JP3165699B2 - ほぼ純粋なｅｇ▲ｉｉｉ▼セルラーゼを含有する洗剤組成物 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 1.発明の利用分野 本発明はトリコダーマspp（Trichoderma spp.）から
得られるほぼ純粋なEG IIIセルラーゼを含有する洗剤組
成物およびその組成物の使用方法に関するものである。
より詳しくは、本発明の洗剤組成物は洗浄に有効な量の
少なくとも一種の界面活性剤とほぼ純粋なEG IIIセルラ
ーゼから成っている。

2.技術の現状 セルラーゼはセルロース（β−1,4−グルカンリンケ
ージ）を加水分解してグルコース、セロビオース、セロ
オリゴ糖類等を生成する酵素として知られている。セル
ラーゼは菌類、バクテリア等内で生成（発現）される
が、ある種の菌類、特に、菌類トリコダーマspp（中で
もトリコダーマリーゼイ（reesei））によって生成され
るセルラーゼは、結晶形態のセルロースを減成すること
のできる完全なセルラーゼシステムを発酵によって容易
に大量に製造することができるため特に注目されてい
る。

上述のようなことに関して、ウッド（Wood）等の［酵
素学の方法（Methods in Enzymology）］160,25（198
8）234ページ以降には、完全な菌セルラーゼシステムは
エキソーセロビオハイドロラーゼ（exo−cellobiohydro
lases）（EC3.2.1.91）（CBH）、エンドグルカナーゼ
（endoglucanases）（EC3.2.1.4）（EG）、β−グルコ
シダーゼ（β−glucosidases）（EC3.2.1.21）（BG）と
称されるものを含む異なる数種の酵素からなっているこ
とが開示されている。その菌セルラーゼ類CBH、EG、BG
は各種には多成分のものを含ませることができる。例え
ば、様々な菌源から多成分CBH及び多成分EGが分離され
ている。

CBH、EG、BG成分からなる完全なセルラーゼシステム
は結晶セルロースをグルコースに効率よく変換するのに
要求されている。遊離した成分の結晶セルロースの加水
分解作用は極めて弱い。更に、セルラーゼ成分の間に
は、特にそれら異種である場合には、相助作用がみられ
る。

一方、セルラーゼとその成分は単独で用いても、組み
合せて用いても、洗剤組成物に有用であることが知られ
ている。例えば、菌セルラーゼのエンドグルカナーゼ成
分は洗剤組成物の洗浄能力を高めるためや綿製品の感触
をよくするためにも使用されているし、また、軟化剤と
しても使用されている。しかしながら、トリコダーマsp
pとくにトリコダーマリーゼイから誘導されたEG IやEG
II成分を洗剤組成物に使用する場合にはつぎのような問
題がある。このような成分の最適pHは酸性領域にある
が、ほとんどの洗濯用洗剤組成物は中性若しくはアルカ
リ（pH7から約pH10）状態で使用するように調製されて
いる。米国特許出願No.07/668,640には洗剤組成物にト
リコダーマリーゼイの少なくとも一種の酸性成分を用い
ることによって、例えアルカリ条件で処理しても、綿を
含む生地の軟化、保色性、色の回復性、および感触を改
良することが開示されているが、本発明はトリコダーマ
sppのEG III成分がトリコダーマリーゼイのEG IやEG II
成分と比較して優れたそして予期せむ効果を洗剤組成物
に与えると言う発見に基づくものである。

このEG III成分はアルカリ条件下でも極めて高い酵素
活性を示すことが発見された。

発明の概要 本発明はほぼ純粋なEG IIIセルラーゼを洗剤組成物に
使用することによって軟化、保色性、色の回復性、およ
び感触を改良することを目的とするものである。特に、
EG IIIセルラーゼはアルカリ条件下で極めて高い活性を
示すので、ほぼ純粋なEG IIIセルラーゼを含有する洗剤
組成物は中性ないしアルカリ性の洗剤を使用する洗濯に
特に適している。

本発明の洗剤組成物は洗浄に有効な量の少なくとも一
種の界面活性剤と約0.01から約5wt％の、望ましくは約
0.05から約2wt％のほぼ純粋なEG IIIセルラーゼから成
っている。

本発明の一つの方法は、綿を含む生地の柔らかさを高
める方法であって、洗浄に有効な量の少なくとも一種の
界面活性剤と約0.01から約5wt％の、望ましくは約0.05
から約2wt％のほぼ純粋なEG IIIセルラーゼから成る洗
剤組成物から得られる洗濯媒体でその生地を洗うことを
特徴とするものである。

本発明の他の方法は、綿を含む生地の保色性と色の回
復性を改良する方法であって、洗浄に有効な量の少なく
とも一種の界面活性剤と約0.01から約5wt％の、望まし
くは約0.05から約2wt％のほぼ純粋なEG IIIセルラーゼ
から成る洗剤組成物から得られる洗濯媒体でその生地を
１度ないし数度洗うことを特徴とするものである。

図面の簡単な説明 第１図はCBH IとCBH IIを発現できないように変性さ
れたトリコダーマリーゼイの変種から誘導されたEG富裕
化菌性セルラーゼの40℃における一定pH領域での、RBB
−CMC活性を、トリコダーマリーゼイから誘導されたEG
III富裕化セルラーゼのそれとともに示す。

第２図は等電位電気泳動ゲルであり、レーンＡは自生
型トリコダーマリーゼイによって生産された蛋白質を示
し、レーンＢはEG I、EG II成分を発現できないように
変性されたトリコダーマリーゼイの変種によって生産さ
れた蛋白質を示し、レーンＣはほぼ純粋なEG IIIセルラ
ーゼ内で発見された蛋白質を示す。この図の右端にはCB
H I、CBH II、EG I、EG II、EG IIIに起因するバンドを
示すマークが付されている。

第３図はEG IIIの種々のpHにおける繊維除去特性すな
わち色回付特性を示す。

第４図はEG IIIの２つの断片から得られるアミノ酸配
列である。

第５図はＰΔCHB I pyr4の形成を概略的に示す。

第６図はＰΔCHB I pyr4からの大きい方の断片をトリ
コダーマリーゼイクロモソームの一方のcbh1座に組込む
ことによるトリコダーマリーゼイの遺伝子の除去を示
す。

第７図は32Pで標識されたＰΔCHB I pyr4をプローブ
としてサザン法を行った後の、EcoR Iで消化されたＰΔ
CHB I pyr4で変性したトリコダーマリーゼイ変種GC69か
らのDNAのオートラヂオグラフィーで、分子量マーカー
の大きさが図の左側にキロ塩基対で示されている。

第８図は32Pで標識されたp I ntCHB Iをプローブとし
て変性したトリコダーマリーゼイ変種GC69からのDNAの
オートラヂオグラフィーで、分子量マーカーの大きさが
図の左側にキロ塩基対で示されている。

第９図は自生型トリコダーマリーゼイおよび変性され
たトリコダーマリーゼイ変種から分泌された蛋白質を示
す等電集束ゲルである。レーンＡはトリコダーマリーゼ
イからの部分的に精製されたCHB Iを使用しており、レ
ーンＢは自生型トリコダーマリーゼイを使用しており、
レーンＣはcbh1遺伝子を除去したトリコダーマリーゼイ
変種からの蛋白質を使用しており、レーンＤはcbh1遺伝
子とcbh2遺伝子を除去したトリコダーマリーゼイ変種か
らの蛋白質を使用している。第９図の右側には分泌され
た蛋白質内に発見された個々のたんぱく質の位置を示す
マーカーがふされている。BGはβ−グルコシダーゼ、E1
はエンドグルカナーゼＩ、E2はエンドグルカナーゼII、
E3はエンドグルカナーゼIII、C1はエキソーセロビオハ
イドロラーゼＩ、C2はエキソーセロビオハイドロラーゼ
IIである。

第10A図はゲノムDNAの4.1kbのEcoR I断片としてクロ
ーニングされたトリコダーマリーゼイのcbh2座を示し、
第10B図はcbh2遺伝子除去ベクターＰΔCHB IIを示して
いる。

第11図は32Pで標識されたＰΔCHB IIをプローブとし
てサザン法を行った後の、EcoR Iで消化されたＰΔCHB
IIで変性したトリコダーマリーゼイ変種P37PΔCHB I py
r26からのDNAのオートラヂオグラフィーである。分子量
マーカーの大きさが図の左側にキロ塩基対で示されてい
る。

第12図はプラスミドpEG I pyr4の模式図である。

第13図は便利な制限エンドヌクレアーゼクリーヴィッ
ジ部位を作るためにeg1l遺伝子とeg12遺伝子内で行われ
た部位変更を示す模式図である。

第14図はpCEPC1から得られる大きい方のEcoR I断片の
模式図である。

第15図は変性していないトリコダーマリーゼイ変種Ru
tC30からのDNAおよびEcoR Iで消化されたpCEPC1で変性
して得られる変性種からのDNAのオートラヂオグラフィ
ーである。DNAはPst Iで消化され、サザンブロットで得
られ、32Pで標識されたpUC4K::cbh1とのあいだでハイブ
リッド成形がなされた。マーカーDNA断片の大きさが図
の左側にキロ塩基対で示されている。

第16図はプラスミドpEG II::P−１の模式図である。

第17図はpEG II::P−１で消化されたHind IIIとBamH
Iで変性したトリコダーマリーゼイ変種pEG II::P−１か
らのDNAのオートラヂオグラフィーである。サザンブロ
ットが用意され、DNAはegl3遺伝子を含む放射線標識さ
れたトリコダーマリーゼイDNAの約4kbのPst I断片との
間でハイブリット形成した。レーンＡ、Ｃ、Ｅは変性さ
れていない変種からのDNAを含み、レーンＢ、Ｄ、Ｆは
変性されていないトリコダーマリーゼイ変種からのDNA
を含む。トリコダーマリーゼイDNAはレーンＡ、Ｂにお
いてBg1 II、レーンＣ、ＤにおいてEcoR V、レーンＥ、
ＦにおいてPst Iに消化された。マーカーDNA断片の大き
さが図の左側にキロ塩基対で示されている。

第18図はプラスミドpPΔEG I−１の模式図である。

第19図はHind IIIで消化されたＰΔEG I pyr−３によ
って得られた変種GC69から分離されたDNAのサザンブロ
ットのオートラヂオグラフィーである。変性されていな
い変種にたいして予測される、プローブ、すなわ放射線
標識されたＰΔEG I pyr−３、とのハイブリッド成形の
パターンがレーンＣに示されている。レーンＡはehl1遺
伝子が破壊されている変性種にたいして予想されるパタ
ーンを示している。レーンＢはＰΔEG I pyr−3DNAがゲ
ノムに組込まれているが、ehl1遺伝子が破壊されていな
い変性種にたいして予測されるパターンを示している。
レーンＤ果てきとうな大きさのマーカーを提供するよう
にHind IIIで消化されたＰΔEG I pyr−３を含んでい
る。マーカーDNA断片の大きさが図の左側にキロ塩基対
で示されている。

発明の詳細な説明 前述のように、ほぼ純粋なEG IIIセルラーゼを含む洗
剤組成物とその洗剤組成物の使用方法に関するものであ
る。このような洗剤組成物はアルカリ性の水性洗濯媒体
中で使用すると綿を含む生地の軟化、保色、色の回復、
および触感の改良に極めて効果的である。

本発明について詳細に説明する前に次の用語について
定義する。

「EG IIIセルラーゼ」とは、トリコダーマsppから得
られる、最適pHが約5.5から6.0、等電点pIが約7.2から
8.0、分子量が約23から28Kdaltonのエンドグルカナーゼ
成分を称する。EG IIIセルラーゼはトリコダーマリーゼ
イもしくはトリコダーマヴァイライド（Viride）から誘
導するのが望ましい。トリコダーマリーゼイから誘導さ
れるEG IIIセルラーゼは最適pHが約5.5から6.0、等電点
（pI）が約7.4、分子量が約25から28Kdaltonである。ト
リコダーマヴァイライドから誘導されるEG IIIセルラー
ゼは最適pHが約5.5、等電点（pI）が約7.7、分子量が約
23.5Kdaltonである。

「ほぼ純粋なEG IIIセルラーゼ」とは、少なくとも約
40wt％、望ましくは少なくとも約70wt％、さらに望まし
くは少なくとも約90wt％のEG IIIを含有するセルラーゼ
蛋白組成物（wt％はセルラーゼ蛋白の総重量に基づく）
を称するものである。

EG IIIセルラーゼは発行条件が適当であればEG IIIを
生産するトリコダーマsppのどのような変種からも精製
することができる。EG III源はあまり重要ではないが、
トリコダーマリーゼイとトリコダーマヴァイライドが望
ましい。トリコダーマリーゼイからのEG IIIの特に望ま
しい供給源はサイトラーゼ123セルラーゼ（Cytolase123
cellulase）である。このサイトラーゼ123セルラーゼ
Genencor International Inc.（180Kimball Way,South
San Francisco,CA 94080）から販売されている。pIが
高いために、EG IIIセルラーゼは、トリコダーマsppに
よって発現される高pIキシラナーゼ等の高pI成分が一般
に存在する等電集束ゲル（isoelectrofocusing gel）の
領域の領域に存在する。実際は、図２のEG IIIと示され
ているバンドはEG IもしくはEG IIの減成生成物である
と仮定されている。しかしながら、EG IとEG IIを除去
したセルラーゼ（米国特許出願No.07/593,919及びNo.07
/668,640に記載された方法で調製）のゲル等電集束によ
れば、このバンドがEG IもしくはEG IIの減成生成物に
起因すると考えることは出来ない（図２参照） EG IIは以前はある用語体系ではEG IIIと命名されて
いたが、現在の用語体系では「EG II」が当てられてい
る。いずれにしても、後述の実施例２の表１に明白に示
されるようにEG II蛋白は分子量、pI、最適pHにおいてE
G III蛋白とは相当に異なっている。

トリコダーマsppから誘導される完全なセルラーゼシ
ステム（全セルラーゼ）からほぼ純粋なEG IIIセルラー
ゼを得る適当な方法は例えば以下の実施例に挙げるよう
なものがある。以下の実施例から明らかとなるように、
異名る分留材（分留塔）を使用して繰りかえし分留する
工程を含む精製法によって全セルラーゼを精製すること
によってほぼ純粋なEG IIIセルラーゼを容易に得ること
ができる。また分留工程の前に、ポリエチレングリコー
ル8000を使用した抽出によってEG IIIセルラーゼフラク
ション（約20から50％の純粋なEG IIIセルラーゼを含
む）を得て、そのEG IIIセルラーゼフラクションを分留
することによってほぼ純粋なEG IIIセルラーゼを得るよ
うにしてもよい。

更に、微生物を、ほぼ純粋なEG IIIセルラーゼを産生
するように遺伝学的に操作してほぼ純粋なEG IIIセルラ
ーゼを得ることも考えられる。例えば、後述の実施例に
おいて分留法によって調製されたほぼ純粋なEG IIIセル
ラーゼは公知の配列法でたんぱく質の一部又は全部のア
ミノ酸配列を決定するのに使用することができる。EG I
IIセルラーゼの部分のアミノ酸配列が分かれば、合成DN
Aプローブを作ってこの情報をエンコードする遺伝子を
クローニングすることができる。そのEG IIIエンコード
遺伝子がクローニングできれば、それを操作して種々の
トリコダーマspp変種や他の微生物に挿入することがで
きる。例えば、1990年10月５日出願の米国特許出願No.0
7/593,919および1991年３月13日出願の米国特許出願No.
07/668,640にはトリコダーマリーゼイを遺伝子工学的に
操作して特定のセルラーゼ遺伝子を発現できないように
するとともに、他のセルラーゼ遺伝子を過剰に生産させ
るようにする方法が開示されている。1990年10月５日出
願の米国特許出願No.07/593,919および1991年３月13日
出願の米国特許出願No.07/668,640を参考例としてここ
に引用する。本出願に記載された方法を使用することに
よって、トリコダーマリーゼイをEG IIIを単独でもしく
は他のセルラーゼ蛋白質とともに産生するように遺伝子
工学的に操作することができる。また本出願に記載され
た方法によって、異種蛋白質を産生しないトリコダーマ
リーゼイ変種を作ることができる。

また、サッカロマイセスセレヴィジエ（Saccharomyce
s cerevisiae）、ピチアパストリス（Pichia pastori
s）、ハンセヌラポロモルファ（Hansenula polymorph
a）、クルイヴァロマイセスラクチス（Kluyveromyces l
actis）、ヤロイアリポリチカ（Yarrowia lipolytic
a）、スカニオマイセスオクシデンタリス（Schaniomyce
s occidentalis）等のイースト菌等の他の微生物にEG
IIIエンコード遺伝子を発現させてもよい。例えば、PCT
No.WO85/04672を参照されたい。このような代替の非
トリコダーマ宿主に発現させるためには、EG IIIエンコ
ードDNA配列をその特定の宿主からの遺伝子から得られ
るプロモーター配列とターミネータ配列に機能的に結合
させる必要があるかもしれない。また、その代替宿主か
らの分泌信号配列をエンコードするDNA配列をEG III分
泌信号配列をエンコードするDNA配列と置き換える必要
もあるかもしれない。他の有機体内でのEG IIIの分泌と
産生ができればEG IIIをほぼ純粋な形で得ることができ
る。

「セルラーゼ蛋白」とは自生のトリコダーマsppもし
くはその形質転換された変種によって発現された全ての
そして各々のエキソセロビオハイドロラーゼ（exo−cel
lobiohydrolase）（CBH）蛋白、エンドグルカナーゼ（E
G）蛋白およびβ−グルコシターゼ（BG）蛋白を称する
ものである。したがって、セルラーゼ蛋白はキシラナー
ゼ、プロテイアーゼ、アミラーゼ等のトリコダーマspp
が発現する他の蛋白を含まない。

「エキソセロビオハイドロラーゼ（CBH）成分」とは
トリコダーマリーゼイのCBH I成分やCBH II成分を称す
るものであり、また「CBH型成分」という用語はトリコ
ダーマリーゼイのCBH I成分やCBH II成分と同様な洗剤
活性特性を示す菌セルラーゼ成分を称するものである。
この意味において、トリコダーマリーゼイのEG成分の非
存在下で使用した場合には、トリコダーマリーゼイのCB
H I、CBH II成分だけでは処理された綿含有生地に充分
な保色性や色回復性を与えることは出来ないし、またそ
の触感を良くすることも出来ない。更に、そのようなEG
成分とともに使用したときには、トリコダーマリーゼイ
のCBH I成分は綿含有生地の強度ロスを大きくするとと
もにクリーニングの効果を増大させることができる。

したがって、「CBH I型成分、「CBH II型成分」とは
それぞれトリコダーマリーゼイのCBH I成分とCBH II成
分と同様な洗剤活性特性を示す菌セルラーゼ成分を称す
るものである。上述のように、CBH I型成分に関してはC
BH I成分と同様な洗剤活性特性とは、EG成分とともに使
用したときに綿含有生地の強度ロスを大きくするととも
にクリーニングの効果を増大させることができる特性を
含むものである。望ましい実施例においては、CBH I型
成分はEG成分の存在かでは生地をより軟化させることが
できる。

そのようなCBH型成分には、従来CBH IとCBH IIをトリ
コダーマリーゼイから特徴付けるために使用される活性
度試験によってエキソセロビオハイドロラーゼ成分と分
類されていた成分を含まなくともよい。例えば、そのよ
うな従来の分類試験によった場合に、そのような成分は
（ａ）セロビオースによって競合阻害される（K_i＝約1m
M）、（ｂ）リン酸によって膨れたセルロースを重合度
の低い高度に結晶化したセルロースに加水分解する、
（ｃ）カルボキシメチルセルロースのような高度に置換
されたセルロースを加水分解することができない。これ
に対して、上記のような活性度試験によってエキソセロ
ビオハイドロラーゼ成分とされるCBH成分のうちにはト
リコダーマリーゼイのCBH成分と同様な機能的特性を持
たないものがあると考えられている。すなわち、このよ
うな成分は、トリコダーマリーゼイのCBH成分が有する
ような洗剤組成物中での機能的特性を持たないから、こ
こでの目的に照らして、このようなエキソセロビオハイ
ドロラーゼはCBH型成分としない方がより正確であると
考えられる。

「β−グルコシターゼ（BG）成分」とはBG活性を示す
セルラーゼの成分を称する。すなわち、そのような成分
はセロビオースや他の可溶性セロオリゴサッカライド
（セロビオース）の非還元性末端から作用し唯一の生成
物としてグルコースを生成する。BG成分はセルロースポ
リマーに吸着もしないし反応もしない。またこのような
BG成分はグルコースによって競合阻害される（K_i＝約1m
M）。なおBG成分はセルロースを減成できないので、厳
密な意味では学術上セルラーゼではない。このようなBG
成分はセルラーゼシステムのなかに含まれるものであ
る。なぜなら、これらの酵素はCBH成分とEG成分の相乗
作用によって産生された阻害性のセルロース減成産物
（特にセロビオース）をさらに減成することによってセ
ルロース全体の減成を容易にするからである。BG成分が
ないと、結晶セルロースの適度な加水分解が生ずるか、
あるいは加水分解がほとんど生じないかである。BG成分
はしばしばＰ−ニトロフェノールＢ−Ｄ−グルコシド
（PNPG）等のアリル基質に対して特徴付けられ、アリル
−グルコシダーゼと呼ばれることが良くある。しかしな
がら、全てのアリル−グルコシダーゼがBG成分である分
けではなく、その内にはセロビオースを加水分解しない
ものがある。

本発明の洗剤組成物にBG成分を混合した方が望ましい
場合もある。（例えば、BG成分がない場合にセロビオー
スのレベルがセルロースの全体的な加水分解を抑えるほ
ど高くなるようなときに全体的な加水分解を促進するた
めに）このような場合には、精製したBG成分を洗剤組成
物に加えてもよい。このとき加えるBG成分の量は洗濯の
際に生ずるセロビオースの量によるが、それは当業者に
は容易に決定できる。しかしながら、BG成分を加える場
合には、ほぼ純粋なEG IIIセルラーゼの総重量にたいす
るBG成分の量は約0.4から約10wt％が望ましく、更に望
ましくは、約１から約5wt％である。

菌セルラーゼは２種以上のBG成分を含むことがあり、
一般にイオン交換クロマトグラフィー等によって分離さ
れる。分離を容易にするために、BG量が増加されたセル
ラーゼ組成物を使用するのが望ましい。セルラーゼ組成
物中のBG成分の量を増加させる方法については、1990年
12月10日出願の米国特許出願No.07/625,140「SACCHARIF
ICATION OF CELLULOSE BY CLONING AND AMPLIFICATION
OF THEβ−GLUCOSIDASE GENE OF TRICHODERMA REESE
I」に開示されている。

「綿含有生地」とは綿の織り地、綿のニット、綿のデ
ニム等の100％コットンもしくはコットンブレンドの縫
製後および未縫製の生地を意味する。コットンブレンド
の場合には、綿の量は少なくとも約40wt％であるべきで
あり、望ましくは約60wt％以上、更に望ましくは、約75
wt％以上である。コットンブレンドの場合一種または２
種以上の綿以外の繊維を綿に混ぜることできる。例え
ば、ポリアミド繊維（例えば、ナイロン６、ナイロン6
6）、アクリル（例えば、ポリアクリロニトリル繊
維）、ポリエステル繊維（例えば、ポリエチレンテレフ
タレート）、ポリヴィニルアルコール繊維（例えば、ヴ
ィニロン）、ポリヴィニルクロライド繊維、ポリヴィニ
リデンクロライド繊維、ポリウレタン繊維、ポリユリア
繊維、アラミド繊維等の合成繊維を混ぜることができ
る。また、レーヨン等の再生セルロースを綿含有生地に
含まれる綿の替わりに使用してもよい。

「界面活性剤」とは、従来から洗剤組成物に使用され
ているアニオン界面活性剤、ノニオン界面活性剤及び両
性界面活性剤を称する。

「洗濯媒体」とは、水に必要量の洗剤（界面活性剤）
組成物を加えて得られる洗濯水である。一般にその洗濯
媒体は洗浄に有効な量の洗剤を含んでいる。

pHが約４以上７未満である場合、その洗濯媒体を酸性
洗濯媒体と定義し、約７である場合、その洗濯媒体を中
性洗濯媒体と定義し、約７から約10である場合、その洗
濯媒体をアルカリ性洗濯媒体と定義する。アルカリ性洗
濯媒体はpHが約７から約９であるのが望ましく、更に望
ましくはpHが約７から約８である。

CBH Iの欠けたセルラーゼ組成物、CBH Iを増加させた
セルラーゼ組成物、あるいはEG IIIを増加させたセルラ
ーゼ組成物を含む洗剤組成物の場合、綿含有生地に対す
る望ましい洗剤特性、すなわち、改良された色回復性、
改良された軟化性もしくは改良された洗浄効果、を洗剤
組成物に付与するのはセルラーゼの量であって、セルロ
ースから還元糖類を産する特定の酵素組成物による加水
分解の相対速度ではないということが発見された。

本発明は、ほぼ純粋なEG IIIセルラーゼを洗剤組成物
に加えると、その洗剤組成物から得られる洗濯媒体が酸
性であっても、中性であっても、アルカリ性であって
も、綿含有生地の柔らかさを増し、保色性、色回復性を
改良し、触感を改良することができると言う発見に基づ
くものである。しかしながら、EG IIIはアルカリ条件か
で極めて高い活性を示すので、ほぼ純粋なEG IIIセルラ
ーゼを使用した洗剤組成物は、トリコダーマリーゼイか
ら誘導される他のエンドグルカナーゼ成分を使用した洗
剤組成物に比べて綿含有生地の柔らかさを増し、保色
性、色回復性を改良し、触感を改良する点において優れ
ている。

EG IIIセルラーゼの存在によって、綿含有生地の柔ら
かさを増し、保色性、色回復性を改良し、触感を改良す
ることができるが、EG IIIセルラーゼと他のセルラーゼ
の特定の混合によって付加的な利益が得られる。すなわ
ち、EG IIIセルラーゼの使用によって、洗浄効果と軟化
性が向上するが、EG IIIセルラーゼとCBH I型セルラー
ゼとを含む洗剤組成物で綿含有生地を洗濯すると洗浄効
果と軟化性が更に向上する。

一方、相当量のCBH I型成分がEG IIIセルラーゼと共
に存在すると、CBH I型成分が全く存在しないかあるい
は少量である場合に比べて綿含有生地の強度ロスを大き
くしてしまうことがある。従って、洗剤組成物がCBH I
型成分を含む場合には、その量はセルラーゼ蛋白の総重
量に対して、約10wt％以下であるのが望ましく、より望
ましくは約5wt％以下、更により望ましくは約2wt％以下
である。

上述の点に関して、本発明の洗剤組成物に一般に使用
されるほぼ純粋なEG IIIセルラーゼの量は綿含有生地の
柔らかさ、保色性、色回復性を与えるのに充分な量であ
る。ほぼ純粋なEG IIIセルラーゼ洗剤組成物の量は総洗
剤組成物の重量にたいして約0.01wt％から約5wt％であ
るのが望ましく、更に望ましくは約0.05wt％から約2wt
％である。

一般に、本発明の洗剤組成物に一般に使用される他の
セルラーゼ蛋白の量はEG IIIセルラーゼを含むセルラー
ゼ蛋白の総重量の約60wt％以下であり、望ましくは約30
wt％以下、更に望ましくは約10wt％以下である。更に望
ましくは、CBH I型成分の量はセルラーゼ蛋白の総重量
の約5wt％以下である（すなわちほぼ純粋なEG IIIセル
ラーゼ）。

洗剤組成物に使用されるほぼ純粋なEG IIIセルラーゼ
の濃度は洗濯媒体中で希釈したときにEG IIIセルラーゼ
の濃度が約0.5から約500ppmとなるように選択するのが
望ましく、約２から約100ppmとなるように選択するのが
更に望ましい。また洗剤組成物に使用されるほぼ純粋な
EG IIIセルラーゼの量は水に加えて洗濯媒体を作るとき
に洗剤組成物がどの程度に希釈されるかによる。これら
のファクターは当業者には容易に決定することができる
であろう。

セルラーゼ濃度が低い場合には（洗濯媒体中のEG III
セルラーゼ濃度が約5ppm未満）、本発明の洗剤組成物の
綿含有生地の柔らかさ、保色性、色回復性および触感に
対する効果は洗濯を繰りかえす度に顕著になる。またセ
ルラーゼ濃度が高い場合には（洗濯媒体中のEG IIIセル
ラーゼ濃度が約5ppm以上）、本発明の洗剤組成物の綿含
有生地の柔らかさ、保色性、色回復性および触感に対す
る効果は１度の洗濯ではっきりする。

本発明の重要な点の一つは、セルラーゼ組成物をほぼ
純粋なEG IIIセルラーゼを含むようにすることによっ
て、洗剤組成物中でのセルラーゼ濃度が低くても綿含有
生地の柔らかさ、保色性、色回復性を向上させる効果が
得られることである。セルラーゼ濃度が低い方が消費者
の安全には望ましい。

ほぼ純粋なEG IIIセルラーゼは液体状態で洗剤組成物
に加えてもよいし、顆粒状態で加えてもよいし、エマル
ジョン状態で加えてもよいし、ゲル状態で加えてもよい
し、ペースト状態で加えてもよいし、他の種々の状態で
加えてもよい。洗剤組成物が固体である場合には、セル
ラーゼ組成物は顆粒状態であるのが望ましい。またセル
ラーゼ保護剤を含んだ状態で顆粒化するのが望ましい。
例えば、1991年１月17日出願の米国特許出願No,07/642/
669「GRANULES CONTAINING BOTH AN ENZIME AND AN EN
ZYME PROTECTING AGENT AND DETERGENT COMPOSITIONS
CONTAINING SUCH GRANULES」を参照されたい。洗濯媒体
中への顆粒の溶解速度を小さくする材料を含むように顆
粒化することも出来る。そのような材料および顆粒は19
91年１月17日出願の米国特許No,07/642/596「GRANULAR
COMPOSITIONS」に開示されている。

本発明の洗剤組成物にはアニオン界面活性剤、ノニオ
ン界面活性剤、両性界面活性剤等の従来から洗剤組成物
に使用されている界面活性剤が使用される。

本発明の洗剤組成物に使用するのに適したアニオン界
面活性剤としては、直鎖または枝分かれアルキルベンゼ
ンスルフォネート、直鎖または枝分かれアルキル基ある
いはアルケニル基を有するアルキルもしくはアルケニル
エーテルスルフェート、アルキルもしくはアルケニルス
ルフェート、オレフィンスルフォネート、アルカンスル
フォネート等がある。アニオン界面活性剤に対する適当
なカウンタイオンとしては、ナトリウム、リン等のアル
カリ金属イオン、カルシウム、マグネシウム等のアルカ
リ土類金属イオン、アンモニウムイオン、および炭素数
が２または３のアルカノイル基を１から３個有するアル
カノルアミンがある。

両性界面活性剤としては、第４アンモニウム塩スルフ
ォネート、ベタイン型両性界面活性剤等がある。これら
の両性界面活性剤は同一分子中に正電荷を有する基と陰
電荷を有する基の両方を持っている。

ノニオン界面活性剤としてはポリオキシアルキレネー
テル、高級脂肪酸のアルカノルアミド、そのアルキレン
オキシドアダクト、脂肪酸グリセリンモノエステル等が
ある。

本発明において使用するのに適した界面活性剤は英国
特許出願No.2094826に開示されている。

界面活性剤の混合物も使用することができる。

本発明の洗剤組成物に使用される界面活性剤または界
面活性剤の混合物の量は総洗剤組成物の約１から約95wt
％であり、約５から約45wt％であるのが望ましい。洗濯
媒体中に希釈したときの界面活性剤濃度は通常約500ppm
以上であり、約1,000ppmから15,000ppmであるのが望ま
しい。

本発明の洗剤組成物はセルラーゼ組成物と界面活性剤
の他に、次の成分の一つまたはそれ以上を含んでも差し
支えない。

セルラーゼ以外のハイドロラーゼ カルボキシレートエステルハイドロラーゼ、チオエス
テルハイドロラーゼ、フォスエートモノエステルハイド
ロラーゼ、エステル結合に作用するフォスエートジエス
テルハイドロラーゼ、グリコシル化合物に作用するグリ
コシドハイドロラーゼ、Ｎ−グリコシル化合物を加水分
解する酵素、エーテル結合に作用するチオエーテルハイ
ドロラーゼ、α−アミノ−アシル−ペプチドハイドロラ
ーゼ、ペプチジール−アミノ酸ハイドロラーゼ、アシル
−アミノ酸ハイドロラーゼ、ジペプチドハイドロラー
ゼ、ペプチド結合に作用するペプチジール−ペプチドハ
イドロラーゼ。この中で、カルボキシレートエステルハ
イドロラーゼ、グリコシドハイドロラーゼ、およびペプ
チジール−ペプチドハイドロラーゼが望ましい。適当な
ハイドロラーゼとしては（１）ペプシン、ペプシンＢ、
レンニン、トリプシン、チモトリプシンＡ、チモトリプ
シンＢ、エラスターゼ、エンテロキナーゼ、カプシン
Ｃ、パパイン、チモパパイン、フィシン、スロムビン、
フィビリノリジン、レニン、サブチリシン、アスパジロ
ペプチターゼＡ、コラゲナーゼ、クロストリヂオペプチ
ダーゼＢ、カリクレイン、ガストリジン、カテプシン
Ｄ、ブロメリン、ケラチナーゼ、チモトリプシンＣ、ペ
プシンＣ、アスパジロペプチターゼＢ、ウロキナーゼ、
カルボキシペプチダーゼA,B、アミノペプチダーゼ等の
ペプチジール−ペプチドハイドロラーゼに属するプロテ
アーゼ、（２）α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、グル
コアミラーゼ、インヴェルターゼ、リソジーム、ペクチ
ナーゼ、チチナーゼ、デキストラナーゼ等のグリコシド
ハイドロラーゼ（必須の成分であるセルラーゼはこのグ
ループから除いてある）。これらは酸性ないし中性の系
内で作用するが、バクテリアから得らたものはアルカリ
性系内で高い活性を示す。例えば、（３）カルボキシル
エステラーゼ、リパーゼ、ペクチンエステラーゼ、クロ
ロフィラーゼ等のカルボキシレートエステルハイドロラ
ーゼがある。特にリパーゼが効果的である。

商品名と生産者は次の通りである。

“Alkalase"、“Esperase"、“Savinase"、“AMG"、
“BAN"、“Fungamill"、“Sweetzyme"、“Thermamyl"
（Novo Industry、Copenhagen Denmark）、“Makusatas
e"、“High−alkarine protease"、“Amylas THC"、“L
ipase"（Gist Brocades、N.V.,Delft,Holland）、“Pro
tease B−400"、“Protease B−4000"、“Protease A
P"、“Protease AP2100"（Schweizerische Ferment A.
G.,Basel,Switzerland）、“CRD Proteas"（Monsant Co
mpany,St.Louis,Missouri）、“Piocase"（Piopin Corp
oration,Monticello,Illinois）、“Pronase P"、“Pro
nase AS"、“Pronase AF"（Kaken Chemical Co.,Ltd,Ja
pan）、“Lapidase P−2000"（Lapidas,Secran,Franc
e）、プロテアーゼ産物（タイラー標準ふるい、16メッ
シュ100％通過、150メッシュ100％不通過）（Clington
Corn Products,Division of Standard Brabds Corp,.Ne
w York）、“Takamine"、“Bromelain 1:10"、“HT Pro
tease200"、“Enzyme L−W"（バクテリアではなく菌類
から得られたもの）（Μiles Chemical Company,Elkhar
t,Ind.）、“Rhozyme P−11 Conc."、“Pectinol"、“L
ipase B"、“Rhozyme PF"、“Rhozyme J−25"（Rohm＆H
aas,Genecor,South San Francisco,CA）、Ambrozyme20
0"（Jack Wolf＆Co.Ltd.,Subsidiary of Nopco Chemica
l Company,Newark,N.J.）、“ATP 40"、“ATP 120"、
“ATP160"（Lapidas,Secran,France）、“Oripase"（Na
gase＆Co..,Ltd,Japan） セルラーゼ以外のハイドロラーゼは目的に応じて必要
な量だけ加えられ、精製された量で0.001から5wt％加え
るのが望ましく、更に望ましくは0.02から3wt％であ
る。この酵素は粗酵素だけであるいは洗剤組成物の他の
成分と組み合わされた状態で顆粒化した形で使用する必
要がある。粗酵素の顆粒は精製された酵素が顆粒の0.00
1から50wt％であるような量で使用される。また顆粒は
0.002から20wt％、望ましくは0.1から10wt％だけ加える
のが望まし。セルラーゼと同様に酵素保護剤と溶解遅延
剤を含んだ状態で顆粒化することもできる。

カチオン界面活性剤と長鎖脂肪酸塩 カチオン界面活性剤と長鎖脂肪酸塩には、飽和もしく
は不飽和脂肪酸塩、アルキルもしくはアルケニルエーテ
ルカルボキシル酸塩、α−スルフォ脂肪酸塩もしくはエ
ステル、アミノ酸型界面活性剤、フォスフェートエステ
ル界面活性剤、第４アンモニウン塩（３まら４個のアル
キル置換基と１個までのフェニル置換アルキル置換基を
有するものを含む）等がある。適当なカチオン界面活性
剤と長鎖脂肪酸塩は英国特許出願No.2 094 826Aに開示
されている。本発明の洗剤組成物はそのようなカチオン
界面活性剤と長鎖脂肪酸塩を約１から20wt％含んでも差
し支えない。

ビルダー A.2価の金属イオン封鎖剤 本発明の洗剤組成物は次にあげる化合物のアルカリ金
属塩とアルカノルアミン塩からなる群から選ばれた一種
もしくは数種のビルダー成分を約50％まで含んでも差し
支えない。フォスフェート、フォスフォネート、フォス
フォノカルボキシネート、アミノ酸塩、アミノポリアセ
テート高分子電解質、非解離性ポリマー、ジカルボキシ
ル酸塩、及びアルミノシリケート塩。適当な２価の金属
イオン封鎖剤は英国特許出願No.2 094 826Aに開示され
ている。

B.アルカリまたは無機電解質 本発明の洗剤組成物は次にあげる化合物のアルカリ金
属塩の一種以上を約１から約50wt％、望ましくは約５か
ら約30wt％、アルカリまたは無機電解質として含んでも
差し支えない。シリケート、カーボネート、スルフェー
ト。また、トリエタノールアミン、ジエタノールアミ
ン、モノエタノールアミン、トリイソプロパノールアミ
ン等の有機アルカリでも差し支えない。

アンチリデポジション剤 本発明の洗剤組成物は次にあげる化合分の一種以上を
約0.1から約5wt％アンチリデポジション剤として含んで
も差し支えない。ポリエチレングリコール、ポリビニル
アルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチル
セルロース これらの内で、カルボキシメチルセルロースやポリエ
チレングリコールを本発明のセルラーゼ組成物と組み合
せると塵埃除去組成物として極めて有用である。

漂白剤 本発明のセルラーゼをソヂウムペルカーボネート、ソ
ヂウムペルボレート、ソヂウムスルフェート／過酸化水
素アダクト等の漂白剤やスルホン化されたフタロシアニ
ンの亜鉛塩、アルミニウム塩等の感光性漂白染料等と組
み合せて使用すると洗浄効果が更に高くなる。

青味剤と蛍光染料 もし必要ならば、種々の青味剤と蛍光染料を本発明の
洗剤組成物に加えて差し支えない。適当な青味剤と蛍光
染料は英国特許出願No.2 094 826Aに開示されている。

ケーキング防止剤 粉末洗剤には次のようなケーキング防止剤を加えて差
し支えない。Ｐ−トルエン塩スルフォン酸塩、キシレン
スルフォン酸塩、酢酸塩、硫化琥珀酸塩、タルク、微粉
砕したシリカ、粘土、カルシウムシリケート（例えば、
Johns Manville Co.製のMicro−Cell）、カルシウムカ
ーボネート、酸化マグネシウム セルラーゼ活性を阻害する因子にたいするマスキング剤 本発明のセルラーゼ組成物は銅、亜鉛、クロム、水
銀、鉛、マンガン、銀のイオンもしくはこれらの化合物
の存在かで奪活されることがある。これらの阻害剤にた
いしては種々の金属キレート化剤および金属沈殿剤が有
効である。そのような金属キレート化剤ないし金属沈殿
剤としては、上述の２価の金属イオン封鎖剤やマグネシ
ウムシリケート、マグネシウムスルフェート等がある。

セロビオーゼ、グルコースおよびグルコノラクトンが
阻害剤として作用する場合もある。このようなサッカラ
イドとセルラーゼの共存は出来る限り避けるのが望まし
い。その共存が避けられない場合にはサッカライドをコ
ーティングするなどしてサッカライドがセルラーゼと直
接接触しないようにする必要がある。

長鎖脂肪酸塩やカチオン界面活性剤も阻害剤として作
用する場合がある。しかしながらこれらのセルラーゼと
の共存は、タブレット化、コーティング等によって両者
が直接接触するのを防止できれば差し支えない。

上述のようなマスキング剤やマスキング法は必要なら
ば使用して差し支えない。

セルラーゼ活性剤 活性剤はセルラーゼの種類によって変わる。蛋白質、
コバルトおよびその塩、マグネシウムおよびその塩、カ
リウムおよびその塩、ナトリウムおよびその塩、または
マンノース、キシロース等のモノサッカライドの存在下
では、セルラーゼは活性化され、その洗浄力が大きく向
上する。

酸化防止剤 酸化防止剤としては、ターブチルヒドロキシトルエ
ン、4,4′−ブチリデンビス（６−ターブチル−３−メ
チルフェノール）、2,2′−ブチリデンビス（６−ター
ブチル−４−メチルフェノール）、モノスチレネーチッ
ドクレゾール、ジスチレネーチッドクレゾール、モノス
チレネーチッドフェノール、ジスチレネーチッドフェノ
ール、1,1′−ビス（４−ヒドロキシ−フェニール）シ
クロケキサン等がある。

可溶化剤 可溶化剤としてはエタノール等の低級アルコール、ベ
ンゼンスルフォネート塩、ｐ−トルエンスルフォネート
塩等の低級アルキルベンゼンスルフォネート塩、プロピ
レングリコール等のグリコール、アセチルベンゼンスル
フォネート塩、アセトアミド、ピリジニンジカルボキシ
ル酸アミド、ベンゾネート、尿素等がある。

本発明の洗剤組成物は酸性からアルカリ性にわたる広
いpH範囲で使用することができる。望ましい実施例で
は、本発明の洗剤組成物はアルカリ性洗濯媒体中で使用
することができ、更に望ましい実施例においてはpHが７
より高く約８以下のアルカリ性洗濯媒体中で使用するこ
とができる。

上述の成分の他に、香料、緩衝剤、防腐剤、染料等、
従来一般に使用されているものを本発明の洗剤組成物
に、必要ならば加えて差し支えない。

洗剤の基礎材料が粉末である場合、噴霧乾燥法、顆粒
化法等公知のどの様な方法で調製しても差し支えない。
しかしながら、噴霧乾燥法または噴霧乾燥顆粒化法によ
って得られるものが望ましい。噴霧乾燥法によってえら
れる基礎材料は調製条件によって制限されるものではな
い。噴霧乾燥法によってえられる基礎材料は、界面活性
剤、ビルダー等の耐熱性成分の水性スラリーを高熱の空
間内に噴霧して得られる中空の顆粒である。その顆粒の
大きさは50から2000ミクロンである。噴霧乾燥の後に香
料、酵素、漂白剤、無機アルカリ性ビルダーを加えても
よい。噴霧乾燥顆粒化法によって得られるような高度に
稠密な顆粒状基礎材料の場合にはその調製後に種々の成
分を加えてもよい。

基礎材料が液体である場合それは均一な溶液であって
もよいし、不均一な分散液であってもよい。洗剤中のセ
ルラーゼによってカルボキシメチルセルロースが分解さ
れるのを避けるために、カルボキシメチルセルロースを
前もって顆粒化もしくはコーティングしておくのが望ま
しい。

本発明の洗剤組成物は工業用にも家庭用にも通常の温
度及び割合で使用される。

本発明のほぼ純粋なEG IIIセルラーゼは洗剤に使用さ
れるだけでなく、綿含有生地の柔らかさを増し、保色
性、色回復性を改良し、触感を改良するのに充分な活性
を有する中間的なpHで適当な溶液中で予備洗濯するのに
も使用することができる。ほぼ純粋なEG IIIセルラーゼ
が予備浸軟（例えば、予備洗濯）組成物に使用する場合
には、それは液体組成物、噴霧組成物、ゲル組成物、あ
るいはペースト組成物としてその予備浸軟組成物の総重
量の約0.01から約20wt％の範囲で使用するのが普通であ
る。予備浸軟組成物の場合には、界面活性剤を使用する
ことができ、使用するばあいには予備浸軟組成物の総重
量の約0.01から約20wt％の範囲の濃度で使用される。予
備浸軟組成物の残部は希釈剤、緩衝剤、他の酵素（プロ
テアーゼ）等の公知の成分であり、通常の濃度で使用さ
れる。すなわち予備浸軟組成物は０から約20wt％の界面
活性剤と約0.01から約20wt％のほぼ純粋なEG IIIセルラ
ーゼを含む。

また本明細書でいうほぼ純粋なEG IIIセルラーゼはし
み抜き、あるいは退色した生地の色回復に適した（例え
ば、米国特許No.4,738,682参照）独立した組成物として
家庭で使用することができる。

またそのほぼ純粋なEG IIIセルラーゼは中性からアル
カリ性の条件下で活性が高いため、紡織工程で綿含有生
地を処理（米国特許出願No.07/677,385およびNo.07/67
8,865参照）するのに有用であり、また緑蔵飼料や堆肥
を作るのにも有用である。

以下に示す実施例は本発明を説明するためのものであ
り、本発明の範囲を限定するものと解釈すべきものでは
ない。

実施例 実施例１はCytolase 123 Cellulase（トリコダーマリ
ーゼイから得られた全菌セルラーゼ組成物、South San
FranciscoのGenecor International,Inc発売）からの
精製によるEG III以外の成分の分離を説明するものであ
る。

実施例１ シトラーゼ123セルラーゼのセルラーゼ成分への精製 Cytolase 123 Cellulaseを次のようにして精留した。
このセルラーゼ系のセルラーゼ成分の正規分布は次の通
りである。

CBH I 45−55wt％ CBH II 13−15wt％ EG I 11−13wt％ EG II ８−10wt％ EG III １−4wt％ BG 0.5−10wt％ 精留は次の樹脂を入れた塔を使用して行われた。Seph
adex G−25ゲル濾過樹脂（Sigma Chemical Company,St.
Louis）、QA Trisacryl Mアニオン交換樹脂、SP Trisac
ryl Mカチオン交換樹脂（IBF Biotechnics,Savage,Md） 0.5gのCytolase 123 Cellulaseを３のSephadex G−
25ゲル濾過樹脂と10mMのりん酸ナトリウム緩衝液を入れ
た塔でpH6.8で脱塩した。得られた脱塩溶液を20mlのQA
Trisacryl Mアニオン交換樹脂の塔に充填した。この塔
に結合されたフラクションはCBH IとEG Iを含んでい
た。これらの成分は０から約500mMの塩化ナトリウムを
含む水性密度勾配を使用して、密度勾配溶離によって分
離した。この塔に結合されなかったフラクションはCBH
IIとEG IIを含んでいた。これらのフラクションは10mM
のくえん酸ナトリウム（pH3.3）で平衡させたSephadex
G−25ゲル濾過樹脂の塔を使用して脱塩した。この溶液2
00mlをSP Trisacryl Mカチオン交換樹脂20mlの塔に充填
した。

CBH IIとEG IIは０から約200mMの塩化ナトリウムを含
む水性密度勾配を使用して別々に溶離した。

実施例２ Cytolase 123 CellulaseからのEG IIIの精製 実施例１においてはCytolase 123 Cellulaseからいく
つかの成分が分離された。EG IIIはCytolase 123 Cellu
laseには極めて微量しか含まれていないため、この成分
を分離するために次のような手法が使用された。

A.EG IIIセルラーゼ酵素の大規模抽出 100のセルのないセルラーゼ濾液を約30℃に加熱し
た。この加熱された材料は、約４％wt/volのPEG8000
（分子量約8000のポリエチレングリコール）と約10％wt
/volの無水硫酸ナトリウムを含んでいた。混合物は２相
の液体であった。その２相はSA−１積層ディスク（disk
stack）円心機によって分離した。また相は銀汚染性
等電集束ゲルを使用して分析した。EG IIIとキシラーゼ
が精留され富裕化していた。回収された組成物は約20か
ら50wt％のEG IIIを含んでいた。

上記の方法に関して、分子量が約8000より小さいポリ
エチレングリコールを使用すると分離が不適切になっ
た。これに対して、分子量が約8000より相当大きいポリ
エチレングリコールを使用すると、所望の酵素を回収組
成物から追い出す結果となった。硫酸ナトリウムの量に
関しては、その量が約10％wt/volより相当多いと沈殿の
問題が生じ、それより相当少ないとうまく分離しない
か、あるいは溶液が１相のままであった。

B.精留によるEG IIIの精製 自生型のトリコダーマリーゼイから産出された全菌セ
ルラーゼ組成物（Cytolase 123 Cellulase、South San
FranciscoのGenecor International,Inc発売）からの
精留によってEG IIIを精製した。精留は次の樹脂を入れ
た塔を使用して行われた。

Sephadex G−25ゲル濾過樹脂（Sigma Chemical Compa
ny,St.Louis）、QA Trisacryl Mアニオン交換樹脂、SP
Trisacryl Mカチオン交換樹脂（IBF Biotechnics,Savag
e,Md） 0.5gのCytolase 123 Cellulaseを３のSephadex G−
25ゲル濾過樹脂と10mMのりん酸ナトリウム緩衝液を入れ
た塔でpH6.8で脱塩した。得られた脱塩溶液を20mlのQA
Trisacryl Mアニオン交換樹脂の塔に充填した。この塔
に結合されたフラクションはCBH IとEG Iを含んでい
た。この塔に結合されなかったフラクションはCBH IIと
EG IIとEG IIIを含んでいた。これらのフラクションは1
0mMのくえん酸ナトリウム（pH4.5）で平衡させたSephad
ex G−25ゲル濾過樹脂の塔を使用して脱塩した。この溶
液200mlをSP Trisacryl Mカチオン交換樹脂20mlの塔に
充填した。EG IIIは200mMの塩化ナトリウム水溶液200mL
で溶離した。

EG IIIの分離効率を上げるためには、EG IIIを過剰に
生産するか、および／またはEG I、EG II、CBH I、CBH
II成分の少なくとも一種を生産できないように遺伝学的
に変質されたトリコダーマリーゼイを使用するのが望ま
しいかもしれない。これによれば、例えば、精留および
／またはPEG抽出によって必然的にEG IIIの分離効率が
上がる。1991年３月13日出願の米国特許出願No.07/668,
640にはこのような変種のいくつかの製造が開示されて
いる。

同様に、上述のEG III組成物を更に精製した方が望ま
しいかもしれない。例えば、上記の方法Ａ）又はＢ）で
分離されたEG III蛋白を、方法Ａ）で得られた材料を方
法Ｂ）で使用することによって、またはその逆によって
更に精製することができる。EG IIIを更に精製する特別
の方法の一つは、この実施例２のパートｂ）で得られた
EG IIIサンプルを更に精製することである。Mono−Ｓ−
HR5/5column（Piscataway,N.J.のPharmaica LKB Biotec
hnology社製）を使用したFPLC装置によって更に精製し
た。FPLC装置は液体クロマトグラフィー制御装置、２個
のポンプ、デュアルパスモニター、フラクション収集装
置およびチャートレコーダー（全てPiscataway,N.J.のP
harmaica LKB Biotechnology社製）から成っている。こ
の実施例２のパートｂ）で得られたEG IIIサンプル5ml
を10mMのくえん酸ナトリウム（pH4）であらかじめ平衡
させた20mlのSephadex G−25の塔を使用して脱塩した。
この塔を０から200mΜの塩化ナトリウムを含む水性密度
勾配を使用して0.5ml/分の速度で溶離して、サンプルを
1mlずつのフラクションとした。EG IIIはフラクション1
0、11内に回収されており、その純度はゲル電気泳動に
よって90％を超えると決定された。この純度のEG IIIは
公知の技法によってＮ−末端アミノ酸配列を決定するの
に適している。

ほぼ純粋なEG IIIの特性をトリコダーマリーゼイから
分離された他のエンドグルカナーゼと比較して次に示
す。

上記表から分かるように、EG IIIはトリコダーマリー
ゼイの他のエンドグルカナーゼ成分と比べて最適pHもpI
も高い。下記の実施例３において分かるように、EG III
はアルカリpH下で相当高いRBB−CMC活性を保持してい
る。

トリコダーマsppの他の変種から得られたEG IIIセル
ラーゼも同様にして精製することができる。例えば、ト
リコダーマヴァイライドから誘導されたEG IIIセルラー
ゼについてVoragen等の「Methods in Enzymology,160:2
43−249］に記載がある。これにはEG IIIセルラーゼは
約23.5Kdaltonの分子量を有し、最適pHが5.5、pIが7.7
であると記載されてる。

実施例３ 所定のpH領域におけるセルラーゼ組成物の活性 次は二つの異なるセルラーゼ組成物のpH特性を決定す
るためになされたものである。第１のセルラーゼ組成物
は上述と同様にしてCBH I成分とCBH II成分を産生出来
ないように遺伝子工学的に変性したトリコダーマリーゼ
イから調製した、CBH I成分とCBH II成分の欠けたセル
ラーゼ組成物であった。このセルラーゼ組成物は、トリ
コダーマリーゼイから誘導されたセルラーゼ組成物の約
58から70％を通常占めるCBH I成分とCBH II成分を有さ
ないため、必然的にEG成分に富んでいる。EG IIIはトリ
コダーマリーゼイのエンドグルカナーゼ成分の内で最も
少ないから、この組成物はEG IとEG IIがほとんどであ
る。

第２のセルラーゼ組成物は実施例２のパートｂ）と同
様な精製法によってトリコダーマリーゼイから誘導され
たセルラーゼ組成物から分離された純度約20から40％の
EG IIIフラクションであった。

これらのセルラーゼ組成物の活性を40℃で次のように
して決定した。

５から20μの適切な酵素溶液を最終溶液に必要量の
酵素を与えるのに充分な濃度で加える。2wt％のRBB−CM
C（Remazol Brilliant Blue R−Carboxymethyl−cellul
ose−−−6 Altona Place,North Rocks,N.S.W.2151,Aus
traliaのMegaZyme社製）250μをpH4、５、5.5、６、
6.5、７、7.5、８のシトレート／フォスフェート緩衝液
0.5Mと混合したものを加える。

撹拌し、40℃で30分間インキュベートする。氷浴で５
から10分間冷やす。0.3Mの酢酸ナトリウムと0.02Mの酢
酸亜鉛を含むメチルセロソルブ1000μを加える。撹拌
し、５から10分間放置する。遠心分離し、上澄みをキュ
ベット（cuvet）に注ぐ。

各キュベット内の溶液の光学濃度（OD）を590nmで測
定することによって比活性を決定した。光学濃度が高い
ほど活性が高いことを示している。

この分析結果は第１図に示されている。第１図はCBH
IとCBH IIの欠けたセルラーゼ組成物の比活性をEG III
セルラーゼのそれと比較して示すものである。第１図か
ら分かるように、CBH IとCBH IIの欠けたセルラーゼ組
成物はRBB−CMCに対する最大セルロース加水分解活性が
pH5.5付近にあり、pH約７から８のアルカリ領域でもあ
る程度の活性がある。これに対して、EG IIIに富んだセ
ルラーゼ組成物は最大セルロース加水分解がpH5.5から
６にあり、アルカリ領域でも相当のの活性がある。

実施例４ 等電集束ゲル この実施例の目的は異なるEG IIIセルラーゼ組成物等
電集束ゲルを説明することである。すなわち、自生型の
トリコダーマリーゼイによって産生されたセルラーゼ、
EG I、EG IIIセルラーゼ蛋白を産生出来ないように変性
したトリコダーマリーゼイの変種から誘導したセルラー
ゼおよびほぼ純粋なEG IIIセルラーゼを等電集束ゲルに
ついて分析した。

これらのセルラーゼをPhermacia IEF装置（FBE−300
0、Piscataway,N.J.のPharmaica社製）とpH3から10のプ
リキャストゲル（Servalyt Precot、ドイツン、Carl−B
ergのServa社製）を使用してメーカーのインストラクシ
ョンにしたがって等電集束によって分析した。ゲルは蛋
白バンドが見えるようにEphortec変種（Serva Blue W,W
estburyのServa Fine Biochemicals社製）で汚した。得
られたゲルを第２図に示す。第２図では、レーンＡは自
生型のトリコダーマリーゼイから誘導されたセルラーゼ
の等電集束ゲル、レーンＢはEG I、EG IIセルラーゼ蛋
白を産生出来ないように変性したトリコダーマリーゼイ
の変種から誘導したセルラーゼの等電集束ゲル、レーン
Ｃはほぼ純粋なEG IIIセルラーゼの等電集束ゲルを示
す。この図では、各蛋白の特定ができるようにセルラー
ゼ蛋白に対応するバンドを示すマークをレーンＡに隣接
する縁に付けた。

第２図から明らかなように、EG IIIはpIが高いため
に、通常は高pIキシラーゼ、高pIのβ−グルコシダーゼ
等の他の高pI系分と結び付く領域にEG IIIが存在する。
更に、第２図によればレーンＢにはEG IIIはあるがEG
I、EG IIはないことからEG IIIはEG Iの減成産物でもな
ければ、EG IIの減成産物でもないことが分かる。

実施例５ 色回復性 EG IIIセルラーゼの綿含有生地の色を回復する能力に
ついて分析した。擦り切れた綿の生地の色の鮮明度の低
下は表面の繊維が生地の上に集積することによって生じ
る。その集積した繊維のために生地が退色した艶消しの
外観を呈する。したがってその集積した繊維を取り除く
ことが、その生地の元の鮮明な色を回復するためには不
可欠である。この意味において、この実施例ではEG III
セルラーゼの表面繊維を取り除く能力を測定して、色を
回復する能力を決定した。

この実施例では二つの異なる組成物の表面繊維を取り
除く能力を比較した。第１の組成物は実施例２と同様に
して調製したほぼ純粋なEG IIIセルラーゼを含んでお
り、第２の組成物はEG IIIセルラーゼを含んでいなかっ
た。

この実施例では、0.5mlのノニオン界面活性剤を含む2
0mMのシトレート／フォスフェート緩衝液400mlずつに適
当量のセルラーゼ（もし使用するなら）を加えた。サン
プルを調製滴定し、pH6、pH7、pH8、pH9の４つのサンプ
ルを作った。得られた溶液を別々のラウンデロメータキ
ャニスター（launderometer canister）に加えた。これ
らのキャニスターに繊維除去を容易にするための大理石
を７インチx5インチの綿生地（100％線織物、200Blackf
ord ave.,Middlesex,NJ08846のTest Fabrics,Inc製スタ
イルNo.439W）とともに加えた。次に各キャニスターを
閉めて、43℃に保たれているラウンデロメータ浴に沈
め、少なくとも約40rpmで約１時間回転させた。その
後、生地を取り出して、よくすすいで、標準のドライヤ
ーで乾燥した。

このように処理した生地の繊維除去をパネルテストの
評価によって分析した。各生地は印を付けずに６人によ
って繊維のレベルを評価した。各生地の表面繊維を目視
で評価し、７の等級に分けた。各等級に対して次のよう
な見本を使用した。

全ての見本の生地は、200Blackford ave.,Middlesex,
NJ08846のTest Fabrics,Inc製の100％綿の粗布規格化試
験生地（スタイルNo.439W）であった。また各見本を処
理したセルラーゼは同一の組成であり、その濃度は総蛋
白に基づくものである。ラウンデロメータ処理条件は実
施例16と同じである。

各生地は上記見本の内で最も近いものの等級を与えら
れ、各生地に対して全員が与えた等級の値を合計し平均
値をだした。この値が小さい程繊維除去が良いことにな
る。

この分析の結果は第３図に示されている。第３図から
ほぼ純粋なEG IIIセルラーゼが酸性、中性、アルカリ性
のいずれにおいても繊維除去に寄与することが明らかで
ある。

実施例６ EG IIIのペプチド配列 蛋白質溶液（濃度1mg/ml）0.1mlに0.9mlのアセトンを
加えて、−20℃で10分間インキュベートしてEG III成分
を沈殿させた。蛋白質を遠心分離で集め、そのペレット
を乾燥し、8Mの尿素0.01mlの88％蟻酸溶液中及びシアノ
ゲンブロミド（200mg/ml）0.01mlの88％蟻酸溶液中に再
懸濁させた。その混合物を室温で４時間インキュベート
した。

個々のペプチドをHPLC（高圧液体クロマトグラフィ
ー）コラムで精製した。Synchropak RP−４コラムを0.0
5％のTEA（トリエチルアミン）と0.05％のTFAとmilliQ
水中で平衡させた。サンプルをHPLCコラムに充填し、10
0％アセトニトリル、0.05％のTEA、0.05％のTFAで１％
ん／分の勾配で溶離を行った。分離されたペプチドのア
ミノ末端基領域を完全自動装置を使用してエドマン法で
配列した。EG III成分の２つの部分から得られたアミノ
酸配列が第４図に示されている。

実施例７ トリコダーマリーゼイのpyr4誘導体選出 pyr4遺伝子はウリジンを生合成するのに必要な酵素で
あるオロチジン−５′−モノフォスフェートデカルボキ
シラーゼをコードする。毒性インヒビターの５−フルオ
ロオロチックアシッド（FOA）を自生型セルによって組
み込んでそのセルをこわした。しかしながら、pyr4遺伝
子に欠陥があるセルはこのインヒビターに耐性があり、
ウリジンに増殖を求める。そのため、FOAを使用してpyr
4誘導体変種選出が可能である。実際には、トリコダー
マリーゼイ変種RL−P37（Sheir−Neis,G.and Monteneco
urt,B.S.Appl.Microbiol.Biotechnol.20,P.46−53（198
4）参照）の胞子を2mg/mlのウリジンと1.2mg/mlのFOAを
含む固形媒質の表面にまいた。３、４日の内に自発性耐
FOAコロニーが現れ、ウリジンに増殖を求める耐FOA誘導
体を特定することができた。それらの欠陥のあるpyr4遺
伝子を特異的に有する誘導体を特定するために、原形体
を作り、自生型のpyr4遺伝子を含むプラスミドで変性し
た。変性の後、原形体を媒質のうちウリジンに塗った。
その後に変性されたコロニーの増殖があったことは、欠
陥pyr4遺伝子のプラスミドに担われたpyr4遺伝子による
補足性を示している。このようにして、変種GC−69が変
種PL−P37のpyr4誘導体であることが特定された。

実施例８ CBH I欠失ベクターの調製 CBH I蛋白をコードするcbh1遺伝子を、トリコダーマ
リーゼイ変種の遺伝子DNAから、公知のプローブ合成法
（Shoemaker等による）によってこの遺伝子の既知の配
列に基づいて設計されたオリゴヌクレオチドプローブと
のハイブリッド成形によってクローニングした。cbh1遺
伝子は6.5kb Pst I断片上にあり、公知の技法（Maniati
s等によって開示された）によってベクターのKan遺伝子
を置き換えて、Pst I断片pUC4k（NJ,PiscatawayのPharm
acia Inc.から購入）に挿入した。得られたプラスミ
ド、pUC4k::cbh1をHind IIIで切断し、約6kbの大きい方
の断片を分離し、再結紮してpUC4k::cbh1ΔH/H（第５参
照）を得た。この手順によってcbh1をコードする配列全
体とフランキング（flanking）配列の約1.2kb上流と1.5
kb下流が除かれる。元のPst I断片の両端から1kbずつの
フランキングDNAが残る。

トリコダーマリーゼイのpyr4遺伝子を上述のManiatis
等の方法にしたがってpUC18内の遺伝子DNAの6.5kbのHin
d III断片としてクローニングした。プラスミドpUC4k::
cbh1ΔH/HをHind IIIで切断し、その両端を子牛の腸の
アルカリフォスファターゼをデフォスフォリレートし
た。この末端デフォスフォリレートDNAをトリコダーマ
リーゼイのpyr4遺伝子を含む6.5kbのHind III断片と結
紮（ligate）しｐΔCBH I pyr4を得た。このプラスミド
の構造が第５図に示されている。

実施例９ 原形体の分離 約5x10⁷のトリコダーマリーゼイGC69の胞子（pyr4誘
導変種）に100mlのYEG（0.5％イーストエキス、２％グ
ルコース）を500mlのフラスコ内で接種して菌糸体を得
た。そのフラスコを振盪しながら37℃で約16時間インキ
ュベートした。2,750xgで遠心分離して菌糸体を収穫し
た。その菌糸体を1.2Mのソルビトール溶液で洗浄し、更
に5mg/mlのNovozym^R234溶液（1,3−α−グルカナーゼ、
1,3−β−グルカナーゼ、ラミナリナーゼ、キシラナー
ゼ、キチナーゼおよびプロテアーゼを含む多成分酵素系
の商品名、CT,DanburyのNovo Biolabs社製）、5mg/mlの
MgSO₄・7H₂O、0.5mg/mlの牛の血清アルブミン、および
1.2Mのソルビトールを含む溶液中に再懸濁させた。細胞
屑から原形体をMiracloth（CA,La JollaのCalbiochem C
orp.製）を使用した濾過によって取りだし、2000xgでの
遠心分離で回収した。その原形体を1.2Mのソルビトール
中で３度洗浄し、1.2Mのソルビトール、50mMのCaCl₂中
で１度洗浄し、遠心分離し、1.2Mのソルビトール、50mM
のCaCl₂1mlにつき約2x10⁸の原形体の密度で再懸濁させ
た。

実施例10 菌原形体のｐΔCBH I pyr4による変性 実施例９で調製した原形体懸濁液200μを、TE緩衝
液（10mMのTris、pH7.4、1mMのEDTA）および50μのポ
リエチレングリコール（PEG）溶液（25％PEG4000、0.6M
のKClおよび50mMのCaCl₂を含む）中で、ECOR I消化ｐΔ
CBH I pyr4（実施例８で調製）に加えた。この混合物を
氷の上で20分間インキュベートした。このインキュベー
ション期間の後、上述のPEG溶液を2.0ml加えた。そして
その溶液を更に混合して、５分間室温でインキュベート
した。この２回目のインキュベーションの後、1.2Mのソ
ルビトール、50mMのCaCl₂を含む溶液4.0mlを加え、更に
混合した。その原形体溶液を、更に１％のグルコースと
1.2Mのソルビトールと１％のアガロースとを含むフォー
ゲルの媒質Ｎ（１あたり3gのソジウムシトレート、5g
のKH₂PO₄、2gのNH₄NO₃、0.2gのMgSO₄・7H₂O、0.1gのCaC
l₂・2H₂O、５μｇのα−ビオチン、5mgのクエン酸、5mg
のZnSO₄・7H₂O、1mgのFe（NH₄）・6H₂O、0.25mgのCuSO₄
75H₂O、50μｇのMnSO₄・4H₂Oを含む）の溶融アリコート
に直ちに加えた。その原形体／媒体混合物を同じフォー
ゲルの媒質を含む固体媒質上に注いだ。その媒質にはウ
リジンが存在しないので、ｐΔCBH I pyr4内の自生型py
r4遺伝子インサートによる変種GC69のpyr4突然変異の補
足の結果として変性コロニーのみが増殖できた。これら
のコロニーを移して、１％のグルコースを添加剤として
含む固体フォーゲルの媒質Ｎ上で精製した。次の分析の
ために安定した変性種（transformant）を選んだ。

この段階では、安定した変性種は、増殖の速さと、ウ
リジンのない培養基上でのぎざぎざでない滑らかな輪郭
を持つ円形のコロニーの形成によって不安定な変性種と
区別した。その変性種を固体の非選択的培養基（すなわ
ちウリジンを含む）上で増殖させ、胞子を取って、その
胞子の内でウリジンのない選択的培養基上で発芽し増殖
するものの割合を決定することによって安定度を試験し
た場合もあった。

実施例11 変性種の分析 実施例10で得た変性種から、その変性種を液体フォー
ゲルの媒質Ｎ上で増殖させた後、DNAを分離した。その
変性種DNAサンプルをPst I制限酵素で切断し、アガロー
スゲル電気泳動にかけた。そのゲルをNytranメンブラン
フィルター上に移し、³²Pで標識したｐΔCBH I pyr4プ
ローブとの間でハイブリッドを形成した。そのプローブ
は自生のchb1遺伝子を6.5kb Pst I断片、自生のpyr4遺
伝子および変性DNA断片から誘導されるいずれかのDNA配
列であると特定するために選択された。

ハイブリッド形成からの放射性バンドをオートラジオ
グラフィーで可視化した。第７図はそのオートラジオグ
ラフを示す。５つのサンプルが上記のように処理され
た。そのサンプルをサンプルＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅとす
る。レーンＥは変性されていない変種GC69であり、この
分析においてコントロールとして使用された。レーンＡ
からＤは上述の方法で得られた変性種を表している。オ
ートラジオグラフの横の数字は分子量マーカーの大きさ
を表している。このオートラジオグラフから分かるよう
に、レーンＤは6.5kbのCBH Iバンドを含んでいない。こ
れはこの遺伝子が、DNA断片がcbh1遺伝子に組み込まれ
ることによって変性種の中から完全に除かれていること
を示している。cbh1を除去された変種はp37ΔCBH Iと呼
ばれる。第６図は一方のトリコダーマリーゼイ上のcbh1
遺伝子座におけるｐΔCBH I pyr4からの大きい方のEcoR
I断片のダブルクロスオーバーを通じた組み込みによる
トリコダーマリーゼイのcbh1遺伝子除去を概略的に示す
ものである。他の変性種の分析結果は変性されていない
コントロールと同じであった。

実施例12 p I ntCBH Iによる変性種の分析 本実施例は使用するプローブを³²Pで標識したp I ntC
BH Iプローブに変えた以外は実施例11と同様な方法で行
った。このプローブはpUC4k::cbh1ΔH/Hにおいて取り除
かれた領域内のcbh1座からの2kbのBg1 II断片を含むpUC
型プラスミドである。この実施例はサンプルＡとサンプ
ルＢの２つのサンプルについて行われた。サンプルＡは
コントロールであり変性していない変種GC69であり、サ
ンプルＢは変性種P37PΔCBH Iであった。第８図から明
らかなように、6.5kbのバンドが示すようにサンプルＡ
はcbh1遺伝子を含んでいたが、変性種サンプルＢはcbh1
遺伝子もpUCプラスミドから誘導されるどんな配列も含
んでいない。

実施例13 変性種P37PΔCBH Iによる蛋白質分泌 P37PΔCBH I変種からの胞子を１％のグルコース、0.1
4％の（NH₄）SO4、0.2％のKH₂PO₄、0.03％のMgSO₄、0.0
3％の尿素、0.75％バクトトリプトン、0.05％のTween8
0、0.000016％のCuSO₄・5H₂O、0.001％のFeSO₄・7H₂O、
0.000128％のZnSO₄・7H₂O、0.0000054％のNa₂MoO₄・2H₂
O、0.0000007％のMnCl・4H₂Oを含むトリコダーマ基礎基
質50mlに接種し、その媒質を250mlフラスコ中で振盪し
ながら、37℃で約48時間インキュベートした。得られた
菌糸体をMiraclothによる濾過によって回収し、17mMの
リン酸カリウムで２ないし３回洗った。さらにその菌糸
体をソフォローズ1mMを含む17mMのリン酸カリウム中に
懸濁させ、振盪しながら、30℃で約24時間さらにインキ
ュベートした。上澄みをこれらの培養基から回収し、菌
糸体を捨てた。その上澄みサンプルをPharmacia Phastg
el装置とpH3から９のプリキャストゲルを使用して等電
集束によって分析した。ゲルは蛋白バンドが見えるよう
に銀で汚された。第９図に示すようにcbh1蛋白に対応す
るバンドはP37PΔCBH I変種から誘導されたサンプルに
は欠けている。この等電集束ゲルはトリコダーマリーゼ
イの異なる上澄み培養基内の種々の蛋白を示している。
レーンＡは部分的に精製されたCBH I、レーンＢは変性
されていないトリコダーマリーゼイ培養基からの上澄
み、レーンＣは本発明の方法にしたがって製造されたP3
7PΔCBH I変種からの上澄みである。それぞれのセルラ
ーゼ成分の位置にCBH I、CBH II、EG I、EG II、EG III
と標識した。CBH Iは総細胞外蛋白の50％を占める主た
る分泌蛋白であるため、最も黒いバンドになっている。
この等電集束ゲルはP37PΔCBH I変種からCBH I蛋白が除
去されていることを明確に示している。

実施例14 pPΔCBH IIの調製 第10A図に模式的に示すように（Chen等の,1987,Biote
chnology,5−274−278）遺伝子DNAの4.1kbのEcoR I断片
としてクローニングされた、CBH II蛋白をコードするト
リコダーマリーゼイcbh2遺伝子をpUC4XLのEcoR I部位間
に挿入した。後者のプラスミドはpUC誘導体（Genecor I
nternational Inc.R.M.Berkaによる）であり、次に示す
ような順で並んだ制限エンドヌクレアーゼ部位の対称パ
ターンを有する多重クローニング部位を含んでいる。Ec
oR I、BamH I、Sac I、Sma I、Hind III、Xho I、Bg1 I
I、Cla I、Bg1 II、Xho I、Hind III、Sma I、Sac I、B
amH I、EcoR I 公知の方法によって、Hind III部位（CBH II翻訳開始
部位の74bp3′）とCla I部位（CBH II最後のコドンの26
5bp3′）の間の1.7kbの中央領域が除かれ、トリコダー
マリーゼイpyr4遺伝子を含む1.6kbのHind III−Cla I D
NA断片と入れ変えてなる、プラスミド、pPΔCBH II（第
10B図）を形成した。

トリコダーマリーゼイpyr4遺伝子を1.6kbのNhe I−Sp
h I断片に乗せてpTpyr2（第８図参照）から除去し、pUC
219（実施例22参照）のSph I部位とXba I部位の間に挿
入してp219M（Smith等、1991、Curr.Genet 19p.27−3
3）を作った。次に、pyr4遺伝子を、pUC219no多重クロ
ーニング部位から誘導された一端にDNAの7bpを有し、他
端に6bpを有するHind III−Cla I断片とし除去し、cbh2
遺伝子のHind III部位およびCla I部位に挿入して、プ
ラスミド、pPΔCBH II（第10B図）を形成した。

このプラスミドをEcoR Iで消化すると、cbh2座からの
0.7kbのフランキングDNAを一端に有し、cbh2座からの1.
7kbのフランキングDNAを他端に有し、トリコダーマリー
ゼイpyr4遺伝子を中央に有する断片が遊離される。

実施例15 トリコダーマリーゼイ変種GC69内のcbh2遺伝子の除去 実施例８、９で説明した方法で変種GC69の原形体を
得、EcoR I消化pPΔCBH IIで変性する。その変性種から
のDNAをEcoR IとAsp718で消化し、アガロースゲル電気
泳動にかける。そのゲルからのDNAをメンブランフィル
ター上に移し、³²Pで標識したｐΔCBH IIとの間で実施
例17の方法でハイブリットを形成した。その変性種はcb
h2座に正確に組み込まれたpPΔCBH IIからのEcoR I断片
の単一のコピーを有するものとして特定される。またそ
の変性種は実施例13において振盪フラスコ内で増殖さ
れ、培養基の上澄み内の蛋白が等電集束で調べられる。
このようにして、CBH II蛋白を産生しないトリコダーマ
リーゼイ変種GC69が形成される。

実施例16 P37PΔCBH Iのpyr4誘導体の形成 cbh1遺伝子を除された変性種（P37PΔCBH I）の胞子
をFOAを含む媒質上にまいた。次にこの変性種のpyr4誘
電体を実施例７の方法で得た。このpyr4変種はP37PΔCB
H I Pyr26と名ずけた。

実施例17 cbh1遺伝子を除去された変種のcbh2の除去 変種P37PΔCBH I Pyr26を形成し、実施例８、９で説
明した方法でEcoR I消化pPΔCBH IIで変性した。

精製された安定な変性種を実施例13と同様にして振盪
フラスコ内で培養し、上澄み内の蛋白を等電集束で調べ
た。変性種の１つ（P37PΔCBH67と命名）はCBH II蛋白
を全く産生しなかった。第９図のレーンＤは本発明の方
法で作られた、cbh1遺伝子、1bh2遺伝子の両方を除去さ
れた変性種の上澄み を示している。

DNAを変種P37PΔΔCBH67から抽出し、EcoR IとAsp718
で消化させ、アガロースゲル電気泳動にかけた。そのゲ
ルからのDNAをメンブランフィルター上に移し、³²Pで標
識したｐΔCBH IIとの間でハイブリッドを形成した。
（第11図）第11図のレーンＡは変性されていないトリコ
ダーマリーゼイ変種からのDNAのハイブリッド形成パタ
ーンを示している。自生型のcbh2遺伝子を含む4.1kbの
E.coR I断片が見られた。レーンＢは変種P37PΔΔCBH67
のハイブリッド形成パターンを示している。単一の4.1k
bバンドが消えており、ほぼ0.9と3.1kbの２本のバンド
に変わっている。これは、pPΔCBH IIからのEcoR I断片
の単一のコピーがcbh2座に正確に組み込まれたとすると
当然予想されるパターンである。

同じDNAサンプルをEcoR Iで消化させ、上述と同様に
サザン法を実行した。この実施例では、プローブとして
³²Pで標識したpIntCBH IIを使用した。このプラスミド
にはプラスミドpPΔCBH IIから除去したcbh2遺伝子のセ
グメントのcbh2遺伝子をコードする配列の一部が含まれ
ている。変種P37PΔΔCBH67からのDNAとの間にはハイブ
リッド形成が見られなかったが、これはcbh2遺伝子が除
去されており、したがってこの変種にはpUCプラスミド
から誘導された配列が存在しないことを示している。

実施例18 pEG I pyr4の形成 EG Iをコードするトリコダーマリーゼイのegl1遺伝子
を、公知の配列（Penttila等、1986,Gene 45:253−263;
van Arsdell等,1987,Bio/Technology 5:60−64）に従っ
て合成したオリゴヌクレオチドとのハイブリッド形成に
よって変種RL−P37からの遺伝子DNAの4.2kbのHind III
断片としてクローニングした。このクローンから3.6kb
のHind III−BamH I断片をとりだし、pTpyr2（実施れ８
参照）から得たトリコダーマリーゼイpyr4遺伝子と、Hi
nd IIIで切断したpCU218（pCU219と同じであるが（第22
図参照）、反対方向に多重クローニングぶいをもってい
る）とを含む1.6kbのHind III−BamH I断片と結紮し
て、プラスミドpEG I pyr4を得た（第12図）。pEG I py
rを4Hind IIIで消化させることによって、２つの遺伝子
の間の24bpの配列された合成DNAと一端の6bpの配列され
た合成DNAを除いてはトリコダーマリーゼイの遺伝子DNA
のみを含むDNA断片が遊離される（第12図参照）。

実施例19 プラスミドpEG I pyr4を含むトリコダーマリーゼイの変
種 トリコダーマリーゼイの変種RutC30（Shier−Neiss a
nd Motenecourt,（1984）,Appl.Microbiol.Biotechno
l.20:46;54）のpyr4に欠陥のある誘導体を実施例７の方
法で得た。この変種の原形体を未消化のpEG I pyr4で変
性し、安定な変性種を精製した。

これらの変種の内の５つ（EP2、EP4、EP5、EP6、EP1
1）を変性していないRutC3とともに250mlの振盪フラス
コ中で50mlのYEG媒質（イーストエキス5g/、グルコー
ス20g/）に接種して、振盪しながら28℃で２日間培養し
た。得られた菌糸体を無菌水で洗い、50mlのTSF媒質
（0.05Mのシトレート／フォスフェート緩衝液、pH5;ア
ヴィセル微晶質セルロース、10g/;KH₂PO₄、2.0g/；
（NH₄）2SO₄、1.4g/；プロテオーゼペプトン、1.0g/
；尿素、0.3g/;MgSO₄・7H₂O、0.3g/;CaCl₂、0.3g
/;FeSO₄・7H₂O、5.0mg/;MnSO₄・H₂O、1.6mg/;ZnS
O₄、1.4mg/;CoCl₂、2.0mg/;0.1％Tween80）に加え
た。これらの培養基を振盪しながら28℃でさらに４日間
インキュベートした。これらの培養基から上澄みのサン
プルを取りだし、蛋白の総量の測定をエンドグルカナー
ゼの活性の測定を以下のようにして行った。

エンドグルカナーゼの活性の測定はRomazol Brillian
t Blue−carboximethylcellulose（RBB−CMC、Australi
a North RocksのMegaZyme社性）からの可溶性の染めら
れたオリゴサッカライドの遊離に元ずいて行った。2gの
乾燥RBB−CMCを沸騰したばかりの脱イオン水80mlに激し
く撹拌しながら加えて基質を調製した。室温まで温度が
下がってから、2Mのソヂウムアセテート緩衝液（pH4.
8）を5ml加えて、pHを4.5に調整した。脱イオン水で体
積を最終的に100mlにし、アジ化ナトリウムを最終濃度
が0.02％となるように加えた。トリコダーマリーゼイコ
ントロール培養基のアリコート、pEG I pyr4変性種の培
養基上澄みのアリコート、0.1Mのソヂウムアセテート10
−20μ（ブランクとして）を試験管に入れ、250μ
の基質を加えて、その試験管を37℃で30分間インキュベ
ートした。その試験管を10分間氷の上に置き、1mlの冷
やした沈殿剤（3.3％ソヂウムアセテート、0.4％の酢酸
亜鉛、76％エタノール、塩酸でpH5に調整）を加えた。
その試験管を撹拌して、５分間放置した後、約13,000xg
で３分間遠心分離した。光学濃度を590から600nmの波長
で分光光度分析によって測定した。

使用した蛋白測定はIllinois州RockfordのPierce社製
の試薬を使用するBCA（バイシンコニン酸）測定であっ
た。標準は牛の血清アルブミンであった。BCA試薬は試
薬B1部と試薬A50部を混合して作った。1mlのBCA試薬を
適当に希釈したBSA50μもしくは測定培養基の上澄み
と混合した。37℃で30分間インキュベートし、最後に光
学濃度を562nmの波長で分光光度分析によって測定し
た。

上記測定の結果を表１にしめす。変性種のなかには変
性してない変種Rut30に比べて大量のエンドグルカナー
ゼ活性を産生したものがあるのは明白である。変性して
ないトリコダーマリーゼイによって産生されたエンドグ
ルカナーゼとエキソ−セロビオハイドロラーゼは分泌さ
れた蛋白の総量のそれぞれ約20％と70％を占めると考え
られる。それ故、EP5のような変性種は、変種Rut30の約
４倍以上のエンドグルカナーゼを産生するが、エンドグ
ルカナーゼ型蛋白とエキソ−セロビオハイドロラーゼ型
蛋白をほぼ同量ずつ分泌すると思われる。

この実施例の変性種は無傷のpEG I pyr4に用いて得ら
れ、pUCプラスミドから誘導されたゲノムに組み込まれ
たDNA配列を含んでいる。変性の前に、pEG I pyr4をHin
d IIIで消化し、トリコダーマリーゼイDNAのみを含むよ
り大きなDNA断片を分離することも出来る。この分離さ
れたDNA断片でトリコダーマリーゼイを変性するとEG I
を過剰に産生し、第12図に示した２本の短い合成DNA以
外は異種のDNA配列を含まなかったへんせいしゅを分離
できたと考えられる。またchb1遺伝子とchb2遺伝子のど
ちらか一方又は両方を除去された変種を変性するのにpE
G I pyr4を使用することも可能である。このようにし
て、EG Iを過剰に産生しエキソ−セロビオハイドロラー
ゼをほとんどまたは全く産生しない変種を形成すること
ができると思われる。

実施例19の方法によって、トリコダーマリーゼイによ
って通常作られる他のセルラーゼ成分、キシラナーゼ成
分および他の蛋白質の任意のものを過剰に産生するトリ
コダーマリーゼイの変種を作ることができると思われ
る。

上記結果は、総蛋白質に対してEG Iを成分を過剰に生
産できることを示すために掲げたものであり、過剰生産
される量を示そうとするものではない。この点に関し
て、過剰生産される量は実験の度に変われると予想され
る。

実施例20 pCEPC1の形成 EG Iをコードする配列がcbh1遺伝子からのプロモータ
ーに機能的に結合されているプラスミド、pCEPC1、を形
成した。これはcbh1遺伝子とcbh2遺伝子のDNAはい列を
変えて、それぞれの翻訳開始部位のすぐ５′末端側（上
流）に便利な制限エンドヌクレアーゼクリーヴィッジ部
位を作るために生体外部特異的ミュータゲネシス（muta
genesis）を使用してなされた。２つのDNAのセグメント
の結合部における予想される配列を実証するためにDNA
配列分析をした。その変更が第13図に示されている。

pCEPC1を形成するために組み合わされたDNA断片はpUC
4kのEcoR I部位の間に挿入され、次の通りであった（第
14図参照）。

Ａ）cbh1座の５′フランキング領域からの2.1kbの断
片。これはプロモーター領域を含み、操作されたBc1 I
部位まで延び、cbh1をコードする配列を含んでいない。

Ｂ）操作されたBamH I部位を有する５′末端から始ま
り、コード領域を通って延びるとともに翻訳終結コドン
を越えた約0.5kbを含むegl1座からのゲノムDNAの1.9kb
の断片。その断片の３′末端には、pUC218多重クローニ
ング部位から誘導された18bpとこの断片を下記の断片と
リンクするのに使用される15bpの合成オリゴヌクレオチ
ドがある。

Ｃ）約1kb下流の位置からcbh1翻訳終結コドンの約2.5kb
下流まで延びる、cbh1座の３′フランキング領域からの
DNA断片。

Ｄ）断片（Ｃ）のNhe I部位に挿入されたのは、pTpyr2
（実施例８）から得られたトリコダーマリーゼイpyr4遺
伝子を含むとともに一端にpUC218多重クローニング部位
から誘導された24bpのDNAを有するDNAの3.1kbのNhe I−
Sph I断片であった。

プラスミドpCEPC1は、ホスト変種に外部のDNAを持ち
込まずにCBH IIをコードする配列を置き換えてEG Iコー
ド配列をcbh1座に組み込むように設計されている。EcoR
Iによってこのプラスミドを消化すると、cbh1プロモー
ター領域、gel1コード配列、egl1転写終結領域トリコダ
ーマリーゼイpyr4遺伝子およびcbh1座の３′（下流）フ
ランキング領域からのDNAセグメント（第13図参照）を
含む断片が遊離する。

実施例21 pCEPC1DNAを含む変性種 トリコダーマリーゼイの変種RutC30（Shier−Neiss前
出）のpyr4に欠陥のある誘導体を実施例７の方法で得
た。この変種をEcoR Iで消化されたpCEPC1で変性した。
安定な変性種を選択して実施例19で述べたようにセルラ
ーゼを作るために振盪フラスコ内で培養した。そのセル
ラーゼ可視化するために等電集束ゲル電気泳動を実施例
13に記載の方法でこれらの培養基からのサンプルに対し
て行った。このようにして分析した計23の変性種の内12
はCBH I蛋白を生産しなかった。これはcbh1座にCEPC1DN
Aを組み込んだことによる予想通りの結果である。サザ
ン法を使用して、組み込みがこれらと変性種のいくつか
で確かに起きたことを確認し、バクテリアプラスミドベ
クター（pUC4K）から誘導された配列が存在しない（第1
5図参照）ことを確認した。この分析のために、変性種
からのDNAを、電気泳動を行いメンブランフィルターに
移す前に、Pst Iで消化させた。得られたサザンブロッ
トを放射線標識したプラスミドpUC4k::cbh1（第８図参
照）でプローブした。そのプローブは変性されていない
コントロール培養基からのDNAの6.5kb断片上のcbh1遺伝
子とハイブリッド形成した。cbh1座にDNAのCEPC1断片を
組み込むと、この6.5kbバンドが失われ、約1.0kb、2.0k
b、3.5kbのDNA断片に対応する他の３つのバンドが現れ
ると予想される。これは第15図のレーンＣに示す変性種
について観察されたパターンそのものである。また第15
図のレーンＢはcbh1座以外のゲノム内の部位にpCEPC1の
複数のコピーが組み込まれた変性種の例である。

変性されていない培養基と変性種の上澄みのサンプル
に対して、各サンプルの蛋白質濃度がほぼ0.03mg/mlか
ら0.07mg/mlとなるようにそれらを前もって50倍に希釈
した以外は実施例19と全く同様にしてエンドグルカナー
ゼ活性を測定した。変性されていないコントロール培養
基と４つの異なる変性種（CEPC1−101、CEPC1−103、CE
PC1−105、CEPC1−112）に対して行った測定の結果を表
２にしめす。CEPC1−105とCEPC1−112はCEPC1断片の組
み込みがCBH I産出の欠失につながった例である。

上記結果は、総蛋白質に対してEG I成分を過剰に生産
できることを示すために掲げたものであり、過剰生産さ
れる量を示そうとするものではない。この点に関して、
過剰生産される量は実験の度に変わると予想される。

egl1遺伝子を置き換える他のどのトリコダーマリーゼ
イ遺伝子を有するpCEPC1に似たプラスミドを形成するこ
とも可能である。これによって、他の遺伝子を過剰生産
させると同時にcbh1遺伝子を除去することができる。

また他の遺伝子、例えば、cbh2を予め除去されたトリ
コダーマリーゼイのpyr4誘導変種をpCEPC1で変性して、
例えば、エキソ−セロビオハイドロラーゼを生産せず、
エンドグルカナーゼを過剰生産する変性種を形成するこ
とも可能である。

pCEPC1に似た構造であるが、トリコダーマリーゼイの
他の遺伝子座からのDNAがcbh1遺伝子座からのDNAに置き
換わっている構造を使用すると、トリコダーマリーゼイ
ゲノムの他の遺伝子座にある他のプロモーターの制御下
で遺伝子を挿入することが可能である。

実施例22 pEG II::P−１の形成 EG II（かつ7EG IIIと呼ばれたこともある）をコード
するegl3遺伝子をトリコダーマリーゼイと公知のDNA配
列（Saloheimo等,1988,Gene63:11−21）からクローニン
グした。変種RL−P37からpUC219のPst I部位とXho I部
位の間に挿入されたゲノムDNAの約4kbのPst I−Xho I断
片として遺伝子を得た。後者のベクター、pUC219、は多
重クローニング部位をBg1 II、Cla I、Xho Iの制限部位
を含むように拡大することによって、pUC119（Wilson等
によって述べられている、1989,Gene77:69−78）から誘
導される。公知の技法によって、ゲノムDNAの2.7kbのSa
l I断片上にあるトリコダーマリーゼイのpyr4遺伝子をE
G IIコード配列内のSal I部位に挿入しプラスミドpEG I
I::P−１（第16図）を形成した。これによってどの配列
も除去することなくEG IIコード配列をこわした。プラ
スミドpEG II::P−１はHind IIIとBamH Iに消化され
て、一端の5bpと他端の16bp（ともにpUC219の多重クロ
ーニング部位から誘導される）を除いてはトリコダーマ
リーゼイだけから誘導されるDNAの直線断片を生じる。

実施例23 pEG II::P−１でのトリコダーマリーゼイGC69の変性に
よってEG IIを生産できない変種を作る トリコダーマリーゼイの変種GC69をHind IIIとBamH I
に消化されたpEG II::P−１で変性し、安定な変性種を
選ぶ。全DNAをその変性種から分離し、pyr4遺伝子とegl
3遺伝子を含むDNA断片がgel3座に組み込まれてEG IIコ
ード配列をこわしている変性種を特定するためにサザン
法を実施した。その変性種はEG IIを生産できない。cbh
1、cbh2、gel1遺伝子の１つまたは全部が除去されてい
る変種を変性するのにもpEG II::P−１を使用すること
ができる。このようにして、あるセルラーゼ成分のみを
生産し、EG II成分を生産しない変種を作ることができ
る。

実施例24 pEG II::P−１でのトリコダーマリーゼイの変性によっ
てCBH I、CBH II、EG IIを生産できない変種を作る 実施例７の方法によって変種P37PΔΔCBH67（実施例1
7で得た）のpyr4の欠けた誘導体を得た。この変種P37P
ΔΔCBH67をHind IIIとBamH Iに消化されたpEG II::P−
１で変性し、安定な変性種を選んだ。全DNAをその変性
種から分離し、pyr4遺伝子とegl3遺伝子を含むDNA断片
がgel3座に組み込まれてEG IIコード配列をこわしてい
る変性種を特定するためにサザン法を実施した。第17図
に示されているサザンブロットをpUC18のPst I部位にク
ローンされた後、再分離されていたegl3遺伝子を含むト
リコダーマリーゼイDNAの約4kbのPst I断片でプローブ
した。変種P37PΔΔCBH67P1から分離されたDNAをサザン
法のためにPst Iで消化すると、egl3座がオートラジオ
グラフ上に単一の4kbバンド（第17図、レーンＥ）とし
て見えた。しかしながら、gl3を破壊された変性種の場
合は、このバンドは失われ、予想通り２本の新しいバン
ド（第17図、レーンＦ）に変わっていた。もしDNAがEco
R VまたはBg1 IIに消化されていると、egl3遺伝子に対
応するバンドは変性されていないP37PΔΔCBH67P1変種
（レーンＡとＣ）′gel3を破壊された変性種（第17図、
レーンＢとＤ）との間で、約2.7kb（挿入されたpyr4断
片の大きさ）拡大されている。第17図に示す破壊された
egl3遺伝子を含む変性種はA22と命名された。第17図に
特定された変性種はCBH Iも、CBH IIも、EG IIもを生産
できない。

実施例25 pPΔEG I−１の形成 トリコダーマリーゼイの変種RL−P37のegl1遺伝子を
実施例18のようにしてゲノムDNAの4.2kbのHind III断片
として得た。この断片をpUC100（pUC18の誘導体、Yanis
ch−Perron等、1985,Gene33:103−119、多重クローニン
グ部位に挿入されてBg1 II、Cla I、Xho Iの制限部位を
増加させるオリゴヌクレオリドを有する）のHind III部
位に挿入した。公知の技法を用いて、EG Iコード配列の
中央に近い位置からそのコード配列の３′端を越える位
置まで延べる約1kbのEcoR V断片を除去し、pyr4遺伝子
を含むトリコダーマリーゼイDNAの3.5kbのCla I断片と
置き換えた。得られたプラスミドをpPΔEG I−１（第18
図参照）と命名した。

プラスミドpPΔEG I−１はHind IIIで消化されて、ど
ちらか一端にeg1l遺伝子のセグメントを有し、EG Iコー
ド配列の一部に置き換わったpyr4遺伝子を中央に有する
トリコダーマリーゼイのゲノムDNAのみからなるDNA断片
を遊離する。

Hind IIIで消化されたpPΔEG I−１で適当な、pyr4の
欠けたトリコダーマリーゼイ変種の変性によって、ある
変性種ではこのDNA断片をeg1l座に組み込む結果にな
る。このようにして、EG Iを生産できない変種がえられ
る。

実施例26 ＰΔEG I pyr−３の形成とpyr4の欠けたトリコダーマリ
ーゼイ変種の変性 実施例25の方法によって、EG I遺伝子を不活性に出来
るのではないかと言う予測がこの実施例によって強めら
れた。この場合には、Asoergillus niger pyr4遺伝子が
選択可能なマーカーとしてトリコダーマリーゼイpyr4遺
伝子に置き換わっている以外はpPΔEG I−１に似ている
ＰΔEG I pyr−３を形成した。この場合、egl1遺伝子し
はpUC100のHind III部位に挿入された4.2kbのHind III
断片として存在した。同じ1kbの内部EcoR V断片がpPΔE
G I−１の形成中に（実施例25参照）除去されたが、こ
の場合には、クローンされたAsoergillus niger pyrG遺
伝子（Wilson等、1988,Nucl.Acids Res.16p.2339）を含
む2.2kbの断片によって置き換えられた。Hind IIIに消
化されて、egl1座からのフランキング領域を有するpyrG
遺伝子を含む断片を遊離した後に、トリコダーマリーゼ
イのpyr4遺伝子の欠けた変種をＰΔEG I pyr−３によっ
て変性すると、egl1遺伝子の破壊された変性種が得られ
る。これらの変性種は、Hind IIIに消化された変性種DN
Aのサザン法による分析によって認識し、放射線標識さ
れたＰΔEG I pyr−３によってプローブした。トリコダ
ーマリーゼイの変性されていない変種においては、egl1
遺伝子はDNAの4.2kbのHind III断片に存在した。しかし
ながら、その後、ＰΔEG I pyr−３からの望ましい断片
の組込みによって、egl1遺伝子を除去すると、この4.2k
bの断片が消え、約1.2kb大きい断片に置き換わった（第
19図、レーンＡ）。第19図のレーンＢはcbh1座以外のゲ
ノム内の部位にpPΔEG I pyr−３の単一のコピーが組み
込まれた変性種の例である。

実施例27 pPΔEG I−１でのトリコダーマリーゼイの変性によって
CBH I、CBH II、EG I、EG IIを生産できない変種を作る 実施例７の方法によって変種A22（実施例24で得た）
のpyr4の欠けた誘導体を得る。Hind IIIに消化されてど
ちらか一端にeg1l遺伝子のセグメントを有するとともに
EG Iコード配列の一部に置き換わったpyr4遺伝子を有す
るトリコダーマリーゼイのゲノムDNAのみからなるDNA断
片を遊離したpPΔEG I−１でこの変種を変性する。

安定なpur4＋変性種を選び、全DNAをその変性種から
分離する。pyr4遺伝子とegl1遺伝子を含むDNA断片がgel
1座に組み込まれてEG Iコード配列をこわしている変性
種を特定するためにサザン法を実施した後、³²Pで標識
したpPΔEG I−１でプローブする。特定された変性種は
CBH Iも、CBH IIも、EG Iも、EG IIもを生産できない。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ワイス，ジェフリー エル アメリカ合衆国 カリフォルニア州 94117 サンフランシスコ ブエナ ヴ ィスタ アヴェニュー 457 (72)発明者 レアナス，エドマンド エイ アメリカ合衆国 カリフォルニア州 94038 モス ビーチ ネヴァダ 301 (56)参考文献 国際公開89／9259（ＷＯ，Ａ１) Ｇｅｎｅ，（1987），Ｖｏｌ．51，Ｎ ｏ．１，ｐ．43−52 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C11D 3/386 C12N 9/42 D06L 1/12 - 1/22 D06M 16/00 ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (12)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】洗浄有効量の界面活性剤または界面活性剤
   混合物と、約0.01から約5wt％のほぼ純粋なEG IIIセル
   ラーゼからなる洗剤組成物。
2. 【請求項２】前記ほぼ純粋なEG IIIセルラーゼが前記洗
   剤組成物の約0.05から約2wt％をしめることを特徴とす
   る請求の範囲第１項記載の洗剤組成物。
3. 【請求項３】CBH I型成分を全く含まないことを特徴と
   する請求の範囲第１項記載の洗剤組成物。
4. 【請求項４】CBH型成分を全く含まないことを特徴とす
   る請求の範囲第３項記載の洗剤組成物。
5. 【請求項５】綿を含有する生地の柔らかさを高める方法
   であって、洗浄有効量の界面活性剤または界面活性剤混
   合物と、約0.01から約5wt％のほぼ純粋なEG IIIセルラ
   ーゼからなる洗剤組成物から得られる洗濯媒体でその生
   地を洗うことを特徴とする方法。
6. 【請求項６】前記ほぼ純粋なEG IIIセルラーゼが前記洗
   剤組成物の約0.05から約2wt％をしめることを特徴とす
   る請求の範囲第５項記載の方法。
7. 【請求項７】前記洗剤組成物がCBH I型成分を全く含ま
   ないことを特徴とする請求の範囲第５項記載の方法。
8. 【請求項８】前記洗剤組成物がCBH型成分を全く含まな
   いことを特徴とする請求の範囲第７項記載の方法。
9. 【請求項９】綿を含有する生地の色を保ちかつ回復する
   方法であって、洗浄有効量の界面活性剤または界面活性
   剤混合物と、約0.01から約5wt％のほぼ純粋なEG IIIセ
   ルラーゼからなる洗剤組成物から得られる洗濯媒体でそ
   の生地を１度ないし数度洗うことを特徴とする方法。
10. 【請求項１０】前記ほぼ純粋なEG IIIセルラーゼが前記
    洗剤組成物の約0.05から約2wt％をしめることを特徴と
    する請求の範囲第９項記載の方法。
11. 【請求項１１】前記洗剤組成物がCBH I型成分を全く含
    まないことを特徴とする請求の範囲第９項記載の方法。
12. 【請求項１２】前記洗剤組成物がCBH型成分を全く含ま
    ないことを特徴とする請求の範囲第11項記載の方法。