JP2002517995A - 所望の特性を有するポリヌクレオチドを生成するための方法 - Google Patents
所望の特性を有するポリヌクレオチドを生成するための方法Info
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Abstract
(57)【要約】
本発明は、選択可能であるかまたはスクリーニングされ得る所望の特性（例えば、所望の表現型を付与する、および／または所望の特性を有するポリペプチドをコードする）を有するポリヌクレオチドの生成のための方法を提供する。この方法は、集団中のＤＮＡセグメント中のランダムな部位において、挿入および／または欠失を作製する工程を包含する。いくつかの実施態様において、ランダムな挿入および欠失は、再帰的に作製され得る。
Description
【０００１】 （発明の分野） 本発明は、所望の表現型を付与し、かつ／または選択可能であるかもしくはス
クリーニングされ得る有利な予め決定された特性を有するポリペプチドをコード
する、ポリヌクレオチドの生成のための方法に関する。
クリーニングされ得る有利な予め決定された特性を有するポリペプチドをコード
する、ポリヌクレオチドの生成のための方法に関する。
【０００２】 （発明の背景） 新規な遺伝子およびタンパク質を生成するための伝統的な分子生物学的方法は
、一般に、合理的変異または特異的変異を伴った。ある例は、公知の制限部位を
使用して、２つの特徴付けられたタンパク質からの機能的ドメインを組み合わせ
ることによる、融合タンパク質またはキメラタンパク質をコードするポリヌクレ
オチドの生成である。別の例は、ポリペプチドの特定の部位での点変異の導入で
ある。有用であるが、これらおよび類似の方法の能力は、変異誘発を容易にする
配列または制限マップ情報の必要性、および効率的に生成され得る改変体の数が
制限されることにより、限定される。
、一般に、合理的変異または特異的変異を伴った。ある例は、公知の制限部位を
使用して、２つの特徴付けられたタンパク質からの機能的ドメインを組み合わせ
ることによる、融合タンパク質またはキメラタンパク質をコードするポリヌクレ
オチドの生成である。別の例は、ポリペプチドの特定の部位での点変異の導入で
ある。有用であるが、これらおよび類似の方法の能力は、変異誘発を容易にする
配列または制限マップ情報の必要性、および効率的に生成され得る改変体の数が
制限されることにより、限定される。
【０００３】 改変体の生成に対する別のアプローチは、「ＤＮＡシャッフリング」のような
ランダムな組換え技術を使用する（Ｐａｔｔｅｎら、１９９７、Ｃｕｒｒ．Ｏｐ
ｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１８：７２４−７３３）。ＤＮＡシャッフリングは、反
復サイクルの組換えおよびスクリーニングもしくは選択を実行して、個々の遺伝
子、全プラスミドもしくはウイルス、多重遺伝子クラスター、または全ゲノムを
「進化」させることを伴う。このような技術は、大規模な分析、およびポリヌク
レオチドおよびポリペプチドを操作するための従来の方法に必要とされる計算を
必要としない。さらに、ＤＮＡシャッフリングは、従来の２つ１組の（ｐａｉｒ
ｗｉｓｅ）組換え事象と対照的に、最小数の選択サイクルで、多数の変異の組換
えを可能にする。従って、ＤＮＡシャッフリング技術は、変異の間の組換えをこ
れらのいずれかまたは全てに提供し、それにより、変異の異なる組み合わせが所
望の結果に影響し得る様式を探索する非常に迅速な方法を提供することが利点で
ある。
ランダムな組換え技術を使用する（Ｐａｔｔｅｎら、１９９７、Ｃｕｒｒ．Ｏｐ
ｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１８：７２４−７３３）。ＤＮＡシャッフリングは、反
復サイクルの組換えおよびスクリーニングもしくは選択を実行して、個々の遺伝
子、全プラスミドもしくはウイルス、多重遺伝子クラスター、または全ゲノムを
「進化」させることを伴う。このような技術は、大規模な分析、およびポリヌク
レオチドおよびポリペプチドを操作するための従来の方法に必要とされる計算を
必要としない。さらに、ＤＮＡシャッフリングは、従来の２つ１組の（ｐａｉｒ
ｗｉｓｅ）組換え事象と対照的に、最小数の選択サイクルで、多数の変異の組換
えを可能にする。従って、ＤＮＡシャッフリング技術は、変異の間の組換えをこ
れらのいずれかまたは全てに提供し、それにより、変異の異なる組み合わせが所
望の結果に影響し得る様式を探索する非常に迅速な方法を提供することが利点で
ある。
【０００４】 本発明は、単独、またはＤＮＡシャッフリングのようなランダムな組換え技術
と組み合わせて使用されて、所望の特性または特性の組み合わせを有するか、ま
たはこれらを有するポリペプチドをコードする新規なポリヌクレオチドを生成し
得る方法を提供する。
と組み合わせて使用されて、所望の特性または特性の組み合わせを有するか、ま
たはこれらを有するポリペプチドをコードする新規なポリヌクレオチドを生成し
得る方法を提供する。
【０００５】 （発明の要旨） １つの局面において、本発明は、所望の特性または特性の組み合わせを有する
ＤＮＡセグメントを、基質集団を変異させることによって生成する方法を提供す
る。この方法は以下を包含する： ａ）複数のＤＮＡセグメントを含む基質集団を、以下： ｉ）セグメント中のランダムな部位で挿入を作製する（ランダムな挿入）、 ｉｉ）セグメント中のランダムな部位で欠失を作製する（ランダムな欠失）
、 またはその両方を作製して変異ＤＮＡセグメントを含む変異集団を生成すること
により、変異させる工程、 ｂ）この変異集団をスクリーニングして、第２の所望の特性を有する少なくと
も１つのＤＮＡセグメントを含む第１の選択された集団を得る工程、 ｃ）ランダムな挿入、ランダムな欠失、またはその両方を作製して、再帰的に
変異させた集団を作製することにより、この第１の選択された集団を変異させる
工程、ならびに、 ｄ）この再帰的に変異させた集団をスクリーニングして、第２の所望の特性を
有する少なくとも１つのＤＮＡセグメントを含む再帰的に選択された集団を得る
工程。
ＤＮＡセグメントを、基質集団を変異させることによって生成する方法を提供す
る。この方法は以下を包含する： ａ）複数のＤＮＡセグメントを含む基質集団を、以下： ｉ）セグメント中のランダムな部位で挿入を作製する（ランダムな挿入）、 ｉｉ）セグメント中のランダムな部位で欠失を作製する（ランダムな欠失）
、 またはその両方を作製して変異ＤＮＡセグメントを含む変異集団を生成すること
により、変異させる工程、 ｂ）この変異集団をスクリーニングして、第２の所望の特性を有する少なくと
も１つのＤＮＡセグメントを含む第１の選択された集団を得る工程、 ｃ）ランダムな挿入、ランダムな欠失、またはその両方を作製して、再帰的に
変異させた集団を作製することにより、この第１の選択された集団を変異させる
工程、ならびに、 ｄ）この再帰的に変異させた集団をスクリーニングして、第２の所望の特性を
有する少なくとも１つのＤＮＡセグメントを含む再帰的に選択された集団を得る
工程。
【０００６】 いくつかの実施態様において、この方法はさらに、工程（ｄ）の後に、少なく
ともさらに１サイクルの変異およびスクリーニング（例えば、再帰的に選択され
た集団を変異させ、そして得られた再帰的に変異させた集団をスクリーニングし
て、所望の特性を有する新たな再帰的に選択された集団を得ること）を含む。い
くつかの実施態様において、再帰的に選択された集団内での１つのポリヌクレオ
チドまたはポリヌクレオチドの組み合わせのシャッフリングが行われる。
ともさらに１サイクルの変異およびスクリーニング（例えば、再帰的に選択され
た集団を変異させ、そして得られた再帰的に変異させた集団をスクリーニングし
て、所望の特性を有する新たな再帰的に選択された集団を得ること）を含む。い
くつかの実施態様において、再帰的に選択された集団内での１つのポリヌクレオ
チドまたはポリヌクレオチドの組み合わせのシャッフリングが行われる。
【０００７】 様々な実施態様において、第２の所望の特性は、第１の所望の特性と同じであ
り得るかまたは異なり得、そしてこれは特性の組み合わせであり得る。いくつか
の実施態様において、再帰的に選択された集団内のポリヌクレオチドは、第１の
選択された集団内のポリヌクレオチドと比較した場合に増強される特性を有する
。いくつかの実施態様において、基質集団は、ポリペプチド、触媒ＲＮＡ、プロ
モーター配列またはベクターをコードするＤＮＡセグメントを含む。いくつかの
実施態様において、基質集団は均一である。いくつかの実施態様において、ポリ
ペプチドをコードするポリヌクレオチドは、酵素活性、基質特異性、またはポリ
ペプチドの結合活性のような活性についてスクリーニングされる。
り得るかまたは異なり得、そしてこれは特性の組み合わせであり得る。いくつか
の実施態様において、再帰的に選択された集団内のポリヌクレオチドは、第１の
選択された集団内のポリヌクレオチドと比較した場合に増強される特性を有する
。いくつかの実施態様において、基質集団は、ポリペプチド、触媒ＲＮＡ、プロ
モーター配列またはベクターをコードするＤＮＡセグメントを含む。いくつかの
実施態様において、基質集団は均一である。いくつかの実施態様において、ポリ
ペプチドをコードするポリヌクレオチドは、酵素活性、基質特異性、またはポリ
ペプチドの結合活性のような活性についてスクリーニングされる。
【０００８】 別の局面において、本発明は、所望の特性を有するＤＮＡセグメントを生成す
る方法を提供し、この方法は、以下による： ａ）複数のＤＮＡセグメントを含む第１の基質集団を、以下： ｉ）セグメント中のランダムな部位で挿入を作製する（ランダムな挿入）、 ｉｉ）セグメント中のランダムな部位で欠失を作製する（ランダムな欠失）
、 またはその両方を作製して変異ＤＮＡセグメントの第１の変異集団を生成するこ
とにより、変異させる工程； ｂ）複数のＤＮＡセグメントを含む第２の基質集団を、以下： ｉ）セグメント中のランダムな部位で挿入を作製する、 ｉｉ）セグメント中のランダムな部位で欠失を作製する、 またはその両方を作製して変異ＤＮＡセグメントの第２の変異集団を生成するこ
とにより、変異させる工程； ｃ）第１の基質集団と第２の基質集団とを組換えて、組換え集団を生成する工
程；ならびに、 ｄ）この組換え集団をスクリーニングして、所望の特性を有する少なくとも１
つのＤＮＡセグメントを同定する工程。
る方法を提供し、この方法は、以下による： ａ）複数のＤＮＡセグメントを含む第１の基質集団を、以下： ｉ）セグメント中のランダムな部位で挿入を作製する（ランダムな挿入）、 ｉｉ）セグメント中のランダムな部位で欠失を作製する（ランダムな欠失）
、 またはその両方を作製して変異ＤＮＡセグメントの第１の変異集団を生成するこ
とにより、変異させる工程； ｂ）複数のＤＮＡセグメントを含む第２の基質集団を、以下： ｉ）セグメント中のランダムな部位で挿入を作製する、 ｉｉ）セグメント中のランダムな部位で欠失を作製する、 またはその両方を作製して変異ＤＮＡセグメントの第２の変異集団を生成するこ
とにより、変異させる工程； ｃ）第１の基質集団と第２の基質集団とを組換えて、組換え集団を生成する工
程；ならびに、 ｄ）この組換え集団をスクリーニングして、所望の特性を有する少なくとも１
つのＤＮＡセグメントを同定する工程。
【０００９】 １つの実施態様において、第１および第２の変異集団がスクリーニングされて
、第１および第２の選択された集団（これらの各々は、所望の特性を有する）が
生成され、そして選択された集団が組換えられる。
、第１および第２の選択された集団（これらの各々は、所望の特性を有する）が
生成され、そして選択された集団が組換えられる。
【００１０】 様々な実施態様において、組換えは、シャッフリングまたは特異的組換えによ
って達成され得る。いくつかの実施態様において、第１の所望の特性および第２
の所望の特性は同じである。いくつかの実施態様において、基質集団は、ポリペ
プチド、触媒ＲＮＡ、プロモーター配列またはベクターをコードするＤＮＡセグ
メントを含む。いくつかの実施態様において、基質集団は均一である。いくつか
の実施態様において、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ポリペプ
チドの酵素活性、基質特異性、または結合活性のような活性についてスクリーニ
ングされる。
って達成され得る。いくつかの実施態様において、第１の所望の特性および第２
の所望の特性は同じである。いくつかの実施態様において、基質集団は、ポリペ
プチド、触媒ＲＮＡ、プロモーター配列またはベクターをコードするＤＮＡセグ
メントを含む。いくつかの実施態様において、基質集団は均一である。いくつか
の実施態様において、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ポリペプ
チドの酵素活性、基質特異性、または結合活性のような活性についてスクリーニ
ングされる。
【００１１】 別の局面において、本発明は、所望の特性を有するＤＮＡセグメントを生成す
る方法を提供し、この方法は以下による： ａ）複数のＤＮＡセグメントを含む基質集団を、以下 ｉ）セグメント中のランダムな部位で挿入を作製する、 ｉｉ）セグメント中のランダムな部位で欠失を作製する、 またはその両方を作製して変異ＤＮＡセグメントの変異集団を生成することによ
り、変異させる工程； ｂ）この変異集団をスクリーニングして、所望の特性を有する少なくとも１つ
のＤＮＡセグメントを含む選択された集団を得る工程； ｃ）少なくとも１つのＤＮＡセグメントを、この選択された集団についてシャ
ッフリングして、組換え集団を生成する工程； ｄ）この組換え集団を、所望の特性についてスクリーニングする工程。
る方法を提供し、この方法は以下による： ａ）複数のＤＮＡセグメントを含む基質集団を、以下 ｉ）セグメント中のランダムな部位で挿入を作製する、 ｉｉ）セグメント中のランダムな部位で欠失を作製する、 またはその両方を作製して変異ＤＮＡセグメントの変異集団を生成することによ
り、変異させる工程； ｂ）この変異集団をスクリーニングして、所望の特性を有する少なくとも１つ
のＤＮＡセグメントを含む選択された集団を得る工程； ｃ）少なくとも１つのＤＮＡセグメントを、この選択された集団についてシャ
ッフリングして、組換え集団を生成する工程； ｄ）この組換え集団を、所望の特性についてスクリーニングする工程。
【００１２】 １つの実施態様において、シャッフリングは、選択された集団からの少なくと
も１つのポリヌクレオチドの重複セグメントついて、あるセグメントが別のセグ
メントの伸長のためのテンプレートとして作用する条件下で、ポリヌクレオチド
増幅プロセスを行って、組換えポリヌクレオチドの集団を生成することを含む。
も１つのポリヌクレオチドの重複セグメントついて、あるセグメントが別のセグ
メントの伸長のためのテンプレートとして作用する条件下で、ポリヌクレオチド
増幅プロセスを行って、組換えポリヌクレオチドの集団を生成することを含む。
【００１３】 いくつかの実施態様において、基質集団は、ポリペプチド、触媒ＲＮＡ、プロ
モーター配列またはベクターをコードするＤＮＡセグメントを含む。いくつかの
実施態様において、この基質集団は均一である。いくつかの実施態様において、
ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ポリペプチドの酵素活性、基質
特異性、または結合活性のような活性についてスクリーニングされる。
モーター配列またはベクターをコードするＤＮＡセグメントを含む。いくつかの
実施態様において、この基質集団は均一である。いくつかの実施態様において、
ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ポリペプチドの酵素活性、基質
特異性、または結合活性のような活性についてスクリーニングされる。
【００１４】 （詳細な説明） （Ｉ．欠失） 以下の用語は、本発明の実施において、当業者にさらなる手引きを提供するた
めに定義される。
めに定義される。
【００１５】 本明細書中で使用される用語「シャッフリング」とは、実質的に相同であるが
、同一ではないポリヌクレオチド間のランダムな組換えのための技術をいう。様
々なシャッフリング方法が、以下に記載される：
、同一ではないポリヌクレオチド間のランダムな組換えのための技術をいう。様
々なシャッフリング方法が、以下に記載される：
【００１６】
【数１】 シャッフリング技術はまた、以下の米国特許および米国特許出願に記載される：
【００１７】
【数２】 前述の特許、特許出願、および刊行物の各々は、その全体において、および全て
の目的のために本明細書中で参考として援用される。シャッフリングの１つの方
法は、あるセグメントが別のセグメントの伸長のためのテンプレートそして作用
する条件下で、ポリヌクレオチドの改変体の集団の重複セグメントについてポリ
ヌクレオチド増幅プロセスを行い、組換えポリヌクレオチドの集団を生成する工
程、および組換えポリヌクレオチドまたはその発現産物を、所望の特性について
スクリーニングまたは選択する工程を包含する。シャッフリングのいくつかの方
法は、多様性の供給源としてランダムな点変異（代表的には、ＰＣＲ増幅工程に
おいて導入される）を使用する。
の目的のために本明細書中で参考として援用される。シャッフリングの１つの方
法は、あるセグメントが別のセグメントの伸長のためのテンプレートそして作用
する条件下で、ポリヌクレオチドの改変体の集団の重複セグメントについてポリ
ヌクレオチド増幅プロセスを行い、組換えポリヌクレオチドの集団を生成する工
程、および組換えポリヌクレオチドまたはその発現産物を、所望の特性について
スクリーニングまたは選択する工程を包含する。シャッフリングのいくつかの方
法は、多様性の供給源としてランダムな点変異（代表的には、ＰＣＲ増幅工程に
おいて導入される）を使用する。
【００１８】 本明細書中で使用される用語「オリゴヌクレオチド」とは、一般的に、約５０
塩基より短い（例えば、長さが、約６、９、１２、１５、１８、２１、２５、３
５または５０塩基）ポリヌクレオチドをいう。本明細書中で使用される用語「ポ
リヌクレオチド」とは、オリゴヌクレオチドおよびより長い分子（例えば、長さ
が、少なくとも約６０、１００、２００、３００、５００、１０００、５０００
、１０，０００塩基または塩基対、あるいはそれ以上）の両方をいう。本発明に
おいて使用されるオリゴおよびポリヌクレオチドは、通常、ＤＮＡ分子であり、
代表的には二本鎖である。
塩基より短い（例えば、長さが、約６、９、１２、１５、１８、２１、２５、３
５または５０塩基）ポリヌクレオチドをいう。本明細書中で使用される用語「ポ
リヌクレオチド」とは、オリゴヌクレオチドおよびより長い分子（例えば、長さ
が、少なくとも約６０、１００、２００、３００、５００、１０００、５０００
、１０，０００塩基または塩基対、あるいはそれ以上）の両方をいう。本発明に
おいて使用されるオリゴおよびポリヌクレオチドは、通常、ＤＮＡ分子であり、
代表的には二本鎖である。
【００１９】 本明細書中で使用される用語「特性」とは、スクリーニング系において選択さ
れ得るかまたは検出され得る、ポリヌクレオチド（または、例えば、コードされ
るポリペプチドもしくはＲＮＡ）の任意の特徴または性状をいい、これには、例
えば、ポリヌクレオチドまたはコードされたポリペプチドの酵素活性または結合
活性（例えば、新たな活性、あるいは既存の活性の増強されたレベルまたは減少
したレベル）、蛍光、特定のポリヌクレオチドを含む細胞に付与された特性、結
合活性（例えば、特定の標的分子（例えば、レセプター、リガンド、抗体もしく
は抗体フラグメント、抗原、エピトープ、または他の生物学的高分子）を結合す
るかまたはそれによって結合される特性）が挙げられる。この特性は、以下の性
状であり得る：転写を制御する配列（例えば、プロモーター強度（ｓｔｒｅｎｇ
ｔｈ）、調節）、ＲＮＡプロセシングに影響する配列（例えば、ＲＮＡ安定性ま
たはスプライシング）、翻訳に影響する配列（例えば、レベル、調節、翻訳後修
飾）、または遺伝子もしくは導入遺伝子の他の発現特性に影響する配列；複製エ
レメント、タンパク質結合エレメント；ベクター；コードタンパク質（例えば、
酵素活性および酵素特異性、結合活性および結合特異性、ｐＩ、変性に対する安
定性）、コードＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡまたは触媒ＲＮＡ）など。さらなる例
は、本明細書中または本明細書中に援用される参考文献において記載されるか、
あるいは、当業者にとっては、この開示を読めば、明らかである。
れ得るかまたは検出され得る、ポリヌクレオチド（または、例えば、コードされ
るポリペプチドもしくはＲＮＡ）の任意の特徴または性状をいい、これには、例
えば、ポリヌクレオチドまたはコードされたポリペプチドの酵素活性または結合
活性（例えば、新たな活性、あるいは既存の活性の増強されたレベルまたは減少
したレベル）、蛍光、特定のポリヌクレオチドを含む細胞に付与された特性、結
合活性（例えば、特定の標的分子（例えば、レセプター、リガンド、抗体もしく
は抗体フラグメント、抗原、エピトープ、または他の生物学的高分子）を結合す
るかまたはそれによって結合される特性）が挙げられる。この特性は、以下の性
状であり得る：転写を制御する配列（例えば、プロモーター強度（ｓｔｒｅｎｇ
ｔｈ）、調節）、ＲＮＡプロセシングに影響する配列（例えば、ＲＮＡ安定性ま
たはスプライシング）、翻訳に影響する配列（例えば、レベル、調節、翻訳後修
飾）、または遺伝子もしくは導入遺伝子の他の発現特性に影響する配列；複製エ
レメント、タンパク質結合エレメント；ベクター；コードタンパク質（例えば、
酵素活性および酵素特異性、結合活性および結合特異性、ｐＩ、変性に対する安
定性）、コードＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡまたは触媒ＲＮＡ）など。さらなる例
は、本明細書中または本明細書中に援用される参考文献において記載されるか、
あるいは、当業者にとっては、この開示を読めば、明らかである。
【００２０】 本明細書中で使用される用語「進化」とは、バリエーションを高分子の集団に
導入し、そして所望の特性の取得または所望の特性の部分的取得について選択ま
たはスクリーニングし、開始集団の分子とは異なる１つ以上の分子の生成をもた
らすプロセスをいう。
導入し、そして所望の特性の取得または所望の特性の部分的取得について選択ま
たはスクリーニングし、開始集団の分子とは異なる１つ以上の分子の生成をもた
らすプロセスをいう。
【００２１】 （ＩＩ．概要） 本発明は、所望の特性（例えば、選択可能であるか、またはスクリーニングさ
れ得る、有利な、予め決定された特性）を有するポリヌクレオチドの生成のため
の新規な方法を提供する。１つの局面において、本発明は、配列のランダムな挿
入または欠失および新規もしくは増強された特性を有する改変体の同定により、
ポリヌクレオチドの集団において多様性を生成するための方法を提供する。いく
つかの実施態様において、複数のサイクルの挿入／欠失およびスクリーニングが
行われる。いくつかの実施態様において、改変体の特性は、１つ以上の種々の方
法によって進化させられる。
れ得る、有利な、予め決定された特性）を有するポリヌクレオチドの生成のため
の新規な方法を提供する。１つの局面において、本発明は、配列のランダムな挿
入または欠失および新規もしくは増強された特性を有する改変体の同定により、
ポリヌクレオチドの集団において多様性を生成するための方法を提供する。いく
つかの実施態様において、複数のサイクルの挿入／欠失およびスクリーニングが
行われる。いくつかの実施態様において、改変体の特性は、１つ以上の種々の方
法によって進化させられる。
【００２２】 代表的には、変異ポリヌクレオチドは、二本鎖ＤＮＡセグメントである。適切
なＤＮＡセグメントの例としては、遺伝子、遺伝子フラグメント、遺伝子のグル
ープ、ベクター、ポリペプチドコード配列、発現調節配列（例えば、プロモータ
ー、エンハンサー）などを含むＤＮＡが挙げられる。
なＤＮＡセグメントの例としては、遺伝子、遺伝子フラグメント、遺伝子のグル
ープ、ベクター、ポリペプチドコード配列、発現調節配列（例えば、プロモータ
ー、エンハンサー）などを含むＤＮＡが挙げられる。
【００２３】 本発明の１つの実施態様において、ポリヌクレオチドの集団（すなわち、基質
集団）は、ランダムな挿入または欠失によって変異され、そして得られる変異集
団がスクリーニングされて、所望の特性を有する種の部分集団（ｓｕｂｐｏｐｕ
ｌａｔｉｏｎ）（すなわち、選択された集団）が同定される。次いで、選択され
た集団は、ランダムな挿入または欠失によってそれ自体が変異され、そして得ら
れる２回変異された集団は、再度、スクリーニングに供されて、新たに選択され
た集団が生成される。第２回目のスクリーニングは、先の回においてスクリーニ
ングされるのと同じもしくは類似の特性についてであり得るか、または全体的に
異なる特性についてであり得る。例えば、ベクターの基質集団が変位される場合
、第１のスクリーニングは、基質集団において見出されないクロラムフェニコー
ル耐性を付与する配列を取得した種についてであり得、そして第２のスクリーニ
ングは、増大したクロラムフェニコール耐性（同じもしくは類似の特性）につい
てであり得るか、あるいは、テトラサイクリン耐性（異なる特性）を付与する配
列の取得のための続く回の変異およびスクリーニングであり得る。変異または選
択のプロセスは、所望であれば、複数のサイクルについて行われて、特定の所望
の特性または特性の組み合わせを有する１つ以上の新規なＤＮＡセグメントが生
成され得る。例えば、いくつかの実施態様において、少なくとも２、５または１
０サイクルのランダムな挿入／欠失およびスクリーニングが行われる。２回以上
のサイクルの変異および選択の後、所望の特性（単数または複数）（例えば、ポ
リヌクレオチドの開始集団では見出されない活性）を有する少なくとも１つのポ
リヌクレオチド種は、部分集団から単離される。このプロセスは、一般的には、
図１に略述される；しかし、この図は単に、読者を補助するために示され、本発
明をいかなる方法においても限定することは意図されない。
集団）は、ランダムな挿入または欠失によって変異され、そして得られる変異集
団がスクリーニングされて、所望の特性を有する種の部分集団（ｓｕｂｐｏｐｕ
ｌａｔｉｏｎ）（すなわち、選択された集団）が同定される。次いで、選択され
た集団は、ランダムな挿入または欠失によってそれ自体が変異され、そして得ら
れる２回変異された集団は、再度、スクリーニングに供されて、新たに選択され
た集団が生成される。第２回目のスクリーニングは、先の回においてスクリーニ
ングされるのと同じもしくは類似の特性についてであり得るか、または全体的に
異なる特性についてであり得る。例えば、ベクターの基質集団が変位される場合
、第１のスクリーニングは、基質集団において見出されないクロラムフェニコー
ル耐性を付与する配列を取得した種についてであり得、そして第２のスクリーニ
ングは、増大したクロラムフェニコール耐性（同じもしくは類似の特性）につい
てであり得るか、あるいは、テトラサイクリン耐性（異なる特性）を付与する配
列の取得のための続く回の変異およびスクリーニングであり得る。変異または選
択のプロセスは、所望であれば、複数のサイクルについて行われて、特定の所望
の特性または特性の組み合わせを有する１つ以上の新規なＤＮＡセグメントが生
成され得る。例えば、いくつかの実施態様において、少なくとも２、５または１
０サイクルのランダムな挿入／欠失およびスクリーニングが行われる。２回以上
のサイクルの変異および選択の後、所望の特性（単数または複数）（例えば、ポ
リヌクレオチドの開始集団では見出されない活性）を有する少なくとも１つのポ
リヌクレオチド種は、部分集団から単離される。このプロセスは、一般的には、
図１に略述される；しかし、この図は単に、読者を補助するために示され、本発
明をいかなる方法においても限定することは意図されない。
【００２４】 別の実施態様において、２つ以上の異なる基質集団は、ランダムな挿入または
欠失によって変異され、対応する変異集団を生成する。多くの実施態様において
、２つ以上の変異集団は、特定の所望の特性についてスクリーニングされる（例
えば、各々の変異集団が、異なる特性についてスクリーニングされる）。２つ以
上の変異集団の生成後（または、行われる場合には、スクリーニングの後）、こ
の変異集団の各々からのポリヌクレオチドセグメントは組換えられて、単一の組
換え集団が生成される。この組換えは、ＤＮＡシャッフリングによって、あるい
は、ポリヌクレオチドのある集団がポリヌクレオチド第２の集団の特定の部位（
例えば、制限部位）にクローニングされる「古典的な」分子クローニング技術を
用いて行われ得る。「古典的な」技術としては、以下が上げられる：（ｉ）ＤＮ
Ａ分子の２つの集団の制限、および集団の１つからのフラグメントの第２の集団
のＤＮＡにおける制限部位への連結、（ｉｉ）あるポリヌクレオチド集団の領域
の（例えば、ＰＣＲまたは逆ＰＣＲによる）増幅、および第２の集団のポリヌク
レオチドへの連結、ならびに（ｉｉｉ）当該分野で公知の他の方法。次いで、組
換えられた集団は、所望の特性（単数または複数）についてスクリーニングされ
る。いくつかの実施態様において、続くサイクルのランダムな挿入／欠失または
組換えおよびスクリーニングが行われる。このプロセスは、図２に略述される；
図１と同様に、この図は、本発明を限定することは意図されない。
欠失によって変異され、対応する変異集団を生成する。多くの実施態様において
、２つ以上の変異集団は、特定の所望の特性についてスクリーニングされる（例
えば、各々の変異集団が、異なる特性についてスクリーニングされる）。２つ以
上の変異集団の生成後（または、行われる場合には、スクリーニングの後）、こ
の変異集団の各々からのポリヌクレオチドセグメントは組換えられて、単一の組
換え集団が生成される。この組換えは、ＤＮＡシャッフリングによって、あるい
は、ポリヌクレオチドのある集団がポリヌクレオチド第２の集団の特定の部位（
例えば、制限部位）にクローニングされる「古典的な」分子クローニング技術を
用いて行われ得る。「古典的な」技術としては、以下が上げられる：（ｉ）ＤＮ
Ａ分子の２つの集団の制限、および集団の１つからのフラグメントの第２の集団
のＤＮＡにおける制限部位への連結、（ｉｉ）あるポリヌクレオチド集団の領域
の（例えば、ＰＣＲまたは逆ＰＣＲによる）増幅、および第２の集団のポリヌク
レオチドへの連結、ならびに（ｉｉｉ）当該分野で公知の他の方法。次いで、組
換えられた集団は、所望の特性（単数または複数）についてスクリーニングされ
る。いくつかの実施態様において、続くサイクルのランダムな挿入／欠失または
組換えおよびスクリーニングが行われる。このプロセスは、図２に略述される；
図１と同様に、この図は、本発明を限定することは意図されない。
【００２５】 第３の実施態様において、ポリヌクレオチドの基質集団は、ランダムな挿入ま
たは変異によって変異され、得られる変異集団はスクリーニングされて、所望の
特性を有する種（例えば、「選択された集団」）が同定される。次いで、選択さ
れた集団（または、そこから単離された種（単数または複数）は、ランダムな組
換え（点変異と組み合わせたランダムな組換えを含む）によって進化させられる
。この組換えは、再帰的または単回のサイクルのランダムな組換えであり得る。
このプロセスは、図３に略述される；この図もまた、本発明を限定することは意
図されない。
たは変異によって変異され、得られる変異集団はスクリーニングされて、所望の
特性を有する種（例えば、「選択された集団」）が同定される。次いで、選択さ
れた集団（または、そこから単離された種（単数または複数）は、ランダムな組
換え（点変異と組み合わせたランダムな組換えを含む）によって進化させられる
。この組換えは、再帰的または単回のサイクルのランダムな組換えであり得る。
このプロセスは、図３に略述される；この図もまた、本発明を限定することは意
図されない。
【００２６】 ここで、本発明は、より詳細に記載される。
【００２７】 （ＩＩＩ．基質集団の変異） （ａ．概説） 本発明の方法の開始工程は、ポリヌクレオチドの集団中のランダムな部位での
挿入または欠失の導入である。変異および欠失は、時にひとまとめにして、本明
細書中で「変異」と呼ばれる。便宜上、変異が導入されるポリヌクレオチドの集
団は、「基質集団」と呼ばれ得る。
挿入または欠失の導入である。変異および欠失は、時にひとまとめにして、本明
細書中で「変異」と呼ばれる。便宜上、変異が導入されるポリヌクレオチドの集
団は、「基質集団」と呼ばれ得る。
【００２８】 本方法は、挿入または欠失によりランダムな様式で変異され得る任意のポリヌ
クレオチドに対して実行され得るが、上述のように、このポリヌクレオチドは、
最も頻繁にはＤＮＡ分子（ｃＤＮＡを含む）、通常は二本鎖ＤＮＡ分子である。
この基質集団を構成するＤＮＡ分子は、いくつかの型のいずれでもあり得る。こ
れらの型には、以下が挙げられる：ポリペプチドコード配列を含むＤＮＡ分子（
例えば、タンパク質、複数のタンパク質、または１つのタンパク質の一部をコー
ドする）、調節ＤＮＡ（例えば、プロモーター、エンハンサー）、ベクター（例
えば、発現ベクター）、およびウイルス（例えば、弱毒化ビリオンを生成するた
め）。これらのＤＮＡ分子は、時にはまた、「ＤＮＡセグメント」とも呼ばれる
。
クレオチドに対して実行され得るが、上述のように、このポリヌクレオチドは、
最も頻繁にはＤＮＡ分子（ｃＤＮＡを含む）、通常は二本鎖ＤＮＡ分子である。
この基質集団を構成するＤＮＡ分子は、いくつかの型のいずれでもあり得る。こ
れらの型には、以下が挙げられる：ポリペプチドコード配列を含むＤＮＡ分子（
例えば、タンパク質、複数のタンパク質、または１つのタンパク質の一部をコー
ドする）、調節ＤＮＡ（例えば、プロモーター、エンハンサー）、ベクター（例
えば、発現ベクター）、およびウイルス（例えば、弱毒化ビリオンを生成するた
め）。これらのＤＮＡ分子は、時にはまた、「ＤＮＡセグメント」とも呼ばれる
。
【００２９】 この基質集団は、複数のＤＮＡセグメント、代表的には少なくとも１０2、よ
り頻繁には１０4、または少なくとも１０6のＤＮＡセグメントを含む。多くの実
施態様において、任意の特定の基質集団中のＤＮＡセグメントが互いに同一であ
り、単一の親ＤＮＡに由来している（例えば、同一の細菌培養物から調製された
プラスミドＤＮＡ）。このような集団は、「均質な」基質集団である。しかし、
いくつかの実施態様において、この基質集団は、以下のような同一でないＤＮＡ
セグメントを含む：点変異により互いに異なるＤＮＡセグメント（例えば、誤り
がちな（ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ）ＰＣＲを使用して鋳型から生成された分子）
または他の変異（例えば、挿入または欠失）により互いに異なるＤＮＡセグメン
ト；異なる生物由来の相同体として関連するＤＮＡセグメント；ならびにＤＮＡ
シャッフリング反応の生成物であるので互いに関連するＤＮＡセグメント（例え
ば、Ｐａｔｔｅｎら、１９９７、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．８：７
２４を参照のこと）。関連する実施態様において、この基質集団は、関連しない
配列を有するＤＮＡセグメントを含み（例えば、いくつかの異なるプラスミドベ
クターを含む基質集団）、通常は、複数の（例えば、少なくとも１０2または１
０6）各種が存在する。
り頻繁には１０4、または少なくとも１０6のＤＮＡセグメントを含む。多くの実
施態様において、任意の特定の基質集団中のＤＮＡセグメントが互いに同一であ
り、単一の親ＤＮＡに由来している（例えば、同一の細菌培養物から調製された
プラスミドＤＮＡ）。このような集団は、「均質な」基質集団である。しかし、
いくつかの実施態様において、この基質集団は、以下のような同一でないＤＮＡ
セグメントを含む：点変異により互いに異なるＤＮＡセグメント（例えば、誤り
がちな（ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ）ＰＣＲを使用して鋳型から生成された分子）
または他の変異（例えば、挿入または欠失）により互いに異なるＤＮＡセグメン
ト；異なる生物由来の相同体として関連するＤＮＡセグメント；ならびにＤＮＡ
シャッフリング反応の生成物であるので互いに関連するＤＮＡセグメント（例え
ば、Ｐａｔｔｅｎら、１９９７、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．８：７
２４を参照のこと）。関連する実施態様において、この基質集団は、関連しない
配列を有するＤＮＡセグメントを含み（例えば、いくつかの異なるプラスミドベ
クターを含む基質集団）、通常は、複数の（例えば、少なくとも１０2または１
０6）各種が存在する。
【００３０】 変異（挿入または欠失、あるいは両方）が、この基質集団中のＤＮＡセグメン
トに導入される。便宜上、変異されたポリヌクレオチドの集団は、「変異集団」
と呼ばれ得る。本発明の重要な局面は、この変異が、このＤＮＡセグメントにお
いてランダムな部位に導入されることである。「ランダムな」とは、この文脈に
おいては、その通常の意味を有し、そして以下である挿入および欠失をいう：（
ｉ）標的ポリヌクレオチドの所定の部位で作製されない、そして（ｉｉ）多くの
異なる挿入部位または欠失部位が示されるポリヌクレオチドの集団（例えば、変
異集団）を生じる（すなわち、この変異集団中の異なる種が、異なる部位で挿入
または欠失を含む）。本発明において使用されるランダム変異とは対照的に、変
異が集団中のポリヌクレオチドの所定の部位で作製される場合（例えば、集団の
ＤＡＮセグメント中の特定の制限部位へのカセットの挿入、すなわち、部位特異
的変異誘発）、変異は「指向されている」。
トに導入される。便宜上、変異されたポリヌクレオチドの集団は、「変異集団」
と呼ばれ得る。本発明の重要な局面は、この変異が、このＤＮＡセグメントにお
いてランダムな部位に導入されることである。「ランダムな」とは、この文脈に
おいては、その通常の意味を有し、そして以下である挿入および欠失をいう：（
ｉ）標的ポリヌクレオチドの所定の部位で作製されない、そして（ｉｉ）多くの
異なる挿入部位または欠失部位が示されるポリヌクレオチドの集団（例えば、変
異集団）を生じる（すなわち、この変異集団中の異なる種が、異なる部位で挿入
または欠失を含む）。本発明において使用されるランダム変異とは対照的に、変
異が集団中のポリヌクレオチドの所定の部位で作製される場合（例えば、集団の
ＤＡＮセグメント中の特定の制限部位へのカセットの挿入、すなわち、部位特異
的変異誘発）、変異は「指向されている」。
【００３１】 当該分野では、ポリヌクレオチド中にランダムな挿入および／または欠失を作
製するための種々のインビトロ法およびインビボ法が公知である。本発明が挿入
または欠失を作製するためのいかなる特定の方法にも制限されないことが理解さ
れるが、これらの方法の例示的例が以下に提供される。
製するための種々のインビトロ法およびインビボ法が公知である。本発明が挿入
または欠失を作製するためのいかなる特定の方法にも制限されないことが理解さ
れるが、これらの方法の例示的例が以下に提供される。
【００３２】 通常、インビトロで変異されるＤＮＡセグメントは、細胞から単離された閉環
状分子（例えば、プラスミド、環状バクテリオファージ、および特定のベクター
）であるか、あるいはインビトロで環状化され得る。任意の環状化の方法が使用
され得る。例えば、線状バクテリオファージ、真核生物ウイルス、ＰＣＲ生成物
および他の線状分子が、ＤＮＡリガーゼまたはその等価物を用いる処理によって
環状化され得る。いくつかの実施態様において、この連結反応を低濃度の基質分
子で実行して、コンカテマー化を回避するか、または減少させることが望ましい
。特定の実施態様において、後のランダムな線状化工程（下記）においてヌクレ
アーゼ活性を１分子あたり１つの切断事象に制限するために、スーパーコイル化
環状ＤＮＡが使用される。閉環状分子は、トポイソメラーゼＩＩを用いる処理に
よってスーパーコイル化され得る（Ｇｅｌｌｅｒｔら、１９７６、Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７３：３８７２〜３８７６）。
状分子（例えば、プラスミド、環状バクテリオファージ、および特定のベクター
）であるか、あるいはインビトロで環状化され得る。任意の環状化の方法が使用
され得る。例えば、線状バクテリオファージ、真核生物ウイルス、ＰＣＲ生成物
および他の線状分子が、ＤＮＡリガーゼまたはその等価物を用いる処理によって
環状化され得る。いくつかの実施態様において、この連結反応を低濃度の基質分
子で実行して、コンカテマー化を回避するか、または減少させることが望ましい
。特定の実施態様において、後のランダムな線状化工程（下記）においてヌクレ
アーゼ活性を１分子あたり１つの切断事象に制限するために、スーパーコイル化
環状ＤＮＡが使用される。閉環状分子は、トポイソメラーゼＩＩを用いる処理に
よってスーパーコイル化され得る（Ｇｅｌｌｅｒｔら、１９７６、Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７３：３８７２〜３８７６）。
【００３３】 ランダム変異の１つの方法において、閉環状分子が、単一部位で、ランダムに
切断される。環状ポリヌクレオチドは、一度切断された場合に「線状化」される
（「フラグメント化」されたポリヌクレオチドとは対照的に）。ランダムな線状
化のための方法は公知であり、そして以下を使用する二本鎖ＤＮＡの限定加水分
解を含む：二本鎖切断ヌクレアーゼ（例えば、ＤＮＡａｓｅ Ｉ）、または二本
鎖ＤＮＡニック化酵素（例えば、臭化エチジウムの存在下でのＤＮＡａｓｅ Ｉ
、トポイソメラーゼ変異体）と一本鎖特異的ヌクレアーゼ（例えば、Ｓ１ヌクレ
アーゼ、Ｐ１ヌクレアーゼ、ダイズヌクレアーゼ）との組合せ。例えば、Ｙｏｋ
ｏｃｈｉら、１９９６、Ｇｅｎｅｓ Ｃｅｌｌｓ １：１０６９〜１０７５；Ｃ
ｈａｕｄｒｙら、１９９５、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２３：８０５〜
８０９を参照のこと。あるいは、「擬似ランダムな」線状化が、切断が１分子あ
たり約１回生じる条件下で、比較的非特異的な制限エンドヌクレアーゼ（例えば
、共通の４塩基配列を認識するもの）を使用して実行され得る。必要な場合、挿
入または欠失の前に、突出末端は、（例えば、ポリメラーゼおよびｄＮＴＰを使
用して）充填することによって、および／またはエキソヌクレアーゼでの処理に
よって、平滑化され得る。
切断される。環状ポリヌクレオチドは、一度切断された場合に「線状化」される
（「フラグメント化」されたポリヌクレオチドとは対照的に）。ランダムな線状
化のための方法は公知であり、そして以下を使用する二本鎖ＤＮＡの限定加水分
解を含む：二本鎖切断ヌクレアーゼ（例えば、ＤＮＡａｓｅ Ｉ）、または二本
鎖ＤＮＡニック化酵素（例えば、臭化エチジウムの存在下でのＤＮＡａｓｅ Ｉ
、トポイソメラーゼ変異体）と一本鎖特異的ヌクレアーゼ（例えば、Ｓ１ヌクレ
アーゼ、Ｐ１ヌクレアーゼ、ダイズヌクレアーゼ）との組合せ。例えば、Ｙｏｋ
ｏｃｈｉら、１９９６、Ｇｅｎｅｓ Ｃｅｌｌｓ １：１０６９〜１０７５；Ｃ
ｈａｕｄｒｙら、１９９５、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２３：８０５〜
８０９を参照のこと。あるいは、「擬似ランダムな」線状化が、切断が１分子あ
たり約１回生じる条件下で、比較的非特異的な制限エンドヌクレアーゼ（例えば
、共通の４塩基配列を認識するもの）を使用して実行され得る。必要な場合、挿
入または欠失の前に、突出末端は、（例えば、ポリメラーゼおよびｄＮＴＰを使
用して）充填することによって、および／またはエキソヌクレアーゼでの処理に
よって、平滑化され得る。
【００３４】 実施上、大集団の分子の切断は、通常、線状化されたものに加えて、未切断の
いくつかの分子、および１つより多い部位での切断によりフラグメント化された
他のものを含む、ポリヌクレオチドの分布を生じる。酵素および基質濃度、消化
時間、ならびに他の条件を、主に１箇所切断された分子を得るように調整するこ
とは、当該分野で公知である。所望ならば、線状化分子は、慣用的方法（例えば
、ゲル電気泳動、クロマトグラフィー、または遠心分離によるサイズ選択）によ
ってフラグメントから単離され得る。しかし、１箇所で切断された分子を、未切
断であるか、または複数箇所切断されたものから分離することは、必要ではない
。
いくつかの分子、および１つより多い部位での切断によりフラグメント化された
他のものを含む、ポリヌクレオチドの分布を生じる。酵素および基質濃度、消化
時間、ならびに他の条件を、主に１箇所切断された分子を得るように調整するこ
とは、当該分野で公知である。所望ならば、線状化分子は、慣用的方法（例えば
、ゲル電気泳動、クロマトグラフィー、または遠心分離によるサイズ選択）によ
ってフラグメントから単離され得る。しかし、１箇所で切断された分子を、未切
断であるか、または複数箇所切断されたものから分離することは、必要ではない
。
【００３５】 （ｂ）ランダムな挿入） ランダムに線状化されたポリヌクレオチドの集団にランダムに挿入されるポリ
ヌクレオチド配列またはオリゴヌクレオチド配列は、任意の種々の供給源由来で
あり得る。（挿入される配列は、挿入配列または「挿入集団」と呼ばれ得る。）
従って、挿入されるオリゴ／ポリヌクレオチドは、規定された配列および／また
は生物学的機能を有し得る（例えば、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ角質遺伝子のＴＡＴ
Ａボックス配列）。挿入に適したポリヌクレオチドは、規定された機能性分子ま
たは分子の集団（例えば、以下のライブラリー：プロモーター、エンハンサー、
または他の調節エレメント、Ｔ細胞エピトープをコードする配列もしくはＢ細胞
エピトープをコードする配列、ビオチン化ドメイン、抗体選択ペプチド、タンパ
ク質結合ドメイン、セルロース結合ドメイン、選択マーカー、レポーター遺伝子
、タンパク質ループ配列、タンパク質の機能性ドメイン、ウイルスゲノムのフラ
グメントまたは細菌ゲノムのフラグメントなど）を含む。挿入に適したポリヌク
レオチドはまた、既知の機能を有する分子の規定されたフラグメントまたは規定
されていないフラグメント（例えば、既知のプロモーター配列のフラグメント、
ポリペプチドコード配列のフラグメント）も含む。このオリゴ／ポリヌクレオチ
ドは、未知もしくはランダムな、配列および／または生物学的機能であり得るか
、あるいはなにも特定の生物学的機能を有さないものであり得る（例えば、ラン
ダム配列１２マーのライブラリー）。
ヌクレオチド配列またはオリゴヌクレオチド配列は、任意の種々の供給源由来で
あり得る。（挿入される配列は、挿入配列または「挿入集団」と呼ばれ得る。）
従って、挿入されるオリゴ／ポリヌクレオチドは、規定された配列および／また
は生物学的機能を有し得る（例えば、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ角質遺伝子のＴＡＴ
Ａボックス配列）。挿入に適したポリヌクレオチドは、規定された機能性分子ま
たは分子の集団（例えば、以下のライブラリー：プロモーター、エンハンサー、
または他の調節エレメント、Ｔ細胞エピトープをコードする配列もしくはＢ細胞
エピトープをコードする配列、ビオチン化ドメイン、抗体選択ペプチド、タンパ
ク質結合ドメイン、セルロース結合ドメイン、選択マーカー、レポーター遺伝子
、タンパク質ループ配列、タンパク質の機能性ドメイン、ウイルスゲノムのフラ
グメントまたは細菌ゲノムのフラグメントなど）を含む。挿入に適したポリヌク
レオチドはまた、既知の機能を有する分子の規定されたフラグメントまたは規定
されていないフラグメント（例えば、既知のプロモーター配列のフラグメント、
ポリペプチドコード配列のフラグメント）も含む。このオリゴ／ポリヌクレオチ
ドは、未知もしくはランダムな、配列および／または生物学的機能であり得るか
、あるいはなにも特定の生物学的機能を有さないものであり得る（例えば、ラン
ダム配列１２マーのライブラリー）。
【００３６】 適切な挿入ポリヌクレオチドは、化学合成、ＰＣＲ増幅、酵素的フラグメント
化、または他の任意の手段によって生成され得る。挿入される配列のサイズは、
少なくとも約３塩基、６塩基、９塩基、１２塩基、１５塩基、１８塩基、２１塩
基、２５塩基、または５０塩基長から、約０．１キロ塩基、０．５キロ塩基、１
キロ塩基、または２キロ塩基まで、あるいはなおそれより長くまでのような広範
囲であり得る。線状化されたポリヌクレオチドの末端間での配列の挿入は、任意
の適切な方法によって実行され得る。代表的には、連結される配列が、ＤＮＡリ
ガーゼの存在下でともにインキュベートされる。
化、または他の任意の手段によって生成され得る。挿入される配列のサイズは、
少なくとも約３塩基、６塩基、９塩基、１２塩基、１５塩基、１８塩基、２１塩
基、２５塩基、または５０塩基長から、約０．１キロ塩基、０．５キロ塩基、１
キロ塩基、または２キロ塩基まで、あるいはなおそれより長くまでのような広範
囲であり得る。線状化されたポリヌクレオチドの末端間での配列の挿入は、任意
の適切な方法によって実行され得る。代表的には、連結される配列が、ＤＮＡリ
ガーゼの存在下でともにインキュベートされる。
【００３７】 いくつかの実施態様において、単一種のポリヌクレオチド（例えば、１２マー
の特定の配列）が、ポリヌクレオチドの集団にランダムに挿入される。異なる実
施態様において、複数の（すなわち、１より多い）異なる種のポリヌクレオチド
が、変異プロセス中の特定の工程において導入される（例えば、ランダム配列１
２マーのセットか、またはプロモーター配列のフラグメントの混合物が挿入され
る）。
の特定の配列）が、ポリヌクレオチドの集団にランダムに挿入される。異なる実
施態様において、複数の（すなわち、１より多い）異なる種のポリヌクレオチド
が、変異プロセス中の特定の工程において導入される（例えば、ランダム配列１
２マーのセットか、またはプロモーター配列のフラグメントの混合物が挿入され
る）。
【００３８】 挿入された配列は、種々の様式のいずれかで、基質分子の特性を改変し得るか
、または補完し得る。この挿入された配列は、以下に提供される例から明らかで
あるように、特定の配列（例えば、特定のエピトープコード配列、タンパク質結
合部位またはタンパク質認識部位、転写因子結合部位、ＲＮＡスプライス部位な
ど）を提供するように選択され得る。あるいは、またはさらに、この挿入された
配列は、ポリヌクレオチドまたはコードされたポリペプチドに長さの変動を導入
するように作用し得る。コードされたポリペプチドにおいて、長さの変動は、分
子の特異性（例えば、酵素の基質特異性、抗体の抗原特異性）に影響する。ポリ
ヌクレオチドにおいて、長さの変動は、例えば、プロモーターにおける転写因子
エレメント間の間隔を変化させ、そのプロモーターの機能に大いに影響する。
、または補完し得る。この挿入された配列は、以下に提供される例から明らかで
あるように、特定の配列（例えば、特定のエピトープコード配列、タンパク質結
合部位またはタンパク質認識部位、転写因子結合部位、ＲＮＡスプライス部位な
ど）を提供するように選択され得る。あるいは、またはさらに、この挿入された
配列は、ポリヌクレオチドまたはコードされたポリペプチドに長さの変動を導入
するように作用し得る。コードされたポリペプチドにおいて、長さの変動は、分
子の特異性（例えば、酵素の基質特異性、抗体の抗原特異性）に影響する。ポリ
ヌクレオチドにおいて、長さの変動は、例えば、プロモーターにおける転写因子
エレメント間の間隔を変化させ、そのプロモーターの機能に大いに影響する。
【００３９】 挿入がポリヌクレオチドのタンパク質コード配列において作製される場合、所
望ならば、特定のリーディングフレームが保持されるために、特定の技術が利用
され得る（例えば、この欠失および／または挿入が３ヌクレオチド塩基長の倍数
であることを確実にすることによる）。例えば、１つの実施態様において、単一
のコドン（すなわち、３ヌクレオチド）が挿入される。これは、３塩基の倍数で
ある長さを有するオリゴヌクレオチドをランダムに挿入することによって達成さ
れ得る（例えば、Ｂｏｕｌａｉｎら、１９８６、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．
２０：３３９〜３４８）。別の方法は、最初に耐性（例えば、薬物耐性）カセッ
トをランダムに挿入し、このカセットを、選択（例えば、選択培地上での増殖）
後に制限エンドヌクレアーゼにより切断し得ることを含む。この挿入カセットは
、コード配列中に単一または複数の、ランダムかまたはランダムでないコドンを
残すように設計され得る（Ｗｏｎｇら、１９９３、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ
．１０：２８３〜２９２；Ｄｙｋｘｈｏｏｒｎら、１９９７、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ
ｓ Ｒｅｓ．５：４２０９〜４２１８；Ｈａｌｌｅｔら、１９９７、Ｎｕｃ．Ａ
ｃｉｄｓ Ｒｅｓ２５：１８６６〜１８６７）。さらに、レポーター遺伝子（例
えば、ＧＦＰ）同時翻訳カップリング技術が使用されて、非増殖性の（すなわち
、フレームシフトした）生成物が同定または除去され得る。もともとのリーディ
ングフレームを保持することは変異集団における「非増殖性」ポリヌクレオチド
の数を減少させ、それによりスクリーニングをいくらかより効率的にするが、フ
レームシフト変異を除去することは、必ずしもまたは常には、所望されないこと
が、理解される。
望ならば、特定のリーディングフレームが保持されるために、特定の技術が利用
され得る（例えば、この欠失および／または挿入が３ヌクレオチド塩基長の倍数
であることを確実にすることによる）。例えば、１つの実施態様において、単一
のコドン（すなわち、３ヌクレオチド）が挿入される。これは、３塩基の倍数で
ある長さを有するオリゴヌクレオチドをランダムに挿入することによって達成さ
れ得る（例えば、Ｂｏｕｌａｉｎら、１９８６、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．
２０：３３９〜３４８）。別の方法は、最初に耐性（例えば、薬物耐性）カセッ
トをランダムに挿入し、このカセットを、選択（例えば、選択培地上での増殖）
後に制限エンドヌクレアーゼにより切断し得ることを含む。この挿入カセットは
、コード配列中に単一または複数の、ランダムかまたはランダムでないコドンを
残すように設計され得る（Ｗｏｎｇら、１９９３、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ
．１０：２８３〜２９２；Ｄｙｋｘｈｏｏｒｎら、１９９７、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ
ｓ Ｒｅｓ．５：４２０９〜４２１８；Ｈａｌｌｅｔら、１９９７、Ｎｕｃ．Ａ
ｃｉｄｓ Ｒｅｓ２５：１８６６〜１８６７）。さらに、レポーター遺伝子（例
えば、ＧＦＰ）同時翻訳カップリング技術が使用されて、非増殖性の（すなわち
、フレームシフトした）生成物が同定または除去され得る。もともとのリーディ
ングフレームを保持することは変異集団における「非増殖性」ポリヌクレオチド
の数を減少させ、それによりスクリーニングをいくらかより効率的にするが、フ
レームシフト変異を除去することは、必ずしもまたは常には、所望されないこと
が、理解される。
【００４０】 （ｃ）ランダムな欠失） 本発明のいくつかの実施態様において、欠失が、基質集団中のランダムな部位
に導入される。欠失の導入が、ポリヌクレオチド配列のサイズを減少するため（
すなわち、ベクターの挿入能力を増大させるため）、ポリヌクレオチドの特性を
変化させるため（例えば、ＤＮＡセグメントによりコードされるポリペプチド中
の機能性ドメインの間隔を変化させることにより）、そして他の目的のために、
使用され得る。
に導入される。欠失の導入が、ポリヌクレオチド配列のサイズを減少するため（
すなわち、ベクターの挿入能力を増大させるため）、ポリヌクレオチドの特性を
変化させるため（例えば、ＤＮＡセグメントによりコードされるポリペプチド中
の機能性ドメインの間隔を変化させることにより）、そして他の目的のために、
使用され得る。
【００４１】 ポリヌクレオチドの集団がランダムに欠失される（すなわち、欠失がランダム
な位置に導入される）場合、通常、この集団中の種々の分子において、欠失の程
度の変動が存在する。いずれか１つの工程において導入される欠失の長さは、そ
の研究者の目的に依存して変化するが、代表的には、１００塩基もしくは１００
塩基対未満（例えば、少なくとも約３塩基、６塩基、９塩基、１２塩基、１５塩
基、１８塩基、２１塩基、２５塩基、３５塩基、５０塩基、または１００塩基の
長さ）である。しかし、いくつかの実施態様において、いくつかの欠失または全
ての欠失はより長く、例えば、少なくとも約２００または５００塩基であり得る
。
な位置に導入される）場合、通常、この集団中の種々の分子において、欠失の程
度の変動が存在する。いずれか１つの工程において導入される欠失の長さは、そ
の研究者の目的に依存して変化するが、代表的には、１００塩基もしくは１００
塩基対未満（例えば、少なくとも約３塩基、６塩基、９塩基、１２塩基、１５塩
基、１８塩基、２１塩基、２５塩基、３５塩基、５０塩基、または１００塩基の
長さ）である。しかし、いくつかの実施態様において、いくつかの欠失または全
ての欠失はより長く、例えば、少なくとも約２００または５００塩基であり得る
。
【００４２】 欠失は、種々の方法によって作製され得る。１つの実施態様において、環状分
子または環状化分子（例えば、ベクター）が、上記のようにランダムに線状化さ
れる。次いで、このランダムに線状化された分子は、進行的エキソヌクレアーゼ
（例えば、Ｂａｌ３１またはエキソヌクレアーゼＩＩＩ）の使用によって、サイ
ズが減少される（すなわち、配列が欠失される）。いくつかの実施態様において
、生じた線状分子は、標準的方法によって平滑化され、その後、連結によって再
環状化される（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎ
ｉｎｇ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、第１〜３巻）。１
つの実施態様において、挿入される配列（例えば、上記のようなもの）が、この
連結反応に含まれ得る（その基質集団に対して、配列の同時挿入および欠失を生
じる）。
子または環状化分子（例えば、ベクター）が、上記のようにランダムに線状化さ
れる。次いで、このランダムに線状化された分子は、進行的エキソヌクレアーゼ
（例えば、Ｂａｌ３１またはエキソヌクレアーゼＩＩＩ）の使用によって、サイ
ズが減少される（すなわち、配列が欠失される）。いくつかの実施態様において
、生じた線状分子は、標準的方法によって平滑化され、その後、連結によって再
環状化される（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎ
ｉｎｇ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、第１〜３巻）。１
つの実施態様において、挿入される配列（例えば、上記のようなもの）が、この
連結反応に含まれ得る（その基質集団に対して、配列の同時挿入および欠失を生
じる）。
【００４３】 本発明の１つの実施態様において、このポリヌクレオチドはベクターであり、
そしてランダムな欠失の導入および選択が使用されて、このベクターの機能に重
要な配列（例えば、複製起点）を除去することなく、ベクターのサイズが減少さ
れる。サイズの減少は、ベクター骨格中へ新規遺伝子またはより大きな遺伝子を
導入する能力を増大する。例えば、限定されたＤＮＡパッケージング長（キャプ
シド能力に起因する）を有するバクテリオファージベクターを使用する場合、こ
のバクテリオファージゲノムのサイズの減少は、本質的なファージ機能に影響す
ることなく、新規遺伝子またはより長い遺伝子のパッケージングを可能にする。
特に、本発明は、ベクターのサイズの減少および／または他の供給源由来の遺伝
子の導入を、親ベクター部分の機能の先験的知識を伴わずに可能にする。従って
、本発明は、特徴付けられていないバクテリオファージをベクターとして使用す
る場合（例えば、ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓバクテリオファージΦＣ３１におけ
る使用のために）、特に有用である。
そしてランダムな欠失の導入および選択が使用されて、このベクターの機能に重
要な配列（例えば、複製起点）を除去することなく、ベクターのサイズが減少さ
れる。サイズの減少は、ベクター骨格中へ新規遺伝子またはより大きな遺伝子を
導入する能力を増大する。例えば、限定されたＤＮＡパッケージング長（キャプ
シド能力に起因する）を有するバクテリオファージベクターを使用する場合、こ
のバクテリオファージゲノムのサイズの減少は、本質的なファージ機能に影響す
ることなく、新規遺伝子またはより長い遺伝子のパッケージングを可能にする。
特に、本発明は、ベクターのサイズの減少および／または他の供給源由来の遺伝
子の導入を、親ベクター部分の機能の先験的知識を伴わずに可能にする。従って
、本発明は、特徴付けられていないバクテリオファージをベクターとして使用す
る場合（例えば、ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓバクテリオファージΦＣ３１におけ
る使用のために）、特に有用である。
【００４４】 上記のように、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを変異する場合に
、親ベクターに見出されるリーディングフレームを保持するための技術を使用す
ることが、時に所望される。例えば、１つの実施態様において、単一のトリプレ
ットが、基質集団の欠失ポリヌクレオチド（の各々）から欠失される。これは、
まず、（例えば、選択後に）切除され得る耐性カセットを挿入して、３ヌクレオ
チドを欠失させることによって実行され得る。例えば、ＩＩＳ型制限酵素認識部
位（例えば、ＥａｒＩ、ＳａｐＩ）を含むカセットまたは短いオリゴヌクレオチ
ドが消化され、ランダムな挿入後に、これが環状ＤＮＡから切断され得、その結
果、３ヌクレオチドの倍数が切除される。あるいは、トランスポゾンの可動化（
例えば、ｃｒｅ／ｌｏｘを使用して）が使用されて、この耐性カセットが切除さ
れ得る。
、親ベクターに見出されるリーディングフレームを保持するための技術を使用す
ることが、時に所望される。例えば、１つの実施態様において、単一のトリプレ
ットが、基質集団の欠失ポリヌクレオチド（の各々）から欠失される。これは、
まず、（例えば、選択後に）切除され得る耐性カセットを挿入して、３ヌクレオ
チドを欠失させることによって実行され得る。例えば、ＩＩＳ型制限酵素認識部
位（例えば、ＥａｒＩ、ＳａｐＩ）を含むカセットまたは短いオリゴヌクレオチ
ドが消化され、ランダムな挿入後に、これが環状ＤＮＡから切断され得、その結
果、３ヌクレオチドの倍数が切除される。あるいは、トランスポゾンの可動化（
例えば、ｃｒｅ／ｌｏｘを使用して）が使用されて、この耐性カセットが切除さ
れ得る。
【００４５】 （ｄ）さらなる方法） 本発明の別の実施態様において、変異集団は、ポリヌクレオチドの２つの部分
集団の進行的エキソヌクレアーゼ消化を使用して生成されたランダムな挿入およ
び／または欠失の導入によって、基質集団から生成される。次いで、この部分集
団は、下記のように、連結されて新規な配列の組合せが生成される。
集団の進行的エキソヌクレアーゼ消化を使用して生成されたランダムな挿入およ
び／または欠失の導入によって、基質集団から生成される。次いで、この部分集
団は、下記のように、連結されて新規な配列の組合せが生成される。
【００４６】 本実施態様に従って、この基質集団は均質（すなわち、同一の配列を有する（
例えば、タンパク質をコードする特定の遺伝子の配列を有する）複数のポリヌク
レオチド）であり得るか、あるいは非均質（例えば、関連配列（例えば、関連遺
伝子[例えば、ヒトアクチンをコードする]のファミリー）または異なる種由来の
相同体[例えば、ヒトのアクチン遺伝子およびウシのアクチン遺伝子をコードす
る]を有するポリヌクレオチド、あるいはシャッフリング反応の産物、あるいは
上記のような他の同一ではないポリヌクレオチドの混合物を含む）であり得る。
例えば、タンパク質をコードする特定の遺伝子の配列を有する）複数のポリヌク
レオチド）であり得るか、あるいは非均質（例えば、関連配列（例えば、関連遺
伝子[例えば、ヒトアクチンをコードする]のファミリー）または異なる種由来の
相同体[例えば、ヒトのアクチン遺伝子およびウシのアクチン遺伝子をコードす
る]を有するポリヌクレオチド、あるいはシャッフリング反応の産物、あるいは
上記のような他の同一ではないポリヌクレオチドの混合物を含む）であり得る。
【００４７】 ランダムな挿入および／または欠失を有する変異集団を生成するために、基質
集団が、少なくとも２つの部分集団へと分割される。一連の入れ子状（ｎｅｓｔ
ｅｄ）欠失が、当該分野で周知の方法を使用して、例えば、エキソヌクレアーゼ
とともにインキュベートすることによって、２つの部分集団の各々から生成され
る（例えば、Ｈｅｎｉｋｏｆｆ、１９８４、Ｇｅｎｅ ２８：３５１を参照のこ
と、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｃａｔａｌｏｇ １９９８／９
９、１２９頁「Ｅｘｏ−ＳｉｚｅＴＭ Ｄｅｌｅｔｉｏｎ Ｋｉｔ」もまた参照
のこと）。手短かには、エキソヌクレアーゼＩＩＩのようなヌクレアーゼが使用
されて、各部分集団のポリヌクレオチドにおいて一方向性欠失が作製される。好
ましくは、各部分集団においてＤＮＡセグメントの制限エンドヌクレアーゼ消化
が使用されて、ヌクレアーゼ感受性末端（すなわち、５’突出末端または平滑末
端）およびヌクレアーゼ非感受性末端（すなわち、３’突出末端）の両方が導入
され、その結果、このヌクレアーゼは、１つの方向でのみ消化する。この少なく
とも２つの部分集団は、このヌクレアーゼ感受性末端の部位が異なる部分集団で
異なるという点で異なる。一連の種々の長さの欠失（すなわち、入れ子状欠失）
が各部分集団で生成された（例えば、アリコートを異なる長さの時間の間エキソ
ヌクレアーゼとともにインキュベートすることによって）後、各部分集団由来の
ポリヌクレオチドが連結されて、ランダムな挿入（例えば、重複）および／また
は欠失を連結部位に有する変異ポリヌクレオチドの混合物（変異集団）が生成さ
れる。
集団が、少なくとも２つの部分集団へと分割される。一連の入れ子状（ｎｅｓｔ
ｅｄ）欠失が、当該分野で周知の方法を使用して、例えば、エキソヌクレアーゼ
とともにインキュベートすることによって、２つの部分集団の各々から生成され
る（例えば、Ｈｅｎｉｋｏｆｆ、１９８４、Ｇｅｎｅ ２８：３５１を参照のこ
と、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｃａｔａｌｏｇ １９９８／９
９、１２９頁「Ｅｘｏ−ＳｉｚｅＴＭ Ｄｅｌｅｔｉｏｎ Ｋｉｔ」もまた参照
のこと）。手短かには、エキソヌクレアーゼＩＩＩのようなヌクレアーゼが使用
されて、各部分集団のポリヌクレオチドにおいて一方向性欠失が作製される。好
ましくは、各部分集団においてＤＮＡセグメントの制限エンドヌクレアーゼ消化
が使用されて、ヌクレアーゼ感受性末端（すなわち、５’突出末端または平滑末
端）およびヌクレアーゼ非感受性末端（すなわち、３’突出末端）の両方が導入
され、その結果、このヌクレアーゼは、１つの方向でのみ消化する。この少なく
とも２つの部分集団は、このヌクレアーゼ感受性末端の部位が異なる部分集団で
異なるという点で異なる。一連の種々の長さの欠失（すなわち、入れ子状欠失）
が各部分集団で生成された（例えば、アリコートを異なる長さの時間の間エキソ
ヌクレアーゼとともにインキュベートすることによって）後、各部分集団由来の
ポリヌクレオチドが連結されて、ランダムな挿入（例えば、重複）および／また
は欠失を連結部位に有する変異ポリヌクレオチドの混合物（変異集団）が生成さ
れる。
【００４８】 例は、本発明のこの実施態様を例証するのを補助する。従って、ポリペプチド
をコードするＤＮＡセグメントの均一な基質集団（この基質集団は、２つの部分
集団へと分割される）を考える。この方法の１つの実施態様において、一方の部
分集団中のヌクレアーゼ感受性末端が、コードされるポリペプチドのアミノ末端
に対応するポリヌクレオチド部位に導入されて、ｃ末端へと消化され、そして他
方の部分集団中のヌクレアーゼ感受性部位が、コードされるポリペプチドのカル
ボキシ末端に対応するポリヌクレオチド部位に導入されて、ｎ末端へと消化され
る。説明目的のために、この例示的例のこの２つの部分集団は、「アミノ末端欠
失」生成物または「カルボキシ末端欠失」生成物を生成すると言われ得る。
をコードするＤＮＡセグメントの均一な基質集団（この基質集団は、２つの部分
集団へと分割される）を考える。この方法の１つの実施態様において、一方の部
分集団中のヌクレアーゼ感受性末端が、コードされるポリペプチドのアミノ末端
に対応するポリヌクレオチド部位に導入されて、ｃ末端へと消化され、そして他
方の部分集団中のヌクレアーゼ感受性部位が、コードされるポリペプチドのカル
ボキシ末端に対応するポリヌクレオチド部位に導入されて、ｎ末端へと消化され
る。説明目的のために、この例示的例のこの２つの部分集団は、「アミノ末端欠
失」生成物または「カルボキシ末端欠失」生成物を生成すると言われ得る。
【００４９】 一連の入れ子状欠失が各部分集団において生成された後、各部分集団由来のポ
リヌクレオチドが連結されて、ランダムな挿入（例えば、重複）および／または
欠失を結合部位に有する変異ポリヌクレオチドの混合物が生成される。従って、
上記の（例示目的であって、限定目的ではない）例を継続すると、各々の部分集
団において、欠失が１塩基〜そのポリヌクレオチドの長さの約９９％（例えば、
５％欠失、１０％欠失、９０％欠失、および９５％欠失を含む）の範囲であると
想定する。アミノ末端欠失分子（この分子の長さの正確に１０％が欠失されてい
る）のカルボキシ末端欠失分子（この分子の長さの正確に９５％が欠失されてい
る）への連結は、その基質ポリヌクレオチド配列と比較して、（連結部分で）５
％の重複を有する分子を生じる。同様に、アミノ末端欠失分子（この分子の長さ
の正確５％が欠失されている）のカルボキシ末端欠失分子（この分子の長さの正
確に９０％が欠失されている）への連結は、その基質ポリヌクレオチド配列と比
較して、（連結部分で）５％の欠失を有する分子を生じる。
リヌクレオチドが連結されて、ランダムな挿入（例えば、重複）および／または
欠失を結合部位に有する変異ポリヌクレオチドの混合物が生成される。従って、
上記の（例示目的であって、限定目的ではない）例を継続すると、各々の部分集
団において、欠失が１塩基〜そのポリヌクレオチドの長さの約９９％（例えば、
５％欠失、１０％欠失、９０％欠失、および９５％欠失を含む）の範囲であると
想定する。アミノ末端欠失分子（この分子の長さの正確に１０％が欠失されてい
る）のカルボキシ末端欠失分子（この分子の長さの正確に９５％が欠失されてい
る）への連結は、その基質ポリヌクレオチド配列と比較して、（連結部分で）５
％の重複を有する分子を生じる。同様に、アミノ末端欠失分子（この分子の長さ
の正確５％が欠失されている）のカルボキシ末端欠失分子（この分子の長さの正
確に９０％が欠失されている）への連結は、その基質ポリヌクレオチド配列と比
較して、（連結部分で）５％の欠失を有する分子を生じる。
【００５０】 この基本的スキームの多くのバリエーション（例えば、ポリペプチド末端に対
応するもの以外の部位での感受性末端の導入を含む）が利用可能であること明ら
かである。
応するもの以外の部位での感受性末端の導入を含む）が利用可能であること明ら
かである。
【００５１】 本発明が、いかなる特定のランダムな挿入または欠失の方法に限定されないこ
と、および上記に具体的に記載されたもの以外の方法が使用され得ることが、理
解される。例えば、自己挿入ＤＮＡ（すなわち、トランスポゾン）が、続く、可
動化によるインビボ切除か、または制限エンドヌクレアーゼによるインビトロ切
除と組み合わせて、インビボ挿入のために使用され得る。
と、および上記に具体的に記載されたもの以外の方法が使用され得ることが、理
解される。例えば、自己挿入ＤＮＡ（すなわち、トランスポゾン）が、続く、可
動化によるインビボ切除か、または制限エンドヌクレアーゼによるインビトロ切
除と組み合わせて、インビボ挿入のために使用され得る。
【００５２】 スクリーニング工程（下記）の前に、変異された（すなわち、挿入または欠失
による）ポリヌクレオチドについての変異集団を富化する（ｅｎｒｉｃｈ）こと
が、しばしば所望される。富化は望ましい。なぜなら、挿入および欠失の効率的
な方法でさえ、野生型である（すなわち、挿入または欠失を含まない）いくつか
の分子、または実質的な割合の分子さえ含む、変異集団をしばしば生じるからで
ある。富化工程を使用すると、後にスクリーニングされなければならない集団の
サイズが減少される。種々の方法が、富化のために使用され得る。１つの方法（
耐性カセットの使用）が、上記に議論されている。挿入事象の富化に適切な別の
方法は、変異されたプールのＤＮＡを変性すること、続いて、これを固相支持体
上に固定化された挿入ＤＮＡの別のアリコートに結合することによって、実行さ
れる。非結合（例えば、野生型）ポリヌクレオチドが洗浄によって除去され、そ
して変異分子は、アフィニティーマトリクスから溶出される（例えば、温度、尿
素などを使用して）。富化に適する別の方法は、挿入された配列に加えて、固定
化された配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質（例えば、ＬａｃＩリプレッサー）に
より結合される第２の配列（例えば、ｌａｃオペレーター部位）を含むオリゴヌ
クレオチドまたはポリヌクレオチドを挿入することを含む。洗浄後、この挿入を
有するポリヌクレオチドは、溶出され得る（例えば、イソプロピルチオガラクト
シドの存在下で）。続いて、結合の原因であるオリゴヌクレオチド配列またはポ
リヌクレオチド配列は、所望ならば、種々の方法（このうちのいくつかは上記で
議論されている）によって、このポリヌクレオチドから切除され、挿入された配
列の後ろが残り得る。
による）ポリヌクレオチドについての変異集団を富化する（ｅｎｒｉｃｈ）こと
が、しばしば所望される。富化は望ましい。なぜなら、挿入および欠失の効率的
な方法でさえ、野生型である（すなわち、挿入または欠失を含まない）いくつか
の分子、または実質的な割合の分子さえ含む、変異集団をしばしば生じるからで
ある。富化工程を使用すると、後にスクリーニングされなければならない集団の
サイズが減少される。種々の方法が、富化のために使用され得る。１つの方法（
耐性カセットの使用）が、上記に議論されている。挿入事象の富化に適切な別の
方法は、変異されたプールのＤＮＡを変性すること、続いて、これを固相支持体
上に固定化された挿入ＤＮＡの別のアリコートに結合することによって、実行さ
れる。非結合（例えば、野生型）ポリヌクレオチドが洗浄によって除去され、そ
して変異分子は、アフィニティーマトリクスから溶出される（例えば、温度、尿
素などを使用して）。富化に適する別の方法は、挿入された配列に加えて、固定
化された配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質（例えば、ＬａｃＩリプレッサー）に
より結合される第２の配列（例えば、ｌａｃオペレーター部位）を含むオリゴヌ
クレオチドまたはポリヌクレオチドを挿入することを含む。洗浄後、この挿入を
有するポリヌクレオチドは、溶出され得る（例えば、イソプロピルチオガラクト
シドの存在下で）。続いて、結合の原因であるオリゴヌクレオチド配列またはポ
リヌクレオチド配列は、所望ならば、種々の方法（このうちのいくつかは上記で
議論されている）によって、このポリヌクレオチドから切除され、挿入された配
列の後ろが残り得る。
【００５３】 本発明の実施は、分子生物学の当業者に周知の種々の技術を伴うことが、上記
の説明から明らかである。適切なクローニング、配列決定、変異、ランダム組換
え技術、および他の技術を通じて当業者に指示するに十分な指示は、例えば以下
に見出される：ＢｅｒｇｅｒおよびＫｉｍｍｅｌ、Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ
Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第１５２巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．
、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ；Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版）第１
〜３巻；ならびにＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｂｅｌら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔ
ｏｃｏｌｓ、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉ
ｎｃ．とＪｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．との間の合弁会社（１９８
９補遺）、ならびに本明細書中に引用される他の参考文献、ならびに当該分野で
公知の他の参考文献。
の説明から明らかである。適切なクローニング、配列決定、変異、ランダム組換
え技術、および他の技術を通じて当業者に指示するに十分な指示は、例えば以下
に見出される：ＢｅｒｇｅｒおよびＫｉｍｍｅｌ、Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ
Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第１５２巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．
、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ；Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版）第１
〜３巻；ならびにＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｂｅｌら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔ
ｏｃｏｌｓ、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉ
ｎｃ．とＪｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．との間の合弁会社（１９８
９補遺）、ならびに本明細書中に引用される他の参考文献、ならびに当該分野で
公知の他の参考文献。
【００５４】 （ＩＶ．変異集団のスクリーニング） 本発明の方法における別の工程は、所望の特性についての変異集団のスクリー
ニングである。このことは、変異の結果として所望の特性（例えば、新規な特性
）を獲得するか、または既存の特性が所望されるように増強される、ＤＮＡセグ
メントの同定および単離、またはＤＮＡセグメントの富化を生じる。本明細書中
で使用される場合、用語「スクリーニング」とは、当該分野においてその通常の
意味を有し、そして一般に、２段階の工程である。第１の工程において、ＤＮＡ
セグメントが特定の特性を有するか否かが決定され、そして第２の工程において
、この特性を有するＤＮＡセグメントが、この特性を有していないＤＮＡセグメ
ントから物理的に分離される。便宜上、このスクリーニングから得られたポリヌ
クレオチドの集団は、「選択された集団」といわれ得る。
ニングである。このことは、変異の結果として所望の特性（例えば、新規な特性
）を獲得するか、または既存の特性が所望されるように増強される、ＤＮＡセグ
メントの同定および単離、またはＤＮＡセグメントの富化を生じる。本明細書中
で使用される場合、用語「スクリーニング」とは、当該分野においてその通常の
意味を有し、そして一般に、２段階の工程である。第１の工程において、ＤＮＡ
セグメントが特定の特性を有するか否かが決定され、そして第２の工程において
、この特性を有するＤＮＡセグメントが、この特性を有していないＤＮＡセグメ
ントから物理的に分離される。便宜上、このスクリーニングから得られたポリヌ
クレオチドの集団は、「選択された集団」といわれ得る。
【００５５】 スクリーニングのいくつかの形態において、同定および物理的分離が、同時に
達成される。例えば、細胞に薬物耐性を付与するポリヌクレオチドの同定および
分離は、その薬物に耐性である細胞の選択（例えば、非耐性細胞が生存しない条
件下で培養すること）によって達成され得る。スクリーニングの「分離」工程は
、所望の特性を有する生化学的に純粋なポリヌクレオチドの単離を内包または必
要としないことが、本例から明らかである。むしろ、分離は、目的のＤＮＡセグ
メントが他のＤＮＡセグメント（例えば、他のＤＮＡセグメントを含む細胞）か
ら分離されることを意味する。本発明のいくつかの実施態様において、スクリー
ニングが実行される場合、この特性を有するＤＮＡセグメントとこの特性を有さ
ないＤＮＡセグメントの物理的分離は、完全である必要はなく、方法論的制限に
起因して、しばしば完全ではない。従って、いくつかの実施態様において、変異
集団のスクリーニングは、所望の特性を有するＤＮＡセグメントについて富化さ
れる選択された集団を生じる。
達成される。例えば、細胞に薬物耐性を付与するポリヌクレオチドの同定および
分離は、その薬物に耐性である細胞の選択（例えば、非耐性細胞が生存しない条
件下で培養すること）によって達成され得る。スクリーニングの「分離」工程は
、所望の特性を有する生化学的に純粋なポリヌクレオチドの単離を内包または必
要としないことが、本例から明らかである。むしろ、分離は、目的のＤＮＡセグ
メントが他のＤＮＡセグメント（例えば、他のＤＮＡセグメントを含む細胞）か
ら分離されることを意味する。本発明のいくつかの実施態様において、スクリー
ニングが実行される場合、この特性を有するＤＮＡセグメントとこの特性を有さ
ないＤＮＡセグメントの物理的分離は、完全である必要はなく、方法論的制限に
起因して、しばしば完全ではない。従って、いくつかの実施態様において、変異
集団のスクリーニングは、所望の特性を有するＤＮＡセグメントについて富化さ
れる選択された集団を生じる。
【００５６】 スクリーニングが所望の特性を有するＤＮＡセグメントを同定するためのアッ
セイを必要とすることは、当業者にただちに明らかである。特定のアッセイが特
定の所望の特性に依存することもまた明らかである。種々の実施例が、当業者に
さらなる指針を提供するために後に提供される。本発明の使用に適切な多数のさ
らなるスクリーニングは、「ＤＮＡシャッフリング」法を記載する刊行物および
開示物に記載される。従って、読者は、「シャッフリング」の説明中の第Ｉ節（
前出）に列挙される特許、出願、および刊行物を参照する。これらの各々は、全
体が、全ての目的のために参考として本明細書中に援用される。しかし、本発明
は、いずれの特定のスクリーニング法にも限定されないことが理解される。
セイを必要とすることは、当業者にただちに明らかである。特定のアッセイが特
定の所望の特性に依存することもまた明らかである。種々の実施例が、当業者に
さらなる指針を提供するために後に提供される。本発明の使用に適切な多数のさ
らなるスクリーニングは、「ＤＮＡシャッフリング」法を記載する刊行物および
開示物に記載される。従って、読者は、「シャッフリング」の説明中の第Ｉ節（
前出）に列挙される特許、出願、および刊行物を参照する。これらの各々は、全
体が、全ての目的のために参考として本明細書中に援用される。しかし、本発明
は、いずれの特定のスクリーニング法にも限定されないことが理解される。
【００５７】 （Ｖ．再帰的変異およびスクリーニング） 本発明の１つの実施態様において、上記されたように作製された選択された集
団が、変異される。すなわち、挿入、欠失、またはその両方が、この選択された
集団中のＤＮＡセグメントのランダムな部位にて導入される。この変異型は、基
質集団（すなわち、オリジナルな基質集団または第１の基質集団）中に導入され
た変異と同じでも異なっていてもよい。例えば、ランダムな挿入が基質集団中に
作製された場合、挿入がまた、この選択された集団中に導入され得るか、あるい
は欠失が導入され得る。さらに、挿入が作製される場合、挿入されたポリヌクレ
オチドは、以前の工程の挿入ポリヌクレオチドと同じでも異なっていてもよい。
変異したＤＮＡセグメントの得られた集団は、「再帰変異集団」といわれ得、こ
れは、ＤＮＡセグメントが挿入および／または欠失による変異の１より多いサイ
クルに供されている事実に関する。
団が、変異される。すなわち、挿入、欠失、またはその両方が、この選択された
集団中のＤＮＡセグメントのランダムな部位にて導入される。この変異型は、基
質集団（すなわち、オリジナルな基質集団または第１の基質集団）中に導入され
た変異と同じでも異なっていてもよい。例えば、ランダムな挿入が基質集団中に
作製された場合、挿入がまた、この選択された集団中に導入され得るか、あるい
は欠失が導入され得る。さらに、挿入が作製される場合、挿入されたポリヌクレ
オチドは、以前の工程の挿入ポリヌクレオチドと同じでも異なっていてもよい。
変異したＤＮＡセグメントの得られた集団は、「再帰変異集団」といわれ得、こ
れは、ＤＮＡセグメントが挿入および／または欠失による変異の１より多いサイ
クルに供されている事実に関する。
【００５８】 次いで、再帰的に変異した集団は、所望の特性についてスクリーニングされる
。このスクリーニングから得られたＤＮＡセグメントの集団は、「再帰的に（ｒ
ｅｃｕｒｓｉｖｅｌｙ）選択された集団」（すなわち、「第１の再帰的に選択さ
れた集団」といわれる。「選択された集団」および「再帰的に選択された集団」
に使用されるスクリーニングは、同じでも異なっていてもよい。同じスクリーニ
ングが使用される実施態様において、スクリーニングのストリンジェンシーは、
ますます強い特性を有するＤＮＡセグメントを同定するために増大される。例え
ば、所望の特性が、細胞に薬物耐性を付与する（ＤＮＡセグメント）の能力であ
る場合、第２またはその後のスクリーニングアッセイは、最初のスクリーニング
（すなわち、変異集団のスクリーニング）よりも高い薬物濃度を使用し得る。別
の例のように、所望の特性が特定の抗体によって結合されるポリペプチドをコー
ドするＤＮＡセグメントの能力である場合、漸増的にストリンジェントな結合条
件が、スクリーニングに用いられ得る。
。このスクリーニングから得られたＤＮＡセグメントの集団は、「再帰的に（ｒ
ｅｃｕｒｓｉｖｅｌｙ）選択された集団」（すなわち、「第１の再帰的に選択さ
れた集団」といわれる。「選択された集団」および「再帰的に選択された集団」
に使用されるスクリーニングは、同じでも異なっていてもよい。同じスクリーニ
ングが使用される実施態様において、スクリーニングのストリンジェンシーは、
ますます強い特性を有するＤＮＡセグメントを同定するために増大される。例え
ば、所望の特性が、細胞に薬物耐性を付与する（ＤＮＡセグメント）の能力であ
る場合、第２またはその後のスクリーニングアッセイは、最初のスクリーニング
（すなわち、変異集団のスクリーニング）よりも高い薬物濃度を使用し得る。別
の例のように、所望の特性が特定の抗体によって結合されるポリペプチドをコー
ドするＤＮＡセグメントの能力である場合、漸増的にストリンジェントな結合条
件が、スクリーニングに用いられ得る。
【００５９】 図１に例示されるように、変異およびスクリーニングのさらなるサイクルは、
所望される場合に実行され得る。一般に、１〜５０のさらなるサイクル（より頻
繁には、約３〜約１０回のさらなる回数）が、実行される。変異およびスクリー
ニングのさらなるサイクルが実行される場合、得られた選択された集団を「第２
の再帰的に選択された集団」、「第３の再帰的に選択された集団」などと呼ぶこ
とは、都合がよい。
所望される場合に実行され得る。一般に、１〜５０のさらなるサイクル（より頻
繁には、約３〜約１０回のさらなる回数）が、実行される。変異およびスクリー
ニングのさらなるサイクルが実行される場合、得られた選択された集団を「第２
の再帰的に選択された集団」、「第３の再帰的に選択された集団」などと呼ぶこ
とは、都合がよい。
【００６０】 明らかなように、再帰的に選択された集団の各々は、所望の特性を有するＤＮ
Ａセグメントを含む。いくつかの場合、この集団が全体として有用であるが、よ
り頻繁に、ＤＮＡセグメントの特定の種が、集団から単離され、そして使用され
る。
Ａセグメントを含む。いくつかの場合、この集団が全体として有用であるが、よ
り頻繁に、ＤＮＡセグメントの特定の種が、集団から単離され、そして使用され
る。
【００６１】 （ＶＩ．複数の基質集団の変異および組換え体のスクリーニング） 本発明の関連する実施態様において、ランダムな挿入または欠失は、２つ（ま
たはそれよりも多く）の異なる基質集団中に導入され、そして各々の集団に由来
する配列エレメントが、特異的（ｄｉｒｅｃｔｅｄ）組換えまたはランダムな組
換え（例えば、シャッフリング）によって組み合わされる。代表的には、異なる
挿入配列が、各々の基質集団中に導入される。変異した基質集団うちの１つまた
は各々は、この基質集団の組換えの前に、その集団の変異によって付与された特
定の特性についてスクリーニングまたは選択に供され得る。変異した基質集団の
スクリーニングが引き受けられても引き受けられなくても、この組換え集団は、
所望の特性または特性の組合せについてスクリーニング／選択されるように供さ
れる。
たはそれよりも多く）の異なる基質集団中に導入され、そして各々の集団に由来
する配列エレメントが、特異的（ｄｉｒｅｃｔｅｄ）組換えまたはランダムな組
換え（例えば、シャッフリング）によって組み合わされる。代表的には、異なる
挿入配列が、各々の基質集団中に導入される。変異した基質集団うちの１つまた
は各々は、この基質集団の組換えの前に、その集団の変異によって付与された特
定の特性についてスクリーニングまたは選択に供され得る。変異した基質集団の
スクリーニングが引き受けられても引き受けられなくても、この組換え集団は、
所望の特性または特性の組合せについてスクリーニング／選択されるように供さ
れる。
【００６２】 留意したように、ランダムな組換え方法は、ＤＮＡシャッフリング技術を含む
。シャッフリングは、（例えば、誤りがちな増幅によって）点変異の導入と組み
合わせてか、あるいは（プルーフリーディングポリメラーゼの使用によって）点
変異の導入なしに実行され得る。対照的に、「特異的組換え」またはサブクロー
ニングは、各々の基質集団の少なくとも一部の制限マップの知識を必要とし、そ
して第２の集団中の特定の制限部位への、１つの集団に由来する制限フラグメン
トの挿入を生じる組換え方法をいう。例は、第２の基質集団中の特定部位または
位置への１つの基質集団に由来する、（制限およびライゲーションによる）特定
の制限フラグメントの挿入あるいは（通常、ライゲーションもしくはＳＯＥ−Ｐ
ＣＲ［重複伸長ＰＣＲによるスプライシング］による）ＰＣＲアンプリコン挿入
および２つのランダムに線状化された基質集団の連結を含む。
。シャッフリングは、（例えば、誤りがちな増幅によって）点変異の導入と組み
合わせてか、あるいは（プルーフリーディングポリメラーゼの使用によって）点
変異の導入なしに実行され得る。対照的に、「特異的組換え」またはサブクロー
ニングは、各々の基質集団の少なくとも一部の制限マップの知識を必要とし、そ
して第２の集団中の特定の制限部位への、１つの集団に由来する制限フラグメン
トの挿入を生じる組換え方法をいう。例は、第２の基質集団中の特定部位または
位置への１つの基質集団に由来する、（制限およびライゲーションによる）特定
の制限フラグメントの挿入あるいは（通常、ライゲーションもしくはＳＯＥ−Ｐ
ＣＲ［重複伸長ＰＣＲによるスプライシング］による）ＰＣＲアンプリコン挿入
および２つのランダムに線状化された基質集団の連結を含む。
【００６３】 （ＶＩＩ．選択された集団のランダムな組換え） 本発明の異なる実施態様において、選択された集団（第ＩＩＩ節（前出）に記
載される）、再帰的に選択された集団（第Ｖ節に記載される）、またはこのよう
な集団から単離されたＤＮＡセグメント種は、ランダムな組換えおよび点変異（
例えば、ＤＮＡシャッフリング）を導く方法のための開始物質として使用される
。ランダムな組換えは、特定の規定された配列の特異的な交換以外の組換え法（
例えば、ＶＩ節（前出）に記載されるような、規定された制限フラグメントの制
限およびライゲーションによる、ＤＮＡセグメントの１つの集団から第２の集団
への配列の転移）をいうことが理解される。ランダムな組換え法は、単一のＤＮ
Ａ配列または関連ＤＮＡ配列のファミリーのランダムなフラグメント化による、
ＤＮＡフラグメントの大きなプールの作製、および新しい構造（すなわち、欠失
、挿入および／または導入された点変異の新しい組合せ）かつ所望の特性を有す
るＤＮＡセグメントを生じる種々の組合せにおけるフラグメントの再アセンブリ
に依存する。
載される）、再帰的に選択された集団（第Ｖ節に記載される）、またはこのよう
な集団から単離されたＤＮＡセグメント種は、ランダムな組換えおよび点変異（
例えば、ＤＮＡシャッフリング）を導く方法のための開始物質として使用される
。ランダムな組換えは、特定の規定された配列の特異的な交換以外の組換え法（
例えば、ＶＩ節（前出）に記載されるような、規定された制限フラグメントの制
限およびライゲーションによる、ＤＮＡセグメントの１つの集団から第２の集団
への配列の転移）をいうことが理解される。ランダムな組換え法は、単一のＤＮ
Ａ配列または関連ＤＮＡ配列のファミリーのランダムなフラグメント化による、
ＤＮＡフラグメントの大きなプールの作製、および新しい構造（すなわち、欠失
、挿入および／または導入された点変異の新しい組合せ）かつ所望の特性を有す
るＤＮＡセグメントを生じる種々の組合せにおけるフラグメントの再アセンブリ
に依存する。
【００６４】 再帰的ランダム組換え方法または非再帰的ランダム組換え方法が使用され得る
。この状況における用語「再帰的（に）」は、フラグメント化、組換えおよびス
クリーニングの複数サイクル（例えば、少なくとも２サイクル、時折少なくとも
５サイクル）の使用をいう。代表的には、ランダムな組換え法が選択された集団
由来の単一のＤＮＡセグメントに適用される場合、再帰的組換え法（例えば、Ｚ
ｈａｎｇら、１９９７、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９４：４５０
４）が使用される。異なるＤＮＡセグメントの集団が使用される場合、再帰的お
よび非再帰的（すなわち、１サイクルのフラグメント化、組換え、およびスクリ
ーニング）組換え法の両方が適切である（Ｃｒａｍｅｒｉら、１９９８、Ｎａｔ
ｕｒｅ ３９１：２８８〜２９１を参照のこと）。
。この状況における用語「再帰的（に）」は、フラグメント化、組換えおよびス
クリーニングの複数サイクル（例えば、少なくとも２サイクル、時折少なくとも
５サイクル）の使用をいう。代表的には、ランダムな組換え法が選択された集団
由来の単一のＤＮＡセグメントに適用される場合、再帰的組換え法（例えば、Ｚ
ｈａｎｇら、１９９７、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９４：４５０
４）が使用される。異なるＤＮＡセグメントの集団が使用される場合、再帰的お
よび非再帰的（すなわち、１サイクルのフラグメント化、組換え、およびスクリ
ーニング）組換え法の両方が適切である（Ｃｒａｍｅｒｉら、１９９８、Ｎａｔ
ｕｒｅ ３９１：２８８〜２９１を参照のこと）。
【００６５】 （ＶＩＩＩ．例示的な適用） この節は、本発明の種々の使用を例証する、いくつかの例示的な例を提供する
。多くの他の使用およびバリエーションは、本発明の開示を読む当業者に明らか
である。
。多くの他の使用およびバリエーションは、本発明の開示を読む当業者に明らか
である。
【００６６】 （例示的な適用１：プロモーター特異性の変化） １つの実施態様において、本発明の方法は、転写調節配列（例えば、プロモー
ター配列またはエンハンサー配列）を進化させるように使用され、その結果調節
配列の発現特徴（例えば、誘導性、組織特異性、もしくはプロモーター強度）が
変化される。本発明の方法の使用は、調節エレメントの進化に特に強力である。
なぜなら、このようなエレメントは、代表的には、予測不能な様式において調節
活性／機能に寄与する、異なる組合せのモジュール（または相対的な方向におけ
る差異）を有する、構造中のモジュラーである。
ター配列またはエンハンサー配列）を進化させるように使用され、その結果調節
配列の発現特徴（例えば、誘導性、組織特異性、もしくはプロモーター強度）が
変化される。本発明の方法の使用は、調節エレメントの進化に特に強力である。
なぜなら、このようなエレメントは、代表的には、予測不能な様式において調節
活性／機能に寄与する、異なる組合せのモジュール（または相対的な方向におけ
る差異）を有する、構造中のモジュラーである。
【００６７】 代表的には、プロモーター配列の変異およびスクリーニングは、標的プロモー
ターがレポーター遺伝子（すなわち、都合よくアッセイされ得る遺伝子産物をコ
ードする遺伝子）に作動可能に連結されるベクター（例えば、発現ベクター）を
使用して実行される。多くの適切なレポーター遺伝子（緑色蛍光タンパク質（Ｇ
ＦＰ）、ルシフェラーゼ、β−グルクロニダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、およ
び分泌アルカリホスファターゼを含む）が、当該分野において周知である。プロ
モーター−レポーター系を使用する利点は、プロモーター機能における変化が容
易に検出され得、種々の簡単なスクリーニング方法を容易にするという点である
。一旦、プロモーター配列が本発明の方法によって、所望の特性または特性の組
合せを有するように進化されると、プロモーター領域は、（例えば、レポーター
遺伝子以外の目的の遺伝子の転写を駆動するように）異なるベクター中にクロー
ニングされ得る。あるいは、レポーター遺伝子配列は、変異したベクターから除
去され得、そして異なる目的の遺伝子が、その位置に挿入され得る。ベクター中
のプロモーター配列またはコード配列をサブクローニングするための方法は、当
業者に周知である（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、前出を参照のこと）。例えば、
変異したプロモーターは、ポリメラーゼ連鎖反応によって増幅され得、そして増
幅された配列は、選択されたコード配列の上流の領域にクローニングされ得る。
ターがレポーター遺伝子（すなわち、都合よくアッセイされ得る遺伝子産物をコ
ードする遺伝子）に作動可能に連結されるベクター（例えば、発現ベクター）を
使用して実行される。多くの適切なレポーター遺伝子（緑色蛍光タンパク質（Ｇ
ＦＰ）、ルシフェラーゼ、β−グルクロニダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、およ
び分泌アルカリホスファターゼを含む）が、当該分野において周知である。プロ
モーター−レポーター系を使用する利点は、プロモーター機能における変化が容
易に検出され得、種々の簡単なスクリーニング方法を容易にするという点である
。一旦、プロモーター配列が本発明の方法によって、所望の特性または特性の組
合せを有するように進化されると、プロモーター領域は、（例えば、レポーター
遺伝子以外の目的の遺伝子の転写を駆動するように）異なるベクター中にクロー
ニングされ得る。あるいは、レポーター遺伝子配列は、変異したベクターから除
去され得、そして異なる目的の遺伝子が、その位置に挿入され得る。ベクター中
のプロモーター配列またはコード配列をサブクローニングするための方法は、当
業者に周知である（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、前出を参照のこと）。例えば、
変異したプロモーターは、ポリメラーゼ連鎖反応によって増幅され得、そして増
幅された配列は、選択されたコード配列の上流の領域にクローニングされ得る。
【００６８】 従って、本発明の１つの例示的な実施態様において、（１）基質集団は、特定
のプロモーター活性（例えば、肝細胞特異的な様式においてレポーター遺伝子の
転写を指向する能力）を有するＤＮＡセグメントの集団であり、そして（２）所
望の特性は、異なるプロモーター活性（例えば、Ｔリンパ球における発現を駆動
する能力）または活性の組合せ（例えば、Ｔリンパ球および肝細胞の両方におけ
る発現を駆動するが、膵β細胞における発現を駆動しない能力）である。リンパ
球特異的プロモーターの作製は、例えば、ＧＦＰレポーター遺伝子に作動可能に
連結された肝細胞プロモーターを含む基質集団を変異させること、および得られ
た変異集団の適切なスクリーニングを実行することによって、実行され得る。
のプロモーター活性（例えば、肝細胞特異的な様式においてレポーター遺伝子の
転写を指向する能力）を有するＤＮＡセグメントの集団であり、そして（２）所
望の特性は、異なるプロモーター活性（例えば、Ｔリンパ球における発現を駆動
する能力）または活性の組合せ（例えば、Ｔリンパ球および肝細胞の両方におけ
る発現を駆動するが、膵β細胞における発現を駆動しない能力）である。リンパ
球特異的プロモーターの作製は、例えば、ＧＦＰレポーター遺伝子に作動可能に
連結された肝細胞プロモーターを含む基質集団を変異させること、および得られ
た変異集団の適切なスクリーニングを実行することによって、実行され得る。
【００６９】 このプロモーター配列は、ランダムな挿入および／またはランダムな欠失によ
って変異される。上記されるように、挿入に適切なポリヌクレオチドの例として
は、既知のプロモーター（例えば、Ｔ細胞もしくは肝細胞特異的プロモーター、
メタロチオネインプロモーター、構成的アデノウイルス主要後期プロモーター、
デキサメタゾン誘導性ＭＭＴＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＭＲＰ
ｐｏｌＩＩＩプロモーター、構成的ＭＰＳＶプロモーター、構成的ＣＭＶプロモ
ーター、および当該分野において公知のプロモーター−エンハンサーの組合せ）
由来のランダムなフラグメント、既知のプロモーターに由来するモジュールを構
成する合成オリゴヌクレオチド、ランダムな配列のポリヌクレオチド、および他
の配列が挙げられる。１よりも多い回の変異が存在する実施態様において、異な
るポリヌクレオチドが、異なる工程にて挿入され得る。例えば、基質集団は、Ｍ
ＭＴＶプロモーターエレメントのランダムなフラグメントのランダムな挿入によ
って変異され得、そして選択された集団は、メタロチオネインプロモーター由来
の規定されたフラグメントのランダムな挿入によって変異され得る。
って変異される。上記されるように、挿入に適切なポリヌクレオチドの例として
は、既知のプロモーター（例えば、Ｔ細胞もしくは肝細胞特異的プロモーター、
メタロチオネインプロモーター、構成的アデノウイルス主要後期プロモーター、
デキサメタゾン誘導性ＭＭＴＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＭＲＰ
ｐｏｌＩＩＩプロモーター、構成的ＭＰＳＶプロモーター、構成的ＣＭＶプロモ
ーター、および当該分野において公知のプロモーター−エンハンサーの組合せ）
由来のランダムなフラグメント、既知のプロモーターに由来するモジュールを構
成する合成オリゴヌクレオチド、ランダムな配列のポリヌクレオチド、および他
の配列が挙げられる。１よりも多い回の変異が存在する実施態様において、異な
るポリヌクレオチドが、異なる工程にて挿入され得る。例えば、基質集団は、Ｍ
ＭＴＶプロモーターエレメントのランダムなフラグメントのランダムな挿入によ
って変異され得、そして選択された集団は、メタロチオネインプロモーター由来
の規定されたフラグメントのランダムな挿入によって変異され得る。
【００７０】 １つの適切なスクリーニングは、ポリヌクレオチドの変異集団を、特定の型（
例えば、Ｊｕｒｋａｔ Ｔリンパ球細胞株）の培養細胞中に形質導入すること、
（例えば、ＧＦＰ発現を検出する蛍光活性化セルソーティングを使用することに
よって）細胞中のレポーター遺伝子の発現をアッセイすること、ならびにレポー
ター遺伝子が発現される細胞を選択することを包含する。Ｊｕｒｋａｔ細胞型に
おける発現は、変異した肝細胞プロモーターセグメントが第２の細胞型における
転写を駆動する能力を獲得したことを示す。次いで、変異したＤＮＡセグメント
は、所望の特性（例えば、新しい発現の特異性）を示す形質導入された細胞の集
団から単離され、（プールとして単離されていない場合に）プールされ、そして
ランダムな挿入／欠失の変異誘発またはランダムな組換えのさらなる回に使用さ
れ得る。変異およびスクリーニングの引き続く回は、Ｊｕｒｋａｔ細胞において
より高ＧＦＰ発現レベルを有する部分集団を進化させるために使用され得、プロ
モーターに他のエレメントを付加する（例えば、ステロイドホルモン誘導性を付
与する）。さらなるスクリーニングは、所望される場合、さらなる所望の特徴を
有する新規なプロモーターを同定するために実行され得る。例えば、Ｔ細胞にお
ける発現を駆動する、上記の変異したＤＮＡセグメントの能力のスクリーニング
の後またはそれと同時に、肝細胞中にＤＮＡセグメントの集団を形質導入し、肝
細胞にて転写を駆動する能力（または能力の欠損）についてスクリーニングする
ことが所望され得る。スクリーニングの組合せを使用して、例えば、Ｔ細胞およ
び肝細胞にて発現を駆動するが、β細胞にて発現を駆動しない、新規なプロモー
ター配列を同定することが可能である。細胞型および他のバリエーションのさら
なるパネルは、本開示を読む当業者に明らかである。
例えば、Ｊｕｒｋａｔ Ｔリンパ球細胞株）の培養細胞中に形質導入すること、
（例えば、ＧＦＰ発現を検出する蛍光活性化セルソーティングを使用することに
よって）細胞中のレポーター遺伝子の発現をアッセイすること、ならびにレポー
ター遺伝子が発現される細胞を選択することを包含する。Ｊｕｒｋａｔ細胞型に
おける発現は、変異した肝細胞プロモーターセグメントが第２の細胞型における
転写を駆動する能力を獲得したことを示す。次いで、変異したＤＮＡセグメント
は、所望の特性（例えば、新しい発現の特異性）を示す形質導入された細胞の集
団から単離され、（プールとして単離されていない場合に）プールされ、そして
ランダムな挿入／欠失の変異誘発またはランダムな組換えのさらなる回に使用さ
れ得る。変異およびスクリーニングの引き続く回は、Ｊｕｒｋａｔ細胞において
より高ＧＦＰ発現レベルを有する部分集団を進化させるために使用され得、プロ
モーターに他のエレメントを付加する（例えば、ステロイドホルモン誘導性を付
与する）。さらなるスクリーニングは、所望される場合、さらなる所望の特徴を
有する新規なプロモーターを同定するために実行され得る。例えば、Ｔ細胞にお
ける発現を駆動する、上記の変異したＤＮＡセグメントの能力のスクリーニング
の後またはそれと同時に、肝細胞中にＤＮＡセグメントの集団を形質導入し、肝
細胞にて転写を駆動する能力（または能力の欠損）についてスクリーニングする
ことが所望され得る。スクリーニングの組合せを使用して、例えば、Ｔ細胞およ
び肝細胞にて発現を駆動するが、β細胞にて発現を駆動しない、新規なプロモー
ター配列を同定することが可能である。細胞型および他のバリエーションのさら
なるパネルは、本開示を読む当業者に明らかである。
【００７１】 上記のスクリーニングにおいて、当業者に公知のコントロール実験もまた、通
常、実行されることが認識される。所望される場合、この新しい転写特異性を有
するＤＮＡセグメントが、さらなる操作のために細胞から単離され得る（例えば
、種々のコード配列に作動可能に連結され得る）。
常、実行されることが認識される。所望される場合、この新しい転写特異性を有
するＤＮＡセグメントが、さらなる操作のために細胞から単離され得る（例えば
、種々のコード配列に作動可能に連結され得る）。
【００７２】 当業者に明らかなように、変異工程が、プロモーターおよびレポーター遺伝子
を含むベクターにて実行される場合、いくつかの変異は、レポーター遺伝子の機
能を（例えば、フレームシフトを導入することによって）不能にし得る。このよ
うな場合、変異集団中の「非増殖性変異体」は、スクリーニング工程において除
去される。あるいは、変異工程は、プロモーターのみを含むベクターにて実行さ
れ得、変異の後に、このプロモーター配列は、（例えば、制限およびライゲーシ
ョンならびに／あるいはプロモーター配列のＰＣＲ増幅およびこの産物の挿入に
よって）レポーター遺伝子を含むプリスチンベクター中にカセットとして移され
得る。種々のストラテジーは、本開示の指針に従い当業者に明らかである。
を含むベクターにて実行される場合、いくつかの変異は、レポーター遺伝子の機
能を（例えば、フレームシフトを導入することによって）不能にし得る。このよ
うな場合、変異集団中の「非増殖性変異体」は、スクリーニング工程において除
去される。あるいは、変異工程は、プロモーターのみを含むベクターにて実行さ
れ得、変異の後に、このプロモーター配列は、（例えば、制限およびライゲーシ
ョンならびに／あるいはプロモーター配列のＰＣＲ増幅およびこの産物の挿入に
よって）レポーター遺伝子を含むプリスチンベクター中にカセットとして移され
得る。種々のストラテジーは、本開示の指針に従い当業者に明らかである。
【００７３】 （例示的な適用２：酵素活性の変化） 本発明のいくつかの実施態様において、基質集団は、酵素活性を有するポリペ
プチドをコードするＤＮＡセグメントの集団であり、そして所望の特性は、新し
い酵素活性である。１つの実施態様において、基質ＤＮＡセグメントは、β−ガ
ラクトシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードし、そして所望される異なる
酵素特異性は、フコシダーゼ活性である。（５〜２０塩基対の）代替的な欠失に
よる変異および（ランダムなヘキサマーのライブラリーに由来する）挿入の再帰
の回は、Ｚｈａｎｇら、１９９７、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
９４：４５０４に記載されるようにスクリーニングと組み合わされ得る。上記の
ように、タンパク質をコードするＤＮＡが変異される場合において、既存のリー
ディングフレームを保持する変異方法（例えば、複数の３ヌクレオチド塩基の欠
失および／または挿入）を使用することは、しばしば所望されるが、所望される
場合、非機能的なフレームシフト変異体が、スクリーニング工程の間に除去され
得る。
プチドをコードするＤＮＡセグメントの集団であり、そして所望の特性は、新し
い酵素活性である。１つの実施態様において、基質ＤＮＡセグメントは、β−ガ
ラクトシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードし、そして所望される異なる
酵素特異性は、フコシダーゼ活性である。（５〜２０塩基対の）代替的な欠失に
よる変異および（ランダムなヘキサマーのライブラリーに由来する）挿入の再帰
の回は、Ｚｈａｎｇら、１９９７、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
９４：４５０４に記載されるようにスクリーニングと組み合わされ得る。上記の
ように、タンパク質をコードするＤＮＡが変異される場合において、既存のリー
ディングフレームを保持する変異方法（例えば、複数の３ヌクレオチド塩基の欠
失および／または挿入）を使用することは、しばしば所望されるが、所望される
場合、非機能的なフレームシフト変異体が、スクリーニング工程の間に除去され
得る。
【００７４】 （例示的な適用３：コードされるＲＮＡの特性の変化） 本発明の方法は、ＤＮＡセグメントによりコードされるＲＮＡの調節エレメン
ト（または他の領域）を進化させるために使用され得る。例えば、物理的に結合
している（例えば、タンパク質をコードする配列の下流にコードされる）ｍＲＮ
Ａに安定性の増加を付与するＲＮＡ安定性エレメントが、既知である。従って、
本発明の１つの実施態様において、基質集団は、ｍＲＮＡをコードするＤＮＡセ
グメントの集団であり、そして所望の特性は、ｍＲＮＡ安定性の増大である。
ト（または他の領域）を進化させるために使用され得る。例えば、物理的に結合
している（例えば、タンパク質をコードする配列の下流にコードされる）ｍＲＮ
Ａに安定性の増加を付与するＲＮＡ安定性エレメントが、既知である。従って、
本発明の１つの実施態様において、基質集団は、ｍＲＮＡをコードするＤＮＡセ
グメントの集団であり、そして所望の特性は、ｍＲＮＡ安定性の増大である。
【００７５】 より安定なＲＮＡをコードするｍＲＮＡコード配列の進化は、ｍＲＮＡをコー
ドする基質集団中にＤＮＡ配列をランダムに挿入すること、およびタンパク質の
高いレベルの発現についてスクリーニングまたは選択すること（なぜなら、一般
に、遺伝子のタンパク質産物の発現は、ｍＲＮＡ安定性に比例するので）あるい
はｍＲＮＡの発現レベルを直接アッセイすることによって達成される。１つの実
施態様において、この挿入される配列は、既知の安定性エレメントに由来するＤ
ＮＡ配列のフラグメント（例えば、規定されたフラグメントまたはランダムなフ
ラグメント）である（Ｃｈａｎら、１９９８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ
．Ｓｃｉ．９５：６４３〜６５４７；Ｒｕｓｓｅｌｌら、１９９８、Ｍｏｌ．Ｃ
ｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１８：２１７３〜２１８３）。
ドする基質集団中にＤＮＡ配列をランダムに挿入すること、およびタンパク質の
高いレベルの発現についてスクリーニングまたは選択すること（なぜなら、一般
に、遺伝子のタンパク質産物の発現は、ｍＲＮＡ安定性に比例するので）あるい
はｍＲＮＡの発現レベルを直接アッセイすることによって達成される。１つの実
施態様において、この挿入される配列は、既知の安定性エレメントに由来するＤ
ＮＡ配列のフラグメント（例えば、規定されたフラグメントまたはランダムなフ
ラグメント）である（Ｃｈａｎら、１９９８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ
．Ｓｃｉ．９５：６４３〜６５４７；Ｒｕｓｓｅｌｌら、１９９８、Ｍｏｌ．Ｃ
ｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１８：２１７３〜２１８３）。
【００７６】 １つの実施態様において、変異集団中の遺伝子発現の増大が検出され、そして
得られたクローンのセット（または最高のｍＲＮＡ安定性を有する２〜２０個の
クローンのプール）（すなわち、選択された集団）は、シャッフリングにて、ま
たはさらなる変異についての標的集団として使用される。さらなる変異には、さ
らなる下流のｍＲＮＡ安定性を付与するフラグメントの挿入（より初期の工程に
て挿入されたフラグメントと同じかまたは異なる）、欠失およびｍＲＮＡ安定性
の増大についてのスクリーニング、あるいは（例えば、ＲＮＡをコードするＤＮ
Ａセグメントに異なる選択特性を付与する）異なる配列の挿入が挙げられ得る。
得られたクローンのセット（または最高のｍＲＮＡ安定性を有する２〜２０個の
クローンのプール）（すなわち、選択された集団）は、シャッフリングにて、ま
たはさらなる変異についての標的集団として使用される。さらなる変異には、さ
らなる下流のｍＲＮＡ安定性を付与するフラグメントの挿入（より初期の工程に
て挿入されたフラグメントと同じかまたは異なる）、欠失およびｍＲＮＡ安定性
の増大についてのスクリーニング、あるいは（例えば、ＲＮＡをコードするＤＮ
Ａセグメントに異なる選択特性を付与する）異なる配列の挿入が挙げられ得る。
【００７７】 （例示的な適用４：クローニングベクターまたは発現ベクターへの機能ドメイ
ンの付加） 本実施例において、基質集団のＤＮＡセグメントは、原核生物ベクターでも、
真核生物ベクターでもシャトルベクターでもよく、かつ特徴付けされたベクター
（例えば、ｐＵＣ１８）でも特徴付けされていないベクターでもよいクローニン
グベクターである。ベクターの例には、人工染色体、プラスミド、エピソーム、
ウイルス、バクテリオファージ、および可動エレメント（例えば、トランスポゾ
ン、挿入エレメント）が挙げられる。（例えば、耐性マーカーまたは目的の新規
な遺伝子をコードする）ポリペプチドをコードするカセット、調節エレメント、
遺伝子および調節エレメントの組合せ、あるいは他の機能エレメントまたは構造
エレメントを挿入することによって、新たな機能ドメインまたはエレメントをベ
クターに付加することがしばしば所望される。しかし、しばしば、挿入について
の最適な位置は、既知ではない。ベクターが複雑（例えば、ヒトパピローマウイ
ルスおよび他の真核生物ウイルス）であるか、または真菌、植物、細菌（例えば
、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔｅｓ）などの比較的に特徴付けられていない種にお
ける使用に意図される場合に、特定の特性または最適な特性を有するベクターを
設計することが特に困難である。ランダムな様式にて機能ドメインまたはそのフ
ラグメントを挿入すること、得られた変異集団をスクリーニングすること、およ
び再帰的挿入／欠失変異（および必要に応じて、シャッフリング）によって所望
の特性を最適化することによって、新規かつ最適化された特性を有するベクター
を効率的に作製することが可能である。
ンの付加） 本実施例において、基質集団のＤＮＡセグメントは、原核生物ベクターでも、
真核生物ベクターでもシャトルベクターでもよく、かつ特徴付けされたベクター
（例えば、ｐＵＣ１８）でも特徴付けされていないベクターでもよいクローニン
グベクターである。ベクターの例には、人工染色体、プラスミド、エピソーム、
ウイルス、バクテリオファージ、および可動エレメント（例えば、トランスポゾ
ン、挿入エレメント）が挙げられる。（例えば、耐性マーカーまたは目的の新規
な遺伝子をコードする）ポリペプチドをコードするカセット、調節エレメント、
遺伝子および調節エレメントの組合せ、あるいは他の機能エレメントまたは構造
エレメントを挿入することによって、新たな機能ドメインまたはエレメントをベ
クターに付加することがしばしば所望される。しかし、しばしば、挿入について
の最適な位置は、既知ではない。ベクターが複雑（例えば、ヒトパピローマウイ
ルスおよび他の真核生物ウイルス）であるか、または真菌、植物、細菌（例えば
、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔｅｓ）などの比較的に特徴付けられていない種にお
ける使用に意図される場合に、特定の特性または最適な特性を有するベクターを
設計することが特に困難である。ランダムな様式にて機能ドメインまたはそのフ
ラグメントを挿入すること、得られた変異集団をスクリーニングすること、およ
び再帰的挿入／欠失変異（および必要に応じて、シャッフリング）によって所望
の特性を最適化することによって、新規かつ最適化された特性を有するベクター
を効率的に作製することが可能である。
【００７８】 １つの実施態様において、発現カセット（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ ｌａｃプロ
モーターの制御下のＧＦＰ）は、ランダムに線状化されたベクターの混合物のプ
ール（例えば、ｐＵＣ１９、ｐＥＴ１１、ｐＢＲ３２２、およびｐＢＡＤ２４の
プール）のランダムな位置に挿入される。宿主細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）中
への形質転換の後に、このタンパク質の発現は、（例えば、その活性（例えば、
ＧＦＰに対する緑色蛍光）によりアッセイされるように）アッセイされ、そして
ＩＰＴＧまたはアラビノースによって誘導される場合、レポーター遺伝子の最高
レベルを発現するクローンが、同定されかつ単離される（例えば、Ｃｒａｍｅｒ
ｉら、１９９６、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１４：３１５〜３１９を参照
のこと）。ＤＮＡシャッフリングおよびさらなるスクリーニングが実行される。
得られた産物は、そのタンパク質の最高の発現特性を提供する位置にて、特定の
ベクター骨格中に位置するＧＦＰ構造遺伝子を含むベクターである。
モーターの制御下のＧＦＰ）は、ランダムに線状化されたベクターの混合物のプ
ール（例えば、ｐＵＣ１９、ｐＥＴ１１、ｐＢＲ３２２、およびｐＢＡＤ２４の
プール）のランダムな位置に挿入される。宿主細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）中
への形質転換の後に、このタンパク質の発現は、（例えば、その活性（例えば、
ＧＦＰに対する緑色蛍光）によりアッセイされるように）アッセイされ、そして
ＩＰＴＧまたはアラビノースによって誘導される場合、レポーター遺伝子の最高
レベルを発現するクローンが、同定されかつ単離される（例えば、Ｃｒａｍｅｒ
ｉら、１９９６、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１４：３１５〜３１９を参照
のこと）。ＤＮＡシャッフリングおよびさらなるスクリーニングが実行される。
得られた産物は、そのタンパク質の最高の発現特性を提供する位置にて、特定の
ベクター骨格中に位置するＧＦＰ構造遺伝子を含むベクターである。
【００７９】 （例示的適用５：細胞に対して多重遺伝子性表現型を付与するオペロンの構築
） 別の例において、本発明の方法を用いて、いくつかのコード配列（例えば、特
定の代謝経路において活性なタンパク質をコードする遺伝子）をコードする細菌
オペロンを生成する。従って、１つの実施態様において、発現されるタンパク質
（例えば、酵素）の各々についてのコード配列を、段階的様式（例えば、図１に
概説されるように）で、そのポリペプチドコード配列の転写を駆動し得る１つ以
上のプロモーターを含むベクター中に挿入する。各挿入工程の後、スクリーニン
グを、挿入されたポリペプチドにより付与される表現型を最適に発現する細胞に
ついて行う。得られた多重遺伝子オペロンは、互いに対して配置された各ポリペ
プチド配列、調節エレメント、および最適な発現（または他の選択された特性）
を生じる配置における他のベクターエレメントの各々を含む。
） 別の例において、本発明の方法を用いて、いくつかのコード配列（例えば、特
定の代謝経路において活性なタンパク質をコードする遺伝子）をコードする細菌
オペロンを生成する。従って、１つの実施態様において、発現されるタンパク質
（例えば、酵素）の各々についてのコード配列を、段階的様式（例えば、図１に
概説されるように）で、そのポリペプチドコード配列の転写を駆動し得る１つ以
上のプロモーターを含むベクター中に挿入する。各挿入工程の後、スクリーニン
グを、挿入されたポリペプチドにより付与される表現型を最適に発現する細胞に
ついて行う。得られた多重遺伝子オペロンは、互いに対して配置された各ポリペ
プチド配列、調節エレメント、および最適な発現（または他の選択された特性）
を生じる配置における他のベクターエレメントの各々を含む。
【００８０】 （例示的適用６：ポリペプチドへのアフィニティー選択Ｔａｇの挿入） 別の例において、アフィニティー選択Ｔａｇをコードするカセットは、ポリペ
プチドコード配列を含むＤＮＡセグメントの基質集団にランダムに挿入される。
このことによって生物学的活性を保持し、そしてアフィニティー選択される能力
を獲得した変異ポリペプチドを生じる。生物学的に活性なタンパク質に対するア
フィニティー選択タグの付加は、例えば、タンパク質精製のために有用である。
プチドコード配列を含むＤＮＡセグメントの基質集団にランダムに挿入される。
このことによって生物学的活性を保持し、そしてアフィニティー選択される能力
を獲得した変異ポリペプチドを生じる。生物学的に活性なタンパク質に対するア
フィニティー選択タグの付加は、例えば、タンパク質精製のために有用である。
【００８１】 その基質集団のポリペプチドコード配列にランダムに挿入され得る配列の例と
しては、アフィニティー選択オリゴペプチド配列またはアフィニティー選択ポリ
ペプチド配列をコードするポリヌクレオチド（例えば、免疫グロブリンにより認
識されるペプチドエピトープ）、抗抗体フラグメント（例えば、Ｖａｕｇｈａｎ
ら、１９９６、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１４：３０９−３１４）、および当該
分野で周知の他の配列が挙げられる。挿入後に、変異集団を組み合わせアッセイ
によりスクリーニングおよび／または選択する：代表的には、１つのアッセイは
、アフィニティー選択配列を含む変異ポリペプチドを同定し、そして第２のアッ
セイは、第２の生物学的特性（例えば、触媒的に活性な酵素）を有するポリペプ
チドを同定する。親和性についてのスクリーニング（アフィニティー選択）は、
任意の適切な方法（例えば、アフィニティークロマトグラフィー、免疫沈降など
）により行われ得る。いくつかの実施態様において、ファージディスプレイ系を
、アフィニティー富化のために使用する。このような系において、コードされた
オリゴペプチドまたはポリペプチドは、アフィニティーパートナーが結合しやす
い、細胞、ウイルスまたはバクテリオファージの表面に存在する（例えば、Ｅｒ
ｎｓｔら、１９９８、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２６：１７１８−
１７２３；ならびに米国特許第５，２２３，４０９号および同第５，４０３，４
８４号）。
しては、アフィニティー選択オリゴペプチド配列またはアフィニティー選択ポリ
ペプチド配列をコードするポリヌクレオチド（例えば、免疫グロブリンにより認
識されるペプチドエピトープ）、抗抗体フラグメント（例えば、Ｖａｕｇｈａｎ
ら、１９９６、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１４：３０９−３１４）、および当該
分野で周知の他の配列が挙げられる。挿入後に、変異集団を組み合わせアッセイ
によりスクリーニングおよび／または選択する：代表的には、１つのアッセイは
、アフィニティー選択配列を含む変異ポリペプチドを同定し、そして第２のアッ
セイは、第２の生物学的特性（例えば、触媒的に活性な酵素）を有するポリペプ
チドを同定する。親和性についてのスクリーニング（アフィニティー選択）は、
任意の適切な方法（例えば、アフィニティークロマトグラフィー、免疫沈降など
）により行われ得る。いくつかの実施態様において、ファージディスプレイ系を
、アフィニティー富化のために使用する。このような系において、コードされた
オリゴペプチドまたはポリペプチドは、アフィニティーパートナーが結合しやす
い、細胞、ウイルスまたはバクテリオファージの表面に存在する（例えば、Ｅｒ
ｎｓｔら、１９９８、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２６：１７１８−
１７２３；ならびに米国特許第５，２２３，４０９号および同第５，４０３，４
８４号）。
【００８２】 （例示的適用７：タンパク質ワクチンの生成） タンパク質ワクチンの生成は、抗原性タンパク質の不十分な発現またはＭＨＣ
複合体に対する提示のためには不十分な抗原のプロセシングにより、頻繁に制限
される。このことは、抗原由来の１つまたはいくつかのエピトープ配列を、十分
に発現されたか、または効率的にプロセシングされたタンパク質に挿入すること
により克服し得る。従って、１つのアプローチにおいて、複数のＴ細胞および／
またはＢ細胞エピトープを、公知のタンパク質「足場」に挿入する。１つの実施
態様において、本発明を用いて、高度に発現可能なタンパク質の足場に免疫原性
タンパク質の免疫優性Ｔ細胞およびＢ細胞エピトープの挿入により有効なワクチ
ンを生成する。
複合体に対する提示のためには不十分な抗原のプロセシングにより、頻繁に制限
される。このことは、抗原由来の１つまたはいくつかのエピトープ配列を、十分
に発現されたか、または効率的にプロセシングされたタンパク質に挿入すること
により克服し得る。従って、１つのアプローチにおいて、複数のＴ細胞および／
またはＢ細胞エピトープを、公知のタンパク質「足場」に挿入する。１つの実施
態様において、本発明を用いて、高度に発現可能なタンパク質の足場に免疫原性
タンパク質の免疫優性Ｔ細胞およびＢ細胞エピトープの挿入により有効なワクチ
ンを生成する。
【００８３】 例示的な実施態様において、ＨＩＶ ｇｐ１２０由来の公知のＢ細胞エピトー
プを、ヒトｓｃＦｖタンパク質に挿入し（Ｖａｕｇｈａｎら、１９９６ Ｎａｔ
ｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：３０９−３１４）、そしてＥ．ｃ
ｏｌｉ中で発現させた。キメラタンパク質におけるＢ細胞エピトープの存在を、
同時係属中の米国特許出願第０９／０２１７６９号、および６０／０７４，２９
４号に記載のようにスクリーニングする。ポジティブクローン（すなわち、選択
された集団由来）をプールし、そして全てのポジティブクローンをさらなるＢ細
胞エピトープおよび／またはＴ細胞エピトープの次の回の挿入のために使用する
。ＤＮＡシャッフリングを個々のクローン由来のＤＮＡを用いて行う。得られる
ポリペプチドは、複数の、十分に発現され、かつ十分にプロセシングされた免疫
原性ペプチドを含み、そしてこれはワクチンとして有用である。
プを、ヒトｓｃＦｖタンパク質に挿入し（Ｖａｕｇｈａｎら、１９９６ Ｎａｔ
ｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：３０９−３１４）、そしてＥ．ｃ
ｏｌｉ中で発現させた。キメラタンパク質におけるＢ細胞エピトープの存在を、
同時係属中の米国特許出願第０９／０２１７６９号、および６０／０７４，２９
４号に記載のようにスクリーニングする。ポジティブクローン（すなわち、選択
された集団由来）をプールし、そして全てのポジティブクローンをさらなるＢ細
胞エピトープおよび／またはＴ細胞エピトープの次の回の挿入のために使用する
。ＤＮＡシャッフリングを個々のクローン由来のＤＮＡを用いて行う。得られる
ポリペプチドは、複数の、十分に発現され、かつ十分にプロセシングされた免疫
原性ペプチドを含み、そしてこれはワクチンとして有用である。
【００８４】 （ＩＸ．実施例） 以下の実施例は、本発明の実施を例示するために提供される。
【００８５】 （実施例Ｉ：新たな調節可能なプロモーターを含む細菌ベクターの合成） 本実施例は、本発明の使用によって新規な特性を有するベクターを生成するこ
とを実証する。グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現し得る公知のベクター
（ｐＡＫ４００−ＧＦＰ）から始め、２サイクルのランダム挿入／欠失変異およ
び選択またはスクリーニングを含むプロセスを用いて、新規なベクターの一団を
生成する。この新たなベクターは、テトラサイクリン耐性、誘導性、およびＧＦ
Ｐ発現レベルに関して、（親ベクターと比較して）新たな所望の特性を有する。
とを実証する。グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現し得る公知のベクター
（ｐＡＫ４００−ＧＦＰ）から始め、２サイクルのランダム挿入／欠失変異およ
び選択またはスクリーニングを含むプロセスを用いて、新規なベクターの一団を
生成する。この新たなベクターは、テトラサイクリン耐性、誘導性、およびＧＦ
Ｐ発現レベルに関して、（親ベクターと比較して）新たな所望の特性を有する。
【００８６】 （Ａ）ランダムに線状化したｐＡＫ４００−ＧＦＰの合成） 親ベクターｐＡＫ４００−ＧＦＰは、ｐＡＫ４００ベクター（Ｋｒｅｂｂｅｒ
ら、１９９７、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．２０１：３５−５５）に基づく
が、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）のコード配列とともに、ｔｅｔR（テト
ラサイクリン耐性）遺伝子をコードする配列の置換により改変される。ｐＡＫ４
００−ＧＦＰを構築するために、ＧＦＰを、ｐＢＡＤＧＦＰ ｃｙｃｌｅ３（Ｃ
ｒａｍｅｒｉら、１９９６、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１４：３１５−３
１９）由来のプライマー「ＧＦＰ．Ｆｏｒ」および「ＧＦＰ．Ｒｅｖ」によりＰ
ＣＲ増幅し、そして３つのフラグメント連結においてＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩ
ＩＩにより、ｐＡＫ４００のＮｄｅＩおよびＨｉｎｄｌＩＩベクターフラグメン
ト中にクローニングし、「ｐＡＫ４００−ＧＦＰ」を得る。ｐＡＫ４００−ＧＦ
Ｐにおいて、ＧＦＰの発現は、ｌａｃプロモーターの制御下にあり、そしてイソ
プロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）により誘導される。このベクターはまた
、Ｅ．ｃｏｌｉ ｐＵＣ由来のＣｏｌＥｌ複製起点、効率的にｌａｃプロモータ
ーを抑制するためのｌａｃリプレッサーの発現のためのｌａｃＩ遺伝子、ファー
ジミド中の１本鎖ＤＮＡのパッケージングのためのｆｌ複製起点、およびクロラ
ムフェニコールに対する耐性（ＣａｍR）を付与するクロラムフェニコールアセ
チルトランスフェラーゼについての遺伝子を含む。
ら、１９９７、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．２０１：３５−５５）に基づく
が、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）のコード配列とともに、ｔｅｔR（テト
ラサイクリン耐性）遺伝子をコードする配列の置換により改変される。ｐＡＫ４
００−ＧＦＰを構築するために、ＧＦＰを、ｐＢＡＤＧＦＰ ｃｙｃｌｅ３（Ｃ
ｒａｍｅｒｉら、１９９６、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１４：３１５−３
１９）由来のプライマー「ＧＦＰ．Ｆｏｒ」および「ＧＦＰ．Ｒｅｖ」によりＰ
ＣＲ増幅し、そして３つのフラグメント連結においてＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩ
ＩＩにより、ｐＡＫ４００のＮｄｅＩおよびＨｉｎｄｌＩＩベクターフラグメン
ト中にクローニングし、「ｐＡＫ４００−ＧＦＰ」を得る。ｐＡＫ４００−ＧＦ
Ｐにおいて、ＧＦＰの発現は、ｌａｃプロモーターの制御下にあり、そしてイソ
プロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）により誘導される。このベクターはまた
、Ｅ．ｃｏｌｉ ｐＵＣ由来のＣｏｌＥｌ複製起点、効率的にｌａｃプロモータ
ーを抑制するためのｌａｃリプレッサーの発現のためのｌａｃＩ遺伝子、ファー
ジミド中の１本鎖ＤＮＡのパッケージングのためのｆｌ複製起点、およびクロラ
ムフェニコールに対する耐性（ＣａｍR）を付与するクロラムフェニコールアセ
チルトランスフェラーゼについての遺伝子を含む。
【００８７】 スーパーコイル状のｐＡＫ４００−ＧＦＰを、標準的な手順（例えば、Ｓａｍ
ｂｒｏｏｋら、前出）に従う、ＣｓＣｌ／エチジウムブロミド平衡遠心分離によ
りＥ．ｃｏｌｉ中に調製する。このベクターを、Ｃｈａｕｄｒｙら、１９９５、
Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２３：３８０５−３８０９に記載される
ように、エチジウムブロミドの存在下でＤＮＡｓｅ Ｉでの処理によるランダム
な切断によって線状化する。フェノール／クロロホルム抽出後、一旦ランダムに
ニックを入れた（ｎｉｃｋｅｄ）ベクターを、Ｓ１ヌクレアーゼで低ｐＨで処理
して、１本鎖ニックの反対を切断する（Ｃｈａｕｄｒｙら、前出）。ランダムに
線状化したベクターをフェノール／クロロホルムを用いて抽出し、沈澱させ、そ
してポリメラーゼ（確実にＤＮＡを平滑末端化するため）およびアルカリホスフ
ァターゼ（線状化した分子が自己連結することを妨げるため）を用いて処理する
。最後に線状化した（すなわち、一旦切断した）分子を、５％ポリアクリルアミ
ドゲル上でまたはＣｓＣｌ／エチジウムブロミド平衡遠心分離（Ｓａｍｂｒｏｏ
ｋら、前出）により精製する。
ｂｒｏｏｋら、前出）に従う、ＣｓＣｌ／エチジウムブロミド平衡遠心分離によ
りＥ．ｃｏｌｉ中に調製する。このベクターを、Ｃｈａｕｄｒｙら、１９９５、
Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２３：３８０５−３８０９に記載される
ように、エチジウムブロミドの存在下でＤＮＡｓｅ Ｉでの処理によるランダム
な切断によって線状化する。フェノール／クロロホルム抽出後、一旦ランダムに
ニックを入れた（ｎｉｃｋｅｄ）ベクターを、Ｓ１ヌクレアーゼで低ｐＨで処理
して、１本鎖ニックの反対を切断する（Ｃｈａｕｄｒｙら、前出）。ランダムに
線状化したベクターをフェノール／クロロホルムを用いて抽出し、沈澱させ、そ
してポリメラーゼ（確実にＤＮＡを平滑末端化するため）およびアルカリホスフ
ァターゼ（線状化した分子が自己連結することを妨げるため）を用いて処理する
。最後に線状化した（すなわち、一旦切断した）分子を、５％ポリアクリルアミ
ドゲル上でまたはＣｓＣｌ／エチジウムブロミド平衡遠心分離（Ｓａｍｂｒｏｏ
ｋら、前出）により精製する。
【００８８】 （Ｂ）ランダムな挿入のためのｔｅｔＲポリヌクレオチドの合成） Ｔｎ１０のｔｅｔR（テトラサイクリン耐性）遺伝子を含有するｔｅｔＲＡオ
ペロン（Ｓｃｈｏｌｌｍｅｉｅｒら、１９８４、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６
０：４９９〜５０３）を、リン酸化プライマーＴｅｔ．ＦｏｒおよびＴｅｔ．Ｒ
ｅｖならびにプルーフリーディングポリメラーゼ（Ｐｆｕ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎ
ｅ）を使用して、ｐＡＫ４００（Ｋｒｅｂｂｅｒら、１９９７、Ｊ．Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ．Ｍｅｔｈ．２０１：３５〜５５）からＰＣＲ増幅する。
ペロン（Ｓｃｈｏｌｌｍｅｉｅｒら、１９８４、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６
０：４９９〜５０３）を、リン酸化プライマーＴｅｔ．ＦｏｒおよびＴｅｔ．Ｒ
ｅｖならびにプルーフリーディングポリメラーゼ（Ｐｆｕ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎ
ｅ）を使用して、ｐＡＫ４００（Ｋｒｅｂｂｅｒら、１９９７、Ｊ．Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ．Ｍｅｔｈ．２０１：３５〜５５）からＰＣＲ増幅する。
【００８９】 （Ｃ）ｐＡＫ４００−ＧＦＰ中へのｔｅｔオペロンのランダムな挿入） 上記の（Ａ）および（Ｂ）の平滑末端化産物を標準的な手順（Ｓａｍｂｒｏｏ
ｋら、上記）に従ってお互いに連結する。
ｋら、上記）に従ってお互いに連結する。
【００９０】 （Ｄ）テトラサイクリンおよびクロラムフェニコール耐性についての選択、な
らびにＩＲＴＧによるＧＦＰの誘導性についてのスクリーニング） 工程（Ｃ）の連結反応物を、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２株中に形質転換する。形質
転換細胞をプレーティングし、そしてクロラムフェニコール、テトラサイクリン
およびＩＰＴＧを含有するＬＢアガー（「ＩＰＴＧプレート」）上で選択する。
３７℃での一晩の増殖の後、コロニーをグリーン蛍光タンパク質のＵＶ光への曝
露（ＧＦＰの発現を示す）に基づき選択する（Ｃｒａｍｅｒｉら、１９９６、Ｎ
ａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１４：３１５〜３１９）。ＧＦＰ発現コロニーを
、クロラムフェニコール、テトラサイクリン、および２％グルコースを含有する
アガープレート（「グルコースプレート」）上に、レプリカプレートして、ＧＦ
Ｐ発現についてアッセイする（ＵＶ照射下での検査）。ＤＮＡを、ＩＰＴＧプレ
ート（最初のプレーティング）上でＧＦＰを発現するが、グルコースプレート（
レプリカプレーティング）上では発現しない１００個のコロニーから調製する。
これらのＤＮＡセグメントは、ＣａｍR、ＴｅｔR、ＩＰＴＧ誘導性ＧＦＰ発現（
すなわち、ＩＰＴＧ誘導性プロモーター）の表現型を用いて（ｔｅｔＲＡ−オペ
ロンの位置について）異なるベクターの集団に欠陥を生じさせる。この集団中の
ベクターは、ｐＡＫ４００−ＧＦＰ−Ｔｅｔとも呼ばれ得る。上記のように、ｔ
ｅｔＲ遺伝子は、この集団中の異なる種の中の異なる位置において、挿入される
。
らびにＩＲＴＧによるＧＦＰの誘導性についてのスクリーニング） 工程（Ｃ）の連結反応物を、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２株中に形質転換する。形質
転換細胞をプレーティングし、そしてクロラムフェニコール、テトラサイクリン
およびＩＰＴＧを含有するＬＢアガー（「ＩＰＴＧプレート」）上で選択する。
３７℃での一晩の増殖の後、コロニーをグリーン蛍光タンパク質のＵＶ光への曝
露（ＧＦＰの発現を示す）に基づき選択する（Ｃｒａｍｅｒｉら、１９９６、Ｎ
ａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１４：３１５〜３１９）。ＧＦＰ発現コロニーを
、クロラムフェニコール、テトラサイクリン、および２％グルコースを含有する
アガープレート（「グルコースプレート」）上に、レプリカプレートして、ＧＦ
Ｐ発現についてアッセイする（ＵＶ照射下での検査）。ＤＮＡを、ＩＰＴＧプレ
ート（最初のプレーティング）上でＧＦＰを発現するが、グルコースプレート（
レプリカプレーティング）上では発現しない１００個のコロニーから調製する。
これらのＤＮＡセグメントは、ＣａｍR、ＴｅｔR、ＩＰＴＧ誘導性ＧＦＰ発現（
すなわち、ＩＰＴＧ誘導性プロモーター）の表現型を用いて（ｔｅｔＲＡ−オペ
ロンの位置について）異なるベクターの集団に欠陥を生じさせる。この集団中の
ベクターは、ｐＡＫ４００−ＧＦＰ−Ｔｅｔとも呼ばれ得る。上記のように、ｔ
ｅｔＲ遺伝子は、この集団中の異なる種の中の異なる位置において、挿入される
。
【００９１】 （Ｅ）Ｔｎ１０のｔｅｔ調節単位由来の二本鎖オリゴヌクレオチドの合成） ｔｎ１０プロモーターの２つのオペレーターをコードする、非リン酸化二重鎖
オリゴヌクレオチド（Ｏｐ１．Ｆｏｒ／Ｏｐ１．Ｒｅｖの対およびＯｐ２．Ｆｏ
ｒ／Ｏｐ２．Ｒｅｖの対（Ｂｅｒｔｒａｎｄら、１９８３、Ｇｅｎｅ ２３：１
４９〜１５６））を、化学的に合成する。２つのオリゴヌクレオチドをともに、
「ｔｅｔオリゴヌクレオチド」と呼ぶ。
オリゴヌクレオチド（Ｏｐ１．Ｆｏｒ／Ｏｐ１．Ｒｅｖの対およびＯｐ２．Ｆｏ
ｒ／Ｏｐ２．Ｒｅｖの対（Ｂｅｒｔｒａｎｄら、１９８３、Ｇｅｎｅ ２３：１
４９〜１５６））を、化学的に合成する。２つのオリゴヌクレオチドをともに、
「ｔｅｔオリゴヌクレオチド」と呼ぶ。
【００９２】 （Ｆ）直鎖状ベクターｐＡＫ４００−ＧＦＰ中へのｔｅｔオリゴヌクレオチド
の連結、およびｐＡＫ４００−ＧＦＰ−Ｔｅｔ中へのプロモーター領域の交換） この工程および次の工程において、ｔｅｔオリゴヌクレオチドを、直鎖状ｐＡ
Ｋ４００ベクター（上記の工程ＡにおいてｐＡＫ４００−ＧＦＰについて記載さ
れたように直鎖状化するが、脱リン酸化しない）中にランダムに挿入し、オリゴ
ヌクレオチドのランダムな挿入を含有するｐＡＫ４００ベクターの集団を生成す
る。次に、この集団（挿入物を含む）由来の（変異した）ｌａｃプロモーター領
域を、上記の工程Ｄにおいて作製されたｐＡＫ４００−ＧＦＰ−Ｔｅｔベクター
に移す。
の連結、およびｐＡＫ４００−ＧＦＰ−Ｔｅｔ中へのプロモーター領域の交換） この工程および次の工程において、ｔｅｔオリゴヌクレオチドを、直鎖状ｐＡ
Ｋ４００ベクター（上記の工程ＡにおいてｐＡＫ４００−ＧＦＰについて記載さ
れたように直鎖状化するが、脱リン酸化しない）中にランダムに挿入し、オリゴ
ヌクレオチドのランダムな挿入を含有するｐＡＫ４００ベクターの集団を生成す
る。次に、この集団（挿入物を含む）由来の（変異した）ｌａｃプロモーター領
域を、上記の工程Ｄにおいて作製されたｐＡＫ４００−ＧＦＰ−Ｔｅｔベクター
に移す。
【００９３】 （代替的な戦略は、ｐＡＫ４００−ＧＦＰ−Ｔｅｔベクター集団中にランダム
に挿入することである。使用される戦略は、好ましい。なぜなら、より少ないク
ローン（すなわち、ｔｅｔオリゴヌクレオチドがベクターの他の部位においてよ
りもむしろｌａｃプロモーター領域内にランダムに挿入されるクローンのみ）の
スクリーニングを必要とするからである。） 最初の工程として、二本鎖ｔｅｔオリゴヌクレオチドの濃度を、異なる量のオ
リゴヌクレオチドをランダムに直線化したベクター中に連結すること、次いで、
適切なＥ．ｃｏｌｉ Ｋ１２株中への形質転換により、最適化する。３７℃での
一晩の増殖の後、コロニーを計数する。オリゴヌクレオチドの最適濃度は、コロ
ニーの数をわずかに減少する濃度である。オリゴヌクレオチドの濃度の最適化は
、効率を上昇させるが、この工程は重要ではない。
に挿入することである。使用される戦略は、好ましい。なぜなら、より少ないク
ローン（すなわち、ｔｅｔオリゴヌクレオチドがベクターの他の部位においてよ
りもむしろｌａｃプロモーター領域内にランダムに挿入されるクローンのみ）の
スクリーニングを必要とするからである。） 最初の工程として、二本鎖ｔｅｔオリゴヌクレオチドの濃度を、異なる量のオ
リゴヌクレオチドをランダムに直線化したベクター中に連結すること、次いで、
適切なＥ．ｃｏｌｉ Ｋ１２株中への形質転換により、最適化する。３７℃での
一晩の増殖の後、コロニーを計数する。オリゴヌクレオチドの最適濃度は、コロ
ニーの数をわずかに減少する濃度である。オリゴヌクレオチドの濃度の最適化は
、効率を上昇させるが、この工程は重要ではない。
【００９４】 ランダムに直鎖状化したｐＡＫ４００（上記由来）への挿入について最適なオ
リゴヌクレオチド濃度を決定すると、ｔｅｔプロモーター領域の一部をコードす
る二本鎖ｔｅｔオリゴヌクレオチドを、平滑末端連結によって、ランダムに直鎖
状化したｐＡＫ４００中に挿入する。フェノール／クロロホルム抽出の後、生じ
る連結物を、ＫｐｎＩおよびＮｄｅＩを用いて、ｐＡＫ４００のｌａｃプロモー
ターに隣接する独特の部位で、切断する。ｌａｃプロモーターおよびｔｅｔプロ
モーターのオリゴヌクレオチドを含有する生じるフラグメントを、非変性８％ポ
リアクリルアミドゲル中での電気泳動を使用して単離する（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、
前出）。ｐＡＫ４００由来のＫｐｎＩ−ＮｄｅＩフラグメントは、２０９ｂｐで
ある。２０塩基対のオリゴヌクレオチドが挿入される場合、ｌａｃプロモーター
フラグメントは、サイズが２２９ｂｐまで増加する。従って、２２９ｂｐのバン
ドを、非変性ゲルから単離する。この単離されたフラグメントを、ＫｐｎＩおよ
びＮｄｅＩで消化されているｐＡＫ４００−ＧＦＰ−ＴＥＴベクターのプール中
にクローン化（連結）する。結果は、（通常は全てではないが）いくつかの生じ
る連結産物は、ランダムに変異したｌａｃプロモーター（すなわち、ｔｅｔプロ
モーターオリゴヌクレオチドのランダムな挿入物を含む）を、またランダムに変
異したｐＡＫ４００−ＧＦＰベクター（すなわち、ｔｅｔＲＡオペロンのランダ
ムな挿入による）中に含むというものである。
リゴヌクレオチド濃度を決定すると、ｔｅｔプロモーター領域の一部をコードす
る二本鎖ｔｅｔオリゴヌクレオチドを、平滑末端連結によって、ランダムに直鎖
状化したｐＡＫ４００中に挿入する。フェノール／クロロホルム抽出の後、生じ
る連結物を、ＫｐｎＩおよびＮｄｅＩを用いて、ｐＡＫ４００のｌａｃプロモー
ターに隣接する独特の部位で、切断する。ｌａｃプロモーターおよびｔｅｔプロ
モーターのオリゴヌクレオチドを含有する生じるフラグメントを、非変性８％ポ
リアクリルアミドゲル中での電気泳動を使用して単離する（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、
前出）。ｐＡＫ４００由来のＫｐｎＩ−ＮｄｅＩフラグメントは、２０９ｂｐで
ある。２０塩基対のオリゴヌクレオチドが挿入される場合、ｌａｃプロモーター
フラグメントは、サイズが２２９ｂｐまで増加する。従って、２２９ｂｐのバン
ドを、非変性ゲルから単離する。この単離されたフラグメントを、ＫｐｎＩおよ
びＮｄｅＩで消化されているｐＡＫ４００−ＧＦＰ−ＴＥＴベクターのプール中
にクローン化（連結）する。結果は、（通常は全てではないが）いくつかの生じ
る連結産物は、ランダムに変異したｌａｃプロモーター（すなわち、ｔｅｔプロ
モーターオリゴヌクレオチドのランダムな挿入物を含む）を、またランダムに変
異したｐＡＫ４００−ＧＦＰベクター（すなわち、ｔｅｔＲＡオペロンのランダ
ムな挿入による）中に含むというものである。
【００９５】 （Ｇ）ｔｅｔおよびｃａｍ耐性についての選択および、ＩＰＴＧおよび／また
はテトラサイクリンによるＧＦＰの誘導性についてのスクリーニング） 工程（Ｆ）の連結産物を、適切なＥ．ｃｏｌｉ Ｋ１２株中に形質転換する。
形質転換物をプレーティングし、そして３０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール
、５μｇ／ｍｌのテトラサイクリン、および２％グルコースを含むアガープレー
ト上で選択する。コロニーを３７℃で一晩増殖する。
はテトラサイクリンによるＧＦＰの誘導性についてのスクリーニング） 工程（Ｆ）の連結産物を、適切なＥ．ｃｏｌｉ Ｋ１２株中に形質転換する。
形質転換物をプレーティングし、そして３０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール
、５μｇ／ｍｌのテトラサイクリン、および２％グルコースを含むアガープレー
ト上で選択する。コロニーを３７℃で一晩増殖する。
【００９６】 組換え体をスクリーニングして、異なるプロモーターを有するベクターを同定
する。ＩＰＴＧおよび／またはテトラサイクリンの存在下および非存在下でのＧ
ＦＰの発現を下記に記載のように測定する。テトラサイクリン耐性およびクロラ
ムフェニコール耐性のコロニーを、２つの抗生物質の存在下での増殖によって選
択する。耐性コロニーを４つの異なるプレート上にレプリカプレートする。全て
のプレートは、クロラムフェニコール（ｐＡＫ４００ベクター骨格のＣａｍRに
ついて選択するため）を含む。プレート２は、さらにＩＰＴＧを含む。プレート
３は、さらにテトラサイクリンを含む。プレート４は、テトラサイクリンおよび
ＩＰＴＧをさらに含む。
する。ＩＰＴＧおよび／またはテトラサイクリンの存在下および非存在下でのＧ
ＦＰの発現を下記に記載のように測定する。テトラサイクリン耐性およびクロラ
ムフェニコール耐性のコロニーを、２つの抗生物質の存在下での増殖によって選
択する。耐性コロニーを４つの異なるプレート上にレプリカプレートする。全て
のプレートは、クロラムフェニコール（ｐＡＫ４００ベクター骨格のＣａｍRに
ついて選択するため）を含む。プレート２は、さらにＩＰＴＧを含む。プレート
３は、さらにテトラサイクリンを含む。プレート４は、テトラサイクリンおよび
ＩＰＴＧをさらに含む。
【００９７】 コロニーによるＧＦＰレポーター遺伝子の発現をＵＶ光に曝露されたコロニー
の緑色蛍光の、視覚的または電子的観察によって検出する（Ｃｒａｍｅｒｉら、
１９９６、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１４：３１５〜３１９）。１つのプ
レート上でＧＦＰを発現し、そして他のプレートの１つでＧＦＰを発現しないコ
ロニーは、ＩＰＴＧおよび／またはテトラサイクリンによって調節される。親の
ベクター（もっぱら、ＩＰＴＧの存在または非存在によって調節される）と比較
して、テトラサイクリンの存在または非存在によって、ＧＦＰ発現が、増加する
か、または減少するかのいずれかのコロニーは、親において存在しなかった調節
機能を有する。このスクリーニングは、新規の表現型（すなわち、ＣａｍR、Ｔ
ｅｔR、およびテトラサイクリンおよびＩＰＴＧの異なる組み合わせを使用する
場合のＧＦＰ発現）を有するベクターを集団を同定し得る。
の緑色蛍光の、視覚的または電子的観察によって検出する（Ｃｒａｍｅｒｉら、
１９９６、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１４：３１５〜３１９）。１つのプ
レート上でＧＦＰを発現し、そして他のプレートの１つでＧＦＰを発現しないコ
ロニーは、ＩＰＴＧおよび／またはテトラサイクリンによって調節される。親の
ベクター（もっぱら、ＩＰＴＧの存在または非存在によって調節される）と比較
して、テトラサイクリンの存在または非存在によって、ＧＦＰ発現が、増加する
か、または減少するかのいずれかのコロニーは、親において存在しなかった調節
機能を有する。このスクリーニングは、新規の表現型（すなわち、ＣａｍR、Ｔ
ｅｔR、およびテトラサイクリンおよびＩＰＴＧの異なる組み合わせを使用する
場合のＧＦＰ発現）を有するベクターを集団を同定し得る。
【００９８】 これらのベクターの記載された特徴は、挿入のさらなる回、欠失の回によるか
、またはシャッフリングにより、上記と同一のスクリーニング（および、例えば
、ＧＦＰ発現の増加したレベルのアッセイによる）か、または他のスクリーニン
グを使用して、さらに増強され得る。
、またはシャッフリングにより、上記と同一のスクリーニング（および、例えば
、ＧＦＰ発現の増加したレベルのアッセイによる）か、または他のスクリーニン
グを使用して、さらに増強され得る。
【００９９】 （実施例ＩＩ：インビボでのビオチン化ペプチドを含むβ−ラクタマーゼの産
生） この実施例は、インビボでのビオチン化配列を含む、高い活性のβ−ラクタマ
ーゼペプチドの産生を実証する。β−ラクタマーゼ遺伝子は、細菌において発現
される場合、アンピシリン耐性を付与し得る；このビオチン化配列を使用して、
高い活性のβ−ラクタマーゼポリペプチドを含むポリヌクレオチドを検出または
精製し得る。この実施例は、本発明の技法を用いた新規の多機能性ポリペプチド
の生成を示す。
生） この実施例は、インビボでのビオチン化配列を含む、高い活性のβ−ラクタマ
ーゼペプチドの産生を実証する。β−ラクタマーゼ遺伝子は、細菌において発現
される場合、アンピシリン耐性を付与し得る；このビオチン化配列を使用して、
高い活性のβ−ラクタマーゼポリペプチドを含むポリヌクレオチドを検出または
精製し得る。この実施例は、本発明の技法を用いた新規の多機能性ポリペプチド
の生成を示す。
【０１００】 Ａ）ｂｌａ遺伝子（β−ラクタマーゼをコードする）を、プライマーＢｌａ．
ＦｏｒおよびＢｌａ．Ｒｅｖを用いてｐＵＣ１９から増幅し、そして続いてｐＡ
Ｋ２００のＳｆｉＩ制限部位中にクローン化する（Ｋｒｅｂｂｅｒら、１９９７
、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．２０１：３５〜５５）。得られるベクター、
ｐＡＫ２００ＳＡＭＰは、実施例Ｉ（前出）に記載されるように、ランダムに線
状化される（しかしリン酸化されない）。
ＦｏｒおよびＢｌａ．Ｒｅｖを用いてｐＵＣ１９から増幅し、そして続いてｐＡ
Ｋ２００のＳｆｉＩ制限部位中にクローン化する（Ｋｒｅｂｂｅｒら、１９９７
、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．２０１：３５〜５５）。得られるベクター、
ｐＡＫ２００ＳＡＭＰは、実施例Ｉ（前出）に記載されるように、ランダムに線
状化される（しかしリン酸化されない）。
【０１０１】 二本鎖の９０ｂｐポリデオキシリボヌクレオチドを、９０マーのＢｉｏ．Ｒｅ
ｖおよびＢｉｏ．Ｆｏｒ（インビボでのビオチン化部位配列を有するポリペプチ
ドをコードする）（Ｓｃｈａｔｚ、１９９３、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
１１：１１３８〜１１４３）のアニーリングにより生成し、過剰に添加し、そし
てランダムに線状化されたｐＡＫ２００ＳＡＭＰベクターに、ランダムな位置で
連結する。ｂｉｒＡによりコードされる内因性ビオチンホロ酵素シンテターゼを
発現するタンパク質が、Ｅ．ｃｏｌｉ株中で発現される場合、このインビボでの
ビオチン化部位はビオチン化される（Ｂａｒｋｅｒら、１９８１、Ｊ．Ｍｏｌ．
Ｂｉｏｌ．１４６：４５１〜４６７）。
ｖおよびＢｉｏ．Ｆｏｒ（インビボでのビオチン化部位配列を有するポリペプチ
ドをコードする）（Ｓｃｈａｔｚ、１９９３、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
１１：１１３８〜１１４３）のアニーリングにより生成し、過剰に添加し、そし
てランダムに線状化されたｐＡＫ２００ＳＡＭＰベクターに、ランダムな位置で
連結する。ｂｉｒＡによりコードされる内因性ビオチンホロ酵素シンテターゼを
発現するタンパク質が、Ｅ．ｃｏｌｉ株中で発現される場合、このインビボでの
ビオチン化部位はビオチン化される（Ｂａｒｋｅｒら、１９８１、Ｊ．Ｍｏｌ．
Ｂｉｏｌ．１４６：４５１〜４６７）。
【０１０２】 ｐＡＫ２００ＳＡＭＰベクターをＳｆｉＩで切断する。ｂｌａ遺伝子および９
０ｂｐの挿入を含むフラグメントを、サイズにより同定し、そして標準的な方法
によりゲル精製する。このビオチン化配列を含むフラグメントは、約８９６ｂｐ
である（挿入物なしの約８０６ｂｐと比較して）。この精製したフラグメントを
、ファージディスプレイベクターｐＡＫ２００のＳｆｉＩ部位中にクローン化す
る（Ｋｒｅｂｂｅｒら、１９９７、前出）。ファージミドライブラリーの形質転
換の後、細菌を、３０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールおよび形質転換からの
回収を測定した複雑性の５０％に減少させる濃度のアンピシリンを含む２ＹＴ−
寒天プレート上に薄く塗る（測定した複雑性は、３０μｇ／ｍｌのクロラムフェ
ニコールを含む２ＹＴ−寒天上（本明細書中、以降「２ＹＴ−Ｃａｍ３０」プレ
ート）でプレーティングすることによって評価する）。
０ｂｐの挿入を含むフラグメントを、サイズにより同定し、そして標準的な方法
によりゲル精製する。このビオチン化配列を含むフラグメントは、約８９６ｂｐ
である（挿入物なしの約８０６ｂｐと比較して）。この精製したフラグメントを
、ファージディスプレイベクターｐＡＫ２００のＳｆｉＩ部位中にクローン化す
る（Ｋｒｅｂｂｅｒら、１９９７、前出）。ファージミドライブラリーの形質転
換の後、細菌を、３０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールおよび形質転換からの
回収を測定した複雑性の５０％に減少させる濃度のアンピシリンを含む２ＹＴ−
寒天プレート上に薄く塗る（測定した複雑性は、３０μｇ／ｍｌのクロラムフェ
ニコールを含む２ＹＴ−寒天上（本明細書中、以降「２ＹＴ−Ｃａｍ３０」プレ
ート）でプレーティングすることによって評価する）。
【０１０３】 ３０℃にて一晩の増殖の後、このプレートをかきとり、そして２ＹＴ中に再懸
濁する。アリコートを、上記の算出した濃度のアンピシリンを含む１００ｍｌの
２ＹＴ−Ｃａｍ３０に添加する。Ｋｒｅｂｂｅｒら、１９９７（前出）に従って
、ＶＣＳＭ１３（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）で同時感染させそして増殖させた後、
ファージを、磁気ビーズ（Ｄｙｎａｌ）上で固定されるストレプトアビジンに対
して２から４回、ＰＢＳ／透析した２％スキムミルク中で沈殿させ、そしてパニ
ングする（Ｈａｗｋｉｎｓら、１９９２、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２６：８８
９〜８９６）。単一のクローンのストレプトアビジンへの結合は、ファージＥＬ
ＩＳＡ（Ｌｉｎｄｎｅｒら、１９９７、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２２：１
４０〜４９）により変化する。これらのクローン（異種起源である）は、「ｐＡ
Ｋ２００−ｂｌａ−ｂｉｏ」と呼ばれる。アンピシリンプレート上での選択とパ
ニング手順との組み合わせにより、ビオチン化配列を含む活性β−ラクタマーゼ
遺伝子をコードするポリヌクレオチドを同定する。
濁する。アリコートを、上記の算出した濃度のアンピシリンを含む１００ｍｌの
２ＹＴ−Ｃａｍ３０に添加する。Ｋｒｅｂｂｅｒら、１９９７（前出）に従って
、ＶＣＳＭ１３（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）で同時感染させそして増殖させた後、
ファージを、磁気ビーズ（Ｄｙｎａｌ）上で固定されるストレプトアビジンに対
して２から４回、ＰＢＳ／透析した２％スキムミルク中で沈殿させ、そしてパニ
ングする（Ｈａｗｋｉｎｓら、１９９２、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２６：８８
９〜８９６）。単一のクローンのストレプトアビジンへの結合は、ファージＥＬ
ＩＳＡ（Ｌｉｎｄｎｅｒら、１９９７、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２２：１
４０〜４９）により変化する。これらのクローン（異種起源である）は、「ｐＡ
Ｋ２００−ｂｌａ−ｂｉｏ」と呼ばれる。アンピシリンプレート上での選択とパ
ニング手順との組み合わせにより、ビオチン化配列を含む活性β−ラクタマーゼ
遺伝子をコードするポリヌクレオチドを同定する。
【０１０４】 Ｂ）Ａ節（前出）で生成されるｐＡＫ２００−ｂｌａ−ｂｉｏの発現およびβ
−ラクタマーゼ活性は、ＰＣＲシャッフリングにより最適化される（Ｓｔｅｍｍ
ｅｒ、１９９４、Ｎａｔｕｒｅ ３７０：３８９〜３９１）。これを行うために
、５〜１０のｐＡＫ２００−ｂｌａ−ｂｉｏ種（クローン）を、比較的高いβ−
ラクタマーゼ活性に基づいて選択する（高いアンピシリン濃度に対する宿主細菌
における耐性の付与により評価する）。ｂｌａ−ｂｉｏ挿入物を、Ｂｌａ．Ｆｏ
ｒおよびＢｌａ．Ｒｅｖプライマーを用いてＰＣＲにより増幅する。標準的なＰ
ＣＲシャッフリングプロトコル（Ｓｔｅｍｍｅｒ、１９９４、Ｎａｔｕｒｅ、前
出）に従って、ＰＣＲ産物を、ＤＮＡａｓｅＩによりランダムにフラグメント化
し、再アセンブリし、そしてｐＡＫ２００ＳＡＭＰのＳｆｉＩ部位中にクローン
化する。このライブラリーを、３０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールおよびア
ンピシリンを欠くプレート上で増殖された場合に、形質転換からの回収を測定さ
れた複雑性の２５％までに減少させる濃度のアンピシリン（「制限」濃度）を含
む２ＹＴ−寒天上で３０℃にて一晩増殖させる。前出に記載されるように、この
ライブラリーを、プレートからかきとり、制限濃度のアンピシリンの存在下で増
殖させ、そしてヘルパーファージ（前出）で同時感染して、ｂｌａ−ｂｉｏ融合
挿入体を提示するファージ粒子を産生する。これらのファージ粒子を、再度スト
レプトアビジンビーズ（前出）に対してパニングする。さらなるシャッフリング
の回を、アンピシリン濃度を増大させ、そして増殖、選択およびパニングの温度
を３７℃まで上昇させる選択的条件を用いて実行する。これは、活性、ビオチン
化レベル、折り畳みおよび安定性に関してｂｌａ−ｂｉｏ挿入融合体のさらなる
最適化を可能にする。最適な活性を有する融合体は、例えば、サンドイッチＥＬ
ＩＳＡにおけるβ−ラクタマーゼ活性を測定することによる、ストレプトアビジ
ンの定量のために使用され得る。
−ラクタマーゼ活性は、ＰＣＲシャッフリングにより最適化される（Ｓｔｅｍｍ
ｅｒ、１９９４、Ｎａｔｕｒｅ ３７０：３８９〜３９１）。これを行うために
、５〜１０のｐＡＫ２００−ｂｌａ−ｂｉｏ種（クローン）を、比較的高いβ−
ラクタマーゼ活性に基づいて選択する（高いアンピシリン濃度に対する宿主細菌
における耐性の付与により評価する）。ｂｌａ−ｂｉｏ挿入物を、Ｂｌａ．Ｆｏ
ｒおよびＢｌａ．Ｒｅｖプライマーを用いてＰＣＲにより増幅する。標準的なＰ
ＣＲシャッフリングプロトコル（Ｓｔｅｍｍｅｒ、１９９４、Ｎａｔｕｒｅ、前
出）に従って、ＰＣＲ産物を、ＤＮＡａｓｅＩによりランダムにフラグメント化
し、再アセンブリし、そしてｐＡＫ２００ＳＡＭＰのＳｆｉＩ部位中にクローン
化する。このライブラリーを、３０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールおよびア
ンピシリンを欠くプレート上で増殖された場合に、形質転換からの回収を測定さ
れた複雑性の２５％までに減少させる濃度のアンピシリン（「制限」濃度）を含
む２ＹＴ−寒天上で３０℃にて一晩増殖させる。前出に記載されるように、この
ライブラリーを、プレートからかきとり、制限濃度のアンピシリンの存在下で増
殖させ、そしてヘルパーファージ（前出）で同時感染して、ｂｌａ−ｂｉｏ融合
挿入体を提示するファージ粒子を産生する。これらのファージ粒子を、再度スト
レプトアビジンビーズ（前出）に対してパニングする。さらなるシャッフリング
の回を、アンピシリン濃度を増大させ、そして増殖、選択およびパニングの温度
を３７℃まで上昇させる選択的条件を用いて実行する。これは、活性、ビオチン
化レベル、折り畳みおよび安定性に関してｂｌａ−ｂｉｏ挿入融合体のさらなる
最適化を可能にする。最適な活性を有する融合体は、例えば、サンドイッチＥＬ
ＩＳＡにおけるβ−ラクタマーゼ活性を測定することによる、ストレプトアビジ
ンの定量のために使用され得る。
【０１０５】
【表１】 本発明の多くの改変およびバリエーションは、当業者に明白であるように、そ
の精神および範囲を逸脱することなくなされ得る。本明細書中に記載される特定
の実施態様は、例示のみの目的で提供され、そして本発明は、添付の特許請求の
範囲に対して権利が与えられる等価物の全範囲とともに、そのような特許請求の
範囲の用語のみに限定されない。
の精神および範囲を逸脱することなくなされ得る。本明細書中に記載される特定
の実施態様は、例示のみの目的で提供され、そして本発明は、添付の特許請求の
範囲に対して権利が与えられる等価物の全範囲とともに、そのような特許請求の
範囲の用語のみに限定されない。
【０１０６】 本明細書中で引用される全ての参考文献は、各個々の出版物または特許出願が
具体的にかつ別々に、全ての目的のためにその全体において参考として援用され
るように示されるのと同じ程度に、その全体において参考としておよび全ての目
的のために本明細書中で援用される。
具体的にかつ別々に、全ての目的のためにその全体において参考として援用され
るように示されるのと同じ程度に、その全体において参考としておよび全ての目
的のために本明細書中で援用される。
【図１】 図１は、本発明の実施態様のフロー図を提供する。この図において、ランダム
な挿入または欠失およびスクリーニングの再帰的工程を使用して、所望の特性を
有するＤＮＡセグメントを生成する。
な挿入または欠失およびスクリーニングの再帰的工程を使用して、所望の特性を
有するＤＮＡセグメントを生成する。
【図２】 図２は、本発明の実施態様のフロー図を提供する。この図において、ランダム
な挿入または欠失を、２つの異なる基質集団において行い、ついでこれを組換え
る。
な挿入または欠失を、２つの異なる基質集団において行い、ついでこれを組換え
る。
【図３】 図３は、本発明の実施態様のフロー図を提供する。この図において、ランダム
な挿入または欠失、スクリーニング、およびランダムな組換え工程を使用して、
所望の特性を有するＤＮＡセグメントを生成する。
な挿入または欠失、スクリーニング、およびランダムな組換え工程を使用して、
所望の特性を有するＤＮＡセグメントを生成する。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，Ｇ Ｅ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，Ｚ Ｗ
Claims (11)
- 【請求項１】 所望の機能的特性を有する組換えポリヌクレオチドを生成す
るための方法であって、該方法は、以下の工程： ａ）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの第１の基質集団を、エキソ
ヌクレアーゼを使用して第１のヌクレアーゼ感受性末端から欠失を作製すること
によって変異させ、それにより核酸セグメントを欠失した第１の集団が生成され
る、工程； ｂ）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの第２の基質集団を、エキソ
ヌクレアーゼを使用して第２のヌクレアーゼ感受性末端から欠失を作製すること
によって変異させ、それにより核酸セグメントを欠失した第２の集団が生成され
る、工程； ｃ）（ａ）において生成される欠失ポリヌクレオチドセグメントを、（ｂ）に
おいて生成した欠失ポリヌクレオチドセグメントに組換えて、組換えポリヌクレ
オチドの混合物を生成する工程；および ｄ）該組換えポリヌクレオチドの混合物をスクリーニングして、所望の機能的
特性を有する少なくとも１つの組換えポリヌクレオチドを同定する工程、 を包含する、方法。 - 【請求項２】 前記工程（ｄ）において同定された１つ以上の組換えポリヌ
クレオチドをＤＮＡシャッフリングに供する工程をさらに包含する、請求項１に
記載の方法。 - 【請求項３】 前記工程（ｄ）のスクリーニング工程が、以下： ａ）酵素活性； ｂ）結合活性；および ｃ）変性に対する安定性、 からなる群より選択される機能的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌ
クレオチドについてである、請求項１に記載の方法。 - 【請求項４】 前記活性が酵素活性である、請求項３に記載の方法。
- 【請求項５】 前記ポリヌクレオチドの基質集団が、同じ配列を有する複数
のポリヌクレオチドを含む、請求項１に記載の方法。 - 【請求項６】 前記基質集団が、関連配列を有するポリヌクレオチドの混合
物を含む、請求項１に記載の方法。 - 【請求項７】 前記関連配列が、関連遺伝子のファミリーを含む、請求項６
に記載の方法。 - 【請求項８】 前記関連配列が、異なる種由来のホモログ遺伝子を含む、請
求項６に記載の方法。 - 【請求項９】 前記工程（ｄ）の組換えポリヌクレオチドが、少なくともさ
らに１サイクルの変異誘発工程およびスクリーニング工程に供される、請求項１
に記載の方法。 - 【請求項１０】 前記少なくともさらに１サイクルの変異誘発工程およびス
クリーニング工程が、１つのセグメントが別のセグメントの伸長のためのテンプ
レートとして作用する条件下で、工程（ｄ）の組換えポリヌクレオチドの重複セ
グメントにポリヌクレオチド増幅プロセスを実行し、それにより、組換えポリヌ
クレオチドのさらなる集団を生成し、そして該組換えポリヌクレオチドのさらな
る集団を所望の特性ついてスクリーニングする工程を包含する、請求項９に記載
の方法。 - 【請求項１１】 前記所望の機能的特性を有する少なくとも１つの選択され
た組換えポリヌクレオチド配列についての単離または富化を包含する、請求項１
に記載の方法。
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