JP3056524B2 - 部分的相同性ｄｎａ配列の生体中組換え法 - Google Patents

部分的相同性ｄｎａ配列の生体中組換え法

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JP3056524B2 JP2501752A JP50175290A JP3056524B2 JP 3056524 B2 JP3056524 B2 JP 3056524B2 JP 2501752 A JP2501752 A JP 2501752A JP 50175290 A JP50175290 A JP 50175290A JP 3056524 B2 JP3056524 B2 JP 3056524B2
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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、特に30％に達する大きな塩基不対合部分を
有する部分的相同性DNA配列の生体中組換え法に関する
ものである。
このようにして、同一祖先を共有する相異なる種およ
び類の細胞または生体のレベルで個々の遺伝子を組換え
る事ができる。
また本発明は、相異なる種および／または類の生体の
生体中での交差および組換えによって組換えられた生体
の生産方法、および雑種遺伝子およびこれらの遺伝子に
よってコード付けされたタンパク質の生体中生産方法に
関するものである。
DNAの合成に際して、誤って、不対合部分と呼ばれる
非補形塩基対が得られる事がある。DNA中の誤り（塩基
の不対合部分または非対合部分）の修正法が存在する。
この方法は酵素システムを介在させる。すなわち、バク
テリアEscherichia ColiおよびSalmonella typhimurium
においては、誤りは非常に急速に正確に２種の酵素（Mu
tSおよびMutL）によって検出され、これらの酵素が第３
酵素（MutU）によってDNAの２鎖を派生させ、第４酵素
（MutH）によって新合成鎖をDNA配列（GATC）に切断
し、これをさらに他の酵素（参照文献:1）によってメチ
ル化する。最もしばしば見られる誤りG:T,A:Cおよび少
なくとも１つの塩基が最も有効に修復される。これらの
酵素Mutによって検出されず、またはよく検出されない
誤り（一部の箇所におけるG:A、C:TおよびC:C）は２つ
の鎖を「開く」特殊構造を有する。
今日まで交雑種または雑種遺伝子を得るには、多くの
問題があった。交雑種に関しては、植物の分野で試験管
中で細胞融合によって実施される最も進んだ試みは遺伝
子の不安定性という大きな問題に突き当たった。雑種遺
伝子または雑種酵素を得る事は試験管中において遺伝的
遺伝子によってのみ可能であった。
本発明の目的は、新種の交雑種、特に新種の雑種遺伝
子または雑種酵素を試験管中において遺伝子間および／
または種間組換えによって効率的に、またより容易に生
産するにある。
そのため、本発明の第１実施態様によれば、DNAの塩
基の不対合部分の修復システムの中に欠陥を有する突然
変異体を使用し、または遺伝子間組換えを増大するその
他の突然変異体を使用する。
特に、Escherichia ColiおよびSalmonella typhimuri
umの菌株mut、特にmut L,S,HまたはU,あるいはStreptoc
occus pneumoniaeの菌株hex（参照文献:2）および酵母
株のpms（参照文献:3）をあげる事ができる。
実際に本発明によれば、種形成の分子メカニズム、従
って新種出現のメカニズムは不対合部分修復酵素のみの
活性の厳格な制御を必要としている事が発見された。実
際上、本発明はこれらの不対合部分修復酵素の持ってい
る、DNA塩基不対合部分によって刺激される、「抗組換
え」機能を利用するにある。この機能が種形成の分子メ
カニズム、すなわち新種の最初の遺伝的分離メカニズム
を決定する。
しかし、DNA塩基の不対合部分修復酵素システム中に
欠陥突然変異体を使用する代わりに、所望の組換え体を
得る時間、このシステムを一時的に飽和作用によって不
活性化する事ができる。
不対合部分修復突然変異体が遺伝的に不安定である事
を考慮して、正常な遺伝的安定性に戻る前に、所望の遺
伝的構成に必要なその一時的欠陥を利用する事は好まし
い方法である。従来のバイオテクノロジーの主要な問題
は「工業的」菌株の遺伝的不安定性である。所望の変異
体の選択後に、その固有の遺伝的安定性が劣化し、発酵
器中での成長中に野生型に戻る。
本発明による不対合部分修復システムの一時的不活性
化の方策は２つある。
ａ）Escherichia Coliにおける遺伝的構成のためにEsch
erichia Coliの条件的修復突然変異体（mutSts−１）を
利用する方法、 ｂ）多数の不対合部分を細胞中に導入する事による修復
システムの飽和、すなわち機能的不活性化。この方法は
任意の生体に使用可能である。
従って本発明の目的は、部分的相同性DNA配列の生体
中組換え法において、前記DNA配列間の組換えを生じる
時間、飽和作用によって、または遺伝的組換えを増大す
る突然変異体によって、一時的に欠陥を示しまたは不活
性化された塩基不対合部分修復酵素システムを有する細
胞または生体の中に、前記部分的相同性DNA配列を加え
る方法にある。
従って必要な場合には、少なくとも１つの酵素、すな
わち組換えあるいは誤りの本来の修復に関わる酵素を不
活性化する事が望ましい。
組換えられるべきDNA配列は染色体内配列としまたは
染色体外の配列とする事ができるが、後者の場合は各ク
ローニング遺伝子間の組換えを可能とする。
生体中のこの組換え法の応用として、本発明の他の目
的は雑種遺伝子およびそのコード付けられたタンパク質
の生体中生産法において、塩基不対合部分修復酵素シス
テムにおいて欠陥を有しまたは不活性化された前記生体
の中に、２種の相異なる生体から派生し部分的相同性遺
伝子から成る２種の前記DNA配列を存在させる段階と、
所望の雑種遺伝子またはそのコード付けされたタンパク
質を選択する段階とを含む事を特徴とする方法にある。
この場合、染色体外の生体中生産である。
例えばプラスミドの上に、同一機能のコードを有する
が相異なる配列と相異なる生成物酵素特性を有する２種
の部分的相同性遺伝子を導入し、つぎにペトリシャーレ
上で数千の相異なる組換えの中から興味ある組換えを選
定する事ができる。これは、試験管中の遺伝的遺伝子の
膨大な作業に相当する。
また本発明は、雑種遺伝子およびそのコード付けタン
パク質の生体中生産法において、第１生体の第１遺伝子
が第１プラスミドによって保持され、第２生体の部分的
相同性第２遺伝子が、欠陥のある塩基不対合部分修復酵
素システムを有するバクテリアの中に、または遺伝子間
組換えを増大するその他任意のバクテリアの中に、ある
いは一時的に不活性化された塩基不対合部分修復酵素シ
ステムを有するバクテリアの中に転換によって導入され
る段階と、前記遺伝子を組換える段階と、所望の雑種遺
伝子またはそのコード付けされたタンパク質を選択する
段階とを含む方法を提供する。
さらに詳しくは前記の方法において、組換えられる遺
伝子を保持するプラスミドと共に転換されるバクテリア
は、塩基不対合部分修復酵素システムにおいて欠陥を有
しまたは一時的に不活性化された菌株E.coliまたはSalm
onella typhimurium、または遺伝子間組換えを増大する
このようなバクテリアのその他の任意の突然変異体とす
る事ができる。
望ましくはE.coliにおけるすべての構成については、
不対合部分の修復機能のための感熱性菌株、例えばE.co
li mutSts-1を使用する。この菌株は42℃において変異
性mutS−、または32℃において正常mut＋である。42℃
において異種特異的組換えを活性化し、32℃において所
望の特性を選定する。
本発明の他の目的は、本発明による生体中組換え法の
応用として転換技術または融合技術によって組換えられ
た細胞を生産する方法において、 −下記を使用し、 ・第１類および第１種の生体の細胞のDNA、 ・第２種および／または第２類の生体の細胞の染色体
DNA、 第２種または第２類の生体の前記細胞は塩基不対合部
分修復酵素システムの中において欠陥を有しまたは特に
飽和作用によって一時的に不活性化されているようにし
て生体中転換および組換えを実施する方法、あるいは −これらの２つの型の細胞の融合後にこれらの細胞の染
色体の生体中組換えを実施し、これらの細胞はいずれも
欠陥を有する塩基不対合部分修復酵素システムを有し、
あるいは特に飽和作用によって一時的に不活性化された
前記システムを有する方法とを含む。
また本発明の目的は、本発明による生体中組換え法の
応用として、相異なる種および／または類の生体の生体
中交差および組換えによって組換えられた生体を生産す
る方法において、 −第１種および第１類の生体と、 −第２種および／または第２類の生体との間において、 生体中交差および組換えを実施し、これら２種の生体
の少なくとも一方は塩基不対合部分修復酵素システム中
において欠陥を示し、または特に飽和作用によって一時
的に不活性化された前記システムを有する段階を含む方
法を提供するにある。
本発明により組換えられた細胞または生体の生産法に
おいては、バクテリアのみならず、酵母菌、植物または
動物の組換え細胞または組換え生体を生産する事ができ
る。特に本発明は、相異なる種および／または類のバク
テリアの交差と組換えによって組換えられたバクテリア
の生産方法において、 −塩基不対合部分修復酵素システムにおいて欠陥を有し
またはその塩基不対合部分修復酵素システムが特に飽和
作用によって一時的に不活性化された第１種および第１
類のいわゆる受容体バクテリアと、 −受容体細胞に与えようとする特性を有する第２種およ
び／または第２類のいわゆる供与体バクテリアとの間
で、 生体中において接合および形質導入する方法にある。
望ましくは、いわゆる受容体バクテリアはさらにDNA
の制限酵素システムの中において欠陥を有する。
本発明はバクテリアの接合の分野で有望である事が明
らかになった。140,000,000年前に遺伝的に分離した２
類のバクテリアE.coliおよびSalmonella typhimurium
（Ochman ＆ Wison 1987）は現在、DNAの組換えによっ
ても交差しない。
Salmonella typhimuriumとE.coliとの接合による交差
は実際上無効である。すなわち、組換えが考察される場
所によってまったく存在せずまたは非常に弱い（Baron
et al.1959:Einsenstark 1965,Mergeay ＆ Gerits 198
3）。しかし例えば突然変異体によってMutL機能またはM
utS機能が除去されると、これらの菌株から140x106年後
に再び非常に有効な（突然変異体していないバクテリア
におけるよりも少なくとも106倍有効な）組換えによる
交差が再び得られる。このようにバクテリアの交差にお
いて、特異性間および遺伝子間の不毛状態に関する修復
酵素の役割が立証された。
本発明により組換えられたバクテリアの生産法の他の
実施態様においては、菌株E.coliおよび菌株Salmonella
typhimuriumを交差させ、少なくともその一方（受容
体）が塩基不対合部分修復酵素システムにおいて欠陥を
有しまたは特に飽和によって不活性化されている。
好ましくは、Hfr型の供与体バクテリアをＦ−型の受
容体バクテリアと接合する。
本発明の特定の実施態様において、供与体菌株E.coli
Hfrと、MutS型またはMutL型の塩基不対合部分修復酵
素システムにおいて欠陥を有する、すなわち不対合部分
の認識に介入するタンパク質MutSおよびMutLにおいて欠
陥を有する突然変異菌株Salmonella typhimurium Ｆ−
との間の接合を実施した。
本発明による組換えバクテリアの生産方法は新規な菌
株を生産する事ができる。例えば、菌株E.coliとの交差
によって無毒性に成されているが病原性Salmonella ty
phimurium菌株の表面の抗原決定子を担持している減衰
された病原性Salmonella typhimurium菌株を生産する事
ができ、これは対応すのサルモネローズに対するワクチ
ンの生産に利用される。
本発明による組換え生体生産法の応用として、本発明
の他の目的は、２種の部分的相同性遺伝子から雑種遺伝
子およびそのコード付けされたタンパク質を生体中生産
する方法において、第１遺伝子を含有する前記第１生体
の細胞と、部分的相同性第２遺伝子を含有する前記第２
生体の細胞とから組換え細胞を生産する段階と、所望の
雑種遺伝子またはそのコード付けタンパク質を選択する
段階とを含む方法が提供される。
さらに詳しくは、塩基不対合部分修復突然変異体を使
用して相異なる起源のバクテリアを交差し、このように
して新規な遺伝子を生産し、所望の特性を選択する。こ
の場合は、染色体遺伝子の処理である。
前述のように、塩基不対合部分修復酵素システムにお
いて突然変異体を利用する代わりに、不対合部分の豊富
なDNAの異種二重らせんをトランスフェクションによっ
て導入する事によって前記酵素システムを飽和する事が
できる。
最後に本発明の目的は、突然変異前に、修復しようと
する変異塩基を含む遺伝子を生体中においてこの遺伝子
の標的逆突然変異誘発を実施する方法において、生体の
塩基不対合部分修復酵素システムを飽和作用によって不
活性化するための多数の不対合部分を含有する異種二重
らせん、および遺伝子の突然変異体の前と同様に修復さ
れたDNA配列から成るオリゴヌクレオチドを導入する方
法を提供するにある。
この方法によれば、塩基不対合部分修復酵素システム
機能を不活性化する期間、細胞の中に多量の合成オリゴ
ヌクレオチドを導入する事によって標的遺伝子変換を実
施する事ができる。
なお本発明において、動物あるいは生体にはヒトは含
まれない。
以下、本発明を二、三の実施例について説明する。
第１図はEscherichia Coli HfrとSalmonella typhim
urium Ｆ−との交差から得られた３種の遺伝子間組換
えの制限プロフィルを示す。
実施例１ 菌株E.coli HfrとSalmonella typhimurium
Ｆ−の接合 DNAの制限システムにおいて欠陥を有し、さらに塩基
不対合部分修復酵素システムについて欠陥を有する菌株
E.ColiのHfrとSalmonella typhimuriumのＦ−（突然変
異体mutL,mutS,mutHまたはMutU）との間の接合を実施し
た。
菌株E.coliのHfrは地図上の76.5分において転移起源
を有し、キシロースが最初に（78′）注入されるマーカ
ーである。菌株Salmonella typhimuriumのＦ−は２つの
栄養要求性（met Aおよびmet E）と、キシローズ使用不
能性（xyz−）を有する。これらの菌株はストレプトマ
イシンに対して抵抗性である。菌株E.ColiのHfrはこれ
らのマーカに対して野生型であり、ストレプトマイシン
に対して感受性である。この菌株は他の２つの栄養要求
性（ロイシンおよびトレオニン）を有し、従って接合に
際して三重逆選択を可能とする。制限システムについて
欠陥を有する菌株E.ColiのHfrとSalmonella typhimuri
um Ｆ−、mutL＋,mutS,mutHまたはMutUは富化液体培地
（LB）で培養される。これらの菌株が指数増殖期（１〜
５ 108/ml）にある時、1mlのHfrと1mlのＦ−とを加
え、直ちに混合物をミリポアフィルタでろ過する。この
濾液を予熱された富化培地シャーレ上で37℃で培養す
る。接合を40分間継続させ、濾液を回収し、1mlの10-2M
のMgSO4の中に入れ、つぎに１分間強く撹拌してバクテ
リアを懸濁させ、接合物を分離する。met＋の選択のた
めにはグルコースを含有しメチオニンを含有せず、また
はxyl＋の選択のためには単一の糖としてのキシローズ
を含有しメチオニン（100μg/ml）を含有する最少培地6
3（Miller J.H.1972,Experiments in Molecular Geneti
cs,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbo
r,N.Y.）のシャーレ上にアリコートを陳列した。これら
の２選択培地はトレオニンもロイシンも含有しないが、
Hfrの三重逆選択を可能にするため、ストレプトマイシ
ン（25μg/ml）を含有する。これらのシャーレをそれぞ
れ37℃で40時間、60時間、および88時間培養し、組換え
クローンを集めて計数し、検査した。ホモスペシフィッ
ク交差 Hfr E.coli×Ｆ− E.Coliに対応する対照テス
トを同一条件で実施した。
さらに菌株Salmonella typhimuriumのＦ−をrecAにつ
いて突然変異性に成した（タンパク質recAはすべての相
同性組換えに不可欠である）。
もっとも大きな効果を得た菌株mutLとmutSのテスト結
果を下記の表１に示す。この表は、受容体菌株のみによ
って得られた復帰突然変異体（60時間培養）の抽出後に
供与体バクテリアHfrによってxyl＋に成された受容体Ｆ
−の頻度を示す。同等の結果がマーカmetについても得
られた。
表 １ 接合 供与体xyl+/Hfr頻度 Coli Hfr＋Coli Ｆ− 1.3 10-1 Coli Hfr＋Sal.mut＋Ｆ− 6.7 10-7 Coli Hfr＋Sal.mutL F− 2.1 10-3 Coli Hfr＋Sal.mutS F− 1.7 10-3 Coli Hfr＋Sal.mut＋recA Ｆ− 4.3 10-8 Coli Hfr＋Sal.mutL recA Ｆ− 1.8 10-8 Coli Hfr＋Sal.mutS recA Ｆ− ６ 10-8 遺伝子間組換え頻度は、mutLとmutSについては少なく
とも104の倍率で増大し、DNA制限に対して欠陥を有する
が不対合部分修復遺伝子に対して野生的なSalmonellas
Ｆ−（mut＋）について実施された接合に関してはmut
HとＵについて少し弱い。選択的培地における組換え体
の選択により、E.ColiとSalmonella typhimuriumとの間
のこれらの雑種を得る事ができたが、これらは新規な組
換えと新規な組換え遺伝子とによって得られた新種「E
schenella」および「Salmorichia」であると考える。
インタスペシフィック組換えによって得られたキシロ
ーズ糖（xyl＋）を発酵させる事のできる原栄養菌組換
え体（met＋）は種々のメカニズムによって形成され
る。最も簡単なメカニズムは、E.Coli間またはSalmonel
la typhimurium間のrecA依存接合（イントラスペシフィ
ック接合）の通常の結果としての遺伝子の直接置換であ
る。他の２つのメカニズムは部分的ディプロイドの形成
を生じる。これらの型の組換え体はその安定性に関して
相違する。単なる置換が安定であり部分的ディプロイド
が不安定であると期待される。その結果、インジケータ
シャーレ上の線状痕検査により、各交差の組換え体の表
現型安定性を確認した（１％キシローズ McConkey培
地、Miller,J.H.Experiments in molecular genetics
（Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbo
r,New York,1972）参照）。全体として、遺伝子間組換
え体の安定性プロフィルは異種グループを示している。
Escherichia Coliの遺伝子mut＋がSalmonella typhim
uriumの遺伝子mutを置換したか否かを知るため、Salmon
ella typhimuriumの遺伝子mutの中に挿入されたトラン
スポゾンの運命を追跡した。機能性E.Coliの遺伝子mut
がTnを有する残留遺伝子mutを置換したとすれば、組換
え体は抗生物質に対する抵抗性とその突然変異特性とを
同時に失うであろう。受容体菌株Salmonella typhimuri
um mutL::Tn10との交差に際して得られた８安定組換え
体xyl＋ met＋の７について、前記の現象が実際に生じ
た。これは、組換え体以外は、Escherichia Coliの配列
がmutL部位の中での最後の遺伝子（metA）の選択の約５
分後まで、Salmonella typhimurium配列を置換した事を
示す。受容体菌株としてのSalmonella typhimurium mut
U::Tn5との交差に際して、19組換え体xyl＋の19におい
て遺伝子mutUが置換された。mutS::Tn10およびmutH::Tn
5の交差の組換え体xyl＋ met＋はいずれもトランスポゾ
ンの喪失または遺伝子mutの置換を示さなかった。これ
は、接合が40分後に中断され、遺伝子mutS、mutHの染色
体部が伝達されなかったからである。
第１図はSalmonella typhimurium配列とEscherichia
Coli配列との間の物理的結合を示す。２つの親株の遺伝
子DNAとその３種の安定遺伝子間組換え体xyl＋ met＋
（それぞれ交差mutL,MutSおよびmutH）を酵素Spe Iによ
って切断し、得られた鎖をBeckman Gene Line TAFE装置
上の脈動フィールド上で電気泳動作用で分離した。親Sa
lmonella typhimurium Ｆ−のDNAの２つのより大きな
鎖（Δ）は前記３組換え体の中に存在せず、これらの組
換え体はその代わりに少なくとも１つの非親鎖を取得
し、これは種間DNA結合を含むものと考えられる。その
ほか、E.Coli Hfrの少なくとも１つの大きなDNA制限鎖
（Ｖ）が組換え体L17とS12の中に観察された（L17は番
号1832で寄託された組換え体）。
使用されたSalmonella typhimurium菌株mutL F−はパ
スツール研究所のCNCMに番号SL4213 mutL（No.1831）
に寄託された。
遺伝子組換え体E.Coli Hfr/Salmonella typhimurium
Ｆ−も、パスツール研究所のCNCMに番号SCL17（No.18
32）に寄託された。
実施例 ２ ヒスチジンオペロン中の異種特異的組換
え:Escherichia Coli遺伝子によるSalmonella typhimur
ium遺伝子の置換 Salmonella typhimuriumとEscherichia Coli間の異種
特異的組換えによる遺伝子の置換頻度を測定する実験手
法は下記のとおりであった。
（１）遺伝子情報「受容体」菌株として、下記の２つの
欠陥遺伝子を含むSalmonella typhimurium LT2を使用
し、その組換えによる機能回復を研究した。
−細胞His−をヒスチジノールの介在においてもヒス
チジンを合成不能とする突然変異を伴うhisD::IS200、
および −プロリン（pro−）合成を不能とする欠失を伴うpro
AB47（Lam,S. ＆ Roth,J.F.（1983）,Cell 34 951−96
0:Csonka,L.N.（1981）Mol.Gen.Genet.182 82−86参
照）。HisD::IS200は不活性転移可能要素の挿入に相当
し、hisD＋には戻らない。
遺伝子情報供与体菌株は完全なヒスチジンオペロンま
たはプロリンオペロン（his＋およびpro＋）を含むSalm
onella typhimurium菌株、またはオペロン his（his64
4）を欠失しているが、E.Coliのオペロンhisを含むE.Co
li、Ｆ′150のエピゾームの取得によってhis＋に成され
たSalmonella typhimurium菌株とする（Hartman et a
l.,（1971）Adv.Genet.16,1034;Low,K.B.（1973）Bact.
Rev.36,587−607参照）。
（２）受容体中への供与体の遺伝子転位は、形質導入バ
クテリオファージ p22 Hfr int3（Schnieger.H.（197
2）Mol.Gen.Genet 119,75−88）によって実施される。
これは遺伝子転位の伝統的方法である（Miller,I.H.“E
xperimets in Molecular Genetics",Cold springHarbor
Laboratory,N.Y.1972）。ファージを供与体菌株上で成
長させてファージストックを生産し、バクテリアによる
多数回感染によって受容体菌株を感染させ、感染された
バクテリアを「セレクティブ」シャーレ上に展開し、こ
れらのシャーレ上には供与体菌株の遺伝子特性を取得し
たバクテリアのみが成長する（例えば、バクテリアhisD
＋の検出のためにはプロリンを含有するがヒスチジンを
含有せずヒスチジノール（30μg/ml）を含有し、またバ
クテリアpro＋の検出のためには、ヒスチジンとアルギ
ニンを含有するがプロリンを含有しないゲローズM63最
小培地（前記文献Miller参照））。37℃で２日培養後に
hisD＋またはpro＋コロニーを計数する。
相同性（イントラスペシフィック）組換えに対するホ
メログ（遺伝子間）組換え中の変動を表示する１つの方
法は、供与体E.ColiのhisD−または供与体Salmonella t
yphimuriumのhisD＋から生じるリザートP22Hfr int3に
対するトランスダクタントhisD＋およびpro＋の比率を
確定するにある（これら２種の菌株は同一のサルモネラ
proABを有する）。
下記の表3Aは、野生型菌株mut＋と受容体菌株の誘導
体mutL,mutS,mutUおよびmuthに対するこれらの２比率hi
sD＋/proAB＋（異種特異性および同種特異性）を示す。
異種特異性hisDに対する比率hisD＋/proAB＋はバクテリ
アmutSおよびmutLの中では100倍以上増大するが、mutH
の中ではこれより少し増大し、mutUは非常にわずかに増
大する。この比率は供与体がSalmonella typhimuriumの
hisD＋およびproAB＋である時、４倍以上増大しない。
これらの結果は接合結果を定量的に確証する。
この場合、hisDの欠陥の遺伝的マーカとして、クロル
アンフェニコール（10μg/ml）に対する抵抗性を有し遺
伝子hisDの中に進入してこの遺伝子を破壊する欠陥トラ
ンスポゾンTn10−dcamを使用する事によって、遺伝子置
換を実証した。機能遺伝子E.ColiのhisD＋による欠陥遺
伝子hisD::Tn10d−camの置換は下記の２つの付随表現型
効果を示す。
（ｉ）受容体バクテリアがhisD＋となる（ヒスチジノ
ールの存在において成長；表現型Hol＋）および （ii）受容体バクテリアはそのトランスポゾンTn10d
−camを失い、クロルアンフェニコールに感性となる。
下記の表3Bは、いずれのトランスダクタントhisD＋も
クロルアンフェニコールに対する抵抗性を保持しなかっ
たが、トランスダクタントpro＋（遺伝子proABは遺伝子
hisDから離間している）はそのクロルアンフェニコール
に対する抵抗性を保持している事を示す。
実施例 ３ 塩基不対合部分修復酵素システムの一時的
飽和による不活性化 E.coliにおいては、誤り修正システムMut（H,L,S,U）
は限られており、滴定によって、すなわちタンパク質Mu
tLの機能不活性化によって飽和させる事ができる。
最も突然変異性として知られる菌株E.coli mutD5
は、DNAポリメラーゼIIIに組み合わされた核外修復読み
取りにおいて欠陥を有するので、多くの複製誤りを生じ
る。
ファージ φX 174またはλの異種二重らせんDNAによ
るトランスフェクションによって、これらのバクテリア
が富化培地中の成長に際して不対合部分の修復において
欠陥がある事が証明された。バクテリアDNAの複製を停
止すれば（感熱性突然変異による複製の制止状態または
特異的停止）、修復活性が完全に回復される。再びクロ
ルアムフェニコールによってタンパク質合成を阻止すれ
ばこのような修復作用が阻止される。従ってMutシステ
ムは飽和されるだけでなく「死亡」するので、これらの
酵素または修復酵素を再合成しなければならない。
生体中不対分子の修復テストは、基質として、試験管
中において、DNAの鎖を分離し異種二重らせん型の新し
い二重らせんを再構成する事によって構成された特定の
分子を使用する。配列に関して特定の突然変異遺伝子を
使用する事により、単一の特定不対合部分を有する分子
を構成する事ができる。遺伝子c Iの中にバクテリオフ
ァージλの抑制因子をコード付けする突然変異遺伝子を
使用した。これはバクテリオファージλのプロファージ
「休眠」状態に対応するタンパク質であって、これが野
生型ファージの「濁り」部位に対して細胞溶解部位に表
現型「透明」を与える。この場合、遺伝子c Iの第43塩
基対のレベルでA:Tを生じるG:C突然変異に対応する突然
変異UV23が問題となる。選ばれた鎖に対応して、野生型
鎖と突然変異UV23を有する鎖とをもったファージλのDN
Aを構成した。この二重らせんは、突然変異UV23のレベ
ルにおける不対合部分G:TまたはA:C以外の約50,000塩基
対において正常である。ファージλのストックの作成
と、ポリ（U,G）（ウリジンおよびグアノシン）重合体
の存在における塩化セシウムのグラジエント中の鎖の分
離については、M.Meselson ＆ R.Yuan（1968）,Nature,
217−1110−1114に記載されている。
塩基不対合部分修復酵素システムは５′GATC配列のメ
チル化（６−メチル−アデニン）によって方向付けられ
るのであるから（Radman ＆ Wagner（1988）,Scietific
American,August 1988）、単一の鎖上にメチル化部位
を有する異質二重らせんDNAを構成した。塩化カルシウ
ム法によって外部DNAに対して透過性に成されたバクテ
リアE.coliの中に前記DNAを単一コピーとして導入する
（Mande ＆ Miga（1970）,J.Mol.Biol.53:159−162）
（指数関数成長中のバクテリアが少なくとも2.5時間、
氷浴中において0.1MのCaCl2の中に保持される）。トラ
ンスフェクション処理されたバクテリアを、１晩培養さ
れたペトリシャーレ上に柔らかいゲロースと共に展開
し、感染中心の各異種二重らせんのファージ子孫を各感
染中心の移植ファージの再展開によって特定した。感染
中心の３つの型が可能である。すなわち、純粋混濁（ｃ
＋）、純粋透明（ｃ）およびファージｃ＋とを含む混合
型。混合型感染中心は修復されていない異種二重らせん
DNAの子孫を含み、２つの鎖、ｃ＋とｃは、それぞれの
特性を有する不対塩基を修復によって除去する事ができ
る以前に、複製されてファージ子孫を生じている。従っ
て多数の混合型感染中心の存在する事は修復が行われな
かった事を意味し、またその逆が成り立つ。さらに、方
向付けられた修復はメチル鎖によって担持された型の純
粋感染中心を生じるので、比率c/c＋の中に影響を生じ
る（下記の表４参照）。
この方法はProc.Natl.Acad.Sci.USA 82:503−505（19
85）に記載されている。
下記の表４は、DNA合成の忠実度において欠陥を有
し、従ってそのDNA複製に際して多数の不対合部分を発
生する突然変異体菌株mutD5においては、不対合部分の
修復が欠陥を有する事を示している。
バクテリアW 3110 dna Atsの混合感染中心の３％をバ
クテリアmutD5における混合感染中心の48乃至49％と比
較すれば明らかなように、突然変異体mutD5における不
対合部分の修復が欠陥を示す。混合感染中心の49％を突
然変異体mutLの86乃至92％と比較すれば明らかなよう
に、不対合部分の修復欠陥がすべてではない。42℃にお
いて２時間の突然変異体dna AtsのバクテリアDNA複製の
中断はmutD5以外の菌株の不対合部分の修復には影響し
ていない。dna Atsにおいては、混合感染中心を10％含
む不対合部分の修復の回復が見られた。このような回復
はタンパク質合成抑止剤、すなわち100μg/mlのクロル
アンフェニコールの存在においては生じなかった。従っ
て、誤った複製による不対合部分の形成を停止した場
合、タンパク質の合成以外には修復を実施する事はでき
ない。この事は、不対合部分の修復が酵素の「自殺」を
意味する事を示している。この場合、飽和作用は単数ま
たは複数のタンパク質Mutの機能不活性化に対応する。
下記の実験において、機能欠損タンパク質がタンパク質
MutLである事を示す。
ファージM13 mp2の環状異種二重らせんの生産 ファージDNAおよび細胞間DNAは、純粋ファージから、
またはファージによる感染と30分の培養後に、Brooks e
t al.（1988）に記載のように臭化エチジウムの存在に
おいてCsCl遠心分離によって分離される。これはManiai
ts,Fritsche ＆ Sambrook（1982）,Molecular Cloning,
Laboratory manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Ne
w Yorkによって記載された標準法である。線形二重分岐
を有する細胞管DNA（RFI）を、70℃の水中で10分間変性
しつぎに60℃の緩衝液２×SSCの中で10分間、単一鎖DNA
の存在において復元された酵素Ava IIと共にヒブリド
化する事によって生産される。
一本鎖のDNAは0.1MのNaClの存在においてベンゾイル
化−ナフタイル化セルローズによって除去される。G:T
不対合部分を有する異種二重らせんDNAはpH8の0.05M T
risおよび0.001MのEDTAの緩衝液の中に保存される。
G:T不対合部分はそのマーカを備える： ５′−−−GTT−−−３′（−）青（lac＋）メチル− ３′−−−TAA−−−５′（＋）白（lac−）メチル＋ ファージλのDNAについて述べたように、細胞壁体に
対するジチオトレイトール カルシウムとジメチルスル
フォキシドとの作用に基づくハナハン法（Maniatis et
coll.1982）によって透過性に成された細胞の中に単一
の分子が入る。トランスフェクション化されたバクテリ
アは希釈され、インジケータ菌株CSH 50 （del lac−
pro,ara−,pro,atr A）と共に、Ｘ−galとIPTGの存在に
おいて展開されて、ファージlac−（突然変異体）では
なくファージプラックlac＋の青色着色を可能とする。
混合細胞溶解（白／青）の部位は修復されない異種二重
らせんを示す。
下記の表５は、成長の対数段階で、修復欠陥突然変異
体mutLと突然変異体mutDにおいて感染中心部分が類似し
ている事を示す。しかし静止段階前の遅い対数段階にお
いては、突然変異体mutDの混合感染中心部分は野生型mu
t＋と同一であり、従って例えばmutDは急速成長中は不
対合部分修復に関して欠陥を有するが、成長が減速した
時にその修復活性を回復する。
下記の表６は、クローニングされ過発現された遺伝子
が菌株mutDの中において不定部分修復活性を回復できる
事を示す。さらに詳しくは、菌株mutDの中に導入された
プラスミドpBR325の中にクローニングされた遺伝子mutS
およびmutUではなく遺伝子mutLおよびmutHは、ほとんど
完全な修復活性を示す。またこの観察と一致して、下記
の表７に示すようにプラスミドpBR325（mutS＋）または
pBR325（mutU＋）ではなくプラスミドpBR325（mutL＋）
またはpBR325（mutH＋）を有するmutDの中において、自
発的突然変異の頻度が低下している。
これらのテストは、誤まりの重大な結果またはなだれ
効果の第１の実験的証明である。DNA合成レベルでの過
度の誤りは塩基不対合部分修復酵素システムの飽和（不
活性化）を生じる。その結果は、システム中の複製忠実
度の二重の欠損である。
E.ColimutD5の中にプラスミドmutH＋、mutL＋、mutS
＋およびmutU＋を導入する際に、MutL機能が過生産され
る時には修復活性の喪失が存在しない事を示す事ができ
る。従って、タンパク質MutLは修復作用中に「自殺」す
る。突然変異体mutD5は「誤りの重大結果」の第１の実
験結果を示す。DNA複製レベルでの過度の誤りは修復シ
ステムに過負荷を加え、このシステムが崩壊して「なだ
れ」効果を生じる。
従って、修復システムが崩壊して基質の「溶解」まで
不活性にとどまり不対合部分と酵素Mutの再合成を生じ
るためには、細胞中に過度に多数の塩基不対合部分を一
挙に導入すればよい。
実施例 ４ ほ乳動物の細胞における塩基不対合部分修
復酵素システムの飽和 ほ乳動物の細胞において突然変異体mut〜の分離は困
難である。同一類の２コピーの同時的不活性化を必要と
する二倍体細胞中の劣性突然変異が問題となる。またこ
れらの突然変異は致死的である。これは、特に反復配列
の種々のファクシミリのレベルでの配列の多形性が染色
体安定性のキー要素である事による。実際上、この多形
性の故に、塩基不対合部分修復酵素システムは反復配列
間の危険な組換え（染色体の変体）または相同性染色体
間の組換え（有枝分裂組換えによるホモ接合体）を防止
する事ができる。ただし、母分子の複製から生じて同様
配列を有する姉妹染色体間の修復組換え、すなわち姉妹
染色体の交換の場合を除く。
３テストを試みた。不対合部分の豊富な異種二重らせ
んDNAをマウス細胞の中に導入した後に、下記が見られ
るか否かを測定した。
ａ）変化した反復配列間の組換えの活性化による染色体
変体の出現、 ｂ）修復されない複製誤りによる突然変異体の出現、 ｃ）合成ヌクレオチドによる発ガン突然変異体の標的
化、つぎに他のオリゴヌクレオチドによるその修復。
ａ）C.Chen ＆ H.Okayama（1987）,Mol.Cell.Biol.7:27
45−2752（“High efficiency tranformation of mamma
lian cells by plasmid DNA"）に記載の方法によるCHO
細胞（チャイニーズハムスタの卵巣）とNIH3T3（マウス
の繊維細胞）のトランスフェクション化を実施する。細
胞の約50％を下記において製法を説明する環状DNA、す
なわち異種二重らせんM13/fdをもって確実にトランスフ
ェクション化し、約106のDNA塩基対が細胞の中に入り、
従って約200分子が約35,000不対合部分を有する。凝縮
された有糸分裂染色体を観察するための中期プラック
を、A.R.Kinsella ＆ M.Raman,“Inhibition of carcin
ogen−induced chromosomal aberrations by an antica
rcinogenic protease inhibitor",Proc.Natl.Acad.Sci.
USA（1980）77,3544−3547および“Tumor promotorindu
ces sister chromatid exchanges:relevance to mechan
isms of carcinogenesis",Proc.Natl.Acad.Sci.USA（19
78）75,6149−6153に記載の方法によって調製した。
ｂ）不対合部分の豊富な異種二重らせんによるトランス
フェクション化の突然変異効果をテストするため、プラ
スミドpcD neoのDNA（Chen ＆ Okayama（1987）Mol.Ce
ll.Biol.7:2745−2752“high efficiency transformati
on of mammalian cells by plasmid DNA"）を異種二重
らせんと混合する。これにより、400μg/mlのネオマイ
シンG418の存在において、外因性DNAの進入した細胞を
選択する事ができる。これらの細胞のうちから、Kinell
a ＆ Radman（1978）P.N.A.S.USA 75,6149−6153に記載
のようにして、６−チアグアニンおよびウアバインに対
して抵抗性の突然変異体の頻度をテストする。
ｃ）標的およびプログラミング突然変異誘発物質。
合成オリゴヌクレオチドの進入を実施するため、種々
の方法、例えばリン酸カルシウム法、エレクトロポレー
ション法、およびChen ＆ Okayama,Andreason ＆ Evans
＆ mannis ＆ Gould−FogenteによってBiotechniques,
vol6,,No7,7月/8月、1988に記載されたリポゾーム法を
使用する事ができる。核中の直接ミクロ噴射法も実施す
る事ができる。
形質転換のためにマウスの細胞NIH3T3を使用し、塩基
不対合部分修復酵素システムの不活性化剤として下記に
製法を説明する異種二重らせんM13/fdを使用し、また合
成オリゴヌクレオチド 19−mer 5′GTTGGAGCTTGTGGCGTA
G（下線のＴは腫瘍遺伝子Ｋ−rasのコドン12の中に存在
する多くの人間腫瘍またはけっ歯類の腫瘍の中の「突然
変異」塩基である）を使用した。転換細胞の発ガン特性
は単層表層上の「炉床」の成長によって、または柔らか
なゲロース中の成長によって示される。オリゴヌクレオ
チド５′GTTGGAGCTGGTGGCGTAGと逆の突然変異誘発因子
によって、遺伝学的治療を実施する事ができる。
異種二重らせんM13/fdと異種二重らせんφX1 74/G4の調
製 バクテリオファージM13とfdのDNA間に３％の不対合部
分を含む異種二重らせんを作成した。
操作手順は下記である。
−細胞間DNA（環状、二重鎖またはRFI）の分離、 −各分子集団を一度、しかし分子の相異なる箇所におい
て劈開する、 −変性−復元 −環状DNAの分離（Brooks et al.,1989に記載のよう
に）。
（配列:Van Wezenbeek et Coll.（1980）Gene,11:129−
148） バクテリア培養、ファージ感染、バクテリオファージ
M13またはfdの複製型（RFI）は、Messingによって、met
hods in enzymology vo.101,p 20−78（1983）に記載さ
れている。
型Ｉ（RFI）は、ファージM13はBa IIによって、ファ
ージfdはBamH Iによって切断した。酵素消化後に、これ
らのDNAをLee,Clark ＆ Modrich PNAS 80,4639−4643
（1983）に記載の手順によって変性しつぎに復元した。
リガーゼE.Coliの作用後に、等価結合によって閉じた環
状DNAをCsCl−EtdBr遠心分離によって精製した。
また同様にして、ファージφX 174およびG4のDNAの間
に30％の不対合部分を含有する異種二重らせんを調製し
た。
下記の菌株を1988年12月23日に、Collection Nationa
l de Cultures de Microorganismes,Institut Pasteur,
28,rue du Docteur Roux,75724 PARIS CEDEX 15に寄託
した。
Salmonella typhimurium SL 4213 mut L No.1 831 遺伝子間組換え体 SCL17 No.I 832 参照文献 1.MARINUS M.とMORRIS N.（1973）］.Bacteriol 114 11
43−1150. 2.TIRABY G.とSICARD A.（1973）］.Bacteriol 116 113
0−1135. 3.WILLIAMSON et al.（1965）Genetics 110 609−646. 4.OchmanとWilson in E.coliとSalmonella typhimurium
Vol.2 American Society for Microbiology Washingt
on DC pp 1649−1654. 5.BARON et al（1959）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 45 976
−984. 6.EISENSTARK（1965）Proc.natl.Acad.Sci.USA 54 117
−120. 7.MERGEAYとGERITS（1983）］J.Gen.Microbiol 129 321
−335. 8.P.BROOKS et al.accepted for Proc.Natl.Acad.Sci.U
SA. 9.Maniatis et coll.（1982）Molecules cloning Cold
Spring harbor Laboratory. 10.Meselsonとyaun（1968）Nature 217 1110−1114. 11.RadmanとWagner（1988）Scientific american Augus
t 1988（“Pour la Science"October 1988）． 12.MendelとMiga（1970）M.Mol.Biol 53 159−162. 13.DohetとWagner（1985）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82
503−505. 14.C.Chan,H.Okayama（1987）Mol.Cell.biol.７ 2745−
2752. 15.KinsellaとRadman（1978）PNAS 75 6149−6153. 16.KinsellaとRadman（1980）PNAS 77 3544−3547. 17.Biotechniques Vol.6 n゜7 July/August（1988）． 18.Methods in enzymology Vol.101 pp.20−78（198
3）． 19.PNAS 80 4639−4643（1983）．
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 Ｍｉｄｄｌｅ Ｅａｓｔ Ｔｅｃｈ； Ｕｎｉｖ．Ｊ．Ｐｕｒｅ Ａｐｐｌ．Ｓ ｃｉ．，16（1983）ｐ．253−262 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/00 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ)

Claims (5)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】生体中での属間および／または種間の組替
    え法であって、細胞中において第１の種または属からの
    二本鎖DNAを第２の種または属からの二本鎖DNAと結合す
    ることを含み、該第１および第２のDNAは、部分的に相
    同でありかつ細胞の塩基不対合部分修復酵素システムが
    機能的である時このシステムを活性化できる塩基不対合
    部分を有する配列を有し、ここで塩基不対合部分修復酵
    素システムは欠陥であるかまたは該DNA配列間の安定な
    組換えを可能とするように一時的に不活性化されてお
    り、該方法が下記からなる方法群から選択されることを
    特徴とする方法。 （ｉ） 第１の種または第１の属の生体の細胞と第２の
    種または第２の属の生体の細胞との融合であって、第２
    の種または第２の属の該生体の該細胞が塩基不対合部分
    修復酵素システムに欠陥を有しているかまたは該システ
    ムが一時的に不活性化されている融合、 （ii） 第１の種または第１の属の単細胞生体と第２の
    種または第２の属の単細胞生体との交差であって、少な
    くとも一つの生体が塩基不対合部分修復酵素システムに
    欠陥を有しているかまたは該システムが一時的に不活性
    化されている交差、 （iii） 第１の種または第１の属の受容体細菌と第２
    の種または第２の属の供与体細菌との接合または形質導
    入であって、該供与体細菌が該受容体細菌に移入される
    少なくとも一つのDNA配列を有しており、該供与体細菌
    および該受容体細菌の少なくとも一つが、塩基不対合部
    分修復酵素システムに欠陥を有しているかまたは該シス
    テムが一時的に不活性化されている接合または形質導
    入、 （iv） 塩基不対合部分修復酵素システムの、mutSおよ
    びmutL遺伝子の少なくとも一つの、少なくとも一つの突
    然変異による不活性化、および （ｖ） 二つのDNA配列の、塩基不対合部分修復酵素シ
    ステムに欠陥を有しているかまたは不活性化されている
    単細胞生体への配置であって、該二つのDNA配列が二つ
    の異なる生体に由来する部分的に相同な遺伝子である配
    置、および、所望の雑種配列、遺伝子またはその生成物
    の選択。
  2. 【請求項２】上記（ｖ）において、各DNA配列が分離し
    たプラスミド中に含まれ、該各プラスミドが、欠陥のあ
    るまたは不活性化された塩基不対合DNA修復システムを
    含有する細菌に導入される、請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】属間および／または種間の組換え法であっ
    て、細胞中において第１の種または属からの二本鎖DNA
    を第２の種または属からの二本鎖DNAと結合することを
    含み、該第１および第２のDNAは、部分的に相同であり
    かつ細胞の塩基不対合部分修復酵素システムが機能的で
    ある時このシステムを活性化できる塩基不対合部分を有
    する配列を有し、ここで塩基不対合部分修復酵素システ
    ムは欠陥であるかまたは該DNA配列間の安定な組換えを
    可能とするように一時的に不活性化されており、該方法
    が下記からなる方法群から選択されることを特徴とする
    方法。 （ｉ） 第１の種または第１の属の生体の細胞と第２の
    種または第２の属の生体の細胞との融合であって、第２
    の種または第２の属の該生体の該細胞が塩基不対合部分
    修復酵素システムに欠陥を有しているかまたは該システ
    ムが一時的に不活性化されている融合、 （ii） 第１の種または第１の属の単細胞生体と第２の
    種または第２の属の単細胞生体との交差であって、少な
    くとも一つの生体が塩基不対合部分修復酵素システムに
    欠陥を有しているかまたは該システムが一時的に不活性
    化されている交差、 （iii） 第１の種または第１の属の受容体細菌と第２
    の種または第２の属の供与体細菌との接合または形質導
    入であって、該供与体細菌が該受容体細菌に移入される
    少なくとも一つのDNA配列を有しており、該供与体細菌
    および該受容体細菌の少なくとも一つが、塩基不対合部
    分修復酵素システムに欠陥を有しているかまたは該シス
    テムが一時的に不活性化されている接合または形質導
    入、 （iv） 塩基不対合部分修復酵素システムの、mutSおよ
    びmutL遺伝子の少なくとも一つの、少なくとも一つの突
    然変異による不活性化、および （ｖ） 二つのDNA配列の、塩基不対合部分修復酵素シ
    ステムに欠陥を有しているかまたは不活性化されている
    単細胞生体への配置であって、該二つのDNA配列が二つ
    の異なる生体に由来する部分的に相同な遺伝子である配
    置、および、所望の雑種配列、遺伝子またはその生成物
    の選択。
  4. 【請求項４】上記（ｉ）において、該細胞が細菌、酵
    母、植物および動物細胞からなる細胞の群から選択され
    る、請求項１記載の方法。
  5. 【請求項５】上記（ｉ）において、該細胞が細菌、酵
    母、植物および動物細胞からなる細胞の群から選択され
    る、請求項３記載の方法。
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