JPH06501732A - Ｃｂｈ ｉ型成分が欠損したセルラーゼ組成物を含有する洗浄剤組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 １、　産業上の利用分野 本発明は特定のセルラーゼ組成物を含有する洗浄剤組成物に関するものである。

つまり、本発明は、（ａ）洗浄に効果的な量の１つ以上の界面活性剤、および（ ｂ）１つ以上のエンドグルカナーゼ（ＥＧ）型成分および約５重量パーセント未 満のエキソ−セロビオヒドロラーゼ（ＣＢＨ）■型成分および、好ましくは、約 ５重量パーセント未満の全ＣＢＨ型成分を含有するセルラーゼ組成物、を含有す る洗浄剤組成物に関するものである。さらに好ましくは、本発明の洗浄剤組成物 に用いられるセルラーゼ組成物は、ＣＢＨＩ型成分を全く含まず、そして好まし くはＣＢＨ型成分を全く含まない。そのような洗浄剤組成物は、柔らかさ、感触 、色彩の保持／復元、等における改善を与える。

加えて、そのようなセルラーゼ組成物かいくらかのＣＢＨＩ型成分を含有する場 合、それが約５重量パーセント未満でも、増大した洗浄効果がまた観察される。

２、　従来技術 セルラーゼは、セルロース（β−１，４−グルカン環）を加水分解し、それによ りグルコース、セロビオース、セロ−オリゴ糖類等の形成を生じせしめる酵素と して従来技術において知られている。セルラーゼは菌類、細菌等中で産生（表現 ）される一方、ある菌類はセルロースの結晶性形状を分解可能な完全セルラーゼ 系を産生じ、そのようなセルラーゼは、発酵工程により大量に容易に産生される ので、菌類により産生されたセルラーゼは最も注目されている。

上述点に関して、ウッドらの「酵素学における方法」１６０．２５、頁２３４　 （１９８８）は、ある菌類が、エキソ−セロビオヒドロラーゼ（ＥＣ３，２，１ ，９１）（ｒＣＢＨＪ　）　、エンドグルカナーゼ（ＥＣ３，２，１゜４）（ｒ ＥＧＪ　）およびβ−グルコシダーゼ（ＥＣ３゜２．１．２１）（ｒＢＧＪ）と して同定される酵素を含むいくつかの異なる酵素分類からなる完全セルラーゼ系 を産生ずることを開示している。一方で、ある菌類は完全セルラーゼ系を産生で きない。一般的に、これらの系はＣＢＨ成分を欠いている。例えば、コーランら のセルロース分解の生化学および遺伝学、アルバートら、編集者、頁１１、（ア カデミツク出版、１９８８）；およびウッドらの、酵素学における方法、１６０ ．２５、頁８７、（アカデミツク出版、ニューヨーク、１９８８）を参照のこと 。

同様に、細菌セルラーゼが、ＣＢＨをほとんどまたは全く含有しないとして文献 に報告されているが、細菌セルラーゼから誘導されたＣＢＨ状成分がエキソ−セ ロビオヒドロラーゼ活性を有すると報告された事例はわずがである。

ＣＢＨ，ＥＧおよびＢＧの菌類セルラーゼ分類はさらに拡大して、各分類内の多 重（ｍｕｌｔｉｐｌｅ）成分を含有することができる。例えば、多重ＣＢＨおよ びＥＧは、２つのｃＢＨ，すなわち、ＣＢＨＩおよびＣＢＨＩＩ、および少なく とも３つのＥＧ、すなわち、ＥＧ　Ｉ、ＥＧＩＩおよびＥＧ　ＩＩＩを含有する Ｔｒ　ｉ　ｃｈｏｄｅ　ｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉを含む様々な菌類源から単離され る。

各ＣＢＨ，ＥＧおよびＢＧ骨分類らの成分からなる完全セルラーゼ系には、結晶 性セルロースをグルコースに効果的に転化することが要求される。単離された成 分は、結晶性セルロースを加水分解するに際して全く効果的ではない。

さらに、セルラーゼ成分の間に、特にそれらが異なる分類にある場合、相乗関係 が観察される。すなわち、完全セルラーゼ系の効果的なことは、同一の分類の単 離成分がらの貢献の合計よりも著しく大きい。この点に関して、ＥＧ酸成分よび ＣＢＨ成分は相乗的に相互作用してより効果的にセルロースを分解することが従 来技術において知られている。例えば、ウッド、バイオケム、Ｓｏｃ、Ｔｒａｎ ｓ、、１３、頁４０７−４１０　（１９８５）参照のこと。

基質特異性および異なるセルラーゼ成分の作用様式は、結合成分の相乗作用を説 明する分類に関して著しく異なる。

例えば、セルラーゼ作用の現在受は入れられている様式は、エンドグルカナーゼ 成分か、特にセルロースの低結晶度の領域における、内部β−１，４−グルコシ ド結合を加水分解し、エキソ−セロビオヒドロラーゼ成分が、セルロースの非還 元末端からのセロビオースを加水分解することである。エンドグルカナーゼ成分 の作用は、エキソ−セロビオヒドロラーゼ成分により認識される新たな鎖末端を 作成することにより、エキソ−セロビオヒドロラーゼの作用を大きく促進させる 。

β−グルコシダーゼ成分は、セロオリゴ糖類、例えば、セロビオース、のみに作 用し、唯一の産生物としてグルコースを与える。β−グルコシダーゼ成分はグル コースに対する全体的な反応を行ない、それによりＣＢＨおよびＥＧ成分上のセ ロビオースの阻害効果を解放するので、セルラーゼ系の必須部分であると考えら れる。

一方では、セルラーゼはまた従来技術において、組成物の洗浄能力を高める目的 の、柔軟剤としての使用の、および綿織物等の感触を改善する洗浄剤組成物に使 用されることが知られている。セルラーゼ組成物が衣類を柔軟化する正確な機構 は完全には理解されていないが、セルラーゼの柔軟化および色彩回復特性は、セ ルラーゼ組成物中のアルカリ性エンドグルカナーゼに帰する。それゆえ、例えば 、国際出願公報ＷＯ３９１０９２５９号は、特定アルカリ性エンドグルカナーゼ 成分の豊富なセルラーゼ組成物を含有する洗浄剤組成物は、そのような成分が豊 富でないセルラ−ゼ組成物と比較して、処理衣類に色彩の回復および改善された 柔らかさを与えることを開示している。加えて、洗浄剤組成物中へのそのような アルカリ性エンドグルカナーゼ成分の使用は、その洗浄剤組成物のｐＨ必要条件 を補足する。この参照文献のエンド−グルカナーゼせいぶんは、７．５から１０ のアルカリ性ｐＨで最大の活性を示し、アビセルとカルボキシメチル−セルロー ス上の活性基準を定義するものとして定義される。

一方で、セルラーゼ組成物は、綿含有織物を分解することが知られており、その 分解が減少した織物の強度損失により確証される。かわりに、そのような強度損 失は、部分的に、市販洗浄剤中のセルラーゼ組成物の不本意を説明する。

したがって、上述点に関して、完全なセルラーゼ系と比較して綿含有織物に減少 した強度損失をも与える１つ以上のエンドグルカナーゼ成分を含有するセルラー ゼ組成物は、洗浄剤組成物中の使用が特に有利である。

発明の概要 １つ以上のエンドグルカナーゼ成分を含有するセルラーゼ組成物が洗浄剤組成物 と結合して、そのような組成物を含有する洗濯媒質中で洗濯した綿含有織物に、 柔軟化、色彩保持／回復および感触の改善を与えることを発見した。

さらに、そのようなセルラーゼ組成物が約５重量パーセント未満のＣＢＨＩ型成 分を含有する場合、生成した洗浄剤組成物は、そのように洗濯された綿含有織物 により少ない強度損失を与えることを発見した。

ＣＢＩ（Ｉ欠損、ＣＢＨＩ豊富、まはＥＧＩＩＩ豊富であるセルラーゼ組成物を 含有する洗浄剤組成物に関して、セルロースからの還元糖を産生ずるのは、セル ラーゼの量であって、特定の酵素成分の加水分解の相対比ではなく、このことは 綿含有織物に所望の洗浄剤特性、例えば、洗浄剤組成物に１つ以上の改善された 色彩回復、改善された柔軟化および改善された洗浄を与えることを発見した。

したがって、組成物の一面として、本発明は、（ａ）洗浄に効果的な量の界面活 性剤または界面活性剤の混合物および（ｂ）洗浄剤組成物の重量に基づいて約０ ．０１から約５重量パーセント、好ましくは約０．０５から約２重量パーセント の菌類セルラーゼ組成物からなる洗浄剤組成物に関し、ここで菌類セルラーゼは １つ以上のＥＧ型成分および約５重量パーセント未満のＣＢＨＩ型成分（セルラ ーゼ組成物中の合計タンパク質に基づく）からなる。好ましい実施態様において 、洗浄剤組成物中に用いられる菌類セルラーゼ組成物は、１つ以上のＥＧ型成分 および約５重量パーセント未満の全ＣＢＨ型成分からなる。さらに好ましくは、 本発明に用いられる菌類セルラーゼ組成物は、全てのＣＢＨＩ型成分を含まず、 さらにより好ましくは全ＣＢＨ型成分を含まない。

別の好ましい実施態様において、セルラーゼ組成物は、いかなるＣＢＨＩ型成分 およびさらに好ましくはいかなるＣＢＨ型成分、すなわち、ＣＢＨＩ型およびＣ ＢＨＩＩ型成分を産生できないように遺伝学的に修飾された微生物から誘導され る。さらに好ましい実施態様において、セルラーゼ組成物は、いかなる異種タン パク質の表現なくして、いかなるＣＢＨＩ型成分またはいかなるＣＢＨ型成分を 産生できないように遺伝学的に修飾された微生物から誘導される。

その方法の一面において、本発明は、綿含有織物の柔らかさを高める強度損失抵 抗方法に関し、その方法は、（ａ）洗浄に効果的な量の界面活性剤または界面活 性剤の混合物および（ｂ）洗浄剤組成物の重量に基づいて約０．０１から約５重 量パーセント、好ましくは約０．０５から約２重量パーセントの菌類セルラーゼ 組成物からなる洗浄剤組成物であって、ここでセルラーゼ組成物が１つ以上のＥ Ｇ型成分およびセルラーゼ組成物中のタンパク質の重量に基づいた約５重量パー セント未満のＣＢＨＩ型成分からなる洗浄剤組成物から誘導される洗濯媒質中で その織物を洗濯することからなる。

その方法の別な一面において、本発明は、綿含有織物の色彩を保持／回復する強 度損失抵抗方法に関し、その方法は、（ａ）洗浄に効果的な量の界面活性剤また は界面活性剤の混合物および（ｂ）洗浄剤組成物の重量に基づいて約０．０１か ら約５重量パーセント、好ましくは釣０．　０５から約２重量パーセントの菌類 セルラーゼ組成物からなる洗浄剤組成物であって、ここでセルラーゼ組成物が１ つ以上のＥＧ型成分およびセルラーゼ組成物中のタンパク質の重量に基づいた約 ５重量パーセント未満のＣＢＨＩ型成分からなる洗浄剤組成物から誘導される洗 濯媒質中で１回以上その織物を洗濯することからなる。

図面の簡単な説明 図１は、ｐΔＣＢＨＩｐｙｒ４の構成の概略図である。

図２は、１つのＴ、ｒｅｅｓｅｉ染色体上のｃｂｈｌ座でのｐΔＣＢＨ１ｐｙｒ ４からの大きなＥｃｏＲＩ断片の組込みによるＴ、ｒｅｅｓｅｉ遺伝子の削除を 説明する図。

図３は、プローブとして３２ｐ標識ｐΔＣＢＨ１ｐｙｒ４を用いたサザン分析後 のＥｃｏＲＩ切断ｐΔｃＢａｒｐｙｒ４で転換したＴ、ｒｅｅｓｅｉ菌株ＧＣ６ ９からのＤＮＡのオートラジオグラフである。分子量マーカーのサイズハ、図の 左側にキロベースベアで示す。

図４は、プローブとして３２ｐ標識ｐＩｎｔｃＢＨＩを用いたサザン分析後のＥ ｃｏＲＩ切断ｐΔＣＢＨＩｐｙｒ４で転換したＴ、ｒｅｅｓｅｉ菌株ＧＣ６９か らのＤＮＡのオートラジオグラフである。分子量マーカーのサイズは、図の左側 にキロベースベアで示ス。

図５は、Ｔ、ｒｅｅｓｅｉの野生型により、そして転換菌株により分泌されたタ ンパク質を示す等電点電気泳動ゲルである。特に、図５において、等電点電気泳 動ゲルのし−ンＡはＴ、ｒｅｅｓｅｉからの部分的精製ＣＢＨＩを用いている； レーンＢは野生型Ｔ、ｒｅｅｓｅｉを用いている：レーンＣはｃｂｈｌ遺伝子が 欠失されたＴ、ｒｅｅｓｅｉ菌株からのタンパク質を用いている：そしてレーン Ｄはｃｂｈｌ遺伝子およびｃｂｈ２遺伝子が欠失されたＴ。

ｒｅｅｓｅｉ菌株からのタンパク質を用いている。図５において、図の右側は、 １つ以上の分泌タンパク質に発見された単一のタンパク質の位置を示すように印 を付けたものである。特に、ＢＧはβ−グルコシダーゼを指し、Ｅｌはエンドグ ルカナーゼＩを指し、Ｅ２はエンドグルカナーゼＩＩを指し、Ｅ３はエンドグル ヵナーゼエＩＩを指し、Ｃ１はエキソ−セロビオヒドロラーゼ■を指し、そして ０２はエキソ−セロビオヒドロラーゼＩＩを指す。

図６Ａは、ゲノムＤＮＡ上の４．ｌｋｂ　ＥｃｏＲＩ断片としてクローンしたＴ 、ｒｅｅｓｅｉ　ｃｂｈ２座を示した図であり、図６Ｂは、ｃｂｈ２遺伝子欠失 ベクターｐＰΔＣＢＨＩＩを示した図である。

図７は、プローブとして３２ｐ標識ｐＰΔＣＢＨＩＩを用いたサザン分析後のＥ ｃｏＲＩ切断ｐＰΔＣＢＨＩＩで転換したＴ、ｒｅｅｓｅｉ菌株Ｐ３７ＰΔＣＢ ＨＩＰｙｒ２６からのＤＮＡのオートラジオグラフである。分子量マーカーのサ イズは、図の左側にキロベースペアで示す。

図８は、プラスミドｐＥＧＩｐｙｒ４のダイヤグラムである。

図９は、４０℃でのｐＨ範囲に亘るＴｒ　ｉ　ｃｈｏｄｅ　ｒｍａ　ｒｅｅｓｅ ｉから誘導された酸性ＥＧ豊富菌類セルラーゼ組成物（ＣＢＨＩおよびＩＩを欠 失した）のＲＢＢ−ＣＭＣ活性プロフィール、並びに４０℃でのｐＨ範囲に亘る Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉから誘導された豊富ＥＧＩＩＩセルラー ゼ組成物の活性プロフィールを説明する図である。

図１０は、様々な量のＣＢＨ成分を有するセルラーゼ組成物で処理した綿含有織 物のランダロメータ（１ａｕｎｄｅｒｏｍｅｔｅｒ）中の３回の洗濯後の強度損 失の結果を説明する図である。

図１１は、様々なｐＨでの野生型Ｔｒ　ｉ　ｃｈｏｄｅ　ｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ により分泌されたセルラーゼで処理した綿含有織物の繊維除去の結果（パネルテ ストスコアに基づく）を説明する図である。

図１２は、野生型Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉにより分泌された様々 な濃度のセルラーゼ（ｐｐｍ）で処理した綿含有織物、およびＣＢＨＩおよびＣ ＢＨＩＩを分泌できないように遺伝学的に設計したＴｒ　ｉ　ｃｈ。

ｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉの菌株により分泌されたセルラーゼで処理した綿織物 の繊維除去の結果（パネルテストスコアに基づく）を説明する図である。

図１３は、ＣＢＨＩおよびＣＢＨＩＩを分泌できないように遺伝学的に変更した Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉの菌株から誘導した様々な濃度（ｐｐｍ ）のＥＧ豊富セルラーゼ組成物の柔軟さのパネルテストを説明する図である。

図１４は、都合のよい制限エンドヌクレアーゼ開裂部位を生成するためにｅｇｌ ｌおよびｃｂｈｌに作られた部位特定交代のダイヤグラムである。それぞれの場 合において、上側のラインは元のＤＮＡ配列を示し、導入された変化を中はどの ラインに示し、新たな配列は下側のラインに示す。

図１５は、ｐｃＥＰｃｌから得られるより大きなＥｃ。

ＲＩ断片のダイヤグラムである。

図１６は、Ｔ、ｒｅｅｓｅｉ　ＲｕｔＣ３０の未変換菌株からの、およびＴ、ｒ ｅｅｓｅｉをＥｃｏＲＩ切断ｐＣＥＰＣＩで変換することにより得られた２つの 形質転換株からのＤＮＡのオートラジオグラフである。ＤＮＡをＰｓｔｉで切断 して相補性ＤＮＡ鎖が得られ、３２ｐ標識ｐＵＣ４に：　：　ｃｂｈｌで雑種形 成した。マーカーＤＮＡ断片のサイズは図の左側にキロベースの組で示す。

図１７は、プラスミドｐＥＧＩ　Ｉ　：　：　Ｐ−１のダイヤグラムである。

図１８は、ＨｉｎｄｌｌｌおよびＢａｍＨＩで切断したｐＥＧＩ　Ｉ　：　：Ｐ −１で変換したＴ、ｒｅｅｓｅｉ菌株Ｐ３７ＰΔΔ６７Ｐ１からのＤＮＡのオー トラジオグラフである。相補性ＤＮＡ鎖を調製し、ＤＮＡは、ｅｇ１３遺伝子を 含有する放射線標識Ｔ、ｒｅｅｓｅｉＤＮＡの約４ｋｂ　Ｐｓｔｌ断片で雑種形 成した。ラインＡ、、ＣおよびＥは、未変換株からのＤＮＡを含有し、−万Ｂ、 ＤおよびＦは、未変換Ｔ、ｒｅｅｓｅｉ菌株からのＤＮＡを含有する。

Ｔ、ｒｅｅｓｅｉＤＮＡを、ラインＡＳＢのＢｇｌｌｌで、ラインＣ，ＤのＥｃ ｏＲＶで、そしてラインＥ、ＦのＰｓｌｏで切断した。マーカーＤＮＡ断片のサ イズは図の左側にキロベースペアで示す。

図１９は、プラスミドｐＰΔＥＧＩ−１のダイヤグラムである。

図２０は、Ｈｉｎｄｌ　Ｉ　Ｉ切断ｐΔＥＧＩｐｙｒ−３により得られた菌株Ｇ Ｃ６９の形質転換株から単離したＤＮＡの相補性ＤＮＡ鎖のオートラジオグラフ である。未変換株に予期したプローブ、放射線標識ｐΔＥＧＩｐｙｒ−３による 雑種形成の模様をレーンＣに示す。レーンＡはｅｑ１１遺伝子が分裂した形質転 換株に予期された模様を示し、レーンＢはｐΔＥＧＩｐｙｒ−３ＤＮＡがゲノム 中に組込まれたがｅｑｌｌ遺伝子を分裂しない形質転換株を示す。

レーンＤはＨｉｎｄｌ　Ｉ　Ｉで切断したｐΔＥＧＩｐｙｒ−３を含有し、適切 なサイズのマーカーを提供する。マーカーＤＮＡ断片のサイズは図の左側にキロ ベースペアで示す。

発明の詳細な説明 上述したように、本発明は全般的に、１つ以上のＥＧ型セルラーゼ成分および約 ５重量パーセント未満のＣＢＨＩ型成分を含有する菌類セルラーゼ組成物を含む 洗浄剤組酸物、並びにそのようなセルラーゼ組成物を用いた方法に関するもので ある。酸性、中性またはアルカリ性のｐＨをと有する媒質中で用いられる場合、 そのような洗浄剤組成物は、その媒質中で洗濯される綿含有織物に、柔らかさ、 色彩保持／回復、および感触における改善を与える。さらに、そのセルラーゼ組 成物中に存在する少量のＣＢＨＩ型成分のために、これらの組成物はまた、多量 のＣＢＨＩ型成分金成分する組成物と比較して、減少した強度損失を与える。

しかしながら、本発明を詳細に論じる前に、以下の用語を最初に定義しておく。

「菌類セルラーゼ」という用語は、菌類から得られたセルラーゼ遺伝子の全てま たは一部を含有し表現するために遺伝学的に変更された菌類源または微生物から 誘導された酵素組成物を指す。菌類セルラーゼはセルロースまたは１つ以上のそ の分解産生物に作用し、セルロースを加水分解し、主生成物、グルコースとセロ ビオースを与える。菌類セルラーゼは、放線菌、滑走細菌（粘液細菌）および真 性細菌のような微生物を含む非菌類源から生成したセルラーゼから区別される。

ここに記載した洗浄剤組成物に用いられるセルラーゼ組成物を調製するのに都合 のよいセルラーゼを生成することのできる菌類は、英国特許第２，０９４，８２ ６号に開示されており、その開示をここに参照文献として用いる。

最良の菌類セルラーゼは一般的に、酸性または中性のｐＨ範囲において最大の活 性を有するが、いくつかの菌類セルラーゼが、中性およびややアルカリ性の条件 下で著しい活性を有することが知られており、すなわち、例えばＨｕｍｉｃｏｌ ａ　１ｎｓｏｌｅｎｓから誘導されたセルラーゼは中性からややアルカリ性条件 下で著しい活性を有することが知られている。

菌類セルラーゼは、異なる基質特異性、酵素的作用パターン等を有するいくつか の酵素分類からなることが知られている。加えて、各分類内の酵素成分は、異な る分子量、ことなるグリコジル化度、異なる等電点、異なる基質特異性等を示し 得る。例えば、菌類セルラーゼは、エンドグルカナーゼ（ＥＧ）、エキソ−セロ ビオヒドロラーゼ（ＣＢＨ）、β−クルコシダーゼ（ＢＧ）等を含むセルラーゼ 分類を含む。一方、細菌セルラーゼが、はとんどまたは全くＣＢＨ成分を含有し ないと文献に報告されているが、細菌セルラーゼから誘導されたＣＢＨ状成分が エキソ−セロビオヒドロラーゼ活性を有すると報告されたことはまれである。

自然に発生した菌類源により産生されて１つ以上のＣＢＨおよびＥＧ酸成分らな る菌類セルラーゼ組成物は、これらの成分それぞれが菌類源により産生された比 率で発見され、ここではときどき「完全菌類セルラーゼ系」または「完全菌類セ ルラーゼ組成物」と称され、その組成物を、そこから単離されたセルラーゼの分 類および成分から、細菌とある菌類により産生された不完全セルラーゼ組成物か ら、またはセルラーゼのＣＢＨおよび／またはＥＧ酸成分生産しないように、ま たは産生過剰、産生不足となるように遺伝学的に修飾した微生物から得たセルラ ーゼ組成物から区別する。

セルラーゼの産生のための菌類を培養する発酵方法は、従来技術においてそれ自 体が知られている。例えば、セルラーゼ系は、バッチ、フェト−バッチ（ｆｅｄ −ｂａｔｅｈ）および連続流動工程を含む固体または浸水培地のいずれかにより 産生され得る。発酵肉汁（ｂ　ｒ　ｏ　ｔ　ｈ）からのセルラーゼ系の集積およ び精製はまた、従来技術においてそれ自体が知られている方法により達成される 。

「エンドグルカナーゼ（ｒＥＧＪ　）型成分」は、それら全ての菌類セルラーゼ 成分またはＴｒ　ｉ　ｃｈｏｄｅ　ｒｍａｒｅｅｓｅｉのエンドグルカナーゼ成 分に似た洗浄剤活性特性を示す成分の組合せを示す。この点に関して、Ｔｒｉｃ ｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉのエンドグルカナーゼ成分（特に、ＥＧ　Ｉ、Ｅ Ｇ　ＩＩ、ＥＧ　ＩＩＩ等を単一または組合せで）は、これらの成分が洗濯媒質 ちゅに含まれ、その織物がこの媒質で処理された場合、締金を織物に、柔らかさ 、色彩保持／回復および改善された感触を与える。したかって、エンドグルカナ ーゼ型成分は、これらの成分が洗濯媒質中に含まれる場合に線表類に柔らかさ、 色彩保持／回復および改善された感触を与える菌類セルラーゼ成分である。好ま しい実施態様において、本発明の洗浄剤組成物に用いられるエンドグルカナーゼ 型成分はまた、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉから誘導された完全セル ラーゼ系から生じた強度損失と比較して、綿含有織物により少ない強度損失を与 える。

そのようなエンドグルカナーゼ型成分は、伝統的な生化学活性試験を用いてエン ドグルカナーゼとして分類される成分を含まない。例えば、そのような伝統的な 活性試験は、（ａ）カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）のような溶性セルロ ース誘導体を加水分解して、それにより溶液を含有するＣＭＣの粘度を減少せし める、（ｂ）リン酸膨潤セルロース（例えば、ワルセスセルロース）のようなセ ルロースの水和形態を容易に加水分解する、およびセルロースのより高度な結晶 性形！！！（例えば、アビセル、ソルカフロク等）を容易ではないが加水分解す る、成分の能力に基づく。一方で、そのような活性試験により定義されるような 全てのエンドグルカナーゼ成分が、綿含有織物に、改善された柔らかさ、感触お よび色彩保持／回復を与えるわけではないと思われている。したがって、エンド グルカナーゼ型成分を、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉのエンドグルカ ナーゼ成分により所有されるような類似の洗浄剤組成物における特性を所有する 菌類セルラーゼの成分として定義することが本発明にとってより正確である。

菌類セルラーゼは１つより多いＥＧ型成分を含有し得る。

異なる成分は一般的に、異なる等電点、異なる分子量、異なるグリコジル化度、 異なる基質特異性、異なる酵素活性パターン等を有する。成分の異なる等電点に より、イオン交換クロマトグラフィー等による分離か可能となる。実際、異なる 菌類源からの成分の単離は従来技術において知られている。例えば、ボルフらの 米国特許出願０７／４２２，８１４、シュラインらの、国際出願Ｗ　Ｏ８９１０ ９２５９、ウッドらのセルロース分解の生化学および遺伝学、３１から５２　（ １９８ｇ）　；ウッドらの炭化水素リサーチ、１９０巻、２７９から２’１７　 （１９１１８）　；シュライン、酵素学における方法、１６０巻、２３４から２ ４２（１９８８）等を参照のこと。これらの各参照文献の完全な開示を、ここに 引用する。

一般的に、ＥＧ型成分の組合せは、単一のＥＧ酸成分比較して柔らかさ、色彩保 持／回復および感触を改善する際に、相乗応答を示すと考えられている。一方で は、単一のＥＧ型成分はより安定であり、ｐＨ範囲に亘り広いスペクトルの活性 を有する。したがって、本発明に用いられるＥＧ型成分は、単一のＥＧ型成分ま たは２つ以上のＥＧ型成分の組合せのいずれかである。成分の組合せが用いられ る場合、ＥＧ型成分は同一または異なる菌類源ら誘導される。

「エキソ−セロビオヒドロラーゼ型ＣｒＣＢＨ型」）成分」は、Ｔｒｉｃｈｏｄ ｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉのＣＢＨＩおよび／またはＣＢＨＩＩセルラーゼに類似 した洗浄剤活性特性を示す菌類セルラーゼ成分を指す。この点に関して、ＥＧ型 酸成分セルラーゼ成分不在下で用いられた場合（上記定義したように）、Ｔｒｉ ｃｈｏｄｅｒｍａｒｅｅｓｅｉのＣＢＨＩおよびＣＢＨＩＩ酸成分みでは、その 処理した綿含有織物に、著しい色彩保持／回復および改善された感触を与えない 。したがって、ＥＧ型成分と組み合わせて用いた場合、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ 　ｒｅｅｓｅｉのＣＢＨＩ成分は、その綿含有織物に高められた強度の損失およ び増大した洗浄効果を与える。

したがって、ＣＢＨＩ型成分およびＣＢ）１　１１型成分は、それぞれＴｒｉｃ ｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉのＣＢＨＩおよびＣＢＨＩＩ酸成分類似した洗浄 剤活性特性を示す菌類セルラーゼ成分を指す。上述したように、ＣＢＨＩ型成分 に関して、このことは、ＥＧ型成分の存在下で用いられる場合、綿含有織物の強 度損失を高める、および／または増大した洗浄効果を与える特性を含む。好まし い実施態様において、ＥＧ型成分の存在下で用いられる場合、ＣＢＨＩ成分はま た増大した柔軟化効果を与える。

そのようなエキソ−セロビオヒドロラーゼ型成分はどうしてもｓＴｒｉｃｈｏｄ ｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉのＣＢＨＩおよびＣＢＨＩＩを特徴付けるのに用いられ たような活性試験を用いてエキソ−セロビオヒドロラーゼとして因襲的に分類さ れた成分は含まない。例えば、そのような伝統的な分類試験を用いて、そのよう な成分は、（ａ）セルビオースにより競争的に阻害される（Ｋｉは約１ｍＭ）； （ｂ）カルボキシメチルセルロース等のような置換セルロースを著しくは加水分 解できない：　（Ｃ）リン酸膨潤セルロースを加水分解し、高度な結晶性セルロ ースはあまり加水分解しない。対称的に、活性試験によりＣＢＨ成分として特徴 付けられたある菌類セルラーゼ成分は、洗浄剤組成物中で単独で用いられる場合 、綿含有織物に、改善された柔らかさ、感触および色彩保持／回復を提供すると 思われる。したがって、エキソ−セロビオヒドロラーゼ成分は、Ｔｒｉｃｈｏｄ ｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉのエンドグルカナーゼ成分により所有されるような洗浄 剤組成物の類似の機能特性を所有するので、そのようなエキソ−セロビオヒドロ ラーゼをＥＧ型成分として定義することか本発明に関してより正確であると思わ れる。

ＥＧ酸成分豊富な菌類セルラーゼは、精製技術により得られる。つまり、完全菌 類セルラーゼ系は、適切なｐＨでのイオン交換クロマトグラフィー、親和力クロ マトグラフィー、サイズ排他等を含む、文献中においてよく出版されている認識 された分離技術により、実質的に純粋な成分に精製できる。例えば、イオン交換 クロマトグラフィーにおいて（通常陰イオン交換クロマトグラフィー）、ｐＨ勾 配、または塩勾配、またはｐＨと塩の両方の勾配で溶出することにより、セルラ ーゼ成分を分離できる。

ＣＢＨＩ型セルラーゼ成分に対するＥＧ型成分の必要な比率を有するセルラーゼ 成分の混合物が、その成分の単離および組換え以外の方法で調製されることも考 えられる。

この点に関して、ＣＢＨ成分に対するＥＧ酸成分比較的高い比率を与えるために 、天然微生物の発酵条件を変更することも可能である。同様に、組換え技術は、 ＣＢＨ成分に対するＥＧ酸成分比較的高い比率を有する、または全ＣＢＨ成分を 含まない１つ以上のＥＧ酸成分産生できるセルラーゼ成分の混合物を産生ずるよ うにＣＢＨ成分に対するＥＧ酸成分相対比率を変更することもできる。

上述したことに関して、ＥＧ酸成分豊富なセルラーゼ組成物の調製に適した方法 は、１つ以上のＣＢＨ型成分を産生できないように遺伝学的に微生物を修飾する ことによるものであり、その方法はいかなる異種タンパク質も産生じない。同様 に、１つ以上のＥＧ型成分を過剰産生ずるように遺伝学的に微生物を修飾するこ ともまた可能である。例えば、１９９０年１０月５日に出願され、ここにその全 体を参照文献として含む米国特許出願０７１５９３．９１９号は、１つ以上のＣ ＢＨ成分を産生できないようにおよび／または１つ以上のＥＧ酸成分過剰産生で きないように遺伝学的にＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉを作成する方法 を開示している。さらに、その用途の方法は、いかなる異種タンパク質も産生し ないＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｒｅｅｓｅｉを産生する。同様に、ミラーらの、ｒ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎ１ｄｕｌａｎｓにおける直接または間接置換」分子 および細胞生化学、頁１７１４−１７２１　（１９８５）は、５相同ＤＮＡの線 形断片を用いたＤＮＡ媒介転換によりＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎ１ｄｕｌａｎ Ｓ中の遺伝子を欠失する方法を開示している。ミラーらの方法は、いかなる異種 タンパク質を産生ずることなく遺伝子の欠失を達成する。

上述点に関して、ＣＢＨＩ型またはＣＢＨＩＩ型セルラーゼ成分のいずれかを産 生ずる原因となる遺伝子の欠失は、セルラーゼ組成物中に存在するＥＧ型成分の 量を豊富にする効果を有する。同様に、ＣＢＨＩ型およびＣＢＨＩＩ型セルラー ゼ成分を産生ずる原因となる遺伝子の欠失は、ＣＢＨ型成分を含まないセルラー ゼ組成物となる。

さらに、菌類セルラーゼ組成物は、不完全な菌類セルラーゼ組成物を産生ずる菌 類源からここに用いられる。例えば、ある菌類がＣＢＨ成分を含まないセルラー ゼ組成物を産生ずることが知られている。例えば、コーラランらの、セルロース 分解の生化学および遺伝子学、オーパートらの編集、頁１ｌ−３０（アカデミツ ク出版、１９８８）は、赤腐れ菌類は、明らかにＣＢＨ成分を産生じないが、こ れらの成分の１つ以上がＣＢＨＩ型成分であるかのうせいもあることを開示して いる。一方、本発明の目的のために、そのような菌類により産生された十分な量 のエンドグルカナーゼがＥＧ型成分である場合、ＣＢＨＩ型成分に対するＥＧ型 成分の必要な比率を得るために豊富にすることなく、本発明の実施にそのような セルラー・ゼを用いることが可能である。

加えて、従来の方法により精製された１つ以上のＣＢＨ型成分の必要量は、１つ 以上のＣＢＨ型成分に対するＥＧ型成分の特定比率を達成するように、ＣＢＨ型 成分を産生できないように遺伝学的に作成された微生物から産生されるセルラー ゼ組成物に加えられる、すなわち、ＥＧ型成分が豊富であるように全ＣＢＥ［型 成分を含まないセルラーゼ組成物は、１重量パーセントの精製ＣＢＨＩ型成分を セルラーゼ組成物に加えることによるだけで、１重量パーセントのＣＢＨＩ型成 分を含有するように配合できる。

「β−グルコシダーゼ（ＢＧ）成分」は、ＢＧ活性を示すセルラーゼ成分を指し 、すなわちそのような成分はセロビオースの非還元末端および他のセロオリゴ糖 類（「セロビオース」）から作用し、単一産生物としてのグルコースを与える。

ＢＧ酸成分セルロース高分子上に吸着されず、または反応しない。さらに、その ようなりＧ成分は競争的にグルコースにより阻害される（Ｋｉは約１ｍＭ）。厳 密な意味において、ＢＧ酸成分セルロースを分解できないので文字通りにはセル ラーゼではないが、そのようなりＧ成分は、これらの酵素が、ＣＢＨ成分および ＥＧ酸成分結合作用により産生された阻害セルロース分解産生物（特にセロビオ ース）をさらに分解することによりセルロースの全体的な分解を促進させるため 、セルラーゼ系の定義内に含まれる。ＢＧ酸成分存在なくしては、結晶性セルロ ースの加水分解は緩やかにしかまたはほとんど生じない。ＢＧ酸成分しばしば、 ｐ−ニトロフェノールＢ−Ｄ−グルコシド（ＰＮＰＧ）のようなアリル基質に特 徴付けられ、それゆえしばしばアリル−グルコシダーゼと呼ばれる。全てのアリ ルグルコシダーゼがＢＧ酸成分あるわけてはなく、あるものはセロビオースを加 水分解しない。

セルラーゼ組成物中のＢＧ酸成分存在または不在は、ＣＢＨ成分の活性を調整す るのに用いられると考えられる。

つまり、セロビオースはＣＢＨ成分によるセルロース分解中に産生されるので、 そして高濃度のセロビオースがＣＢＨ活性を阻害することが知られているので、 さらにそのようなセロビオースはＢＧ酸成分よりグルコースに加水分解されるの で、セルラーゼ組成物中のＢＧ酸成分不在は、セロビオースの濃度が阻害水準に 達する場合にＣＢＨ活性を「消失」させる。また、１つ以上の添加剤（例えば、 セロビオース、グルコース等）を、そのセルラーゼ組成物に加えて、直接にまた は間接的に、いくらかまたは全てのＣＢＨ１型活性型皿性に他のＣＢＨ活性を効 果的に「消失」できると考えられる。そのような添加剤が用いられた場合、用い られる添加剤の量か、ＣＢＨＩ型活性を、ここに記載したセルラーゼ組成物を用 いることにより達成されるＣＢＨＩ型活性と等しい水準、または少ない水準に低 下させるのに十分であれば、本発明への使用に適した組成物であると考えられる 。

一方、ＣＢＨ成分により生成されたセロビオースの水準が、添加したＢＧ酸成分 不在下でそのような全体の加水分解の制限となる場合、添加した量のＢＧ酸成分 含有するセルラーゼ組成物は、セルロースの全体の加水分解を増大させる。

セルラーゼ組成物中のＢＧ酸成分量を増加せしめるまたは減少せしめるいずれか の方法か、事務所明細書番号０１００５５−０５６として１９９０年１２月１０ 日に出願され、「クローニングによるセルロースの糖化およびＴＲＩ　ＣＨＯＤ ＥＲＭＡＲＥＥＳＥＩによるβ−グルコシダーゼ遺伝子の増幅」と題された米国 特許出願節０７／８２５．１４０号に記載されており、ここに参照文献として含 む。

菌類セルラーゼは１つ以上のＢＧ酸成分含有できる。異なる成分は一般的に、イ オン交換クロマトグラフィー等によりそれらの分離を可能にする異なる等電点を 有する。単体ＢＧ酸成分たはＢＧ酸成分組合せのいずれかが用いられる。

洗浄剤組成物中で用いられる場合、ＢＧ酸成分一般的に、セロビオースにより、 ＣＢＨおよびＥＧ酸成分そして特に、ＣＢＨＩ型成分の阻害を防ぐのに十分な量 で加えられる。

加えるＢＧ酸成分量は、当業者により容易に決定される洗浄剤洗濯中に産生され るセロビオースの量に依存する。しかしながら、使用される場合、セルラーゼ組 成物中に存在するいかなるＣＢＨ型成分と比較したＢＧ酸成分重量パーセントは 、好ましくは約０．２から約１０重量パーセントであり、より好ましくは約０． ５から約５重量パーセントである。

本発明に用いられる菌類セルラーゼ組成物を調製するのに使用される好ましい菌 類セルラーゼは、Ｔｒ　ｉ　ｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉＳＴｒｉｅｈｏｄ ｅｒｍａ　ｋ。

ｎｉｎｇｉｉ、Ｐｅｎｅｉ　１１ｕｍ　ｓｐ、　、Ｈｕｍｉｃｏｌａ　１ｎｓｏ ｌｅｎｓ、等から得られるものである。

ある菌類セルラーゼは市販されている。すなわち、セルキャスト（デンマーク、 コペンハーゲン、ノボインダストリー社から得られる）、ラビダーゼ（オランダ 、デルフト、Ｎ、■１、ギストブロケイド社から得られる）、サイトラーゼ１２ ３（カリフォルニア州、南すンフランシスコ、ジネンカーインターナショナル社 から得られる）等である。

他の菌類セルラーゼもまた、周知の発酵および単離方法により容易に単離できる 。

「綿含有織物」という用語は、綿を編んだ織物、綿ニット、綿デニム等を含む綿 ブレンドまたは純粋な綿から作られる縫った、または縫われていない織物を指す 。綿ブレンドが用いられる場合、織物中の綿の量は、少なくとも４０重量パーセ ントの綿、好まｌ、＜は約６０重量パーセントより多い綿、そして最も好ましく は約７５重量パーセントより多い綿である。ブレンドとして用いられる場合、そ の織物に用いられる材料は、ポリアミド繊維（例えば、ナイロン６およびナイロ ン６６）、アクリル繊維（例えば、ポリアクリロニトリル繊維）、ポリエステル 繊維（例えば、ポリエチレンテレフタレート）、ポリビニルアルコール繊維（例 えば、ビニロン）、ポリ塩化ビニル繊維、ポリ塩化ビニリデン繊維、ポリウレタ ン繊維、ポリ尿素繊維およびアラミド繊維のような合成繊維を含む１つ以上の綿 ではない繊維を含む。レーヨンのような再生セルロースは、綿含有織物中で綿の 代替物として用いられる。

「界面活性剤」という用語は、洗浄剤組成物中への使用としてよく知られている アニオン、非イオンおよび両性電解質界面活性剤を指す。

「洗濯媒質」という用語は、必要量の洗浄剤（界面活性剤）組成物を水に加える ことにより調製される水性洗濯溶液を指す。その洗濯媒質は一般的に、洗浄に効 果的な量の洗浄剤を含む。

洗濯媒質は、その媒質のｐＨが約４から約７未満である場合、「酸性洗濯媒質」 と定義される。洗濯媒質は、その媒質のｐＨが約７である場合、「中性媒質」と 定義される。

洗濯媒質は、その媒質のｐＨが７より上で約１０までである場合、「アルカリ性 洗濯媒質」と定義される。好ましくは、アルカリ性洗濯媒質は、７より上で約９ まで、さらに好ましくは７より上で約８までのｐＨををする。本発明は、ＥＧ型 成分が、洗浄剤組成物中に用いられ、その組成物が酸性、中性またはアルカリ性 洗濯媒質中で用いられるかにかかわらす、綿含有織物の柔軟化並びに色彩保持／ 復元および感触をもたらすことかできるという発見に基づく。しかしながら、洗 浄剤組成物は一般的にアルカリ性条件において用いられるので、使用されるセル ラーゼ組成物は好ま１、　＜は、そのような条件下でいくらかの活性を有するも のである。好ましいセルラーゼ組成物は、Ｔ、ｒｅｅｓｅｉおよびＨｕｍｉｃｏ ｌａ　１ｎｓｏｌｅｎｓから誘導されたものを含む。Ｈｕｍｉｃｏｌａ　１ｎｓ ｏｌｅｎｓからのセルラーゼ組成物は、アルカリ性条件下で著しい活性を保持す ることか従来技術において知られている。

ＥＧ酸成分存在は色彩の保持／復元、柔軟化および改善された感触をもたらすの に必要であるか、ＥＧ型成分およびＣＢＨ型成分（ＣＢＨＩ型成分を含む）の特 定の混合物はまた、同一の利益またはいくらか増大した利益を示す。

つまり、ＥＧ酸成分使用はいくらかの洗浄の利益となる一方、増大した洗浄の利 益は、１つ以上のＥＧ型成分を含み、さらにＣＢＨＩ型セルラーゼ成分を含むセ ルラーゼ組成物を含む洗浄剤組成物で洗濯した綿含有織物に観察される。

加えて、ＥＧ酸成分使用は柔軟化をもたらすが、増大した柔軟化の利益は、ＥＧ 型成分とともにいくらかのＣＢＨＩ型成分金成分ことにより達成される。

一方では、ＥＧ酸成分組み合わされた大量のＣＢＨＩ型成分の存在は、ＣＢＨＩ 型成分を含まない、または減じられた量のＣＢＨＩ型成分を含むのいずれかであ るセルラーゼ組成物と比較して、綿含有織物に増大した強度損失を与えることと なる。したがって、セルラーゼ含有洗浄剤組成物の強度損失特性を最小限とする ために、本発明の洗浄剤組成物は、１つ以上のＥＧ型成分および約５重量パーセ ント未満、好ましくは約２重量パーセント未満のＣＢＨ１型成分金成分セルラー ゼ組成物を使用する。そのようなセルラーゼ組成物を含有する洗浄剤組成物は、 綿含有織物に所望の高められた質を提供するが、より多量のＣＢＨ１型成分金成 分るセルラーゼ組成物を含有する洗浄剤組成物と比較して、減少した強度損失を も提供する。

さらに上述した点に関して、本発明の洗浄剤組成物に使用する特定のセルラーゼ 組成物は、最小限のＣＢＨＩ型成分の使用またはＣＢＨＩ型成分を全く使用しな いことを要求する強度損失抵抗の利益に対して、いくらかのＣＢＨ１型成分金成 分により達成される増大した洗浄効果への要望を釣り合わせることにより作られ る。すなわち、セルラーゼを洗浄剤中に含む主な重点が、綿含有織物に、最小限 に可能な強度損失とともに、改善された柔らかさ、色彩保持／復元、および改善 された感触を与えるためである場合、その洗浄剤組成物中に用いられるらるは、 全てのＣＢＨＩ型成分を含まない１つ以上のＥＧ型成分からなることが好ましい 。

一方では、セルラーゼを洗浄剤中に含む主な重点が、増大した洗浄の利益ととも に、色彩の保持／復元、改善された軟らかさおよび改善された感触を綿含有織物 に与えることである場合、洗浄剤組成物中に用いられるらるは、１つ以上のＥＧ 型成分並びにいくらかのＣＢＨＩ型成分（たとえセルラーゼ組成物の合計タンパ ク質重量に基づいて約５重皿パーセント未満、好ましくは約２重量パーセント未 満でも）を含有する。

上述点に関して、本発明の洗浄剤組成物中に一般的に用いられるセルラーゼの量 は、線表類に色彩保持／復元および軟らかさを与えるのに十分な量である。好ま しくは、セルラーゼ組成物は、全洗浄剤組成物の重量に対して、約０゜０１重量 パーセントから約５重皿パーセントで用いられる。

さらに好ましくは、セルラーゼ組成物は、全洗浄剤組成物の重量に対して、約０ ．０５重量パーセントから約２重皿パーセントで用いられる。洗浄剤組成物中に 用いられるセルラーゼの特定の濃度は、洗濯媒質への希釈において、ＥＧ型成分 の濃度が約０．５から約５００ｐｐｍ、好ましくは約２から約１１００ｐｐの範 囲となるように選択される。

洗浄剤組成物中に用いられるらるの特定量は１、セルラーゼ組成物中のＥＧ型成 分の量、並びにその洗浄剤組成物が水への添加により希釈されて洗濯媒質を形成 する程度に依存する。これらの要因は、当業者により容易に確認される。

好ましくは、本発明の洗浄剤組成物中に用いられるセルラーゼ組成物は、セルラ ーゼ組成物中タンパク質の合計重量に基づいて少なくとも約２重皿パーセントの エンドグルカナーゼ型成分、さらに好ましくは、セルラーゼ組成物中タンパク質 の合計重量に基づいて少なくとも約２重皿パーセント、ざらの好ましくは、少な くとも約２重皿パーセント、最も好ましくは、少なくとも約２重皿パーセントの エンドグルカナーゼ型成分を含有する。

より低いセルラーゼ濃度では（すなわち、洗濯媒質中で約５ｐｐｍ未満のＥＧ型 成分の濃度）、本発明の洗浄剤組成物の使用により達成される軟らかさ、色彩の 保持／復元および改善された感触は、繰り返しの洗濯に亘りより明確である。よ り高い濃度では（すなわち、洗濯媒質中駒５ｐｐｍおよびそれより高いＥＣ型成 分の濃度）、その改善は１回の洗濯において顕著である。

本発明の重要な面の１つは、１つ以上のＥＧ型成分を含有し、最少量のＣＢＨＩ 型成分を含有するようにセルラーゼ組成物を調製することにより、綿含有織物に 、減少した強度損失を達成する一方で、柔軟化、色彩保持／復元および改善され た感触の所望の効果を達成できることである。

加えて、そのように調製したセルラーゼ組成物の使用により、その洗浄剤組成物 中において低濃度のセルラーゼの使用となる。次に、洗浄剤組成物中の低濃度の セルラーゼの使用は、改善された消費者の安全性を導く。

上述したセルラーゼ組成物は、液体希釈物、粒状、乳濁液、ゲル、ペースト等の いずれかの状態で洗浄剤組成物に加えられる。そのような形状は当業者によ（知 られている。

固体の洗浄剤組成物が用いられる場合、セルラーゼ組成物は好ましくは粒剤とし て配合される。好ましくは、その粒剤は、セルラーゼ保護剤を含有するように配 合される。例えば、その明細書かここにその全体を２照文献として含まれる、１ ９９１年１月１７日に出願され、「酵素および酵素保護剤を含有する粒剤、並び にそのような粒剤を含有する洗浄剤組成物」という名称の米国特許出願節０７／ ６４２．６６９号を参照のこと。同様に、その粒剤は、その粒剤の洗濯媒質中へ の溶解度を減少させる物質を含有するように配合され得る。そのような物質およ び粒剤は、その明細書がここにその全体を参照文献として含まれる、事務所番号 ＧＣＳ−１７１−ＵＳＩとして１９９１年１月１７日に出願され、「粒剤組成物 」と称する米国特許第０７／６４２．５９６号に開示されている。

本発明の洗浄剤組成物は、洗浄剤組成物中への使用がよく知られているアニオン 、非イオン、両性電解質界面活性剤を含む界面活性剤を使用する。

本発明の洗浄剤組成物への使用に適したアニオン界面活性剤は、直鎖または枝別 れアルキルゼンゼンスルホン酸塩、直鎖または枝別れアルキル基またはアルケニ ル基を有するアルキルまたはアルケニルエーテル硫酸塩、アルキルまはアルケニ ル硫酸塩、オレフィン硫酸塩、アルカン−スルホン酸塩等を含む。アニオン界面 活性剤に適した対イオンは、ナトリウムおよびカリウムのようなアルカリ金属イ オン、カルシウムおよびマグネシウムのようなアルカリ土類金属、アンモニウム イオン、および炭素数２または３のアルカノール基を１から３こ有するアルカノ ールアミンを含む。

両性電解質界面活性剤は、第４級アンモニウム塩スルホン酸塩、ベタイン型両性 電解質界面活性剤等を含む。そのような両性電解質界面活性剤は、同一の分子中 に陽性および陰性に荷電した基の両者を含む。非イオン界面活性剤は一般的に、 ポリオキシ−アルキレンエーテル、並びに高級脂肪酸アルカノールアミドまはそ のアルキレン酸化物付加物、高級酸グリセリンモノエステル等からなる。

本発明への使用に適した界面活性剤は、英国特許第２゜０９４．８２６号に開示 されており、その開示をここに参照文献として含む。

そのような界面活性剤の混合物もまた用いられる。

界面活性剤または界面活性剤の混合物は一般的に、洗浄剤組成物合計の約１重皿 パーセントから約２重皿パーセントの量で、好ましくは、洗浄剤組成物合計の約 ５重皿パーセントから約２重皿パーセントの量で本発明の洗浄剤組成物中に用い られる。洗濯媒質中の希釈に関して、界面活性剤の濃度は一般的に、約５００ｐ ｐｍまたはそれ以上、好ましくは、約１１０００ｐｐから１５．ＯＯＯｐｐｍで ある。

セルラーゼ組成物および界面活性剤に加えて、本発明の洗浄剤組成物は必要に応 じて、１つ以上の以下の成分を含有できる： セルラーゼ以外の加水分解酵素 そのような加水分解酵素は、エステル結合に作用するカルボキシレートエステル 加水分解酵素、チオエステル加水分解酵素、リン酸塩モジエステル加水分解酵素 およびリン酸塩ジエステル加水分解酵素；グリコジル化合物に作用するグリコシ ド加水分解酵素：Ｎ−グリコジル化合物を加水分解する酵素：エーテル結合に作 用するチオエーテル加水分解酵素；ペプチド結合に作用するα−アミノ−アシル −ペプチド加水分解酵素、ペプチジル−アミノ酸加水分解酵素、アシル−アミノ 酸加水分解酵素、ジペプチド加水分解酵素、およびペプチジル−ペプチド加水分 解酵素を含む。

それらの中で好ましいものは、カルボキシレートエステル加水分解酵素、グリコ シド加水分解酵素、およびペプチジル−ペプチド加水分解酵素である。適した加 水分解酵素は、（１）ペプシン、ペプシンＢルンニン、トリプシン、キモトリプ シンＡ１キモトリプシンＢ１エラスターゼ、エンテロキナーゼ、カテプシンｃ１ パパイン、キモパパイン、フィシン、トロンビン、フィブリノリジン、レニン、 サブチリシン、アスベルギルベブチダーゼＡ１コラゲナーゼ、クロストリジオペ ブチダーゼＢ１カリクレイン、ガストリシン、カテプシンＤ０、ブロメリン、ケ ラチナーゼ、キモトリプシンＣ１ペプシンＣ１アスベルギルベプチダーゼＢ１ウ ロキナーゼ、カルボキシ−ペプチダーゼＡとＢ１および、アミノペプチダーゼの ようなペプチジル−ペプチド加水分解酵素に属するプロテアーゼ；　（２）α− アミラーゼ、β−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、インベルターゼ、リソシーム 、ペクチナーゼ、キチナーゼおよびデキストナラーゼのようなグリコシド加水分 解酵素（本質的な成分であるセルラーゼはこの群より除外される。それらの中で 好ましいもの、α−アミラーゼおよびβ−アミラーゼである。それらは酸性から 中性系で機能し、アルカリ性系において高い活性を示す細菌から得られるものも ある：　（３）カルボキシエステラーゼ、リパーゼ、ペクチンエステラーゼおよ びクロロフィラーゼを含むカルボキシレートエステラーゼ。

それらの中で特に効果的なものはリパーゼである。

市販されている製品の商標名および製造社は以下のとおりである：　「アルカラ ーゼ」、「エスペラーゼ」、「サビナーゼ」、ｒＡＭＧＪ、ｒＢＡＮＪ、「フン ガミル」、「スイートザイム」、「テルマミル」　（デンマーク、コペンハーゲ ン、ノボインダストリー）：「マヵスターゼ」、「高アルカリ性プロテアーゼ」 、「アミラーゼＴＨＣＪ、「リパーゼ」　（オランダ、デルフト、Ｎ、Ｖ、　、 ギストブロケード）：「プロテアーゼＢ−４００Ｊ、「プロテアーゼＢ−４００ ０Ｊ、「プロテアーゼＡＰＪ、「プロテアーゼＡＰ２１００Ｊ　（スイス、バセ ル、スイスフアーメントＡ、　Ｇ、）；　ｒＣＲＤプロテアーゼ」　（ミズーリ 、セントルイス、モンサントＵ）；　「ビオカーゼ」　（イリノイ、ミンチセロ 、ビオビン社）；「プロナーゼＰ」、「プロナーゼＡＳＪ、「プロナーゼＡＦＪ 　（日本、カケンケミカル社）；　［ラビダーゼＰ−２０００Ｊ　（フランス、 セフラン、ラビダス）；プロテアーゼ産生物（タイラー標準ふるい、１６メツシ ユで１００％通過し、１５０メツシユで１００％残る）にューヨーク、スタンダ ードブランド社の部門、クリントンコーンプロダクッ）；「タカミネ」、「ブロ メレイン１：１０Ｊ、ｒＨＴプロテアーゼ２００」、「酵素Ｌ−ＷＪ　（細菌で はなく、菌類から得られた）（インディアナ、エルクハート、マイルスケミカル 社）；「ロザイムＰ−１１濃縮物」、「ベクチノール」、「リパーゼＢ」、「ロ ザイムＰＦＪ、「ロザイムＪ−２５Ｊ　（ＣＡ、南すンフランシスコ、ジネンカ ー、ローム及ハース社）：「アンプロザイム２００Ｊ　（Ｎ、Ｊ、　、ネワーク 、ノブコケミカル社に従属するジャックウルツ社）；　ｒＡＴＰ４０Ｊ、ｒＡＴ Ｐ１２０Ｊ、ｒＡＴＰ１６０Ｊ　（フランス、セフラン、ラピダス）：「オリバ ーゼ」　（日本、長潮産業）。

セルラーゼ以外の加水分解酵素が、目的により要求されるだけ洗浄剤組成物中に 含まれる。その加水分解酵素は、好ましくは、精製したものに関して、０．００ １から５重量パーセント、さらに好ましくは０．０２から３重量パーセントの量 で含まれる。この酵素は、粗製酵素のみから作られた粒剤の形状で、または洗浄 剤組成物中の他の成分と組み合わされて用いられる。粗製酵素の粒剤は、精製酵 素がその粒剤中に０．００１から５０重量パーセントとなる量で用いられる。そ の粒剤は、０．００２から２０、好ましくは０．１から１０重量パーセントの二 で用いられる。

セルラーゼに関して、これらの粒剤は、酵素保護剤および溶解遅延物質を含有す るように配合される。

陽イオン界面活性剤および長鎖脂肪酸塩そのような陽イオン界面活性剤および長 鎖脂肪酸塩は、飽和または不飽和脂肪酸塩、アルキルまたはアルケニルエーテル カルボン酸塩、α−スルホ脂肪酸塩またはエステル、アミノ酸型界面活性剤、リ ン酸塩エステル界面活性剤、３から４のアルキル置換基および１までのフェニル 置換アルキル置換基を有するものを含む第４アンモニウム塩を含む。

適切な陽イオン界面活性剤および長鎖脂肪酸塩が、英国特許第２，０９４，８２ ６号に開示されており、その開示をここに参照文献として含む。その組成物は、 そのような陽イオン界面活性剤および長鎖脂肪酸塩の約１から約２０重量パーセ ントを含む。

ビルダー Ａ、二価金属イオン封鎖剤 その組成物は、以下の化合物のアルカリ金属塩およびアルカノールアミン塩から なる群より選択される１つ以上のビルダー成分を約０から約５０重量パーセント で含む：すン酸塩、ホスホン酸塩、ホスホノカルボキシレート、アミノ酸の塩、 アミノポリ酢酸塩高分子電解質、非溶解ポリマー、ジカルボン酸の塩、およびア ルミノケイ酸塩。適切な二値金属イオン封鎖剤が、英国特許第２，０９４，８２ ６号に開示されており、その開示をここに２照文献として含む。

Ｂ、アルカリまたは無機電解質 その組成物は、アルカリまたは無機電解質として以下の化合物の１つ以上のアル カリ金属塩の組成物を、約１がら約５０重量パーセント、好ましくは約５から約 ３０重量パーセントで含む：ケイ酸塩、炭酸塩および硫酸塩、並びにトリエタノ ールアミン、ジェタノールアミン、モノエタノールアミンおよびトリイソプロパ ツールアミンのような有機アルカリ。

抗再析出剤 その組成物は、抗再析出剤として以下の化合物の１つ以上を約０．　１から約５ 重量パーセントで含む：ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリ ビニルピロリドンおよびカルボキシメチルセルロース。

それらの中で、カルボキシメチルセルロースおよび／またはポリエチレングリコ ールと本発明のセルラーゼ組成物の組合せは、特に有用な泥除去組成物を提供す る。

漂白剤 過炭酸ナトリウム、過硼酸ナトリウム、硫酸ナトリウム／過酸化水素付加物およ び塩化ナトリウム／過酸化水素付加物のよにうな漂白剤または／およびスルホン 化フタロシアニンの亜鉛またはアルミニウム塩のような感光漂白染料と組み合わ せての本発明のセルラーゼの使用はさらに、洗浄効果を改善する。

青味付は剤および蛍光染料 必要であれば、組成物中に青味付は剤および蛍光染料を含有できる。適切な青味 付は剤および蛍光染料が、英国特許第２．０９４．８２６号に開示されており、 その開示をここに参照文献として含む。

固化阻害剤 以下の固化阻害剤が、粉末の洗浄剤中に含まれる：ｐ−トルエンスルホン酸塩、 キシレンスルホン酸塩、酢酸塩、スルホサクシン酸塩、タルク、微粉砕シリカ、 粘土、ケイ酸カルシウム（ジョーンズマンビル社のミクロセルのような）炭酸カ ルシウムおよび酸化マグネシウム。

セルラーゼ活性を阻害する因子のマスキング剤本発明のセルラーゼ組成物は、銅 イオン、亜鉛イオン、クロムイオン、水銀イオン、鉛イオン、マンガンイオンま たは銀イオンもしくはその化合物の存在下においである場合には失活せしめられ る。様々な金属キレート剤および金属沈殿剤がこれらの阻害剤に対して効果的で ある。それらは、例えば、必要に応じての添加剤に関して上記に記載したような 二価金属イオン封鎖剤並びにケイ酸マグネシウムおよび硫酸マグネシウムを含む 。

セロビオース、グルコースおよびグルコノラクトンは、同時に阻害剤として作用 する。これらの糖類とセルラーゼの共存は、できる限り避けることが好ましい。

共存か不可避の場合、糖類とセルラーゼの直接の接触を、例えばそれらを被覆す ることにより避けることが必要である。

長鎖脂肪酸塩および陽イオン界面活性剤はある場合には阻害剤として作用する。

しかしながら、これらの物質とセルラーゼとの共存は、それらの直接の接触が、 タブレット化または被覆のような方法により避けられる場合、さしつかえない。

上述したマスキング剤および方法は、必要であれば、本発明に用いられる。

セルラーゼ活性剤 活性剤は、様々なセルラーゼに依存して変化する。タンパク質、コバルトおよび その塩、マグネシウムおよびその塩、カルシウムおよびその塩、カリウムおよび その塩、ナトリウムおよびその塩、またはマンノースとキシロースのような単糖 類の存在下において、セルラーゼは活性化せしめられ、その洗浄力は著しく改善 される。

抗酸化剤 抗酸化剤は、例えば、第３ブチル−ヒドロキシトルエン、４．４′　−ブチリデ ンビス（６−第３−ブチル−３−メチル−フェノール）　、２．２’−ブチリデ ンビス（６−第３−ブチル−４−メチル−フェノール）、モノスチレン化フェノ ール、ジスチレン化フェノールおよび１，１−ビス（４−ヒドロキシ−フェノー ル）シクロヘキサンを含む。

可溶化剤 可溶化剤は、例えば、エタノールのような低級アルコール、ベンゼンスルホン酸 塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩のような低級アルキル−ベンゼンスルホン酸塩、 プロピレングリコールのようなグリコール、アセチルベンゼンスルホン酸塩、ア セトアミド、ピリジンジカルボン酸アミド、安息香酸塩および尿素を含む。

本発明の洗浄剤組成物は、酸性からアルカリ性ｐＨまでの広いｐＨ範囲において 用いられる。好ましい実施態様において、本発明の洗浄剤組成物は、アルカリ性 洗浄剤洗濯媒質中、さらに好ましくは、７より上で８以下のｐＨを有するアルカ リ性洗浄剤洗濯媒質中で用いられる。

上述した成分は別として、所望であれば、本発明の洗浄剤組成物に、香料、緩衝 液、保存剤、染料等が用いられる。

そのような成分は、これまで従来技術において用いられている量で用いられる。

本発明に使用される洗浄剤のベースが粉末の形状である場合、吹付は一乾燥法お よび粒剤法を含む既知の調製方法により調製されるものである。特に吹付は一乾 燥法および／または吹付は一乾燥粒剤法により得られた洗浄剤ベースが好ましい 。吹付は一乾燥法により得られた洗浄剤ベースは、調製条件間して制限されない 。その吹付は一乾燥法により得られた洗浄剤ベースは、界面活性剤およびビルダ ーのような熱抵抗性成分の水性スラリーを熱した空間に吹き付けることにより得 られる中空の粒剤である。その粒剤は、５０から２０００マイクロメーターのサ イズを有する。吹付は一乾燥後、香料、酵素、漂白剤、無機アルカリ性ビルダー を加える。吹付は一乾燥粒剤法により得られるような高密度の粒剤洗浄剤ベース に関して、様々な製粉がそのベースの調製後に加えられる。

洗浄剤ベースが液体である場合、均質な溶液または不均質な分散物のいずれかで ある。洗浄剤中のセルラーゼによりカルボキシメチルセルロースの析出物を除去 するために、その組成物中に含有する前に、カルボキシメチルセルロースは粒剤 化または塗膜されることが望ましい。

本発明の洗浄剤組成物は、工業的および家族的に、これらの環境で従来用いられ る温度および液体比率で用いられる。

洗濯洗浄剤への使用に加えて、ここに記載したセルラーゼ組成物は、色彩の保持 ／復元、柔軟化および感触における所望の改善を提供する十分な活性を示す中間 のｐＨでの適切な溶液中での予洗工程においても用いることができる。

セルラーゼ組成物か、液体、吹付け、ゲルまたはペースト組成物のいずれかとし て、予洗（例えば、プリウォッシュ）組成物中に用いられる場合、そのセルラー ゼ組成物は、予洗組成物の合計重量に基づいて約０．０１から約２０重量パーセ ントで用いられる。そのような組成物に置いて、界面活性剤も必要に応じて用い られ、用いられる場合には、予洗組成物の合計重量に基づいて約０．０１から約 ２０重量パーセントで存在する。組成物の残りは、予洗に用いられている従来の 成分、すなわちそれぞれ従来の濃度で、希釈剤、緩衝液、他の酵素（プロテアー ゼ）等からなる。したがって、そのような予洗組成物は、約０から約２０重量パ ーセントの界面活性剤、および約０．０１から約２０重量パーセントの、１つ以 上のＥＧ型成分と約５重量パーセント未満のＣＢＨＩ型成分からなるセルラーゼ よりなる。

また、ここに記載したセルラーゼ組成物は、色褪せた織物に色彩を復元するのに 適した孤立組成物として家庭の用途で用いられる。例えば、ここにその全体を参 照文献として含む、米国特許第４，７３８，６８２号を参照のこと。

以下の実施例は本発明を説明するために提示されたものであり、その視野を限定 するように解釈されるべきではない。

実施例 実施例１−１２および２０−２８は、１つ以上のセルラーゼ組成物を産生できな いように、または特定のセルラーゼ組成物を過剰産生ずるように、遺伝学的に設 計したＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉの産生を説明する。

実施例１ Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉのｐｙｒ４誘導体の選択 ｐｙｒ４遺伝子は、ウリジンの生合成に必要とされる酵素である、オロチジン− ５′−モノリン酸塩デカルボキシラーゼをコードする。毒性阻害因子５−フルオ ロオロチン酸（ＦＯＡ）か、野生型細胞によりウリジン中に含まれ、それゆえ細 胞を毒する。しかしながら、ｐｙｒ４遺伝子中に検出される細胞はこの阻害因子 に対する抵抗を有するか、成長のためにウリジンを必要とする。それゆえ、ＦＯ Ａを用いてｐｙｒ４誘導体菌株を選択することが可能である。

実際、Ｔ、ｒｅｅｓｅｉ菌株ＲＬ−Ｐ３７の芽胞（シールーニース、Ｇ、および モンテンコート、Ｂ、Ｓ、　、Ａｐｌ）１、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、Ｂｉｏｔｅｃ ｈｎｏｌ、２０、ｐ、　４６−５３　（１９８４）　）を、２ｍｇ／ｍｌのウリ ジンおよび１．２ｍｇ／ｍｌのＦＯＡを含有する固体化した媒質の表面上に広げ た。３または４日以内に、自然なＦＯＡ抵抗群体が現れ、その後に、成長のため にウリジンを必要とするそれらのＦＯＡ抵抗誘導体を同定することができる。特 異的に欠損ｐｙｒ４遺伝子を有したそれらの誘導体を同定するために、プロトプ ラストを産生じ、野生型ｐｙｒ４遺伝子を含有するプラスミドで転換した（実施 例３および４参照）。転換に続いて、プロトプラストを、ウリジンを欠いた媒質 上に展開した。転換群体の続いての成長は、プラスミドボーン（ｂｏｒｎｅ）ｐ ｙｒ４遺伝子による欠損ｐｙｒ４遺伝子の補完を示した。このようにして、菌株 ＧＣ６９を、菌株ＲＬ−Ｐ３７のｐｙｒ４誘導体であると同定した。

実施例２ ＣＢＨＩ欠失ベクターの調製 ＣＢＨＩタンパク質をコードするｃｂｈｌ遺伝子を、既知のプローブ合成方法を 用いた、この遺伝子に関して公表された配列を元にして設計したオリゴヌクレオ チドプローブでの雌型形成により、Ｔ、ｒｅｅｓｅｉ菌株ＲＬ−Ｐ３７のゲノム ＤＮＡからクローンした（シューメーカーら、１９８３ｂ　）。ｃｂｈｌ遺伝子 は、６．５ｋｂ　ＰｓｔＩ断片上に存在し、当業者に知られた技術を用いてこの ベクターのＫａｎ’遺伝子を置換することによりＰｔ５Ｉ切断ｐＵＣ４Ｋ　（Ｎ Ｊ、ビス力タウエイ、ファーマシア社から購入）中に挿入され、この技術はマニ アチスらにより述べられており（１９８９）　、ここに参照文献として含む。次 いで産生じたプラスミド、１）ＵＣ４に：　：　ｃｂｈｌをＨｉｎｄＩＩＩで切 断し、約６ｋｂのより大きな断片を単離して、再結さつしてＩ）ＵＣ４に：　： 　ｃｂｈｌΔＨ／Ｈを与えた（図１参照）。この方法は、完全なｃｂｈｌ暗号配 列および約１゜２ｋｂ上流と１．５ｋｂ下流下流側列配除去する。元来のＰｓｔ ｌ断片のいずれかの末端からの、おおよそ１ｋｂＯ側腹ＤＮＡが残る。

Ｔ、ｒｅｅｓｅｉ　ｐｙｒ４遺伝子を、マニアチスらの方法に従って、ｐＵｃ１ ８中のゲノムＤＮＡの６．５ｋｂＨｉｎｄＩ　Ｉ　Ｉ断片としてクローンし、ｐ Ｔｐｙｒ２（スミスら、１９９１）を形成した。プラスミドｐＵＣ４に＋：ｃｂ ｈｌΔＨ／ＨをＨｉｎｄＩＩＩで切断し、その末端を子牛腸アルカリ性ホスファ ターゼで脱リンした。この末端脱リンＤＮＡを、Ｔ、ｒｅｅｓｅｉ　ｐｙｒ４遺 伝子を含有する６、５ｋｂ　ＨｉｎｄｌＩＩ断片と連結し、ｐΔＣＢＨＩｐｙｒ ４を得た。図１はこのプラスミドの構成を説明している。

実施例３ プロトプラストの単離 ５００ｍ１のフラスコ中の１００ｍ１のＹＥＧ　（０，５％の酵母抽出物、２％ のグルコース）を約５Ｘ１０’のＴ６ｒｅｅｓｅｉ　ＧＣ６９芽胞（ｐｙｒ４誘 導体菌株）で接種することにより菌糸体を得た。次いでそのフラスコを振動させ ながら３７℃で約１６時間、培養した。２．　７５０Ｘｇでの遠心分離により菌 糸体を収穫した。収穫した菌糸体をさらに、１．２Ｍソルビット溶液中で洗浄し 、５ｍｇ／ｍｌのノボザイム２３４溶液（Ｃｔ、ダンバリー、ノボバイオラボか ら得られる、１．３−アルファーグルカナーゼ、１．３−ベーターグルカナーゼ 、ラミナリナーゼ、キシラーゼ、キチナーゼおよびプロテアーゼを含有する多成 分酵素系の商標である）；５ｍｇ／ｍｌのＭｇＳＯ４−７Ｈ２０；　０．５ｍｇ ／ｍ１の牛血清アルブミン、１．２Ｍソルビットを含有する４０ｍ１の溶液中に 再懸濁せしめた。

プロトプラストを、ミラクロス（ＣＡ、ラジョラ、カルビオケム社）を通じての 濾過により細胞デブリから除去し、２．０００ｇでの遠心分離により集積した。

そのプロトプラストを、１．２Ｍのソルビット中で３回洗浄して、１゜２Ｍのソ ルビット、５０ｍＭの（ａＣ１２中で１回洗浄し、遠心分離し、］、２２Ｍソル ビット５０ｍＭのＣａＣ１゜のｍ１当たり約２Ｘ１０８プロトプラストの密度で 再懸濁せしめた。

実施例４ 菌類プロトプラストのｐΔＣＢＨＩｐｙｒ４による転換実施例３において調製し た２００μｌのプロトプラスト懸濁液を、２０μｌのＴＥ緩衝液（１０ｍｌ　ト リス、ｐＨ７，４，１ｍＭ　ＥＤＴＡ）中のＥｃｏＲＩ切断ｐΔＣＢＨ’１ｐｙ ｒ４（実施例２において調製）、および２５％ＰＥＧ　４０００．０．６Ｍ　Ｋ ＣＩおよび５０ｍＭのＣａｃ１□を含有する５０μｌのポリエチレングリコール （ＰＥＧ）溶液に加えた。この混合物を２０分間、氷上で培養した。この培養期 間の後に、そこに上述のように同定した２、０ｍｌのＰＥＧを加え、その溶液を さらに混合し、室温で５分間培養した。この第２の培養後、１．２Ｍのソルビッ トおよび５０ｍＭのＣａＣｌ２を含有する４、０ｍｌの溶液をそれに加え、この 溶液をさらに混合した。次いてそのプロトプラスト溶液を、追加の１％のグルコ ース、１．２Ｍのソルビットおよび１％のアガロースを含有するボゲルス媒質Ｎ （１リツトル当たり、３グラムのクエン酸ナトリウム、５グラムのＫＨ２ＰＯ４ ，２グラムのＮＨ４Ｎ０３．０．２グラムのＭｇＳＯ４・７Ｈ２０，０，１グラ ムのＣａＣ１２”　２Ｈ２０，５μｇのα−ビオチン、５ｍｇのクエン酸、５ｍ ｇのＺｎＳＯ４”　７Ｈ２０，１ｍｇのＦ　ｅ　（ＮＨ４）　２　”　６Ｈ２０ ，０，２５ｍｇのＣｕＳＯ４−５Ｈ２０，５０μｇのＭｎＳＯ４−４Ｈ２０）の 溶解アリコートに直ちに加えた。次いでプロトプラスト／媒質混合物を、上述し た同一のボゲル媒質を含有する固体媒質上に注いだ。その媒質中にはウリジンは 全く存在せず、それゆえ、転換群体のみが、ｐΔＣＢＨＩ、ｐｙｒ４中に挿入さ れた野生型ｐｙｒ４遺伝子による菌株ＧＣ６９のｐｙｒ４突然変異の補完め結果 として成長することができた。これらの群体を続いて転移せしめ、添加剤として １％のグルコースを含有する固体水ゲル媒質Ｎ上に精製し、安定な形質転換体を さらなる分析のために選択した。

この段階において、安定な形質転換体を、そのより速い成長速度およびウリジン を欠いた固体培養媒質上のぎざぎざというよりもむしろ滑らかな輪郭を有する円 形の群体の形成により不安定な形質転換体とは区別した。ある場合においては、 固体の非選択性媒質（すなわち、ウリジンを含有する）上に形質転換体を成長さ せ、この媒質から芽胞を収穫し、続いて発芽してウリジンを欠いた選択性媒質上 に成長するこれらの芽胞の百分率をめることにより、さらなる安定性の試験を行 なった。

実施例５ 形質転換体の分析 形質転換体が、１％のグルコースを含有する液体水ゲル媒質Ｎ中で成長せしめら れた後に、ＤＮＡを、実施例４で得られた形質転換体から単離した。これらの形 質転換体ＤＮＡ試料をさらにＰｓｔｌ制限酵素で切断し、アガロースゲル電気泳 動を行なった。次いでそのゲルを、ニドラン膜フイルタ上にプロットし、３２ｐ 標識ｐΔＣＢＨＩｐｙｒ４プローブで雑種形成した。プローブを選択して、６． ５ｋｂ　Ｐｓｔｌ断片としての天然ｃｂｈｌ遺伝子、転換ＤＮＡ断片から誘導さ れたいかなるＤＮＡ配列および天然ｐｙｒ４遺伝子を同定した。

雑種形成からの放射線活性帯は、オートラジオグラフィーにより顕像化された。

そのオートラジオグラフィーを図３に示す。上述したように５つの試料Ａ、Ｂ、 Ｃ，ＤおよびＥを試験した。Ｅは未転換菌株ＧＣ６９であり、本分析において対 照として用いた。レーンＡからＤは、上述した方法により得られた形質転換化体 を示す。オートラジオグラフィーの横側の数は、分子量マーカーのサイズを示す 。

このオートラジオグラフィーから分かるように、レーンＤは６．５ｋｂ　ＣＢＨ Ｉ帯を含まず、この遺伝子が全体的に、ｃｂｈｌ遺伝子でのＤＮＡ断片の組込み により形質転操体中に欠失されたことを示す。ｃｂｈｌ欠失菌株はＰ３７ＰΔＣ ＢＨＩと呼ばれる。図２は、Ｔ、ｒｅｅｓｅｉ染色体の１つのｃｂｈｌ座でのｐ ΔＣＢＨＩｐｙｒ４がらのより大きなＥｃｏＲＩ断片の二重交さの発生を通じて の組込みによるＴ、ｒｅｅｓｅｉ　ｃｂｈｌ遺伝子の欠失の概略を示す。分析し た他の形質転換体は、未転換対照菌株と同一であると思われる。

実施例６ ｐＩｎｔＣＢＨＩを有する形質転換体の分析使用したプローブが３２ｐ標識ｐｌ ｎｔｃＢＨＩプローブに代わったことを除いては、実施例５と同一の方法を本実 施例において用いた。このプローブは、ｐＵＣ４に：　：　ｃｂｈｌΔＨ／Ｈ中 で欠失された領域内のｃｂｈｌ座からの２ｋｂ　ＢｇｌＩＩ断片を含有するｐＵ Ｃ−型プラスミドである。この実施例において、対照、未転換菌株ＧＣ６９であ る試料Ａ、形質転換体Ｐ３７ＰΔＣＢＨＩを含む２つの試料を分析した。図４か ら分がるように、６．５ｋｂでの帯により示されるように、試料Ａはｃｂｈｌ遺 伝子を含有した。しかしながら、形質転換体、試料Ｂはこの６．５ｋｂでの帯を 含有せず、それゆえｃｂｈｌ遺伝子を含有せず、ｐＵＣプラスミドから誘導され たいがなる配列をも含有しない。

実施例７ 菌株Ｐ３７ＰΔＣＢＨＩによるタンパク質分泌産生したＰ３７ＰΔＣＢＨＩ菌株 からの芽胞を、１％のグルコース、０．１４％の（ＮＨ４）２　ＳＯ４，０，２ ％（７）ＫＨ２ＰＯ４，０，０３％ノＭｇ　Ｓ　Ｏ４，０，０３％の尿素、０． ７５％のバクトドリプトン（ｂａｃｔｏｔｒｙｐｔｏｎｅ）　、０．０５％のツ イーン（Ｔｗｅｅｎ）８０．０．００００１６％のＣｕ５Ｏ，・５Ｈ２０，０， ００１％のＦｅＳＯ４”７Ｈ２０，０，０００１２８％のＺｎＳＯ４・７Ｈ２０ ，０，０００００５４％のＮａ２ＭｏＯ４−２Ｈ２０、および０．００００００ ７％のＭｎＣ１・４Ｈ２０を含有する５０ｍ１のＴｒ　ｉ　ｃｈｏｄｅ　ｒｍａ 基礎媒質中に接種した。その媒質を振動させながら、２５０ｍ１のフラスコ中、 ３７℃で約４８時間、培養した。産生じた菌糸体わミラクロス（カルバイオヶム 社）を通過させた濾過により集積し、１７ｍＭのリン酸カリウムで２または３回 洗浄した。その菌糸体は最終的に、１ｍＭのソフォロース（ｓｏｐｈｏｒｏｓｅ ）を有する１７ｍＭのリン酸カリウム中で懸濁せしめ、さらに振動させなから３ ０”Ｃで２４時間、培養した。次いで上澄みをこれらの培養物から集積し、菌糸 体を捨てた。培養上澄みの試料を、フチーマシアファストゲルシステムおよび製 造者の指示に従ったｐＨ３−９プレキヤストゲルを用いた等電点電気泳動により 分析した。そのゲルは銀染料で染色し、タンパク賃借を顕像化した。ｃｂｈｌタ ンパク質に対応する帯は、図５に示すように、菌株Ｐ３７ＰΔＣＢＨＩから誘導 した試料には存在しなかった。この等電点電気泳動ゲルは、Ｔ、ｒｅｅｓｅｉの 異なる上澄み培養中の様々なタンパク質を示す。レーンＡは部分的に精製したＣ ＢＨＩであり、レーンＢは未転換Ｔ、ｒｅｅｓｅｉ培養からの上澄みであり、レ ーンＣは本発明の方法により産生された菌株Ｐ３７ＰΔＣＢＨＩからの上澄みで ある。様々なセルラーゼ成分の位置を、ＣＢＨＩ、ＣＢ）ＩＩ　Ｉ、ＥＧＩ、Ｅ ＧＩＩ、およびＥＧＩＩＩで標識する。ＣＢＨＩは全細胞外タンパク質の５０％ を構成するので、ＣＢＨＩは主な分泌タンパク質であり、それゆえゲル上で最も 暗い帯となる。この等電点電気泳動ゲルは明確に、Ｐ３７ＰΔＣＢＨＩ菌株中の ＣＢＨＩタンパク質の欠失を示す。

実施例８ ｐＰΔＣＢＨＩＩの調製 ＣＢＨＩＩタンパク質をコードするＴ、ｒｅｅｓｅｉのｃｂｈ２遺伝子は、図６ Ａの図表に示すゲノムＤＮＡの４゜１ｋｂ　ＥｃｏＲＩ断片としてクローンしで ある（チェノら、１９８７、バイオテクノロジー５　：　２７４−２７８）。こ の４．１ｋｂ断片をｐＵＣ４ＸＬのＥｃｏＲＩ部位の間に挿入した。後者のプラ スミドは、ここに示す順番：　Ｅｃ。

ＲＩ、ＢａｍＨＩ、Ｓａｃ　Ｉ、Ｓｍａ　Ｉ、ＨｉｎｄＩＩＩ、Ｘｈｏｌ、Ｂｇ ｌＩＩ、ＣｌａＩＳＢｇｌｌＩ、ＸｈｏＩ。

Ｈｉｎｄ　Ｉ　Ｉ　ＩＳＳｍａ　Ｉ、Ｓａｃ　Ｉ、ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、で 配列した制限エンドグルカナーゼ部位の相称的な模様を有する多重クローニング 部位を含有するｐＵＣ誘導体（ジネンカーインターナショナル社のＲｌＭ、ベー カにより構成された）である。従来技術において知られている方法を用いて、プ ラスミド、ｐＰΔＣＢＨＩ　Ｉ　（図６Ｂ）を構成し、ここて（ＣＢＨＩＩ翻訳 開始部位の７４ｂｐ３′での）ＨｉｎｄＩＩＩ部位と（ＣＢＨＩＩの最後のコド ンの２６５ｂり３’での）ＣｌａＩ部位との間のこの遺伝子の１．７ｋｂ中央領 域を除去し、Ｔ、ｒｅｅｓｅｉ　ｐｙｒ４遺伝子を含有する１、６ｋｂ　Ｈｉｎ ｄｌＩＩ−Ｃ１ａＩ　ＤＮＡと置換した。

Ｔ、ｒｅｅｓｅｉ　ｐｙｒ４遺伝子を１．６ｋｂＮｈｅＩ−５ｐｈｌ断片上のｐ Ｔｐｙｒ２　（実施例２参照）がら切除し、ｐＵｃ２１９のｓｐｈ　ＩとＸｂａ １部位との間に挿入しく実施例２５参照）、９２１９Ｍを産生じた（スミスら、 １９９１、Ｃｕｒｒ、Ｇｅｎｅｔ　１９ｐ、２７−３３）。次いでｐｙｒ４遺伝 子を、一方の末端にＤＮＡの７ｂｐと、他方の末端１：ＤＮＡの６ｂｐを有し、 ｐＵｃ２１９多重クローニング部位から誘導されたＨｉｎｄｌＩＩ−Ｃｌａｌ断 片として除去し、ｃｂｈ２遺伝子のＨｉｎｄＩｌｌおよびＣｌａｌ部位中に挿入 し、プラスミドｐＰΔＣＢＨＩＩを形成した（図６Ｂ参照）。

このプラスミドのＥｃｏＲＩでの切断は、一方の末端でのｃｂｈ２座からの０． ７ｋｂの側端ＤＮＡ、他方の末端でのｃｂｈ２座からの１．７ｋｂの側端ＤＮＡ および真中のＴ、ｒｅｅｓｅｉ　ｐｙｒ４遺伝子を有する断片を雌牛ずる。

実施例９ Ｔ、ｒｅｅｓｅｉ菌株ＧＣ６９中のｃｂｈ２遺伝子の欠失実施例３および４に略 述した方法に従って、菌株のプロトプラストを産生し、ＥｃｏＲＩ切断ｐＰΔＣ ＢＨＩＩで転換する。形質転換体からのＤＮＡを、ＥｃｏＲＩおよびＡｓｐ７１ ８で切断し、アガロースゲル電気泳動を行なう。

ゲルからのＤＮＡを膜フィルタにプロットし、実施例１１の方法に従って３２ｐ 標識ｐＰΔＣＢＨＩＩで雑種形成する。

正確にｃｂｈ２座で組み込まれたｐＰΔＣＢＨＩＩからのＥｃｏＲＩ断片の単一 のコピーを有する形質転換体を同定する。その形質転換体はまた、実施例７にお けるような振動フラスコ中で成長せしめられ、培養上澄み中のタンパク質は等電 点電気泳動により試験される。このようにして、ＣＢＨＩＩタンパク質を産生し ないＴ、ｒｅｅｓｅｉ　ＧＣ６９形質転換体が産生される。

実施例１０ Ｐ３７ＰΔＣＢＨＩのｐｙｒ４誘導体の産生ｃｂｈｌ遺伝子に関して欠失された 形質転換体の芽胞（Ｐ３７ＰΔＣＢＨＩ）を、ＦＯＡ含有媒質上に展開した。

続いて、実施例１の方法を用いてこの形質転換体のｐｙｒ４誘導体を得た。この ｐｙｒ４菌株をＰ３７ＰΔＣＢＨＩＰｙｒ２６と称した。

実施例１１ ｃｂｈｌに関して事前に欠失した菌株中のＣｂｈ２遺伝子の欠失 菌株Ｐ３７ＰΔＣＢＨＩＰｙｒ２６を産生じ、実施例３および４において概略を 示した方法に従ってＥｃｏＴＩ切断ｐＰΔＣＢＨＩ　Ｉで転換した。

精製した安定形質転換体を実施例７のように振動フラスコ中で培養し、その培養 上澄み中のタンパク質を等電点電気泳動により試験した。どのようなＣＢＨＩＩ タンパク質も産生じなかった１つの形質転換体Ｐ３７ＰΔΔＣＢＨ６７と称する ）を同定した。図５のレーンＤは、本発明の方法に従って産生したｃｂｈｌおよ びｃｂｈ２遺伝子の両方を欠失した形質転換体からの上澄みを示す。

３７ＰΔΔＣＢＨ６７から抽出し、アガロースゲル電気泳動を行なった。このゲ ルからのＤＮＡを膜フィルターにプロットし、３２ｐ標識ｐｐΔＣＢＨＩＩで雑 種形成した（図７）。図７のレーンＡは、未転換Ｔ、ｒｅｅｓｅＬ菌株からのＤ ＮＡに関して観察された雑種形成パターンを示す。

野生型ｃｂｈ２遺伝子を含有する４、ｌｋｂ　ＥｃｏＲＩ断片が観察された。レ ーンＢは、菌株Ｐ３７ＰΔΔＣＢＨ６７に関して観察された雑種形成パターンを 示す。１つの４、ｌｋｂ帯が除去され、約０，９および３．ｌｋｂの２つの帯に より置換された。これは、ｐＰΔＣＢＨＩＩからのＥｃｏＲＩ断片の１つのコピ ーが正確にｃｂｈ２座で組み込まれた場合に予期されるパターンである。

同一のＤＮＡ試料をまたＥｃｏＲＩで切断し、サザン分析を上述したように行な った。この実施例において、プローブは３２ｐ標識ｐｌｎｔｃＢＨＩＩであった 。このプラスミドは、プラスミドｐＰΔＣＢＨ，ＩＩ中で欠失されたｃｂｈ２遺 伝子のその断片内からのｃｂｈ２遺伝子暗号配列の一部を含む。どの雑種形成も 菌株Ｐ３７ＰΔΔＣＢＨ６７からのＤＮＡに関して見られず、このことはｃｂｈ ２遺伝子が欠失されたこと、およびｐＵＣプラスミドから誘導されたどの配列も この菌株中に存在しなかったことを示す。

実施例１２ ｐＥＧＩｐｙｒ４の構成 ＥＧＩをコードするＴ、ｒｅｅｓｅｉ　ｅｑｌｌ遺伝子は、公表された配列に従 って合成されたオリゴヌクレオチドでの雑種形成による菌株ＲＬ−Ｐ３７からの ゲノムＤＮＡの４．２ｋｂ　Ｈｉｎｄｌｌｌ断片としてクローンされた（ベンチ ラら、１９８６、遺伝子４５　：　２５３−２６３　；パンアースデルら、１９ ８７、バイオ／テクノロジー５　：　６Ｏ−６４）。３．６ｋｂ　ＨｉｎｄｌＩ Ｉ−ＢａｍＨＩ断片をこのクローンから取り出して、ＨｉｎｄＩ　Ｉ　Ｉて切断 したｐＵｃ２１．８　（ｐＵｃ２１９と同一であるか、反対の配向において多重 クローニング部位を有する、実施例２５参照）およびｐＴｐｙｒ２から得たＴ、 ｒｅｅｓｅｉ　ｐｙｒ４遺伝子（実施例２参照）を含有する１、６ｋｂ　Ｈｉｎ ｄｌｌｌ−ＢａｍＨＩ断片と連結し、プラスミドｐＥＧＩｐｙｒ４を得た（図８ ）、ｐＥＧＩｐｙｒ４のＨｉｎｄＩＩＩでの切断は、Ｔ、ｒｅｅｓｅｉゲノムＤ ＮＡ（ｅｇｌｌおよびｐｙｒ４遺伝子）のみを含有し、２つの遺伝子の間の２４ ｂｐ配列合成りＮＡおよび一方の末端での６ｂｐ配列合成りＮＡを除＜ＤＮＡの 断片を雌牛ずる（図８）。

実施例１３は、精製工程によるサイトラーゼ１２３セルラーゼ（Ｔｒｉｃｈｏｄ ｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉから得た、ＣＡ、南すンフランシスコ、ジネンカーイン ターナショナル社から得られる完全菌類セルラーゼ組成物）の成分の単離を説明 する。

実施例１３ サイトラーゼ１２３セルラーゼのセルラーゼ成分への精製サイトラーゼ１２３セ ルラーゼを以下のように分画した。

このセルラーゼ系のセルラーゼ成分の通常の分配は以下のとおりである： ＣＢＨＩ　４５−５５重量パーセント ＣＢＨＩＩ　１３−１５重量パーセントＥＧ　Ｉ　１１−１３重量パーセント ＥＧ　ＩＩ　８−１０重量パーセント ＥＧ　ＩＩＩ　１−４　重量パーセントＢＧ　０．５−１重量パーセント その分画は以下の樹脂を含有するカラムを用いて行なった：シグマケミカル社（ ＭＯ，セントルイス）からのセファデックスＧ−２５ゲル濾過樹脂、ＩＢＦバイ オテクニクス（ＭＤ、サバジ）からのＳＰ）リサクリルＭ陽イオン交換樹脂およ びＱＡ）リサクリルＭ陰イオン交換樹脂。ｐＨ６，８の１０ｍＭリン酸ナトリウ ム緩衝液とセファデックスＧ−２５ゲル濾過樹脂で満たした３リツトルのカラム を用いてサイトラーゼ１２３セルラーゼ、０．５ｇを脱塩した。次いで脱塩溶液 をＱＡトリサクリルＭ陰イオン交換樹脂の２０ｍ１のカラムに装填した。このカ ラムに結合した分画はＣＢＨＩおよびＥＧ　１を含有した。これらの成分を、０ から約５００ｍＭの塩化ナトリウムを含有する水性勾配を用いて勾配溶出により 分離した。このカラムに結合しなかった分画はＣＢＨＩＩおよびＥＧＩＩを含有 した。これらの分画を、ｐＨ３，３の１０ｍＭのクエン酸ナトリウムで均衡化し たセファデックスＧ−２５ゲル濾過樹脂のカラムを用いて脱塩した。次いでこの 溶液、２ｏ。

ｍｌを、ＳＰトリサクリルＭ陽イオン交換樹脂の２０ｍ１のカラムに装填した。

ＣＢＨＩＩおよびＥＧＩＩを、０から約２００ｍＭの塩化ナトリウムを含有する 水性勾配を用いて別々に溶出した。

上述した実施例１３の方法と類似した方法に従って、それらの成分中に分離でき る他のセルラーゼ系は、セルキャスト（デンマーク、コペンハーゲン、ノボイン ダストリーから得られる）、ラビダーゼ（オランダ、デルフト、Ｎ。

■９、ギストブロケイドから得られる）、およびＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｋｏ ｎｉｎｇｉｉＳＰｅｎｉｃｉｌｌｕｍｓｐ、等から誘導したセルラーゼ系を含む 。

実施例１４ サイトラーゼ１２３セルラーゼからのＥＧＩＩＩの精製上述した実施例１３は、 サイトラーゼ１２３セルラーゼからのいくつかの成分の単離を示した。しかしな がら、ＥＧ　ＩＩＩはサイトラーゼ１２３セルラーゼ中に非常に少量した存在し ないので、この成分を単離するのに以下の方法が用いられた。

Ａ、ＥＧＩＩＩセルラーゼ酵素の大規模な抽出１００リツトルの細胞不含有セル ラーゼ濾液を約３０℃まで加熱した。加熱した物質は、約４丸３０００　（約８ ０００の分子量、ポリエチレングリコール）および約り０％重量／容積の無水硫 酸ナトリウムから調製された。その混合物は２相液体混合物を形成した。この相 を、５Ａ−１ディスクスタック遠心分離機を用いて分離した。その相を、銀染色 等電点電気泳動ゲルを用いて分析した。分画および集積によりＥＧ　ＩＩＩおよ びキシラナーゼを得た。取り出した組成物は、約２０から５０重量パーセントの ＥＧ　ＩＩＩを含有した。

上述した方法に関して、約８０００未満の分子量を有するポリエチレングリコー ルの使用は分離に不適切であり、一方約８０００より実質的に大きい分子量を有 するポリエチレングリコールの使用は取り出した組成物中の所望の酵素を排除す ることとなる。硫酸ナトリウムの量に関して、１０％重量／容積より大きな硫酸 ナトリウムの水準は沈殿問題を引き起こし、一方丈質的に１０％重Ｒ／容積未満 の硫酸ナトリウムの水準では不十分な分離または１つの相中に残留する溶液とな った。

Ｂ１分画によるＥＧ　ＩＩＩの精製 ＥＧ　ＩＩＩの精製は、野生型Ｔｒｉｃｈｉｄｅｒｍａｒｅｅｓｅｉにより産生 される完全な菌類セルラーゼ組成物（ＣＡ，南すンフランシスコ、ジネンヵーイ ンターナショナルから市販されている、サイトラーゼ１２３セルラーゼ）からの 分画により行なわれる。つまり、分画は、以下の樹脂：シグマケミカル社（Ｍｏ ，セントルイス）がら得られるセファデックスＧ−２５ゲル濾過樹脂、ＩＢＦバ イオテクニクス（ＭＤ，サバジ）からのＳＰ）リサクリルＭ陽イオン交換樹脂お よびＱＡ）リサクリルＭ陰イオン交換樹脂を含有するカラムを用いて行なわれる 。ｐＨ６．　８の１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液とセファデックスＧ−２５ゲ ル濾過樹脂で満たした３リツトルのカラムを用いてサイトラーゼ１２３セルラー ゼ、０．５ｇを脱塩した。次いで脱塩溶液をＱＡ）リサクリルＭ陰イオン交換樹 脂の２０ｍ１のカラムに装填した。このカラムに結合した分画はＣＢＨ　Ｉおよ びＥＧ　Ｉを含有した。二〇カラムに結合しない分画は、ＣＢＨ　ＩＩ，ＥＧ　 ＩＩおよびＥＧ　１１Ｉを含む。これらの分画を、ｐＨ４．５の１０ｍＭのクエ ン酸ナトリウムで均衡化したセファデックスＧ−２５ゲル濾過樹脂のカラムを用 いて脱塩した。次いでこの溶液、２００ｍ１を、ＳＰトリサクリルＭ陽イオン交 換樹脂の２０ｍ１のカラムに装填した。ＥＧ　ＩＩＩを、２００ｍＭの塩化ナト リウム１００ｍ１で溶出した。

ＥＧ　ＩＩＩの単離能率を高めるために、ＥＧ　ＩＩＩを過剰表現するようにお よび／または１つ以上のＥＧ　Ｉ。

ＥＧ　ＩＩ，ＣＢＨ　Ｉおよび／またはＣＢＨ　ＩＩ酸成分産生できないように 遺伝学的に修飾されたＴｒ　ｉ　ｃｈ。

ｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉを使用することが望ましい。このことは必然的に、例 えば、上述した分画および／またはＰＥＧ抽出によりＥＧＩＩＩのより効果的な 単離を導く。

同様に、上述したＥＧ　ＩＩＩ組成物をさらに精製して、実質的に純粋なＥＧ　 ＩＩＩ組成物、すなわち、タンパク質の約８０重量パーセントより多いＥＧＩＩ Ｉを含有する組成物を提供することが望ましい。例えば、そのような実質的に純 粋なＥＧ　ＩＩＩタンパク質は、方法Ｂの方法Ａから得られた物質を用いること により得られる。さらにＥＧ　ＩＩＩを精製する１つの特定の方法は、この実施 例１４のパートｂ）で得られたＥＧ　ＩＩＩ試料のさらなる分画によるものであ る。さらなる分画は、モノ−８−ＨＲ５１５カラム（ＮＪ，ビス力タウエイ、フ ァーマシアＬＫＢバイオテクノロジーから得られる）を用いたＦＰＬＣシステム により行なわれる。ＦＰＬＣシステムは、液体クロマトグラフィーコントローラ 、２つのポンプ、二重通路モニター、分画集積装置およびチャートレコーダー（ 全てＮＪ、ビス力タウエイ、ファーマシアＬＫＢバイオテクノロジーから得られ る）からなる。分画は、実施例１４のパートｂ）で調製ｊ７たＥＧ　ＩＩＩ試料 、５ｍｌを、以前にｐＨ４の１０ｍＭクエン酸ナトリウムで均衡化した２　０　 ｍｌセファデックスＧ−２５カラムで脱塩することにより行なわれた。次いでカ ラムを、１ｍｌの分画に集積した試料Ｉ関して、０．５ｍｌ／分の速度でのＮａ Ｃｌの０−２００ｍＭ水性勾配により溶出させた。ＥＧ　ＩＩＩは、分画１０お よび］１において取り出され、ＳＤＳゲル電気泳動により９０％より純粋である と測定された。この純粋なＥＧ　ＩＩＩは、既知の技術によるＮ末端アミノ酸配 列の測定に適１７でいる。

上述した実施例１３において精製した実質的に純粋なＥＧ　ＩＩＩ並びにＥＧ　 １およびＥＧＩＩ成分は、本発明の方法に単一または混合物で用いられる。こら のＥＧ酸成分以下の特性を有する： ＭＷ　ｐＩ　最適ｐＨＩ ＥＧ　Ｉ　〜４７−４９ｋＤ　４．７　〜５ＥＧＩＩ　〜３５ｋＤ５．５　〜５ ＥＧ　ＩＩＩ　〜２５−２８ｋＤ　７．４　〜５．５−６．０１、以下の実施例 １５によるＲＢＢ−ＣＭＣ活性により測定された最適ｐＨ。

本発明の実施にこれらの混合物を使用すると、単一の成分と比較して、柔らかさ 、感触、外観等を改善する相乗応答が得られる。一方で、本発明の実施に単一の 成分を使用すると、より安定であるか、またはｐＨ範囲に亘り広い活性のスペク トルを有することとなる。例えば、以下の実施例１５は、ＥＧＩＩＩが７７１． カＩＪ性条件下のＲＢＢ−ＣＭＣに対して著しい活性を有することを示す。

実施例１５ ｐＨ範囲に亘るセルラーゼ組成物の活性２つの異なるセルラーゼ組成物のｐＨプ ロフィールを測定するために以下の方法を用いた。第１のセルラーゼ組成物は、 ＣＢＨＩおよびＣＢＨＩＩ酸成分産生ずることがで今ないように上述した方法と 類似の方法で遺伝学的に修飾したＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉがら調 製したＣＢＨＩおよびＩＩ欠失セルラーゼ組成物であった。

このセルラーゼ組成物が、一般的にＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉから 誘導されたセルラーゼ組成物、約５８から７０パーセントからなるＣＢＨＩおよ びＣＢＨＩＩを含有しない限り、このセルラーゼ組成物は、必ず実質的にＣＢＨ Ｉ型およびＣＢＨＩＩ型セルラーゼ成分を含まず、したかってＥＧ酸成分すなわ ち、ＥＧ　Ｉ、ＥＧ　ｌｌ５ＥＧ　ＩＩＩ等が豊富である。

第２のセルラーゼ組成物は、実施例１４のパートｂ）と類似の精製方法によりＴ ｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉから誘導されたセルラーゼ組成物から単離 したＥＧＩＩＩの純粋な分画、約２０から４０％であった。

これらのセルラーゼ組成物の活性を、４０℃で測定し、その測定は以下の方法を 用いて行なわれた。

最終溶液中に必要な量の酵素を提供するのに十分な濃度で、適切な酵素溶液、５ から２０μｌを加える。ｐＨ４，５，５，５，６，６，５，７，７，５および８ の、０．０５Ｍクエン酸塩／リン酸塩緩衝液中で２重量パーセントのＲＢＢ−Ｃ ＭＣ（オーストラリア、Ｎ、Ｓ、Ｗ、２１５１、ノースロック、６アルトナブレ イス、メガザイムから市販されているレマゾルブリリアントブルーＲ−カルボキ シメメチルセルロース）、２５０μｍを加える。

撹拌し、４０℃で３０分培養する。水浴中で５から１０分間、冷却する。０．３ Ｍの酢酸ナトリウムおよび０．０２Ｍの酢酸亜鉛を含有するメチルセロソルブ、 １０００μｌを加える。撹拌し、５−１０分間、放置する。遠心分離し、上澄み をキュベツト中に注ぐ。各キュベツト中の溶液の５９０ｎｍでの光学濃度（ＯＤ ）を測定する。より高い水準の光学濃度が、より高い水準の酵素活性に対応する 。

この分析の結果を図９に述べるが、これは、ＥＧＩＩＩセルラーゼ組成物と比較 したＣＢＨＩおよびＩＩ欠失セルラーゼ組成物の相対活性を説明している。この 図から、ＣＢＨＩおよびＣＢＨＩＩの欠失したセルラ−ゼ成物は、ｐＨ５，５あ たりでＲＢＢ−ＣＭＣに対する最適なセルロースを加水分解する活性を有し、ア ルカリ性ｐＨ１すなわち、７より上で８のｐＨである程度の活性を有する。

一方で、ＥＧ　ＩＩＩの豊富なセルラーゼ組成物は、ｐＨ５，５−６で最適なセ ルロースを加水分解する活性を有し、アルカリ性ｐＨで相当な活性を有する。

実施例１６ セルラーゼ組成物のランダロメーター強度損失検定本実施例の目的は、異なるセ ルラーゼ組成物の綿含有織物の強度を減少せしめる能力を試験することにある。

Ｔ「ｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉから誘導されたほとんどのセルラーゼ組 成物の活性はｐＨ５またはそのあたりで最大であるので、強度損失は、その検定 がこのｐＨあたりで行なわれる場合に、最も明確になる。しかしながら、ｐＨ５ で達成された結果は、別のｐＨで生じる強度損失の結果と相関すると思われ、し たがって、分析したセルラーゼ成分の相対強度損失能力を示している。

つまり、この実施例において、分析した第１のセルラーゼ組成物は、野生型のＴ ｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉから産生された完全菌類セルラーゼ系（Ｃ Ａ、南すンフランシスコ、ジネンカーインターナショナルから市販されているサ イトラーゼ１２３セルラーゼ）であり、ＧＣＯｌｏと同定される。

分析した第２のセルラーゼ組成物は、ＣＢＨＩＩを表現できないように、上述し た１から１２および以下の２０から２８の実施例と類似した方法で遺伝学的に修 飾したＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉから調製したＣＢＨＩＩ欠失セル ラーゼ組成物であり、ＣＢＨＩＩｄと同定される。ＣＢＨＩＩがセルラーゼ組成 物の約１５パーセントまでからなる限りは、この成分の欠失は、ＣＢＨＬおよび 全てのＥＧ酸成分豊富な水準となる。

分析した第３のセルラーゼ組成物は、ＣＢＨＩおよびした方法で遺伝学的に修飾 したＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｒｅｅｓｅｉから調製したＣＢＨＩおよびＣＢＨＩ Ｉ欠失セルラーゼ組成物であり、ＣＢＨＩ／Ｉ　Ｉｄと同定される。ＣＢＨＩお よびＣＢＨＩＩが約７０％までのセルラーゼ組成物からなる限り、この成分の欠 失は、豊富な水準の全てのＥＧ酸成分なる。

分析した最後のセルラーゼ組成物は、ＣＢＨＩを表現できないように、上述した 方法と類似した方法で遺伝学的に修飾したＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅ ｉから調製したＣＢＨＩ欠失セルラーゼ組成物であり、ＣＢＨＩｄと同定される 。ＣＢＨＩが約５５％までのセルラーゼ組成物からなる限りは、この成分の欠失 は豊富な水準のＣＢＨＩＩおよび全てのＥＧ酸成分なる。

ランプロメーター中で綿含有織物の強度損失の効果について、上述したセルラー ゼ組成物を試験した。その組成物を、等量のＥＧ酸成分用いられるように、最初 に標準化した。各セルラーゼ組成物を加えて、ｐＨ５に滴定し、０゜５ｍｌの非 イオン界面活性剤を含有する２０ｍＭクエン酸塩／リン酸塩緩衝液、４００ｍ１ の溶液を分離した。精製した各溶液を分離ランダロメーターキャニスターに加え た。

これらのキャニスタ−中に、強度損失を促進させるある量の大理石、並びに１６ インチＸ２０インチの綿織物（ＮＪ０８８４６、ミドルセックス、ブラックフォ ード通り２００、テストファブリック社からのスタイル４６７番として得られる ）を加えた。次いでそのキャニスタ−を閉じて、４３℃に保持されたランプロメ ーター中に降ろした。次いでそのキャニスタ−を約１時間に亘り、１分間に少な くとも４０回転（ｒｐｍ）の速度で浴中で回転せしめた。その後、衣類を取り出 してよく濯ぎ、標準乾燥機中で乾燥せしめた。

強度損失結果を最大限度にするために、上述した方法をさらに２回繰り返し、３ 回目の処理後、綿織物を取り出し、強度損失の分析を行なった。強度損失は、イ ンストロンテスターを用いた横方向の引張り強度（ｒＦＴｓＪ　）を測定するこ とによりめ、その結果を、セルラーゼを加えなかったことを除いては同一の溶液 で処理した織物のＦＴＳと比較した。この分析の結果を、以下の式によりめた強 度損失パーセントとして報告する： この分析の結果を図１０に示すが、これは、ＣＢＨＩ。

すなわぢ全セルラーゼ（ＧＣＯＩＯ）　およびｃＢＨＩ　Ｉ欠失セルラーゼを含 有する組成物が最大の強度損失を有し、一方、ＣＢＨＩを含有しない組成物が、 全セルラーゼおよびＣＢＨＩＩ欠失セルラーゼと比較して著しく減少した強度損 失を有することを示す。これらの結果がら、セルラーゼ組成物中のＣＢＨＩ型成 分の存在は、ＣＢＨＩ型成分を含有しない類似の組成物と比較して、その組成物 に増大した強度損失を与えることが分かった。

同様に、これらの結果は、ＣＢＨＩＩが強度損失においである役割を果たすこと を示す。

したがって、これらの結果から見て、強度損失抵抗セルラーゼ組成物は、全ての ＣＢＨＩ３ｊ：！セルラーゼ成分および、好ましくは全てのＣＢＨ型セルラーゼ 成分を含まない組成物である。この点に関して、ＥＧ豊富セルラーゼ組成物は、 図１０に示すｐＨ５で観察されたそれらの結果よりもｐＨ≧７でのより低い強度 損失となると考えられる。

実施例１７ 色彩の回復 綿含有織物中の色彩を回復せしめるＥＣ豊富セルラーゼの能力を、以下の実験に おいて分析した。つまり、すり切れた綿織物の色彩復元は、ある期間に亘る織物 上の表面繊維の蓄積から生じる。これらの繊維は、織物の色褪せて纒れた外観を 生じさせ、したがって、これらの繊維の除去は、その織物に元来の鮮明な色彩を 復元させるのに必要な条件である。上記点に関して、これらの実験は、表面繊維 を除去するセルラーゼ組成物の能力を測定することにより、色彩を復元するセル ラーゼ組成物の能力を決定する。

最初の実験は、野生型Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉにより産生された 完全セルラーゼ系（ＣＡ、南すンフランシスコ、ジネンカーインターナショナル から市販されているサイトラーゼ１２３セルラーゼ）の様々なｐＨに亘る綿含有 織物から表面繊維を除去する能力を測定する。

このセルラーゼを、ランプロメーター中で表面繊維を除去する能力について試験 した。最終組成物中に２５ｐｐｍまたは１１００ｐｐのいずれかのセルラーゼを ていきをうする適切な量のセルラーゼは、０．　５ｍ　ｌの非イオン界面活性剤 を含有する２０ｍＭのクエン酸塩／リン酸塩緩衝液の分離溶液４００ｍ１に加え た。各試料を調製し、ｐＨ５、ｐＨ６、ｐＨ７およびｐＨ７，５の試料を提供す るように滴定した。次いで生成した各溶液を、分離ランプロメーターキャニスタ −中に加えた。これらのキャニスタ−中に、繊維の除去を促進させる量の大理石 、並びにフインチ×５インチの綿織物（ＮＪＯ８８４６，ミドルセックス、ブラ ックフォード通り２００、テストファブリック社からスタイル４３９Ｗとして得 られる１００％織られた綿）を加えた。次いでそのキャニスタ−を閉じて、４３ ℃に保持されたランダロメーター浴中に降ろした。次いでそのキャニスタ−は、 約１時間、１分あたり少なくとも約４０回転（「ｐｍ）の速度でその浴中で回転 せ１２めた。その後、衣類を取り出して、よく濯ぎ、標準乾燥機中で乾燥させる 。

次いでそのように処理した織物を、パネル試験における評価により繊維の除去に ついて分析した。

特に、織物（マークせず）を６つの個々により繊維の水準に関して評価した。織 物を、表面繊維に関して視覚的に評価し、０から６のスケールで評価した。この スケールは意義のある比較を行なうために６つの標準を有する。その標準は： 評価　標準２ ０　セルラーゼで処理してない織物 １、８ｐｐｍのセルラーゼで処理したゝ織物２　１６ｐｐｍのセルラーゼで処理 した織物３　２０ｐｐｍのセルラーゼで処理した織物４　４０ｐｐｍのセルラー ゼで処理した織物５　５０ｐｐｍのセルラーゼで処理した織物６　１１００ｐｐ のセルラーゼで処理した織物２）　全ての標準において、織物は、ＮＪＯ８８４ ６、ミドルセックス、ブランクフォード通り２００、テストファブリック社から 得た１００％綿シートｍ準化試験織物（スタイル４３９Ｗ番）であった。

３）　全ての試料は同一のセルラーゼ組成物で処理した。

セルラーゼ濃縮物は合計のタンパク質であった。ランダロメーター処理条件は、 上述した実施例１６中に示す。

評価する織物に、その標準の最も厳密に適合した評価を与えた。織物の完全な分 析の後に、個々の全てにより各織物に与えられた値を加え、平均値を出した。

この分析の結果を図１１に示す。つまり、図１１は、同一のｐＨにおいて、用量 依存応答が除去された繊維の量として見られることを示す。すなわち、同一のｐ Ｉ（において、より多いセルラーゼで処理した繊維は、より少ないセルラーゼで 処理した繊維と比較して繊維除去のより高い水準を提供した。さらに、この形の 結果は、より高いｐＨにおいて、繊維の除去はまだ、単により高濃度のセルラー ゼを用いることにより影響を受けることを示す。

第２に実験において、２つの異なるセルラーゼ組成物を、繊維を除去する能力に ついて比較した。つまり、分析した第１のセルラーゼは、野生型Ｔｒｉｃｈｏｄ ｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉにより産生された完全セルラーゼ系（ＣＡ、南すンフラ ンシスコ、ジネンカーインターナショナルから市販されている、サイトラーゼ１ ２３）であり、ＧＣＯＩＯと称される。

分析した第２のセルラーゼ組成物は、その組成をＣＢＨｌおよびＣＢＨＩＩを産 生できないように上述した方法と類似の方法で遺伝学的に修飾したＴｒｉｅｈｏ ｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉにより調製されたＣＢＨＩおよびＣＢｕｌｌ欠失セル ラーゼ組成物であり、ＣＢＨ型成分　Ｉ欠失として同定される。ＣＢＨＩおよび ＣＢＨＩＩがセルラーゼ組成物の約７０パーセントまでを構成する限りは、この 成分の欠失は、全てのＥＧ酸成分豊富な水準となる。

そのセルラーゼ組成物を、同一量のＥＧ酸成分用いられるように、最初に標準化 した。これらの組成物を、ランタロメーター中の表面繊維を除去する能力につい て試験した。

最終組成物中にＥＧ酸成分必要な濃度を提供するのに適切な量のセルラーゼを、 ０．５ｍｇの非イオン界面活性剤を含有する２０ｍＭのクエン酸塩／リン酸塩緩 衝液４００ｍ１の分離溶液に加えた。試料を調製し、ｐＨ５に滴定した。

次いで作成した各溶液をランプロメーターキャニスタ−中に加えた。これらのキ ャニスタ−中に、繊維の除去を促進させるある量の大理石、並びにフインチ×５ インチの綿織物（ＮＪ　０８８４６、ミドルセックス、ブラックフォード通り２ ００、テストファブリック社からのスタイル４３９Ｗ番として得られる、１００ ％織綿）を加えた。次いでそのキャニスタ−を閉じて、４３℃に保持されたラン タロメーター中に降ろした。次いでキャニスタ−を、１分当たり少なくとも約４ ０回転（ｒｐｍ）の速度で１時間、浴中で回転せしめた。その後に衣類を取り出 して、よく濯ぎ、標準乾燥機中で乾燥せしめる。

次いでそのように処理した織物を上述したパネル試験の評価により繊維除去の分 析を行なった。この分析の結果を、図１２に示す。つまり、図１２は、ＧＣＯＩ ＯおよびＣＢＨＩ／ＩＩ欠失セルラーゼ組成物か、等量のＥＧが用いられた場合 に、実質的に同一の繊維除去結果を与えた。これら結果は、繊維除去を提供する のはＥＧ酸成分あることを示唆している。図１１の結果と関連したこれらの結果 は、ＥＧ酸成分アルカリ性条件下においても表面繊維を除去することを示す。

実施例１８ テルゴトメーター（Ｔｅｒｇｏｔｏｍｅｔｅｒ）色彩の復ＢＨ型成分が色彩の復 元に必要のないことを実証するものである。本実施例の目的は、ＣＢＨ型成分の 欠失したセルラーゼ組成物の綿含有織物に対して色彩を復元する能力を調査する ことにある。Ｔｒｉｃｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉから誘導されたほとんどのＥ Ｇ酸成分活性はｐＨでまたはそのあたりで最大であるので、色彩復元結果は、そ の検定がほぼこのｐＨで行なわれる場合に最も明確である。しかしながら、ｐＨ ５で達成された結果は、他のｐＨで生じた色彩復元の結果と相関するとおもわれ 、したがって、分析するセルラーゼ成分の相対色彩復元能力を示す。

つまり、本実施例に用いたセルラーゼ組成物は、ＣＢＨＩおよびＣＢＨＩＩを産 生することのできないように上述した方法と類似の方法で遺伝学的に修飾したＴ ｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉから調製したＣＢＨ１およびＣＢＨＩＩ欠 失セルラーゼ組成物であった。ＣＢＨＩおよびＣＢＨＩＩがセルラーゼ組成物の 約７０パーセントまでを構成する限りは、この成分の欠失は、全てのＥＧ酸成分 豊富な水準となる。

検定は、十分な濃度のこのセルラーゼ組成物を５０ｍＭのクエン酸塩／リン酸塩 緩衝液に加え、５００ｐｐｍのセルラーゼを提供することにより行なった。その 溶液をｐＨ５に滴定し、０．１重量パーセントの非イオン界面活性剤（ＮＣ２７ ３６０、トーマスピル、グレスコＮｆｇ、、から市販されている、グレスコター クＧＬ１００）を含有した。１０インチＸ１０インチの色褪せた綿含有織物を、 この緩衝液の１リツトルの中に配し、ｌｌ０Ｆ’で３０分間放置し、次いで３０ 分間、１分当たり少なくとも１００回転で撹拌した。次いで織物を緩衝液から取 り出し、洗浄し、乾燥せしめた。生じた織物を次いで、処理前の織物と比較した 。この分析の結果を以下に示す： 綿含有材料　結果 すり切れた綿Ｔシャツ　利益が見られた新しい綿ニット　利益が見られた 「利益が見られた」という言葉は、処理織物が、非処理織物と比較して色彩の復 元（すなわち、色褪せて見えない）を示す。これらの結果は、ＣＢＢ型成分成分 在が色褪せた綿含有織物の色彩復元をもたらすのに必要ないという実施例１７の 結果を実証する。

そのようなセルラーゼ組成物は、織物への有害な強度損失なくして、加工中に生 成される破壊された／緩んだ繊維を除去するので、その組成物の使用は繊維加工 中に利益をもたらすと考えられる。

実施例１９ 柔軟さ 本実施例は、ＣＢＬ型成分成分在が綿含有織物に改善された柔軟さを与えるのに 必要ないことを示す。つまり、この実施例は、その組成物が、ＣＢＨＩおよびＣ ＢＨ１１成分を産生ずることができないように上述した方法により遺伝学的に製 造したＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉから誘導したものであるセルラー ゼ組成物を用いる。

このセルラーゼ組成物を、テリー織りの洗浄布を柔らかくする能力に関して試験 した。つまり、１４インチＸ１５インチの、柔軟化されていない８．５オンスの 綿テリー織り布（ＮＪＯ８８４６、ミドルセックス、ブラックフォード通り２０ ０、テストファブリック社からのスタイル４２ＯＮＳ番として得られる）を、フ インチ×７．５インチの切れ端に切断した。

上述したセルラーゼ組成物を、ランノロメーター中でこれらの切れ端を柔らかく する能力について試験した。つまり、最終セルラーゼ組成物中に５００ｐｐｍ、 ２５０ｐｐｍｓ　１１００ｐｐ、５０ｐｐｍ、および１０ｐｐｍのセルラーゼを 提供するように、適切な量のセルラーゼを、０゜０２５重量パーセントの非イオ ン界面活性剤（トリトンＸ１１４）を含有する２０ｍＭクエン酸塩／リン酸塩緩 衝液４００ｍ１の分離溶液に加えた。加えて、同一の溶液を含有するが、セルラ ーゼの加えられていないブランクを作成した。そのように調製した試料を、ｐＨ ５に滴定した。次いで作成した各溶液を分離ランダロメーターキャニスターに加 えた。これらのキャニスタ−中に、柔軟さを促進させる量の大理石、並びに上述 した綿の切れ端を加えた。全ての条件は、キャニスタ−ごとに２つの切れ端で３ 重に行なった。次いでそのキャニスタ−を閉じて、３７℃に保持されたランノロ メーター中に降ろした。次いてキャニスタ−を、１分当たり少なくとも約４０回 転（ｒｐｍ）の速度で１時間、浴中で回転せしめた。その後に衣類を取り出して 、よく濯ぎ、標準乾燥機中で乾燥せしめた。

次いでその切れ端を、選択試験における評価により柔軟さについて試験した。つ まり、６人のパネリストに、各自の一連の切れ端を与え、全体の織物の柔軟性の ような柔軟の判定基準に基づいた柔軟さに関してその切れ端を評価するように指 示した。５つの異なる酵素濃度での処理により得られた切れ端とブランクをスク リーンの背後に配し、パネリストは最も柔らかくないものから最も柔らかいもの まで順番に並べるように指示した。他の切れ端に対するその順番に基づいて各切 れ端にスコアを付けた；５が最も柔らかく、０が最も柔らかくない。各パネリス トからのスコアを累積して、平均した。

この平均の結果を図１３に示す。つまり、これらの結果は、濃度が高ければ高い ほど、改善された柔軟さが得られることを示す。この改善された柔軟化は、セル ラーゼ組成物中にＣＢＨＩまたはＩＩのいずれかの存在なくして達成されること が分かる。

これらの結果に関して、セルラーゼ組成物のより低い濃度においても、改善され た柔軟化が繰返しの洗濯に亘り明確になる。

実施例１６から１９に関して、Ｔｒ　ｉ　ｃｏｄｅ　ｒｍａｒｅｅｓｅｉ以外の 微生物から誘導されたＥＧ型成分の豊富なセルラーゼ組成物は、これらの実施例 に記載したセルラーゼ組成物と置き換えて用いられる。特に、ＥＧ型成分の豊富 なセルラーゼ組成物の供給源は、本発明にとって重要ではなく、ＥＧ型成分の豊 富などのような菌類セルラーゼ組成物も用いられる。例えば、本発明に用いられ る菌類セルラーゼ組成物を調製するのに使用する菌類セルラーゼは、Ｔｒｉｃｈ ｏｄｅｒｍａ　ｋｏｎｉｎｇｉ　ｔＳＰｅｎｃｉｌｌｕｍ　ｓｐ、等から得られ 、または市販されているセルラーゼ、すなわち、セルクラスト（デンマーク、コ ペンハーゲン、ノボインダストリーから得られる）、ラビダーゼ（オランダ、デ ルフト、Ｎ、Ｖ、　、ギストブロケードから得られる）等が用いられる。

実施例２０ プラスミドｐＥＧＩｐｙｒ４を含有するＴｒ　ｉ　ｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓ ｅｉの転換 実施例１に概略を示した方法により、Ｔ、ｒｅｅｓｅｉ菌株Ｒｕ　ｔ　Ｃ３０の ｐｙｒ４欠損誘導体（シールニースおよびモンテンコート、（１９８４）　、Ａ ｐｐ　１．　Ｍｉ　ｃ　ｒｏｂｉｏｌ、　Ｂｉｏｔｅｅｈｎｏｌ、　２０：　： ４６−５３）を得た。この菌株のプロトプラストを、未切断ｐＥＧＩｐｙｒ４で 転換し、安定形質転換体を精製した。

これらの形質転換体の５つ（ＥＰ２、ＥＰ４、ＥＰ５、ＥＰ６、ＥＰＩＩと称す る）、奈良真備に未転換ＲｕｔＣ３０を、２５０ｍ１の振動フラスコ中の５０ｍ １のＹＥＧ媒質に接種【７．２日間、２８℃で振動させながら培養した。

生成した菌糸体を無歯水で洗浄し、５０ｍ１のＴＳＦ媒質（０，０５Ｍのクエン 酸−リン酸緩衝液、ｐＨ５，０；アビセルミクロ結晶性セルロース、１０ｇ／ｌ 　；ＫＨ２ＰＯ４，２，０ｇ／ｌ；　（ＮＨ４）２ＳＯ４，１，４ｇ／ｌ；ブロ テオースベブトン、１．０ｇ／ｌ；尿素、０．３ｇ／ｌ　；ＭｇＳＯ４’　７Ｈ ２０，０，３ｇ／ｌ　；ＣａＣｌ２．０．３ｇ／ｌ　；　Ｆｅ３Ｏ４・７Ｈ２０ ，５，０ｍｇ／ｌ；ＭｎＳＯ４・Ｈ２０ｓ　１．６ｍｇ／ｌ　；ＺｎＳＯ４，１ ゜４ｍｇ／ｌ　；ＣＯＣｌ２．２．０ｍｇ／ｌ　；０．１％ツイーン８０）に加 えた。これらの培養物はさらに２８℃で４日間、振動させながら培養した。これ らの培養物から上澄み試料を採取し、タンパク質およびエンドグルカナーゼ活性 の合計量を測定するだめの検定を以下に記載するようにして行なった。

エンドグルカナーゼ検定は、レマゾールブリリアントブルーカルボキシメチルセ ルロース（オーストラリア、Ｎ５Ｗ１ノースロツク、メガザイムから得られる、 ＲＢＢ−ＣＭＣ）からの溶性染色オリゴ糖類の解放により行なわれる。

２ｇの乾燥ＲＢＢ−ＣＭＣを８０ｍ１の激しく撹拌し沸騰したでの脱イオン水に 加えることにより媒質を調製した。

室温まで冷却したときに、５ｍｌの２Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４，８）を 加え、ｐＨを４．５に調整した。脱イオン水により、その容積を最終的に１００ ｍ１に調節し、０．０２％の最終濃度までナトリウムアジ化物を加えた。

Ｔ、ｒｅｅｓｅｉ対照培養物、ｐＥＧＩｐｙｒ４形質転換体培養物上澄みまたは ブランクとしての０．１Ｍ酢酸ナトリウム（１０−２０μｌ）のアリコートを、 管中に配し、２５０μｌの媒質を加え、その管を３７℃で３０分間培養した。そ の管を氷上に１０分間配し、１ｍｌの冷たい沈殿剤（３，３％の酢酸ナトリウム 、０．４％の酢酸亜鉛、ＨＣｌによるｐＨ５，７６％エタノール）を加えた。そ の管に渦を生じさせ、約１３，０００Ｘｇでの３分間の遠心分離の前に、５分間 放置した。光学濃度を、５９０−６００ｎｍの波長で分光測光的に測定した。

使用したタンパク質検定は、米国イリノイ州、ロックフォード、ピアースから得 られた試薬を用いたＢＣＡ　（ビシンクロニック酸）検定であった。標準は、子 牛血清アルブミン（ＢＳＡ）であった。ＢＣＡ試薬は、１部の試薬Ｂと５０部の 試薬Ａとの混合により調製した。１ｍｌのＢＣＡ試薬を５０μｌの適切に希釈し たＢＳＡまたは試験培養上澄みと混合した。培養は３７℃で３０分間行ない、光 学密度は最終的に５６２ｎｍの波長で光学測光的に測定した。

上述した検定結果を表１に示す。産生じた形質転換体のいくつかは、未転換菌株 ＲｕｔＣ３０と比較してエンドグルカナーゼ活性の量を増加せしめたことが明確 である。未転換Ｔ、ｒｅｅｓｅｉにより産生されたエキソ−セロビオヒドロラー ゼおよびエンドグルカナーゼは、分泌されたタンパク質の合計量のそれぞれ７０ および２０パーセントを構成すると思われる。それゆえ、菌株ＲｕｔＣ３０より もほぼ４倍のエンドグルカナーゼを産生ずるＥＰ５のような形質転換体は、はぼ 等量のエンドグルカナーゼ型およびエキソ−セロビオヒドロラーゼ型タンパク質 を分泌すると予期される。

本実施例に記載した形質転換体は、完全なｐＥＧＩｐｙｒ４を用いて得られ、ｐ ＵＣプラスミドから誘導されたゲノム中に組み込まれるＤＮＡ配列を含有する。

転換の前に、ＨｉｎｄｌｌｌでｐＥＧＩｐｙｒ４を切断し、Ｔ、ｒｅｅｓｅｉ　 ＤＮＡのみを含有するより大きなりＮＡ断片を単離することが可能である。Ｔ、 ｒｅｅｓｅｉの、ＤＮＡのこの単離断片による転換により、ＥＧＩを過剰産生じ 、図８に示す合成りＮＡの２つの短片を除いた異種ＤＮＡ配列をまったく含まな い形質転換体の単離ができる。また、ｐＥＧＩｐｙｒ４を用いて、ｃｂｈｌ遺伝 子、またはｃｂｈ２遺伝子、または両方の遺伝子が欠失した菌株を転換すること も可能である。このようにして、ＥＧＩを過剰産生し、制限範囲のエキソ−セロ ビオヒドロラーゼを産生じ、またはエキソ−セロビオヒドロラーゼを全く産生じ ない菌株が構成される。

実施例２０の方法は、他のセルラーゼ組成物、キシラナーゼ成分またはＴ、ｒｅ ｅｓｅＬにより通常産生される他のタンパク質のいずれかを過剰に産生するＴ、 ｒｅｅｓｅｉ菌株を産生ずるのに用いられる。

表　１ エンドグルカナーゼの活性　タ　ンパク質菌株　（５９０ｎｍ　での光学潴ｆ） 　（ｓｇ／ｓｌ）　Ａ　／　ＢＲｕｔＣ３００，３２４，１０，０７８ＢＰ２　 ０．７０　３．７　０．１８９ＥＰ４　０．７６　３．８５　０．２０８ＥＰ５ 　１．２４　４．１　０．３０２ＥＰ６　０．５２　２．９３　０．１７７ＥＰ ＩＩ　Ｏ，９９４，１１０，２４１上述した結果は、合計タンパク質に対するＥ ＧＩ成分の産生過剰を示す目的にために提示したものであって、産生過剰の度合 いを示す目的のためではない。この点に関して、産生過剰は各実施例に関して変 わるものと思われる。

実施例２１ ｐｃＥＰｃｌの構成 プラスミド、ｐｃＥＰｃｌを構成した。ここでＥＧＩの暗号配列は、ｃｂｈｌ遺 伝子からのプロモーターに機能的に融合された。これは、それぞれの翻訳開始部 位の５′（上流）の都合のよい制限エンドヌクレアーゼ開裂部位を生成するため にｃｂｈｌおよびｅｇｌｌ遺伝子のＤＮＡ配列を変更する、生体外の部位特異性 突然誘発を用いて行なわれる。ＤＮＡ配列分析を行なって、２つのＤＮＡ断片の 間の接合部での予期した配列を確認した。行なわれた特異的な変更を図１４に示 す。

ｐｃＥＰｃｌを形成するように結合されたＤＮＡ断片は、ｐＵＣ４にのＥｃｏＲ Ｉ部位の間に挿入され、これは以下のようであった： Ａ）　ｃｂｈｌ座の５′側腹領域からの２．１ｋｂ断片。

これはプロモーター領域を含み、製造したＢｅ１１部位に延び、ｃｂｈｌ暗号配 列を含まない。

Ｂ）　製造したＢａｍＨ１部位を有する５′末端で開始し、翻訳停止コードンの 向こうに約０．５ｋｂを含むｅｇ１１座からのゲノムＤＮＡの１．９ｋｂ断片。

その断片の３′末端にはｐＵｃ２１８多重クローニング部位から誘導された１８ ｂｐがあり、１５ｂｐ合成オリゴヌクレオチドがこ？断片を以下の断片と連結さ せるのに用いられる。

Ｃ）　ｃｂｈｌ翻訳停止コードンの約１ｋｂ下流の位置から約２．５ｋｂ下流に 延びる、ｃｂｈｌ座の３′側腹領域からのＤＮＡの断片。Ｄ）ｐＴｐｙｒ２から 得られたＴ。

ｒｅｅｓｅＬ　ｐｙｒ４遺伝子（実施例２）を含有し、ｐＵＣ１８多重クローニ ング部位から誘導された１末端でのＤＮＡの２４ｂｐを有するＤＮＡの３．ｌｋ ｂ　ＮｈｅＯ−８ｐｈＩ断片を、断片（Ｃ）のＮｈｅＩ部位中に挿入した。

プラスミド、ｐｃＥＰｃｌを、ＥＧＩ暗号配列がｃｂｈｌ座で組み込まれ、いか なる異種ＤＮＡをも宿主菌株中に導入せずにＣＢＨＩの暗号配列を置換するよう に設計した。

このプラスミドのＥｃｏＲＩによる切断は、ｃｂｈ１プロモーター領域、ｅｇｌ ｌ暗号配列および転写終止領域を含む断片、Ｔ、ｒｅｅｓｅｉ　ｐｙｒ４遺伝子 およびｃｂｈｌ座の３′　（下流）側腹領域からのＤＮＡ断片を雌牛ずる（図１ ５参照）。

実施例２２ ｐｃＥＰｃＩ　ＤＮＡを含有する形質転換体Ｔ、ｒｅｅｓｅｉ　ＲｕｔＣ３０の ｐｙｒ４欠損菌株（シールーニース、前述）を、実施例１に概略を説明した方法 により得た。この菌株は、ＥｃｏＲＩで切断されたｐＣＥＰＣＩにより転換され た。安定な形質転換体を選択し、続いて実施例２０に記載したようにセルラーゼ 産生のために振動フラスコ中で培養した。セルラーゼタンパク質を視覚化するた めに、実施例７に記載した方法を用いてこれらの培養物からの試料上に等電点電 気泳動ゲルの電気泳動を行なった。この方法により分析した合計２３の形質転換 体のうち１２が、ＣＢＨＩタンパク質を全く産生じないことカ分カリ、：ｔＬは ｃｂｈｌＥｌｃ’（７）ｐｃＥＰｃＩ　ＤＮＡ（７）組込みの予期した結果であ る。サザン法分析を用いて、統合がこらの形質転換体のうちのいくつかのｃｂｈ ｌ座で完全に生じたこと、および細菌プラスミドベクター（ｐＵＣ４Ｋ）から誘 導された配列か全く存在しないこと（図１６参照）を確証した。この分析に関し て、形質転換体からのＤＮＡを、電気泳動を行ない、膜フィルターにプロットす る前に、ＰｓｔＩで切断した。生成したサザンプロットは、放射性標識プラスミ ドｐＵＣ４Ｋ　：　：　ｃｂｈｌでプローブした（実施例２）。そのプローブは 、未転換対照培養物か成した（図１６、レーンＡ）。ｃｂｈｌ座でのＤＮＡのｐ ＣＥＰＣＩ断片の組込みは、この６．５ｋｂ帯の損失およびほぼ１．０ｋｂ、２ ．Ｏｋｂおよび３．ＯｋｂのＤＮＡ断片と対応する３つの他の帯の外観となると 思われる。これは、図１６、レーンＣに示した形質転換体に観察される正確な模 様である。また図１６に示すように、レーンＢは、ｐｃＥＰｃｌの多重コピーが ｃｂｈｌ座以外のゲノム中の部位で組み込まれた形質転換体の実施例である。

試料中のタンパク質濃度が約０．０３と０．０７ｍｇ／ｍｌの間にあるように、 エンドグルカナーゼ活性検定を、未転換培養物、および試料が検定の前に５０倍 に希釈されたことを除いて実施例２０に記載したように形質転換体、からの培養 上澄みの試料に行なった。未転換対照培養物および４つの異なる形質転換体（Ｃ ＥＰＣＩ−１０１゜ＣＥＰＣＩ−１０３、ＣＥＰＣＩ−１０５およびＣＥＰＣＩ −１１２と称する）に行なった検定の結果を表２に示す。形質転換体ＣＥＰＣＩ −１０３およびＣＥＰＣＩ−１１２は、ＣＥＰＣＩ断片の統合がＣＢＨＩ産生の 損失となった実施例である。

表　２ エンドグルカナーゼの活性　タ　ンパク質菌株　（５９０ｎ１１　での先学１り 　（ｍｇ／＋＋ｌ）　Ａ／ＢＲｕｔＣ３０００，０３７２，３８０，０１８ＣＥ ＰＣＩ−１０１０，０８２２，７２０，０３０ＣＥＰＣＩ−１０３０，０９９１ ，９３０，０５１ＣＥＰＣＩ−１０５０，０３３２，０７０，０ＬＢＣＥＰＣＩ −１１２０，０９３１，７２０，０５４上述した結果は、合計タンパク質に対す るＥＧＩ成分の産生過剰を示す目的にために提示したものであって、産生過剰の 度合いを示す目的のためではない。この点に関して、産生過剰は各実施例に関し て変わるものと思われる。

ｐｃＥＰｃｌに類似するが、ｅｇ１１遺伝子を置換する他のＴ、ｒｅｅｓｅｉ遺 伝子を有するプラスミドを構成することか可能である。このようにして、他の遺 伝子の表現過剰およびｃｂｈｌ遺伝子の同時の欠失を達成できた。

また、事前に他の遺伝子、例えばｃｂｈ２が欠失したＴ。

ｒｅｅｓｅｉのｐｙｒ４誘導体菌株をｐｃＥＰｃｌで転換し、例えば全くエキソ −セロビオヒドロラーゼを産生ぜず、エンドグルカナーゼを過剰表現する形質転 換体を構成することも可能である。

ｐｃＥＰｃｌに類似の構成物を用いるか、Ｔ、ｒｅｅｓｅｉの別の座からのＤＮ Ａをｃｂｈｌ座からのＤＮＡと置換する場合、Ｔ、ｒｅｅｓｅｉゲノム中の別の 座での別のプロモーターの制御下で遺伝子を挿入することも可能である。

実施例２３ ｐＥＧＩＩ　：　：Ｐ−１の構成 ＥＧＩＩをコードする（以前に他者によりＥＧＩＩＩと称された）ｅｇ１３遺伝 子が、Ｔ、ｒｅｅｓｅｉからクローンされ、そのＤＮＡ配列が公表された（サロ ヘイモら、１９８８、遺伝子６３　：１ｌ−２１）。菌株ＲＬ−Ｐ３７から、ｐ Ｕｃ２１９のＰｓｔ１部位およびＸｈｏＩ部位の間に挿入されたゲノムＤＮＡの 約４ｋｂ　Ｐｓｔｌ−Ｘｈｏｌ断片として遺伝子を得た。ベクターｐＵｃ２１９ は、ＢｇｌＩＩＳＣｌａＩおよびＸｈｏｌの制限部位を含むように多重クローニ ング部位を広げることによりｐＵｃ２１９から誘導される（ウィルソンらにより １９８９年に記載された、遺伝子７７　：　６９−７８）。従来技術において知 られている方法を用いて、ゲノムＤＮＡの２．７ｋｂ　５ａｌｌ断片上に存在す るＴ、ｒｅｅｓｅｉ　ｐｙｒ４遺伝子を、ＥＧ１１暗号配列内の５ａ１１部位中 に挿入し、プラスミドｐＥＧＩ　Ｉ　：　：　Ｐ−１を産生じた（図１７）。こ れは、どの配列を欠失することがないがＥＧＩＩ暗号配列の分断となった。プラ スミド、ｐＥＧＩ　Ｉ　：　：　Ｐ−１は、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩで 切断でき、その両者がｐＵｃ２１９の多重クローニング部位から誘導された、一 方の末端の５ｂｐ上、および他方の末端の１６ｂｐを除いたＴ、ｒｅｅｓｅｉか ら排他的に誘導されたＤＮＡの線形断片を産生できる。

実施例２４ ＥＧＩＩを産生できない菌株を産生ずるためのＴ、ｒｅｅｓｅｉ　ＧＣ６９のｐ ＥＧＩ　Ｉ　：　：Ｐ−１による転換Ｔ、ｒｅｅｓｅｉ閑株ＧＣ６９は、以前に ＨｉｎｄＩｌｌおよびＢａｍＨＩで切断されたｐＥＧＩ　Ｉ　：　：Ｐ−１で転 換され、安定な形質転換体が選択される。全ＤＮＡはそれらの形質転換体から単 離され、サザン法分析が、これらの形質転換体を同定するのに用いられ、ここで ｐｙｒ４およびｅｇ１３遺伝子を含有するＤＮＡの断片がｅｇｌＢ座で組み込ま れ、その結果としてＥＧＩＩ暗号配列を分断した。その形質転換体はＥＧＩＩを 産生ずることができない。

また、ｐＥＧＩ　Ｉ　：　：　Ｐ−１を用いて、ｃｂｈｌ遺伝子、ｃｂｈ２遺伝 子、またはｅｇｌｌ遺伝子のいずれか、または全てが欠失された菌株を転換する こともできる。このようにして、あるセルラーゼ成分を産生じ、ＥＧＩＩ成分を 全く産生じない菌株を構成できた。

実施例２５ ＣＢＨＩＳＣＢＨＩ　Ｉ、およびＥＧＩＩを産生ずることのできない菌株を産生 ずるためのＴ、ｒｅｅｓｅｉのｐＥＧＩＩ：：Ｐ−１による転換 実施例１に概略を示した方法により、菌株Ｐ３７ＰΔΔＣＢＨ６７のｐｙｒ４欠 損誘導体（実施例１１から）を得た。この菌株Ｐ３７ΔΔ６７Ｐ１は、以前にＨ ｉｎｄＩｌｌおよびＢａｍＨＩで切断したｐＥＧＩ　Ｉ　：　：ｐ−１で転換さ れ、安定な形質転換体が選択された。全ＤＮＡはそれらの形質転換体から単離さ れ、サザン法分析が、これらの形質転換体を同定するのに用いられ、ここでｐｙ ｒ４およびｅｇ１３遺伝子を含有するＤＮＡの断片がｅｇｌＢ座で組み込まれ、 その結果としてＥＧＩＩ暗号配列を分断した。

図１８に説明したサザンプロットを、ｐＵｃ１８のＰｓｔ１部位中にクローンさ れ、続いて再単離されたｅｇ１３遺伝子を含有するＴ、ｒｅｅｓｅｔ　ＤＮＡの 約４ｋｂ　Ｐｓｔｌ断片でプローブした。菌株Ｐ３７ΔΔ６７Ｐ１から単離した ＤＮＡを、サザン法分析のためにＰｓｔＩで切断した場合、ｅｇ１３座は続いて オートラジオグラフ上の単一４ｋｂ帯として視覚化された（図１８、レーンＥ） 。しかしながら、ｅｇ１３遺伝子が分断された形質転換体に関より置換された（ 図１８、レーンＦ）。ＤＮＡがＥｃｏＲＶまたはＢｇｌＩＩで切断された場合、 ｅｇ１３遺伝子に対応する帯のサイズは、未転換Ｐ３７ΔΔ６７Ｐ１菌株（レー ンＡおよびＣ）とｅｇ１３が分断した形質転換体（図１８、レーンＢおよびＤ） との間の約２．　７ｋｂ　（挿入ｐｙｒ４断片のサイズ）により増加した。図１ ８に示した分断ｅｇ１３遺伝子を含有する形質転換体（レーンＢ１ＤおよびＦ） は、Ａ２２と称した。図１８において同定した形質転換体は、ＣＢＨＩ、ＣＢＨ ＩＩまたはＥＧＩＩを産生できない。

実施例２６ ｐＰΔＥＧＩ−１の構成 実施例１２に記載したように、Ｔ、ｒｅｅｓｅｉ菌株ＲＬ−Ｐ３７のｅｇｌｌ遺 伝子を、ゲノムＤＮＡのＨｉｎｄ１１１断片として得た。この断片をｐＵｃｌｏ ｏのＨｉｎｄｌｌＩ部位に挿入した（ｐＵｃ１８の誘導体、ヤニシューベロンら 、１９８５、遺伝子３３：ＢｇｌｌｌＳＣｌａｌおよびＸｈｏｌの制限部位を加 える多重クローニング部位中に挿入されたオリゴヌクレオチドを有する１０３− １１９）。従来技術において知られている方法論を用いて、ＥＧＩ暗号配列の中 央に近い位置からその暗号配列の３′末端を超えた位置に広がる約１ｋｂ　Ｅｃ ｏＲＶ断片を除去し、ｐｙｒ４遺伝子を含有するＴ、ｒｅｅｓｅｉ　ＤＮＡの３ ゜５ｋｂ　５ｃａｌ断片により置換した。作成したプラスミドをｐＰΔＥＧＩ− １と称した（図１９参照）。

プラスミドｐｐΔＥＧ　Ｉ−１は、Ｈｉｎｄｌ　Ｉ　Ｉで切断され、いずれの末 端にもｅｇｌｌ遺伝子の断片およびその中央でＥＧＩ暗号配列の一部を置換する ｐｙｒ４遺伝子を有するＴ、ｒｅｅｓｅｉゲノムＤＮＡのみからなるＤＮＡ断片 を放出てきる。

適切なＴ、ｒｅｅｓｅｉ　ｐｙｒ４欠損菌株のＨｉ　ｎｄＩＩＩで切断したｐＰ ΔＥＧＩ−１による転換は、形質転換体のある割合においてｅｇｌｌ座にこのＤ ＮＡを組み込むことを導く。このようにして、ＥＧＩを産生できない菌株が得ら れる。

実施例２７ ｐΔＥＧＩｐｙｒ−３の構成およびＴ、ｒｅｅｓｅｉのｐｙｒ４欠損菌株の転換 ＥＧＩ遺伝子を、実施例２６に概説した方法を用いて不活化できるという予想が 本実験により増強される。この場合、プラスミド、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎ ｉｇｅｒｐｙｒ４遺伝子が選択可能マーカーとしてのＴ、ｒｅｅｓｅｉ　ｐｙｒ ４遺伝子を置換することを除いてｐＰΔＥＧＩ−１に類似であるｐΔＥＧ１ｐｙ ｒ−３を構成した。この場合、ｅｇｌｌ遺伝子は、ｐＵｃｌｏｏのＨｉｎｄＩ１ １部位に挿入された４、２ｋｂ　Ｈｉｎｄｌｌｌ断片として再度存在した。ｐＰ ΔＥＧＩ−１の構成中に（実施例２８参照）、同一の内部１ｋｂ　ＥｃｏＲＶ断 片を除去したが、この場合、その断片はクローンされたＡ、ｎｉｇｅｒｐｙｒＧ 遺伝子を含有する２、２ｋｂ断片により置換された（ウィルソンら、１９８８、 Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１６ｐ、２３３９）、りΔＥＧＩｐｙｒ−３を 有するＴ、ｒｅｅｓｅｉのｐｙｒ４欠損菌株（菌株ＧＣ６９）の転換は、その菌 株がＨｉｎｄＩ　Ｉ　Ｉで切断されていずれの末端のｅｇｌｌ座から側腹領域を 有するｐｙ　ｒＧ遺伝子を含有する断片を放出した後に、ｅｇｌｌ遺伝子か分断 された形質転換体に導かれた。これらの形質転換体は、Ｈｉｎｄｌｌｌで切断さ れ、放射線標識ｐΔＥＧＩｐｙｒ−３でプローブされた形質転換体ＤＮＡのササ ン法分析により認識された。Ｔ、ｒｅｅｓｅｉの未転換菌株において、ｅｇ１１ 遺伝子は、ＤＮＡの４．２ｋｂ　ＨｉｎｄＩＩＩ断片上に存在し、この雑種形成 のパターンは、図２０、レーンＣとして表される。しかしながら、ｐΔＥＧＩｐ ｙｒ−３からの所望の断片の組込みによるｅｇＬｌ遺伝子の欠失に従って、この ４．２ｋｂ断片は消失し、より大きなサイズの約１．２ｋｂ、図２０．レーンＡ の断片により置換された。また図２０に示すように、レーンＢは、ｐΔＥＧＩｐ ｙ「−３の単一コピーの組込みがｅｇｌｌ座以外のゲノム中の部位で生じた形質 転換体の実施例である。

実施例２８ ＣＢＨＩ、ＣＢＨＩ　Ｉ、ＥＧＩおよびＥＧＩＩを産生できない菌株を産生ずる Ｔ、ｒｅｅｓｅｉのｐＰΔＥＧＩ−１による転換 実施例１に概説した方法により、菌株Ａ２２（実施例２５から）のｐｙｒ４欠損 菌株を得る。この菌株は、以前にＨｉｎｄｌ　Ｉ　Ｉで切断され、ｐｙｒ４遺伝 子により置換されたＥＧＩ暗号配列の一部を有するいずれかの末端でｅｇ１１遺 伝子の断片を有するＴ、ｒｅｅｓｅｉゲノムＤＮＡのみからなるＤＮＡ断片を放 出するｐＰΔＥＧｔ−１により転換される。

安定なｐｙｒＪ＋形質転換体を選択し、全ＤＮＡをその形質転換体から単離され る。ＤＮＡは、形質転換体を同定するためにサザン法分析後に３２ｐ標識ｐＰΔ ＥＧ　Ｉ−１でプローブされる。ここで、ｐｙｒ４遺伝子およびｅｇｌｌ配列を 含有するＤＮＡの断片は、ｅｇｌｌ座で組み込まれ、結果としてＥＧＩ暗号配列 を分断する。同定された形質転換体は、ＣＢＨＩＳＣＢＨＩ　Ｌ　ＥＧＩおよび ＥＧＩＩを産生することができない。

ＦＩＧ、−２ ２４　ｂｐ右べＤＮＡ ＦＩＧ、−８ ｅｌ　１６　（）　Ｈロ　＋／ｌ　ｏｕ”＞　ロ！　史　ｃ′！　〜　へ　―　 ＝　Ｏ ｏｏ　ロ　ロ　ロ　。　ロ　。

如Ｊは 棗ｎユ ＦＩＧ、　１４ ＥｃｏＲ工τ力ｅｉｈｔ＝Ｊ’ｌ　ＰＣＥＰＣＩ　からイ扁、９に７＝　ＤＮＡ 　１７１　ｊＪｔｈ断ｔ”）ＦＩＧ、　１５ ＡＳ　Ｃ ＦＩＧ−ｔｓ ｅｇｌＵ　遵イ云う−の Ｂｇｌｌｌ　３　’　イＩＩ　ｑ（／シトへＤＩＡＧＲＡＭ　ＯＦ　ｐＥＧＩＩ ：：Ｐ−１ＦＩＧ、　１７ ＢＣＤＥＦ ＦＩＧ−ｔｓ ｅｇｌｌ　ａイｉ！引の ＦＩＧ、　１９ ＦＩＧ−２゜ 国際調査報告 フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，Ｓ　識別記号　庁内整理番号Ｃｌ２Ｓ　１１１００ （Ｃ１２Ｎ　９／４２ Ｃ１２Ｒ１：８８５） （Ｃ１２Ｎ　１５１５６ Ｃ１２Ｒ１：８８５） （７２）発明者　ワイス、ジェフリー　エルアメリカ合衆国　カリフォルニア州 ９４１１７　サンフランシスコ　ブエナ　ヴイスタ　アヴエニュ−４５７ Ｉ （７２）発明者　レアナス、ニドマント　エイアメリカ合衆国　カリフォルニア 州 ９４０３８　モス　ビーチ　ネヴアダ　３０１（７２）発明者　シューメイカー 、シャロン　ピーアメリカ合衆国　カリフォルニア州 ９４５３３　フェアフィールド　バーバンクドライヴ　３１７３

Claims (21)

【特許請求の範囲】
1. １．（ａ）洗浄に効果的な量の界面活性剤または界面活性剤の混合物、および （ｂ）洗浄剤組成物の重量に基づいて約０．０１から約５重量パーセントの菌類 セルラーゼ組成物からなる洗浄剤組成物であって、該セルラーゼ組成物が、１つ 以上のＥＧ型成分、および該セルラーゼ組成物中のタンパク質の重量に基づいて 約５重量パーセント未満のＣＢＨＩ型成分からなることを特徴とする洗浄剤組成 物。
2. ２．前記セルラーゼ組成物が、前記洗浄剤組成物の約０．０５から約２重量パー セントを構成することを特徴とする請求の範囲第１項記載の洗浄剤組成物。
3. ３．前記セルラーゼ組成物が全てのＣＢＨ　Ｉ型成分を含まないことを特徴とす る請求の範囲第１項記載の洗浄剤組成物。
4. ４．前記セルラーゼ組成物が全てのＣＢＨ型成分を含まないことを特徴とする請 求の範囲第３項記載の洗浄剤組成物。
5. ５．前記セルラーゼ組成物が、いかなるＣＢＨ　Ｉ型成分も表現できないように 、および／または１つ以上のＥＧ型成分を過剰表現できるように遺伝学的に修飾 された微生物から誘導されることを特徴とする請求の範囲第４項記載の洗浄剤組 成物。
6. ６．前記セルラーゼ組成物が、いかなるＣＢＨ型成分も表現できないように遺伝 学的に修飾された微生物から誘導されることを特徴とする請求の範囲第１項記載 の洗浄剤組成物。
7. ７．前記セルラーゼ組成物がいかなる異種タンパク質も含まないことを特徴とす る請求の範囲第６項記載の洗浄剤組成物。
8. ８．綿含有織物の軟らかさを高める方法であって、該方法が、（ａ）洗浄に効果 的な量の界面活性剤または界面活性剤の混合物、および（ｂ）洗浄剤組成物の重 量に基づいて約０．０１から約５重量パーセントの菌類セルラーゼ組成物からな り、ここで前記セルラーゼ組成物が、１つ以上のＥＧ型成分、および該セルラー ゼ組成物中のタンパク質の重量に基づいて約５重量パーセント未満のＣＢＨ　Ｉ 型成分からなる洗浄剤組成物から誘導された洗濯媒質中で前記織物を洗濯するこ とからなることを特徴とする方法。
9. ９．前記セルラーゼ組成物が、前記洗浄剤組成物の約０．０５から約２重量パー セントを構成することを特徴とする請求の範囲第８項記載の方法。
10. １０．前記セルラーゼ組成物が全てのＣＢＨ　Ｉ型成分を含まないことを特徴と する請求の範囲第８項記載の方法。
11. １１．前記セルラーゼ組成物が全てのＣＢＨ型成分を含まないことを特徴とする 請求の範囲第１０項記載の方法。
12. １２．前記セルラーゼ組成物が、いかなるＣＢＨ　Ｉ型成分も表現できないよう に、および／または１つ以上のＥＧ型成分を過剰表現できるように遺伝学的に修 飾された微生物から誘導されることを特徴とする請求の範囲第８項記載の方法。
13. １３．前記セルラーゼ組成物が、いかなるＣＢＨ型成分も表現できないように遺 伝学的に修飾された微生物から誘導されることを特徴とする請求の範囲第８項記 載の方法。
14. １４．前記セルラーゼ組成物がいかなる異種タンパク質も含まないことを特徴と する請求の範囲第１３項記載の方法。
15. １５．綿含有織物の色彩を保持／復元する方法であって、該方法が、（ａ）洗浄 に効果的な量の界面活性剤または界面活性剤の混合物、および（ｂ）洗浄剤組成 物の重量に基づいて約０．０１から約５重量パーセントの菌類セルラーゼ組成物 からなり、ここで前記セルラーゼ組成物が、１つ以上のＥＧ型成分、および該セ ルラーゼ組成物中のタンパク質の重量に基づいて約５重量パーセント未満のＣＢ Ｈ　Ｉ型成分からなる洗浄剤組成物から誘導された洗濯媒質中で１回以上前記織 物を洗濯することからなることを特徴とする方法。
16. １６．前記セルラーゼ組成物が、前記洗浄剤組成物の約０．０５から約２重量パ ーセントを構成することを特徴とする請求の範囲第１５項記載の方法。
17. １７．前記セルラーゼ組成物が全てのＣＢＨ　Ｉ型成分を含まないことを特徴と する請求の範囲第１５項記載の方法。
18. １８．前記セルラーゼ組成物が全てのＣＢＨ型成分を含まないことを特徴とする 請求の範囲第１７項記載の方法。
19. １９．前記セルラーゼ組成物が、いかなるＣＢＨ　Ｉ型成分も表現できないよう に、および／または１つ以上のＥＧ型成分を過剰表現できるように遺伝学的に修 飾された微生物から誘導されることを特徴とする請求の範囲第１５項記載の方法 。
20. ２０．前記セルラーゼ組成物が、いかなるＣＢＨ型成分も表現できないように遺 伝学的に修飾された微生物から誘導されることを特徴とする請求の範囲第１５項 記載の方法。
21. ２１．前記セルラーゼ組成物がいかなる異種タンパク質も含まないことを特徴と する請求の範囲第２０項記載の方法。