JP2002536990A

JP2002536990A - 不活性化されたｄｎａミスマッチ修復系を有する菌類細胞

Info

Publication number: JP2002536990A
Application number: JP2000601131A
Authority: JP
Inventors: ベデルボルケルト，トルベン; クリスチャンセン，ラース; ビン，イェスペル
Original assignee: ノボザイムスアクティーゼルスカブ
Priority date: 1999-02-24
Filing date: 2000-02-17
Publication date: 2002-11-05
Also published as: EP1157095A1; CN1341146A; AU2536400A; WO2000050567A1

Abstract

(57)【要約】糸状菌細胞のミスマッチ修復系に包含される新規クローン化された遺伝子を用いて、糸状菌細胞においてDNAライブラリーを製造するための方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】発明の分野：糸状菌細胞のミスマッチ修復系に包含される新規クローン化された遺伝子を用
いて、糸状菌細胞においてDNAライブラリーを製造するための方法に関する。

【０００２】発明の背景：ミスマッチ修復系は、新しく合成された二重鎖DNA配列におけるミスマッチを
認識する、細胞内のシステムである。次に、ミスマッチ修復系は、例えば鋳型としてメチル化された“古い”株を用
いることによって、エラーとして見られるミスマッチを訂正するか、又は他方で
は、それは、ミスマッチを含んで成る二重鎖のDNA配列の変性を介在することが
できる。正確な機構とは無関係に、最終結果として、“ミスマッチ修復系”は、ミスマ
ッチを含んで成る二重鎖DNA配列として表される、細胞内の“多様性”（diversi
ty）を制限するであろう。

【０００３】例えば、単一のミスマッチを含んで成る二重鎖DNA配列は、細胞内に２種の異
なったDNA配列の多様性を表す。ミスマッチ修復系がそのミスマッチを訂正する
と、細胞内に１つの多様性のみが存在するであろう。あるいは、ミスマッチ修復系がそのような二重鎖DNA配列の変性（degradation
）を介在する場合、多様性は失われるであろう。ミスマッチ修復系が細胞内でい
かにして作動するかについて図解を示す図１を参照のこと。従って、ミスマッチを含んで成る二重鎖DNA配列が注目のDNAライブラリーを表
す場合、このライブラリーの多様性は、活性なミスマッチ修復系を有する細胞中
に形質転換される場合、制限される。

【０００４】従来技術は、ミスマッチ系が不活性である細胞を製造することによってこの問
題の解決法を提供する。ヨーロッパ特許第449923号は、ミスマッチ系が不活性化された細菌細胞を記載
している。 WO79/37011号は、ミスマッチ系が不活性化された酵母細胞を記載している。こ
の書類の実施例を参照のこと。 WO97/05268号は、ミスマッチ系が不活性化されたマウス細胞を記載している。
この書類の実施例を参照のこと。

【０００５】発明の要約：本発明により解決されるべき問題は、糸状菌細胞においてDNAライブラリーを
製造するための改良された方法を提供することである。次に、DNAライブラリー
を含んで成る糸状菌細胞集団は、注目のポリペプチドを選択するために使用され
得る。また、特定の性質を有するポリヌクレオチド配列、例えばプロモーター、
ターミネーター、及び変更され/改良された性質を有する他の調節要素が選択さ
れ得る。

【０００６】解決法は、本発明者が、糸状菌細胞のミスマッチ修復系に含まれる新規遺伝子
をクローン化したことに基づいている。さらに、この遺伝子は、糸状菌細胞のミ
スマッチ修復系に含まれる最初のクローン化された遺伝子である。糸状菌細胞におけるこの遺伝子を不活性化することによって、そのミスマッチ
修復系を欠失せしめ、そして糸状菌細胞においてDNAライブラリーを調製するた
めに非常に有用である糸状菌細胞を得ることが可能である。前記遺伝子は、配列番号２の位置683-758に示されるポリペプチド配列をコー
ドする非常に特徴的なDNA配列を含んで成る。

【０００７】このDNAは、配列番号２の位置1−940に示されるポリペプチド配列をコードす
る十分な長さの遺伝子をクローン化するために使用されて来た。本明細書におけ
る実施例を参照のこと（下記参照のこと）。本明細書における実施例に記載のようにしてクローン化された遺伝子は、アス
ペルギラス・オリザエ（Aspergillus oryzae）糸状菌細胞からクローン化された
遺伝子である。

【０００８】しかしながら、本明細書に提供される新規配列情報に基づけば、例えば標準ハ
イブリダイゼーション又はPCR技法により、好ましくはハイブリダイゼーション
プローブ又はPCRプライマーを製造するための基本原理として、配列番号２の位
置683-758に示されるポリペプチド配列をコードするDNA配列を用いることにより
、他の糸状菌細胞から類似する相同遺伝子をクローン化することは、当業者の通
常の作業である。

【０００９】従って、第１の観点においては、本発明は、ミスマッチ修復系に含まれる遺伝
子が不活性化されており、そして前記ミスマッチ修復系に含まれる遺伝子が、（ａ）配列番号２の位置683−758に示されるポリペプチド配列をコードするDN
A配列；又は（ｂ）配列番号２の位置683−758に示されるポリペプチド配列に対して少なく
とも70％同一であるポリペプチド配列をコードするDNA配列；を含んで成ることを特徴とする糸状菌細胞に関し；そして

【００１０】第２の観点においては、本発明は、ミスマッチ修復系に含まれる遺伝子が不活
性化されており、そして前記ミスマッチ修復系に含まれる遺伝子が、（ａ）配列番号２の位置1−940に示されるポリペプチド配列をコードするDNA
配列；又は（ｂ）配列番号２の位置1−940に示されるポリペプチド配列に対して少なくと
も70％同一であるポリペプチド配列をコードするDNA配列；を含んで成ることを特徴とする糸状菌細胞に関する。

【００１１】上記で言及されたように、本発明の第１又は第２観点の糸状菌細胞は、糸状菌
細胞における注目のDNAライブラリーを製造するために非常に適切である。従って、第３の観点においては、本発明は、糸状菌細胞集団の調製方法に関し
、ここで前記集団における個々の細胞は注目のDNAライブラリーを表す注目のそ
れぞれ異なったDNA配列を含んでなり；次の段階、（ａ）本発明の第1又は第２の観点の糸状菌細胞を含んで成る糸状菌細胞集団
に、注目の個々の異なったDNA配列を配置し；そして（ｂ）本発明の第1又は第２の観点のミスマッチ修復系遺伝子が不活性化され
ている条件下で前記集団における注目の個々のDNA配列の少なくとも１度の倍化
を可能にする時間、前記（ａ）の集団を増殖せしめる；ことを含んで成る。

【００１２】第３の観点の段階（ｂ）下に記載のように、個々のミスマッチ修復不活性化さ
れた糸状菌細胞による注目のDNAの倍化を可能にする利点の1つが、図１に例示さ
れる。図１に見られるように、本明細書に記載されるような糸状菌ミスマッチ修
復不活性化された細胞を用いる第３の観点の方法は、DNAライブラリーの調製を
可能にし、結果的に、ヘテロ二重鎖DNAミスマッチが訂正されない。これは、不
活性化されたミスマッチ修復系を有さない糸状菌細胞において製造されるDNAラ
イブラリーに比較して、高い多様性を有するDNAライブラリーを付与する（図１
を参照のこと）。注目のDNA配列の重複は、２本の鎖が複製され、その結果、二
本鎖DNAの２つの異なった組が生成され、ここで個々は２つの元の鎖の異なった1
つに基づかれていることを意味する。

【００１３】糸状菌細胞集団（ここで、前記集団における個々の細胞は上記のように注目の
DNAライブラリーを含んで成る）が、注目のポリペプチドを選択するために使用
され得る。従って、第４の観点においては、本発明は、第３の観点の段階を含んで成る注
目のポリペプチドの生成方法に関し、ここで前記注目のDNA配列が注目のポリペ
プチドをコードし、そして次の段階：（ｃ）、第３の観点の段階（ｂ）の糸状菌細胞のその得られる集団から、注目
の所望のポリペプチドを選択することをさらに含んで成る。

【００１４】前記第４の観点の方法の利点は、注目のポリペプチドが、そのポリペプチドを
発現する糸状菌細胞から選択されることであり得る。従って、前記ポリペプチド
は、続いて、糸状菌細胞において大規模にポリペプチドを生成することが必要と
される場合に有用である糸状菌細胞から発現され得ることが直接知られている。
これは、糸状菌ポリペプチドが好ましくは、糸状菌細胞において産業的に適切な
高い収率で生成されることが知られているので、DNAライブラリーが、糸状菌細
胞に由来する注目のポリペプチドをコードする場合、特に注目のものであり得る
。

【００１５】これは、例えば酵母細胞を用いての類似する選択方法に相反するものである。
ここで、知られている唯一のことは、選択されたポリペプチドが酵母において発
現され得、そして特に高い収率が必要とされる場合、発現が遅いほど、糸状菌細
胞は問題をもたらすことである。

【００１６】定義：次のセクションは、本発明の上記観点における技術的特徴の定義を提供する。用語“遺伝子”とは、遺伝子（DNA配列）が前記細胞内でポリペプチドに発現
されるであろうことを示す。従って、前記遺伝子は、開始コドン（通常、“ATG
”、“GTG”又は“TTG”）から出発して、そして停止コドン（通常、“TTA”、
“TAG”又は“TGA”）で終結するオープンリーディングフレームとして定義され
るであろう。

【００１７】前記遺伝子を発現するためには、遺伝子に関連して、当業界において知られて
いるように細胞内における遺伝子の発現のために必要な要素が存在すべきである
。そのような標準の要素は、プロモーター、リボソーム結合部位、終結配列、及
び当業界において知られている他の要素を包含することができる。

【００１８】用語“ミスマッチ修復系”は、二重鎖DNA配列においてミスマッチを認識する
、細胞内のシステムとして当業界においては理解されるであろう。例えば、WO97
/37011号（１ページの21〜28行）を参照のこと。次に、ミスマッチ修復系は、例えば鋳型として、メチル化された“古い”株を
用いることによって、エラーとして見られるミスマッチを訂正するか、又は他方
では、それは、ミスマッチを含んで成る二重鎖DNA配列の変性を介在することが
できる。正確な機構とは無関係に、その最終結果は、“ミスマッチ修復系”が、ミスマ
ッチを含んでなるそのような二重鎖DNA配列により表される細胞内の“多様性を
制限することであろう。

【００１９】例えば、単一のミスマッチを含んでなる重複のDNA配列は、細胞内の２種の異
なったDNA配列の多様性を表す。ミスマッチ修復系がミスマッチを訂正する場合
、細胞内の１つの多様性のみが存在するであろう。他方では、ミスマッチ修復系
がそのような二重鎖DNA配列の変性を介在する場合、この多様性は失われるであ
ろう。ミスマッチ修復系に包含される遺伝子によりコードされるポリペプチドは、ミ
スマッチへの結合を包含する機構によりミスマッチを認識する。

【００２０】従って、本明細書に記載される糸状菌細胞がそのミスマッチ修復系において不
活性化されるか又は否かを試験するための適切なアッセイは、“ゲルシフトアッ
セイ”を使用することであり、又は他方では、“ゲル遅延アッセイ”と呼ばれる
。これは、当業界において使用される標準のアッセイである。WO97/05268 (16,
17及び25ページを参照のこと)。そのようなアッセイにおける原理は、細胞抽出物が、（ａ）糸状菌細胞（ここ
で、ミスマッチ修復系に包含される、本明細書に記載されるような遺伝子が活性
化されている）；及び（ｂ）遺伝子が不活性化されていない、その対応する糸状
菌細胞の両者から調製される。次に、それらの抽出物は、塩基対ミスマッチされ
たG：T；G：A；G：G；A：C及びへリックス外TGジヌクレオチドを含むオリゴヌク
レオチドに結合され/混合され、そして非変性ゲル上で追跡される。

【００２１】ゲルシフトアッセイが、対照糸状菌細胞（遺伝子が不活性化されていない）が
、本明細書に記載されるように、上記オリゴヌクレオチドのいずれかに結合する
いずれかのタンパク質を含んで成り、そしてそれらの結合タンパク質が、ミスマ
ッチ修復系に包含される遺伝子が不活性化されている糸状菌細胞に見出されない
ことを示す場合、後者におけるミスマッチ修復系が不活性化されていることが確
認される。適切なゲルシフトアッセイの詳細な記載が、本明細書における実施例１に提供
される。

【００２２】下記用語： “配列番号２の位置683−758に示されるポリペプチド配列に対して少なくとも 70％同一であるポリペプチド配列をコードするDNA配列 ”、及び “配列番号２の位置1−940に示されるポリペプチド配列に対して少なくとも70 ％同一であるポリペプチド配列をコードするDNA配列 ” に関しての配列同一性
は、第２配列からの第１配列の誘導を示す２種の配列間の同一性の程度として決
定される。

【００２３】その同一性は、当業界において知られているコンピュータープログラム、例え
ばGCGプログラムパッケージ（Program Manual）for the Wisconsin Package, Ve
rsion 8, Angust 1994, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madiso
n, Wisconsin, USA 53711) に供給されるGAP により適切に決定され得る（Needl
eman, S. B. and Wunsch, C.D., (1970), Journal of Molecular Biology, 48,
443-453）。

【００２４】ポリペプチド配列比較のための次の設定：3.0のGAP創造ペナルティー及び0.1
のGAP延長ペナルティーによるGAPを用いる場合、本発明の類似DNA配列によりコ
ードされるポリペプチドは、本発明の第１の観点に従って、配列番号２の位置68
3−758に示されるアミノ酸配列と；又は本発明の第２の観点に従って、配列番号
２の位置1−940に示されるアミノ酸配列と、少なくとも70％、より好ましくは少
なくとも80％、より好ましくは少なくとも90％、より好ましくは少なくとも95％
及び特に少なくとも97％の程度の同一性を示す。

【００２５】用語“DNAライブラリー”とは、本明細書においては、少なくとも２つの異な
ったDNA配列のライブラリーを示す。多くの実施目的のためには、ライブラリー
はより大きくあるべきである。従って、DNAライブラリーは好ましくは、少なく
とも1000の異なったDNA配列、より好ましくは少なくとも10000の異なったDNA配
列、及びさらにより好ましくは少なくとも100000の異なったDNA配列を含んで成
る。

【００２６】本発明の第３の観点の方法における段階（ａ）に関して、用語“糸状菌細胞集団に注目の個々の異なったDNA配列を配置する ”とは、本明細書においては、そ
れは糸状菌細胞集団に配置される注目の同一のDNA配列ではない点で広く理解さ
れるであろう。本発明においては、ミスマッチ修復欠失細胞を用いてDNAライブ
ラリーを製造するための方法に関しては、前記用語は好ましくは、糸状菌細胞集
団内の細胞が、それらが細胞内でお互いハイブリダイズし/組換えることができ
るように部分的に相同である注目の少なくとも２種の異なったDNA配列を含んで
成る情況を示すべきである。細胞内での前記組換えを得るために、そのような配
列がいかに部分的に相同であるかを決定することは、当業者の一般的な知識の範
囲内である。

【００２７】染色体DNA配列に対して一部相同の1本鎖オリゴヌクレオチドが細胞内に配置さ
れ、又はミスマッチ（例えば、ベクター内に含まれる）を含んで成る二重鎖DNA
配列が細胞内に配置される実施例が存在する。糸状菌細胞内にそれらのDNA配列を配置する特定の実験手段は、多くの適切な
技法、例えば形質転換技法のいずれかに従って実施され得る。

【００２８】本発明の第３の観点の手段（ｂ）に従っての用語“ミスマッチ修復系遺伝子が不活性化されている条件下で、集団における注目の個々のDNA配列の少なくとも
１回の重複を可能にする時間、（ａ）の集団を増殖する ”とは、個々の細胞が少
なくとも１度、自律重複した後、ミスマッチ修復系が、その工程の利点を失わな
いで、再び活性化され得ることを示す。これについての技術的理由は、図１に示
される。

【００２９】個の例においては、単一のミスマッチを含んで成る二重鎖DNA配列が、糸状菌
細胞に配置される。細胞が、ミスマッチ修復系遺伝子が不活性化されている条件
下で1度、重複された後、その二重鎖DNA内の２種のそれぞれ異なった1本鎖DNA配
列がそれぞれ重複され、２種の異なった重複配列が提供され、ここで個々の重複
された細胞における１つはいずれのミスマッチも有さない。従って、そのような
細胞はミスマッチを有する注目の二重鎖DNA配列を含まないので、ミスマッチ修
復系不活性のまま持続する技術的必要性は存在しない。

【００３０】下記セクションにおいては、例の手段によってのみ本発明の好ましい態様が記
載される。発明の特定の記載：ミスマッチ修復系に包含される、本明細書に記載されるような遺伝子が不活性化されている、本明細書に記載されるような糸状菌細胞ミスマッチ修復系に包含される遺伝子の不活性化：ミスマッチ修復系に包含される、本明細書に記載されるような新規遺伝子は、
当業者に知られている多くの既知技法のいずれかにより不活性化され得る。

【００３１】本発明の態様は、ミスマッチ修復に包含される遺伝子が欠失性である、本明細
書に記載されるような糸状菌細胞に関する。 DNA配列が知られている場合、遺伝子を欠失性にするための多くの方法は、当
業者に知られている。それらの方法は、遺伝子のDNA配列の一部の欠失；ヌクレ
オチドの欠失又は挿入によるフレームシフト突然変異の導入；停止コドンの挿入
、などを包含する。本発明の好ましい態様は、ミスマッチ修復に関与する遺伝子が一時的に不活性
化されている、本明細書に記載されるような糸状菌細胞に関する。

【００３２】上記に類似して、これを行うための多くの方法、例えば遺伝子の上流への調節
可能プロモーターの挿入、又は例えば染色体上の遺伝子の一部の永久的な欠失、
続いて、遺伝子を含んで成る細胞中へのベクター（例えば、プラスミド）の挿入
は、当業者に知られている。次に、プラスミドは、遺伝子の上流に調節可能プロ
モーターを含んで成るか、又はたぶん、プラスミドは、ミスマッチ修復系が一時
的に不活性化される場合、細胞から除去され得、そして次に、ミスマッチ修復系
が再活性化される場合、細胞中に再挿入され得る。

【００３３】特定の技術目的のために適切な手段を選択することは、当業者の一般的な知識
の範囲内である。本明細書に記載されるようなミスマッチ修復系を一時的に不活性化できる糸状
菌細胞を製造するための好ましい手段は、最初に、細胞の染色体上の本明細書に
記載されるミスマッチ修復遺伝の永久的な不活性化、続いて、前記遺伝子を含ん
で成る細胞中へのプラスミドの挿入であり、ここで前記プラスミドは、それが適
切な複製開始配列及び適切な選択マーカーを含んで成ることにより特徴づけられ
る。

【００３４】好ましくは、適切な複製開始配列は、AMA１（Gems, D., など., 1991, Gene 9
8: 61-67）である。適切な複製開始配列及び適切な選択マーカーのより詳細な記載は、この直後に
提供されており、そして本明細書における実施例４においては、複製開始配列と
してAMA１及び選択マーカーとしてAmdSを含んで成るプラスミドを用いてのこの
手段の例が提供されている。

【００３５】複製開始配列：本明細書において使用される場合、用語“菌類複製開始配列”とは、通常、プ
ラスミドの構造的な転移又は宿主細胞ゲノム中への組み込みを伴なわないで、菌
類宿主細胞において、染色体外分子の自律的複製を支持できる核酸配列、例えば
、プラスミド又はDNAベクターとして定義される。その複製開始配列は、それが
、菌類細胞において複製開始活性を介在できる限り、いずれかの起原のものでも
良い。

【００３６】好ましくは、複製開始配列は、糸状菌細胞、より好ましくは、アスペルギラス
（Aspergillus）、フサリウム（Fusarium）又はアルテルナリア（Alternaria）
の株、及びさらにより好ましくは、アスペルギラス・ニジュランス（Aspergillu
s nidulans）、アスペルギラス・オリザエ（Aspergillus oryzae）、アスペルギ
ラス・ニガー（Aspergillus niger）、フサリウム・オキシスポラス（Fusarium
oxysporum）又はアルデルナリア・アルテナタ（Alternaria altenata）の株から
得られる。

【００３７】複製開始配列は、当業界において良く知られている方法により同定され得る。
たとえば、前記配列は、酵母における自律的複製を維持できる配列として問題の
生物に由来するゲノムフラグメント間で同定され得る（Balance and Turner, Ge
ne, 36 (1985), 321-331; 糸状菌細胞における自律的複製の能力の表示）。所定
の配列の菌類における複製開始活性はまた、企画されたプラスミド複製体により
菌類を形質転換し、そしてプラスミド上に見出される遺伝子について選択する場
合、選択培地に対する増殖の欠失を導くであろう選択プラスミドの欠失を示す不
規則な形態学を有するコロニーを選択することによって決定され得る（Gems な
ど., Gene 98 (1991) 61-67）。

【００３８】 AMA1はこの手段で単離される。複製開始配列を単離するための他の手段は、天
然に存在するプラスミド（例えば、Tsugeなど., Genetics 146 (1997) 111−120
によりアルテルナリア・アルテナタについて開示されるような）を単離すること
である。複製開始配列の例は、それぞれ、Cullen, D., など. (1987, Nucleic Acids R
es. 15: 9163-9175) 及びGems, D., など. (1991, Genne 98: 61-67) により記
載されるように、アスペルギラス・ニジュランスのANS１及びAMA１配列を包含す
るが、但しそれらだけには限定されない。

【００３９】用語“複製開始活性”とは、その従来の意味で、すなわち配列が、菌類細胞に
おいて染色体外分子、例えばプラスミド又はDNAベクターの自律的複製を指示で
きることを示すために、本明細書において使用される。用語“プラスミドの構造的転移を伴なわないで”とは、プラスミドの一部が、
欠失されても、又はプラスミドの他の部分中に挿入されても、いずれかの宿主ゲ
ノムDNAがプラスミド中に挿入されてもいないことを意味する。

【００４０】糸状菌選択マーカー：用語“選択的圧力”とは、有効量の適切な選択剤の存在化で又はその剤の不在
下で、注目のポリヌクレオチド配列に操作可能的に連結される菌類選択マーカー
遺伝子を含むDNAベクターを含む糸状菌細胞の培養として、本明細書において定
義される。有効量の選択剤は、選択マーカーを含まない細胞からの選択マーカー
を含む細胞の選択を可能にするのに十分な量として、本明細書において定義され
る。好ましい態様においては、菌類選択マーカーは、殺生物剤又はウィルス毒性に
対する耐性、重金属毒性に対する耐性、又は栄養素要求株に対する原栄養性を提
供できる生成物をコードする遺伝子の群から選択される。

【００４１】より好ましい態様においては、原栄養性は、ヌクレオチド合成、補因子合成、
アミノ酸合成、アセトアミド代謝、プロリン代謝、スルフェート代謝及びニトレ
ート代謝から成る代謝経路の群から選択された酵素から得られる。本発明の方法における、さらにより好ましい態様においては、菌類選択マーカ
ーは、argB (オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ)、andS (アセトアミ
ダーゼ)、bar (ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ)、hemA (５−
アミノレブリン酸シンターゼ)、hemB (ポルホビリノーゲンシンターゼ)、hygB (
ヒグロマイシンホスホトランスフェラーゼ)、niaD (硝酸レダクターゼ)、prn (
プロリンペルミアーゼ)、pyrG (オルチジン−5’−リン酸デカルボキシラーゼ)
、pyroA, riboB, sC（硫酸アデニル−トランスフェラーゼ）及びtrpC (アントラ
ニル酸シンターゼ) から成る群から選択された遺伝子である。

【００４２】菌類細胞は、所望する特徴を有するか又はコードする注目の変異体ポリヌクレ
オチド配列を有する形質転換体をスクリーニングし、又は選択するための適切な
培地において及び適切な条件下で培養される。培養は、ポリヌクレオチド変異体
ライブラリーのスクリーニングについて当業界において良く知られている方法に
従って行われ得る。

【００４３】糸状菌細胞：本明細書において記載されるような糸状菌細胞は、真菌類及び卵菌類のすべて
の糸状形を包含する。糸状菌は、キチン、セルローズ、グルカン、キトサン、マ
ンナン、及び他の複合多糖類から構成される菌糸壁により特徴づけられる。植物
性増殖は菌子延長によってであり、そして炭素異化は絶対好気性である。対照的
に、酵母、例えばサッカロミセス・セレビシアエによる植物性増殖は、単細胞葉
状体の発芽によってであり、そして炭素異化は発酵性である。

【００４４】好ましい態様においては、糸状菌細胞は、アクレモニウム（Acremonium）、ア
スペルギラス（Aspergillus）、フサリウム（Fusarium）、ヒューミコラ（Humic
ola）、ムコル（Mucor）、マイセリオプソラ（Myceliophthora）、ネウロスポラ
（Neurospora）、ペニシリウム（Penicillium）、シタリジウム（Scytalidium）
、チエラビア（Thielavia）、トリポクラジウム（Tolypockadium）及びトリコダ
ーマ（Trichoderma）の種の細胞であるが、但しそれらだけには限定されない。

【００４５】本発明への使用の糸状菌細胞の例は、アスペルギラス細胞、アクレモニウム細
胞、フサリウム、ヒューミコラ細胞、マイセリオプソラ細胞、ネウロスポラ細胞
、ペニシリウム細胞、チェラビア細胞、トリポクラジウム細胞及びトリコダーマ
細胞を包含する。

【００４６】より特定には、糸状菌細胞は、アスペルギラス・アワモリ（Aspergillus awam
ori）、アスペルギラス・フォエチダス（Aspergillus foetidus）、アスペルギ
ラス・ジポニカス（Aspergillus japonicus）、アスペルギラス・ニジュランス
（Aspergillus nidulans）、アスペルギラス・ニガー（Aspergillus niger）又
はアスペルギラス・オクザエ（Aspergillus oryzae）; フサリウム・バクトリジ
オイデス（Fusarium bactridioides）、F. セレアリス（F. cerealis）、F. ク
ロオクウェレンス（F. crookwellense）、F. クルモラス（F. culmorum）、F.
グラミネアラム（F. graminearum）、F. グラミナム（F. graminum）、F. ヘテ
ロスポラム（F. heterosporum）、F. ネグンジ（F. negundi）、F. オキンスポ
ラム（F. oxysporum）、F. レチクラタム（F. reticulatum）、F. ロセウム（F.
roseum）、F. サムブシナム（F. sambucinum）、F. サロコラム（F. saroochro
um）、F. スポロトリシオイデス（F. sporotricioides）、

【００４７】 F. スルフレウム（F. sulphureum）、F. トリコテシオイデス（F. trichothec
ioides）、F. ベネナタム（F. venenatum）細胞又はF. ベネナタム細胞（Nirenb
erg sp. nov）; ヒューミコラ・インソレンス（Humicola insolens）細胞又はH.
ラヌギノサ（H. lanuginosa）細胞；ムコル・ミエヘイ（Mucor miehei）細胞；
マイセリオプソラ・サーモフィラス（Myceliophthora thermophilsa）細胞；ネ
ウロスポラ・クラサ（Neurospora crassa）細胞；ペニシリウム・フルプロゲナ
ム（Penicillium purpurogenum）細胞；チエラビア・テレストリス（Thielavia
terrestris）細胞又はT. ハルジアナム（T. harzianum）; トリコダーマ・コニ
ンギ（Trichoderma koningii）、T. ロンギブラキアタム（T. longibrachiatum
）、T. レセイ（T. reesei）又はT. ビリデ（T. viride）細胞である。

【００４８】DNAライブラリーを含んで成る糸状菌細胞集団の本発明の第３の観点に従っての
調製方法：本発明の第３の観点の方法の段階（ａ）に従っての糸状菌細胞集団への注目の個々の異なったDNA配列の配置：上記で言及されたように、糸状菌細胞内へのそれらのDNA配列の配置の特定の
実験手段は、多くの適切な技法のいずれか、例えば形質転換技法に従って行われ
得る。そのような標準の技法のさらなる説明については、一般的な菌類テキスト
ブック“Fungal Genetic”（1996, ISBN 0-8247-9544-X）を参照のこと。

【００４９】実際の例は、染色体DNA配列に対して部分的に相同の1本鎖オリゴヌクレオチド
配列が細胞内に配置されることであり得る。これについてさらなる説明について
は、Calissanoなど., (Fungal Genetic News letter 43: 15-16 (1995))を参照
のこと。もう1つの例は、ミスマッチを含んで成る二重鎖DNA配列（例えば、図1に示さ
れるようなベクター内に含まれる）が細胞内に配置されることであり得る。好ましい態様においては、注目の異なったDNA配列が、上記のような適切な複
製開始配列及び適切な選択マーカーを含んで成ることにより特徴づけられるプラ
スミドに含まれる。好ましくは、適切な複製開始配列は、AMA１（Gemes, D., など. 1991, Gene 9
8: 61-67）である。

【００５０】本明細書に記載されるように、ミスマッチ修復系遺伝子が不活性化されている条件下で段階（ａ）の集団における注目のDNA配列の少なくとも１度の重複を可
能にする時間、本発明の第３の観点の段階（ｂ）に従っての前記集団の増殖前記集団の増殖は、糸状菌細胞を増殖するための多くの適切な既知の培地のい
ずれかにおいて行われ得る。そのような適切な培地を選択することは、当業者の
一般的知識の範囲内である。

【００５１】上記で説明されたように、前記集団における個々の細胞は、ミスマッチ修復系
遺伝子が、本明細書に記載されるように、不活性化されている条件下で、少なく
とも１度の重複を可能にされるべきである。前記細胞は、もちろん、ミスマッチ修復系遺伝子が不活性化されている条件下
で、１回以上、重複を可能にされ得る。ミスマッチ修復系の不活性化は通常、細胞内の染色体DNAに対する突然変異の
蓄積を引き起こし、そしてそれにより、細胞に致死突然変異を付与するので、上
記のような重複サイクルの実際の好ましい数は、そのような可能性ある致死突然
変異がいかに早く生じるかに依存するであろう。

【００５２】いかに多くの重複サイクルが好ましいかを決定することは、当業者の一般的な
知識の範囲内である。それらの可能性ある致死突然変異のために、段階（ａ）下でのミスマッチ修復
系が一時的に不活性化されることが好ましい。第３の観点の段階（ｂ）に従っての重複の適切なサイクルの後、その一時的に
不活性化されたミスマッチ修復系は、糸状菌細胞自体におけるそれらの致死突然
変異を回避するために、再び活性化される。この一時的不活性化のための方法は
、上記方法のいずれかであり得る。

【００５３】染色体上への突然変異の導入を制限するもう1つの方法は、ミスマッチ修復欠
失条件下で染色体外要素を複製しながら、染色体複製を一時的に停止することで
ある。これは、染色体複製のために単に必要である要素に突然変異を導入するこ
とによって達成され得る。好ましい方法は、糸状菌細胞を使用することであり、ここで本明細書に記載さ
れるようなミスマッチ修復系に包含される遺伝子は、前記遺伝子を含んで成る細
胞中に、適切な複製開始配列及び適切なマーカーを含んで成ることによって特徴
づけられるプラスミドを挿入することによって、細胞の染色体上で永久的に不活
性化される。この方法のさらなる説明については、上記を参照のこと。

【００５４】好ましくは、適切な複製開始配列は、AMA１（Gems, D., など. 1991, Gene 98
: 61-67）である。さらなる態様は、段階（ｂ）下でのミスマッチ修復系が欠失性である、本発明
の第３の観点の方法に関する。さらなる態様においては、本発明は、本発明の第３観点の段階（ｂ）下で、注
目の部分的に相同のDNA配列のインビボ遺伝子間組換えが存在する、本明細書に
記載される方法に関する。本発明の全体的な概念はミスマッチ系の不活性化を包含する方法を提供するこ
とであるので、もちろん好ましくは、前記部分的に相同のDNA配列が、ミスマッ
チを含んで成る二重鎖DNA配列をインビボ形成できることである。

【００５５】本発明の第３の観点の段階を含んで成り、そして注目のDNA配列が本発明の第４
の観点に従って、注目のポリペプチドをコードする、注目のポリペプチドの生成方法：第３の観点の段階（ｂ）の糸状菌細胞のその得られる集団から、第４の段階（ｃ
）に従っての注目の所望するポリペプチドの選択。注目の所望するポリペプチドは、所望する技術的な特徴、例えば改良された安
定性；所望する比活性；所望のpH最適性；洗剤における改良された洗浄性能；等
を含んで成るいずれかのポリペプチドであり得る。注目のこの所望するポリペプチドを選択するための特定の方法は、当業者に知
られている多くの選択方法のいずれか、例えばプレートスクリーニングアッセイ
、マイクロタイタープレートに基づくアッセイ、等であり得る。

【００５６】本発明の態様は、次の段階：（ｄ）特にさらなる特定の必要性に従って、注目の所望の選択されたポリペプ
チドのアミノ酸配列を任意に修飾し；（ｅ）注目のポリペプチドの大規模生成のために適切である糸状菌細胞中に、
第４の観点の段階（ｃ）の注目のポリペプチドをコードするDNA配列、又は前記
段階（ｄ）の修飾されたポリペプチドを配置し；（ｆ）少なくとも1000m³の発酵器において、前記段階（ｅ）の糸状菌細胞を、
前記注目のポリペプチドの発現を可能にする条件下で培養し；そして（ｇ）前記注目のポリペプチドを単離することをさらに含んで成る、本発明の第４の観点の方法に関する。

【００５７】この態様は、選択された注目のポリペプチドが大規模に生成される、産業的に
非常に適切な方法に関する。前記任意の段階（ｄ）は、例えば注目の所望のポリペプチドが、本発明の第３
の観点の段階（ｃ）の洗剤における改良された洗浄性能を有するポリペプチドを
同定するために選択される情況に関する。このポリペプチドは、洗剤における改
良された洗浄性能を有するが、市販の製品のためには十分には安定性ではない。
従って、この選択されたポリペプチドにおけるいくつかの追加のアミノ酸置換、
例えばこのポリペプチドを商品化するための十分な安定性を得るために、適切な
プロリン置換を行うことが必要とされる。

【００５８】さらなる態様は、前記態様の段階（ｅ）の注目のポリペプチドの大規模生成の
ために適切である糸状菌細胞が、本発明の第３の段階（ａ）の糸状菌細胞に比較
して、もう１つの糸状菌細胞である、上記態様の方法に関する。この態様は、注目のポリペプチドを選択するために使用される糸状菌細胞が大
規模生成のために使用される細胞とは異なる状況に関する。さらなる態様は、注目のポリペプチドが糸状菌細胞に由来するポリペプチドで
ある、本明細書に記載されるような方法に関する。糸状菌細胞に由来する用語は、注目のポリペプチドのアミノ酸配列における情
報が糸状菌細胞から得られるポリペプチドに由来する意味で理解されるべきであ
る。

【００５９】結果的に、それは、野生型糸状菌ポリペプチドの変異体であり得、そして/又
は複数の異なった糸状菌ポリペプチドの組換え/混合の結果であるポリペプチド
であり得る。さらなる態様においては、本発明は、注目のポリペプチドが酵素、例えばアミ
ラーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、リパーゼ、キシラナーゼ、ホスホリパーゼ
である、本発明細胞に記載されるような方法に関する。

【００６０】実施例材料：緩衝液及び基質として使用される化学物質は、少なくとも試薬品種の市販の製
品であった。例１：本明細書に記載されるような糸状菌細胞がミスマッチ修復系において不活性化されるかどうかを決定するために適切なゲルシフトアッセイ：このゲルシフトアッセイにおける原理は、細胞抽出物が、（ａ）ミスマッチ修
復系に包含される、本明細書に記載されるような遺伝子が不活性化される糸状菌
細胞；及び（ｂ）前記遺伝子が不活性化されていないその対応する糸状菌細胞の
両者から調製されることである。次に、それらの抽出物は、塩基対ミスマッチさ
れたG：T；G：A；G：G；A：C及びヘリックス外TGジヌクレオチドを含むオリゴヌ
クレオチドに結合され/混合され、そして非変性ゲル上で追跡される。

【００６１】ゲルシフトアッセイが、遺伝子が不活性化されていない対照糸状菌細胞が上記
オリゴヌクレオチドのいずれかに結合するいずれかのタンパク質を含んで成り、
そしてそれらの結合タンパク質が、ミスマッチ修復系に包含される、本明細書に
記載されるような遺伝子が不活性化されている糸状菌細胞に見られないことを示
す場合、後者のミスマッチ修復系は不活性化されていることが確認される。

【００６２】実験方法：細胞抽出物の調製を、Nagataなど. Mol. Gen. Genet (1993) 237: 251-160 (
材料及び方法を参照のこと)に記載のようにして行う。オリゴヌクレオチドのアニーリング、ミスマッチを含む重複オリゴヌクレオチ
ドへの細胞抽出物の結合、及び非変性ポリヌクレオチドゲル電気泳動を、Stephe
nson and Karran, Selective binding to DNA base pair mismatches by protei
ns from human cell, J. Biol. Chem. 264: 2177-21182 (1989) に記載のように
して実質的に行った。

【００６３】しかしながら、ゲル電気泳動は、TEE緩衝液においてよりむしろTAE緩衝液にお
いて行われる。重複オリゴヌクレオチドを得るために、オリゴヌクレオチドUを
、放射性ラベルし、そしてラベルをされていないオリゴヌクレオチドL-G.T, L-G
.A, L-G.G, L-A.C, L-T.G又はL-HOMのいずれかによりアニーリングする。オリゴ
ヌクレオチド配列は、Aquilina など., Proc. Natl. Acad. Sci. USA91: 8905-8
909 (1994)から誘導される。

【００６４】 U：5’-GGGAAGCTGCCAGGCCCCAGTGTCAGCCTCCTATGCTC-3’ (配列番号３)； L-G.T:5’-GAGCATAGGAGGCTGACATTGGGGCCTGGCAGCTTCCC-3’ (配列番号４)（G.T
ミスマッチをもたらす）； L-G.A:5’-GAGCATAGGAGGCTGACAATGGGGCCTGGCAGCTTCCC-3’ (配列番号５)（G.A
ミスマッチをもたらす）； L-G.G:5’-GAGCATAGGAGGCTGACAGTGGGGCCTGGCAGCTTCCC-3’ (配列番号６)（G.G
ミスマッチをもたらす）； L-A.C:5’-GAGCATAGGAGGCTGACACCGGGGCCTGGCAGCTTCCC-3’ (配列番号７)（A.C
ミスマッチをもたらす）； L-TG:5’-GAGCATAGGAGGCTGACACTGTGGGGCCTGGCAGCTTCCC-3’ (配列番号８)（ヘ
リックスTGジヌクレオチドをもたらす）； L-HOM:5’-GAGCATAGGAGCCTGACACCGGGGCCTGGCAGCTTCCC-3’ (配列番号９)（ホ
モ重複体をもたらす）。すべてのアッセイにおいて、２倍過剰のラベルされていないホモ重複体競争体
オリゴヌクレオチドが包含される。

【００６５】例２：アスペルギラス・オリザエ細胞のミスマッチ修復系包含される遺伝子のクローニング：この例に記載のようにしてクローニング化された遺伝子は、配列番号１（DNA
配列）及び配列番号２（翻訳されたアミノ酸配列）で示される。種々の生物からのミスマッチ修復タンパク質のいくつかの配列は知られており
、それらのうちわずか３種が次において利用された：S.セレビシアエ（M84170）
、H.サピエンス（L47580）及びマウス（U21011）。示される番号は、公的に入手できるGenBankデータベースからの参照番号であ
る。

【００６６】既知のミスマッチ修復タンパク質間のC−末端相同性に基づいて、アスペルギ
ラス・オリザエ相同体の部分配列の増幅を目的とする１組の変性プライマーを企
画した： Pr117858（配列番号10）： P-GGCNCARATHGGNTGYTTYGTNCC； Pr117859 (配列番号11) : P-GCCCANGCNARNCCRAANCC。鋳型としてのA. オリザエ株JaL142（WO96/29391号）からの染色体DNA、及び上
記プライマーを用いて、次の50μlのPWOポリメラーゼに基づくPCR反応を、８種
のMgSO₄濃度（製造業者により推薦されるような0.5mM〜4.0mM；Boehringer M）
で行った。1mMのMgSO₄が、最適であることが見出され、そしてイントロンが配列
において具体化されない場合に予測されるように、約230bpの別々のバンドを付
与した。

【００６７】 PCR−サイクルプロフィール：［96℃；2分−（94℃；15秒−50℃；15秒−72℃
；30秒）の30サイクル−72℃、７分−4℃；維持］ 230bpのPCRフラグメントを、pUC19のフィルインされたBamHI部位中にフラグメ
ント末端連結した。pUC19を、ウシ腸アルカリホスファターゼの存在下でBamHI分
離し、続いて、クレノウポリメラーゼ及びdNTPにより付着端をフィルインした。
挿入体を有する３種の個々のプラスミドを、上記連結のE.コリ×L1形質転換体か
ら単離し、そして配列決定した。クローン化されたPCRフラグメントの翻訳によ
り誘導されたポリペプチドの一列整列は、既知のミスマッチの修復タンパク質配
列に対して強い相同性を示した（図２を参照のこと）。

【００６８】図２の下線の配列は、上記コンセンサスPCRプライマーに有来する配列である
。図２の３種のアスペルギラス配列は、位置683−758からの配列番号２に示され
る配列に等しく、但し最終のクローン化された配列において、上記に示されるよ
うにIle（I）の代わりにThr（T）である位置685を除く。これは、上記コンセン
サスプライマーにおける配列のためである。図２に示される一列整列は、クローン化されたフラグメントがミスマッチ修復
タンパク質のA. オリザエ相同体に起因することを明確に示す。

【００６９】全遺伝子をクローン化するために、クローン化されたフラグメントの放射性ラ
ベルされたプローブを、Taqポリメラーゼ、30pモルのpUC前方向及び逆方向プラ
イマー、及び0.2mMのdG-, dC-, dTTP及び0.2mMのdATP＋³²P−dATPを含む反応体1
00mlにおいて、鋳型として0.5mgのpUC19’msh2’−13（上記参照のこと）を用い
て、PCRにより生成した。生成された、放射性ラベルされたプローブを、EcoRI−
Hind3消化によりpUC19配列から生成し、続いて、その得られる293bpのフラグメ
ントをゲル精製した。プローブを、A.オリザエ株A1560（JaL142）（WO92/29391号）からのゲノムDNA
の膜グリッドされたコスミドライブラリーにハイブリダイズした。陽性クローン
を、ホスホイメージャーにおいて分析される場合、フィルター上に同定し、そし
てクローンをλ31A2として同定した。

【００７０】 λ31A2コスミドDNAを増殖し、そして上記と同じ放射性ラベルされたプライマ
ーを用いて、サザンブロット分析のために使用した。BstX（クローン化されたPC
Rフラグメントにおいて前で見出されている）により5.8及び3.2kbのフラグメン
ト（両者ともプローブにより明白にされる）に分割される約９kbのPstフラグメ
ントを同定し、そしてPstにより切断されたpUC19中にクローン化し、pU19msh2P
と命名されたプラスミドを得た。前に決定された配列を示すプライマーから出発
して、続いて最後の試験において決定された配列に基づいてのプライマーにより
、前記挿入体を連続的に配列決定した：

【００７１】 130740 (配列番号12)： GCTCGAAACATCCAACATCC 130741 (配列番号13)： GCTGTGAATCACTTGCACC 131928 (配列番号14)： CTTCATAAACTGCGACAAATCATGC 131929 (配列番号15)： GGAGGAGCATCTTCGC 131930 (配列番号16)： GGAACTTGAAGACTTTACTTCATCC 134608 (配列番号17)： CCAGAAACTCGCTAACACC 134609 (配列番号18)： GTGCTTTGCGGACGC 134610 (配列番号19)： CAGGACAGTAGGACGC 135320 (配列番号20)： CGAGCGATGAACTCTGC 135321 (配列番号21)： GCGTTGGTGGATTATCC 136105 (配列番号22)： CGTTGCATCTATCATATACC 136106 (配列番号23)： GGTATATGATAGATGCAACGC

【００７２】それにより決定された3825bpの配列（配列番号１）を、PCRフラグメントにお
いて前もって決定された読み取り枠に整合して翻訳した。Ao. MSH2と呼ばれる、
その得られるタンパク質（配列番号２）を、図３における既知のミスマッチ修復
タンパク質のタンパク質配列に整列した。図３に示される一列整列から、クロー
ン化され、そして配列決定されたDNAは明らかに、N−末端部分における１つのイ
ントロンと共に、酵母、ヒト及びマウスミスマッチ修復タンパク質の相同体のた
めのコード配列を包含する。イントロンの位置を、標準のスプライス規則により
推定し、そして唯一の可能性を設定する。

【００７３】例３：アスペルギラス・オリザエ細胞の染色体上での例１においてクローン化された遺伝子の分布：分布実験のために、msh2 CDSを、PCRによりpUCによりpUC19msh2P (例２を参照
のこと) から欠失し、代わりにNot１部位を導入した。これは、下記プライマー
により行われた： 137208（配列番号24）：5’ P-CCGCGTCTCCAACAAGATGAATGG 137207 (配列番号25)：5’ P-CCGCTTTCTCGGGGTCATAGC

【００７４】 2.5mMのMgSO₄及び50pgのpUC19msh2Pとの、Pwoポリメラーゼに基づくPCR反応（
製造業者に従っての条件）において： PCR−サイクルプロフィール：［96℃；２分−（94℃；30秒−52℃；30秒−72
℃；３分）の４サイクル−（94℃；30秒−59℃；30秒−72℃；３分）の25サイク
ル−72℃；10分］。約8.9kbのその得られるPCR生成物を単離し、pUC19中に連結し、そしてE. コリ
XL1を形質転換した。得られる形質転換からpMsh2Δを単離し、そしてその新規連
結部分及びその周囲部分の正確性を、［プライマー138149（配列番号26）：CCTT
TCCACTTTAATCCTAAGC］（Xl１/pMsh2Δ：Lac3073）を配列決定することによって
確かめた。

【００７５】この構造体においては、A.オリザエpyrG (WO96/29391号) が、NotI部位中に挿
入されている。この構造体を用いることによって、アスペルギラス・オリザエ細胞における染
色体遺伝子を、相同組換えにより染色体上の欠失された遺伝子における交差のた
めに、当業界において知られている標準技法に従って欠失する（Miller, B.L.,
など., 1985 Mol. And Cell. Biol. 5: 1714-1721）。

【００７６】例４：配列番号１に示されるミスマッチ修復遺伝子、AMA１複製開始配列及びAmdS選択
マーカーを含んで成るプラスミドの構成：下記のようにして構成されたプラスミドは、ミスマッチ修復系が一時的に不活
性化され得る糸状菌細胞を製造するために非常に適切であり、ここでこのプラス
ミドは、ミスマッチ修復系が活性化される場合、例３のミスマッチ破壊された株
中に挿入され得、そしてミスマッチ修復系が不活性化される場合、株から欠失さ
れ得る。

【００７７】ミスマッチ修復遺伝子の破壊は、新規染色体突然変異の蓄積を引き起こし、従
ってそのような株は遺伝的不安定である。従って、株における染色体破壊を行う
ことが決定され、ここでミスマッチ修復遺伝子が、ミスマッチ修復表現型が所望
される場合、容易に失われる染色体外要素から発現された。前記染色体外要素は、本明細書においては、複製開始配列としてAMA1、及び選
択マーカーとしてAmdSを含んで成るプラスミドであった。この目的のために、ミスマッチ修復遺伝子（配列番号１）を、１つのAMA１反
復体を有する自律的に複製する構成体中にクローン化した。

【００７８】 pMT1505 (pMT1505の記載に関しては下記例５を参照のこと) から、次のフラグ
メントを単離し、そして一緒に連結した： 5.16kbのNotI−[Hind3]^★＋3.515kbの [Sal]^★−BamHI＋757bpのBamHI−NotI
；ここで [ ]^★ は、部位がクレノウ−ポリメラーゼ及びdNTPによりフィルイン
されたことを示す。

【００７９】この連結反応から、pMT1505DHSを単離し（LaC3212）、そしてミスマッチ修復
発現カセットを、BamHI−MunIフラグメントとして、pMT1505DHSにおけるその対
応する部位に導入し、プラスミドpAma-msh2 (LaC3216) をもたらした。アスペルギラス・オリザエJaL250（例５を参照のこと）を、pAma-msh2を有す
るAmdS⁺により形質転換し、そして形質転換体を、選択されない場合（形質転換
体の50％）、amdS特徴を失う能力について調べ、染色体外としてこのプラスミド
の維持を示した。（LaC3244は、アセトアミド＋ウリジン上で維持する）。

【００８０】例５：例４において使用されたプラスミドpMT1505の構成：プラスミド： pMY1505：例５において下記のようにして構成された。 pHelp１：Gems, D., など. 1991, Gene 98: 61-67により記載のようにして、
選択マーカーとしてA. オリザエからのpyrG遺伝子、及びA. ニジュランスにおけ
る自律的な複製を可能にするAMA１配列を含む。

【００８１】 pToC68：ヨーロッパ特許第0531372号（Novo Nordisk A/S）に記載のような。
株： JaL250：pyrG遺伝子が不活性化されている、WO98/01470号に記載されるような
、アスペルギラス・オリザエA1560の誘導体。 DH5a：GIBCO BRL (Life Technologies, Inc., Rockville MD) から購入された
E. コリ宿主細胞。

【００８２】 pMT1466を、pHelp１からのSphI/NarIフラグメントを、pToC68中に挿入するこ
とによって構成した。pMT1489を、pMT1466をSphI及びStuIにより消化し、そして
再連結することによって構成した。pMT1500を、pMT1489をAatII及びNarIにより
消化し、そしてリンカーを連結することによって構成した。pMT1504を、pMT1500
をNheIにより消化し、そして再連結することによって構成した。 pMT1505を、A. ニジュランスゲノムDNAからの遺伝子をコードするandS (Corri
ck, c. M., など. 1987, Gene 53: 63-71) を含む、2.7kbのXbaIフラグメントを
、NheIにより切断されたpMT1504中に挿入することによって構成した。

【００８３】例６：染色体上のmshII遺伝子の一部の欠失：プラスミドp418MsHII (lac3159からの) を、SalI及びXhoIにより切断し、そし
てウシ腸ホスファターゼにより処理する。この態様において、msHII遺伝子の一
部を切断する。ベクター及びmsHII遺伝子のほとんどを含む大きなバンド（6400b
p）を、１％アガロースゲルから単離する。

【００８４】プラスミドpJa1554を、pSO2からのSpeI/SspBIにより切断されたフラグメント
（5330bp）を、pSO2からのAsp718/NheIにより切断されたフラグメント（316bp）
に連結することによって構成した。プラスミドpJa1554を、SalIにより切断し、
そしてpyrG遺伝子を含む2350bpのバンドを、1％アガロースゲル上で単離する。p
yrGを有する2350bpのバンドを、前記切断されたp418MsHIIに連結し、そしてE.コ
リを形質転換する。正しいE.コリ形質転換体を制限分析により同定し、そしてプ
ラスミド調製物をこの形質転換体から製造する。

【００８５】このようにして調製されたプラスミドを、EcoRIにより切断し、プラスミドを
線状化し、その後、それを用いて、例えばアスペルギラス・オリザエJa1250を形
質転換する。形質転換体を、最少プレート上で選択する。二重交差現象が生じた形質転換体を、アスペルギラス染色体DNA調製物を製造
し、続いて、適切なプライマーを用いて、十分な長さのmshII遺伝子についてPCR
スクリーンすることにより同定する。サザンブロットを、適切な酵素によりラン
ダムに断片化された染色体DNA、及び欠失されたmsHIIフラグメント（いずれの長
いフラグメントも存在しない）のための適切なプローブ、並びに正の対照プロー
ブを用いて製造する。

【００８６】不活性化されたmsHII遺伝子を有する株における高められた突然変異頻度を決
定するために、niaD遺伝子における突然変異についてのスクリーンを行う。これ
は、親株アスペルギラスJa1250及びmsHII不活性化された株をプレート上で増殖
することによって行われる。

【００８７】胞子−懸濁液を製造し、そして胞子のアリコートを、Unkleeなど（S. E. Unkl
es, E.C. Campbell. Y.M.J.T. de Ruite Jacobs, M. Broekhuisen, J.A. Macro,
D. Carrez, R. Contreras, C.A.M.J.J. van den Hondel J.R. Kinghorn. The d
evelopment of a homologous transformation system for Aspergillus oryzae
based on nitrate assimilation pathway: A convenient and general selectio
n system for filamentous fungal transformation. Molecular and general ge
netics V: 218, p99-104 (1989)）により記載のようにして、塩素酸塩含有プレ
ート上にプレートする。 MsHIIタンパク質の発現を有さない株は、対照株よりも、niaD突然変異（より
塩素酸塩耐性のクローン）の高い割合を有するであろう。

【００８８】例７：アンチセンスmRNAの転写を駆動するTAKAプロモーターを用いての、msHII mRNAの翻訳を阻害するインビボアンチセンスmsHII RNAの製造：アンチセンスRNA発現は、インビボでいずれかの遺伝子の発現をダウンレギュ
レーションするために良く知られた手段である（The design of Antisense RNA,
Georg Cczakiel, Antisense and Nucleic acid drug development V. 7, p.439
-444 (1997)）。

【００８９】 PCRフラグメントを、下記オリゴマー： 000120j2 (配列番号27)：TCTGCGAATCGCTTGGATCCCGAACGCGACAACAC； 000120j4 (配列番号28)：GAGCTCAGATCTCTTAGGTTCTGGACGAGAAGA, 及び鋳型としてpUC19msh2Pを用いて製造した。このPCRフラグメントは、5’側ms
HII mRNAの予測される部分を包含する、msHII遺伝子5’末端を含む。もう１つの
PCRフラグメントを、下記オリゴマー： 000120j3 (配列番号29)：GTTGTCGCGTTCGGGATCCAAGCGATTCGCAGAAG； 1298-TAKA (配列番号30)：GCAAGCGCGCGCAATACATGGTGTTTTGATCAT, 及び鋳型としてpENI1298 (PCT DK99/00552号)を用いて製造した。両PCT反応を、
製造当業者のマニュアル（Hoehringer−Mannheim）に従ってPWOポリメラーゼを
用いて行う。

【００９０】 PCRフラグメントを、Qiagen PCR精製キット（Qiagen）を用いて精製する。２
つのPCRフラグメントを混合し、そして第３のPCR反応を、プライマー1298−TAKA
及び000120j4により行う。この態様においては、２種のPCRフラグメントがアセ
ンブリーされる。アセンブリーされたPCRフラグメントを、BssHII及びBglIIにより切断し、そし
て1.5％アガロースゲルから精製し、そしてBssHII及びBglIIにより切断されたpE
NI1298（１％アガロースゲルから精製された）により連結した。その連結混合物
を用いて、E.コリを形質転換する。DNA−調製物を、前記得られたE.コリ形質転
換体の個々から製造する。アセンブリーされたPCRフラグメントを配列決定し、
所望しない突然変異が前記工程の間に導入されないことを確かめる。正しい構造
体は、msHIIアンチセンスmRNAの転写を駆動するTAKAプロモーターを含む。

【００９１】得られるプラスミド、及び対照としてのpENI1298を用いて、例えばアスペルギ
ラス・オリザエJa1250を形質転換し、そして形質転換体を、最小プレート上で選
択する。得られる形質転換体を最少プレート上で単離し、そしてそれらが胞子形
成するまで、37℃でインキュベートする。

【００９２】 msHII mRNAの翻訳が、msHIIアンチセンスRNA発現により妨げられている、株に
おける高められた突然変異頻度を決定するために、niaD遺伝子における突然変異
についてスクリーンを行う。胞子−懸濁液を、対照の形質転換体（pENi1298）か
ら、及びmsHIIアンチセンスRNA形質転換体から調製し、そして等量の胞子を、Un
kles など.（S. E. Unkles, E.C. Campbell. Y.M.J.T. de Ruite Jacobs, M. Br
oekhuisen, J.A. Macro, D. Carrez, R. Contreras, C.A.M.J.J. van den Honde
l J.R. Kinghorn. The development of a homologous transformation system f
or Aspergillus oryzae based on nitrate assimilation pathway: A convenien
t and general selection system for filamentous fungal transformation. Mo
lecular and general genetics V: 218, p99-104 (1989)）により記載のように
して、塩素酸塩含有プレート上にプレートする。 msHIIタンパク質の低い発現を有するか、又はまったく有さない株は、対照株よ
りもniaD突然変異（より塩素酸塩耐性のクローン）の高い割合を有するであろう
。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】図１：この図は、単一のミスマッチを含んで成る二重鎖DNA配列が糸状菌に配
置される例を例示する。細胞が、ミスマッチ修復系遺伝子が不活性化されている
条件下で１度、重複された後、二重鎖DNA内の２つの個々の異なった1本鎖DNA配
列が個々に重複され、２つの異なった重複配列が提供され、ここで個々の重複さ
れた細胞における１つの配列はいずれのミスマッチも有さない。対照的に、ミス
マッチ修復系が活性的である細胞においては、重複体内のミスマッチが訂正され
る。

【図２】図２：この図は、３種の部分アスペルギラス・オリザエポリペプチド配列を示
す：クローン化されたPCRフラグメントに由来する“msh2’Ao-co110/13/15。そ
れらの３種の部分ポリペプチド配列を、次のミスマッチ修復タンパク質の２つの
他の部分ポリペプチド配列と共に一列整列する：ヒトミスマッチ修復タンパク質
、すなわちmsh2-ヒト.p; 及び菌類サッカロミセス・セレビシアエミスマッチ修
復タンパク質、すなわちS.C.msh2。図中の下線の配列は、PCRフラグメントの構
成に起因する。

【図３】図３：この図は、ヒト（msh2−ヒト.p）、マウス（msh2−mus.p）及び酵母（S
.c. msh2）からの３種の既知ミスマッチ修復タンパク質のポリペプチド配列と共
に、推定上のアスペルギラス・オリザエミスマッチ修復タンパク質（Ao. MSH2）
の提案されたポリペプチド配列の一列整列を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考） (Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｒ 1:77） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者ビン，イェスペルデンマーク国，デーコー−2800 リンビー，バグスバエルトバイ 115 Ｆターム(参考） 4B024 AA20 BA11 BA13 BA14 CA05 DA11 HA03 4B050 CC03 DD03 EE10 4B065 AA60 AA65 AB01 AC14 BA01 CA31 CA32 CA33

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】糸状菌細胞であって、ミスマッチ修復系に含まれる遺伝子が
不活性化されており、そして前記ミスマッチ修復系に含まれる遺伝子が、（ａ）配列番号２の位置683−758に示されるポリペプチド配列をコードするDN
A配列；又は（ｂ）配列番号２の位置683−758に示されるポリペプチド配列に対して少なく
とも70％同一であるポリペプチド配列をコードするDNA配列；を含んで成る、ことを特徴とする糸状菌細胞。
【請求項２】糸状菌細胞であって、ミスマッチ修復系に含まれる遺伝子が
不活性化されており、そして前記ミスマッチ修復系に含まれる遺伝子が、（ａ）配列番号２の位置1−940に示されるポリペプチド配列をコードするDNA
配列；又は（ｂ）配列番号２の位置1−940に示されるポリペプチド配列に対して少なくと
も70％同一であるポリペプチド配列をコードするDNA配列；を含んで成る、ことを特徴とする糸状菌細胞。
【請求項３】前記ミスマッチ修復に含まれる遺伝子が欠陥を有する請求項
１又は２記載の糸状菌細胞。
【請求項４】前記ミスマッチ修復に含まれる遺伝子が一時的に不活性化さ
れている請求項１又は２記載の糸状菌細胞。
【請求項５】前記糸状菌細胞がフサリウム（Fusarium）、又はより好まし
くはアスペルギラス（Aspergillus）の株である請求項１〜４のいずれか１項記
載の糸状菌細胞。
【請求項６】糸状菌細胞集団の調製方法であって、ここで前記集団におけ
る個々の細胞は注目のDNAライブラリーを表す注目のそれぞれ異なったDNA配列を
含んでなり；次の段階、（ａ）請求項１又は２の糸状菌細胞を含んで成る糸状菌細胞集団に、注目の個
々の異なったDNA配列を配置し；そして（ｂ）請求項１又は２記載のミスマッチ修復系遺伝子が不活性化されている条
件下で前記集団における注目の個々のDNA配列の少なくとも１度の倍化を可能に
する時間、前記（ａ）の集団を増殖せしめる；ことを含んで成る方法。
【請求項７】前記段階（ｂ）下でのミスマッチ修復系が欠陥性である請求
項６記載の方法。
【請求項８】前記段階（ｂ）下でのミスマッチ修復系が一時的に不活性化
されている請求項６記載の方法。
【請求項９】前記糸状菌細胞がフサリウム、又はより好ましくはアスペル
ギラスの株である請求項６〜８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】請求項６記載の段階（ｂ）下で、注目の部分的に相同のDN
A配列のインビボ遺伝子間組換えが存在する請求項６〜９のいずれか１項記載の
方法。
【請求項１１】請求項６記載の段階を含んで成る注目のポリペプチドの生
成方法であって、前記注目のDNA配列が注目のポリペプチドをコードし、そして
次の段階：（ｃ）請求項６記載の段階（ｂ）の糸状菌細胞のその得られる集団から、注目
の所望のポリペプチドを選択することをさらに含んで成る方法。
【請求項１２】次の段階：（ｄ）特にさらなる特定の必要性に従って、注目の所望の選択されたポリペプ
チドのアミノ酸配列を任意に修飾し；（ｅ）注目のポリペプチドの大規模生成のために適切である糸状菌細胞中に、
請求項11記載の段階（ｃ）の注目のポリペプチドをコードするDNA配列、又は前
記段階（ｄ）の修飾されたポリペプチドを配置し；（ｆ）少なくとも1000m³の発酵器において、前記段階（ｅ）の糸状菌細胞を、
前記注目のポリペプチドの発現を可能にする条件下で培養し；そして（ｇ）前記注目のポリペプチドを単離する；ことをさらに含んで成る請求項11記載の方法。
【請求項１３】請求項12記載の段階（ｅ）の注目のポリペプチドの大規模
生成のために適切である糸状菌細胞が、請求項６記載の段階（ａ）の糸状菌細胞
に比較して、もう１つの糸状菌細胞である請求項12記載の方法。
【請求項１４】前記注目のポリペプチドが、糸状菌細胞に由来するポリペ
プチドである請求項11〜13のいずれか１項記載の方法。
【請求項１５】前記注目のポリペプチドが、酸素、例えばアミラーゼ、プ
ロテアーゼ、セルラーゼ、リパーゼ、キシラナーゼ，ホスホリパーゼである請求
項11〜14のいずれか１項記載の方法。