JP2988951B2 - 大腸菌における異種蛋白質の製造法 - Google Patents

大腸菌における異種蛋白質の製造法

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Description

【発明の詳細な説明】 <産業上の利用分野> 本発明は、大腸菌を宿主とする組換えDNA手法を用い
た異種蛋白質の製造法に関するものである。
<従来の技術> 大腸菌において異種蛋白質を組換えDNA手法を用いて
製造する場合、異種蛋白質によっては大腸菌のプロテア
ーゼに対して高い感受性を示し、通常の発現系では、そ
の生産性が極めて低くなるものがある。また、大腸菌プ
ロテアーゼに高い感受性を示さないまでも、ある程度プ
ロテアーゼの作用を受け、その収量が低下する場合が数
多く存在している。
T4ファーゼは、大腸菌を宿主とするビルレントファー
ジの一つであり、宿主プロテアーゼに対するインヒビタ
ーを生産する(Simonら,Nature,275,424(1978))など
の優れた物質生産能を有している。このため、T4ファー
ジの諸機能、特に宿主プロテアーゼに対するインヒビタ
ー生産能を大腸菌を宿主とする組換えDNA手法による有
用物質の製造に応用することは産業上非常に有益であ
る。
従来、T4ファージの機能を直接利用する目的で、T4フ
ァージゲノムに異種蛋白質の遺伝情報をコードするDNA
断片をクローン化し、T4ファージ自身を発現ベクター化
する研究がなされてきた(Casnaら,Gene,18,297(198
2),Noguchiら,Gene,44,133(1986),Mattsonや特表昭6
0−502187)。これらはいずれもT4ファージのDNA組換え
活性を利用し、プラスミドにクローン化したT4ファージ
DNA部分と宿主に感染したT4フォージゲノムとのDNA相同
性を介したin vivoで置換型組換えを起こさせて異種蛋
白質の遺伝情報をコードするDNA断片をファージゲノム
に導入するというものである。この方法により適当なT4
ファージプロモーターと発現を目的する異種蛋白質の遺
伝子を連結したものをファージゲノムに導入することが
でき、T4ファージ自身を発現ベクター化することは一応
の成功を収めた(Casnaら,Gene,37,31(1985),野口
ら,特開昭62−232384)。
<本発明が解決しようとする課題> T4ファージは、そのDNA鎖中に通常のシトシン(C)
の代わりに異常塩基であるヒドロキシメチルシトシン
(HMC)を含んでいる。しかし遺伝子42、56、denBおよ
びalcに変異が導入されるとそのHMCが通常のCに完全に
置換される(Snyderら,Proc.Natl.Acad.Sci(USA),7
3,2098(1976))。このような多重変異株を通常T4dCフ
ァージと呼ぶ。T4dCファージは、denB−(endonuclease
IV欠損)であるため、野生型に比べプラスミドとのDNA
組換え頻度は極めて高い。このため、前述した従来法に
おいてはT4dCファージを感染させてプラスミドとDNA組
換えを起こさせて組換え体T4dCファージを造成している
(野口ら,Gene,44,133(1986))。しかし、T4dCファー
ジは、多重変異株であるため野生型ファージに比べ増殖
力弱く、物質生産能も低下しており、目的とする異種蛋
白質を大量に発現させるためには先に得られた組換え体
T4dCファージをさらに野生型ファージと掛け合わせてHM
C型組換え体ファージを造成する必要があった。
上述したように、T4ファージ自身の発見ベクター化
は、雑種プラスミドの作製を含め非常に煩雑であり、ま
た目的とする異種蛋白質の発現量も十分満足し得るもの
ではなかった(野口ら,特開昭62−232384,Gasnaら,Gen
e,37,31(1986))。
<課題を解決するための手段> 本発明者らは、T4ファージ自身を発現ベクター化する
従来法とは異なり、より簡便な方法を開発すべく研究を
重ねた結果、適当なT4ファージ由来の転写開始シグナル
および翻訳開始シグナルの下流の生産を目的とする異種
蛋白質の遺伝情報をコードするDNA断片を連結した融合D
NAを含有するプラスミドにより形質転換された大腸菌に
T4ファージdenBおよび/またはalc変異株を低い多重感
染度(m.o.i.=multiplicity of infection)で感染さ
せることにより、目的とする異種蛋白質を従来法と比較
して極めて収率よく生産できることを見い出し、本発明
を完成させた。
以下、本発明方法を説明する。
本明細書において、以下の用語は下記の定義のとおり
である。
「転写開始シグナルおよび翻訳開始シグナル」とは、
鋳型DNAから伝令RNA(mRNA)への転写とmRNAの情報を蛋
白質へ翻訳させるために必要とされる特定の塩基配列を
含有するDNA断片を指称する。T4ファージとその宿主で
ある大腸菌における転写開始シグナルおよび翻訳開始シ
グナルに対応するDNAの塩基配列は多少相違しており(R
abussay,BacteriophageT4,Mathewら編集,American Soci
ety for Microbiology,Washinston,D.C.,167〜173(198
3))、Tファージ感染後の宿主遺伝子の発現は完全に
抑制され、ファージ遺伝子のみが発現される。このた
め、本発明方法に用いる転写開始シグナルおよび翻訳開
始シグナルはT4ファージ由来のもの、またはT4ファージ
由来のものと同一の機能を有する合成DNA断片を使用す
る。本発明において使用可能なT4ファージ由来の転写開
始シグナルおよび翻訳開始シグナルを含有する遺伝子を
具体的に例示すれば、T4ファージの初期および中期遺伝
子(uvsY遺伝子など)、または後期遺伝子(g18遺伝
子、g22遺伝子など)などが挙げられる。
「生産を目的とする異種蛋白質の遺伝情報をコードす
るDNA断片」とは、製造を目的とする蛋白質またはペプ
チドをコードするDNA断片のことを示す。本発明方法に
使用する異種蛋白質の遺伝情報をコードするDNA断片
は、種類、起源、由来などに制限されず、例えば動物、
植物、微生物などの天然物から得られるDNA断片、前記
の天然物から得られるmRNAに逆転写酵素等を作用させて
得られるDNA断片、または化学的に合成されたDNA断片な
どのいずれであってもよい。
「プラスミド」とは、特定の制限酵素切断部位を有
し、大腸菌内で複製可能なプラスミドを示す。本発明方
法においては、上記条件を満足するものであればいずれ
のものも使用可能であり、より好ましくは目的とする蛋
白質あるいはペプチドの生産量を多くするために、菌体
中のコピー数の高いプラスミドを使用するのが望まし
い。具体的にはCo1E1の系統、pMB9の系統、pBR322の系
統、pSC101の系統、R6Kの系統などのプラスミドを、よ
り具体的に、たとえばpBR322(Boliverら,Gene,,95
(1975)),pUC18,pUC19(Messingら,Methods in Enzym
ology,101,20(1983))などを例示することができる。
「m.o.i.」とは菌体1個あたりの感染させるファージ
数を表わす。
本発明方法は以下のA〜E工程を主要構成工程とする
ものである。
(A)T4ファージ由来の転写開始シグナル及び翻訳開始
シグナルの下流に生産を目的とする異種蛋白質の遺伝情
報をコードするDNA断片を発現可能な形で連結し、これ
を大腸菌内で複製可能なプラスミドに挿入する工程、 (B)A工程で得られた雑種プラスミドを用いて大腸菌
を形質転換する工程、 (C)B工程で得られた形質転換体を当該微生物が増殖
可能な培地中で増殖させ、T4ファージdenBおよび/また
はalc変異株を低い多重感染度(m.o.i.)で感染させる
工程、 (D)C工程で得られたファージ感染菌を培養する工
程、 (E)D工程で培養した菌体を回収し、目的とする異種
蛋白質を取得する工程。
I. A工程 A工程におけるT4ファージ由来の転写開始シグナルお
よび翻訳開始シグナルを含むDNA断片と異種蛋白質の遺
伝情報をコードするDNA断片との連結並びにその融合DNA
をプラスミドに挿入する方法は一般の技術者、特に生化
学、分子生物学、遺伝子工学の分野に属する技術者にと
っては周知の技術であり、具体的には、例えば「Molecu
lar Cloniug」(Maniatisら編,Cold Spring Harbor,Col
d Spring Harbor Laboratory,New York(1982))に記
載の方法に従って行うことができる。
II. B工程 B工程において使用される大腸菌は、安全性が高く扱
いやすいものであれば特にその菌株の種類に限定されな
い。ただしT4dCのファージを感染させる場合は、使用す
る大腸菌としては制限系欠損株であることが望ましい。
より具体的には組換えDNA実験に繁用されているJM105
菌、JM109菌(Messingら,Methods in Enzymology,101,2
0(1983))、MC1061菌(CasadabanとCohen,J,Mol,Bio
l.,138,179(1980))などが使用可能である。
大腸菌を形質転換する方法は、例えば大腸菌を低温
下、塩化カルシウム処理して菌体内にプラスミドを移入
する方法(Mandelら,J.Mol,Biol.,53,159(1970))な
どの常法によればよい。
III. C工程 形質転換体の培養は、炭素源、窒素源などの大腸菌の
増殖に必要な栄養源を含有する培地を用いて常法に従っ
て行えばよい。例えば2xYT培地(Messingら,Methods in
Enzymology,100,20(1983)),LB培地、M9CA培地(Man
iatisら編,Molecular Cloning,前述)などの大腸菌の培
養に使用されている培地を用い、プラスミドの脱落を防
ぐため適当な抗生物質(アンピシリン、テトラサイクリ
ン等)等の薬剤を適当量加えて20〜40℃で必要により通
気・撹拌しながら培養する。
培養中に生産を目的とする異種蛋白質の発現を誘導す
るため、T4ファージdenBおよび/またはalc変異株を低
いm.o.i.、好ましくはm.o.i.=0.01〜1.0の範囲で感染
させる。感染させるT4ファージとしては、発現用の転写
開始および翻訳開始シグナルとして、T4初期または中期
遺伝子由来のものを使用し、ファージ感染初期もしくは
中期に目的とする異種遺伝子を発現させる場合には、al
c変異ファージを用いることが必要である。alc+ファー
ジの感染では通常のシトシンを含有するプラスミドDAN
からの転写は抑制される(Snyder,L.ら,Proc.Natl.Aca
d.Sic.(USA),73,2093(1976),Kutter,E.M.ら,J.Vir
ol.,40,822(1981))。一方、T4後期遺伝子由来の転写
開始および翻訳開始シグナルを使用し、感染後期に異種
遺伝子を発現される場合には、danB変異ファージを用い
ることが望ましい。danB遺伝子は感染初期に発現し、そ
の産物は、通常のシトシンを含有するDNAを分解する(W
arner,H.R.とSnustad.D.P.,Bacteriophage T4,Mathews,
C.K.ら編集,American Society for Microbiology,Washi
ngton.D.C.1983,pp103−109)。そのためdenB+ファージ
の感染においては、感染後期のプラスミド上の遺伝子の
発現は抑制を受ける。
なお、T4後期遺伝子由来のDNAを含むプラスミドと感
染T4ファージゲノムとの間で相同性を介した組換えが起
こり、プラスミドもHMCを含んだDNAとして複製するため
(Mattson,T.らJ.Mol.Biol.,170,356(1983))、この
場合は、alc変異は必要ではない。ただし、denB,alc両
遺伝子の変異ちなファージを使用する方が生産性の面か
らは、好ましい。具体的にはT4dCファージ(denBおよび
alc変異株)などが例示される。また生産性を上げるた
め、リシスインヒビション現象(「バクテリオファージ
の実験法」富沢純一著、1970年5月30日、岩波書店発
行)を利用することも有効であり、この場合にはr II+
ファージを使用するのが望ましい。
IV. D工程 ファージ感染後も形質転換体の培養を数時間行う。具
体的には、前記培養温度で0.5〜10時間程度ファージ感
染菌を培養すればよい。またこの際、通気、撹拌を十分
に行うことが望ましい。
V. E工程 培養後、菌体からの目的蛋白質の取得は、常法を適宜
応用して行うことができる。例えば回収した菌体を適当
な緩衝液に懸濁して超音波処理等の常法によって菌体を
砕して目的蛋白質を抽出し、遠心分離により菌体残渣を
除去後、イオン交換クロマトグラフィー法およびゲル濾
過法などを用いて目的とする蛋白質の精製を行えばよ
い。
<発明の効果> 本発明方法は、従来法のようにT4ファージ自身を発現
ベクター化せずに、T4ファージ由来の転写開始シグナル
および翻訳開始シグナルの下流に生産を目的とする異種
蛋白質の遺伝情報をコードするDNA断片を発現可能な形
で連結し、これを大腸菌で複製可能なプラスミドに挿入
した雑種プラスミドを造成し(A工程)、これを用いて
大腸菌を形質転換後(B工程)、T4ファージdenBおよび
/またはalc変異株を低いm.o.i.で感染させ(C工
程)、目的とする異種蛋白質を発現、回収するものであ
る(DおよびE工程)。このような極めて簡便な方法に
より特に大腸菌プロテアーゼに感受性を示し、従来は大
腸菌において生産性の低い異種蛋白質をT4ファージのプ
ロテアーゼインヒビター生産能を利用して大腸菌で大量
に生産することが可能となった。さらに本発明方法に使
用する発現系は、その構築は極めて容易であり、またT4
ファージdenBおよび/またはalc変異株の低m.o.i.感染
により生産性を向上させることもできた。
すなわち本発明は、T4ファージの物質生産能を利用
し、大腸菌を宿主とする組換えDNA手法を用いた有用物
質(特に大腸菌菌体内で不安定な蛋白質またはぺプチ
ド)の実用的な製造法を初めて提供するものである。
<実施例> 大腸菌プロテアーゼに対して非常に感受性の高い蛋白
質であるヒト心室筋ミオシンL鎖の製造を実施例として
以下に示す。
また、本実施例におけるDNAの精製、制限酵素による
切断、T4ポリヌクレオチドキナーゼによるリン酸化、T4
DNAリガーゼによるDNAの連結、並びに大腸菌の形質転換
法は全て「Molecular Cloning」(Maniatisら編,Cold S
pring Harbor,Cold Spring Harbor Laboratory,New Yor
k(1982))に従って行った。また各種制限酵素、T4ポ
リヌクレオチドキナーゼ,T4DNAリガーゼ、並びにクロー
ニングベクターpUC18,pBR322は全て宝酒造(株)より入
手した。
ヒト心室筋ミオシンL鎖オープンリーディングフレ
ーム(ORF)DNAの調製 ヒト心室ミオシンL鎖cDNAを含むプラスミドpDR−VLC
4(特開平1−240197参照)DNAを制限酵素BamH Iで切断
し、640bpのヒト心室筋ミオシンL鎖ORFをコードするDN
A断片をアガロースゲル電気泳動法により分離・精製し
た。このDNAを制限酵素Fok Iにより切断し、生じた201b
pおよび389bpのDNA断片を10%ポリアクリルアミドゲル
によるゲル電気泳動法により分離・精製した。
ヒト心室筋ミオシンL鎖ORFの5′−側領域は、T4フ
ァージuvsYプロモーターと連結するため、以下の2本の
DNAをDNA合成機(ファルマシア社製,Gene Assembler pl
us)を用いて合成した。
合成した2本のDNAをT4ポリヌクレオチドキナーゼを
用いて5′−末端をリン酸化し、アニーリングさせた
後、先の201bpおよび389bpのDNA断片とT4DNAリガーゼを
用いて連結させた。連結反応後、DNAをエタノール沈殿
により回収し、制限酵素BamH Iで切断した。この627bp
のヒト心室筋ミオシンL鎖ORFDNAをクローイングベクタ
ーpUC18のBamH I切断部位にMessingらの方法(Methods
in Enzymology,101,20(1983))を用いてクローン化し
た(pUC−VLC28)。
ヒト心室筋ミオシンL鎖ORFとT4uvsY遺伝子プロモ
ーターとの連結 pHTL8〔高橋ら、Virology,120,122(1982),pHTL8を
挿入したC600菌は、大腸菌K12株TNC101菌として工業技
術院微生物工業技術研究所に寄託されている(微工研菌
寄第8038号)〕DNAを制限酵素Hind IIIで切断し、アガ
ロースゲル電気泳動法によりT4uvsY遺伝子を含む1.4Kb
のDNA断片を分離,精製した。制限酵素Hind IIIにより
切断したpBR322のDNAとこの1.4KbのDNA断片をT4DNAリガ
ーゼを用いて連結し、大腸菌C600(微工研菌寄第8037
号)をこのDNAを用いて形質転換した。
得られたアンピシリン耐性、テトラサイクリン感受性
形質転換体より、1.4KbのDNA断片がHind III切断部位に
挿入されたpHB5を選出した。
pHB5は、T4遺伝子25およびuvsY遺伝子を含み、uvsYプ
ロモーターの直下に制限酵素Bgl II切断部位を1ヵ所有
している。
次に、pUC−VLC28 DNAを制限酵素BamH1で切断し、ア
ガロースゲル電気泳動により627bpのDNA断片を分離精製
した。この627bpのDNA断片とBgl IIで切断したpHB5をT4
DNAリガーゼにより連結し、この反応液を用いて大腸菌M
C1061(Casadabanら,Proc.Natl.Acad.Sci USA,76,4530
(1979))を形質転換した。得られたアンピシリン耐性
形質転換体より、pHB−VLC28を選出した。
pHB−VLC28は、T4uvsYプロモーターの下流にヒト心室
筋ミオシンL鎖ORFが転写方向に一致して挿入されたも
のであるが、そのアミノ酸配列は、生来のものと若干異
なっている。詳しくは、N端末から2番めのアラニンが
4アミノ酸(アルギニン−ロイシン−グルタミン酸−ア
スパラギン酸)に置換された形となっている。
T4dCファージ感染によるヒト心室筋ミオシンL鎖の
発現誘導 pHB−VLC28を含む大腸菌MC1061(微工研菌寄第3206
号)を30μg/mのアンピシリンを含むM9CA培地(0.18
%NaH2PO4・12H2O,0.3%NaCl,0.05%NH4Cl,0.5%グルコ
ース,0.5%カザミノ酸[Difco社],1mM MgSO4(pH7.
2))100mを用い、37℃で培養し、2×108菌/mに達
した時点でT4dCファージGT1(denB-,alc-)(Wilsonら,
Nature,280,80(1979))をm.o.i.=0.1となるように感
染させた。感染後さらに37℃で3時間培養を続け、培養
液を8000×g、10分間の遠心分離により菌体を調製し
た。得られた菌体は、10mの緩衝液[50mM トリス−
塩酸緩衝液(pH7.8)、20mM EDTA,1mMフェニルメタン
スルホニル・フロライド(PMSF)および50μM 2−メ
ルカプトエタノール含有]に懸濁し、超音波処理により
菌体を破壊した。
次に10000×g,10分間の遠心分離を行い、菌体残渣を
除去し、上清画分を試料として矢崎らの方法(特開昭61
−286752号公報)に従ってヒト心筋ミオシンL鎖を定量
した。また同試料の蛋白質濃度をプロテインアッセイキ
ット(バイオーラッド社製)を用いて測定した。対照実
験としてtacプロモーター(Boerら,Proc.Natl.acad.US
A.,80,21(1983))を用いた発現系(特開平1−24019
7)でヒト心室筋ミオシンL鎖の生産を行った。
その結果を第1表に示す。
第1表に示す通り、ヒト心室筋ミオシンL鎖は、大腸
菌体内で非常に不安定であり、従来法においてはその生
産量は、0.28μg/mg蛋白質と低かった。一方、本発明に
よる発現系では、ファージ感染により、ヒト心室筋ミオ
シンL鎖は約12μg/mg蛋白質の生産性が得られた。
なお、T4dCファージGT7の代わりにdenB+株である野生
型T4ファージを感染させたとこを、上述のような発現誘
導は全く認められなかった。
次に、M9CA培地を用いて、T4dCファージGT7を種々の
m.o.i.で感染させ、ヒト心室筋ミオシンL鎖の生産性を
解析した。ファージ感染後3時間における培地当たりの
生産量を第2表に示す。
第2表に示すとおり、高m.o.i.感染(たとえばm.o.i.
=5.00)においては、感染後速やかな溶菌が起こり、生
産量は低m.o.i.に比べて極めて低かった。
さらに使用する培地と生産性に関して解析したところ
2xTY培地(前述)において、感染5時間後に14μg/m
の生産性が得られた。
以上示したように、本発明は、T4ファージの持つ物質
生産能(特に宿主プロテアーゼインヒビター生産性)を
利用した、大腸菌における異種蛋白質の大量製造を可能
たらしめるものである。
(微生物の寄託) pHB−VLC28を含む大腸菌MC1061は平成2年1月19日に
工業技術院微生物工業技術研究所に寄託されて、微工研
菌寄第11198号の受託番号を得ている。その後、平成2
年12月17日にブタペスト条約に基づく国際寄託に移行さ
れ、微工研条第3206号の受託番号が与えられた。また、
T4dCファージGT7は今だに微生物工業技術研究所の寄託
対象微生物になっておらず、寄託することができないが
T4ファージ(ATCC 11303−B4)から公知の方法(Proc.
Natl.Acad.Sci.(USA),73,2098(1976)、Nature,28
0,80(1979))により調製することができる。
【図面の簡単な説明】
第1図は、pHB−VLC28の構築を示す。

Claims (1)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】下記の(A)〜(E)工程からなる大腸菌
    における異種蛋白質の製造法。 (A)T4ファージ由来の転写開始シグナル及び翻訳開始
    シグナルの下流に生産を目的とする異種蛋白質の遺伝情
    報をコードするDNA断片を発現可能な形で連結し、これ
    を大腸菌内で複製可能なプラスミドに挿入する工程、 (B)A工程で得られた雑種プラスミドを用いて大腸菌
    を形質転換する工程、 (C)B工程で得られた形質転換体を当該微生物が増殖
    可能な培地中で増殖させ、T4ファージdenBおよび/また
    はalc変異株を多重感染度(m.o.i.)=0.01〜1.0で感染
    させる工程、 (D)C工程で得られたファージ感染菌を培養する工
    程、 (E)D工程で培養した菌体を回収し、目的とする異種
    蛋白質を取得する工程。
JP2031123A 1990-02-09 1990-02-09 大腸菌における異種蛋白質の製造法 Expired - Lifetime JP2988951B2 (ja)

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