DE69122687T2

DE69122687T2 - Cellulase, Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung

Info

Publication number: DE69122687T2
Application number: DE69122687T
Authority: DE
Inventors: Eiko Masatsuji; Kiyoshi Saito; Masahiko Seko
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novozymes AS
Priority date: 1990-07-24
Filing date: 1991-07-23
Publication date: 1997-10-30
Anticipated expiration: 2011-07-24
Also published as: EP0468464A2; US5318905A; JPH0479882A; CA2047613A1; EP0468464B1; US5231022A; JP2859393B2; EP0468464A3; DE69122687D1; US5314637A

Description

Technisches Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft eine neuartige Cellulase und ein Verfahren zu deren Herstellung, sowie deren Verwendung als Hilfsstoff für Detergentien oder als Mittel zur Behandlung von Papier.

Beschreibung des Standes der Technik

Die Entwicklung von Cellulasen wurde im Hinblick auf wirksame Verwertung von Biomasseressourcen durchgeführt, insbesondere von Celluloseressourcen. Die Verwertung von Cellulase für Biomasse im industriellen Maßstab ist jedoch noch nicht so weit verbreitet.
Andererseits ist als eine neuartige industrielle Anwendung von Cellulase bekannt, daß Cellulase die Wirkung aufweist, die Waschkraft von Waschmitteln zu erhöhen. Beispielsweise wurde festgestellt, daß sich Cellulase wegen ihrer Fähigkeit, feinen Faserstaub zu entfernen, zum Waschen von Jeansstoff eignet (vgl. britische Patente Nrn. 2094826 und 2095275). Es sind zahlreiche Veröffentlichungen erschienen, die die Verwendung von Cellulase bei verschiedenen Schritten der Papierherstellung, wie beispielsweise dem Entfärben von Altpapier, dem Bleichen von Zellstoff und der Verbesserung der Herstellungsverfahren für wiederaufgearbeitetes Papier zum Inhalt haben, und wobei besonderes Augenmerk auf der Cellulase lag (vgl. Offenlegungsschriften der japanischen Patentanmeldungen Nr. 9299/1984, 80683/1990, europäische Patentanmeldungen Nr. 395792 und 383999, und Tappi Journal Bd. 72, Nr. 6, 197-201 (1989) und Band 73, Nr. 12, 197-202 (1990)).
So betrifft JP-A-59/009299 ein Entfärbemittel für die Wiederaufarbeitung von Altpapier, welches Cellulase, insbesondere eine alkalische Cellulase enthält. Die in diesen Verfahren verwendete Cellulase weist ein pH-Optimum von 10, eine Stabilität in einem pH-Bereich von 5,5 bis 11,0, ein Temperaturoptinum von 60ºC und Temperaturbeständigkeit bis 70ºC auf.
Unter herkömmlichen Waschbedingungen liegt der pH-Wert der Waschlösung im Bereich höherer Alkalinität, und ein Teil der Papierherstellungsschritte wird unter stark alkalischen Bedingungen durchgeführt, was dazu führt, daß die in Waschoder Papierherstellungsverfahren verwendeten Cellulasen alkalische Cellulasen sein müssen, die unter stark alkalischen Bedingungen wirken können. Weiterhin müssen die Cellulasen solche sein, welche in Gegenwart von Detergentien oder anionischen Tensiden, die in einem Teil der Papierherstellungsschritte verwendet werden, ihre Wirksamkeit behalten.
Von Mikroorganismen produzierte alkalische Cellulasen umfassen solche, die mittels eines Verfahrens produziert werden, bei dem ein alkalophiles Bakterium der Gattung Bazillus gezüchtet wird, und eine produzierte alkalische Cellulase isoliert wird (vgl. U.S. Patent Nr. 3844890), ein Verfahren, bei dem ein alkalophiles Bakterium der Gattung Cellulomonas 4 gezüchtet wird, um die alkalische Cellulase 301-A zu produzieren (vgl. Offenlegungsschrift der japanischen Patentanmeldung Nr. 224686/1983) bzw. ein Verfahren, bei dem ein alkalophiles Bakterium der Gattung Bacillus KSM-635 gezüchtet wird, um die alkalische Cellulase K (vgl. U.S. Patent Nr. 4945053) herzustellen.
Eine andere alkalische Cellulase, die aus einem Bacillusstamm erhältlich ist, wird in EP-A-0 339 550 offenbart. Diese Cellulase zeigt ein pH-Optimum von 9 bis 10, Stabilität in einem pH-Bereich von 4,5 bis 10,5, ein Temperaturoptimum von 40ºC und eine Temperaturstabilität bis 40ºC.
JP-A-62/296874 beschreibt ein Verfahren zur Übertragung einer hohen Produktivität für alkalische Cellulase auf eine Bakterienzelle, bei dem ein DNA-Fragment, welches die genetische Information der Alkalicellulase trägt, in einen Plasmidvektor, eingebaut wird, und eine Bakterienzelle des Stammes Bacillus mit dem rekombinanten Plasmid transformiert wird. Die alkalische Cellulase, die mittels der Transformanten produziert wird, weist ein pH-Optimum von 9,5, Stabilität in einem pH-Bereich von 6,0 bis 11,0 und ein Temperaturoptimum von 50ºC und eine Temperaturstabilität bis 70ºC auf. Die Produktion von Cellulase 212 und Hemicellulase 333 durch Züchtung eines Aeromonasstammes wird in GB-A-l 465 307 beschrieben. Cellulase 212 weist ein pH-Optimum von 6,0, Stabilität in einem pH- Bereich von 5,0 bis 10,0, ein Temperaturoptimum von 45 bis 55ºC und Temperaturstabilität bis 50ºC auf, während Hemicellulase 333 ein pH-Optimum von 7,0, Stabilität in einem pH-Bereich von 4,0 bis 9,0, ein Temperaturoptimum von 60ºC und eine Temperaturstabilität bis 60ºC aufweist.
Die bekannten alkalischen Cellulasen sind gegenüber einem anionischen Tensid, welches eine Detergentienkomponente darstellt, nicht immer genügend stabil. Infolgedessen besteht 4 ein dringender Bedarf an der Entwicklung von Cellulasen mit einer hervorragenden Beständigkeit gegenüber anionischen Tensiden.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist es, eine neuartige Cellulase zur Verfügung zu stellen, die ein pH- Optimum im Bereich starker Alkalinität aufweist und gegenüber anionischen Tensiden stabil ist.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zur Herstellung einer solchen Cellulase zur Verfügung zu stellen.
Ein noch anderer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist es, ein Hilfsmittel für Detergentien zur Verfügung zu stellen, welches eine solche Cellulase als wirksamen Bestandteil enthält.
Ein noch weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist es, ein Mittel zur Behandlung von Papier zur Verfügung zu stellen, das eine solche Cellulase als wirksamen Bestandteil enthält.
Um eine Cellulase mit den oben genannten Eigenschaften zu erhalten, haben die hier genannten Erfinder eine Anzahl von Mikroorganismen untersucht, indem sie diese isoliert und gezüchtet haben, und als Ergebnis haben die hier genannten Erfinder festgestellt, daß ein Bakterium der Gattung Bacillus, welches aus Erde isoliert wurde, die in den Vororten von Tokyo gesammelt wurde, nämlich Bacillus sp. SD402, FERM BP-3431, eine neuartige Cellulase produzieren kann, welche unter alkalischen Bedingungen hervorragende Eigenschaften aufweist und infolgedessen als Hilfsmittel für Detergentien und als Mittel zur Behandlung von Papier geeignet ist. Die vorliegende Erfindung basiert auf dieser Untersuchung.
Gemäß einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung bedeutet dies, daß eine Cellulase mit den folgenden Eigenschaften zur Verfügung gestellt wird:
(1) ein pH-Optimum zwischen 9,5 und 10,5, gemessen unter Verwendung von Carboxymethylcellulose als Substrat;
(2) Stabilität in einem pH-Bereich zwischen 6 und 11, gemessen unter Verwendung von Carboxymethylcellulose als Substrat;
(3) ein Temperaturoptimum bei etwa 55ºC, gemessen unter Verwendung von carboxymethylcellulose als Substrat;
(4) der Einfluß eines Tensids ist dahingehend, daß die Restaktivität 90% oder mehr nach 2-stündiger Behandlung mit Natrium-n-alkylbenzolsulfonat in einer Konzentration von 3000 ppm bei 30ºC und einem pH-Wert von 9,0 beträgt;
(5) ein Molekulargewicht von 52000 ± 2000, gemessen durch SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese; und
(6) ein isoelektrischer Punkt von 4,2 ± 0,2, gemessen durch Polyacrylamidgel-Elektrophorese.
Gemäß einem zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung einer Cellulase zur Verfügung gestellt, das die folgenden Schritte umfaßt: Züchtung eines Mikroorganismus der Gattung Bacillus, welcher die Fähigkeit aufweist, die oben beschriebene Cellulase zu produzieren, in einem Medium; und Isolieren der gewünschten Cellulase aus dem Medium. Hierbei kann der Mikroorganismus der Bacillusstamm sp. SD402, FERM BP-3431, dessen Mutantenstämme oder dessen gentechnisch manipulierte Stämme sein.
Gemäß einem dritten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Hilfsmittel für Detergentien zur Verfügung gestellt, welches die oben beschriebene Cellulase als wirksamen Bestandteil enthält.
Gemäß einem vierten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Mittel zur Behandlung von Papier zur Verfügung gestellt, das die oben beschriebene Cellulase als wirksamen Bestandteil enthält.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Fig. 1 veranschaulicht die relative Aktivität der erfindungsgemäßen Cellulase bei verschiedenen pH-Bedingungen;
Fig. 2 veranschaulicht die Restaktivität der erfindungsgemäßen Cellulase bei verschiedenen pH-Bedingungen;
Fig. 3 veranschaulicht die relative Aktivität der erfindungsgemäßen Cellulase bei verschiedenen Reaktionstemperaturen;
Fig. 4 veranschaulicht die Restaktivität der erfindungsgemäßen Cellulase bei verschiedenen Temperaturen;
Fig. 5 veranschaulicht die Restaktivität der erfindungsgemäßen Cellulase, wenn sie in Gegenwart von 3000 ppm Natrium-n-alkylbenzolsulfonat bei 30ºC und einem pH-Wert von 9,0 behandelt wird; und
Fig. 6 veranschaulicht die CMCase-Aktivitäten einer jeden mit Diethylaminoethyl (DEAE) -Anionenaustauserchharz erhaltenen Fraktion eines Rohenzyms, das aus dem erfindungsgemäßen SD402- Stamm erhältlich ist.

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Nachstehend wird der neuartige Stamm, der die erfindungsgemäße Cellulase produziert, die Cellulase, ein Verfahren zu deren Herstellung und ihre Verwendung im einzelnen erläutert.

Cellulase-produzierende Mikroorganismen

Der für die Produktion der erfindungsgemäßen neuartigen Cellulase verwendete Mikroorganismus ist ein Bakterium der Gattung Bacillus, und der die Fähigkeit aufweist, Cellulase mit den oben genannten Eigenschaften zu produzieren. Das Bakterium hat die folgenden Eigenschaften.
(a) Morphologie
(1) Form und Größe der Zelle: Stäbchen mit einer Größe von 0,3 bis 0,5 x 2,8 bis 5,2 µm.
(2) Polymorphie der Zelle: keine
(3) Beweglichkeit: peritrich begeißelt
(4) Sporenbildung: bildet ellipsenförmige Sporen mit einer Größe von 1,0 bis 1,5 x 1,8 bis 2,2 µm
(5) Gramfärbung: Positiv
(6) Säurefärbung: Negativ
(b) Wachstum auf den folgenden Medien
(1) Agarplattenmedium mit Fleischbrühe: ringförmige Kolonien mit glatten Oberflächen und leichter Wölbung an deren zentralen Stellen. Gelbstichig weiß und durchscheinend.
(2) Schrägagarmedium mit Fleischbrühe: gewebeartig sich ausbreitende Form.
(3) Flüssigmedium mit Fleischbrühe: Trüb
(4) Stichkulturmedium mit Fleischbrühe und Gelatine: Verflüssigung
(5) Lackmusmilch: weder ausgeflockt noch peptonisiert.
(c) Physiologische Eigenschaften
(1) Nitratreduktion: Negativ.
(2) Denitrifizierungsreaktion: Negativ.
(3) MR-Test: Negativ.
(4) VP-Test: Negativ.
(5) Indolproduktion: Negativ.
(6) Produktion von Schwefelwasserstoff: Negativ.
(7) Stärkehydrolyse: Positiv.
(8) Assimilation von Zitronensäure: Negativ.
(9) Assimilation von anorganischem Stickstoff: Assimiliert Nitrate und Ammoniumsalze
(10) Produktion von Pigmenten: Negativ.
(11) Urease: Negativ.
(12) Oxidase: Positiv.
(13) Katalase: Positiv.
(14) Wachstumsbereich (pH): wächst bei 8,0, aber nicht bei 7,1. Wächst bei 10,8, aber nicht bei 12,3.
(Temperatur): wächst bei 15ºC und 40ºC, aber nicht bei 50ºC.
(15) Verhalten gegenüber Sauerstoff: Aerob
(16) O-F-Test: Fermentativ
(17) Produktion von Säure aus Zuckern und Gasbildung:
In Hinblick auf die oben erwähnten bakteriologischen Eigenschaften wurde "Bergey's Manual of Systematic Bacteriology (1986)" und "Agriculture Handbook, Nr. 427", The Genus Bacillus (U.S. Dept. of Agr. 1973)" herangezogen, und der erfindungsgemäße Bakterienstamm wurde aufgrund seiner Beweglichkeit, Gramfärbung, Aerophilie, seines pH-abhängigen Wachstums und anderen Eigenschaften als ein Sporangium Bacillus, noch genauer als ein Stamm, der dem Bacillus alcalophilus ähnelt, identifiziert. Infolgedessen wurde der erfindungsgemäße Stamm Bachlus sp. SD402 genannt.
Vergleicht man die Eigenschaften des Bacillus sp. SD402 mit denen des Bacillus alcalophilus, die in "Bergey's Manual of Systematic Bacteriology" unter anderem mit "Produktion von Säure aus Zucker" beschrieben sind, stellt man folgende Unterschiede fest:
Beim Züchten eines in Bergey's Manual beschriebenen Standardstammes NCIB10438 von Bacillus alcalophilus und des erfindungsgemäßen Stammes unter gleichen Kulturbedingungen und beim Vergleich der bakteriologischen Eigenschaften zwischen beiden Stammen wurden die folgenden Unterschiede festgestellt:
Nach den oben genannten Ergebnissen wurde der erfindungsgemäße Stamm als ein neuartiger Stamm identifiziert, der taxonomisch mit Bacillus Alcalophilus vergleichbar ist, aber andere Eigenschaften als die der bekannten Stämme aufweist.
Der erfindungsgemäße Bacillus sp. SD402 Stamm wurde am 14. Juni 1990 beim Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry, Japan, gemäß dem "Budapester Vertrag über die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zwecke von Patentverfahren" unter der Hinterlegungsnummer FERM BP-3431 hinterlegt.
Der zur Produktion der erfindungsgemäßen Cellulase verwendete Mikroorganismus ist nicht auf den oben erwähnten Bacillus sp. SD402 Stamm beschränkt, sondern es kann jeder Stamm benutzt werden, vorausgesetzt er kann eine Cellulase mit den oben erläuterten Eigenschaften produzieren. Der Bacillus sp. SD402 kann auch natürliche oder synthetische Mutanten und genetisch manipulierte Varianten umfassen.
Künstlich hergestellte Mutanten des Bacillus sp. SD402 können mittels eines herkömmlichen Verfahrens erhalten werden. Beispielsweise wird ein Ausgangsstamm einer künstlichen Mutationsbehandlung, wie beispielsweise Bestrahlung mit ultravioletten Strahlen oder Behandlung mit einer Chemikalie, beispielsweise N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin (NTG), unterworfen und anschließend auf einem Agarmedium, enthaltend L-Nährlösung (Hefeextrakt, Pepton, NaCl, und Glucose), die mit 4 Natriumcarbonat auf einen pH-Wert von ungefähr 9 eingestellt wurde, und ungefähr 0,1 bis 0,2 Gew.-% Carboxymethylcellulose, (CMC) verteilt und 1 bis 2 Tage kultiviert, so daß sich Kolonien bilden können. Jede Kolonie wird in zwei Gruppen geteilt. Eine wird auf eine Agarplatte mit L-Nährlösung bzw. die andere auf eine Agarplatte, die L-Nährlösung mit CMC enthält, aufgetragen, welche auf einen pH-Wert von 9, eingestellt worden waren. Die Koloniegruppe auf L-Nährlösung mit CMC wird in eine wässrige Kongorotlösung getaucht und eine Weile stehen gelassen und anschließend mit Kochsalzlösung gewaschen. Unter den Kolonien mit entfärbten, relativ durchsichtigen Hemmhöfen, wird die mit dem größten Hemmhof ausgewählt, und der entsprechende Stamm, welcher auf einer Agarplatte mit L-Nährlösung (ohne CMC) wächst, wird isoliert. Der Stamm wird anschließend auf einem herkömmlichen Medium zur Cellulaseproduktion gezüchtet, und die erhaltene Cellulase wird im Hinblick auf ihre Identität überprüft. Ein Stamm mit der hervorragendsten Produktivität für die Zielcellulase kann auf diese Weise gescreent werden (vgl. Applied Environmental Microbiology, Band 43, 777-780 (1982)).
Ein genetisch manipulierter Stamm kann mittels eines herkömmlichen Verfahrens ebenfalls erhalten werden. Beispielsweise wird die gesamte chromosomale DNA aus dem Ausgangsstamm extrahiert und mit einem geeigneten Restriktionsenzym verdaut, um DNA-Fragmente zu erhalten. Die so erhaltenen chromosomalen DNA-Fragmente werden in einen geeigneten Vektor eingebaut und in einen Stamm, der keine Cellulase produziert, eingeführt, und die Cellulaseproduktion wird überprüft. Das DNA-Fragment, bei dem Cellulaseproduktion festgestellt wurde, wird unter Verwendung eines geeigneten Vektors, wie beispielsweise einem Plasmid in den Ausgangsstamm oder in einen Stamm mit einer höheren Enzymproduktivität (d.h. mit einer größeren Fähigkeit, Proteine zu sekretieren) eingeführt, um einen Stamm mit verbesserter Produktivität zu erhalten (vgl. General Microbiology, 136, 1327-1334, 1990 und Appl. Microbiology Biotechnology 31, 256-271, 1989).

Züchtungsverfahren

Bei der erfindungsgemäßen Cellulaseproduktion besteht kein bestimmtes Erfordernis im Hinblick auf das Züchtungsverfahren des oben genannten Mikroorganismus, und dieser kann nach einem geeigneten herkömmlichen Verfahren entsprechend gezüchtet werden.
Als Nährstoffquellen des Mediums können diejenigen verwendet werden, die üblicherweise für die Züchtung von Mikroorganismen verwendet werden. Kohlenstoffquelle kann jede assimilierbare Kohlenstoffverbindung oder Substanzen, die diese enthalten, beispielsweise Glucose, Maltose, Stärke, CMC, etc. sein. Als Stickstoffquelle können assimilierbare Stickstoffverbindungen oder Substanzen, die diese enthalten, beispielsweise Ammoniumsalze, Pepton, Sojabohnenpulver, entfettetes Sojabohnenpulver etc. dienen. Anorganische Salze umfassen Salze wie beispielsweise Phosphate und Magnesiumsalze. Darüberhinaus können verschiedene organische oder anorganische Substanzen, die für das Wachstum von Bakterien und die Produktion von Enzymen erforderlich sind, oder Substanzen, die diese enthalten, beispielsweise Vitamine, Hefeextrakt, etc. zum Kulturmedium zugegeben werden.
Die Züchtung kann entweder in einem flüssigen Medium oder auf einem festen Medium durchgeführt werden. Eine flüssige Kultur ist bevorzugt. Die Bedingungen für die flüssige Kultur sollten für die Produktion der Zielcellulase optimiert sein, obwohl solche Bedingungen in Abhängigkeit von der Zusammensetzung des verwendeten Mediums mehr oder weniger variieren können. Die Züchtungstemperatur liegt in einem Bereich von 25 bis 35ºC und die Züchtungszeit in einem Bereich von ungefähr 12 Stunden bis ungefähr 3 Tage, und die Züchtung kann beendet werden, wenn die Cellulaseproduktion das Maximum erreicht hat. Der pH-Wert des Mediums beträgt üblicherweise 8 oder mehr, und ein pH-Wert von 9 bis 10 ist für die Cellulaseproduktion bevorzugt. Wenn die Züchtung wie oben beschrieben durchgeführt wird, kann die Zielcellulase in dem flüssigen Kulturmedium erhalten werden.

Isolierungs- und Reinigungsverfahren

Die erfindungsgemäße Cellulase kann aus dem flüssigen Kulturmedium, das wie oben beschrieben erhalten wird, isoliert und durch herkömmliche Verfahren zur Gewinnung des Enzyms gereinigt werden. Das bedeutet, die aus dem Medium erhaltenen Zellen und Feststoffe können durch ein geeignetes herkömmliches Trennungsverfahren, wie beispielsweise Filtration oder Zentrifugieren entfernt werden, um die überstehende Flüssigkeit oder das Filtrat zu erhalten. Nach Einengen kann die so abgetrennte Flüssigkeit im Sprühverfahren getrocknet oder lyophilisiert werden, oder die abgetrennte Lösung kann ohne Einengen durch Zugabe eines löslichen Salzes ausgesalzen oder durch Zugabe eines hydrophilen organischen Lösungsmittels ausgefällt werden, um eine Cellulase zu erhalten. Das Enzym kann weiterhin durch ein oder mehrere Reinigungsverfahren, wie beispielsweise Eliminierung durch Adsorption mittels eines Ionenaustauscherharzes und Gelfiltration gereinigt werden.

Eigenschaften des Enzyms

Die Eigenschaften der erfindungsgemäßen Cellulase werden nachstehend im einzelnen beschrieben.

Assay der Enzymaktivitäten

(1) Carboxymethylcellulase (CMCase)-Aktivität

Der Assay wird unter Verwendung einer Carboxymethylcellulose (CMC)-Lösung in einem M/20 Natriumcarbonat-M/20-Borsäure-Kaliumchloridpuffer (pH-Wert 9,0) als Substrat durchgeführt. Noch genauer wird 0,1 ml des Enzyms zu 0,9 ml einer Substratlösung, erhältlich durch Auflösen von CMC in M/20 Natriumcarbonat-M/20 Borsäure-Kaliumchloridpuffer (pH-Wert 9,0) zugefügt, um eine Lösung mit 0,5 Gew.-% (pH-Wert 9,0) zu erhalten, und die Reaktion wird 15 Minuten lang bei 30ºC durchgeführt. Nach Beendigung der Reaktion wird die Bestimmung der reduzierenden Zucker mittels der p- Hydroxybenzoesäurehydrazidmethode (PHBAH-Methode) durchgeführt. Das bedeutet, 3,0 ml PHBAH-Reagenz werden zu 1,0 ml Reaktionsgemisch zugegeben, und das erhaltene Gemisch wird bis zur Färbung 10 Minuten lang auf 100ºC erhitzt. Nach dem Abkühlen wird die optische Dichte bei 410 nm gemessen. Der Enzym-Assay wird in (U)-Einheiten ausgedrückt, wobei die Einheit (1 U) bedeutet, daß ein reduzierender Zucker, der einem µMol Glucose äquivalent ist, innnerhalb von 1 Minute produziert wird.

2) Avicelase-Aktivität

Avicel (Merck) wurde vorbehandelt, um die wasserlöslichen Fraktionen zu entfernen, und anschließend in M/20 Natriumcarbonat-M/20 Borsäure-Kaliumchloridpufferlösung (pH- Wert 9,0) suspendiert. Noch genauer wurde 0,1 ml der Cellulase- Lösung zu 0,9 ml 1,0 %igem Avicel (pH-Wert 9,0) zugegeben, und das Gemisch wurde 30 Minuten lang bei 30ºC umgesetzt. Nach Beendigung der Reaktion wurden 3,0 ml PHBAH-Reagenz zu 1,0 ml des Reaktionsgemisches zugefügt. Das erhaltene Gemisch wurde bis zur Färbung 10 Minuten lang bei 100ºC erhitzt. Nach Abkühlen wurde das Reaktionsgemisch colorimetrisch bei einer Wellenlänge von 410 nm gemessen. Die Einheit (1 U) des Cellulase-Assays wurde als 1 U definiert, wenn die Cellulase unter den oben genannten Bedingungen einen reduzierenden Zucker, der äquivalent zu 1µm Glucose ist, innerhalb von 1 Minute produzierte.

(3) β-Glucosidase-Aktivität und p-Nitrophenylcellobiosid- Zersetzungs aktivität

Die Aktivität der erfindungsgemäßen Cellulase als β- Glucosidase wird unter Verwendung von p-Nitrophenyl-β-D- glucopyranosid (pNPG) bestimmt, und auch die Aktivität der Zersetzung von p-Nitrophenylcellobiosid wird unter Verwendung von p-Nitrophenyl-β-D-cellobiosid (pNPC) bestimmt. Sowohl pNPG als auch pNPC sind synthetische Substrate. Noch genauer werden 0,1 ml Cellulaselösung zu einer Substratlösung aus 1,5 ml M/20 Natriumcarbonat-M/20 Borsäure-Kaliumchloridpuffer (pH 9,0) und 0,1 ml 50 mM pNPG oder 5 mM pNPC zugegeben, und das erhaltene Gemisch wird 30 Minuten lang bei 30ºC umgesetzt. Freigesetztes p-Nitrophenol wird colorimetrisch bei 400 nm bestimmt. Die Menge an Cellulase, die 1 µMol p-Nitrophenol in 1 Minute unter denselben Bedingungen freisetzt, wird als Einheit (1 U) definiert.

Eigenschaften des Enzyms

(1) Wirkung

Die erfindungsgemäße Cellulase bewirkt die Hydrolyse der β-glycosidischen Bindungen in Carboxymethylcellulose (CMC) und in hochkristalliner Cellulose, wie beispielsweise Avicel. Ebenso bewirkt sie die Freisetzung von p-Nitrophenol aus p- Nitrophenylcellobiosid, einem der synthetischen Substrate.

(2) Substratspezifität

Die erfindungsgemäße Cellulase wirkt auf CMC, Avicel, p- Nitrophenyl-β-D-cellobiosid (pNPC), aber nicht auf p- Nitrophenyl-β-D-glucopyranosid (pNPG). Setzt man die CMCase- Aktivität gleich 100, dann zeigt die Cellulase eine relative Avicelase-Aktivität von 0,04 und eine relative pNPC- Zersetzungsaktivität von 0,3.

(3) pH-Optimum

Die Cellulase wird mit CMC als Substrat 15 Minuten lang bei 30ºC und unter verschiedenen pH-Bedingungen unter Verwendung einer Britton-Robinson-Pufferlösung umgesetzt, und die Aktivität wird gemessen. Fig. 1 veranschaulicht die Beziehung zwischen dem pH-Wert, bei dem die Reaktion abläuft und der relativen Aktivität. Auf diese Weise wird das pH- Optimum zu 9,5 bis 10,5 bestimmt.

(4) Stabilität in einem pH-Bereich

Die Cellulase wird in unterschiedlichen Britton-Robinson- Pufferlösungen mit verschiedenen pH-Werten 30 Minuten lang bei 30ºC stehengelassen, und anschließend wird ihre Aktivität nach der Reaktion 15 Minuten lang bei 30ºC unter Verwendung von CMC als Substrat gemessen. Fig. 2 veranschaulicht die Beziehung zwischen dem pH-Wert, bei dem die Behandlung durchgeführt wird, und der Restaktivität der Cellulase. Der pH-Bereich der Stabilität wird auf diese Weise zu 6 bis 11 bestimmt.

(5) Temperaturoptimum

Die Cellulase wird mit CMC bei einem pH-Wert von 9,0 15 Minuten lang bei unterschiedlichen Temperaturen umgesetzt. Fig. 3 veranschaulicht die Beziehung zwischen der Reaktionstemperatur und der relativen Aktivität der Cellulase. Das Temperaturoptimum der Cellulase wird auf diese Weise zu ungefähr 55ºC bestimmt.

(6) Thermische Stabilität

Wenn die Cellulase bei verschiedenen Temperaturen (5 bis 65ºC) 30 Minuten lang in M/20 Natriumcarbonat-M/20 Borsäure- Kaliumchloridpuffer (pH-Wert 9,0) erhitzt wird, zeigt sie keine Desaktivierung bis ungefähr 40ºC und weist bei 55ºC eine Restaktivität von ungefähr 50% und bei 65ºC eine Restaktivität von ungefähr 30% auf. Fig. 4 veranschaulicht die Beziehung zwischen der Behandlungstemperatur und der Restaktivität der Cellulase.

(7) Einfluß von Enzyminhibitoren, Metallionen und Chelatbildnern

Die erfindungsgemäße Cellulase wird durch Cu&spplus;&spplus; (5 mM) oder p-Mercuribenzoesäure (5 mM) inhibiert, aber sie wird mit Ca&spplus;&spplus; (5 mM) aktiviert. EDTA (5 mM) hat keinen Einfluß auf die Aktivität der Cellulase.

(8) Einfluß des Tensids

Praktisch keine Deaktivierung wird beobachtet, wenn eine Behandlung bei 30ºC und einem pH-Wert von 9,0 2 Stunden lang in Gegenwart eines Natrium-n-alkylbenzolsulfonats in einer Konzentration von 3000 ppm durchgeführt wird. Fig. 5 veranschaulicht die Beziehung zwischen der Behandlungszeit und der Restaktivität des Enzyms.

(9) Molekulargewicht

Das Molekulargewicht der erfindungsgemäßen Cellulase, gemessen mittels des SDS-Polyacrylamidgel- Elektrophoreseverfahrens, beträgt 52000 + 2000.

(10) Isoelektrischer Punkt

Der isoelektrische Punkt der erfindungsgemäßen Cellulase, gemessen mittels Polyacrylamidgel-Elektrophorese, beträgt 4,2 ± 0,2.
Die erfindungsgemäße Cellulase wird von einem neuartigen Stamm der Gattung Bacillus, nämlich Bacillus sp. SD402 produziert und weist ein pH-Optimum in einem pH-Bereich höherer Alkalinität auf.
Vergleicht man die erfindungsgemäße Cellulase mit alkalischen Cellulasen, die von bekannten Bacillus-Stämmen produziert werden, stellt man die folgenden Unterschiede fest, die zeigen, daß die erfindungsgemäße Cellulase sich deutlich von den bekannten unterscheidet, und daß es offensichtlich ist, daß die erfindungsgemäße Cellulase eine neuartige alkalische Cellulase ist.
Die erfindungsgemäße Cellulase weist ein hohes pH-Optimum in Höhe von 9,5 bis 10,5 auf, und sogar bei einem pH-Wert von 11 ist noch eine relative Aktivität von ungefähr 70% der Aktivität des pH-Optimums und bei pH 6 eine relative Aktivität von ungefähr 60% der Aktivität des pH-Optimums vorhanden, und infolgedessen zeigt die Cellulase Aktivität in einem weiten pH Bereich. Außerdem behält sie ihre Aktivität bei niedrigen Temperaturen.
Die Verwendung der erfindungsgemäßen Cellulase ist nicht besonders eingeschränkt, und sie kann in verschiedenen Bereichen unter bestmöglicher Ausnutzung der oben genannten Eigenschaften verwendet werden. Typische Beispiele für die Verwendung der Cellulase umfassen einen Hilfsstoff für Waschmittel und ein Mittel zur Behandlung von Papier, um die Waschkraft oder die Papierherstellungsverfahren zu verbessern, da sie eine hohe Stabilität gegenüber anionischen Tensiden aufweist, welche in Waschmitteln oder bei Papierherstellungsverfahren verwendet werden. Die Menge an verwendeter Cellulase ist nicht genau vorgeschrieben, da sie in Abhängigkeit von den Verwendungszwecken, Formulierungen, Aktivitäten und Ähnlichem variieren kann. Beispielsweise enthält eine als Hilfsstoff für Waschmittel verwendete Formulierung ungefähr 0,1 bis 10 Gew.-% Cellulase, von der angenommen wird, daß ihre Aktivität 100 u/g beträgt, bezogen auf das Gewicht der Waschmittelkomponenten, die eine Gerüstsubstanz, ein Tensid, etc. umfassen. In einer Formulierung für ein Mittel zur Behandlung von Papier werden ungefähr 0,1 bis 2 Gew.-% Cellulase zu einer Aufschlämmung, die 3 bis 10 Gew.-% Zellstoffbrei enthält, zugegeben. Bei Verwendung von Cellulase mit höherer Aktivität reduziert sich die Menge an zugegebener Cellulase entsprechend.

BEISPIELE

Nachstehend wird die vorliegende Erfindung anhand von Beispielen ausführlicher erklärt. Die vorliegende Erfindung ist jedoch nicht darauf beschränkt. Soweit nicht ausdrücklich anders angegeben, sind alle Prozent-und Teilangaben auf das Gewicht bezogen.

Beispiel 1

Gleiche Teile eines flüssigen Kulturmediums, das aus 1% Pepton, 0,5% Natriumchlorid, 0,1% Dikaliumhydrogenphosphat, 0,05% Magnesiumsulfat, 0,5% Hefeextrakt, 0,5% Cellobiose, 0,5% CMC und 0,5% Natriumcarbonat zusammengesetzt war, wurden jeweils in Teströhrchen gegeben, und die Teströhrchen wurden auf herkömmliche Weise sterilisiert. Der SD402-Stamm wurde in die Teströhrchen eingeimpft, welche anschließend unter Schütteln bei 35ºC 25 Stunden lang inkubiert wurden. Das Kulturmedium wurde zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit wurde auf ihre Cellulaseaktivität gemessen. Die Aktivität betrug 0,2 U/ml.

Beispiel 2

Ein flüssiges Kulturmedium, das aus 2% Sojabohnenpulver, 0,5% Natriumchlorid, 0,1% Dikaliumhydrogenphosphat, 0,02% Magnesiumsulfat, 0,5% Hefeextrakt, 0,5% Maltose, 0,1% CMC und 0,3% Natriumcarbonat zusammengesetzt war, wurde in einen 5- Liter-Fermenter eingebracht und mit Dampf sterilisiert. Dieses Medium wurde mit vorher gezüchtetem Bacillus sp. SD402-Stamm beimpft und bei 35ºC 35 Stunden lang unter Belüftung und Rühren inkubiert. Die Kulturlösung wurde zentrifugiert, um die überstehende Flüssigkeit zu erhalten. Die überstehende Flüssigkeit wies eine Cellulaseaktivität von 1,1 U/ml auf. Die überstehende Flüssigkeit (1,3 Liter) wurde unter Verwendung einer Ultrafiltrationsmembran konzentriert und lyophilisiert, um ein Rohenzym mit einer spezifischen Cellulaseaktivität von 100 U/g zu erhalten.

Beispiel 3

Die erfindungsgemäße Cellulase wurde aus dem in Beispiel 2 erhaltenen Rohenzym in reiner Form isoliert.
Das Rohenzym (4 g) wurde in 200 ml einer 10 mM Natriumcarbonat-10 mM Borsäure-Kaliumchlorid-Pufferlösung (pH- Wert 9) aufgelöst, und mittels eines herkömmlichen Ammoniumsulfat-Fällungsverfahrens wurde ein Niederschlag erhalten, der einer Fraktion von 20 bis 70% entsprach. Der Niederschlag wurde in der oben genannten Pufferlösung aufgelöst. Nach Entsalzen mittels einer Ultrafiltrationsmembran wurde die Lösung mittels einer CM (Carboxymethyl)- Kationenaustauscherharzkolonne (Durchmesser: 25 mm, Länge: 30 cm), die mit 10 mM bis-Trispufferlösung (pH 7,0) äquilibriert war, gereinigt. Die mittels dieses Verfahrens eluierten aktiven Fraktionen wurden konzentriert und mit einer Ultrafiltrationsmembran entsalzt und anschließend an einer DEAE (Diethylaminoethyl)-Anionenaustauscherharzkolonne (Durchmesser: 25 mm, Länge: 36 cm) adsorbiert und nachfolgend mit einer Natriumchloridlösung graduell ansteigender Dichte (0 bis 1 M) eluiert. Als Ergebnis erhielt das Rohenzym mindestens 3 Cellulasetypen mit unterschiedlichen CMCase-Aktivitäten. Fig. 6 veranschaulicht die CMCase-Aktivitäten einer jeden Fraktionierung mittels eines DEAE Anionenaustauscherharzes. Die Fraktion mit den Fraktionsnummern 122 bis 141, bei der die Hauptkomponente u.a. die hervorragendenste CMCase-Aktivität aufwies, wurde konzentriert, und mittels einer Ultrafiltrationsmembran entsalzt, und anschließend mit dem gleichen DEAE-Anionenaustauscherharz gereinigt. Die aktiven Fraktionen, die mittels dieses Verfahrens eluiert wurden, wurden mit einer Ultrafiltrationsmembran entsalzt, lyophilisiert, in 10 mM bis-Trispufferlösung (pH 7,0) aufgelöst, an einer Phenylsepharose CL4B-Kolonne adsorbiert, die mit 10 mM bis-Tris-Pufferlösung (pH 7,0) äquilibriert war und anschließend mit Ammoniumsulfatlösung eluiert, deren Dichte von 1 bis 0 M graduell abnahm. Die mit diesem Verfahren eluierten aktiven Fraktionen wurden mittels einer Ultrafiltrationsmembran entsalzt und lyophilisiert. Bei dieser Vorgehensweise wurden 2,2 mg lyophilisiertes Präparat erhalten.
Das lyophilisierte Präparat war weiß, und mittels Elektrophorese an Polyacrylamidgel wurde bestätigt, daß es sich um einen einheitlichen Stoff handelte.
Unter Verwendung dieses lyophilisierten Präparats wurden das pH-Optimum, die pH-Stabilität, das Temperaturoptimum, die thermische Stabilität, Einflüsse von Enzyminhibitoren und die Stabilität gegenüber Tensiden untersucht. Die Fig. 1 bis 5 zeigen die Ergebnisse.

Beispiel 4

Unter Verwendung der erfindungsgemäßen Cellulase wurde der folgende Waschtest durchgeführt.

(a) Herstellung verschmutzter Kleidung

Ungefähr 200 ml Aktivkohle wurde in einen Mörser gegeben und mit entionisiertem Wasser verknetet, um eine wässrige Suspension zu erhalten. Auf einer Platte wurde Baumwollkleidung gleichmäßig mit dieser Suspension bestrichen und an der Luft getrocknet. Anschließend wurde die Kleidung mit einem Schwamm 20 mal gerieben, um überschüssige Aktivkohle zu entfernen. Nachdem die Kleidung in 5 cm x 5 cm große Stücke geschnitten worden war, wurden Waschtests damit durchgeführt.

(b) Waschtest

Das Waschen wurde unter Verwendung eines Terg-O-Tometers mit einer Drehzahl von 120 U/min bei 30ºC 10 Minuten lang bei einer Waschmittelkonzentration von 1330 ppm (unter Verwendung eines phosphatfreien JIS-Standardwaschmittels) durchgeführt. Die Zugabe des in Beispiel 2 erhaltenen Rohenzyms in einer Konzentration von 10 mg/l führte zur Erhöhung des Weißgrades um 5% und der Waschmittelwirksamkeit um 8% im Vergleich zu dem Waschmittel ohne Enzym.

Beispiel 5

Als Beispiel für die Verwendung der erfindungsgemäßen Cellulase in Papierherstellungsverfahren wurde ein Entfärbungstest von Altpapier folgendermaßen durchgeführt.

(a) Herstellung einer Zellstoffaufschlämmung

Altes Zeitungspapier (9 g) wurde in 5 cm x 5 cm große Stücke geschnitten, in 300 ml entionisiertes Wasser gegeben und 30 Minuten lang bei 45ºC stehengelassen. Das Gemisch wurde in einem Mischer gerührt, um eine Zellstoffaufschlämmung zu erhalten. Die Zellstoffaufschlämmung wurde mit 0,1 N NaOH auf pH 9 eingestellt und einem Entfärbungstest unterzogen.

(b) Entfärbungstest

Zu 20 ml der eingestellten Zellstoffaufschlämmung wurden 7 mg des in Beispiel 2 erhaltenen Rohenzyms gegeben und bei 45ºC 1 Stunde lang gerührt.
Das erhaltene Gemisch wurde durch ein Drahtnetz mit einer Maschenweite von 180 µm filtriert, um den Zellstoffbrei zurückzugewinnen. Der so erhaltende Zellstoffbrei wurde in 200 ml entionisiertem Wasser suspendiert und durch ein Drahtnetz mit einer Maschenweite von 180 µm filtriert, um den Zellstoffbrei zu waschen und anschließend erneut in 200 ml entionisierten Wasser suspendiert.
Die erhaltene Zellstoffauschlämmung (100 ml) wurde einem Papierherstellungsverfahren unter Verwendung eines KIRIYAMA- Trichters mit 60 mm Durchmesser unterzogen. Nach dem Trocknen an Luft wurde der Weißgrad des Papiers gemessen.
Im Vergleich mit Proben ohne Enzymzugabe zeigten die erfindungsgemäßen Proben, zu denen 7 mg des Enzyms zugegeben worden waren, einen um ungefähr 2% erhöhten Weißgrad.

Claims

1. Cellulase, die folgende Eigenschaften besitzt:

(1) ein pH-Optimum zwischen 9,5 und 10,5, gemessen unter Verwendung von Carboxymethylcellulose als Substrat;

(2) Stabilität in einem pH-Bereich zwischen 6 und 11, gemessen unter Verwendung von Carboxymethylcellulose als Substrat;

(3) ein Temperaturoptimum bei etwa 55 ºC, gemessen unter Verwendung von Carboxymethylcellulose als Substrat;

(4) der Einfluß eines Tensids ist dahingehend, daß die Restaktivität 90 % oder mehr nach 2-stündiger Behandlung mit Natrium-n-alkylbenzolsulfonat in einer Konzentration von 3000 ppm bei 30 ºC und einem pH-Wert von 9,0 beträgt;

(5) ein Molekulargewicht von 52.000 ± 2.000, gemessen durch SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese;

(6) einen isoelektrischen Punkt von 4,2 ± 0,2, gemessen durch Polyacrylamidgel-Elektrophorese; und

(7) eine thermische Stabilität bis annähernd 40 ºC.

2. Verfahren zur Herstellung einer Cellulase nach Anspruch 1, das folgende Schritte aufweist:

Züchtung eines Mikroorganismus, der zur Gattung Bacillus gehört und die in Anspruch 1 definierte Cellulase produzieren kann, in einem Medium; und

Isolierung dieser Cellulase aus dem Medium.

3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei der Mikroorganismus Bacillus sp. SD402 FERM BP-3431, ein Mutantenstamm davon oder ein gentechnisch veränderter Stamm ist, wobei letzterer die DNA-Sequenz enthält, die für die Produktion von Cellulase aus Bacillus sp. SD402 FERM BP-3431 kodiert und operativ in einen geeigneten Expressionsvektor eingebaut ist.

4. Hilfsstoff für Detergentien, der eine Cellulase nach Anspruch 1 als wirksamen Bestandteil enthält.

5. Mittel zur Behandlung von Papier, das eine Cellulase nach Anspruch 1 als wirksamen Bestandteil enthält.

6. Stamm eines Mikroorganismus, der befähigt ist, eine Celluiase nach Anspruch 1 zu produzieren, wobei der Stamm dieses Mikroorganismus Bacillus sp. SD402 FERM BP-3431, ein Mutantenstamm davon oder ein gentechnisch veränderter Stamm ist, wobei letzterer die DNA-Sequenz enthält, die für die Produktion von Cellulase aus Bacillus sp. SD402 FERM BP-3431 kodiert und operativ in einen geeigneten Expressionsvektor eingebaut ist.