JP2002528076A - 糸状面細胞内の問題のdnaライブラリーの作製及びスクリーニング - Google Patents
糸状面細胞内の問題のdnaライブラリーの作製及びスクリーニングInfo
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Abstract
Description
作製及びスクリーニングする方法に関する。
れている。しかしながら、特定の変化した特徴、例えば熱安定性、pH活性プロフ
ィール、比活性、基質特異性、Km,Vmax等のポリペプチドの変異体を生産
することが要求される場合、変異体コーディング配列のライブラリーの作製及び
スクリーニングは、一般に、中間体宿主、例えば細菌細胞又はイーストの使用を
要求する。これは、独立して形質転換された糸状菌細胞の中での低い形質転換の
頻度及びコピー数のバリエーションによる。
いくつかの方法があり、ここでは、イーストにおいてライブラリーをスクリーニ
ングした後に、生産関連宿主、例えば糸状菌が、問題の潜在的な変異体ポリヌク
レオチド配列で形質転換される。 しかしながら、しばしば、イースト又は細菌においてスクリーニングにより同
定されるポリヌクレオチド配列は、生産関連糸状菌細胞に形質転換した時に発現
されないか、又は低レベルでしか発現されない。これは、コドン用法、mRNA
レベルのレギュレーション、転移機構、翻訳後修飾機構(例えばシステイン架橋
、グリコシル化及びアシル化パターン)等の差を含むいくつかの理由による。
発現されるであろうか否かは必ずしも予測できない。例えば、ライブラリーをス
クリーニングするのに用いる生物が例えば細菌又はイースト細胞であり、生産関
連宿主細胞が糸状菌細胞であるなら、プロテアーゼプロフィールは異なる。これ
により、イーストにおいて同定されている問題の1又は複数の特徴をコードする
配列は、産物関連糸状菌宿主細胞において発現されたプロテアーゼにより分解さ
れ得る。更に、調節タンパク質又は調節配列の機能を変化させることにより発現
される産物の最適な収率を得ることは、生産宿主の直接の操作を要求する。
373〜387 )は、遺伝子クローニング及び発現研究のための、自己複製ベクター
又は自己複製配列(ARS)の使用を開示する。AMA1(アスペルギルスにお
ける自己メンテナンス)は、議論されるプラスミドレプリケーター因子の1つで
ある。それは、0.3kb中心スペーサーにより分離されたMATE1(移動性ア
スペルギルス形質転換エンハンサー)で示すゲノム反復の2つの逆方向コピーか
らなる。AMA1は、再配置多重重合化又は染色体組込みなしにプラスミド複製
を促進する。
て2つの利点を供することが見い出された。第1は、受容体アスペルギルス(A spergillus )株を、連結混合物で直接、形質転換することができるよ
うに、潜在的なライブラリーサイズを増加させ、かつ中間体宿主、例えば大腸菌
でのライブラリー増幅の必要性を排除し得る形質転換の高い頻度である。第2は
、遺伝子発現のために安定で標準的な環境を供することにより、その形質転換体
の特性が均一になるであろうことである。
び均一な高レベルの遺伝子発現を供するためのエピソーム複製DNAベクターの
使用により、糸状菌細胞において問題のポリヌクレオチド配列のライブラリーを
作製及びスクリーニングするための改良された方法を供することである。独立し
て形質転換された細胞の中でのコピー数のバリエーションを最小にすることによ
り、問題の変異体ポリペプチドは、問題の特徴の発現に基づいて直接、同定する
ことができる。
チド配列のライブラリーを作製し及び選択又はスクリーニングする方法であって
、 (a)前記糸状菌細胞をDNAベクターの集団で形質転換し、ここで各々のベ
クターは、 (i)真菌選択マーカー及び真菌複製開始配列をコードするポリヌクレオチド
配列であって、該マーカー及び複製開始配列が前記集団内で変化しないポリヌク
レオチド;並びに (ii)問題のポリヌクレオチド配列であって、DNAベクターの集団が該ポリ
ヌクレオチド配列の1超の変異体を含むポリヌクレオチド配列 を含み; (b)前記細胞を選択圧下で培養し; (c)要求される特徴を発現する1又は複数の形質転換体について選択又はス
クリーニングし; (d)問題の形質転換体を単離すること を含む方法に関する。
作製するため及びこのようなポリヌクレオチド配列のライブラリーをスクリーニ
ング又は選択するための真菌複製開始配列の使用に関する。 発明の詳細な記載 第1の実施形態において、本発明は、糸状菌細胞内の問題のポリヌクレオチド
配列のライブラリーを作製し及び選択又はスクリーニングする方法であって、 (a)前記糸状菌細胞をDNAベクターの集団で形質転換し、ここで各々のベ
クターは、(i)真菌選択マーカー及び真菌複製開始配列をコードするポリヌク
レオチド配列であって、該マーカー及び複製開始配列が前記集団内で変化しない
ポリヌクレオチド配列;並びに(ii)問題のポリヌクレオチド配列であって、D
NAベクターの集団が該ポリヌクレオチド配列の1超の変異体を含むポリヌクレ
オチド配列を含み; (b)前記細胞を選択圧下で培養し; (c)要求される特徴を発現する1又は複数の形質転換体について選択又はス
クリーニングし、 (d)問題の形質転換体を単離すること を含む方法に関する。
は活性をコードし又はそれを有するポリヌクレオチド配列のコレクションをいう
。ライブラリーは、変異体のコレクションとして本明細書で定義される“問題の
ポリヌクレオチド配列の変異体のライブラリー”であり得る。ここでその変異体
は、前記親ポリヌクレオチド配列の1又は複数の改変を含むことにより親ポリヌ
クレオチド配列と異なる。便利には、ポリヌクレオチド配列又は変異体は、突然
変異誘発、好ましくはランダム変異誘発により問題の少くとも1の親ポリヌクレ
オチド配列から生成され、最小数で4、好ましくは最小で25の異なるポリヌク
レオチド配列をそのコレクション内に生ずる。親ポリヌクレオチド配列を変異誘
発するために役立つ種々の方法が“ランダム変異誘発”及び“局所的ランダム変
異誘発”との標題の下のセクションに記載される。用語“改変”は、その変異体
のものと比べて、配列中の1又は複数のヌクレオチドの置換、挿入及び/又は削
除を示すことを意図し、2又はそれ超の異なる親ポリヌクレオチドのハイブリッ
ドを含み得る。
伝子バリエーションからも生じ得る。対立遺伝子変異体は、同じ染色体座を占有
する遺伝子の2又はそれ超の別の型のいずれかをいう。対立遺伝子変異は、突然
変異を介して生じ、集団内で表現型多型性を引きおこし得る。遺伝子変異は、サ
イレント(即ちコードされるポリペプチドに変化なし)であっても、変化したア
ミノ酸配列を有するポリペプチドをコードしてもよい。更に、1又は複数の親ヌ
クレオチド配列から生成されるよりむしろ、ライブラリーのポリヌクレオチド配
列は異なるソースから得ることができ、異なるが同じ活性又は機能を有する高度
に関連したポリペプチドをコードし得る。本文脈において、“高度に関連”は、
ポリペプチドが同じ活性又は機能を有し、そして更に、“DNAシャッフリング
”の標題の更に下のセクションに記載されるような共有する保存された領域を有
するポリヌクレオチド配列によりコードされることを示すことを意図する。
例えば微生物から単離されることを示すことを意図する。ポリヌクレオチド配列
は、非培養性生物から作られたものであってよい。ポリヌクレオチド配列は、問
題の生物活性又は機能を有し又はそれをコードし、変異体ヌクレオチド配列の生
産を許容するために少くとも6ヌクレオチドのサブ配列を含むいずれのポリヌク
レオチド配列であってもよい。
活性又は機能”は、ポリヌクレオチド配列が(定量的に測定して)同じ又は類似
した生物活性もしくは機能を有するポリペプチドをコードするか、ポリヌクレオ
チド配列自体が同じ(定量的)活性又は機能を有することを示すことを意図する
。例えば、ポリヌクレオチド配列は、プロモーター活性を有し得、即ち転写を促
進することができるか、又は同じ定量的活性もしくは機能、例えば同じ酵素活性
もしくは機能、例えばプロテアーゼ、リパーゼ又はアミラーゼ活性のポリペプチ
ドをコードし得る。
得るポリヌクレオチド配列である。これにより、DNAベクターは、複製開始配
列、例えば起点(例えばColE1起点、F1起点、M13起点、2μ起点(イ
ースト)、oriP(EBウイルス)(pi))を含む。DNAベクターは、例
えばプラスミドであり得る。
とは、DNAベクターの集団が問題の生物機能又は活性をコードし又は有する異
なるポリヌクレオチド配列を含むことを示すことを意図する。 好ましい実施形態において、問題のポリヌクレオチド配列はポリペプチドコー
ディング配列である。用語“ポリペプチド”は、ペプチド、オリゴペプチド、及
びタンパク質を包含し、それゆえ特定の長さのコードされた産物に限られない。
ポリペプチドは宿主細胞に対してネイティブであっても、異種ポリペプチドであ
ってもよい。用語“異種ポリペプチド”は、宿主細胞に対してネイティブでない
ポリペプチドとして定義される。ポリペプチドは、ポリペプチドの生産に関連す
る核酸配列に対して外来性の1又は複数の調節配列を含む核酸配列によりコード
される細胞に対してネイティブであるポリペプチドである組換えポリペプチドで
あってもよい。ポリペプチドをコードする核酸配列は、以下に記載のようにいく
つかの様式で操作され得る。ポリペプチドは、野生型ポリペプチドであってもそ
の変異体であってもよく、本発明の方法にかけることができる。ポリペプチドは
、1又は複数のポリペプチドが細胞に対して異種であり得る少くとも2の異なる
ポリペプチドから得られた部分的又は完全なポリペプチドの組合せを含むハイブ
リッドポリペプチドであってもよい。ポリペプチドは、更に、天然の対立遺伝子
及び上述のポリペプチドの操作された変異体を含む。
ドコーディング配列と通常、関連した調節配列である。調節配列はポリペプチド
をコードする核酸又はポリペプチドの生産に関連する他のものに作用可能に結合
した全ての成分を含む。このような調節配列は、これらに限らないが、本明細書
に記載される。プロモーター、シグナル配列、プロペプチド配列、転写ターミネ
ーター、リーダー、プロモーター認識配列、エンハンサー配列及びポリアデニル
化配列を含む。なお更なる実施形態において問題のポリヌクレオチド配列は、ポ
リペプチドコーディング配列(又はその配列の一部)と、a)調節配列(その調
節配列の一部)又はb)2もしくはそれ超の調節配列(又はその配列の一部)と
の組合せである。調節配列の各々は、コーディング配列に対してネイティブであ
っても外来性であってもよい。
ポリペプチドは、抗体もしくはその部分、抗原、凝固因子、酵素、ホルモンもし
くはホルモン変異体、レセプターもしくはその部分、調節タンパク質、構造タン
パク質、リポーター、又は輸送タンパク質である。 より好ましい実施形態において、酵素は、オキシドレダクターゼ、トランスフ
ェラーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、又はリガーゼである。
ゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キ
チナーゼ、クチナーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、デキストラナーゼ、エステ
ラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、α
−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、ハロペルオキシダーゼ、インベルター
ゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、マンノシダーゼ、ムタナーゼ、オキシダーゼ、ペク
チン分解酵素、ペルオキシダーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、
タンパク質分解酵素、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼ、又はキシラ
ナーゼである。リパーゼの特定の例は、サーモマイセス・ラヌギノサ(Ther momyces lanuginosa )由来のリパーゼ又はそのリパーゼの変
異体、例えば、WO97/04079に開示されるようにN末端伸長部が成熟リ
パーゼ酵素に付加されている変異体である。
、ヒト成長ホルモン、エリトロポイエチン、又はインスリノトロピンである。 更に好ましい実施形態において、調節配列はプロモーター配列、好ましくは真
菌プロモーター、例えばアスペルギルス・オリザエTAKAアミラーゼ、NA2
−tpi(A.ニゲル中性α−アミラーゼ及びA.オリザエトリオースリン酸イ
ソメラーゼをコードする遺伝子からのプロモーターのハイブリッド)及びアスペ
ルギルス・ニゲル又はアスペルギルス・アワモリグルコアミラーゼをコードする
遺伝子から得られるプロモーターである。
yR認識配列(WO98/01470)、creA(WO94/13820)及
びareA(WO95/35385)である。 更なる本発明に関連する問題の調節配列の例は、“DNAベクター及び調節配
列”の標題のセクションに更に下に列記される。
択マーカー遺伝子及び問題のポリヌクレオチド配列を含む、糸状菌細胞を培養す
ることとして本明細書で定義される。選択剤の有効量は、選択マーカーを含まな
い細胞からの選択マーカーを含む細胞の選択を許容するために十分な量として本
明細書で定義される。
毒性に対する耐性、重金属毒性に対する耐性、又は栄養要求体に対する原栄養性
を供することができる産物をコードする遺伝子の群から選択される。 より好ましい実施形態において、原栄養性は、ヌクレオチド合成、コファクタ
ー合成、アミノ酸合成、アセトアミド代謝、プロリン代謝、スルフェート代謝、
及びニトレート代謝からなる代謝経路の群から選択される酵素から得られる。
ニチンカルバモイルトランスフェラーゼ)、amdS(アセトアミダーゼ)、b ar (ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ)、hemA(5−アミ
ノレブリネートシンターゼ)、hemB(ホルホビリノーゲンシンターゼ)、h ygB (ヒグロマイシンホスホトランスフェラーゼ)、niaD(ニトレートレ
ダクターゼ)、prn(プロリンパーミアーゼ)、pyrG(オロチジン−5′
−ホスフェートデカルボキシラーゼ)、pyroA,riboB,sC(スルフ
ェートアデニルトランスフェラーゼ)、及びtrpC(アントラニレートシンタ
ーゼ)から選択される遺伝子である。
クレオチド配列を有する形質転換体についてスクリーニング又は選択するための
好適な培地及び好適な条件下で培養される。培養は、ポリヌクレオチド配列ライ
ブラリーのスクリーニングのための当業界で公知の方法に従って行うことができ
る。
の構造的再配置又は宿主細胞ゲノムへの組込みなしに、真菌細胞内で、絶体外分
子、例えばDNAベクター、例えばプラスミドの自律的複製を支持することがで
きる核酸配列として定義される。複製開始配列は、それが真菌細胞内で複製開始
活性を媒介することができる限り、いずれの起源のものであってもよい。例えば
、複製開始配列はアスペルギルスにおいて複製するプラスミド能力を与えるヒト
起源のテロマーであってよい(Alek Senko and Ivanova, Mo.Gen.Genet. 260 (1
998) 159〜164)。好ましくは、複製開始配列は、糸状菌細胞、より好ましくはア
スペルギルス、フサリウム又はアルテルナリア(Alternaria)の株、
更により好ましくはA.ニジュランス、A.オリザエ、A.ニゲル、F.オキシ
スポルム又はアルテルナリア・アルテナタ(Alternaria alten ara )の株から得られる。
ば、その配列は、問題の生物由来のゲノムフラグメントの中で、糸状菌細胞内で
の自律的複製の能力を示す、イーストにおいて自律的複製を維持することができ
る配列として同定することができる。所定の配列の真菌中の複製開始活性は、真
菌を、考えられるプラスミドレプリケーターで形質転換し、そして後にプラスミ
ド上で見い出される遺伝子について選択する時に選択培地上で増殖の欠如を導く
であろうセクターのプラスミドの喪失を示す、不規則な形態を有するコロニーに
ついて選択することによっても決定することができる(Gemsら、Gene, 98 (1991
) 61〜67)、AMA1は、この方法で単離された、複製開始配列を単離するため
のかわりの方法は、(例えばアルテルナラ・アテルナタ(Alternaria
aternata)についてTsuge ら、Genetics 146 (1997) 111〜120に開示
されるような)天然のプラスミドを単離することである。
eic Acids Res. 15: 9163 〜9175)及びGems, D.ら(1991, Gene 98: 61 〜67)
により各々記載されるような、アスペルギルス・ニジュランスのANS1及びA
MA1がある。 用語“複製開始活性”は、本明細書においてその慣用的な意味で、その配列が
、染色体外分子、例えば真菌細胞におれるプラスミド又はDNAベクターの自律
的複製を支持することができることを示す。
はプラスミドの別の部分に挿入されることがなく、またいずれの宿主ゲノムDN
Aもプラスミドに挿入されることがないことを意味するとして本明細書で用いる
。 好ましくは、本発明の方法に用いるべき複製開始配列は、 (a)配列番号:1又は配列番号:2の核酸配列と少くとも50%の同一性を
有し、かつ真菌中で複製を開始できるヌクレオチド配列; (b)(i)配列番号:1もしくは配列番号:2の核酸配列、又は(ii)その
各々の相補鎖と低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする複製を開始す
ることができるヌクレオチド配列であって、該低ストリンジェンシー条件が、4
2℃で、5×SSPE、0.3% SDS、200mg/mLせん断変性サケ精子D
NA、及び25%ホルムアミド中でのプレハイブリダイゼーション及びハイブリ
ダイゼーションにより定義され、そして洗浄条件が、50℃で、30分、2×S
SC、0.2% SDS中として定義されるヌクレオチド配列;及び (c)真菌中で複製を開始することができる(a)又は(b)のサブ配列から
なる群から選択される核酸配列である。
:2に記載の核酸配列と、少くとも約50%、より好ましくは約60%、更によ
り好ましくは70%、更により好ましくは約80%、更により好ましくは約90
%、そして最も好ましくは約97%の同一性の程度を有する(以後、“相同ポリ
ヌクレオチド”)。相同ポリヌクレオチドは、真菌細胞内で複製開始活性を有す
る配列番号:1又は配列番号:2のサブ配列も包含する。本発明の目的のため、
同一性の程度は、好適には、当業界で知られたコンピュータープログラム、例え
ば、ポリヌクレオチド配列比較のための次のセッティング:5.0のGAP c
reation penalty及び0.3のGAP extension p
enaltyでGAPを用いて、GCGプログラムパッケージ(Program Manual
for the Wisconsin Package, Version 8, August 1994, Genetics Computer Gr
oup, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711)(Needleman, S.B. a
nd Wunsch, C.D., (1970), Journal of Molecular Biology, 48, 443-45 )に供
されるGAPにより決定することができる。
、複製開始配列が、低〜高ストリンジェンシー条件(即ち42℃で5×SSPE
、0.3% SDS、200μg/mLせん断変性サケ精子DNA、並びに低、中
及び高ストリンジェンシーについて各々、25,35又は50%のホルムアミド
でのプレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーション)下で、配列番号
:1又は配列番号:2に記載の核酸配列から得られるオリゴヌクレオチドプロー
ブにハイブリダイズすることを示す。配列番号:1又は配列番号:2と相同であ
るクローン又はDNAを同定するために、ハイブリダイゼーション反応は、各々
、2×SSC、0.2% SDSを用いて、好ましくは少くとも50℃、より好
ましくは少くとも55℃、より好ましくは少くとも60℃、より好ましくは少く
とも65℃、更により好ましくは少くとも70℃、そして最も好ましくは少くと
も75℃で、30分、3回、洗浄される。
列であっても、その各々のサブ配列であってもよい。より詳しくは、オリゴヌク
レオチドプローブは、全体の配列よりかなり短くてもよいが、少くとも15、好
ましくは少くとも25、そしてより好ましくは少くとも40ヌクレオチド長であ
る。DNA及びRNAの両方のプローブを用いることができる。
又は35S−標識化オリゴヌクレオチドプローブがハイブリダイズする分子は、X
線フィルムを用いることにより検出することができる。 本発明に用いるための複製開始配列を単離する場合、その配列を有すると予想
される先に定義されるような生物から調製されたゲノムDNA,cDNA又はコ
ンビナトリアル化学ライブラリーは、複製開始活性を有する上述のオリゴヌクレ
オチドプローブとハイブリダイズするDNAについてスクリーニングされる。こ
のような他の生物からのゲノム又は他のDNAは、アガロースもしくはポリアク
リルアミドゲル電気泳動、又は他の分離技術によって分離することができる。ラ
イブラリーからのDNA又は分離されたDNAは、ニトロセルロース又は他の好
適な担体材料に移し、そしてそれ上に固定することができる。配列番号:1又は
配列番号:2と相同であるクローン又はDNAは、次に、以下の標準的サザンブ
ロッティング手順に従って同定することができる。
当業界で知られており、ゲノムDNA又はcDNAからの単離を含む。このよう
なDNAからのクローニングは、例えば共有する構造的特徴でクローン化DNA
フラグメントを検出するためにポリメラーゼ鎖反応(PCR)に基づく方法を用
いることにより、行うことができる(例えばInnis ら、1990, PCR: A Guide to
Method and Application, Academic Press, New York)。他の核酸増幅手順、例
えばリガーゼ鎖反応(LCR)を用いることができる。
:2に記載の核酸配列、又はそれらの各々の機能的サブ配列を有する。例えば、
配列番号:1の機能的サブ配列は、5′及び/又は3′端からの1又は複数のヌ
クレオチドが削除されていることを除いて配列番号:1又は配列番号:2により
包含される核酸配列である。好ましくは、サブ配列は、少くとも100ヌクレオ
チド、より好ましくは少くとも1000ヌクレオチド、そして最も好ましくは少
くとも2000ヌクレオチドを含む。より好ましい実施形態において、配列番号
:1のサブ配列は、少くとも配列番号:2に示す核酸配列を含む。
問題のポリヌクレオチド配列を含むDNAベクターにおいて、そのポリヌクレオ
チド配列は、ポリペプチドをコードし得る。この場合、そのコーディング配列の
発現を指示する1又は複数の調節配列に作用可能に結合する。あるいは、ポリヌ
クレオチド配列は、調節配列であり、この場合、問題の調節配列に依存して、そ
れは、通常、調節配列の活性を評価することができるためにポリペプチドコーデ
ィング配列に作用可能に連結する(これにより、要求される特性を有する親調節
配列の変異体を選択することができる)。
えばSambrookら、1989、前掲を参照のこと)。 用語“作用可能に連結”は、調節配列がポリペプチドの発現を指示し、又はポ
リペプチドの生産に関連するように、調節配列がポリペプチドコーディング配列
に関連する位置に適切に配置されるコンフィグレーションとして本明細書で定義
される。
クレオチド配列に作用可能に結合したもの(問題のポリヌクレオチド配列はポリ
ペプチドをコードする)、及び問題のポリヌクレオチド配列を構成するもの(ポ
リヌクレオチド配列が調節配列である場合)をコードする。問題のポリヌクレオ
チド配列として(ライブラリーが調節配列のライブラリーである場合)又は問題
のポリヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドの生産に関連した調節
配列として(ライブラリーがポリペプチドをコードする問題のポリヌクレオチド
配列のライブラリーである場合)1つ及び同じ調節配列を用いることができ、そ
して以下の開示が両方のタイプの調節配列の使用をカバーすることが理解されよ
う。
識される核酸配列である好適なプロモーター配列であり得る。プロモーター配列
は、ポリペプチドの発現を媒介する転写調節配列を含む。プロモーターは、変異
体、トランケート化、及びハイブリッドプロモーターを含む選択された宿主細胞
内で転写活性を示すいずれの核酸配列であってもよく、宿主細胞に対して同種又
は異種の細胞外又は細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から得ることができ
る。
するための好適なプロモーターの例は、Aspergillus oryzae
TAKAアミラーゼ、Rhizomucor mieheiアスパラチックプロ
テイナーゼ、Aspergillus niger中性α−アミラーゼ、Asp
ergillus niger酸安定性α−アミラーゼ、Aspergillu
s niger又はAspergillus awamoriグルコアミラーゼ
(glaA)、Rhizomucor mieheiリパーゼ、Aspergi
llus oryzaeアルカリプロテアーゼ、Aspergillus or
yzaeトリオースホスフェートイソメラーゼ、Aspergillus ni
dulansアセトアミダーゼ、Fusarium oxysporumトリプ
シン様プロテアーゼ(米国特許4,288,627)並びにその変異体、トラン
ケート化、及びハイブリッドプロモーターをコードする遺伝子から得られるプロ
モーターである。糸状菌宿主細胞に用いるための特に好ましいプロモーターは、
TAKAアミラーゼ、NA2−tpi(アスペルギルス・ニゲル中性α−アミラ
ーゼ及びアスペルギルス・オリザエトリオースリン酸イソメラーゼからのプロモ
ーターのハイブリッド)、及びglaAプロモーターである。
好適な転写ターミネーター配列であってもよい。ターミネーター配列はポリペプ
チドコーディングヌクレオチド配列の3′末端に作用可能に結合される、糸状菌
細胞内で機能的であるいずれのターミネーターも本発明に用いることができる。 好ましいターミネーターは、Aspergillus oryzaeTAKA
アミラーゼ、Aspergillus nigerグルコアミラーゼ、Aspe
rgillus nidulansアントラニレートシンターゼ、Asperg
illus niger α−グルコシダーゼ、及びFusarium oxy
sporumトリプシン様プロテアーゼをコードする遺伝子から得られる。
ある好適なリーダー配列であってもよい。リーダー配列は、ポリペプチドコーデ
ィングヌクレオチド配列の5′末端に作用可能に結合される。糸状菌細胞内で機
能的であるいずれのリーダー配列も本発明に用いることができる。 好ましいリーダーは、アスペルギルス・オリザエTAKAアミラーゼ及びアス
ペルギルス・ニジュランストリオースホスフェートイソメラーゼをコードする遺
伝子から得られる。
えるためのシグナルとして糸状菌細胞により認識されるポリペプチドコーディン
グヌクレオチド配列の3′末端に作用可能に結合された配列であるポリアデニル
化配列であってもよい。糸状菌細胞内で機能的であるいずれのポリアデニル化配
列も本発明に用いることができる。
ゼ、アスペルギルス・ニゲルグルコアミラーゼ、アスペルギルス・ニジュランス
アントラニレートシンターゼ、及びアスペルギルス・ニゲルα−グルコシダーゼ
をコードする遺伝子から得られる。 調節配列は、細胞の分泌経路にコードされたポリペプチドを向かわせることが
できるポリペプチドのアミノ末端に結合したアミノ酸配列をコードするシグナル
ペプチドコーディング領域であってもよい。ポリペプチドコーディングヌクレオ
チド配列の5′端は、固有に、分泌されるポリペプチドをコードするコーディン
グ領域のセグメントに翻訳読み枠内で天然で連結したシグナルペプチドコーディ
ング領域を含んでもよい。あるいは、コーディング配列の5′端は、そのコーデ
ィング配列に対して外来性であるシグナルペプチドコーディング領域を含み得る
。コーディング配列がシグナルペプチドコーディング領域を通常、含まない場合
に、外来シグナルペプチドコーディング領域が必要とされ得る。あるいは、外来
シグナルペプチドコーディング領域はそのポリペプチドの分泌を増強させるため
に、天然のシグナルペプチド領域に単に置きかわることができる。シグナルペプ
チドコーディング領域は、アスペルギルス種からのグルコアミラーゼもしくはア
ミラーゼ遺伝子、又はリゾムコル種からのリパーゼもしくはプロテイナーゼ遺伝
子から得ることができる。しかしながら、発現されたポリペプチドを糸状菌細胞
の分泌経路に向かわせるいずれのシグナルペプチドコーディング領域も本発明に
用いることができる。
KAアミラーゼ遺伝子、アスペルギルス・ニゲル中性アミラーゼ遺伝子、リゾム
コル・ミエヘイアスパラチックプロテイナーゼ遺伝子、又はヒュミコラ・ラヌギ
ノサセルラーゼ遺伝子から得られるシグナルペプチドコーディング領域である。 調節配列は、ポリペプチドのアミノ末端に位置したアミノ酸配列をコードする
プロペプチドコーディング領域であってもよい。得られたポリペプチドは、プロ
酵素又はプロポリペプチド(又は特定の場合、チモーゲン)として知られる。プ
ロポリペプチドは一般に不活性であり、そのプロポリペプチドからのプロペプチ
ドの触媒的又は自己触媒的開裂により成熟活性ポリペプチドに変換することがで
きる。プロペプチドコーディング領域は、リゾムコル・ミエヘイアスパラチック
プロテイナーゼ遺伝子又はマイセリオフトラ・サーモフィララッカーゼ遺伝子か
ら得られる(WO95/33836)。
存在する場合、プロペプチド領域は、ポリペプチドのアミノ末端の次に位置し、
シグナルペプチド領域はそのプロペプチド領域のアミノ末端の次に位置する。 ポリペプチドコーディングヌクレオチド配列は、ポリペプチドの発現を指示す
るために有利な1又は複数の因子、例えば転写アクティベーター(例えばトラン
ス作用因子)、シャペロン、及びプロセッシングプロテアーゼをコードする1又
は複数の核酸配列に作用可能に結合させることもできる。糸状菌細胞において機
能的であるいずれの因子も本発明に用いることができる。これらの因子を1又は
複数、コードする核酸は、ポリペプチドコーディングヌクレオチド配列と必ずし
もタンデムである必要はない。
性化するタンパク質である(Kudla ら、1990, EMBO, Journal 9: 1355 〜1364:
Jarai及びBuxton, 1994, Currene Genetics 26: 2238〜244; Verdier, 1990, Ye
ast 6: 271〜297 )。アクティベーターをコードする核酸配列はSacchar
omyces cerevisiaeヘムアクティベータープロテイン1(ha p1 )、Saccharomyces cerevisiaeガラクトース代謝
プロテイン4(gal4)、Aspergillus nidulansアンモ
ニア調節タンパク質(areA)、及びAspergillus oryzae
α−アミラーゼアクティベーター(amyR)をコードする遺伝子から得られ
る。更なる例について、Verdier, 1990, supra and MacKenzie et al., 1993, J
ournal of General Microbiology 139: 2295-2307を参照のこと。
ンパク質である(Hartl et al., 1994, TIBS 19: 20-25; Bergeron et al., 199
4, TIBS 19: 124-128; Demolder et al., 1994, Journal of Biotechnology 32:
179-189; Craig, 1993, Science 260: 1902-1903; Gething and Sambrook, 199
2, Nature 355; 33-45; Puig and Gilbert, 1994, Journal of Biological Chem
istry 269: 7764-7771; Wang and Tsou, 1993, The FASEB Journal 7: 1515-111
57; Robinson et al., 1994, Bio/Technology 1: 381-384; Jacobs et al., 199
3, Molecular Microbiology 8: 957-966)。シャペロンをコードする核酸配列は
、アスペルギルス・オリザエタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ又はサッカロ
マイセス・セレビシアエカルネキシン、サッカロマイセス・セレビシアエBiP
/GRP78、及びサッカロマイセス・セレビシアエHsp70から得ることが
できる。更なる例について、Gething 及びSambrook, 1992、前掲、及びHartl ら
、1994、前掲を参照のこと。
り出すためにプロペプチドを開裂するプロテアーゼである。(Enderlin and Ogr
ydziak, 1994, Yeast 10: 67-79; Fuller et al., 1989, Proceedings of the N
ational Academy of Sciences USA 86: 1434-1438; Julius et al., 1984, Cell
37: 1075-1089; Julius et al., 1983, Cell 32: 839-852; 米国特許5,70
2,934)。プロセッシングプロテアーゼをコードする核酸配列はSacch
aromyces cerevisiaeジペプチジルアミノペプチダーゼ、S
accharomyces cerevisiae Kex2、Yarrowi
a lipolytica塩基性プロセッシングエンドプロテアーゼ(xpr6
)、及びFusarium oxysporum metalloprotea
se(p45遺伝子)から得られる。
加えることも要求され得る。調節システムの例は、調節化合物の存在を含む、化
学的又は物理的刺激に対する応答において遺伝子の発現をターン・オン又はオフ
するものである。TAKAα−アミラーゼプロモーター、アスペルギルス・ニゲ
ルグルコアミラーゼプロモーター、及びアスペルギルス・オリザエグルコアミラ
ーゼプロモーターを調節配列として用いることができる。他の調節配列の例は、
遺伝子増幅を許容するもの、例えば重金属で増幅されるメタロチオネイン遺伝子
である。これらの場合、ポリペプチドコーディングヌクレオチド配列は、調節配
列に作用可能に結合するであろう。
プラスト形成、プロトプラストの形質転換、及び細胞壁の再生からなる方法に関
連し得る。アスペルギルス宿主細胞の形質転換のための好適な手順は、EP 2
38023及びYeltonら、1984, Proceedings of the National Academy of Sci
ences USA 81: 1470〜1474に記載される。フサリウム種を形質転換する好適な方
法は、Malardier ら、1989, Gene 78: 147〜156 又はWO96/00787に記
載される。
類の全ての糸状菌型を含む。糸状菌は、キチン、セルラーゼ、グルカン、キトサ
ン、マンナン、及び他の複合ポリサッカライドから構成される菌糸壁を特徴とす
る。栄養生長は、菌糸伸長により、炭素異化作用は絶対好気性である。対照的に
、サッカロマイセスセレビシアエのようなイーストによる栄養生長は、単細胞葉
状体により、炭素異化作用は発酵的であり得る。好ましい実施形態において、糸
状菌細胞はこれらに限られないが、Acremonium,Aspergill
us,Fusarium,Humicola,Mucor,Mycelioph
thora,Neurospora,Penicillium,Scytali
dium,Thielavia,Tolypocladium、及びTrich
odermaの種の細胞である。
き選択される。例えば、問題のポリヌクレオチドがアスペルギルス細胞に用いる
ことを意図した調節配列であるなら、糸状菌細胞は通常、アスペルギルス細胞で
ある。本発明に用いる糸状菌細胞の例には、Aspergillus細胞、Ac
remonium細胞、Fusarium細胞、Humicola細胞、Muc
or細胞、Myceliophthora細胞、Neurospora細胞、P
enicillium細胞、Thielavia細胞、Tolypocladi
um細胞、及びTrichoderma細胞がある。
spergillus foetidus,Aspergillus japo
nicus,Aspergillus nidulans,Aspergill
us niger、又はAspergillus oryzae細胞; a Fusarium bactridioides,Fusarium c
erealis,Fusarium crookwellense,Fusar
ium culmorum,Fusarium graminearum,Fu
sarium graminum,Fusarium heterosporu
m,Fusarium negundi,Fusarium oxysporu
m,Fusarium reticulatum,Fusarium rose
um,Fusarium sambucinum,Fusarium sarc
ochroum,Fusarium sporotricioides,Fus
arium sulphureum,Fusarium torulosum,
Fusarium trichothecioides,Fusarium v
enenatum細胞又はFusarium venenatum細胞(Nir
enberg sp.nov;Humicola insolens cell
又はHumicola lanuginosa細胞;,Mucor miehe
i細胞;Myceliophthora thermophila細胞;Neu
rospora crassa細胞;Penicillium purpuro
genum細胞;Thielavia terrestris細胞;又はTri
choderma harzianum,Trichoderma konin
gii,Trichoderma longibrachiatum,Tric
hoderma reesei、又はTrichoderma viride細
胞である。
方法は、問題のポリヌクレオチド配列に依存するであろう。ステップc)に用い
る“要求される特徴を発現する1又は複数の形質転換体についての選択又はスク
リーニング”とは、要求される活性又は機能を有し、任意に、以下に例示される
ような更なる特徴を有する(培養ステップbの間に問題のポリヌクレオチド配列
に基づいて生成されている)問題の改変されたポリヌクレオチド配列を含む形質
転換体を同定するために、スクリーニング又は選択を行うことを示すことを意図
する。これにより、問題のポリヌクレオチド配列が特定の活性又は機能を有する
ポリペプチドをコードするなら、その選択は、要求される活性又は機能を有する
ポリペプチドを発現する形質転換体が増殖するのを許容するだけであろう。これ
により、問題のポリヌクレオチド配列が特定の活性又は機能を有するポリペプチ
ドをコードするなら、その要求される活性又は機能を有するポリペプチドを発現
する形質転換体を同定するためにスクリーニングが行われよう。例えば、問題の
ポリヌクレオチド配列が酵素、例えばリパーゼをコードするなら、選択又はスク
リーニングステップc)は、リパーゼ活性を発現する形質転換体を同定するため
に行われよう。リパーゼを、特定の特徴、例えば高い熱安定性として同定すべき
であることが要求されるなら、スクリーニングは、要求される高い熱安定性を有
するリパーゼを同定することができる条件(典型的な温度)下で行われるべきで
ある。
あるなら、選択又はスクリーニングステップc)は、プロモーター活性を評価す
ることができる条件下で行われる。典型的には、ライブラリーにおいて、問題の
プロモーターポリヌクレオチド配列は、そのプロモーター活性が第2の配列の転
写を引用してアッセイすることができるように、転写されるべき第2の配列(例
えばポリペプチドコーディング配列)に作用可能に結合される。
作製し、及びスクリーニング又は選択する方法であって、 (a)細菌又はイースト細胞の培養物を、DNAベクターの集団で形質転換し
、ここで各々のベクターは、 (i)糸状菌選択マーカー、糸状菌複製開始配列、細菌又はイースト選択マー
カー及び細菌又はイースト複製開始配列(各々は、DNAベクターの集団内で実
質的に変化がない)をコードするポリヌクレオチド配列、及び (ii)問題のポリヌクレオチド配列であって、そのポリヌクレオチド配列の1
超の変異体がDNAベクターの集団内に含まれるもの を含み; (b)細菌又はイースト細胞を選択圧下で培養し; (c)(b)の形質転換体からDNAベクターを単離し; (d)糸状菌細胞を(c)のDNAベクターで形質転換し; (e)(d)の糸状菌細胞を選択圧下で培養し; (f)要求される特徴を発現する1又は複数の糸状菌形質転換体について選択
又はスクリーニングし;そして (g)問題の糸状菌形質転換体を単離すること を含む方法にも関する。
ギルスのような糸状菌細胞についてのものより100〜1000倍高く、最初に
、操作され任意に連結されたDNAベクターをイースト又は細菌に形質転換し、
次にその単離されたスーパーコイルベクターを糸状菌細胞に形質転換する場合に
より大きなライブラリーを作り出すことである。
上述の問題の生物機能を有し又はそれをコードする少くとも1の親ポリヌクレオ
チド配列のランダム変異誘発又は天然の対立遺伝子変異体によって調製される。 別の好ましい実施形態において、細菌細胞は大腸菌の株である。 別の好ましい実施形態において、イースト細胞は、サッカロマイセス種の株、
特にサッカロマイセス・セレビシアエ又はサッカロマイセス・クルイベリ又はス
キゾサッカロマイセス種の株である。好適なイースト細胞の更なる例は、クルイ
ベロマイセス、例えばK.ラクチス、ハンセヌラ(Hansenula)、例え
ばH.ポリモルファ(H.polymorpha)、又はピキア(Pichia
)、例えばP.パストリス(P.pastoris)の株である。
胞の容易な選択を許容する選択マーカーを含む。細菌選択マーカーの例には、こ
れらに限らないが、抗生物質、耐性例えばアンピシリン、カナマイシン、エリト
ロマイシン、クロランフェニコール又はテトラサイクリン耐性を与えるマーカー
がある。更に、選択は、例えばWO91/09129に記載されるように、同時
形質転換によって行うことができる。ここでは、選択マーカーは別個のベクター
上にある。
,LYS2,MET3,TRP1、及びURA3である。 好ましい実施形態において、細菌又はイースト選択マーカーは、殺生物剤に対
する耐性を与え、ここで殺生物剤は、アンピシリン、カナマイシン、テトラサイ
クリン、クロランフェニコール、ネオマイシン、ヒグロマイシン及びメトトレキ
セートからなる群から選択される。
もしくはウイルス毒性に対する耐性、重金属毒性に対する耐性又は栄養要求体に
対する原栄養性を供する産物をコードする遺伝子の群から選択される。 別の好ましい実施形態において、原栄養性は、ヌクレオチド合成、コファクタ
ー合成、アミノ酸合成、アセトアミド代謝、プロリン代謝、スルフェート代謝、
及びニトレート代謝からなる代謝経路からなる群から選択される酵素から得られ
る。
胞内で自律的に複製することを可能による複製の起点を更に含み得る。複製の細
菌の起点の例は、大腸菌内で複製を許容するプラスミドpBR322,pUC1
9,pACYC177、及びpACYC184の複製の起点である。 イースト宿主細胞に用いるための複製の起点の例は、複素の2ミクロン起点、
ARS1,ARS4,ARS1とCEN3の組合せ、及びARS4とCEN6の
組合せである。
により、エレクトロポレーションにより、又は細菌細胞のコンジュゲーションに
より、行うことができる(例えばJ.Sambrook, E.F.Fritsch 、及びT.Maniatis,
1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d edition, Cold Spring Ha
rbor, New Yorkを参照のこと)。これらの細胞の選択圧下での培養は、当業界で
知られた方法に従って行うことができる。
好ましくは本明細書、例えば“糸状菌選択マーカー”及び“複製開始配列”の標
題のセクションに記載される通りである。 問題の形質転換体の選択又はスクリーニングは、“形質転換体の選択及びスク
リーニング”の標識のセクションに上述されるように行うことができる。
ング又は選択するためにも有用であろう。より詳しくは、本発明の方法に用いる
べき問題のポリヌクレオチド配列は、問題の生物活性又は機能を有し又はそれを
コードする親ポリヌクレオチド配列から生成することができる。例えば、問題の
ポリヌクレオチド配列は、遺伝子のランダム変異誘発により問題のポリペプチド
をコードする遺伝子から生成される。あるいは、問題のポリヌクレオチド配列は
、先に定義されるような調節配列、例えばプロモーター配列である。また、更に
上述されるように、問題のポリヌクレオチド配列は、異なるソース、例えば異な
る天然のソース、例えば微生物から得ることができる。問題のポリヌクレオチド
配列は、ポリペプチドコーディング配列及び調節配列の組合せであり得る。
は化学的変異誘発剤の使用、ドープ化(doped)オリゴヌクレオチドの使用
、DNAシャッフリングにより、核酸配列をPCR生成変異誘発にかけることに
より、又はそれらのいずれかの組合せにより行われる。 あるいは、問題のポリヌクレオチド配列は、誤りがちなポリメラーゼ(err
or−prone polymerase)又はエラーの形成を促進するために
最適以下の条件下で作用するポリメラーゼを用いることにより、即ち、エラー・
プローンPCRにより、ヌクレオチド塩基の誤った組込みにより、配列を変異誘
発にかけることにより得ることができる、エラー・プローンDNA合成は、例え
ば種々のミューテーター株の使用により、試験管内又は生体内で行うことができ
る。
ための一般的なアプローチは、例えばUS 4,894,331及びWO93/
01285に開示されるような、ランダム変異誘発に基づいている。このアプロ
ーチは、本発明とあわせて用いることもできる。例えば、ランダム変異誘発は、
好適な物理的もしくは化学的変異誘発剤の使用により、好適なオリゴヌクレオチ
ドの使用により、又はポリヌクレオチド配列をPCR生成変異誘発にかけること
により行うことができる。更に、ランダム変異誘発は、これらの変異誘発剤のい
ずれかの組合せの使用により行うことができる。変異誘発剤は、例えば、転位、
トランスバージョン、逆位、スクランブリング、削除及び/又は挿入を誘導する
ものであってよい。
ヒドロキシルアミン、N−メチル−N′−ニトロ−N−ニトロングアニジン(M
NNG)、O−メチルヒドロキシルアミン、亜硝酸、エチルメタンスルホネート
(EMS)、重硫酸ナトリウム、ギ酸、及びヌクレオチドアナログがある。この
ような剤を用いる場合、変異誘発は、典型的には、問題のポリヌクレオチド配列
を、選択された変異誘発剤の存在下で、変異誘発がおこるために適した条件下で
インキュベートすることにより行われる。
、変化すべき位置でオリゴヌクレオチドの合成の間、3つの非親ヌクレオチドで
ドープ又はスパイクすることができる。ドーピング又はスパイキングは、不要な
アミノ酸のためのコドンが回避されるように行うことができる。ドープ化又はス
パイク化オリゴヌクレオチドは、いずれかの公開された技術により、例えばPC
R,LCR又は好適と思われるいずれかのDNAポリメラーゼ及びリガーゼによ
り問題のポリヌクレオチドに組込むことができる。
されている“コンスタントランダムドーピング”を用いて行われる。更に、ドー
ピングは、特定のヌクレオチドの導入のための選択、それにより1又は複数の特
定のアミノ酸残基の導入についての選択に対して行うことができる。ドーピング
は、例えば各々の位置での90%野生型及び10%変異の導入を許容するように
、行うことができる。ドーピングスキームの選択における更なる考慮は、遺伝子
及びタンパク質構造束縛に基づく。ドーピングスキームは、とりわけ終止コドン
の導入を避けるDOPEプログラム(例えば、Tomardl, Dら、1997, Journal of
Computer-Aided Molecular Design 11: 29〜38; Jensen, LJ, Andersen KV, Sv
endsen, A., 及びKretzschmar, T., 1998, Nucleic Acids Reseach 26: 697〜70
2)を用いることによって行うことができる。
リヌクレオチド配列は、ヌクレオチドの誤った組込みを増加させる条件下でPC
Rにかけられる(Deshler, J.O., 1992, Genetic Analysis, Techniques and Ar
rlications 9: 103 〜106; Leungら、1989, Technique 1: 11 〜15)。 大腸菌(Foulerら、1974, Molec.Gen.Genet. 133: 179〜191)、S.セレビシ
アエ又はいずれかの他の微生物のミューテーター株は、問題のポリヌクレオチド
配列のランダム変異誘発のために、例えば親ポリヌクレオチド配列を含むプラス
ミドをミューテーター株に形質転換し、そのミューテーター株をプラスミドと共
に増殖させそしてそのミューテーター株から変異したプラスミドを単離すること
により用いることができる。変異したプラスミドは、次に、発現生物に形質転換
することができる。
ら調製されたゲノム又はcDNAライブラリー中に存在し得る。あるいは、その
配列は、それ自体、変異誘発剤と共にインキュベートすることができ、又はそれ
に露出することができるプラスミド又はバクテリオファージのような好適なベク
ター上に存在し得る。変異誘発すべきポリヌクレオチド配列は、単離された形態
であってよい。ランダム変異誘発にかけるべきポリヌクレオチド配列は、好まし
くはcDNA又はゲノムDNA配列であることが理解されよう。その変異誘発さ
れたDNA配列は、変異されたDNA配列の発現を許容する機能をコードするD
NA配列を更に含み得る。
方法には、生体内又は試験管内DNAシャッフリングの方法がある。ここで、D
NAシャッフリングは、2又はそれ超の相同ポリヌクレオチド間のヌクレオチド
配列フラグメントの生体内又は試験管内の組換えとして定義され、インプットポ
リヌクレオチド(即ちシャッフリングにかけられるポリヌクレオチド)と比べて
、いくつかの変化したヌクレオチドフラグメントを含むアウトプットポリヌクレ
オチド(即ちシャッフリングサイクルにかけられたポリヌクレオチド)を生ずる
。シャッフリングは、その例が以下に列記される当業界で知られた方法により、
細胞内での組換えにより試験管内又は生体内で行うことができる。
61〜5669)は、2つの相同遺伝子間の生体内組換えにより遺伝子を改変するため
の方法を記載する。ここでは、組換え体は、耐性マーカーを用いて同定され、単
離される。 Pomponら(1989, Gene 83: 15 〜24)は、サッカロマイセス・セレビシアエを
、フィル・イン端を有する直鎖化プラスミド、及びそのプラスミドの端と部分的
に相同であるDNAフラグメントで形質転換することにより、サッカロマイセス
・セレビシアエにおける部分的に相同な配列の生体内組換えによる哺乳動物シト
クロムP−450の遺伝子ドメインをシャッフリングするための方法を記載する
。
てプラスミドDNAを用いる生体内組換えにより、相同なDNA配列の異なるヌ
クレオチド配列をシャッフリングすることにより調製される方法が記述される。 米国特許第5,093,257号(Genencor International, Inc.)は、生体
内組換えによりハイブリッドポリペプチドを生産するための方法を開示する。
又はそれ超の相同な核酸配列間の生体内組換えによって得られ、 (a)問題のポリヌクレオチド配列間の少くとも1の保存された領域を同定し
; (b)問題のポリヌクレオチド配列の各々のフラグメントであって、(a)の
保存された領域を含むフラグメントを生成し; (c)1又は複数の相同なリンク点として保存された領域を用いることにより
(b)のフラグメントを組換えることを含む。
をコードするか、又は先に定義されるような調節配列もしくは両方のいずれかの
組合せである。 用語“保存(された)領域”とは、2又はそれ超の配列が共有する好ましくは
少くとも10bpのサブ配列をいい、少くとも約50%、より好ましくは少くとも
約60%、更により好ましくは少くとも約70%、更により好ましくは少くとも
約80%、更により好ましくは少くとも約90%、そして最も好ましくは少くと
も約97%のサブ配列間の同一性の程度がある。
めに、保存された領域内の配列間の同一性の程度は、配列間の例えば上述の条件
下で、ハイブリダイゼーションを可能にするのに十分に高く、それにより保存さ
れた領域はリンク点として機能する。 試験管内の相同DNA配列のシャッフリングのための1つの方法は、Stemmer
(Stemmer, 1994. Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 91: 10747-10751; Stemmer, 1994.
Nature 370: 389-391; Crameri, A., et al., 1997. Nature Biotechnology 15
: 436-438 )により記載されている。その方法は、試験管内PCR技術を用いる
ことにより相関DNA配列をシャッフリングすることに関する。シャッフ化DN
A配列を含む陽性細胞組換え遺伝子は、発現されたタンパク質の改良された機能
に基づきDNAライブラリーから選択される。
O95/22625にも記載される。その方法における重要なステップは、相同
なテンプレート二本鎖ポリヌクレオチドを、要求されるサイズのランダムフラグ
メントに開裂し、次にそれらフラグメントを全長遺伝子に相同的に再アセンブル
することである。
験管内DNA合成の間に誘導されたテンプレートシフトによりいくつかの異なる
インプットDNAテンプレート及びプライマーから作製される。 局所化ランダム変異誘発 ランダム変異誘発は、問題の親ポリヌクレオチド配列の一部に有利に局在化さ
せることができる。改変すべき配列は例えば、遺伝子産物の活性のために本質的
である遺伝子のコーディング領域もしくはその一部、又は先に定義される調節配
列もしくはその一部であり得る。このような調節配列の好ましい例は、プロモー
ター配列又はその機能的部分、即ち核酸配列の発現を行うために十分である部分
である。
域が特に重要であると同定されている場合に有利であり得る。例えば、問題のポ
リヌクレオチド配列がポリペプチドをコードする場合、その重要な領域は、その
ポリペプチドの所定の特性のために本質的なものであり得、その領域の改変はこ
の特性が改変されている変異体を生ずると予想される。このような領域は、通常
、親ポリペプチドの三次構造が解明されてその機能と関連づけられている場合に
同定することができる。同様に、問題のポリヌクレオチド配列が、調節配列、例
えばプロモーターである場合、問題の領域は、プロモーター活性に本質的である
か又はそれに関連すると予想されるものであり得る。
生成変異誘発技術又は当業界で知られたいずれかの他の好適な技術の使用により
行われる。あるいは、改変すべきポリヌクレオチド配列の部分をコードするヌク
レオチド配列は、例えば好適なベクターへの挿入により単離することができ、そ
の部分は、次に、先に議論した変異誘発法のいずれかの使用により変異誘発にか
けることができる。
配列のライブラリーを作製し、選択又はスクリーニングするための本明細書に定
義される真菌複製開始配列の使用に関する。好ましくは、ライブラリーは、本発
明の第1又は第2の態様に従う方法によって作製される。好ましい実施形態にお
いて、真菌複製開始配列は、 (a)配列番号:1もしくは配列番号:2の核酸配列と少くとも50%の同一
性を有し、複製を開始することができる複製開始配列; (b)(i)配列番号:1もしくは配列番号:2の核酸配列、又は(ii)それ
ら各々の相補鎖と低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする複製開始配
列であって、その低ストリンジェンシー条件は、42℃で、5×SSPE、0.
3% SDS、200mg/mLせん断変性サケ精子DNA、及び25%ホルムアミ
ド中でのプレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションにより規定さ
れ、洗浄条件が50℃で30分、2×SSC、0.2% SDS中として規定さ
れる複製開始配列; (c)(a)又は(b)のサブ配列であって複製開始活性を有するもの からなる群から選択される。
A.ニジュランスの株から得られる。最も好ましい実施形態において、複製開始
配列は、配列番号:1もしくは配列番号:2に記載の核酸配列を有するか、又は
それらの各々の機能的サブ配列である。この態様に従って用いるべき複製開始配
列は、“複製開始配列”の標題の上述のセクションに記載され得る通りである。
菌細胞を含む問題のポリヌクレオチド配列のライブラリーであって、各々のベク
ターが、 (i)真菌選択マーカー及び真菌複製開始配列をコードする遺伝子であって、
該マーカー及び複製開始配列が前記集団内で変化していない遺伝子;及び (ii)問題のポリヌクレオチド配列であって、DNAベクターの集団がポリヌ
クレオチド配列の1超の変異体を含むポリヌクレオチド配列を含むライブラリー
に関する。
び細菌又はイースト複製開始配列をコードする核酸を更に含む。好ましくは、ラ
イブラリーは、本発明の第1又は第2の態様に従う方法によって調製される。好
ましくは、ライブラリーの要素、例えばDNAベクター及びその言及される構成
物は明細書に記載される。
るものとして解釈すべきでない。 実施例 材料 緩衝液及び基質として用いる化学物質は少くとも試薬グレードの商用製品であ
った。
yrG遺伝子を含む pENI1127:実施例1に後述の通り作製 pENI1245:実施例1に後述の通り作製 pENI1246:実施例1に後述の通り作製 pENI1298:実施例1に後述の通り作製 pENI1299:実施例1に後述の通り作製 株 JaL250:WO98/01470に記載される通り、pyrGが不活性化さ れているアスペルギルス・オリザエA1560の誘導体 DH5a :GIBCO BRL から購入した大腸菌宿主細胞(Life Technologies, Inc., Rockville MD) DLM15 :以下の実施例5に記載されるようなフサリウム・ベネナトウム( Fusarium venenatum)の誘導体 実施例1:pENI1298及びpENI1299の作製 pMT1466を、pHelp1からのSphI/NarIフラグメントをp
TpC68に挿入することにより作製した。pMT1489を、pMT1466
をSphI及びStuIで消化し、次に再連結することにより作製した。pMT
1500を、pMT1489をAatII及びNurIで消化し、リンカーを連結
することにより作製した。pMT1504を、pMT1500をNheIで消化
し、再連結することにより作製した。pMT1505を、A.ニジュランスゲノ
ムDNAからのamdSコーディング遺伝子を含む2.7kb XbaIフラグメ
ント(Corrick, C.M. ら、1987, Gene 53: 63 〜71)を、NheIで切断された
pMT1504に挿入することにより作製した。pENI1127を、SalI
で消化したpMT1505から作製し、AMA1反復のうちの1つ及び中心スペ
ーサー領域を除去した。
403bp及び5253bpのフラグメントを作り、それらを1%アガロースのゲル
から精製し、リパーゼコーディング配列を含むベクターpAHL内のHindII
I 部位にクローン化した。得られたプラスミドを各々pEN1245及びpEN
1246と呼んだ。
2から切り出し、pENI1245及びpENI1246の両方のStuI/B
buI部位に挿入した。得られたプラスミドを各々pEN1298及びpEN1
299と呼んだ。pENI1298についての制限地図を図1に、pENI12
99を図2に示す。
リパーゼの発現レベル JaL250を、例えばWO98/01470に記載される標準的手順を用い
て、pENI1298及びpENI1299で形質転換した。次にその細胞を3
7℃でCoveプレート上で培養した。
キュベーション後に現れた。それは、AMA1配列の欠如下での形質転換頻度の
100〜10,000倍の増加であった。 pENI1298及びpENI1299形質転換体からの30の独立した形質
転換体を、Coveプレート上で単離し、同時に、各々のウェル中に1* vog
el、2%マルトースの200μL最小培地(例えばMethods in Enzymology, V
ol.17 p.84)を含む96ウェルマイクロタイター皿に接種した。
からの培地を、リパーゼ活性についてアッセイした。各々のウェルからの培地の
10μLアリコートを、0.018% p−ニトロフェニルブチレートのリパー
ゼ基質200μL、0.1% Triton X−100、10mM CaCl2
、50mM Tris pH7.5を含むマイクロタイターウェルに加えた。活性を
、標準的酵素学プロトコル(例えばEnzyme Kinetics, Paul C.Engel, ed, 1981,
Chapman and Hall Ltd.)を用いて、カイネティックマイクロタイターリーダー
(Molecular Device Corp., Sunnyvale CA)を用いて5分間にわたり、15秒間
隔で分光光度測定によりアッセイした、要約すると、産物形成は、基質ターンオ
ーバーの最初の比率の間、測定し、5分間、15秒毎に405mmでの吸光度から
計算した曲線の傾きとして規定した。任意リパーゼ活性単位を、最も高いリパー
ゼ活性を示す形質転換体に対して標準化した。30の形質転換体の各々のグルー
プについて平均値及び標準偏差を計算した。
Coveプレート上に再び単離し、前述のようにマイクロタイターウェルに再接
種した。更に3日間、培養した後に、もう1回、アッセイ、再単離及び再接種の
手順をくり返した。 以下の表1に要約した結果は、形質転換後6日にpENI1298形質転換体
により生産される量に対する、生産されたリパーゼの量を示す。標準偏差の低い
値により示されるように、30の独立して増殖させた形質転換体の中でリパーゼ
発現レベルにほとんど変化はない。通常、糸状菌の形質転換を行う場合、ベクタ
ーのゲノムへのランダム組込み及び組み込まれたベクターの数の両方により、か
なり大きい相対的な標準偏差が見られる(70%〜100%)。最も悪い及び最
も優れた生産性真菌形質転換体間で発現レベルで100〜1000倍の差となり
得る。
た形質転換体からのリパーゼの平均発現レベル及び各々についての標準誤差 実施例3:プラスミドの再配置についてのテスト pENI1298又はpENI1299のいずれかを含むJal250の形質
転換体をYPD培地中で一晩、増殖させた。
niprepキット(QIAGEN, Venlo, The Netherlands)を用いて形質転換体の
各々からDNAを調製した。要約すると、各々の株を3日間、5mL YPD中で
増殖させた。その菌糸体を、ろ過により収集し、200mLの水で洗い、次に2mL
マイクロフュージチューブに移し、60℃で3時間、真空下で遠心により凍結乾
燥した。その乾燥した菌糸体を次に、粉砕し、1mLの溶解緩衝液(100mM E
DTA、10mM Tris pH8.0、1% triton X−100、50
0mMグアニジン−HCl、200mM NaCl)に再度懸濁し、次に全体を混合
した。20mgのRNAseを各々のチューブに加え、次にそれを10分、37℃
でインキュベートした。100μgのプロテイナーゼKを加え、その反応を30
分、50℃でインキョベートした。次に各々のチューブを、標準的トップ・マイ
クロフュージ中でトップヒスピードで15分、遠心した。その上清をQIApr
ep(登録商標)スピンカラムに適用し、次に遠心してろ液を捨てた。そのカラ
ムを次に、そのキットに供される0.5mL PB中で洗い、1分間、再び遠心し
た。ろ液を捨てた後、そのカラムをキットに供される0.75mL PE中で洗い
、次にもう1回、1分、遠心した。そのカラムを空気乾燥させ、そのDNAを1
00μLのTE緩衝液を加えることにより溶出し、最後に1分、回転させた。
がA.オリザエ内のエピソームに維持した。プラスミドDNAを製造元の説明に
従って、QIAprep(登録商標)Miniprep Kit(QIAGEN)を用
いて細菌細胞から精製した。 次にその精製したプラスミドDNAをScaIで消化し、その制限パターンを
、標準的アガロースゲル分画技術により分析した。
JaL250形質転換体に再配置は1つもなく、8のpENI1298JaL2
50形質転換体のうち1つのみが再配置を示し、プラスミド再配置がまれである
ことを示した。 実施例4:ライブラリーのスクリーニング 変異体ポリペプチドを、親ポリペプチドに相当するレベルで発現される改良さ
れた機能的特徴で同定するために、変異体ポリペプチドのライブラリーを作製し
、アスペルギルス・オリザエにおいてスクリーニングした。テンプレートとして
pENI1298並びに以下に記載のような各々のプライマー2pmol/mL:1つ
のプライマーとしてoligo19670、第2のプライマーとしてドープ化o
ligo23701,23702又は23703を用いるポリメラーゼ鎖反応を
以下の条件下で行った;94℃、5分;30サイクルの(94℃、30秒;50
℃、30秒;75℃、1分)、及び72℃、5分。商用Taqポリメラーゼ、A
mpliTaqを、供給元(Perkin-Elmer Corp., Branchburg NJ, USA)により
推奨される通り用いた。
sala SE )を用いて精製した。pENI1298 DNAを含むその精製された
産物を以下の条件下で2回目のPCR増幅にかけた:94℃、5分;30サイク
ルの(94℃、1分;50℃、10分;72℃、2分);及び72℃7分。以下
のプライマーを用いた。
94℃で30分、インキュベートしてDpn1酵素を不活性化した。 JaL250を、BalI及びSgrAI消化してリパーゼコーディング配列
のほとんどを除去した2μgのpENI1298、並びに23701,2370
2又は23703ドープ化オリゴ反応起源のPCRフラグメントのうちの1つ5
μgを用いて形質転換した。そのベクター及びPCRフラグメントをWO97/
07205に記載のように生体内で組み換えた。JaL250細胞は、消化した
pENI1298又はPCR産物各々のみでも形質転換した。細胞をベクターの
みで形質転換した場合に1つの形質転換体を得て、PCRフラグメントのみの形
質転換からは形質転換体は得られなかった。
び26の形質転換体を1.1* vogel、2%グルコース培地200μLを含
むマイクロタイタープレートに接種し、72時間、インキュベートした。pEN
I1298のJaL250形質転換体もコントロールとして接種した。次にその
培養物をCoveプレート上にストリーキングした。マイクロタイター培養物中
のリパーゼ活性を先の実施例2に記載されるように、及びマイクロタイターウェ
ル中商用洗濯用界面活性剤を用いて調製した200μLのリパーゼ基質に10μ
Lのマイクロタイター培養物を加える界面活性剤含有アッセイでアッセイした。
活性は、分光光度測定により405nmで測定し、先の実施例2に記載されるよう
に計算した。
レート上に再単離した。72時間、37℃でインキュベートしたCoveプレー
ト各々から、上述の通り、10のpENI1298形質転換体と共に、2つのコ
ロニーをマイクロタイター皿に接種し、次に72時間、34℃で培養した。全て
のクローンが界面活性剤アッセイで活性を示したが、pENI1298形質転換
体は示さなかった。更に、独立して重複した培養物として増殖させた形質転換体
は、相対的に小さいレベルの活性しか示さなかった。結果を以下の表2に要約す
る。
において優れた発現及び能力を示したので、そのポリペプチドの縮重したN末端
配列を決定するためにDNAを単離し、それはSPPRRPPであると決定され
た。天然のN末端配列はSPIRREであり、それはkex2様プロテアーゼに
より切断除去されるプロペプチドをコードする。他の形質転換体のいくつかから
のDNAを配列決定し、それは次の縮重N末端配列を生じた:23701.2(
SPPRRRR),23702.1(SPPRPRRR),23702.7(S
PPRPRRP),23703.1(SPPRRRRRP)、及び23703.
4(SPPRRPRRR)。これにより、親ポリペプチドに相当するレベルで発
現することができる改良された機能的特徴を有する変異体ポリペプチドが生産宿
主において同定された。
の実施形態にその範囲が限定されるべきでない。なぜならこれらの実施形態は本
発明のいくつかの態様を説明する目的だからである。いずれの等価な実施形態も
本発明の範囲内にあることを意図する。実際、本明細書に示され、記述されるも
のに加えて、本発明の種々の改変が先の記載から当業者に明らかになるであろう
。このような改変も添付の請求の範囲の範囲内にあることを意図する。
載し及び開示する目的のために引用により本明細書に組み込まれる。上述の出版
物は本願の出願日前、それらの開示のためのみに供される。本発明者らが先の発
明によるこのような開示に先立つ権利がないとの承認として解釈すべきものはな
い。
得ることが理解されるはずである。本明細書に用いる用語は、特定の実施形態を
記述する目的のためだけであり、限定を意図したものではない。なぜなら本発明
の範囲は添付の請求の範囲によってのみ限定されるであろうからである。 特に示さない限り、本明細書に用いる全ての技術及び科学用語は、本発明の属
する分野の当業者により一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記
載されるのと類似した又は等価のいずれの材料又は方法も本発明の実施又はテス
トに用いることができるが、その好ましい方法及び材料が記載される。
として再分類されるフサリウム株A315(Yoder and Christianson, 1998, Fu
ngal Genetics and Biology 23: 62-80; O'Donnell et al., 1998, Fungal Gene
tics and Biology 23: 57-67)を、Dr. Anthony Trinci, University of Manche
ster, Manchester, England から又はAmerican Type Culture Collection, Mana
ssas, VAからFusarium株ATCC 20334として得た。CCl−3
と呼ぶフサリウム・ベネナトウムA315の形態変異体(Wiebe et al., 1992,
Mycological Research 96: 555-562; Wiebe et al., 1991, Mycological Resear
ch 95: 1284-1288; Wiebe et al., 1991, Mycological Research 96: 555-562)
は高度に枝分れしたコロニー状変異体である。この実験で用いた株MLY3は、
フサリウム・ベネナトウムA315形態転換体CCl−3から得た。それはCC
l−3と同一の補足特性を有する。
52gのKH2 PO4 、1mlのCOVE微量金属溶液、1gのグルコース、50
0mgのMgSO4 ・7H2 O、342.3gのスクロース、及び20gの不活性
寒天(pH6.5)から構成される。
、1gのグルコース、20mlの50×Vogels、及び0.5mlの10mg/ml
NaMoO4 保存溶液、(pH6.0)から構成される。 YEPG培地は、1リッター当り10gのイーストエキス、20gのペプトン
、及び20gのグルコースから構成される。
l2 から構成される。 SPTCは、40% PEG 4000、0.8Mソルビトール、25mM T
ris pH8、25mM CaCl2 から構成される。 COVE微量金属溶液は、1リッター当り0.04gのNaB4 O7 ・10H 2 O、0.4gのCuSO4 ・5H2 O、1.2gのFeSO4 ・7H2 O、0
.7gのMnSO4 ・H2 O、0.8gのNa2 MoO2 ・2H2 O、及び10
gのZnSO4 ・7H2 Oから構成される。
される。 COVEトップアガロースは、1リッター当り、20mLの50×COVE塩、
0.8Mスクロース、1.5mMセシウムクロライド、1.0mMアセトアミド、及
び10gの低融点アガロース(pH6.0)から構成される。
×COVE塩溶液、10mLの1Mアセトアミド、10mLの1.5M CsCl2
、及び25gのNoble寒天から構成される。 50×Vogels培地は、1リッター当り150gのクエン酸ナトリウム、
250gのKH2 PO4 、10gのMgSO4 ・7H2 O、10gのCaCl2
・2H2 O、2.5mLのビオチン保存溶液、及び5.0mLのAMG微量金属溶液
から構成される。
、1×Vogel’s塩、10mMアセトアミド、15mM CsCl、及び25g
のNoble寒天から構成される。 フルオロアセトアミド培地は、1リッター当り、12gの酢酸ナトリウム、2
gの塩化ナトリウム、0.5gのMgSO4 、3gのKH2 PO4 、0.3gの
尿素、2gのフルオロアセトアミド、1mLの50×Vogels塩、及び15g
のAgarose I(Amresco; Solon, Ohio )、pH6.1から構成される。
削除を、最初にpyrG遺伝子を削除しそしてそれを、アスペルギルス・オリザ
エpyrG遺伝子の上流領域から単離された反復DNA配列に隣接したアスペル
ギルス・ニジュランスamdS遺伝子で置きかけることにより形成した。次に、 amdS 遺伝子から処理した単離物を、フルオロアセトアミドを含むプレート上
での増殖により選択した。
334からクローン化した3.9kbゲルEcoRI pyrGフラグメントをp
UC118のEcoRI部位に挿入することによって作製した。そのpyrGフ
ラグメントは、全コーディング領域+1.3kbのプロモーター及び1.5kbのタ
ーミネーターを含んだ(図3)。フサリウム・ベネナトウムMLY3のネイティ
ブpyrG遺伝子を相同的組換えにより、pyrGの全オープンリーディングフ
レームが削除されている4.4kbフラグメントにより相同的組換えを介して置換
し、そして図3に示す通り230bp反復配列に隣接するamdS遺伝子で置換し
た。
されているpNEB193(New Englard Biolabs )から構成されるpJRoy
43を作製することにより作製した。これを達成するために、5′端にBamH I 部位、中間にSwaI部位、及び3′端にSalI部位を含むリンカーを、次
の2つのオリゴを一緒にアニーリングすることにより作った。
で消化し、pJRoy43を作った。 次に、アスペルギルス・オリザエpyrG遺伝子の上流230bp領域をフサリ
ウム・ベネナトウム中の反復配列として選択した。この領域を以下の2つのプラ
イマー対、プライマー3と4及びプライマー5と6を用いて、アスペルギルス・
オリザエpyrGプラスミドpJaL335(WO98/12300)からの2
つの異なる産物として増幅した: プライマー3:配列番号:10 プライマー4:配列番号:11 プライマー5:配列番号:12 プライマー6:配列番号:13 増幅反応物(50μL)を、テンプレートとしてDNeasy Plant
Mini Kitを用いて調製したゲノムDNA約40〜50μgを用いて調製
した。各々の反応は次の成分を含んだ:40〜50μgのゲノムDNA、各々5
0pmolのプライマー3及び4又はプライマー5及び6、各々200μMのdAT
P,dCTP,dGTP、及びdTTP、1×Taq DNAポリメラーゼ緩衝
液、及び2.5UnitのTaq DNAポリメラーゼ。その反応物を次の通りプロ
グラムしたPerkin−Elmer Model 480 Thermal
Cycler中でインキュベートした:94℃で2.5分及び72℃で2.5分
のサイクル1;各々94℃で45秒、50℃で45秒、及び72℃で2分のサイ
クル2〜26;並びに94℃で45秒、50℃で45秒、及び72℃で10分の
サイクル27。
メントが単離された。最初のPCR産物(約230bpフラグメント)はその5′
端にSwaI部位及び3′端にEcoRV部位を含むが、2回目のPCR産物(
約230bpフラグメント)は5′端にEcoRV部位及び3′端にPmeI部位
を含んだ。それら2つの精製した反復フラグメントを最初にEcoRVで消化し
、一緒に連結した。精製(フェノール−クロロホルム抽出及びエタノール沈殿)
後、その連結産物を次にPmeI及びSwaIで消化して約500bpのフラグメ
ントを作り出し、それをアガロースゲル電気泳動及びアガロース処理により精製
した。
クローン化してpJRoy44を作り出した(図4)。このベクターは、Eco
RV部位により分離され、SwaI及びPmeI部位に隣接した2つの230bp
反復を含む。 amdS遺伝子を含むEcoRIフラグメント及び調節領域をp3SR2(Ke
lly 及びHynes, 1985, EMBO Journal 4: 475〜479 )から単離し、クレノウフラ
グメントで平滑化し、そしてEcoRVで消化したpJRoy44に連結してp
JRoy47を作った(図3)。
トとしてpJRoy47から得て、EcoRV/StuIで消化したpDM15
6.2に挿入してpDM222.Aを作った(図3)。pDM222.AをEc
oRIで消化し、pyrG削除カセットを含む4.4kb EcoRIフラグメン
トをQiaquick Gel Extraction Kit(Qiagen, Chat
sworth, CA)を用いてゲル精製した後、形質転換した。
含むフラスコに、最小培地プレートからの3つの1cm2 菌子体プラグを接種し、
そして28℃、150rpm で2〜3日、インキュベートすることにより形成した
。胞子をMiracloth(Calbiochem, San Diego, CA )を介して収集し、
Sorvall RC−5Bセントリフュージ(E.I.DuPont De Nemours and Co
., Wilmington, DE )中の7000rpm で20分、遠心した。ペレット化胞子を
滅菌蒸留水で2回、洗い、少量の水に再度懸濁し、そして次にヘモサイトメータ
ーを用いてカウントした。
ナトウムMLY3の胞子を接種し、そして16時間、24℃で150rpm でイン
キュベートすることにより調製した。その培養物を7分、3500rpm でSor
vall RT 6000D(E.I.DuPont De Nemours and Co., Wilmington, D
E )中で遠心した。ペレットを30mLの1M MgSO4 で2回、洗い、1M
MgSO4 中5mg/mlのNOVOZYME 234TM(batch PPM 4356, Novo N
ordisk A/S, Bagsvaerd, Denmark)15mLに再度懸濁した。培養物を24℃、1
50rpm で、プロトプラストが形成されるまでインキュベートした。35mLの容
量の2Mソルビトールをプロトプラスト消化物に加え、その混合物を2500rp
m で10分、遠心した。そのペレットを再度懸濁し、STCで2回、洗い、そし
て2000rpm で10分、遠心してプロトプラストをペレット化した。プロトプ
ラストをヘモサイトメーターでカウントし、STC:SPTC:DMSOの8:
2:0.1溶液中に1.25×107 プロトプラスト/mLの最終濃度まで再度懸
濁した。そのプロトプラストを、Nalgene Cryo 1℃ Fretzing Container (VWR S
cientific, Inc., San Francisco, CA)中で速度制御凍結した後、−80℃に保
存した。
た。上述のpDM222.Aからの4.4kb EcoRIフラグメント1μg及
びヘパリン5μL(STS 1mL当り5mg)を50mL滅菌ポリプロピレンチュー
ブに加えた。100μLのプロトプラストを加え、静かに混合し、そして30分
、氷上でインキュベートした。1mLのSPTLを加え、20分、室温でインキュ
ベートした。25mLの40℃ COVEトップアグロース+10mMウリジンを加
えた後、その混合物を、amdS遺伝子の組込みについて選択するためにCOV
E寒天を含む150mm径プレートに注いだ。
EcoRIフラグメントを、pyrG隣接配列、及び230bp反復配列に隣接す
るamdS遺伝子を含む4.4kbフラグメントによる相同的組換えを介して置換
した。これは、全pyrGコーディング領域+0.78kbの5′非翻訳及び0.
8kbの3′非翻訳領域を削除した。その削除カセットでのネイティブpyrG遺
伝子の置換を、サザン・ハイブリダイゼーションにより確認した。サザンハイブ
リダイゼーションは、製造元により供されるAmersham(Arlington, IL
)Vista and Rapid Hybプロトコル又はBoehringe
r Mannheim DIG Systemプロトコルを用いて行った。推定
上の削除体の真菌ゲノムDNAを、DNeasy Plant Mini Ki
t(Qiagen Chatworth, CA)を用いて調製し、EcoRIで消化した。サザンブ
ロットを、Magnagraph膜(Micron Separations, Inc; Westborough,
MA)及び標準的分子生物学技術を用いて行った。膜は、製造元の説明に従って展
開し、フルオレセイン標識化プローブのためにSTORM860(Molecular Dy
namics, Sunnyvale, CA )を用いてスキャンするか、又はDIG標識化プローブ
のためにフィルムに露出した。3.2kb pyrGプローブは、全pyrGコー
ディング領域、0.64kb 5′領域、及び1.42kb 3′非翻訳領域を含ん
だ。
で胞子形成させ、マイクロマニュピレーターを用いて単一の胞子を単離した。胞
子単離物を、Vogel’s/アセトアミド寒天+10mMウリジン上で増殖させ
た。1つの胞子単離物をRA培地+10mMウリジン中で胞子形成させた。その胞
子培養物をMiraclothを介してろ過して菌糸体を除いた。確認されたp yrG 削除体の約9.5×105 胞子を、フロオロアセトアミド培地+10mMウ
リジンを含む5つの150mmプレートの各々に広げることによりamdSマーカ
ーの損失についての選択を行った。これらのプレートを室温で2週間までインキ
ュベートした。得られたコロニーをCOVEプレート及びフロオロアセトアミド
プレート+10mMウリジンにサブクローン化した。フロオロアセトアミドで十分
に生長し、COVE上でほとんど又は全く生長しなかったコロニーを更に分析し
た。これらの株のうちの3つからの胞子単離物をサザンブロット分析にかけた。
ゲノムDNAをEcoRIで切断し、上述のpyrGプローブでプロービングし
た。胞子単離物のいくつかは1.4kbハイブリダイズバンドを形成し、amdS
“ループアウト”を示した。1つの胞子単離物を選択し、フサリウム・ベネナト
ウムDLM15と呼んだ。
体におけるリパーゼの発現レベル 実施例5に記載されるpyrGマイナスフサリウム・ベネナトウム株DLM1
5を、アセトアミドを硝酸ナトリウム(25mM)で置きかえるRoyer ら1995, Bi
otech, 13, 1479 〜1483に記載される通り、標準的手順を用いて、(実施例2に
記載される)pENI1298で形質転換した。形質転換体は、2週間のインキ
ュベーション後、50〜100/μg DNAの形質転換頻度で現れ、それはA
MA1配列の欠如下の形質転換頻度の10〜100倍の増加であった。20の形
質転換体を最小培地プレート上に単離し、更に2週間、室温で増殖させた。その
形質転換体を20mMウリジンを補給した又はウリジンのない(実施例2のような
)200μL vogel培地中マイクロタイター皿中でインキュベートし、室
温で増殖させた。ウリジンを補給した形質転換体は十分に増殖したが、ウリジン
なしの最小培地プレート上で単離した場合、増殖することができず、このことは
、pyrG遺伝子を含むプラスミドが失われており、これによりそのプラスミド
が自律的に複製することを示す。ウリジン補給培地中で増殖した形質転換体から
リパーゼ活性は検出することができなかった。リパーゼ活性は、ウリジンを補給
しなかった最小培地中で増殖する形質転換体からの培地中で検出することができ
なかった。平均任意活性は、独立して増殖させたフサリウム形質転換体と比べた
場合、15%の相対標準偏差で34.8であった。これにより、このプラスミド
は、フサリウム種におけるライブラリーの作製のために潜在的に用いることがで
きる。
切断ベクターで生体内で組み換わり、そして同じクローンからの多重酵素の発現
を保持するであろうか否かを評価するために行った。2つのPCRフラグメント
を、標準的PCR条件(94℃、5分;(94℃、30秒;50℃、30秒;7
2℃、1分)の30サイクル;及び72℃、5分)、oligo115120(
配列番号:14)、oligo134532(配列番号:15)及びテンプレー
トとしてpAHL誘導体(pAHLのリパーゼ変異体)又はpENI1543誘
導体(AMG変異体)を用いて、リパーゼ遺伝子又はAMG遺伝子(プロモータ
ー及びターミネーターを含む)ように作った。pENI1543を、BalII及
びSalIで切断し、それをBamHI及びXhoIで切断したpAHLにクロ
ーン化したoligo139123(配列番号:16)及び139124(配列
番号:17)を用いてアスペルギルス・ニゲルからのグルコアミラーゼ遺伝子(
cDNA)を含むPCRフラグメント(EMBL:AC:X00548、テンプ
レートとして)を形成することにより作製した。
シ腸ホスファターゼで処理したpENI1299(1μg)と共に(実施例4に
記載のような)Jal250に形質転換した。20の形質転換体を単離し、(実
施例4に記載の通り)最小培地に接種した。72時間のインキュベーションの後
、その培養培地をリパーゼ(pnp−ブチレート活性)及びグルコアミラーゼ(
pnp−グルコピラノシド活性)の存在についてアッセイした。リパーゼ及びグ
ルコアミラーゼ活性の両方を示す形質転換体はなく、これにより、同じ細胞内で
の多重変異体の同時形質転換及び発現は極めて頻度の低い事象であり、これによ
り糸状菌ライブラリーのスクリーニングに問題とならないことを示す。
メント、pENI1298からの4.0kb BssHII/SphIフラグメント
、及びpBANe6(TAKA/NA2/TPIプロモーター/AMGターミネ
ーター;WO98/1203に記載)からの0.75kb BssHI/BalII
フラグメントを用いて行い、これによりpJers2801を作った。クルバリ
ア・ベルルクロサ(Curvularia verruculosa)からのハ
ロペルオキシダーゼを含むPCRフラグメント(特許WO974102−A1)
を、oligo 1029fup(配列番号:18)及び1029rev(配列
番号:19)を用いて形成した。そのPCRフラグメントをSwaI及びNot
Iで切断し、同じ制限酵素で切断したpJers2801にクローン化し、これ
によりpHPOD1を形成した。
現レベル pHPOD1を実施例2に記載されるようにJal250に形質転換した。p
ENi1298(実施例2)についてのとほぼ同じ形質転換頻度を得た。10の
独立したアスペルギルス形質転換体を各々のウェル内に200μLのG2−gl
y−培地を含む96ウェルマイクロタイタープレートに接種し、72時間、増殖
させた。ハロペルオキシダーゼ活性は、本質的にDe Boer らにより記載されるよ
うに10の形質転換体の各々について決定した[1987; Vanadium containing br
omoperoxidase: An example of an oxidoreductase with a high operationel s
tability in aqueous and organic media, Biotechnol. Bioeng. 30: 607-610]
。平均発現レベルは82.5±9.1(ア−ビトラリーユニット)であった。独
立した形質転換体間の発現レベルの相対的な標準偏差は約11%であり、それは
驚くほど低い。これにより、本発明はリパーゼに適用できるばかりでなく、更に
他の酵素にも適用できる。
への同時形質転換 2つの異なる酵素を形質転換し、増殖の間、同じ細胞内に保持され、これによ
り1超のプラスミドがコードする酵素の細胞外同時発現を導き得るか否かを評価
するために以下の実験を行った。
(実施例2に記載)の両方で同時形質転換した。40の独立した形質転換体を単
離し、(実施例4に記載される通り)最小培地に接種した。72時間のインキュ
ベーションの後、その培養培地を(実施例4に記載されるように)リパーゼ及び
(実施例8に記載されるように)ハロペルオキシダーゼ活性の存在についてアッ
セイした。リパーゼ及びハロペルオキシダーゼ活性の両方を示す形質転換体はな
く、このことは、同じ細胞内の多重変異体の同時形質転換及び同時発現は極めて
頻度の低い出来事であり、糸状菌ライブラリーのスクリーニングに問題はないこ
とを示す。
る。
る。
M222.Aの制限地図である。
Claims (29)
- 【請求項1】 糸状菌細胞内の問題のポリヌクレオチド配列のライブラリー
を作製し及び選択又はスクリーニングする方法であって、 (a)前記糸状菌細胞をDNAベクターの集団で形質転換し、ここで各々のベ
クターは、 (i)真菌選択マーカー及び真菌複製開始配列をコードするポリヌクレオチド
配列であって、該マーカー及び複製開始配列が前記集団内で変化しないポリヌク
レオチド配列;並びに (ii)問題のポリヌクレオチド配列であって、DNAベクターの集団が該ポリ
ヌクレオチド配列の1超の変異体を含むポリヌクレオチド配列 を含み; (b)前記細胞を選択圧下で培養し; (c)要求される特徴を発現する1又は複数の形質転換体について選択又はス
クリーニングし; (d)問題の形質転換体を単離すること を含む方法。 - 【請求項2】 前記問題のポリヌクレオチド配列のライブラリーが、問題の
生物活性又は機能を有し又はそれをコードする少くとも1の親ポリヌクレオチド
配列のランダム突然変異誘発又は天然の対立遺伝子変異により調製される請求項
1に記載の方法。 - 【請求項3】 前記ポリヌクレオチド配列が、ポリペプチドをコードするか
、もしくは調節配列であるか;又は前記ポリヌクレオチド配列がポリペプチドも
しくはその一部をコードし、該ポリペプチドの発現に関連する調節配列もしくは
該調節配列の一部を更に含む請求項1又は2に記載の方法。 - 【請求項4】 前記ポリペプチドが、ホルモン、酵素、レセプターもしくは
その一部、抗体もしくはその一部、リポーター、又は調節タンパク質である請求
項3に記載の方法。 - 【請求項5】 前記酵素が、オキシドレダクターゼ、トランスフェラーゼ、
ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、又はリガーゼである請求項4に記載の
方法。 - 【請求項6】 前記酵素が、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、カルボヒド
ラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチ
ナーゼ、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ、デオキシリボヌク
レアーゼ、エステラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、グル
コアミラーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、インベルターゼ、ラ
ッカーゼ、リパーゼ、マンノシダーゼ、ムタナーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分
解酵素、ペルオキシダーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、タンパ
ク質分解酵素、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼ、又はキシラナーゼ
である請求項4又は5のいずれかに記載の方法。 - 【請求項7】 前記調節配列が、エンハンサー配列、リーダー配列、ポリア
デニル化配列、プロペプチド配列、プロモーター、複製開始配列、シグナル配列
、転写ターミネーター又は翻訳ターミネーターである請求項1又は2に記載の方
法。 - 【請求項8】 前記プロモーターが、アスペルギルス・オリザエ(Aspe rgillus oryzae )TAKAアミラーゼ、NA2−tpi及びアス
ペルギルス・ニゲル(Aspergillus niger)又はアスペルギル
ス・アワモリ(Aspergillus awamori)グルコアミラーゼか
ら得られる請求項7に記載の方法。 - 【請求項9】 前記選択マーカーが、殺生物剤もしくはウイルス毒性に対す
る耐性、重金属毒性に対する耐性、又は独立栄養体に対する原栄養性を供する産
物をコードする遺伝子の群から選択される請求項1〜8のいずれかに記載の方法
。 - 【請求項10】 前記原栄養性が、ヌクレオチド合成、コファクター合成、
アミノ酸合成、アセトアミド代謝、プロリン代謝、スルフェート代謝、及びニト
レート代謝からなる代謝経路の群から選択される酵素から得られる請求項9に記
載の方法。 - 【請求項11】 前記選択マーカーが、argB(オルニチンカルバモイル
トランスフェラーゼ)、amdS(アセトアミダーゼ)、bar(ホスフィノト
リシンアセチルトランスフェラーゼ)、hemA(5−アミノレブリネートシン
ターゼ)、hemB(ポルホビリノーゲンシンターゼ)、hygB(ヒグロマイ
シンホスホトランスフェラーゼ)、niaD(ニトレートレダクターゼ)、pr n (プロリンパーミアーゼ)、pyrG(オロチジン−5′−ホスフェートデカ
ルボキシラーゼ)、pyroA,riboB,sC(スルフェートアデニルトラ
ンスフェラーゼ)、及びtrpC(アントラニレートシンターゼ)からなる群か
ら選択される遺伝子である請求項9に記載の方法。 - 【請求項12】 前記複製開始配列が、 (a)配列番号:1又は配列番号:2の核酸配列と少くとも50%の同一性を
有し、かつ複製を開始できる複製開始配列; (b)(i)配列番号:1もしくは配列番号:2の核酸配列、又は(ii)その
各々の相補鎖と低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする複製開始配列
であって、該低ストリンジェンシー条件が、42℃で、5×SSPE、0.3% SDS、200mg/mLせん断変性サケ精子DNA、及び25%ホルムアミド中
でのプレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションにより定義され、
そして洗浄条件が、50℃で、30分、2×SSC、0.2% SDS中として
定義される複製開始配列;及び (c)複製開始活性を有する(a)又は(b)のサブ配列からなる群から選択
される核酸配列である請求項1〜11のいずれかに記載の方法。 - 【請求項13】 前記核酸配列が、配列番号:1又は配列番号:2の核酸配
列と、少くとも50%の同一性、より好ましくは約60%、更により好ましくは
約70%、更により好ましくは約80%、更により好ましくは約90%、そして
最も好ましくは約97%の同一性を有する請求項12に記載の方法。 - 【請求項14】 前記複製開始配列が、糸状菌細胞から得られる請求項12
に記載の方法。 - 【請求項15】 前記糸状菌細胞がアスペルギルス(Aspergillu s )の株である請求項14に記載の方法。
- 【請求項16】 前記アスペルギルスの株がA.ニジュランス(A.nid ulans )の株から得られる請求項15に記載の方法。
- 【請求項17】 前記複製開始配列が、配列番号:1もしくは配列番号:2
に記載される核酸配列を有するか、又はその各々の機能的サブ配列である請求項
12〜16のいずれかに記載の方法。 - 【請求項18】 前記親ポリヌクレオチド配列の改変が、突然変異誘発、好
ましくはランダム変異誘発により、物理的もしくは化学的変異誘発剤の使用によ
り、ドープ化(doped)オリゴヌクレオチドの使用により、DNAシャッフ
リングにより、もしくは前記核酸配列をPCR生成変異誘発にかけることにより
、又はそれらのいずれかの組合せを用いることにより行われる請求項2に記載の
方法。 - 【請求項19】 前記問題のポリヌクレオチド配列がポリペプチドもしくは
調節配列、又は両方のいずれかの組合せをコードする2又はそれ超の相同核酸配
列間の生体内組換えにより得られる請求項18に記載の方法であって、 (a)問題のポリヌクレオチド配列間の少くとも1の保存された領域を同定し
; (b)前記問題のポリヌクレオチド配列の各々のフラグメントであって、(a
)の保存された領域を含むものを生成し;そして (c)1又は複数の相同結合点として前記保存された領域を用いることにより
(b)のフラグメントを組み換えること を含む方法。 - 【請求項20】 前記DNAベクターの集団で形質転換される糸状菌細胞が
、アクレモニウム(Acremonium)、アスペルギルス(Aspergi llus )、コプリヌス(Coprinus)、フサリウム(Fusarium
)、ヒュミコラ(Humicola)、ムコル(Mucor)、マイセリオフト
ラ(Myceliopthora)、ニューロスポラ(Neurospora)
、ペニシリウム(Penicillium)、チエラビア(Thielavia
)、トリポクラジウム(Tolypocladium)又はトリコデルマ(Tr
ichoderma)の株の細胞である請求項1〜19のいずれかに記載の方法
。 - 【請求項21】 前記細胞が、アスペルギルス・オリザエ(Aspergi llus oryzae )、アスペルギルス・ニゲル(Aspergillus
niger)、アスペルギルス・ニジュランス(Aspergillus n idulans )、コプリヌス・シネレウス(Coprinus cinere us )、フサリウム・オキシスポルム(Fusarium oxysporum
)、又はトリコデルマ・レエセイ(Trichoderma reesei)細
胞である請求項20に記載の方法。 - 【請求項22】 糸状菌細胞において問題のポリヌクレオチド配列のライブ
ラリーを作製し、及びスクリーニング又は選択する方法であって、 (a)請求項1〜21のいずれかに記載のDNAベクターの集団で、細菌又は
イースト細胞の培養物を形質転換し、ここで該ベクターは、細菌又はイースト選
択マーカー及び細菌又はイースト複製開始配列をコードする核酸配列を更に含み
; (b)前記細菌又はイースト細胞を選択圧下で培養し; (c)(b)の形質転換体からDNA構成物を単離し; (d)糸状菌細胞を(c)のDNA構成物で形質転換し; (e)(d)の糸状菌細胞を培養し; (f)要求される特徴を発現する1又は複数の糸状菌形質転換体について選択
又はスクリーニングし、そして (g)問題の糸状菌形質転換体を単離すること を含む方法。 - 【請求項23】 前記細菌又はイースト選択マーカーが、殺生物剤もしくは
ウイルス毒性に対する耐性、重金属毒性に対する耐性、又は独立栄養体に対する
原栄養性を供する産物をコードする遺伝子の群から選択される請求項22に記載
の方法。 - 【請求項24】 問題のポリヌクレオチド配列のライブラリーの作製におけ
る真菌複製開始配列の使用。 - 【請求項25】 前記真菌複製開始配列が、 (a)配列番号:1又は配列番号:2の核酸配列と少くとも50%の同一性を
有し、かつ複製を開始できる複製開始配列; (b)(i)配列番号:1もしくは配列番号:2の核酸配列、又は(ii)その
各々の相補鎖と低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする複製開始配列
であって、該低ストリンジェンシー条件が、42℃で、5×SSPE、0.3% SDS、200mg/mLせん断変性サケ精子DNA、及び25%ホルムアミド中
でのプレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションにより定義され、
そして洗浄条件が、50℃で、30分、2×SSC、0.2% SDS中として
定義される複製開始配列;及び (c)複製開始活性を有する(a)又は(b)のサブ配列からなる群から選択
される核酸配列である請求項24に記載の使用。 - 【請求項26】 前記複製開始配列が、糸状菌細胞から、特にアスペルギル
スの株、例えばA.ニジュランスから得られる請求項25に記載の使用。 - 【請求項27】 前記複製開始配列が、配列番号:1もしくは配列番号:2
に記載される核酸配列を有するか、又はその各々の機能的サブ配列である請求項
25又は26に記載の使用。 - 【請求項28】 DNAベクターの集団で形質転換された糸状菌細胞を含む
問題のポリヌクレオチド配列のライブラリーであって、各々のベクターが、 (i)真菌選択マーカー及び真菌複製開始配列をコードする遺伝子であって、
該マーカー及び複製開始配列が前記集団内で変化しない遺伝子;及び (ii)問題のポリヌクレオチド配列であって、前記DNAベクターの集団が該
ポリヌクレオチド配列の1を超える変異体を含むポリヌクレオチド配列 を含むライブラリー。 - 【請求項29】 前記ベクターが、細菌又はイースト選択マーカー及び細菌
又はイースト複製開始配列をコードする核酸配列を更に含む請求項28に記載の
ライブラリー。
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