JPS62296874A - 組換えｄｎａを有するバチルス属菌及びそれを用いるアルカリセルラ−ゼの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ３、発明の詳細な説明 〔産業上の利用分野〕 本発明は、アルカリ側に生育至ＪｐＨを有するバチルス
属菌由来のアルカリセルラーゼ遺伝子を有する新規な形
質転換体及びそれを用いるアルカリセルラーゼの製造法
に関するものである。

Ｃ従来技術〕 アルカリセルラーゼは、近年衣料の洗浄効果を高める洗
剤成分の１つとして期待さている。アルカリセルラーゼ
が微生物により生産される例は極めて少な（、自然界よ
り分離された菌としては、僅かにアルカリ側に生育主通
ｐ＋＋を有するバチルス（Ｂａｃｉ　１１ｕｓ）属菌（
特公昭５Ｏ−２８５１５）、セルロモナス（Ｃｅｌｌｕ
ｌｏｍｏｎｕｓ）　ｎ菌（特開昭５８−２２４６８６）
、ストレプトマイセス（Ｓｔ、ｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）
　’ｄ菌（特開昭６１１２２８２）等が知られているの
みである。一方、近年遺伝子操作技術が急速に発展し、
セルラーゼの形質転換体による生産も可能となり（特開
昭６０−１４９３８７）、アルカリセルラーゼに関する
例としては、バチルス・エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　
ｓｐ、）　Ｎ　−４菌及びバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
）　ＨＮｎ　１１３９菌由来のセルラーゼ遺伝子を組み
込んだ大腸菌によって、アルカリセルラーゼが生産され
たことが報告されている〔Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　
　　　１５８　　：４！５　　、　　　５０３〜５０６
　　頁　　（１９８４）　　、層化大会昭和６０年度要
旨築３２頁〕。

〔発明が解決しようとする問題点〕

上述のアルカリセルラーゼ生産菌のうちの１つである好
アルカリ性バチルス属菌を一般の酵素生産に利用される
培地で培養を行ってもその生産量は極めて少量であり、
このままでは工業的に安価にアルカリセルラーゼを製造
出来ないのであった。

一方、バチルス・エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ、
）　Ｎ　−４菌及びバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）　ｍ
Ｎｎ　１１３９菌由来のセルラーゼ遺伝子を組み込んだ
大腸菌によっである程度生産性が高められたけれども、
まだ不十分であり、かつ菌体内に酵素が生産されるため
工業上利用するには不利であった。

〔問題点を解決するための手段〕

かかる状況に鑑み、工業的に安定に安価なアルカリセル
ラーゼを製造する方法として遺伝子組換え技術を応用し
、かつ枯草菌にアルカリセルラーゼ遺伝子を組み入れる
ことを検討した。そしてアルカリセルラーゼ生産性好ア
ルカリ細菌であるバチルス・エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓ　ｓｐ、）　Ｎ　−２（ＦＥＲＭ−Ｐ　Ｎ１８８０９
）菌よりアルカリセルラーゼ遺伝子断片を単離し、次い
でこのアルカリセルラーゼの遺伝情報を担うＤＮＡ断片
をプラスミドベクターに組み込ませ、この組換えプラス
ミドを例えばバチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
　５ｕｂｔｉｌｉｓ　）　ＲＭ１２５株に導入すること
によって得られた微生物は通常の培養培地を用いて培養
したところ高いアルカリセルラーゼ生産能を有し、しか
も安定でかつ菌体外にアルカリセルラーゼを生産してい
ることを見出し本発明を完成したのである。

以下に本発明の詳細な説明する。

〔本発明微生物の調製〕

アルカリセルラーゼ生産国バチルス・エスピー（Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓ　ｓｐ、）　Ｎ　　２　（ＦＥＲＭ−Ｐ　患
８８０９）菌株からの染色体ＤＮＡの分離は常法に従っ
て、例えばＢｉｏｃｈｉｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃ
ｊａ　　７２巻、　　６１９〜６２９頁（１９６３）に
記載の斉藤らの方法によって調製できる。

次に、この染色体ＤＮＡからアルカリセルラーゼ遺伝子
を単離する目的で大腸菌によるショットガンクローニン
グを行う。即ち、上記で得られた染色体ＤＮＡをベクタ
ーＤＮＡに組み込んで組換えＤＮＡを調製する。染色体
ＤＮＡのベクターＤＮＡへの組み込みは、Ｊ、　Ｍｏ１
．　Ｂｉｏｌ、　９６Ｑ、　　１７１〜１８４　　（１
９７５）に記載の方法に従い染色体ＤＮＡ及びベクター
ＤＮＡを制限酵素で切断し、次いでリガーゼを用いて結
合することにより行うことができる。ベクターＤＮＡと
しては、例えばプラスミドＤＮＡが挙げられ、特にプラ
スミドｐＢＲ３２２が好ましい。又制限酵素としては、
例えば旧ｎｄＩＩ［。

［ＥｃｏＩＩ　＋などが挙げられ、リガーゼとしては、
例えばＴ　４　Ｄ　Ｎ　Ａ　リガーゼが挙げられる。

組換えＤＮＡの大腸菌への導入は、例えばＪ、　Ｂａｃ
ｔｅｒｉｏｌ、　　１１９巻、　１０７２〜１０７４頁
（１９７４）に記載の塩化カルシウム処理法により行う
ことができる。尚使用する大腸菌としては、エツジエリ
チア・コリ　（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）　
ＨＢ　１０１株が好ましい。アルカリセルラーゼ遺伝子
を組み込んだいわゆる組換えＤＮＡを含有する菌株の選
択は、まず組換えＤＮＡを導入された大腸菌をアンピシ
リン及びカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ−Ｎａ）
を含むし一ブロス寒天培地にまき、２日間培養後、アン
ピシリンを含むし一グロス寒天培地にレプリカした後、
２日間培養したマスタープレートをＡｐｐｌ、　Ｅｎｖ
ｉｒｏｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　４３巻、７７７頁
（１９Ｂ２）に記載のコンゴーレッドを用いる発色によ
るエンドグルカナーゼ（ＣＭＣａｓｅ）の検出法によっ
て行うことが出来る。又ＣＭＣ−Ｎａを含む上記培地に
トリパンブルーを０．２５ｍｇ／−の濃度に添加した培
地にまいて、直接ハローを検出させる方法によってもセ
ルラーゼ生産性株の選択が出来る。次にコンゴーレッド
による発色法或いはトリバンブルーでの直接選択法によ
って選択された菌株をアンピシリンを含むし一ブロス培
地で一夜振盪培養後、菌体を集め、菌体を超音波、凍結
融解、リゾチーム−トリトン処理等の方法により、酵素
蛋白質などを抽出し、セルラーゼ活性の有無を調べる。

一方、菌体からＮｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ。

７巻、　１５１３〜１５２３頁（１９７９）に記載のア
ルカリ法によってプラスミドを抽出し、各種制限酵素に
よる分解を行い、アルカリセルラーゼ遺伝子を含む遺伝
子断片の存在が確認されると共に、制限酵素地図も作成
される。かくして得られる組換えＤＮＡでは、アルカリ
セルラーゼ以外の遺伝子部分を多く含んでいるため更に
低分子化をする必要がある。いわゆるサブクローニング
と呼ばれる手段によって低分子化する。即ち、適切な制
限酵素によって上記組換えＤＮＡを切断後、Ｔ　４　Ｄ
　Ｎ　Ａ　Ｕガーゼによって再結合して大腸菌に導入し
た後、アルカリセルラーゼ生産性を指標としてｉｊｊ記
の如く陽性株を選択する。得られた陽性株より低分子化
さたプラスミドを採取する。

次に得られたアルカリセルラーゼ遺伝子断片を例えばプ
ラスミドベクターｐＵＢ１１０の様な枯草菌用ベクター
に結合してバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）　ａ菌に導入
することにより、高生産能を有する形質転換株が得られ
る。即ち、大腸菌より調製されたプラスミドを例えば、
制限酵素１１ｉｎｄｌｌＩ又はＣ１ａ　Ｉで分解し、ｐ
ＢＲ３２２のＥｃｏＲＩ　　Ｂａｍ１ｌ　１部位をｐＵ
ＢｌｌｏのＥｅｏＲＩ　−ＢａｍＨＩ部位と置き換えて
調製した枯草菌用プラスミドベクターｐｔｌＢＨＩ　　
〔Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１６０巻、　　４４２
〜４４４頁（１，９８４）　３の旧ｎｄｌＩＩ又はＣｌ
ａＩ分解物にＴ４ＤＮＡリガーゼで結合し、とｏｌ、　
Ｇｅｎ。

Ｇｅｎｅｔ、　１６８巻、　　１１１〜１１５頁（１９
７９）に記載のチャングとコーエン（Ｃｈａｎｇ　＆Ｃ
ｏｈｅｎ　）の方法に従って、例えばバチルス屈細菌と
してバチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂ
ｔｉｌｉｓ　）　ＲＭ　１２５株を宿主菌として形質転
換する。アルカリセルラーゼ生産性法の検出は、カナマ
イシンを含むＤＭ−３培地に生育した形質転換株を培地
にレプリカしてハローを形成する株として選択（−るこ
とか出来る。

本発明の微生物としては、前記した方法でｐＵＢＩｌｒ
にバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）　Ｎ　−２株の染色体
ＤＮＡ由来のアルカリセルラーゼ遺伝子を導入したプラ
スミドを含有する、例えばバチルス・ズブチリス（Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ　）　ＲＭ　１２５　
　（ｐｃＮＵ２２１　）及び同様の方法でｐｕｎｃｈの
ＥｃｏＲＶ　−１１ｉｎｄＩ［１部位に別のアルカリセ
ルラーゼ遺伝子を導入したプラスミドを有する同（ｐｃ
ＮＵ２１１　）が挙げられる。

〔アルカリセルラーゼの製造〕

本発明の微生物によるアルカリセルラーゼの製造に用い
られる培地としては、一般的に微生物の培養において使
用される炭素源、窒素源、無機物を含有する合成培地も
しくは天然培地のいずれをも使用することが出来る。し
かし例示した様な栄養要求性を有する株を宿主とする場
合には要求物質を別途添加する必要がある。炭素源とし
ては、例えばでん粉、グルコース、シュークロース、糖
蜜などの種々の炭水化物が５〜ｌｏｏｇ／Ｎの濃度で使
用されることが好ましい。又窒素源としては、例えば硝
酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、シュウ酸アンモニ
ウムなどの無機物或いはペプトン、酵母エキス、肉エキ
ス、大豆タンパク、魚粉、コーンステイープリカー、カ
ゼイン分解物などの有機窒素化合物などが用いられる。

その濃度は２〜８０ｇ／ｊ！が好ましい。又その他に、
微量無機成分としてリン酸第１水素カリウム、リン酸第
２カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸マンガン、食塩な
どの添加が好ましく、０．０２〜５　ｇ　／　（！の濃
度が良い。更に微量の添加が好ましい物質としては、プ
ラスミドの安定保持のための抗生物質などがある。

例えば、カナマイシン耐性遺伝子を有するプラスミドベ
クターｐＵＢ１１０由来の組換えＤＮＡの場合には、カ
ナマイシンが５〜１０ｐｇ／ｒｒｄ！の濃度で加えられ
る。本発明の微生物の培養は、組換えＤＮＡに関する規
制の範囲内で、一般の微生物の液体培養と同様の方法で
行うことが出来る。そして、アルカリセルラーゼは培養
上清に生産蓄積され、通常の酵素のｔＷＡ製法に従って
回収生成される。

〔アルカリセルラーゼの活性測定〕

アルカリセルラーゼ活性の測定はジニトロサリチル酸（
ＤＮＳ）による還元糖の定量法に基づいて以下の如く行
う。即ち、基質として、ＣＭＣ−Ｎａ　　１．２５％水
溶液０．８−１Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＮａＣ１−ＮａＯＨ緩
衝液（Ｉ　Ｍ、　ｐＨ１０，０）　　０．１＋ｎｅ、酵
素液０．１ｉを混合して３７℃、２０分間反応させ、反
応終了後、ＤＮＳＮＳ溶液２脊ｌ合して、１００℃、６
分間加熱する。冷却後、脱イオン水２ｍｅを加えて希釈
した後、波長５４０ｎｍにおける吸光度を測定する。対
照は酵素液を加える前にＤＮＳ溶液を加え、次に酵素液
を所定量加えて直ちに１００℃、６分間加熱した後、同
様に吸光度を測定する。

酵素力価は上記条件下で１分間に１μｍｏｌｅのグルコ
ースに相当する還元糖を生成するとき１単位とする。

〔アルカリセルラーゼ遺伝子の塩基配列の決定〕アルカ
リセルラーゼ遺伝子のＤＮＡ塩基配列は、ベクターＭ１
３ｍｐ１９にクローニングしたＤＮＡ断片をＰｒｏｃ、
　　Ｎａｔｌ、　八ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　　ＵＳＡ　　
７４巻、　　５４６３頁（１９７７）記載のジデオキシ
シーケンス法を用いて決定出来る。尚決定されたＤＮＡ
塩基配列を示したが、塩基置換、削除、挿入、転移等の
変異の入った誘導配列についても本発明の方法の実施に
より得られることは当然考えられる。

以下、実施例により本発明の詳細な説明する。

実施例１ （１）アルカリセルラーゼ遺伝子の大腸菌によるクロー
ニング ｉ）アルカリセルラーゼ生産菌バチルス・エスピー（Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ、）　Ｎ　−２（ＦＥＲＭ−Ｐｍ
８８０９）菌株からの染色体ＤＮＡの調製バチルス・エ
スピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ、）　Ｎ　−２（ＦＥＲ
Ｍ−ＰＩＩ＆１８８０９）菌株をＬ−ブロス培地１１で
、３７℃、１５時間振盪培養して得られた菌体から、Ｂ
ｉｏｃｈｉｍ、　　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　八ｃｔａ　　　
７２巻、　　　６１９〜６２９　　頁（１９６３）に記
載の斉藤らの方法に従って染色体ＤＮＡの調製を行い、
約４３０ノｘｇ　／　ｒｎｌ！のＤＮＡｆ６液１〇−全
１〇。

ｉｉ　）染色体ＤＮＡ断片のベクターへの挿入バチルス
・エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ、）　Ｎ　−２（
ＦＥＲＭ−Ｐｍ８８０９）菌株より調製した染色体ＤＮ
Ａ溶液１０度、１０倍濃度のｌ１ｉｎｄＩＩｒ用覆衝液
５）Ｊｅ、滅菌蒸留水３４ノ司、ｌ１ｉｎｄＩＩＩ　（
宝酒造社製品）ＩＡを混合し、３７℃、５分間、１０分
間、２０分間の反応を行った。次に、１ｍＭＥＤＴＡを
含む１ＯＩＩ＋Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐｔｌ　８．０、
ＴＥと略す。）で飽和したフェノール溶液を等回加えて
反応を停止させると同時に除蛋白を行い、エーテル抽出
後、エタノール沈澱によりＤＮＡの精製を行い、得られ
た沈澱物を乾燥ｆ＆５０ｐｆのＴＥにｆ６解して染色体
ＤＮＡ断片溶液とした。一方、プラスミドベクターｐＢ
Ｒ３２２（３３０Ｐｇ／ｍｉ’）　３１ｕｊ！、１０倍
濃度の旧ｎｄｌｌｌ用緩衝液１０ｐ２、滅菌蒸留水５６
ｇ、）ＩｉｎｄＩ［Ｉ　３　ｐｉを混合し、３７°Ｃ１
３時間反応した後、エタノール沈澱を行い、沈澱物を滅
菌蒸留水１８０．ｆに熔解し、１０倍濃度の大腸菌アル
カリフォスファターゼ用緩ｔｉｊ液２ｆＷ、大腸菌アル
カリフォスファターゼ（宝酒造社製品）ＩＡを加えて混
合し、６０℃、１時間脱リン酸化反応を行った。フェノ
ール処理後、前記と同様にエタノール沈澱を行い沈澱物
をＴ　Ｅ　２０ｐＲに熔解してリガーゼ反応に供した。

即ち、リガーゼ反応は先に調製した染色体ＤＮＡ断片溶
液各２０ｐＲ，Ｈ４ｎｄ１Ｍ分解後ＢＡＰ処理を施した
ｐＢＲ３２２溶液各２４．１０倍濃度のりガーゼ緩衝液
５　ｐｉ、　１００ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）
溶液５４．１０ｍＭＡ　Ｔ　Ｐ　５　ｐｉ、滅菌蒸留水
１２Ｊ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製品）１＋ｄを
混合して１０°Ｃｌ２Ｏ時間反応し、その全量を形質転
換に使用した。

ｉｉｉ　）大腸菌の形質転換とアルカリセルラーゼ生産
株の選択 形質転換は宿主菌としてエツジエリチア・コリ（Ｅｓｃ
ｈｅｒｉｃｈｔａ　ｃｏｌｉ）　ＨＢ　１０１株を用い
先に記した塩化カルシウム法により行った。即ち、宿主
菌をＬ−ブロス５ｍｆ！にて対数増殖中期（ＯＤ６６６
ｎｍ＃０．４０）まで生育させた後、遠心分離により集
菌し、氷冷した５０ｍＭ塩化カルシウム溶液２．５ｍｌ
を加えて懸濁し氷水中に３０分間保存後遠心分離により
集菌し、再び同溶液０．３ｄに懸濁し、ｉｉ　）で得た
ＤＮＡ１液を加え、氷水中に３０分間保持した後、４２
℃で２分間加熱処理を行った。この処理液にＬ−ブロス
　１．７ｍ＋’を加え、３７°Ｃ１１時間保温した後、
ＣＭＣ−Ｎａ　　１％、アンピシリン１００．ｕｇ　／
　ｍｔ！を含むＬ−ブロス寒天培地にまき、３７℃、２
日巻培養した。アルカリセルラーゼ生産株の検出は、生
育した形質転換株をアンピシリン１１００ｐ／−のみを
含むＬ−ブロス寒天培地にレプリカ法により移植後、マ
スタープレートにコンゴーレッド’１ｇ　液（０，１％
）約５ｍ１を加えて１５分間放置し水洗後ＩＭ食塩溶液
全豹−を加えてコロニーの周辺に透明ゾーンを形成させ
るコンゴーレッド発色法により行い、陽性株を３種得た
。これらの菌株からＮｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ
ｓ、　　７巻、　　１５１３〜１５２３頁（１９７９）
記載のアルカリ法によってプラスミドを分離し、各種制
限酵素を用いて分解し、１％アガロースゲル電気泳動に
よる解析を行った結果、約１１．７Ｋｂの挿入断片を有
する１群と約４．２Ｋｂの挿入断片を有する■群にタイ
プ別けした。タイプＩ、■については更に旧ｎｄＩ［Ｉ
切断部位を利用してサブクローニングを実施した。即ち
、アルカリ法によって調製して得たプラスミド約３ｐｇ
を含む溶液２５ｐ１．１０倍濃度の旧ｎｄｉｎｌＵ衝液
５ｇ、滅菌水１６４、ＲＮａｓｅＡ熔液２４、溶液ｎｄ
ｌｌｌ　２　ｐｉ！を混合し、３７℃、１５分間反応さ
せた後、前記の如くアルカリフォスファターゼ処理を行
った。得られたＨｉｌｄＩＩ［分解物を予めＨｉｎｄｌ
ｌｒで分解した約０　、２ｐｇのｐＢｒ１３２２にＴ４
ＤＮＡリガーゼを用いて結合させて、前記の如く大腸菌
に導入シタ。タイプ■からは３．４Ｋｂのｌ１ｉｎｄＩ
ＩＩＩ！ｆｒ片を有するプラスミドｐｃＮ２１０、タイ
プ■からは２．ＩＫｂの旧ｎｄＩＩ［断片を有するプラ
スミド匹Ｎ２２１を得た。

更にｐｃＮ２１０からはＥｃｏＲＶ切断部位を利用して
、ｐｃＮ２１０をＥｃｏＲＶで分解後、Ｔ４ＤＮＡリガ
ーゼで結合させる事により　２．５Ｋｂの旧ｎｄＩＩ［
−ＥｃｏＲＶ断片が挿入、されたプラスミドｐｃＮ２１
１を得た。

（２）アルカリセルラーゼ遺伝子の塩基配列の決定上記
実施例１−（１）で得られたプラスミドｐｃＮ２１１及
びｐｃＮ２２１の挿入断片、即ち２．５Ｋｂの旧ｎｄｌ
ｌｌ　−ＥｃｏＲＶ断片と２．ＩＫｂの！１ｉｎｄｌＩ
［断片の塩基配列をベクターＭ１３ｍｐ１８及びＭ１３
ｍｐ１９を利用するジデオキシシーケンス法により決定
した。

結果を第１図及び第２図に示す。

（３）大腸菌形質転換株によるアルカリセルラーゼの生
産 得られた２種の形質転換株、エツジエリチア・コリ　（
Ｈｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）　Ｊ（Ｂ　１０１
　　（ｐｃＮ２１１）、エツジエリチア・コリ　（Ｅｓ
ｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）ＨＢ　１０１　　（ｐ
ｃＮ２２１）をアンピシリンを１００μｇ／ｍＲ添加し
たし一ブロス２００ｍ１で３７°Ｃ１１８時間振盪培養
し、集菌洗浄後、２０ｍＭ　トリス塩酸緩衝液（ｐ）１
７．５）　１０ｍ１により海砂を用いて摩砕を行い、粗
酵素抽出液を得た。この粗酵素液を用いてアルカリセル
ラーゼの作用１ＡｐＨをブリトンーロビンソン緩衝液を
使用して常法に従って測定した結果、いずれも至適ｐ）
ＩがｐＨ７〜８付近に存在し、ｐＨ１０でも最大活性の
５０％以上を示す事が確認された。尚、宿主菌であるエ
ツジエリチア・コリ　（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌ
ｔ　）　ＨＢ　１０１株ではこの様なアルカリセルラー
ゼは全く検出されなかった。

（４）アルカリセルラーゼ遺伝子のバチルス屈細菌への
導入 ｉ　）　ｐｃＮ２１１由来アルカリセルラーゼ遺伝子断
片のｐＵＢｌｌＴへの導入 エツジエリチア・コリ　（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃ
ｏｌｉ）ＨＢ　１０１　　（ｐｃＮ２１１）株より得ら
れたプラスミドｐｃＮ２１１を約３ｐｇ含む溶液２５．
ｕｆ、　１０倍濃度のＥｃｏＲＩ緩衝液５　ｐＪ！、加
熱処理したＲＮａｓｅＡ　（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ社製
品＞２ｔａｇ／ｍｅ’１ｇ液５　ｐｉ’、滅菌蒸留水１
０４、ＥｃｏＲＶ　２．５４．　ＨｉｎｄＩ［２，５ｐ
Ｊ！を混合して３７℃、３時間反応後、１２．５４の反
応停止液を加えて１％アガロースゲル電気泳動を行った
。一方プラスミドベクターｐＵＢＩ１１約１　ｐｇを含
む溶液１０度、上記ＥｃｏＲＩ　緩衝液２ｐｌ、　ＲＮ
ａｓｅＡ熔液２Ａ、減液２Ａ水４ｐ、ＥｃｏＲＶ　ｌ　
扉、ＨｉｎｄＩ［Ｉ　１　ｐｉを混合して同様に反応を
行い、５ｐβの反応停止液を加えて電気泳動を行った。

泳動後、アルカリセルラーゼ遺伝子断片＜　２．５Ｋｂ
）とｐＵＢｌｌＩのＥｃｏＲＶ　−ＨｉｎｄＩ［Ｉ断片
（３，９Ｋｂ）を＾ｎａ１．　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１０
１％、　３３９頁（１９８０）記載のガラスフィルター
によるアガロースゲルからのＤＮＡ断片の抽出精製法に
より採取した。各抽出全豹１７Ｊと、１０倍濃度のりガ
ーゼ緩衝液５　ｐｅ、１００ｍＭＤ　Ｔ　Ｔ溶液５ｄ、
１０ｍＭＡ　Ｔ　Ｐ　　５４２．　Ｔ　４ＤＮＡリガ一
ゼ１度を混合して室温で２時間反応し、その全量を形質
転換に使用した。

ｉｉ）バチルス属細菌の形質転換とアルカリセルラーゼ
の生産株の選択 形質転換は、宿主菌として、バチルス・ズブチリス（Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｕｔｉｌｉｓ）　ＲＭ　１２５
株を用い、Ｃｈａｎｇ　ａｎｄ　Ｃｏｈｅｎによるプロ
トプラスト法に従って行った。即ち、宿主菌をバクトペ
ナセイブロス（Ｄｉｆｃｏ社製品）５−にて対数増殖中
期（ＯＤ６６０ｎｍ＃０．４　）まで生育させた後、遠
心分離により集菌し、ＳＭＶＰ溶液０．５ｍｆ！で洗浄
後、リゾチームを２■／ｉの濃度に添加したＳＭＭＰ溶
液に懸濁し、３７℃、１時間〜１．５時間保温してプロ
トプラスト化を行った。次に遠心分離してプロトプラス
トを集めた後、ＳＭＭＰ溶液で洗浄し、同波０．５−に
懸濁した。このプロトプラスト懸濁液に上記ＤＮＡ溶液
全量を混合し、直ちに４０％ポリエチレングリコール溶
液１．５−を加えて静かに攪拌混合し、２分後にＳＭＭ
Ｐ溶液５−を加えてから遠心分離してプロトプラストを
集め、ＳＭＭＰ熔液１溶液加えて懸濁後、３７℃、１．
５時間保温した。

保温後カナマイシン３００ｚ嘔／ｍｅの濃度に含’ｌ；
ＤＭ−３培地に塗布し、３７℃、２日間培養した。生育
した形質転換株をカナマイシン１０ｐｇ／ｍｅ、トリパ
ンブルー０．２５ｍｇ／ｍｅ、ＣＭＣ−Ｎａ　　１％を
含むＭ−３寒天培地に移植した。１〜２日後、コロニー
の周辺に生成される透明ゾーンの大きさによりアルカリ
セルラーゼ遺伝子を保持する形質転換株の選択を行った
。

ｉｉｉ　）　ｐｃＮ２２１由来アルカリセルラーゼ遺伝
子断片のバチルス属細菌への導入 ｐｃＮ２２１由来アルカリセルラーゼ遺伝子の場合と同
様にエツジエリチア・コリ　（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｌｉ
ａｃｏｌｉ）　ＨＢ　１０１　　（ｐｃＮ２２１）株よ
りアルカリ法で開裂したプラスミドから旧ｎｄＩＩ［断
片（２，ＩＫｂ）を採取し、ｐＵＢＨＩの旧ｎｄｌＩ＋
部位に挿入してバチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕ
ＳＳｕｂｔｉｌｉｓ　）　ＲＭ　１２５株に導入した。

実施例２　アルカリセルラーゼ遺伝子含有バチルス属細
菌によるアルカリセルラーゼの生産バチルス（Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓ）　Ｎ　−２、バチルス・ズブチリス（Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ　）　ＲＭ　１２５、バ
チルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌ
ｉｓ　）　ＲＭ１２５（ｐＣＮＵ２工１）、バチルス・
ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ　）　
ＲＭ　１２５　（ｐｃＮＵ２２１　）の各菌株を可溶性
デンプン１％を含むＮＹ−ブロス培地で３７℃、２日間
振盪培養した。培養終了後、遠心分離により菌体を除去
した後、上清についてアルカリセルラーゼ活性を測定し
た。尚、Ｎ−２株の場合には別殺菌した１０％炭酸ナト
リウム溶液を１／１゜量添加した培地を用い、形質転換
株の場合にはカナマイシンを１０ｐｇ／ｍｅの濃度に添
加した培地を用いた。

第　　１　　表 □□□厘 〔発明の効果〕 好アルカリ性バチルス菌のアルカリセルラーゼ遺伝子を
通常の枯草凹に組み入れることによって工業的に安価な
アルカリセルラーゼを製造することに成功した。

【図面の簡単な説明】

第１図及び第２図はプラスミドｐｃＮ２１１及びｐｃＮ
２２１の挿入されたアルカリセルラーゼ断片の塩基配列
を示すものである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　バチルス属菌細胞内で発現しアルカリセルラーゼを
   コードする遺伝子がバチルス属菌細胞内で増殖しうるプ
   ラスミドベクターに接続されている組換えＤＮＡを有す
   るバチルス属菌。 ２　アルカリセルラーゼをコードする遺伝子が第１図及
   び第２図で示されるＤＮＡ塩基配列である特許請求の範
   囲第１項記載の組換えＤＮＡを有するバチルス属菌。 ３　バチルス属菌細胞内で発現しアルカリセルラーゼを
   コードする遺伝子がバチルス属菌細胞内で増殖しうるプ
   ラスミドベクターに接続されている組換えＤＮＡを有す
   るバチルス属菌を培養し、培養物中にアルカリセルラー
   ゼを生成せしめこれを採取することを特徴とするアルカ
   リセルラーゼの製造法。 ４　アルカリセルラーゼをコードする遺伝子が第１図及
   び第２図で示されるＤＮＡ塩基配列である特許請求の範
   囲第３項記載のアルカリセルラーゼの製造法。