BRPI0819184B1 - Variantes de alfa-amilase com propriedades alteradas, polinucleotídeo, vetor, célula hospedeira, composição, kit, bem como métodos para tratamento de um caldo de amido, para produção de um substrato fermentável, e para tratamento de um material contendo amido - Google Patents

Abstract

VARIANTES DE ALFA-AMILASE COM PROPRIEDADES ALTERADAS. A presente invenção refere-se a composições que compreendem variantes de alfa-amilase que possuem atividade de alfa-amilase e que exibem propriedades alteradas em relação a uma alfa-amilase parental semelhante à AmyS da qual são derivados. As composições compreendem uma enzima adicional como, por exemplo, uma fitase. Também são descritosdescrito método de utilização das composições, e kits a elas relacionados.

Description

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

[001] É anexada a este relatório descritivo uma listagem de sequências que compreende as SEQ ID Nos: 1-31, cada uma delas sendo aqui incorporada por referência em sua totalidade.

CAMPO DA INVENÇÃO

[002] A presente invenção refere-sedescrição a novas alfa- amilases. Em particular, ela se refere a certas atividades de variante de alfa-amilase, além de misturas destas com uma ou mais outras enzimas, por exemplo, fitases.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[003] Alfa-amilases (alfa-1,4-glucan-4-glucano-hidrolases, E.C.3.2.1.1) constituem um grupo de enzimas que catalisam a hidrólise de amido e 1,4-oligo- e polissacarídeos glicosídicos lineares ou ramificados relacionados.

[004] Alfa-amilases podem ser usadas para diversas finalidades.Por exemplos, alfa-amilases são usadas comercialmente nos estágios iniciais do processamento do amido (por exemplo, liquefação); em processos de moagem úmida; e na produção de álcool a partir de fontes de carboidrato. Elas também são usadas como agentes ou auxiliares de limpeza em matrizes detergentes; na indústria têxtil para de- sengomagem de amido; em aplicações de cozimento; na indústria de bebidas; em campos petrolíferos em processos de perfuração; em processos de reciclagem, por exemplo, para descoloração de papel, e em ração animal.

[005] Foram feitas tentativas para a construção de variantes de alfa-amilase com propriedades aprimoradas para usos específicos, por exemplo, liquefação de amido e desengomagem têxtil.

[006] Há a necessidade da criação e aperfeiçoamento de amila-ses que forneçam, por exemplo, vantagens de fabricação e/ou desempenho em relação às enzimas industriais padronizadas (por exemplo, de Bacillus licheniformis), para vários usos, incluindo o processamento comercial de grãos, por exemplo, processos de liquefação. Também há necessidade de composições que compreendem amilases e enzimas adicionais aprimoradas, por exemplo, fitases.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[007] Em um aspecto, a presente invenção refere-sedescrição,inter alia, a novas variantes de enzimas α-amiloliticas de α-amilase parente como, por exemplo, a α-amilase semelhante à AmyS, em particular variantes que exibem propriedades alteradas que são vantajosas em relação ao processamento industrial do amido (liquefação do amido, sacarificação, e similares).

[008] Por exemplo, a variante é alterada, quando comparada com uma alfa-amilase parental semelhante à AmyS ou uma alfa-amilase de referência, em um ou mais dentre carga elétrica líquida, especificidade de substrato, clivagem de substrato, ligação de substrato, estabilidade térmica, atividades em um ou mais pHs, estabilidade em um ou mais pHs [como, por exemplo, estabilidade aumentada em pHs específicos (por exemplo, valores de pH baixos (por exemplo, pH < 6, em particular, pH < 5) ou elevados (por exemplo, pH > 9)], estabilidade em condições oxidantes, necessidades de íon metálico [por exemplo, dependência de Ca2+ ou necessidades de Ca2+], atividades específicas, taxa catalítica, eficiência catalítica, atividades na presença de ácido fítico ou outros fitatos (ou seja, suscetibilidade à inibição por fitatos), estabilida- de térmica ou de pH na presença de ácido fítico ou um fitato, capacidade de efetuar viscosidade de pico em um teste de liquefação, ou capacidade de efetuar viscosidade final em um teste de liquefação, e outras propriedades de interesse. Por exemplo, uma ou mais alterações podem resultar em uma variante que possui dependência de Ca2+ reduzida e/ou um perfil de pH/atividades alterado e/ou termoestabilidade alterada, quando comparada com uma α-amilase parente como, por exemplo, uma alfa-amilase semelhante à AmyS.

[009] Em um de seus aspectos, a invenção está relacionada a alfa-amilases variantes que compreendem uma sequência de aminoá- cidos pelo menos 95% idêntica àquela de uma alfa-amilase parental semelhante à AmyS, e que possui uma substituição em uma posição de aminoácido que corresponde à posição 242 de uma alfa-amilase de referência, e que ainda compreende uma ou mais das seguintes modificações às suas sequência de aminoácidos: a) uma ou mais das substituições nas posições da seguinte forma: uma cisteína na posição de aminoácido 349, uma cisteína em 428, um ácido glutâmico em 97, uma arginina em 97, um ácido glutâ- mico em 319, uma arginina em 319, um ácido glutâmico em 358, uma arginina em 358, um ácido glutâmico em 443 ou uma arginina em 443; b) outra modificação de sequência em uma ou mais posições de aminoácidos que correspondem às posições de aminoácidos 97, 319, 349, 358, 428 ou 443; c) eliminação de um ou mais aminoácidos nas posições F178, R179, G180, I181, G182 ou K183, ou pares destas; d) outras modificações de sequências em uma ou mais posições de aminoácidos 178, 179, 180, 181, 182 ou 183; e) substituição de N193F ou V416G, ou ambas; f) outra modificação de sequência na posição 193, 416 ou ambas; g) substituição de um ou mais resíduos de prolina presentes na parte da variante de alfa-amilase que é modificada, com um resíduo de alanina, glicina, serina, treonina, valina ou leucina. h) substituição de um ou mais resíduos de prolina presentes na parte da variante de alfa-amilase que é modificada, com outro resíduo de aminoácido de ocorrência natural; i) substituição de um ou mais resíduos de cisteína presentes na alfa-amilase parente com um resíduo de serina, alanina, treoni- na, glicina, valina ou leucina; j) substituição de um ou mais resíduos de cisteína presentes na variante de alfa-amilase parente, com outro resíduo de aminoá- cido de ocorrência natural; k) em que a SEQ ID N°: 7 é a amilase de referência para numeração, qualquer uma das seguintes mutações M15T,L, M15X, V128E, V128X, H133Y, H133X, N188S,T,P, N188X, M197T,L, M197X, A209V, A209X, M197T/W138F, M197T/138Y, M15T/H133Y/N188S, M15N128E/H133Y/N188S, E119C/S130C, D124C/R127C, H133Y/T149I, G475R, H133Y/S187D ou H133Y/A209V. l) outra modificação em uma ou mais das posições M15, V128, A111, H133, W138, T149, M197, N188, A209, A210, H405, T412, em que a SEQ ID N°: 7 é a amilase de referência; m) em que a alfa-amilase parente compreende a SEQ ID N°: 7, a eliminação ou substituição de um ou mais de um resíduo de cisteína (C363) ou um ou mais resíduos de metionina localizados em qualquer uma das posições M8, M9, M96, M200, M206, M284, M307, M311, M316 e M438 quando a SEQ ID N°: 2 é a amilase de referência; n) modificação de um ou mais resíduos de aminoácidos que correspondem a P17, D19, T21, N28, S51, G72, V74, A82, Q86, Q89, A93, G95, Q97, W115, D117, P123, S124, D125, N127, I130,G132, Q135, P145, G146, G148, S153,Y159, W166, S169, K171, R179, G180, I181, G182, K183, W187, P209, N224, S242, P245, G256, D269, N271, T278, N281, G302, A304, R308, T321, Q358, P378, S382, K383, T398, H405, T417, E418, P420, G421, P432, W437, G446, G454, S457, T459, T461, S464, G474 ou R483, em que a SEQ ID N°: 1 ou 2 é a amilase de referência; ou o) um conjunto de substituições de: a) Q97E, Q319E, Q358E, Q443E; b) Q97E, Q319R, Q358E, Q443R; c) Q97E, Q319R, Q358E; d) Q97E, Q319R, Q443E; e) Q97E, Q319R, Q443R; f) Q97E, Q358R; g) Q97E, Q443E; h) Q319R, Q358E, Q443E; ou i) Q319R, Q358R, Q443E.

[0010] Nas modalidades atualmente preferidas, a variante de alfa-amilase é uma variante S242A, S242D, S242E, S242F, S242G,S242H, S242L, S242M, S242N, S242Q ou S242T.

[0011] A variante de alfa-amilase é preferivelmente derivada de uma alfa-amilase parental semelhante à AmyS que compreende qualquer uma das SEQ ID Nos: 1, 2, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 15 ou 16. A alfa- amilase de referência usada para numeração dos resíduos de aminoá- cidos é preferivelmente a SEQ ID N°: 1 ou 2, em certas modalidades.

[0012] Em uma modalidade, a sequência de aminoácidos da variante é pelo menos 98% idêntica àquela de uma alfa-amilase parental semelhante à AmyS.

[0013] Também são fornecidos ácidos nucleicos, ou seja, polinu-cleotídeos, que compreendem uma sequência codificadora que codifica: a) uma sequência de aminoácidos das variantes aqui descritas; ou b) qualquer uma das SEQ ID Nos: 3, 4, 16, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30. Também são fornecidos vetores e células hospedeiras que compreendem os polinucleotídeos ou vetores.

[0014] Em várias modalidades, a célula hospedeira é um Bacillus subtilis, B. licheniformis, B. lentus, B. brevis, B. stearothermophilus, B. alkalophilus, B. amyloliquefaciens, B. coagulans, B. circulans, B. lau- tus, B. thuringiensis, Streptomyces lividans, S. murinus; Escherichia coli ou uma Pseudomonas spp.

[0015] Em outro aspecto, é aqui fornecida uma variante de uma alfa-amilase de Geobacillus stearothermophilus parente, em que a variante possui uma sequência de aminoácidos que possui pelo menos 95% de homologia para uma alfa-amilase de Geobacillus stearother- mophilus parente e compreende uma substituição de aminoácido 242, em que as posições de aminoácidos na sequência peptídica são numeradas em relação aa SEQ ID N°: 1 ou 2, e em que a variante possui atividades de alfa-amilase.

[0016] Em outro aspecto, são fornecidas composições que compreendem: a) uma variante de alfa-amilase como aqui fornecida, e b) pelo menos uma enzima adicional.

[0017] Em uma modalidade, a composição é uma que compreen de: a) pelo menos uma amilase variante que compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 95% idêntica àquela de uma alfa- amilase parental semelhante à AmyS, e que possui uma substituição em uma posição de aminoácido que corresponde à posição 242 de uma alfa-amilase de referência, a referida variante possuindo atividades detectáveis de alfa-amilase, e b) pelo menos uma enzima adicional.

[0018] A enzima adicional é preferivelmente uma fitase. A variante de alfa-amilase na composição é preferivelmente uma variante S242A, S242D, S242E, S242F, S242G, S242H, S242L, S242M, S242N,S242Q ou S242T.

[0019] Em uma modalidade, a variante de alfa-amilase ainda compreende uma modificação de sequência em uma ou mais posições de aminoácidos que correspondem às posições de aminoácidos 97, 179, 180, 193, 319, 349, 358, 416, 428 ou 443 da alfa-amilase de referên- cia. A variante de alfa-amilase também pode compreender uma ou mais das substituições nas posições da seguinte forma: uma cisteína em 349, uma cisteína em 428, um ácido glutâmico em 97, uma argini- na em 97, um ácido glutâmico em 319, uma arginina em 319, um ácido glutâmico em 358, uma arginina em 358, um ácido glutâmico em 443 ou uma arginina em 443.

[0020] Em uma modalidade, a variante de alfa-amilase compreende uma substituição de uma N193 ou uma V416 ou de ambas, por exemplo, uma substituição de N193F ou V416G, ou ambas.

[0021] A variante de alfa-amilase compreende eliminação dos aminoácidos 179 e 180 em outras modalidades. A composição, em uma modalidade, compreende uma variante de alfa-amilase possui pelo menos 95% de homologia para a SEQ ID N°: 2 e compreende uma substituição de aminoácido 242 em relação à numeração em uma alfa-amilase de referência que compreende a sequência de aminoáci- dos SEQ ID N°: 1. Como acima, a alfa-amilase parental semelhante à AmyS é preferivelmente a SEQ ID N°: 1, 2, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 15 ou 16.

[0022] Em um aspecto, a invenção está relacionada à hidrólise de um substrato de amido solúvel com o uso de atividades de alfa- amilase (AA) e uma enzima de hidrólise de fitato (FTU). Por exemplo, em que a proporção de AAU:FTU é de cerca de 1:15 a cerca de 15:1, preferivelmente de 1:10 a cerca de 10:1. Em uma modalidade, a proporção de AAU:FTU é de 1:4 a 3:1. Em uma modalidade adicional, a proporção de AAU:FTU é de 1:1. Em uma composição atualmente preferida, a fitase possui uma sequência que é a SEQ ID N°: 31.

[0023] Mais particularmente, são fornecidos métodos para o tratamento de um caldo de amido que compreende as etapas de: a) adição ao caldo de amido de pelo menos uma fitase e pelo menos uma alfa- amilase; em que a fitase e a alfa-amilase são adicionadas ao mesmo tempo ou aproximadamente ao mesmo tempo, ou separadamente em qualquer ordem, e em que a alfa-amilase é uma amilase variante que compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 95% idêntica àquela de uma alfa-amilase parental semelhante à AmyS, e que possui uma substituição em uma posição de aminoácido que corresponde à posição 242 de uma alfa-amilase de referência, a referida variante possuindo atividades detectáveis de alfa-amilase; e b) incubação do caldo de amido sob condições que permitem as atividades da fitase e da alfa-amilase.

[0024] A variante de alfa-amilase para uso no método é preferivelmente uma variante S242A, S242D, S242E, S242F, S242G, S242H, S242L, S242M, S242N, S242Q ou S242T. Em uma modalidade, a variante de alfa-amilase ainda compreende uma modificação de sequência em uma ou mais posições de aminoácidos que correspondem às posições de aminoácidos 97, 179, 180, 193, 319, 349, 358, 416, 428 ou 443 da alfa-amilase de referência. A variante de alfa- amilase pode compreender uma ou mais das substituições nas posições da seguinte forma: uma cisteína em 349, uma cisteína em 428, um ácido glutâmico em 97, uma arginina em 97, um ácido glutâmico em 319, uma arginina em 319, um ácido glutâmico em 358, uma argi- nina em 358, um ácido glutâmico em 443 ou uma arginina em 443. Em uma modalidade, a variante de alfa-amilase compreende uma substituição de uma N193 ou uma V416 ou de ambas, por exemplo, uma substituição de N193F ou V416G, ou ambas. A variante de alfa- amilase apresenta eliminação dos aminoácidos 179 e 180 em outras modalidades.

[0025] Em uma modalidade do método, a alfa-amilase parental semelhante à AmyS é a SEQ ID N°: 1, 2, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 15 ou 16.

[0026] A fitase pode ser adicionada antes ou depois da variante de alfa-amilase. O caldo de amido pode ser pré-incubado após adição da fitase, e antes da adição da variante de alfa-amilase. Em uma modalidade, a inclusão da fitase resulta em um aumento da termoestabilida- de da variante de alfa-amilase em relação a um método comparável que não inclui o contato do caldo de amido com fitase. Em uma modalidade do método, a fitase e a variante de alfa-amilase estão presentes em uma única mistura antes da adição do caldo de amido. Em outra, a fitase possui a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°: 31.

[0027] Em um aspecto adicional, esse está relacionado a um método para liquefação de amido em um caldo que compreende um substrato que inclui material de planta como, por exemplo, amido granular de um processo de moagem seca ou úmida, o método compreendendo uma etapa de liquefação primária e/ou secundária, o método compreendendo a adição ao caldo na etapa de liquefação primária e/ou secundária, em qualquer ordem, de uma combinação de pelo menos uma enzima de hidrólise de ácido fítico e pelo menos uma alfa- amilase, simultânea ou separadamente. O método pode ainda compreender a sacarificação do amido liquefeito para obter açúcares fer-mentáveis; e recuperação dos açúcares fermentáveis. Em algumas modalidades, o método ainda compreende a fermentação dos açúcares fermentáveis sob condições de fermentação adequadas para a obtenção de produtos finais como, por exemplo, álcool. Em algumas modalidades, a composição de enzima contém pelo menos uma alfa- amilase e uma fitase. Em algumas modalidades, a composição de enzima está em forma misturada. Em um aspecto adicional, esse está relacionado a um método para a fermentação de um substrato de amido, o método compreendendo a adição em qualquer ordem de uma combinação de uma alfa-amilase e uma fitase em uma dose única ou dividida. Em outro aspecto, o substrato de amido tratado é fermentado em etanol.

[0028] Em várias modalidades do método, a alfa-amilase de referência é a SEQ ID N°: 1 ou 2, e a variante de alfa-amilase é uma variante de alfa-amilase S242A, S242D, S242E, S242F, S242G, S242H, S242L, S242M, S242N, S242Q ou S242T.

[0029] Um outro aspecto consiste em um método de obtenção de um substrato fermentável por contato de um caldo de grãos triturados contendo amido granular com uma enzima de hidrólise de ácido fítico em uma temperatura de cerca de 0 a cerca de 30°C menos do que a temperatura de gelatinização do amido, contato do caldo com uma al- fa-amilase, elevação da temperatura acima da temperatura de gelatini- zação para o amido granular para permitir a gelatinização do amido, hidrólise do amido gelatinizado por contato do amido gelatinizado com a alfa-amilase por um tempo suficiente para hidrolisar o amido, e obtenção de um substrato fermentável. A enzima de hidrólise de ácido fítico pode ser uma fitase bacteriana ou fúngica. A fitase fúngica pode ser uma fitase de Aspergillus ou uma fitase de Buttiauxella. Em algumas modalidades, a fitase bacteriana é de Escherichia coli.

[0030] Dessa forma, são fornecidos métodos de produção de um substrato fermentável a partir de um caldo contendo amido que compreendem grãos triturados, o método compreende as etapas de: a) contato do caldo contendo amido com pelo menos uma fitase e pelo menos uma alfa-amilase em uma quantidade suficiente para produzir um substrato fermentável a partir do amido;

[0031] em que o contato com a fitase e a alfa-amilase é iniciado ao mesmo tempo ou aproximadamente ao mesmo tempo, ou separadamente em qualquer ordem, e em que a alfa-amilase é uma amilase variante que compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 95% idêntica àquela de uma alfa-amilase parental semelhante à AmyS, e que possui uma substituição em uma posição de aminoácido que corresponde à posição 242 de uma alfa-amilase de referência, a referida variante possuindo atividades detectáveis de alfa-amilase; e b) incubação do caldo de amido sob condições que permitem as atividades da fitase e da alfa-amilase por um tempo que permita a produção do substrato fermentável; em que, quando o contato com a fitase é iniciado antes da amilase, o caldo é incubado em uma temperatura que é 0-30°C menor do que a temperatura de gelatiniza- ção antes do contato do caldo com a amilase, quando então a temperatura é elevada acima da gelatinização por um tempo eficaz para hi- drolisar o amido.

[0032] Em uma modalidade, a alfa-amilase de referência é a SEQ ID N°: 1 ou 2, e a alfa-amilase parental semelhante à AmyS compreende qualquer uma das SEQ ID Nos: 1, 2, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 15 ou 16. A variante de alfa-amilase é preferivelmente uma variante de alfa- amilase S242A, S242D, S242E, S242F, S242G, S242H, S242L,S242M, S242N, S242Q ou S242T.

[0033] Em uma modalidade, o método compreende o uso de pelo menos uma enzima adicional que é uma fitase, celulase, protease, aminopeptidase, amilase, carboidrase, carboxipeptidase, catalase, qui- tinase, cutinase, ciclodextrina glucanotransferase, desoxirribonuclease, esterase, α-galactosidase, β-galactosidase, glicoamilase, α- glicosidase, β-glicosidase, haloperoxidase, invertase, isomerase, laca- se, lipase, manosidase, oxidase, pectinase, peptidoglutaminase, peroxidase, polifenoloxidase, nuclease, ribonuclease, transglutaminase, xilanase, pululanase, isoamilase, carragenase, ou uma combinação de duas ou mais das citadas anteriormente.

[0034] O método é preferivelmente parte de um processo para degradação do amido, liquefação, fermentação, produção de álcool, produção de adoçante, produção de um substrato fermentável, limpeza, lavagem, remoção de manchas ou processo de cozimento, ou similares.

[0035] Em outro aspecto, a invenção está relacionada a um processo para a produção de um açúcar fermentável, que compreende: (a) mistura do material contendo amido triturado com água e vinhaça fina, em que a vinhaça fina está na faixa de 10 a 70% v/v, e obtenção de um caldo que compreende amido e que possui um teor de sólidos secos (ds) de 20 a 50% p/p, (b) tratamento do caldo com uma fitase antes ou simultaneamente à liquefação do amido, (c) liquefação do amido, (d) adição de uma alfa-amilase ao amido durante a etapa (b) e/ou simultaneamente à etapa de liquefação, e (e) sacarificação do amido liquefeito para obter açúcares fermentáveis, em que o pH não é ajustado durante qualquer uma das etapas (a), (b), (c), (d) ou (e). Em algumas modalidades, o açúcar fermentável é recuperado e purificado ou isomerizado. Em outras modalidades, a fitase é adicionada antes da etapa de liquefação. Em modalidades adicionais, a alfa-amilase é adicionada com a fitase. Ainda em modalidades adicionais, uma segunda dose de alfa-amilase é adicionada durante a etapa de liquefação.

[0036] Também são aqui fornecidos métodos de tratamento de um material contendo amido ou um amido com uma amilase. Os métodos compreendem a etapa de contato do material contendo amido ou do amido com uma composição que compreende pelo menos uma variante de alfa-amilase aqui descrita sob condições suficientes para permitir atividades detectáveis da alfa-amilase; em que a amilase variante é qualquer variante aqui descrita; e em que o amido é pelo menos parcialmente degradado pela amilase variante. Em modalidades preferidas, a variante de alfa-amilase é uma alfa-amilase variante S242A, S242D, S242E, S242F, S242G, S242H, S242L, S242M, S242N, S242Q ou S242T. Os métodos são usados convenientemente como parte de um processo para degradação do amido, liquefação, fermentação, produção de álcool, produção de adoçante, produção de um substrato fer- mentável, limpeza, lavagem, remoção de manchas, ou processo de cozimento, ou similares.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0037] A figura 1 mostra o alinhamento de sequências de aminoá-cidos entre várias alfa-amilases parentes candidatas (amilases semelhantes à AmyS) para uso neste pedido. As posições que correspondem a qualquer posição de aminoácido (por exemplo, 1 a 520) da ami- lase de Geobacillus stearothermophilus (SEQ ID N°: 1) podem ser facilmente determinadas. SEQ ID N°: 1, alfa- amilase de G. stearothermophilus "BSG"; SEQ ID N°: 2, amilase truncada de G. stearothermophilus (AmyS, SPEZYME XTRA); SEQ ID N°: 3, G. stearothermophilus (amilase variante S242A); SEQ ID N°: 4, G. stearothermophilus (amilase variante S242Q); SEQ ID N°: 5, G. stearothermophilus (amilase variante S242E); SEQ ID N°: 6, amilase Yamane 707; SEQ ID N°: 7, amilase madura LAT; SEQ ID N°: 8, amilase do tipo selvagem de Bacillus licheniformis [TERMAMYL (NOVOZYMES) = SEQ ID N°: 8 em WO 02/10355A2]; SEQ ID N°: 9, amilase de B. amyloliquefaciens, BAN; SEQ ID N°: 10, STAINZYME = AA560 que é a SEQ ID N°: 2 em WO 0060060 ou SEQ ID N°: 24 em U.S. 6.528.298; SEQ ID N°: 11, amilase de B. halmapalus (NATALASE); SEQ ID N°: 12, KSM-1378 (KAO CORP., SEQ ID N°: 3 em EP 1199356); SEQ ID N°: 13, Bacillus spp. KSM-K38 (KAO CORP., SEQ ID N°: 4 em U.S. 6.403.355 B1); SEQ ID N°: 14, Bacillus spp. KSM-K36 (KAO CORP., SEQ ID N°: 2 em U.S. 6,403,355 B1); SEQ ID N°: 15, LIQUOZYME SC (NOVOZYMES); SEQ ID N°: 16, Sequência de Consenso de Alfa-Amilase Parente Ns1;

[0038] A figura 2 mostra o plasmídeo pHPLT-AmyS.

[0039] A figura 3 mostra o percentual de atividades residuais de variantes S242 após estresse por aquecimento a 95°C por 30 minutos. Um controle positivo, G. stearothermophilus com Δ179-180 com o terminal C truncado por 29 aminoácidos (ou seja, SEQ ID N°: 2), também é mostrado. As linhas indicam 2x e 3x acima do desvio padrão do percentual de atividades residuais da enzima do tipo selvagem. S242A e S242Q mostram nitidamente atividades residuais maiores do que o tipo selvagem.

[0040] Figura 4: os painéis A, B, C, D, E, F, G, H e I mostram alinhamentos pareados e sequências de consenso para várias sequências da figura 1, e apresenta, respectivamente, Sequências de consenso 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 9 e 10, ou SEQ ID Nos: 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 e 30, respectivamente.

[0041] A figura 5 mostra as curvas de fusão térmica e os pontos de fusão para as amilases do tipo selvagem e variantes sem cálcio adicionado.

[0042] A figura 6 mostra as curvas de fusão térmica e os pontos de fusão na presença de 2 mM de cálcio adicionado para as amilases do tipo selvagem e variantes.

[0043] A figura 7 mostra o perfil de atividades a 4, 10 e 20 minutos para Spezyme Xtra e duas variantes, em relação à Liquozyme SC.

[0044] A figura 8 mostra o perfil de atividades de quatro variants em relação à variante S242Q para três pontos do tempo.

[0045] A figura 9 mostra a redução da viscosidade de farinha de milho em função da ação das alfa-amilases Liquozyme SC, Spezyme Ethyl ou Spezyme Xtra em uma dose de 30 μg.

[0046] A figura 10 mostra a redução da viscosidade de farinha de milho em função da ação das alfa-amilases Liquozyme SC ou Spezyme Xtra, ou uma de duas variantes (S242A e S242Q) em uma dose de 30 μg.

[0047] A figura 11 mostra a redução da viscosidade de farinha de milho em função da ação da alfa-amilase Liquozyme SC ou Spezyme Xtra, ou uma de duas variantes (S242A e S242Q) em uma dose de 20 μg.

[0048] A figura 12 mostra a progressão de Equivalentes de Dextrose (DE) de milho inteiro triturado tratado com Liquozyme SC, Spezyme Xtra, ou uma de duas variantes (S242A e S242Q) ao longo do tempo (0, 30, 60 e 90 minutos). As dosagens de enzimas de liquefação pré- e pós-jato estão indicadas como "X + Y" em que: X e Y representam o número de unidades de enzima adicionadas antes e depois do jato, respectivamente.

[0049] A figura 13 mostra a viscosidade pós-jato de milho inteiro triturado tratado com Liquozyme SC, Spezyme Xtra, ou uma de duas variantes (S242A e S242Q) ao longo do tempo (0, 30, 60 e 90 minutos). X e Y são como na figura 12.

[0050] A figura 14 mostra a progressão de DE de milho inteiro triturado tratado com fitase e uma amilase (Spezyme Xtra ou variante S242Q) ao longo do tempo (0, 30, 60 e 90 minutos). MAXALIQ é uma mistura de fitase/amilase disponível por Genencor, uma Danisco Division. O efeito da fitase foi observado durante liquefação primária usando 242Q AA em processo de liquefação com pH baixo (5,2) de milho inteiro triturado, 32% de ds. de milho contendo 30% de vinhaça fina, sem pré-tratamento contínuo (jet cooking). É feita referência ao Exemplo 8.

[0051] A figura 15 mostra a viscosidade pós-jato de milho inteiro triturado tratado com fitase e amilase (por exemplo, Spezyme Xtra ou variante S242Q) ao longo do tempo (0, 30, 60 e 90 minutos). As condições foram como na figura 14. É feita referência ao Exemplo 8.

[0052] A figura 16 mostra a progressão de DE de milho inteiro triturado tratado com a variante S242Q e fitase. As condições incluíram: 32% de milho inteiro triturado contendo 30% de vinhaça fina, pH 5,2. Durante pré-incubação de 30 minutos, fitase BP-17 foi adicionada em 0 (controle), 1, 2, 4, 6, 9 e 12 FTU, seguida por liquefação primária. Enzimas usadas durante a liquefação primária: 242Q 4 AAU/g ds mi- lho, o tempo de incubação foi de 45 minutos a 70°C. A liquefação secundária foi a 90°C por 90 min. É feita referência ao Exemplo 9.

[0053] A figura 17 mostra a viscosidade pós-jato de milho inteiro triturado tratado com a variante S242Q e fitase. Foram observados os efeitos da remoção de fitato sobre a redução da viscosidade de liquefação descontínua de milho inteiro triturado a 90°C, pH 5,2. A pré- incubação com fitase ocorreu como na Fig. 16. É feita referência ao Exemplo 9.

[0054] A figura 18 mostra o efeito do tratamento com fitase de milho inteiro triturado sobre o aumento na termoestabilidade e estabilidade em pH baixo da variante S242Q. Foram observados os efeitos do pH baixo sobre o processo de liquefação de milho inteiro triturado, 32% de ds. de milho contendo 30% de vinhaça fina. Triângulos, pH 5,2; quadrados, pH 4,8; diamantes, pH 4,5; e círculos, pH 4,2. É feita referência ao Exemplo 9.

[0055] A figura 19 mostra o efeito da adição de fitase durante liquefação primária de milho inteiro triturado sobre a redução da viscosidade após pré-tratamento contínuo. As condições foram como na figura 18. Branco, pH 5,2; preto, pH 4,8; pontilhado, pH 4,5; e tracejado, pH 4,2. É feita referência ao Exemplo 9.

[0056] A figura 20 é um gráfico que mostra os efeitos da concen tração de BP-17 durante liquefação primária de milho inteiro triturado, pH 5,2, pela variante S242Q AA (4AAU/gds de milho) sobre a taxa de progressão de DE a 90°C. As taxas de progressão de DE (quadrados) e o percentual de redução de ácido fítico como IP6 (diamantes) foram medidas.

[0057] A figura 21 é um gráfico que mostra o efeito da variante de alfa-amilase S242Q sobre a progressão de DE sob condições de pro-cessamento convencionais. Observação dos efeitos do pH sobre o de-sempenho de S242Q na liquefação com pré-tratamento contínuo (32% DS, 30% de vinhaça fina, caldo 10 min a 85°C + jato a 107°C + tempo de residência de 3 min + liquefação secundária em batelada de 90 min a 85°C). Quadrados, pH 5,8; diamantes, pH 5,5. É feita referência ao Exemplo 8.

[0058] A figura 22 é um gráfico que descreve o desempenho de S242Q (círculos preenchidos) e suas variantes (círculos abertos), como uma função da carga, no ensaio microswatch de fécula de arroz sob condições de lavagem norte-americanas usando biblioteca combinatória de carga de S242Q, limpeza de microswatch de fécula de arroz em Tide 2x, a 20°C. É feita referência ao Exemplo 16.

[0059] A figura 23 é um gráfico que descreve o desempenho de uma amilase truncada de Bacillus sp. TS-23 (círculos fechados) com as seguintes mutações: Q98R, M201L, S243Q R309A, Q320R Q359E e K444E, e suas variantes de carga (círculos abertos) (veja o Pedido de Patente U.S. co-pendente N° PCT/US2008/007103, depositado em 6 de junho de 2008) no ensaio microswatch de fécula de arroz como uma função da carga sob condições de lavagem da Europa Ocidental com a biblioteca combinatória de carga de TS23t, limpeza de microswatch de fécula de arroz em Persil a 40°C. É feita referência ao Exemplo 16.

[0060] A figura 24 é um gráfico que descreve o desempenho de S242Q (círculos fechados) e suas variantes (círculos abertos) no ensaio de BODIPY-amido como uma função da carga. Biblioteca combinatória de carga de S242Q (CCL), atividades específicas em BODIPY- amido, condições de ensaio padronizadas. É feita referência ao Exemplo 16.

[0061] A figura 25A é um gráfico que descreve a hidrólise relative de BODIPY-amido como uma função da expressão relativa em tubo de agitação (ou seja, hidrólise relativa de BODIPY-amido vs. expressão relativa em tubo de agitação). A figura 25B é um gráfico que descreve a hidrólise relativa de microswatch de amido como uma função da expressão relativa em tubo de agitação (ou seja, hidrólise relativa de microswatch de amido vs. expressão relativa em tubo de agitação). É feita referência ao Exemplo 19.

[0062] A figura 26A é um gráfico que descreve a expressão relati va em tubo de agitação como uma função da carga. A figura 26B é um gráfico que descreve a hidrólise relativa de BODIPY-amido como uma função da carga. É feita referência ao Exemplo 19.

[0063] A figura 27A é um gráfico que descreve a expressão relativa em tubo de agitação como uma função da carga. A figura 27B é um gráfico que descreve as atividades de limpeza relativa de microswatch como uma função da carga. É feita referência ao Exemplo 19.

DESCRIÇÃODESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO 1. Definições e abreviações

[0064] De acordo com esta invenção, as seguintes abreviações e definições se aplicam. Deve-se observar que, como aqui usadas, as formas no singular "um", "uma", "o" e "a" incluem os referentes no plural, a menos que o contexto indique claramente de forma diferente. Dessa forma, por exemplo, referência a um "polipeptídeo" inclui vários desses polipeptídeos e referência à "formulação" inclui referência a uma ou mais formulações e equivalentes destas conhecidas por aqueles versados na técnica, e assim por diante.

[0065] A menos que definido de forma diferente, todos os termos técnicos e científicos aqui usados possuem os mesmos significados comumente entendidos por aqueles versados na técnica. Os seguintes termos são fornecidos abaixo.

Abreviações

[0066] As seguintes abreviações se aplicam, a menos que indica do de forma diferente: AATCC "American Association of Textile Chemists and Colorists" (Associação Americana de Químicos e Coloristas Têxteis); ADW lavagem de louça automática; AE álcool etoxilato; AEO álcool etoxilato; AEOS álcool etóxi-sulfato; AES álcool etóxi-sulfato; AFAU unidades de alfa-amilase fúngica ácida; AGU unidades de atividades de glicoamilase; AOS α-olefinsulfonato; AS álcool sulfato; BAA alfa-amilase bacteriana; °C graus centígrados; CCL biblioteca combinatória de carga; cDNA DNA complementar; CMC carboximetilcelulose; dE diferença de cor total, como definida pelo espaço de cor CIE-LAB; dH2O água deionizada; dIH2O água deionizada, filtração Milli-Q; DE Equivalente de Dextrose; DNA ácido desoxirribonucleico; dNTP trifosfatos de desoxirribonucleotídeo; DO oxigênio dissolvido; DP3 grau de polimerização com três subunidades; DPn grau de polimerização com n subunidades; DS (ou ds) teor de sólidos secos; DSC calorimetria por varredura diferencial; DTMPA ácido dietiltriaminapenta-acético; EC comissão de enzimas para classificação de enzima; EDTA ácido etilenodiaminatetra-acético; EDTMPA ácido etilenodiaminatetrametileno fosfônico; EO óxido de etileno; eq ETOH equivalentes; etanol; F&HC cuidados de tecidos e domésticos; FTU unidades de "fitase", unidade de hidrólise de fitato; g GAU gramas; unidade de glicoamilase; gpg g/l grãos por galão; gramas por litro; Genencor Danisco U.S. Inc, Genencor Division, Palo Alto, CA; H2O água; HDG detergente granular de limpeza pesada; HDL detergente líquido de limpeza pesada; HFCS xarope de milho rico em frutose; HFSS xarope à base de amido rico em frutose; HPAEC-PAD cromatografia por troca aniônica de alto desempe nho com detecção amperimétrica pulsada; h hora/horas; IKA ton, NC; IKA Works Inc. 2635 North Chase Parkway SE, Wilming- IPTG isopropil β-D-tiogalactosideo; JPN Japão; kg LA quilogramas; Ágar de Luria; LAS alquilbenezenossulfonato linear; LB Caldo de Luria; LU unidades de lipase; M molar; Meio MBD meio definido à base de MOPS; MES ácido 2-(N-morfolino)etanossulfônico; mg min miligramas; minuto/minutos; ml mililitros; mm milímetros; mM milimolar; MOPS ácido 3-(N-Morfolino)-propanossulfônico; MW peso molecular; NA América do Norte; Ncm centímetro de Newton; NEO neomicina; ng nanograma; nm nanômetro; NOBS nonanoiloxibenzenossulfonato; N Normal; NTA ácido nitrilotriacético; PAHBAH hidrazida de ácido p-hidroxibenzóico; PCR reação em cadeia de polimerase; PEG polietilenoglicol; pI ponto isoelétrico; ppm PVA partes por milhão; poli(álcool vinílico); PVP poli(vinilpirrolidona); RAU Unidades de Amilase de Referência; RMS média quadrática; RNA ácido ribonucleico; rpm SAPU revoluções por minuto; unidade espectrofotométricas de protease ácida; SAS alcano sulfonatos secundários; 1X SSC 0,15 M de NaCl, 0,015 M de citrato de sódio, pH 7,0; s segundos; % de SRI índice percentual de remoção de manchas; SSF sacarificação e fermentação simultâneas; TAED tetra-acetil-etileno-diamina; Tf centro térmico para uma curva DSC, ou temperatura de fusão de uma proteína; TNBS ácido trinitrobenzenossulfônico; μg microgramas; μl microlitres; μNm metros de microNewton; μm micrômetro; μM micromolar; U unidades; V/V volume por volume; WE Europa Ocidental; p% percentual em peso; p/v peso/volume; p/p peso/peso; wt do tipo selvagem.

1.2. Definições

[0067] Em alguns aspectos, a presente descriçãodescrição se ba seia em técnicas e métodos de rotina usados no campo da engenharia genética e biologia molecular. As fontes seguintes incluem descrições de metodologia geral útil de acordo com o que é aqui descritodescrito: Sambrook et al., "MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL" (2a Edição, 1989); Kreigler, "GENE TRANSFER AND EXPRESSION; A LABORATORY MANUAL" (1990) e Ausubel et al., Eds. "CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY" (1994).

[0068] Essas referências gerais fornecem definições e métodos conhecidos por aqueles versados na técnica. A menos que aqui defini- do de forma diferente, todos os termos técnicos e científicos aqui usados possuem o mesmo significado que comumente entendido por aqueles versados na técnica à qual esta descrição pertence. Singleton, et al., "DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY", 2a Edição, John Wiley e Sons, Nova York (1994) e Hale & Markham, "THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY", Harper Perennial, NY (1991) dão àqueles versados na técnica dicionários gerais de muitos dos termos usados nesta descrição.

[0069] O termo "isolado" significa que a substância isolada, por exemplo, um composto ou uma sequência, é modificada pela mão do homem em relação àquele composto ou sequência encontrada na na-tureza. Por exemplo, uma sequência isolada é pelo menos parcialmente livre, ou até mesmo substancialmente livre, de pelo menos outro componente com o qual a sequência está naturalmente associada como encontrada na natureza.

[0070] O termo "purificado", quando usado para descrever um material ou substância, significa que o material ou a substância está em um estado relativamente puro, por exemplo, pelo menos cerca de 90% puro, pelo menos cerca de 95% puro, pelo menos cerca de 98% puro, ou pelo menos cerca de 99% puro.

[0071] Como aqui usado, "amido" refere-se a qualquer composição de carboidrato que compreenda polissacarídeos complexos, com-preendendo amilose e/ou amilopectina com a fórmula (C6H10O5)x, em que "X" pode ser qualquer número. De preferência, amido refere-se a qualquer carboidrato desse tipo que esteja naturalmente presente em plantas, incluindo, sem limitação, grãos, gramas, tubérculos e raízes e, mais especificamente, de trigo, cevada, milho, centeio, arroz, sorgo, mandioca, painço, batata, batata doce e tapioca. Amido também pode se referir aos amidos sintéticos ou aos amidos modificados, por exemplo, amido modificado quimicamente para uso como um substrato de- tectável para ensaios de enzima, ou amidos modificados química ou enzimaticamente para melhorar uma ou mais propriedades para uso.

[0072] Como aqui usado, "ácido fítico" (ou hexaquisfosfato de inositol (IP6)) é a principal forma de armazenamento de fósforo em muitos tecidos de planta, por exemplo, farelo, sementes, e similares. O ácido fítico também é aqui denominado "fitato", especialmente quando na forma de sal. Vários outros fosfatos de inositol como, por exemplo, penta- (IP5), tetra- (IP4) e trifosfato (IP3) de inositol, também são aqui denominados fitatos. Fitatos são geralmente indigeríveis pelo homem e pela maioria dos animais monogástricos.

[0073] As enzimas que degradam fitatos são aqui denominadas "fitases", e são geralmente mioinositol-hexafosfato fosfohidrolases. As atividades de fitase são definidas como unidades de fitase (FTU ou U), em que uma FTU é definida como a quantidade de enzima que libera 1 micromol de P inorgânico por minuto a partir de 0,0015 mol/l de fitato de sódio em pH 5,5, e a 37°C. Essa definição fornece uma medida útil da quantidade de atividades de fitase e representa uma medida de comparação simples. Enzimas de degradação de fitase de leveduras (por exemplo, Schwanniomyces occidentalis, Pichia anomala, Arxula adeninivorans), bactérias gram-negativas (por exemplo, Escherichia coli, Pseudomonas spp., Klebsiella spp.) e gram-positivas (por exemplo, Bacillus spp.) foram identificadas e caracterizadas. Fitases de muitas plantas, e de fungos filamentosos como, por exemplo, Penicillium spp., Aspergillus spp., Trichoderma spp. Mucor piriformis e Cladospo- rium spp., também são conhecidas. 3-fitases (EC 3.1.3.8) e 6-fitases (EC 3.1.3.26), dependendo do local de iniciação da hidrólise, foram caracterizadas. Além disso, fitases foram caracterizadas com base em seu pH "ótimo", como ácidas (pH ótimo em torno de 5) ou alcalinas (pH ótimo em torno de 9). Diversas fitases comerciais estão disponíveis, incluindo ROVABIO (Genencor International).

[0074] "Amilase" refere-se a uma enzima que é capaz de catalisar a clivagem de um substrato de amido, levando a uma degradação ou degradação parcial do amido. As amilases são geralmente hidrolases que clivam ligações glicosídicas em amido. Como aqui usado, o termo "amilase" inclui qualquer glicoamilase, alfa-amilase, β-amilase, por exemplo, as alfa-amilases do tipo selvagem de Bacillus spp., especi-almente B. licheniformis. Geralmente, alfa-amilases (EC 3.2.1.1; α-D- (1^4)-glucano glucano-hidrolase) são enzimas de atuação endo definidas como que clivam ligações α-D-(1^4) O-glicosídicas dentro da molécula de amido de forma aleatória. Em contraste, as enzimas ami- lolíticas de atuação exo, por exemplo, β-amilases (EC 3.2.1.2; α-D- (1^4)-glucano maltohidrolase) e algumas amilases produto- específicas como alfa-amilase maltogêncca (EC 3.2.1.133), clivam o molécula de amido de substrato da extremidade não redutora. β-Amilases, α-glicosidases (EC 3.2.1.20; α-D-glucosida glicohidrolase), glicoamilase (EC 3.2.1.3; α-D-(1^4)-glucano glicohidrolase) e amila- ses produto-específicas podem produzir malto-oligossacarídeos de comprimento específico a partir de amido. Alfa-amilase do tipo selvagem de Bacillus stearothermophilus ou amilase "AmyS" algumas vezes é aqui denominada XTRA ou SPEZYME XTRA, que são produtos comerciais de AmyS de Genencor International.

[0075] Como aqui usadas, "alfa-amilases semelhantes à AmyS" são úteis como amilases parentes neste pedido. Alfa-amilases seme-lhantes à AmyS constituem uma classe de alfa-amilases neste pedido, com base na homologia substancial encontrada entre elas. O termo "alfa-amilase semelhante à AmyS" visa indicar a classe de alfa- amilases, em particular alfa-amilases de Bacillus, especialmente alfa- amilases de Geobacillus stearothermophilus, que, no nível de aminoá- cido, exibem uma identidade substancial para a alfa-amilase que possui a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID N°: 2, neste pe- dido. Spezyme Xtra está disponível comercialmente por Danisco U.S. Inc., Genencor Division. Geobacillus stearothermophilus era denominado as Bacillus stearothermophilus na literatura e as duas denominações podem ser aqui usadas de forma intercambiável. Todas as alfa- amilases que possuem as sequências de aminoácidos aqui fornecidas como SEQ ID Nos: 1, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 15 e 16, respectivamente, são consideradas como sendo alfa-amilases semelhantes à AmyS e, dessa forma, são adequadas como alfa-amilases parentes. Alfa- amilases semelhantes à AmyS também incluem alfa-amilases: i) que possuem sequências de aminoácidos com pelo menos 60% de homo- logia (identidade), por exemplo, pelo menos 70%, pelo menos 75%, ou pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% de identidade, com pelo menos uma das sequências de aminoácidos mostrada nas SEQ ID Nos: 1, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 15 e 16, e/ou ii) que são codificadas por uma sequência de DNA que hibri- diza com uma sequência de DNA que codifica qualquer uma das alfa- amilases especificadas acima, ou aquelas evidentes a partir das SEQ ID Nos: 9 (BAN), 5 (BSG), 3 (SP722), 1 (SP690), 7 (LAT), 11 (AA560) de WO 06/002643 ou da presente especificação, que codificam qualquer uma das sequências de aminoácidos mostradas nas SEQ ID Nos: 1, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 15 e 16 neste pedido, respectivamente. Ainda, alfa-amilases homólogas adicionais úteis como alfa-amilases semelhantes à AmyS e, dessa forma, como enzimas parentes para a produção de variantes neste pedido, incluem a alfa-amilase produzida pela cepa de B. licheniformis descrita em EP 0252666. (ATCC 27811) e a alfa-amilases identificada em WO 91/00353 e WO 94/18314. Alfa- amilases semelhantes à AmyS comerciais estão compreendidas nos produtos vendidos sob os seguintes nomes comerciais: Spezyme® AA e ULTRAPHLOW (disponíveis por Danisco U.S. Inc., Genencor Divisi on), e Keistase® (disponível por Daiwa) e LIQUEZYME SC (disponível por Novozymes, Dinamarca). A Seção 1.5 deste pedido abaixo fornece informações adicionais em relação à alfa-amilases semelhantes à AmyS. A Tabela A fornece uma lista de várias alfa-amilases semelhantes à AmyS úteis, bem como um método conveniente de comparação de identidades de sequência de aminoácidos entre elas. Aqueles versados na técnica observarão que podem ser construídas tabelas similares para outras alfa-amilases para determinar sua adequabilidade para uso neste pedido como enzima aparente.

[0076] Como aqui usado, "unidade espectrofotométrica de protease ácida" ("SAPU") é uma unidade de atividade de enzima protease, em que 1 SAPU é a quantidade de atividade de enzima protease que libera um micromol de tirosina por minuto de um substrato de caseína sob condições do ensaio.

[0077] "Unidade de glicoamilase" ("GAU") é uma medida de atividade amiolítica definida como a quantidade de atividade enzima que produzirá 1 g de açúcar redutor, calculado como glicose, por hora de um substrato de amido solúvel em pH 4,2 e 60°C.

[0078] Como aqui usado, o termo "variante" pode ser usado de forma intercambiável com o termo "mutante". "Variantes" também podem se referir a polipeptídeos ou ácidos nucleicos. Variantes incluem uma ou mais "modificações" de sequência, que, como aqui usadas, incluem substituições, inserções, eliminações, truncamentos, transver- sões e/ou inversões, em uma ou mais localizações em relação a uma sequência de referência. Cada modificação pode incluir alterações que resultam em uma mudança de um ou mais resíduos de aminoácidos ou nucleotídeos em uma sequência, em relação à sequência de referência. Ácidos nucleicos variantes incluem sequências que são complementares às sequências que são capazes de hibridizar para as sequências de nucleotídeos aqui apresentadas. Por exemplo, uma se- quência de ácidos nucleicos variante aqui apresentada pode ser pelo menos parcialmente complementar a uma sequência capaz de hibridi- zar sob condições estringentes (por exemplo, 50°C e 0,2X SSC {1X SSC = NaCl a 0,15 M, citrato de sódio a 0,015 M, pH 7,0}) para as sequências de nucleotídeos aqui apresentadas. Mais preferivelmente, o termo "variante" engloba sequências que são complementares às sequências que são capazes de hibridizar sob condições altamente es- tringentes (por exemplo, 65°C e 0,1X SSC) para as sequências de nu- cleotídeos aqui apresentadas.

[0079] O termo "termoestável" quando usado para descrever uma enzima significa que a enzima é mais termoestável do que uma enzima de referência. No presente pedido, uma variante de alfa-amilase é mais termoestável do que uma alfa-amilase de B. licheniformis do tipo selvagem se a variante possui uma atividade enzimática relativamente maior após um intervalo de tempo específico sob as mesmas condições experimentais, por exemplo, a mesma temperatura, concentração de substrato etc. Alternativamente, uma enzima mais termoestável possui uma capacidade de aquecimento maior determinada por calorimetria por varredura diferencial, comparada com uma enzima de referência.

[0080] "Temperatura de fusão" (Tf) de um polipeptídeo é uma temperatura na qual a conformação do polipeptídeo passa por uma alteração mensurável dependente da temperatura. A conformação da proteína e a Tf podem ser analisadas, por exemplo, por dicroísmo circular, uma das ferramentas mais gerais e básicas para estudar o enovelamento de proteína. A espectroscopia do dicroísmo circular mede a absorção da luz circularmente polarizada. Nas proteínas, estruturas como, por exemplo, alfa hélices e lâminas beta são geralmente quirais e, dessa forma, absorvem a luz circularmente polarizada. A absorção de luz fornece uma medida do grau de enovelamento da proteína. As alterações nessa absorção como uma função da temperatura ou con-centração de um desnaturante podem ser usadas para estudar o de- senovelamento de equilíbrio da proteína. Esse tipo de espectroscopia também pode ser combinado com dispositivos como, por exemplo, misturadores de fluxo interrompido, para medir a cinética de enovela- mento/desenovelamento de proteína.

[0081] "Dependente de cálcio" significa que uma enzima em particular exige cálcio para exibir substancialmente atividade catalítica. Ge-ralmente, como aqui usado, o termo "dependente de cálcio" engloba uma propriedade de qualquer enzima que possui uma necessidade estrita de um íon metálico divalente para exibir atividade catalítica, e também inclui enzimas cuja atividade catalítica é substancialmente (por exemplo, mais do que 20%) aumentada na presença de cálcio ou de outro cátion divalente.

[0082] Como aqui usado, o termo "pH estável", com relação a uma enzima, pode se referir à atividade da enzima ou à conformação de proteína da enzima. No primeiro sentido, "pH estável" significa que a enzima permanece cataliticamente ativa em um pH especificado ou ao longo de uma faixa especificada de pHs. No Segundo sentido, uma enzima pode ser considerada "estável" em um pH no qual a proteína não é desnaturada irreversivelmente. Nesse caso, a enzima se tornaria cataliticamente ativa quando retornada a um pH capaz de apoiar a atividade catalítica. A estabilidade do pH também pode ser usada de uma forma relativa ou comparativa, por exemplo, com uma enzima de referência. No presente pedido, uma variante de alfa-amilase pode ser mais pH-estável do que uma alfa-amilase de B. licheniformis do tipo selvagem quando a variante possui uma atividade relativamente maior do que a do tipo selvagem, por exemplo, quando mantida em certo pH ou testada sob as mesmas condições, incluindo pH. Os pHs de maior interesse são tipicamente as condições do uso real, ou pHs que estão nos limites ou próximos a ele, ou nos extremos da habilidade natural da enzima para permanecer cataliticamente ativa.

[0083] O termo "faixa de pH" significa uma gama de valores de pH, por exemplo, do mais ácido ao mais básico, ou vice-versa. Com relação a uma atividade enzimática, uma faixa de pH indica os valores de pH superiores e inferiores nos quais a enzima exibe um nível especificado de atividade, por exemplo, uma atividade mínima, uma percentagem especificada da atividade máxima, ou um nível especificado de conversão de substrato ou formação de produto.

[0084] O termo "recombinante", quando usado em referência a uma célula, um ácido nucleico, uma proteína ou um vetor, indica que a célula, o ácido nucleico, a proteína ou o vetor é o resultado ou foi mo-dificado pela introdução de uma sequência heteróloga ou pela alteração de uma sequência nativa, ou que a célula é derivada de uma célula assim modificada ou alterada. Dessa forma, por exemplo, células recombinantes podem expressar genes que não são encontrados na forma nativa (não recombinante) da célula, ou podem expressar genes nativos que são, de outro modo, expressos diferentemente (por exemplo, subexpressos ou hiper-expressos), expressos anormalmente, ou não são expressos de forma alguma.

[0085] Como aqui usado, o termo "sequência de nucleotídeos" ou "sequência de ácidos nucleicos" refere-se a qualquer sequência de dois ou mais nucleotídeos, ribonucleotídeos, ou similares, ou derivados destes. Sequências de nucleotídeos incluem sequências de oligo- nucleotídeos e polinucleotídeos, bem como variantes, homólogos, fragmentos e derivados destes. Uma sequência de nucleotídeos pode ser de fita simples, dupla ou múltipla. A sequência de nucleotídeos pode ser de qualquer fonte ou origem, por exemplo, genômica, sintética ou recombinante, e inclui DNA genômico, cDNA, DNA sintético e RNA, e similares, bem como híbridos destes. Sequências de nucleotídeos po- dem compreender um ou mais códons e podem codificar um ou mais polipeptídeos. As sequências de nucleotídeos podem preferencialmente assumir uma ou mais estruturas tridimensionais energeticamente preferidas.

[0086] Um "vetor" refere-se a uma sequência de nucleotídeos fre quentemente útil para uso experimental in vitro, ou para introdução de ácidos nucleicos em um ou mais tipos de células. Vetores incluem vetores de clonagem, vetores de expressão in vivo ou in vitro, vetores shuttle, plasmídeos, fagomídeos, cosmídeos, partículas de fago, cassetes, e similares.

[0087] O termo "vetor de expressão", como aqui usado, significa um construto de DNA que compreende uma sequência de DNA que está ligada operacionalmente a uma sequência de controle adequada capaz de efetuar a expressão do DNA em um hospedeiro adequado. Essas sequências de controle podem incluir um promotor para efetuar a transcrição, uma sequência operadora opcional para controlar a transcrição, uma sequência que codifica sítios de ligação de ribossomo adequados no mRNA, intensificadores e sequências que controlam a terminação da transcrição e da tradução.

[0088] Um polinucleotídeo ou um polipeptídeo que possui certo percentual (por exemplo, pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95% ou 99%) de identidade de sequência com outra sequência significa que, quando alinhadas, aquela percentagem de bases ou resíduos de aminoácidos é a mesma na comparação das duas sequências. Esse alinhamento e o percentual de homologia ou de identidade podem ser determinados com o uso de qualquer programa de computador adequado conhecido na técnica, por exemplo, aqueles descritos em "CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY" (F. M. Ausubel et al. ( ds) 1987, Suplemento 30, seção 7.7.18). Esses programas podem incluir o programa GCG Pileup, FASTA (Pearson et al. (1988) Proc. Natl, Acad. Sci USA 85: 2.444-2.448) e BLAST (BLAST Manual, Altschul et al., Natl Cent. Biotechnol. Inf., Natl Lib. Med. (NCIB NLM NIH), Bethesda, Md., e Altschul et al., (1997) NAR 25: 3.389-3.402). Outro programa de alinhamento é ALIGN Plus (Scientific and Educational Software, PA), com o uso dos parâmetros padronizados. Outro programa de computador de sequências que tem utilidade é programa "TFASTA Data Searching", disponível em "Sequence Software Package" Versão 6.0 (Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, WI).

[0089] Aqueles versados na técnica reconhecerão que as sequências englobadas pela invenção também são definidas pela capacidade de hibridizar sob condições de hibridização estringentes com a sequência de amyS exemplificada (por exemplo, SEQ ID N°: 5 de WO 06/002643). Um ácido nucleico é hibridizável para outra sequência de ácidos nucleicos quando uma forma de fita simples do ácido nucleico pode anelar para o outro ácido nucleico sob condições apropriadas de temperatura e potência iônica da solução. As condições de hibridiza- ção e de lavagem são bem-conhecidas na técnica (veja, por exemplo, Sambrook (1989) supra, particularmente os capítulos 9 e 11). Em algumas modalidades, as condições estringentes correspondem a uma Tf de 65°C e 0,1 x SSC, SDS 0,1%.

[0090] Um "gene" refere-se a um segmento de DNA que está envolvido na produção de um polipeptídeo e inclui regiões que precedem e após as regiões codificadoras, bem como sequências intervenientes (íntrons) entre segmentos codificadores individuais (éxons).

[0091] O termo "heterólogo", com referência a um polinucleotídeo ou a uma proteína, refere-se a um polinucleotídeo ou a uma proteína que não ocorre naturalmente em uma célula hospedeira. Em algumas modalidades, a proteína é uma proteína industrial comercialmente im-portante. Deseja-se que o termo englobe proteínas que são codifica- das por genes de ocorrência natural, genes mutados e ácidos nuclei- cos que codificam proteínas heterólogas como, por exemplo, proteínas de fusão e/ou genes sintéticos.

[0092] O termo "endógeno", com referência a um polinucleotídeo ou a uma proteína, refere-se a um polinucleotídeo ou a uma proteína que ocorre naturalmente na célula hospedeira.

[0093] Como aqui usado, os termos "transformada", "transformada estavelmente" e "transgênica", usados em referência a uma célula, significa que a célula compreende pelo menos uma sequência de ácidos nucleicos não nativa (por exemplo, heteróloga). Uma célula transformada estavelmente compreende pelo menos uma sequência de ácidos nucleicos desse tipo integrada em seu genoma, ou em um plasmídeo epissômico que é mantido através de várias gerações.

[0094] Como aqui usado, o termo "expressão" refere-se ao processo pelo qual um polipeptídeo é produzido com base na sequência de ácidos nucleicos de um gene. O processo inclui tanto a transcrição quanto a tradução.

[0095] Uma "sequência sinalizadora" significa uma sequência de aminoácidos ligada covalentemente à porção do terminal N de uma proteína, o que facilita o transporte da proteína, por exemplo, secreção da forma madura da proteína fora da célula. A definição de uma sequência sinalizadora é funcional. A forma madura da proteína extrace- lular é desprovida da sequência sinalizadora que é retirada por clivagem, por exemplo, durante o processo de secreção.

[0096] Como aqui usado, o termo "derivado" engloba os termos "originado de", "obtido de" ou "passível de obtenção por" e "isolado de".

[0097] Os termos "proteína" e "polipeptídeo" são aqui usados de forma intercambiável. É aqui usado o código convencional de uma letra ou de três letras para resíduos de aminoácidos.

[0098] Um "promotor" é uma sequência reguladora que está en volvida na ligação à RNA polimerase para iniciar a transcrição de um gene. O promotor pode ser um promotor indutível ou um promotor constitutivo. Por exemplo, cbh1 de Trichoderma reesei, um promotor indutível, pode ser aqui utilizado.

[0099] O termo "ligado operacionalmente" refere-se à justaposição em que elementos estão em um arranjo que os permite estar funcio-nalmente relacionados, até mesmo quando não estão em proximidade física íntima. Por exemplo, um promotor está ligado operacionalmente a uma sequência codificadora caso seja capaz de controlar a sequência codificadora e controle a transcrição da sequência sob condições permissivas desta, ou que conduzam a ela.

[00100] O termo "marcador seletivo" refere-se a um gene capaz de expressão em um hospedeiro, e que permite a seleção daqueles hos-pedeiros que expressam o gene marcador. Exemplos de marcadores selecionáveis incluem, sem limitação, genes que fornecem resistência alterada a um agente antimicrobiano (por exemplo, higromicina, bleo- micina ou cloranfenicol) e/ou genes que conferem seletividade metabólica, por exemplo, uma vantagem nutricional sobre a célula hospedeira, por exemplo, crescimento em um substrato em particular como a única fonte de carboidrato.

[00101] "Introduzido" no contexto de inserção de uma sequência de ácidos nucleicos em uma célula significa "transfecção" ou "transformação" ou "transdução" e inclui referência à incorporação de uma sequência de ácidos nucleicos em uma célula eucariótica ou procariótica em que a sequência de ácidos nucleicos pode ser incorporada no ge- noma da célula (por exemplo, cromossomo, plasmídeo, plastídeo ou DNA mitocondrial), convertida em um replicon autônomo ou expressa transitoriamente (por exemplo, mRNA transfectado).

[00102] O termo "hospedeiro", "cepa hospedeira" ou "célula hospe- deira" significa uma célula adequada na qual se coloca um vetor de expressão ou construção de DNA que compreende um polinucleotí- deo, por exemplo, que codifica uma alfa-amilase variante. Cepas hospedeiras são preferivelmente células bacterianas. Em uma modalidade preferida, "célula hospedeira" significa células e/ou protoplastos criados pelas células de uma cepa microbiana, por exemplo, um Bacillus spp.

[00103] O termo "cultivo" refere-se ao crescimento de uma população de células microbianas sob condições adequadas em um meio capaz de apoiar esse crescimento. Em uma modalidade, cultivo refere- se à bioconversão fermentativa de um substrato de amido que contém amido granular em um produto final (tipicamente em um vaso ou reator).

[00104] "Fermentação" é a degradação de substâncias orgânicas por micro-organismos para a produção de compostos orgânicos mais simples. Embora a fermentação geralmente ocorra sob condições pre-dominantemente anaeróbicas, isso não significa que o termo seja limitado às condições anaeróbicas estritas, na medida em que a fermentação também ocorre na presença de oxigênio.

[00105] O termo "conversão enzimática" em geral refere-se à modificação de um substrato por ação da enzima. O termo, como aqui usado, também se refere à modificação de um substrato de amido pela ação de uma enzima.

[00106] Como aqui usado, o termo "sacarificação" refere-se à conversão enzimática de amido em glicose.

[00107] O termo "gelatinização" significa a solubilização pelo menos parcial de um grânulo ou molécula de amido, por exemplo, por cozimento, para formar uma suspensão viscosa.

[00108] O termo "liquefação" geralmente refere-se a um estágio durante a conversão de amido em que o amido é pelo menos parcial- mente hidrolisado para gerar um produto com peso molecular menor, por exemplo, dextrinas solúveis.

[00109] O termo "grau de polimerização" (DP) refere-se ao número (n) de unidades de anidroglucopiranose em certo sacarídeo. Exemplos de DP1 são monossacarídeos, por exemplo, glicose e frutose. Exemplos de DP2 são dissacarídeos, por exemplo, maltose e sacarose. Um DP > 3 denota polímeros com um grau de polimerização maior do que 3. Aqueles versados na técnica saberão que compostos com DE maior são mais poliméricos.

[00110] O termo "produto final" ou "produto final desejado" refere-se a qualquer produto desejado em uma reação enzimática, por exemplo, uma molécula derivada de amido que é convertida enzimaticamente pelo substrato de amido.

[00111] Como aqui usado, o termo "teor de sólidos secos" (ds) refere-se aos sólidos totais de um caldo em % com base no peso seco. O termo "caldo" refere-se a uma mistura aquosa que contém sólidos in-solúveis.

[00112] O termo "amido residual" refere-se a qualquer amido restante (solúvel ou insolúvel) que resta em uma composição após fermentação de um substrato que contém amido.

[00113] Uma "etapa de reciclagem" refere-se à reciclagem de com-ponentes amassados, que podem incluir amido residual, enzimas e/ou micro-organismos para fermentar substratos que compreendem amido.

[00114] O termo "massa" refere-se a uma mistura de uma fonte de carbono fermentável (carboidrato) em água usada para produzir um produto fermentado, por exemplo, um álcool. Em algumas modalidades, os termos "cerveja" e "massa" são aqui usados de forma inter- cambiável.

[00115] "Vinhaça" significa uma mistura de sólidos não fermentados e água, por exemplo, o resíduo após remoção de álcool de uma massa fermentada.

[00116] Os termos "grão seco de destiladores" (DDG) e "grão seco de destiladores com solúveis" (DDGS) referem-se a um subproduto útil da fermentação de grãos.

[00117] Como aqui usado, o termo "micro-organismo etanologêni- co" refere-se a um micro-organismo com a capacidade de converter um carboidrato (por exemplo, mono-, di-, oligo- ou polissacarídeos) em etanol. Os micro-organismos etanologênicos são etanologênicos em virtude de sua capacidade de expressar uma ou mais enzimas que individual ou coletivamente convertem o carboidrato em etanol.

[00118] Como aqui usado, o termo "produtor de etanol" ou "micro-organismo produtor de etanol" refere-se a qualquer organismo ou célula que seja capaz de produzir etanol a partir de uma hexose ou pentose. Geralmente, células produtoras de etanol contêm uma álcool desi- drogenase e uma piruvato descarboxilase. Exemplos de microorganismos produtores de etanol incluem micro-organismos fúngicos como, por exemplo, leveduras.

[00119] Como aqui usado, o termo "atividade específica" significa uma unidade de enzima definida como o número de moles de substrato convertidos no produto por uma preparação de enzima por unidade de tempo sob condições específicas. A atividade específica é expressa como unidades (U)/unidade de peso de proteína, geralmente, U/mg de proteína.

[00120] O termo "rendimento" refere-se à quantidade de produto final ou de produtos finais desejados produzida com o uso dos métodos da presente descrição. Em algumas modalidades, o rendimento é maior do que aquele produzido com o uso de métodos conhecidos na técnica. Em algumas modalidades, o termo refere-se ao volume do produto final e, em outra modalidade, o termo refere-se à concentração do produto final.

[00121] Como aqui usado, o termo "biologicamente ativo" refere-se a um composto ou sequência que possui um efeito mensurável sobre um sistema biológico, por exemplo, uma célula, um órgão ou um organismo.

[00122] "ATCC" refere-se à "American Type Culture Collection", localizada em Manassas, VA 20108 (ATCC).

[00123] "NRRL" refere-se à "Agricultural Research Service Culture Collection", "National Center for Agricultural Utilization Research" (e conhecida anteriormente como "USDA Northern Regional Research Laboratory"), Peoria, Ill.

[00124] Como aqui usado, "alimento" significa qualquer ingrediente, componente ou composição que forneça um valor nutritivo para um animal, incluindo um ser humano.

[00125] Como aqui usado, por convenção, quando são descritas proteínas e genes que as codificam, o termo para o gene geralmente está em itálico (por exemplo, o gene que codifica amyL (B. lichenifor- mis AA) pode ser representado como amyL). O termo para proteína geralmente não está em itálico e a primeira letra está geralmente em caixa alta (por exemplo, a proteína codificada pelo gene amyL pode ser representada como AmyL ou amyL). A menos que indicado de forma diferente, as sequências de ácidos nucleicos são apresentadas da esquerda para a direita na orientação 5‘ para 3‘, e as sequências de aminoácidos são escritas da esquerda para a direita na orientação de amino para carbóxi, respectivamente.

[00126] Como aqui usado, o termo "que compreende" e seus cognatos são usados em seu sentido inclusivo; ou seja, equivalente ao termo "incluindo" e seus cognatos correspondentes. As faixas numéricas são inclusivas dos números que definem a faixa.

[00127] Os cabeçalhos aqui apresentados não são limitações dos vários aspectos ou modalidades do que é aqui descrito.

[00128] Embora quaisquer métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles aqui descritos possam ser usados na prática ou testes do que é aqui descrito, certos métodos e materiais atualmente preferidos são descritos sem a intenção de limitar o profissional a quaisquer métodos, protocolos e reagentes descritos em particular, uma vez que esses podem ser variados. Todas as patentes e publicações aqui citadas, incluindo todas as sequências descritas nessas patentes e publicações, são expressamente incorporadas por referência.

2. Nomenclatura

[00129] Na presente descrição e nas reivindicações, são usados os códigos convencionais de uma letra e de três letras para resíduos de aminoácidos. Para facilitar a referência, variantes de alfa-amilase são geralmente descritas com o uso da seguinte nomenclatura:

[00130] Aminoácido(s) original: posição(s): aminoácido(s) substituí- do(s)

[00131] De acordo com essa nomenclatura, por exemplo, a substituição de serina por uma alanina na posição 242 é mostrada como: Ser242Ala ou S242A

[00132] uma eliminação de alanina na posição 30 é mostrada como: Ala30* ou A30* ou ΔA30

[00133] e a inserção de um resíduo de aminoácido adicional, por exemplo, lisina, é mostrada como: Ala30AlaLys ou A30AK

[00134] Uma eliminação de um trecho consecutivo de resíduos de aminoácidos, por exemplo, resíduos de aminoácidos 30-33, é indicada como (30-33)* ou Δ(A30-N33).

[00135] Quando uma alfa-amilase específica contiver uma "eliminação" em comparação com outras alfa-amilases e for feita uma inserção nessa posição, essa será indicada como:*36Asp ou *36D

[00136] para a inserção de um ácido aspártico na posição 36.

[00137] Várias mutações são separadas por sinais "+", ou seja: Ala30Asp + Glu34Ser ou A30N + E34S

[00138] que representam mutações nas posições 30 e 34, que substituem alanina e ácido glutâmico no lugar de asparagina e serina, respectivamente.

[00139] Quando um ou mais resíduos de aminoácidos alternativos puderem ser inseridos em certa posição, ele será indicado como:A30N,E ou, alternativamente, A30N ou A30E

[00140] Além disso, quando uma posição adequada à modificação for aqui identificada sem que qualquer modificação específica seja sugerida, deve-se subentender que qualquer resíduo de aminoácido poderá servir de substituto para o resíduo de aminoácido presente na posição. Dessa forma, por exemplo, quando uma modificação de uma alanina na posição 30 for mencionada, mas não especificada, deve-se subentender que a alanina poderá ser eliminada ou substituída no lugar de qualquer outro aminoácido, ou seja, qualquer um de:R, N, D, A, C, Q, E, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V.

[00141] Além disso, "A30X" significa qualquer uma das seguintes substituições: A30R, A30N, A30D, A30C, A30Q, A30E, A30G, A30H, A30I, A30L, A30K, A30M, A30F, A30P, A30S, A30T, A30W, A30Y ou A30 V; ou, resumidamente:A30R,N,D,C,Q,E,G,H,I,L,K,M,F,P,S,T,W,Y,V.

[00142] Caso a enzima parente usada para a numeração já possua o resíduo de aminoácido em questão sugerido para a substituição naquela posição, será usada a seguinte nomenclatura:

[00143] "X30N" ou "X30N,V" quando, por exemplo, um ou N ou Vestá presente no tipo selvagem. Isso indica que outras enzimas parentes correspondentes são substituídas por um "Asn" ou "Val" na posição 30. 3. Características de resíduos de aminoácidos Aminoácidos carregados: Asp, Glu, Arg, Lys, His Aminoácidos carregados negativamente (com o resíduo mais negativo primeiro): Asp, Glu Aminoácidos carregados positivamente (com o resíduo mais positivo primeiro): Arg, Lys, His Aminoácidos neutros: Gly, Ala, Val, Leu, lie, Phe, Tyr, Trp, Met, Cys, Asn, Gln, Ser, Thr, Pro Resíduos de aminoácidos hidrofóbicos (com o resíduo mais hidrofóbico listado por último): Gly, Ala, Val, Pro, Met, Leu, lie, Tyr, Phe, Trp Aminoácidos hidrofílicos (com o resíduo mais hidrofílico listado por último): Thr, Ser, Cys, Gln, Asn

4. Alfa-amilases e amilases semelhantes à AmyS 4.1 Identidade de aminoácidos de várias alfa-amilases

[00144] Diversas alfa-amilases produzidas por Bacillus spp. são altamente homólogas (idênticas) no nível de aminoácidos e podem ser úteis como enzimas parentes neste pedido. O percentual de identidade (com base na sequência de aminoácidos) de diversas alfa-amilases de Bacillus conhecidas, em relação umas às outras, pode ser encontrado na Tabela A abaixo: TABELA A: identidade de sequência de aminoácidos de várias alfa-amilases de Bacillus conhecidas

[00145] Aqueles versados na técnica observarão que as identidades percentuais podem ser determinadas a partir da literatura, ou por qualquer meio aqui descrito ou conhecido na técnica. Por exemplo, verificou-se que a alfa-amilase de B. licheniformis (LAT) (SEQ ID N°: 7) é cerca de 81% homóloga à alfa-amilase de B. amyloliquefaciens (SEQ ID N°: 9) e cerca de 65% homóloga à alfa-amilase de G. stea- rothermophilus (BSG) (SEQ ID N°: 1). Alfa-amilases homólogas adicionais incluem SP690 e SP722 descritas em WO 95/26397, bem como a alfa-amilase N°707 derivada de Bacillus spp. (SEQ ID N°: 6), descrita por Tsukamoto et al., Biochemical and Biophysical Research Communications, 151 (1988), pp. 25-31. A alfa-amilase KSM AP1378 é descrita em WO 97/00324 (de KAO Corporation).

4.2 Alfa-amilases parentes

[00146] Alfa-amilases semelhantes à AmyS, como definidas acima, podem ser usadas como uma alfa-amilase parente. Em uma modalidade preferida, a alfa-amilase parente é derivada de G. stearother- mophilus, por exemplo, uma daquelas citadas acima, por exemplo, a alfa-amilase de G. stearothermophilus que possui a sequência de ami- noácidos mostrada na SEQ ID N°: 1 ou 2.

4.3 Alfa-amilases parentes híbridas

[00147] A alfa-amilase parente (ou seja, alfa-amilase-base) também pode ser uma alfa-amilase híbrida, ou seja, uma alfa-amilase que compreende uma combinação de sequências de aminoácidos parciais derivadas de pelo menos duas alfa-amilases.

[00148] A alfa-amilase parente híbrida pode ser aquela que, com base na homologia de aminoácidos (identidade) e/ou hibridização de DNA (como definida acima), pode ser determinada como pertencente à família da alfa-amilase semelhante à AmyS descrita acima. Nesse caso, a alfa-amilase híbrida é composta tipicamente por pelo menos uma parte de uma alfa-amilase semelhante à AmyS e parte(s) de uma ou mais outras alfa-amilases selecionadas das alfa-amilases semelhantes à AmyS ou não-alfa-amilases semelhantes à AmyS de origem microbiana (bacteriana ou fúngica) e/ou mamífera.

[00149] Dessa forma, a alfa-amilase parente híbrida pode compreender uma combinação de sequências de aminoácidos parciais derivadas de pelo menos duas alfa-amilases semelhantes à AmyS, ou de pelo menos uma semelhante à AmyS e pelo menos uma não alfa- amilase semelhante à AmyS bacteriana, ou de pelo menos uma semelhante à AmyS e pelo menos uma alfa-amilase fúngica. A alfa-amilase semelhante à AmyS da qual uma sequência de aminoácidos parcial é derivada pode ser qualquer uma das alfa-amilases semelhantes à AmyS específicas aqui citadas.

[00150] Por exemplo, a alfa-amilase parente pode compreender uma parte do terminal C de uma alfa-amilase derivada de uma cepa de B. licheniformis, e uma parte do terminal N de uma alfa-amilase derivada de uma cepa de G. stearothermophilus ou de uma cepa de G. stearothermophilus (BSG).

5. Homologia (identidade)

[00151] A homologia pode ser determinada como o grau de identi- dade entre duas sequências que indica um relacionamento entre elas, por exemplo, uma derivação da primeira sequência em relação à segunda ou vice-versa. A homologia pode ser determinada por inspeção visual ou por cálculo manual, mas, mais convenientemente, por meio de programas de computador conhecidos na técnica como, por exemplo, GAP, um programa fornecido na suíte de programas GCG (descrita acima). Dessa forma, pode ser usado Gap GCG v8, por exemplo, com a matriz de pontuação padronizada para identidade e os seguintes parâmetros padronizados: penalidade de criação de GAP de 5,0 e penalidade de extensão de GAP de 0,3, respectivamente, para comparação de sequências de ácidos nucleicos, e penalidade de criação de GAP de 3,0 e penalidade de extensão de GAP de 0,1, respectivamente, para comparação de sequência de proteína. GAP usa o método de Needleman e Wunsch, (1970), J. Mol. Biol. 48: 443-453, para a criação de alinhamentos e para calcular a identidade.

[00152] Um alinhamento estrutural entre Spezyme Xtra (SEQ ID N°: 2) e, por exemplo, outra alfa-amilase, pode ser usado para identificar posições equivalentes/correspondentes em outras alfa-amilases semelhantes à AmyS. Um método de obtenção do referido alinhamento estrutural é a utilização do programa Pile Up da suíte de programas GCG com o uso de valores padronizados de penalidades de gap, ou seja, uma penalidade de criação de gap de 3,0 e uma penalidade de extensão de gap de 0,1. Outros métodos de alinhamento estrutural incluem a análise de cluster hidrofóbico (Gaboriaud et al., FEBS Lett. 224: 149155, 1987) e threading reverso (Huber, T; Torda, A.E., Protein Sci. 7(1): 142-149, 1998).

6. Hibridização

[00153] A sonda de oligonucleotídeo usada na caracterização da alfa-amilase semelhante à AmyS acima pode ser adequadamente preparada com base na sequência de nucleotídeos ou de aminoácidos total ou parcial da alfa-amilase em questão.

[00154] Condições adequadas para avaliar a hibridização envolvem a pré-imersão em 5X SSC e pré-hibridização por 1 hora a 40°C em uma solução de 20% formamida, 5X solução de Denhardt, 50 mM de fosfato de sódio, pH 6,8, e 50 mg de DNA desnaturado sonificado de timo de bezerro, seguido por hibridização na mesma solução suplementada com 100 mM de ATP por 18 horas a 40°C, seguido por lavagem três vezes do filtro em 2X SSC, SDS 0,2% a 40°C por 30 minutos (baixa estringência), preferivelmente a 50°C (estringência média), mais preferivelmente a 65°C (alta estringência), ainda mais preferivelmente a 75°C (estringência muito alta). Mais detalhes sobre o método de hi- bridização podem ser encontrados em Sambrook et al., "MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL", 2a Edição, Cold Spring Harbor, 1989.

[00155] No presente contexto, "derivada de" visa indicar não apenas uma alfa-amilase produzida ou produtível por uma cepa do organismo em questão, mas também uma alfa-amilase codificada por uma sequência de DNA isolada dessa cepa e produzida em um organismo hospedeiro transformado com a referida sequência de DNA. Finalmente, o termo visa indicar uma alfa-amilase que é codificada por uma sequência de DNA de origem sintética e/ou de cDNA e que possui as características de identificação da alfa-amilase em questão. O termo também visa indicar que a alfa-amilase parente pode ser uma variante de uma alfa-amilase de ocorrência natural, ou seja, uma variante, que é o resultado de uma modificação (inserção, substituição, eliminação) de um ou mais resíduos de aminoácidos da alfa-amilase de ocorrência natural.

7. Mutações gerais em alfa-amilases variantes

[00156] Uma variante aqui descrita pode, em uma modalidade, compreender uma ou mais modificações, além daquelas apresentadas acima. Dessa forma, pode ser vantajoso que um ou mais resíduos de prolina (Pro) presentes na parte da variante de alfa-amilase que é mo-dificada sejam substituídos por um resíduo não prolina que pode ser qualquer um dos resíduos não prolina de ocorrência natural possíveis, e que preferivelmente é uma alanina, glicina, serina, treonina, valina ou leucina.

[00157] De forma análoga, em uma modalidade, um ou mais resíduos de cisteína presentes na alfa-amilase parente podem ser substituídos com um resíduo de não cisteína como, por exemplo, serina, alanina, treonina, glicina, valina ou leucina.

[00158] Deve-se entender que as variantes podem incorporar duas ou mais das modificações apresentadas acima.

[00159] Além disso, pode ser vantajoso introduzir mutações em uma ou mais das seguintes posições (usando a SEQ ID N°: 7 para a numeração): M15, V128, A111, H133, W138, T149, M197, N188, A209, A210, H405, T412, em particular as seguintes mutações únicas, duplas, triplas ou múltiplas: M15X, em particular M15T,L; V128X, em particular V128E; H133X, em particular H133Y; N188X, em particular N188S,T,P; M197X, em particular M197T,L; A209X, em particular A209V; M197T/W138F; M197T/138Y; M15T/H133Y/N188S; M15N128E/H133Y/N188S; E119C/S130C; D124C/R127C; H133Y/T149I; G475R, H133Y/S187D; H133Y/A209V.

[00160] No caso da alfa-amilase parente que possui a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID N°: 7, resíduos de aminoácidos re- levantes que podem ser eliminados ou substituídos com o objetivo de aumentar a estabilidade à oxidação incluem o único resíduo de cisteí- na (C363) e os resíduos de metionina localizados nas posições M8, M9, M96, M200, M206, M284, M307, M311, M316 e M438 na SEQ ID N°: 2.

[00161] Com relação ao aumento da estabilidade térmica de uma variante de alfa-amilase em relação à sua alfa-amilase parente, parece ser particularmente desejável eliminar pelo menos um, e preferivelmente dois, ou até mesmo três, dos seguintes resíduos de aminoáci- dos na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID N°: 2: F178, R179, G180, I181, G182 e K183.

[00162] Eliminações pareadas desse tipo particularmente interessantes são R179*+G180*; e I181*+G182* (SEQ ID N°: 16 ou 15, respectivamente) (ou equivalentes dessas eliminações pareadas em outra alfa-amilase que atende às necessidades de uma alfa-amilase parente no contexto da presente descrição).

[00163] Outros resíduos de interesse incluem N193F e V416G na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID N°: 2.

8. Propriedades alteradas de variantes 8.2. Geral

[00164] A seção seguinte descreve o relacionamento entre mutações que estão presentes em uma variante aqui descrita, e alterações desejáveis nas propriedades (em relação àquelas de uma alfa-amilase parental semelhante à AmyS), que podem dela resultar.

[00165] São aqui descritas alfa-amilases semelhantes à AmyS com propriedades alteradas. As alfa-amilases parentes especificamente aqui contempladas são alfa-amilases semelhantes à AmyS e alfa- amilases parentais semelhantes à AmyS híbridas.

[00166] Em uma modalidade, a alfa-amilase de Geobacillus stea- rothermophilus (SEQ ID N°: 2) é usada como o ponto de partida, mas, em outras modalidades, as alfa-amilases de Bacillus SP722, BLA, BAN, AA560, SP690, KSM AP1378, ^707 e outras podem ser usadas. As posições de aminoácidos que correspondem às posições na SEQ ID N°: 2 são prontamente determinadas de acordo com isso.

[00167] Aqueles versados na técnica observarão que, embora qualquer alfa-amilase parente pudesse ser usada como uma amilase de referência a fim de numerar/identificar os resíduos de aminoácidos modificados ou a serem modificados em uma variante em particular, a SEQ ID N°: 1 é atualmente uma sequência preferida para essa finalidade, pois é a sequência de B. stearothermophilus mais longa atualmente aqui disponível.

[00168] Em um aspecto, esta invenção está relacionada a uma variante com propriedades alteradas, por exemplo, como descrito acima.

[00169] Em um de seus vários aspectos, esta invenção fornece uma variante de uma alfa-amilase parente de G. stearothermophilus, que compreende uma alteração em uma ou mais posições (usando, por exemplo, a SEQ ID N°: 1 para a numeração de aminoácidos) selecionadas do grupo de:

[00170] P17, D19, T21, N28, S51, G72, V74, A82, Q86, Q89, A93,G95, Q97, W115, D117, P123, S124, D125, N127, I130,G132, Q135, P145, G146, G148, S153,Y159, W166, S169, K171, W187, P209, N224, S242, G256, D269, N271, T278, N281, G302, A304, R308, T321, Q358, P378, S382, K383, T398, H405, T417, E418, P420, G421, P432, W437, G446, G454, S457, T459, T461, S464, G474, R483,

[00171] em que: (a) as alterações são independentemente (i) uma inserção de um aminoácido abaixo do aminoácido que ocupa a posição; (ii) uma eliminação do aminoácido que ocupa a posição; ou (iii) uma substituição do aminoácido que ocupa a posição com um aminoácido diferente, (b) a variante possui atividade de alfa-amilase, e (c) cada posição corresponde a uma posição da sequência de aminoácidos da amilase parente, por exemplo, uma alfa-amilase de G. stearothermophilus, por exemplo, que possui a sequência de ami- noácidos mostrada na SEQ ID N°: 2, por exemplo, uma alfa-amilase truncada que está disponível comercialmente como SPEZYME XTRA por Genencor.

[00172] São especificamente aqui contempladas as variants S242A, S242Q, S242N e S242E.

[00173] Adicionalmente, os resíduos R179, G180, I181, G182 e K183 foram escolhidos para explorar o efeito de mutações na região de ligação de cálcio-sódio, e P245 foi escolhida porque uma prolina no meio de uma hélice alfa é incomum.

[00174] As posições correspondentes em outras alfa-amilases parentais semelhantes à AmyS podem ser encontradas por alinhamento, como descrito acima, por exemplo, como com aquelas sequências mostradas no alinhamento na figura 4. Dessa forma, as variantes de uma alfa-amilase parental semelhante à AmyS que compreendem uma alteração em uma ou mais das posições enumeradas acima (usando, por exemplo, SEQ ID N°: 1, para numeração comparativa de aminoá- cidos) são aqui contempladas.

8.3. Propriedades alteradas: estabilidade

[00175] No contexto das variantes aqui descritas, mutações (incluindo substituições e eliminações de aminoácidos) de importância com relação à obtenção de estabilidade alterada, em particular estabilidade aprimorada (ou seja, maior ou menor), especialmente em temperaturas elevadas (ou seja, 70-120°C) e/ou em pH extremo (ou seja, pH baixo ou alto, ou seja, pH 4-6 ou pH 8-11, respectivamente), em particular em concentrações de cálcio livre (ou seja, não ligado e, portanto em solução) abaixo de 60 ppm, incluem qualquer uma das mutações listadas na seção "Propriedades alteradas". A estabilidade pode ser determinada como descrito na seção "Métodos" abaixo.

8.4. Propriedades alteradas: Estabilidade de Ca2+

[00176] Estabilidade de Ca2+ alterada significa que a estabilidade da enzima sob depleção de Ca2+ foi aprimorada, ou seja, estabilidade maior ou menor, em relação à enzima parente. No contexto das variantes atualmente descritas, mutações (incluindo substituições e eliminações de aminoácidos) de importância com relação à obtenção de estabilidade de Ca2+ alterada, em particular estabilidade de Ca2+ aprimorada, ou seja, estabilidade maior ou menor, especialmente em pH elevado (ou seja, pH 8-10,5), incluem qualquer uma das mutações listadas na seção "Propriedades alteradas".

8.5. Propriedades alteradas: atividade específica

[00177] Em um aspecto adicional, mutações importantes (incluindo substituições e eliminações de aminoácidos) com relação à obtenção de variantes que exibem atividade específica alterada, em particular atividade específica aumentada ou diminuída, especialmente em temperaturas de 10-60°C, preferivelmente 20-50°C, especialmente 3040°C, incluem qualquer uma das mutações listadas na seção "Propriedades alteradas". A atividade específica pode ser determinada como descrito na seção "Métodos" abaixo.

8.6. Propriedades alteradas: estabilidade à oxidação

[00178] As variantes descritas podem ter estabilidade à oxidação alterada, em particular maior estabilidade à oxidação, em comparação com a alfa-amilase parente. A estabilidade à oxidação aumentada é vantajosa, por exemplo, em composições detergentes, e a estabilidade à oxidação diminuída pode ser vantajosa em composições destinadas à liquefação de amido. A estabilidade à oxidação pode ser determinada como descrito na seção "Métodos" abaixo.

8.7. Propriedades alteradas: perfil de pH alterado

[00179] Posições e mutações importantes com relação à obtenção de variantes com perfil de pH alterado, em particular atividade aprimorada especialmente em pH elevado (ou seja, pH 8-10,5) ou pH baixo (ou seja, pH 4-6), incluem mutações de resíduos amino localizados próximo aos resíduos do sítio ativo.

[00180] Mutações/substituições específicas preferidas incluem aquelas listadas acima na seção "Propriedades alteradas" para as posições em questão. Ensaios adequados são descritos na seção "Métodos" abaixo.

8.8. Propriedades alteradas: desempenho de lavagem

[00181] Posições e mutações importantes com relação à obtenção de variantes com desempenho de lavagem aprimorado, especialmente em pH elevado (ou seja, pH 8,5-11), incluem as muta- ções/substituições específicas listadas acima na seção "Propriedades alteradas" para as posições em questão. O desempenho de lavagem pode ser testado como descrito abaixo na seção "Métodos".

9. Métodos de preparação de variantes de α-amilase

[00182] Métodos para a introdução de mutações em genes são conhecidos na técnica, bem como métodos de clonagem para sequências de DNA que codificam α-amilase. Esses métodos, incluindo métodos para a geração de mutações em locais específicos dentro da sequência codificadora de α-amilase, serão discutidos abaixo.

9.2. Clonagem de uma sequência de DNA que codifica uma α- amilase

[00183] A sequência de DNA que codifica uma α-amilase parente pode ser isolada de qualquer célula ou micro-organismo que produza a α-amilase em questão, usando vários métodos bem-conhecidos na técnica. Primeiro, deve ser construída uma biblioteca de DNA genômi- co e/ou cDNA usando DNA cromossômico ou RNA mensageiro do organismo que produz a α-amilase a ser estudada. Caso a sequência de aminoácidos da α-amilase seja conhecida, sondas de oligonucleotí- deos homólogas marcadas poderão ser sintetizadas e usadas para identificar clones que codificam α-amilase de uma biblioteca genômica preparada a partir do organismo em questão. Alternativamente, uma sonda de oligonucleotídeo marcada contendo sequências homólogas a um gene de α-amilase conhecido pode ser usada como uma sonda para identificar clones que codificam α-amilase, por exemplo, com a utilização de condições de hibridização e de lavagem de estringência menor.

[00184] Outro método para a identificação de clones que codificam α-amilase se baseia na inserção de fragmentos de DNA genômico em um vetor de expressão, por exemplo, um plasmídeo, a transformação de bactérias α-amilase-negativas com a biblioteca de DNA genômico resultante, e o plaqueamento das bactérias transformadas em ágar contendo um substrato para α-amilase, permitindo, dessa forma que os clones que expressam a α-amilase sejam prontamente identificados.

[00185] Alternativamente, a sequência de DNA que codifica a enzima pode ser preparada sinteticamente por métodos padronizados estabelecidos, por exemplo, o método de fosfoamidita descrito por S. L. Beaucage e M. H. Caruthers, Tetrahedron Letters 22: 1.859-1.869 (1981) ou o método descrito por Matthes et al., EMBO J. 3: 801-895 (1984). No método de fosfoamidita, os oligonucleotídeos são sintetizados, por exemplo, em um sintetizador de DNA automático, purificados, anelados, ligados e clonados em vetores apropriados.

[00186] Finalmente, a sequência de DNA pode ser de origem mista, compreendendo, por exemplo, sequências genômicas e sintéticas, se-quências sintéticas e de cDNA, ou sequências genômicas e de cDNA, preparada por ligação de fragmentos de origem sintética, genômica ou de cDNA (como adequado, os fragmentos que correspondem às várias partes de toda a sequência de DNA), de acordo com técnicas padrão. A sequência de DNA também pode ser preparada por reação em cadeia de polimerase (PCR) usando iniciadores específicos, por exemplo, como descrito na Patente U.S. N° 4.683.202 ou R. K. Saiki et al. EMBO J. 3: 801-895 (1988).

9.3. Mutagênese sítio-dirigida

[00187] Após uma sequência de DNA que codifica α-amilase ter sido isolada e os sítios para mutação desejados identificados, as mutações podem ser introduzidas com o uso de oligonucleotídeos sintéticos. Esses oligonucleotídeos contêm sequências de nucleotídeos que flanqueiam os sítios de mutação desejados; nucleotídeos mutantes são inseridos durante a síntese de oligonucleotídeo. Em um método específico, um gap de DNA de fita simples, que faz uma ponte para a sequência codificadora de α-amilase, é criado em um vetor que carrega o gene de α-amilase. A seguir, o nucleotídeo sintético, que abriga a mutação desejada, é anelado a uma porção homóloga do DNA de fita simples. O gap restante é então preenchido com DNA polimerase I (fragmento de Klenow) e o construto é ligado com o uso de T4 ligase. Um exemplo específico desse método é descrito em Morinaga et al. Biotechnology 2: 636-639 (1984). A Patente U.S. N° 4.760.025 descreve a introdução de oligonucleotídeos que codificam várias mutações por realização de pequenas alterações do cassete. No entanto, uma variedade ainda maior de mutações pode ser introduzida em qualquer momento pelo método de Morinaga, uma vez que uma variedade de oligonucleotídeos, de vários comprimentos, pode ser introduzida.

[00188] Outro método de introdução de mutações em sequências de DNA que codificam α-amilase é descrito em Nelson e Long, Analytical Biochem., 180: 147-151 (1989). Ele envolve a geração em 3 etapas de um fragmento de PCR contendo a mutação desejada introduzida pelo uso de uma fita de DNA sintetizada quimicamente como um dos iniciadores nas reações de PCR. A partir do fragmento gerado por PCR, um fragmento de DNA que carrega a mutação pode ser isolado por clivagem com endonucleases de restrição e reinserido em um plasmídeo de expressão.

[00189] Aqueles versados na técnica observarão que muitos métodos alternativos estão disponíveis para o fornecimento ou obtenção de variantes neste pedido. Por exemplo, o embaralhamento de DNA (gene shuffling), por exemplo, como descrito em WO 95/22625 (de Affy- max Technologies N.V.) ou em WO 96/00343 (de Novo Nordisk A/S), ou outras técnicas correspondentes que resultam em enzimas híbridas que compreendem a mutação (ou as mutações), por exemplo, substituições e/ou eliminações em questão.

9.4. Expressão de variantes de alfa-amilase

[00190] Uma sequência de DNA que codifica a variante produzida pelos métodos descritos acima, ou por qualquer um dos métodos alternativos conhecidos na técnica, pode ser expressa, na forma de enzima, com o uso de um vetor de expressão que tipicamente inclui sequências de controle que codificam um promotor, operador, sítio de ligação de ribossomo, sinal de iniciação da tradução e, opcionalmente, um gene repressor ou vários genes ativadores.

[00191] O vetor de expressão recombinante que carrega a sequência de DNA que codifica uma variante de alfa-amilase para uso nesta invenção pode ser qualquer vetor, que pode ser submetido convenientemente a procedimentos de DNA recombinante, e a escolha do vetor frequentemente dependerá da célula hospedeira na qual será introduzido. Dessa forma, o vetor pode ser um vetor que se replica autonomamente, ou seja, um vetor que existe como uma entidade extracro- mossômica, cuja replicação é independente de replicação cromossô- mica, por exemplo, um plasmídeo, um bacteriófago, um elemento ex- tracromossômico, um minicromossomo ou um cromossomo artificial. Alternativamente, o vetor pode ser integrado no genoma da célula hospedeira e replicado junto com o(s) cromossomo(s) no qual foi inte-grado.

[00192] No vetor, a sequência de DNA deve ser conectada operaci-onalmente a uma sequência promotora adequada. O promotor pode ser qualquer sequência de DNA que mostre atividade transcricional na célula hospedeira de escolha e pode ser derivado de genes que codificam proteínas homólogas ou heterólogas à célula hospedeira. Exemplos de promotores adequados para o direcionamento da transcrição da sequência de DNA que codifica uma variante de alfa-amilase para uso nesta invenção, especialmente em um hospedeiro bacteriano, são o promotor do óperon lac de E. coli, os promotores do gene de agara- se dagA de Streptomyces coelicolor, os promotores do gene de alfa- amilase de Bacillus licheniformis (amyL), os promotores do gene de amilase maltogênica de Geobacillus stearothermophilus (amyM), os promotores dos gene de alfa-amilase de Bacillus amyloliquefaciens (amyQ), os promotores dos genes xilA e xilB de Bacillus subtilis etc. Para transcrição em um hospedeiro fúngico, exemplos de promotores úteis são aqueles derivados do gene que codifica amilase de A. oryzae TAKA, proteinase aspártica de Rhizomucor miehei, alfa-amilase neutra de A. niger, alfa-amilase ácido-estável de A. niger, glicoamilase de A. niger, lipase de Rhizomucor miehei, protease alcalina de A. oryzae, triose fosfato isomerase de A. oryzae ou acetamidase de A. nidulans.

[00193] Vetores de expressão para uso nesta invenção também podem compreender um terminador da transcrição adequado e, em eucariotas, sequências de poliadenilação conectadas operacionalmente à sequência de DNA que codifica a variante de alfa-amilase. Sequências de terminação e poliadenilação podem adequadamente ser derivadas das mesmas fontes que o promotor.

[00194] O vetor pode ainda compreender uma sequência de DNA que permite que o vetor se replique na célula hospedeira em questão. Exemplos dessas sequências são as origens de replicação de plasmí- deos pUC19, pACYC177, pUB110, pE194, pAMB1 e pIJ702.

[00195] O vetor também pode compreender um marcador selecio- nável, por exemplo, um gene cujo produto complementa um defeito na célula hospedeira, por exemplo, os genes dal de B. subtilis ou de B. licheniformis, ou um que confira resistência, por exemplo, resistência à ampicilina, canamicina, cloranfenicol ou tetraciclina. Além disso, o vetor pode compreender marcadores de seleção de Aspergillus como, por exemplo, amdS, argB, niaD e sC, um marcador que dê origem à resistência à higromicina, ou a seleção pode ser obtida por co- transformação, por exemplo, como descrito em WO 91/17243.

[00196] Embora a expressão intracelular possa ser vantajosa em alguns aspectos, por exemplo, quando se utilizam certas bactérias como células hospedeiras, prefere-se geralmente que a expressão seja extracelular. Em geral, as alfa-amilases de Bacillus aqui mencionadas compreendem uma pré-região que permite a secreção da protease expressa no meio de cultura. Se desejável, essa pré-região pode ser substituída por uma pré-região ou sequência sinalizadora diferente, convenientemente obtida por substituição das sequências de DNA que codificam as respectivas pré-regiões.

[00197] Os procedimentos usados para ligar um construto de DNA que codifica uma variante de alfa-amilase, o elemento promotor, termi- nador e outros elementos, respectivamente, e para inseri-los em vetores adequados que contêm as informações necessárias à replicação, são bem-conhecidos pelos versados na técnica (veja, por exemplo, Sambrook et al., "MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL", 2a Edição, Cold Spring Harbor, 1989).

[00198] As células para uso nesta invenção, por exemplo, que compreendem um construto de DNA ou um vetor de expressão, como definidos acima, podem ser usadas como células hospedeiras na pro-dução recombinante de uma variante de alfa-amilase. A célula pode ser transformada com um construto de DNA que codifica a variante, convenientemente por integração da construção de DNA (em uma ou mais cópias) no cromossomo do hospedeiro. Essa integração é geralmente considerada como sendo uma vantagem, na medida em que a sequência de DNA tem maior probabilidade de ser mantida estavel- mente na célula. A integração das construções de DNA no cromossomo do hospedeiro pode ser realizada de acordo com métodos convencionais, por exemplo, por recombinação homóloga ou heteróloga. Alternativamente, a célula pode ser transformada com um vetor de expressão, como descrito acima em relação aos diferentes tipos de células hospedeiras.

[00199] As células para uso nesta invenção podem ser células de um organismo superior como, por exemplo, um mamífero ou um inseto, mas são preferivelmente células microbianas, por exemplo, uma célula bacteriana ou fúngica (incluindo células de levedura).

[00200] Exemplos de bactérias adequadas são bactérias gram- positivas como, por exemplo, Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus brevis, Geobacillus stearothermophilus, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus circulans, Bacillus lautus, Bacillus megaterium, Bacillus thuringien- sis ou Streptomyces lividans, ou Streptomyces murinus, ou bactérias gram-negativas como, por exemplo, E. coli. A transformação das bactérias pode ser efetuada, por exemplo, por transformação de proto- plasto ou pela utilização de células competentes de uma forma conhecida per se.

[00201] Quando usada para expressão, uma levedura pode ser fa-voravelmente selecionada de uma espécie de Saccharomyces ou Schizosaccharomyces, por exemplo, Saccharomyces cerevisiae. Um fungo filamentoso pode ser vantajosamente selecionado de uma espécie de Aspergillus, por exemplo, Aspergillus oryzae ou Aspergillus niger. Células fúngicas podem ser transformadas por um processo que envolve a formação e transformação de protoplasto dos protoplastos, seguidas por regeneração da parede celular de uma forma conhecida per se. Um procedimento adequado para a transformação de células hospedeiras de Aspergillus é descrito em EP 238 023.

[00202] Ainda em outro aspecto adicional, a invenção está relacionada a um método de produção de uma variante de alfa-amilase, cujo método compreende o cultivo de uma célula hospedeira, como descrito acima, sob condições que conduzem à produção da variante, e a recuperação da variante das células e/ou do meio de cultura.

[00203] O meio usado para cultivar as células pode ser qualquer meio convencional adequado ao crescimento da célula hospedeira em questão e obtenção da expressão da variante de alfa-amilase. Meios adequados estão disponíveis por fornecedores comerciais ou podem ser preparados de acordo com receitas publicadas (por exemplo, como descrito nos catálogos da ATCC).

[00204] A variante de alfa-amilase secretada pelas células hospedeiras pode ser recuperada do meio de cultura por procedimentos conhecidos, incluindo a separação das células do meio por centrifugação ou filtração, e precipitação dos componentes proteináceos do meio através de um sal como, por exemplo, sulfato de amônio, seguida pelo uso de procedimentos cromatográficos como, por exemplo, cromato- grafia por troca iônica, cromatografia por afinidade, ou similares.

9.5. Métodos para a caracterização e avaliação das variantes 9.4.1 Ensaios de avaliação com filtro

[00205] Os ensaios abaixo podem ser usados para a avaliação de variantes de alfa-amilase semelhante à AmyS que possuem estabilidade alterada em pH elevado ou baixo e/ou sob condições de deple- ção de Ca2+, comparadas com a enzima parente e alfa-amilase semelhante à AmyS.

9.4.2 Ensaios com filtros em pH elevado

[00206] Bibliotecas de Bacillus são plaqueadas em um sanduíche de acetato de celulose (OE 67, Schleicher & Schuell, Dassel, Alemanha) e filtros de nitrocelulose (Protran-Ba 85, Schleicher & Schuell, Dassel, Alemanha) em placas de ágar TY com 10 microgramas/ml de canamicina a 37°C por pelo menos 21 horas. A camada de acetato de celulose está localizada na placa de ágar TY.

[00207] Cada sanduíche de filtro é marcado especificamente com uma agulha após plaqueamento, mas antes da incubação, a fim de permitir a localização de variantes positivas no filtro, e o filtro de nitro- celulose com variantes ligadas é transferido para um recipiente com tampão de glicina-NaOH, pH 8,6-10,6 e incubado em temperatura ambiente (pode ser alterado de 10-60°C) por 15 min. Os filtros de acetato de celulose com colônias são armazenados nas placas TY em temperatura ambiente até serem utilizados. Após incubação, a atividade residual é detectada nas placas que contêm agarose a 1%, amido a 0,2% em tampão de glicina-NaOH, pH 8,6-10,6. As placas de ensaio com os filtros de nitrocelulose são marcadas da mesma forma que o sanduíche de filtro, e incubadas por 2 horas em temperatura ambiente. Após remoção dos filtros, as placas de ensaio são coradas com solução de Lugol a 10%. As variantes que degradam amido são detectadas como manchas brancas em fundo azul escuro e depois identificadas nas placas de armazenamento. As variantes positivas são reavaliadas duas vezes sob as mesmas condições que a primeira avaliação.

9.4.3 Ensaio com filtro com cálcio reduzido

[00208] Bibliotecas de Bacillus são plaqueadas em um sanduíche de filtros de acetato de celulose (OE 67, Schleicher & Schuell, Dassel, Alemanha) e de nitrocelulose (Protran-Ba 85, Schleicher & Schuell, Dassel, Alemanha) em placas de ágar TY com um antibiótico relevante, por exemplo, canamicina ou cloranfenicol, a 37°C por pelo menos 21 horas. A camada de celulose-acetato está localizada na placa de ágar TY.

[00209] Cada sanduíche de filtro é marcado especificamente com uma agulha após plaqueamento, mas antes da incubação, a fim de permitir a localização de variantes positivas no filtro, e o filtro de nitro- celulose com variantes ligadas é transferido para um recipiente com tampão de carbonato/bicarbonato pH 8,5-10 e com diferentes concentrações de EDTA (0,001 mM-100 mM). Os filtros são incubados em temperatura ambiente por 1 hora. Os filtros de acetato de celulose com colônias são armazenados nas placas TY em temperatura ambiente até serem utilizados. Após incubação, a atividade residual é detectada nas placas que contêm agarose a 1%, amido a 0,2% em tampão de carbonato/bicarbonato pH 8,5-10. As placas de ensaio com os filtros de nitrocelulose são marcadas da mesma forma que o sanduíche de filtro, e incubadas por 2 horas em temperatura ambiente. Após remoção dos filtros, as placas de ensaio são coradas com solução de Lugol a 10%. As variantes que degradam amido são detectadas como manchas brancas em um fundo azul escuro e depois identificadas nas placas de armazenamento. As variantes positivas são reavaliadas duas vezes sob as mesmas condições que a primeira avaliação.

9.4.4 Ensaio com filtro em pH reduzido

[00210] Bibliotecas de Bacillus são plaqueadas em um sanduíche de acetato de celulose (OE 67, Schleicher & Schuell, Dassel, Alemanha) e filtros de nitrocelulose (Protran-Ba 85, Schleicher & Schuell, Dasseli Germany) em placas de ágar TY com 10 microgramas/ml de cloranfenicol a 37°C por pelo menos 21 horas. A camada de acetato de celulose está localizada na placa de ágar TY.

[00211] Cada sanduíche de filtro é marcado especificamente com uma agulha após plaqueamento, mas antes da incubação, a fim de permitir a localização de variantes positivas no filtro, e o filtro de nitro- celulose com variantes ligadas é transferido para um recipiente com tampão de citrato, pH 4,5 e incubado a 80°C por 20 minutos (quando são avaliadas variantes na estrutura principal do tipo selvagem) ou a 85°C por 60 minutos (quando são avaliadas variantes da alfa-amilase parente). Os filtros de acetato de celulose com colônias são armazenados nas placas TY em temperatura ambiente até serem utilizados. Após incubação, a atividade residual é detectada em placas de ensaio contendo agarose a 1%, amido a 0,2% em tampão de citrato, pH 6,0. As placas de ensaio com os filtros de nitrocelulose são marcadas da mesma forma que o sanduíche de filtro, e incubadas por 2 horas a 50°C. Após remoção dos filtros, as placas de ensaio são coradas com solução de Lugol a 10%. As variantes que degradam amido são detectadas como manchas brancas em um fundo azul escuro e depois identificadas nas placas de armazenamento. As variantes positivas são reavaliadas duas vezes sob as mesmas condições que a primeira avaliação.

9.4.5 Avaliação secundária

[00212] Os transformantes positivos após reavaliação são escolhidos da placa de armazenamento e testados em um ensaio de placa secundário. Os transformantes positivos são desenvolvidos por 22 horas a 37°C em 5 ml de LB + cloranfenicol. A cultura de Bacillus de cada transformante positivo e, como controle, um clone que expressa a estrutura principal correspondente, são incubados em tampão de citrato, pH 4,5 a 90°C, e são coletadas amostras em 0, 10, 20, 30, 40, 60 e 80 minutos. Uma amostra de 3 μl é espalhada em placa de ensaio. A placa de ensaio é corada com solução de Lugol a 10%. As variantes aprimoradas são observadas como variantes com atividade residual mais elevada (detectada como halos na placa de ensaio) do que a es- trutura principal. As variantes aprimoradas são determinadas por se- quenciamento de nucleotídeo.

9.4.6 Ensaio de estabilidade de variantes não purificadas

[00213] A estabilidade das variantes pode ser testada da seguinte forma: culturas de Bacillus que expressam as variantes a serem analisadas são desenvolvidas por 21 horas a 37°C em 10 ml de LB com cloranfenicol. Uma cultura de 800 microlitros é misturada com 200 mi- crolitros de tampão de citrato, pH 4,5. Diversas alíquotas de 70 μl que correspondem ao número de pontos do tempo da amostra são feitas em tubos de PCR e incubadas a 70°C ou 90°C por vários pontos do tempo (tipicamente 5, 10, 15, 20, 25 e 30 minutos) em uma máquina de PCR. A amostra de 0 min não é incubada em temperatura elevada. A atividade na amostra é medida por transferência de 20 microlitros a 200 microlitros do substrato de alfa-amilase PNP-G7 MPR3 (Boehringer Mannheim N° de Catálogo 1660730), como descrito abaixo sob "Ensaios para atividade de alfa-amilase". Os resultados são tabulados como atividade percentual (em relação ao ponto do tempo 0) versus tempo, ou definidos como atividade residual percentual após incubação por certo período de tempo.

9.4.7 Fermentação e purificação de variantes de alfa-amilase

[00214] Uma cepa de B. subtilis que abriga o plasmídeo de expressão relevante pode ser fermentada e purificada da seguinte forma: a cepa é raspada em uma placa de ágar-LB com 10 μg/ml de canamici- na de um estoque a -80°C, e desenvolvida de um dia para o outro a 37°C. As colônias são transferidas para 100 ml de meio PS-1 suplementado com 10 μg/ml de cloranfenicol em um frasco de agitação de 500 ml. Composição do meio PS-1 Açúcar pérola 100 g/l Farelo de soja 40 g/l Na2HPO4, 12 H2O 10 g/l Pluronic ® PE 6100 0,1 g/l CaCO3 5 g/l

[00215] A cultura é agitada a 37°C a 270 rpm por 5 dias.

[00216] As células e os restos celulares são removidos do caldo de fermentação por centrifugação a 4.500 rpm em 20-25 minutos. A seguir, o sobrenadante é filtrado para obter uma solução completamente transparente. O filtrado é concentrado e lavado em um filtro UF (mem-brana com valor de corte de 10.000) e o tampão é trocado para 20 mM de acetato pH 5,5. O filtrado UF é aplicado em uma F.F. de S- SEFAROSE e a eluição é realizada por eluição em etapas com 0,2 M de NaCl no mesmo tampão. O eluado é dialisado contra 10 mM de Tris, pH 9,0, e aplicado em uma F.F. de Q-SEFAROSE e eluído com um gradiente linear de 0-0,3 M de NaCl ao longo de 6 volumes de coluna. As frações que contêm a atividade (medida pelo ensaio PHADE- BAS) são reunidas em pool, o pH foi ajustado até pH 7,5 e a cor restante foi removida por tratamento com 0,5% p/v de carvão ativo em 5 minutos.

9.4.8 Determinação da atividade específica

[00217] A atividade específica é determinada usando o ensaio PHADEBAS® (Magle Life Sciences) como atividade/mg de enzima. São seguidas as instruções do fabricante (veja também abaixo sob "Ensaio para atividade de alfa-amilase").

9.4.9 Determinação do ponto isoelétrico

[00218] O pI é determinado por focalização isoelétrica (ex: Pharma- cia, Ampholine, pH 3,5-9,3).

9.4.10 Determinação da estabilidade

[00219] A estabilidade da amilase pode ser medida com a utilização do seguinte método:

[00220] A enzima é incubada sob as condições relevantes. São co- letadas amostras em vários pontos do tempo, por exemplo, após 0, 5, 10, 15 e 30 minutos, e diluída 25 vezes (mesma diluição para todas as amostras coletadas) em tampão de ensaio (50 mM de tampão de Britton pH 7,3), e a atividade é medida usando o ensaio PHADEBAS (Ma- gle Life Sciences) sob condições padronizadas de pH 7,3, 37°C.

[00221] A atividade medida antes da incubação (0 minuto) é usada como referência (100%). O declínio em percentual é calculado em função do tempo de incubação. A tabela mostra a atividade residual após, por exemplo, 30 minutos de incubação.

9.4.11 Ensaios para atividade de alfa-amilase 1. Ensaio PHADEBAS

[00222] A atividade de alfa-amilase é determinada por um método que emprega comprimidos PHADEBAS® como substrato. Os comprimidos PHADEBAS (Teste de Amilase PHADEBAS®, fornecido por Magle Life Sciences) contêm um polímero de amido reticulado, insolúvel, da cor azul, que foi misturado com albumina de soro bovino e uma substância e comprimido tampão.

[00223] Para cada medida única, um comprimido é suspenso em um tubo contendo 5 ml de 50 mM de tampão de Britton-Robinson (50 mM de ácido acético, 50 mM de ácido fosfórico, 50 mM de ácido bórico, 0,1 mM de CaCl2, pH ajustado até o valor de interesse com NaOH). O teste é realizado em um banho-maria na temperatura de interesse. A alfa-amilase a ser testada é diluída em 50 mM de tampão de Britton- Robinson. Um mililitro dessa solução de alfa-amilase é adicionado aos 5 ml de 50 mM de tampão de Britton-Robinson. O amido é hidrolisado pela alfa-amilase gerando fragmentos solúveis azuis. A absorbância da solução azul resultante, medida por espectrofotometria a 620 nm, é uma função da atividade de alfa-amilase.

[00224] É importante que a absorbância a 620 nm medida após 10 ou 15 minutos de incubação (tempo de teste) esteja na faixa de 0,2 a 2,0 unidades de absorbância a 620 nm. Nessa faixa de absorbância, há linearidade entre a atividade e a absorbância (lei de Lambert-Beer). Portanto, a diluição da enzima tem que ser ajustada para se adaptar a esse critério. Sob um conjunto de condições especificado (temperatura, pH, tempo de reação, condições de tampão), 1 mg de certa alfa- amilase hidrolisará certa quantidade de substrato e será produzida uma cor azul. A intensidade da cor é medida a 620 nm. A absorbância medida é diretamente proporcional à atividade específica (ativida- de/mg de proteína da alfa-amilase pura) da alfa-amilase em questão sob certo conjunto de condições.

2. Método alternativo

[00225] A atividade de alfa-amilase é determinada por um método que emprega o substrato PNP-G7. PNP-G7, que é uma abreviação para p-nitrofenil-alfa,D-maltoheptaosida, é um oligossacarídeo bloqueado que pode ser clivado por uma endoamilase. Após a clivagem, a alfa- Glicosidase incluída no kit digere o substrato para liberar uma molécula de PNP livre que possui uma cor amarela e, dessa forma, pode ser medida por espectrofotometria visível a À = 405 nm (400-420 nm). Os kits contendo o substrato PNP-G7 e alfa-Glicosidase são fabricados por Boehringer-Mannheim (N° de Catálogo 1054635).

[00226] Para preparar a solução de reagente, 10 ml de solução de substrato/tampão são adicionados a 50 ml de solução de enzi- ma/tampão, como recomendado pelo fabricante. O ensaio é realizado por transferência de uma amostra de 20 microlitros para uma placa de microtitulação de 96 poços e incubação a 25°C. Duzentos μl de solução de reagente pré-equilibrada até 25°C são adicionados. A solução é misturada, e pré-incubada por 1 minuto, e a absorção é medida a cada 30 segundos ao longo de 4 minutos em OD 405 nm em uma leitora de ELISA.

[00227] A inclinação da curva de absorção tempo-dependente é diretamente proporcional à atividade da alfa-amilase em questão sob o conjunto de condições especificado.

9.4.12 Determinação da sensibilidade ao LAS

[00228] A variante é incubada com diferentes concentrações de LAS (alquil benzeno sulfonato linear; Nansa 1169/P) por 10 minutos a 40°C.

[00229] A atividade residual é determinada com o uso do método de ensaio PHADEBAS® ou com o método alternativo que emprega o substrato PNP-G7.

[00230] LAS é diluído em 0,1 M de tampão de fosfato, pH 7,5.

[00231] São usadas as seguintes concentrações:

[00232] 500 ppm, 250 ppm, 100 ppm, 50 ppm, 25 ppm e 10 ppm ou ausência de LAS.

[00233] A variante é diluída nos diferentes tampões de LAS até a concentração de 0,01-5 mg/l em um volume total de 10 ml, e incubada por 10 minutos em um banho-maria com temperatura controlada. A incubação é interrompida por transferência de uma pequena alíquota em tampão de ensaio gelado. É importante que, durante a medida da atividade, a concentração de LAS esteja abaixo de 1 ppm, a fim de não afetar a medida da atividade. A atividade residual é determinada em duplicata com a utilização do ensaio PHADEBAS® ou do método alternativo mencionados acima. A atividade é medida após subtração do vazio. A atividade sem LAS é de 100%.

10. Métodos de utilização das variantes de amilase: aplicações industriais

[00234] As variantes de alfa-amilase aqui apresentadas possuem propriedades valiosas que permitem diversas aplicações industriais. Uma ou mais das enzimas variantes ou composições aqui descritas também podem ser usadas em composições detergentes, em particular composições detergentes para lavagem de roupas e composições detergentes para lavagem de louça, composições para limpeza de su-perfícies rígidas e em composição para a desengomagem de têxteis, tecidos ou vestimentas, para a produção de polpa e papel, produção de cerveja, produção de etanol e processos de conversão de amido, como descrito acima.

[00235] Uma ou mais das variantes com propriedades alteradas podem ser usadas para processos com amido, em particular conversão de amido, especialmente liquefação de amido (veja, por exemplo, Patente U.S. N° 3.912.590, Pedidos de Patente EP Nos 252.730 e 63.909, WO 99/19467 e WO 96/28567, todas as referências aqui incorporadas por referência). Também são contempladas composições para fins de conversão de amido, que também podem compreender uma glicoamilase, pululanase, e/ou outra(s) alfa-amilase(s).

[00236] Além disso, uma ou mais das variantes também são parti-cularmente úteis na produção de adoçantes e etanol (veja, por exemplo, a Patente U.S. N° 5.231.017, aqui incorporada por referência), por exemplo, etanol combustível, de bebidas e industrial, a partir de amido ou grãos inteiros.

[00237] As variantes neste pedido também podem ser úteis para desengomagem de têxteis, tecidos e vestimentas (veja, por exemplo, WO 95/21247, Patente U.S. N° 4.643.736, EP 119.920, aqui incorporados por referência), produção de cerveja ou cervejaria, e na produção de polpa e papel ou processos relacionados.

10.1. Pré-Tratamento de amido nativo

[00238] O amido nativo consiste em grânulos microscópicos, que são insolúveis em água em temperatura ambiente. Quando um caldo de amido aquoso é aquecido, os grânulos incham e eventualmente se rompem, liberando as moléculas de amido na solução. Durante esse processo de "gelatinização", há um aumento dramático da viscosidade. Na medida em que o nível de sólidos é de 30-40% em um processo industrial típico, o amido deve ser afilado "liquefeito", de modo que possa ser processado adequadamente. Essa redução da viscosidade é primeiramente obtida por degradação enzimática na prática comercial atual.

10.2. Conversão de amido

[00239] Os processos convencionais de conversão de amido como, por exemplo, os processos de liquefação e sacarificação, são descritos, por exemplo, na Patente U.S. N° 3.912.590 e Publicações de Patente EP Nos 252.730 e 63.909, cada um deles sendo aqui incorporado por referência.

[00240] Em uma modalidade, o processo de conversão que degrada amido em componentes de carboidrato de peso molecular menor como, por exemplo, açúcares ou substitutos de gordura, inclui uma etapa de desramificação.

10.3. Conversão de amido em açúcar

[00241] No caso da conversão de amido em um açúcar, o amido é despolimerizado. Esse processo de despolimerização consiste, por exemplo, em uma etapa de pré-tratamento e duas ou três etapas con-secutivas do processo, ou seja, um processo de liquefação, um processo de sacarificação e, dependendo do produto final desejado, um processo opcional de isomerização.

10.4. Isomerização

[00242] Quando um produto de açúcar final desejado é, por exemplo, xarope rico em frutose, o xarope de dextrose pode ser convertido em frutose. Após o processo de sacarificação, o pH é aumentado até um valor na faixa de 6-8, preferivelmente pH 7,5, e o cálcio é removido por troca iônica. O xarope de dextrose é então convertido em xarope rico em frutose, usando, por exemplo, uma glicose isomerase imobilizada (por exemplo, Gensweet® IGI-HF).

10.5. Produção de etanol, outra fermentação

[00243] Em geral, a produção de álcool (etanol) a partir do grão inteiro pode ser separada em 4 etapas principais: Trituração Liquefação Sacarificação Fermentação

10.6. Trituração

[00244] O grão é triturado a fim de abrir a estrutura e permitir um processamento posterior. Os dois processos usados são trituração úmida ou seca. Na trituração seca, o caroço inteiro é triturado e usado na parte restante do processo. A trituração úmida gera uma boa separação do germe e do farelo (grânulos de amido e proteína) e é, com poucas exceções, aplicada em localizações onde há uma produção em paralelo de xaropes.

10.7. Liquefação

[00245] No processo de liquefação, os grânulos de amido são solu- bilizados por hidrólise em principalmente maltodextrinas de um DP maior do que 4. A hidrólise pode ser realizada por tratamento com ácido ou enzimaticamente por alfa-amilase. A hidrólise com ácido é usada de forma limitada. A matéria prima pode ser grão inteiro triturado ou um fluxo lateral do processamento do amido.

[00246] Durante uma liquefação enzimática típica, o amido de cadeia longa é degradado em unidades ramificadas e lineares mais curtas (maltodextrinas) por uma alfa-amilase. A liquefação enzimática é geralmente realizada como um processo com caldo quente em três etapas. O caldo é aquecido até entre 60-95°C (preferivelmente 7786°C, 80-85°C e 83-85°C) e a(s) enzima(s) é (são) adicionada(s). O processo de liquefação é realizado a 105-110°C por 5 a 10 minutos, seguido por 1-2 horas a 95°C. O pH é geralmente entre 5,5 e 6,2. A fim de assegurar a estabilidade ótima da enzima sob essas condições, 1 mM de cálcio é adicionado (para fornecer cerca de 40 ppm de íons de cálcio livre). Após esse tratamento, o amido liquefeito terá um "equiva-lente de dextrose" (DE) de 10-15.

[00247] O caldo é subsequentemente submetido a um cozimento a jato de vapor entre 95-140°C, preferivelmente 105-125°C, resfriado até 60-95°C, e mais enzima(s) é (são) adicionada(s) para se obter a hidrólise final. O processo de liquefação é realizado em pH 4,5-6,5, tipicamente em um pH entre 5 e 6. O grão triturado e liquefeito é conhecido como massa.

10.8. Sacarificação e fermentação

[00248] O material liquefeito contendo amido é sacarificado na presença de enzimas de sacarificação como, por exemplo, glicoamilases. O processo de sacarificação pode durar 12 horas a 120 horas (por exemplo, 12 a 90 horas, 12 a 60 horas e 12 a 48 horas). No entanto, é comum realizar uma etapa de pré-sacarificação por cerca de 30 minutos a 2 horas (por exemplo, 30 a 90 minutos) em uma faixa de temperatura de 30 a 65°C e tipicamente em torno de 60°C, seguida por uma sacarificação completa durante a fermentação denominada sacarificação e fermentação simultâneas (SSF). O pH é normalmente entre 4,24,8, preferivelmente pH 4,5. EM um processo de sacarificação e fermentação simultâneas (SSF), não há estágio de retenção para sacarificação e, em vez disso, a levedura e as enzimas são adicionadas juntas.

[00249] Em um processo de sacarificação típico, as maltodextrinas produzidas durante a liquefação são convertidas em dextrose por adição de uma glicoamilase (por exemplo, OPTIDEX® L-400) e uma enzima de desramificação como, por exemplo, uma isoamilase (Patente U.S. N° 4.335.208) ou uma pululanase. A temperatura é reduzida para 60°C, antes de a glicoamilase e a enzima de desramificação serem adicionadas. O processo de sacarificação procede por 24-72 horas.

[00250] Antes da adição das enzimas de sacarificação, o pH é reduzido para menos de 4,5, mantendo-se uma temperatura elevada (acima de 95°C), para inativar a alfa-amilase em liquefação. Esse processo reduz a formação de oligossacarídeos curtos denominados "precursores de panose", que não podem ser hidrolisados adequadamente pela enzima de desramificação. Normalmente, cerca de 0,20,5% do produto da sacarificação é o trissacarídeo ramificado panose (Glc pα1-6Glc pα1-4Glc), que não pode ser degradado por uma pulu- lanase. Se a amilase ativa da liquefação permanece presente durante a sacarificação (ou seja, sem desnaturação), a quantidade de panose pode ser tão alta quanto 1-2%, o que é altamente indesejável, na medida em que reduz o rendimento da sacarificação significativamente.

[00251] Açúcares fermentáveis (por exemplo, dextrinas, monossa- carídeos, particularmente glicose) são produzidos por sacarificação enzimática. Esses açúcares fermentáveis podem ainda ser purificados e/ou convertidos em produtos de açúcar úteis. Além disso, os açúcares podem ser usados como uma matéria-prima para fermentação em um processo de fermentação microbiano para a produção de produtos finais como, por exemplo, álcool (por exemplo, etanol e butanol), ácidos orgânicos (por exemplo, ácido succínico e ácido lático), alcoóis de açúcar (por exemplo, glicerol), intermediários de ácido ascórbico (por exemplo, gluconato, 2-ceto-D-gluconato, 2,5-diceto-D-gluconato ácido e 2-ceto-L-glucônico), aminoácidos (por exemplo, lisina), proteínas (por exemplo, anticorpos e fragmento destes).

[00252] Em uma modalidade preferida, os açúcares fermentáveis obtidos durante as etapas do processo de liquefação são usados para a produção de álcool e, particularmente, etanol. Na produção de eta- nol, um processo de SSF é comumente usado, em que as enzimas de sacarificação e os organismos de fermentação (por exemplo, levedura) são adicionados juntos e depois efetuados em uma temperatura de 30°C a 40°C.

[00253] O organismo usado nas fermentações dependerá do produto final desejado. Tipicamente, caso o etanol seja o produto final desejado, será usada levedura como o organismo de fermentação. Em algumas modalidades preferidas, o micro-organismo produtor de etanol é uma levedura e especificamente Saccharomyces como, por exemplo, as cepas de S. cerevisiae (Patente U.S. N° 4.316.956). Diversas S. cerevisiae estão disponíveis comercialmente e essas incluem, sem limitação, FALI (Fermento Fleischmann), SUPERSTART (Alltech), FERMIOL (DSM Specialties), RED STAR (Lesaffre) e levedura de álcool Angel (Angel Yeast Company, China). A quantidade de levedura de partida empregada nos métodos é uma quantidade eficaz para produzir uma quantidade comercialmente significativa de etanol em uma quantidade de tempo adequada (por exemplo, para produzir pelo menos 10% de etanol a partir de um substrato que possui entre 25-40% de DS em menos de 72 horas). As células de levedura são geralmente fornecidas em quantidades de cerca de 104 a cerca de 1012, e preferivelmente de cerca de 107 a cerca de 1010 como contagem de leveduras viáveis por ml de caldo de fermentação. Após a levedura ser adicionada à massa, ela é tipicamente submetida à fermentação por cerca de 24-96 horas, por exemplo, 35-60 horas. A temperatura é de cerca de 26-34°C, tipicamente em cerca de 32°C, e o pH é de pH 3-6, preferivelmente em torno do pH 4-5.

[00254] A fermentação pode incluir, além do micro-organismo de fermentação (por exemplo, levedura), nutrientes e enzimas adicionais, incluindo fitases. O uso de levedura na fermentação é bem-conhecido, e é feita referência ao livro "THE ALCOHOL TEXTBOOK", K. Jacques et al., Eds. 1999, NOTTINGHAM UNIVERSITY PRESS, UK.

[00255] Em modalidades adicionais, o uso de micro-organismos de fermentação apropriados, como é conhecido na técnica, pode resultar no fato de o produto final da fermentação incluir, por exemplo, glicerol, 1,3-propanodiol, gluconato, 2-ceto-D-gluconato, 2,5-diceto-D- gluconato, ácido 2-ceto-L-glucônico, ácido succínico, ácido lático, ami- noácidos, e derivados destes. Mais especificamente, quando ácido lá- tico é o produto final desejado, pode ser usado um Lactobacillus sp. (L. casei); quando glicerol ou 1,3-propanodiol são os produtos finais desejados, pode ser usada E. coli; e quando 2-ceto-D-gluconato, 2,5- diceto-D-gluconato e ácido 2-ceto-L-glucônico são os produtos finais desejados, pode ser usada Pantoea citrea como o micro-organismo de fermentação. A lista acima enumerada são apenas exemplos e aqueles versados na técnica terão conhecimento de diversos microorganismos de fermentação que podem ser usados para se obter um produto final desejado.

10.9. Fabricação de cerveja

[00256] As alfa-amilases variantes aqui fornecidas também podem ser muito úteis em um processo de fabricação de cerveja e em fermentações similares; as alfa-amilases tipicamente serão adicionadas durante o processo de moagem. O processo é substancialmente similar aos processos de trituração, liquefação, sacarificação e fermentação descritos acima.

10.10. O uso de variantes de amilase para processamento de caldo de amido com vinhaça

[00257] Material triturado contendo amido é combinado com água e vinhaça fina reciclada resultando em um caldo aquoso. O caldo pode compreender entre 15 a 55% de ds p/p (por exemplo, 20 a 50%, 25 a 50%, 25 a 45%, 25 a 40%, 20 a 35% e 30-36% de ds). Em algumas modalidades, a vinhaça fina reciclada (refluxo) está na faixa cerca de 10 a 70% v/v (por exemplo, 10 a 60%, 10 a 50%, 10 a 40%, 10 a 30%, 10 a 20%, 20 a 60%, 20 a 50%, 20 a 40% e também 20 a 30%).

[00258] Após o material contendo amido triturado ser combinado com água e o refluxo, o pH não é ajustado no caldo. Além disso, o pH não é ajustado após a adição de fitase e, opcionalmente, alfa-amilase ao caldo. Em uma modalidade preferida, o pH do caldo estará na faixa de cerca de 4,5 a menos do que eu cerca de 6,0 (por exemplo, pH 4,5 a 5,8, pH 4,5 a 5,6, pH 4,8 to 5,8, pH 5,0 a 5,8, pH 5,0 a 5,4, pH 5,2 a 5,5 e pH 5,2 a 5,9). O pH do caldo pode estar entre cerca de 4,5 e 5,2, dependendo da quantidade de vinhaça fina adicionada ao caldo e do tipo de material que compreende a vinhaça fina. Por exemplo, o pH da vinhaça fina pode estar entre 3,8 e pH 4,5. Como exemplo adicional, a Tabela B abaixo ilustra a alteração de pH que ocorre com a adição de quantidades crescentes de vinhaça fina a um caldo de milho inteiro triturado (32% de ds) após agitação por 2 horas a 68,33°C.TABELA B:

[00259] Durante a produção de etanol, podem ser adicionados ácidos para reduzir o pH no tonel de cerveja, para reduzir o risco de contaminação microbiana, antes da destilação.

[00260] Em algumas modalidades, é adicionada fitase ao caldo. Em outras modalidades, além da fitase, é adicionada alfa-amilase ao caldo. Em algumas modalidades, fitase e alfa-amilase são adicionadas ao caldo sequencialmente. Em outras modalidades, fitase e alfa-amilase são adicionadas simultaneamente. Em algumas modalidades, o caldo que compreende fitase e, opcionalmente, alfa-amilase, é incubado (pré-tratado) por um período de cerca de 5 minutos a cerca de 8 horas (por exemplo, 5 minutos a 6 horas, 5 minutos a 4 horas, 5 minutos a 2 horas e 15 minutos a 4 horas). Em outras modalidades, o caldo é incubado em uma temperatura na faixa de cerca de 40 a 115°C (por exemplo, 45 a 80°C, 50 a 70°C, 50 a 75°C, 60 a 110°C, 60 a 95°C, 70 a 110°C, 70 a 85°C e 77 a 86°C).

[00261] Em outras modalidades, o caldo é incubado em uma temperatura de cerca de 0 a cerca de 30°C (por exemplo, 0 a 25°C, 0 a 20°C, 0 a 15°C, 0 a 10°C e 0 a 5°C) abaixo da temperatura de gelatini- zação do amido do material que contém amido. Em algumas modalidades, a temperatura está abaixo de cerca de 68°C, abaixo de cerca de 65°C, abaixo de cerca de 62°C, abaixo de cerca de 60°C e abaixo de cerca de 55°C. Em algumas modalidades, a temperatura está acima de cerca de 45°C, acima de cerca de 50°C, acima de cerca de 55°C e acima de cerca de 60°C. Em algumas modalidades, a incubação do caldo que compreende uma fitase e uma alfa-amilase em uma temperatura abaixo da temperatura de gelatinização do amido é denominada liquefação primária (1°).

[00262] Em uma modalidade, o material contendo amido triturado é milho ou sorgo. O caldo compreende 25 a 40% de ds, o pH está na faixa de 4,8 a 5,2, e o caldo é incubado com uma fitase e, opcionalmente, uma alfa-amilase por 5 minutos a 2 horas, em uma faixa de temperatura de 60 a 75°C.

[00263] Atualmente, acredita-se que alfa-amilases microbianas dis-poníveis comercialmente usadas no processo de liquefação geralmente não são suficientemente estáveis para produzir substrato de amido liquefeito de um processo de trituração seca com a utilização de grão inteiro moído em uma temperatura acima de cerca de 80°C em um nível de pH que é menor do que o pH 5,6. A estabilidade de muitas alfa- amilases disponíveis comercialmente é reduzida em um pH de menos do que cerca de 4,0.

[00264] Em uma etapa de liquefação adicional, o material contendo amido incubado ou pré-tratado é exposto a um aumento na temperatura como, por exemplo, cerca de 0 a cerca de 45°C acima da temperatura de gelatinização do amido do material contendo amido (por exemplo, 70°C a 120°C, 70°C a 110°C e 70°C a 90°C) por um período de tempo de cerca de 2 minutos a cerca de 6 horas (por exemplo, 2 minutos a 4 horas, 90 minutos, 140 minutos e 90 a 140 minutos) em um pH de cerca de 4,0 a 5,5, mais preferivelmente entre 1 hora a 2 horas. A temperatura pode ser aumentada por um sistema convencional de pré- tratamento contínuo em temperatura elevada por um período de tempo curto, por exemplo, por 1 a 15 minutos. A seguir, o amido pode ainda ser hidrolisado em uma temperatura que varia de cerca de 75°C a 95°C (por exemplo, 80°C a 90°C e 80°C a 85°C) por um período de cerca de 15 a 150 minutos (por exemplo, 30 a 120 minutos). Em uma modalidade preferida, o pH não é ajustado durante essas etapas do processo e o pH da massa liquefeita está na faixa cerca de 4,0 a 5,8 (por exemplo, pH 4,5 a 5,8, pH 4,8 a 5,4 e pH 5,0 a 5.2). Em algumas modalidades, uma segunda dose de alfa-amilase termoestável é adicionada à etapa de liquefação secundária, mas em outras modalidades não há dosagem adicional de alfa-amilase.

[00265] As etapas de incubação e liquefação podem ser seguidas por etapas de sacarificação e fermentação bem-conhecidas na técnica.

10.11. Destilação

[00266] Opcionalmente, após a fermentação, álcool (por exemplo, etanol) pode ser extraído, por exemplo, por destilação e, opcionalmente, seguida por uma ou mais etapas do processo.

[00267] Em algumas modalidades, o rendimento de etanol produzido pelos métodos aqui fornecidos é pelo menos 8%, pelo menos 10%, pelo menos 12%, pelo menos 14%, pelo menos 15%, pelo menos 16%, pelo menos 17%, pelo menos 18% (v/v) e pelo menos 23% v/v. O etanol obtido de acordo com o processo aqui fornecido pode ser usado, por exemplo, como etanol combustível, etanol de bebida, ou seja, destilado neutro de milho ou etanol industrial.

10.12. Subprodutos

[00268] O grão é o resto da fermentação, que é tipicamente usado para ração animal na forma líquida ou seca. Em modalidades adicionais, o produto final pode incluir os coprodutos da fermentação como, por exemplo, grãos secos de destiladores (DDG) e grãos secos de destiladores mais solúveis (DDGS), que podem ser usados, por exemplo, como uma ração animal.

[00269] Mais detalhes sobre como efetuar a liquefação, sacarificação, fermentação, destilação e recuperação de etanol são bem- conhecidos por aqueles versados na técnica.

[00270] De acordo com o processo aqui fornecido, a sacarificação e a fermentação podem ser realizadas simultânea ou separadamente.

10.13. Produção de polpa e de papel

[00271] A alfa-amilase alcalina variante também pode ser usada na produção de materiais lignocelulósicos como, por exemplo, polpa, papel e papelão, de papel e papelão de resíduos reforçados de amido, especialmente quando a re-esmagamento ocorre em pH acima 7 e quando as amilases facilitam a desintegração do material residual através da degradação do amido reforçado. As variantes de alfa- amilase são especialmente úteis em um processo para a produção de uma polpa para a fabricação de papel a partir de um papel impresso revestido com amido. O processo pode ser realizado como descrito em WO 95/14807, que compreende as seguintes etapas: (a) desintegração do papel para produzir uma polpa, (b) tratamento com uma enzima de degradação de amido antes, durante ou depois da etapa (a), e (c) separação de partículas de tinta da polpa após etapas as etapas (a) e (b).

[00272] As alfa-amilases também podem ser muito úteis na modificação de amido quando é usado amido modificado enzimaticamente na fabricação de papel junto com enchimentos alcalinos como, por exemplo, carbonato de cálcio, caulim e argilas. Com as variantes de alfa-amilase alcalinas, é possível modificar o amido na presença do enchimento, permitindo, dessa forma, um processo integrado mais simples.

10.14. Desengomagem de têxteis, tecidos e vestimentas

[00273] Uma variante de alfa-amilase também pode ser muito útil na desengomagem de têxteis, tecidos ou vestimentas. Na indústria de processamento de têxteis, as alfa-amilases são tradicionalmente usadas como auxiliares no processo de desengomagem para facilitar a remoção de goma contendo amido, que serviu como um revestimento protetor em fios entrelaçados durante a tecelagem. A remoção completa do revestimento de goma após tecelagem é importante para assegurar resultados ótimos nos processos subsequentes, nos quais o tecido é esfregado, alvejado e tingido. A degradação enzimática do amido é preferida porque não envolve nenhum efeito prejudicial sobre o material de fibra. A fim de reduzir os custos de processamento e aumentar o rendimento da moagem, o processamento de desengoma- gem algumas vezes é combinado com as etapas de esfregação e alve- jamento. Nesses casos, são usados auxiliares não enzimáticos como, por exemplo, agentes alcalinos ou de oxidação, para degradar o amido, porque as alfa-amilases tradicionais não são muito compatíveis com níveis elevados de pH e agentes alvejantes. A degradação não enzimática da goma de amido causa algum dano às fibras por causa das substâncias químicas agressivas usadas. Consequentemente, seria desejável utilizar as variantes de alfa-amilase, na medida em que elas possuem um desempenho aprimorado em soluções alcalinas. As alfa-amilases podem ser usadas isoladamente ou em combinação com uma celulase quando é feita a desengomagem de tecidos ou têxteis que contêm celulose.

[00274] Os processos de desengomagem e alvejamento são bem- conhecidos na técnica. Por exemplo, esses processos são descritos em WO 95/21247, Patente U.S. N° 4.643.736, EP 119.920, aqui incorporados por referência.

[00275] Produtos comercialmente disponíveis para desengomagem incluem OPTISIZE® FLEX de Genencor.

10.15. Processos de limpeza e composições detergentes

[00276] As alfa-amilases variantes aqui descritas podem ser adicionadas e, dessa forma, se tornar um componente de uma composição detergente para vários processos de limpeza e lavagem, incluindo lavagem de roupas e lavagem de louça.

[00277] A composição detergente aqui fornecida pode, por exemplo, ser formulada como uma composição detergente para lavagem de roupas manualmente ou em máquinas, incluindo uma composição de aditivo para lavagem de roupas adequada ao pré-tratamento de tecidos tingidos e uma composição amaciante de tecidos adicionada no enxágue, ou pode ser formulada como uma composição detergente para uso na limpeza doméstica geral de operações em superfícies rígidas, ou pode ser formulada para operações de lavagem de louça manualmente ou em máquinas.

[00278] Em um aspecto específico, é aqui fornecido um aditivo detergente que compreende uma enzima variante aqui descrita. O aditivo detergente, bem como a composição detergente, pode compreender uma ou mais outras enzimas como, por exemplo, uma protease, uma lipase, uma peroxidase, outra enzima amilolítica, por exemplo, outra alfa-amilase, glicoamilase, amilase maltogênica, CGTase e/ou uma celulase mananase (por exemplo, MANNASTAR® de Danisco US Inc., Genencor Division)), pectinase, pectina liase, cutinase e/ou lacase.

[00279] Em geral, as propriedades da(s) enzima(s) escolhida(s) devem ser compatíveis com o detergente selecionado (ou seja, pH ótimo, compatibilidade com outros ingredientes enzimáticos e não enzimáti- cos etc.), e a(s) enzima(s) deve estar presente em quantidades eficazes.

[00280] Proteases: proteases adequadas incluem aquelas de origem animal, vegetal ou microbiana. A origem microbiana é preferida. Mutantes modificados quimicamente ou com proteína criada geneticamente estão incluídos. A protease podem ser uma serina protease ou uma metaloprotease, preferivelmente uma protease microbiana alcalina ou uma semelhante à protease tripsina. Exemplos de proteases alcalinas são subtilisinas, especialmente aquelas derivadas de Bacillus, por exemplo, subtilisina Novo, subtilisina Carlsberg, subtilisina 309, subtilisina 147 e subtilisina 168 (descritas em WO 89/06279). Exemplos de semelhantes à protease tripsina são tripsina (por exemplo, de origem suína ou bovina) e a protease de Fusarium descrita em WO 89/06270 e WO 94/25583.

[00281] Enzimas protease preferidas disponíveis comercialmente incluem ALCALASE®, SAVINASE®, PRIMASE®, DURALASE®, ES- PERASE®, e KANNASE® (de Novozymes A/S), MAXATASE®, MA- XACAL, MAXAPEM®, PROPERASE®, PURAFECT®, PURAFECT OXP®, FN2®, FN3®, FN4® (Genencor International Inc.).

[00282] Lipases: lipases adequadas incluem aquelas de origem bacteriana ou fúngica. Mutantes modificados quimicamente ou com proteína criada geneticamente estão incluídos. Exemplos de lipases úteis incluem lipases de Humicola (sinônimo Thermomyces), por exemplo, de H. lanuginosa (T. lanuginosus), como descrito em EP 258 068 e EP 305 216, ou de H. insolens, como descrito em WO 96/13580, uma lipase de Pseudomonas, por exemplo, de P. alcaligenes ou P. pseudoalcaligenes (EP 218 272), P. cepacia (EP 331 376), P. stutzeri (GB 1,372,034), P. fluorescens, Pseudomonas spp. cepa SD 705 (WO 95/06720 e WO 96/27002), P. wisconsinensis (WO 96/12012), uma lipase de Bacillus, por exemplo, de B. subtilis (Dartois et al. (1993), Bi- ochemica et Biophysica Acta, 1.131, 253-360), de B. stearothermophi- lus (JP 64/744992) ou B. pumilus (WO 91/16422). Outros exemplos são variantes de lipase como, por exemplo, aquelas descritas em WO 92/05249, WO 94/01541, EP 407 225, EP 260 105, WO 95/35381, WO 96/00292, WO 95/30744, WO 94/25578, WO 95/14783, WO 95/22615, WO 97/04079 e WO 97/07202.

[00283] Enzimas lipase preferidas disponíveis comercialmente incluem LIPOLASE® e LIPOLASE ULTRA® (Novozymes A/S).

[00284] Amilases: uma ou mais amilases adicionais também podem ser incluídas. Amilases adequadas (alfa e/ou beta) incluem aquelas de origem bacteriana ou fúngica. Mutantes modificados quimicamente ou com proteína criada geneticamente estão incluídos. Amilases incluem, por exemplo, alfa-amilases obtidas de Bacillus, por exemplo, uma cepa especial de B. licheniformis, descrita com mais detalhes em GB 1.296.839. Exemplos de alfa-amilases úteis são as variantes descritas em WO 94/18314, WO 96/39528, WO 94/02597, WO 94/18314, WO 96/23873 e WO 97/43424, especialmente as variantes com substituições em uma ou mais das seguintes posições: 15, 23, 105, 106, 124, 128, 133, 154, 156, 181, 188, 190, 197, 202, 208, 209, 243, 264, 304, 305, 391, 408 e 444.

[00285] Alfa-amilases disponíveis comercialmente são DURAMYL®, LlQUEZYME® TERMAMY®, NATALASE®, FUNGAMYL® e BAN® (No- vozymes A/S), RAPIDASE® e PURASTAR® (de Genencor).

[00286] Celulases: celulases adequadas incluem aquelas de origem bacteriana ou fúngica. Mutantes modificados quimicamente ou com proteína criada geneticamente estão incluídos. Celulases adequadas incluem celulases dos gêneros Bacillus, Pseudomonas, Trichoderma, Humicola, Fusarium, Thielavia, Acremonium, por exemplo, as celula- ses fúngicas produzidas por Humicola insolens, Myceliophthora thermophila e Fusarium oxisporum descritas na Patente U.S. N° 4.435.307, na Patente U.S. N° 5.648.263, na Patente U.S. N° 5.691.178, na Patente U.S. N° 5.776.757 e WO 89/09259. As celulases de Trichoderma reesei são descritas na Patente U.S. N° 4.689.297, na Patente U.S. N° 5.814.501, na Patente U.S. N° 5.324.649, WO 92/06221 e WO 92/06165. Celulases de Bacillus são descritas na Patente U.S. N° 6.562.612.

[00287] Celulases disponíveis comercialmente incluem CELLUZYME® e CAREZYME® (Novozymes A/S), CLAZINASE® e PURADAX HA® (Genencor International Inc.), e KAC-500(B)® (Kao Corporation).

[00288] Peroxidases/oxidases: peroxidases/oxidases adequadas incluem aquelas originárias de plantas, de origem bacteriana ou fúngica. Mutantes modificados quimicamente ou com proteína criada gene-ticamente estão incluídos. Exemplos de peroxidases úteis incluem pe-roxidases de Coprinus, por exemplo, de C. cinereus, e variantes destas, como aquelas descritas em WO 93/24618, WO 95/10602 e WO 98/15257.

[00289] Peroxidases disponíveis comercialmente incluem GUAR- DZYME® (Novozymes A/S).

[00290] A(s) enzima(s) do detergente pode ser incluída em uma composição detergente por adição de aditivos separados contendo uma ou mais enzimas, ou por adição de um aditivo combinado que compreende todas essas enzimas. Um aditivo detergente, por exemplo, um aditivo separado ou um aditivo combinado, pode ser formulado, por exemplo, granulado, um líquido, um caldo etc. formulações de aditivo detergente preferido são granulados, em particular granulados não dispersantes, líquidos, em particular líquidos estabilizados ou caldos.

[00291] Granulados não dispersantes podem ser produzidos, por exemplo, como descrito nas Patentes U.S. Nos 4.106.991 e 4.661.452, e podem opcionalmente ser revestidos por métodos conhecidos na técnica. Exemplos de materiais de revestimento encerados são produtos de poli(óxido de etileno) (polietilenoglicol, PEG) com pesos molares médios de 1.000 a 20.000; nonil-fenóis etoxilados que possuem de 16 a 50 unidades de óxido de etileno; alcoóis graxos etoxilados nos quais o álcool contém de 12 a 20 átomos de carbono e nos quais há 15 a 80 unidades de óxido de etileno; alcoóis graxos; ácidos graxos; e mono- e di- e triglicerídeos de ácidos graxos. Exemplos de materiais de revestimento formadores de película adequados para aplicação por técnicas de leito fluidizado são dados em GB 1483591. As preparações líquidas de enzima podem ser estabilizadas, por exemplo, por adição de um poliol como, por exemplo, propileno glicol, um açúcar ou álcool de açúcar, ácido lático ou ácido bórico de acordo com métodos estabelecidos. Enzimas protegidas podem ser preparadas de acordo com o método descrito em EP 238.216.

[00292] A composição detergente pode estar em qualquer forma conveniente, por exemplo, uma barra, um comprimido, um pó, um grânulo, uma pasta ou um líquido. Um detergente líquido pode ser aquoso, contendo tipicamente até cerca de 70% de água e 0 a cerca de 30% de solvente orgânico, ou não aquoso.

[00293] A composição detergente compreende um ou mais tensoa- tivos, que podem ser não iônicos, incluindo semipolares e/ou aniônicos e/ou catiônicos e/ou zwitteriônicos. Os tensoativos estão tipicamente presentes em um nível de cerca de 0,1% a 60% em peso.

[00294] Quando aqui incluído, o detergente normalmente conterá de cerca de 1% a cerca de 40% de um tensoativo aniônico como, por exemplo, alquilbenzenosulfonato linear, alfa-olefinsulfonato, alquil sulfato (sulfato de álcool graxo), álcool etóxi-sulfato, alcanossulfonato secundário, éster metílico de ácido alfa-sulfo graxo, ácido alquil- ou al- quenil-succínico ou sabão.

[00295] Quando aqui incluído, o detergente normalmente conterá de cerca de 0,2% a cerca de 40% de um tensoativo não iônico como, por exemplo, álcool etoxilato, nonil-fenol etoxilato, alquilpoliglicosídeo, alquildimetilamina-óxido, monoetanol-amida de ácido graxo etoxilado, monoetanolamida de ácido graxo, amida de ácido polihidróxi alquil graxo, ou derivados N-acil N-alquil de glucosamina ("glucamidas").

[00296] O detergente pode conter 0 a cerca de 65% de um agente formador ou criador de complexos de detergente como, por exemplo, zeolita, difosfato, trifosfato, fosfonato, carbonato, citrato, ácido nitrilotri- acético, ácido etilenodiaminatetra-acético, ácido dietileno-triamina- penta-acético, ácido alquil- ou alquenil-succínico, silicatos solúveis ou silicatos estratificados (por exemplo, SKS-6 de Hoechst).

[00297] O detergente pode compreender um ou mais polímeros. Exemplos são carboximetilcelulose, poli(vinil-pirrolidona), poli (etileno glicol), poli(álcool vinílico), poli(vinilpiridina-N-óxido), poli(vinilimidazol), policarboxilatos como, por exemplo, poliacrilatos, copolímeros de ácido maleico/acrílico e co-polímeros de ácido lauril metacrilato/acrílico.

[00298] O detergente pode conter um sistema alvejante, que pode compreender uma fonte H2O2 como, por exemplo, perborato ou per-carbonato, que pode ser combinada com um ativador de alvejante formador de perácido como, por exemplo, tetra-acetil-etileno-diamina ou nonanoil-oxibenzenossulfonato. Alternativamente, o sistema alvejante pode compreender peróxi-ácidos, por exemplo, do tipo amida, imida ou sulfona.

[00299] A(s) enzima(s) da composição detergente pode ser estabilizada com a utilização de agentes estabilizantes convencionais, por exemplo, um poliol como, por exemplo, propileno glicol ou glicerol, um açúcar ou álcool de açúcar, ácido lático, ácido bórico, ou um derivado de ácido bórico, por exemplo, um éster de borato aromático, ou um derivado de ácido fenil borônico como, por exemplo, ácido 4-formilfenil borônico, e a composição pode ser formulada como descrito, por exemplo, em WO 92/19709 e WO 92/19708.

[00300] O detergente também pode conter outros ingredientes de detergente convencionais como, por exemplo, condicionadores de tecido, incluindo argilas, intensificadores de espuma, supressores de bolhas, agentes anticorrosão, agentes de suspensão de manchas, agentes anti-re-deposição de manchas, corantes, bactericidas, agentes que aumentam o brilho óptico, hidrótropos, inibidores de manchas ou perfumes.

[00301] No momento, contempla-se que, nas composições detergentes, qualquer enzima, em particular uma ou mais das enzimas variantes aqui descritas, pode ser adicionada em uma quantidade que corresponde a 0,01-100 mg de proteína de enzima por litro de solução de lavagem, preferivelmente 0,055 mg de proteína de enzima por litro de solução de lavagem, em particular 0,1-1 mg de proteína de enzima por litro de solução de lavagem.

[00302] Uma ou mais das enzimas variantes aqui descritas podem adicionalmente ser incorporadas nas formulações detergentes descritas em WO 97/07202, que é aqui incorporada como referência.

10.16. Composições detergentes para lavagem de louças

[00303] As enzimas também podem ser usadas em composições detergentes para lavagem de louças, incluindo as seguintes: 1) COMPOSIÇÃO PARA LAVAGEM AUTOMÁTICA DE LOUÇAS EM PÓ Tensoativo não iônico 0,4-2,5% Metassilicato de sódio 0-20% Dissilicato de sódio 3-20% Trifosfato de sódio 20-40% Carbonato de sódio 0-20% Perborato de sódio 2-9% Tetra-acetil etileno diamina (TAED) 1-4% Sulfato de sódio 5-33% Enzimas 0,0001-0,1% 2) COMPOSIÇÃO PARA LAVAGEM AUTOMÁTICA DE LOUÇAS EM PÓ Tensoativo não iônico 1-2% (por exemplo, álcool etoxilato) Dissilicato de sódio 2-30% Carbonato de sódio 10-50% Fosfonato de sódio 0-5% Di-hidrato de tricitrato de sódio 9-30% Acetato nitrilotrissódico (NTA) Mono-hidrato de perborato de sódio Tetra-acetil etileno diamina (TAED) Polímero de poliacrilato 0-20% 5-10% 1-2% 6-25% (por exemplo, copolímero de ácido maleico ácido/acrílico) Enzimas 0,0001-0,1% Perfume 0,1-0,5% Água 5-10% 3) COMPOSIÇÃO PARA LAVAGEM AUTOMÁTICA DE LOUÇAS EM PÓ Tensoativo não iônico 0,5-2,0% Dissilicato de sódio 25-40% Citrato de sódio 30-55% Carbonato de sódio 0-29% Bicarbonato de sódio 0-20% Mono-hidrato de perborato de sódio 0-15% Tetra-acetil etileno diamina (TAED) Copolímero de 0-6% ácido maleico/ ácido acrílico 0-5% Argila 1-3% Poliaminoácidos 0-20% Poliacrilato de sódio 0-8% Enzimas 0,0001-0,1% 4) COMPOSIÇÃO PARA LAVAGEM AUTOMÁTICA DE LOUÇAS EM PÓ Tensoativo não iônico 1-2% Zeólita MAP 15-42% Dissilicato de sódio 30-34% Citrato de sódio 0-12% Carbonato de sódio 0-20% Mono-hidrato de perborato de sódio 7-15% Tetra-acetil etileno 0-3% Polímero de diamina (TAED) Copolímero de 0-4% ácido maleico/ácido acrílico 0-5% Fosfonato orgânico 0-4% Argila 1-2% Enzimas 0,0001-0,1% Sulfato de sódio Equilíbrio 5) COMPOSIÇÃO PARA LAVAGEM AUTOMÁTICA DE LOUÇAS EM PÓ Tensoativo não iônico 1-7% Dissilicato de sódio 18-30% Tricitrato de sódio 10-24% Carbonato de sódio 12-20% Mono-persulfato 15-21% (2KHSO5.KHSO4.K2SO4) Estabilizador de alvejante 0,1-2% Copolímero de ácido maleico/ácido acrílico 0-6% Penta-acetato de dietileno triamina, Sal pentassódico 0-2,5% Enzimas 0,0001-0,1% Sulfato de sódio, água Equilíbrio 6) COMPOSIÇÃO PARA LAVAGEM DE LOUÇAS EM PÓ E LÍQUIDA COM SISTEMA DE LIMPEZA COM TENSOATIVO Tensoativo não iônico 0-1,5% Di-hidrato de N-óxido de octadecil dimetilamina 0-5% 80:20 p. C18/C16 mistura de octadecil dimetilamina 0-4% Di-hidrato N-óxido e di-hidrato de hexadecildimetil amina N-óxido 70:30 p. C18/C16 mistura de octadecil bis 0-5% (hidroxietil)amina N-óxido anidro e hexadecil bis (hidroxietil)amina N-óxido anidro C13-C15 alquil etóxi-sulfato com um grau médio de 0-10% etoxilação de 3 C12-C15 alquil etóxi-sulfato com um grau médio de 0-5% etoxilação de 3 C13-C15 álcool etoxilado com um grau médio de 0-5% etoxilação de 12 Uma mistura de C12-C15 alcoóis etoxilados com um 0-6,5% grau médio de etoxilação de 9 Uma mistura de C13-C15 alcoóis etoxilados com um 0-4% grau médio de etoxilação de 30 Dissilicato de sódio 0-33% Tripolifosfato de sódio Citrato de sódio Ácido cítrico 0-46% 0-28% 0-29% Carbonato de sódio 0-20% Mono-hidrato de perborato de sódio Tetra-acetil etileno diamina (TAED) Copolímero de ácido maleico/ácido acrílico 0-11,5% 0-4% 0-7,5% Sulfato de sódio 0-12,5% Enzimas 0,0001-0,1% 7) COMPOSIÇÃO LÍQUIDA NÃO AQUOSA PARA LAVAGEM AU-TOMÁTICA DE LOUÇAS Tensoativo não iônico líquido (por exemplo, álcool etoxilatos) Silicato de metal alcalino 2,0-10,0% 3,0-15,0% Fosfato de metal alcalino Veículo líquido selecionado de glicóis superiores, poliglicóis, polióxidos, glicol-éteres Estabilizante (por exemplo, um éster parcial de ácido fosfórico e um C16-C18 alcanol) Supressor de espuma (por exemplo, silicone) Enzimas 20,0-40,0% 25,0-45,0% 0,5-7,0% 0-1,5% 0,0001-0,1% 8) COMPOSIÇÃO PARA LAVAGEM DE LOUÇAS LÍQUIDA NÃO AQUOSA Tensoativo não iônico líquido (por exemplo, álcool etoxilatos) Silicato de sódio Carbonato de metal alcalino Citrato de sódio Sistema estabilizante (por exemplo, misturas de silicone finamente dividido e éteres de dialquil poliglicol de baixo peso molecular) Polímero de poliacrilato de baixo peso molecular Espessante de gel de argila (por exemplo, bentonita) Polímero de hidroxipropil celulose Enzimas Veículo líquido selecionado de glicóis superiores, poliglicóis, polióxidos e éteres de glicol 0,5-7,0% 5,0-15,0% 0,0-10,0% 0,0-0,6% 0,0001-0,1% Equilíbrio 9) COMPOSIÇÃO LÍQUIDA TIXOTRÓPICA PARA LAVAGEM AU- TOMÁTICA DE LOUÇAS C12-C14 ácido graxo Tensoativo de copolímero em bloco Citrato de sódio 0-0,5% 1,5-15,0% 0-12% Tripolifosfato de sódio Carbonato de sódio 0-15% 0-8% Triestearato de alumínio 0-0,1% Cumeno sulfonato de sódio 0-1,7% Espessante de poliacrilato Poliacrilato de sódio 1,32-2,5% 2,4-6,0% Ácido bórico 0-4,0% Formiato de sódio 0-0,45% Formiato de cálcio 0-0,2% Dissulfonato de n-decildifenil óxido de sódio 0-4,0% Monoetanol amina (MEA) Hidróxido de sódio (50%) 1,2-Propanodiol Enzimas 0-1,86% 1,9-9,3% 0-9,4% 0,0001-0,1% Supressor de manchas, corante, perfumes, água Equilíbrio 10) COMPOSIÇÃO LÍQUIDA PARA LAVAGEM AUTOMÁTICA DE LOUÇAS Álcool etoxilato 0-20% Sulfonato de éster ácido graxo 0-30% Dodecil sulfato de sódio 0-20% Alquil poliglicosídeo 0-21% Ácido oleico 0-10% Mono-hidrato de dissilicato de sódio 18-33% Di-hidrato de citrato de sódio 18-33% Estearato de sódio 0-2,5% Mono-hidrato de perborato de sódio 0-13% Tetra-acetil etileno diamina (TAED) 0-8% Copolímero de Ácido maleico/ácido acrílico 4-8% Enzimas 0,0001-0,1% 11) COMPOSIÇÃO LÍQUIDA PARA LAVAGEM AUTOMÁTICA DE LOUÇAS CONTENDO PARTÍCULAS PROTEGIDAS DE ALVEJANTE Silicato de sódio 5-10% Pirofosfato de tetrapotássio 15-25% Trifosfato de sódio 0-2% Carbonato de potássio 4-8% Partículas protegidas de alvejante, por exemplo, cloro 5-10% Espessante polimérico 0,7-1,5% Hidróxido de potássio 0-2% Enzimas 0,0001-0,1% Água Equilíbrio 12) Composições para lavagem automática de louça como descritas em 1), 2), 3), 4), 6) e 10), em que o perborato é substituído por percar-bonato. 13) Composições para lavagem automática de louça como descritas em 1)-6) que adicionalmente contêm um catalisador de manganês. O catalisador de manganês pode ser, por exemplo, um dos compostos descritos em "Efficient manganese catalysts for low-temperature blea-ching", Nature 369: 637-39 (1994). 14) FORMULAÇÕES DETERGENTES LÍQUIDAS HDL PREMIUM Bio-Soft S-101 Ácido alquilbenzeno sulfônico linear Steol CS-330 Laureth sulfato de sódio Bio-soft N25-7 Alquiletoxilato linear com 7 moles de EO Stepanate SXS Xileno sulfonato de sódio 15) FORMULAÇÃO DETERGENTE ULTRA LÍQUIDA Tionopal CBS-X Agente de branqueamento fluorescente Alpha-etapa MC-48 Alfa-sulfometil-éster de sódio Makon TD-6 Tridecil-álcool-etoxilato

10 17 Uso de variantes em conjunto com outras enzimas: fitases 10.17.1 Uso de fitases

[00304] Fitases úteis nesta invenção incluem enzimas capazes de hidrolisar fitatos e/ou ácido fítico sob as condições de uso, por exemplo, as etapas de incubação e/ou liquefação. Em algumas modalidades, a fitase é capaz de liberar pelo menos um fosfato inorgânico de um hexafosfato de inositol (por exemplo, ácido fítico). As fitases podem ser agrupadas de acordo com sua preferência por uma posição específica do grupo éster fosfato na molécula de fitato na qual a hidrólise é iniciada (por exemplo, como 3-fitases (EC 3.1.3.8) ou como 6- fitases (EC 3.1.3.26)). Um exemplo típico de fitase é mioinositol- hexaquifosfato-3-fosfohidrolase.

[00305] As fitases podem ser obtidas de micro-organismos como, por exemplo, organismos fúngicos e bacterianos. Alguns desses mi cro-organismos incluem, por exemplo, Aspergillus (por exemplo, A. niger, A. terreus, A. ficum e A. fumigatus), Myceliophthora (M. thermophila), Talaromyces (T. thermophilus), Trichoderma spp (T. reesei) e Thermomyces (WO 99/49740). Também são disponíveis fitases de espécies Penicillium, por exemplo, P. hordei (N° ATCC 22053), P. pi- ceum (N° ATCC 10519) ou P. brevi-compactum (N° ATCC 48944). Veja, por exemplo, USP 6.475.762. Além disso, estão disponíveis fitases de Bacillus (por exemplo, B. subtilis, Pseudomonas, Peniophora, E. coli, Citrobacter, Enterbacter e Buttiauxella (veja, por exemplo, WO 2006/043178).

[00306] Estão disponíveis fitases comerciais como, por exemplo, NATUPHOS (BASF), RONOZYME P (Novozymes A/S), PHZYME (Da- nisco A/S, Diversa) e FINASE (AB Enzymes). O método para determi-nação da atividade de fitase microbiana e da definição de uma unidade de fitase foi publicado por Engelen et al. (1994) J. of AOAC International, 77: 760 - 764. A fitase pode ser uma fitase do tipo selvagem, uma variante ativa ou fragmento ativo desta.

[00307] Em uma modalidade, a fitase é derivada da bactéria Butti- auxiella spp. A Buttiauxiella spp. inclui B. agrestis, B. brennerae, B. ferragutiase, B. gaviniae, B. izardii, B. noackiae e B. warmboldiae. Cepas de espécies de Buttiauxella estão disponíveis por DSMZ, pelo "German National Resource Center for Biological Material" (Inhoffens- trabe 7B, 38124 Braunschweig, Alemanha). A cepa de Buttiauxella sp. P1-29 depositada sob número de acesso NCIMB 41248 é um exemplo de uma cepa particularmente útil da qual uma fitase útil pode ser obtida. Em algumas modalidades, a fitase é BP-do tipo selvagem, uma variante desta (por exemplo, BP-11) descrita em WO 06/043178 ou uma variante como descrita no Pedido de Patente U.S. N° 11/714.487, depositado em 6 de março de 2007. Por exemplo, uma BP-do tipo selvagem e variantes desta são descritas na Tabela 1 de WO 06/043178, em que a numeração é feita em referência aa SEQ ID N°: 3 do pedido PCT publicado.

[00308] Em uma modalidade preferida, uma fitase útil é aquela que possui pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 88%, pelo menos 90%, pelo menos 93%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% e pelo menos 99% de identidade de sequência para a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID N°: 31 mostrada abaixo ou uma variante ativa desta. Mais preferivelmente, a fitase terá pelo menos 95% a 99% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID N°: 31 ou uma variante ativa desta. Em algumas modalidades, a fitase compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°: 31. Ainda em outras, a fitase é a SEQ ID N°: 31. Sequência da proteína madura da fitase de Buttiauxella BP-17 (SEQ ID N°: 31) NDTPASGYQV EKVVILSRHG VRAPTKMTQT MRDVTPNTWP EWPVKLGYIT PRGEHLISLM GGFYRQKFQQ QGILSQGSCP TPNSIYVWAD VDQRTLKTGE AFLAGLAPQC GLTIH- HQQNL EKADPLFHPV KAGTCSMDKT QVQQAVEKEA QTPIDN- LNQH YIPFLALMNT TLNFSTSAWC QKHSADKSCD LGLSMPSKLS IKDNGNKVAL DGAIGLSSTL AEIFLLEYAQ GMPQAAWGNI HSEQE- WASLL KLHNVQFDLM ARTPYIARHN GTPLLQAISN ALNPNATESK LPDISPDNKI LFIAGHDTNI ANIAGMLNMR WTLPGQPDNT PPGGAL- VFER LADKSGKQYV SVSMVYQTLE QLRSQTPLSL NQPAGSVQLK IPGCNDQTAE GYCPLSTFTR VVSQSVEPGC QLQ

[00309] Em algumas modalidades, a quantidade (dosagem) de fi- tase usada nos processos de incubação e/ou liquefação está na faixa cerca de 0,001 a 50 FTU/g de ds (por exemplo, na faixa de cerca de 0,01 a 25 FTU/g de ds, cerca de 0,01 a 15 FTU/g de ds, cerca de 0,01 a 10 FTU/g de ds, cerca de 0,05 a 15 FTU/g de ds, ou cerca de 0,05 a 5,0 FTU/g).

10.17.2 Determinação da atividade de fitase (FTU)

[00310] A "atividade de fitase" ("FTU") é medida pela liberação de fosfato inorgânico. O fosfato inorgânico forma um complexo amarelo com reagente ácido de molibdato/vanadato; e o complexo amarelo é medido em um comprimento de onda de 415 nm em um espectrofotô- metro e o fosfato inorgânico liberado é quantificado com uma curva- padrão de fosfato. Uma unidade de fitase (FTU) é a quantidade de enzima que libera 1 micromol de fosfato inorgânico de fitato por minuto sob as condições de reação definidas no "European Standard" (CEN/TC 327,2005-TC327WI 003270XX).

10.17.3 Determinação do teor de ácido fítico

[00311] Teor de ácido fítico: o ácido fítico foi extraído da amostra por ajuste do pH do caldo 5% (se for a amostra seca) até o pH 10 e depois determinado por um método de HPLC usando uma coluna de troca iônica. O ácido fítico foi eluído da coluna usando um sistema de gradiente de NaOH. O teor de ácido fítico no líquido foi então calculado por comparação com um padrão de um ácido fítico.

11. Composições (misturas) que compreendem as alfa-amilases variantes

[00312] Em um de seus vários aspectos, esta invenção fornece composições que compreendem: a) pelo menos uma variante de alfa-amilase que compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 95% idêntica àquela de uma alfa-amilase parental semelhante à AmyS, e que possui uma substituição em uma posição de aminoácido que corresponde à posição 242 de uma alfa-amilase de referência, a referida variante possuindo atividade detectável de alfa-amilase, e b) pelo menos uma enzima adicional.

[00313] A variante é alterada, quando comparada com uma alfa- amilase parental semelhante à AmyS ou uma alfa-amilase de referência, em um ou mais de quaisquer atributos úteis ou mensuráveis, incluindo carga elétrica líquida, especificidade de substrato, clivagem de substrato, ligação de substrato, estabilidade térmica, atividade em um ou mais pHs, estabilidade em um ou mais pHs, estabilidade em condições oxidantes, necessidades de Ca2+, atividade específica, taxa catalítica, eficiência catalítica, atividade na presença de um fitato, estabilidade térmica ou de pH na presença de um fitato, capacidade de efetuar viscosidade de pico em um teste de liquefação, ou capacidade de efetuar viscosidade final em um teste de liquefação. Em modalidades preferidas, a variante terá mais de um atributo alterado, por exemplo, termoestabilidade aprimorada, e a capacidade de reduzir a viscosidade de pico em uma liquefação, ou a capacidade de reduzir tanto a viscosidade de pico quanto a viscosidade final em uma liquefação, quando comparada com uma alfa-amilase parente, por exemplo, uma ami- lase semelhante à AmyS.

[00314] Em várias modalidades, a amilase de referência é a SEQ ID N°: 1 ou 2. Outras alfa-amilases podem ser usadas como a alfa-amilase de referência. Prefere-se que a alfa-amilase de referência para uso nesta invenção possua um resíduo de serina na posição de aminoácido 242.

[00315] Em várias modalidades, a enzima adicional é uma fitase, protease, lipase, pululanase, glicoamilases, isomerase, ou outras enzimas úteis em um processo comercial em conjunto com uma alfa- amilase. Essas enzimas são conhecidas na técnica no processamento do amido, conversão de açúcar, fermentações para álcool e outros produtos finais úteis, detergentes e auxiliares de limpeza comerciais, remoção de manchas, tratamento ou desengomagem de tecidos, e similares. Enzimas adicionais atualmente preferidas são fitases. Uma modalidade utiliza uma fitase que compreende a SEQ ID N°: 17.

[00316] Em certas modalidades, a variante é uma variante S242A, S242D, S242E, S242F, S242G, S242H, S242L, S242M, S242N,S242Q ou S242T. Essas variantes são exemplificadas e caracterizadas nos exemplos de trabalho aqui fornecidos.

[00317] A variante, em algumas modalidades, ainda compreende uma modificação de sequência em uma ou mais posições de aminoá- cidos que correspondem às posições de aminoácidos 97, 179, 180, 193, 319, 349, 358, 416, 428 ou 443 da amilase de referência, por exemplo, SEQ ID N°: 1 ou 2. Mais especificamente, a variante compreende uma ou mais das substituições nas posições da seguinte forma: uma cisteína em 349, uma cisteína em 428, um ácido glutâmico em 97, uma arginina em 97, um ácido glutâmico em 319, uma arginina em 319, um ácido glutâmico em 358, uma arginina em 358, um ácido glutâmico em 443 ou uma arginina em 443. A substituição de uma N193 ou de uma V416 ou ambas, por exemplo, uma substituição de N193F ou V416G, ou ambas, são úteis nesta invenção para variantes. A eliminação de aminoácidos que correspondem às posições 179 e 180 também pode ser aqui usada com qualquer amilase variante.

[00318] Em uma modalidade da composição, a variante de alfa- amilase possui pelo menos 95% de homologia para a SEQ ID N°: 2 e compreende uma substituição de aminoácido 242 em relação à numeração em uma amilase de referência que compreende a sequência de aminoácidos SEQ ID N°: 1. Como acima, a variante preferivelmente possui atividade detectável de alfa-amilase sob condições que permitem essa atividade.

[00319] Amilases parentes úteis são discutidas acima. Em algumas modalidades, a alfa-amilase parente é a SEQ ID N°: 1, 2, 15 ou 16. Em outras, a alfa-amilase parente é a SEQ ID N°: 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12.

[00320] Em várias modalidades, a amilase variante e a fitase estão presentes em quantidades tais que a proporção de AAU:FTU seja de cerca de 1:15 a cerca de 15:1. De preferência, em algumas modalidades, a amilase variante e a fitase estão presentes em quantidades tais que a proporção de AAU:FTU seja de cerca de 1:4 a cerca de 3:1.

12. Métodos para utilização das variantes com outras enzimas

[00321] Em outro aspecto, esta invenção fornece de utilização das alfa-amilases variantes em conjunto com outras enzimas, particularmente fitases. Em uma modalidade, são fornecidos métodos para o tratamento de um caldo de amido. O tratamento pode ser parte de um processo de liquefação, um processo de sacarificação, um processo de fermentação, e similares. O método geralmente compreende as etapas de: a) adição de pelo menos uma fitase e pelo menos uma alfa- amilase ao caldo de amido, e b) incubação do caldo de amido sob condições que permitem a atividade da fitase e da alfa-amilase. O método engloba qualquer uma ou mais etapas de adição, de tal forma que a fitase e a alfa-amilase sejam adicionadas ao mesmo tempo, ou aproximadamente ao mesmo tempo, ou separadamente, em qualquer ordem (ou seja, primeiro fitase ou primeiro amilase), com qualquer quantidade útil de separação temporal entre essas etapas de adição. Como ocorre com as composições, a alfa-amilase é uma amilase variante que compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 95% idêntica àquela de uma alfa-amilase parental semelhante à AmyS, e que possui uma substituição em uma posição de aminoácido que corresponde à posição 242 de uma alfa-amilase de referência. A variante possui atividade detectável de alfa-amilase.

[00322] Em uma modalidade, a variante é alterada, quando comparada com uma alfa-amilase parental semelhante à AmyS ou a amilase de referência, em qualquer um ou mais de carga elétrica líquida, espe-cificidade de substrato, clivagem de substrato, ligação de substrato, estabilidade térmica, atividade em um ou mais pHs, estabilidade em um ou mais pHs, estabilidade em condições oxidantes, necessidades de Ca2+, atividade específica, taxa catalítica, eficiência catalítica, atividade na presença de um fitato, estabilidade térmica ou de pH na presença de um fitato, capacidade de efetuar viscosidade de pico em um teste de liquefação e/ou capacidade de efetuar viscosidade final em um teste de liquefação.

[00323] Como discutido acima, o uso de fitases pode trazer um impacto sobre a estabilidade ou outras propriedades de alfa-amilases pelo alívio de alguma inibição sobre a atividade de alfa-amilase em função da presença de um ou mais fitatos no material de planta, por exemplo, grãos triturados. Sem se prender a uma teoria em particular, a remoção pelo menos parcial dos fitatos parece aprimorar uma ou mais propriedades da amilase, de tal forma que o rendimento ou os resultados são melhorados.

[00324] As amilases de referência são discutidas acima e, em uma modalidade do método, a amilase de referência é a SEQ ID N°: 1 ou 2.

[00325] Em várias modalidades, a variante é uma variante S242A, S242D, S242E, S242F, S242G, S242H, S242L, S242M, S242N,S242Q ou S242T. Em outras, a variante ainda compreende uma modi-ficação de sequência em uma ou mais posições de aminoácidos que correspondem às posições de aminoácidos 97, 179, 180, 193, 319, 349, 358, 416, 428 ou 443 da amilase de referência. Mais particularmente, a variante compreende uma ou mais das substituições nas posições da seguinte forma: uma cisteína em 349, uma cisteína em 428, um ácido glutâmico em 97, uma arginina em 97, um ácido glutâmico em 319, uma arginina em 319, um ácido glutâmico em 358, uma argi- nina em 358, um ácido glutâmico em 443 ou uma arginina em 443 em várias modalidades. A substituição de uma N193 ou uma V416 ou ambas, por exemplo, uma substituição de N193F ou V416G, ou ambas, também são úteis em certas variantes. Como ocorre com as outras modificações, a eliminação dos aminoácidos 179 e 180 também pode ser usada - isoladamente ou em combinação com qualquer uma das alterações apresentadas anteriormente.

[00326] Em certas modalidades, a alfa-amilase parente é conveni-entemente a SEQ ID N°: 1, 2, 15 ou 16, enquanto, em outras, a alfa- amilase parente é a SEQ ID N°: 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12.

[00327] Em uma modalidade, a etapa de adição compreende a adição da fitase antes da amilase. De preferência, quando a fitase é adicionada primeiro, o caldo é pré-incubado após a adição da fitase e antes da adição da alfa-amilase, por exemplo, por tempo suficiente para reduzir de forma mensurável o teor de fitato.

[00328] Em várias modalidades, a inclusão da fitase resulta em um aumento na termoestabilidade da alfa-amilase em relação a um método comparável que não inclui o contato do caldo com fitase.

[00329] Em outras aplicações, a fitase e a amilase estão presentes em uma única mistura, por exemplo, uma mistura comercial, antes da adição ao caldo. Em uma modalidade atualmente preferida, a fitase possui a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°: 17.

[00330] Em outro de seus vários aspectos, esta invenção fornece métodos de produção de um substrato fermentável a partir de um caldo contendo amido que compreendem grãos triturados. O método compreende as etapas de: a) contato do caldo contendo amido com pelo menos uma fitase e pelo menos uma alfa-amilase em uma quantidade suficiente para produzir um substrato fermentável a partir do amido; e b) incubação do caldo de amido sob condições que permitem a atividade da fitase e da alfa-amilase por um tempo que permita a produção do substrato fermentável; em que, quando o contato com a fitase é iniciado antes da amilase, o caldo é incubado em uma temperatura que é cerca de 0-30°C menos do que a temperatura de gelatini- zação antes do contato do caldo com a amilase, quando então a tem-peratura é elevada acima da gelatinização por um tempo eficaz para hidrolisar o amido.

[00331] Em várias modalidades, o contato com a fitase e com a al- fa-amilase é iniciado ao mesmo tempo, ou aproximadamente ao mesmo tempo, ou separadamente em qualquer ordem. A alfa-amilase usada nesses métodos é uma amilase variante que compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 95% idêntica àquela de uma alfa-amilase parental semelhante à AmyS, e que possui uma substituição em uma posição de aminoácido que corresponde à posição 242 de uma alfa-amilase de referência, a referida variante possuindo atividade detectável de alfa-amilase.

[00332] A amilase de referência é a SEQ ID N°: 1 ou 2, e a variante é uma variante S242A, S242D, S242E, S242F, S242G, S242H, S242L, S242M, S242N, S242Q ou S242T em certas modalidades.

[00333] Também são aqui fornecidos kits que compreendem, em uma ou mais embalagens fornecidas como uma unidade: i) pelo menos uma amilase variante que compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 95% idêntica àquela de uma alfa-amilase parental semelhante à AmyS, e que possui uma substituição em uma posição de aminoácido que corresponde à posição 242 de uma alfa-amilase de referência, a referida variante possuindo atividade detectável de alfa-amilase, e ii) pelo menos uma enzima adicional.

[00334] Os kits que ainda compreendem instruções para utilização das enzimas em um processo útil que envolve a clivagem enzimática de moléculas de amido. Os kits também ainda compreendem uma ou mais enzimas adicionais, acidulantes ou outros compostos para o ajuste do pH de um caldo de amido, nutrientes, cofatores, e similares.

[00335] Esta invenção inclui ainda detalhes nos exemplos seguin- tes, que não visam, de forma alguma, limitar o escopo do que é reivin-dicado. As figuras são partes integrais do relatório descritivo e descrição fornecidas. Todas as referências citadas são aqui especificamente incorporadas por referência para tudo que é aqui descrito. Dessa forma, os exemplos seguintes são oferecidos para ilustrar, mas não limitar, o que é reivindicado.

EXEMPLOS Exemplo 1 - Construção de variantes

[00336] As variantes na posição S242 da sequência madura de AmyS foram construídas usando mutagênese sítio-dirigida. O modelo para a mutagênese foi pHPLT-AmyS metilada (veja a figura 2) com o uso de dam-Metilase de New England Biolabs (Massachusetts). Iniciadores degenerados (S242F (direto) e S242R (reverso) SEQ ID Nos: 17 e 18, respectivamente, mostrados abaixo) foram sintetizados e diluídos até 10 μM em Óperon (Huntsville, AL) com sequências diretas e reversas complementares, ambas contendo um grupo fosfato 5' para ligação na reação. A sequência da alfa-amilase parente é a SEQ ID N°: 2. Foram criadas bibliotecas com o kit Stratagene Quik-Change® Multisite (Stratagene, La Jolla CA) usando os iniciadores de oligonucleotí- deos randomizados com NN(G/C) na posição-alvo. O aminoácido selecionado (ou seja, S242) foi substituído aleatoriamente com todas as 19 alternativas possíveis. S242 iniciadores para mutagênese: S242 F: 5' [Phos] GTCAAGCATATTAAGTTCNNSTTTTTT- CCTGATTGGTTG 3' SEQ ID N°: 17 S242 R: 5' [Phos] CAACCAATCAGGAAAAAASNNGAACTTAATA- TGCTTGAC 3' ID DE SEQ. N°: 18

[00337] A reação foi realizada da seguinte forma:

Reação QUIK-CHANGE:

[00338] A reação consistiu em 18 μl de H2O destilada estéril, 2,5 μl de 10x tampão do kit, 1 μl de dNTPs do kit, 1,25 μl dos iniciadores diretos (do estoque de 10 μM), 1,25 μl dos iniciadores reversos (do estoque de 10 μM), 1 μl de plasmídeo DNA de pHPLT-AmyS como modelo (aproximadamente 70 ng) e 1 μl da mistura de enzima do kit para um total de 26,5 μl.

Condições de ciclagem:

[00339] As condições de ciclagem foram 95°C por 1 min uma vez, depois 95°C por 1 min, 55°C por 1 min, 65°C por 10 min por 25 ciclos.

[00340] Um microlitro de Dpn I (10 U/μl) foi adicionado à mistura de reação Multi-site Quik-Change® e incubado a 37°C por 18 horas, e depois mais 0,5 μl foi adicionado por mais 3 horas.

[00341] Um microlitro de reação digerida com DpnI foi usado como modelo para amplificação rolling circle com o kit de amplificação TEM- PLIPHI (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ), e a reação foi realizada de acordo com o protocolo da Amersham. Um microlitro de DNA de rolling circle foi transformado em 100 μl de células competentes de Bacillus subtilis (cepa 2 com protease eliminada de B. subtilis (ΔaprE, ΔnprE, amyE::xilRPxilAcomK-phleo)) e agitado a 37°C por 1 hora. A seguir, toda a transformação foi plaqueada em LA + 10 ppm Neo + placas de amido insolúvel 1% (25 μl em uma placa, 75 μl em outra placa) e incubada de um dia para o outro a 37°C. Noventa e seis trans- formantes fora retirados em 150 μl de LB + 10 ppm de Neo em uma placa de microtitulação e desenvolvidos de um dia para o outro a 37°C. A placa de um dia para o outro foi colocada sobre uma LA + 10 ppm Neo + placa de amido insolúvel a 1% com uma ferramenta de re- plicação de 96 pinos e submetida ao Quintara Biosciences (Berkeley, CA) para PCR da colônia e sequenciamento.

[00342] Após as sequências variantes serem determinadas, as va- riantes foram colocadas em uma placa de microtitulação de 96 poços contendo 125 μl de LB + 10 ppm Neo, dispondo as variantes em um formato quadrangular com controles. A placa de microtitulação disposta foi desenvolvida por 6 horas a 37°C e 250 rpm. Usando uma ferramenta de replicação (Enzyscreen, Leiden, Holanda), a placa de cultura de microtitulação foi usada para inocular uma nova placa de microtitu- lação (placa de microtitulação e tampas das placas de Enzyscreen, Leiden, Holanda) contendo 150 μl de meio MBD para expressão de proteína (G. Vogtentanz et al., "A Bacillus subtilis fusion protein system to produce soybean Bowman-Birk protease inhibitor", Prot. Expr. & Pu- rif. 55 (2007) 40-52) e suplementado com 5 mM de CaCl2 para expressão de proteína. As placas de expressão foram desenvolvidas por 64 horas a 37°C, 250 rpm e 70% de umidade. A seguir, as culturas de expressão foram filtradas através de uma placa de microfiltro (0,22 μm, Millipore, Billerica, MA) e avaliadas quanto à termoestabilidade aprimorada (veja Exemplo 3).

Exemplo 2 - Expressão, purificação e caracterização de variantes

[00343] As colônias foram raspadas das placas de microtitulação do Exemplo 1 sobre placas de amido com 10 ppm de Neomicina. As placas foram incubadas de um dia para o outro a 37°C e colônias únicas foram retiradas e usadas para inocular frascos de agitação (250 ml com 25 ml de meios) contendo meios (veja abaixo) e 20 ppm de Neo- micina. A culturas foram desenvolvidas a 37°C, 275 rpm, por cerca de 8 horas (até que fosse atingida uma OD (600 nm) de 2,0). Os caldos de cultura foram misturados com glicerol 50% em proporção de 2:1, colocados em frascos de cultura rotulados individualmente e congelados a -80°C. A produção subsequente das alfa-amilases selecionadas foi feita a partir desses estoques de glicerol.

[00344] As fermentações para amilases foram realizadas em frascos de agitação de 500 ml desenvolvidos a 37°C por 60 horas em meio de cultura MOPS mínimo (Neidhardt et al., J. Bacteriol. 119(3): 736747, 1974) com Soytone 1% (p/v). As enzimas foram purificadas do caldo de fermentação usando cromatografia por interação hidrofóbica da seguinte forma: o caldo foi concentrado 10 vezes e depois diluído de volta até seu volume original com 50 mM de MES, 2 mM de CaCl2, pH 6,8, com 1 M de sulfato de amônio, e depois filtrado de forma estéril usando um filtro de fibra de vidro. Foram então carregadas amostras em uma coluna de alta densidade FENIL SEFAROSE FF (20 x 95 mm; Amersham, GE Healthcare Bio-Sciences, Sweden) pré-equilibrada com o mesmo tampão. As proteínas não amilase foram removidas com 10 volumes de coluna do mesmo tampão, sem sulfato de amônio, seguidos por 5 volumes de coluna de água. As enzimas de interesse foram eluídas com 50 mM de MES, 2 mM de CaCl2, pH 6,8, contendo propileno glicol a 40%.

[00345] As concentrações de proteína foram determinadas com um método quantitativo padronizado de densitometria em gel SDS-PAGE ou com o uso de um ensaio de atividade utilizando um kit de ensaio de amilase padronizado de Megazyme (Wicklow, Irlanda). Uma curva- padrão gerada com o uso de amilase purificada (amilase de Bacillus 707; SEQ ID N°: 6) foi usada para comparação dos dados do ensaio.

Exemplo 3 - Determinação de propriedades alteradas: estresse térmico

[00346] Este exemplo mostra que as variantes aqui descritas podem ter uma propriedade alterada em relação à alfa-amilase parente. Foi feita uma avaliação da estabilidade térmica de alto rendimento de variantes de alfa-amilase (AmyS) de G. stearothermophilus.

[00347] Após uma investigação inicial, foram escolhidas condições de estresse por aquecimento de tal forma que a enzima do tipo selvagem apresentou aproximadamente 40% de sua atividade inicial (pré- stress) após o estresse por aquecimento (ou seja, (atividade após es- tresse por aquecimento)/(atividade antes do estresse por aquecimento) foi de aproximadamente 0,4). Foram avaliadas bibliotecas de mu- tantes em quadruplicata, e os vencedores potenciais foram identificados como aqueles que mostraram atividade residual após estresse por aquecimento que era de pelo menos dois desvios padrões acima da atividade residual média da enzima do tipo selvagem.

[00348] A expressão de amilase foi de aproximadamente 100 ppm nos sobrenadantes da cultura das placas de expressão. Após 60-65 horas de crescimento a 37°C em uma agitadora umidificada (250 rpm e 70% de umidade relativa), os sobrenadantes da cultura foram clarificados para remover material celular com o uso de placas de filtro. Os sobrenadantes clarificados foram diluídos 10 vezes em tampão contendo 50 mM de NaOAc/2,6 mM de CaCl2/ Tween-20 0,002%, pH 5,8, até uma concentração final de aproximadamente 10 ppm. Uma alíquota de cada sobrenadante foi ainda diluída até 0,02 ppm, para determinação da atividade das variantes da enzima, como descrito abaixo, com o uso de um substrato de amido de milho marcado de forma fluorescente. Uma segunda alíquota de cada sobrenadante foi submetida a um estresse de 30 minutos por aquecimento a 95°C em um ciclador térmico, e depois diluída até 0,02 ppm em 50 mM de NaOAc/2,6 mM de CaCl2/Tween-20 0,002%, pH 5,8, e testada quanto à atividade residual com o uso do substrato fluorescente e do ensaio descrito abaixo.

[00349] A atividade de amilase foi determinada usando o kit de ensaio de amilase ENZCHECK ULTRA AMYLASE basicamente como descrito pelo fabricante (Invitrogen, San Diego CA). A concentração final da amilase no ensaio foi de aproximadamente 0,02 ppm. O tampão de ensaio foi 50 mM de NaOAc/2,6 mM de CaCl2/Tween-20 0,002%, pH 5,8. O substrato foi corante de fluorescência BODIPY conjugado a 100 μg/ml de amido DQ® de milho (Invitrogen, Eugene, OR). A fluorescência aumentada, que indica atividade de amilase, foi medi- da usando um SpectraMAX M2 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). A reação foi monitorada em temperatura ambiente por 5 minutos com o instrumento registrando em modo cinético. O comprimento de onda de excitação foi de 485 nm; a emissão foi monitorada a 520 nm com um filtro com valor de corte a 515 nm.

[00350] A AmyS (Xtra) do tipo selvagem mostrou 33-43% de atividade residual após ser submetida ao estresse térmico por 30 minutos a 95°C. As variantes de AmyS, S242A e S242Q, retiveram 55-65% e 70-80% de atividade residual, respectivamente, após as mesmas condições de estresse térmico. Veja a figura 3 e a Tabela 3-1. Essas medidas da atividade residual indicam que as duas variantes são mais termoestáveis do que a alfa-amilase do tipo selvagem.Tabela 3-1: Percentual da atividade residual de cada variante. Do tipo selvagem (SPEZYME XTRA). Cada placa inclui SPEZYME ETHYL e SPEZYME XTRA como controles, como indicado.

Exemplo 4 - Determinação de propriedades alteradas: DSC

[00351] Spezyme Xtra, S242A, S242E e S242Q foram purificadas do caldo de fermentação do frasco de agitação (veja Exemplo 2) usando cromatografia por interação hidrofóbica. A proteína foi eluída da coluna na forma purificada usando 50 mM de MES, pH 6,8, contendo propileno glicol a 40% e 2 mM de CaCl2.

[00352] Curvas de capacidade de aquecimento excessiva foram medidas usando um microcalorímetro de varredura ultrassensível de alto rendimento, VP-CAP DSC (MicroCal, Inc., Northampton, MA). O procedimento-padrão para as medidas de DSC e a teoria da técnica foram publicados (Freire, E., "Differential Scanning Calorimetry", Methods. Mol. Biol. 41, 191-218, 1995). Aproximadamente 500 μl de 0,5 mg/ml de α-amilase de Bacillus stearothermophilus do tipo selvagem ou variantes S242A, S242E e S242Q (ambos na ausência e na presença de 2 mM de cloreto de cálcio) foram avaliados em uma faixa de temperatura de 30-120°C. A mesma amostra foi então reavaliada para verificar a reversibilidade do processo. Para α-amilase, o processo de desenovelamento térmico foi irreversível. O tampão usado foi 10 mM de acetato de sódio, pH 5,5. Uma taxa de varredura de 200oC/h foi usada pra minimizar quaisquer artefatos que possam ter resultado da agregação. O centro térmico (Tf) das curvas de DSC foi usado como um indicador da estabilidade térmica da proteína testada. A Tabela 4-1 mostra os pontos de fusão térmica para as proteínas de amilase testadas. As curvas de fusão térmica e os pontos de fusão para as amila- ses do tipo selvagem e variantes são mostradas na figura 5.

[00353] O desenovelamento térmico para as variantes de amilase S242A, S242E e S242Q na ausência e presença de 2 mM de cloreto de cálcio mostram um aumento considerável nos pontos de fusão para as variantes, quando comparadas àqueles para a enzima do tipo selvagem. Na ausência de cloreto de cálcio adicionado, a amilase do tipo selvagem possui um ponto de fusão térmica de 100,8°C, enquanto as Tf para S242A, S242E e S242Q são de 106,5°C, 107,8°C e 110,1°C, respectivamente. Dessa forma, a substituição de S242 com A resulta em um aumento na Tf de 5,7°C, a substituição de S242 com E resulta em um aumento na Tf de 7,0°C, e a substituição de S242 com Q resulta em um aumento na Tf de 9,3°C.

[00354] Na presença de 2 mM de cloreto de cálcio, a amilase do tipo selvagem exibiu um ponto de fusão térmica de 106,8°C, enquanto as Tf para S242A, S242E e S242Q foram de 111,8°C, 112,2°C e 113,8°C, respectivamente. Dessa forma, em relação às medidas na ausência de cálcio, na presença de 2 mM de cloreto de cálcio, todas as quatro proteínas tiveram valores de Tf aumentados. O aumento na Tf para a enzima do tipo selvagem e para as variantes S242A na presença de cálcio foi de 6°C e 5,3°C, respectivamente. O aumento na Tf para as variante S242E foi de 4,4°C. O aumento na Tf para a variante S242Q foi de 3,7°C. Isso sugere que a variante S242Q é menos estabilizada por cálcio, ou que a variante é menos dependente do cálcio para estabilidade. O aumento na Tf das variantes S242A, S242E e S242Q em relação à enzima do tipo selvagem na presença de cloreto de cálcio foi de 5°C, 5,4°C e 3°C, respectivamente. Isso sugere que as propriedades termodinâmicas das variantes diferem daquelas da enzima do tipo selvagem, ou Spezyme Xtra. Essa observação foi consistente com seu desempenho aumentado em estudos de aplicação (veja Exemplo 5).Tabela 4-1 Tf (°C) para várias amilases por DSC

Exemplo 5 - Perfis de atividade

[00355] Este exemplo mostra que as variantes testadas possuem perfis de atividade alterados em relação não somente à alfa-amilase parente, mas também a uma enzima industrial padrão. As determinações de proteína foram feitas em amostras purificadas ou na placa. Cada uma das variantes e a alfa-amilases-padrão foram testadas com base em uma concentração igual de proteína.

[00356] As variantes na placa ou purificadas foram diluídas até aproximadamente 20 ppm usando tampão de ácido málico, pH 5,6. O substrato consistiu em amido de milho a 15% nos mesmos 50 mM de tampão de ácido málico, pH 5,6. Quatrocentos microlitros da suspensão de amido foram equilibrados até 70°C por 2,5 minutos. A seguir, 7 μl da enzima diluída foram adicionados rapidamente ao amido equilibrado até uma concentração final de proteína de cerca de 0,36 ppm. A mistura de reação foi então colocada em um bloco de aquecimento em agitação pré-aquecido a 85°C e misturada a 300 rpm. As reações foram extintas com 50 μl de 125 mM de NaOH em intervalos de tempo predeterminados. Os tubos de reação foram centrifugados e o sobre- nadante foi diluído 10 vezes em 10 mM de NaOH, para análise do per-fil de DP por HPAEC-PAD.

[00357] As reações foram ajustadas por 4, 10 e 20 minutos. A reação de 4 minutos fornece uma indicação da conversão inicial da enzima de produto em substrato; a reação de 10 minutos fornece uma indicação da atividade térmica da enzima, e a reação de 20 minutos fornece uma indicação da estabilidade térmica da enzima.

[00358] A área total de DP2 ao final da rodada de HPLC foi integrada, e dividida pela proteína total e pelo tempo de reação. Os resultados são fornecidos nas figuras 6 e 7.

Exemplo 6 - Liquefação no viscosímetro

[00359] Este exemplo mostra que as variantes S242A e S242Q, que mostraram atividade residual alterada em relação à parente do tipo selvagem, também possuem desempenho alterado em relação à alfa-amilase parente. As alfa-amilases variantes do Exemplo 2 foram purificadas e caracterizadas quanto à proteína total e à atividade es-pecífica antes de serem testadas no viscosímetro.

[00360] A redução da viscosidade da farinha de milho em função da ação da alfa-amilase foi monitorada usando um instrumento HAAKE VISCOTESTER 550. O caldo do substrato fresco era feito diariamente em modo de batelada com 30% de sólidos secos de farinha de milho. O pH foi ajustado até 5,8 usando ácido sulfúrico. Cinquenta (50) g do caldo (15 g de sólidos secos) foram pesados e pré-incubados, com agitação, por 10 minutos para aquecer até 70°C. Com a adição de al- fa-amilase, a temperatura foi imediatamente elevada de 70°C a 85°C com uma velocidade de rotação de 75 rpm. Após a temperatura da mistura de caldo e enzima ter alcançado 85°C, a temperatura foi mantida constante. A viscosidade foi monitorada por mais 30 minutos. A viscosidade foi medida ao longo do processo e relatada em μNm. AmyS do tipo selvagem, S242A e S242Q foram testadas com base em uma proteína igual em duas concentrações de proteína (20 e 30 μg/50 g de caldo de farinha de milho).

[00361] A aplicação do viscosímetro mostrou que ambas as variantes de AmyS, S242A e S242Q, tiveram melhor desempenho do que as alfa-amilases de comparação - Liquozyme SC, Ethyl e Xtra. As variantes exibiram tanto uma viscosidade de pico baixa, característica de Xtra, como uma viscosidade final baixa, característica de Liquozyme SC e Ethyl. Quando carregadas na concentração de proteína menor (20 μg de proteína total), a diferença entre a viscosidade de pico menor das variantes comparada com aquela de Liquozyme SC era ainda mais evidente. Veja as figuras 9, 10 e 11.

Exemplo 7 - Liquefação em um cozimento a jato de vapor

[00362] Milho triturado inteiro foi processado até um caldo de 32% (milho de sólidos secos) por utilização de uma proporção de 70:30 de água para vinhaça fina. O pH do caldo foi ajustado até pH 5,8 com 10 N de NaOH. O caldo foi aquecido até 70°C usando água e vapor em uma caldeira encamisada. As enzimas de liquefação (SPEZYME Xtra, LiquozymeSC ou S242Q) foram adicionadas e o caldo foi aquecido até 85°C ao longo de aproximadamente 10 minutos. Após o caldo ter alcançado 85°C, ele foi incubado por mais 10 minutos naquela temperatura. O caldo foi passado através de um cozimento a jato de vapor mantido a 107°C com um tempo de descanso de 3 minutos usando uma instalação piloto de cozimento a jato de vapor (equipada com um hidroaquecedor M103 de Hydro-Thermal Corp., Waukesha, Wisconsin). O produto liquefeito foi coletado do jato e colocado em um banho- maria a 85°C. Uma segunda dose de enzima de liquefação foi adicionada pós-jato. O produto liquefeito foi agitado continuamente e mantido a 85°C por 90 minutos. Foram coletadas amostras em 0, 30, 60 e 90 minutos. Todas as amostras pós-jato foram testadas quanto ao DE (usando o método de Schoorls) e à viscosidade (viscosímetro do tipo Brookfield (Lab-Line Instruments Inc., Melrose Park, IL), eixo 3 a 20 rpm). As dosagens de enzimas de liquefação pré- e pós-jato são indicadas nas figuras seguintes como "X + Y", em que X representa o número de unidades de enzima adicionadas antes do jato, e Y representa o número de unidades adicionadas ao produto liquefeito após passar através do cozimento a jato de vapor. Os resultados são mostrados nas figuras 12 e 13.

Exemplo 8 - Efeito da remoção da inibição de ácido fítico sobre a termoestabilidade de alfa-amilase

[00363] O efeito da remoção da inibição de ácido fítico sobre a ter- moestabilidade de alfa-amilases termoestáveis em liquefação foi estu-dado.

A. Sem pré-tratamento contínuo (dose única de enzima)

[00364] Um caldo de milho inteiro triturado (obtido de Badger State Ethanol, Monroe, WI) foi feito com água contendo 30% v/v de vinhaça fina até uma concentração final de cerca de 32% de ds. Os sólidos de milho foram preparados em uma caldeira encamisada. O caldo foi bem misturado e o pH foi medido (pH 5,2). Não foi feito nenhum ajuste do pH. O caldo foi misturado em uma caldeira encamisada e levado até a temperatura de pré-tratamento de 70°C. Imediatamente antes de alcançar 70°C, a enzima de liquefação, ou seja, uma alfa-amilase (4 AAU por grama de milho ds), foi adicionada. Caldos idênticos foram tratados, um com e um sem fitase adicionada (4 FTU por grama de milho ds), para começar a incubação ou a etapa de liquefação primária. O caldo foi incubado por 30 minutos na presença da amilase, com ou sem fitase adicionada. A fitase usada nesse experimento foi BP-17. Embora a fitase tenha sido adicionada ao mesmo tempo em que a al- fa-amilase neste exemplo, ela pode ser adicionada em outros momentos, por exemplo, antes da amilase.

[00365] O caldo tratado foi então colocado em um banho-maria mantido a 90°C para começar a etapa de liquefação secundária (2a liquefação). Foram coletadas amostras de cada um dos caldos tratados (amilase com ou sem fitases) em 0, 30, 60 e 90 minutos para testes de viscosidade (por Brookfield) e DE (por Schoorls). Os resultados são mostrados nas figuras 14 e 15.

B. Com pré-tratamento contínuo (dose dividida de enzima)

[00366] Um caldo de milho inteiro triturado (obtido de Badger State Ethanol, Monroe, WI) foi feito com água contendo 30% v/v de vinhaça fina até uma concentração final de cerca de 32% de ds. Os sólidos de milho foram preparados em uma caldeira encamisada. O caldo foi bem misturado e o pH do caldo foi medido (pH 5,2). Esse caldo foi misturado em uma caldeira encamisada e levado até 70°C. Imediatamente antes de alcançar 70°C, a enzima de liquefação, ou seja, uma variante de alfa-amilase S242Q (3 AAU por grama de milho ds), foi adicionada para começar incubação, ou a etapa de liquefação primária. Caldos idênticos foram incubados por 30 minutos na presença da alfa- amilase, com ou sem fitase adicionada (4 FTU por grama de milho ds).

[00367] Embora a fitase tenha sido adicionada ao mesmo tempo em que a alfa-amilase neste exemplo, ela pode ser adicionada em outros momentos, por exemplo, antes da amilase.

[00368] Cada caldo incubado foi passado através de um cozimento a jato de vapor (107,2°C) que havia sido pré-aquecido até a temperatura desejada usando vapor e água. O caldo foi enviado através do jato na velocidade máxima (ajuste de 1,5) de cerca de 4 litros/minuto. O uso da bobina de conservação resultou em um tempo de descanso de pouco mais que 3 minutos. Após toda a água ser deslocada e a temperatura desejada mantida estável, uma alíquota de massa de milho solubilizada foi coletada e colocada em um banho secundário (p/agitação por cima) a 85°C para começar a etapa de liquefação secundária (2a liquefação). Uma segunda dose da S242Q (1 AAU/g de ds) foi adicionada, e a liquefação continuou por mais 90 minutos. Fo- ram coletadas amostras de cada caldo (amilase com ou sem fitases) para testes de viscosidade (por Brookfield) e DE (por Schoorls) em 0, 30, 60 e 90 minutos.

[00369] O produto liquefeito resultante foi usado no Exemplo 10B.

C. Cozimento a jato de vapor, convencional

[00370] Um caldo de milho inteiro triturado (obtido de Badger State Ethanol, Monroe, WI) foi feito com água contendo 30% v/v de vinhaça fina até uma concentração final de cerca de 32% de ds. Os sólidos de milho foram preparados em uma caldeira encamisada. O caldo foi bem misturado e o pH do caldo foi medido (pH 5,2). O pH foi ajustado até pH 5,8 com NaOH diluído. O caldo foi misturado em uma caldeira en- camisada e elevado até a temperatura de pré-tratamento de 70°C. Imediatamente antes de alcançar 70°C, a enzima de liquefação, ou seja, uma variante de alfa-amilase S242Q (3 AAU por grama de milho ds), foi adicionada para começar a incubação ou a etapa de liquefação primária. O caldo foi incubado por 30 minutos na presença de uma al- fa-amilase sem fitase adicionada.

[00371] O caldo incubado foi passado através de um cozimento a jato de vapor (107,2°C) que havia sido pré-aquecido até a temperatura desejada usando vapor e água. O caldo foi enviado através do jato na velocidade máxima (ajuste de 1,5) de cerca de 4 litros/minuto. A bobina de conservação resultou em um tempo de descanso de pouco mais de 3 minutos. Após toda a água ser deslocada e a temperatura desejada mantida estável, uma alíquota de massa de milho solubilizada foi coletada e colocada em um banho secundário (agitação superior) a 85°C para começar a etapa de liquefação secundária (2a liquefação). Uma segunda dose da variante de alfa-amilase S242Q (1 AAU/g de ds) foi adicionada e a liquefação continuou por mais 90 minutos. Foram coletadas amostras em 0, 30, 60 e 90 minutos para testes de viscosidade (por Brookfield) e DE (por Schoorls). O experimento acima foi realizado em um pH do caldo de 5,5. Veja a figura 21.

[00372] O produto liquefeito resultante foi usado no Exemplo 10A.

D. Resultados com e sem pré-tratamento contínuo

[00373] A adição de fitase BP-17 durante a incubação (liquefação primária) reduziu o teor de ácido fítico do milho inteiro triturado de 0,60% de ds de milho para 0,09% de ds de milho (redução > 85%) (figura 20). Também fica evidente a partir das figuras 14 e 15 que as al- fa-amilases foram inativadas em uma temperatura de pré-tratamento contínuo de 107°C com base no desenvolvimento de DE ou redução da viscosidade. No entanto, a inclusão de fitase antes do pré- tratamento contínuo resultou em um aumento significativo da termoes- tabilidade das alfa-amilases, como demonstrado pela progressão de DE e redução da viscosidade a 90°C durante a etapa de liquefação secundária. Resultados similares foram observados com pré- tratamento contínuo (dados não mostrados), como mostrado nas figuras 14 e 15. Sem se prender a uma teoria de operação em particular, acredita-se que a adição da fitase ajuda a minimizar, reduzir ou eliminar a inibição por ácido fítico da atividade de amilase.

Exemplo 9 - Efeito da concentração de fitase BP-17 sobre a esta-bilidade de alfa-amilase em pH baixo

[00374] O aumento da termoestabilidade de alfa-amilase em função da remoção da inibição por ácido fítico da alfa-amilase foi estudado. O ácido fítico foi hidrolisado com o uso de fitase antes da liquefação secundária de milho inteiro triturado, e o aprimoramento na estabilidade do pH em pH baixo foi determinado.

[00375] Em um experimento típico, milho inteiro triturado foi processado até 32% (ds de milho) pela utilização de uma proporção de 70:30 de água e vinhaça fina. O pH do caldo era de pH 5,2. O caldo foi aquecido até 70°C usando água e vapor em uma caldeira encamisada. A enzima de liquefação, ou seja, a variante de alfa-amilase S242Q (4 AAU/g de ds de milho), e concentrações variadas de BP-17 (0-12 FTU/g de ds de milho), foram adicionadas. O caldo foi pré-tratado mantendo-se a temperatura em 70°C por 45 minutos. O caldo foi então colocado em um banho-maria a 90°C. O produto liquefeito foi agitado continuamente e mantido a 90°C por 90 minutos. Foram coletadas amostras em 0, 30, 60 e 90 minutos. Todas as amostras foram testadas quanto ao DE (usando o método de Schoorls) e quanto à viscosidade (viscosímetro de Brookfield, eixo 2 a 20 rpm). Os dados de progressão de DE e da viscosidade estão resumidos nas figuras 16-17.

[00376] Os resultados mostraram que a adição de fitase resultou em um aumento significativo na estabilidade do pH (em pH baixo) para a atividade de amilase, como evidenciado por um aumento estável na progressão de DE a 90°C, com uma diminuição concomitante na viscosidade do produto liquefeito (veja figuras 16 - 17). Isso pode ser causado pela redução da inibição por ácido fítico da alfa-amilase. Os dados mostram que a variante de alfa-amilase S242Q pode ser usada com sucesso no processo de liquefação para o milho inteiro triturado em um pH de 5,2 na presença de uma fitase adicionada. Na figura 20, pode ser observado que a taxa de progressão de DE aumenta com a adição aumentada de fitase, e alcança um máximo em 4 FTU/g de ds. Esses resultados podem indicar que a fitase aumenta a termoestabili- dade da variante de alfa-amilase S242Q por remoção do ácido fítico do caldo.

Exemplo 10 - Efeito do pH

[00377] O efeito do pH sobre a variante de alfa-amilase S242Q foi estudado neste exemplo.

[00378] Em um experimento típico, milho inteiro triturado foi processado até 32% (ds de milho) pela utilização de uma proporção de 70:30 de água e vinhaça fina. O pH do caldo era de 5,2. O pH foi reduzido para entre 4,2 e 4,8 com o uso de H2SO4. O caldo foi aquecido até 70°C usando água e vapor em uma caldeira encamisada. A enzima de liquefação, ou seja, a variante S242Q (4 AAU/g de ds) e BP-17(4 FTU/g de ds), foi adicionada e o caldo foi pré-tratado mantendo-se a temperatura em 70°C por 45 minutos. O caldo foi então colocado em um banho-maria a 90°C. O produto liquefeito foi agitado continuamente e mantido a 90°C por 90 minutos. Foram coletadas amostras em 0, 30, 60 e 90 minutos. Todas as amostras foram testadas quanto ao DE (usando o método de Schoorls) e quanto à viscosidade (viscosímetro de Brookfield, eixo 2 a 20 rpm). Os dados da progressão de DE e da viscosidade estão resumidos nas figuras 18-19.

[00379] O DE diminuiu com a diminuição do pH de 5,2 para 4,5. A enzima amilase foi completamente inativada em pH 4,2.

Exemplo 11 - Efeito sobre a produção de etanol

[00380] Os produtos liquefeitos foram usados como matéria-prima para fermentações na fermentação de etanol para a produção de álcool. Um caldo de milho inteiro triturado (obtido de Badger State Ethanol, Monroe, WI) foi misturado com água contendo 30% v/v de vinhaça fina até uma concentração final de cerca de 32% de ds.

A. Processo convencional

[00381] Foi usado o produto liquefeito do Exemplo 8, Parte C (Produto liquefeito A).

[00382] O pH do produto liquefeito secundário foi ajustado para 4,2 com o uso de H2SO4 antes do estágio de sacarificação e fermentação simultâneas (SSF).

B. pH baixo, pré-tratamento contínuo (dose dividida)

[00383] Foi usado o produto liquefeito do Exemplo 8B (Produto liquefeito B). Não foi feito nenhum ajuste do pH antes da SSF.

C. Sacarificação e fermentação simultâneas

[00384] Em cada experimento, os pesos líquidos dos vasos foram obtidos antes da preparação dos meios. Um produto liquefeito de mi- lho DS 32% (2 litros) foi colocado em um frasco de 2 litros. Inóculos da levedura Red Star Ethanol Red (RED STAR (Lesaffre)) foram preparados por adição de 10 gramas de levedura e 1 grama de glicose a 40 gramas de água sob agitação leve por uma hora. Cinco ml de cada inóculo foram adicionados aos fermentadores equilibrados, seguido pela adição de Etanol G Zyme® 480 (Danisco U.S. Inc., Genencor Division) a 0,4 GAU/g de ds de milho, para iniciar a sacarificação e fermentação simultâneas. O peso bruto inicial foi anotado e o frasco foi colocado em um banho-maria mantido a 32°C. Foram coletadas amostras em diferentes intervalos de tempo, e essas foram analisadas quanto ao teor de carboidrato e etanol com o uso de HPLC. Também foram feitas fermentações usando um quilograma de cada produto liquefeito. A perda de peso durante a fermentação foi medida em diferentes intervalos de tempo. O álcool foi determinado com base na perda de peso causada pela perda de dióxido de carbono. Ao término da fermentação, foi obtido um peso bruto final. O caldo foi transferido quantitativamente em um vaso redondo de 5 litros. A destilação foi realizada sob vácuo até que fossem coletados aproximadamente 800 ml de etanol em um receptáculo contendo 200 ml de água. O etanol foi diluído até 2 litros, e foi analisado por HPLC. O peso e o DS dos fundos imóveis foram obtidos antes da secagem. A análise do amido residual foi realizada no DDGS. Foram feitos cálculos estequiométricos com base na perda de peso, destilação e análise de amido residual.

[00385] Cálculo de etanol usando perda de peso de CO2:

[00386] Produção de EtOH (mmol) = perda de CO2 (g)/88

[00387] Produção de EtOH (g) = (perda de CO2 (g)/88) * 92 => per da de CO2 (g) * 1,045

[00388] Produção de EtOH (ml) = ((perda de CO2 (g)/88) * 92)/0,789 => perda de CO2 (g) x 1,325

[00389] A Tabela 11 resume uma comparação de teor de sulfato e de ácido fítico em DDGS de um processo convencional com aquele do processo sem ajuste do pH. Os dados mostram uma diferença importante no teor de sulfato livre e ácido fítico entre os dois processos. A adição de fitase com a alfa-amilase termoestável na incubação resultou no DDGS com teor de ácido fítico reduzido, fosfato disponível (livre) maior e sulfato reduzido. Dessa forma, o processo sem ajuste do pH confere estabilidade de pH em pH baixo para alfa-amilases ter- moestáveis em liquefação na liquefação de amido. Condições de liquefação Rendimento de álcool ga- lões/Bushel DDGS, % de ds Amido Ácido fítico % IP 6 Fosfato livre Sulfato* Processo convencional - pH 5,8 (Produto liquefeito A) 2,70 7,25 0,6 100 1,20 1,92 Processo sem ajuste do pH, pH 5,2 3+1 AAU (dose dividida), 4 FTU BP-17, com pré- tratamento contínuo, 107,2°C (Produto liquefeito B) 2,69 9,28 0,2 0 1,33 0,23 TABELA 11:

Exemplo 12 - Métodos adicionais

[00390] Os ensaios seguintes foram usados nos Exemplos. Desvios dos protocolos apresentados abaixo são geralmente indicados nos Exemplos. Nesses experimentos, um espectrofotômetro foi usado para medir a absorbância dos produtos formados durante as reações.

A. Determinação do teor de proteína Ensaio de BCA (ácido bicinconínico)

[00391] O ensaio de BCA (Pierce) foi usado para determinar a con-centração de proteína em amostras em escala de placa de microtitula- ção (MTP). As soluções químicas e reagentes usados foram: reagente de ensaio de proteína de BCA e tampão de diluição de Pierce (50 mM de MES, pH 6,5, 2 mM de CaCl2, TWEEN®-80 0,005%). O equipamento incluiu uma leitora de MTP SpectraMAX (tipo 340; Molecular Devices). As MTPs foram obtidas de Costar (tipo 9017).

[00392] Duzentos (200) μl de Reagente de BCA foram pipetados em cada poço, seguidos por 20 μl de proteína diluída. Após mistura cuidadosa, as MTPs foram incubadas por 30 minutos a 37°C. As bolhas de ar foram removidas antes de a densidade óptica (OD) da solução nos poços ser lida a 562 nm. Para determinar a concentração de proteína, a leitura de fundo foi subtraída das leituras da amostra. A OD562 foi tabulada para padrões de proteína (enzima purificada) para produzir uma curva-padrão. A concentração de proteína das amostras foi interpolada a partir da curva-padrão.

Ensaio de Bradford

[00393] O ensaio com reagente corante de Bradford (Quick Start) foi usado para determinar a concentração de proteína em amostras em escala de MTP. As soluções químicas e reagentes usados foram: Re-agente Corante de Bradford Quick Start (BIO-RAD N° de Catálogo: 500-0205), tampão de diluição (10 mM de NaCl, 0,1 mM de CaCl2, 0,005% TWEEN®-80. O equipamento usado foi um Biomek FX Robot (Beckman) e uma leitora de MTP SpectraMAX (tipo 340). As MTPs eram de Costar (tipo 9017).

[00394] Duzentos (200) μl de reagente corante de Bradford foram pipetados em cada poço, seguidos por 15 μl de tampão de diluição. Dez (10) μl de caldo de cultura filtrado foram adicionados aos poços. Após mistura cuidadosa, as MTPs foram incubadas por pelo menos 10 minutos em temperatura ambiente. As bolhas de ar foram retiradas e a OD de cada poço foi lida a 595 nm. Para determinar a concentração de proteína, a leitura de fundo (ou seja, de poços não inoculados) foi subtraída das leituras da amostra. Os valores da OD595 obtido fornecem uma medida relativa do teor de proteína nas amostras.

B. Ensaio de microswatch para testes de desempenho da enzima

[00395] Os detergentes usados nesse ensaio não continham enzimas ou as enzimas presentes em detergentes comerciais tinham sido destruídas por meio de desativação por aquecimento, como descrito em outra seção neste documento. O equipamento usado incluía um termomixer de Eppendorf e uma leitora de MTP SpectraMAX (tipo 340). As MTPs foram obtidas de Costar (tipo 9017).

Preparação do detergente (AATCC HDL; condições US)

[00396] Água Milli-Q foi ajustada até 6 gpg de dureza de água (Ca/Mg = 3/1) e 1,5 g/l de padrão de referência de detergente líquido AATCC 2003 sem clareador adicionado. A solução detergente foi agitada vigorosamente por pelo menos 15 minutos. A seguir, 5 mM de HEPES (ácido livre) foram adicionados e o pH ajustado até 8,0.

Ensaio microswatch de amido de arroz para testar o desempenho da amilase

[00397] Os detergentes de teste foram preparados como descrito em outra seção neste documento. O equipamento usado incluía uma incubadora/agitadora New Brunswick Innova 4230 e uma leitora de MTP SpectraMAX (tipo 340). As MTPs foram obtidas de Corning (tipo 3641). Fécula de arroz envelhecida com pedaços de pigmento laranja (CS-28) foi obtida do "Center for Test Materials" (Vlaardingen, Holanda). Antes de cortar microswatches circulares de 6,35 milímetros, o tecido foi lavado com água. Dois microswatches foram colocados em cada poço de uma placa de microtitulação de 96 poços. O detergente de teste foi equilibrado a 20°C (North America) ou 40°C (Europa Ocidental). Cento e noventa μl de solução detergente foram adicionados a cada poço da MTP, contendo microswatches. A essa mistura, 10 μl da solução diluída de enzima foram adicionados. A MTP foi lacrada com uma folha metálica adesiva e colocada na incubadora por 1 hora com agitação a 750 rpm na temperatura de teste desejada (tipicamente 20°C ou 40°C). Após a incubação, 150 μl da solução de cada poço foram transferidos para uma MTP fresca e lidos a 488 nm usando uma leitora de MTP SpectraMAX para quantificar a limpeza. Controles em branco, bem como controles contendo microswatches e detergente, mas sem enzima, também foram incluídos.

Cálculo do desempenho da enzima

[00398] O valor de absorbância obtido foi corrigido para o valor em branco (ou seja, obtido após incubação de microswatches na ausência de enzima). A absorbância resultante era uma medida da atividade hidrolítica.

C. Determinação da concentração de amilase por titulação de an-ticorpo

[00399] A concentração e a atividade específica de alfa-amilase foram determinadas, em alguns casos, por titulação com um anticorpo policlonal inibidor. Verificou-se que anticorpos policlonais despertados para alfa-amilase (AmyS) de Bacillus stearothermophilus são fortemente inibidores de AmyS e da alfa-amilase de Bacillus sp. TS23 (por exemplo, a ligação é suficientemente forte para produzir uma titulação linear de perda de atividade). Portanto, esse anticorpo pode ser usado para medir a concentração de enzima, a qual, por sua vez, é usada para calcular a atividade específica.

[00400] Resumidamente, a quantidade de inibição de enzima produzida por várias concentrações conhecidas de anticorpo é medida. A partir dessa informação, a concentração de anticorpo necessária para a inibição completa é extrapolada, que é equivalente à concentração de enzima na amostra. A atividade e a inibição de alfa-amilase foram medidas usando o ensaio fluorogênico de BODIPY-amido. O tampão foi 50 mM de MOPS, pH 7,0, contendo Tween-80 0,005%.

[00401] Um anticorpo policlonal dirigido contra AmyS purificada foi despertado em um coelho e purificado por métodos padronizados. Um valor empírico da "concentração aparente" de uma solução de estoque de anticorpo foi determinada por medida da inibição de uma amostra de AmyS de atividade específica conhecida. A amostra de anticorpo foi usada para determinar a concentração e a atividade específica de AmyS e variantes TS23t. Esses valores foram usados para criar placas de estoque de enzima de 96 placas, nas quais todas as variantes foram diluídas até uma concentração comum.

D. Eletroforese em gel de proteína nativa

[00402] A mobilidade eletroforética de amostras da proteína variante foi medida usando o sistema PHASTGEL (GE Healthcare) em géis de poliacrilamida nativos pré-moldados (PHASTGEL Homogeneous) em uma concentração de 7,5% ou 12,5%. Foram usadas fitas de tampão (PHASTGEL Native) que consistiam em pH 8,8 em 0,88 M de L- Alanina, 0,25 M de tampão Tris. As condições de execução típicas consistiram em 400 V por 12,75 minutos com uma distância de anodo a catodo de 3,7 cm.

[00403] Alternativamente, a mobilidade eletroforética de amostras da proteína variante foi medida em géis de agarose 0,5-1,5% com 1 mm de espessura em vários valores de pH (ou seja, 5,8, 8,0 e 10,0) através da escolha de um sistema tampão adequado. A eletroforese foi realizada sob condições não desnaturantes. O comprimento cato- do-anodo foi de 13,9 cm. Uma amostra de 1-2 μg de proteína foi misturada com glicerol 5% + azul bromofenol 0,05%, e carregada em cada raia. Os géis foram processados tipicamente por 1 hora a 100 V.

[00404] Os géis foram corados com corante azul de Louisville dissolvido em ácido acético 10% e descoloridos com metanol 10% e áci- do-em-água acídico 10%. Entre 12 e 20 de variantes de proteína foram carregadas simultaneamente, dependendo do sistema de gel nativo usado. Em consequência, a mobilidade eletroforética de uma variante de proteína pode ser avaliada imediatamente, em relação aos padrões de escala de carga carregados no mesmo gel.

E. Inativação de detergente por aquecimento

[00405] A inativação por aquecimento de fórmulas de detergentes comerciais serve para destruir a atividade enzimática de quaisquer componentes proteicos, retendo as propriedades de componentes não enzimáticos. Dessa forma, esse método era adequado para o preparo de detergentes adquiridos comercialmente para uso no teste das variantes de enzimas. Para detergentes líquidos para lavagem de roupas pesada (HDL) da América do Norte (NA) e da Europa Ocidental (WE), a inativação por aquecimento foi realizada colocando-se detergente líquido pré-pesado (em uma garrafa de vidro) em um banho-maria a 95°C por 2 horas. O tempo de incubação para a inativação por aquecimento do detergente granular lavagem de roupas pesada (HDG) da América do Norte (NA) e Japonês (JPN) foi de 8 horas e o para o detergente HDG da Europa Ocidental (WE) foi de 5 horas. O tempo de incubação para a inativação por aquecimento de NA e WE para detergentes de lavagem de louças automática (ADW) foi de 8 horas. Os detergentes foram adquiridos de supermercados locais. Os detergentes não aquecidos e aquecidos foram testados em até 5 minutos de disso lução do detergente para determinar com precisão a percentagem de-sativada. A atividade enzimática foi testada pelo ensaio de suc-AAPF- pNA.

[00406] Para testes da atividade enzimática em detergentes inati- vados por aquecimento, foram feitas soluções de trabalho de detergentes a partir dos estoques inativados por aquecimento. Quantidades apropriadas de dureza de água (6 gpg ou 12 gpg) e tampão foram adi-cionadas às soluções detergentes para combinar com as condições desejadas (Tabela 12-1). As soluções foram misturadas por turbilho- namento ou inversão das garrafas. RRegião FForma DDose Detergente* Tampão Gpg pH T (°C) Lavagem (líquido e granular de limpeza pesada) NA HDL 0,78 g/l P&G TIDE® 2X 5 mM de HEPES 6 8,0 20 WE HDL 5,0 g/l Henkel Persil 5 mM de HEPES 12 8,2 40 WE HDG 8,0 g/l P&G Ariel 2 mM de Na2 CO3 12 10,5 40 JPN HDG 0,7 g/l P&G TIDE® 2 mM de Na2 CO3 6 10,0 20 NA HDG 1,0 g/l P&G TIDE® 2 mM de Na2 CO3 6 10,0 20 Limpeza de louças automática WE ADW 3,0 g/l RB Calgonit 2 mM de Na2 CO3 21 10,0 40 NA ADW 3,0 g/l P&G Cascade 2 mM de Na2 CO3 9 10,0 40 * Abreviações: Procter & Gamble ( P&G); e Reckitt Benckiser (RB). TABELA 12-1. Condições de lavagem de roupas e de louças

F. Ensaio "TERG-O-TOMETER" para o desempenho da limpeza Determinação do desempenho

[00407] Foi usado um protocolo-padrão para avaliar a limpeza de manchas de proteína e carboidrato, em que o nível de manchas em um retalho de tecido foi medido antes e depois, sob condições padrão. Os retalhos de tecido consistiam em um tecido de algodão trancado manchado com amido de milho, fécula de arroz ou uma mistura de sangue, leite e negro-de-fumo. Os retalhos foram adquiridos de Tesfa- brics, Inc. (West Pittiston, PA). Manchas técnicas de amido de milho (EMPA 161) e sangue, leite, negro-de-fumo (EMPA 116) foram produzidas por EMPA Test Materials AG (St. Gallen, Suíça). As manchas de amido de arroz (CFT CS-28) foram produzidas pelo "Center for Testmaterials BV "(Vlaardingen, Holanda). Cada mancha foi medida antes e depois do tratamento por refletância óptica usando um reflectômetro Minolta CR-410 ajustado para um iluminante-padrão D65 (6500°K). A diferença nos valores de L, a, b foi convertida em diferença de cor total (dE), como definido pelo espaço de cor CIE-LAB. A limpeza das manchas é expressa como índice percentual de remoção de manchas (%SRI) considerando-se a proporção entre a diferença de cor antes e depois da lavagem, e comparando-a com a diferença de manchas não lavadas (antes da lavagem) com tecido não manchado.

[00408] Foram feitos experimentos de limpeza em um TERG-O- TOMETER (United States Testing Co., Hoboken, NJ) equipado com 6 potes de 2 litros de aço inoxidável adaptados com agitadores superiores. Cada tratamento foi realizado em um volume total de 1 litro consistindo em dureza de água de 6 grãos por galão 3:1 (cálcio:magnésio) ou dureza de água de 12 grãos por galão. Os detergentes usados nos experimentos de lavagem foram 1,5 g/l de detergente líquido AATCC HDL WOB 2003 com 5 mM de tampão HEPES em pH 8, 0,7 g/l de detergente granular AATCC HDD WOB 1993, 8 g/l de detergente granu- lar IEC A* 60456 com perborato e alvejante TAED ou 5 g/l de detergente líquido Persil Power Gel. A enzima foi adicionada diretamente na solução de lavagem e as reações foram então iniciadas por adição de 40 g/l ou 200 g/l de tecido manchado e amassado. As reações de lavagem foram agitadas a 100 rpm por 10, 15 ou 40 minutos a 20 oC, 25 °C, 30 oC, 40 oC ou 50 oC. Após a limpeza, os retalhos foram enxaguados por 3 minutos em água corrente, centrifugados em uma máquina de lavar de carga frontal a 1.000 rpm para remover o excesso de água, e secos em uma secadora em aquecimento baixo em um ciclo de pressão permanente por aproximadamente 45 minutos. A comparação da extensão da remoção de manchas foi avaliada por reflecto- metria e expressa como o índice % de remoção de manchas (% de SRI). A condição de controle não continha enzima e o controle positivo consistiu em várias doses de enzimas comerciais de comparação.

G. Ensaio de BODIPY- amido para determinação da atividade de amilase

[00409] O ensaio de BODIPY-amido foi realizado usando o Kit de Ensaio de Amilase EnzChek® Ultra (E33651, Invitrogen). Uma solução de estoque de 1 mg/ml do substrato de amido DQ foi preparada por dissolução do conteúdo do frasco contendo o substrato liofilizado em 100 μl de 50 mM de tampão de acetato de sódio em pH 4,0. O frasco foi turbilhonado por cerca de 20 segundos e deixado em temperatura ambiente, no escuro, com mistura ocasional até dissolvido. Novecentos μl de tampão de ensaio (50 mM de acetato de sódio com 2,6 mM de CaCl2 pH 5,8) foram adicionados, e o frasco foi misturado por turbi- lhonamento por cerca de 20 segundos. A solução de substrato foi armazenada em temperatura ambiente, no escuro, até estar pronta para uso ou a 4°C. Para o ensaio, 100 μg/ml de uma solução de trabalho do substrato DQ foram preparados a partir de 1 mg/ml da solução de substrato no tampão de ensaio. Cento e noventa μl de 100 μg/ml da solução de substrato foram adicionados a cada poço em uma placa de microtitulação de 96 poços de fundo redondo. Dez μl de cada amostra de enzima foram adicionados a um poço, misturados por 30 segundos usando um termomixer a 800 rpm. Uma amostra em branco contendo apenas tampão e substrato (sem enzima) foi incluída no ensaio. A taxa de alteração da intensidade de fluorescência foi medida (excitação: 485 nm, emissão: 520 nm) em uma leitora de fluorescência de placas de microtitulação a 25°C por 5 minutos.

H. Hidrólise de farinha de milho para determinação da atividade de amilase

[00410] Ensaio de hidrólise de amido de substrato de farinha de milho para atividade enzimática. Farinha de milho orgânica (Azure Farms, lote N° 03227) foi espalhada igualmente em uma microplaca de 96 poços Greiner, de polipropileno, preta, poços em chaminé de fundo plano (N° de Catálogo 655209), usando um dispositivo de dispensa de sólidos (V&P Scientific). Oitenta e cinco μl de 20 mM de acetato de sódio pH 5,6 foram adicionados a cada poço e misturados. Um lacre de folha metálica foi aplicado ao topo da placa e a placa pré-incubada a 70°C no Termomixer por 20-30 minutos. As amostras de enzima foram diluídas em uma placa de polipropileno Agilent (5042-1385) em 20 mM de tampão de acetato de sódio. Onze μl de amostras de enzima diluída foram adicionados à placa de substrato e a placa lacrada firmemente com outra folha metálica. As placas foram então transferidas para uma Incubadora/Agitadora Labnet VorTemp 56 com blocos de metal (N° de Catálogo S2056A), pré-aquecidos até 95°C e a velocidade de agitação ajustada em 500 rpm. A incubação continuou por 30 minutos. Ao final da incubação, as placas foram resfriadas rapidamente em um balde de gelo e a reação de hidrólise de amido foi interrompida por adição de 100 μl de 0,1 N de H2SO4 a cada poço. A placa foi misturada brevemente e os produtos da reação de hidrólise de amido foram ana- lisados pelo ensaio de PAHBAH ou HPLC.

[00411] Detecção colorimétrica de concentrações de açúcar solúvel da hidrólise enzimática de substrato de farinha de milho. Alíquotas de 80 μl de 0,5 N NaOH foram adicionadas a todos os poços de uma placa de PCR vazia, seguido por 20 μl de reagente PAHBAH (5% p/v de hidrazida de ácido p-hidroxibenzóico - PAHBAH, Sigma Ns H9882, dissolvida em 0,5 N de HCl) e misturadas (placa de reação de PAHBAH). Dez μl dos sobrenadantes da reação de hidrólise de amido foram adicionados à placa de reação de PAHBAH. Todas as placas foram lacradas e colocadas no termociclador (MJ Research Tetrad), programado por 2 minutos a 95°C, e depois resfriadas até 20°C. Amostras de 80 μl das misturas de reação de PAHBAH desenvolvidas foram transferidas para uma placa de leitura e a absorbância foi medida a 405 nm em um espectrofotômetro.

[00412] Determinação por HPLC de concentrações de açúcar solúvel da hidrólise enzimática de substrato de farinha de milho. Padrões de açúcar solúvel (DP1-DP7) obtidos de Sigma (St. Louis, MO) foram diluídos em água Milli-Q até 100 mg/ml e usados para a conversão da área de pico para os açúcares nas concentrações reais de açúcar. A placa extinta do ensaio de hidrólise de amido foi centrifugada em uma centrífuga Beckman Coulter Allegra 6R por 5 minutos a 3.000 rpm 25°C. O sobrenadante foi pipetado da placa de centrifugação e transferido para uma placa de filtro Multiscreen-HV (N° de Catálogo: MAHVN4550). A placa de filtro foi centrifugada sobre uma placa Agilent HPLC na centrífuga Hettich Rotanta por 10 minutos a 6.000 rpm a 25°C. Cinquenta μl de 0,01 N de fase móvel de ácido sulfúrico (0,1 N de ácido sulfúrico diluído 10X com água Milli-Q) foram transferidos para cada poço de outra placa Agilent HPLC limpa. A placa filtrada foi misturada brevemente e 50 μl do filtrado foram transferidos para os poços correspondentes na placa com 50 μl por poço de fase móvel. Padrões de açúcar diluídos foram adicionados para esvaziar os poços na placa a serem incluídos na calibração. O conteúdo foi misturado brevemente em uma agitadora de plataforma e a placa foi coberta com uma Tampa Nalgene Pré-slit Well. A coluna de HPLC (coluna Bio-Rad Aminex HPX-87H N° de Catálogo: 125-0140) foi preparada previamente com 2 litros de fase móvel correndo em uma taxa de fluxo constante de 0,6 ml/minuto. Todas as amostras na placa foram processadas com um volume de injeção de 20 μl e analisadas usando AMINEXH.M e RID (índice de refração) como o detector. Após o final do processamento, a taxa de fluxo na HPLC foi reduzida drasticamente para 0,05 ml/min.

I. Determinação da redução da viscosidade de amido por alfa- amilase

[00413] Nesse ensaio, a redução da viscosidade da solução de substrato de amido de milho foi medida em um viscosímetro. O caldo do substrato de amido de milho foi feito fresco em modo de batelada com 30% de sólidos secos de farinha de milho em água destilada e ajustado até o pH 5,8 usando ácido sulfúrico. Para cada rodada, 50 gramas do caldo (15 gramas de sólidos secos) foram pesados e pré- incubados por 10 minutos para aquecer até 70°C. Com a adição da amilase, a temperatura era imediatamente elevada de 70°C a 85°C com uma velocidade de rotação de 75 rpm. Após a temperatura da mistura de caldo e amilase alcançar 85°C, a temperatura era mantida constante e a viscosidade monitorada por mais 30 minutos.

J. Medida da ligação de enzima aos substratos macromoleculares

[00414] Foram feitos ensaios para determinar a ligação de substrato de variantes de Amilase (AmyS) com carga escalonada (alteração de carga = -12 a +12 em relação à AmyS do tipo selvagem) à forragem e bagaço de milho. Os substratos usados incluíram bagaço (bagaço de cana de açúcar do Brasil, pré-tratado com ácido diluído pelo "National Renewable Energy Laboratory", lavado e tamponado em pH 5), AFEX (forragem de milho com expansão de fibra de amônia), e PCS (forragem de milho pré-tratada com ácido sulfúrico diluído, lavada e ajustada ao pH 5). Todos os substratos foram levados até a percentagem de sólidos desejada antes do uso.

[00415] Ligação de amilase: variantes de amilase com carga escalonada foram purificadas e diluídas até 200 ppm para testes. Uma solução a 1% de bagaço de celulose foi preparada em tampão de borato (40 mM, pH 8,5, Tween-80 a 0,016%). Cento e cinquenta μl da solução de bagaço foram adicionados em cada poço em uma placa de filtração de microtitulação. Cento e cinquenta μl de tampão de borato foram adicionados em um conjunto de poços separados, que serviram como controles. Dez μl de variantes de amilase com carga escalonada foram adicionados na placa de filtração, com cada condição em duplicata. A placa foi incubada em temperatura ambiente por 2 horas. O filtrado foi coletado e a atividade de amilase no sobrenadante foi medida pelo ensaio de BODIPY-amido.

[00416] Medida de ligação de enzima aos microswatches: as variantes de amilase foram incubadas com ou sem microswatches de fécula de arroz CS-28 sob condições de lavagem padronizadas por 30 minutos. A quantidade de enzima livre foi medida pelo ensaio de BO- DIPY-amido. A fração de enzima ligada aos microswatches foi calculada da seguinte forma: fração ligada = (atividade de enzima na ausência de swatch - atividade de enzima na presença de swatch)/(atividade de enzima na ausência de swatch).

Exemplo 13 - Produção de amilase em B. subtilis

[00417] Neste Exemplo, é descrita a produção de uma forma mutante truncada de alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus amilase (que possui uma mutação S242Q e uma eliminação de 29 aminoáci- dos do terminal C; também aqui denominada S242Q) e variantes desta em B. subtilis. A transformação foi realizada como conhecido na técnica (veja, por exemplo, WO 02/14490). Resumidamente, o gene que codifica as amilases parentes foi clonado no vetor de expressão pHPLT, que contém o promotor de LAT (PLAT), uma sequência que codifica o peptídeo sinalizador LAT (preLAT), seguido por sítios de restrição PstI e HpaI para clonagem.

[00418] A região codificadora para o peptídeo sinalizador LAT é mostrada abaixo: atgaaacaac aaaaacggct ttacgcccga ttgctgacgc tgttatttgc gctcatcttc ttgctgcctc attctgcagc ttcagca (SEQ ID N°: 19).

[00419] A sequência de aminoácidos do peptídeo sinalizador LAT é mostrada abaixo: MKQQKRLYAR LLTLLFALIF LLPHSAASA (SEQ ID N°: 20)

[00420] A sequência de aminoácidos da amilase truncada madura S242Q com o aminoácido substituído mostrado em itálico foi usada como base para a produção das bibliotecas de variantes aqui descritas: AAPFNGTMMQ YFEWYLPDDG TLWTKVANEA NNLSS- LGITA LWLPPAYKGT SRSDVGYGVY DLYDLGEFNQ KGTVRTKYGT KAQYLQAIQA AHAAGMQVYA DVVFDHKGGA DGTEWVDAVE VNPSDRNQEI SGTYQIQAWT KFDFPGRGNT YSSFKWRWYH FDGVDWDESR KLSRIYKFRG IGKAWDWEVD TENGNYDYLM YADLDMDHPE VVTELKNWGK WYVNTTNIDG FRLDAVKHIK FQFFPDWLSY VRSQTGKPLF TVGEYWSYDI NKLHNYITKT NGTMSLFDAP LHNKFYTASK SGGAFDMRTL MTNTLMKDQP TLAVTFVDNH DTEPGQALQS WVDPWFKPLA YAFILTRQEG YPCVFYGDYY GIPQYNIPSL KSKIDPLLIA RRDYAYGTQH DYLDHS- DIIG WTREGVTEKP GSGLAALITD GPGGSKWMYV GKQHAGKVFY DLTGNRSDTV TINSDGWGEF KVNGGSVSVW VPRKTT (SEQ ID N°: 21).

[00421] Os produtos de PCR foram purificados com o uso de colunas QIAQUIK de Qiagen, e ressuspensos em 50 μl de água deioniza- da. Cinquenta μl do DNA purificado foram digeridos com Hpa I (Roche) e PstI (Roche), e o DNA resultante ressuspenso em 30 μl de água dei- onizada. 10-20 ng/μl do DNA foram clonados em plasmídeo pHPLT usando os sítios de clonagem PstI e HpaI. As misturas de ligação foram transformadas diretamente em células competentes de B. subtilis (genótipo: Δvpr, ΔwprA, Δmpr-ybfJ, ΔnprB). As células de B. subtilis possuem um gene de competência (comK) que é colocado sob um promotor indutível de xilose e, portanto, xilose foi usada para induzir competência para ligação e captação de DNA (veja Hahn et al., Mol. Microbiol., 21: 763-775, 1996).

[00422] Os elementos do plasmídeo pHPLT-AmyS incluem: pUB110 = fragmento de DNA do plasmídeo pUB110 (McKenzie et al., Plasmid 15: 93-103, 1986). As características do plasmídeo incluem: ori-pUB110 = origem de replicação de pUB110; neo = gene de resistência à neomicina de pUB110; Plat = promotor da transcrição de ami- lase de B. licheniformis; Pre LAT = peptídeo sinalizador de amilase de B. licheniformis; SAMY 425ss = a região codificadora para a sequência do gene de AmyE truncada (substituída por regiões codificadoras para cada variante de AmyE truncada expressa nesse estudo); e Termina- dor = terminador da transcrição de amilase de B. licheniformis.

Exemplo 14 - Expressão de variantes da enzima

[00423] Este Exemplo descreve os métodos usados para expressar várias enzimas recombinantes do B. subtilis transformado dos Exemplos precedentes.

Expressão de amilase - escala de 2 ml

[00424] Clones de B. subtilis contendo vetores de expressão de S242Q (ou uma variante desta) foram replicados com um replicador de aço de 96 poços de estoques de glicerol em placas de cultura de 96 poços (BD, 353075) contendo 150 μl de meio LB + 10 μg/ml de neomi- cina, desenvolvidos de um dia para o outro a 37°C, 220 rpm, em um ambiente confinado umidificado. Uma alíquota de 100 μl da cultura de um dia para o outro foi usada para inocular 2000 μl de meio definido + 10 μg/ml de neomicina em 5 ml de tubos cultura de plástico. O meio de cultivo foi um meio semidefinido enriquecido com base em tampão MOPS, com uréia como principal fonte de major nitrogênio, glicose como principal fonte de fonte de carbono, e suplementado com SOYTONE 1% e 5 mM de cálcio para um crescimento celular robusto. Os tubos de cultura foram incubados a 37°C, 250 rpm, por 72 horas. Após essa incubação, os caldos de cultura foram centrifugados por 10 minutos a 3.000 x g. A solução de sobrenadante foi decantada em 15 ml de tubos cônicos de polipropileno, e 80 μl de cada amostra foram divididos em alíquotas em placas de 96 poços para quantificação de proteína.

Exemplo 15 - Produção de variantes da enzima

[00425] Este Exemplo descreve a produção de escalonamentos de carga da enzima e bibliotecas combinatórias de cargas.

Escalonamentos de carga da enzima

[00426] Múltiplas variantes de proteínas que englobam uma gama de propriedades físicas de interesse são selecionadas das bibliotecas existentes ou são geradas por técnicas de mutagênese sítio-dirigida, como conhecido na técnica (veja, por exemplo, Pedidos de Patente U.S. Nos: 10/576.331, 11/581.102 e 11/583.334, emitidos para Genen- cor International). Esse conjunto definido de proteínas-sonda é então testado em um teste de interesse.

[00427] Variantes de amilase com carga escalonada exemplares são mostradas nas tabelas seguintes e testadas, como aqui descrito. Nessas tabelas, a alteração da carga é em relação à enzima parente. Tabela 15-1. Escalonamento de carga de AmyS-S242Q

Bibliotecas combinatórias de cargas de enzima (CCL) Geração de CCL de AmyS-S242Q de B. stearothermophilus

[00428] O DNA de plasmídeo de AmyS-S242Q foi isolado de uma cepa transformada de B. subtilis (genótipo: Δ aprE, Δ nprE, amyE::xilRPxilAcomK-phleo) e enviado à DNA2.0 Inc. como o modelo para a construção de CCL. Foi feita uma solicitação à DNA2.0 Inc. (Mountain View, CA) para a geração de bibliotecas posicionais em cada um dos quatro sítios na amilase AmyS-S242Q (S242Q) que são mostrados na Tabela 15-2. Variantes foram fornecidas como estoques de glicerol em placas de 96 poços.

[00429] A biblioteca combinatória de cargas de AmyS S242Q foi projetada por identificação dos seguintes quatro resíduos: Gln-97, Gln 319, Gln 358 e Gln 443. Um quarto sítio, CCL de 81 membros, foi criado fazendo-se todas as combinações de três possibilidades em cada sítio: do tipo selvagem, arginina ou ácido aspártico.Tabela 15-2. Variantes da CCL de S242Q

Exemplo 16 - Desempenho de lavagem da enzima

[00430] Este Exemplo descreve o teste da variante S242Q em um ensaio de microswatch com 1,0 μg/ml em Detergente AATCC HDL ou 5 mM de tampão HEPES sob potência iônica variável. Foram usados os métodos apresentados no Exemplo 12 (Veja "Ensaio de microswatch de amido de arroz para o teste do desempenho de amilase" e "Hidrólise de farinha de milho").

[00431] Há uma alteração ótima da carga elétrica líquida para o desempenho de limpeza para enzima no Detergente AATCC HDL. O de-sempenho é medido em termos de desempenho de limpeza relativo observado em um ensaio de atividade de microswatch de fécula de arroz. Um valor em torno de 1,0 indica desempenho de limpeza superior nesse ensaio. Esse é um exemplo de otimização de uma propriedade física de proteína (por exemplo, carga elétrica líquida) para aprimorar certo resultado final ou benefício (por exemplo, desempenho de limpeza em um detergente líquido para lavagem de roupas). Essa carga ótima identificada com esse conjunto limitado de proteínas-sonda coincide com a carga ótima observada quando se mede toda a biblioteca combinatória de cargas. O uso de proteínas-sonda é, portanto, preditivo do comportamento de toda a biblioteca.

[00432] De acordo com a teoria de Debye-Hückel (Israelachivili, "In- termolecular and Surface Forces, 2nd Edition: With Applications to Col-loidal and Biological Systems", Academic Press 2a Edição [1992]), as interações eletrostáticas são governadas primariamente pela potência de forças de camada dupla entre espécies em interação em potencial constante ou carga constante (enzimas, substratos, tecido e detergente), por seu tamanho e pela constante dielétrica do meio circundante. A fim de caracterizar o comportamento eletrostático de partículas em um meio complexo, por exemplo, uma formulação de detergente, sua interação em um ambiente reduzido que possui o mesmo comprimento de avaliação de Debye é suficiente. Isso foi obtido por escolha de um tampão de pH e condutividade compatíveis com aqueles do detergente sob condições de lavagem. Um tampão apropriado para esses testes é 5 mM de tampão HEPES em pH 8,0 com quantidades variáveis de ele- trólitos indiferentes, por exemplo, NaCl. A adição de 2,5 mM de NaCl a esse tampão combina o pH e a condutividade das condições de lavagem norte-americanas típicas. A adição de uma concentração de NaCl maior é representativa das condições de lavagem japonesas e européias, tipicamente maiores em termos de potência iônica em função da dureza de água e concentrações de detergente aumentadas.

[00433] A figura 22 mostra que variantes de carga S242Q com carga positiva são superiores para a limpeza de microswatches de fécula de arroz sob condições de lavagem norte-americanas. Da mesma forma, variantes TS23t de carga negativa são superiores para a limpeza de microswatches de fécula de arroz em condições de lavagem da Europa Ocidental (figura 23).

[00434] A figura 24 demonstra que variantes S242Q positivas exibem atividade específica superior para hidrólise de substratos granulares de amido de milho.

Exemplo 17 - Termoestabilidade

[00435] Este Exemplo descreve a determinação do relacionamento entre carga da proteína e estabilidade térmica. Os ensaios alfa- amilase se baseavam na hidrólise de BODIPY-amido antes e depois de aquecimento do sobrenadante da cultura. As mesmas soluções químicas e de reagentes foram usadas, como descrito no Exemplo 12.

Ensaio de estabilidade térmica de alfa-amilases

[00436] Os sobrenadantes da cultura filtrados foram diluídos serialmente em 50 mM de acetato de sódio + 2 mM de CaCl2 pH 5,8 com Tween a 0,02%. Foram testados 10 μl de cada sobrenadante de cultura diluído para determinar a atividade de amilase inicial pelo ensaio de BODIPY-amido. Cinquenta μl de cada sobrenadante de cultura diluído foram colocados em uma placa de PCR de 96 poços VWR de perfil baixo. Trinta μl de óleo mineral foram adicionados a cada poço como selante. A placa foi incubada em um ciclador térmico BioRad DNA Engine Peltier a 95°C por 30 ou 60 minutos, dependendo da estabilidade da enzima parente. Após incubação, a placa foi resfriada até 4°C por 5 min e depois mantida em temperatura ambiente. Dez μl de cada amostra foram adicionados a uma placa fresca e testados para determinar a atividade de amilase final pelo Ensaio de BODIPY-amido, como descrito no Exemplo 1.

Cálculo da termoestabilidade

[00437] A atividade residual de uma amostra foi expressa como a proporção da absorbância final e da absorbância inicial, ambas corrigidas para vazios. Um índice maior indica uma variante mais termoestá- vel. Esse é um exemplo de otimização de uma propriedade física da proteína, nesse caso, a carga elétrica líquida, para aprimoramento da estabilidade térmica da enzima para uma aplicação em um líquido para lavagem de roupas.

Ensaio de termoestabilidade

[00438] A termoestabilidade das variantes foi avaliada como descrito acima. Os vencedores da termoestabilidade estão listados na Tabela 17-1. Os vencedores foram definidos como aqueles que possuem uma proporção de atividade residual mutante para atividade parente (ou seja, S242Q) residual acima de 1. Tabela 17-1: S242Q CCL - Vencedores da estabilidade térmica

Exemplo 18 - Desempenho da enzima

[00439] Este Exemplo demonstra que o desempenho da enzima pode ser afetado pela carga.

[00440] O desempenho da enzima foi avaliado pelo uso de detergentes inativados por aquecimento, como descrito acima no Exemplo 12. Os vencedores foram definidos como aqueles que possuem um Índice de Desempenho (PI) acima de 1. O PI é a proporção de atividade mutante residual para atividade parente (ou seja, S242Q) residual. Os resultados são mostrados nas Tabelas 18-1 e 18-2.Tabela 18-1: S242Q CCL - Vencedores dos microswatches de fécula de arroz CS-28, Tide 2x (condições norte-americanas, como descrito no Ex. 12)

Tabela 18-2: S242Q CCL - Vencedores de microswatches de fécula de arroz CS-28, Persil (condições da Europa Ocidental)

[00441] A atividade também foi medida usando o ensaio de hidrólise de BODIPY-amido, como aqui fornecido. Os resultados são mostrados na Tabela 18-3. A atividade específica relativa nesse substrato de amido (um amido de milho) acima de 1 indica que a variante possui atividade específica maior do que a S242Q parente. O ppm relativo é a titulação da expressão e, quando maior do que 1, indica titulações maiores (em tubos de agitação) do que S242Q parente.Tabela 18-3: S242Q CCL - Vencedores da titulação e/ou BODIPY- amido

Exemplo 19 - Efeitos do equilíbrio de mutações sobre a atividade e expressão de amilase

[00442] Este exemplo ilustra que duas propriedades separadas da enzima podem ser otimizadas simultaneamente pela introdução de várias substituições de aminoácidos, até mesmo quando as propriedades estão correlacionadas negativamente de forma oposta em consequência, por exemplo, das características de carga da proteína.

[00443] Foi determinado durante experimentação que a expressão mediana de AmyS-242Q diminuía com o aumento da carga positiva. No entanto, a hidrólise específica da BODIPY-amido aumentava com o aumento da carga positiva. As expressões de amilase e da hidrólise de amido aumentadas são desejáveis em uma variante de AmyS-242Q criada geneticamente adequada para liquefação de amido na indústria de etanol combustível ou na limpeza em aplicações detergentes, por exemplo. Essas propriedades, no entanto, são propriedades aparentemente conflitantes. Com os métodos aqui fornecidos, é possível produzir uma variante de amilase mais altamente expressa, sem comprometer severamente a hidrólise de amido por combinação seletiva de mutações únicas. A estratégia aqui descrita foi usada com sucesso para produzir e selecionar variantes AmyS-242Q com substituições múltiplas que possuem aperfeiçoamentos em uma primeira propriedade (por exemplo, expressão como a propriedade primária), aprimorando ou não sacrificando, ao mesmo tempo, uma segunda propriedade (por exemplo, hidrólise de amido como a propriedade secundária).

[00444] Além disso, ao contrário da expressão mediana de variantes AmyS-242Q, a limpeza de microswatches de amido de milho aumentou com cargas positivas crescentes. A expressão de amilase re- combinante e o desempenho de limpeza aumentados são desejáveis em uma variante de AmyS-242Q criada geneticamente. Essas propriedades, no entanto, também são propriedades aparentemente confli- tantes. Com o uso dos métodos aqui descritos, é possível produzir uma variante de amilase mais altamente expressa, sem comprometer severamente o desempenho de limpeza por combinação seletiva de mutações únicas. A estratégia aqui descrita foi usada com sucesso para produzir e selecionar variantes AmyS-242Q com substituições múltiplas que possuem aperfeiçoamentos em uma primeira propriedade (por exemplo, expressão como a propriedade primária), aprimorando ou não sacrificando, ao mesmo tempo, uma segunda propriedade (por exemplo, limpeza de microswatches de fécula de arroz como a propriedade secundária).

[00445] Em particular, uma biblioteca combinatória de cargas de AmyS-S242Q (CCL) de oitenta membros compreendendo variantes que possuem combinações de uma a quatro substituições de resíduos com carga foi testada quanto à expressão em tubo de agitação, hidrólise de BODIPY-amido e atividade de limpeza de fécula de arroz. As AmyS-S242Q vencedoras estão mostradas nas Tabelas 7-1 e 7-1. Significativamente, as variantes com substituições múltiplas da Tabela 19-1 possuem expressão igual ou aumentada e hidrólise de BODIPY- amido, quando comparadas à enzima parente. Similarmente, as variantes com substituições múltiplas da Tabela 19-2 possuem expressão igual ou aumentada e atividade de limpeza de fécula de arroz igual ou aumentada, quando comparadas à enzima parente. Tabela 19-1. Vencedores da expressão de AmyS-S242Q e hidrólise de BODIPY-amido

Tabela 19-2. Vencedores da expressão de AmyS-S242Q e da hi-drólise de amido de arroz

[00446] Resumindo, como a atividade enzimática e a produção de enzima possuem dependências de carga diferentes (veja FIG. 26A, 26B, 27A e 27B), elas se correlacionam negativamente (veja FIG. 25A e 25B). No entanto, há diversas variantes que são aprimoradas tanto na expressão quanto na atividade, e a análise da biblioteca dessa forma permite que elas sejam identificadas.

[00447] Embora tenha sido demonstrado com amilases, esse méto- do é aplicável a outras classes de enzima como, por exemplo, proteases, lipases, celulases, transferases e pectinases. Além disso, qualquer combinação de duas ou mais propriedades pode ser analisada simultaneamente como, por exemplo, expressão, atividade, ligação, estabilidade térmica, estabilidade detergente e quelante.

Exemplo 20: Caracterização adicional de Variantes S242.

[00448] Uma biblioteca de variantes S242 (S242A, 242A, 242C, 242D, 242E, 242F, 242G, 242H, 242I, 242K, 242L, 242M, 242N, 242P, 242Q, 242R, 242T, 242V, 242W e 242Y) foi ainda caracterizada para determinar a expressão de proteína, atividade específica em pH 5,8 e pH 4, atividade específica em farinha de milho 85, e % de atividade residual na temperatura (veja também o Exemplo 3). Os resultados são mostrados com comparação relativa à enzima do tipo selvagem (ou amilase parente S242S) e à enzima de controle (SPEZYME ETHYL).

[00449] Os dados estão mostrados na Tabela 20-1.

[00450] A atividade específica em pH 5,8 e pH 4 foi medida usando o Ensaio de atividade de alfa-amilase em maltoheptaose (determinação da estabilidade ao pH) da seguinte forma:

[00451] A atividade de alfa-amilase de AmyS de B. subtilis e variantes de AmyS em maltoheptaose em pH 5,8 e pH 4 foi medida por monitoramento da produção de glicose, usando um ensaio colorimétrico cinético acoplado à enzima. As reações enzimáticas foram realizadas em placas de microtitulação de poliestireno de 96 poços de fundo achatado em temperatura ambiente. Para o ensaio realizado em pH 5,8, 10 μl dos sobrenadantes de cultura de AmyS e variantes de AmyS foram misturados com 40 μl de tampão contendo acetato de sódio (pH 5,8), CaCl2, Tween-20, peroxidase de raiz-forte (Sigma-Aldrich, N° de Catálogo 8375) e glicose oxidase (Genencor OxyGo®), em concentrações tais que o volume de 50 μl final contivesse 50 mM, 2,6 mM, 0,005% (p/v), 20 U/ml e 50 U/ml de cada componente, respectivamente. As reações foram iniciadas pela adição de 50 μl de tampão contendo 50 mM de acetato de sódio (pH 5,8), 5,4 mg/ml de sal diamônio de 2,2'-Azino-bis (ácido 3-etilbenzotiazolina-6-sulfônico) (Sigma-Aldrich, N° de Catálogo: A1888) e 10 mM de maltoheptaose (Sigma-Aldrich, N° de Catálogo M7753), e foram seguidas por 5 segundos de mistura. A formação de cor na reação foi monitorada a 405 nm em intervalos de 9 segundos por 240 segundos usando um espectrofotômetro Spectra- MAX 250 (Molecular Devices). A atividade enzimática foi registrada como a taxa de formação de cor durante o intervalo de monitoramento de 120-240 segundos. Para o ensaio realizado em pH 4,0, o método descrito acima foi repetido exatamente, exceto com o uso de tampões em pH 4,0. Tabela 20-1: Caracterização de variantes S242

[00452] Todas as publicações e patentes mencionadas no relatório descritivo acima são aqui incorporadas por referência. Embora os mé-todos e as enzimas descritos tenham sido descritos, em alguns casos, em conexão com modalidades específicas ou preferidas, deve-se su-bentender que o que está englobado pelas reivindicações em anexo não se limita a essas modalidades específicas ou preferidas. Na verdade, muitas modificações e variações dos métodos e enzimas descritos ficarão evidentes àqueles versados na técnica, e várias modificações dos modos descritos para a prática daquilo que foi descrito estão incluídas dentro do escopo das reivindicações que serão apresentadas a seguir.

Claims (12)

1. Variante de alfa-amilase, caracterizada pelo fato de que compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 que possui uma substituição S242A ou S242Q, e em que a variante tem uma termoestabilidade melhorada em comparação com a alfa-amilase parental semelhante à AmyS, e em que a variante tem atividade alfa- amilase detectável, em que a termoestabilidade é determinada para a parental e para a variante sob as mesmas condições experimentais.

2. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende: (a) uma variante de alfa-amilase como definida na reivindicação 1, e (b) pelo menos uma enzima adicional.

3. Composição detergente, caracterizada pelo fato de que compreende a composição como definida na reivindicação 2, em que a enzima adicional é uma amilase.

4. Composição de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que a enzima adicional é uma fitase, a qual opcionalmente tem a sequência que é a SEQ ID NO: 31.

5. Composição de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que a variante de alfa-amilase e a fitase estão presentes em quantidades tais que a proporção de AAU:FTU seja de 1:15 a 15:1, ou mais preferencialmente de 1:4 a 3:1.

6. Método de tratamento de um caldo de amido, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) adição ao caldo de amido de pelo menos uma fitase, a qual opcionalmente tem a sequência que é a SEQ ID NO: 31, e pelo menos uma variante de alfa-amilase como definida na reivindicação 1; em que a fitase e a variante de alfa-amilase são adicionadas ao mesmo tempo ou aproximadamente ao mesmo tempo, ou separadamente em qualquer ordem; e (b) incubação do caldo de amido sob condições que permitem a atividade da fitase e da variante de alfa-amilase.

7. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que (I) a fitase é adicionada antes da variante de alfa-amilase, e em que o caldo de amido é opcionalmente pré-incubado após a adição da fitase e antes da adição da variante de alfa-amilase, ou (II) a fitase e a variante de alfa-amilase estão presentes em uma mistura única antes da adição ao caldo de amido.

8. Método de produção de um substrato fermentável a partir de um caldo contendo amido que compreende grãos triturados, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) contato do caldo contendo amido com pelo menos uma fitase e pelo menos uma variante de alfa-amilase como definida na reivindicação 1 em uma quantidade suficiente para produzir um substrato fermentável a partir do caldo contendo amido; em que o contato com a fitase e a variante de alfa-amilase é iniciada ao mesmo tempo ou aproximadamente ao mesmo tempo, ou separadamente em qualquer ordem; e (b) incubação do caldo contendo amido sob condições que permitem a atividade da fitase e da variante de alfa-amilase por um tempo que permita a produção do substrato fermentável; em que, quando o contato com a fitase é iniciado antes da variante de alfa- amilase, o caldo contendo amido é incubado em uma temperatura que é 0-30°C menor do que uma temperatura de gelatinização antes do contato do caldo contendo amido com a variante de alfa-amilase, após o que a temperatura é elevada acima da temperatura de gelatinização por um período eficaz para hidrolisar o amido.

9. Método de tratamento de um material contendo amido ou um amido, caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de contato do material contendo amido ou do amido com uma composição que compreende pelo menos uma variante de alfa-amilase como definida na reivindicação 1 sob condições suficientes para permitir atividade detectável da variante de alfa-amilase, e em que o material contendo amido ou o amido é pelo menos parcialmente degradado pela variante de alfa-amilase.

10. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que compreende ainda pelo menos uma enzima adicional que é uma fitase, celulase, protease, aminopeptidase, amilase, carboidrase, carboxipeptidase, catalase, quitinase, cutinase, ciclodextrina glucanotransferase, desoxirribonuclease, esterase, α- galactosidase, β-galactosidase, glicoamilase, α-glicosidase, β- glicosidase, haloperoxidase, invertase, isomerase, lacase, lipase, manosidase, oxidase, pectinase, peptidoglutaminase, peroxidase, polifenoloxidase, nuclease, ribonuclease, transglutaminase, xilanase, pululanase, isoamilase, carragenase, ou uma combinação de duas ou mais das citadas anteriormente.

11. Método de acordo com a reivindicação 9 ou 10, caracterizado pelo fato de que é parte de um processo para degradação do amido, liquefação, fermentação, produção de álcool, produção de adoçante, produção de um substrato fermentável, limpeza, lavagem, remoção de manchas ou processo de cozimento.

12. Kit, caracterizado pelo fato de que compreende, em uma ou mais embalagens fornecidas como uma unidade: (i) pelo menos uma variante de alfa-amilase como definida na reivindicação 1; e (ii) pelo menos uma enzima adicional, em que a enzima adicional é opcionalmente uma fitase.

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