonucleótidos (SEC ID Nº. 4) usada para la mutagénesis aleatoria localizada de los aminoácidos 91-97 de la enzima lipolítica de H. lanuginosa. Los números presentados en la secuencia se refieren a las botellas cuya composición aparece a la derecha de la secuencia.

TABLA 2

83

Tabla 2: El número de cepa se refiere a los clones seleccionados originariamente y clonados en el vector de expresión de Aspergillus pAHL. Tipo de variante se refiere a clones idénticos, que probablemente han surgido durante la ampliación de la biblioteca mutagenizada aleatoriamente. Los tipos de variantes I y II están activos en Dobanol®25-7 al 0.01% mientras que los demás están inactivos como en el tipo salvaje.

TABLA 3

84

Tabla 3: La secuencia de tipo salvaje está mostrada en la línea superior. Sólo los nucleótidos que difieren de wt están escritos en las secuencias de variantes. Las bases de los codones 91 y 93 fueron impurificadas con 1:1 de C/T y T/G, respectivamente. Por otra parte, los nucleótidos en el codón 91-97 fueron impurificados usando el 93% wt y 2.33% de los otros tres nucleótidos.

Resultados de la realización de una selección de una biblioteca mutagenizada de forma aleatoria de aa 85-99 (región de tapa) con una impurificación en base a los resultados obtenidos a partir de positivos de mutagénesis aleatorias de aa 91-97 Construcción de la biblioteca mutagenizada de forma aleatoria Antecedentes

Cinco tipos diferentes de mutantes positivos fuertes fueron encontrados durante la selección de la primera biblioteca de la región de tapa (aa 91-97, ver ejemplo precedente). El D96 fue cambiado a A, V, N o H y se halló un cambio de los aminoácidos E87K, G91A y N94K en dos a tres mutantes independientes en combinación con un cambio del D96 indicando su importancia para la independencia de calcio de la lipolasa. Puesto que estas mutaciones fueron mejoradas con respecto a la baja actividad de calcio/Dobanol en comparación con wt en varios ensayos, éstas fueron usadas como un punto de partida en una segunda mutagénesis aleatoria de toda la región de tapa.

Mutagénesis aleatoria localizada

Los aa 85-99 + 83S/T de la región de aminoácidos fueron mutagenizados de forma aleatoria como sigue.

Esquema de impurificación: S83 - 50%S/50%T; E87 - 93%K/7%X; G91 - 93%A/7%X; N94 - 50%K/50%N; D96 - 100%X; los demás fueron 93%wt/7%X (los porcentajes se refieren a la impurificación de los codones a nivel de los nucleótidos (ver la secuencia del oligo). El porcentaje teórico de los distintos codones de aminoácidos que resultan de estas impurificaciones puede ser calculado usando un programa informático del estado de la técnica). Se sintetizó, donde fue posible sin cambiar el aminoácido, el tercer nucleótido (la base de oscilación) en los codones con 50%G/50%C para dar una probabilidad más grande de cambios a aminoácidos con sólo uno o dos codones. La composición del oligonucleótido mutagénico está mostrada en la SEC ID Nº. oligo 2. (SEC ID Nº 6). La región de nucleótidos no mutagenizados fue elegida usando el programa Oligo que optimiza la estabilidad y no la estructura secundaria.

Esta mutagénesis da una frecuencia calculada de aproximadamente el 93% de ambios del punto de partida (sin incluir S83, N94 y D96) en la biblioteca. Esta es una frecuencia de mutación altísima que debería dar la posibilidad de unos cambios más importantes de la región de tapa.

Se usó el cebador mutagénico en una reacción PCR con un cebador opuesto adecuado. El fragmento de PCR resultante fue usado en una segunda reacción PCR como un cebador con un segundo cebador opuesto adecuado. Esta fase fue necesaria para poder digerir y clonar la región mutagenizada en el vector de expresión de levadura pYESHL. Es importante tener en cuenta el A añadido al extremo 3' del fragmento de PCR por Taq polimerasa al designar un cebador mutagénico para un método de PCR en dos fases de este tipo.

De esta manera se prepararon unas bibliotecas mutagenizadas de forma aleatoria de la región del aa 85-99 + 83S/T.

Selección

El ensayo de filtro bajo en calcio fue usado con Dobanol y LAS. Se realizó la selección de la biblioteca lid2 con 5 mM de EGTA, 0.01% de Dobanol y 0.006% de LAS. Se detectaron varios positivos y se aislaron, se ordenaron, se transformaron en Aspergillus, se purificaron y se evaluaron en pruebas de lavado.

Secuencia y resultados de lavado de positivos seleccionados

Las condiciones subrayadas representan las usadas en el ensayo de filtro. IF = Factor de mejora en un lavado de 3-ciclos.

5 mM de EGTA,0.01% de Dobano1,0.006% de LAS

E87K,G91A,L93I,N94K,D96A. IF=1.3

5 mM de EGTA,0.02% de Dobanol,

N73D,S85T,E87K,G91A,N94K,D96A. IF=1.1

S83T,E87K,W89G,G91A,N94K,D96V. IF=0.8

E87K,G91A,D96R,I100V. IF= 5.2

S83T,E87K,Q249R

2g/1 PCS

E87K,G91A. IF=5.0

Secuencias de Oligo-lid2 (SEC ID Nº.6):

5'-C ATT TAT 886 888 655 (C/G)(A/C/G/T)(A/C/G/T) 755 (C/G)88 (A/C)57 588 (C/G)76 (7/8)58 665 788 688 (8/7)58 775 ACG AG(A/T) GCC ACG-3'

Matraz 5: 93% A; 2,33% C; 2,33% G og 2,33% T.

Matraz 6: 93% C; 2,33% A; 2,33% G og 2,33% T.

Matraz 7: 93% G; 2,33% A; 2,33% C og 2,33% T.

Matraz 8: 93% T; 2,33% A; 2,33% C og 2,33% G.

Mutagénesis aleatoria local realizada en dos regiones simultáneamente

Las bibliotecas mutagenizadas aleatorias de la región de aa 56 a 64 y 81 a 99 + 102 fueron preparadas según se describe en Materiales y Métodos usando los dos nucleótidos de oligo 004 y 005 según se muestra en la Tabla 4 en una reacción PCR. Se sintetizó oligo 004 para la región de aa 81 a 99 + 102 con 93% de nucleótidos de wt y 2.33% de cada uno de los otros 3 nucleótidos en cada posición salvo el codón S83 que fue impurificado para dar 50%S/50%T (ver tabla 4). Para aa con 4 ó 6 codones una mezcla al 50%/50% de G/C o A/C fue usada para la tercera base (ver tabla 4). Para la tercera base del codón Ile se usó una mezcla al 50%/50% de la botella 7 y 8. El D96L fue usado como punto de partida en la mutagénesis aleatoria puesto que se descubrió anteriormente en variantes de buen rendimiento. El Oligo 005 fue sintetizado para la región de aa 56 a 64 con 93% de nucleótidos de wt y 2.33% de cada uno de los otros 3 nucleótidos en cada posición. Para las posiciones 56, 57 y 62 se introdujo una parte de aa con carga positiva entre otros (ver tabla 4). Para aa con 4 ó 6 codones, se usó una mezcla al 50%/50% de G/C o G/T para la tercera base. En general, la reacción PCR puede introducir mutaciones fuera de la región impurificada siendo una ventaja puesto que tales mutaciones pueden ser beneficiosas para las propiedades de una variante.

También se usó el oligo 004 en combinación con oligo 006 (ver tabla 4) clonado por una reacción PCR doble dando como resultado una biblioteca que cubre la región 81 a 99 + 102 y la región 248-257,259, 263-269. El oligo 006 fue sintetizado para la región de aa 248-257,259, 263-269 con el 93% de nucleótidos de wt y el 2.33% de cada uno de los otros 3 nucleótidos en cada posición. Para aa con 4 ó 6 codones se usó una mezcla al 50%/50% de G/C o A/C para la tercera base (ver tabla 4). Para la tercera base del codón Ile se usó una mezcla al 50%/50% de la botella 7 y 8.

Los oligo 005 y 006 fueron también usados para construir positivos que usan bibliotecas mutagenizadas aleatorias en la región de tapa como molde.

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(Tabla pasa a página siguiente)

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TABLA 4

86

87

88

Algunos de los positivos obtenidos mediante la selección de estas bibliotecas en placas que contenían detergente se muestran a continuación:

E56R+D57L+190F+D96L+E99K

E56R+D57L+V6OM+D62N+S83T+D96P+D102E

D57G+N94K+D96L+L97M

E87K+G91A+D96R+I100V+E129K+K237M+I252L+P256T+G263A+L264Q

E56R+D57G+S58F+D62C+T64R+EB7G+G91A+F95L+D96P+K98I

A47V+D62G+D96L+A121T

E56G+D57G+V60E+D62G+N94K+D96L

Las siguientes variantes fueron obtenidas por mutagénesis aleatoria de todo el gen solo (por PCR o PCR + ácido fórmico según se describe en la sección Materiales y Métodos) y seleccionadas en placas que contenían detergente:

I34V+S54P+F80L+S85T+D96L+R108W+G109V+D111G+S116P+L124S+V132M+V140Q+

V141A+F124S+H145R+N162T+1166V+F181P+F183S+R205G+A243T+D254G+F262L

A19T+D167G+E210V+W221L (mutagénesis aleatoria basada en D167G+E210V)

A49P+D167G+E210V (mutagénesis aleatoria basada en D167G+E210V)

Ejemplo 2 Construcción de variantes de primer lavado de la enzima lipolítica de H. lanuginosa 1. Redistribución de dominios por recombinación y selección

20 variantes de enzimas lipolíticas de H. lanuginosa con un rendimiento de lavado muy bueno (según se ha evaluado en varias pruebas de lavado relacionadas), algunas de ellas construidas según el Ejemplo 1, permitieron la recombinación por un método de recombinación in vivo en YNG318 de S. cerevisiae según se describe en la sección Materiales y Métodos en la presente. Las variantes de enzimas lipolíticas usadas resultan de la Tabla 1. La mayor parte de estas variantes han sido construidas por mutagénesis aleatoria o aleatoria localizada según se describe en la sección Materiales y Métodos anterior y mediante la selección de una dependencia reducida al calcio y una tolerancia mejorada al componente de detergente Dobanol 25-7 (ver la sección Materiales y Métodos anterior). Algunas variantes son el resultado de dos o más series de mutagénesis consecutivas y selecciones.

El vector abierto de la enzima de restricción y los fragmentos de PCR resultantes de la tabla siguiente y estudiados adicionalmente en la sección Materiales y Métodos fueron mezclados en una proporción molar de aproximadamente 1:1 y se usaron para transformar células competentes de S. cerevisiae (realizado según el método de acetato de litio según se describe en Current Protocols in Molecular Biology, eds. F.M. Ausubel et al., capítulo 13.7, John Wiley & Sons, Inc., EEUU.). Las células transformadas fueron dispuestas en placas en filtros y seleccionadas por su dependencia reducida al calcio y su tolerancia incrementada al detergente usando el ensayo de filtro descrito en la sección Materiales y Métodos anterior.

Las colonias que dieron una señal positiva fueron intercaladas en colonias individuales en nuevas placas y filtros y seleccionadas nuevamente. Después de 2 a 4 reselecciones, se fermentaron las colonias positivas como sigue:

Fermentación de enzimas lipolíticas y variantes de H. lanuainosa en levadura

10 ml de un medio de SC-ura son inoculados con una colonia de S. cerevisiae y desarrollados a 30ºC durante 2 días. Los 10 ml son usados para inocular 300 ml de un medio SC-ura que tras la inoculación se cultiva a 30ºC durante 3 días. Los 300 ml son usados para inocular 5 l del siguiente G-substrato:

400 g	Amicasa
6.7 g	extracto de levadura (Difco)
12.5 g	L-Leucina (Fluka)
6.7 g	(NH_{4})_{2}SO_{4}
10g	MgSO_{4}.7H_{2}O
17 g	K_{2}SO_{4}
10 ml	compuestos de metal traza, ver abajo
5 ml	solución de vitamina, ver abajo
6.7ml	H_{3}PO_{4}
25 ml	plurónico al 20% (antiespuma)

En un volumen total de 5000 ml.

Compuestos de metal traza:

6.8 g	ZnCl_{2}
54.0 g	FeCl_{2}.6H_{2}O
19.1 g	MnCl_{2}.4H_{2}O
2.2 g	CuSO_{4}.5H_{2}O
2.58 g	CoCl_{2}
0.62 g	H_{3}BO_{3}
0.024g	(NH_{4})_{6}Mo_{7}O_{24}.4H_{2}O
0.2 g	Kl
100 ml	HCl (concentrado)

En un volumen total de 1 l.

Solución de vitamina:

250 mg	biotina
3 g	tiamina
10g	D-Calciopantotenato
100 g	Mio-Inositol
50 g	Colinaclorida
1.6 g	Piridoxina
1.2 g	Niacinamida
0.4 g	Folicacida
0.4 g	Riboflavina

En un volumen total de 1 l.

Las células de levadura fueron fermentadas durante 5 días a 30ºC en un medio de 5000 ml. La glucosa fue introducida en la fermentadora con una dosificación inicial de 100 ml de glucosa al 70% y una adición de 400 ml de glucosa al 70%/día. El pH del caldo de fermentación fue mantenido a un pH 5.0 mediante la adición controlada de una solución de NH_{3} al 10%.

La agitación fue de 300 rpm en las primeras 22 h, y luego de 900 rpm para el resto de la fermentación. Se proporcionó aire con 1 l de aire/l/min en las primeras 22 h seguido de 1.5 l de aire/l/min para el resto de la fermentación.

Tras la purificación, la capacidad de la variante para eliminar la manteca de cerdo fue evaluada en el ensayo de lavado de un solo ciclo descrito en la sección anterior Materiales y Métodos. Los resultados se proporcionaron en el siguiente Ejemplo 2 y 3.

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Tabla 1

Variantes usadas para la recombinación Variantes de lipasa de Humicola lanuginosa usadas para preparar un vector (abierto con Nrul) para la recombinación in vivo (redistribución de genes)

E56R,D57L,I90F,D96L,E99K

E56R,D57L,V60M, D62N,S83T,D96P,D102E

D57G,N94K,D96L,L97M

E87K,G91A,D96R,I100V,E129K,K237M,1252L,P256T,G263A,L264Q

E56R,D57G,S58F,D62C,T64R,E87G,G91A,F95L,D96P,K98I,(K237M)

E210K

Variantes de lipasa de Humicola lanuginosa usadas para preparar fragmentos de ADN (por ampliación estándar de PCR de todo el gen de los plásmidos que contienen la variante) para la recombinación in vivo (redistribución de genes)

S83T,N94K,D96N

E87K,D96V

N94K,D96A

E87K,G91A,D96A

D167G,E210V

S83T,G91A,Q249R

E87K,G91A

S83T,E87K,G91A,N94K,D96N,D111N.

N73D,E87K,G91A,N94I,D96G.

L67P,I76V,S83T,E87N,I90N,G91A,D96A,K98R.

E210K

S83T,E87K,G91A,N92H,N94K,D96M

S85P,E87K,G91A,D96L,L97V.

E87K,I90N,G91A,N94S,D96N,I100T.

I34V,S54P,F80L,S85T,D96G,R108W,G109V,D111G,S116P,L124S,V132M,V140Q,V141A,F142S,H145R,
N162T,I166V,F181P,F183S,R205G,A243T,D254G,F262L.

E56R,D57L,I90F,D96L,E99K

E56R,D57L,V60M,D62N,S83T,D96P,D102E

D57G,N94K,D96L,L97M

E87K,G91A,D96R,I100V,E129K,K237M,I252L,P256T,G263A,L264Q

E56R,D57G,S58F,D62C,T64R,E87G,G91A,F95L,D96P,K98I,(K237M)

2. Redistribución del dominio por donación tradicional de dos positivos juntos

El vector de expresión de Aspergillus pHD414 que contiene una secuencia de ADN que codifica la variante de lipasa de Humicola lanuginosa (D57G+N94K+D96L+L97M) fue digerido con las enzimas de restricción Narl y XbaI dando como resultado dos fragmentos. Los fragmentos fueron separados por electroforesis en gel de agarosa y el fragmento más grande fue aislado del gel de agarosa. Este fragmento fue ligado al fragmento más pequeño de digestión de la variante (S83T+G91A+Q249R) con Narl y XbaI. La ligadura fue transformada en E. coli y las construcciones de plásmido resultantes fueron aisladas de uno de los transformantes y dispuestas en secuencias para evaluar su correcto ensamblaje. El plásmido fue transformado en Aspergillus oryzae fermentado y purificado según se describe en la sección Materiales y Métodos. Esta variante contenía las mutaciones siguientes D57G+N94K+D96L+ L97M+Q249R.

Ejemplo 3 Construcción y expresión de la variante de la enzima lipolítica de H. lanuginosa, HL9 en JaL125 de Aspergillus oryzae

La variante HL9 contiene las mutaciones siguientes en la parte madura: E1P+D57G+N94K+D96L+Q249R y la adición peptídica de N-terminal SPIRPR se fundió hasta El P (dando como resultado la adición peptídica global de N-terminal SPIRPRP. Una adición peptídica de N-terminal fue aplicada a la enzima lipolítica madre de H. lanuginosa (DSM 4109) que tenía el aminoácido y la secuencia de ADN, respectivamente, resultante de EP 305 216 y que además lleva las mutaciones siguientes D57G+N94K+D96L+Q249R en su parte madura (introducida por mutagénesis dirigida convencional) en la secuencia de ADN (EP 305 216). La adición peptídica de SPIRPRP fue aplicada al N-terminal de las enzimas genitoras como sigue:

Construcción de pIVI220

El plásmido fue construido usando el kit de mutagénesis dirigida bicatenario Chamelon, de Stratagene según el protocolo descrito.

El pHL296 fue usado como el molde del plásmido. Dicho plásmido contiene el gen que codifica la enzima lipolítica de H. lanuginosa con las mutaciones anteriormente mencionadas (D57G+N94K+D96L+L97M+Q249R) clonadas en pHD414.

El cebador no. 7258 fue usado como el cebador de selección.

7258: 5'p gaa tga ctt ggt tga cgc gtc acc agt cac 3'

(Cambiando así el sitio de Scal encontrado en el gen de resistencia a la ampicilina y usado para cortar un sitio Mlul).

El cebador no. 7770 fue usado como el cebador de selección.

7770: 5'p tct agc cca gaa tac tgg atc aaa tc 3' (cambia el sitio Scal encontrado en el gen de lipasa de H. lanuginosa sin cambiar la secuencia de aminoácidos).

El cebador no. 8479 fue usado como el cebador mutagénico.

8479: 5'p gcg tgg acg gcc ttg gct agc cct att cgt cct cga ccg gtc tcg cag gat ctg (reemplazando el propéptido y el El N-terminal de la enzima madre de H. lanuginosa (SPIRRE por SPIRPRP).

Construcción de pIVI245

El plásmido fue construido usando el kit de mutagénesis dirigida bicatenario Chameleon, de Stratagene (cat no. 200509) según el protocolo descrito.

El pIVI220 fue usado como molde del plásmido y el cebador no.7887 como el cebador de selección (cambiando el sitio Mlul introducido encontrado en el gen de resistencia a la ampicilina y usado para cortar un sitio Scal).

7887: 5'p-gaa tga ctt ggt tga gta ctc acc agt cac 3'

El cebador no. 8932 fue usado como el cebador mutagénico (8932: 5'p-g aac tgg ata gga aat ttg aag ttc ctg ttg aaa gaa ata aat gac 3' (volviendo así de M97 a L97 como tipo salvaje y además conservando las dos mutaciones N94K y D96L)).

2. Construcción del plásmido de expresión de A. oryzae pCaHj483

El pCaHj483 está representado en la Figura 8. Está construido a partir de los fragmentos siguientes:

a) el vector pToC65 (WO91/17243) cortado con EcoRI y XbaI.

b) un fragmento de 2.7 kb de XbaI de A. nidulans que lleva el gen amdS (C. M. Corrick et al., (1987), Gene 53, P. 63-71). El gen amdS se usa como un marcador selectivo en transformaciones micóticas. El gen amdS ha sido modificado de modo que el sitio BamHI normalmente presente en el gen es destruido. Esto ha sido realizado introduciendo
una mutación puntual silenciosa que usa el cebador 3: AGAAATCGGGTATCCTTTCAG (SEC ID Nº. 1)

c) un fragmento EcoRI/BamHI de 0.6 kb que lleva el promotor NA2 de A. niger fundido hasta un fragmento de ADN de 60bp de la secuencia que codifica el extremo 5' sin traducir del ARNm del gen de A. nidulans tpi. El promotor de NA2 fue aislado del plásmido pNA2 (EP 383 779) y fundido hasta la secuencia de tpi de 60 bp por PCR. El cebador (cebador 4 SEC ID Nº. 7) que codifica la secuencia de tpi de 60 bp tuvo la secuencia siguiente: 5'-GCTCC
TCATGGTGGATCCCCAGTTGTGTATATAGAGGATTGAGGAAGGAAGAGAAGTGTGGATAGAGGTAAATTG
AGTTGGAAACTCCAAGCATGGCATCCTTGC-3'

d) un fragmento XbaI de 675 bp que lleva el terminador de la transcripción de glucoamilasa de A. Niger. El fragmento fue aislado del plásmido pICAMG/Term (EP 238 023).

El sitio de BamHI del fragmento c) fue conectado al sitio de XbaI en frente del terminador de la transcripción en el fragmento d) por medio del ligador pIC19R (BamHI a XbaI)

Construcción del plásmido pCaHi485 de expresión de HL9

El plásmido pJVi 245 fue digerido con BamH I y Sal I, y se aisló el fragmento resultante de 904 bp que codifica la enzima lipolítica HL9. El pCaHj 483 fue digerido con BamH I y Sal I, y se ligó el fragmento del vector grande (6757) al fragmento de HL9. La mezcla de ligadura fue usada para transformar las células DH5\alpha de E. coli, y se aisló un transformante que albergaba el plásmido esperado. El plásmido fue denominado pCaHj485.

3. Transformación de pCaHj 485 en JaL125

El JaL 125 de Aspergillus oryzae fue transformado con pCaHj 485 usando la selección en acetamida según se describe en la patente EP 0 531 372. Los transformantes fueron esporas reaisladas dos veces. Las esporas del segundo reaislamiento de cada transformante fueron usadas para inocular 200 \mul de YPM (1% de extracto de levadura, 2% de peptona, 2% de maltosa) en platos de microtitración de 96 cavidades. Los cultivos de YPM fueron desarrollados durante 4 días a 34ºC, y los productores más grandes fueron seleccionados usando un ensayo de p-nitro fenilbutirato:

Solución madre: 18 \mul de p nitro fenilbutirato fueron disueltos en 1 ml de isopropanol.

Solución de trabajo: 0.1 ml de solución madre fue mezclada con 10 ml de tris/HCI 50 mM pH 7.5; 10 mM de CaCl_{2}.

Ensayo: 1 \mul de sobrenadante de YPM fue mezclado con 200 \mul de solución de trabajo en platos de microtitración de 96 cavidades+ y el desarrollo del color fue medido a 450 nm usando un lector ELISA.

Un transformante fue seleccionado para la fermentación en tanques.

4. Fermentación en tanques de JaL 125/pCaHj 485

La fermentación se efectuó como una fermentación discontinua que usaba una temperatura media constante de 34ºC y un volumen inicial de 1.2 litros. El pH inicial del medio fue preparado a 6.5. Cuando el pH aumentó a 7.0 este valor fue mantenido mediante la adición de H_{3}PO_{4} al 10%. El nivel de oxígeno disuelto en el medio fue controlado variando el nivel de agitación y usando un nivel de aireación fija de 1.0 litros de aire por litro de medio por minuto. El nivel de adición de alimento fue mantenido a un nivel constante durante toda la fase de alimentación discontinua. El medio discontinuo contenía jarabe de maltosa como fuente de carbono, úrea y extracto de levadura como fuente de nitrógeno y una mezcla de metales traza y sales.

El alimento añadido continuamente durante la fase de alimentación discontinua contenía jarabe de maltosa como fuente de carbono mientras que el extracto de levadura y úrea fue añadido con el objetivo de asegurar una alimentación suficiente de nitrógeno.

5. Purificación de la enzima lipolítica de primer lavado

1) El sobrenadante de la fermentación fue filtrado a través de un filtro milipore Cat. No. AP2504700 tipo AP25.

2) El sobrenadante de fermentación fue filtrado otra vez a través del filtro estéril de membrana Millipore Tipo GS de 0.22 micrones.

3) El sobrenadante de la fermenation fue entonces ajustado a 0.8M de acetato de amonio añadiendo acetato de amonio sólido.

4) Una cromatografía hidrofóbica en gel TSK de butil-Toyopearl 650. Se añadieron 50 ml de columna a la matriz con butil-Toyopearl. La columna fue lavada y equilibrada con 0.8M de acetato de amonio. Después se aplicó un litro de sobrenadante de la fermentación ajustado con acetato de amonio en la columna de butilo. La columna fue lavada con 0.8M de acetato de amonio hasta que todo material no ligado fue enjuagado. El material ligado fue entonces eluido con agua y etanol al 50% de forma consecutiva. Se recogieron las fracciones y se analizó su actividad lipásica usando un ensayo estándar de LU. Las fracciones que contenían actividad lipásica fueron agrupadas y diluidas para ajustar la conductividad de la agrupación por debajo de 4 mSi y el pH a 8.5.

5) Cromatografía de intercambio aniónico de Q Sepharose de alto rendimiento (Pharmacia, código No.17-1014-01). Se unieron 50 ml de columna y se lavaron con 50 mM de un tampón de borato pH 8.5. La agrupación que contenía actividad enzimática lipolítica fue entonces aplicada en la columna de Q Sepharose de Alto Rendimiento. El material no ligado fue lavado con el tampón de borato pH 8.5. La actividad ligada fue entonces eluida con un tampón de borato usando un tampón de borato que contenía 1 M de cloruro sódico pH 8.5. Se recogieron las fracciones y se evaluó su actividad lipásica. Las fracciones que contenían actividad lipásica con una proporción de absorbancia UV a A280 y A260 superior a 1.7 fueron agrupadas.

Ejemplo 4 Construcción de adiciones de N-terminales por mutagénesis aleatoria

Se realizó una mutagénesis aleatoria de la parte de la secuencia de ADN que codifica la adición de N-terminales SPIRPRP añadidos al primer residuo de aminoácidos de la enzima lipolítica de H. lanuginosa (que se puede obtener a partir de DSM 4109) y que contiene las mutaciones adicionales siguientes en su parte madura: D57G+N94K+D96L+
L97M+Q249R. Las mutaciones en la parte madura de la enzima lipolítica madre fueron realizadas por mutagénesis dirigida conducida por PCR usando las secuencias del cebador apropiadas mediante los procedimientos descritos en WO 95/26215. La adición peptídica SPIRPRP fue aplicada según se describe en el ejemplo 3, (es decir el último P reemplaza a E1).

El esquema de impurificación de nucleótidos de los codones de SPIRPRP fue el siguiente:

Oligo 1: 5'-GCG TGG ACG GCC TTG GCC 86(T/A) 66(A/T) 58(T/A) 67(T/A) 66(T/A) 575 66(T/A) GAG GTC TCG CAG GAT CTG-3' (57-mero) (SEC ID Nº 11) donde los números se refieren a los matraces siguientes para su uso.

Matraz 5: 80% de A; 6.66% de C; 6.66% de G og 6.66% de T.

Matraz 6: 80% de C; 6.66% de A; 6.66% de G og 6.66% de T.

Matraz 7: 80% de G; 6.66% de A; 6.66% de C og 6.66% de T.

Matraz 8: 80% de T; 6.66% de A; 6.66% de C og 6.66% de G.

Se usó un protocolo de reacción de PCR de dos fases: La primera fase con el cebador anterior como el cebador 5' y con el cebador 2056 (5'gca cgt aat gtt tgt acc 3') como el cebador 3' conducido usando pHL296 como el molde del plásmido. El producto de la primera serie de PCR fue usado en una nueva PCR con 4699 (5'cgg tac ccg ggg atc cac 3') como el cebador 5' (para introducir el sitio BamHI y la primera parte de la secuencia de codificación) y con el producto de PCR como el cebador 3' con el mismo molde. El producto resultante fue purificado en Spin 100 (de Clonetech Lab., Inc.) y cortado con BamHI y PvuII. El fragmento de ADN resultante fue purificado a partir del gel de agarosa con SpinX (Costar) y ligado en el vector de expresión de levadura pJSO37 que contiene el gen de la enzima lipolítica de H. lanuginosa de pHL296 clonado como un fragmento de BamHI-XbaI cortado con BamHI y PvuII. El ADN resultante fue electrotransformado en células de E. Coli (Gibco/BRG Lifetechnologies) usando la técnica convencional.

Tras la transformación en E. coli y la ampliación, el plásmido fue purificado y transformado en S. cerevisiae YNG 318. Las células resultantes de S. cerevisiae fueron seleccionadas por buen rendimiento en el ensayo de filtro de lipasa alternativo que contenía detergente (3 g/l de PCS). Los positivos fueron ordenados y se halló que contenían las siguientes adiciones peptídicas: GPIRPRP, SHSRHNA, TAIRPRK, SALRRRP, STRRPRP, SPRRPRT, SPIPPGP, LPFRQRP, SPFRPKL, y SALRRP (denominadas HL10s1-10, respectivamente).

El rendimiento del lavado de un ciclo, cada uno de HL10s1-6, fue evaluado según se describe en la sección Materiales y Métodos anterior (ensayo para la evaluación del efecto de primer lavado) a una temperatura de 30ºC y usando 5 g/l de Ariel Futur inactivado enzimático como detergente. La cantidad de material graso eliminado por cada enzima modificada se muestra a continuación:

89

La tendencia fue que los mejores rendimientos tenían más aminoácidos con carga positiva en la adición de N-terminales.

De forma análoga, se realizaron mutagénesis aleatorias de la adición de N-terminales RPRPRPRP añadidos a la variante de lipasa de H. lanuginosa E1*+ D57G+ N94K+ D96L+ L97M+ Q249R más otras variantes. El esquema de impurificación de nucleótidos de los codones RPRPRPRP fue como sigue:

Oligo 2: 5'-GTC TCT GCG TGG ACG GCC TTG GCG GCG CCA CCT CCA 67(T/A) 66(T/A) 575 66(T/A) 67(T/A) 66(T/A) 575 66(T/A) (6/7)(7/8)(C/G) 57(C/G) C57 (5/7)5(C/G) CTG TTT MC CAG TTC AAT CTC-3' (93-mero)

Matraz 5: 80% de A; 6.66% de C; 6.66% de G og 6.66% de T.

Matraz 6: 80% de C; 6.66% de A; 6.66% de G og 6.66% de T.

Matraz 7: 80% de G; 6.66% de A; 6.66% de C og 6.66% de T.

Matraz 8: 80% de T; 6.66% de A; 6.66% de C og 6.66% de G.

Se añade APPP en el N-terminal del RPRPRPRP mutagenizado de forma aleatoria y antes de la señal peptídica para protegerse de la degradación proteolítica de la adición de N-terminales. Esto puede no ser necesario. Se eliminó El con el objetivo de excluir un aminoácido con carga negativa. Los aminoácidos en la posición 2 a 5 de la secuencia de lipasa madura de H. lanuginosa fueron también mutagenizados con el objetivo de encontrar mutantes mejorados en esta parte no-estructural de la lipasa. De lo contrario, el procedimiento es igual al descrito anteriormente para la mutagénesis aleatoria de SPIRPRP.

Se obtuvieron las siguientes adiciones peptídicas de N-terminales:

Ala-Pro-Pro-Pro-Arg-Pro-Arg-Leu-Leu-Pro-lle-Ser(APPPRPRLLPIS) (además del residuo El eliminado, esta variante lleva la mutación adicional D5E en su parte no-estructural de N-terminales de la enzima madura).

Ala-Pro-Pro-Pro-Thr-Arg-Gln-Arg-Gln-Ser-Pro(APPPTRQRQSP) (además del residuo El eliminado, esta variante lleva las mutaciones adicionales V2L, S3T y D5V en su parte no-estructural de N-terminales de la enzima madura).

Ala-pro-pro-pro-Arg-Thr-lle-pro-Arg-Ser-Ser-Pro(APPPRTIPRSSP) (además del residuo El eliminado, esta variante lleva las mutaciones adicionales V2L, S3R y D5E en su parte no-estructural de N-terminales de la enzima madura).

Ala-pro-pro-pro-Arg-pro-Arg-pro-Arg-pro-Arg-pro (APPPRPRPRPRP) (además del residuo El eliminado, esta variante lleva las mutaciones adicionales V2G y D5E en su parte no-estructural de N-terminales de la enzima madura).

Ala-pro-pro-pro-Arg-Thr-Arg-pro-Arg-pro-Arg-Ser (APPPRTRPRPRS) (además del residuo El eliminado, esta variante lleva las mutaciones adicionales V2GL, S3T, Q4P y D5E en su parte no-estructural de N-terminales de la enzima madura).

Ala-pro-pro-pro-Lys-Ala-Ser-pro-Arg-Gln-Arg-pro (APPPKASPRQRP) (además del residuo El eliminado, esta variante lleva las mutaciones adicionales V2GL, D5Q y L6M en su parte no-estructural de N-terminales de la enzima madura).

Ejemplo 5 Actividad del primer lavado de enzimas lipolíticas de la invención

La actividad del primer lavado de enzimas lipolíticas fue evaluada usando el "ensayo para la evaluación del efecto del primer lavado" descrito en la sección anterior Materiales y Métodos con la composición de detergente A o B. Algunas de las nuevas lipasas del primer lavado están comparadas con lo que se considera el estado presente de la técnica en enzimas lipolíticas para detergentes.

Nota:

\Box son producidas en Aspergillus oryzae según se describe en el Ejemplo 2.

* son producidas en levadura según se describe en el Ejemplo 4.

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Ejemplos adicionales

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Ejemplo 6 Ensayo de la actividad en detergente (AiD)

El ensayo AiD es un ensayo analítico que es útil para seleccionar enzimas lipolíticas madre para ser usadas en la construcción de una enzima lipolítica de primer lavado según se describe en este caso.

Equipamiento: Baño de agua con vasos de precipitación de 150 ml. Se consigue la agitación por un agitador.

Dosificación de enzima lipolítica:12500 LU/l.

Substratos:6 piezas (3.5*3.5 cm) de algodón con 6 \mul de aceite de oliva para una prueba.

Detergente:0.5 g/l de detergente* líquido modelo disuelto en 0.36 mM de Ca^{2}/Mg^{2}. (5:1), ajustado a un pH 10, 100 ml por vaso de recipitación.

Después de agitar la muestra durante 60 min. a 30ºC el detergente que queda en las muestras es eliminado añadiendo agua corriente durante 15 min. Se colocan las muestras en un matraz que contiene 10 ml de tetrahidrofurano y 6.25 ml de HCl 4M y se evaporan hasta el día siguiente, tras lo cual se disuelve la muestra en tetrahidrofurano. La composición de grasa está determinada por TLC/FID y la cantidad del % de FFA (ácidos grasos libres) se utiliza para distinguirse de las enzimas lipolíticas.

* formulación del detergente más abajo

Nota

\Box son producidas en Aspergillus oryzae ast según se describe en el Ejemplo 2.

* todas las variantes son producidas en levadura como se describe en el Ejemplo 4.

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Ejemplo 7

La actividad del primer lavado de un gran número de enzimas lipolíticas de primer lavado potenciales fue evaluada usando el "ensayo para la evaluación del efecto de primer lavado" descrito en la sección anterior Materiales y Métodos con un detergente comercial específico - Ariel Futur (comercialmente disponible lote No.4279 b 23:35). Las enzimas ya presentes en los detergentes fueron inactivadas por calor (4 minutos a 85ºC en micro horno) antes del lavado.

La primera tabla puede utilizarse para comparar los Ejemplos 5 y 6. A continuación, los resultados se dividen como sigue:

a) % de eliminación después de la dosificación con unidades LU (ver definición en Métodos y Materiales)

b) % de eliminación después de la dosificación con miligramos de proteína enzimática pura

c) reflectancia delta después de la dosificación con unidades LU (ver definición en Métodos y Materiales)

d) reflectancia delta después de la dosificación con miligramos de proteína enzimática pura

Nota:

\Box son producidas en Aspergillus oryzae según se describe en el Ejemplo 2

* son producidas en levadura según se describe en el Ejemplo 4.

Se obtuvieron los resultados siguientes:

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Ejemplo 8

La actividad de primer lavado de una enzima lipolítica de primer lavado fue evaluada usando el "ensayo para la evaluación del efecto del primer lavado" descrito en la anterior sección Materiales y Métodos con un conjunto de detergentes comerciales.

Las enzimas ya presentes en los detergentes fueron inactivadas por calor (4 minutos a 85ºC en horno microondas) antes del lavado.

Se usó la variante de lipolasa EISPIRPRP+D57G+N94K+ D96L+L97M+Q249R producida en Aspergillus oryzae como se describe en el Ejemplo 2.

Se usaron las siguientes condiciones geográficas diferentes:

Europeas:	Tiempo:	20 minutos.
	Temperatura:	30ºC
	Dureza del agua:	3.2 mM Ca^{2}./Mg^{2}. (5:1) ^{\sim}18ºdH
US:	Tiempo:	10 minutos.
	Temperatura:	30ºC
	Dureza del agua:	1.07 mM Ca^{2}/Mg^{2} (5:1) ^{\sim}6ºdH

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Ejemplo 9 Producción de una lipasa de primer lavado en F. Graminarum Cepas y medios

La cepa de partida es Fusarium graminearum A3/5 (ATCC 20334).

Las placas COVE están compuestas por 343.3 g de sacarosa, 20 mlo de solución de sales COVE, 10 ml de acetamida 1 M, 10 ml de CsCI 3 M, y 25 g de agar Noble por litro. La solución de sales COVE (50X) está compuesta por 26 g de KCI, 26 g de MgSO_{4}-7H_{2}O, 76 g de KH_{2}PO_{4}, y 50 ml de solución de metales traza COVE. La solución de metales traza COVE está compuesta por 0.04 g de NaB_{4}O_{7}-10H_{2}O, 0.040 g de CuSO_{4}-5H_{2}O, 0.70 g de FeSO_{4}-H_{2}O, 0.80 g de Na_{2}MoO_{2}-2H_{2}O, y 10 g de ZnSO_{4} por litro.

El medio M400Da está compuesto por 50 g de maltodextrina, 2.0 g de MgSO_{4}-7H_{2}O, 2.0 g de KH_{2}PO_{4}, 4.0 g de ácido cítrico, 8.0 g de extracto de levadura, 2.0 g de úrea, y 0.5 ml de solución de metales traza por litro. El medio está ajustado a un pH 6.0 con 5 N de NaOH. La solución de metales traza está compuesta por 14.3 g de ZnSO_{4}-7H_{2}O, 2.5 g de CuSO_{4}-5H_{2}O, 0.5 g de NiCl_{2}-6H_{2}O, 13.8 g de FeSO_{4}-7H_{2}O, 8.5 g de MnSO4-H20, y 3.0 g de ácido cítrico por litro.

Construcción del plásmido de expresión de la variante de enzima lipolítica de H. lanuginosa HL A (EISPIRPRP+D57G+N94K+D96L+L97M+Q249R) para Fusarium graminearum

La construcción de un plásmido de expresión para Fusarium graminearum está destacada en la Fig. 7.

Específicamente, se realiza un cassette de expresión de Fusarium usando la técnica de superposicón de PCR (Higuchi. R., In Innis, M.A.. Gelfond, D.H., Sniski. J.J., y White. T.J., editors. PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, páginas 177-183. Academic Press, Inc., Nueva York) para fundir 1.24 kb del promotor de tripsina de Fusarium oxysporum a 1.1 kb del terminador de tripsina de Fusarium oxysporum (Royer et al., 1995 Bio/Technology 13: 1479-1483). Una región poliligadora que contiene sitios de restricción SwaI, KpnI y PacI es introducida entre el promotor y el terminador como parte de la reacción de PCR superpuesta. En el extremo 5' del promotor, se añade un sitio XhoI y se conserva el sitio nativo EcoRI. En el extremo 3' del terminador, se incorporan los sitios EcoRI, HindIII y NsiI mediante la reacción de PCR.

Se genera un fragmento de PCR que contiene -1208 a -1 del promotor de tripsina de Fusarium oxysporum más un poliligador de 25 bp a partir del plásmido pJRoy2O (Royer et al., 1995, supra) usando los cebadores siguientes:

900

Las letras mayúsculas son la secuencia nativa del promotor de tripsina de Fusarium oxysporum.

Las condiciones de PCR usadas son 95ºC durante 3 minutos seguido de 25 ciclos cada uno a 95ºC durante 30 segundos, 50ºC durante 1 minuto, y 72ºC durante 1 minuto. El ciclo de extensión final está a 72ºC durante 5 minutos. Se usa la ADN-polimerasa Pwo (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN.) con el tampón provisto por el fabricante.

Se genera un fragmento de PCR que contiene -5 a -1 del promotor de tripsina de Fusarium oxysporum, el poliligador de 25 bp y 1060 bp de la región 3' no traducida del gen de tripsina de Fusarium oxysporum (región del terminador) a partir del plásmido pJRoy20 usando los cebadores siguientes:

901

Las letras mayúsculas son la secuencia nativa del promotor y terminador de tripsina de Fusarium oxysporum. Las condiciones de PCR usadas son las del modo descrito anteriormente.

Se realiza el fragmento de PCR de superposición final de 2.3 kb que contiene -1208 a -1 del promotor de tripsina de Fusarium oxysporum, el poliligador de 25 bp y 1060 bp del terminador de tripsina de Fusarium oxysporum usando 0.2 \mul de la primera reacción de PCR (promotor) y 3 \mul de la segunda reacción (terminador) como molde y los cebadores número 1 y 4. Las condiciones de PCR usadas son 95ºC durante 3 minutos seguido de 30 ciclos cada uno a 95ºC durante 30 segundos, 62ºC durante 1 minuto, y 72ºC durante 3 minutos. El ciclo de extensión final es 5 minutos a 72ºC. La ADN polimerasa pwo también se usa para esta reacción.

La banda de 2.3kb resultante es digerida con XhoI y NsiI y clonada en el plásmido pBaNe6 que es digerido parcialmente con NsiI y hasta su finalización con SalI. De hecho, las secuencias promotoras y terminadoras de Aspergillus de pBaNe6 están reemplazadas con el promotor de tripsina de Fusarium oxysporum y las secuencias terminadoras. El constructo resultante (pDM174.3) es digerido con SwaI y PacI.

Los cebadores de ADN HLIP-A y HLIP-B mostrados más abajo se usan en una reacción de PCR para ampliar el gen de lipasa HLA a partir del plásmido pJVi220:

902

Las letras mayúsculas representan las secuencias en el gen de lipasa.

La PCR está realizada en una reacción de 50 que contiene aprox. 50 ng de pHLA, 0.05 mM cada uno de dATP, dTTP, dGTP, dCTP, 100 pmol cada uno de HLIP-A y HLIP-B. Tampón IX PwoI (Boehringer Mannheim, Indianapolis, en), y 2.5 unidades de PwoI (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN). Las condiciones de PCR son 95ºC durante 3 minutos, 30 ciclos cada uno a 95ºC durante 1 minuto, 60ºC durante 1 minuto; y 72ºC durante 1.5 minutos, y luego 72ºC durante 5 minutos. La mezcla de reacción de PCR se realiza en un gel de agarosa y se corta la banda de ADN HLA de aprox. 0.9 kb. El ADN está purificado por solubilización de la agarosa con 3 volúmenes de un tampón de solubilización Qia-ex (Qiagen, Los Angeles, CA) seguido de una columna Qiaquick spin de PCR según las instrucciones del fabricante (Qiagen, Los Angeles, CA). Se recupera el ADN en 50 \mul de 1 mM de EDTA-10 mM de Tris pH 8. Se corta una alícuota de 20 \mul del ADN en un volumen final de 25 que contiene 1X tampones de enzimas de restricción y enzimas de restricción PacI y SwaI según indiquen los fabricantes. La mezcla reactiva es luego calentada a 80ºC durante 10 minutos. Un \mul del gen de lipasa HLA cortado de PacI/SwaI es ligado en el plásmido pBANe6 cortado de PacI/SwaI. La mezcla de ligadura se utiliza para transformar la cepa DH5\alpha de E.coli. El plásmido que contiene pBANe6 y secuencias de HLA se denomina pJeRS33.

El fragmento HLA de SwaI/PacI de 0.9 kb de pJeRS33 es clonado en el vector pDM174.3 digerido por SwaI/PacI para crear el plásmido pDM177.

Transformación de Fusarium graminearum

La cepa A3/5 de F. graminearum (ATCC 20334) se cultiva en placas petri de 10 X 15 mm de un medio Vogel (Vogel, 1964, Am. Nature 98: 435-446) más glucosa al 1.5% y agar durante 3 semanas a 25ºC. Se desplazan las conidias (aproximadamente 10^{8} por placa) en 10 ml de agua estéril mediante un bucle de transferencia y se purifican por filtración a través de 4 capas de estopilla de algodón y finalmente a través de una capa de Miracloth. Las suspensiones conidiales son concentradas por centrifugado. Cinquenta ml del medio YPG compuesto por el 1% de extracto de levadura, 2% de bactopeptona, y 2% de glucosa se inoculan con aproximadamente 100 conidias, y se incuban durante 14 horas a 24ºC, 150 rpm. Los hyphae resultantes son retenidos en un filtro estéril de 0.4 mm y lavados sucesivamente con agua destilada estéril y 1.0 M de MgSO_{4}. Los hyphae son resuspendidos en una solución (2-10 mg/ml en 1.0 M de MgSO_{4}) de 10 ml de NOVOZYM 234™(Novo Nordisk A/S, Bagsvaerd, Dinamarca) y digeridos durante 15-30 minutos a 34ºC con agitación a 80 rpm. El material de hyphae no digerido es eliminado de la suspensión de protoplastos resultante por filtración sucesiva a través de 4 capas de estopilla de algodón y a través de Miracloth. Se pasan veinte ml de sorbitol 1M a través de la estopilla de algodón y del Miracloth y se combinan con la solución de protoplastos. Tras la mezcla, los protoplastos (aproximadamente 5 X 108) son granulados por centrifugado y lavados sucesivamente por resuspensión y centrifugados en 20 ml de sorbitol 1M y en 20 ml de STC (0.8M de Sorbitol, 0.05 M de Tris pH 8.0, 0.05 M de CaCl_{2}). Los protoplastos lavados son resuspendidos en 4 partes de STC y 1 parte de SPTC (0.8M de sorbitol, 40% de PEG 4000, 0.05 M de Tris pH 8.0, 0.05 M CaCl_{2}) con una concentración de 1-2 X 10^{8}/ml. Cien µl de suspensión de protoplastos son agregados a 3µg de pDM 177 ADN y 5 \mul de heparina (5 mg/ml en STC) en tubos de polipropileno (17 X 100 mm) e incubados en hielo durante 30 minutos. Un ml de SPTC es mezclado suavemente en la suspensión de protoplastos y se continua la incubación a temperatura ambiente durante 20 minutos. Quince ml de solución fundida (enfriada a 40ºC) consistente en sales COVE, 0.8 M de Sacarosa y 1% de agarosa de fusión baja (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO) son mezclados con los protoplastos y luego colocados en placas petri de 150 mm que contienen agar COVE. Se continua la incubación a temperatura ambiente durante 10 a 14 días.

Expresión de la actividad de la lipasa

Cinco transformantes pDM177 de Fusarium graminearum A3/5 son cultivados en un medio M400Da en frascos de agitación durante 7 días a 30ºC. Al mismo tiempo y bajo las mismas condiciones que un cultivo de control, se cultiva un transformante A3/5 del plásmido pDM155 (Royer et al., 1995 Bio/Technology 13: 1479-1483), que contiene la lipasa de tipo salvaje de Humicola lanuginosa introducida entre el promotor y terminador de tripsina de Fusarium oxysporum.

Actividad de primer lavado de HL A

La lipasa arriba producida así como la lipasa análoga (que lleva las mismas mutaciones, pero que están producidas en A. oryzae) fue evaluada en el "Ensayo para la evaluación del efecto de primer lavado" descrito aquí usando Ariel Futur enzimático inactivado. Se obtuvieron los resultados siguientes:

E1SPIRPRP+D57G+N94K+D96L+L97M+Q249R en		dR a
	1250 LU/l	LU/l 12500
A. orizae	8	15
F.graminearum	9	14

Ejemplo 10 Construcción de mutantes de Absidia reflexa Materiales y métodos

Las cepas y plásmidos están catalogados en la sección de Materiales y Métodos que preceden los ejemplos.

Cebadores: cebador TiK57, cebador TiK58, cebador TiK59, cebador TiK60, cebador TiK61, cebador TiK62, cebador TiK64, cebador Tik66, cebador TiK72, cebador TiK74, cebador Tik75, cebadores TiK76.

Kits, soluciones, medios y similares

Polimerasa Taq-ADN (Promega)

Medio de LB complementado con 100 \mug/ml de ampicilina

Kit ADN Maxi-prep (QIAGEN).

Kit de transformación de levadura de polietilenoglicol/LiOAc (Yeastmaker, Clontech).

Aminoácidos de base nitrogenada tipo aceite en agua de levadura (Difco 0919-15-3)

Ácidos de casamino (Difco 0230-01-1)

Bacto-agar (Difco)

Medio de YPG (20 g de caseína-peptona y 10 g de extracto de levadura (Difco))

Medio de LB complementado con 100 pg/ml de ampicilina

Equipamiento

Secuenciador de ADN Applied Biosystems 373

Filtros de acetato de celulosa (Schleicher-Schüll)

Placas SYC

Se disuelven completamente 13.6 g de NaOH y 22.6 g de ácido succínico en 500 ml de H_{2}O, 15 g de aminoácidos de base nitrogenada tipo aceite en agua de levadura (Difco 0919-15-3), 10 g de ácidos de casamino (Difco 0230-01-1). Se agregan 20 ml de una solución de treonina al 2%, y 20 ml de una solución de triptófano 1%. Se rellena la solución hasta 1 litro de H_{2}O. Se filtra de forma estéril, y se almacena a 4ºC. Para preparar medios líquidos, se diluye 1 litro de SYC añadiendo 200 ml de una solución de glucosa al 20% y 800 ml de H_{2}O. Para preparar placas de agar se diluye 1 litro de SYC a 60ºC con 800 ml de bacto-agar (37.5 g de bacto-agar (Difco) disueltos en 1 litro de H_{2}O) y 200 ml de una solución de glucosa al 20%.

Ensayo de verde brillante

Para preparar placas de BG-agar, se diluyen 10 g de agarosa mediante calentamiento en 500 ml de un tampón 100 mM de tris-Cl pH 9.0. Esta solución de agarosa está mezclada a 60ºC con 24 ml de una emulsión de aceite de oliva (8 ml aceite de oliva (Sigma) y se mezclan 16 ml de una solución de polivinilalcohol al 2% (Sigma) en H_{2}O y se homogeniza de forma íntegra en hielo con un Ultra-Turrax T25), 10 ml de un stock de verde brillante (4 mg/ml de H_{2}O), 465 ml de un tampón 100 mM de tris-Cl pH 9.0 que contiene 6.45 g del detergente, y 1.4 ml de una solución 250 mM de CaCl_{2}.

Las colonias de levadura transformadas se cultivan durante 3 días a 30ºC en filtros estériles de acetato de celulosa (Schleicher-Schüll) en placas de agar SYC. Los filtros son entonces transferidos a las placas de BG-agar e incubados durante 2-8 horas a 37ºC. Las colonias que generan una mancha verde en el agar se consideran positivas.

Análisis de enzimas de restricción y secuenciación de bibliotecas mutantes

El ADN del plásmido recuperado fue sometido a digestión por NcoI. Los clones correctos produjeron dos fragmentos de 2.9 y 3.1 kb. El ADN del plásmido fue posteriormente secuenciado a ciclos por PCR de un terminador del color o secuenciado en un secuenciador de ADN de Applied Biosystems 373. En el caso de clones aislados de las bibliotecas 3 y 4 (Tabla 1), se usaron los oligonucleótidos TiK61 y TiK66 para las secuenciaciones bicatenarias, mientras que en las bibliotecas 7 y 8 se aplicó TiK62 y TiK72.

Ejemplo 10A Construcción de vectores de expresión de lipasa 44896 de Absidia Reflexa ATTC

Dos vectores fueron construidos para la expresión de la lipasa 44896 de Absidia Reflexa ATTC de tipo salvaje (con/sin extensión peptídica SPIRR) en Saccharomyces cerevisiae.

La codificación de clones de ADNc que codifican la lipasa 44896 de ATTC de Absidia reflexa (SEC ID Nº. 13 y figura 1) fue una PCR ampliada (T_{a} = 50ºC, 25 ciclos, 5 unidades de Taq-ADN polimerasa) usando el par cebador TiK57/59 (proporcionando una extensión SPIRR de N-terminales) o bien el par cebador TiK58/59 (sin extensión SPIRR). Los fragmentos de la PCR fueron ligados por medio de sitios NheI-XbaI en el vector de expresión de levadura pJSO37 (con un sitio NheI introducido debajo de la señal peptídica) que alberga una región que codifica una lipasa de H. lanuginosa activa en el sitio de clonación de BamHI/XbaI original.

El gen que codifica la lipasa de H. lanuginosa activa fue ligeramente modificado por la introducción de un sitio NheI debajo del sitio BamHI (ver Figura 2). Puesto que los sitios NheI y XbaI son compatibles, el vector fue tratado con fosfatasa alcalina antes de la ligadura. Finalmente, se obtuvieron dos construcciones del vector, es decir pTiK04 que incluye la extensión SPIRR justo encima del principio del gen de lipasa maduro, y pTiK05 que no contenía una parte de codificación de la extensión SPIRR. En ambos casos la secuencia de la señal original de la lipasa de Humicola lanuginosa fue mantenida constante entre los sitios BamHI y NheI.

Constructos de secuencias de señales MF\alpha1

La secuencia de señales de lipasa de H. lanuginosa fue reemplazada por la señal del factor \alpha1 de acoplamiento.

El ADN genómico de la cepa de levadura YPH499 (Stratagene) fue preparado según protocolos estándar (Ausubel et al., (1995). Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons). Un \mug de ADN genómico fue sometido a PCR (T_{a} = 50ºC, 25 ciclos, 5 unidades Taq-ADN polimerasa) con el par cebador TiK74/75. El fragmento de la secuencia de la señal de MF\alpha1 ampliada (Fig. 3) fue introducido en pTiKO4 y pTiKO5 por medio de los sitios BamHI y NheI para producir pTiKO6 y pTiKO7, respectivamente.

Ejemplo 10B Construcción de variantes de lipasa 44896 de Absidia Reflexa ATTC por mutagénesis con oligonucleótidos impurificados

Cuatro bibliotecas fueron construidas con oligonucleótidos impurificados.

En las bibliotecas A y B (ver Tabla 1 más abajo) se introdujeron mutaciones aleatorias en la región de tapa putativa de la lipasa 44896 de Absidia Reflexa ATTC. En la biblioteca A se mantuvo la secuencia SPIRR constante, en la biblioteca B se omitió.

Las bibliotecas C y D fueron construidas con mutaciones en dos zonas de contacto lipídicas putativas en el N-término de Absidia Reflexa ATTC 44896. En la biblioteca C la secuencia SPIRR fue mantenida nuevamente constante.

La mutagénesis de la región de tapa putativa del gen de lipasa 44896 de Absidia Reflexa ATTC (posiciones de los aminoácidos 82-99) fue realizada por PCR estándar (Sambrook et al., (1989), Molecular cloning - A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor. NY) con 5 unidades de Taq-ADN polimerasa con el par cebador TiK60/TiK64 a T_{a} = 50ºC y 25 ciclos usando pTiKO5 como molde. En una segunda PCR estándar, mediante un cebador TiK62 y el fragmento de ADN purificado en gel de agarosa generó en la primera PCR, se restauró todo el gen de lipasa 44896 de Absidia Reflexa ATTC usando las mismas condiciones de ampliación que para la primera PCR. A diferencia de la primera PCR, se eligió pTiKO4 o pTiKO5 como moldes de tal manera que se obtuvo las bibliotecas (con/sin extensión SPIRR de N-terminales).

Para mutagénesis de las posiciones de los aminoácidos 30-45, se usaron los cebadores TiK76 y TiK64 para la primera PCR. La segunda PCR fue en principio idéntica a la descrita anteriormente.

Los fragmentos de la PCR obtenidos fueron ligados en pJSO37 por medio de los sitios BamHI-XbaI. La transformación de E. coli y posteriormente de células de levadura YNG318 competentes fue realizada según el modo descrito anteriormente.

TABLA 1 Resumen de las bibliotecas mutantes de 44896 construidas y seleccionadas de Absidia Reflexa ATTC

111

Ejemplo 10C Selección de bibliotecas mutantes de lipasa 44896 de Absidia Reflexa AATTC y recuperación de plásmidos de colonias positivas

Las células de levadura transformadas obtenidas según se describe en el Ejemplo 10B fueron extendidas en un filtro de acetato de celulosa en una placa de agar SYC de 14 cm. Después del crecimiento selectivo de transformantes y transferencia del filtro a placas de BG-agar, se seleccionaron las colonias positivas, se resuspendieron en H_{2}O, y se reextendieron en filtros de acetato de celulosa en placas de SYC-agar para permitir una segunda serie de confirmación del ensayo de BG (ver la sección Matariales y Métodos).

Los clones positivos de la segunda serie fueron transferidos a un medio SYC de 20 ml, agitándose durante 2 días a 30ºC. El ADN del plásmido fue preparado a partir de 1.5 ml de este cultivo de levadura saturada según el método estándar de fenol/cuenas de vidrio (Ausubel et al., (1995), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons).

Una alícuota de la preparación del plásmido fue sometida a electroporación en células E.coli DH10B que fueron luego colocadas en placas de LB-agar completadas con 100 \mug/ml de ampicilina. El ADN de las colonias fue aislado y aplicado al análisis enzimático de restricción y secuenciación según se describe en la sección anterior Materiales y Métodos.

Secuenciación

La secuenciación de 15 clones seleccionados de forma aleatoria en la biblioteca A y B mostró que la impurificación elegida del 10% finalmente resultó en:

20% siendo de tipo salvaje,

13% con 1 intercambio de aminoácidos,

20% con 2 intercambios,

13% con 3,

20% con 4,

0% con 5, y

13% con 6 intercambios de aminoácidos por molécula.

De la biblioteca A se aislaron seis clones de cada 1.8 X 10^{5} colonias seleccionadas con 3 g/l de detergente en el ensayo BG (1 por cada 3 X 10^{4} seleccionadas), y de la biblioteca B se aislaron dos clones positivos de 2.0 X 10^{5} colonias seleccionadas (1 por cada 1.0 X 10^{5} seleccionadas, Tabla 1). Las diferencias de la secuencia observadas en estos 8 clones están representadas en la Tabla 2 más abajo.

Según se ha mencionado anteriormente las bibliotecas C y D fueron construidas con mutaciones en dos zonas de contacto de lípidos putativas en el N-terminus de lipasa de Absidia Reflexa ATTC 44896.

La secuenciación de 13 clones seleccionados de forma aleatoria mostró que el nivel de impurificación elegido del 10% resultó en:

8% siendo de tipo salvaje,

15% con 1 intercambio de aminoácidos,

46% con 2 intercambios,

15% con 3, y

15% con 4 intercambios por molécula.

La biblioteca C liberó 3 clones por cada 1.6 X 10^{5} colonias seleccionadas con 3 g/l de detergente en el ensayo BG (1 positivo por cada 53333 seleccionadas), y de la biblioteca D se podría aislar un clon positivo de 1.7 X 10^{5} (tabla 1). Las secuencias de estos 4 clones están representadas también en la Tabla 2.

TABLA 2 Secuencias de las variantes mejoradas de Absidia Reflexa ATTC 44896

112

Ejemplo 10D Expresión de variantes de Absidia Reflexa ATTC 44896 y medición de unidades lipásicas

Cuatro de los mutantes mejorados identificados de la biblioteca A fueron sometidos a la medición de LU segregadas en el medio de cultivo así como la medición de LU de la fracción cruda de citosol/membrana.

Se disolvieron 10 ml del medio-YPG en 900 ml H_{2}O, se sometieron a autoclave y se añadieron 100 ml de una solución de glucosa al 20%) y se inocularon con 1 ml de un cultivo de levadura saturada en medio-SYC. El cultivo fue agitado a 30ºC durante 2 días. Las células fueron recogidas por centrifugado (5 minutos X 4000 g) y el sobrenadante fue almacenado en hielo para la medición de LU. El granulado celular fue tratado con Novozym™234 para preparar esferoplastos y se alisó usando el procedimiento de cuentas de vidrio (Ausubel et al., (1995). Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons). La fracción de citosol crudo obtenida que también incluía la fracción de la membrana fue aplicada inmediatamente a la medición de LU (ver sección Materiales y Métodos) con el objetivo de minimizar la degradación proteolítica. El resultado se muestra en la Tabla 3. Los cuatro clones mostraron LU débiles pero significantes en la fracción citosol/membrana. Además, se pudieron registrar las señales débiles de LU de dos de estos cuatro clones. Todos los datos que difieren de 0.0 LU/ml son actividades enzimáticas significantes tal como se ha confirmado por mediciones repetidas.

\newpage

TABLA 3 Resumen de la unidad lipásica obtenida segregada en el medio o medida a partir de la fracción de citosol de variantes ATTC 44896 de la biblioteca

A. La desviación estándar es del 10%

113

Ejemplo 12 Afinidad del substrato de enzimas lipolíticas

Se ha desarrollado un procedimiento para realizar una simple comparación de la capacidad de las enzimas lipolíticas para acumular sobre/en una fase de substrato (aceite de oliva, Incl. FFA)) con un pH alcalino (pH 9.0) y en presencia del agente tensioactivo no-iónico Dobanol 25-7 (100 partes por millón) (es decir una medida para la afinidad de substrato).

Procedimiento

1.

Se preparan dos soluciones tampón idénticas (5 ml) en frascos precintables de 20 ml, ("Muestra" (s) y "Referencia" (r)).

2.

Se añade la enzima en "Muestra" y "Referencia" y se determina la concentración de lipasa (X LU/ml).

3.

Se añade aceite de oliva sobre la "muestra" y se agitan ambas soluciones de lipasa enérgicamente. Incubación a 4ºC hasta el día siguiente.

4.

Tras la incubación, se determina la concentración de la lipasa restante en las fases acuosas (Yi LU/ml i=r,s).

Resumen de las condiciones de la incubación

Tampón:	100 mM de glicina (5 ml).
pH:	9.0.
Substrato:	Aceite de oliva (5 ml).
Dobanol 25-7:	100 ppm.
T:	4ºC.
Lipasa:	5-10 LU/ml.
Incubación:	Hasta el día siguiente (24-26 horas).

Evaluación de datos

Después de un experimento, se calcula el resultado para comparar la pérdida de actividad de la incubación en la fase acuosa en contacto con aceite de oliva con respecto a la pérdida de actividad de la fase acuosa en ausencia de aceite de oliva:

\alpha= Ys/Yr (ver arriba)

Resultados TABLA 11

Lipasa	\alpha (%)
Lipolase™	95%
D57G+N94K+D96L+L97M+Q249R	65%
SPIRPR+E1P+D57G+N94K+D96L+L97M+Q249R	45%
SALRPRK+D57G+N94K+D96L+L97M+Q249R	25%
SPIRPR+E1P+D137G+D167G+E210V+W221L	50%

Comparando los resultados presentados anteriormente para lavar, los datos descritos en los ejemplos 5-8 indican claramente que las variantes de la lipolasa con un rendimiento aumentado del primer lavado generalmente han aumentado la afinidad del substrato en comparación con la lipolasa.

Ejemplo 13 Mutagénesis aleatoria localizada de la lipasa de Pseudomonas sp. (Liposam)

Un esquema de impurificación adecuado que puede usarse para introducir mutaciones que se ha observado que conducen a una actividad de primer lavado de la lipasa anterior puede comprender una mutagénesis aleatoria localizada en toda o en parte de una o más de las regiones siguientes. 93% wt/7% aleatorio significa que los codones respectivos están sintetizados con el 93% de nucleótidos de wt y el 7% de los otros 3 nucleótidos en el oligonucleótido usado para construir la biblioteca mutagenizada aleatoria.

De forma similar para el 90% wt/10% aleatorio.

En la región de los aminoácidos 17-37:

Posición de aminoácido 17-18+20-24+26-29+32-37: 93% wt/7% aleatorio M19:

Impurificados para dar preferentemente L,I,F

En la región de los aminoácidos 109-161:

Posición de aminoácidos 109-118: 93% wt/7% aleatorio

Posición de aminoácidos 120 + 123-137 + 139-161: 90% wt/10% aleatorio

En la región de aminoácidos 208-239:

Posición de aminoácidos 208-212+214-215+217-231+233-239: 90% wt/10% aleatorio

En la región de los aminoácidos 253-271:

Posición de aminoácidos 253+255+259-268+270-271: 90% wt/10% aleatorio V258: 90% wt/10% aleatorio pero impurificado para no ser un aminoácido con carga positiva

La mutagénesis aleatoria localizada puede ser realizada según se describe en la sección Materiales y Métodos y en el Ejemplo 1 de la presente, y los mutantes resultantes seleccionados por una dependencia reducida al calcio y/o una tolerancia aumentada hacia un detergente o componente de detergente y después de la actividad de primer lavado. Posteriormente, y si fuera necesario, la mutagénesis aleatoria localizada de los mutantes resultantes puede ser repetida y/o los genes pueden ser sometidos a una redistribución genética según se describe en la presente.

Referencias citadas en la especificación

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\newpage

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Grochulski, P. et al. (1993) J. Biol. Chem. 268, p. 12843.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

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(i)

SOLICITANTE:

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(A)

NOMBRE: Novo Nordisk A/S

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CALLE: Novo Alle

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(C)

CUIDAD: Bagsvaerd

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(E)

PAÍS: Denmark

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

CÓDIGO POSTAL (ZIP): DK-2880

\vskip0.500000\baselineskip

(G)

TELÉFONO: +45 4444 8888

\vskip0.500000\baselineskip

(H)

FAX: +45 4449 3256

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Nuevas enzimas lipolíticas

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 100

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(iv)

FORMA DE LECTURA POR ORDENADOR:

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(A)

TIPO DE MEDIO: Disquete

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(B)

ORDENADOR: IBM PC compatible

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(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Version #1.30B (EPO)

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID. Nº 1:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "Primer 3"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº 1:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGAAATCGGG TATCCTTTCA G

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID. Nº 2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 30 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "Primer 7258"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gaatgacttg gttgacgcgt caccagtcac

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID. Nº 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 26 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "Primer 7770"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tctagcccag aatactggat caaatc

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID. Nº4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 53 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "randon 1"

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Botella 5: 93% A; 2.33% C; 2.33% G y 2.33% T

\vskip0.500000\baselineskip

Botella 6: 93% C; 2.33% A; 2.33% G y 2.33% T

\vskip0.500000\baselineskip

Botella 7: 93% G; 2.33% A; 2.33% C y 2.33% T

\vskip0.500000\baselineskip

Botella 8: 93% T; 2.33% A; 2.33% C y 2.33% G

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:

9011

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID. Nº 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 93 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "Oligo 2"

\vskip0.500000\baselineskip

Frasco 5: 80% A; 6,66% C; 6,66% G og 6,66% T.

\vskip0.500000\baselineskip

Frasco 6: 80% C; 6,66% A; 6,66% G og 6,66% T.

\vskip0.500000\baselineskip

Frasco 7: 80% G; 6,66% A; 6,66% C og 6,66% T.

\vskip0.500000\baselineskip

Frasco 8: 80% T; 6,66% A; 6,66% C og 6,66% G.

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:

\vskip1.000000\baselineskip

903

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID. Nº 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 64 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "Oligo lid2"

\vskip0.500000\baselineskip

Frasco 5: 93% A; 2,33% C; 2,33% G og 2,33% T.

\vskip0.500000\baselineskip

Frasco 6: 93% C; 2,33% A; 2,33% G og 2,33% T.

\vskip0.500000\baselineskip

Frasco 7: 93% G; 2,33% A; 2,33% C og 2,33% T.

\vskip0.500000\baselineskip

Frasco 8: 93% T; 2,33% A; 2,33% C og 2,33% G.

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6:

\vskip1.000000\baselineskip

904

2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID. Nº 7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 105 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "Primer 4"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7:

\vskip1.000000\baselineskip

905

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID. Nº 8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 54 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "Primer 8479"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 8:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCGTGGACGG CCTTGGCTAG CCCTATTCGT CCTCGACCGG TCTCGCAGGA TCTG

\hfill

54

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID. Nº 9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 30 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "Primer 7887"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 9:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GAATGACTTG GTTGAGTACT CACCAGTCAC

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID. Nº 10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 46 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "Primer 8932"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 10:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GAACTGGATA GGAAATTTGA AGTTCCTGTT GAAAGAAATA AATGAC

\hfill

46

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID. Nº 11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 57 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "Oligo 1"

\vskip0.500000\baselineskip

Frasco 5: 80% A; 6.66% C; 6.66% G og 6.66% T.

\vskip0.500000\baselineskip

Frasco 6: 80% C; 6.66% A; 6.66% G og 6.66% T.

\vskip0.500000\baselineskip

Frasco 7: 80% G; 6.66% A; 6.66% C og 6.66% T.

\vskip0.500000\baselineskip

Frasco 8: 80% T; 6.66% A; 6.66% C og 6.66% G.

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 11:

\vskip1.000000\baselineskip

906

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID. Nº 12:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 18 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "Primer 2056"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 12:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCACGTAATG TTTGTACC

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID. Nº 13:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 18 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "Primer 4699"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 13:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGGTACCCGG GGATCCAC

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID. Nº 14:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 30 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "Forward Primer 1"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 14:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GAGCTCGAGG AATTCTTACA AACCTTCAAC

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID. Nº 15:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 47 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "Reverse Primer 2"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 15:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTAATTAAGG TACCTGAATT TAAATGGTGA AGAGATAGAT ATCCAA

\hfill

47

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID. Nº 16:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 51 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "Forward Primer 3"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 16:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TCACCATTTA AATTCAGGTA CCTTAATTAA ATTCCTTGTT GGAAGCGTCG A

\hfill

51

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID. Nº 17:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 42 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "Reverse Primer 4"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 17:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGGTATGCAT AAGCTTGAAT TCAGGTAAAC AAGATATAAT TT

\hfill

42

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID. Nº 18:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 32 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "HLIP-A Primer 5"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 18:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCCATTTAAA TATGAGGAGC TCCCTTGTGC TG

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID. Nº 19:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 32 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "HLIP-B Primer 6"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 19:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCCTTAATTA ACTAAAGACA TGTCCCAATT AA

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID. Nº 20:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 6 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: adición de péptidos

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 20:

\vskip1.000000\baselineskip

907

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID. Nº 21:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 5 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: adición de péptidos

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 21:

\vskip1.000000\baselineskip

1001

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID. Nº 22:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 6 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: adición de péptidos

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 22:

\vskip1.000000\baselineskip

1002

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID. Nº 23:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 6 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: adición de péptidos

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 23:

\vskip1.000000\baselineskip

1003

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID. Nº 24:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 6 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: adición de péptidos

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 24:

\vskip1.000000\baselineskip

1004

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID. Nº 25:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 5 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: adición de péptidos

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 25:

\vskip1.000000\baselineskip

1005

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID. Nº 26:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 5 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: adición de péptidos

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 26:

\vskip1.000000\baselineskip

1006

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID. Nº 27:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 6 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: adición de péptidos

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 27:

\vskip1.000000\baselineskip

1007

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID. Nº 28:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 5 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: adición de péptidos

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 28:

\vskip1.000000\baselineskip

1008

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID. Nº 29:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 5 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: adición de péptidos

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 29:

\vskip1.000000\baselineskip

1009

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID. Nº 30:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 5 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: adición de péptidos

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 30:

\vskip1.000000\baselineskip

1010

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID. Nº 31:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 4 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: adición de péptidos

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 31:

\vskip1.000000\baselineskip

1011

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID. Nº 32:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 5 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: adición de péptidos

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 32:

\vskip1.000000\baselineskip

1012

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID. Nº 33:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 4 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: adición de péptidos

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 33:

\vskip1.000000\baselineskip

1013

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID. Nº 34:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 7 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: adición de péptidos

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 34:

\vskip1.000000\baselineskip

1014

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID. Nº 35:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 7 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: adición de péptidos

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 35:

\vskip1.000000\baselineskip

1015

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID. Nº 36:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 7 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: adición de péptidos

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 36:

\vskip1.000000\baselineskip

1016

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID. Nº 37:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 7 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: adición de péptidos

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 37:

\vskip1.000000\baselineskip

1017

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID. Nº 38:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 6 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: adición de péptidos

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 38:

\vskip1.000000\baselineskip

1018

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID. Nº 39:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 6 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: adición de péptidos

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 39:

\vskip1.000000\baselineskip

1019

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID. Nº 40:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 6 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: adición de péptidos

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 40:

\vskip1.000000\baselineskip

1020

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID. Nº 41:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 6 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: adición de péptidos

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 41:

\vskip1.000000\baselineskip

1021

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID. Nº 42:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 6 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: adición de péptidos

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 42:

\vskip1.000000\baselineskip

1022

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID. Nº 43:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 6 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: adición de péptidos

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 43:

\vskip1.000000\baselineskip

1023

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID. Nº 44:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 6 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: adición de péptidos

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 44:

\vskip1.000000\baselineskip

1024

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID. Nº 45:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 6 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: adición de péptidos

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 45:

\vskip1.000000\baselineskip

1025

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID. Nº 46:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 6 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: adición de péptidos

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 46:

\vskip1.000000\baselineskip

1026

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID. Nº 47:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 5 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: adición de péptidos

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 47:

\vskip1.000000\baselineskip

1027

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID. Nº 48:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 5 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: adición de péptidos

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 48:

\vskip1.000000\baselineskip

1028

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID. Nº 49:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 7 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: adición de péptidos

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 49:

\vskip1.000000\baselineskip

1029

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID. Nº 50:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 7 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: adición de péptidos

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 50:

\vskip1.000000\baselineskip

1030

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID. Nº 51:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 7 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: adición de péptidos

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 51:

\vskip1.000000\baselineskip

1031

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID. Nº 52:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 7 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: adición de péptidos

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 52:

\vskip1.000000\baselineskip

1032

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID. Nº 53:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 7 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: adición de péptidos

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 53:

\vskip1.000000\baselineskip

1033

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID. Nº 54:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 7 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: adición de péptidos

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 54:

\vskip1.000000\baselineskip

1034

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID. Nº 55:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 7 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: adición de péptidos

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 55:

\vskip1.000000\baselineskip

1035

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID. Nº 56:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 7 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: adición de péptidos

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 56:

\vskip1.000000\baselineskip

1036

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID. Nº 57:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 6 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: adición de péptidos

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 57:

\vskip1.000000\baselineskip

1037

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID. Nº 58:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 5 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: adición de péptidos

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 58:

\vskip1.000000\baselineskip

1038

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID. Nº 59:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 5 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: adición de péptidos

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 59:

\vskip1.000000\baselineskip

1039

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID. Nº 60:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 8 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: adición de péptidos

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 60:

\vskip1.000000\baselineskip

1040

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID. Nº 61:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 11 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: adición de péptidos

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 61:

\vskip1.000000\baselineskip

1041

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID. Nº 62:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 11 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: adición de péptidos

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 62:

\vskip1.000000\baselineskip

1042

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID. Nº 63:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 12 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: adición de péptidos

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 63:

\vskip1.000000\baselineskip

1043

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID. Nº 64:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 12 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: adición de péptidos

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 64:

\vskip1.000000\baselineskip

1044

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID. Nº 65:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 8 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: adición de péptidos

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 65:

\vskip1.000000\baselineskip

1045

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID. Nº 66:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 9 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: adición de péptidos

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 66:

\vskip1.000000\baselineskip

1046

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID. Nº 67:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 8 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: adición de péptidos

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 67:

\vskip1.000000\baselineskip

1047

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID. Nº 68:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 10 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: adición de péptidos

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 68:

\vskip1.000000\baselineskip

1048

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID. Nº 69:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 9 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: adición de péptidos

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 69:

\vskip1.000000\baselineskip

1049

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID. Nº 70:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 12 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: adición de péptidos

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 70:

\vskip1.000000\baselineskip

1050

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID. Nº71:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 15 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: adición de péptidos

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 71:

\vskip1.000000\baselineskip

1051

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID. Nº 72:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 8 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: adición de péptidos

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 72:

\vskip1.000000\baselineskip

1052

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID. Nº 73:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 8 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: adición de péptidos

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 73:

\vskip1.000000\baselineskip

1053

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID. Nº 74:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 8 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: adición de péptidos

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 74:

\vskip1.000000\baselineskip

1054

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID. Nº 75:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 8 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: adición de péptidos

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 75:

\vskip1.000000\baselineskip

1055

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID. Nº 76:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 8 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: adición de péptidos

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 76:

\vskip1.000000\baselineskip

1056

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID. Nº 77:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 8 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: adición de péptidos

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 77:

\vskip1.000000\baselineskip

1057

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID. Nº 78:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 8 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: adición de péptidos

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 78:

\vskip1.000000\baselineskip

1058

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID. Nº 79:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 8 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: adición de péptidos

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 79:

\vskip1.000000\baselineskip

1059

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID. Nº 80:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 7 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: adición de péptidos

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 80:

\vskip1.000000\baselineskip

1060

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID. Nº 81:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 42 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "Primer TiK 57"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº 81:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTTGGCTAGC CCTATACGTA GATCATCCAC ACAAGATTAT CG

\hfill

42

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID. Nº 82:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 32 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "Primer TiK 58"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº 82:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTTGGCTAGC TCCACACAAG ATTATCGTAT TG

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID. Nº 83:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 32 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "Primer TiK 59"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº 83:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCCCTCTAGA CTATAAACAG AGACCAGTGT TC

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID. Nº 84:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 83 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "Primer TiK 60"

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

5: 90% A y 3.33% de cada C, G, T.

\vskip0.500000\baselineskip

6:

90% C y 3.33% de cada A, G, T.

\vskip0.500000\baselineskip

7:

90% G y 3.33% de cada A, C, T.

\vskip0.500000\baselineskip

8:

90% T y 3.33% de cada A, C, G.

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº 84:

\vskip1.000000\baselineskip

1061

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID. Nº 85:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 17 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "Primer TiK 61"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº 85:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGAACAGCTG TTGCACC

\hfill

17

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID. Nº 86:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 19 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "Primer TiK 62"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº 86:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCGGGGA TCCACCATG

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID. Nº 87:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "Primer TiK 64"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº 87:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCCCTCTAGA CTATAAACAG

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID. Nº 88:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 17 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "Primer TiK 66"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº 88:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTGCAGAACT GTCATTC

\hfill

17

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID. Nº 89:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 16 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "Primer TiK 72"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº 89:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTGAGCTTGT ACCACG

\hfill

16

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID. Nº 90:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 36 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "Primer TiK 74"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº 90:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCGGGGATCC ACCATGAGAT TTCCTTCTAT TTTTAC

\hfill

36

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID. Nº 91:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 31 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "Primer TiK 75"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº 91:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGGAGCTAGC TCTTTTATCC AAAGAAACAC C

\hfill

31

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID. Nº 92:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 85 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "Primer TiK 76"

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

5: 90% G y 3.33% de cada C, G, T.

\vskip0.500000\baselineskip

6:

90% A y 3.33% de cada A, G, T.

\vskip0.500000\baselineskip

7:

90% T y 3.33% de cada A, C, T.

\vskip0.500000\baselineskip

8:

90% C y 3.33% de cada A, C, G.

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº 92:

\vskip1.000000\baselineskip

1062

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID. Nº 93:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1115 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Cepa: Absidia reflexa ATTC 44896

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 93:

114

115

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID. Nº 94:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1020 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: circular

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "vector de expresión de levadura pTik05"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

SITUACIÓN:3..1020

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 94:

\vskip1.000000\baselineskip

116

117

118

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID. Nº 95:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 339 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 95:

119

120

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID. Nº 96:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 255 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: secuencia señal MF\alpha1 (factor de acoplamiento)

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CEPA: cepa de levadura YPH499

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: sig_peptide

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

SITUACIÓN:1..255

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

SITUACIÓN:1..255

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 96:

121

122

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID. Nº 97:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 85 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 97:

\vskip1.000000\baselineskip

123

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID. Nº 98:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 98:

124

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID. Nº 99:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 864 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CEPA: Pseudomonas sp.

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: mat_peptide

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

SITUACIÓN:1..864

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

SITUACIÓN:1..864

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 99:

125

126

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID. Nº 100:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 288 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 100:

127

128

Claims (43)

1. Método de preparación de una enzima lipolítica mutada, el cual comprende al menos las fases siguientes:

a) sometimiento de una secuencia de ADN que codifica una enzima lipolítica madre a mutagénesis para formar una variedad de secuencias de ADN mutadas;

b) expresión de las secuencias de ADN mutadas en células huésped;

c) selección de las células huésped que expresan una enzima lipolítica mutada que tiene una menor dependencia al calcio y/o una tolerancia mejorada a un detergente o un componente detergente en comparación con la enzima lipolítica madre; y

d) selección de una enzima lipolítica mutada entre aquellas que resultan de la fase (c) la cual, cuando está presente en una composición de detergente, es capaz de eliminar al menos un 15% más de manteca de cerdo de una muestra manchada con manteca de cerdo, que la misma composición de detergente sin la enzima lipolítica, en un ensayo de lavado de un ciclo que comprende el sometimiento de 7 muestras de algodón manchadas con manteca de cerdo (9 x 9 cm) por vaso de precipitación a un lavado de un ciclo en un TOM con termostato, cada vaso de precipitación conteniendo 1000 ml de agua que incluye 3.2 mM Ca^{2+}/Mg^{2+} (en una proporción de 5:1) y 5 g/l de dicha composición de detergente, ajustada a un pH 10, y que incluye12500 LU/l de la enzima lipolítica, durante 20 minutos a una temperatura de 30ºC, seguido de un aclarado durante 15 minutos en agua corriente del grifo y secado tendido durante la noche a temperatura ambiente, posterior extracción y cuantificación de la materia grasa de las muestras resultantes mediante extracción Soxhlet.

2. Método según la reivindicación 1, en el que la mutagénesis de la fase (a) es mutagénesis aleatoria.

3. Método según la reivindicación precedente en el que la mutagénesis es mutagénesis aleatoria localizada realizada en la zona de contacto lipídica o en cualquier adición de un péptido presente en el extremo N-terminal y/o C-terminal de la enzima lipolítica madre.

4. Método de cualquiera de las reivindicaciones 1-3 en el que las fases (a), (b), (c) y/o (d) se repiten una o más veces.

5. Método de cualquiera de las reivindicaciones 1-4 en el que la enzima lipolítica madre es derivada de la cepa de Humicola lanuginosa DSM 4109 y tiene la secuencia de aminoácidos descrita en EP 0 305 216.

6. Método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes en el que la enzima lipolítica mutada comprende al menos 3 mutaciones en comparación con la enzima lipolítica madre.

7. Método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes en el que la enzima lipolítica mutada (en comparación con la enzima lipolítica madre) comprende la sustitución de al menos un residuo aminoácido neutral por un residuo aminoácido cargado positivamente, la supresión de al menos un residuo aminoácido cargado negativamente, o la sustitución de al menos un residuo aminoácido cargado negativamente, por un residuo aminoácido neutral o cargado positivamente.

8. Método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes en el que la enzima lipolítica mutada, en comparación con la enzima lipolítica madre, ha sido modificada mediante la supresión o sustitución de al menos un residuo aminoácido en una zona de contacto lipídica de la enzima lipolítica madre o la adición de al menos un residuo aminoácido a dicha zona de contacto lipídica.

9. Método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes en el que la enzima lipolítica mutada, en comparación con la enzima lipolítica madre, comprende al menos una mutación dentro y al menos una mutación fuera de la zona de contacto lipídica de la enzima lipolítica madre.

10. Método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes en el que la enzima lipolítica mutada, en comparación con la enzima lipolítica madre, comprende una adición de péptidos aplicada en o dentro del extremo C- y/o N-terminal de la forma madura de la enzima lipolítica madre.

11. Método de la reivindicación precedente en el que la adición de un péptido forma un enlace covalente con la parte madura de la enzima lipolítica madre.

12. Método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes en el que la enzima lipolítica mutada comprende un residuo de cisteína en la adición del péptido, un residuo de cisteína en la parte madura de la enzima lipolítica madre y un puente de cistina entre los dos residuos de cisteína.

13. Método de cualquiera de reivindicaciones 10-12 en el que la adición del péptido comprende al menos un residuo de prolina.

14. Método de la reivindicación precedente en el que la adición del péptido comprende dos o tres residuos de prolina.

15. Método de cualquiera de las reivindicaciones 10-14 en el que la adición del péptido comprende al menos un residuo aminoácido positivo o hidrofóbico.

16. Método de la reivindicación precedente en el que la adición del péptido comprende dos o tres residuos aminoácidos hidrofóbicos.

17. Método de cualquiera de reivindicaciones 10-16 en el que la adición de péptidos tiene una longitud de entre 1 y 15 aminoácidos.

18. Método de la reivindicación 17 en el que la adición de péptidos tiene una longitud de 4 a 10 aminoácidos.

19. Método de cualquiera de las reivindicaciones 10-18 en el que la enzima lipolítica mutada comprende además una mutación en una parte no estructural del N-terminal y/o C-terminal de la enzima lipolítica madre.

20. Método de la reivindicación precedente en el que la mutación ocasiona la eliminación de al menos un residuo aminoácido cargado negativamente.

21. Método de la reivindicación 19 o 20 en el que un residuo aminoácido cargado negativamente de dicha parte no estructural ha sido suprimido o reemplazado por un residuo aminoácido neutral o cargado positivamente o por un residuo aminoácido hidrofóbico, o en el que un residuo aminoácido neutral ha sido reemplazado por un residuo aminoácido cargado positivamente.

22. Método de preparación de una enzima lipolítica mutada, el cual comprende al menos las fases siguientes:

a) construcción de secuencias de ADN mutadas mediante la combinación de i) una secuencia de ADN que codifica una primera enzima lipolítica madre o una parte de dicha secuencia de ADN y ii) una secuencia de ADN que codifica una segunda enzima lipolítica madre o una parte de dicha secuencia de ADN, y opcionalmente iii) otras secuencias de ADN que codifican una tercera (y opcionalmente más) enzimas lipolíticas madre o una parte de dicha/s secuencia/s de ADN, las secuencias de ADN que van a ser combinadas siendo lo suficientemente homólogas para permitir que tenga lugar una recombinación homóloga entre las secuencias,

b) expresión de las secuencias de ADN mutadas resultantes en células huésped, y

c) selección de una enzima lipolítica mutada entre aquellas que resultan de la fase (b) la cual, cuando está presente en una composición de detergente A y/o B es capaz de eliminar al menos un 15% más de manteca de cerdo de una muestra manchada con manteca de cerdo, que la misma composición de detergente sin la enzima lipolítica, en un ensayo de lavado de un ciclo que comprende el sometimiento de 7 muestras de algodón manchadas de manteca de cerdo (9 x 9 cm) por vaso de precipitación a un lavado de un ciclo en un TOM con termostato, cada vaso de precipitación conteniendo 1000 ml de agua que incluye 3.2 mM Ca^{2+}/Mg^{2+} (en una proporción de 5:1) y 5 g/l de dicha composición de detergente, ajustando el pH 10, y que incluye 12500 LU/l de la enzima lipolítica, durante 20 minutos a una temperatura de 30ºC, seguido de un aclarado durante 15 minutos en agua corriente del grifo y secado tendido durante la noche a temperatura ambiente, posterior extracción y cuantificación de la materia grasa de las muestras resultantes mediante extracción Soxhlet.

23. Método de la reivindicación 22, en el que, antes de la fase (c), se realiza una selección de células huésped que expresan una enzima lipolítica mutada con una menor dependencia al calcio y/o una tolerancia mejorada a un detergente o a un componente de detergente en comparación con cualquiera de las enzimas lipolíticas madre.

24. Método de la reivindicación 22 o 23, en el que una o más de las secuencias de ADN homólogas i)-iii) usadas para construir la secuencia de ADN mutada en la fase (a) ha sido preparada

a) sometimiento de una secuencia de ADN que codifica una enzima lipolítica madre a mutagénesis para formar una variedad de secuencias de ADN mutadas;

b) expresión de las secuencias de ADN mutadas en células huésped;

c) selección de las células huésped que expresan una enzima lipolítica mutada que tiene una menor dependencia al calcio y/o una tolerancia mejorada a un detergente o a un componente de detergente en comparación con la enzima lipolítica madre; y opcionalmente

d) selección de una enzima lipolítica mutada entre aquellas que resultan de la fase (c) la cual, cuando está presente en la composición de detergente A o B, es capaz de eliminar al menos un 15% más de manteca de cerdo de una muestra manchada con manteca de cerdo, que la misma composición de detergente sin la enzima lipolítica, en un ensayo de lavado de un ciclo que comprende el sometimiento de 7 muestras de algodón manchadas con manteca de cerdo (9 x 9 cm) por vaso de precipitación a un lavado de un ciclo en un TOM con termostato, cada vaso de precipitación conteniendo 1000 ml de agua que incluye 3.2 mM Ca^{2+}/Mg^{2+} (en una proporción de 5:1) y 5 g/l de dicha composición de detergente, ajustando el pH 10, y que incluye 12500 LU/l de la enzima lipolítica, durante 20 minutos a una temperatura de 30ºC, seguido de un aclarado durante 15 minutos en agua corriente del grifo y secado tendido durante la noche a temperatura ambiente, posterior extracción y cuantificación de la materia grasa de las muestras resultantes mediante extracción Soxhlet.

25. Método de cualquiera de las reivindicaciones 22-24 en el que las enzimas lipolíticas madre codificadas por las secuencias de ADN homólogas i), ii) y iii) constituyen variantes diferentes de la misma enzima lipolítica de origen natural.

26. Método de cualquiera de las reivindicaciones 22-25 en el que la enzima lipolítica madre es derivada de un hongo o una bacteria.

27. Método de la reivindicación precedente, en el que una enzima lipolítica madre es derivada de una cepa de Humicola lanuginosa DSM 4109 y tiene la secuencia de aminoácidos descrita en EP 0 305 216.

28. Método de cualquiera de las reivindicaciones 22-27 en el que la combinación de secuencias de ADN es realizada por PCR sexual o por redistribución de genes.

29. Enzima lipolítica que es una variante de una enzima lipolítica madre, en la que la enzima lipolítica madre es derivada de la cepa de Humicola lanuginosa DSM 4109 y tiene la secuencia de aminoácidos descrita en EP 0 305 216, y la variante tiene una de las mutaciones siguientes:

a) SPIRPRP+D57G+N94K+D96L+Q249R;

b) SPPRRP+I90F+D96L+E99K+D137G+V187A;

c) SPIRPRP+N94K+D96L+L97M+Q249R;

d) SPPPRPRP+N94K+D96L+L97M+Q249R;

e) SPIRPRP+D57G+N94K+D96L+L97M+Q249R;

f) SPPRRP+I90F+D96L+E99K+V187A;

g) SPIRPRP+D137G+D167G+E21V+W221L;

h) E1SPIRPRP+I90F+D96L+E99K+V187A;

i) E1SRKRKRK+I90F+D96L+E99K+V187A;

j) E1SPRIKPRIK+I90F+D96L+E99K+V187A;

k) E1SPPRRP+D62R+I90F+D96L+E99K+V187A;

l) E1SPPRRP+I90F+D96L+E99K+V187A+N200R+R209A;

m) E1SPPRRP+I90F+D96L+E99K+V187A+T199R+N200R+R209A;

n) E1SPIRPRP+D57G+D62R+N94K+D96L+Q249R;

o) E1SPIRPRP+D57G+N94K+D96L+N200R+R209A+Q249R;

p) E1SPIRPRP+D57G+N94K+D96L+T199R+N200R+Q249R;

q) E1SPPRRP+I90F+D96L+E99K+V187A+T199R;

r) E1SPIRPRP+D57G+N94K+D96L+T199R+R209A+Q249R;

s) E1SPIRPRP+I90F+D96L+E99K+V187A+Q249R;

t) E1SPPRRP+I90F+D96L+E99K+V187A+P253R;

u) E1SPPRRP+I90F+D96L+E99K+D137G+D167G+V187A+Q249R;

v) E1SPPRRP+I90F+D96L+E99K+D137G+V187A+Q249R;

w) E1SPPRRP+D96L+E99K+V187A+Q249R;

x) E1SPPRPR+V2P+N94K+D96L+Q249R;

y) E1SPPWWP+V2W+S3R+N94K+D96L+Q249R;

z) E1SPPWRP+V2R+S3R+N94K+D96L+Q249R;

aa) E1SPPRWP+V2R+S3R+N94K+D96L+Q249R;

bb) E1SPPWWP+V2R+S3W+N94K+D96L+Q249R;

cc) E1SPPRWP+V2W+S3R+N94K+D96L+Q249R;

dd) E1SPPRWP+V2R+S3W+N94K+D96L+Q249R;

ee) E1SPPRWP+N94K+D96L+Q249R;

ff) E1SPPRRP+N94K+D96L+Q249R;

gg) E1PPPRPRPRPRP+V2G+S3T+D57G+N94K+D96L+L97M+Q249R;

hh) E1APPPRTRPRPRS+V2G+S3T+Q4P+D5E+D57G+N94K+D96L+L97M+Q249R;

ii) E1APPPKASPRQRP+V2G+D5Q+L6M+D57G+N94K+D96L+L97M+Q249R;

jj) SCIRR+N94K+D96L+E239C+Q249R;

kk) E1SPPRRP+D57G+N94K+D96L+Y53C+K127C+Q239R;

ll) E1SPPRRPR+V2R+S3P+N94K+D96L+Q249R;

mm) E1SPPWPRP+V2R+S3P+N94K+D96L+Q249R;

nn) E1SPPRRP+N94K+D96L+E99K;

oo) E1PPRRP+N94K+D96L+E99K+Q249R;

pp) E1SPPCGRRP+N94K+D96L+E239C+Q249R;

qq) E1SPCRPRP+N94K+D96L+E239C+Q249R;

rr) SPPCRRRP+N94K+D96L+E239C+Q249R;

ss) E1PPRRP+D57G+N94K+D96L+Q249.

30. Construcción de ADN que comprende una secuencia de ADN que codifica la enzima lipolítica según la reivindicación 29.

31. Vector que alberga la construcción de ADN de la reivindicación 30.

32. Vector de la reivindicación 31 que es un plásmido o un bacteriófago.

33. Vector de la reivindicación 31 o 32 que es un vector de expresión de la enzima lipolítica.

34. Célula huésped que alberga la construcción de ADN de la reivindicación 30 o el vector de cualquiera de las reivindicaciones 31-33.

35. Célula según la reivindicación 34 que es una célula microbiana.

36. Célula de la reivindicación 35 que es una célula de una cepa micótica o bacteriana.

37. Célula de la reivindicación 36 que es una célula del genero Aspergillus, Fusarium, o Saccharomyces.

38. Célula de la reivindicación 37 que es A. Niger, A. oryzae, A. nidulans, F. graminearum o S. ceravisiae.

39. Aditivo detergente en forma de un granulado no espolvoreado, un líquido estabilizado o una enzima protegida que comprende la enzima lipolítica según la reivindicación 29.

40. Aditivo detergente de la reivindicación 39 que contiene 0.02-200 de proteína enzimática/g de aditivo.

41. Aditivo detergente de la reivindicación 39 o 40, que además comprende una enzima lipolítica proteasa, amilasa, peroxidasa, cutinasa, y/o celulasa.

42. Composición de detergente que comprende un agente tensioactivo y la enzima lipolítica según la reivindicación 29.

43. Composición de detergente de la reivindicación 42 que además comprende una enzima lipolítica proteasa, amilasa, peroxidasa, cutinasa, y/o celulasa.