JPH06217781A - 新規ｄｎａ断片、これを保有するプラスミドベクター及び組換え微生物並びにこれを用いる蛋白質の製造法 - Google Patents
新規ｄｎａ断片、これを保有するプラスミドベクター及び組換え微生物並びにこれを用いる蛋白質の製造法Info
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- JPH06217781A JPH06217781A JP2592593A JP2592593A JPH06217781A JP H06217781 A JPH06217781 A JP H06217781A JP 2592593 A JP2592593 A JP 2592593A JP 2592593 A JP2592593 A JP 2592593A JP H06217781 A JPH06217781 A JP H06217781A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 バチルス属細菌由来アルカリセルラーゼ産生
遺伝子のプロモーター領域および分泌シグナルペプチド
領域に由来する塩基配列を有する、下流領域に結合した
構造遺伝子の発現を増大させ得るＤＮＡ断片、このＤＮ
Ａ断片を保有するプラスミドベクターおよび当該ベクタ
ーを含む組換え微生物並びにこの微生物を培養し、当該
培養物中から目的蛋白質を分離することを特徴とする蛋
白質の製造法。 【効果】 本発明のＤＮＡ断片を組み込んだプラスミド
ベクターは幅広い宿主微生物において、有用な蛋白質を
コードする各種の構造遺伝子の発現を促進することがで
きるので、有用蛋白質の大量生産が可能となる。
遺伝子のプロモーター領域および分泌シグナルペプチド
領域に由来する塩基配列を有する、下流領域に結合した
構造遺伝子の発現を増大させ得るＤＮＡ断片、このＤＮ
Ａ断片を保有するプラスミドベクターおよび当該ベクタ
ーを含む組換え微生物並びにこの微生物を培養し、当該
培養物中から目的蛋白質を分離することを特徴とする蛋
白質の製造法。 【効果】 本発明のＤＮＡ断片を組み込んだプラスミド
ベクターは幅広い宿主微生物において、有用な蛋白質を
コードする各種の構造遺伝子の発現を促進することがで
きるので、有用蛋白質の大量生産が可能となる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、各種宿主微生物におい
て遺伝子発現を促進させ得るＤＮＡ断片、これを含有す
る新規なプラスミドベクター及びこのプラスミドベクタ
ーを含む組換え微生物並びに当該組換え微生物を用いた
蛋白質の製造法に関する。
て遺伝子発現を促進させ得るＤＮＡ断片、これを含有す
る新規なプラスミドベクター及びこのプラスミドベクタ
ーを含む組換え微生物並びに当該組換え微生物を用いた
蛋白質の製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】最近、遺伝子工学の研究が盛んに行われ
てきており、遺伝子組換え体微生物を用いて有用蛋白質
を大量に生産させる例が報告されている。遺伝子工学に
おける蛋白質の大量生産に用いるベクターとしては、ア
ミラーゼ、プロテアーゼやレバンシュークラーゼ等の菌
体外酵素の生産に関与する遺伝子の各種のプロモーター
領域及びこれらの蛋白質の菌体外への分泌に関するシグ
ナルペプチドをコードする領域を応用した発現・分泌ベ
クターが用いられている。
てきており、遺伝子組換え体微生物を用いて有用蛋白質
を大量に生産させる例が報告されている。遺伝子工学に
おける蛋白質の大量生産に用いるベクターとしては、ア
ミラーゼ、プロテアーゼやレバンシュークラーゼ等の菌
体外酵素の生産に関与する遺伝子の各種のプロモーター
領域及びこれらの蛋白質の菌体外への分泌に関するシグ
ナルペプチドをコードする領域を応用した発現・分泌ベ
クターが用いられている。
【０００３】これらの発現・分泌ベクターは、前記プロ
モーター領域や分泌シグナルペプチド領域の下流に目的
の蛋白質をコードする構造遺伝子を連結し、これを大腸
菌（Escherichia coli）、枯草菌（Bacillus subtili
s）、パン酵母（Saccharomycescerevisiae）等の適当な
宿主菌に導入することによって目的の蛋白質を大量に分
泌生産することが可能とするものである。
モーター領域や分泌シグナルペプチド領域の下流に目的
の蛋白質をコードする構造遺伝子を連結し、これを大腸
菌（Escherichia coli）、枯草菌（Bacillus subtili
s）、パン酵母（Saccharomycescerevisiae）等の適当な
宿主菌に導入することによって目的の蛋白質を大量に分
泌生産することが可能とするものである。
【０００４】具体的には、バチルス アミロリケファシ
エンス（Bacillus amyloliquefacience）のα−アミラ
ーゼ遺伝子を利用した発現分泌ベクターによる枯草菌宿
主でのヒト インターフェロンα2の生産［I. Palvaら、
Gene, 22, 229-235(1983)］、枯草菌のα−アミラーゼ
遺伝子を利用した枯草菌宿主での大腸菌β−ラクタマー
ゼの生産［K. Ohmura ら、J. Biochem., 95. 87-93(198
4)］、バチルス アミロリケファシエンスのアルカリ及
び中性プロテアーゼ遺伝子を利用した枯草菌宿主でのス
タフィロコッカス（Staphylococcus）プロテインＡの生
産［N. Vasanthaと L. D. Thompson、J. Bacteriol., 1
65, 837-842(1986)］、バチルス アミロリケファシエン
スのアルカリプロテアーゼ遺伝子を利用した枯草菌宿主
での大腸菌アルカリホスファターゼの生産［M. S. Payn
e と E. N. Jackson、J. Bacteriol.,173, 2278-2282(1
991) ］、大腸菌の外膜蛋白質遺伝子を利用した大腸菌
宿主でのβ−ガラクトシダーゼの生産［J-H Seoら、Bio
technol. Bioeng., 32. 725-730(1988)］、枯草菌のレ
バンシュークラーゼ遺伝子を利用した枯草菌宿主でのク
ロストリディウム（Clostridium）のエンドグルカナー
ゼＡの生産［G. Joliffら、Appl. Environ. Microbio
l., 55, 2739-2744(1989)］などが報告されている。
エンス（Bacillus amyloliquefacience）のα−アミラ
ーゼ遺伝子を利用した発現分泌ベクターによる枯草菌宿
主でのヒト インターフェロンα2の生産［I. Palvaら、
Gene, 22, 229-235(1983)］、枯草菌のα−アミラーゼ
遺伝子を利用した枯草菌宿主での大腸菌β−ラクタマー
ゼの生産［K. Ohmura ら、J. Biochem., 95. 87-93(198
4)］、バチルス アミロリケファシエンスのアルカリ及
び中性プロテアーゼ遺伝子を利用した枯草菌宿主でのス
タフィロコッカス（Staphylococcus）プロテインＡの生
産［N. Vasanthaと L. D. Thompson、J. Bacteriol., 1
65, 837-842(1986)］、バチルス アミロリケファシエン
スのアルカリプロテアーゼ遺伝子を利用した枯草菌宿主
での大腸菌アルカリホスファターゼの生産［M. S. Payn
e と E. N. Jackson、J. Bacteriol.,173, 2278-2282(1
991) ］、大腸菌の外膜蛋白質遺伝子を利用した大腸菌
宿主でのβ−ガラクトシダーゼの生産［J-H Seoら、Bio
technol. Bioeng., 32. 725-730(1988)］、枯草菌のレ
バンシュークラーゼ遺伝子を利用した枯草菌宿主でのク
ロストリディウム（Clostridium）のエンドグルカナー
ゼＡの生産［G. Joliffら、Appl. Environ. Microbio
l., 55, 2739-2744(1989)］などが報告されている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、上述の
様なベクターを用いた蛋白質生産においては、その生産
量が未だ十分とはいえず、遺伝子工学の応用による有用
蛋白質の工業的生産例は、極めて少ないのが現状であっ
た。このような状況から見て、幅広い宿主微生物におい
て、有用な蛋白質をコードする各種の構造遺伝子の発現
を促進するＤＮＡ断片を見出し、これを用いて有用蛋白
質の大量生産を可能とする新規なプラスミドベクターを
構築することは極めて意義のあることであり、遺伝子工
学の大きな課題である。
様なベクターを用いた蛋白質生産においては、その生産
量が未だ十分とはいえず、遺伝子工学の応用による有用
蛋白質の工業的生産例は、極めて少ないのが現状であっ
た。このような状況から見て、幅広い宿主微生物におい
て、有用な蛋白質をコードする各種の構造遺伝子の発現
を促進するＤＮＡ断片を見出し、これを用いて有用蛋白
質の大量生産を可能とする新規なプラスミドベクターを
構築することは極めて意義のあることであり、遺伝子工
学の大きな課題である。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、バチルス
属細菌由来のアルカリセルラーゼ遺伝子をクローニング
し、当該遺伝子の上流領域、すなわちプロモーター領域
や分泌シグナルペプチド領域が下流の遺伝子の発現に与
える効果の解析を行った。そしてこの結果、当該遺伝子
の上流に存在する最大６３９ｂｐのＤＮＡ断片の下流
に、異種蛋白質の構造遺伝子を結合し、これを適当なベ
クターに挿入して、適当な宿主菌に導入すれば、下流に
結合した構造遺伝子産物の生産量を大幅に増大させ得る
ことを見出し、本発明を完成するに至った。
属細菌由来のアルカリセルラーゼ遺伝子をクローニング
し、当該遺伝子の上流領域、すなわちプロモーター領域
や分泌シグナルペプチド領域が下流の遺伝子の発現に与
える効果の解析を行った。そしてこの結果、当該遺伝子
の上流に存在する最大６３９ｂｐのＤＮＡ断片の下流
に、異種蛋白質の構造遺伝子を結合し、これを適当なベ
クターに挿入して、適当な宿主菌に導入すれば、下流に
結合した構造遺伝子産物の生産量を大幅に増大させ得る
ことを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】すなわち、本発明の目的は、バチルス属細
菌由来のアルカリセルラーゼ産生遺伝子のプロモーター
領域および分泌シグナルペプチド領域に由来する塩基配
列を有する、下流領域に結合した構造遺伝子の発現を促
進させ得るＤＮＡ断片（以下、「高発現誘導ＤＮＡ」と
称する）並びに、これを含む新規なプラスミドベクター
を提供することである。
菌由来のアルカリセルラーゼ産生遺伝子のプロモーター
領域および分泌シグナルペプチド領域に由来する塩基配
列を有する、下流領域に結合した構造遺伝子の発現を促
進させ得るＤＮＡ断片（以下、「高発現誘導ＤＮＡ」と
称する）並びに、これを含む新規なプラスミドベクター
を提供することである。
【０００８】また、本発明の他の目的は、この新規プラ
スミドベクターの高発現誘導ＤＮＡの下流に蛋白質の構
造遺伝子を結合した組換えプラスミドを含む微生物を提
供することである。
スミドベクターの高発現誘導ＤＮＡの下流に蛋白質の構
造遺伝子を結合した組換えプラスミドを含む微生物を提
供することである。
【０００９】更に、本発明の他の目的は、上記組換え微
生物を培養することによる蛋白質の製造法を提供するこ
とである。
生物を培養することによる蛋白質の製造法を提供するこ
とである。
【００１０】以下に本発明を詳細に説明する。本発明に
おける高発現誘導ＤＮＡは、アルカリセルラーゼ産生能
を有するバチルス属細菌の、アルカリセルラーゼ産生遺
伝子の上流部に存在し、プロモーター領域および分泌シ
グナルペプチド領域をコードするものである。
おける高発現誘導ＤＮＡは、アルカリセルラーゼ産生能
を有するバチルス属細菌の、アルカリセルラーゼ産生遺
伝子の上流部に存在し、プロモーター領域および分泌シ
グナルペプチド領域をコードするものである。
【００１１】例えば、高発現誘導ＤＮＡは、バチルス属
微生物であるバチルス エスピー（Bacillus sp.）ＫＳ
Ｍ−６４（FERM P-10482）株のアルカリセルラーゼＫ−
６４遺伝子上流領域に存在し、図１に示したような塩基
配列を有するものである。
微生物であるバチルス エスピー（Bacillus sp.）ＫＳ
Ｍ−６４（FERM P-10482）株のアルカリセルラーゼＫ−
６４遺伝子上流領域に存在し、図１に示したような塩基
配列を有するものである。
【００１２】このバチルス エスピー ＫＳＭ−６４株の
有する高発現誘導ＤＮＡは、６３９塩基からなり、１０
０番目の塩基から１３２番目の塩基及び２０８番目の塩
基から２３６番目の塩基領域に各々逆向き繰り返し配列
（ＩＲ−１及びＩＲ−２）が存在する。 また、２０６
番目の塩基から２３４番目の塩基領域、３６５番目の塩
基から３９６番目及び４８７番目の塩基から５１５番目
の塩基領域にそれぞれプロモーター様の配列（Ｐ−１、
Ｐ−２及びＰ−３）［C. P. Moran ら、Mol.Gen. Gene
t., 186, 339-346(1982)］が存在する。
有する高発現誘導ＤＮＡは、６３９塩基からなり、１０
０番目の塩基から１３２番目の塩基及び２０８番目の塩
基から２３６番目の塩基領域に各々逆向き繰り返し配列
（ＩＲ−１及びＩＲ−２）が存在する。 また、２０６
番目の塩基から２３４番目の塩基領域、３６５番目の塩
基から３９６番目及び４８７番目の塩基から５１５番目
の塩基領域にそれぞれプロモーター様の配列（Ｐ−１、
Ｐ−２及びＰ−３）［C. P. Moran ら、Mol.Gen. Gene
t., 186, 339-346(1982)］が存在する。
【００１３】更に、３９９番目から４１４番目の塩基配
列領域に異化代謝産物抑制に関するオペレーター様の配
列［W. L. Nicholsonら、J. Mol. Biol., 198, 609-618
(1987)］が、６００番目から６０６番目の塩基領域にリ
ボゾーム結合部位（ＳＤ配列）［P. J. HagerとJ. C. R
abinowitz、The Molecular Biology of the Bacilli,vo
l. II, pp. 1-32. D. A. Dubnau編 Academic Press］が
存在する。 そして、６１０番目からは、アルカリセル
ラーゼＫ−６４の構造遺伝子が始まっている。
列領域に異化代謝産物抑制に関するオペレーター様の配
列［W. L. Nicholsonら、J. Mol. Biol., 198, 609-618
(1987)］が、６００番目から６０６番目の塩基領域にリ
ボゾーム結合部位（ＳＤ配列）［P. J. HagerとJ. C. R
abinowitz、The Molecular Biology of the Bacilli,vo
l. II, pp. 1-32. D. A. Dubnau編 Academic Press］が
存在する。 そして、６１０番目からは、アルカリセル
ラーゼＫ−６４の構造遺伝子が始まっている。
【００１４】この高発現誘導ＤＮＡは、後記実施例で明
らかにするように、その下流領域に結合した構造遺伝子
の発現を促進し、構造遺伝子産物の大量生産を可能にす
るものである。例えば、高発現誘導ＤＮＡの下流にバチ
ルス エスピー ＫＳＭ−６４株由来のアルカリセルラー
ゼＫ−６４遺伝子を結合して、枯草菌或いは大腸菌宿主
に導入した場合、高発現誘導ＤＮＡを含まない場合の４
〜６倍以上のアルカリセルラーゼＫ−６４の生産性が認
められる（表１）。
らかにするように、その下流領域に結合した構造遺伝子
の発現を促進し、構造遺伝子産物の大量生産を可能にす
るものである。例えば、高発現誘導ＤＮＡの下流にバチ
ルス エスピー ＫＳＭ−６４株由来のアルカリセルラー
ゼＫ−６４遺伝子を結合して、枯草菌或いは大腸菌宿主
に導入した場合、高発現誘導ＤＮＡを含まない場合の４
〜６倍以上のアルカリセルラーゼＫ−６４の生産性が認
められる（表１）。
【００１５】一方、高発現誘導ＤＮＡの下流にバチルス
エスピー ＫＳＭ−３３０（FERM P-11223）株由来の酸
性セルラーゼＫ−３３０遺伝子を結合した場合は、高発
現誘導ＤＮＡを含まない場合と比較して、酸性セルラー
ゼＫ−３３０の生産量は、大腸菌において４倍以上（表
４）、枯草菌においては５倍以上（表５）の値を示す。
エスピー ＫＳＭ−３３０（FERM P-11223）株由来の酸
性セルラーゼＫ−３３０遺伝子を結合した場合は、高発
現誘導ＤＮＡを含まない場合と比較して、酸性セルラー
ゼＫ−３３０の生産量は、大腸菌において４倍以上（表
４）、枯草菌においては５倍以上（表５）の値を示す。
【００１６】更に、枯草菌宿主において高発現誘導ＤＮ
Ａの下流にバチルス エスピー ＫＳＭ−６３５株由来の
アルカリセルラーゼＫ−６３５遺伝子或いは、クロラム
フェニコール耐性遺伝子を結合することにより、アルカ
リセルラーゼＫ−６３５（表８）或は、クロラムフェニ
コール アセチルトランスフェラーゼ（表１０）を大量
に生産することができる。
Ａの下流にバチルス エスピー ＫＳＭ−６３５株由来の
アルカリセルラーゼＫ−６３５遺伝子或いは、クロラム
フェニコール耐性遺伝子を結合することにより、アルカ
リセルラーゼＫ−６３５（表８）或は、クロラムフェニ
コール アセチルトランスフェラーゼ（表１０）を大量
に生産することができる。
【００１７】本高発現誘導ＤＮＡは、バチルス エスピ
ー ＫＳＭ−６４株をはじめ、アルカリセルラーゼ産生
能を有するバチルス属細菌の染色体ＤＮＡから単離され
るが、その方法としては、例えば、Marmur の方法［J.
Mol. Biol., 3, 208-218(1961)］や、Saito とMiura の
方法［Biochim. Biophys. Acta., 72, 619-629(1963)］
等が挙げられ、更にこれに代え他の類似な方法を用いる
こともできる。
ー ＫＳＭ−６４株をはじめ、アルカリセルラーゼ産生
能を有するバチルス属細菌の染色体ＤＮＡから単離され
るが、その方法としては、例えば、Marmur の方法［J.
Mol. Biol., 3, 208-218(1961)］や、Saito とMiura の
方法［Biochim. Biophys. Acta., 72, 619-629(1963)］
等が挙げられ、更にこれに代え他の類似な方法を用いる
こともできる。
【００１８】単離された染色体ＤＮＡは、これを適当な
制限酵素で切断した後、直鎖分子化した適当なベクター
ＤＮＡと結合することによって、目的とする高発現誘導
ＤＮＡをクローニングすることができる。
制限酵素で切断した後、直鎖分子化した適当なベクター
ＤＮＡと結合することによって、目的とする高発現誘導
ＤＮＡをクローニングすることができる。
【００１９】本発明の高発現誘導ＤＮＡのクローニング
に用いるベクターとしては、宿主菌株中で自己複製可能
であり、且つ、高発現誘導ＤＮＡ及び、その下流に結合
した目的蛋白質をコードする構造遺伝子を安定に保持す
るものであれば、如何なるものでも使用できる。
に用いるベクターとしては、宿主菌株中で自己複製可能
であり、且つ、高発現誘導ＤＮＡ及び、その下流に結合
した目的蛋白質をコードする構造遺伝子を安定に保持す
るものであれば、如何なるものでも使用できる。
【００２０】このようなベクターの例としては、大腸菌
及び枯草菌で複製可能なシャトルベクター ｐＨＹ３０
０ＰＬＫ［H. Ishiwa と H. Shibahra、Jpn. J. Gene
t., 60,235-243(1985)］、枯草菌で複製可能なｐＵＢ１
１０［K. H. Kegginsら、Proc.Natl. Acad. Sci., U.S.
A.,75, 1423-1427(1978)］、更に大腸菌で複製可能なｐ
ＢＲ３２２［F. Bolivarら、Gene, 2, 95-113(1977)］
やｐＵＣ１９［J. Messing, Methods Enzymol., 101, 2
0-78(1983)］などが挙げられる。
及び枯草菌で複製可能なシャトルベクター ｐＨＹ３０
０ＰＬＫ［H. Ishiwa と H. Shibahra、Jpn. J. Gene
t., 60,235-243(1985)］、枯草菌で複製可能なｐＵＢ１
１０［K. H. Kegginsら、Proc.Natl. Acad. Sci., U.S.
A.,75, 1423-1427(1978)］、更に大腸菌で複製可能なｐ
ＢＲ３２２［F. Bolivarら、Gene, 2, 95-113(1977)］
やｐＵＣ１９［J. Messing, Methods Enzymol., 101, 2
0-78(1983)］などが挙げられる。
【００２１】一方、宿主菌の種類としては、目的の組換
えプラスミドを安定に保持し、複製することができるも
のであれば、如何なる菌株を用いても良く、例えば、大
腸菌宿主の場合には、ＨＢ１０１株、Ｃ６００株、或い
はＪＭ１０１株等が、また、枯草菌宿主の場合には、Ｂ
Ｄ１７０株、１６８株、或いはＩＳＷ１２１４株等が挙
げられる。
えプラスミドを安定に保持し、複製することができるも
のであれば、如何なる菌株を用いても良く、例えば、大
腸菌宿主の場合には、ＨＢ１０１株、Ｃ６００株、或い
はＪＭ１０１株等が、また、枯草菌宿主の場合には、Ｂ
Ｄ１７０株、１６８株、或いはＩＳＷ１２１４株等が挙
げられる。
【００２２】組換えＤＮＡ分子による宿主菌の形質転換
の方法もとくに限定されないが、例えば、大腸菌宿主の
場合、Mandel とHiga の方法［J. Mol. Biol., 53, 159
-162(1970)］やHanahanの方法［J. Mol. Biol., 166, 5
57-580(1983)］等、また枯草菌宿主の場合には、コンピ
テント セル（Competent cell）法［S. ContenteとD.Da
bnau、Mol. Gen. Genet., 167, 251-258(1979)］やプロ
トプラスト（protoplast）法［S. Chang とS. N. Cohe
n、Mol. Gen. Genet., 168, 111-115(1978)］等を用い
ることができる。
の方法もとくに限定されないが、例えば、大腸菌宿主の
場合、Mandel とHiga の方法［J. Mol. Biol., 53, 159
-162(1970)］やHanahanの方法［J. Mol. Biol., 166, 5
57-580(1983)］等、また枯草菌宿主の場合には、コンピ
テント セル（Competent cell）法［S. ContenteとD.Da
bnau、Mol. Gen. Genet., 167, 251-258(1979)］やプロ
トプラスト（protoplast）法［S. Chang とS. N. Cohe
n、Mol. Gen. Genet., 168, 111-115(1978)］等を用い
ることができる。
【００２３】目的のクローンの選択方法としては、ベク
ターＤＮＡ上に結合した適当な遺伝子の発現量の増加を
指標とする方法や、図１に示された塩基配列を基に作製
したプローブＤＮＡを用いたハイブリダイゼーションに
よる方法などを用いることができるが、好適には、本高
発現誘導ＤＮＡの下流に存在するアルカリセルラーゼ遺
伝子によるアルカリセルラーゼの生産性を指標としてク
ローニングを行った後、得られた組換えプラスミドか
ら、目的の高発現誘導ＤＮＡをサブクローニングする方
法を用いれば良い。
ターＤＮＡ上に結合した適当な遺伝子の発現量の増加を
指標とする方法や、図１に示された塩基配列を基に作製
したプローブＤＮＡを用いたハイブリダイゼーションに
よる方法などを用いることができるが、好適には、本高
発現誘導ＤＮＡの下流に存在するアルカリセルラーゼ遺
伝子によるアルカリセルラーゼの生産性を指標としてク
ローニングを行った後、得られた組換えプラスミドか
ら、目的の高発現誘導ＤＮＡをサブクローニングする方
法を用いれば良い。
【００２４】具体的に高発現誘導ＤＮＡを得るには、例
えば、まずバチルス エスピー ＫＳＭ−６４株の染色体
ＤＮＡを制限酵素 ＨｉｎｄIII を用いて切断すること
によって、高発現誘導ＤＮＡとアルカリセルラーゼＫ−
６４遺伝子とを含むＤＮＡを調製し、これを同じく制限
酵素 ＨｉｎｄIII により直鎖化したプラスミドｐＵＣ
１９と混合した後、Ｔ4ＤＮＡリガーゼによる結合反応
を行ない、高発現誘導ＤＮＡとアルカリセルラーゼＫ−
６４遺伝子を有し、大腸菌宿主中で自己複製可能なプラ
スミドｐＵＣＬ６４を作製する（図２）。
えば、まずバチルス エスピー ＫＳＭ−６４株の染色体
ＤＮＡを制限酵素 ＨｉｎｄIII を用いて切断すること
によって、高発現誘導ＤＮＡとアルカリセルラーゼＫ−
６４遺伝子とを含むＤＮＡを調製し、これを同じく制限
酵素 ＨｉｎｄIII により直鎖化したプラスミドｐＵＣ
１９と混合した後、Ｔ4ＤＮＡリガーゼによる結合反応
を行ない、高発現誘導ＤＮＡとアルカリセルラーゼＫ−
６４遺伝子を有し、大腸菌宿主中で自己複製可能なプラ
スミドｐＵＣＬ６４を作製する（図２）。
【００２５】次に、このプラスミドｐＵＣＬ６４を制限
酵素ＢｇｌII及びＰｓｔIによって切断し、Henikoffの
方法［Gene, 28, 351-359(1984)］に従って、エキソヌ
クレアーゼ、ヤエナリ（mung bean）ヌクレアーゼ及び
ＤＮＡポリメラーゼ大断片（Klenow enzyme）処理を行
って、アルカリセルラーゼの構造遺伝子領域を消化した
後、Ｔ4 ＤＮＡリガーゼによる自己閉環化反応によっ
て、高発現誘導ＤＮＡとアルカリセルラーゼＫ−６４の
シグナル配列の一部をコードするＤＮＡを有するプラス
ミドベクターｐＵＳ６４が得られる（図２）。
酵素ＢｇｌII及びＰｓｔIによって切断し、Henikoffの
方法［Gene, 28, 351-359(1984)］に従って、エキソヌ
クレアーゼ、ヤエナリ（mung bean）ヌクレアーゼ及び
ＤＮＡポリメラーゼ大断片（Klenow enzyme）処理を行
って、アルカリセルラーゼの構造遺伝子領域を消化した
後、Ｔ4 ＤＮＡリガーゼによる自己閉環化反応によっ
て、高発現誘導ＤＮＡとアルカリセルラーゼＫ−６４の
シグナル配列の一部をコードするＤＮＡを有するプラス
ミドベクターｐＵＳ６４が得られる（図２）。
【００２６】更に、このプラスミドベクターｐＵＳ６４
を制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄIII或いはＥｃｏ
ＲI及びＳｃａI処理することにより得られる１.８ｋｂ
或いは６７９ｂｐのＤＮＡ断片を、制限酵素ＥｃｏＲI
及びＨｉｎｄIII処理或いはＨｉ ｎｄIIIで切断後末端を
平滑化し、更にＥｃｏＲI処理したシャトルベクターｐ
ＨＹ３００ＰＬＫとそれぞれ混合し、Ｔ4ＤＮＡリガー
ゼを用いて結合することにより、高発現誘導ＤＮＡを限
定して含み、枯草菌及び大腸菌宿主で自己複製可能なプ
ラスミドベクターｐＨＳ６４或いはｐＨＳＰ６４を作製
することができる（図２）。
を制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄIII或いはＥｃｏ
ＲI及びＳｃａI処理することにより得られる１.８ｋｂ
或いは６７９ｂｐのＤＮＡ断片を、制限酵素ＥｃｏＲI
及びＨｉｎｄIII処理或いはＨｉ ｎｄIIIで切断後末端を
平滑化し、更にＥｃｏＲI処理したシャトルベクターｐ
ＨＹ３００ＰＬＫとそれぞれ混合し、Ｔ4ＤＮＡリガー
ゼを用いて結合することにより、高発現誘導ＤＮＡを限
定して含み、枯草菌及び大腸菌宿主で自己複製可能なプ
ラスミドベクターｐＨＳ６４或いはｐＨＳＰ６４を作製
することができる（図２）。
【００２７】斯くして得られたプラスミドベクターの高
発現誘導ＤＮＡの下流領域に生産させたい蛋白質の構造
遺伝子を挿入することにより、目的の蛋白質を大量に生
産させるプラスミドが構築できる。
発現誘導ＤＮＡの下流領域に生産させたい蛋白質の構造
遺伝子を挿入することにより、目的の蛋白質を大量に生
産させるプラスミドが構築できる。
【００２８】得られたプラスミドベクターｐＵＳ６４及
びｐＨＳＰ６４（図２）の高発現誘導ＤＮＡの下流領域
には、ＳａｌI、ＸｂａI、ＢａｍＨI、ＳｍａI、Ｋｐｎ
I、ＳａｃI及びＥｃｏＲI制限酵素部位が存在するマル
チクローニング部位（ＭＣＳ）が連結されており、外来
蛋白質構造遺伝子のクローニングに有用である。
びｐＨＳＰ６４（図２）の高発現誘導ＤＮＡの下流領域
には、ＳａｌI、ＸｂａI、ＢａｍＨI、ＳｍａI、Ｋｐｎ
I、ＳａｃI及びＥｃｏＲI制限酵素部位が存在するマル
チクローニング部位（ＭＣＳ）が連結されており、外来
蛋白質構造遺伝子のクローニングに有用である。
【００２９】また、ｐＵＳ６４及びｐＨＳＰ６４の高発
現誘導ＤＮＡの下流領域にはバチルス エスピー ＫＳＭ
−６４株のアルカリセルラーゼＫ−６４遺伝子由来のＳ
Ｄ配列、翻訳開始コドン及びシグナル領域の一部（１０
アミノ酸）が存在しており、目的の遺伝子のオープンリ
ーディング フレーム（ＯＲＦ）をこのシグナル領域の
ＯＲＦと一致させ、融合蛋白質として発現させることも
可能である。
現誘導ＤＮＡの下流領域にはバチルス エスピー ＫＳＭ
−６４株のアルカリセルラーゼＫ−６４遺伝子由来のＳ
Ｄ配列、翻訳開始コドン及びシグナル領域の一部（１０
アミノ酸）が存在しており、目的の遺伝子のオープンリ
ーディング フレーム（ＯＲＦ）をこのシグナル領域の
ＯＲＦと一致させ、融合蛋白質として発現させることも
可能である。
【００３０】上記の様にして得られた高発現誘導ＤＮＡ
は、その下流に各種の構造遺伝子を結合させ、当該構造
遺伝子がコードする蛋白を産生させることが可能であ
る。
は、その下流に各種の構造遺伝子を結合させ、当該構造
遺伝子がコードする蛋白を産生させることが可能であ
る。
【００３１】高発現誘導ＤＮＡに構造遺伝子が結合した
組換えプラスミドの例としては、バチルス エスピー Ｋ
ＳＭ−６４株の高発現誘導ＤＮＡとアルカリセルラーゼ
Ｋ−６４遺伝子を含む４.４ｋｂの断片をシャトルベク
ターｐＨＹ３００ＰＬＫに挿入したｐＨＣＬ６４（図
３）、バチルス エスピー ＫＳＭ−３３０株由来の酸性
セルラーゼＫ−３３０遺伝子を含む１.８ｋｂ断片をプ
ラスミドベクターｐＵＳ６４に挿入した組換えプラスミ
ドｐＵＳ−ＫＣ（図５）や、同１.８ｋｂ断片をプラス
ミドベクターｐＨＳ６４に挿入した組換えプラスミドｐ
ＨＳ−ＫＣ（図６）、バチルス エスピー ＫＳＭ−６３
５（FERM P-8872）株由来のアルカリセルラーゼＫ−６
３５の活性発現に必須なＡｌａ２２８−Ｌｅｕ５８４の
領域をコードする１.０ｋｂ断片をｐＨＳＰ−６４に挿
入したｐＨＳＰ−ＢＣ（図７）、更にクロラムフェニコ
ール耐性遺伝子を含む０.８ｋｂ断片をプラスミドベク
ターｐＨＳＰ６４に挿入した組換えプラスミドｐＨＳＰ
−ＣｍＳＢ（図８）などが挙げられる。
組換えプラスミドの例としては、バチルス エスピー Ｋ
ＳＭ−６４株の高発現誘導ＤＮＡとアルカリセルラーゼ
Ｋ−６４遺伝子を含む４.４ｋｂの断片をシャトルベク
ターｐＨＹ３００ＰＬＫに挿入したｐＨＣＬ６４（図
３）、バチルス エスピー ＫＳＭ−３３０株由来の酸性
セルラーゼＫ−３３０遺伝子を含む１.８ｋｂ断片をプ
ラスミドベクターｐＵＳ６４に挿入した組換えプラスミ
ドｐＵＳ−ＫＣ（図５）や、同１.８ｋｂ断片をプラス
ミドベクターｐＨＳ６４に挿入した組換えプラスミドｐ
ＨＳ−ＫＣ（図６）、バチルス エスピー ＫＳＭ−６３
５（FERM P-8872）株由来のアルカリセルラーゼＫ−６
３５の活性発現に必須なＡｌａ２２８−Ｌｅｕ５８４の
領域をコードする１.０ｋｂ断片をｐＨＳＰ−６４に挿
入したｐＨＳＰ−ＢＣ（図７）、更にクロラムフェニコ
ール耐性遺伝子を含む０.８ｋｂ断片をプラスミドベク
ターｐＨＳＰ６４に挿入した組換えプラスミドｐＨＳＰ
−ＣｍＳＢ（図８）などが挙げられる。
【００３２】以上のうち、 ｐＨＳＰ−ＢＣ及びｐＨＳ
Ｐ−ＣｍＳＢの場合には、挿入した遺伝子のＯＲＦが高
発現誘導ＤＮＡの下流に存在するアルカリセルラーゼの
シグナル領域のＯＲＦと一致しており、目的の蛋白質は
融合蛋白質として発現されるものと予想される。
Ｐ−ＣｍＳＢの場合には、挿入した遺伝子のＯＲＦが高
発現誘導ＤＮＡの下流に存在するアルカリセルラーゼの
シグナル領域のＯＲＦと一致しており、目的の蛋白質は
融合蛋白質として発現されるものと予想される。
【００３３】斯くして得られる組換えプラスミドで、適
当な宿主菌を形質転換し、これを適当な培地中で適当な
培養条件で培養することによって、目的とする蛋白質を
大量に生産させることができる。
当な宿主菌を形質転換し、これを適当な培地中で適当な
培養条件で培養することによって、目的とする蛋白質を
大量に生産させることができる。
【００３４】用いる培地の種類としては、当該組換え微
生物が生育し、当該酵素を生産することのできるもので
あれば良く、特に限定されるものではない。 例えば、
高発現誘導ＤＮＡを含む組換え枯草菌ＩＳＷ１２１４
（ｐＨＣＬ６４）株によってアルカリセルラーゼＫ−６
４を生産する場合、表２に示されるように、炭素源とし
て、ぶどう糖や果糖等の単糖類、しょ糖、麦芽糖或いは
セロビオース等の二糖類または、ＣＭＣや可溶性澱粉等
の多糖類等、また、表３に示されるように、窒素源とし
て、酵母エキス、ゼスト７０、ポリペプトン、肉エキ
ス、魚肉エキス、カルチベーター、コーン スチープ リ
カー（ＣＳＬ）、ファーマメディア、大豆粉、アジプロ
ンＥ2等を用いることができる。
生物が生育し、当該酵素を生産することのできるもので
あれば良く、特に限定されるものではない。 例えば、
高発現誘導ＤＮＡを含む組換え枯草菌ＩＳＷ１２１４
（ｐＨＣＬ６４）株によってアルカリセルラーゼＫ−６
４を生産する場合、表２に示されるように、炭素源とし
て、ぶどう糖や果糖等の単糖類、しょ糖、麦芽糖或いは
セロビオース等の二糖類または、ＣＭＣや可溶性澱粉等
の多糖類等、また、表３に示されるように、窒素源とし
て、酵母エキス、ゼスト７０、ポリペプトン、肉エキ
ス、魚肉エキス、カルチベーター、コーン スチープ リ
カー（ＣＳＬ）、ファーマメディア、大豆粉、アジプロ
ンＥ2等を用いることができる。
【００３５】同様に、高発現誘導ＤＮＡを含む組換え枯
草菌ＩＳＷ１２１４（ｐＨＳ−ＫＣ）株による酸性セル
ラーゼＫ−３３０の生産の場合、表６に示されるよう
に、窒素源として、酵母エキス、魚肉エキス、ゼスト７
０、カルチベーター或いはＣＳＬ等を用いることができ
る。これらの窒素源と炭素源を適当な濃度で適宜組合
せ、この他に適当な濃度の無機塩類、例えば、塩化ナト
リウム、燐酸ナトリウム、硫酸ナトリウム等を添加すれ
ば良い。
草菌ＩＳＷ１２１４（ｐＨＳ−ＫＣ）株による酸性セル
ラーゼＫ−３３０の生産の場合、表６に示されるよう
に、窒素源として、酵母エキス、魚肉エキス、ゼスト７
０、カルチベーター或いはＣＳＬ等を用いることができ
る。これらの窒素源と炭素源を適当な濃度で適宜組合
せ、この他に適当な濃度の無機塩類、例えば、塩化ナト
リウム、燐酸ナトリウム、硫酸ナトリウム等を添加すれ
ば良い。
【００３６】また、培地のｐＨに関しては、用いる組換
え微生物が生育し得る範囲のｐＨであれば、特に限定さ
れないが、ｐＨ６.５〜７.５に調整することが好適であ
る。更に、培養条件については、１５℃〜５０℃、好ま
しくは２５℃〜３５℃で１〜４日間振盪または、通気撹
拌培養すれば良い。
え微生物が生育し得る範囲のｐＨであれば、特に限定さ
れないが、ｐＨ６.５〜７.５に調整することが好適であ
る。更に、培養条件については、１５℃〜５０℃、好ま
しくは２５℃〜３５℃で１〜４日間振盪または、通気撹
拌培養すれば良い。
【００３７】
【発明の効果】以上の本発明によれば、目的とする蛋白
質の大量生産が可能となる。例えば、ＩＳＷ１２１４
（ｐＨＣＬ６４）株の場合、培地１リットル当り ３２,
４００Ｕ以上のアルカリセルラーゼＫ−６４（Bacillus
sp. KSM-64株由来）を得ることが可能となり、また、
ＩＳＷ１２１４（ｐＨＳ−ＫＣ）株では、培地１リット
ル当り ２０,５００Ｕ以上の酸性セルラーゼＫ−３３０
（Bacillus sp.KSM-330株由来）を得ることが可能とな
る。
質の大量生産が可能となる。例えば、ＩＳＷ１２１４
（ｐＨＣＬ６４）株の場合、培地１リットル当り ３２,
４００Ｕ以上のアルカリセルラーゼＫ−６４（Bacillus
sp. KSM-64株由来）を得ることが可能となり、また、
ＩＳＷ１２１４（ｐＨＳ−ＫＣ）株では、培地１リット
ル当り ２０,５００Ｕ以上の酸性セルラーゼＫ−３３０
（Bacillus sp.KSM-330株由来）を得ることが可能とな
る。
【００３８】更に、ＩＳＷ１２１４（ｐＨＳＰ−ＢＣ）
株を用いた場合では培地１リットル当り ５１,４００Ｕ
以上のアルカリセルラーゼ Ｋ−６３５（Bacillus sp.
KSM-635株由来）を、ＩＳＷ１２１４（ｐＨＳＰ−Ｃｍ
ＳＢ）株では培地１リットル当り６８,６００Ｕ以上の
クロラムフェニコール アセチルトランスフェラーゼを
得ることが可能となる。
株を用いた場合では培地１リットル当り ５１,４００Ｕ
以上のアルカリセルラーゼ Ｋ−６３５（Bacillus sp.
KSM-635株由来）を、ＩＳＷ１２１４（ｐＨＳＰ−Ｃｍ
ＳＢ）株では培地１リットル当り６８,６００Ｕ以上の
クロラムフェニコール アセチルトランスフェラーゼを
得ることが可能となる。
【００３９】
【実施例】以下、実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説
明するが、本発明は以下の実施例に何等制約されるもの
ではない。 なお、以上の説明は具体的なバチルス エス
ピー ＫＳＭ−６４株およびその有する塩基配列に即し
て行ったが、これと類似な微生物や前記配列と同一性を
有する塩基配列、すなわち、塩基配列の一部に塩基の欠
失、置換、挿入等があっても元の塩基配列の有する機能
を損なわないものも同様に使用し得ることはもちろんで
ある。
明するが、本発明は以下の実施例に何等制約されるもの
ではない。 なお、以上の説明は具体的なバチルス エス
ピー ＫＳＭ−６４株およびその有する塩基配列に即し
て行ったが、これと類似な微生物や前記配列と同一性を
有する塩基配列、すなわち、塩基配列の一部に塩基の欠
失、置換、挿入等があっても元の塩基配列の有する機能
を損なわないものも同様に使用し得ることはもちろんで
ある。
【００４０】更に、セルラーゼ（ＣＭＣアーゼ）活性は
以下の様に測定した。 すなわち、２.５％ カルボキシ
メチルセルロース（ＣＭＣ；山陽国策パルプ社製 サン
ローズＡＯ１ＭＣ）０.４ｍｌ、０.５Ｍ グリシン緩衝
液（ｐＨ９.０；アルカリセルラーゼの場合）またはク
エン酸緩衝液（ｐＨ５.２；酸性セルラーゼの場合）０.
２ｍｌ及び脱イオン水０.３ｍｌからなる基質溶液に酵
素液 ０.１ｍｌを加え、４０℃で２０分間反応した後、
これによって生成した還元糖を３,５−ジニトロサリチ
ル酸法［G. L. Millerら、Anal. Biochem., 2, 127-132
(1960)］によって定量した。 酵素力価は、上記の条件
下で１分間に１μｍｏｌのグルコースに相当する還元糖
を生成する酵素量を１単位とした。
以下の様に測定した。 すなわち、２.５％ カルボキシ
メチルセルロース（ＣＭＣ；山陽国策パルプ社製 サン
ローズＡＯ１ＭＣ）０.４ｍｌ、０.５Ｍ グリシン緩衝
液（ｐＨ９.０；アルカリセルラーゼの場合）またはク
エン酸緩衝液（ｐＨ５.２；酸性セルラーゼの場合）０.
２ｍｌ及び脱イオン水０.３ｍｌからなる基質溶液に酵
素液 ０.１ｍｌを加え、４０℃で２０分間反応した後、
これによって生成した還元糖を３,５−ジニトロサリチ
ル酸法［G. L. Millerら、Anal. Biochem., 2, 127-132
(1960)］によって定量した。 酵素力価は、上記の条件
下で１分間に１μｍｏｌのグルコースに相当する還元糖
を生成する酵素量を１単位とした。
【００４１】クロラムフェニコール アセチルトランス
フェラーゼ活性は以下のように測定した［W. V. Shaw,
Methods Enzymol., 43, 737-755(1975)］。 すなわち
０.４ｍｇ／ｍｌ ５,５−ジチオビス−２−ニトロ安息
香酸、０.１ｍＭアセチル・コエンザイムＡ及び１００
ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７.８）からなる溶液１ｍ
ｌに、１０μｌの粗酵素液及び２０μｌの０.１ｍＭク
ロラムフェニコールを加え、３７℃で４１２ｎｍの吸光
度の変化を測定した。 酵素力価は上記の条件で１分間
に１μｍｏｌのクロラムフェニコールのアセチル化に相
当する４１２ｎｍの吸光度を変化させる酵素量を１単位
とした。
フェラーゼ活性は以下のように測定した［W. V. Shaw,
Methods Enzymol., 43, 737-755(1975)］。 すなわち
０.４ｍｇ／ｍｌ ５,５−ジチオビス−２−ニトロ安息
香酸、０.１ｍＭアセチル・コエンザイムＡ及び１００
ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７.８）からなる溶液１ｍ
ｌに、１０μｌの粗酵素液及び２０μｌの０.１ｍＭク
ロラムフェニコールを加え、３７℃で４１２ｎｍの吸光
度の変化を測定した。 酵素力価は上記の条件で１分間
に１μｍｏｌのクロラムフェニコールのアセチル化に相
当する４１２ｎｍの吸光度を変化させる酵素量を１単位
とした。
【００４２】蛋白量はバイオ・ラッド プロテイン アッ
セイ キット（バイオ・ラッド社製）を用いて行ない、
牛血漿アルブミンを標準蛋白として算出した。
セイ キット（バイオ・ラッド社製）を用いて行ない、
牛血漿アルブミンを標準蛋白として算出した。
【００４３】実 施 例 １ アルカリセルラーゼＫ−６４の生産菌であるバチルス
エスピー ＫＳＭ−６４を、０.５％ ポリペプトン（日
本製薬社製）、０.５％ 酵母エキス（ディフコ社製）、
０.１％ ＫＨ2ＰＯ4、 ０.０２％ ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ
及び０.５％ Ｎａ2 ＣＯ3から成る培地１００ｍｌを用
い、３０℃で１２時間振盪培養した。 培養終了後、遠
心分離によって集めた菌体からSaitoとMiuraの方法［Bi
ochim. Biophys. Acta, 72, 619-629(1963)］によって
得られた染色体ＤＮＡ １０μｇを常法例えば［T. Mani
atisら、 Molecular Cloning, Cold Spring Harbar Labo
ratry,(1982)］に従って、制限酵素ＨｉｎｄIII（ベー
リンガー・マンハイム社製）で切断した。 次いで、こ
れを同じくＨｉｎｄIIIで切断したプラスミドｐＵＣ１
９（宝酒造社製）１μｇと混合して、Ｔ4ＤＮＡリガー
ゼ（ベーリンガー・マンハイム社製）による結合反応を
行なった。
エスピー ＫＳＭ−６４を、０.５％ ポリペプトン（日
本製薬社製）、０.５％ 酵母エキス（ディフコ社製）、
０.１％ ＫＨ2ＰＯ4、 ０.０２％ ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ
及び０.５％ Ｎａ2 ＣＯ3から成る培地１００ｍｌを用
い、３０℃で１２時間振盪培養した。 培養終了後、遠
心分離によって集めた菌体からSaitoとMiuraの方法［Bi
ochim. Biophys. Acta, 72, 619-629(1963)］によって
得られた染色体ＤＮＡ １０μｇを常法例えば［T. Mani
atisら、 Molecular Cloning, Cold Spring Harbar Labo
ratry,(1982)］に従って、制限酵素ＨｉｎｄIII（ベー
リンガー・マンハイム社製）で切断した。 次いで、こ
れを同じくＨｉｎｄIIIで切断したプラスミドｐＵＣ１
９（宝酒造社製）１μｇと混合して、Ｔ4ＤＮＡリガー
ゼ（ベーリンガー・マンハイム社製）による結合反応を
行なった。
【００４４】この結合反応物による大腸菌ＨＢ１０１株
の形質転換処理をコンピテント・セル（宝酒造社製）を
用いて行ない、処理後の菌懸濁液を５０μｇ／ｍｌアン
ピシリン（シグマ社製）を含むＬＢ寒天プレート培地
［１.０％ トリプトン（ディフコ社製）、０.５％ 酵母
エキス（ディフコ社製）、１.０％ ＮａＣｌ、１.５％
バクト寒天（ディフコ社製）］に塗抹し、３７℃で１２
時間培養した。出現した形質転換体の集落上に、０.５
％ ＣＭＣ、１ｍｇ／ｍｌリゾチーム（シグマ社製）及
び、５０ｍＭのグリシン緩衝液（ｐＨ９）を含む１.０
％寒天を重層した後、約６時間放置した。この後、集落
周辺のＣＭＣを分解した菌株をコンゴー・レッド法［R.
M. TeatherとP. J. Wood, Appl. Environ. Microbio
l.,43, 777-780(1982)］を用いて検出し、目的とする組
換え大腸菌を分離した。
の形質転換処理をコンピテント・セル（宝酒造社製）を
用いて行ない、処理後の菌懸濁液を５０μｇ／ｍｌアン
ピシリン（シグマ社製）を含むＬＢ寒天プレート培地
［１.０％ トリプトン（ディフコ社製）、０.５％ 酵母
エキス（ディフコ社製）、１.０％ ＮａＣｌ、１.５％
バクト寒天（ディフコ社製）］に塗抹し、３７℃で１２
時間培養した。出現した形質転換体の集落上に、０.５
％ ＣＭＣ、１ｍｇ／ｍｌリゾチーム（シグマ社製）及
び、５０ｍＭのグリシン緩衝液（ｐＨ９）を含む１.０
％寒天を重層した後、約６時間放置した。この後、集落
周辺のＣＭＣを分解した菌株をコンゴー・レッド法［R.
M. TeatherとP. J. Wood, Appl. Environ. Microbio
l.,43, 777-780(1982)］を用いて検出し、目的とする組
換え大腸菌を分離した。
【００４５】実 施 例 ２ 実施例１で得た組換え大腸菌の保持する組換えプラスミ
ドを常法［例えば、T.Maniatis ら、Molecular Clonin
g, Cold Spring Harbar Laboratry, (1982)］に従って
採取し、制限酵素切断点の解析をアガロースゲル電気泳
動法［J. A. Meyersら、J. Bacteriol., 127, 1529-15
37(1976)］を用いて行った。 この結果、アルカリセル
ラーゼＫ−６４遺伝子が約４.４ｋｂのＨｉｎｄIII断片
中に存在することが明かとなり、これを含むプラスミド
（７.１ｋｂ）をｐＵＣＬ６４、ｐＵＣＬ６４を含有す
る大腸菌ＨＢ１０１株をＨＢ１０１（ｐＵＣＬ６４）株
と命名した。
ドを常法［例えば、T.Maniatis ら、Molecular Clonin
g, Cold Spring Harbar Laboratry, (1982)］に従って
採取し、制限酵素切断点の解析をアガロースゲル電気泳
動法［J. A. Meyersら、J. Bacteriol., 127, 1529-15
37(1976)］を用いて行った。 この結果、アルカリセル
ラーゼＫ−６４遺伝子が約４.４ｋｂのＨｉｎｄIII断片
中に存在することが明かとなり、これを含むプラスミド
（７.１ｋｂ）をｐＵＣＬ６４、ｐＵＣＬ６４を含有す
る大腸菌ＨＢ１０１株をＨＢ１０１（ｐＵＣＬ６４）株
と命名した。
【００４６】この組換えプラスミド、ｐＵＣＬ６４を制
限酵素ＨｉｎｄIIIによって切断後、アガロース・ゲル
電気泳動を行ない、McDonnellらの方法［J. Mol. Bio
l., 110, 119-146(1977)］によって、約４.４ｋｂのＨ
ｉｎｄIII断片を分離した。 このうち約４.１ｋｂ Ｘｈ
ｏI−ＨｉｎｄIII領域をサンガー法［F. Sangerら、Pro
c. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 74, 5463-5467(1977)］
により決定し、２４６６ｂｐからなるアルカリセルラー
ゼＫ−６４の構造遺伝子を見出した。
限酵素ＨｉｎｄIIIによって切断後、アガロース・ゲル
電気泳動を行ない、McDonnellらの方法［J. Mol. Bio
l., 110, 119-146(1977)］によって、約４.４ｋｂのＨ
ｉｎｄIII断片を分離した。 このうち約４.１ｋｂ Ｘｈ
ｏI−ＨｉｎｄIII領域をサンガー法［F. Sangerら、Pro
c. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 74, 5463-5467(1977)］
により決定し、２４６６ｂｐからなるアルカリセルラー
ゼＫ−６４の構造遺伝子を見出した。
【００４７】この構造遺伝子の上流には、図１に示した
様に、プロモーター様の配列（Ｐ−１,Ｐ−２,Ｐ−
３）、逆向き繰り返し配列（ＩＲ−１,ＩＲ−２）、異
化代謝産物抑制に関するオペレーター様の配列（＝＝
＝）及びリボゾーム結合部位（ＳＤ配列, △△△）等が
認められた。
様に、プロモーター様の配列（Ｐ−１,Ｐ−２,Ｐ−
３）、逆向き繰り返し配列（ＩＲ−１,ＩＲ−２）、異
化代謝産物抑制に関するオペレーター様の配列（＝＝
＝）及びリボゾーム結合部位（ＳＤ配列, △△△）等が
認められた。
【００４８】実 施 例 ３ 実施例２において取得した約４.４ｋｂのＨｉｎｄIII断
片を、図３に示したストラテジーに従って、シャトルベ
クターｐＨＹ３００ＰＬＫに挿入し、組換えプラスミド
ｐＨＣＬ６４を作製した。 また、得られた組換えプラ
スミドｐＨＣＬ６４から図３に示したストラテジーに従
い、ＳｍａI−ＳｃａI １.１ｋｂの断片またはＳｍａI
−ＨｐａI １.５ｋｂの断片が欠失したプラスミドｐＨ
ＣＬ６４ａおよびｐＨＣＬ６４ｂを作製し、これらの組
換えプラスミドを含む組換え大腸菌ＨＢ１０１（ｐＨＣ
Ｌ６４）株、ＨＢ１０１（ｐＨＣＬ６４ａ）株およびＨ
Ｂ１０１（ｐＨＣＬ６４ｂ）株を取得した。
片を、図３に示したストラテジーに従って、シャトルベ
クターｐＨＹ３００ＰＬＫに挿入し、組換えプラスミド
ｐＨＣＬ６４を作製した。 また、得られた組換えプラ
スミドｐＨＣＬ６４から図３に示したストラテジーに従
い、ＳｍａI−ＳｃａI １.１ｋｂの断片またはＳｍａI
−ＨｐａI １.５ｋｂの断片が欠失したプラスミドｐＨ
ＣＬ６４ａおよびｐＨＣＬ６４ｂを作製し、これらの組
換えプラスミドを含む組換え大腸菌ＨＢ１０１（ｐＨＣ
Ｌ６４）株、ＨＢ１０１（ｐＨＣＬ６４ａ）株およびＨ
Ｂ１０１（ｐＨＣＬ６４ｂ）株を取得した。
【００４９】次いで、両組換え大腸菌から実施例２と同
様にして抽出した各精製組換えプラスミドを用いて、枯
草菌ＩＳＷ１２１４株（leuA8, metB5, hsrM1）の形質
転換をプロトプラスト法［S. Chang とS. N. Choen, Mo
l. Gen. Genet., 168, 111-115(1978)］に従って行な
い、５μｇ／ｍｌテトラサイクリンを含むプロトプラス
ト再生用ＤＭ３培地［０.５％ コハク酸ナトリウム（ｐ
Ｈ７.３）、０.５％ カザミノ酸、０.５％ 酵母エキ
ス、０.３５％ Ｋ2ＨＰＯ4、０.１５％ ＫＨ2ＰＯ4 、
０.５％ グルコース、２０ｍＭ ＭｇＣｌ2、０.０１％
牛血清アルブミン（シグマ社製）］を用いて形質転換
体を選択した。
様にして抽出した各精製組換えプラスミドを用いて、枯
草菌ＩＳＷ１２１４株（leuA8, metB5, hsrM1）の形質
転換をプロトプラスト法［S. Chang とS. N. Choen, Mo
l. Gen. Genet., 168, 111-115(1978)］に従って行な
い、５μｇ／ｍｌテトラサイクリンを含むプロトプラス
ト再生用ＤＭ３培地［０.５％ コハク酸ナトリウム（ｐ
Ｈ７.３）、０.５％ カザミノ酸、０.５％ 酵母エキ
ス、０.３５％ Ｋ2ＨＰＯ4、０.１５％ ＫＨ2ＰＯ4 、
０.５％ グルコース、２０ｍＭ ＭｇＣｌ2、０.０１％
牛血清アルブミン（シグマ社製）］を用いて形質転換
体を選択した。
【００５０】この結果、これら組換えプラスミドを含む
組換え枯草菌ＩＳＷ１２１４（ｐＨＣＬ６４）株、ＩＳ
Ｗ１２１４（ｐＨＣＬ６４ａ）株、ＩＳＷ１２１４（ｐ
ＨＣＬ６４ｂ）株を取得した。
組換え枯草菌ＩＳＷ１２１４（ｐＨＣＬ６４）株、ＩＳ
Ｗ１２１４（ｐＨＣＬ６４ａ）株、ＩＳＷ１２１４（ｐ
ＨＣＬ６４ｂ）株を取得した。
【００５１】実 施 例 ４ 実施例３で得られた各組換え枯草菌株或いは大腸菌株を
１５μｇ／ｍｌテトラサイクリンを含むＰＹ培地（２％
ポリペプトン、０.１％ 酵母エキス、０.１％ ＫＨ2
ＰＯ4、０.５％ ＮａＣｌ）或いは５０μｇ／ｍｌアン
ピシリンを含むＬＢ培地中、３０℃或いは３７℃で振盪
培養し、培養液或いは無細胞抽出液中のアルカリセルラ
ーゼ活性を測定したところ、高発現誘導ＤＮＡを含むプ
ラスミド、すなわちｐＨＣＬ６４またはｐＨＣＬ６４ａ
を保持する組換え枯草菌ＩＳＷ１２１４株或いは大腸菌
ＨＢ１０１株によるアルカリセルラーゼＫ−６４の生産
性は、高発現誘導ＤＮＡを含まないｐＨＣＬ６４ｂを保
持する組換え菌株の約４〜６倍であることが明かにな
り、高発現誘導ＤＮＡによる酵素生産の促進効果が示さ
れた（表１）。
１５μｇ／ｍｌテトラサイクリンを含むＰＹ培地（２％
ポリペプトン、０.１％ 酵母エキス、０.１％ ＫＨ2
ＰＯ4、０.５％ ＮａＣｌ）或いは５０μｇ／ｍｌアン
ピシリンを含むＬＢ培地中、３０℃或いは３７℃で振盪
培養し、培養液或いは無細胞抽出液中のアルカリセルラ
ーゼ活性を測定したところ、高発現誘導ＤＮＡを含むプ
ラスミド、すなわちｐＨＣＬ６４またはｐＨＣＬ６４ａ
を保持する組換え枯草菌ＩＳＷ１２１４株或いは大腸菌
ＨＢ１０１株によるアルカリセルラーゼＫ−６４の生産
性は、高発現誘導ＤＮＡを含まないｐＨＣＬ６４ｂを保
持する組換え菌株の約４〜６倍であることが明かにな
り、高発現誘導ＤＮＡによる酵素生産の促進効果が示さ
れた（表１）。
【００５２】
【００５３】また、高発現誘導ＤＮＡを保持する組換え
枯草菌ＩＳＷ１２１４（ｐＨＣＬ６４）株を、種々の炭
素源 ０.２％（但しＣＭＣ及び可溶性澱粉は１.０％）
と１５μｇ／ｍｌテトラサイクリンを含むＰＹ培地およ
び種々の窒素源（総窒素０.２％相当量、すなわち２.６
％ 酵母エキス、２.９％ ゼスト７０、１.８％ ポリペ
プトン、２.０％ 肉エキス、３.４％ 魚肉エキス、９.
６％ カルチベーター、８.０％ ＣＳＬ、２.８％ ファ
ーマメディア、３.６％ 大豆粉または２.６％ アジプロ
ンＥ2）と１５μｇ／ｍｌテトラサイクリンを含むＮ培
地［０.５％ 魚肉エキス（ＮＥ４０）、０.０５％ 酵母
エキス（Ｂ−２）、０.１％ ＫＨ2ＰＯ4、０.０２％ Ｍ
ｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、１.０％ 麦芽糖］で培養した。 こ
の結果、組換え枯草菌ＩＳＷ１２１４(ｐＨＣＬ６４)株
により、より高い生産性でアルカリセルラーゼＫ−６４
が得られることが認められた（表２、表３）。
枯草菌ＩＳＷ１２１４（ｐＨＣＬ６４）株を、種々の炭
素源 ０.２％（但しＣＭＣ及び可溶性澱粉は１.０％）
と１５μｇ／ｍｌテトラサイクリンを含むＰＹ培地およ
び種々の窒素源（総窒素０.２％相当量、すなわち２.６
％ 酵母エキス、２.９％ ゼスト７０、１.８％ ポリペ
プトン、２.０％ 肉エキス、３.４％ 魚肉エキス、９.
６％ カルチベーター、８.０％ ＣＳＬ、２.８％ ファ
ーマメディア、３.６％ 大豆粉または２.６％ アジプロ
ンＥ2）と１５μｇ／ｍｌテトラサイクリンを含むＮ培
地［０.５％ 魚肉エキス（ＮＥ４０）、０.０５％ 酵母
エキス（Ｂ−２）、０.１％ ＫＨ2ＰＯ4、０.０２％ Ｍ
ｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、１.０％ 麦芽糖］で培養した。 こ
の結果、組換え枯草菌ＩＳＷ１２１４(ｐＨＣＬ６４)株
により、より高い生産性でアルカリセルラーゼＫ−６４
が得られることが認められた（表２、表３）。
【００５４】
【００５５】
【００５６】実 施 例 ５ 実施例２で得られた組換えプラスミドｐＵＣＬ６４を制
限酵素ＢｇｌII及びＰｓｔIによって切断し、デレーシ
ョンキット（宝酒造社製）を用いて、アルカリセルラー
ゼ構造遺伝子の消化を行ない、この後、Ｔ4ＤＮＡリガ
ーゼを用いて自己閉環化反応を行った。 次に、実施例
１と同様にして結合反応物による大腸菌の形質転換処理
を行ない、出現した形質転換体の組換えプラスミドを実
施例２と同様に解析することによって、アルカリセルラ
ーゼＫ−６４構造遺伝子の大部分を欠失したプラスミド
ベクターｐＵＳ６４（図２）を保持する組換え大腸菌Ｈ
Ｂ１０１（ｐＵＳ６４）を選択した。
限酵素ＢｇｌII及びＰｓｔIによって切断し、デレーシ
ョンキット（宝酒造社製）を用いて、アルカリセルラー
ゼ構造遺伝子の消化を行ない、この後、Ｔ4ＤＮＡリガ
ーゼを用いて自己閉環化反応を行った。 次に、実施例
１と同様にして結合反応物による大腸菌の形質転換処理
を行ない、出現した形質転換体の組換えプラスミドを実
施例２と同様に解析することによって、アルカリセルラ
ーゼＫ−６４構造遺伝子の大部分を欠失したプラスミド
ベクターｐＵＳ６４（図２）を保持する組換え大腸菌Ｈ
Ｂ１０１（ｐＵＳ６４）を選択した。
【００５７】実 施 例 ６ 実施例２と同様にして組換えプラスミドｐＵＳ６４を抽
出、精製し、これを制限酵素ＥｃｏＲI及びＨｉｎｄIII
によって切断し、アルカリセルラーゼＫ−６４遺伝子上
流領域の１.８ｋｂのＤＮＡ断片を単離した。 これを制
限酵素ＥｃｏＲI及びＨｉｎｄIIIで切断したシャトルベ
クターｐＨＹ３００ＰＬＫとＴ4ＤＮＡリガーゼを用い
て結合した。
出、精製し、これを制限酵素ＥｃｏＲI及びＨｉｎｄIII
によって切断し、アルカリセルラーゼＫ−６４遺伝子上
流領域の１.８ｋｂのＤＮＡ断片を単離した。 これを制
限酵素ＥｃｏＲI及びＨｉｎｄIIIで切断したシャトルベ
クターｐＨＹ３００ＰＬＫとＴ4ＤＮＡリガーゼを用い
て結合した。
【００５８】一方、同様にして組換えプラスミドｐＵＳ
６４を制限酵素ＥｃｏＲI及び ＳｃａIによって切断
後、アルカリセルラーゼＫ−６４上流領域の６７９ｂｐ
のＤＮＡ断片を単離した。 このＤＮＡ断片と、制限酵
素ＨｉｎｄIIIで切断後、末端をＤＮＡブランティング
キット（宝酒造社製）によって平滑化し、更に制限酵素
ＥｃｏＲIで切断したシャトルベクターｐＨＹ３００Ｐ
ＬＫとを混合して、Ｔ4ＤＮＡリガーゼで結合した。
６４を制限酵素ＥｃｏＲI及び ＳｃａIによって切断
後、アルカリセルラーゼＫ−６４上流領域の６７９ｂｐ
のＤＮＡ断片を単離した。 このＤＮＡ断片と、制限酵
素ＨｉｎｄIIIで切断後、末端をＤＮＡブランティング
キット（宝酒造社製）によって平滑化し、更に制限酵素
ＥｃｏＲIで切断したシャトルベクターｐＨＹ３００Ｐ
ＬＫとを混合して、Ｔ4ＤＮＡリガーゼで結合した。
【００５９】両結合反応物による大腸菌の形質転換処理
を実施例１に従って行ない、１５μｇ／ｍｌのテトラサ
イクリン（シグマ社製）を含むＬＢ寒天プレート培地に
塗抹し、３７℃で１２時間培養した。 出現した形質転
換体の集落を、テトラサイクリンを含む５ｍｌのＬＢ培
地に接種し、実施例２と同様にして得られた組換えプラ
スミドの制限酵素切断点の解析を行って、プラスミドベ
クターｐＨＳ６４を保持する組換え大腸菌ＨＢ１０１
（ｐＨＳ６４）株およびプラスミドベクターｐＨＳＰ６
４を保持する大腸菌ＨＢ１０１（ｐＨＳＰ６４）株を選
択した（図２）。
を実施例１に従って行ない、１５μｇ／ｍｌのテトラサ
イクリン（シグマ社製）を含むＬＢ寒天プレート培地に
塗抹し、３７℃で１２時間培養した。 出現した形質転
換体の集落を、テトラサイクリンを含む５ｍｌのＬＢ培
地に接種し、実施例２と同様にして得られた組換えプラ
スミドの制限酵素切断点の解析を行って、プラスミドベ
クターｐＨＳ６４を保持する組換え大腸菌ＨＢ１０１
（ｐＨＳ６４）株およびプラスミドベクターｐＨＳＰ６
４を保持する大腸菌ＨＢ１０１（ｐＨＳＰ６４）株を選
択した（図２）。
【００６０】実 施 例 ７ バチルス エスピー ＫＳＭ−３３０株由来の酸性セルラ
ーゼＫ−３３０遺伝子を含む、約１.８ｋｂのＨｉｎｄI
II−ＨｐａI断片［K. Ozaki ら、J. Gen.Microbiol., 1
37, 2299-2305(1991)］の末端をＤＮＡブランティング
キット（宝酒造社製）によって平滑化した。 これを制
限酵素ＳｍａIで切断した直鎖状のベクターｐＵＣ１
９、プラスミドベクターｐＵＳ６４、プラスミドベクタ
ーｐＨＳ６４およびシャトルベクターｐＨＹ３００ＰＬ
Ｋと別個に混合し、Ｔ4ＤＮＡリガーゼで結合した。
ーゼＫ−３３０遺伝子を含む、約１.８ｋｂのＨｉｎｄI
II−ＨｐａI断片［K. Ozaki ら、J. Gen.Microbiol., 1
37, 2299-2305(1991)］の末端をＤＮＡブランティング
キット（宝酒造社製）によって平滑化した。 これを制
限酵素ＳｍａIで切断した直鎖状のベクターｐＵＣ１
９、プラスミドベクターｐＵＳ６４、プラスミドベクタ
ーｐＨＳ６４およびシャトルベクターｐＨＹ３００ＰＬ
Ｋと別個に混合し、Ｔ4ＤＮＡリガーゼで結合した。
【００６１】実施例１と同様にして結合反応物による大
腸菌の形質転換処理を行ない、得られたプラスミドの制
限酵素切断点の解析を行って、当該ＤＮＡ断片が各プラ
スミドのＳｍａI部位に挿入された各組換えプラスミ
ド、すなわち、ｐＵＫＣ３３１及びｐＵＫＣ３３１Ｒ
（図４）、ｐＵＳ−ＫＣ及びｐＵＳ−ＫＣＲ（図５）、
ｐＨＳ−ＫＣ及びｐＨＳ−ＫＣＲ（図６）、並びにｐＨ
ＫＣ３３１及びｐＨＫＣ３３１Ｒ（図４）をそれぞれ含
む組換え大腸菌ＨＢ１０１各株を取得した。
腸菌の形質転換処理を行ない、得られたプラスミドの制
限酵素切断点の解析を行って、当該ＤＮＡ断片が各プラ
スミドのＳｍａI部位に挿入された各組換えプラスミ
ド、すなわち、ｐＵＫＣ３３１及びｐＵＫＣ３３１Ｒ
（図４）、ｐＵＳ−ＫＣ及びｐＵＳ−ＫＣＲ（図５）、
ｐＨＳ−ＫＣ及びｐＨＳ−ＫＣＲ（図６）、並びにｐＨ
ＫＣ３３１及びｐＨＫＣ３３１Ｒ（図４）をそれぞれ含
む組換え大腸菌ＨＢ１０１各株を取得した。
【００６２】また、実施例３と同様にして、ｐＨＹ３０
０ＰＬＫに由来する各組換えプラスミドによって、枯草
菌ＩＳＷ１２１４株を形質転換し、組換え枯草菌ＩＳＷ
１２１４（ｐＨＫＣ３３１）株、ＩＳＷ１２１４（ｐＨ
ＫＣ３３１Ｒ）株、ＩＳＷ１２１４（ｐＨＳ−ＫＣ）株
及びＩＳＷ１２１４（ｐＨＳ−ＫＣＲ）株を取得した。
０ＰＬＫに由来する各組換えプラスミドによって、枯草
菌ＩＳＷ１２１４株を形質転換し、組換え枯草菌ＩＳＷ
１２１４（ｐＨＫＣ３３１）株、ＩＳＷ１２１４（ｐＨ
ＫＣ３３１Ｒ）株、ＩＳＷ１２１４（ｐＨＳ−ＫＣ）株
及びＩＳＷ１２１４（ｐＨＳ−ＫＣＲ）株を取得した。
【００６３】実 施 例 ８ 実施例７で取得した各組換え大腸菌及び枯草菌株を、ア
ンピシリンを含むＬＢ培地またはテトラサイクリンを含
むＰＹ培地に接種し、３７℃または３０℃で、振盪培養
を行った。 この結果、高発現誘導ＤＮＡが酸性セルラ
ーゼＫ−３３０構造遺伝子の上流に存在するプラスミド
を保持する組換え枯草菌ＩＳＷ１２１４（ｐＨＳ−Ｋ
Ｃ）株の酸性セルラーゼの生産性は、高発現誘導ＤＮＡ
を含まない組換え枯草菌ＩＳＷ１２１４（ｐＨＫＣ３３
０）株や酸性セルラーゼＫ−３３０構造遺伝子の下流に
存在する組換え枯草菌ＩＳＷ１２１４（ｐＨＳ−ＫＣ
Ｒ）株の約５倍から６倍であることが明らかになり（表
４）、ここにおいても高発現誘導ＤＮＡの有効性が示さ
れた。 また、高発現誘導ＤＮＡを含む組換え枯草菌Ｉ
ＳＷ１２１４（ｐＨＳ−ＫＣ）株は、各種窒素源を含む
Ｎ培地において良好な酸性セルラーゼＫ−３３０の生産
を示した（表５）。
ンピシリンを含むＬＢ培地またはテトラサイクリンを含
むＰＹ培地に接種し、３７℃または３０℃で、振盪培養
を行った。 この結果、高発現誘導ＤＮＡが酸性セルラ
ーゼＫ−３３０構造遺伝子の上流に存在するプラスミド
を保持する組換え枯草菌ＩＳＷ１２１４（ｐＨＳ−Ｋ
Ｃ）株の酸性セルラーゼの生産性は、高発現誘導ＤＮＡ
を含まない組換え枯草菌ＩＳＷ１２１４（ｐＨＫＣ３３
０）株や酸性セルラーゼＫ−３３０構造遺伝子の下流に
存在する組換え枯草菌ＩＳＷ１２１４（ｐＨＳ−ＫＣ
Ｒ）株の約５倍から６倍であることが明らかになり（表
４）、ここにおいても高発現誘導ＤＮＡの有効性が示さ
れた。 また、高発現誘導ＤＮＡを含む組換え枯草菌Ｉ
ＳＷ１２１４（ｐＨＳ−ＫＣ）株は、各種窒素源を含む
Ｎ培地において良好な酸性セルラーゼＫ−３３０の生産
を示した（表５）。
【００６４】 * 図４参照、 * *図６参照 + 高発現誘導ＤＮＡ内に存在する分泌シグナルペプチド
の転写方向に対する方向を示す。
の転写方向に対する方向を示す。
【００６５】
【００６６】同様に、組換え大腸菌においても、高発現
誘導ＤＮＡが酸性セルラーゼＫ−３３０構造遺伝子の上
流に存在するプラスミドを保持する組換え大腸菌（ｐＵ
Ｓ−ＫＣ）の無細胞抽出液中に、高い酸性セルラーゼ活
性が認められた（表６）。
誘導ＤＮＡが酸性セルラーゼＫ−３３０構造遺伝子の上
流に存在するプラスミドを保持する組換え大腸菌（ｐＵ
Ｓ−ＫＣ）の無細胞抽出液中に、高い酸性セルラーゼ活
性が認められた（表６）。
【００６７】 * 図４参照、 ** 図５参照 + 高発現誘導ＤＮＡ内に存在する分泌シグナルペプチド
の転写方向に対する方向を示す。
の転写方向に対する方向を示す。
【００６８】実 施 例 ９ バチルス エスピー ＫＳＭ−６３５株由来のアルカリセ
ルラーゼＫ−６３５遺伝子を含む約１.０ｋｂのＢａｍ
ＨI−ＢａｍＨI断片を、制限酵素ＢａｍＨIで切断した
ベクターｐＨＹ３００ＰＬＫと、また、アルカリセルラ
ーゼＫ−６３５構造遺伝子を含む約１.０ｋｂのＢａｍ
ＨI−ＳａｌI断片を、制限酵素ＢａｍＨI−ＳａｌIで切
断した直鎖状のベクターｐＨＳＰ６４とそれぞれ混合し
て、Ｔ4ＤＮＡリガーゼで結合した。
ルラーゼＫ−６３５遺伝子を含む約１.０ｋｂのＢａｍ
ＨI−ＢａｍＨI断片を、制限酵素ＢａｍＨIで切断した
ベクターｐＨＹ３００ＰＬＫと、また、アルカリセルラ
ーゼＫ−６３５構造遺伝子を含む約１.０ｋｂのＢａｍ
ＨI−ＳａｌI断片を、制限酵素ＢａｍＨI−ＳａｌIで切
断した直鎖状のベクターｐＨＳＰ６４とそれぞれ混合し
て、Ｔ4ＤＮＡリガーゼで結合した。
【００６９】実施例１と同様にして結合反応物による大
腸菌ＨＢ１０１株の形質転換処理を行ない、得られた組
換えプラスミドの制限酵素切断点の解析を行った。 こ
の結果、各消化ＤＮＡ断片を、ｐＨＹ３００ＰＬＫのＢ
ａｍＨI部位またはｐＨＳＰ６４の ＢａｍＨI、ＳａｌI
部位間に挿入された各組換えプラスミドである、ｐＨＢ
Ｃ１１５Ｂ、ｐＨＢＣ１１５ＢＲ及びｐＨＳＰ−ＢＣ
（図７）をそれぞれ含む組換え大腸菌ＨＢ１０１株を取
得した。
腸菌ＨＢ１０１株の形質転換処理を行ない、得られた組
換えプラスミドの制限酵素切断点の解析を行った。 こ
の結果、各消化ＤＮＡ断片を、ｐＨＹ３００ＰＬＫのＢ
ａｍＨI部位またはｐＨＳＰ６４の ＢａｍＨI、ＳａｌI
部位間に挿入された各組換えプラスミドである、ｐＨＢ
Ｃ１１５Ｂ、ｐＨＢＣ１１５ＢＲ及びｐＨＳＰ−ＢＣ
（図７）をそれぞれ含む組換え大腸菌ＨＢ１０１株を取
得した。
【００７０】また、実施例２と同様にして抽出した各組
換えプラスミドによる枯草菌ＩＳＷ１２１４株の形質転
換を実施例３と同様にして行ない、組換え枯草菌ＩＳＷ
１２１４（ｐＨＢＣ１１５Ｂ）株、ＩＳＷ１２１４（ｐ
ＨＢＣ１１５ＢＲ）株、ＩＳＷ１２１４（ｐＨＳＰ−Ｂ
Ｃ）株を取得した。
換えプラスミドによる枯草菌ＩＳＷ１２１４株の形質転
換を実施例３と同様にして行ない、組換え枯草菌ＩＳＷ
１２１４（ｐＨＢＣ１１５Ｂ）株、ＩＳＷ１２１４（ｐ
ＨＢＣ１１５ＢＲ）株、ＩＳＷ１２１４（ｐＨＳＰ−Ｂ
Ｃ）株を取得した。
【００７１】実 施 例 １０ 実施例９で取得した各組換え枯草菌株を、テトラサイク
リンを含むＰＹ培地に接種し、３０℃で、振盪培養を行
った。 この結果、アルカリセルラーゼＫ−６３５構造
遺伝子の上流に高発現誘導ＤＮＡを有するプラスミドを
保持する組換え枯草菌ＩＳＷ１２１４（ｐＨＳＰ−Ｂ
Ｃ）株では、アルカリセルラーゼの高い生産性が認めら
れた（表７）。 また、高発現誘導ＤＮＡを含む組換え
枯草菌ＩＳＷ１２１４（ｐＨＳＰ−ＢＣ）株は、テトラ
サイクリンを含むＮ培地において良好なアルカリセルラ
ーゼＫ−６３５の生産を示した（表８）。
リンを含むＰＹ培地に接種し、３０℃で、振盪培養を行
った。 この結果、アルカリセルラーゼＫ−６３５構造
遺伝子の上流に高発現誘導ＤＮＡを有するプラスミドを
保持する組換え枯草菌ＩＳＷ１２１４（ｐＨＳＰ−Ｂ
Ｃ）株では、アルカリセルラーゼの高い生産性が認めら
れた（表７）。 また、高発現誘導ＤＮＡを含む組換え
枯草菌ＩＳＷ１２１４（ｐＨＳＰ−ＢＣ）株は、テトラ
サイクリンを含むＮ培地において良好なアルカリセルラ
ーゼＫ−６３５の生産を示した（表８）。
【００７２】
【００７３】
【００７４】実 施 例 １１ 実施例７と同様にして、約０.８ｋｂのクロラムフェニ
コール耐性遺伝子（ファルマシア社製）の末端を平滑化
した後、これと制限酵素ＳｍａIで切断した直鎖状のプ
ラスミドベクターｐＨＳＰ６４を混合し、Ｔ4ＤＮＡリ
ガーゼで結合した。 結合反応物による大腸菌の形質転
換処理を実施例１に従って行った。 処理後の菌懸濁液
を１５μｇ／ｍｌテトラサイクリン（シグマ社製）を含
むＬＢ寒天プレート培地に塗抹し、３７℃で１２時間培
養した。
コール耐性遺伝子（ファルマシア社製）の末端を平滑化
した後、これと制限酵素ＳｍａIで切断した直鎖状のプ
ラスミドベクターｐＨＳＰ６４を混合し、Ｔ4ＤＮＡリ
ガーゼで結合した。 結合反応物による大腸菌の形質転
換処理を実施例１に従って行った。 処理後の菌懸濁液
を１５μｇ／ｍｌテトラサイクリン（シグマ社製）を含
むＬＢ寒天プレート培地に塗抹し、３７℃で１２時間培
養した。
【００７５】出現した形質転換体から、実施例２と同様
にして得られた組換えプラスミドの制限酵素切断点の解
析を行い、組換えプラスミドｐＨＳＰ−Ｃｍ（図８）を
保持する組換え大腸菌ＨＢ１０１（ｐＨＳＰ−Ｃｍ）を
選択した。 更にこのｐＨＳＰ−ＣｍをＳａｌIとＢａｍ
ＨIで切断後、ヤエナリ ヌクレアーゼによる消化及びＴ
4ＤＮＡリガーゼによる再結合反応を行って、高発現誘
導ＤＮＡ内の分泌シグナルペプチド領域とクロラムフェ
ニコール アセチルトランスフェラーゼ構造遺伝子のＯ
ＲＦが一致したｐＨＳＰ−ＣｍＳＢを作製した。
にして得られた組換えプラスミドの制限酵素切断点の解
析を行い、組換えプラスミドｐＨＳＰ−Ｃｍ（図８）を
保持する組換え大腸菌ＨＢ１０１（ｐＨＳＰ−Ｃｍ）を
選択した。 更にこのｐＨＳＰ−ＣｍをＳａｌIとＢａｍ
ＨIで切断後、ヤエナリ ヌクレアーゼによる消化及びＴ
4ＤＮＡリガーゼによる再結合反応を行って、高発現誘
導ＤＮＡ内の分泌シグナルペプチド領域とクロラムフェ
ニコール アセチルトランスフェラーゼ構造遺伝子のＯ
ＲＦが一致したｐＨＳＰ−ＣｍＳＢを作製した。
【００７６】実施例２と同様にして抽出したプラスミド
ｐＨＳＰ−ＣｍＳＢによって、実施例３と同様の方法で
枯草菌ＩＳＷ１２１４株の形質転換を行ない、プラスミ
ドｐＨＳＰ−ＣｍＳＢを保持する組換え枯草菌ＩＳＷ１
２１４（ｐＨＳＰ−ＣｍＳＢ）株を取得した。
ｐＨＳＰ−ＣｍＳＢによって、実施例３と同様の方法で
枯草菌ＩＳＷ１２１４株の形質転換を行ない、プラスミ
ドｐＨＳＰ−ＣｍＳＢを保持する組換え枯草菌ＩＳＷ１
２１４（ｐＨＳＰ−ＣｍＳＢ）株を取得した。
【００７７】組換え枯草菌ＩＳＷ１２１４（ｐＨＳＰ−
ＣｍＳＢ）株及び対照実験としてＩＳＷ１２１４（ｐＨ
ＳＰ６４）株及びＩＳＷ１２１４（ｐＨＹ３００ＰＬ
Ｋ）株をテトラサイクリンを含むＬＢ培地に接種し、３
０℃で振盪培養を行ったところ、高発現誘導ＤＮＡを持
つプラスミドｐＨＳＰ−ＣｍＳＢを保持する組換え枯草
菌は、約８０ｍｇ／ｌのクロラムフェニコール アセチ
ルトランスフェラーゼを生産した（表９）。 また、高
発現誘導ＤＮＡを含む組換え枯草菌ＩＳＷ１２１４（ｐ
ＨＳＰ−ＣｍＳＢ）株は、テトラサイクリンを含むＮ培
地において良好なクロラムフェニコール アセチルトラ
ンスフェラーゼの生産を示した（表１０）。
ＣｍＳＢ）株及び対照実験としてＩＳＷ１２１４（ｐＨ
ＳＰ６４）株及びＩＳＷ１２１４（ｐＨＹ３００ＰＬ
Ｋ）株をテトラサイクリンを含むＬＢ培地に接種し、３
０℃で振盪培養を行ったところ、高発現誘導ＤＮＡを持
つプラスミドｐＨＳＰ−ＣｍＳＢを保持する組換え枯草
菌は、約８０ｍｇ／ｌのクロラムフェニコール アセチ
ルトランスフェラーゼを生産した（表９）。 また、高
発現誘導ＤＮＡを含む組換え枯草菌ＩＳＷ１２１４（ｐ
ＨＳＰ−ＣｍＳＢ）株は、テトラサイクリンを含むＮ培
地において良好なクロラムフェニコール アセチルトラ
ンスフェラーゼの生産を示した（表１０）。
【００７８】
【００７９】
【００８０】
【配列表】 配列番号 ：１ 配列の長さ：639 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：Genomic DNA 起 源： 生物名： ハ゛チルス エスヒ゜ー(Bacillus sp.) 株 名： KSM-64 配列の特徴： 特徴を表す記号：RBS 存在位置：600..606 特徴を決定した方法：E 配列の特徴： 特徴を表す記号：peptide 存在位置：610..639 特徴を決定した方法：E 配 列 AGTACTTACC ATTTTAGAGT CAAAAGATAG AAGCCAAGCA GGATTTGCCG ATGCAACCGG 60 CTTATATTTA GAGGGAATTT CTTTTTAAAT TGAATACGGA ATAAAATCAG GTAAACAGGT 120 CCTGATTTTA TTTTTTTGAA TTTTTTTGAG AACTAAAGAT TGAAATAGAA GTAGAAGACA 180 ACGGACATAA GAAAATTGTA TTAGTTTTAA TTATAGAAAA CGCTTTTCTA TAATTATTTA 240 TACCTAGAAC GAAAATACTG TTTCGAAAGC GGTTTACTAT AAAACCTTAT ATTCCGGCTC 300 TTTTTTTAAA CAGGGGGTGA AAATTCACTC TAGTATTCTA ATTTCAACAT GCTATAATAA 360 ATTTGTAAGA CGCAATATAC ATCTTTTTTT TATGATATTT GTAAGCGGTT AACCTTGTGC 420 TATATGCCGA TTTAGGAAGG GGGTAGATTG AGTCAAGTAG TCATAATTTA GATAACTTAT 480 AAGTTGTTGA GAAGCAGGAG AGAATCTGGG TTACTCACAA GTTTTTTAAA ACATTATCGA 540 AAGCACTTTC GGTTATGCTT ATGAATTTAG CTATTTGATT CAATTACTTT AATAATTTTA 600 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 GGAGGTAAT ATG ATG TTA AGA AAG AAA ACA AAG CAG TTG 639 Met Met Leu Arg Lys Lys Thr Lys Gln Leu
【図１】 バチルス エスピー ＫＳＭ−６４株のアルカ
リセルラーゼＫ−６４遺伝子上流領域（高発現誘導ＤＮ
Ａ）の塩基配列の図である。
リセルラーゼＫ−６４遺伝子上流領域（高発現誘導ＤＮ
Ａ）の塩基配列の図である。
【図２】 高発現誘導ＤＮＡを含むプラスミドベクター
ｐＵＳ６４、ｐＨＳ６４及びｐＨＳＰ６４の構築を示す
図である。
ｐＵＳ６４、ｐＨＳ６４及びｐＨＳＰ６４の構築を示す
図である。
【図３】 バチルス エスピー ＫＳＭ−６４株のアルカ
リセルラーゼＫ−６４遺伝子を含むプラスミドの構築を
示す図である。
リセルラーゼＫ−６４遺伝子を含むプラスミドの構築を
示す図である。
【図４】 バチルス エスピー ＫＳＭ−３３０株の酸性
セルラーゼＫ−３３０遺伝子を含むプラスミドの構築を
示す図である。
セルラーゼＫ−３３０遺伝子を含むプラスミドの構築を
示す図である。
【図５】 バチルス エスピー ＫＳＭ−３３０株の酸性
セルラーゼＫ−３３０遺伝子を含むプラスミドの構築を
示す図である。
セルラーゼＫ−３３０遺伝子を含むプラスミドの構築を
示す図である。
【図６】 バチルス エスピー ＫＳＭ−３３０株の酸性
セルラーゼＫ−３３０遺伝子を含むプラスミドの構築を
示す図である。
セルラーゼＫ−３３０遺伝子を含むプラスミドの構築を
示す図である。
【図７】 バチルス エスピー ＫＳＭ−６３５株のアル
カリセルラーゼＫ−６３５遺伝子を含むプラスミド作製
を示す図である。
カリセルラーゼＫ−６３５遺伝子を含むプラスミド作製
を示す図である。
【図８】 クロラムフェニコール耐性遺伝子を含むプラ
スミド作製を示す図である。
スミド作製を示す図である。
図２から図８において、太線部分は挿入遺伝子のＤＮＡ
断片であり、細線部分は各プラスミドの中に示したプラ
スミドｐＵＣ１９またはｐＨＹ３００ＰＬＫ由来のＤＮ
Ａ断片である。 一方、矢印は投入した各種遺伝子の構
造遺伝子領域であり、また、斜線部分は高発現誘導ＤＮ
Ａの領域を示す。 Ｂａ ＢａｍＨI Ｂｇ Ｂｇ１II Ｋｐ ＫｐｎI Ｈｐ ＨｐａI Ｈｉ ＨｉｎｄIII Ｐｓ ＰｓｔI Ｐｖ ＰｖｕII Ｓｌ ＳａｌI Ｅｃ ＥｃｏＲI Ｓｍ ＳｍａI Ｘｂ ＸｂａI Ｘｈ ＸｈｏI Ｓｃ ＳｃａI Ｓａ ＳａｃI Ａｐ アンピシリン耐性遺伝子 Ｔｃ テトラサイクリン遺伝子 （マルチプルクローニングサイト） ＭＣＳI Ｅｃ-Ｓａ-Ｋｐ-Ｓｍ-Ｂａ-Ｘｂ-Ｓｌ-Ｐ
ｓ-Ｓｐ-Ｈｉ ＭＣＳII Ｅｃ-Ｓｍ-Ｂａ-Ｓｌ-Ｐｓ-Ｂｇ-Ｘｂ-Ｈ
ｉ ＭＣＳIII Ｅｃ-Ｓａ-Ｋｐ-Ｓｍ-Ｂａ-Ｘｂ-Ｓｌ ＭＣＳIV Ｅｃ-Ｓａ-Ｋｐ-（Ｓｍ） ＭＣＳV Ｈｉ-Ｓｐ-Ｐｓ-Ｓｌ-Ｘｂ-Ｂａ-（Ｓｍ） ＭＣＳVI Ｓｌ-Ｘｂ-Ｂａ-（Ｓｍ） ＭＣＳVII Ｈｉ-Ｘｂ-Ｂｇ-Ｐｓ-Ｓｌ-Ｂａ ＭＣＳVIII Ｓｐ-Ｐｓ-Ｓｌ-Ｘｂ-Ｂａ-Ｓｍ-Ｅｃ ＭＣＳIX Ｈｉ-Ｘｂ-Ｂｇ-Ｐｓ-Ｓｌ-Ｂａ-Ｘｂ-Ｓ
ｌ-Ｐｓ-Ｓｐ ＭＣＳX Ｂａ-Ｓｍ-Ｅｃ ＭＣＳXI Ｂａ-Ｓｍ-Ｋｐ-Ｓａ-Ｅｃ 以 上
断片であり、細線部分は各プラスミドの中に示したプラ
スミドｐＵＣ１９またはｐＨＹ３００ＰＬＫ由来のＤＮ
Ａ断片である。 一方、矢印は投入した各種遺伝子の構
造遺伝子領域であり、また、斜線部分は高発現誘導ＤＮ
Ａの領域を示す。 Ｂａ ＢａｍＨI Ｂｇ Ｂｇ１II Ｋｐ ＫｐｎI Ｈｐ ＨｐａI Ｈｉ ＨｉｎｄIII Ｐｓ ＰｓｔI Ｐｖ ＰｖｕII Ｓｌ ＳａｌI Ｅｃ ＥｃｏＲI Ｓｍ ＳｍａI Ｘｂ ＸｂａI Ｘｈ ＸｈｏI Ｓｃ ＳｃａI Ｓａ ＳａｃI Ａｐ アンピシリン耐性遺伝子 Ｔｃ テトラサイクリン遺伝子 （マルチプルクローニングサイト） ＭＣＳI Ｅｃ-Ｓａ-Ｋｐ-Ｓｍ-Ｂａ-Ｘｂ-Ｓｌ-Ｐ
ｓ-Ｓｐ-Ｈｉ ＭＣＳII Ｅｃ-Ｓｍ-Ｂａ-Ｓｌ-Ｐｓ-Ｂｇ-Ｘｂ-Ｈ
ｉ ＭＣＳIII Ｅｃ-Ｓａ-Ｋｐ-Ｓｍ-Ｂａ-Ｘｂ-Ｓｌ ＭＣＳIV Ｅｃ-Ｓａ-Ｋｐ-（Ｓｍ） ＭＣＳV Ｈｉ-Ｓｐ-Ｐｓ-Ｓｌ-Ｘｂ-Ｂａ-（Ｓｍ） ＭＣＳVI Ｓｌ-Ｘｂ-Ｂａ-（Ｓｍ） ＭＣＳVII Ｈｉ-Ｘｂ-Ｂｇ-Ｐｓ-Ｓｌ-Ｂａ ＭＣＳVIII Ｓｐ-Ｐｓ-Ｓｌ-Ｘｂ-Ｂａ-Ｓｍ-Ｅｃ ＭＣＳIX Ｈｉ-Ｘｂ-Ｂｇ-Ｐｓ-Ｓｌ-Ｂａ-Ｘｂ-Ｓ
ｌ-Ｐｓ-Ｓｐ ＭＣＳX Ｂａ-Ｓｍ-Ｅｃ ＭＣＳXI Ｂａ-Ｓｍ-Ｋｐ-Ｓａ-Ｅｃ 以 上
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成５年１０月２２日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３５
【補正方法】変更
【補正内容】
【００３５】同様に、高発現誘導ＤＮＡを含む組換え枯
草菌ＩＳＷ１２１４（ｐＨＳ−ＫＣ）株による酸性セル
ラーゼＫ−３３０の生産の場合、表５に示されるよう
に、窒素源として、酵母エキス、魚肉エキス、ゼスト７
０、カルチベーター或いはＣＳＬ等を用いることができ
る。これらの窒素源と炭素源を適当な濃度で適宜組合
せ、この他に適当な濃度の無機塩類、例えば、塩化ナト
リウム、燐酸ナトリウム、硫酸ナトリウム等を添加すれ
ば良い。
草菌ＩＳＷ１２１４（ｐＨＳ−ＫＣ）株による酸性セル
ラーゼＫ−３３０の生産の場合、表５に示されるよう
に、窒素源として、酵母エキス、魚肉エキス、ゼスト７
０、カルチベーター或いはＣＳＬ等を用いることができ
る。これらの窒素源と炭素源を適当な濃度で適宜組合
せ、この他に適当な濃度の無機塩類、例えば、塩化ナト
リウム、燐酸ナトリウム、硫酸ナトリウム等を添加すれ
ば良い。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６３
【補正方法】変更
【補正内容】
【００６３】実施 例８ 実施例７で取得した各組換え大腸菌及び枯草菌株を、ア
ンピシリンを含むＬＢ培地またはテトラサイクリンを含
むＰＹ培地に接種し、３７℃または３０℃で、振盪培養
を行った。この結果、高発現誘導ＤＮＡが酸性セルラー
ゼＫ−３３０構造遺伝子の上流に存在するプラスミドを
保持する組換え枯草菌ＩＳＷ１２１４（ｐＨＳ−ＫＣ）
株の酸性セルラーゼの生産性は、高発現誘導ＤＮＡを含
まない組換え枯草菌ＩＳＷ１２１４（ｐＨＫＣ３３１
Ｒ）株や酸性セルラーゼＫ−３３０構造遺伝子の下流に
存在する組換え枯草菌ＩＳＷ１２１４（ｐＨＳ−ＫＣ
Ｒ）株の約５倍から６倍であることが明らかになり（表
４）、ここにおいても高発現誘導ＤＮＡの有効性が示さ
れた。また、高発現誘導ＤＮＡを含む組換え枯草菌ＩＳ
Ｗ１２１４（ｐＨＳ−ＫＣ）株は、各種窒素源を含むＮ
培地において良好な酸性セルラーゼＫ−３３０の生産を
示した（表５）。
ンピシリンを含むＬＢ培地またはテトラサイクリンを含
むＰＹ培地に接種し、３７℃または３０℃で、振盪培養
を行った。この結果、高発現誘導ＤＮＡが酸性セルラー
ゼＫ−３３０構造遺伝子の上流に存在するプラスミドを
保持する組換え枯草菌ＩＳＷ１２１４（ｐＨＳ−ＫＣ）
株の酸性セルラーゼの生産性は、高発現誘導ＤＮＡを含
まない組換え枯草菌ＩＳＷ１２１４（ｐＨＫＣ３３１
Ｒ）株や酸性セルラーゼＫ−３３０構造遺伝子の下流に
存在する組換え枯草菌ＩＳＷ１２１４（ｐＨＳ−ＫＣ
Ｒ）株の約５倍から６倍であることが明らかになり（表
４）、ここにおいても高発現誘導ＤＮＡの有効性が示さ
れた。また、高発現誘導ＤＮＡを含む組換え枯草菌ＩＳ
Ｗ１２１４（ｐＨＳ−ＫＣ）株は、各種窒素源を含むＮ
培地において良好な酸性セルラーゼＫ−３３０の生産を
示した（表５）。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６７
【補正方法】変更
【補正内容】
【００６７】
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】符号の説明
【補正方法】変更
【補正内容】
【符号の説明】 図２から図８において、太線部分は挿入遺伝子のＤＮＡ
断片であり、細線部分は各プラスミドの中に示したプラ
スミドｐＵＣ１９またはｐＨＹ３００ＰＬＫ由来のＤＮ
Ａ断片であ。一方、矢印は投入した各種遺伝子の構造遺
伝子領域であり、また、斜線部分は高発現誘導ＤＮＡの
領域を示す。 Ｂａ ＢａｍＨＩ Ｂｇ ＢｇｌＩＩ Ｋｐ ＫｐｎＩ Ｈｐ ＨｐａＩ Ｈｉ ＨｉｎｄＩＩＩ Ｐｓ ＰｓｔＩ Ｐｖ ＰｖｕＩＩ Ｓｌ ＳａｌＩ Ｅｃ ＥｃｏＲＩ Ｓｍ ＳｍａＩ Ｘｂ ＸｂａＩ Ｘｈ ＸｈｏＩ Ｓｃ ＳｃａＩ Ｓａ ＳａｃＩ Ａｐ アンピシリン耐性遺伝子 Ｔｃ テトラサイクリン遺伝子ＡＥＧ アルカリセルラーゼ遺伝子 （マルチプルクローニングサイト） ＭＣＳＩ Ｅｃ−Ｓａ−Ｋｐ−Ｓｍ−Ｂａ−Ｘｂ−
Ｓｌ−Ｐｓ−Ｓｐ−Ｈｉ ＭＣＳＩＩ Ｅｃ−Ｓｍ−Ｂａ−Ｓｌ−Ｐｓ−Ｂｇ−
Ｘｂ−Ｈｉ ＭＣＳＩＩＩ Ｅｃ−Ｓａ−Ｋｐ−Ｓｍ−Ｂａ−Ｘｂ−
Ｓｌ ＭＣＳＩＶ Ｅｃ−Ｓａ−Ｋｐ−（Ｓｍ） ＭＣＳＶ Ｈｉ−Ｓｐ−Ｐｓ−Ｓｌ−Ｘｂ−Ｂａ−
（Ｓｍ） ＭＣＳＶＩ Ｓｌ−Ｘｂ−Ｂａ−（Ｓｍ） ＭＣＳＶＩＩ Ｈｉ−Ｘｂ−Ｂｇ−Ｐｓ−Ｓｌ−Ｂａ ＭＣＳＶＩＩＩ Ｓｐ−Ｐｓ−Ｓｌ−Ｘｂ−Ｂａ−Ｓｍ
−Ｅｃ ＭＣＳＩＸ Ｈｉ−Ｘｂ−Ｂｇ−Ｐｓ−Ｓｌ−Ｂａ−
Ｘｂ−Ｓｌ−Ｐｓ−Ｓｐ ＭＣＳＸ Ｂａ−Ｓｍ−Ｅｃ ＭＣＳＸＩ Ｂａ−Ｓｍ−Ｋｐ−Ｓａ−Ｅｃ
断片であり、細線部分は各プラスミドの中に示したプラ
スミドｐＵＣ１９またはｐＨＹ３００ＰＬＫ由来のＤＮ
Ａ断片であ。一方、矢印は投入した各種遺伝子の構造遺
伝子領域であり、また、斜線部分は高発現誘導ＤＮＡの
領域を示す。 Ｂａ ＢａｍＨＩ Ｂｇ ＢｇｌＩＩ Ｋｐ ＫｐｎＩ Ｈｐ ＨｐａＩ Ｈｉ ＨｉｎｄＩＩＩ Ｐｓ ＰｓｔＩ Ｐｖ ＰｖｕＩＩ Ｓｌ ＳａｌＩ Ｅｃ ＥｃｏＲＩ Ｓｍ ＳｍａＩ Ｘｂ ＸｂａＩ Ｘｈ ＸｈｏＩ Ｓｃ ＳｃａＩ Ｓａ ＳａｃＩ Ａｐ アンピシリン耐性遺伝子 Ｔｃ テトラサイクリン遺伝子ＡＥＧ アルカリセルラーゼ遺伝子 （マルチプルクローニングサイト） ＭＣＳＩ Ｅｃ−Ｓａ−Ｋｐ−Ｓｍ−Ｂａ−Ｘｂ−
Ｓｌ−Ｐｓ−Ｓｐ−Ｈｉ ＭＣＳＩＩ Ｅｃ−Ｓｍ−Ｂａ−Ｓｌ−Ｐｓ−Ｂｇ−
Ｘｂ−Ｈｉ ＭＣＳＩＩＩ Ｅｃ−Ｓａ−Ｋｐ−Ｓｍ−Ｂａ−Ｘｂ−
Ｓｌ ＭＣＳＩＶ Ｅｃ−Ｓａ−Ｋｐ−（Ｓｍ） ＭＣＳＶ Ｈｉ−Ｓｐ−Ｐｓ−Ｓｌ−Ｘｂ−Ｂａ−
（Ｓｍ） ＭＣＳＶＩ Ｓｌ−Ｘｂ−Ｂａ−（Ｓｍ） ＭＣＳＶＩＩ Ｈｉ−Ｘｂ−Ｂｇ−Ｐｓ−Ｓｌ−Ｂａ ＭＣＳＶＩＩＩ Ｓｐ−Ｐｓ−Ｓｌ−Ｘｂ−Ｂａ−Ｓｍ
−Ｅｃ ＭＣＳＩＸ Ｈｉ−Ｘｂ−Ｂｇ−Ｐｓ−Ｓｌ−Ｂａ−
Ｘｂ−Ｓｌ−Ｐｓ−Ｓｐ ＭＣＳＸ Ｂａ−Ｓｍ−Ｅｃ ＭＣＳＸＩ Ｂａ−Ｓｍ−Ｋｐ−Ｓａ−Ｅｃ
【手続補正５】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１】
【手続補正６】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２
【補正方法】変更
【補正内容】
【図２】
【手続補正７】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図３
【補正方法】変更
【補正内容】
【図３】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/70 //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:125） (Ｃ１２Ｎ 9/10 Ｃ１２Ｒ 1:125） (Ｃ１２Ｎ 9/10 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/42 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/42 Ｃ１２Ｒ 1:125）
Claims (11)
- 【請求項１】 バチルス属細菌由来アルカリセルラーゼ
産生遺伝子のプロモーター領域および分泌シグナルペプ
チド領域に由来する塩基配列を有する、下流領域に結合
した構造遺伝子の発現を促進させ得るＤＮＡ断片。 - 【請求項２】 バチルス属細菌由来アルカリセルラーゼ
産生遺伝子のプロモーター領域および分泌シグナルペプ
チド領域に由来する塩基配列が、図１に示す塩基配列ま
たはこれと相同性を有する塩基配列である請求項第１項
記載のＤＮＡ断片。 - 【請求項３】 バチルス属細菌がバチルス エスピー Ｋ
ＳＭ−６４株である請求項第１項または第２項記載のＤ
ＮＡ断片。 - 【請求項４】 バチルス属細菌由来アルカリセルラーゼ
産生遺伝子のプロモーター領域および分泌シグナルペプ
チド領域に由来する塩基配列を有するＤＮＡ断片を含む
プラスミドベクター。 - 【請求項５】 バチルス属細菌由来アルカリセルラーゼ
産生遺伝子のプロモーター領域および分泌シグナルペプ
チド領域に由来する塩基配列が、図１に示す塩基配列ま
たはこれと相同性を有する塩基配列である請求項第４項
記載のプラスミドベクター。 - 【請求項６】 バチルス属細菌がバチルス エスピー Ｋ
ＳＭ−６４株である請求項第４項または第５項記載のプ
ラスミドベクター。 - 【請求項７】 バチルス属細菌由来アルカリセルラーゼ
産生遺伝子のプロモーター領域および分泌シグナルペプ
チド領域に由来する塩基配列と、目的蛋白質をコードす
る塩基配列とを有するＤＮＡ断片を保持するプラスミド
ベクターを含む組換え微生物。 - 【請求項８】 バチルス属細菌由来アルカリセルラーゼ
産生遺伝子のプロモーター領域および分泌シグナルペプ
チド領域に由来する塩基配列が、図１に示す塩基配列ま
たはこれと相同性を有する塩基配列である請求項第７項
記載の組換え微生物。 - 【請求項９】 バチルス属細菌がバチルス エスピー Ｋ
ＳＭ−６４株である請求項第７項または第８項記載の組
換え微生物。 - 【請求項１０】 宿主微生物が大腸菌または枯草菌であ
る請求項第７〜９項の何れかの項記載の組換え微生物。 - 【請求項１１】 請求項第７〜１１項の何れかの項に記
載の組換え微生物を培養し、当該培養物中から目的蛋白
質を分離することを特徴とする蛋白質の製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2592593A JP3504955B2 (ja) | 1993-01-22 | 1993-01-22 | 新規ｄｎａ断片、これを保有するプラスミドベクター及び組換え微生物並びにこれを用いる蛋白質の製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2592593A JP3504955B2 (ja) | 1993-01-22 | 1993-01-22 | 新規ｄｎａ断片、これを保有するプラスミドベクター及び組換え微生物並びにこれを用いる蛋白質の製造法 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2003107954A Division JP2003265167A (ja) | 2003-04-11 | 2003-04-11 | 新規ｄｎａ断片を保有するプラスミドベクターを含む組換え微生物を用いる蛋白質の製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06217781A true JPH06217781A (ja) | 1994-08-09 |
| JP3504955B2 JP3504955B2 (ja) | 2004-03-08 |
Family
ID=12179357
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2592593A Expired - Fee Related JP3504955B2 (ja) | 1993-01-22 | 1993-01-22 | 新規ｄｎａ断片、これを保有するプラスミドベクター及び組換え微生物並びにこれを用いる蛋白質の製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3504955B2 (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006345860A (ja) * | 2005-05-20 | 2006-12-28 | Shinshu Univ | 組換えバチルス属細菌 |
| WO2009011259A1 (ja) * | 2007-07-13 | 2009-01-22 | Japan Agency For Marine-Earth Science And Technology | 新規ｄｎａ断片およびそれを含む組換えベクター、それらによって形質転換された形質転換体、ならびにそれらの利用 |
| WO2010082619A1 (ja) | 2009-01-16 | 2010-07-22 | 大塚化学株式会社 | 高発現プロモーターおよびこれを用いた遺伝子産物製造法 |
-
1993
- 1993-01-22 JP JP2592593A patent/JP3504955B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006345860A (ja) * | 2005-05-20 | 2006-12-28 | Shinshu Univ | 組換えバチルス属細菌 |
| WO2009011259A1 (ja) * | 2007-07-13 | 2009-01-22 | Japan Agency For Marine-Earth Science And Technology | 新規ｄｎａ断片およびそれを含む組換えベクター、それらによって形質転換された形質転換体、ならびにそれらの利用 |
| JP2009017841A (ja) * | 2007-07-13 | 2009-01-29 | Japan Agengy For Marine-Earth Science & Technology | 新規ｄｎａ断片およびそれを含む組換えベクター、それらによって形質転換された形質転換体、ならびにそれらの利用 |
| US8354248B2 (en) | 2007-07-13 | 2013-01-15 | Japan Agency For Marine-Earth Science And Technology | Promoter-encoding DNA fragment, recombinant vector, recombiant transformant, and uses thereof |
| WO2010082619A1 (ja) | 2009-01-16 | 2010-07-22 | 大塚化学株式会社 | 高発現プロモーターおよびこれを用いた遺伝子産物製造法 |
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|---|---|
| JP3504955B2 (ja) | 2004-03-08 |
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