DE68911131T2

DE68911131T2 - Cellulosezubereitung.

Info

Publication number: DE68911131T2
Application number: DE89904527T
Authority: DE
Inventors: Kirsten Boegh; Martin Schuelein
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novo Nordisk AS
Priority date: 1988-03-24
Filing date: 1989-03-22
Publication date: 1994-03-31
Anticipated expiration: 2009-03-23
Also published as: JPH03504080A; WO1989009259A1; DE68911131D1; EP0406314B1; US5691178A; JP2728531B2; EP0406314A1

Description

ERFINDUNGSGEBIET

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Cellulasezubereitung, die nützlich ist zur Verringerung der Härte von baumwollhaltigen Geweben und zur Verringerung der Geschwindigkeit, mit der solche Gewebe hart werden. Die Erfindung betrifft außerdem einen Waschmittelzusatzstoff, der die Cellulasezubereitung umfaßt, eine Waschmittelzusammensetzung, die die Cellulasezubereitung enthält, sowie ein Verfahren zur Behandlung baumwollhaltiger Gewebe mit der Cellulasezubereitung.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Es ist in der Technik gut bekannt, daß wiederholtes Waschen von baumwollhaltigen Geweben im allgemeinen eine ausgeprägte, unangenehme Härte im Gewebe verursachen, und mehrere Verfahren zur Überwindung dieses Problems sind bereits früher in der Technik vorgeschlagen worden. Zum Beispiel lehrt US 1.368.599 von Unilever Ltd. die Verwendung cellulytischer Enzyme zur Verringerung der Härte von baumwollhaltigen Geweben. Auch US 4.435.307 (von Novo Industri A/S) lehrt die Verwendung eines cellulytischen Enzyms, das aus Humicola insolens gewonnen ist, sowie einer Fraktion desselben, bezeichnet mit ACXI, als ein die Härte verringernder Waschmittelzusatzstoff. Andere Anwendungen von cellulytischen Enzymen, die in der Technik erwähnt sind, betreffen Schmutzentfernung aus und Farbklärung von Gewebe (vgl. zum Beispiel EP 220 016).
Obgleich die Verwendung cellulytischer Enzyme zur Härteverringerung von baumwollhaltigen Geweben vor nahezu 20 Jahren vorgeschlagen und nachgewiesen wurde, ist der Mechanismus dieses Prozesses nicht aufgeklärt worden und ist im Detail immer noch nicht bekannt. Unter anderem beruht dies auf der Vielfalt der Enzyme und der betroffenen enzymkatalysierten Reaktionen. Tatsächlich sind Cellulasen, die in der Natur z.B. durch mikrobielle Spezies erzeugt werden, in der Tat komplexe Gemische cellulytischer Enzyme. Demgemäß ist die Umwandlung natürlich auftretender Materialien, wie Baumwolle, katalysiert durch Cellulasen, im Detail überaus schwierig zu analysieren.
Wegen dieser Umstände hat die praktische Ausnutzung enzymatischer Härteverringerung und -verhinderung, obgleich wünschenswert, keine breite Anwendung und große praktische Bedeutung bekommen: es ist schwierig, die Produktion multipler Enzymsysteme zu optimieren und so industrielle kosteneffektive Produktion cellulytischer Enzyme zu implementieren, und ihre tatsächliche Verwendung ist durch Schwierigkeiten behindert worden, die aus der Notwendigkeit herrühren, ziemlich große Mengen der cellulytischen Enzyme anzuwenden, um die gewünschte Verringerung und Verhinderung der Härte von Baumwollgeweben zu erreichen: zum Beispiel ist die Zugabe großer Mengen der Enzyme zu Waschmittelzusammensetzungen nicht verträglich mit der optimalen Funktion anderer Bestandteile in der Waschmittelformulierung, noch ist die Zugabe sehr großer Mengen von Enzymen zur Waschmittelzusammensetzung im Interesse zum Beispiel der Verbrauchersicherheit.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Wir haben festgestellt, daß enzymatisches Weichmachen von cellulosehaltigen Geweben, in erster Linie baumwollhaltigen Geweben, sowie Schmutzentfernung und Farbklärung überraschenderweise von einer Cellulasefraktion bereitgestellt werden kann, die in Endoglucanase-Aktivität angereichert ist.
Demgemäß betrifft die vorliegende Erfindung eine Cellulasezubereitung, die wenigstens 50% (bezogen auf das Gewicht des Gesamtcellulasegehaltes) einer homogenen Endoglucanase-Komponente umfasst, die von einem Pilz oder einen anderen Bakterium als Bacillus produziert ist, wobei diese Komponente die folgenden Eigenschaften zeigt
(a) eine CMC-Endoase-Aktivität [definiert als die Endoglucanase-Aktivität der Endoglucanase-Komponente als ihre Fähigkeit, die Viskosität einer Carboxymethylcellulose(CMC)-Lösung zu verringern, wie bestimmt durch Herstellen einer Substratlösung von 35 g/l CMC in 0,1 M Tris- Puffer bei pH 9,0, Lösen einer Probe der Cellulasezubereitung in selben Puffer, Vermischen von 10 ml der Substratlösung und 0,5 ml der Enzymlösung und Überführen der Mischung in ein Viskosimeter, das bei 40ºC thermostatisiert ist, wobei 1 Einheit CMC-Endoase-Aktivität als die Enzymmenge definiert ist, die die Viskosität der CMC-Lösung nach 30 Minuten auf die Hälfte verringert] von wenigstens 5 CMC- Endoase-Einheiten pro mg Gesamtprotein,
(b) eine CAVU-Aktivität [definiert als die Affinität der Endoglucanase-Komponente für Cellulose, wie bestimmt durch Zugeben von etwa 50 CMC-Endoase-Einheiten in 10 ml Tris- Puffer, pH 9,0, zu 2,5 g Avicel, Rühren der resultierenden Suspension für 30 Minuten bei Raumtemperatur, Zentrifugieren für 10 Minuten bei 3000 UPM und Messen der CMC-Endoase- Aktivität des resultierenden Überstands, wobei die % CAVU- Aktivität berechnet werden als die Differenz zwischen der Gesamt-CMC-Endoase-Aktivität der ursprünglichen Lösung und derjenigen des Überstands, geteilt durch die Gesamt-CMC- Endoase-Aktivität und multipliziert mit 100] von wenigstens 50% unter alkalischen Bedingungen,
(c) ein pH-Optimum bei einem pH von etwa 7,5 - 10, und
(d) eine Cellobiohydrolase-Aktivität unter 0,5 PNP-Cel/mg.
Es sollte angemerkt werden, daß die Endoglucanase-Komponente, die in der Cellulasezubereitung der Erfindung vorliegt, eine ist, die (im Hinblick auf CMC-Endoase- und CAVU-Aktivität) unter alkalischen Bedingungen aktiv ist. Wie oben angegeben, ist die Endoglucanase-Komponente eine, die ein pH-Optimum bei einem pH von etwa 7,5 - 10 besitzt. Im Gegensatz zu mehreren bekannten Cellulasen, die bei einem sauren pH aktiv und bei alkalischen pH-Werten relativ inaktiv sind, macht dieses Charakteristikum die Cellulasezubereitung der vorliegenden Erfindung besonders nützlich für Waschzwecke, insbesondere als ein Bestandteil in einer Waschmittelzusammensetzung, da das Waschen von Kleidungsstücken wegen der Alkalität der meisten Waschdetergentien typischerweise unter alkalischen Bedingungen durchgeführt wird. Alkalophile Cellulasen sind bekannt z.B. aus EP 271 004, die alkalische Cellulasen beschreibt, die aus Bacillus sp. gewonnen sind. Von diesen Cellulasen ist angegeben, daß sie eine hohe Aktivität auf niedrigkristalliner Cellulose besitzen. Cellulasezubereitungen, die eine Endoglucanase-Komponente besitzen, die aus einem Pilz oder einem anderen Bakterium als Bacillus gewonnen ist und die eine hohe Affinität zu Cellulose unter alkalischen Bedingungen zeigt, werden jedoch als neuartig erachtet.
Die Feststellung, daß eine bestimmte Endoglucanase-Komponente von Cellulase verantwortlich ist für das Erweichen von baumwollhaltigen Geweben, ist von beträchtlicher praktischer Bedeutung: sie erlaubt eine kosteneffektive Produktion von gewebeerweichenden cellulytischen Enzymen, z.B. durch Einsatz rekombinanter DNA-Techniken zur Herstellung der aktiven Komponente, sie macht die tatsächliche effektive Anwendung dieser Enzyme möglich und sie erlaubt eine Identifizierung cellulytischer Enzyme mit einer hohen Affinität zu Cellulose zur Verwendung als Gewebeweichmacher.

DETAILLIERTE OFFENBARUNG DER ERFINDUNG

Bevorzugte Cellulasezubereitungen der Erfindung sind diejenigen, in denen die Endoglucanase-Komponente eine CMC- Endoase-Aktivität von über etwa 10, insbesondere über etwa 15, CMC-Endoase-Einheiten pro mg Gesamtprotein zeigt. Insbesondere zeigt die Endoglucanase-Komponente eine CMC-Endoase-Aktivität von etwa 50 oder mehr CMC-Endoase-Einheiten pro mg Gesamtprotein. Andere bevorzugte Cellulasezubereitungen sind diejenigen, in denen die Endoglucanase-Komponente eine CAVU- Aktivität von über etwa 65%, insbesondere über etwa 75% zeigt. Besonders bevorzugte Cellulasezubereitungen sind diejenigen, in denen die Endoglucanase-Komponente eine hohe CMC-Endoase- Aktivität gleichzeitig mit einer hohen CAVU-Aktivität zeigt.
Die CMC-Endoase(Endoglucanase)-Aktivität kann aus der Viskositätabnahme von CMC wie folgt bestimmt werden:
Eine Substratlösung wird hergestellt, die 35 g/l CMC (Hercules 7 LFD) in 0,1 M Tris-Puffer bei pH 9,0 enthält. Die zu analysierende Enzymprobe wird im selben Puffer gelöst.
10 ml Substratlösung und 0,5 ml Enzymlösung werden vermischt und in ein Viskosimeter überführt (z.B. Haake VT 181, NV- Sensor, 181 UPM) , das bei 40ºC thermostatisiert ist.
Viskositätsablesungen werden so schnell wie möglich nach dem Vermischen und noch einmal 30 Minuten später vorgenommen. Die Enzymmenge, die die Viskosität unter diesen Bedingungen auf die Hälfte verringert, wird definiert als 1 Einheit CMC- Endoase-Aktivität.
Die Affinität von Endoglucanasen gegenüber Cellulosefasern (die "CAVU-Aktivität") kann bestimmt werden durch Messung der Bindung der Enzyme an ein cellulosehaltiges Material unter alkalischen Bedingungen. Diese Aktivitätsmessung kann wie folgt durchgeführt werden:
Zunächst wird die CMC-Endoase-Aktivität wie oben beschrieben bestimmt. Dann werden etwa 50 CMC-Endoase-Einheiten in 10 ml Puffer (0,1 M Tris pH 9,0) in einem 25 ml-Becherglas auf 2,5 g Avicel (Merck Art. 2330) aufgebracht. Die resultierende Suspension wird für 30 Minuten bei Raumtemperatur unter Verwendung eines Magnetrührers gerührt und dann für 10 Minuten bei 3000 UPM zentrifugiert, woraufhin die CMC-Endoase- Aktivität des resultierenden Überstands gemessen wird. Schließlich werden die % CAVU-Aktivität berechnet als die Differenz zwischen der Gesamt-CMC-Endoase-Aktivität, der ursprünglichen Lösung und des Überstands, geteilt durch die Gesamt-CMC-Endoase-Aktivität, und multipliziert mit 100.
Gemäß den Prinzipien der vorliegenden Erfindung ist es ein Vorteil, daß die Cellulasezubereitung so gereinigt wie möglich ist, d.h. daß ihr Gehalt an der Endoglucanase-Komponente so hoch wie möglich ist, so daß eine geringere Menge der Zubereitung für die Erweichung baumwollhaltiger Gewebe erforderlich ist, als dies der Fall bei bekannten Cellulasen ist. Besonders bevorzugte Cellulasezubereitungen der Erfindung sind diejenigen, die etwa 90% oder mehr der geeigneten Endoglucanase-Komponente umfassen.
Cellulasezubereitungen gemäß dieser Erfindung können aus Pflanzen und Mikroorganismen gewonnen werden, in denen Endoglucanasen in geringen Mengen zusammen mit einer breiten Vielzahl anderer cellulytischer Enzyme vorliegen können.
Beispiele für Bakterien und Pilze, aus denen potentiell interessante cellulytische Enzyme isoliert werden können, sind in GB 2094826A, S. 3, Zeile 35, bis S. 6, Zeile 7, aufgelistet. Um Cellulasezubereitungen der Erfindung zu gewinnen, müssen rohe Cellulasen ausgedehnten Reinigungsverfahren gemäß den in der Technik bekannten Prinzipien unterzogen werden. Zur industriellen Produktion der Cellulasezubereitungen gemäß der Erfindung ist es bevorzugt, rekombinante DNA-Techniken oder andere Techniken einzusetzen, einschließlich Einstellungen von Fermentationen, Mutation der betroffenen Mikroorganismen, um Überproduktion der gewünschten enzymatischen Aktivitäten sicherzustellen, oder Entwicklung von Verfahren zur Reinigung der Endoglucanase-Komponente im Großmaßstab. Solche Verfahren und Techniken sind in der Technik bekannt und können von den Fachleuten auf diesem Gebiet ohne weiteres durchgeführt werden. In den folgenden Beispielen sind einige spezielle Beispiele für Reinigungstechniken angegeben, die verwendet werden können, um Enzyme zu liefern, die gemäß dem Verfahren der Erfindung eingesetzt werden sollen. Aus den Beispielen wird deutlich, daß Ionenaustauschchromatographie, Ausstauschchromatographie und fraktionierte Ausfällung Techniken sind, die zu großem Vorteil verwendet werden können.
Die Endoglucanase-Komponente, die in der Cellulasezubereitung der Erfindung vorliegt, kann eine sein, die von einem Pilz produzierbar ist. Wir haben festgestellt, daß Cellulasezubereitungen mit einer hohen CMC-Endoase- und CAVU- Aktivität leicht isoliert werden können aus Spezies von Humicola, wie etwa Humicola insolens, z.B. Stamm DSM 1800, hinterlegt am 1. Oktober 1981 bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen, Mascheroder Weg 1B, D-3300 Braunschweig, BRD, in Übereinstimmung mit den Bestimmungen des Budapester Vertrages über die Internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zwecke von Patentverfahren (der Budapester Vertrag).
Demgemäß betrifft die vorliegende Erfindung weiter eine Cellulasezubereitung, die eine durch Kultivierung eines Stammes von H. insolens herstellbare Cellulase enthält, wobei die Cellulase über etwa 40%, vorzugsweise über 90% bezogen auf des Gesamtprotein, bestimmt aus der OD bei 280 nm) einer Endoglucanase-Komponente mit den folgenden Eigenschaften umfaßt:
a) ungefähres Molekulargewicht von etwa 65 kD (bestimmt durch SDS-Page)
b) isoelektrischer Punkt von etwa 8,5 - 9,5
c) Endoglucanase-Aktivität über etwa 50 CMC-Endoase- Einheiten/mg Gesamtprotein
d) eine Cellobiohydrolase-Aktivität unter 0,5 PNP-Cel/mg
e) immunologische Reaktion mit polyspezifischem Antikörper, gezüchtet gegen eine Cellulase, die aus Humicola insolens DSM 1800 gewonnen ist
(wobei Cellobiohydrolase-Aktivität als die Aktivität gegenüber Cellobiose-p-Nitrophenyl (PNP-Cel) definiert ist, die bestimmt wird, wie unten beschrieben).
Ein anderer bevorzugter Mikroorganismus, aus dem Enzyme isoliert werden können, die gemäß der Erfindung eingesetzt werden können, sind Stämme von Fusarium, wobei Fusarium oxysporum bevorzugt ist, z.B. der Stamm DSM 2672, hinterlegt am 6. Juni 1983 bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen in Übereinstimmung mit den Bestimmungen des Budapester Vertrages.
Ein weiterer bevorzugter Mikroorganismus, aus dem die obengenannten Enzyme isoliert werden können, ist ein Stamm von Myceliopthora, wobei Myceliopthora thermophile besonders bevorzugt ist.
Andere mögliche Quellen von Enzymen, die gemäß der Erfindung verwendet werden sollen, sind Spezies von Erwinia, z.B. Stämme von Erwinia chrysanthermi, beschrieben von M.H. Boyer et. al. in European Journal of Biochemistry, Bd. 162, Seite 311-316 (1987).
Weitere mögliche Quellen von Enzymen sind Spezies von Microbispora, z.B. Microbispora bispora, Spezies von Neocallimastix, wie etwa Neocallimastix frontalis, Spezies von Pirononas, z.B. Piromonas communis, oder Spezies von Robillarda.
Wenn die Endoglucanase-Komponente eine ist, die von einem Bakterium produziert ist, kann sie aus z.B. einer Spezies von Streptomyces, oder Clostridium, wie etwa Clostridium thermocellum, gewonnen werden.
Die Endoglucanase-Komponente kann außerdem eine sein, die mit einem Verfahren herstellbar ist, welches Kultivieren einer Wirtszelle, die mit einem rekombinanten DNA-Vektor transformiert ist, der eine DNA-Sequenz trägt, die besagte Endoglucanase-Komponente kodiert, sowie DNA-Sequenzen, die Funktionen kodieren, die die Expression der DNA-Sequenz, die die Endoglucanase-Komponente kodiert, erlauben, in einem Kulturmedium unter Bedingungen, die die Expression der Endoglucanase-Komponente erlauben, und Gewinnen der Endoglucanase-Komponente aus der Kultur umfasst.
Ein DNA-Fragment, das die Endoglucanase-Komponente kodiert, kann z.B. durch Aufbau einer cDNA- oder Genombibliothek eines Cellulase-produzierenden Mikroorganismus, wie etwa eines der oben erwähnten Organismen, und Screening auf positive Klone mit herkömmlichen Verfahren, wie etwa durch Hybridisierung von Oligonucleotidsonden, die auf der Basis der vollständigen oder teilweisen Aminosäuresequenz der Endoglucanase synthetisiert sind, oder durch Selektieren auf Klone, die die geeigneten Enzym-Aktivität exprimieren (d.h. CMC-Endoase- und CAVU- Aktivität, wie oben definiert) oder durch Selektieren auf Klone, die ein Protein produzieren, das mit einem Antikörper gegen eine native Cellulase(Endoglucanase)-Komponente reaktiv ist, isoliert werden.
Einmal ausgewählt, kann die DNA-Sequenz in einen geeigneten replizierbaren Expressionsvektor inseriert werden, der geeignete Promotor-, Operator- und Terminator-Sequenzen, die erlauben, daß die Endoglucanase in einem bestimmten Wirtsorganismus exprimiert werden kann, sowie einen Replikationsursprung umfaßt, der ermöglicht, daß der Vektor im fraglichen Wirtsorganismus repliziert.
Der resultierende Expressionsvektor kann dann in eine geeignete Wirtszelle, wie etwa eine Pilzzelle, transformiert werden, für die ein bevorzugtes Beispiel eine Spezies von Aspergillus ist, am bevorzugtesten Aspergillus oryzae oder Aspergillus niger. Pilzzellen können mit einem Verfahren transformiert werden, das Protoplastenbildung und Transformation der Protoplasten, gefolgt von Regeneration der Zellwand in einer per se bekannten Art und Weise umfaßt. Die Verwendung von Aspergillus als einem Wirtsmikroorganismus ist beschrieben in EP 238,023 (von Novo Industri A/S), dessen Inhalt hierdurch durch Bezugnahme miteinbezogen wird.
Alternativ können die Wirtsorganismen ein Bakterium sein, insbesondere Stämme von Streptomyces und Bacillus, und E. coli. Die Transformation bakterieller Zellen kann gemäß konventionellen Methoden durchgeführt werden, z.B. wie beschrieben in T. Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, 1982.
Das Screening geeigneter DNA-Sequenzen und die Konstruktion von Vektoren kann ebenfalls mit Standardverfahren ausgeführt werden, vgl. T. Maniatis el al., aaO.
Das Medium, das verwendet wird, um die transformierten Wirtszellen zu kultivieren, kann jedes konventionelle Medium sein, das zum Züchten der fraglichen Wirtszellen geeignet ist. Die exprimierte Endoglucanase kann geeigneterweise in das Kulturmedium sekretiert werden und kann daraus mit gut bekannten Verfahren gewonnen werden, einschließlich Abtrennen der Zellen vom Medium durch Zentrifugation oder Filtration, Ausfällen proteinhaltiger Komponenten des Mediums mit Hilfe eines Salzes, wie etwa Ammoniumsulfat, gefolgt von chromatographischen Verfahren, wie etwa Ionenaustauschchromatographie, Affinitätschromatographie oder dergleichen.
Durch Einsatz rekombinanter DNA-Techniken, wie oben angegeben, Proteinreinigungstechniken, Fermentations- und Mutationstechniken oder anderen Techniken, die auf diesem Gebiet gut bekannt sind, ist es möglich, Endoglucanasen einer hohen Reinheit bereitzustellen.
Die Cellulasezubereitung der Erfindung kann geeigneterweise zu baumwollhaltigen Geweben zusammen mit anderen Waschmittelmaterialien während der Einweich-, Wasch- oder Spülvorgänge zugesetzt werden. Demgemäß betrifft die Erfindung in einem anderen Aspekt einen Waschmittelzusatzstoff, der über etwa 40% bezogen auf Gesamtprotein, wie bestimmt aus der OD bei 280 nm) einer Endoglucanase-Komponente umfasst, die eine CMC-Endoase-Aktivität (wie oben beschrieben) von über etwa 5 CMC-Endoase-Einheiten pro mg Gesamtprotein und eine CAVU- Aktivität (wie oben definiert) von über etwa 50% unter alkalischen Bedingungen zeigt. Der Waschmittelzusatzstoff kann geeigneterweise in der Form eines nicht-staubenden Granulats, einer stabilisierten Flüssigkeit oder eines geschützten Enzyms vorliegen. Nicht-staubende Granulate können z.B. gemäß US 4,106,991 und 4,661,452 (beide für Novo Industri A/S) hergestellt werden und können fakultativ mit in der Technik bekannten Methoden beschichtet werden. Flüssige Enzymzubereitungen können z.B. durch Zugabe eines Polyols, wie etwa Propylenglykol, eines Zuckers oder Zuckeralkohols, von Milchsäure oder Borsäure gemäß eingeführten Methoden stabilisiert werden. Andere Enzymstablilisatoren sind in der Technik gut bekannt. Geschützte Enzyme können gemäß der in EP 238,216 offenbarten Methode hergestellt werden.
Der Waschmittelzusatzstoff kann geeigneterweise eine CMC- Endoase-Aktivität (wie oben definiert) von 500 - 10.000 CMC- Endoase-Einheiten pro Gramm des Zusatzstoffes zeigen. Man wird verstehen, daß der Waschmittelzusatzstoff außerdem ein oder mehrere andere Enzyme, wie Protease, Lipase oder Amylase, einschließen kann, die konventionell in Waschmittelstoffen eingeschlossen sind.
In einem noch weiteren Aspekt betrifft die Erfindung eine Waschmittelzusammensetzung, die eine Cellulasezubereitung, wie oben beschrieben, umfaßt.
Waschmittelzusammensetzungen der Erfindung umfassen zusätzlich Tenside, die vom anionischen, nicht-ionischen, kationischen, amphoteren oder zwitter-ionischen Typ sein können, sowie Mischungen dieser Tensidklassen. Typische Beispiele für anionische Tenside sind lineare Alkylbenzolsulfonate (LAS), Alpha-Olefinsulfonate (AOS), Alkoholethoxysulfate (AES) und Alkalimetallsalze von natürlichen Fettsäuren.
Waschmittelzusammensetzungen der Erfindung können andere in der Technik bekannte Waschmittelbestandteile enthalten, wie z.B. Builder, Bleichmittel, Bleichaktivatoren, Antikorrosionsmittel, Komplexbildner Mittel gegen die erneute Ablagerung von Schmutz, Duftstoffe, Enzymstabilisatoren, etc..
Die Waschmittelzusammensetzung der Erfindung kann in jeder geeigneten Form formuliert werden, z.B. als ein Pulver oder eine Flüssigkeit. Das Enzym kann einem flüssigen Waschmittel durch Einschluß von Enzymstabilisatoren, wie oben angegeben, stabilisiert werden. Üblicherweise wird der pH einer Lösung der Waschmittelzusammensetzung der Erfindung 7-12 und in einigen Fällen 7,0-10,5 sein. Andere Waschmittelenzyme, wie etwa Proteasen, Lipasen oder Amylasen, können in die Waschmittelzusammensetzung der Erfindung eingeschlossen sein, entweder einzeln oder in einem kombinierten Zusatz, wie oben beschrieben.
Die Erweichungs-, Schmutzentfernungs- und Farbklärungswirkungen, die mit Hilfe der Cellulasezubereitung der Erfindung erreichbar sind, erfordern im allgemeinen eine Konzentration der Cellulasezubereitung in der Waschlösung, die einer Endoglucanase-Aktivität von 5-200 CMC-Endoase-Einheiten pro Liter entspricht. Die Waschmittelzusammensetzung der Erfindung wird typischerweise in Konzentrationen von 0,5-20 g/l in der Waschlösung eingesetzt. Folglich ist die Cellulasekonzentration der Waschmittelzusammensetzung der Erfindung etwa 0,3 - 400 CMC-Endoase-Einheiten pro Gramm. Im allgemeinen ist es am geeignetsten, den Waschmittelzusatzstoff in Mengen von 0,1 - 5 Gew.-% zuzusetzen oder vorzugsweise in Mengen von 0,2 - 2% der Waschmittelzusammensetzung.
In einem noch weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Verringerung der Geschwindigkeit, mit der baumwollhaltige Gewebe hart werden, oder zur Verringerung der Härte von baumwollhaltigen Geweben, wobei das Verfahren Behandlung baumwollhaltiger Gewebe mit einer Cellulasezubereitung, wie oben beschrieben, umfaßt. Das Verfahren der Erfindung kann durch Behandlung baumwollhaltiger Gewebe während des Waschens durchgeführt werden. Falls gewünscht, kann Behandlung der Gewebe jedoch auch während des Einweichens oder Spülens oder einfach durch Zugabe der Cellulasezubereitung zum Wasser, in dem die Gewebe eingetaucht sind oder sein, werden durchgeführt werden.
Die vorliegende Erfindung wird im weiteren Detail mit Bezugnahme auf gegenwärtig bevorzugte Ausführungsformen in den folgenden Beispielen beschrieben, die nicht dazu gedacht sind, den Schutzumfang der Erfindung in irgendeiner Weise zu beschränken.

BEISPIELE

Beispiel 1

Reinigung und Waschversuche unter Verwendung von Cellulasen aus Humicola insolens

Fraktionierung von H. insolens-Cellulase

Cellulase wird durch Kultivierung von Humicola insolens DSM 1800, gemäß US 4,435,307, Beispiel 6, hergestellt. Rohe Cellulase wird aus der Kulturbrühe durch Filtration auf Diatomeenerde, Ultrafiltration und Gefriertrocknung des Retentats gewonnen, vgl. Beispiele 1 und 6 von US 4,435,307.
Die rohe Cellulase wird auf DEAE-Sephadex gereinigt und mit Anionenaustauschchromatographie auf DEAE-Sepharose bei pH 10 getrennt. Die nicht-absorbierte Fraktion (bezeichnet mit F1) besitzt eine Erweichungswirkung (pro mg Protein), die etwa das Zweifache derjenigen der rohen Cellulase oder der ACXI-Fraktion von US 4,435,307 ist.
Nach Konzentration wird F1 mit einer zweistufigen (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;- Ausfällung fraktioniert: der Niederschlag bei 25% Sättigung wird verworfen, woraufhin der Niederschlag bei 55% Sättigung gesammelt und mit F1P1 bezeichnet wird. Er hat eine ungefähr 3-mal höhere Erweichungsleistung als die rohe Cellulase.
F1P1 wird dann durch Größenchromatographie (Sephacryl) getrennt. Das Protein eluiert in 3 Hauptpeaks. C1, C2, C3. Der C1 eluiert mit einem scheinbaren MG von etwa 80.000. C2 mit einem MG von etwa 65.000 und C3 mit einem MG von etwa 40.000. Die Hauptaktivität von C1 ist die Aktivität gegen PNP- Cellobiose. Die Hauptaktivität in C2 ist die Endoglucanase- Aktivität. Die C3-Fraktion enthält hauptsächlich Exoglucanase- Aktivität. So liegt von den 3 Fraktionen nur F1P1C2 innerhalb des Umfangs der Erfindung. Sie hat die 5fache Erweichungswirkung der rohen Cellulase.
F1P1C2 enhält etwa 50% eines einzelnen Proteins, bezeichnet mit Endoglucanase I. Dieses kann weiter durch präparative Größenchromatographie gereinigt werden, z.B. auf einer TSK- Säule.
Unten werden die rohe Cellulase und die verschiedenen Fraktionen im Hinblick auf Erweichungsleistung (in Waschtests, die durchgeführt werden, wie unten beschrieben), Endoglucanase-Aktivität (CMC-Endoase, wie oben definiert) und Gehalt an Endoglucanase I (im % vom Gesamtprotein, bestimmt mit einer später angegebenen Methode) verglichen. Jedes von diesen wird ausgedrückt in Bezug auf die Gesamtproteinmenge, bestimmt durch die OD bei 280 nm. Die Zahlen geben typische Ergebnisse an. Man glaubt, daß einige dieser gemessenen Aktivitäten durch Proteaseverunreinigung negativ beeinflußt sind. Cellulasezubereitung CMC-Endoase % Endo I von Protein Erweichungsleistung relativ zu Proteinmenge Stand der Technik: Rohe Cellulase Fraktionen: F1P1C2 (Erfingung)
Wie angegeben, führt Fraktionierung von roher Cellulase zu F1, F1P1 und schließlich F1P1C2 zu einer progressiv ansteigenden Erweichungsleistung (pro Menge Protein). Schmutzentfernung nimmt in ähnlicher Weise zu. Die verbesserten Zubereitungen der Erfindung können von Zubereitungen nach dem Stand der Technik durch erhöhte Endoglucanase-Aktivität (CMC-Endoase/mg Gesamtprotein) und durch den erhöhten Gehalt an Endoglucanase I unterschieden werden. Es wurde festgestellt, daß die rohe Cellulase eine CAVU-Aktivität von 78% zeigt. Die CAVU- Aktivitäten der Fraktionen lagen im Bereich von 75-92%.

Enzymchemische Charakterisierung von "Endoglucanase I"

SDS-PAGE und isoelektrische Fokussierung (IEF) mit Markerproteinen sind geeignete Methoden zur Bestimmung von Molekulargewicht (MG) bzw. Isoelektrischem Punkt (pI). Gemäß diesen Methoden hat Endoglucanase I ein MG von etwa 65kD und einen pI von etwa 8,5-9,5. Die F1P1C2-Fraktion, die oben beschrieben ist, enthält etwa 50% dieser Cellulase und sie enthält eine geringe Menge an Protein mit einem MG von etwa 50 kD und einem pI von etwa 5,8. Wegen des hohen Glykosylierungsgrades können das MG im SDS-Gel und der pI wegen Unterschieden in den Fermentationsbedingungen und im Puffertyp während der Reinigung schwanken.
Die Enzymaktivität wurde gemessen als die CMC-Endoase- und CAVU-Aktivität, wie oben definiert. In jedem Fall wurde die obige F1P1C2-Zubereitung verwendet, um die Eigenschaften reiner Endoglucanase I zu bewerten.
a) Endoglucanase-Aktivität von etwa 50 CMC-Endoase/mg Gesamtprotein.
b) im wesentlichen keine Cellubiohydrolase-Aktivität (unter 0,5 PNP-Cel/mg).
Endoglucanase I ist glykosyliert, wie man durch Bindung an Con-A sehen kann.

Immunchemische Charakterisierung

Antiserum gegen Proteine kann z.B. durch Immunisierung von Kanninchen gemäß der Vorgehensweise erzeugt werden, die von N. Axelsen et al. in : A Manual of Quantitative Immunoelectrophoresis, Blackwell Scientific Publications, 1973, Chapter 23 beschrieben ist. Gereinigte Immunglobuline können aus den Antiseren z.B. durch Salzausfällung ((NH&sub4;)&sub2; SO&sub4;),gefolgt von Dialyse und Ionenaustauschchromatographie, z.B. auf DEAE-Sephadex erhalten werden.
Immunchemische Charakterisierung von Proteinen kann entweder durch Ouchterlony-Doppeldiffusionsanalyse (O. Ouchterlony in: Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir, Ed.), Blackwell Scientific Publications, 1967, sp. 655-706), durch Kreuz-Immunelektrophorese (N. Axelsen et al., aaO, Kapitel 3 und 4) oder durch Rocket-Immunelektrophorese N. Axelsen et al., Kapitel 2) durchgeführt werden.
Die fraktionierten Cellulasezubereitungen der Erfindung ( F1, F1P1, F1P1C2) zeigen immunologische Reaktion mit Serum, erzeugt gegen die rohe Cellulase aus DSM 1800, sowie Serum, erzeugt gegen F1P1C2.

Cellobiohydrolase-Aktivität (PNP-Cel)

Cellobiohydrolase-Aktivität kann mit PNP-Cellobiose, p- Nitrophenyl-beta-D-cellobiosid (Sigma N-5759) gemessen werden. Die Aktivität wird als uMol freigesetztes Nitrophenyl pro Minute bei 37ºC bei pH 7,0 bestimmt.

Bestimmung von Endoalucanase I durch Größenchromatographie

Analytische HPLC wird durchgeführt auf einer 220ml-Säule aus TSK SW 3000 mit Durchfluß 5 ml/min von 0,1M Natriumacetat- Puffer, pH 6,1. C1 eluiert bei 35 Minuten, C2 bei 37 Minuten (als Rinderserumalbumin) und C3 bei 40 Minuten.

Reinigung von Cellulase

Eine Gesamtmenge von 228.000 CMC-Endoase von roher Cellulase, hergestellt wie beschrieben in Beispiel 6 in US 4,435,307, wurde verwendet. Sie wurde in 20 l Puffer bei pH 10,5 unter Verwendung von Ethanolamin verdünnt und mit 25 g DEAE-Sephadex bei 4ºC für 4 Stunden behandelt. Das nicht-gebundene Protein wurde konzentriert und gefriergetrocknet. Dies entspricht der ACXI-Fraktion, die in US-Patent 4,435,307 beschrieben ist.
Nach Konzentration auf einer Millipore-Pelicon-Zelle mit einem MG-Schnitt bei 10000 wurden 4000 ml ACXI erhalten, die 215.000 Endoase enthielten. Dies wurde Anionenaustauschchromatographie bei pH 10,5 unterzogen.
Säulenchromatographie wurde durchgeführt auf DEAE-Sepharose CL auf einer 10 x 25 cm - Säule, die mit Puffer 20 nM Ethanolamin pH 10,5, äquilibriert worden war, Durchfluß 500 ml pro Stunde.
Das nicht-gebundene Material in einem Gesamtvolumen von 10.000 ml wurde eingestellt auf pH 7,0 und konzentriert auf einer Millipore-Pelicon-Zelle mit MG-Schnitt bei 10.000.
Das Ergebnis war eine Fraktion von 1300 ml, bezeichnet mit F1. Diese wurde zunächst mit 20% w/v Ammoniumsulfat gesättigt und der Niederschlag wurde verworfen, gefolgt von 35% w/v Ammoniumsulfat. Der neue Niederschlag wurde durch Zentrifugation gesammelt und in Wasser auf ein Gesamtvolumen von 130 ml löslich gemacht, bezeichnet mit F1P1.
Zweimal 40 ml hiervon wurden aufgebracht auf Sephacryl-S-200- Größenchromatographie: Puffer 100 mM Ammoniumacetat pH 6,5, Durchfluß 200 ml pro Stunde, Größe der Säule 5 x 85 cm. Das Protein eluierte in 3 Hauptpeaks: C1, C2, C3. Ergebnis Volumen Protein mg pro ml Endoase pro ml PNPCEL pro ml

Erweichungswirkung in Waschversuchen

Experimentelle Bedingungen:

Waschmaschine: Terg-O-tometer
Temperatur: 40ºC
Zeit: 15 Minuten
Bewegung: 100 UPM
Waschmittel: 5 g/l "Gr n Biotex" from Bluemoller A/S, Dänemark
pH: Eingestellt auf pH 9,0
Wasserhärte: Leitungswasser, ungefähr 18ºdH
Testmaterial: Baumwollfrotteestoff, 19 cm x 19 cm A/S Georg Jensen Damaskvxveriet, hergestellt wie unten beschrieben
Stoff/Flüssigkeitsverhältnis: 2 Stoffproben 1 Liter pro Kübel, 38/1
Cellulase: Siehe unten
Cellulasedosierungen: In Bereich 2,5 bis 125 mg Protein/l
Spülen: Die Stoffproben wurden in einer Haushaltswaschmaschine (Miele W 761) gespült. Dem Spülen folgte eine Schleudertrocknung bei 900 UPM für 38 Sekunden.
Trocknung: Leinentrocknung
Anzahl von Waschungen: 1

Herstellung von Testmaterial

100 Stoffproben oder etwa 1,9 kg wurden in einer Haushaltswaschmaschine (Miele W 761) vorgewaschen. Das Waschprogramm war "Kul rt vask 60ºC, kort", d.h. ein europäischer Waschvorgang mit einem Zyklus. Die Stoffproben wurden am Ende jedes Waschzyklus bei 1200 UPM schleudergetrocknet, aber zwischen den Waschungen nicht getrocknet. Nach 20 Waschungen wurden die Stoffproben leinengetrocknet.
Verschiedene Cellulasenzubereitungen wurden verwendet und die Weichheit der behandelten Stoffproben wurde verglichen, um die relative Dosis der verschiedenen Zubereitungen herauszufinden, die benötigt wird, um dieselbe Erweichungswirkung zu ergeben. Ergebnisse Cellulase Erweichungsleistung relativ zu Proteinmenge rohe cellulase (genommen als Basis)
Es wird deutlich, daß die drei fraktionierten Zubereitungen (F1, F1P1, F1P1C2) verbesserte Erweichungswirkung zeigen.

Beispiel 2

Reinigung und Waschversuche unter Verwendung von Cellulasen aus Fusarium oxysporum

Fusarium oxysporum-Stamm J 79 (Hinterlegungs-Nr. DSM 2672) wurde bei 30ºC auf einem Agar-Substrat kultiviert, das die folgenden Nährstoffe enthielt:
Hefeextrakt Difco 4 g
K&sub2;HPO&sub4; 1g
MgSO&sub4; 7H&sub2;O 0,5 g
Glucose 15 g
Destilliertes Wasser 1000 ml
Agar 15 g
Die Kultur wurde für 6 Tage in einen Fernbach-Kolben inkubiert, woraufhin die resultierenden Sporen in einen 500 l- Fermentationstank aus rostfreiem Stahl überführt wurden, der 300 Liter Vorfermentations-Substrat der folgenden Zusammensetzung enthielt:
Cornsteep-Lösung 23,3 g pro Liter
Glucose 24,0 g pro Liter
CaCO&sub3; 5,0 g pro Liter
Pluronic 0,1 ml pro Liter
(der pH des Mediums wurde vor Sterilisation bei 121ºC für 60 min mit H&sub3;PO&sub4; auf 5,5 eingestellt). Die resultierende Kultur wurde unter Verwendung von 300 Litern Luft pro Minute bei einem Druck von 0,5 Atmosphären belüftet.
Nach einem Wachstum für 23 Stunden bei 30ºC wurden 150 Liter der erhaltenen dichten Kultur verwendet, um einen Fermentations-Produktionstank zu beimpfen, der 1500 Liter eines Mediums enthielt, das bei pH 6,5 bei 121ºC für 60 Minuten sterilisiert worden war und die folgenden Bestandteile enthielt:
Cornsteep-Lösung 20 g pro Liter
Cellulose-Pulver, Diacell 40 g pro Liter
KH&sub2;PO&sub4; 10 g pro Liter
CaCO&sub3; 5 g pro Liter
NH&sub4;NO&sub3; 10 g pro Liter
MgSO&sub4; 7H&sub2;O 1 g pro Liter
Pluronic 0,1 ml pro Liter.
Die Fermentationsmischung wurde unter Verwendung von 750-1500 Litern Luft pro Minute bei einem Druck von 0,5 Atmosphären belüftet und bei einer Geschwindigkeit von 200 UPM gerührt. Die Temperatur betrug 30ºC und der pH wurde durch Zugabe von 4,9%iger Phosphorsäure während der ersten 40 Stunden Fermentationszeit bei 6,0 und nach 70 Stunden, durch Zugabe verdünnten Calciumcarbonats oberhalb 5,0 gehalten. Nach 108 Stunden wurde die Fermentation gestoppt, die Kultur wurde auf 5ºC abgekühlt, die Kulturbrühe wurde durch Filtration entfernt und schließlich wurde das Filtrat nach Konzentration durch Ultrafiltration gefriergetrocknet.
10 Gramm erhaltenes gefriergetrocknetes Cellulase-Pulver, (das eine Gesamt-CMC-Endoase-Aktivität von 18.118 Einheiten zeigte) wurde Chromatographie auf 350 ml DEAE-Sepharose Typ CL-6B, bezogen von Pharmacia Company, unter Verwendung von 600 ml eines linearen Gradienten von 1M NaCl in 50 mM Tris-Puffer bei pH 7 unterzogen. Fraktionen (20 ml) aus der Chromatographie wurden gepoolt, auf einem Amicon-Ultrafiltrationsmembranreaktor, ausgerüstet mit einer Membran Typ GR 81 PP mit einem MG-Schnitt bei 10 kDalton, bezogen von Danish Sugar Conpany, konzentriert und schließlich analysiert, wie in der Tabelle unten angegeben: Pool Gesamt mg Protein Endoase pro ml Gesamtendoase Endoase/mg Protein
Es wurde festgestellt, daß Pool 1, der sich nicht an die Anionenaustauschsäule band, eine CAVU-Aktivität von 87% zeigte. In SDS-PAGE zeigte er eine Hauptbande mit einem Molekulargewicht von 80 kDalton. Als getestet in Waschversuchen (wie beschrieben in Beispiel 1) unter Verwendung eines einfachen Waschmittels mit pH 8,0 und einer CMC-Endoase-Aktivität von 60 Einheiten pro Liter Waschlauge, wurde festgestellt, daß das Protein in dieser Bande eine hervorragende Erweichungswirkung zeigte.

Beispiel 3

Reinigung und Waschversuche unter Verwendung von Cellulasen aus Myceliopthora thermophile

Der Stamm CBS 11765 (Myceliopthora thermophile) wurde bei 37ºC auf einem Agar-Substrat mit der folgenden Zusammensetzung kultiviert:
Hefeextrakt Difco 4 g
K&sub2;HPO&sub4; 1 g
MgSO&sub4; 7H&sub2;0 0,5 g
Glucose 15 g
Destilliertes Wasser 1000 ml
Agar 15 g
Die Kultur wurde für 6 Tage in einem Fernbach-Kolben inkubiert. Dann wurden die Sporen in einen 500 l- Fermentationstank aus rostfreiem Stahl überführt, der 280 Liter eines Mediums enthielt, das die folgenden Bestandteile enthielt:
Sojabohnenmehl 28,9 g pro Liter
K&sub2;HPO&sub4; 2,1 g pro Liter
CaCO&sub3; 5,0 g pro Liter
Pluronic 0,4 ml pro Liter
Glucose 4,3 g pro Liter
Zitronensäure 6,7 g pro Liter
(Die Glucose und die Zitronensäure des Mediums wurden getrennt bei 123ºC für 60 Minuten sterilisiert. Der pH des Mediums wurde vor Sterilisation bei 123ºC für 90 min mit H&sub3;PO&sub4; auf 5,5 eingestellt). Sterile Luft wurde durch die resultierende Kultur bei einem Druck von 0,5 Atmosphären und bei einer Geschwindigkeit von 200 Litern pro min durchgeleitet.
Nach Wachstum für 48 Stunden bei 37ºC wurden 120 Liter der erhaltenen dichten Kultur verwendet, um einen Enzymproduktionstank zu beimpfen, der 1500 Liter eines Substrats der folgenden Zusammensetzung enthielt:
Sojabohnenmehl 30 g pro Liter
Cellulose-Pulver, Solkafloc 20 g pro Liter
KH&sub2;PO&sub4; 2 g pro Liter
CaCO&sub3; 4,5 g pro Liter
Pluronic 0,17 ml pro Liter
(der pH des Mediums wurde vor Sterilisation bei 123ºC für 90 min mit NaOH/H&sub3;PO&sub4; auf 6,5 eingestellt).
Die Kultur wurde bei einer Geschwindigkeit von 1500 Litern pro Minute unter einem Druck von 0,5 Atmosphären belüftet und wurde bei einer Geschwindigkeit von 250 UPM gerührt. Die Fermentation ließ man für 64 Stunden bei 37ºC voranschreiten, woraufhin die Kultur auf 5ºC abgekühlt und filtriert wurde, um ein Filtrat zu liefern, das nach Konzentration durch Ultrafiltration gefriergetrocknet wurde.
5 Gramm des Cellulase-Pulvers (von dem festgestellt wurde, daß es eine CMC-Endoase-Aktivität von 6176 Einheiten pro Gramm zeigte) wurden unter Verwendung eines Säulenmaterials Sephacryl Typ S 200 und eines 0,1 M Natriumacetat-Puffers mit pH 6,1 fraktioniert. Fraktionen von 15 ml wurden gesammelt, mit SDS-Elektrophorese analysiert und gemäß dem Proteinmuster der Gele wie folgt gepoolt:
Pool 1 475 ml, SDS-Gel: 100, 90 kDalton
Pool 2 500 ml, SDS-Gel: 70, 50, 45 kDalton
Pool 3 400 ml, SDS-Gel: 70, 60, 50, 45 kDalton
Pool 4 410 ml, SDS-Gel: 45, 30 kDalton
Pool 5 310 ml, SDS-Gel: 65, 50, 18 kDalton
Pool 6 850 ml, SDS-Gel: 65, 50, 40, 18 kDalton
Die Pools wurden dann auf einem Amicon-Membranreaktor mit einer Ultrafiltrationsmembran Typ GR 81 PP, bezogen von den Danish Sugar Factories, MG-Schnitt bei 10 kDalton, konzentriert und sie wurden anschließend wie folgt analysiert: Pool Gesamt mg Protein Endoase pro ml Gesamtendoase Endoase/mg Protein
Die folgenden CAVU-Aktivitäten wurden gemessen:
Pool 2 23% CAVU
Pool 3 22% CAVU
Pool 4 13% CAVU
Pool 5 75% CAVU
Pool 6 88% CAVU
Als getestet in Waschversuchen (wie beschrieben in Beispiel 1) unter Verwendung eines einfachen Waschmittels mit pH 8 und einer CMC-Endoase-Aktivität von 180 Einheiten pro Liter Waschlauge, wurde festgestellt, daß nur Pool 5 und 6 eine hervorragende Erweichungswirkung zeigten. Im Gegensatz dazu wurde festgestellt, daß Pool 2, der eine CMC-Endoase-Aktivität von 16 Einheiten/mg zeigte, nicht zu irgendwelcher Erweichung führte, als er getestet wurde.

Claims

1. Cellulasezubereitung, die wenigstens 50 % (bezogen auf das Gewicht des Gesamtcellulasegehaltes) einer homogenen Endoglucanase-Komponente umfaßt, die von einem Pilz oder einem anderen Bakterium als Bacillus produziert ist, wobei diese Komponente die folgenden Eigenschaften zeigt

(a) eine CMC-Endoase-Aktivität [definiert als die Endoglucanase-Aktivität der Endoglucanase-Komponente als ihre Fähigkeit, die Viskosität einer Carboxymethylcellulose(CMC)- Lösung zu verringern, wie bestimmt durch Herstellen einer Substratlösung von 35 g/l CMC in 0,1 M Tris-Puffer bei pH 9,0, Lösen einer Proben der Cellulasezubereitung im selben Puffer, Vermischen von 10 ml der Substratlösung und 0,5 ml der Enzymlösung und Überführen der Mischung in ein Viskosimeter, das bei 40ºC thermostatisiert ist, wobei 1 Einheit CMC- Endoase-Aktivität als die Enzymmenge definiert ist, die die Viskosität der CMC-Lösung nach 30 Minuten auf die Hälfte verringert] von wenigstens 5 CMC-Endoase-Einheiten pro mg Gesamtprotein,

(b) eine CAVU-Aktivität [definiert als die Affinität der Endoglucanase-Komponente für Cellulose, wie bestimmt durch Zugeben von 50 CMC-Endoase-Einheiten in 10 ml Tris-Puffer, pH 9,0, zu 2,5 g Avicel, Rühren der resultierenden Suspension für 30 Minuten bei Raumtemperatur, Zentrifugieren für 10 Minuten bei 3000 UPM und Messen der CMC-Endoase-Aktivität des resultierenden Überstands, wobei die % CAVU-Aktivität berechnet werden als die Differenz zwischen der Gesamt-CMC- Endoase-Aktivität der ursprünglichen Lösung und derjenigen des Überstands, geteilt durch die Gesamt-CMC-Endoase-Aktivität und multipliziert mit 100] von wenigstens 50 % unter alkalischen Bedingungen,

(c) ein pH-Optimum bei einem pH von etwa 7,5 - 10, und

(d) eine Cellobiohydrolase-Aktivität unter 0,5 PNP-Cel/mg.

2. Cellulasezubereitung nach Anspruch 1, die wenigstens 90 % (bezogen auf das Gewicht des Gesamtcellulasegehaltes) von besagter Endoglucanase-Komponente umfaßt.

3. Cellulasezubereitung nach Anspruch 1, wobei die Endoglucanase-Komponente eine CMC-Endoase-Aktivität von über etwa 10 CMC-Endoase-Einheiten pro mg Gesamtprotein zeigt.

4. Cellulasezubereitung nach Anspruch 3, wobei die Endoglucanase-Komponente eine CMC-Endoase-Aktivität von über etwa 15 CMC-Endoase-Einheiten pro mg Gesamtprotein zeigt.

5. Cellulasezubereitung nach den Ansprüchen 3 oder 4, wobei die Endoglucanase-Komponente eine CNC-Endoase-Aktivität von etwa 50 oder mehr CMC-Endoase-Einheiten pro mg Gesamtprotein zeigt.

6. Cellulasezubereitung nach Anspruch 1, wobei die Endoglucanase-Komponente eine CAVU-Aktivität von über etwa 65 % zeigt.

7. Cellulasezubereitung nach Anspruch 6, wobei die Endoglucanase-Komponente eine CAVU-Aktivität von über etwa 75 % zeigt.

8. Cellulasezubereitung nach Anspruch 1, wobei der Pilz eine Humicola-Spezies ist.

9. Cellulasezubereitung nach Anspruch 8, wobei der Pilz Humicola insolens.

10. Cellulasezubereitung nach den Ansprüchen 8 oder 9, wobei die Endoglucanase-Komponente die folgenden Eigenschaften zeigt:

a) ungefähres Molekulargewicht von etwa 65 kD (SDS-PAGE)

b) isoelektrischer Punkt von etwa 8,5 - 9,5

c) Endoglucanase-Aktivität über etwa 50 CMC-Endoase- Einheiten/mg Gesamtprotein

d) eine Cellobiohydrolase-Aktivität unter 0,5 PNP-Cel/mg

e) immunologische Reaktion mit einem polyspezifischen Antikörper, gezüchtet gegen Cellulase, die aus Humicola insolens DSM 1800 gewonnen ist.

11. Cellulasezubereitung nach Anspruch 1, wobei der Pilz eine Fusarium-Spezies oder ein Myceliopthora sp. ist.

12. Waschmittelzusatzstoff, der eine Cellulasezubereitung nach einem der Ansprüche 1-8 umfaßt, in der Form eines nicht- staubenden Granulats, einer stabilisierten Flüssigkeit oder eines geschützten Enzyms.

13. Waschmittelzusatzstoff nach Anspruch 12, der eine CMC- Endoase-Aktivität von 500-10.000 CMC-Endoase-Einheiten pro Gramm des Zusatzstoffes zeigt.

14. Waschmittelzusatzstoff nach Anspruch 12, der zusätzlich ein anderes Enzym umfaßt.

15. Waschmittelzusatzstoff nach Anspruch 14, wobei das andere Enzym eine Protease, Lipase und/oder Amylase ist.

16. Waschmittelzusammensetzung, die eine Cellulasezubereitung nach einem der Ansprüche 1-8 umfaßt, sowie ein Tensid und fakultativ einen Builder, ein Bleichmittel, einen Bleichaktivator, ein Antikorrosionsmittel, einen Komplexbildner, ein Mittel gegen die erneute Ablagerung von Schmutz, einen Duftstoff oder einen Enzymstabilisator.

17. Waschmittelzusammensetzung nach Anspruch 16, die eine CMC- Endoase-Aktivität von 0,3-400 CMC-Endoase-Einheiten pro Gramm Waschmittel zeigt.

18. Waschmittelzusammensetzung nach Anspruch 16, die zusätzlich ein anderes Enzym umfaßt.

19. Waschmittelzusammmensetzung nach Anspruch 18, wobei das andere Enzym eine Protease, Lipase und/oder Amylase ist.

20. Verfahren zur Verringerung der Geschwindigkeit, mit der baumwollhaltige Gewebe hart werden, oder zur Verringerung der Härte von baumwollhaltigen Geweben, wobei das Verfahren Behandlung baumwollhaltiger Gewebe mit einer Cellulasezubereitung nach einem der Ansprüche 1-8 umfaßt.

21. Verfahren nach Anspruch 20, wobei die Behandlung der Gewebe mit der Cellulasezubereitung während des Einweichens, Waschens oder Spülens der Gewebe durchgeführt wird.