JP2544602B2 - 新規プラスミドベクタ− - Google Patents
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Description
本発明は、エシェリキア・コリ（Escherichia coli）
（大腸菌）及び／又はバシラス・サチリス（Bacillus s
ubtilis）（枯草菌）で形質を発現する新規なプラスミ
ドベクターに係る。このプラスミドベクターでは、調節
配列の制御下に異種タンパク質をコードする遺伝子が配
置されており、これにより、かかるプラスミドベクター
により形質転換された微生物は異種タンパク質を高収率
で産生し得る。 特に、本発明は、異種タンパク質をコードする遺伝子
が、大腸菌のファージfdのターミネーティング配列、及
びその−35領域を合成DNAセグメントで置き換えること
によって変性したpE194のエリスロマイシンプロモータ
ーの制御下に配置されてなる大腸菌で形質を発現させる
プラスミドベクター（特にプラスミドベクターpSM146及
びpSM147）に係る。 さらに、本発明は上記プラスミドベクターによって形
質転換させた微生物に係る。 遺伝子工学の分野における最近の発達により、特殊な
タンパク質をコードする異種の遺伝子を含有するプラス
ミドベクターを調製し、このベクターを宿主微生物に導
入し、かかる形質転換された微生物を単離し、異種遺伝
子によるコードタンパク質の発現に適する培養基中でか
かる微生物を培養することからなる方法を介して特殊な
タンパク質を製造することが可能になった。 「異種遺伝子」とは、使用する宿主によっては一般に
産生されないタンパク質（かかるタンパク質を「異種タ
ンパク質」という）をコードするDNAを意味する。 「産生」とは、タンパク質が微生物によって合成され
る操作を意味する。 この操作は２段階で行われる。第１段階は転写であ
り、遺伝子情報がDNAからメッセンジャーRNA（mRNA）に
移される。第２段階は翻訳であり、情報がmRNAからタン
パク質に移される。 DNAからmRNAへの転写は、酵素RNAポリメラーゼによっ
て行われ、プロモーターと呼ばれる配列の付近に配置さ
れたDNAの特殊な部位で開始され、ターミネーターと定
義されるDNAの領域付近の他の特定された部位で終了す
る。 特殊な異種タンパク質が宿主細胞内で合成されるため
には、かかるタンパク質の構造遺伝子は、特殊な配列
［すなわちプロモーター、ターミネーター及びリボソー
ム結合部位（RBS）（これらは宿主微生物によって認識
され、mRNAポリメラーゼがDNAをmRNAへ転写するのを可
能にし、リボソーム及び関連する酵素がmRNAをタンパク
質へ翻訳するのを可能にする）］の制御下に配置されな
ければならない。 「強力」プロモーターの制御下にタンパク質の構造遺
伝子を配置することによって異種タンパク質の産生を高
めることができることも公知である。 強力プロモーターとは、ヌクレオチド塩基の特殊な配
列を有するプロモーターと理解される。 M.Rosemberg及びD.Court,Am.Rev.Genet.,13，（197
9）,319〜353によれば、最適であると考えられる強力プ
ロモーターは、−35領域の塩基TTGACA及び−10領域の塩
基TATAATと、これら２つの間の17〜18個のヌクレオチド
でなるスペーサーとで形成される。 さらに、プラスミドベクター上における強力プロモー
ターの維持は、併存するターミネーターに左右されるこ
とも公知である（R.Genkoら,PNAS,78，（1981）,4936〜
4940）。 実際、ターミネーターは、DNA分子からのRNAポリメラ
ーゼの脱離を決定し、このようにして、DNA分子がプラ
スミドDNAの複製操作を妨害するのを阻止する。ターミ
ネーターが存在しない場合には、細胞に対するプラスミ
ドのコピーの数が減少し、その結果、細胞後代からプラ
スミドが失われることになる。プロモーターと正に同じ
く、ターミネーターも、その配列に応じて「より強力」
又は「若干強力」と定義され、RNAポリメラーゼの離脱
を「より効果的」に又は「多少効果的」に行う能力を有
するものと定義される。 このように、良好なプラスミド安定性、細胞に対する
プラスミドのコピーの数が多いこと及び従って異種タン
パク質の効果的な産生を達成するためには、強力なプロ
モーターを同等に強力なターミネーターと協働させるこ
とが必要である。文献（杉本ら,Nucleic Acids Res.,
（1978），５,4495〜4503）には、大腸菌のファージfd
のターミネーターが特に強力なターミネーターである旨
記載されている。 発明者らは、pE194（バシラス・サチリスBGSC 1E 7中
に存在するプラスミドである）のエリスロマイシンプロ
モーターを、その−35領域を好適に設計された合成DNA
セグメントで置き換えることによって変性させる場合に
は、もとのものよりも強力なプロモーターが得られるこ
とを見出し、本発明に至った。 かかるプロモーターは、大腸菌のファージfdのターミ
ネーティング配列の併存によってプラスミドレベルで適
当な状態に維持され、このようなプロモーターを含有す
るプラスミドベクターによって形質転換された微生物は
異種タンパク質を高収率で産生できる。 このように、本発明の目的は、調節配列（プラスミド
により形質転換された微生物が異種タンパク質を高収率
で産生できるようにする）の制御下に異種タンパク質を
コードする遺伝子を配置してなる大腸菌及び／又は枯草
菌での形質発現可能な新規プラスミドベクターを提供す
ることにある。 特に、本発明の目的は、大腸菌のファージfdのターミ
ネーティング配列、及びその−35領域を合成DNAセグメ
ントで置き換えることによって変性したpE194エリスロ
マイシンプロモーターの制御下に特殊なタンパク質をコ
ードする異種の遺伝子を配置してなる大腸菌で形質を発
現できる新規なプラスミドベクターpSM146及びpSM147を
提供することにある。 同一出願人に係る他の出願によれば、大腸菌及び枯草
菌で形質発現可能であり、プラスミドベクターpSM146及
びpSM147の調製に使用されるプラスミドベクターpSM143
が提供されている。 このプラスミドベクターpSM143は、プロモーター及び
ターミネーターの領域を、他のプロモーター及びターミ
ネーターをコードする新規な合成DNAセグメントで置き
換えることによって形質発現用の他のプラスミドベクタ
ーの調製にも使用される。 本発明によれば、プラスミドpSM146及びpSM147におけ
る合成DNAセグメントは、それぞれ下記の配列を有す
る。 塩基配列（Ｉ）５′ CTGTTTTTTGTCAAT３′ ３′ TCGAGACAAAAAACAGTTAGATC５′ 塩基配列（II）５′ CTGTTTTTTGTCAACAACTTTTTT３′ ３′ TCGAGACAAAAAACAGTTGTTGAAAAAAGATC５′ 上記セグメントは、公知の方法（J.H.Van Boom,J.Bio
l.Chem.,250，（1975）,4952;R.L.Letsingerら,J.Amer.
Chem.Soc.,97，（1975）,32）に従って合成される。 エシェリキア・コリHBIOIの細胞内に導入されたプラ
スミドベクターpSM146及びpSM147は適当な状態に維持さ
れ、このようにして形質転換された細胞にアンピシリン
及びカナマイシンの両者に対する耐性（それぞれ濃度10
0μg/ml及び15μg/mlまで上昇）を付与する。 形質転換され、適切な培養基で培養された大腸菌の細
胞は、高収率で異種タンパク質を産生し得る。本発明に
よれば、pSM143、pSM146及びpSM147において使用されて
いるプロモーター−ターミネーター配列の制御下に配置
される遺伝子は大腸菌のpBR322のβ−ラクタマーゼのも
のである（J.G.Sutcliffe,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,7
5，（1978）,3737参照）。 しかしながら、クローン化される遺伝子の選択は発明
との関連においては重要ではなく、たとえばヒト及び動
物のホルモン、食品用タンパク質、酵素等の他のタンパ
ク質をコードする異種遺伝子を使用することができる。 上記プラスミドベクターpSM146及びpSM147は、プラス
ミドベクターpSM143のSst I−Xba I領域（740bp（塩基
対）を有する）を上述の塩基配列によって定義される合
成DNAセグメントで置き換えることによって得られる。 pSM143のプロモーター配列は、−35領域と−10領域と
の間に唯１つのSst I制限部位及び−35領域の上流側に
唯１つのXba I制限部位を有する。 このように、特殊な制限酵素Sst I及びXba IによるpS
M143の消化後、プロモーターを有する小さいフラグメン
ト（740bp）の置き換えが可能である。 上記プラスミドベクターpSM143は下記の工程を包含す
る方法により得られる。 a.プラスミドpSM110から、Pvu II制限部位の代わりにBa
mH I制限部位を有するプラスミドpSM116を調製するこ
と。 b.プラスミドpSM116から、複製開始部位の下流側にクロ
ーン化に有用な２つの制限酵素Xho I及びBgl IIの制限
部位を有するプラスミドpSM131を調製すること。 c.大腸菌のファージfdのターミネーターを含有するHind
IIIフラグメントをプラスミドpUC8に挿入し、プラスミ
ドpSM138を単離すること。 d.制限酵素BamH Iによる消化後、プラスミドpSM138から
ファージfdのターミネーターを単離すること。 e.ファージfdのターミネーターを含有するBamH Iフラグ
メントをプラスミドpSM131のBal II制限部位に挿入し、
得られたプラスミドpSM137を単離すること。 f.プラスミドpSM116のインビトロ突然変異によりβ−ラ
クタマーゼの構造遺伝子の下流側にHind III制限部位を
導入して得られたプラスミドpSM141を単離すること。 g.プラスミドpSM141及びプラスミドpSM137をHind IIIで
消化した後、β−ラクタマーゼの遺伝子を含有するpSM1
41のHind IIIフラグメントを、プラスミドpSM137の3500
bpのHind IIIフラグメントと連結し、得られたプラスミ
ドpSM142を単離すること。 h.プラスミドpSM142及びプラスミドpSM112を制限酵素Ba
mH I及びEcoR Iで消化した後、プラスミドpSM142のBamH
I−EcoR IフラグメントをプラスミドpSM112と連結し、
得られたプラスミドpSM143を単離すること。 本発明によれば、プラスミドpSM143内でクローン化さ
れる遺伝子は、大腸菌のpBR322のβ−ラクタマーゼのも
のである。しかしながら、β−ラクタマーゼ遺伝子を含
有するEcoR I−Hind IIIフラグメント（850bp）を削除
することにより、調節配列（プロモーター、ターミネー
ター及びRBS）の制御下に大腸菌及び枯草菌によって認
識される他のタンパク質をコードする遺伝子をベクター
に挿入することが可能である。 上記プラスミドpSM143の調製法では、プラスミドpSM1
10（イタリー国特許出願第23,992A/84号の記載に従って
調製され、第１図に示す制限酵素開裂地図を有する）を
原材料として中間プラスミドが調製される。プラスミド
pSM110は、大腸菌のpBR322のβ−ラクタマーゼ遺伝子の
ATGの上流側に配置されたEcoR I制限部位を有する。 このようにして得られたプラスミドpSM143は、β−ラ
クタマーゼ遺伝子の端部に大腸菌のファージfdのターミ
ネーターを有し、かかるファージfdの上流側にpE194の
エリスロマイシンプロモーター（その−10領域におる配
列はM.Rosembergらによって報告されたものと一致する
が、−35領域は配列TTＣＡＴＡの２つの塩基によって異
なる）を有する。 さらに、プラスミドpSM143は大腸菌及び枯草菌におい
て安定な状態で維持され、これら菌において濃度100μg
/mlまでのアンピシリン耐性及び濃度15μg/mlまでのカ
ナマイシン耐性を提供する。 プラスミドpSM143は第２図に示す制限酵素開裂地図に
より特徴づけられる。 本発明によれば、プラスミドベクターpSM143、pSM146
及びpSM147の調製は公知の方法に従って行われる。 特に、プラスミドベクターの消化は、Tris−HCl（pH
8.1）50mM、NaCl50mM及びMgCl210mMを含有する溶液中、
目的に適した制限酵素の存在下、かかる制限酵素に適す
る条件下でDNAプラスミドを懸濁化させることにより行
われる。 本発明で使用する制限酵素はBRL社及びBIOLABS社より
供給されたものである。 消化によって得られたフラグメントの連結反応（連結
酵素による）は、Tris−HCl50mM、MgCl210mM、ジチオト
レイトール（DTT）10mM及びATP1mMを含有する溶液に、
酵素DNA T4リガーゼの存在下、これらのフラグメントを
懸濁化させることにより行われる。 「インビトロ突然変異」反応（制御した状態でDNAの
特殊な領域の塩基配列を変化させることを目的とする）
は、M.I.ZollerらがNucleic Acids Reserch,10，（198
2）,6487〜6500に報告している方法を使用することによ
って行われる。 pBR322のβ−ラクタマーゼ遺伝子の生産に関する各種
のプロモーター及びターミネーターの効果を確認するた
め、本発明のプラスミドをエシェリキア・コリHBIOI及
びバシラス・サチリスBGSC 1A246細胞に導入する。この
ようにして形質転換した細胞を、グルコース0.5％、ト
リプトファン50μg/ml及び微量元素を添加したLB（バク
ト・トリプトン10g、酵母エキス5g及びNaCl10g）（DIFC
O社）及びSMS（Spitizen最小塩）の各液体培地において
37℃で攪拌しながら６時間培養する。 この時間の経過後、大腸菌については細胞内のβ−ラ
クタマーゼ活性及び枯草菌については細胞内及び培養基
内のβ−ラクタマーゼ活性を測定し、イタリー国特許出
願第23,992A/84号に報告の如くして得られたプラスミド
pSM119を含有するバシラス・サチリスNRRL B 15896の細
胞を培養することにより得られたものと比較する。得ら
れた結果から、プラスミドpSM143は枯草菌及び大腸菌内
で安定であり、枯草菌に導入された場合及び大腸菌に導
入された場合のいずれの場合にも、pSM119のものの２倍
のβ−ラクタマーゼ活性を示す。 一方、プラスミドpSM146及びpSM147は大腸菌内でのみ
安定であり、pSM119を含有する大腸菌の菌株で測定され
るものの６ないし65倍のβ−ラクタマーゼ活性を示す。 プラスミドpSM143、pSM138、pSM146及びpSM147を含有
するエシェリキア・コリHBIOIの各菌株は、「アメリカ
ン・タイプ・カルチャー・コレクション（ATCC）」のカ
ルチャーセンターに、それぞれATCC53038、ATCC53037、
ATCC53039及びATCC53040として寄託されている。 下記の実施例は本発明を説明するためのものであり、
本発明を限定するものではない。
（大腸菌）及び／又はバシラス・サチリス（Bacillus s
ubtilis）（枯草菌）で形質を発現する新規なプラスミ
ドベクターに係る。このプラスミドベクターでは、調節
配列の制御下に異種タンパク質をコードする遺伝子が配
置されており、これにより、かかるプラスミドベクター
により形質転換された微生物は異種タンパク質を高収率
で産生し得る。 特に、本発明は、異種タンパク質をコードする遺伝子
が、大腸菌のファージfdのターミネーティング配列、及
びその−35領域を合成DNAセグメントで置き換えること
によって変性したpE194のエリスロマイシンプロモータ
ーの制御下に配置されてなる大腸菌で形質を発現させる
プラスミドベクター（特にプラスミドベクターpSM146及
びpSM147）に係る。 さらに、本発明は上記プラスミドベクターによって形
質転換させた微生物に係る。 遺伝子工学の分野における最近の発達により、特殊な
タンパク質をコードする異種の遺伝子を含有するプラス
ミドベクターを調製し、このベクターを宿主微生物に導
入し、かかる形質転換された微生物を単離し、異種遺伝
子によるコードタンパク質の発現に適する培養基中でか
かる微生物を培養することからなる方法を介して特殊な
タンパク質を製造することが可能になった。 「異種遺伝子」とは、使用する宿主によっては一般に
産生されないタンパク質（かかるタンパク質を「異種タ
ンパク質」という）をコードするDNAを意味する。 「産生」とは、タンパク質が微生物によって合成され
る操作を意味する。 この操作は２段階で行われる。第１段階は転写であ
り、遺伝子情報がDNAからメッセンジャーRNA（mRNA）に
移される。第２段階は翻訳であり、情報がmRNAからタン
パク質に移される。 DNAからmRNAへの転写は、酵素RNAポリメラーゼによっ
て行われ、プロモーターと呼ばれる配列の付近に配置さ
れたDNAの特殊な部位で開始され、ターミネーターと定
義されるDNAの領域付近の他の特定された部位で終了す
る。 特殊な異種タンパク質が宿主細胞内で合成されるため
には、かかるタンパク質の構造遺伝子は、特殊な配列
［すなわちプロモーター、ターミネーター及びリボソー
ム結合部位（RBS）（これらは宿主微生物によって認識
され、mRNAポリメラーゼがDNAをmRNAへ転写するのを可
能にし、リボソーム及び関連する酵素がmRNAをタンパク
質へ翻訳するのを可能にする）］の制御下に配置されな
ければならない。 「強力」プロモーターの制御下にタンパク質の構造遺
伝子を配置することによって異種タンパク質の産生を高
めることができることも公知である。 強力プロモーターとは、ヌクレオチド塩基の特殊な配
列を有するプロモーターと理解される。 M.Rosemberg及びD.Court,Am.Rev.Genet.,13，（197
9）,319〜353によれば、最適であると考えられる強力プ
ロモーターは、−35領域の塩基TTGACA及び−10領域の塩
基TATAATと、これら２つの間の17〜18個のヌクレオチド
でなるスペーサーとで形成される。 さらに、プラスミドベクター上における強力プロモー
ターの維持は、併存するターミネーターに左右されるこ
とも公知である（R.Genkoら,PNAS,78，（1981）,4936〜
4940）。 実際、ターミネーターは、DNA分子からのRNAポリメラ
ーゼの脱離を決定し、このようにして、DNA分子がプラ
スミドDNAの複製操作を妨害するのを阻止する。ターミ
ネーターが存在しない場合には、細胞に対するプラスミ
ドのコピーの数が減少し、その結果、細胞後代からプラ
スミドが失われることになる。プロモーターと正に同じ
く、ターミネーターも、その配列に応じて「より強力」
又は「若干強力」と定義され、RNAポリメラーゼの離脱
を「より効果的」に又は「多少効果的」に行う能力を有
するものと定義される。 このように、良好なプラスミド安定性、細胞に対する
プラスミドのコピーの数が多いこと及び従って異種タン
パク質の効果的な産生を達成するためには、強力なプロ
モーターを同等に強力なターミネーターと協働させるこ
とが必要である。文献（杉本ら,Nucleic Acids Res.,
（1978），５,4495〜4503）には、大腸菌のファージfd
のターミネーターが特に強力なターミネーターである旨
記載されている。 発明者らは、pE194（バシラス・サチリスBGSC 1E 7中
に存在するプラスミドである）のエリスロマイシンプロ
モーターを、その−35領域を好適に設計された合成DNA
セグメントで置き換えることによって変性させる場合に
は、もとのものよりも強力なプロモーターが得られるこ
とを見出し、本発明に至った。 かかるプロモーターは、大腸菌のファージfdのターミ
ネーティング配列の併存によってプラスミドレベルで適
当な状態に維持され、このようなプロモーターを含有す
るプラスミドベクターによって形質転換された微生物は
異種タンパク質を高収率で産生できる。 このように、本発明の目的は、調節配列（プラスミド
により形質転換された微生物が異種タンパク質を高収率
で産生できるようにする）の制御下に異種タンパク質を
コードする遺伝子を配置してなる大腸菌及び／又は枯草
菌での形質発現可能な新規プラスミドベクターを提供す
ることにある。 特に、本発明の目的は、大腸菌のファージfdのターミ
ネーティング配列、及びその−35領域を合成DNAセグメ
ントで置き換えることによって変性したpE194エリスロ
マイシンプロモーターの制御下に特殊なタンパク質をコ
ードする異種の遺伝子を配置してなる大腸菌で形質を発
現できる新規なプラスミドベクターpSM146及びpSM147を
提供することにある。 同一出願人に係る他の出願によれば、大腸菌及び枯草
菌で形質発現可能であり、プラスミドベクターpSM146及
びpSM147の調製に使用されるプラスミドベクターpSM143
が提供されている。 このプラスミドベクターpSM143は、プロモーター及び
ターミネーターの領域を、他のプロモーター及びターミ
ネーターをコードする新規な合成DNAセグメントで置き
換えることによって形質発現用の他のプラスミドベクタ
ーの調製にも使用される。 本発明によれば、プラスミドpSM146及びpSM147におけ
る合成DNAセグメントは、それぞれ下記の配列を有す
る。 塩基配列（Ｉ）５′ CTGTTTTTTGTCAAT３′ ３′ TCGAGACAAAAAACAGTTAGATC５′ 塩基配列（II）５′ CTGTTTTTTGTCAACAACTTTTTT３′ ３′ TCGAGACAAAAAACAGTTGTTGAAAAAAGATC５′ 上記セグメントは、公知の方法（J.H.Van Boom,J.Bio
l.Chem.,250，（1975）,4952;R.L.Letsingerら,J.Amer.
Chem.Soc.,97，（1975）,32）に従って合成される。 エシェリキア・コリHBIOIの細胞内に導入されたプラ
スミドベクターpSM146及びpSM147は適当な状態に維持さ
れ、このようにして形質転換された細胞にアンピシリン
及びカナマイシンの両者に対する耐性（それぞれ濃度10
0μg/ml及び15μg/mlまで上昇）を付与する。 形質転換され、適切な培養基で培養された大腸菌の細
胞は、高収率で異種タンパク質を産生し得る。本発明に
よれば、pSM143、pSM146及びpSM147において使用されて
いるプロモーター−ターミネーター配列の制御下に配置
される遺伝子は大腸菌のpBR322のβ−ラクタマーゼのも
のである（J.G.Sutcliffe,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,7
5，（1978）,3737参照）。 しかしながら、クローン化される遺伝子の選択は発明
との関連においては重要ではなく、たとえばヒト及び動
物のホルモン、食品用タンパク質、酵素等の他のタンパ
ク質をコードする異種遺伝子を使用することができる。 上記プラスミドベクターpSM146及びpSM147は、プラス
ミドベクターpSM143のSst I−Xba I領域（740bp（塩基
対）を有する）を上述の塩基配列によって定義される合
成DNAセグメントで置き換えることによって得られる。 pSM143のプロモーター配列は、−35領域と−10領域と
の間に唯１つのSst I制限部位及び−35領域の上流側に
唯１つのXba I制限部位を有する。 このように、特殊な制限酵素Sst I及びXba IによるpS
M143の消化後、プロモーターを有する小さいフラグメン
ト（740bp）の置き換えが可能である。 上記プラスミドベクターpSM143は下記の工程を包含す
る方法により得られる。 a.プラスミドpSM110から、Pvu II制限部位の代わりにBa
mH I制限部位を有するプラスミドpSM116を調製するこ
と。 b.プラスミドpSM116から、複製開始部位の下流側にクロ
ーン化に有用な２つの制限酵素Xho I及びBgl IIの制限
部位を有するプラスミドpSM131を調製すること。 c.大腸菌のファージfdのターミネーターを含有するHind
IIIフラグメントをプラスミドpUC8に挿入し、プラスミ
ドpSM138を単離すること。 d.制限酵素BamH Iによる消化後、プラスミドpSM138から
ファージfdのターミネーターを単離すること。 e.ファージfdのターミネーターを含有するBamH Iフラグ
メントをプラスミドpSM131のBal II制限部位に挿入し、
得られたプラスミドpSM137を単離すること。 f.プラスミドpSM116のインビトロ突然変異によりβ−ラ
クタマーゼの構造遺伝子の下流側にHind III制限部位を
導入して得られたプラスミドpSM141を単離すること。 g.プラスミドpSM141及びプラスミドpSM137をHind IIIで
消化した後、β−ラクタマーゼの遺伝子を含有するpSM1
41のHind IIIフラグメントを、プラスミドpSM137の3500
bpのHind IIIフラグメントと連結し、得られたプラスミ
ドpSM142を単離すること。 h.プラスミドpSM142及びプラスミドpSM112を制限酵素Ba
mH I及びEcoR Iで消化した後、プラスミドpSM142のBamH
I−EcoR IフラグメントをプラスミドpSM112と連結し、
得られたプラスミドpSM143を単離すること。 本発明によれば、プラスミドpSM143内でクローン化さ
れる遺伝子は、大腸菌のpBR322のβ−ラクタマーゼのも
のである。しかしながら、β−ラクタマーゼ遺伝子を含
有するEcoR I−Hind IIIフラグメント（850bp）を削除
することにより、調節配列（プロモーター、ターミネー
ター及びRBS）の制御下に大腸菌及び枯草菌によって認
識される他のタンパク質をコードする遺伝子をベクター
に挿入することが可能である。 上記プラスミドpSM143の調製法では、プラスミドpSM1
10（イタリー国特許出願第23,992A/84号の記載に従って
調製され、第１図に示す制限酵素開裂地図を有する）を
原材料として中間プラスミドが調製される。プラスミド
pSM110は、大腸菌のpBR322のβ−ラクタマーゼ遺伝子の
ATGの上流側に配置されたEcoR I制限部位を有する。 このようにして得られたプラスミドpSM143は、β−ラ
クタマーゼ遺伝子の端部に大腸菌のファージfdのターミ
ネーターを有し、かかるファージfdの上流側にpE194の
エリスロマイシンプロモーター（その−10領域におる配
列はM.Rosembergらによって報告されたものと一致する
が、−35領域は配列TTＣＡＴＡの２つの塩基によって異
なる）を有する。 さらに、プラスミドpSM143は大腸菌及び枯草菌におい
て安定な状態で維持され、これら菌において濃度100μg
/mlまでのアンピシリン耐性及び濃度15μg/mlまでのカ
ナマイシン耐性を提供する。 プラスミドpSM143は第２図に示す制限酵素開裂地図に
より特徴づけられる。 本発明によれば、プラスミドベクターpSM143、pSM146
及びpSM147の調製は公知の方法に従って行われる。 特に、プラスミドベクターの消化は、Tris−HCl（pH
8.1）50mM、NaCl50mM及びMgCl210mMを含有する溶液中、
目的に適した制限酵素の存在下、かかる制限酵素に適す
る条件下でDNAプラスミドを懸濁化させることにより行
われる。 本発明で使用する制限酵素はBRL社及びBIOLABS社より
供給されたものである。 消化によって得られたフラグメントの連結反応（連結
酵素による）は、Tris−HCl50mM、MgCl210mM、ジチオト
レイトール（DTT）10mM及びATP1mMを含有する溶液に、
酵素DNA T4リガーゼの存在下、これらのフラグメントを
懸濁化させることにより行われる。 「インビトロ突然変異」反応（制御した状態でDNAの
特殊な領域の塩基配列を変化させることを目的とする）
は、M.I.ZollerらがNucleic Acids Reserch,10，（198
2）,6487〜6500に報告している方法を使用することによ
って行われる。 pBR322のβ−ラクタマーゼ遺伝子の生産に関する各種
のプロモーター及びターミネーターの効果を確認するた
め、本発明のプラスミドをエシェリキア・コリHBIOI及
びバシラス・サチリスBGSC 1A246細胞に導入する。この
ようにして形質転換した細胞を、グルコース0.5％、ト
リプトファン50μg/ml及び微量元素を添加したLB（バク
ト・トリプトン10g、酵母エキス5g及びNaCl10g）（DIFC
O社）及びSMS（Spitizen最小塩）の各液体培地において
37℃で攪拌しながら６時間培養する。 この時間の経過後、大腸菌については細胞内のβ−ラ
クタマーゼ活性及び枯草菌については細胞内及び培養基
内のβ−ラクタマーゼ活性を測定し、イタリー国特許出
願第23,992A/84号に報告の如くして得られたプラスミド
pSM119を含有するバシラス・サチリスNRRL B 15896の細
胞を培養することにより得られたものと比較する。得ら
れた結果から、プラスミドpSM143は枯草菌及び大腸菌内
で安定であり、枯草菌に導入された場合及び大腸菌に導
入された場合のいずれの場合にも、pSM119のものの２倍
のβ−ラクタマーゼ活性を示す。 一方、プラスミドpSM146及びpSM147は大腸菌内でのみ
安定であり、pSM119を含有する大腸菌の菌株で測定され
るものの６ないし65倍のβ−ラクタマーゼ活性を示す。 プラスミドpSM143、pSM138、pSM146及びpSM147を含有
するエシェリキア・コリHBIOIの各菌株は、「アメリカ
ン・タイプ・カルチャー・コレクション（ATCC）」のカ
ルチャーセンターに、それぞれATCC53038、ATCC53037、
ATCC53039及びATCC53040として寄託されている。 下記の実施例は本発明を説明するためのものであり、
本発明を限定するものではない。
【実施例１】 プラスミドpSM146の調製 （ｉ）プラスミドpSM116の調製 プラスミドpSM110 1μｇを、50mM Tris−HCl（pH8.
1）、50mM NaCl及び10mM MgCl2を含有する溶液（溶液
Ａ）中に懸濁させ、制限酵素Pvu II（BIOLABS）１単位
（Ｕ）で37℃において１時間消化させた。 この反応の終わりに制限酵素を65℃で10分間処理して
不活性化させた。 このようにして得た反応混合物とリン酸エステル化Ba
mH Iリンカー（BIOLABS）50ngとを、66mM Tris−HCl（p
H7.6）、6mM MgCl2、10mMジチオトレイトール及び1mM A
TPを含有する溶液（溶液Ｂ）19μに加えた後、酵素T4
リガーゼ1Uの存在下で連結させた。 このリガーゼ反応を14℃において14時間で行った。 ついで、リガーゼ混合物全体を使用して、Mandel及び
Higaの方法（J.Mol.Biol.,53，（1970）,159〜162）に
よってCaCl2でコンピテントとしたエシェリキア・コリH
BIOIの細胞を形質転換させた。形質転換した細胞の選択
を、アンピシリン100μg/mlを含むＬ寒天培地（H2O1リ
ットル当たり、バクトトリプトン10g、YE5g、NaCl10g、
DIFCO寒天16g）上に塗抹することにより行った。このよ
うにしてアンピシリン耐性遺伝子を有するプラスミドを
含む細胞（AmpR）だけを単離することが可能であった。 このAmpRのクローンから、周知方法（Rodriguezら
著、Addison−Wesley Publishing Company発行,Recombi
nant DNA Techniques,（1983）参照）によってプラスミ
ドpSM116を抽出、純化した。このプラスミドの制限酵素
開裂地図を第５図に示した。 アガロースゲル上での電気泳動により、このプラスミ
ドpSM116をプラスミドpSM110と較べたところ、プラスミ
ドpSM116はPvu II制限部位の所にBamH I制限部位が存在
する点でプラスミドpSM110と異なっていた。 （ii）プラスミドpSM131の調製 前記工程（ｉ）で得られたプラスミドpSM116 2μｇを
溶液A50μで希釈し、制限酵素Pst I（BIOLABS）2Uで
消化させた。 この消化反応の終わりにH2O50μとフェノール10μ
とを混合物に加えた。 ついで、フェノールを等量をエーテルで水相から抽出
し、酢酸ナトリウム3M溶液（pH5.5）1/10容量と95％エ
タノール2.5容量とを加えて、温度−70℃で10分間処理
してDNAを沈殿させた。 このようにして沈殿したDNAを10,000rpmで10分間遠心
分離して溶液から分離し、ついで酵素Bal 31 0.6Uの存
在下、溶液A30μ中に再懸濁させた。 消化反応を23℃で６分間行った。このようにしてリニ
アライズした（linearized）DNAを上述のようにして反
応混合物から沈殿、分離させた。 このプラスミドDNAをH2O20μに再懸濁させ、該水性
液１μ（DNA50ng）を、T4リガーゼ0.1Uの存在下、Xho
Iリンカー（Wortington）のDNA50ng（前記工程（ｉ）
において述べたように溶液B10μ中に懸濁させた）に
連結させた。 Xho Iリンカーは、Molecular Cloning,A laboratory
manual（T.Maniatis,E.F.Fritsch,J.Sambrook編,Cold S
pring Harbor Laboratory刊）に従って５′末端部位で
前以てリン酸エステル化してある。 Xho IリンカーのDNA（その塩基配列は TCTCGAGA AGAGCTCT である）は、重合化する際、酵素Bgl IIのための認識部
位を生ずる。 少なくとも２つのXho IリンカーをプラスミドpSM116
のDNAに連結し、Pst Iで切断し、Bal31で処理する場合
には、その結果として２つの新しい制限部位Xho I及びB
gl IIを呈する構造が形成されることとなる。リガーゼ
嵌合物10μを使用して、前記工程（ｉ）のようにして
コンピテントとしたエシェリキア・コリHBIOIの細胞を
形質転換する。この細胞はテトラサイクリン20μg/mlを
含むＬ寒天培地上に塗抹することにより、テトラサイク
リン耐性、アンピシリン感受性について選別される。 急速性により44TcRクローンからプラスミドを抽出し
た。 このようにして得たプラスミドDNAを溶液A20μに懸
濁させた後、酵素Xho I1Uで消化してリンカーの挿入の
完成を証明する。 アガロースゲル（７％）での分析の後、Xho Iでリニ
アライズし、pSM116と比較べて低減された長さを有する
プラスミドを、Bgl II制限部位の存在を証明することを
目的として分析した。Bal II制限部位とXho I制限部位
との両方を包含し、pSM116と比べて低減された長さを有
するプラスミドをpSM131と命名した。 プラスミドpSM131のBgl II−BamH IフラグメントのBa
l II制限部位の近くの領域の配列をMaxam及びGilbertの
方法（Methods in Enzymology,Vol.65,p.499〜560,（19
800））によって決定した。 第６図はプラスミドpSM131の制限酵素開裂地図であっ
て、２つのXho Iリンカーの正確な配置を示している。
これらのリンカーは、β−ラクタマーゼの終止コドン
（TAA）から数えて69番目の塩基の位置（pBR322の位置3
224）及びその開始コドン（ATG）から数えて532番目の
塩基の位置（pR322の位置3618）にあり、このようにし
て、酵素Ba131がPst I部から複製開始部位に向かって大
略390bp及びPst I制限部位からEcoR I制限部位に向かっ
てわずかに5bp削除されたことを示す。従って、プラス
ミドpSM131は期待した特性を呈するものであって、pBR3
22の複製開始部位の下流の短い距離にXho I制限部位及
びBgl II制限部位を有するものであった。 （iii）pUC8中のファージfdのターミネーターのクロー
ニング及びプラスミドpSM138の調製 プラスミドpUC8（Boehringer−Mannheim）１μｇ及び
エシェリキア・コリのプラスミドpLUB3 1μｇを、それ
ぞれ溶液A20μ中に懸濁した後、制限酵素Hind III（B
IOLABS）1Uで消化した。 pUC8はHind IIIで切断されてリニアライズされるが、
pLUB3は２つのフラグメントに切断される。これらフラ
グメントのうち小さい方は大略352bpであって、ファー
ジfdのターミネーティング配列を包含していた。 プラスミドDNAを前述のようにして反応混合物から沈
殿、分離した。 pLUB3−Hind III60ng及びpUC8−Hind III15ngを溶液B
10μに懸濁させ、T4リガーゼ0.4Uの存在の下で連結さ
せた。 リガーゼ混合物２μをエシェリキア・コリJM83（BR
L）の適当な細胞の形質転換に用いた。 形質転換した細胞を、J.Messingによって記載された
如くして（Methods in Enz.,Vol.101,（1983）,p.20〜7
8）アンピシリン100μg/ml及びインジケータＸ−Mgalを
含有するＬ寒天培地（DIFCO）上に塗抹することによっ
てアンピシリン耐性について選別した。 このようにして12個の白色コロニーが得られ、これら
から急速法によりプラスミドを抽出した。これらのプラ
スミドの８個は、pUC8のDNAと、ファージfdのターミネ
ーターを含有するpLUB3のHind IIIフラグメントとから
構成されていた。 ターミネーターのHind IIIフラグメントにおいて、Ba
mH I制限部位はHind III端部の一方からわずか４塩基の
距離に位置していた。BamH I制限部位もpUC8上にHind I
II制限部位から数塩基の距離に存在するので、pUC8中に
おけるターミネーターのHind IIIフラグメントのオリエ
ンテーションが２つのBamH I制限部位が遠い位置にある
かの如くであるとすれば、上述の如くして得られたハイ
ブリッドプラスミドのターミネーターを酵素BamH Iでの
消化によって単離することが可能である。 このハイブリッドプラスミドをBamH Iで消化し、DNA
を7.5％アクリルアミドゲルで分離した。エチジウムブ
ロマイドで着色し、UV光線の下でDNAを可視化すると、
分析に使った８個のプラスミドのうちの２個について、
BamH Iでの切断後にDNAの２つのフラグメントが認めら
れ、そのうちの一方は大略350bpであり、他方はpUC8の
長さを有していた。 pSM138と命名したこれらのプラスミドの１つの制限酵
素開裂地図を第７図に示した。 （iv）プラスミドpSM131へのターミネーターの組み込み
及びプラスミドpSM137の調製 前記工程（ii）及び（iii）に記述したようにして得
たpSM131 1μｇ及びpSM138 3.5μｇをそれぞれ溶液A20
μ中に懸濁させた後、酵素Bgl II 1U及びBamH I3.5U
で消化した。 この消化反応の後、酵素を65℃で10分間不活性化処理
した。 反応混合物２μを溶液B20μに加えて、T4リガー
ゼ0.1Uと結合させた。 酵素BamH I及びBgl IIは、DNAの切断後、互いに結合
できる粘着末端を生ずるため、pSM131から及びファージ
fdのターミネーターを含有するpSM138の小さなBamH Iフ
ラグメントから形成されたハイブリッド分子を得ること
が可能である。 リガーゼ混合物２μを使用して、エシェリキア・コ
リHBIOIの適当な細胞を形質転換させた。 ついで、この形質転換した細胞を、テトラサイクリン
20μg/mlを含むＬ寒天培地プレート上で選別した。 このようにして得たTcRクローン中に、ハイブリッド
プラスミドpSM137を有するもの１個が単離された。その
制限酵素開裂地図を第８図に示す。 このプラスミドは、複製の開始（反時計方向）に先立
って位置するファージfdのターミネーターを含むpSM138
の小さなBamH Iフラグメント及びpSM131から構成されて
いる。 （ｖ）β−ラクタマーゼの構造遺伝子の後へのHind III
制限部位の導入及びプラスミドpSM141の調製 二重ら旋（RF）を有するファージM13mp91μｇ及び前
記工程（ｉ）に関して述べたようにして得たpSM116 1μ
ｇを、それぞれBIOLABS社のすすめる条件下で反応混合
物A20μ中に懸濁させた後、酵素EcoR I1U及び酵素Bam
H I1Uで消化させた。65℃で10分間不活性化処理した
後、これら２つの混合物のそれぞれ１μｇずつを反応混
合物B20μ中に懸濁させ、T4リガーゼ0.1Uの存在下で
結合させた。 ついで、リガーゼ混合物５μをエシェリキア・コリ
JM83の適宜な細胞の形質転換に用いた。選別はアンピシ
リン耐性によって行った。 M.Zoller及びM.Smithの方法（Nucl.Ac.Res.,10，（19
82）,6487〜6500）により、このようにして得た白色プ
ラーク12個からファージのDNA（RF）を調製した。 これらのDNAを、ついで、前述のようにして酵素BamH
I及びEcoR Iで消化し、試料を0.8％アガロースゲル上で
分離した。 このようにして得たハイブリッド分子のうち２つがフ
ァージM13mp9のDNAとβ−ラクタマーゼの遺伝子を有す
るプラスミドpSM116の2000bpのフラグメントによって形
成されていることがわかった。 ２つのプラークの一方から、ついで組換ファージDNA
の単一ら旋体を得た。これをZoller及びSmithの方法（N
ucl.Ac.Res.,10，（1982）,6487〜6500）に従って精製
した。 ついで、塩基18個の合成オリゴヌクレオチドをこのDN
A領域を補足すべく設計した。これはβ−ラクタマーゼ
の遺伝子の末端に塩基１つだけ離れて続くものであり、
その配列は次のとおりである。 組換ファージの単一ら旋DNA、ユニバーサルプライマ
ー（BIOLABS社） TCCCAGTCACGACGT 及び合成オリゴヌクレオチド（米国カリフォルニア州サ
ンフランシスコのCreative Biomolecules社により合成
されたもの）を、β−ラクタマーゼの遺伝子の末端の後
にHind III制限部位を配置する目的で、K.Norrisらによ
って開示された（Nucl.Ac.Res.,II,（1983）,5103〜511
2）ようにインビトロ突然変異の実験的調査に用いた。 インビトロ重合化及び連結反応のため、反応混合物を
BIOLABS社によりすすめられた条件下でEcoR I3U及びBam
H I3Uで処理した。ついで、DNAを0.8％アガロースゲル
上で分離し、エチジウムブロマイドによる染色後、UV光
線で可視化される2000bpのEcoR I−BamH Iフラグメント
を、Molecular Cloning,A Laboratory Manual（T.Mania
tis,E.F.Fritsch,J,Sanbrook編，（1982）,Cold Spring
Hardor Laboratory発行）に開示された如くして抽出し
た。 このようにして抽出したDNAセグメント100ng及び7.5
％アクリルアミドゲルから回収した（Maxam及びGilber
t,Enzymology,Vol.65,（1980）,526〜527に開示された
方法による）プラスミドpSM116のEcoR I−BamH Iフラグ
メント（大略350bp）50ngを反応混合物B50μ中に懸濁
させた後、T4リガーゼ0.1Uの存在下で結合させた。リガ
ーゼ混合物10μを使用して、エシェリキア・コリHBIO
Iの適宜の細胞を形質転換させ、アンピシリン（100μg/
ml）耐性の形質転換細胞を選別した。 プラスミドDNAを急速法によって４つのAmpRクローン
から調製した。 このDNA調製物を、ついで反応混合物A30μ中、酵素
Hind III1Uで処理した。 完全な変異の場合には、この酵素の切断により２つの
DNAフラグメント（すなわち、一方は860bp、他方は1600
bpのDNAフラグメント）を生ずるものと期待される。 上述のようにして得た４つのサンプルを１％アガロー
スゲル上で分析した結果、これらのうち２つが期待どお
りの特性を示した。 これらのプラスミドの１つをpSM141と命名した。 その制限酵素開裂地図及びその調製に要した工程を第
９図に示した。 （vi）プラスミドpSM142の調製 プラスミドpSM141 1μｇ及びプラスミドpSM137（これ
は前記工程（iv）で述べたようにして得た）１μｇを溶
液A20μ中に懸濁させた後、それぞれ酵素Hind III1U
で消化させた。 この酵素Hind IIIはプラスミドpSM141を２点で切断
し、２つのフラグメント（すなわち、一方は830bpであ
り、他方は1600bpである）を生ずる。pSM137も２つのHi
nd III制限部位を示し、その消化により550bpのフラグ
メント及び3500bpのフラグメントを生成する（第８
図）。 各反応混合物１μを、酵素T4リガーゼ0.1Uを含む溶
液B18μに加えた。リガーゼ反応を14℃において14時
間で行った。 65℃で10分間処理して酵素を不活性化した後、リガー
ゼ混合物５μを用いてエシェリキア・コリHBIOIの適
宜な細胞の形質転換を行った。 形質転換した細胞を、アンピシリン100μg/ml、テト
ラサイクリン20μg/mlを含有するＬ寒天培地上に塗抹す
ることによりアンピシリン耐性、テトラサイクリン耐性
について選別した。 TcRクローン及びAmpRクローンから急速法によりpSM14
1の大略830bpのフラグメント及びpSM137の大略3500bpの
フラグメントにより形成されたプラスミドが単離され
た。 第10図にその制限酵素開裂地図を示す。このプラスミ
ドをpSM142と命令した。 （vii）プラスミドpSM143の調製 プラスミドpSM142 1μｇ及びイタリア国特許出願第A/
82 23992号に記載のようにして得た第11図に示すプラス
ミドpSM112 1μｇを溶液A20μ中に懸濁させ、酵素Bam
H I1U及び酵素EcoR I1Uで温度37℃において１時間同時
に処理して切断した。 65℃、10分間で処理して酵素を不活性化させた後、反
応混合物１μを前述のようにしてT4リガーゼの存在下
での連結反応に供した。 このようにして得たリガーゼ混合物全体を、ついで、
エシェリキア・コリHBIOIの適当な細胞の形質転換に用
いた。アンピシリン100μg/ml及びカナマイシン15μg/m
lを含有するＬ寒天板上でアンピシリン耐性及びカナマ
イシン耐性を選択することにより形質転換体の選別を行
った。 AmpR及びKmRクローンから急速法によりプラスミドpSM
143を単離した。その制限酵素開裂地図を第２図に示
す。 pSM143は、pSM112の4950bpフラグメント及びpSM142の
2400bpフラグメントからなるものであった。 ついで、このプラスミドpSM143をバシラス・サチリス
SMS003 NRRL B 15897の細胞［Contente及びDubnauによ
って開示された方法（Mol.Gen.Genet.,167,（1979）,25
1〜258）によりコンピテントとしたもの］の形質転換に
用いた。 形質転換された細胞の選別を、カナマイシン５μg/ml
を含有するDIFCO社のトリプトース・ブラット寒天ベー
ス（TBAB）培地上に塗抹することで行った。 pSM143と同じプラスミドをKmRクローンから単離で
き、このプラスミドはこの枯草菌の細胞内で安定した条
件下で維持せしめられることを示した。 （viii）プラスミドpSM146の調製 プラスミドpSM143 1μｇを、酵素Sst I1U及び酵素Xba
I1Uにより同時に溶液A20μ中、37℃、１時間で消化
させた。 65℃、10分間で酵素を不活性化した後、反応混合物１
μをT4リガーゼ0.1U及び合成DNAセグメント（その塩
基配列を第３図に示す）50ngを含有する溶液B19μに
加えた。 リガーゼ反応を14℃において14時間行った。 酵素を65℃、10分間での処理により不活性化した後、
リガーゼ混合物５μを用いてエシェリキア・コリHBIO
Iの適当な細胞の形質転換を行った。 ついで、形質転換した細胞の選別をアンピシリン100
μg/mlを含有するＬ寒天プレート上で行った。AmpRから
急速法によって、pSM143の740bpのフラグメントSst I−
Xba Iフラグメントが15bp＋８孤立塩基の合成DNAセグメ
ントと置き換えられたプラスミドが単離された。この新
しいプラスミドをpSM146と命名した。その制限酵素開裂
地図は第３図に示すとおりである。
1）、50mM NaCl及び10mM MgCl2を含有する溶液（溶液
Ａ）中に懸濁させ、制限酵素Pvu II（BIOLABS）１単位
（Ｕ）で37℃において１時間消化させた。 この反応の終わりに制限酵素を65℃で10分間処理して
不活性化させた。 このようにして得た反応混合物とリン酸エステル化Ba
mH Iリンカー（BIOLABS）50ngとを、66mM Tris−HCl（p
H7.6）、6mM MgCl2、10mMジチオトレイトール及び1mM A
TPを含有する溶液（溶液Ｂ）19μに加えた後、酵素T4
リガーゼ1Uの存在下で連結させた。 このリガーゼ反応を14℃において14時間で行った。 ついで、リガーゼ混合物全体を使用して、Mandel及び
Higaの方法（J.Mol.Biol.,53，（1970）,159〜162）に
よってCaCl2でコンピテントとしたエシェリキア・コリH
BIOIの細胞を形質転換させた。形質転換した細胞の選択
を、アンピシリン100μg/mlを含むＬ寒天培地（H2O1リ
ットル当たり、バクトトリプトン10g、YE5g、NaCl10g、
DIFCO寒天16g）上に塗抹することにより行った。このよ
うにしてアンピシリン耐性遺伝子を有するプラスミドを
含む細胞（AmpR）だけを単離することが可能であった。 このAmpRのクローンから、周知方法（Rodriguezら
著、Addison−Wesley Publishing Company発行,Recombi
nant DNA Techniques,（1983）参照）によってプラスミ
ドpSM116を抽出、純化した。このプラスミドの制限酵素
開裂地図を第５図に示した。 アガロースゲル上での電気泳動により、このプラスミ
ドpSM116をプラスミドpSM110と較べたところ、プラスミ
ドpSM116はPvu II制限部位の所にBamH I制限部位が存在
する点でプラスミドpSM110と異なっていた。 （ii）プラスミドpSM131の調製 前記工程（ｉ）で得られたプラスミドpSM116 2μｇを
溶液A50μで希釈し、制限酵素Pst I（BIOLABS）2Uで
消化させた。 この消化反応の終わりにH2O50μとフェノール10μ
とを混合物に加えた。 ついで、フェノールを等量をエーテルで水相から抽出
し、酢酸ナトリウム3M溶液（pH5.5）1/10容量と95％エ
タノール2.5容量とを加えて、温度−70℃で10分間処理
してDNAを沈殿させた。 このようにして沈殿したDNAを10,000rpmで10分間遠心
分離して溶液から分離し、ついで酵素Bal 31 0.6Uの存
在下、溶液A30μ中に再懸濁させた。 消化反応を23℃で６分間行った。このようにしてリニ
アライズした（linearized）DNAを上述のようにして反
応混合物から沈殿、分離させた。 このプラスミドDNAをH2O20μに再懸濁させ、該水性
液１μ（DNA50ng）を、T4リガーゼ0.1Uの存在下、Xho
Iリンカー（Wortington）のDNA50ng（前記工程（ｉ）
において述べたように溶液B10μ中に懸濁させた）に
連結させた。 Xho Iリンカーは、Molecular Cloning,A laboratory
manual（T.Maniatis,E.F.Fritsch,J.Sambrook編,Cold S
pring Harbor Laboratory刊）に従って５′末端部位で
前以てリン酸エステル化してある。 Xho IリンカーのDNA（その塩基配列は TCTCGAGA AGAGCTCT である）は、重合化する際、酵素Bgl IIのための認識部
位を生ずる。 少なくとも２つのXho IリンカーをプラスミドpSM116
のDNAに連結し、Pst Iで切断し、Bal31で処理する場合
には、その結果として２つの新しい制限部位Xho I及びB
gl IIを呈する構造が形成されることとなる。リガーゼ
嵌合物10μを使用して、前記工程（ｉ）のようにして
コンピテントとしたエシェリキア・コリHBIOIの細胞を
形質転換する。この細胞はテトラサイクリン20μg/mlを
含むＬ寒天培地上に塗抹することにより、テトラサイク
リン耐性、アンピシリン感受性について選別される。 急速性により44TcRクローンからプラスミドを抽出し
た。 このようにして得たプラスミドDNAを溶液A20μに懸
濁させた後、酵素Xho I1Uで消化してリンカーの挿入の
完成を証明する。 アガロースゲル（７％）での分析の後、Xho Iでリニ
アライズし、pSM116と比較べて低減された長さを有する
プラスミドを、Bgl II制限部位の存在を証明することを
目的として分析した。Bal II制限部位とXho I制限部位
との両方を包含し、pSM116と比べて低減された長さを有
するプラスミドをpSM131と命名した。 プラスミドpSM131のBgl II−BamH IフラグメントのBa
l II制限部位の近くの領域の配列をMaxam及びGilbertの
方法（Methods in Enzymology,Vol.65,p.499〜560,（19
800））によって決定した。 第６図はプラスミドpSM131の制限酵素開裂地図であっ
て、２つのXho Iリンカーの正確な配置を示している。
これらのリンカーは、β−ラクタマーゼの終止コドン
（TAA）から数えて69番目の塩基の位置（pBR322の位置3
224）及びその開始コドン（ATG）から数えて532番目の
塩基の位置（pR322の位置3618）にあり、このようにし
て、酵素Ba131がPst I部から複製開始部位に向かって大
略390bp及びPst I制限部位からEcoR I制限部位に向かっ
てわずかに5bp削除されたことを示す。従って、プラス
ミドpSM131は期待した特性を呈するものであって、pBR3
22の複製開始部位の下流の短い距離にXho I制限部位及
びBgl II制限部位を有するものであった。 （iii）pUC8中のファージfdのターミネーターのクロー
ニング及びプラスミドpSM138の調製 プラスミドpUC8（Boehringer−Mannheim）１μｇ及び
エシェリキア・コリのプラスミドpLUB3 1μｇを、それ
ぞれ溶液A20μ中に懸濁した後、制限酵素Hind III（B
IOLABS）1Uで消化した。 pUC8はHind IIIで切断されてリニアライズされるが、
pLUB3は２つのフラグメントに切断される。これらフラ
グメントのうち小さい方は大略352bpであって、ファー
ジfdのターミネーティング配列を包含していた。 プラスミドDNAを前述のようにして反応混合物から沈
殿、分離した。 pLUB3−Hind III60ng及びpUC8−Hind III15ngを溶液B
10μに懸濁させ、T4リガーゼ0.4Uの存在の下で連結さ
せた。 リガーゼ混合物２μをエシェリキア・コリJM83（BR
L）の適当な細胞の形質転換に用いた。 形質転換した細胞を、J.Messingによって記載された
如くして（Methods in Enz.,Vol.101,（1983）,p.20〜7
8）アンピシリン100μg/ml及びインジケータＸ−Mgalを
含有するＬ寒天培地（DIFCO）上に塗抹することによっ
てアンピシリン耐性について選別した。 このようにして12個の白色コロニーが得られ、これら
から急速法によりプラスミドを抽出した。これらのプラ
スミドの８個は、pUC8のDNAと、ファージfdのターミネ
ーターを含有するpLUB3のHind IIIフラグメントとから
構成されていた。 ターミネーターのHind IIIフラグメントにおいて、Ba
mH I制限部位はHind III端部の一方からわずか４塩基の
距離に位置していた。BamH I制限部位もpUC8上にHind I
II制限部位から数塩基の距離に存在するので、pUC8中に
おけるターミネーターのHind IIIフラグメントのオリエ
ンテーションが２つのBamH I制限部位が遠い位置にある
かの如くであるとすれば、上述の如くして得られたハイ
ブリッドプラスミドのターミネーターを酵素BamH Iでの
消化によって単離することが可能である。 このハイブリッドプラスミドをBamH Iで消化し、DNA
を7.5％アクリルアミドゲルで分離した。エチジウムブ
ロマイドで着色し、UV光線の下でDNAを可視化すると、
分析に使った８個のプラスミドのうちの２個について、
BamH Iでの切断後にDNAの２つのフラグメントが認めら
れ、そのうちの一方は大略350bpであり、他方はpUC8の
長さを有していた。 pSM138と命名したこれらのプラスミドの１つの制限酵
素開裂地図を第７図に示した。 （iv）プラスミドpSM131へのターミネーターの組み込み
及びプラスミドpSM137の調製 前記工程（ii）及び（iii）に記述したようにして得
たpSM131 1μｇ及びpSM138 3.5μｇをそれぞれ溶液A20
μ中に懸濁させた後、酵素Bgl II 1U及びBamH I3.5U
で消化した。 この消化反応の後、酵素を65℃で10分間不活性化処理
した。 反応混合物２μを溶液B20μに加えて、T4リガー
ゼ0.1Uと結合させた。 酵素BamH I及びBgl IIは、DNAの切断後、互いに結合
できる粘着末端を生ずるため、pSM131から及びファージ
fdのターミネーターを含有するpSM138の小さなBamH Iフ
ラグメントから形成されたハイブリッド分子を得ること
が可能である。 リガーゼ混合物２μを使用して、エシェリキア・コ
リHBIOIの適当な細胞を形質転換させた。 ついで、この形質転換した細胞を、テトラサイクリン
20μg/mlを含むＬ寒天培地プレート上で選別した。 このようにして得たTcRクローン中に、ハイブリッド
プラスミドpSM137を有するもの１個が単離された。その
制限酵素開裂地図を第８図に示す。 このプラスミドは、複製の開始（反時計方向）に先立
って位置するファージfdのターミネーターを含むpSM138
の小さなBamH Iフラグメント及びpSM131から構成されて
いる。 （ｖ）β−ラクタマーゼの構造遺伝子の後へのHind III
制限部位の導入及びプラスミドpSM141の調製 二重ら旋（RF）を有するファージM13mp91μｇ及び前
記工程（ｉ）に関して述べたようにして得たpSM116 1μ
ｇを、それぞれBIOLABS社のすすめる条件下で反応混合
物A20μ中に懸濁させた後、酵素EcoR I1U及び酵素Bam
H I1Uで消化させた。65℃で10分間不活性化処理した
後、これら２つの混合物のそれぞれ１μｇずつを反応混
合物B20μ中に懸濁させ、T4リガーゼ0.1Uの存在下で
結合させた。 ついで、リガーゼ混合物５μをエシェリキア・コリ
JM83の適宜な細胞の形質転換に用いた。選別はアンピシ
リン耐性によって行った。 M.Zoller及びM.Smithの方法（Nucl.Ac.Res.,10，（19
82）,6487〜6500）により、このようにして得た白色プ
ラーク12個からファージのDNA（RF）を調製した。 これらのDNAを、ついで、前述のようにして酵素BamH
I及びEcoR Iで消化し、試料を0.8％アガロースゲル上で
分離した。 このようにして得たハイブリッド分子のうち２つがフ
ァージM13mp9のDNAとβ−ラクタマーゼの遺伝子を有す
るプラスミドpSM116の2000bpのフラグメントによって形
成されていることがわかった。 ２つのプラークの一方から、ついで組換ファージDNA
の単一ら旋体を得た。これをZoller及びSmithの方法（N
ucl.Ac.Res.,10，（1982）,6487〜6500）に従って精製
した。 ついで、塩基18個の合成オリゴヌクレオチドをこのDN
A領域を補足すべく設計した。これはβ−ラクタマーゼ
の遺伝子の末端に塩基１つだけ離れて続くものであり、
その配列は次のとおりである。 組換ファージの単一ら旋DNA、ユニバーサルプライマ
ー（BIOLABS社） TCCCAGTCACGACGT 及び合成オリゴヌクレオチド（米国カリフォルニア州サ
ンフランシスコのCreative Biomolecules社により合成
されたもの）を、β−ラクタマーゼの遺伝子の末端の後
にHind III制限部位を配置する目的で、K.Norrisらによ
って開示された（Nucl.Ac.Res.,II,（1983）,5103〜511
2）ようにインビトロ突然変異の実験的調査に用いた。 インビトロ重合化及び連結反応のため、反応混合物を
BIOLABS社によりすすめられた条件下でEcoR I3U及びBam
H I3Uで処理した。ついで、DNAを0.8％アガロースゲル
上で分離し、エチジウムブロマイドによる染色後、UV光
線で可視化される2000bpのEcoR I−BamH Iフラグメント
を、Molecular Cloning,A Laboratory Manual（T.Mania
tis,E.F.Fritsch,J,Sanbrook編，（1982）,Cold Spring
Hardor Laboratory発行）に開示された如くして抽出し
た。 このようにして抽出したDNAセグメント100ng及び7.5
％アクリルアミドゲルから回収した（Maxam及びGilber
t,Enzymology,Vol.65,（1980）,526〜527に開示された
方法による）プラスミドpSM116のEcoR I−BamH Iフラグ
メント（大略350bp）50ngを反応混合物B50μ中に懸濁
させた後、T4リガーゼ0.1Uの存在下で結合させた。リガ
ーゼ混合物10μを使用して、エシェリキア・コリHBIO
Iの適宜の細胞を形質転換させ、アンピシリン（100μg/
ml）耐性の形質転換細胞を選別した。 プラスミドDNAを急速法によって４つのAmpRクローン
から調製した。 このDNA調製物を、ついで反応混合物A30μ中、酵素
Hind III1Uで処理した。 完全な変異の場合には、この酵素の切断により２つの
DNAフラグメント（すなわち、一方は860bp、他方は1600
bpのDNAフラグメント）を生ずるものと期待される。 上述のようにして得た４つのサンプルを１％アガロー
スゲル上で分析した結果、これらのうち２つが期待どお
りの特性を示した。 これらのプラスミドの１つをpSM141と命名した。 その制限酵素開裂地図及びその調製に要した工程を第
９図に示した。 （vi）プラスミドpSM142の調製 プラスミドpSM141 1μｇ及びプラスミドpSM137（これ
は前記工程（iv）で述べたようにして得た）１μｇを溶
液A20μ中に懸濁させた後、それぞれ酵素Hind III1U
で消化させた。 この酵素Hind IIIはプラスミドpSM141を２点で切断
し、２つのフラグメント（すなわち、一方は830bpであ
り、他方は1600bpである）を生ずる。pSM137も２つのHi
nd III制限部位を示し、その消化により550bpのフラグ
メント及び3500bpのフラグメントを生成する（第８
図）。 各反応混合物１μを、酵素T4リガーゼ0.1Uを含む溶
液B18μに加えた。リガーゼ反応を14℃において14時
間で行った。 65℃で10分間処理して酵素を不活性化した後、リガー
ゼ混合物５μを用いてエシェリキア・コリHBIOIの適
宜な細胞の形質転換を行った。 形質転換した細胞を、アンピシリン100μg/ml、テト
ラサイクリン20μg/mlを含有するＬ寒天培地上に塗抹す
ることによりアンピシリン耐性、テトラサイクリン耐性
について選別した。 TcRクローン及びAmpRクローンから急速法によりpSM14
1の大略830bpのフラグメント及びpSM137の大略3500bpの
フラグメントにより形成されたプラスミドが単離され
た。 第10図にその制限酵素開裂地図を示す。このプラスミ
ドをpSM142と命令した。 （vii）プラスミドpSM143の調製 プラスミドpSM142 1μｇ及びイタリア国特許出願第A/
82 23992号に記載のようにして得た第11図に示すプラス
ミドpSM112 1μｇを溶液A20μ中に懸濁させ、酵素Bam
H I1U及び酵素EcoR I1Uで温度37℃において１時間同時
に処理して切断した。 65℃、10分間で処理して酵素を不活性化させた後、反
応混合物１μを前述のようにしてT4リガーゼの存在下
での連結反応に供した。 このようにして得たリガーゼ混合物全体を、ついで、
エシェリキア・コリHBIOIの適当な細胞の形質転換に用
いた。アンピシリン100μg/ml及びカナマイシン15μg/m
lを含有するＬ寒天板上でアンピシリン耐性及びカナマ
イシン耐性を選択することにより形質転換体の選別を行
った。 AmpR及びKmRクローンから急速法によりプラスミドpSM
143を単離した。その制限酵素開裂地図を第２図に示
す。 pSM143は、pSM112の4950bpフラグメント及びpSM142の
2400bpフラグメントからなるものであった。 ついで、このプラスミドpSM143をバシラス・サチリス
SMS003 NRRL B 15897の細胞［Contente及びDubnauによ
って開示された方法（Mol.Gen.Genet.,167,（1979）,25
1〜258）によりコンピテントとしたもの］の形質転換に
用いた。 形質転換された細胞の選別を、カナマイシン５μg/ml
を含有するDIFCO社のトリプトース・ブラット寒天ベー
ス（TBAB）培地上に塗抹することで行った。 pSM143と同じプラスミドをKmRクローンから単離で
き、このプラスミドはこの枯草菌の細胞内で安定した条
件下で維持せしめられることを示した。 （viii）プラスミドpSM146の調製 プラスミドpSM143 1μｇを、酵素Sst I1U及び酵素Xba
I1Uにより同時に溶液A20μ中、37℃、１時間で消化
させた。 65℃、10分間で酵素を不活性化した後、反応混合物１
μをT4リガーゼ0.1U及び合成DNAセグメント（その塩
基配列を第３図に示す）50ngを含有する溶液B19μに
加えた。 リガーゼ反応を14℃において14時間行った。 酵素を65℃、10分間での処理により不活性化した後、
リガーゼ混合物５μを用いてエシェリキア・コリHBIO
Iの適当な細胞の形質転換を行った。 ついで、形質転換した細胞の選別をアンピシリン100
μg/mlを含有するＬ寒天プレート上で行った。AmpRから
急速法によって、pSM143の740bpのフラグメントSst I−
Xba Iフラグメントが15bp＋８孤立塩基の合成DNAセグメ
ントと置き換えられたプラスミドが単離された。この新
しいプラスミドをpSM146と命名した。その制限酵素開裂
地図は第３図に示すとおりである。
【実施例２】 プラスミドpSM147の調製 第４図に示す塩基配列を有する合成DNAセグメント50n
gをリガーゼ反応に用いて、上述の実施例１と同じよう
にしてプラスミドの調製を行った。 AmpRクローンから単離されたプラスミドpSM147は、pS
M143と比較すると、Sst I−Xba Iフラグメントが24bp＋
８孤立塩基の合成セグメントで置換えられていることを
示した。このプラスミドpSM147の制限酵素開裂地図を第
８図に示す。
gをリガーゼ反応に用いて、上述の実施例１と同じよう
にしてプラスミドの調製を行った。 AmpRクローンから単離されたプラスミドpSM147は、pS
M143と比較すると、Sst I−Xba Iフラグメントが24bp＋
８孤立塩基の合成セグメントで置換えられていることを
示した。このプラスミドpSM147の制限酵素開裂地図を第
８図に示す。
【参考例１】 pSM143、pSM146及びpSM147のβ−ラクタマーゼ活性の決
定 プラスミドpSM143、pSM146、pSM147及びpSM119（対
照）を含有するエシェリキア・コリHBIOI及びバシラス
・サチリスBGSC 1A246の細胞を容積250mlの三角フラス
コ内で培養した。それぞれの三角フラスコには120℃で1
5分間殺菌した培地25mlが入れてある。 バシラス・サチリスについては、SMS培地にグルコー
ス（0.5％）、トリプトファン（50μg/ml）及び微量元
素を加えたものの中で培養した。 エシェリキア・コリについては、LB（DIFCO）培地で
培養した。 これら三角フラスコに接種し、37℃で６時間振とう培
養した。 β−ラクタマーゼの生産を、エシェリキア・コリにつ
いてはA.Nicolaidisらによって記述された（J.Bacterio
l.,135，（1978）,178）ようにして得たペリプラスム標
本中で、またバシラス・サチリスについては上澄液中と
超音波で破砕処理した細胞中との両方で測定した。この
超音波破砕処理細胞を調製するために、バシラス・サチ
リスの培養液5mlを5000rpmで10分間遠心分離処理した。
このようにして得た細胞を30mM Tris−HCl（pH7.5）及
び50mM NaClを含有する溶液5ml中に懸濁し、再び5000rp
mで10分間遠心分離処理した。ついで、この細胞を100mM
リン酸塩緩衝液（pH7.0）5ml中に懸濁させ、MSE超音波
処理器（Soniprep社モデル150）を最大出力で働かせ、
３回（１回１分間）処理した。 β−ラクタマーゼ活性は０′Callaghanらによって記
載された（Antimicrob.Ag.Chemother:I,（1972）,283〜
288）ようにしてニトロセフィン（Nitrocefin）で測定
した。 β−ラクタマーゼ１単位は、37℃において毎分１ナノ
モルの基質を加水分解するに要する酵素の量である。 表１はバシラス・サチリスBGSC 1A246及びエシェリキ
ア・コリHBIOIの各培養基中で測定したβ−ラクタマー
ゼ活性を示す。
定 プラスミドpSM143、pSM146、pSM147及びpSM119（対
照）を含有するエシェリキア・コリHBIOI及びバシラス
・サチリスBGSC 1A246の細胞を容積250mlの三角フラス
コ内で培養した。それぞれの三角フラスコには120℃で1
5分間殺菌した培地25mlが入れてある。 バシラス・サチリスについては、SMS培地にグルコー
ス（0.5％）、トリプトファン（50μg/ml）及び微量元
素を加えたものの中で培養した。 エシェリキア・コリについては、LB（DIFCO）培地で
培養した。 これら三角フラスコに接種し、37℃で６時間振とう培
養した。 β−ラクタマーゼの生産を、エシェリキア・コリにつ
いてはA.Nicolaidisらによって記述された（J.Bacterio
l.,135，（1978）,178）ようにして得たペリプラスム標
本中で、またバシラス・サチリスについては上澄液中と
超音波で破砕処理した細胞中との両方で測定した。この
超音波破砕処理細胞を調製するために、バシラス・サチ
リスの培養液5mlを5000rpmで10分間遠心分離処理した。
このようにして得た細胞を30mM Tris−HCl（pH7.5）及
び50mM NaClを含有する溶液5ml中に懸濁し、再び5000rp
mで10分間遠心分離処理した。ついで、この細胞を100mM
リン酸塩緩衝液（pH7.0）5ml中に懸濁させ、MSE超音波
処理器（Soniprep社モデル150）を最大出力で働かせ、
３回（１回１分間）処理した。 β−ラクタマーゼ活性は０′Callaghanらによって記
載された（Antimicrob.Ag.Chemother:I,（1972）,283〜
288）ようにしてニトロセフィン（Nitrocefin）で測定
した。 β−ラクタマーゼ１単位は、37℃において毎分１ナノ
モルの基質を加水分解するに要する酵素の量である。 表１はバシラス・サチリスBGSC 1A246及びエシェリキ
ア・コリHBIOIの各培養基中で測定したβ−ラクタマー
ゼ活性を示す。
【図面の簡単な説明】 第１図はプラスミドpSM110の制限酵素開裂地図を示す
図、第２図はプラスミドpSM143の制限酵素開裂地図を示
す図、第３図はプラスミドpSM146の制限酵素開裂地図及
びプロモーターの−35領域に存在する合成DNAセグメン
トの塩基配列を示す図、第４図はプラスミドpSM147の制
限酵素開裂地図及びプロモーターの−35領域に存在する
合成DNAセグメントの塩基配列を示す図、第５図はプラ
スミドpSM116の制限酵素開裂地図を示す図、第６図はプ
ラスミドpSM131の制限酵素開裂地図及び２つのXho Iリ
ンカーの正確な配置を示す図、第７図はプラスミドpSM1
38の制限酵素開裂地図及び大腸菌ファージfdのターミネ
ーターを含有するHind IIIフラグメントの正確なオリエ
ンテーションを示す図、第８図はプラスミドpSM137の制
限酵素開裂地図及びプラスミドの複製（反時計回り方
向）の開始前のファージfdのターミネーターの配置を示
す図、第９図はプラスミドpSM141の制限酵素開裂地図及
びその調製の各段階（インビトロ突然変異）を示す図、
第10図はプラスミドpSM142の制限酵素開裂地図を示す
図、第11図はプラスミドpSM112の制限酵素開裂地図を示
す図である。
図、第２図はプラスミドpSM143の制限酵素開裂地図を示
す図、第３図はプラスミドpSM146の制限酵素開裂地図及
びプロモーターの−35領域に存在する合成DNAセグメン
トの塩基配列を示す図、第４図はプラスミドpSM147の制
限酵素開裂地図及びプロモーターの−35領域に存在する
合成DNAセグメントの塩基配列を示す図、第５図はプラ
スミドpSM116の制限酵素開裂地図を示す図、第６図はプ
ラスミドpSM131の制限酵素開裂地図及び２つのXho Iリ
ンカーの正確な配置を示す図、第７図はプラスミドpSM1
38の制限酵素開裂地図及び大腸菌ファージfdのターミネ
ーターを含有するHind IIIフラグメントの正確なオリエ
ンテーションを示す図、第８図はプラスミドpSM137の制
限酵素開裂地図及びプラスミドの複製（反時計回り方
向）の開始前のファージfdのターミネーターの配置を示
す図、第９図はプラスミドpSM141の制限酵素開裂地図及
びその調製の各段階（インビトロ突然変異）を示す図、
第10図はプラスミドpSM142の制限酵素開裂地図を示す
図、第11図はプラスミドpSM112の制限酵素開裂地図を示
す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:125） (Ｃ１２Ｎ 9/86 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/86 Ｃ１２Ｒ 1:125） (72)発明者 スザンナ・カンパニヨーリ イタリー国コドーニヨ市ビア・チ・カツ タネオ43ア (72)発明者 レンゾ・ノガロツト イタリー国モツタ・デイ・リベンザ市リ ビエラ・モルメンチ42 (56)参考文献 特公 平６−95940（ＪＰ，Ｂ２)
Claims (9)
- 【請求項１】大腸菌及び／又は枯草菌で形質を発現させ
るプラスミドベクターにおいて、異種タンパク質をコー
ドする遺伝子を、大腸菌のファージfdのターミネーティ
ング配列、及び塩基配列（Ｉ）５′ CTGTTTTTTGTCAAT３′ ３′ TCGAGACAAAAAACAGTTAGATC５′ 又は塩基配列（II）５′ CTGTTTTTTGTCAACAACTTTTTT３′ ３′ TCGAGACAAAAAACAGTTGTTGAAAAAAGATC５′ を有する合成DNAセグメントでその−35領域を置き換え
ることによって変性した、下記プラスミドpSM112の制限
酵素地図中、黒点を付して示す領域に相当する制限酵素
地図を有するpE194のエリスロマイシンプロモーターの
制御下に配置したことを特徴とする、プラスミドベクタ
ー。 - 【請求項２】特許請求の範囲第１項記載のものにおい
て、前記異種タンパク質をコードする遺伝子が、ヒト及
び動物のホルモン、食品用タンパク質及び酵素の構造遺
伝子の中から選ばれるものである、プラスミドベクタ
ー。 - 【請求項３】特許請求の範囲第２項記載のものにおい
て、前記構造遺伝子がβ−ラクタマーゼの構造遺伝子で
ある、プラスミドベクター。 - 【請求項４】特許請求の範囲第１項記載のものにおい
て、前記合成DNAセグメントが塩基配列（Ｉ）を有する
ものである、下記制限酵素地図を有するプラスミドベク
ター（pSM146）。 - 【請求項５】特許請求の範囲第１項記載のものにおい
て、前記合成DNAセグメントが塩基配列（II）を有する
ものである、下記制限酵素地図を有するプラスミドベク
ター（pSM147）。 - 【請求項６】異種タンパク質をコードする遺伝子を、大
腸菌のファージfdのターミネーティング配列、及び塩基
配列（Ｉ）５′ CTGTTTTTTGTCAAT３′ ３′ TCGAGACAAAAAACAGTTAGATC５′ 又は塩基配列（II）５′ CTGTTTTTTGTCAACAACTTTTTT３′ ３′ TCGAGACAAAAAACAGTTGTTGAAAAAAGATC５′ を有する合成DNAセグメントでその−35領域を置き換え
ることによって変性した、下記プラスミドpSM112の制限
酵素地図中、黒点を付して示す領域に相当する制限酵素
地図を有するpE194のエリスロマイシンプロモーターの
制御下に配置してなる大腸菌及び／又は枯草菌で形質を
発現させるプラスミドベクターを、制限酵素地図 を有するプラスミドベクターpSM143から調製する方法に
おいて、前記プラスミドベクターpSM143を制限酵素Sst
I及びXba Iで消化した後、該プラスミドベクターpSM143
のプロモーターの740bpのSst I−Xba Iセグメントを、
前記塩基配列（Ｉ）又は（II）を有する合成DNAセグメ
ントで置き換えることを特徴とする、プラスミドベクタ
ーの調製法。 - 【請求項７】異種タンパク質をコードする遺伝子を、大
腸菌のファージfdのターミネーティング配列、及び塩基
配列（Ｉ）５′ CTGTTTTTTGTCAAT３′ ３′ TCGAGACAAAAAACAGTTAGATC５′ 又は塩基配列（II）５′ CTGTTTTTTGTCAACAACTTTTTT３′ ３′ TCGAGACAAAAAACAGTTGTTGAAAAAAGATC５′ を有する合成DNAセグメントでその−35領域を置き換え
ることによって変性した、下記プラスミドpSM112の制限
酵素地図中、黒点を付して示す領域に相当する制限酵素
地図を有するpE194のエリスロマイシンプロモーターの
制御下に配置したプラスミドベクターによってエシェリ
キア・コリ及びバシラス・サチリスの中から選ばれる宿
主微生物を形質転換させてなる、形質転換微生物。 - 【請求項８】特許請求の範囲第７項記載のものにおい
て、宿主微生物がエシェリキア・コリHBIOIである、形
質転換微生物。 - 【請求項９】特許請求の範囲第７項記載のものにおい
て、エシェリキア・コリ（pSM146）ATCC53039又はエシ
ェリキア・コリ（pSM147）ATCC53040である、形質転換
微生物。
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|---|---|---|---|
| IT19960A/85 | 1985-03-19 | ||
| IT8519960A IT1208514B (it) | 1985-03-19 | 1985-03-19 | Vettori plasmidici ad espressione in escherichia coli e/o bacillussubtilis. |
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|---|---|---|---|
| JP6136679A Division JP2544710B2 (ja) | 1985-03-19 | 1994-05-27 | β−ラクタマ―ゼの製法 |
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|---|---|
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| JP2544602B2 true JP2544602B2 (ja) | 1996-10-16 |
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|---|---|---|---|
| JP61059652A Expired - Lifetime JP2544602B2 (ja) | 1985-03-19 | 1986-03-19 | 新規プラスミドベクタ− |
| JP6136679A Expired - Lifetime JP2544710B2 (ja) | 1985-03-19 | 1994-05-27 | β−ラクタマ―ゼの製法 |
| JP6136678A Pending JPH07135977A (ja) | 1985-03-19 | 1994-05-27 | プラスミドベクターｐＳＭ１４３及びその調製法 |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6136679A Expired - Lifetime JP2544710B2 (ja) | 1985-03-19 | 1994-05-27 | β−ラクタマ―ゼの製法 |
| JP6136678A Pending JPH07135977A (ja) | 1985-03-19 | 1994-05-27 | プラスミドベクターｐＳＭ１４３及びその調製法 |
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| JP (3) | JP2544602B2 (ja) |
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| DE (1) | DE3666838D1 (ja) |
| IT (1) | IT1208514B (ja) |
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|---|---|---|---|---|
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| US7049102B1 (en) | 1989-09-22 | 2006-05-23 | Board Of Trustees Of Leland Stanford University | Multi-gene expression profile |
| IT1274168B (it) * | 1994-04-15 | 1997-07-15 | Eniricerche Spa | Vettore plasmidico e suo impiego per la produzione di proteine eterologhe |
| US6951743B2 (en) | 1997-10-31 | 2005-10-04 | University Of Oklahoma Board Of Regents | Hyaluronan synthase genes and expression thereof in bacillus hosts |
| US7091008B1 (en) | 1994-07-01 | 2006-08-15 | The Board Of Regents Of The University Of Oklahoma | Hyaluronan synthase genes and expression thereof in Bacillus hosts |
| US6455304B1 (en) | 1994-07-01 | 2002-09-24 | The Board Of Regents Of The University Of Oklahoma | Hyaluronate synthase gene and uses thereof |
| CN1322121C (zh) | 1997-10-31 | 2007-06-20 | 俄克拉何马大学董事会 | 透明质酸合酶基因及其应用 |
| CN101113436B (zh) | 1997-10-31 | 2013-02-06 | 俄克拉何马大学董事会 | 透明质酸合酶基因及其应用 |
| US7223571B2 (en) | 1998-04-02 | 2007-05-29 | The Board Of Regents Of The Universtiy Of Oklahoma | Targeted glycosaminoglycan polymers by polymer grafting and methods of making and using same |
| US6987023B2 (en) | 1998-04-02 | 2006-01-17 | The Board Of Regents Of The University Of Oklahoma | DNA encoding hyaluronan synthase from Pasteurella multocida and methods of use |
| US20060188966A1 (en) | 1998-04-02 | 2006-08-24 | Deangelis Paul L | Natural, chimeric and hybrid glycosaminoglycan polymers and methods of making and using same |
| US7094581B2 (en) | 1998-10-26 | 2006-08-22 | The Board Of Regents Of The University Of Oklahoma | Hyaluronan synthases and methods of making and using same |
| KR100428998B1 (ko) * | 2001-09-10 | 2004-04-28 | 한국과학기술원 | 모체 단백질과는 크기와 서열이 다른 단백질의 변이집단을생산하는 방법 |
| TW201118170A (en) * | 2009-11-20 | 2011-06-01 | Ind Tech Res Inst | Expression vector for expressing recombinant protein in cyanobacterium |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU545912B2 (en) * | 1980-03-10 | 1985-08-08 | Cetus Corporation | Cloned heterologous jive products in bacillies |
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