KR100428998B1 - 모체 단백질과는 크기와 서열이 다른 단백질의 변이집단을생산하는 방법 - Google Patents

모체 단백질과는 크기와 서열이 다른 단백질의 변이집단을생산하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 모체 단백질과는 크기와 서열이 다른 단백질의 변이집단을 생산하는 방법, 결함유전자(defective template)에 유전체 DNA(genomic DNA) 단편을 삽입시킨 재조합 유전자를 포함하는 플라스미드로 형질전환된 미생물, 전기 미생물로부터 발현된 단백질로부터 선별된 단백질 및 전기 미생물을 배양하여 단백질을 수득하는 단계를 포함하는 모체 단백질과는 크기와 서열이 다른 단백질을 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 의하면, 결함유전자에 DNA 단편을 삽입시킨 재조합 유전자를 포함하는 플라스미드로 형질전환된 미생물 집단(library)을 구축하고, 이로부터 발현된 단백질들로부터 기능이 회복(salvage)되거나 특성이 변화된 단백질들을 선별하여 모체 단백질과는 크기와 서열이 다른 단백질의 변이집단을 효율적이고 간편하게 생산할 수 있다.

Description

모체 단백질과는 크기와 서열이 다른 단백질의 변이집단을 생산하는 방법{A Method for Manufacturing Mutant Library of Proteins with Variable Sequences and Sizes}
본 발명은 모체 단백질과는 크기와 서열이 다른 단백질의 변이집단을 생산하는 방법에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 모체 단백질과는 크기와 서열이 다른 단백질의 변이집단을 생산하는 방법, 결함유전자(defective template)에 유전체 DNA(genomic DNA) 단편을 삽입시킨 재조합 유전자를 포함하는 플라스미드로 형질전환된 미생물, 전기 미생물을 배양하여 단백질을 수득하는 단계를 포함하는 모체 단백질과는 크기와 서열이 다른 단백질을 생산하는 방법 및 전기 방법으로부터 생산된 단백질에 관한 것이다.
단백질은 의약용, 치료용 또는 산업용으로 광범위하게 사용되는 바, 이들의 기능과 특성을 변형시키고자 하는 연구가 지속적으로 진행되고 있으며, 이를 위해서, 단백질의 유전자에 인위적인 돌연변이를 가하여 다양한 변이집단(mutation library)을 생산하고, 그로부터 기능이 변화된 단백질을 선별하는 방법이 주로 사용되고 있다. 따라서, 기능이나 특성이 변화된 단백질의 생산은 다양한 단백질의 변이집단을 생산하는 것에 의해 크게 좌우된다.
단백질의 변이집단을 생산하는 방법으로, 예전에는 단백질의 유전자에 무작위로 돌연변이를 가하는 방법 또는 단백질의 구조를 바탕으로 특정 아미노산을 치환, 결실 또는 부가하는 방법 등이 주로 이용되었고, 좀 더 효율적인 방법으로, 에러 유발 PCR(error-prone PCR)이 이용되었다. 최근에는, DNA 셔플링(shuffling) 방법이 미국의 맥시젠(Maxygen)사에서 개발되어, 매우 효과적으로 단백질의 다양한 변이집단을 생산하는 방법으로 각광을 받고 있고, 이를 여러 단백질에 효과적으로 적용한 예가 많이 보고되고 있다. 그러나, 전기 방법에 의하면, 모체 유전자의 크기는 일정하게 유지하면서 부분적인 돌연변이(point mutation) 또는 서열 상동성에기초한 재조합이 일어난 변이집단만이 주로 생산되기 때문에, 보다 다양한 단백질의 변이집단을 생산하는 데는 한계가 있다.
한편, 자연진화 과정에서 생성되는 다양한 단백질은 본래 유전자의 염기서열이 변형되는 것 뿐만 아니라, 임의의 크기나 염기서열을 갖는 유전자 단편의 치환, 결실 또는 부가 등의 복잡한 과정을 거쳐서 생성되는 것으로 밝혀지고 있다. 이러한 사실에 입각하여, 최근, 단백질 유전자의 C-말단에 임의의 크기와 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 추가로 결합시켜, 모체 단백질과는 크기와 서열이 다른 단백질을 생산한 것에 관한 보고가 있었고, 서브도메인 치환(sub-domain swapping), 도메인(domain) 또는 모듈이식(module grafting), 염기서열의 상동성(homology)과는 무관한 재조합(recombination) 방법 등도 보고되고 있으나, 역시 변이집단을 다양화하는 데는 크게 기여하지 못하고 있는 실정이다.
따라서, 모체 단백질과는 크기와 서열이 다르고, 보다 다양한 기능과 특성을 갖는 단백질의 다양한 변이집단을 효율적이고 간편하게 생산할 수 있는 방법을 개발하여야 할 필요성이 대두되었다.
이에, 본 발명자들은 모체 단백질과는 크기와 서열이 다른 단백질의 변이집단을 생산하는 방법을 개발하고자 예의 노력한 결과, 결함유전자에 DNA 단편을 삽입시킨 재조합 유전자를 포함하는 플라스미드로 형질전환된 미생물 집단(library)을 구축하고, 이로부터 발현된 단백질들로부터 기능이 회복(salvage)되거나 특성이변화된 단백질들을 선별하여 모체 단백질과는 크기와 서열이 다른 단백질의 변이집단을 효율적이고 간편하게 생산할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
결국, 본 발명의 주된 목적은 모체 단백질과는 크기와 서열이 다른 단백질의 변이집단을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 결함유전자에 유전체 DNA 단편을 삽입시킨 재조합 유전자를 포함하는 플라스미드로 형질전환된 미생물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 전기 미생물로부터 발현된 단백질로부터 선별된 단백질을 제공하는 것이다.
도 1은 본 발명의 모체 단백질과는 크기와 서열이 다른 단백질의 변이집단을 생산하는 방법을 모식적으로 나타낸 그림이다.
도 2는 본 발명의 결함유전자 GFP▽176(+2)로부터 구축된 미생물 집단으로부터 무작위로 선택한 클론의 유전자를 아가로스 겔에서 분석한 결과를 나타내는 사진이다.
도 3a 및 3b는 각각 결함유전자인 GFP▽176(+2) 또는 GFP▽172-3/176(+2)에 삽입된 대장균의 유전체 DNA 단편으로부터 유추되는 아미노산 서열과 결함유전자 GFP▽176(+2) 또는 GFP▽172-3/176(+2)의 ORF 크기를 나타낸다.
본 발명의 모체 단백질과는 크기와 서열이 다른 단백질의 변이집단을 생산하는 방법은 인위적인 변이를 가하여 작제한 결함유전자를 이용한다. 이때, 인위적인 변이가 가해지는 부위는 유전자에 변이가 일어난 경우 그로부터 발현된 단백질의 기능이 파괴되는 부위로 선택되며, 모체 단백질의 구조 및 다른 유사 단백질과의 서열 상동성 등의 정보를 바탕으로 하여 결정된다. 전기 결정된 부위에 인위적인 변이를 가하여 작제한 결함유전자는 그로부터 구축된 미생물 집단으로부터 발현된 각 단백질들로부터 기능이 회복되거나 특성이 변화된 단백질들을 선별하는 과정을 용이하게 하고, 기능을 회복시키는 변형이 결함유전자의 원하는 부위에서만 일어나도록 조절하는 것을 가능하게 한다. 이와 같은 유용성은 결함유전자가 파괴된 기능을 회복하기 위해서는 신규한 서열과 크기를 갖도록 변형이 일어나야만 하고, 이 변형은 무작위로 합성된 올리고뉴클레오티드 또는 제한효소로 처리된 유전체 단편의 삽입에 의해 유도되며, 전기 유전체 단편이 삽입되는 부위를 인위적으로 선택하여 지정할 수 있다는 점에서 기인한다.
이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다.
본 발명의 모체 단백질과는 크기와 서열이 다른 단백질의 변이집단을 생산하는 방법은 모체 단백질의 유전자에 인위적인 변이를 가하여 기능이 파괴된 결함유전자를 작제하는 단계; 전기 결함유전자의 특정 부위에 무작위로 합성된 올리고뉴클레오티드 또는 제한효소로 처리된 유전체 DNA 단편을 삽입시킨 재조합 유전자를 포함하는 플라스미드로 형질전환된 미생물 집단을 구축하는 단계; 및, 전기 미생물 집단으로부터 발현된 단백질들로부터 기능이 회복되거나 특성이 변화된 단백질들을 선별하는 단계를 포함한다: 이때, 인위적인 변이는 모체 단백질 유전자의 특정 부위에서 수 개의 아미노산이나 도메인을 암호화하는 염기를 결실시키거나, 프레임 이동(frame shift)을 유발하거나, 또는 전기 두 가지를 병행하여 수행된다. 또한, 결함유전자의 특정 부위에 삽입되는 무작위로 합성된 올리고뉴클레오티드 또는 제한효소로 처리된 유전체 DNA 단편에서, 올리고뉴클레오티드는 dATP, dTTP, dGTP 및 dCTP를 순서대로 첨가하여 합성한 것이 아니라, 전기의 염기 모두 또는 몇 가지만을 첨가하여 무작위로 합성한 것이고, 유전체 DNA 단편은 생물체로부터 수득한 유전체 DNA를 빈도수가 높은 제한효소(예를 들면, Sau3AI) 및 DNase I으로 절단한 다음, 아가로스 겔에서 전기영동하여, 특정한 크기(예를 들면, 25-500bp)의 단편만을 추출한 것이다. 결함유전자의 특정 부위에 전기 무작위로 합성된 올리고뉴클레오티드 또는 제한효소로 처리된 유전체 DNA 단편을 삽입하여 재조합 유전자를 작제하는 단계는 다음의 두 가지 방법으로 수행된다. 하나는 염기 서열의 상동성을 이용하는 PCR에 의한 재조합 방법(PCR-coupled recombination)이고, 다른 하나는 염기서열의 상동성과 관계없는 리가아제(ligase)를 이용하는 직접접합에 의한 재조합 방법(sequence-directed recombination)이다. PCR에 의한 재조합 방법은 상동성을 가진 염기서열들이 생체내에서 자연적으로 재조합되는 현상을 모방한 것으로, 삽입될 DNA 단편을 결함유전자의 DNA 단편과 혼합하여 PCR을 수행함으로써, 결함유전자와 삽입될 DNA 단편의 염기서열 상동성에 의하여 PCR이 진행되는 동안 DNA 단편이 결함유전자로 삽입되도록 하는 것이다. 직접접합에 의한 재조합 방법은 삽입될 DNA 단편을 결함유전자에 염기서열의 상동성과 상관없이 직접 삽입시키는 것으로, 결함유전자의 특정 부위를 제한효소로 절단하고, 삽입될 DNA 단편을 전기 절단부위에 리가아제를 이용하여 직접 연결시키는 것이다. 직접접합에 의한 재조합 방법은 서열과 무관하게 진행되므로, 변이의 다양성을 더욱 증가시킬 수 있다.
도 1은 본 발명의 모체 단백질과는 크기와 서열이 다른 단백질의 변이집단을 생산하는 방법을 모식적으로 나타낸 그림이다.
본 발명자들은 해파리의 녹색형광단백질(GFP)을 개량한 GFPuv의 유전자에서수 개의 아미노산을 암호화하는 염기를 결실시킨 결함유전자인 GFP▽176(+1), GFP▽176(+2), GFP▽172-3/176(+1), GFP▽172-3/176(+2), GFP▽129-138/176(+2) 및 다이하이드로오로타아제의 유전자에서 수십개의 염기를 결실시킨 결함유전자인 DHO▽68-70(+1)를 작제하고, 전기 작제한 결함유전자의 BamHI 인식부위에 대장균의 유전체 DNA 단편을 PCR에 의한 재조합 방법 또는 리가아제를 이용하는 직접접합에 의한 재조합 방법으로 삽입시킨 재조합 유전자를 포함하는 플라스미드로 형질전환된 미생물 집단을 구축한 다음, 전기 미생물 집단으로부터 발현된 단백질들로부터 기능이 회복된 형광단백질 및 다이하이드로오로타아제 활성을 가지는 단백질을 선별하였다: 이때, 결함유전자인 GFP▽176(+2)에 삽입시킨 대장균의 유전체 DNA 단편으로부터 유추되는 아미노산 서열은 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7을 포함하고, GFP▽172-3/176(+2)에 삽입시킨 대장균의 유전체 DNA 단편으로부터 유추되는 아미노산 서열은 서열번호 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 또는 17을 포함한다. 전기 형질전환된 미생물 집단에서 GFPuv의 결함유전자인 GFP∇176(+2)의 BamHI 인식부위에 서열번호 4의 아미노산 서열을 암호화하는 대장균의 유전체 DNA 단편을 삽입시킨 재조합 유전자를 포함하는 플라스미드로 형질전환된 미생물Escherichia coliJM109/pMAL-c2/gfpS22 및 GFPuv의 결함유전자인 GFP∇172-3/176(+2)의 BamHI 인식부위에 서열번호 8의 아미노산 서열을 암호화하는 대장균의 유전체 DNA 단편을 삽입시킨 재조합 유전자를 포함하는 플라스미드로 형질전환된 미생물Escherichia coliJM109/pMAL-c2/gfpI5를 선택하여, 대전광역시 유성구 어은동 52번지 한국생명공학연구원 유전자원센터에 소재하는 국제기탁기관인 유전자은행에 기탁번호 KCTC10059BP 및 KCTC 10058BP로, 2001년 8월 30일자로 기탁하였다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 이들 실시예에 의하여 본 발명의 범위가 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: PCR에 의한 재조합 방법을 이용한 다양한 크기와 서열을 갖는 형광단백질의 생산
형광단백질의 결함유전자의 특정 부위에 제한효소로 처리된 유전체 DNA 단편을 PCR에 의한 재조합 방법으로 삽입시킨 재조합 유전자를 발현시켜, 다양한 크기와 서열을 갖는 형광단백질을 생산하였다: 해파리의 GFP를 개량한 GFPuv의 유전자(Clontech, 캐나다)를 대상으로 GFPuv의 두 번째 베타-스트랜드(β-strand) 부위에 해당하는 176번째 아미노산을 암호화하는 염기와 추가로 1개의 염기 또는 176번째 아미노산을 암호화하는 염기와 추가로 2개의 염기를 결실시켜 결함유전자를 작제하고, 각각 'GFP▽176(+1)' 및 'GFP▽176(+2)'로 명명하였다. 또한, 전기 작제한 결함유전자에서 172번째 또는 173번째 아미노산을 암호화하는 염기를 추가로 결실시켜 결함유전자를 작제하고, 각각 'GFP▽172-3/176(+1)' 및 'GFP▽172-3/176(+2)'로 명명하였다. 이들 결함유전자로부터 발현된 단백질은 형광을 나타내지 않았다. 구체적으로, 전기 결함유전자는 다음의 방법으로 작제하고 증폭하였다: 모체 단백질의 유전자를 주형으로 하고, N-말단에 해당하는 염기서열과 제한효소 인식부위(EcoRI)를 가지는 올리고뉴클레오티드 및 결실하고자 하는 뉴클레오티드의 상류(upstream)에 상보적인 염기서열과 다른 제한효소 인식부위(BamHI)를 가지는 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 하는 PCR을 수행하여, 모체 유전자의 결실하고자 하는 부위의 N-말단 부분을 증폭하였다. 동일한 방법으로, 모체 단백질의 유전자를 주형으로 하고, C-말단에 상보적인 염기서열과 제한효소 인식부위(HindIII)를 가지는 올리고뉴클레오티드 및 결실하고자 하는 뉴클레오티드의 하류(downstream)에 해당하는 염기서열과 다른 제한효소 인식부위(BamHI)를 가지는 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 하는 PCR을 수행하여, 모체 유전자의 결실하고자 하는 부위의 C-말단 부분을 증폭하였다. 먼저, N-말단 부분과 플라스미드 pTrc-99A를 동일한 제한효소(EcoRI과 BamHI)로 절단하고, 리가아제를 이용하여 두 DNA를 접합하였다. 그런 다음, 같은 방법으로 N-말단 부분과 접합된 전기 플라스미드와 C-말단 부분을 동일한 제한효소(BamHI과 HindIII)로 절단하고, C-말단 부분을 N-말단 부분에 연결하여 접합하여, 결함유전자를 포함하는 재조합 플라스미드를 작제한 후에, 이를 이용하여 결함유전자를 증폭하였다.
전기 증폭한 결함유전자를 DNase I으로 절단하고, 아가로스 겔에서 전기영동하여 50-150bp의 DNA 단편을 추출하였다. 삽입될 DNA 단편으로는 대장균의 유전체 DNA를 Sau3AI 및 DNase I으로 절단하여 아가로스 겔에서 추출한 25-500bp의 DNA 단편을 사용하였다. 무작위로 절단한 결함유전자의 DNA 단편과 대장균 유전체의 DNA단편을 혼합하여 PCR(94℃, 1분; 45℃, 1분; 72℃, 40초; 40번 반복)에 의해 재조합시키고, 증폭한 후, 전기 증폭된 재조합 산물을 플라스미드 pTrc-99A에 클로닝하고, 대장균 JM109주에 형질전환시킨 미생물 집단을 구축하였다. 도 2는 본 발명의 결함유전자 GFP▽176(+2)로부터 구축된 미생물 집단으로부터 무작위로 선택한 클론의 유전자를 아가로스 겔에서 분석한 결과를 나타내는 사진이다. 도 2에서 보듯이, 미생물 집단이 포함하는 형광단백질 유전자는 다양한 크기를 갖는다는 것을 알 수 있다. 구축된 미생물 집단을 자외선 램프로 조사하여 기능이 회복되어 형광을 띠는 클론을 선별하고, 전기 클론이 포함하는 형광단백질 유전자의 염기서열과 그로부터 유추되는 아미노산 서열을 결정하였다. 도 3a는 결함유전자인 GFP▽176(+2)에 삽입된 대장균의 유전체 DNA 단편으로부터 유추되는 아미노산 서열과 결함유전자 GFP▽176(+2)의 ORF 크기를 나타낸다. 전기 아미노산 서열은 서열번호 1 내지 7로 나타내었다. 도 3a에서 보듯이, 삽입된 단편의 아미노산 서열과 크기가 매우 다양하므로, 본 발명에 의하여 다양한 아미노산 서열과 크기를 갖는 형광단백질이 생산되었음을 확인할 수 있다. 전기 선별된 클론의 형광단백질 유전자를 대장균의 말토스 결합단백질(maltose binding protein)과 융합한 재조합 유전자를 대장균에서 발현시키고, 순수하게 정제, 분리한 다음, 형광 분석기로 형광 특성을 조사한 결과, 생산된 형광단백질은 모체 형광단백질의 2-16% 정도의 형광세기를 나타냈다.
본 발명의 결함유전자 GFP▽176(+2)로부터 구축된 전기 미생물 집단에서 GFP∇176(+2)의 BamHI 인식부위에 서열번호 4의 아미노산 서열을 암호화하는 대장균의유전체 DNA 단편을 삽입시킨 재조합 유전자를 포함하는 플라스미드로 형질전환된 미생물Escherichia coliJM109/pMAL-c2/gfpS22를 대전광역시 유성구 어은동 52번지 한국생명공학연구원 유전자원센터에 소재하는 국제기탁기관인 유전자은행에 기탁번호 KCTC 10059BP로, 2001년 8월 30일자로 기탁하였다.
실시예 2: 리가아제를 이용하는 직접접합에 의한 재조합 방법을 이용한 다양한 크기와 서열을 갖는 형광단백질의 생산
형광단백질의 결함유전자의 특정 부위에 제한효소로 처리된 유전체 DNA 단편을 리가아제를 이용하는 직접접합에 의한 재조합 방법으로 삽입시킨 재조합 유전자를 발현시켜, 다양한 크기와 서열을 갖는 형광단백질을 생산하였다: 전기 실시예 1에서 작제한 각 결함유전자를 플라스미드 pTrc-99A에 클로닝하고, 제한효소 BamHI으로 절단하여 선형화하였다. 삽입될 DNA 단편으로는 대장균의 유전체 DNA를 Sau3AI으로 절단하여 아가로스 겔에서 추출한 25-500bp의 DNA 단편을 사용하였다. 전기 선형화된 결함유전자와 Sau3AI으로 절단된 유전체 DNA 단편을 리가아제로 접합하고, 대장균 JM109주에 형질전환시킨 미생물 집단을 구축하였다. 전기 작제한 결함유전자 GFP▽172-3/176(+2)로부터 직접접합 방법으로 구축한 미생물 집단을 자외선 램프로 조사하여 기능이 회복되어 형광을 띠는 클론을 선별하고, 염기서열과 그로부터 유추되는 아미노산 서열을 결정하였다. 도 3b는 결함유전자인 GFP▽172-3/176(+2)에 삽입된 대장균의 유전체 DNA 단편으로부터 유추되는 아미노산 서열과결함유전자 GFP▽172-3/176(+2)의 ORF 크기를 나타낸다. 전기 아미노산 서열은 서열번호 8 내지 17로 나타내었다. 도 3a와 마찬가지로, 도 3b에서도 다양한 아미노산 서열과 크기를 갖는 형광단백질이 생산되었음을 확인할 수 있다. 전기 실시예 1과 동일한 방법으로 생산된 형광단백질의 형광 특성을 조사한 결과, 생산된 형광단백질은 모체 형광단백질의 1-17% 정도의 형광 세기를 나타냈다.
본 발명의 결함유전자 GFP∇172-3/176(+2)로부터 구축된 전기 미생물 집단에서 GFP∇176(+2)의 BamHI 인식부위에 서열번호 8의 아미노산 서열을 암호화하는 대장균의 유전체 DNA 단편을 삽입시킨 재조합 유전자를 포함하는 플라스미드로 형질전환된 미생물Escherichia coliJM109/pMAL-c2/gfpI5를 국제기탁기관인 유전자은행에 기탁번호 KCTC 10058BP로, 2001년 8월 30일자로 기탁하였다.
실시예 3: 다양한 부위가 손상된 결함유전자로부터 형광단백질의 생산
형광단백질의 결함유전자의 두 군데의 특정 부위에 제한효소로 처리된 유전체 DNA 단편을 삽입시킨 재조합 유전자를 발현시켜, 다양한 크기와 서열을 갖는 형광단백질을 생산하였다: 전기 실시예 1 및 2에서는 하나의 특정 부위가 손상된 결함유전자를 이용하였으나, 두 군데 이상의 특정 부위가 손상된 결함유전자를 이용하면, 보다 다양한 크기와 서열을 갖는 형광단백질을 생산할 수 있다. 녹색형광단백질 유전자를 대상으로 형광을 띠는데 중요한 역할을 하거나 또는 단백질 구조를 이루는데 기여하는 부위의 두 군데 이상의 부위에 변이를 가하여 결함유전자를 작제하였다. 구체적으로, 베타-스트랜드 부위의 염기를 결실시켜 전기 작제한 결함유전자 GFP▽176(+2)에서 루프(loop) 부위에 해당하는 129번째에서 138번째까지의 아미노산을 암호화하는 염기를 추가로 결실시켜, 신규한 결함유전자인 GFP▽129-138/176(+2)를 작제하고, 전기 실시예 1과 같이 DNaseI으로 절단하여 50-150bp의 단편만을 추출하였다. 그런 다음, 전기 추출된 결함유전자의 단편과 대장균의 유전체 DNA 단편을 혼합하여 PCR로 재조합하고, 증폭한 후, 플라스미드에 클로닝하고, 대장균에 형질전환시켜 녹색 형광을 띠는 클론을 선별하였다.
실시예 4: 다양한 크기와 서열을 갖는 다이하이드로오로타아제 (dihydroorotase) 활성을 가지는 단백질의 생산
히단토이나아제(hydantoinase), 알란토이나아제(allantoinase), 다이하이드로피리미디나아제(dihydropyrimidinase) 등과 함께 싸이클릭 아미도하이드롤라아제 군(cyclic amidohydrolase family)에 속하며, 생체내 퓨린(purine) 및 피리미딘(pyrimidine) 대사에 관련되어 있는 다이하이드로오로타아제의 결함유전자의 특정 부위에 제한효소로 처리된 유전체 DNA 단편을 삽입시킨 재조합 유전자를 발현시켜, 다양한 크기와 서열을 갖는 다이하이드로오로타아제 활성을 가지는 단백질을 생산하였다: 대장균 K12의 유도체에서 PCR을 통해 다이하이드로오로타아제의 유전자를 클로닝하였다. 그런 다음, 싸이클릭 아미도하이드롤라아제 군에 속하는 효소들의 유전자 상동성 및 단백질 구조를 분석하고, 213번째 염기부터 255번째까지의 염기 43개를 결실시켜 효소활성이 상실된 다이하이드로오로타아제의 결함유전자인 DHO▽68-70(+1)을 작제하였다. 작제한 결함유전자를 무작위로 절단하여 전기 실시예 1과 동일한 방법으로 대장균의 유전체 DNA 단편과 혼합하여 PCR을 통해 재조합하고, 증폭하여 플라스미드에 클로닝한 다음, 다이하이드로오로타아제가 결핍된 대장균 X7014a주에 형질전환시킨 미생물을 배양하여, 최소배지에서 생장하는 클론만을 선별하였다. 선별된 클론들의 다이하이드로오로타아제 활성을 확인하고, 염기서열을 분석을 통해 유전체 DNA 단편이 삽입된 부위를 결정하여, 다양한 아미노산 서열과 크기를 갖는 다이하이드로오로타아제 활성을 가지는 단백질을 생산하였다.
이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 모체 단백질과는 크기와 서열이 다른 단백질의 변이집단을 생산하는 방법, 결함유전자에 유전체 DNA 단편을 삽입시킨 재조합 유전자를 포함하는 플라스미드로 형질전환된 미생물, 전기 미생물로부터 발현된 단백질로부터 선별된 단백질 및 전기 미생물을 배양하여 단백질을 수득하는 단계를 포함하는 모체 단백질과는 크기와 서열이 다른 단백질을 생산하는 방법을 제공한다. 본 발명에 의하면, 결함유전자에 DNA 단편을 삽입시킨 재조합 유전자를 포함하는 플라스미드로 형질전환된 미생물 집단을 구축하고, 이로부터 발현된 단백질들로부터 기능이 회복되거나 특성이 변화된 단백질들을 선별하여 모체 단백질과는 크기와 서열이 다른 단백질의 변이집단을 효율적이고 간편하게 생산할수 있다. 본 발명에 의하여 생산된 단백질은 여러 가지 단백질 개량 기술에 의해 안정성, 활성, 기질 특이성 등을 개량시켜, 의약용 항원, 항체 등의 물질 개발 및 산업용 효소의 개량 등 생명공학 및 생물공학 분야에서 광범위하게 활용할 수 있다.

Claims (16)

  1. 다음의 각 단계를 포함하는 모체 단백질과는 크기와 서열이 다른 단백질의 변이집단을 생산하는 방법:
    (i) 모체 단백질의 유전자에 인위적인 변이를 가하여 기능이 파괴된 결함 유전자(defective template)를 작제하는 단계;
    (ii) 전기 결함유전자의 특정 부위에 무작위로 합성된 올리고뉴클레오티드 또는 제한효소로 처리된 유전체 DNA(genomic DNA) 단편을 삽입시킨 재 조합 유전자를 포함하는 플라스미드로 형질전환된 미생물 집단(libra ry)을 구축하는 단계; 및,
    (iii) 전기 미생물 집단으로부터 발현된 단백질로부터 기능이 회복(salva ge)되거나 특성이 변화된 단백질을 선별하는 단계.
  2. 제 1항에 있어서,
    인위적인 변이는 모체 단백질 유전자의 특정 부위에서 수 개의 아미노 산이나 도메인(domain)을 암호화하는 염기를 결실시키거나, 프레임 이 동(frame shift)을 유발하거나, 또는 전기 두가지를 병행하여 수행되 는 것을 특징으로 하는
    모체 단백질과는 크기와 서열이 다른 단백질의 변이집단을 생산하는 방법.
  3. 제 1항에 있어서,
    결함유전자의 특정 부위에 무작위로 합성된 올리고뉴클레오티드 또는 제한효소로 처리된 유전체 DNA 단편을 삽입시키는 단계는 PCR에 의한 재조합 방법으로 수행되는 것을 특징으로 하는
    모체 단백질과는 크기와 서열이 다른 단백질의 변이집단을 생산하는 방법.
  4. 제 1항에 있어서,
    결함유전자의 특정 부위에 무작위로 합성된 올리고뉴클레오티드 또는 제한효소로 처리된 유전체 DNA 단편을 삽입시키는 단계는 리가아제 (ligase)를 이용하는 직접 접합에 의한 재조합 방법으로 수행되는 것 을 특징으로 하는
    모체 단백질과는 크기와 서열이 다른 단백질의 변이집단을 생산하는 방법.
  5. GFPuv의 결함유전자인 GFP∇176(+2)의 BamH1 인식부위에 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7의 아미노산 서열을 암호화하는 대장균의 유전체 DNA 단편을 삽입시킨 재조합 유전자를 포함하는 플라스미드로 형질전환된 미생물.
  6. 삭제
  7. 제 5항에 있어서,
    미생물은 GFPuv의 결함유전자인 GFP∇176(+2)의 BamHI 인식부위에 서 열번호 4의 아미노산 서열을 암호화하는 대장균의 유전체 DNA 단편을 삽입시킨 재조합 유전자를 포함하는 플라스미드로 형질전환된 미생물Escherichia coliJM109/pMAL-c2/gfpS22(KCTC 10059BP)인 것을 특징으 로 하는
    미생물.
  8. 제 5항의 미생물로부터 발현된 단백질로부터 선별된 형광단백질.
  9. GFPuv의 결함유전자인 GFP∇172-3/176(+2)의 BamH1 인식부위에 서열번호 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 또는 17의 아미노산 서열을 암호화하는 대장균의 유전체 DNA 단편을 삽입시킨 재조합 유전자를 포함하는 플라스미드로 형질전환된 미생물.
  10. 삭제
  11. 제 9항에 있어서,
    미생물은 GFPuv의 결함유전자인 GFP∇172-3/176(+2)의 BamHI 인식부위 에 서열번호 8의 아미노산 서열을 암호화하는 대장균의 유전체 DNA 단 편을 삽입시킨 재조합 유전자를 포함하는 플라스미드로 형질전환된 미 생물Escherichia coliJM109/pMAL-c2/gfpI5(KCTC 10058BP)인 것을 특 징으로 하는
    미생물.
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 제 7항의Escherichia coliJM109/pMAL-c2/gfpS22(KCTC 10059BP)를 배양하여 단백질을 수득하는 단계를 포함하는 모체 단백질과는 크기와 서열이 다른 단백질을 생산하는 방법.
  16. 제 11항의Escherichia coliJM109/pMAL-c2/gfpI5(KCTC 10058BP)를 배양하여 단백질을 수득하는 단계를 포함하는 모체 단백질과는 크기와 서열이 다른 단백질을 생산하는 방법.
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