JP2009017841A - 新規dna断片およびそれを含む組換えベクター、それらによって形質転換された形質転換体、ならびにそれらの利用 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】特定の遺伝子調節領域を単独で、または該遺伝子調節領域およびシグナルペプチドをコードする遺伝子を組み合わせて利用することにより、上記課題は解決する。
【選択図】なし
Description
(a)配列表の配列番号1または2に記載の塩基配列;
(b)配列表の配列番号1または2に記載の塩基配列において、1もしくは数個の塩基の欠失、置換、逆位もしくは付加された塩基配列;または
(c)配列表の配列番号1または2に記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリジェントな条件下でハイブリダイズしうるDNAの塩基配列。
(a)配列表の配列番号1または2に記載の塩基配列およびその下流に直接的または間接的に連結されたシグナルペプチドをコードする塩基配列からなる塩基配列;
(b)配列表の配列番号1または2に記載の塩基配列およびその下流に直接的または間接的に連結されたシグナルペプチドをコードする塩基配列からなる塩基配列において、1もしくは数個の塩基の欠失、置換、逆位もしくは付加された塩基配列;または
(c)配列表の配列番号1または2に記載の塩基配列およびその下流に直接的または間接的に連結されたシグナルペプチドをコードする塩基配列からなる塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリジェントな条件下でハイブリダイズしうるDNAの塩基配列。
(a)配列表の配列番号1または2に記載の塩基配列およびその下流に直接的または間接的に連結された配列番号3に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなる塩基配列;
(b)配列表の配列番号1または2に記載の塩基配列およびその下流に直接的または間接的に連結された配列番号3に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなる塩基配列において、1もしくは数個の塩基の欠失、置換、逆位もしくは付加された塩基配列;または
(c)配列表の配列番号1または2に記載の塩基配列およびその下流に直接的または間接的に連結された配列番号3に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなる塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリジェントな条件下でハイブリダイズしうるDNAの塩基配列。
(a)上記した本発明のDNA断片を形質導入した宿主;または
(b)上記した本発明の組換えベクターを含む宿主。
(a)上記した本発明の形質転換体の培養工程;および
(b)該組換えタンパク質の採取工程。
(A)本発明のDNA断片
本発明のDNA断片は、遺伝子調節領域を含むDNA断片、遺伝子調節領域およびその下流に直接的または間接的に連結されたシグナルペプチド遺伝子を含むDNA断片、遺伝子調節領域およびその下流に直接的または間接的に連結された組換えタンパク質遺伝子を含むDNA断片、ならびに遺伝子調節領域およびその下流に直接的もしくは間接的に連結されたシグナルペプチド遺伝子およびその下流に直接的に連結された組換えタンパク質遺伝子を含むDNA断片である。
本発明のDNA断片は適当なベクター中に挿入して使用することができる。本発明で用いるベクターの種類は特に限定されず、例えば、宿主細胞内で自立的に複製することが可能なもの(例えばプラスミド等)でもよいし、あるいは、宿主細胞に導入された際に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、組み込まれた染色体と共に複製されるものであってもよい。好ましくは、本発明で用いるベクターは、プラスミド、バクテリオファージ、またはレトロトランスポゾンである。このようなベクターに組み込まれた本発明のDNA断片は、ベクター内で機能的かつ構造的に安定に保持される。
本発明のDNA断片または組換えベクターを適当な宿主に導入することによって形質転換体を作製することができる。すなわち、本発明の形質転換体は、本発明のDNA断片を導入してなる、または本発明の組換えベクターを含有する形質転換体である。
本発明は、本発明の形質転換体を通常知られる方法にしたがって適当な培地に接種して培養し、培養物から組換えタンパク質を採取してなる、組換えタンパク質の製造方法を包含する。
遺伝子調節領域DNA断片検索用ベクターpPTCFを以下の方法で構築した。
マイクロバルビファー・エスピー JAMB−A7(Microbulbifer sp. JAMB-A7)株(寄託番号;FERM BP−8320)由来の染色体DNAを鋳型にして、配列表の配列番号4に記載のプライマーAおよび配列番号5に記載のプライマーBを用いてPCRを行い、DNA断片Aを得た。得られたDNA断片Aを制限酵素EcoRIで処理し、あらかじめEcoRIで処理しておいた枯草菌−大腸菌のシャトルプラスミドであるpHY300PLK(ヤクルト社製)と連結することにより環状プラスミドBを構築した。環状プラスミドBを用いて大腸菌HB101株を形質転換し、形質転換体Cを得た。形質転換体Cから環状プラスミドBを調製し、その中から寒天分解酵素遺伝子の上流にPHY300PLK由来のポリリンカー部位を有するプラスミドをpPTCFと命名した。
制限酵素Sau3AIによりバチルス・エスピー JAMB750(Bacillus sp. JAMB750)株(寄託番号:FERM AP−20227)の染色体DNAを処理した後、これを制限酵素BamHIで切断した実施例1で構築したプラスミドpPTCFと混ぜてT4DNAリガーゼによりライゲーション反応し、ライゲーション反応液Dを得た。得られたライゲーション反応液Dにより枯草菌を形質転換し、形質転換体E群を得た。形質転換体E群の培養に用いた再生培地として、コハク酸ナトリウム 8%、寒天 1%、カザミノ酸 0.5%、酵母エキス 0.5%、リン酸2水素カリウム 0.15%、リン酸水素2カリウム 0.35%、グルコース 0.5%、硫酸マグネシウム 0.4%、牛血清アルブミン 0.01%、メチオニン 0.001%、ロイシン 0.001%およびテトラサイクリン 7.5μg/mlからなるDM3培地を用いた。形質転換体E群をDM3培地上で培養し、周囲に寒天の窪みを形成した約2000個のクローンを選択し、それぞれを液体培養した。この液体培養では、ポリペプトンS 3%、魚肉エキス 0.5%、酵母エキス 0.05%、リン酸2水素カリウム 0.1%、マルトース 4%、硫酸マグネシウム 0.02%、塩化カルシウム 0.05%およびテトラサイクリン 7.5μg/mlを組成成分とする液体培地を用い、30℃、48時間の振とう条件で培養した。各培養液を超音波で破砕し(Handy sonic model UR−20P、TOMY SEIKO CO.製を使用)、得られた超音波破砕物の寒天分解酵素活性を測定した。その中で最も活性の高かったものを選択し、この形質転換体の持つプラスミドをpCDAG1と命名した。なお、寒天分解酵素活性は下記の方法で測定した。
サラッソモナス・エスピー JAMB−A33(Thalassomonas sp. JAMB−A33)株(寄託番号;DSM17297)由来の染色体DNAを鋳型に配列表の配列番号6に記載のプライマーCと配列番号7に記載のプライマーDを用いてPCR増幅を行い、約300bpから成るPCR増幅DNA断片Fを取得した。このPCR増幅DNA断片Fを制限酵素HindIIIで処理し、あらかじめHindIIIで切断しておいたpHY300PLKとリガーゼ反応により連結し、環状プラスミドGを得た。環状プラスミドGにより大腸菌HB101株を形質転換した。形質転換体からプラスミドを調製し、pHYTERと命名した。
発現ベクターpJEXOPT1を以下の方法で構築した。
実施例2で得られたプラスミドpCDAG1を鋳型にして、配列表の配列番号8に記載のプライマーEおよび配列番号9に記載のリン酸化プライマーFを用いてPCRにより約300bpから成る遺伝子調節領域の増幅を行い、PCR増幅物Hを得た。
一方、配列番号18に記載の塩基配列からなる合成一本鎖DNAと配列番号19に記載の塩基配列からなる合成一本鎖DNAをアニーリングさせ二本鎖DNA断片Iを得て、この末端にリン酸化処理を施した。得られたPCR増幅物Hと二本鎖DNA断片Iをリガーゼ反応により結合し、これを鋳型にして配列番号10に記載のプライマーGと配列番号11に記載のプライマーHを用いてPCR増幅を行った。得られたPCR増幅断片を制限酵素であるEcoRIおよびBamHIで処理した後、EcoRIとBamHIで処理したpHYTERと連結することにより環状プラスミドを構築した。本プラスミドを用いて大腸菌HB101株を形質転換した。形質転換体からプラスミドを調製し、pJEXOPT1と命名した。
βアガラーゼ生産菌であるマイクロバルビファー・エスピー JAMB−A49(Microbulbifer sp. JAMB−A94)株(寄託番号;FERM BP−8321)の染色体を鋳型とし、配列表の配列番号12に記載のプライマーIおよび配列番号13に記載のプライマーJを用いてβアガラーゼ酵素遺伝子DNA断片をPCR増幅した。これを制限酵素BamHIで処理した。発現ベクターpJEXOPT1を制限酵素BamHIで切断し、リガーゼでβアガラーゼ酵素遺伝子と連結した。このβアガラーゼ酵素遺伝子を含むpJEXOPT1で大腸菌HB101株を形質転換した。βアガラーゼ活性を示す形質転換体からプラスミドを調製し、pJEXOPT1bと命名した。このプラスミドを用いて枯草菌ISW1214(Bacillus subtilis ISW1214)株を形質転換し、テトラサイクリン入り再生培地による選抜を行った。得られた形質転換体をポリペプトンS 5%、魚肉エキス 0.5%、酵母エキス 0.05%、リン酸水素カリウム0.1%、マルトース5%、塩化マグネシウム0.02%、塩化カルシウム0.05%、およびテトラサイクリン15μg/mlを組成成分とするPPS培地中で、30℃、72時間、130rpmにて撹拌培養を行い、菌体を除去して得られた培養上清に含まれるβアガラーゼ活性を測定した。その結果、培養液1Lあたり約0.15gのβアガラーゼの大量生産が確認できた。
一方、プラスミドpCDAG1を鋳型にして配列表の配列番号8に記載のリン酸化プライマーEおよび配列番号9に記載のリン酸化プライマーFを用いてPCRによる増幅を行った。得られたPCR断片をpUC18のSmaI部位に導入した。構築されたプラスミドを鋳型にして、プライマーEおよびプライマーFを用いてDiversify PCR Random Mutagenesis Kit( クロンテック社)を用い、キットのプロトコールにしたがって、PCR増幅断片中にランダムに変異を導入した。このランダム変異操作を5回繰り返した。得られたPCR産物を鋳型にプライマーEおよびリン酸化プライマーFを用いてPCR増幅を行った。その後T4DNAポリメラーゼを用いてPCR産物の末端を平滑にした。
一方、配列番号18に記載の塩基配列からなる合成一本鎖DNAと配列番号19に記載の塩基配列からなる合成一本鎖DNAをアニーリングさせ二本鎖DNA断片を得て、この末端にリン酸化処理を施した。
得られたPCR産物と二本鎖DNA断片をリガーゼ反応により結合した。得られたDNA断片を制限酵素EcoRI、BamHIで処理した後、EcoRIとBamHIで処理したpHYTERと連結することにより環状プラスミド群を構築した。本プラスミド群を用いて大腸菌HB101株を形質転換した。得られた数千あまりの形質転換体からまとめてプラスミド群を調整した。これをプラスミド群Aとした。次にβアガラーゼ生産菌であるマイクロバルビファー・エスピー JAMB−A94(Microbulbifer sp. JAMB−A94)株の染色体を鋳型とし、配列番号12に記載のプライマーIおよび配列番号13に記載のプライマーJを用いてβアガラーゼ酵素遺伝子DNA断片をPCR増幅した。これを制限酵素BamHIで処理した。プラスミド群Aを制限酵素BamHIで切断し、リガーゼによってβアガラーゼ酵素遺伝子と連結した。これらを用いて大腸菌HB101株を形質転換した。βアガラーゼ活性を示す形質転換体からプラスミドを調製し、これらのプラスミドを用いて枯草菌ISW1214株を形質転換し、テトラサイクリン入り再生培地による選抜を行った。得られた形質転換体をPPS培地(ポリペプトンS 5%、魚肉エキス 0.5%、酵母エキス 0.05%、リン酸水素カリウム 0.1%、マルトース 5%、塩化マグネシウム 0.02%、塩化カルシウム 0.05%、テトラサイクリン 15μg/ml)中で30℃、72時間、130rpmにて撹拌培養を行い、得られた培養上清に含まれるβアガラーゼ活性を測定した。その結果、培養液1Lあたり約0.2gのβアガラーゼの大量生産できるプラスミドpJEXOPT2を取得できた。
セルラーゼ生産菌であるバシラス・アキバイ1139(Bacillus akibai1139)株(寄託番号;JCM 9157T) (J. Gen. Microbiol. 1986, 132, 2329-2335. Fukumoriら、Int J Syst Evol Microbiol. (2005)55:2309-15. Nogi, Y.ら)の染色体を鋳型とし、配列表の配列番号14に記載のプライマーMおよび配列番号15に記載のプライマーNを用いてセルラーゼ酵素遺伝子DNA断片をPCR増幅した。これを制限酵素BamHIで処理した。pJEXOPT1、pJEXOPT2を制限酵素BamHIで切断し、リガーゼによってセルラーゼ酵素遺伝子と連結した。これらを用いて大腸菌HB101株を形質転換した。セルラーゼ活性を示す形質転換体からプラスミドを調製し、各々pJEXOPT1C、pJEXOPT2Cと命名した。これらのプラスミドを用いて枯草菌ISW1214株を形質転換し、テトラサイクリン入り再生培地による選抜を行った。得られた形質転換体をPPS培地(ポリペプトンS 3%、魚肉エキス 0.5%、酵母エキス 0.05%、リン酸水素カリウム 0.1%、マルトース 4%、塩化マグネシウム 0.02%、塩化カルシウム 0.05%、テトラサイクリン 15μg/ml)中で30℃、72時間、130rpmにて撹拌培養を行い、得られた培養上清に含まれるセルラーゼ活性を測定した。その結果、培養液1LあたりpJEXOPT1Cでは約1g、pJEXOPT2Cでは約1.5gのセルラーゼの大量生産が確認できた。
αアガラーゼ生産菌であるサラッソモナス・エスピー JAMB−A33(Thalassomonas sp. JAMB−A33)株(寄託番号;DSM 17297)の染色体を鋳型とし、配列表の配列番号16に記載のプライマーOおよび配列番号17に記載のプライマーPを用いてαアガラーゼ酵素遺伝子DNA断片をPCR増幅した。これを制限酵素BamHIで処理した。pJEXOPT1、pJEXOPT2を制限酵素BamHIで切断し、リガーゼによってαアガラーゼ酵素構造遺伝子と連結した。これらを用いて大腸菌HB101株を形質転換した。アガラーゼ活性を示す形質転換体からプラスミドを調製し、各々pJEXOPT1a、pJEXOPT2aと命名した。これらのプラスミドを用いて枯草菌ISW1214株を形質転換し、テトラサイクリン入り再生培地による選抜を行った。得られた形質転換体をPPS培地(ポリペプトンS 5%、魚肉エキス 0.5%、酵母エキス 0.05%、リン酸水素カリウム 0.1%、マルトース 5%、塩化マグネシウム 0.02%、塩化カルシウム 0.05%、テトラサイクリン 15μg/ml)中で30℃、72時間、130rpmにて撹拌培養を行い、得られた培養上清に含まれるαアガラーゼ活性を測定した。その結果、培養液1LあたりpJEXOPT1aでは0.2g、pJEXOPT2aでは0.3gのαアガラーゼの大量生産が確認できた。
Claims (15)
- 下記(a)〜(c)のいずれかの塩基配列を含み、その下流に存在する遺伝子の発現を促進しうるDNA断片:
(a)配列表の配列番号1または2に記載の塩基配列;
(b)配列表の配列番号1または2に記載の塩基配列において、1もしくは数個の塩基の欠失、置換、逆位もしくは付加された塩基配列;または
(c)配列表の配列番号1または2に記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリジェントな条件下でハイブリダイズしうるDNAの塩基配列。 - 下記(a)〜(c)のいずれかの塩基配列を含み、その下流に存在する遺伝子の発現を促進し、さらにその遺伝子の遺伝子産物を細胞外に分泌しうるDNA断片:
(a)配列表の配列番号1または2に記載の塩基配列およびその下流に直接的または間接的に連結されたシグナルペプチドをコードする塩基配列からなる塩基配列;
(b)配列表の配列番号1または2に記載の塩基配列およびその下流に直接的または間接的に連結されたシグナルペプチドをコードする塩基配列からなる塩基配列において、1もしくは数個の塩基の欠失、置換、逆位もしくは付加された塩基配列;または
(c)配列表の配列番号1または2に記載の塩基配列およびその下流に直接的または間接的に連結されたシグナルペプチドをコードする塩基配列からなる塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリジェントな条件下でハイブリダイズしうるDNAの塩基配列。 - 下記(a)〜(c)のいずれかの塩基配列を含み、その下流に存在する遺伝子の発現を促進し、さらにその遺伝子の遺伝子産物を細胞外に分泌しうるDNA断片:
(a)配列表の配列番号1または2に記載の塩基配列およびその下流に直接的または間接的に連結された配列番号3に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなる塩基配列;
(b)配列表の配列番号1または2に記載の塩基配列およびその下流に直接的または間接的に連結された配列番号3に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなる塩基配列において、1もしくは数個の塩基の欠失、置換、逆位もしくは付加された塩基配列;または
(c)配列表の配列番号1または2に記載の塩基配列およびその下流に直接的または間接的に連結された配列番号3に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなる塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリジェントな条件下でハイブリダイズしうるDNAの塩基配列。 - 請求項1に記載のDNA断片の塩基配列およびその下流に直接的または間接的に連結された組換えタンパク質をコードする塩基配列を含むDNA断片。
- 請求項2または3に記載のDNA断片の塩基配列およびその下流に直接的に連結された組換えタンパク質をコードする塩基配列を含むDNA断片。
- 組換えタンパク質が、酸化還元酵素、転移酵素、加水分解酵素、加リン酸分解酵素、脱離酵素、異性化酵素、合成酵素、および修飾酵素からなる群から選ばれる1種の酵素である、請求項4または5に記載のDNA断片。
- 請求項1〜6のいずれか1項に記載のDNA断片を含む組換えベクター。
- 組換えベクターが、プラスミド、バクテリオファージ、またはレトロトランスポゾンである、請求項7に記載の組換えベクター。
- 下記(a)または(b)の宿主からなる形質転換体:
(a)請求項1〜6に記載のDNA断片を形質導入した宿主;または
(b)請求項7または8に記載の組換えベクターを含む宿主。 - 宿主が微生物である、請求項9に記載の形質転換体。
- 宿主がグラム陽性細菌である、請求項9に記載の形質転換体。
- 宿主がバチルス属に属する微生物である、請求項9に記載の形質転換体。
- 下記(a)および(b)の工程を含む組換えタンパク質の製造方法:
(a)請求項9〜12のいずれか1項に記載の形質転換体の培養工程;および
(b)該組換えタンパク質の採取工程。 - 組換えタンパク質が、酸化還元酵素、転移酵素、加水分解酵素、加リン酸分解酵素、脱離酵素、異性化酵素、合成酵素、および修飾酵素からなる群から選ばれる1種の酵素である、請求項13に記載の方法。
- 請求項13または14に記載の組換えタンパク質の製造方法に使用するための請求項9〜12のいずれか1項に記載の形質転換体。
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