JPH04503601A

JPH04503601A - 部分的相同性ｄｎａ配列の生体中組換え法

Info

Publication number: JPH04503601A
Application number: JP2501752A
Authority: JP
Inventors: ラドマン，ミロスラブ; レシギュイエ，クリスチャンヌ
Original assignee: セトラテク
Priority date: 1988-12-26
Filing date: 1989-12-22
Publication date: 1992-07-02
Anticipated expiration: 2015-06-26
Also published as: IL92856A; DE68924174D1; FR2641793A1; IE894182L; ATE127519T1; EP0449923B1; WO1990007576A1; US5965415A; CA2006549A1; EP0449923A1; ZA899902B; JP3056524B2; ES2077058T3; AU4834390A; IL92856A0; FR2641793B1; US5912119A; IE72469B1; CA2006549C; DE68924174T2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】部分的相同性ＤＮＡ配列の生体中組換え法本発明は、特に３０％に達する大きな塩基不対合部分を有する部分的相同性ＤＮＡ配列の生体中組換え法に関するものである。

このようにして、同一祖先を共有する相異なる種および類の細胞または生体のレベルで個々の遺伝子を組換える事ができる。

また本発明は、相異なる種および／または類の生体の生体中での交差および組換えによって組換えられた生体の生産方法、および雑種遺伝子およびこれらの遺伝子によってコード付けされたタンパク質の生体中生産方法に関するものである。

ＤＮＡの合成に際して、誤って、不対合部分と呼ばれる非補形塩基対が得られる事がある。ＤＮＡ中の誤り（塩基の不対合部分または非対合部分）の修正法が存在する。この方法は酵素システムを介在させる。すなわち、バクテリアＥｓｃｈｅｒ１ｃｈｉａ　Ｃｏ１ｔ　および５ａｌｓｏｎｅｌ　Ｉａｔｙｐｈｌｍｕｒｉｕｉにおいては、誤りは非常に急速に正確に２種の酵素（ＭｕｔＳおよびＭｕｔＬ）によって検出され、これらの酵素が第３酵素（ＭｕｔＵ）によってＤＮＡの２鎖を派生させ、第４酵素（ＭｕｔＨ）によって新合成鎖をＤＮＡ配列（ＧＡＴＣ）に切断し、これをさらに他の酵素（参照文献：１）によってメチル化する。

最もしばしば見られる誤りＧＥＴ、Ａｒｃおよび少なくとも１つの塩基が最も有効に修復される。これらの酵素Ｈｕｔによって検出されず、またはよく検出されない誤り（一部の箇所におけるＧ：ＡＳＣＡＴおよびＣ：　Ｃ）は２つの鎖を「開く」特殊構造を有する。

今日まで交雑種または雑種遺伝子を得るには、多くの問題があった。交雑種に関しては、植物の分野で試験管中で細胞融合によって実施される最も進んだ試みは遺伝子の不安定性という大きな問題に突き当たった。雑種遺伝子または雑種酵素を得る事は試験管中において遺伝的遺伝子によってのみ可能であった。

本発明の目的は、新種の交雑種、特に新種の雑種遺伝子または雑種酵素を試験管中において遺伝子間および／または種間組換えによって効率的に、またより容易に生産するにある。

そのため、本発明の第１実施態様によれば、ＤＮＡの塩基の不対合部分の修復システムの中に欠陥突然変異体を使用し、または遺伝子間組換えを増大するその他の突然変異体を使用する。

特に、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　Ｃｏ１１およびＳａｌｍｏｎｅｌ　１ａｔｙｐｈｉｉｕｒ１ｕ１１の菌株ＩＩｕｔ　ｓ特にｍｕｔ　Ｌ、Ｓ、ＨまたはＵ、あるいは５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ　の菌株ｈｅｘ　（参照文献：２）および酵母菌のｐｕｓ　（参照文献＝３）をあげる事ができる。

実際に本発明によれば、種形成の分子メカニズム、従って新種出現のメカニズムは不対合部分修復酵素のみの活性の厳格な制御を必要としている事が発見された。実際上、本発明はこれらの不対合部分修復酵素の持っている、ＤＮＡ塩基不対合部分によって刺激される、「抗組換え」機能を利用するにある。この機能が種形成の分子メカニズム、すなわち新種の最初の遺伝的分離メカニズムを決定する。

しかし、ＤＮＡ塩基の不対合部分修復酵素システム中に欠陥突然変異体を使用する代わりに、所望の組換え体を得る時間、このシステムを一時的に飽和作用によって不活性化する事ができる。

不対合部分修復突然変異体が遺伝的に不安定である事を考慮して、正常な遺伝的安定性に戻る前に、所望の遺伝的構成に必要なその一時的欠陥を利用する事は好ましい方法である。従来のバイオテクノロジーの主要な問題は「工業的」菌株の遺伝的不安定性である。所望の変異体の選択後に、その固有の遺伝的安定性が劣化し、発酵器中での成長中に野生型に戻る。

本発明による不対合部分修復システムの一時的不活性化の方策は２つある。

ａ　）　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　Ｃｏ１ｔにおける遺伝的構成のためにＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　Ｃｏ１１の条件的修復突然変異体（ｍｕｔｓｔｓ−１）を利用する方法、ｂ）多数の不対合部分を細胞中に導入する事による修復システムの飽和、すなわち機能的不活性化。この方法は任意の生体に使用可能である。

従って本発明の目的は、部分的相同性ＤＮＡ配列の生体中組換え法において、前記ＤＮＡ配列間の組換えを生じる時間、飽和作用によって、または遺伝的組換えを増大する突然変異体によって、一時的に欠陥を示しまたは不活性化された塩基不対合部分修復酵素システムを有する細胞または生体の中に、前記部分的相同性ＤＮＡ配列を加える方法にある。

従って必要な場合には、少なくとも１つの酵素、すなわち組換えあるいは誤りの本来の修復に関わる酵素を不活性化する事が望ましい。

組換えられるべきＤＮＡ配列は染色体内配列としまたは染色体外の配列とする事ができるが、後者の場合は各クローニング遺伝子間の組換えを可能とする。

生体中のこの組換え法の応用として、本発明の他の目的は雑種遺伝子およびそのコード付けられたタンパク質の生体中生産法において、塩基不対合部分修復酵素システムにおいて欠陥を有しまたは不活性化された前記生体の中に、２種の相異なる生体から派生し部分的相同性遺伝子から成る２種の前記ＤＮＡ配列を存在させる段階と、所望の雑種遺伝子またはそのコード付けされたタンノくり質を選択する段階とを含む事を特徴とする方法にある。

この場合、染色体外の生体中生産である。

例えばプラスミドの上に、同一機能のコードを有するが相異なる配列と相異なる生成物酵素特性を有する２種の部分的相同性遺伝子を導入し、つぎにベトリシャーレ上で数千の相異なる組換えの中から興味ある組換えを選定する事ができる。

これは、試験管中の遺伝的遺伝子の膨大な作業に相当する。

また本発明は、雑種遺伝子およびそのコード付はタンパク質の生体中生産法において、第１生体の第１遺伝子が第１プラスミドによって保持され、第２生体の部分的相同性第２遺伝子が、欠陥のある塩基不対合部分修復酵素システムを有するバクテリアの中に、または遺伝子間組換えを増大するその他任意のバクテリアの中に、あるいは一時的に不活性化された塩基不対合部分修復酵素システムを有するバクテリアの中に転換によって導入される段階と、前記遺伝子を組換える段階と、所望の雑種遺伝子またはそのコード付けされたタンパク質を選択する段階とを含む方法を提供する。

さらに詳しくは前記の方法において、組換えられる遺伝子を保持するプラスミドと共に転換されるＩ（クチリアは、塩基不対合部分修復酵素システムにおいて欠陥を有しまたは一時的に不活性化された菌株Ｅ、　ｃｏｌｔまたは５ａｌｌＯｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｌｍｕｒｆｕｍｓまたは遺伝子間組換えを増大するこのようなバクテリアのその他の任意の突然変異体とする事ができる。

望ましくはＥ、　ｃｏｌｌにおけるすべての構成については、不対合部分の修復機能のための感熱性菌株、例えばＥ。

５−ｔＣｏｌｔ　ｌ１ｕｔｓ　を使用する。この菌株は４２℃において変異性５ｕｔＳ −、また３２℃において正常■ｕｔ＋である。

４２℃において異種特異的組換えを活性化し、３２℃において所望の特性を選定する。

本発明の他の目的は、本発明による生体中組換え法の応用として転換技術または融合技術によって組換えられた細胞を生産する方法において、一下記を使用し、・第１類および第１種の生体の細胞のＤＮＡ。

・第２種および／または第２類の生体の細胞の染色体ＤＮＡ。

第２種または第２類の生体の前記細胞は塩基不対合部分修復酵素システムの中において欠陥を有しまたは特に飽和作用によって一時的に不活性化されているようにして生体中転換および組換えを実施する方法、あるいは−これらの２つの型の細胞の融合後にこれらの細胞の染色体の生体中組換えを実施し、これらの細胞はいずれも欠陥を有する塩基不対合部分修復酵素システムを有し、あるいは特に飽和作用によって一時的に不活性化された前記システムを有する方法とを含む。

また本発明の目的は、本発明による生体中組換え法の応用として、相異なる種および／または類の生体の生体中交差および組換えによって組換えられた生体を生産する方法において、一第１種および第１類の生体と、一第２種および／または第２類の生体との間において、生体中交差および組換えを実施し、これら２種の生体の少なくとも一方は塩基不対合部分修復酵素システム中において欠陥を示し、または特に飽和作用によって一時的に不活性化された前記システムを有する段階を含む方法を提供するにある。

本発明により組換えられた細胞または生体の生産法においては、バクテリアのみならず、酵母菌、植物または動物の組換え細胞または組換え生体を生産する事ができる。　特に本発明は、相異なる種および／または類のバクテリアの交差と組換えによって組換えられたバクテリアの生産方法において、一塩基不対合部分修復酵素システムにおいて欠陥を有しまたはその塩基不対合部分修復酵素システムが特に飽和作用によって一時的に不活性化された第１種および第１類のいわゆる受容体バクテリアと、 −受容体細胞に与えようとする特性を有する第２種および／または第２類のいわゆる供与体バクテリアとの間生体中において接合および形質導入する方法にある。

望ましくは、いわゆる受容体バクテリアはさらにＤＮＡの制限酵素システムの中において欠陥を有する。

本発明はバクテリアの接合の分野で有望である事が明らかになった。１４０，０００，０００年前に遺伝的に分離した２類のバクテリアＥ、　ｃｏｌｔおよび５ａｌＩｌｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉＩＩｌｕｒｉｕａ（ＯｃｈＩｌｌａｎ　＆　Ｗｌｓｏｎ　１９８７　）は現在、ＤＮＡの組換えによっても交差しない。

Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｌｍｕｒｉｕａとＥ、　ｃｏｌｔとの接合による交差は実際上無効である。すなわち、組換えが考察される場所によってまったく存在せずまたは非常に弱い（Ｂａｒｏｎ　ｅｔ　ａｌ、　１９５９：　Ｅｉｎｓｅｎｓｔａｒｋ　１９６５．　Ｍｅｒｇｅａｙ　＆Ｇｅｒ１ｔｓ　１９８ｇ　）。しかし例えば突然変異体によってＭｕｔＬ機能またはＭｕｔＳ機能が除去されると、これらの菌株から１４０ｘｌＯ８年後に再び非常に有効な（突然変異体していないバクテリアにおけるよりも少なくとも１０６倍有効な）組換えによる交差が再び得られる。このようにバクテリアの交差において、特異性間および遺伝子間の不毛状態に関する修復酵素の役割が立証された。

本発明により組換えられたバクテリアの生産法の他の実施態様においては、菌株Ｅ、　ｃｏｌｌおよび菌株Ｓａ１ｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｌｍｕｒｌｕｍを交差させ、少なくともその一方（受容体）、が塩基不対合部分修復酵素システムにおいて欠陥を有しまたは特に飽和によって不活性化されている。

好ましくは、）Ｈｆｒ型の供与体バクテリアをＦ−型の受容体バクテリアと接合する。

本発明の特定の実施態様において、供与体菌株Ｅ。

ｃｏｌｉ　Ｈｆｒと、ＭｕｔＳ型またはＭｕｔＬ型の塩基不対合部分修復酵素システムにおいて欠陥を有する、すなわち不対合部分の認識に介入するタンパク質ＭｕｔＳおよびＭｕｔＬにおいて欠陥を有する突然変異菌株Ｓａ１ｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕａ＋Ｆ−との間の接合を実施した。

本発明による組換えバクテリアの生産方法は新規な菌株を生産する事ができる。

例えば、菌株Ｅ、　ｃｏｉｌとの交差によって無毒性に成されているが病原性５ａｌｓｏｎｅｌ　Ｉａｔｙｐｈｉｗｕｒｉｕｍ菌株の表面の抗原決定子を担持している減衰された病原性Ｓａ１ｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉａ＋ｕｒｉｕａ菌株を生産する事ができ、これは対応のサルモネローズに対するワクチンの生産に利用される。

本発明による組換え生体生産法の応用として、本発明の他の目的は、２種の部分的相同性遺伝子から雑種遺伝子およびそのコード付けされたタンパク質を生体中生産する方法において、第１遺伝子を含有する前記第１生体の細胞と、部分的相同性第２遺伝子を含有する前記第２生体の細胞とから組換え細胞を生産する段階と、所望の雑種遺伝子またはそのコード付はタンパク質を選択する段階とを含む方法が提供される。

さらに詳しくは、塩基不対合部分修復突然変異体を使用して相異なる起源のバクテリアを交差し、このようにして新規な遺伝子を生産し、所望の特性を選択する。この場合は、染色体遺伝子の処理である。

前述のように、塩基不対合部分修復酵素システムにおいて突然変異体を利用する代わりに、不対合部分の豊富すＤ　Ｎ　Ａの異種二重らせんをトランスフェクションによって導入する事によって前記酵素システムを飽和する事ができる。

最後に本発明の目的は、突然変異前に、修復しようとする変異塩基を含む遺伝子を生体中においてこの遺伝子の標的逆突然変異誘発を実施する方法において、生体の塩基不対合部分修復酵素システムを飽和作用によって不活性化するための多数の不対合部分を含有する異種二重らせん、および遺伝子の突然変異体の前と同様に修復されたＤＮＡ配列から成るオリゴヌクレオチドを導入する方法を提供するにある。

この方法によれば、塩基不対合部分修復酵素システム機能を不活性化する期間、細胞の中に多量の合成オリゴヌクレオチドを導入する事によって標的遺伝子変換を実施する事ができる。

以下、本発明を二、三の実施例について説明する。

第１図はＥｓｃｈｅｒｊｃｈｊａ　Ｃｏ１１　Ｈｆｒ　とＳａｌｍｏｎｅｌ　ｌａｔｙｐｈｌｍｕｒｉｕｍ　Ｐ−との交差から得られた３種の遺伝子間組換えの制限プロフィルを示す。

実施例１　菌株Ｅ、Ｃｏ１１　）Ｉｆ’ｒ　とＳａｌｍｏｎｅｌ　Ｉａｔｙｐｈｉｍｕｒｉｔｏｇ　Ｐ−の接合ＤＮＡの制限システムにおいて欠陥を有し、さらに塩基不対合部分修復酵素システムについて欠陥を有する菌株Ｅ、Ｃｏ１１　の）ＩｆｒとＳａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉｓｕｒｉｕＩＩのＦ−（突然変異体ｍｕｔｌ７．　ｎｕｔｓ、　ａ＋ｕｔ）ＩまたはＭｕｔＵ　）との間の接合を実施した。

菌株Ｅ、Ｃｏｌ　ｉの）Ｉｆ’ｒはカード上において７６．５分において転移起源を有し、キジローズが最初に（７８’　）噴射されるマーカである。菌株Ｓａ１ｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉｍｕｒｌｕＩｌのＦ−は２つの栄養要求性（ＩＩｅｔ　Ａおよびｍｅｔ　Ｅ）と、キジローズ使用不能性（ｘｙｚ−）を有する。

これらの菌株はストレプトマイシンに対して抵抗性である。菌株Ｅ、Ｃｏｌ’１のＨｆｒはこれらのマーカに対して野生型であり、ストレプトマイシンに対して感性である。この菌株は他の２つの栄養要求性（ロイシンおよびトレオニン）を有し、従って接合に際して三重逆選択を可能とする。制限システムについて欠陥を有する菌株Ｅ、Ｃｏ１１のＨｆ’ｒと５ａｌａ＋ｏｎｅｌ　ｌａｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕＩＩＰ−，１ｕｔＬ＋　、　ｌ１ｕｔｓ、　ｎ＋ｕｔＨまたはＭｕｔＵは富化液体培地（Ｌ　Ｂ）で培養される。これらの菌株が指数増殖期（コ−〜５　１０”／ｍりにある時、１ｍｌのＨｆｒと１ｍｌのＦ−とを加え、直ちに混合物をミリポアフィルタでろ過する。この濾液を予熱された富化培地シャーレ上で３７℃で培養する。接合を４０分間継続させ、濾液を回収し、１　ｍ　ｌの１０ −２ＭのＭｇＳＯ４’Ｏ中に入れ、つぎに１分間強く撹拌してバクチリアラ懸濁させ、接合物を分離する。ｍｅｔ＋の選択のためにはグルコースを含有しメチオニンを含有せず、またはｘｙｌ＋の選択のためには単一の糖としてのキジローズを含有しメチオニン（１００μｇ／ｍｌ）を含有する最小培地６３（Ｍｉｌｌｅｒ　Ｊ、Ｈ，１９７２，Ｅｘｐｅｒ４ｍｅｎｔｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒＧｅｎｅｔｉｃｓ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　Ｎ、Ｙ、　）のシャーレ上にアリコートを陳列した。これらの２選択培地はトレオニンもロイシンも含有しないが、Ｉｆｒの三重逆選択を可能にするため、ストレプトマイシン（２５μｇ／ｍｌ）を含有する。これらのシャーレをそれぞれ３７℃で４０時間、６０時間、および８８時間培養し、クローニングを集めて計数し、検査した。ホモスペシフィック交差　Ｈｆ’ｒ　Ｅ、Ｃｏ１１Ｘ　Ｆ−Ｅ、Ｃｏ１１に対応する対照テストを同一条件で実施した。

さらに菌株Ｓａ１ｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉｍｕｒｊｕｉのＦ−をｒｅｃＡについて突然変異性に成した（タンパク質ｒｅｃＡはすべての相同性組換えに不可欠である）。

もっとも大きな効果を得た菌株Ｉ！ｕｔＬとｍｕｔｓのテスト結果を下記の表１に示す。この表は、受容体菌株のみによって得られた復帰突然変異体（６０時間培養）の抽出後に供与体バクテリアＨｆｒによってｘｙｌ＋に成された受容体Ｆ −の頻度を示す。同等の結果がマーカｍｅｔについても得られた。

表１接合　供与体ｘｙｌ”　／Ｈｆｒ頻度Ｇｏｌｆ　Ｈｆｒ　＋　Ｃｏ１ｔ　Ｆ−ＩＪ　１Ｏ−１Ｃｏｌｊ　Ｈｆｒ　＋　Ｓａｌ、　ｌｌ１ｕｔ＋　Ｆ−８，７１Ｏ−７ＣｏｌＩＨｆｒ　＋Ｓａ１．　ｍｕｔＬ　Ｆ−２，１１Ｏ−３Ｃｏｌｔ　Ｈｆ’ｒ　＋　Ｓａｌ、　１Ｉｌｕｔｓ　Ｆ−１，７１Ｏ−３Ｃｏｌｔ　Ｈｆｒ　＋　Ｓａｌ、　ＬＩｌｕｔ＋　ｒｅｃＡ　Ｆ−４，３１Ｏ−８Ｃｏｌｉ　Ｈｆ’ｒ　＋　Ｓａｌ、　ｍｕｔＬ　ｒｅｃＡ　Ｐ−１，８１Ｏ−８Ｃｏｌｔ　Ｈｅｒ　＋　Ｓａｌ、　ｔｎｕｔＳ　ｒｅｃＡ　Ｆ−６１０−８遺伝子間組換え頻度は、ｍｕｔＬとｏｌｕｔｓについては少なくとも１０４の倍率で増大し、ＤＮＡ制限に対して欠陥を有するが不対合部分修復遺伝子に対して野生的な５ａｌａｏｎｅｌｌａｓ　Ｆ−（ｍｕｔ＋　）について実施された接合に関してはｎｕｔ　ＨとＵについて少し弱い。選択的培地における組換え体の選択により、Ｅ、Ｃｏ１１とＳａｌｍｏｎｅｌ　Ｉａｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍとの間のこれらの雑種を得る事ができたが、これらは新規な組換えと新規な組換え遺伝子とによって得られた新種ｒＥｓｃｈｅｎｅｌｌａＪおよびｒｓａｌｍｏｒｉｃｈｉａＪであると考える。

インタスペシフィック組換えによって得られたキシロ−ズ糖（ｘｙｌ＋）を発酵させる事のできる原栄養菌組換え体（ｓｅｔ＋）は種々のメカニズムによって形成される。最も簡単なメカニズムは、Ｅ、Ｃｏ１１間またはＳａｌｍｏｎｅｌ　Ｉａｔｙｉ）ｈｉｍｕｒｉｕ１間のｒｅｅＡ依存接合（イントラスペシフィック接合）の通常の結果としての遺伝子の直接置換である。

他の２つのメカニズムは部分的ディプロイドの形成を生じる。これらの型の組換え体はその安定性に関して相違する。単なる置換が安定であり部分的ディプロイドが不安定であると期待される。その結果、インジケータシャーレ上の線状痕検査により、各交差の組換え体の表現型安定性を確認した（１％キジローズ　ＭｃＣｏｎｋｅｙ培地、Ｍｉｌｌｅｒ、　Ｊ、Ｈ，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ　１ｎ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｇｅｎｅｔｉｃｓ（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ。

Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、１９７２）参照）。全体として、遺伝子開維換え体の安定性プロフィルは異種グループを示している。

表　２：　接合交差　Ｅ、Ｃｏ１１　Ｈｆｒ　Ｘ　Ｓａｌａｏｎｅｌｌａｔｙｐｈｌｍｕｒｉｕｓ　Ｐ−の組換え体ｘｙｌ＋およびｍｅｔＥ＋　ｌ１ｅｔＡ＋の分析マーカ　組換え体　ｘｙｌ＋ｘｙｌ＋　中の　■ｅｔ十中の　安定：　トランスポゾン受容体Ｐ−ｍｅｔ＋％　ｘｙｌ十％　不安定：　喪　失５ａｌｌｌＯＤｅｌ　Ｉａｔｙｐｈｌｌｕｒｉｕｍ　：ｃｕｔ　＋　７．７（３８９）　５．８（４１２）　３３：１ｍｕｔＬ：：Ｔｎｌｏ　３．８（４１２）　９．４（４１２）　８：２７　７／８．０／２７ｎｕｔｓ：：Ｔｎｌｏ　８．７（４１２）　６．８（３７５）　１：３４　０／１．０／３４ｍｕｔＨ：：Ｔｎ５　１０．７（４１２）　１．９（４１２）　１：２８　０／７．０／２８ｓｕｔＵ：：Ｔｎ５　２．４（４１２）　２２．０（４１２）　１９：１６　１９／１９Ｊ／１８Ｅ、Ｃｏ１１：ｌ１ｌｕｔ　＋　８３．１（４１２）　１８．９（４１２）　２０：０Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　Ｃｏ１１の遺伝子ＩＩｕｔ＋が５ａｌａ＋ｏｎｅｌ　Ｉａｔｙｐｈｉ■ｕｒｉｕ−の遺伝子ｌ１ｕｔを置換したか否かを知るため、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉａ＋ｕｒｉｕＩＨの遺伝子ｎｕｔの中に挿入されたトランスポゾンの運命を追跡した。機能性Ｅ、Ｃｏ１１の遺伝子■ｕｔがＴｎを有する残留遺伝子１ａｕｔを置換したとすれば、組換え体は抗生物質に対する抵抗性とその突然変異特性とを同時に失うであろう。受容体菌株Ｓａ１ｍｏｎｅｌ　Ｉａｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ　ｇｕｔＬ：：ＴｎｌＧ　との交差に際して得られた８安定組換え体ｘｙｌ＋　１ｌｌｅｔ＋の７について、前記の現象が実際に生じた。これは、組換え体以外は、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａＣｏｌｔの配列がａ＋ｕｔＬ部位の中での最後の遺伝子（ｌｌ１ｅｔＡ）の選択の約５分後まで、Ｓａｌｗｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉｍｕｒ１ｕｍ配列を置換した事を示す。受容体菌株としてのＳａｌｍｏｎｅｌ　Ｉａｔｙｐｈｌｍｕｒｉｕｍ　ＩＩｕｔＵ：：Ｔｎ５との交差に際して、１９組換え体ｘｙｌ＋の１９において遺伝子ｍｕｔＵが置換された。ｍｕｔｓ：　：ＴｎｌＯおよびｍｕｔｅ：　：Ｔｎ５　の交差の組換え体ｘｙｌ＋　ａｅｔ＋はいずれもトランスポゾンの喪失または遺伝子ｆｆ１ｕｔの置換を示さなかった。これは、接合が４０分後に中断され、遺伝子ａ＋ｕｔｓＳｗｕｔＨの染色体部が伝達されなかったからである。

第１図はＳａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉｍｕｒ１ｕＩｌｌ配列とＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａＣｏ１１配列との間の物理的結合を示す。２つの親株の遺伝子ＤＮＡとその３種の安定遺伝子間組換え体ｘｙｌ＋ｗｅｔ＋（それぞれ交差ｍｕｔＬ、Ｍｕｔｓおよびａｃｕｔｅ）を酵素５ｐｅｌによって切断し、得られた鎖をＢｅｃｋｓａｎ　Ｇｅｎｅ　Ｌｉｎｅ　ＴＡＰＥ　装置上の脈動フィールド上で電気泳動作用で分離した。親Ｓａ１ｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｓ　Ｐ −のＤＮＡの２つのより大きな鎖（Δ）は前記３組換え体の中に存在せず、これらの組換え体はその代わりに少なくとも１つの非親鎖を取得し、これは種間ＤＮＡ結合を含むものと考えられる。そのほか、Ｅ、Ｃｏ１Ｉ　Ｈｆ’ｒの少なくとも１つの大きなりＮＡ制限鎖（Ｖ）が組換え体Ｌ１７と９１２の中に観察された（Ｌｉ７は番号１８３２で寄託された組換え体）。

使用されたＳａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ菌株ｍｕｔＬ　Ｆ− はパスツール研究所のＣＮＣＭに番号Ｓ　Ｌ　４２１３　ｌ１ｕｔＬ（Ｎｏ、１８３１　）で寄託された。

遺伝子組換え体Ｅ、Ｃｏ１１　Ｈｆｒ　／ＳａｌＩＩｌｏｎｅｌｌａｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｉ　Ｐ−も、パスツール研究所のＣＮＣＭに番号Ｓ　ＣＬ　１７　（Ｎｏ、１８３２）で寄託された。

実施例　２　ヒスチジンオペロン中の異種特異的組換え：　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｌａ　Ｃｏ１ｔ遺伝子によるＳａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉｇｕｒｉｕＩｍ遺伝子の置換５ａｌＩＩｌｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕａとＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　Ｃｏ１１間の異種特異的組換えによる遺伝子の置換頻度を測定する実験手法は下記のとおりであった。

（１）遺伝子情報「受容体」菌株として、下記の２つの欠陥遺伝子を含む５ａｌｉｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉｍｕｒｌｕｍ　ＬＴ２を使用し、その組換えによる機能回復を研究した。

−細胞種Ｓ−をヒスチジノールの介在においてもヒスチジンを合成不能とする突然変異を伴うｈｉｓＤ：：ｌ５２００　、および一プロリン（ｐｒｏ−）合成を不能とする欠失を伴うｐｒｏＡＢ４７　（Ｌａｍ、Ｓ、　＆　Ｒｏｔｈ、Ｊ、Ｆ、（１９８３）、　Ｃｅ１ｌ　３４９５１−９６０：　Ｃ５ｏｎｋａ、　Ｌ、Ｎ、　（１９８１）Ｍｏ１．Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、　１８２８２−８８参照）。ＨｌｓＤ：　二ｌ５２００は不活性転移可能要素の挿入に相当し、ｈ１ｓＤ＋には戻らない。

遺伝子情報供与体菌株は完全なヒスチジンオペロンまたはプロリンオペロン（ｈｉｓ＋およびｐｒｏ＋）を含むＳａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉｓｕｒｌｕｍ菌株、またはオペロンｈ１ｓ（ｈｉｓ６４４）を欠失しているが、Ｅ、Ｃｏ１１のオペロンｈｉｓを含むＥ、Ｃｏ１１、Ｐ’１５０のエピゾームの取得によってｈｉｓ＋に成されたＳａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈ１ｍｕｒｉｕａ＋菌株とする（Ｈａｒｔｓａｎ　ｅｔ　ａｌ、、（１９７１）＾ｄｖ、Ｇｅｎｅｔ、　１Ｂ、　１０３４；　Ｌｏｗ。

Ｋ、Ｂ、（１９７３）　Ｂａｃｔ、　Ｒｅｖ、３６．５８７−６０７参照）。

“（２）受容体中への供与体の遺伝子転位は、形質導入バクテリオファージ　ｐ２２　Ｈｆ’ｔ　１ｎｔ３　（Ｓｃｈｎｉｅｇｅｒ。

Ｈ，（１９７２）　Ｍｏ１．Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ　１１９．７５−８８　）によって実施される。これは遺伝子転位の伝統的方法である（Ｍｉｌｌｅｒ。

１、）１．　”Ｅｘｐｅｒｉｍｅｔｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ−、ＣｏｌｄｓｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｎ、Ｙ、　１９７２）　ｏファージを供与体菌株上で成長させてファージストックを生産し、バクテリアによる多数回感染によって受容体菌株を感染させ、感染されたバクテリアを「セレクティブ」シャーレ上に展開し、これらのシャーレ上には供与体菌株の遺伝子特性を取得したバクテリアのみが成長する（例えば、バクテリアｈｉｓＤ＋の検出のためにはプロリンを含有するがヒスチジンを含有せずヒスチジノール（３０μｇ／ｌ）を含有し、またバクテリアｐｒｏ＋の検出のためには、ヒスチジンとアルギニンを含有するがプロリンを含有しないゲローズＭ６３最小培地（前記文献Ｘｉ　ｌ　Ｉｅｒ参照））。３７℃で２日培養後にｈｉｓＤ＋またはｐｒｏ＋コロニーを計数する。

相同性（イントラスペシフィック）組換えに対するホメログ（遺伝子間）組換え中の変動を表示する１つの方法は、供与体Ｅ、Ｃｏ１１のｈｉｓＤ−または供与体５ａｌＩＩｏｎｅｌ　Ｉａｔｙｐｈｉｍｕｒ１ｕ＋ｇのｈｉｓＤ＋から生じるリザートＰ２２Ｈｆｔ　ｔｎｔ３に対するトランスダクタントｈｉｓＤ＋およびｐｒｏ＋の比率を確定するにある（これら２種の菌株は同一のサルモネラｐｒｏＡＢを有する）。

下記の表３Ａは、野生型菌株ｎｕｔ＋と受容体菌株の誘導体ｍｕｔＬ、ｍｕｔｓ、１ｕｔＵおよびｇｕｔＨに対するこれらの２比率ｈｉｓＤ＋／ｐｒｏＡＢ＋　（異種特異性および同種特異性）を示す。

異種特異性ｈｉｓＤに対する比率ｈｉｓＤ＋／ｐｒｏＡＢ＋はバクテリア１ｌｕｔｓおよびｍｕｔＬの中では１００倍以上増大するが、ｍｕＬＨの中ではこれより少し増大し、ｍｕｔＵは非常にわずかに増大する。この比率は供与体が５ａｌｉｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｌｍｕｒｉｕｍのｈｉｓＤ＋およびｐｒｏＡＢ＋である時、４倍以上増大しない。これらの結果は接合結果を定量的に確証する。

この場合、ｈｉｓＤの欠陥の遺伝的マーカとして、クロルアンフェニコール（１０μｇ／ｍｌ）に対する抵抗性を有し遺伝子ｈｉｓＤＯ中に進入してこの遺伝子を破壊する欠陥トランスポゾンＴｎｌＯ−ｄｃａｍを使用する事によって、遺伝子置換を実証した。機能遺伝子Ｅ、Ｃｏ１１のｈｉｓＤ＋による欠陥遺伝子ｈｉｓＤ：　：ＴｎｌＯｄ−ｃａＩｌｌの置換は下記の２つの付随表現型効果を示す。

（ｉ）受容体バクテリアがｈｉｓＤ＋となる（ヒスチジノールの存在において成長；表現型）ｌｏｌｌ）および（ｉ　ｉ）受容体バクテリアはそのトランスポゾンＴｎｌＯｄ−ｃａａを失い、クロルアンフェニコールに感性となる。

下記の表３Ｂは、いずれのトランスダクタントｈｉｓＤ＋もクロルアンフェニコールに対する抵抗性を保持しなかったが、トランスダクタントｐｒｏ＋　（遺伝子ｐｒｏＡＢは遺伝子ｈｉｓＤから離間している）はそのクロルアンフェニコールに対する抵抗性を保持している事を示す。

表　３：　形質導入による交差Ａ、突然変異対立遺伝子は、原栄養菌ヒスチジノールを５ａｌＩＩｌｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍに与えるＥ、Ｃｏ１ｊ配列の能力を促進する。

異種特異的　同種特異的交差　交差ｌｏｌｌ：Ｅ、Ｃｏ１１　ｌｏｌｌ：Ｓ、ｔｙｐｈｉｉ＋ｕｒｉｕｍＰｒｏ＋：Ｓ、ｔｙｐｈｉＩＩｕｒｉｕＩＩＰｒｏ＋：Ｓ、ｔｙｐｈｊｍｕｒｉｕｉ受容体菌株の対立遺伝子　Ｈｏｌ＋／Ｐｒｏ＋（ｘ　１０’　）　Ｈｏｌ＋／Ｐｒｏ＋ｕｔ１１ＬＪｔ＋　４　３２０ ■ｕｔＬ書１　３５５　１８０ｍｕｔＬ　雰２　１４７　１５０ａｂｕｔｓ　Ｈ８９６１３０ｉｕｔｓ　＄２　４５１　１８０ｏ＋ｕｔＵ　Ｈ２０４８０ａ＋ｕｔＵ　８２　１０　５２０ｉｕｔＨ宴１　３７　１８０ｉｕｔＨ１ｔ２　１７０　１９０Ｂ、対立遺伝子置換による種間形質導入受容体菌株　ブラックの　ブラック　コロニーのの対立遺伝子　内容　の選択　平均数ｕｔｍｕｔ＋　Ｐｒｏ、Ｈｏｉ　Ｈｏｌ＋　５Ｐｒｏ、　Ｍｏｌ、Ｃａ１ＩＨｏｌ＋　ＣａＩＩ’　０Ｈ１ｓ、Ａｒｇ　Ｐｒｏ＋　４７８Ｈ１ｓ、Ａｒｇ、Ｃａｍ　Ｐｒｏ＋　Ｃａｌ１ｒ　４９ｇｍｕｔｓ　Ｐｒｏ、Ｈｏ１．　Ｈｏｌ＋　１６８Ｐｒｏ、　Ｈｏ１．Ｃａｍ　Ｈｏｌ＋　ＣａＩｒ０）１ｉｓ、Ａｒｇ　Ｐｒｏ＋　１３４４Ｈ１ｓ、　Ａｒｇ、Ｃａｍ　Ｐｒｏ＋　Ｃａｌ１ｒ１１１０凡例：）１ｏ１＋　−ヒスチジノールの存在における成長Ｃａｍ　−クロルアムフェニコール実施例　３　塩基不対合部分修復酵素システムの一時的飽和による不活性化Ｅ、　ｃｏｌｔにおいては、誤り修正システムＨｕｔ（）１．Ｌ、Ｓ、Ｕ）は限られており、滴定によって、すなわちタンパク質ＭｕｔＬの機能不活性化によって飽和させる事ができる。

最も突然変異性として知られる菌株Ｅ、ｃｏｌｉ　ｍｕｔＤ５は、ＤＮＡポリメラーゼ１１１に組み合わされた核外修復読み取りにおいて欠陥を有するので、多くの複製誤りを生じる。

ファージ　φｘ１７４またはλの異種二重らせんＤＮＡによるトランスフェクションによって、これらのバクテリアが富化培地中の成長に際して不対合部分の修復において欠陥がある事が証明された。バクテリアＤＮＡの複製を停止すれば（感熱性突然変異による複製の制止状態または特異的停止）、修復活性が完全に回復される。再−びクロルアムフエニコールによってタンパク質合成を阻止すればこのような修復作用が阻止される。従ってＨｕｔシステムは飽和されるだけでなく　「死亡」するので、これらの酵素または修復酵素を再合成しなければならない。

生体中不対分子の修復テストは、基質として、試験管中において、ＤＮＡの鎖を分離し異種二重らせん型の新しい二重らせんを再構成する事によって構成された特定の分子を使用する。配列に関して特定の突然変異遺伝子を使用する事により、単一の特定不対合部分を有する分子を構成する事ができる。遺伝子ｃｌの中にバクテリオファージλの抑制因子をコード付けする突然変異遺伝子を使用した。

これはバクテリオファージλのプロファージ「休眠」状態に対応するタンパク質であって、これが野生型ファージの「濁り」部位に対して細胞溶解部位に表現型「透明」を与える。この場合、遺伝子ｃｌの第４３塩基対のレベルでＡ：Ｔを生じるＧ：Ｃ突然変異に対応する突然変異ＵＶ２３が問題となる。選ばれた鎖に対応して、野生型鎖と突然変異ＵＶ２Ｂを有する鎖とをもったファージλのＤＮＡを構成した。この二重らせんは、突然変異ＵＶ２Ｂのレベルにおける不対合部分Ｇ：ＴまはＡｒｃ以外の約５０，０００塩基対において正常である。

ファージλのストックの作成と、ポリ（Ｕ、Ｇ）（ウリジンおよびグアノシン）重合体の存在における塩化セシウムのグラジェント中の鎖の分離については、Ｍ、Ｍｅｓｅｌｓｏｎ　＆Ｒ，Ｙｕａｎ　（１９６ｇ）、Ｎａｔｕｒｅ、　２１７：１１１０−１１１４に記載されている。

塩基不対合部分修復酵素システムは５°ＧＡＴＣ配列のメチル化（６−メチル− アデニン）によって方向付けられるのであるから（Ｒａｄｍａｎ　＆νａｇｎｅｔ　（１９８８）。

５ｃｉｅｔｉｆｉｃ　Ａｍｅｒｉｃａｎ、Ａｕｇｕｓｔ　１９ｇｇ）　、単一の鏡上にメチル化部位を有する異質二重らせんＤＮＡを構成した。塩化カルシウム法によって外部ＤＮＡに対して透過性に成されたバクテリアＥ、　ｃｏｌｔの中に前記ＤＮＡを単一コピーとじて導入する（Ｍａｎｄｅ　＆　Ｍｉｇａ　（１９７０）、　Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ。

５３：１５９−１６２）　（指数関数成長中のバクテリアが少なくとも２．５時・間、水浴中において０．１ＭのＣａＣｌ２の中に保持される）。トランスフェクション処理されたバクテリアを、１晩培養されたベトリシャーレ上に柔らかいゲロースと共に展開し、感染中心の各異種二重らせんのファージ子孫を各感染中心の移植ファージの再展開によって特定した。感染中心の３つの型が可能である。すなわち、純粋混濁（Ｃ÷）、純粋透明（ｃ）およびファージＣ＋とを含む混合型。混合型感染中心は修復されていない異種二重らせんＤＮＡの子孫を含み、２つの鎖、Ｃ十とＣは、それぞれの特性を有する不対塩基を修復によって除去する事ができる以前に、複製されてファージ子孫を生じている。従って多数の混合型感染中心の存在する事は修復が行われなかった事を意味し、またその逆が成り立つ。

さらに、方向付けられた修復はメチル鎖によって担持された型の純粋感染中心を生じるので、比率ｃ　／　ｃ＋の中に影響を生じる（下記の表４参照）。

この方法はＰｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８２：５０３− ５０５（１９８５）に記載されている。

下記の表４は、ＤＮＡ合成の忠実度において欠陥を有し、従ってそのＤＮＡ複製に際して多数の不対合部分を発生する突然変異体菌株ｍｕｔＤ５においては、不対合部分の修復が欠陥を有する事を示している。

表４二種々の菌株と成長条件におけるヘミメチル化λバクテリオファージの異種二重らせん分子のファージ子孫の遺伝的分析Ｅ、Ｃｏ１１の　培養　異種二重らせん：　Ｃ＋−Ｇ−−−（ｒ）ｗｅ−菌株　条件　Ｃ−−−Ｔ−−−（１）ｉｅ＋子孫：　ｃ＋　ｃ／ｃ＋　ｃ（％）Ｗ３１１０　３２＠０　４　９６（ＩＩｌｕｔｅ）　４２°　１４９５Ｃ８００（ＩｌｕｔＬ）　３２　＠１　８８　１３４２”　１９２７Ｗ３１００　３２’　Ｏ３９７ｄｎａ　Ａ（ｔｓ）　４２°　０３９７ＫＤ　ｌ０７９　３２°　０　４８　５２（ｍｕｔ　Ｄ５）　４２°　１　４９　５０ＫＤ　１０７９　３２°　１　４８　５１ｄｎａ　Ａ（ｔｓ）Ｉｌｌｕｔ　Ｄ５　４２°　０　１０　９０バクテリアＷ　３１１０　ｄｎａ　Ａｔｓの混合感染中心の３％をバクテリア１ＩｌｕｔＤ５における混合感染中心の４８乃至４９％と比較すれば明らかなように、突然変異体ｍｕｔＤ５における不対合部分の修復が欠陥を示す。混合感染中心の４９％を突然変異体ａ＋ｕｔＬの８６乃至９２％と比較すれば明らかなように、不対合部分の修復欠陥がすべてではない。

４２℃において２時間の突然変異体ｄｎａ　ＡｔｓのバクテリアＤＮＡ複製の中断はａｕｔＤ５以外の菌株の不対合部分の修復には影響していない。ｄｎａ　Ａｔｓにおいては、混合感染中心を１０％含む不対合部分の修復の回復が見られた。

このような回復はタンパク質合成抑止剤、すなわち１００μｇ／ａｌのクロルアンフェニコールの存在においては生じなかった。従って、誤った複製による不対合部分の形成を停止した場合、タンパク質の合成以外には修復を実施する事はできない。この事は、不対合部分の修復が酵素の「自殺」を意味する事を示している。この場合、飽和作用は単数または複数のタンパク質Ｈｕｔの機能不活性化に対応する。下記の実験において、機能欠損タンパク質がタンパク質ＭｕｔＬである事を示す。

ファージＭＩＳ　ｉｐ２の環状異種二重らせんの生産ファージＤＮＡおよび細胞間ＤＮＡは、純粋ファージから、またはファージによる感染と３０分の培養後に、Ｂｒｏｏｋｓ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８ｇ）に記載のように臭化エチジウムの存在においてＣｓＣＩ遠心分離によって分離される。これはＭａｎｉａｉｔｓ、　Ｐｒ１ｔｓｃｈｅ　＆Ｓａｍｂｒｏｏｋ　（１９ｇ２）。

Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｌｎｇ、　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ａ＋ａｎｕａ１．　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇｔ（ａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋによって記載された標準法である。線形二重分岐を有する細胞管ＤＮＡ　（ＲＦＩ　）を、７０℃の水中で１０分間変性しつぎに６０℃の緩衝液２ＸＳＳＣの中で１０分間、単一鎖ＤＮＡの存在において復元された酵素Ａｖａ　ＩＩと共にヒブリド化する事によって生産される。

一本鎖のＤＮＡは０．１ＭのＮａＣｌの存在においてベンゾイル化−ナフタイル化セルローズによって除去される。

ＧＥＴ不対不都合部分する異種二重らせんＤＮＡはｐＨ８の０．０５Ｍ　Ｔｒｊｓおよび０．００１ＭのＥＤＴＡの緩衝液の中に保存される。

ＧＥＴ不対不都合部分のマーカを備える：５−−−ＧＴＴ−−−３’　（−）青（Ｉａｃ＋）メチル−３°−−−ＴＡＡ−−−５°（＋）白（１ａｃ−）メチル＋ファージλのＤＮＡについて述べたように、細胞壁体に対するジチオトレイトール　カルシウムとジメチルスルフオキシドとの作用に基づくハナハン法（Ｍａｎｉａｔｔｓｅｔ　ｃｏｉｌ、　１９ｇ２　）によって透過性に成された細胞の中に単一の分子が入る。トランスフェクション化されたバクテリアは希釈され、インジケータ菌株ＣＳＨ５０（ｄｅｌ　Ｉａｃ−ｐｒｏ、　ａｒａ−、ｐｒｏ− 、ａｔｒ　Ａ　）と共にＳＸ−ｇａｌ　とＩ　ＰＴＧの存在において展開されて、ファージ１ａｃ−（突然変異体）ではなくファージブラックｌａｃ＋の青色着色を可能とする。混合細胞溶解（白／青）の部位は修復されない異種二重らせんを示す。

下記の表５は、成長の対数段階で、修復欠陥突然変異体ｌ１ｕｔＬと突然変異体ｌｌ１ｕｔＤにおいて感染中心部分が類似している事を示す。しかし静止段階前の遅い対数段階においては、突然変異体ｍｕｔＤの混合感染中心部分は野生型ω υ　”ｔ＋と同一であり、従って例えばａ＋ｕｔＤは急速成長中は不対合部分修復に関して欠陥を有するが、成長が減速した時にその修復活性を回復する。

表　５：突然変異菌株中のバクテリオファージの異種二重らせん分子（不対合部分ＧＥＴを有する異種二重らせん分子）のファージ子孫。成長段階の影響。

感染中心の性質とパーセントＥ、Ｃｏ１１の菌株　初期対数段階　後期対数段階混合　白　青　全体　混合　白　青　全体ＫＡ７９Ｂ　０．５　９２　７．５　１１２０　［ｉ、９　７６　１７．１１２９０（ｍｕｔ＋）ＮＲ９１６３（ａ＋ｕｔＬ）　５０．Ｂ　７．９　４１．５　８８０　４７．８　Ｂ、６　４５．８１８０３Ｒ９０ＢＢ（１１ｕｔＤ）　４０．７　２２　３７．３１０１．３　７．５　Ｂ９．８２２．５１９４９下記の表６は、クローニングされ過発現された遺伝子が菌株ＩＩｕｔＤの中において不定部分修復活性を回復できる事を示す。さらに詳しくは、菌株ｍｕｔＤの中に導入されたプラスミドｐＢＲ３２５の中にクローニングされた遺伝子ｎｕｔｓおよびｌ１ｕｔＵではなく遺伝子■υｔＬおよびｌ１ｕｔ）Ｉは、はとんど完全な修復活性を示す。またこの観察と一致して、下記の表７に示すようにプラスミドｐＢＲ３２５（ｍｕｔｓ＋　）またはｐＢＲ３２５（ｍｕｔＵ＋　）ではなくプラスミドｐＢＲ３２５（ｍｕｔＬ＋　）またはｐＢＲ３２５（ｍｕｔＨ＋　）を有する５ｕｔＤの中において、自発的突然変異の頻度が低下している。

表　６：遺伝子ｍｕｔＨｓ　ｍｕｔＬ、　ｇｕｔｓおよびｍｕｔＵを有するプラスミドを含む突然変異体菌株ｌ１ｕｔＤ中の７７一ジＭ１３ｍｐ２の異種二重らせん分子（Ｇ　：　Ｔ不対合部分）のファージ子孫Ｅ、Ｃｏ１１の　感染中心の性質とパーセント菌株　混合　白　青　合計ＮＲ９０６８ｍｕｔＤ５ −　ｐＢＲなし　４７．８　１７．７　３４．４　６６１＋ｐＢｒ（ＩｌｕｔＨ＋＞　６．０　７７．８　１６．４　１７５６十ｐＢｒ（ｍｕｔＬ＋）　１．３　７３．３　２６．２　８７２＋　ｐＢｒ（ｍｕｔｓ＋）　４９．８　１４．１　３Ｂ、０　１１８８＋　ｐＢｒ（ｍｕｔＵ＋）　３９．７　１８．５　４１．６　８６７分離体ｋ（ｍｕｔｅ）　５５．０　１１．８　３３．４　１１６１ＫＡ　７９Ｂ　（ａ＋ｕｔ＋）　２．６　８０．３　１８．９　１７７８ＮＲ９１８３（ｍｕｔＬ−）　４８．２　Ｂ、２　４５．５　１８１１表　７：プラスミド　ｐＢＲ３２５（ｍｕｔＨｓ　１ｕｔＬｓ　ｎｕｔｓまたはａｕｔＬＩ）を含むｍｕｔＤｓ中の自発的突然変異の頻度Ｅ、Ｃｏ１１の　突然変異の頻度（Ｘ　１０’）菌株　Ｒ１ｆＲＮａｌＲＮＲ９０Ｂ６　ｍｕｔＤ５ −　ｐＢＲなし　２１５．０　Ｂｏ、３＋　ｐＢｒ（ｍｕｔＨ＋）　４２．４　８．７＋　ｐＢｒ（＋ｇｕｔＬ＋）　１５．３　０．７１＋　ｐＢｒ（ＩＩｕｔｓ’）　１４９．０　３７．３十ｐＢｒ（ｍｕｔＬｌ＋）　１６５．０　３Ｂ、４分離体ＡＩＩｌｐ５（ｗｕｔＬ−）　２４５．０　５５．ＩＫＡ　７９Ｂ　（ｍｕｔｅ）　０．００Ｂ　０．０００８これらのテストは、誤まりの重大な結果またはなだれ効果の第１の実験的証明である。ＤＮＡ合成レベルでの過度の誤りは塩基不対合部分修復酵素システムの飽和（不活性化）を生じる。その結果は、システム中の複製忠実度の二重の欠損である。

Ｅ、Ｃｏｌ　１ｉｕｔＤ５の中にプラスミドｌ１ｕｔＨ＋　、ｍｕｔＬ＋　、ａｂｕｔｓ＋およびｍｕｔＵ＋を導入する際に、ＭｕｔＬ機能が過生産される時には修復活性の喪失が存在しない事を示す事ができる。従って、タンパク質ＭｕｔＬは修復作用中に「自殺」する。突然変異体ｍｕｔＤ５は「誤りの重大結果」の第１の実験結果を示す。ＤＮＡ複製レベルでの過度の誤りは修復システムに過負荷を加え、このシステムが崩壊して「なだれ」効果を生じる。

従って、修復システムが崩壊して基質の「溶解」まで不活性にとどまり不対合部分と酵素Ｈｕｔの再合成を生じるためには、細胞中に過度に多数の塩基不対合部分を一挙に導入すればよい。

実施例　４　は乳動物の細胞における塩基不対合部分修復酵素システムの飽和は乳動物の細胞において突然変異体ｍｕｔ−の分離は困難である。同一類の２コピーの同時的不活性化を必要とする二倍体細胞中の劣性突然変異が問題となる。

またこれらの突然変異は致死的である。これは、特に反復配列の種々のファミリのレベルでの配列の多形性が染色体安定性のキー要素である事による。実際上、この多形性の故に、塩基不対合部分修復酵素システムは反復配列間の危険な組換え（染色体の変体）または相同性染色体間の組換え（有枝分裂組換えによるホモ接合体）を防止する事ができる。ただし、母分子の複製から生じて同様配列を有する姉妹染色体間の修復組換え、すなわち姉妹染色体の交換の場合を除く。

３テストを試みた。不対合部分の豊富な異種二重らせんＤＮＡをマウス細胞の中に導入した後に、下記が見られるか否かを測定した。

ａ）変化した反復配列間の組換えの活性化による染色体変体の出現、ｂ）修復されない複製膜りによる突然変異体の出現、Ｃ）合成ヌクレオチドによる発ガン突然変異体の標的化、つぎに他のオリゴヌクレオチドによるその修復。

ａ　）　Ｃ，Ｃｈｅｎ　＆　Ｈ，Ｏｋａｙａｍａ（１９８７）、Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、７：２７４５−２７５２　ＣＨｉｇｈ　ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ　ｔｒａｎｆ’ｏｒｎ＋ａｔｉｏｎ　ｏｆｒ５ａ＋ｎ＋ｎａｌｉａｎ　ｃｅｌｌｓ　ｂｙ　ｐｌａｓＩＩｌｉｄ　ＤＮＡ−）に記載の方法によるＣＨＯ細胞（チャイニーズハムスタの卵巣）とＮＩＨ３Ｔ３（マウスの繊維細胞）のトランスフェクション化を実施する。細胞の約５０％を下記において製法を説明する環状ＤＮＡ、すなわち異種二重らせんＭ１３／ｆｄをもって確実にトランスフェクション化し、約１０６のＤＮＡ塩基対が細胞の中に入り、従って約２００分子が約３５，０００不対合部分を有する。凝縮された有糸分裂染色体を観察するための中期ブラックを、Ａ、Ｒ，Ｋ１ｎ５ｅｌｌａ　＆　Ｍ、Ｒａｍａｎ。

Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｏｆ’　ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ　ｃｈｒｏｍｏｓｏａ＋ａｌａｂｅｒｒａｔｔｏｎｓ　ｂｙ　ａｎ　ａｎｔｔｅａｒｃｔｎｏｇｅｎｔｃ　ｐｒｏｔｅａｓｅｉｎｈｉｂｌｔｏｒ”、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＬＩＳＡ（１９８０）　７７゜３５４４−３５４７および”Ｔｕａ＋ｏｒ　ｐｒｏｍｏｔｏｒｉｎｄｕｃｅｓ　ｓｉｓｔｅｒｃｈｒｏｍａｔｉｄ　ｅｘｃｈａｎｇｅｓ：　ｒｅｌｅｖａｎｃｅ　ｔｏ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ　ｏｆｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ”、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＬＩＳＡ（１９７ｇ）７５、６１４９−６１５３に記載の方法によって調製した。

ｂ）不対合部分の豊富な異種二重らせんによるトランスフェクション化の突然変異効果をテストするため、プラスミドｐｃＤ　ｎｅｏのＤＮＡ　ＣＣｈｅｎ　＆　０ｋａｙａｓ＋ａ　（１９８７）Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、　７　：　２７４５−２７５２　”ｈｌｇｈ　ｅｆ’ｆｉｃｉｅｎｃｙｔｒａｎｓｒｏｒｌａｔｉｏｎ　ｏｆｌＩａｍｍａｌｉａｎ　ｃｅｌｌｓ　ｂｙ　ｐｌａｓＩｌｉｄ　ＤＮＡ”　）を異種二重らせんと混合する。これにより、４００μｇ／■１のネオマイシン０４１８の存在において、外因性ＤＮＡの進入した細胞を選択する事ができる。これらの細胞のうちから、’　Ｋ１ｎ５ｅｌｌａ　＆　Ｒａｄｍａｎ　（１９７８）Ｐ、Ｎ、Ａ、Ｓ、　ＵＳＡ　７５゜６１４９−６１５３に記載のようにして、６−チオグアニンおよびウアバインに対して抵抗性の突然変異体の頻度をテストする。

Ｃ）標的およびプログラミング突然変異誘発物質。

合成オリゴヌクレオチドの進入を実施するため、種々の方法、例えばリン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、およびＣｈｅｎ　＆　Ｏｋａｙａｍａ、　Ａｎｄｒｅａｓｏｎ　＆　Ｅｖａｎｓ＆　ｍａｎｎｉｓ　＆　Ｇｏｕｌｄ−ＦｏｇｅｎｔｅによってＢｉｏｔｅｃｈｎｌｑｕｅｓ、　ｖｏｌＳ、、　Ｎｏ７．７月／８月、１９８８に記載されたりポゾーム法を使用する事ができる。核中の直接ミクロ噴射法も実施する事ができる。

形質転換のためにマウスの細胞ＮＩＨ３Ｔ３を使用し、塩基不対合部分修復酵素システムの不活性化剤として下記に製法を説明する異種二重らせんＭ１３／ｆｄを使用し、また合（下線のＴは腫瘍遺伝子に−ｒａｓのコドン１２の中に存在する多くの人間腫瘍またはけっ菌類の腫瘍の中の「突然変異」塩基である）を使用した。転換細胞の発ガン特性は単層表層上の「炉床」の成長によって、または柔らかなグロース中の成長によって示される。オリゴヌクレオチド５’　ＧＴＴＧＧＡＧＣＴＧＧＴＧＧＣＧＴＡＧと逆の突然変異誘発因子によって、遺伝学的治療を実施する事ができる。

異種二重らせんＭ１３／ｆｄと異種二重らせんφＸｉ　７４／Ｇ４の調製バクテリオファージＭ１３とｆ’ｄＯＤＮＡ間に３％の不対合部分を含む異種二重らせんを作成した。

操作手順は下記である。

一細胞間ＤＮＡ　（環状、二重鎖またはＲＰＩ　）の分離、−各分子集団を一度、しかし分子の相異なる箇所において襞間する、一変性一復元一環状ＤＮＡの分離（Ｂｒｏｏｋｓ　ｅｔ　ａｌ、、１．９８９　に記載のように）。

）−５０％　−ｚ５０％８４０１１ｐ、ｂ、分子あたり１７４不対合部分（配列：　Ｖａｎ　Ｗｅｚｅｎｂｅｅｋ　ｅｔ　Ｃｏ１１．（１９８０）　Ｇｅｎｅ、ｌｌ：１２９−１バクテリア培養、ファージ感染、ノくクテリオファージＭ１３またはｆｄの複製型（ＲＦＩ）は、Ｍｅｓｓｉｎｇ　ｉこよって、ｍｅｔｂｏｄｓ　ｉｎ　ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　ｖｏ、１０１．ｐ　２Ｏ−７８（１９８３）ｌこ記載されている。

型Ｉ（ＲＦＩ）は、ファージＭ１３はＢａ１ｌによって、ファージｆｄはＢａｍＨｌによって切断した。酵素消化後（こ、これらのＤＮＡをＬｅｅ、　Ｃ１ａｒｋ　＆　Ｍｏｄｒｉｃｈ　ＰＮＡＳ　８０．４６３９−４６４３（１９８３）　に記載の手順によって変性しつぎ１こ復元した。リガーゼＥ、Ｃｏ１１の作用後に、等個結合によって閉じた環状ＤＮＡをＣ５ＣＩ−ＥｔｄＢｒ遠心分離によって精製した。

また同様にして、ファージφＸ１７４およびＧ４のＤＮＡの間に３０％の不対合部分を含有する異種二重らせんを調製した。

下記の菌株を１９８８年１２月２３日に、Ｃｏ　Ｉ　Ｉ　ｅｃｔ　ＩｏｎＮａｔｉｏｎａｌ　ｄｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅｓ　ｄｅ　Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｔｓｍｅｓ、　１ｎｓｔｉｔｕｔＰａｓｔｅｕｒ、２ｇ、ｒｕｅ　ｄｕ　Ｄｏｃｔｅｕｒ　Ｒｏｕｘ、７５７２４　ＰＡＲＩＳ　ＣＥＤＥＸ　１５　に寄託した。

Ｓａ１ｍｏｎｅ！Ｉａ　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ　ＳＬ　４２１３　ｍｕｔ　Ｌ　Ｎｏ、Ｉ　８３１遺伝子間組換え体　５ＣＬ１７　Ｎｏ、Ｉ　８３２参　照　文　献１．　ＭＡＲＩＮＵＳ　Ｍ、と　ＭＯＲＲＩＳ　Ｎ、　（１９７３）コ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ　１１４　目４３−１１５０゜２、　ＴＩＲＡＢＹ　（、、と５ＩＣＡＲＤ　Ａ、　（１９７３）り、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ　１１６１１３０− １１３５゜３、ＷＩＬＬＩＡＭＳＯＮ　ｅｔ　ａｌ、（１９６５）Ｇｅｎｅｔｉｅｓ　１１０６０９−６４６゜４、　Ｏｃｈｍａｎと’Ｗｉｌｓｏｎ　ｉｎ　Ｅ、　ｃｏｌｉとＳａ１ｍｏｎｅｌｌａτｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ　Ｖｏｌ、　２Ａｍｅｒｉｃａｎ　５ｏｃｉｅｔｙ　ｆｏｒ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ　ＤＣｐｐ　１６４９−１６５４゜５、８ＡＲＯＮ　ｅｔ　ａｌ　（＋９５９）　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＬＩ５Ａ　４５　９７６−９１！１４゜６、ＥＩＳＥＮＳ丁ＡＲＫ　（１９６５）　Ｐｒｏｃ、ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、５ｃｉ、ＵＳＡ　５４　１１７−１２０゜７、ＭＥＲＧＥＡＹ　と　ＧＥＲＩＴＳ　（１’１３）　コ、Ｇｅｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　１２９　３２１−３３５゜８、Ｐ、ＢＲＯＯＫＳ　ｅｔ　ａｌ、ａｃｃｅｐｔｅｄ　ｆｏｒ　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ。

９、Ｍａｎｉａｔ、ｉｓ　ｅｔ　ｃｏｌｌ、　（１９８２）　Ｍｏ１ｅｃｕｌｅｓ　ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ｈａｒｂｏ秩@Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ。

１０、　Ｍｅｓｅｌｓｏｎとｙａｕｎ　（１９６ｇ）　Ｎａｔｕｒｅ　２１７１１１０−１１１４゜Ｉｌ、　Ｒａｄｍａｎ　と　Ｗａｇｎｅｒ　（１９ｇｇ）　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　ａｍｅｒｉｃａｎ　Ａｕｇｕｓｔ　１９８８　ｆ”Ｐｏ浮秩@１ａＳｃｉｅｎｃｅ”　０ｃｔｏｂｅｒ　１９１ｉ８）。

１２、　ＭｅｎｄｅｌとＭｉｇａ　（１９７０）　Ｍ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ　５３１５９−１６２゜＋３．　Ｄｏｈｅｔ　トＷａｇｎｅｒ　（１９８５）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＬＪＳＡ　８２５０３−５０５゜１４、Ｃ，Ｃｈａｎ、Ｈ，Ｏｋａｙａｍａ　（１９８７）Ｍｏ１．Ｃｅ１１．ｂｉｏｌ、７２７４５−２７５２゜１５、　Ｋ１ｎ５ｅｌｌａとＲａｄｍａｎ　（１９７８）　ＰＮＡＳ　７５６１４９−６１５３゜１乙　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　Ｖｏｌ、６　ｎ”　７　コｕｌｙ／Ａｕｇｕｓｔ　（１９８ｇ）。

＋ｇ、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　Ｖｏｌ、１０１　ｐｐ、２０−７８　（１９８３）。

国際調査報告 −１−−１−一一−ｗ−ＰＣＴ／ＦＲ８９１００６７３−一一一〜−一−−９ＰＣｒ／Ｆ’Ｒ８９１００６７３

Claims

【特許請求の範囲】

１．３０％以下の塩基不対合部分を有する部分的相同性ＤＮＡ配列の生体中組換え法において、前記ＤＮＡ配列間の組換えを生じる時間、特に飽和作用によって、または遺伝的組換えを増大する突然変異体によって、欠陥を示しまたは一時的に不活性化された塩基不対合部分修復酵素システムを有する細胞または生体の中に、前記部分的相同性ＤＮＡ配列を加える事を特徴とする方法。
２．雑種遺伝子およびそのコード付けられたタンパク質の生体中生産法において、請求項１による方法にて塩基不対合部分修復酵素システムにおいて欠陥を有しまたは不活性化された前記生体の中に、２種の相異なる生体から派生し部分的相同性遺伝子から成る２種の前記ＤＮＡ配列を存在させることと、所望の雑種遺伝子またはそのコード付けされたタンパク質を選択する事を特徴とする方法。
３．雑種遺伝子およびそのコード付けタンパク質の生体中生産法において、第１生体の第１遺伝子が第１プラスミドによって保持され、第２生体の部分的相同性第２遺伝子が、欠陥のある塩基不対合部分修復酵素システムを有するバクテリアの中に、または遺伝子間組換えを増大するその他任意のバクテリアの中に、あるいは一時的に不活性化された塩基不対合部分修復酵素システムを有するバクテリアの中に転換によって導入されることと、前記遺伝子を組換えることと、所望の雑種遺伝子またはそのコード付けされたタンパク質を選択する事を特徴とする請求項２に記載の方法。
４．組換えられる遺伝子を保持するプラスミドと共に転換されるバクテリアは、塩基不対合部分修復酵素システムにおいて欠陥を有しまたは一時的に不活性化された菌株Ｅ．ｃｏｌｉ　または　Ｓａ１ｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、または遺伝子間組換えを増大するこのようなバクテリアのその他の任意の突然変異体とする事を特徴とする請求項３に記載の方法。
５．塩基不対合部分の修復機能のための感熱性菌株、例えば４２℃において変異性ｍｕｔＳ−、また３２℃において正常ｏｕｔ＋であるＥ．Ｃｏｌｉ　ｍｕｔＳｔｓ−１を使用する事を特徴とする請求項１または２に記載の方法。
６．転換技術または融合技術によって組換えられた細胞を生産する方法において、一下記を使用し、・第１種および第１類の生体の細胞のＤＮＡ、・第２種および／または第２類の生体の細胞の染色体ＤＮＡ、第２種または第２類の生体の前記細胞は塩基不対合部分修復酵素システムの中において欠陥を有しまたは特に飽和作用によって一時的に不活性化されているようにして生体中転換および組換えを実施する方法、あるいは−これらの２つの型の細胞の融合後にこれらの細胞の染色体の生体中組換えを実施し、これらの細胞はいずれも欠陥を有する塩基不対合部分修復酵素システムを有し、あるいは特に飽和作用によって一時的に不活性化された前記システムを有する事を特徴とする請求項１に記載の方法。
７．相異なる種および／または類の生体の生体中交差によって組換えられた生体を生産する方法において、−第１種および第１類の生体と、 −第２種および／または第２類の生体との間において、生体中交差を実施し、これら２種の生体の少なくとも一方は塩基不対合部分修復酵素システム中において欠陥を示し、または特に飽和作用によって一時的に不活性化された前記システムを有する事を特徴とする請求項１に記載の方法。
８．対応の生体からバクテリア、酵母菌、植物または動物の組換え細胞または組換え生体を生産する事を特徴とする請求項６または７のいずれかに記載の方法。
９．相異なる種および／または類のバクテリアの交差と組換えによって組換えられたバクテリアの生産方法において、 −塩基不対合部分修復酵素システムにおいて欠陥を有しまたはその塩基不対合部分修復酵素システムが必要な組換えを得る間特に飽和作用によって一時的に不活性化された第１種および第１類のいわゆる受容体バクテリアと、 −受容体細胞に与えようとする特性を有する第２種および／または第２類のいわゆる供与体バクテリアとを、生体中において接合および形質導入する事を特徴とする請求項６または７に記載の方法。
１０．いわゆる受容体バクテリアはさらにＤＮＡの制限酵素システムの中において欠陥を有する事を特徴とする請求項９に記載の方法。
１１．部分的に相同性の２遺伝子から雑種遺伝子およびそのコード付けされたタンパク質を生体中生産する方法において、請求項７乃至１０のいずれかに記載の方法の第１生体が第１遺伝子を含み、前記第２生体が部分的相同性の第２遺伝子を含むことと、所望の雑種遺伝子および／またはそのコード付けタンパク質を選定することを特徴とする方法。
１２．菌株Ｅ．ｃｏｌｉおよび菌株Ｓａｌｏｍｅｌｌａｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍを交差させ、少なくともその一方が塩基不対合部分修復酵素システムにおいて欠陥を有しまたは一時的に不活性化されている事を特徴とする請求項９乃至１１のいずれかに記載の方法。
１３．塩基不対合部分修復酵素システムにおいて欠陥を有する菌株Ｅ．ｃｏｌｉ　またはＳａ１ｍｏｎｅ１１ａ　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍはｍｕｔＳ−型またはｍｕｔＬ−型であり、すなわち不対合部分の認識において介入するタンパク質ＭｕｔＳおよびＭｕｔＬにおいて欠陥を有する事を特徴とする請求項１２に記載の方法。
１４．接合に際して、供与体バクテリアはＨｆｒ型であり、受容体バクテリアはＦ−突然変異体である事を特徴とする請求項９乃至１３のいずれかに記載の方法。
１５．塩基不対合部分修復酵素システムの飽和は不対合部分の豊富な異種二重らせんの導入によって実施される事を特徴とする請求項１乃至１４のいずれかに記載の方法。
１６．突然変異以前のように復元しようとする突然変異された塩基を有する請求項１による生体中遺伝子の標的逆突然変異誘発法において、生体の塩基不対合部分修復酵素システムを飽和によって不活性化するための多数の不対合部分を含む異種二重らせんと、遺伝子の突然変異以前のように復元されたＤＮＡ配列から成るオリゴヌクレオチドとを前記生体中に導入する事を特徴とする請求項１に記載の方法。
１７．異種二重らせんはファージＭ１３　およびｆｄから生じる事を特徴とする請求項１５または１６のいずれかに記載の方法。