ES2910097T3 - Proteína quimérica con alta actividad antimicrobiana - Google Patents

Abstract

Una proteína quimérica que comprende: (a) una primera secuencia de aminoácidos que comprende el dominio catalítico CHAP de la endolisina LysRODI del fago PhilPLA-RODI y (b) una segunda secuencia de aminoácidos que comprende el dominio de unión a la pared celular SH3b de la endolisina LysH5 del fago philPLA88, en donde la primera secuencia de aminoácidos (a) está unida a la segunda secuencia de aminoácidos (b); y en donde (i) la estabilidad y (ii) la actividad lítica de la proteína quimérica contra Staphylococcus sp. mejoran en comparación con las de las endolisinas precursoras.

Description

DESCRIPCIÓN

Proteína quimérica con alta actividad antimicrobiana

La invención se refiere a una proteína quimérica con una actividad lítica mejorada contra Staphylococcus sp. y una mayor estabilidad que las endolisinas precursoras de la técnica actual. Por tanto, la invención se refiere a esta proteína quimérica y su uso como antimicrobiano, siendo útil para tratar y/o prevenir una infección por Staphylococcus sp., para eliminar biopelículas de Staphylococcus sp., para controlar la contaminación por Staphylococcus sp. en la industria alimentaria y para descontaminar superficies inanimadas sospechosas de contener Staphylococcus sp. Por tanto, la presente invención pertenece al campo del tratamiento de infecciones o contaminaciones bacterianas.

Antecedentes de la técnica

El rápido aumento y diseminación de patógenos multirresistentes (MR) representa una importante amenaza mundial a largo plazo para la salud humana, la producción sostenible de alimentos y el desarrollo sostenible. Según la Organización Mundial de la Salud (OMS), la Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación y la Agricultura (FAO) y la Organización Mundial de Sanidad Animal (OIE), los patógenos MR causan más de 700000 muertes al año en el mundo, y afectan a los países en desarrollo y desarrollados, áreas rurales y urbanas, hospitales, explotaciones agrícolas y comunidades. La aparición de patógenos MR es un riesgo global urgente que sigue sin resolverse.

El Staphylococcus aureus se considera una Prioridad 2 (alta) en la lista global de patógenos prioritarios (PPL global) de bacterias resistentes a antibióticos elaborada por la OMS. Esta bacteria es uno de los principales agentes bacterianos causantes de enfermedades transmitidas por alimentos en seres humanos debido a su capacidad para producir enterotoxinas y también es una grave amenaza para la salud humana. La capacidad de S. aureus para adherirse y proliferar no solo en superficies abióticas sino también en tejidos humanos hace que esta bacteria sea difícil de erradicar.

Durante los últimos años, el estudio de las proteínas líticas codificadas por bacteriófagos (endolisinas y peptidoglucano hidrolasas asociadas a viriones) ha atraído un gran interés para el tratamiento de enfermedades infecciosas. Estas enzimas destruyen las bacterias mediante la degradación de peptidoglucanos seguida de lisis osmótica. De hecho, existen pruebas de que muchas proteínas líticas de fagos (enzibióticos) son eficaces en modelos animales de infección. La endolisina LysH5 (481 aminoácidos) codificada por el fago vB_SauS-philPLA88 (phiIPLA88) tiene tres posibles dominios, una cisteína N-terminal, dominio de amidohidrolasa/peptidasa dependiente de histidina (CHAP) y dominio de amidasa-2 y un dominio de unión a la pared celular (CWB) SH3b C-terminal. LysH5 es capaz de inhibir el crecimiento de S. aureus en la leche y muestra un efecto antimicrobiano sinérgico con la bacteriocina nisina. La peptidoglucano hidrolasa asociada al virión del fago philPLA88 (HydH5, 634 aminoácidos) tiene un dominio lítico CHAP N-terminal y un dominio lítico LYZ2 (familia de lisozimas 2) C-terminal. Rodríguez-Rubio, L. et al. 2013 (PLOS ONE, 8(5): e64671) desvelan dos proteínas de fusión (HydH5SH3b e HydH5Lyso) obtenidas por combinación entre los dominios lisostafina e HydH5. Estas proteínas presentaron alta actividad lítica contra S. aureus bovino y humano.

La solicitud internacional WO2013/188203 A1 desvela la endolisina del fago estafilocócico 2638A que tiene actividad lítica contra S. aureus cuando se expone de forma externa, lo que lo convierte en un nuevo candidato antimicrobiano.

La solicitud internacional WO2013/074959 A2 desvela tres proteínas de fusión diferentes: peptidoglucano hidrolasa HydH5-lisostafina, peptidoglucano hidrolasa HydH5-SH3b e HydH5CHAP-SH3b. Cada polipéptido de fusión recombinante mostró mayor actividad estafilolítica que la enzima precursora o su construcción con supresión. Tanto las proteínas precursoras como las de fusión lisaron células S. aureus en cimogramas, ensayos de lisis en placa y reducción de turbidez.

La patente US8481289 B2 desvela una proteína antimicrobiana de fusión triple de endolisina-lisostafina antimicrobiana que comprende (1) una endolisina CHAp endopeptidasa, (2) un dominio de endolisina amidasa y (3) un dominio de lisostafina glicilglicina endopeptidasa. La proteína tiene especificidad y actividad exolítica para la pared celular de peptidoglucano de células S. aureus vivas, sin tratar, de diferentes fases de crecimiento.

Sin embargo, todavía existe la necesidad de proporcionar nuevas alternativas antimicrobianas con una actividad de destrucción mejorada contra Staphylococcus sp, preferentemente, S. aureus, más preferentemente, S. aureus MR.

Descripción de la invención

Staphylococcus aureus es uno de los principales agentes bacterianos que causan enfermedades transmitidas por los alimentos en seres humanos debido a su capacidad para producir enterotoxinas y adherirse y proliferar no solo en superficies abióticas sino también en tejidos humanos. Ahora, los autores de la presente invención han descubierto que una combinación específica del dominio catalítico (CHAP) y de unión a la pared celular (SH3b) procedentes de dos endolisinas da lugar, sorprendentemente, a una proteína quimérica con una actividad lítica mejorada contra Staphylococcus sp. y una mayor estabilidad que las endolisinas precursoras. La invención describe la fusión del dominio CHAP de la endolisina LysRODI del fago PhiIPLA-RODI con el dominio SH3b de la endolisina LysH5 del fago phiIPLA88.

Para realizar esto, los inventores identificaron y fusionaron el dominio CHAP de la endolisina LysRODI precursora y el dominio SH3b de la endolisina LysH5 precursora, lo que da lugar a una proteína quimérica que se sometió a varias pruebas para analizar su actividad antimicrobiana y su capacidad para prevenir la formación de biopelículas y para eliminar las biopelículas preformadas. Como puede verse en el ejemplo ilustrativo de la invención (ejemplo 1), la proteína quimérica mencionada anteriormente mostró una mayor actividad en comparación con las endolisinas precursoras (figura 1), una tasa de destrucción de bacterias S. aureus similar a la de las endolisinas precursoras (figura 2) y propiedades antibiopelícula aumentadas (figuras 3 y 4). Asimismo, la proteína quimérica desvelada en el presente documento no causa resistencia de Staphylococcus sp., mantiene su actividad desde pH 5 hasta pH 11 lo que permite su uso tópico y su purificación es más fácil que otras proteínas quiméricas. Estas características convierten a la proteína quimérica de la presente invención en un nuevo agente antimicrobiano útil en el tratamiento de enfermedades por Staphylococcus sp., el biocontrol de alimentos y la desinfección de superficies.

Proteína quimérica de la invención

En un aspecto, la presente invención se refiere a una proteína quimérica, en lo sucesivo en el presente documento "proteína quimérica de la invención", que comprende:

(a) una primera secuencia de aminoácidos que comprende el dominio catalítico CHAP de la endolisina LysRODI del fago PhiIPLA-RODI y

(b) una segunda secuencia de aminoácidos que comprende el dominio de unión a la pared celular SH3b de la endolisina LysH5 del fago phiIPLA88,

en donde la primera secuencia de aminoácidos (a) está unida a la segunda secuencia de aminoácidos (b) y en donde (i) la estabilidad y (ii) la actividad lítica de la proteína quimérica contra Staphylococcus sp. mejoran en comparación con las de las endolisinas precursoras.

La expresión "proteína quimérica", como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier proteína compuesta por una primera secuencia de aminoácidos procedente de una primera fuente, unida, de manera covalente o no covalente, a una segunda secuencia de aminoácidos procedente de una segunda fuente, en donde la primera y segunda fuentes no son iguales. Una primera fuente y una segunda fuente que no son iguales pueden incluir dos entidades biológicas diferentes. Una proteína quimérica puede incluir, por ejemplo, una proteína procedente de al menos 2 fuentes biológicas diferentes. La fuente también puede ser una fuente sintética. Una fuente sintética puede incluir una secuencia de proteína o ácido nucleico producida químicamente y no por un sistema biológico (p. ej., síntesis en fase sólida de secuencias de aminoácidos). Por tanto, la expresión "proteína quimérica" significa una proteína o polipéptido que comprende dos o más dominios heterólogos que no se encuentran en la misma relación entre sí en la naturaleza.

La proteína quimérica de la invención comprende una primera secuencia de aminoácidos (secuencia (a)) que comprende el dominio catalítico CHAP de la endolisina LysRODI del fago philPLA-RODI.

La endolisina LysRODI (también denominada LysRODI) está codificada por el orf57 del fago vB-SauM_phiIPLA-RODI (también denominado fago phiIPLA-RODI de Staphylococcus). La endolisina LysRODI muestra la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 7 (número de referencia de Genbank YP_009195893.1).

SEQ ID NO: 7

1 MAKTQAEINK RLDAYAKGTV DSPYRIKKAT SYDPSFGVME AGAIDADGYY HAQCQDLITD

61 YVLWLTDNKV RTWGNAKDQI KQSYGTGFKI HENKPSTVPK KGWIAVFTSG SYQQWGHIGI

121 VYDGGNTSTF TILEQNWNGY ANKKPTKRVD NYYGLTHFIE IPVKAGTTVK KETAKKSASK

181 TPAPKKKATL KVSKNHINYT MDKRGKKPEG MVIHNDAGRS SGQQYENSLA NAGYARYANG

241 IAHYYGSEGY VWEAIDAKNQ IAWHTGDGTG ANSGNFRFAG IEVCQSMSAS DAQFLKNEQA

301 VFQFTAEKFK EWGLTPNRKT VRLHMEFVPT ACPHRSMVLH TGFNPVTQGR PSQAIMNKLK

361 DYFIKQIKNY MDKGTSSSTI VKDGKTSSAS TPATRPVTGS WKKNQFGTWY KPESATFVNG

421 NQPIITRIGS PFLNAPIGGN LPAGATIVYD EVCIQAGHIW IGYNAYNGNR VYCPVRTCQG

481 VPPNHIPGVA WGVFKG

La endolisina LysRODI comprende dos dominios catalíticos: el dominio CHAP [SEQ ID NO: 1: aminoácidos 45 a 136 de la SEQ ID NO: 7 (subrayado)] y el dominio Amidasa_2 (aminoácidos 204 a 335 de la SEQ ID NO: 7), y un dominio de unión a la pared celular SH3b (aminoácidos 409 a 475 de la SEQ ID NO: 7).

Por tanto, en una realización particular de la proteína quimérica de la invención, la secuencia de aminoácidos del dominio catalítico CHAP comprende una secuencia de aminoácidos con una identidad de secuencia de al menos 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 % con la SEQ ID NO: 1.

SEQ ID NO: 1

1 DADGYYHAQC QDLITDYVLW LTDNKVRTWG NAKDQIKQSY GTGFKIHENK PSTVPKKGWI

61 AVFTSGSYQQ WGHIGIVYDG GNTSTFTILE QN

En la presente invención, las expresiones "idéntico", "identidad de secuencia", "identidad" y "similitud" se consideran equivalentes y se pueden usar indistintamente. Por "identidad de secuencia" se entiende el grado de similitud entre dos secuencias de nucleótidos o de aminoácidos obtenidas alineando las dos secuencias. Dependiendo del número de restos comunes entre las secuencias alineadas, se obtendrá un grado diferente de identidad, expresada como un porcentaje. El grado de identidad entre dos secuencias de aminoácidos puede determinarse mediante métodos convencionales, por ejemplo, mediante algoritmos convencionales de alineación de secuencias conocidos en la técnica actual, tales como, por ejemplo, BLAST [Altschul S.F. et al. Basic local alignment search tool. J Mol Biol. 5 de octubre de 1990; 215 (3): 403-10]. Los programas BLAST, por ejemplo, BLASTN, BLASTX y TBLASTX, BLASTP y TBLASTN, son de dominio público en el sitio web del Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI). Las proteínas con la identidad de secuencia mencionada anteriormente con la SEQ ID NO: 1 se consideran variantes de la SEQ ID NO: 1 y también se contemplan dentro de la presente invención.

En otra realización particular, la primera secuencia de aminoácidos de la proteína quimérica de la invención comprende la secuencia SEQ ID NO: 2.

SEQ ID NO: 2

1 MAKTQAEINK RLDAYAKGTV DSPYRIKKAT SYDPSFGVME AGAIDADGYY HAQCQDLITD

61 YVLWLTDNKV RTWGNAKDQI KQSYGTGFKI HENKPSTVPK KGWIAVFTSG SYQQWGHIGI

121 VYDGGNTSTF TILEQNWNGY ANKKPTKRVD NYYGLTHFIE IPVKA

La proteína quimérica de la invención también comprende una segunda secuencia de aminoácidos (secuencia (b) que comprende el dominio de unión a la pared celular SH3b de la endolisina LysH5 del fago phiIPLA88.

La endolisina LysH5 (también denominada LysH5) está codificada por el orf61 del fago vB-SauS_phiIPLA88 (también denominada IPLA88 de virus de Staphylococcus). La endolisina LysH5 muestra la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 8 (número de referencia de Genbank YP_002332536.1).

SEQ ID NO: 8

1 MEVATMQAKL TKKEFIEWLK TSEGKQYNAD GWYGFQCFDY ANAGWKALFG LLLKGVGAKD

61 IPFANNFDGL ATVYQNTPDF LAQPGDMWF GSNYGAGYGH VAWVIEATLD YIIVYEQNWL

121 GGGWTDGVQQ PGSGWEKVTR RQHAYDFPMW FIRPNFKSET APRSVQSPTQ ASKKETAKPQ

181 PKAVELKIIK DWKGYDLPK RGSNPNFIVI HNDAGSKGAT AEAYRNGLVN APLSRLEAGI

241 AHSYVSGNTV WQALDESQVG WHTANQIGNK YGYGIEVCQS MGADNATFLK NEQATFQECA

301 RLLKKWGLPA NRNTIRLHNE FTSTSCPHRS SVLHTGFDPV TRGLLPEDKR LQLKDYFIKQ

361 IRAYMDGKIP VATVSNDSSA SSNTVKPVAS AWKRNKYGTY YMEESARFTN GNQPITVRKV

421 GPFLSCPVGY QFQPGGYCDY TEVMLQDGHV WVGYTWEGQR YYLPIRTWNG SAPPNQILGD

481 LWGEIS

La endolisina LysH5 comprende dos dominios catalíticos: el dominio CHAP (aminoácidos 28 a 118 de la SEQ ID NO: 8) y el dominio Amidasa_2 (aminoácidos 203 a 327 de la SEQ ID NO: 8) y un dominio de unión a la pared celular SH3b (SEQ ID NO: 3: aminoácidos 400 a 465 de la SEQ ID NO: 8).

Por tanto, en una realización particular de la proteína quimérica de la invención, la secuencia de aminoácidos del dominio de unión a la pared celular SH3b comprende una secuencia de aminoácidos con una identidad de secuencia de al menos 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 % con la SEQ ID NO: 3.

SEQ ID NO: 3

1 YYMEESARFT NGNQPITVRK VGPFLSCPVG YQFQPGGYCD YTEVMLQDGH VWVGYTWEGQ

61 RYYLPI

La expresión "identidad de secuencia" se ha desvelado previamente en la presente descripción.

En otra realización particular, la segunda secuencia de aminoácidos de la proteína quimérica de la invención comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 4.

SEQ ID NO: 4

1 LLPEDKRLQL KDYFIKQIRA YMDGKIPVAT VSNDSSASSN TVKPVASAWK RNKYGTYYME

61 ESARFTNGNQ PITVRKVGPF LSCPVGYQFQ PGGYCDYTEV MLQDGHVWVG YTWEGQRYYL

121 PIRTWNGSAP PNQILGDLWG EIS

En otra realización particular, la proteína quimérica (ClyRODI-H5) comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 5.

1 MAKTQAEINK RLDAYAKGTV DSPYRIKKAT SYDPSFGVME AGAIDADGYY HAQCQDLITD

61 YVLWLTDNKV RTWGNAKDQI KQSYGTGFKI HENKPSTVPK KGWIAVFTSG SYQQWGHIGI

121 VYDGGNTSTF TILEQNWNGY ANKKPTKRVD NYYGLTHFIE IPVKALLPED KRLQLKDYFI

181 KQIRAYMDGK IPVATVSNDS SASSNTVKPV ASAWKRNKYG TYYMEESARF TNGNQPITVR

241 KVGPFLSCPV GYQFQPGGYC DYTEVMLQDG HVWVGYTWEG QRYYLPIRTW NGSAPPNQIL

301 GDLWGEIS

Como saben bien los expertos en la materia, alterar la estructura primaria de una proteína mediante una sustitución conservadora puede no alterar significativamente la actividad de ese péptido porque la cadena lateral del aminoácido que se inserta en la secuencia puede formar enlaces y contactos similares a los de la cadena lateral del aminoácido que se ha sido sustituido. Las sustituciones no conservadoras son posibles siempre que no interrumpan o interfieran con la función de la proteína quimérica de la invención.

Como se usan en el presente documento, los términos "variante", "análogo" y "derivado" son equivalentes y se refieren a una proteína que comprende al menos un resto de aminoácido alterado por una sustitución, adición, supresión o modificación química de un aminoácido, en comparación con la proteína nativa, pero que muestra siempre la actividad catalítica de la SEQ ID NO: 5 (la proteína quimérica de la invención). Se pueden encontrar ensayos para verificar la función de variantes de la SEQ ID NO: 5 en el ejemplo de la presente descripción, tales como el ensayo de reducción de turbidez y el ensayo de destrucción en función del tiempo. Los derivados peptídicos incluyen, en particular, sustituciones y/o adiciones de aminoácidos con restos de aminoácidos naturales y modificaciones químicas tales como, por ejemplo, modificaciones enzimáticas, presentes normalmente en la naturaleza. Las variantes de proteínas incluyen, en particular, sustituciones y/o adiciones de aminoácidos con restos de aminoácidos no naturales y modificaciones químicas que no ocurren en la naturaleza. En términos generales, serán posibles menos sustituciones no conservadoras sin alterar la actividad biológica de la proteína quimérica de la invención. Por tanto, los mutantes funcionales, las variantes o los derivados de la proteína quimérica mencionada anteriormente también están abarcados por la presente invención. Una proteína determinada se considera una variante de la proteína quimérica de la invención si dicha proteína muestra una identidad de secuencia de, al menos, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 o 99 % con la SEQ ID NO: 5. La expresión "identidad de secuencia" se ha definido anteriormente. Dichos mutantes, variantes o derivados se consideran "funcionales" si conservan las mismas o similares propiedades y/o actividad que la proteína quimérica de la invención descrita en el presente documento. Una variante de la proteína quimérica de la invención se considera funcional cuando el nivel de actividad sea de al menos el 80 %, aún más preferentemente el 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de la de la proteína quimérica. El experto en la materia es capaz de determinar habitualmente dichas propiedades y actividades y se proporcionan ejemplos de dichos métodos en la memoria descriptiva actual y se han mencionado anteriormente.

La primera y la segunda secuencias de aminoácidos de la proteína quimérica de la invención pueden unirse entre sí de manera covalente o no covalente. Las expresiones "unido a", "acoplado a" y "ligado a" se consideran equivalentes y pueden usarse indistintamente a lo largo de la presente descripción.

La expresión "unidas covalentemente entre sí" significa que las dos secuencias de aminoácidos están unidas por un enlace que implica el intercambio de pares de electrones entre átomos, tal como un enlace peptídico. Por el contrario, la expresión "unidos entre sí de forma no covalente" significa que las dos secuencias de aminoácidos están unidas por un enlace que no implica compartir electrones, sino que implica variaciones más dispersas de interacciones electromagnéticas entre moléculas o dentro de una molécula.

Además, la primera y la segunda secuencias de aminoácidos de la proteína quimérica de la invención pueden estar unidas por un conector. Un "conector" o "conector peptídico" se refiere a una secuencia peptídica unida al extremo N o al extremo C de una secuencia polipeptídica. Cualquier grupo "conector" es opcional. Cuando está presente, su estructura química no es crítica, ya que actúa principalmente como espaciador. El enlazador se compone preferentemente de aminoácidos unidos entre sí por enlaces peptídicos. Por tanto, en realizaciones preferidas, el conector se compone de entre 1 y 20 aminoácidos unidos por enlaces peptídicos, en donde los aminoácidos se seleccionan de los 20 aminoácidos naturales. Algunos de estos aminoácidos pueden estar glucosilados, como entienden bien los expertos en la materia. En una realización más preferida, los 1 a 20 aminoácidos se seleccionan entre glicina, alanina, prolina, asparagina, glutamina y lisina. Aún más preferentemente, un conector está compuesto por una mayoría de aminoácidos que no presentan impedimento estérico, tales como glicina y alanina. Para garantizar el plegamiento adecuado de la proteína, estos conectores no deberían contener hélices a truncadas o láminas p.

En una realización particular, la proteína quimérica es preferentemente una proteína soluble.

La proteína quimérica descrita en el presente documento puede conjugarse con una molécula estabilizante. Los ejemplos no limitantes de moléculas estabilizantes incluyen: un polímero (p. ej., un polietilenglicol) o una proteína (p. ej., seroalbúmina, tal como seroalbúmina felina). De manera análoga, la proteína quimérica también se puede conjugar con un marcador (p. ej., un fluoróforo, radioisótopo o molécula luminiscente) o un agente terapéutico (p. ej., un agente citotóxico o un radioisótopo). Los ejemplos no limitantes de agentes que se pueden conjugar o combinar con la proteína quimérica de la invención incluyen, sin limitación: linezolid, eritromicina, mupirocina, ertapenem, doripenem, imipenem, cilastatina, meropenem, cefadroxilo, cefazolina, cefalotina, cefalotina, cefalexina, ceflacor, cefamandol, cefoxitina, cefprozilo, cefuroxima, cefixima, cefdinir, cefditoreno, cefoperazona, cefotaxima, cefpodoxima, ceftazidima, ceftibuteno, ceftizoxima, ceftriaxona, ceftarolina fosamilo, ceftobiprol, teicoplanina, vancomicina, televancina, clindamicina, lincomicina, daptomicina, amoxicilina, ampicilina, azlocilina, carbenicilina, cloxacilina, dicloxacilina, flucloxacilina, mezlocilina, meticilina, nafcilina, oxacilina, penicilina G, penicilina V, piperacilina, penicilina G, temocilina, ticarcilina, bacitracina, colistina, polimixina B, ciprofloxacina, enoxacino, gatifloxacino, gemifloxacino, levofloxacino, lomefloxacino, moxifloxacino, ácido nalidíxico, norfloxacino, ofloxacino, trovafloxacino, grepafloxacino, esparfloxacino, temafloxacino, mafenida, sulfacetamida, sulfadiazina, sulfadiazina de plata, sulfadimetoxina, sulfametizol, sulfametoxazol, sulfanilamida, sulfasalazina, sulfisoxazol, trimetoprim-sulfametoxazol, sulfonamidocrisoidina, desmeclociclina, doxiciclina, minociclina, oxitetraciclina y tetraciclina.

Además, la proteína quimérica de la invención puede diseñarse para aumentar su actividad lítica, su estabilidad a altas temperaturas y su diversidad de hospedadores. Con este fin, la proteína quimérica se puede modificar mediante una técnica denominada "artilización". Esta técnica comprende fusionar al extremo N o C de la proteína quimérica de la invención un péptido catiónico o policatiónico adicional, un péptido anfipático, un péptido sushi, una defensina, un péptido hidrófobo o un péptido antimicrobiano.

El término "péptido", como se usa en el presente documento, se refiere a polipéptidos cortos que consisten en aproximadamente 2 a aproximadamente l0o restos de aminoácidos, más preferentemente de aproximadamente 4 a aproximadamente 50 restos de aminoácidos, más preferentemente de aproximadamente 5 a 30 restos de aminoácidos, en donde el grupo amino de un resto de aminoácido está ligado al grupo carboxilo de otro resto de aminoácido mediante un enlace peptídico. Un péptido puede ser un péptido natural o un péptido diseñado y producido de forma sintética. El péptido puede ser, por ejemplo, procedente o retirado de una proteína nativa por escisión enzimática o química, o pueden prepararse usando técnicas convencionales de síntesis de péptidos (p. ej., síntesis en fase sólida) o técnicas de biología molecular (véase Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)). Son péptidos producidos de forma sintética preferidos, p. ej., catiónicos, péptidos policatiónicos, péptidos anfipáticos y péptidos hidrófobos. Los péptidos naturales preferidos son, p. ej., péptidos anfipáticos, péptidos sushi, defensinas y péptidos antimicrobianos. Los péptidos no tienen actividad degradante de la pared celular o solo la tienen baja, pero pueden tener actividad de alteración de la pared celular. Un péptido en el sentido de la presente invención no se refiere a marcadores His, marcadores de estrep, tiorredoxina o proteínas de unión a maltosa (MBP) o similares, que se usan para purificar o ubicar proteínas.

Como se usa en el presente documento, la expresión "péptido catiónico" se refiere a un péptido que tiene restos de aminoácidos con carga positiva. Preferentemente, un péptido catiónico tiene un valor de pKa de 9,0 o mayor. Normalmente, al menos cuatro de los restos de aminoácidos del péptido catiónico pueden tener carga positiva, por ejemplo, lisina o arginina. "Con carga positiva" se refiere a las cadenas laterales de los restos de aminoácidos que tienen una carga positiva neta en condiciones aproximadamente fisiológicas. La expresión "péptido catiónico", como se usa en el presente documento, se refiere también a péptidos policatiónicos. Los ejemplos de péptidos policatiónicos incluyen, sin limitación, un péptido desestabilizante de LPS (Briers, Y., et al. 2014. mBio, 5 (4): e01379-14; Germans et al. 2016. Biochem.Soc.Trans. 44: 123-128) y péptido mieloide de oveja de 29 aminoácidos (SMAP-29) (Skerlavaj B, et al. 1999. FEBS Lett. 46: 58-62).

La expresión "péptido policatiónico", como se usa en el presente documento, se refiere a un péptido diseñado y producido sintéticamente compuesto principalmente de restos de aminoácidos con carga positiva, en particular restos de lisina, arginina y/o histidina, más preferentemente restos de lisina y/o arginina. Un péptido se compone principalmente de restos de aminoácidos con carga positiva si al menos aproximadamente el 20, 30, 40, 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o aproximadamente el 100 % de los restos de aminoácidos son restos de aminoácidos con carga positiva, en particular restos de lisina y/o arginina.

La expresión, "péptido antimicrobiano" (AMP), como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier péptido natural que tenga actividad microbicida y/o microbiostática, por ejemplo, en bacterias, virus, hongos, levaduras, micoplasmas y protozoos. Por tanto, la expresión "péptido antimicrobiano", como se usa en el presente documento, se refiere en particular a cualquier péptido que tenga propiedades antibacterianas, antifúngicas, antimicóticas, antiparasitarias, antiprotozoarias, antivíricas, antiinfecciosas, contra infecciones y/o germicidas, algicidas, amebicidas, microbicidas, bactericidas, fungicidas, parasiticidas, protozoácidas, protozoicidas. El péptido antimicrobiano puede ser un miembro de la superfamilia de RNasa A, una defensina, catelicidina, granulisina, histatina, psoriasina, dermicidina o hepcidina. El péptido antimicrobiano puede ser de origen natural en insectos, peces, plantas, arácnidos, vertebrados o mamíferos. Preferentemente, el péptido antimicrobiano puede ser de origen natural en insectos, peces, plantas, arácnidos, vertebrados o mamíferos. Preferentemente, el péptido antimicrobiano puede ser de origen natural en rábano, polilla de seda, licósido, rana, preferentemente en Xenopus laevis, ranas del género Rana, más preferentemente en Rana catesbeiana, sapo, preferentemente sapo asiático Bufo bufo gargarizans, mosca, preferentemente en Drosophila, más preferentemente en Drosophila melanogaster, en Aedes aegypti, en abeja melífera, abejorro, preferentemente en Bombus pascuorum, mosca de la carne, preferentemente en Sarcophaga peregrine, escorpión, cangrejo cacerola, bagre, preferentemente en Parasilurus asotus, vaca, cerdo, oveja, porcino, bovino, mono y ser humano. La expresión "péptido sushi", como se usa en el presente documento, se refiere a proteínas de control del complemento (CCP) que tienen repeticiones de consenso cortas. El módulo sushi de los péptidos sushi actúa como un dominio de interacción de proteína-proteína en muchas proteínas diferentes. Se ha mostrado que los péptidos que contienen un dominio Sushi tienen actividades antimicrobianas. Preferentemente, los péptidos sushi son péptidos naturales.

La expresión "péptido anfipático", como se usa en el presente documento, se refiere a péptidos sintéticos que tienen grupos funcionales tanto hidrófilos como hidrófobos. Preferentemente, la expresión "péptido anfipático", como se usa en el presente documento, se refiere a un péptido que tiene una disposición definida de grupos hidrófilos e hidrófobos, p. ej., los péptidos anfipáticos pueden ser, p. ej., a helicoidales, que tienen predominantemente cadenas laterales no polares a lo largo de un lado de la hélice y restos polares a lo largo del resto de su superficie.

La expresión "grupo hidrófobo", como se usa en el presente documento, se refiere a grupos químicos tales como cadenas laterales de aminoácidos que son sustancialmente insolubles en agua, pero solubles en una fase oleosa, siendo la solubilidad en la fase oleosa mayor que en agua o en una fase acuosa. En el agua, los restos de aminoácidos que tienen una cadena lateral hidrófoba interactúan entre sí para generar un entorno no acuoso. Son ejemplos de restos de aminoácidos con cadenas laterales hidrófobas restos de valina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, triptófano, cisteína, alanina, tirosina, histidina, treonina, serina, prolina y glicina.

En otro aspecto, la invención se refiere a un polinucleótido aislado, en lo sucesivo en el presente documento "polinucleótido de la invención", que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína quimérica de la invención. Por tanto, el polinucleótido de la invención es la secuencia codificante de la proteína quimérica de la invención. La expresión "secuencia codificante" significa un polinucleótido que especifica directamente la secuencia de aminoácidos de una proteína. Los límites de la secuencia codificante están determinados en general por un marco abierto de lectura, que habitualmente comienza con el codón de inicio ATG o codones de inicio alternativos tales como GTG y TTG y termina con un codón de terminación tal como TAA, TAG y TGA. La secuencia codificante puede ser un ADN, ADNc, polinucleótido sintético o recombinante.

Para expresar el polinucleótido que codifica la proteína quimérica de la invención, la secuencia de nucleótidos tiene que introducirse en un sistema de expresión tal como una célula hospedadora. Por tanto, la secuencia de nucleótidos puede optimizarse para una expresión adecuada en la célula hospedadora elegida. En la presente invención, la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína quimérica de la invención está optimizada para su expresión en Escherichia coli. Por tanto, en una realización particular, el polinucleótido de la invención comprende la secuencia SEQ ID NO: 6.

SEQ ID NO: 6

1 AAAACCCAGG CGGAGATCAA CAAGCGTCTG GACGCGTACG CGAAAGGTAC CGTGGATAGC

61 CCGTACCGTA TTAAGAAAGC GACCAGCTAT GATCCGAGCT TCGGTGTTAT GGAAGCGGGC

121 GCGATCGACG CGGATGGTTA CTATCACGCG CAGTGCCAAG ACCTGATTAC CGATTACGTG

181 CTGTGGCTGA CCGACAACAA GGTTCGTACC TGGGGCAACG CGAAAGATCA GATCAAGCAA

241 AGCTATGGTA CCGGCTTCAA AATTCACGAG AACAAGCCGA GCACCGTGCC GAAGAAAGGT

3 01 TGGATCGCGG TTTTTACCAG qqqCAGCTAC CAGCAATGGG GCCACATCGG TATTGTGTAT

361 GATGGTGGCA ACACCAGCAC CTTCACCATT CTGGAACAGA ACTGGAACGG TTACGCGAAC

421 AAGAAACCGA CCAAACGTGT TGACAACTAC TATGGTCTGA CCCACTTTAT CGAGATTCCG

481 GTGAAGGCGC TGCTGCCGGA AGATAAACGC CTGCAGCTGA AGGACTATTT TATTAAACAA

541 ATCCGTGCGT ACATGGATGG CAAGATTCCG GTCGCGACCG TGTCAAACGA CAGTTCCGCC

601 TCATCGAATA CGGTTAAACC GGTCGCCTCG GCATGGAAAC GCAATAAGTA TGGTACCTAT

661 TACATGGAAG AAAGCGCCCG TTTTACCAAC GGCAATCAGC CGATCACGGT GCGCAAAGTT

721 GGTCCGTTTC TGAGCTGCCC GGTCGGCTAT CAGTTCCAAC CGGGTGGCTA TTGTGATTAC

781 ACCGAAGTGA TGCTGCAGGA CGGCCATGTT TGGGTCGGTT ACACGTGGGA AGGCCAGCGT

841 TATTACCTGC CGATTCGCAC CTGGAATGGC TCCGCTCCGC CGAATCAAAT CCTGGGTGAC

901 CTGTGGGGTG AA

El polinucleótido de la invención se puede insertar en una construcción de ácido nucleico. La expresión "construcción de ácido nucleico" significa una molécula de ácido nucleico, monocatenaria o bicatenaria, que se aísla de un gen de origen natural o se modifica para contener segmentos de ácidos nucleicos de una manera que de otro modo no existiría en la naturaleza o que es sintética. La expresión construcción de ácido nucleico es sinónima de la expresión "casete de expresión" cuando la construcción de ácido nucleico contiene secuencias de control necesarias para la expresión del polinucleótido de la invención.

La expresión "secuencias de control" significa todos los componentes necesarios para la expresión de un polinucleótido que codifica un polipéptido o una proteína, y que se colocan en una posición adecuada con respecto a la secuencia codificante de un polinucleótido de manera que la secuencia de control dirige la expresión del polinucleótido. El término "expresión" incluye cualquier etapa implicada en la producción de la proteína quimérica de la invención incluyendo, pero sin limitación, transcripción, modificación postranscripcional, traducción, modificación postraduccional y secreción.

Cada secuencia de control puede ser nativa o ajena al polinucleótido de la invención o nativa o ajena entre sí. Dichas secuencias de control incluyen, pero sin limitación, un líder, una secuencia de poliadenilación, una secuencia de propéptido, promotor, una secuencia de péptido señal y un terminador de la transcripción. Como mínimo, las secuencias de control incluyen un promotor y señales de terminación de la transcripción y la traducción. Las secuencias de control pueden estar provistas de conectores con el fin de introducir sitios de restricción específicos que faciliten el ligamiento de las secuencias de control con la región codificante del polinucleótido de la invención. La secuencia de control puede ser una secuencia promotora adecuada, es decir, una secuencia de nucleótidos que es reconocida por una célula hospedadora para la expresión del polinucleótido de la invención. Un "promotor", como se usa en el presente documento, se refiere a una secuencia de nucleótidos que dirige la transcripción de un gen o una secuencia codificante a la que está unido operativamente.

"Unido operativamente" se refiere a una disposición de dos o más componentes, en donde los componentes así descritos están en una relación que les permite actuar de manera coordinada. A modo de ilustración, una secuencia reguladora de la transcripción o un promotor se une operativamente a una secuencia codificante si la secuencia reguladora de la transcripción o el promotor facilita algún aspecto de la transcripción de la secuencia codificante. Los aspectos del proceso de transcripción incluyen, pero sin limitación, inicio, alargamiento, atenuación y terminación. Una secuencia reguladora de la transcripción unida operativamente se une, en general, en cis con la secuencia codificante, pero no está necesariamente directamente adyacente a ella. La secuencia promotora contiene secuencias de control de la transcripción que median en la expresión del polipéptido. El promotor puede ser cualquier secuencia de nucleótidos que muestre actividad transcripcional en la célula hospedadora elegida, incluyendo promotores mutantes, truncados e híbridos, y puede obtenerse a partir de genes que codifican polipéptidos extracelulares o intracelulares, bien homólogos o heterólogos de la célula hospedadora.

Los ejemplos de promotores adecuados para dirigir la transcripción del polinucleótido de la presente invención en una célula hospedadora bacteriana incluyen, sin limitación, los promotores obtenidos del fago T7, el operón lac de E. coli, el gen de la agarasa de Streptomyces coelicolor (dagA), el gen de la levansucrasa de Bacillus subtilis (sacB), el gen de la a-amilasa de Bacillus licheniformis (amyL), el gen de la amilasa maltogénica de Bacillus stearothermophilus (amyM), el gen de la a-amilasa de Bacillus amyloliquefaciens (amyQ), el gen de la penicilinasa de Bacillus licheniformis (penP), los genes xylA y xylB de Bacillus subtilis y el gen de la betalactamasa procariótica, así como el promotor tac. En una realización particular, el promotor es el promotor 7 del operón pfl de E. coli.

Los ejemplos de promotores adecuados para dirigir la transcripción de las construcciones de ácido nucleico en una célula hospedadora fúngica filamentosa incluyen, sin limitación, promotores obtenidos de los genes para acetamidasa de Aspergillus nidulans, a-amilasa neutra de Aspergillus niger, a-amilasa estable frente a ácidos de A. niger, glucoamilasa de A. niger o Aspergillus awamori (glaA), amilasa TAKA de A. oryzae, proteasa alcalina de A. oryzae, triosa fosfato isomerasa de A. oryzae, proteasa de tipo tripsina de Fusarium oxysporum, amiloglucosidasa de Fusarium venenatum, Daria de Fusarium venenatum, Quinn de Fusarium venenatum, lipasa de Rhizomucor miehei, proteinasa aspártica de R. miehei, p-glucosidasa de Trichoderma reesei, celobiohidrolasa I de T. reesei, celobiohidrolasa II de T. reesei, endoglucanasa I de T. reesei, endoglucanasa II de T. reesei, endoglucanasa III de T. reesei, endoglucanasa IV de T. reesei, endoglucanasa V de T. reesei, xilanasa I de T. reesei, xilanasa II de T. reesei, p-xilosidasa de T. reesei, así como el promotor NA2-tpi (un promotor modificado de un gen que codifica una a-amilasa neutra en Aspergillus en el que el líder no traducido se ha reemplazado con un líder no traducido de un gen que codifica la triosa fosfato isomerasa en Aspergillus; los ejemplos no limitantes incluyen promotores modificados del gen que codifica la a-amilasa neutra en A. niger en el que el líder no traducido se ha reemplazado con un líder no traducido del gen que codifica la triosa fosfato isomerasa en A. nidulans o A. oryzae); y promotores mutantes, truncados e híbridos de los mismos.

En un hospedador de levadura, se obtienen promotores útiles de, sin limitación, los genes de enolasa de S. cerevisiae (ENO-1), galactocinasa de S. cerevisiae (GAL1), alcohol deshidrogenasa/gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa de Saccharomyces cerevisiae (ADH1, ADH2/GAP), triosa fosfato isomerasa de S. cerevisiae (TPI), metalotioneína de S. cerevisiae (CUP1) y 3-fosfoglicerato cinasa de S. cerevisiae.

Los ejemplos de promotores adecuados para dirigir la transcripción del polinucleótido de la invención en una célula hospedadora de mamífero incluyen, sin limitación, promotor de SV40 (Mulligan, et al., Nature 277: 108-14 (1979)), promotor de MMLV-LTR, promotor de EF1a (Mulligan, et al., Nucleic Acids Res 18: 5322 (1990)) o promotor de CMV.

Los ejemplos de promotores adecuados para dirigir la transcripción del polinucleótido de la invención en una célula hospedadora vegetal incluyen, sin limitación, el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV) o su versión mejorada, el promotor 3mas híbrido (ocs), el promotor de la ubiquitina de maíz, promotor de A. thaliana y el promotor de RAmy3D de a-amilasa de arroz que es inducido por la privación de azúcar.

La secuencia de control también puede ser una secuencia terminadora de la transcripción adecuada, una secuencia reconocida por una célula hospedadora para terminar la transcripción. La secuencia terminadora está unida operativamente al extremo 3' de la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína quimérica de la invención. En la presente invención se puede usar cualquier terminador que sea funcional en la célula hospedadora elegida.

Terminadores para células hospedadoras de hongos filamentosos, incluidos, sin limitación, terminadores obtenidos de los genes para antranilato sintasa de Aspergillus nidulans, glucoamilasa de Aspergillus niger, a-glucosidasa de A. niger, TAKA amilasa de Aspergillus oryzae y proteasa de tipo tripsina de Fusarium oxysporum.

Terminadores para células hospedadoras de levadura incluidos, sin limitación, terminadores obtenidos de los genes para enolasa de Saccharomyces cerevisiae, citocromo C (CYC1) de Saccharomyces cerevisiae y gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa de Saccharomyces cerevisiae.

La secuencia de control también puede ser una secuencia líder adecuada, una región no traducida de un ARNm que es importante para la traducción por parte de la célula hospedadora. La secuencia líder está unida operativamente al extremo 5' de la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína quimérica. En la presente invención, se puede usar cualquier secuencia líder que sea funcional en la célula hospedadora elegida.

La secuencia de control también puede ser una secuencia de poliadenilación, una secuencia unida operativamente al extremo 3' de la secuencia de nucleótidos y, cuando se transcribe, es reconocida por la célula hospedadora como una señal para añadir restos de poliadenosina al ARNm transcrito. En la presente invención, se puede usar cualquier secuencia de poliadenilación que sea funcional en la célula hospedadora elegida.

La secuencia de control también puede ser una región codificante del péptido señal que codifica un péptido señal unido al extremo N de un polipéptido y dirige el polipéptido hacia la ruta secretora de la célula. El extremo 5' de la secuencia codificante del polinucleótido puede contener de manera inherente una secuencia codificante del péptido señal unida de manera natural en el marco de lectura de traducción con el segmento de la secuencia codificante que codifica el polipéptido. Como alternativa, el extremo 5' de la secuencia codificante puede contener una secuencia codificante del péptido señal que es extraña a la secuencia codificante. Puede ser necesaria una secuencia codificante del péptido señal extraño cuando la secuencia codificante no contiene de manera natural una secuencia codificante del péptido señal. Se puede usar cualquier secuencia codificante del péptido señal que dirija la proteína quimérica expresada a la ruta secretora de una célula hospedadora elegida.

También puede ser deseable añadir secuencias reguladoras que permitan la regulación de la expresión del polinucleótido en relación con el crecimiento de la célula hospedadora. Son ejemplos de sistemas reguladores los que causan que la expresión del gen se active o desactive en respuesta a un estímulo químico o físico, incluida la presencia de un compuesto regulador. Los sistemas reguladores en los sistemas procarióticos incluyen los sistemas de operador lac, tac y trp. En levaduras, se puede usar el sistema ADH2 o el sistema GAL1. En hongos filamentosos, pueden usarse el promotor de la glucoamilasa de Aspergillus niger, el promotor de la alfa-amilasa TAKA de Aspergillus oryzae y el promotor de la glucoamilasa de Aspergillus oryzae. Otros ejemplos de secuencias reguladoras son las que permiten la amplificación génica. En los sistemas eucariotas, estas secuencias reguladoras incluyen el gen de la dihidrofolato reductasa que se amplifica en presencia de metotrexato y los genes de metalotioneína que se amplifican con metales pesados. En estos casos, el polinucleótido que codifica la proteína quimérica estaría unido operativamente a la secuencia reguladora.

Los diversos ácidos nucleicos y secuencias de control descritos en el presente documento pueden unirse para construir un vector de expresión recombinante que puede incluir uno o más (varios) sitios de restricción convenientes para permitir la inserción o sustitución del polinucleótido de la invención que codifica la proteína quimérica de la invención. Por consiguiente, el polinucleótido de la invención puede comprender sitios de restricción enzimática en los extremos de la secuencia de nucleótidos que permitan su inserción en un vector adecuado. En una realización particular, el polinucleótido de la invención comprende un sitio de restricción en el extremo 5' correspondiente a la enzima de restricción Ndel y/o un sitio de restricción en el extremo 3' de la secuencia de nucleótidos correspondiente a la enzima de restricción Xhol. Por tanto, en una realización más particular, el polinucleótido de la invención comprende la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 7.

SEQ ID NO: 7 (los sitios de restricción se muestran subrayados)

1 ATGGCGAAAACCCAGGCGGAGATCAACAAG CGTCTGGACG CGTACGCGAA AGGTACCGTG

61 GATAGCCCGTACCGTATTAAGAAAGCGACC AGCTATGATC CGAGCTTCGG TGTTATGGAA

121 GCGGGCGCGA TCGACGCGGATGGTTACTAT CACGCGCAGT GCCAAGACCT GATTACCGAT

181 TACGTGCTGT GGCTGACCGACAACAAGGTT CGTACCTGGG GCAACGCGAA AGATCAGATC

241 AAGCAAAGCTATGGTACCGGCTTCAAAATT CACGAGAACA AGCCGAGCAC CGTGCCGAAG

301 AAAGGTTGGA TCGCGGTTTTTACCAGCGGC AGCTACCAGC AATGGGGCCACATCGGTATT

361 GTGTATGATG GTGGCAACACCAGCACCTTC ACCATTCTGG AACAGAACTGGAACGGTTAC

421 GCGAACAAGAAACCGACCAAACGTGTTGAC AACTACTATG GTCTGACCCA CTTTATCGAG

481 ATTCCGGTGAAGGCGCTGCTGCCGGAAGAT AAACGCCTGC AGCTGAAGGACTATTTTATT

541 AAACAAATCC GTGCGTACATGGATGGCAAG ATTCCGGTCG CGACCGTGTC AAACGACAGT

601 TCCGCCTCAT CGAATACGGTTAAACCGGTC GCCTCGGCAT GGAAACGCAA TAAGTATGGT

661 ACCTATTACA TGGAAGAAAGCGCCCGTTTT ACCAACGGCA ATCAGCCGAT CACGGTGCGC

721 AAAGTTGGTC CGTTTCTGAGCTGCCCGGTC GGCTATCAGT TCCAACCGGG TGGCTATTGT

781 GATTACACCG AAGTGATGCTGCAGGACGGC CATGTTTGGG TCGGTTACAC GTGGGAAGGC

841 CAGCGTTATT ACCTGCCGATTCGCACCTGG AATGGCTCCG CTCCGCCGAA TCAAATCCTG

901 GGTGACCTGT GGGGTGAAATCAGC

Una secuencia polinucleotídica puede expresarse mediante la inserción de la secuencia de nucleótidos o una construcción de ácido nucleico que comprende la secuencia en un vector adecuado para la expresión. Al crear el vector de expresión, la secuencia codificante se ubica en el vector de manera que la secuencia codificante esté unida operativamente a las secuencias de control adecuadas para la expresión. La expresión "unido operativamente" se ha definido anteriormente en la presente descripción.

La manipulación de la secuencia del polinucleótido antes de su inserción en un vector puede ser deseable o necesaria dependiendo del vector de expresión. Las técnicas para la modificación de secuencias polinucleotídicas utilizando métodos de ADN recombinante son bien conocidas en la materia. Por tanto, en otro aspecto, la presente invención se refiere a un vector, en lo sucesivo en el presente documento "vector de la invención", que comprende el polinucleótido de la invención. Preferentemente, el vector es un vector de expresión. La expresión "vector de expresión" significa una molécula de ADN lineal o circular que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido y está unido operativamente a nucleótidos adicionales (secuencias de control) que posibilitan su expresión. La expresión "unido operativamente" se ha definido anteriormente.

El vector de expresión recombinante puede ser cualquier vector (p. ej., un plásmido o virus) que pueda someterse convenientemente a procedimientos de ADN recombinante y pueda provocar la expresión de la secuencia de nucleótidos. La elección del vector normalmente dependerá de la compatibilidad del vector con la célula hospedadora en la que ha de introducirse el vector. Los vectores pueden ser plásmidos lineales o circulares cerrados.

Los ejemplos de vectores de bacterias incluyen, sin limitación, pUB110 (Muller et al. 1986, Mol.Gen.Genet, 202: 169­ 171), ColE1 (Chan et al. 1985. J. Biol. Chem. 260: 8925-8935), Ip25 (Casjens et al. 2000. Mol.Microbiol. 35: 490-516), pNOB8 (She et al. 1998. Extremophiles, 2: 417-425), F (Frost et al. 1994. Microbiol.Rev., 58: 162-210), SCP1 (Yamasaki, et al. 2000. J. Bacteriol., 182: 3140-3110) y pSymA (Barnett et al. 2001. Proc. NatI.Acad.Sci.USA, 98: 9883-9888), pUC18 y pUC19 (NEB), vector pBluescript (Stratagene), vectores pACYC (NEB), Supercos (Stratagen), EMBL3 (Promega), AZAP (Stratagene) y pBeloBAC11 (NEB).

Los ejemplos de vectores de E. coli incluyen, sin limitación, pGEX (Amershan Biosciences), pEZZ (Amershan Biosciences), serie pPRO (BD Biosciences Clontech), serie pHAT (BD Biosciences Clontech), serie pBAD (Invitrogen), pBAD/gIII A, B, C (Invitrogen), pBAD/Thio-TOPO (Invitrogen), pThioHis A, B, C (Invitrogen), pLEX (invitrogen), Gateway pDEST (Invitrogen), pRSET A, B, C (Invitrogen), pCR-T7-TOPO (Invitrogen), pTreHis TOPO (Invitrogen), pTreHiS A, B, C (Invitrogen), serie lmpact™CN (New England BioLabs), serie pMALTM (New England BioLabs), serie pET (Novagen), PinPointTM (Promega), pGEMEX (Promega), serie pQE (Qiagen), pHB6 (Roche), pVB6 (Roche), pXB (Roche), pBX (Roche), pBH (Roche), pBv (Roche), pFLAG (Sigma) y serie pCAL (Stratagene). En una realización particular, el vector de expresión es pET21a (EMD Biosciences; vector de expresión bacteriano con promotor T7 lac, añade un marcador epitópico de T7 N-terminal y marcador de His C-terminal; resistencia de amp; clonación de enzimas de restricción) y vectores derivados de pNIC28-Bsa4. En otra realización particular, el vector es PUC57 (GenScript, Township, NJ, Estados Unidos).

Otros vectores útiles incluyen, sin limitación, vectores de expresión procedentes de células de mamíferos (p. ej., pcDNA3 (Invitrogen) y pEGF-BOS (Mizushima S., Nucleic Acids Res 18 (17): 5322 (1990)), pEF, pCDM8), vectores de expresión procedentes de células de insectos (p. ej., "Sistema de expresión de vaculovirus Bac-to-BAC" (GIBCO BRL), pBacPAK8), vectores de expresión procedentes de plantas (p. ej., pMH1, pMH2), vectores de expresión procedentes de virus animales (p. ej., pHSV, pMV, pAdexLcw), vectores de expresión procedentes de retrovirus (p. ej., pZlpneo), vectores de expresión procedentes de levadura (p. ej., "kit de expresión de Pichia" (Invitrogen), pNV11, SP-Q01) y vectores de expresión procedentes de Bacillus subtilis (p. ej., pPL608, pKTH50). Los ejemplos de vectores para expresar un polinucleótido en células animales, tales como células CHO, células COS o células NIH3T3, incluyen, sin limitación, pMAM, pDR2, pBK-RSV, pBK-CMV, pOPRSV o pOP13. Los ejemplos de vectores para expresar un polinucleótido en células vegetales incluyen, sin limitación, plásmido Ti de Agrobacterium tumefaciens y vectores Ti binarios. Los ejemplos de los vectores de expresión de virus incluyen, sin limitación, hospedadores atenuados de virus, tales como la viruela bovina o la viruela aviar, bacilo de Calmette-Guerin (BCG), vectores de adenovirus y vectores de virus adenoasociados, vectores de retrovirus, vectores de Salmonella typhi o vectores de toxina de carbunco destoxificados.

El vector puede ser un vector de replicación autónoma, es decir, un vector que existe como una entidad extracromosómica, cuya replicación es independiente de la replicación cromosómica, p. ej., un plásmido, un elemento extracromosómico, un minicromosoma o un cromosoma artificial. El vector puede contener cualquier medio para garantizar la autorreplicación. Como alternativa, el vector puede ser uno que, cuando se introduzca en la célula hospedadora, se integre en el genoma y se replique junto con el cromosoma o cromosomas en los que se ha integrado. Asimismo, se pueden usar un único vector o plásmido o dos o más vectores o plásmidos que contengan juntos el ADN total que se va a introducir en el genoma de la célula hospedadora o un transposón.

El vector contiene preferentemente uno o más (varios) marcadores seleccionables que permiten la selección fácil de células transformadas, transfectadas, transducidas o similares. Un marcador seleccionable es un gen cuyo producto proporciona resistencia a biocidas o vírica, resistencia a metales pesados, prototrofia a auxótrofos y similares.

Son ejemplos de marcadores bacterianos seleccionables los genes dal de Bacillus subtilis o Bacillus licheniformis, o marcadores que confieren resistencia a antibióticos tal como resistencia a ampicilina, kanamicina, cloranfenicol o tetraciclina. Son marcadores adecuados para células hospedadoras de levadura ADE2, HIS3, LEU2, LYS2, MET3, TRP1 y URA3. Los marcadores seleccionables para su uso en una célula hospedadora de hongo filamentoso incluyen, pero sin limitación, amdS (acetamidasa), argB (ornitina carbamoiltransferasa), bar (fosfinotricina acetiltransferasa), hph (higromicina fosfotransferasa), niaD (nitrato reductasa), pyrG (orotidin-5'-fosfato descarboxilasa), sC (sulfato adeniltransferasa) y trpC (antranilato sintasa), así como equivalentes de los mismos.

Los vectores preferentemente contienen un elemento o elementos que permiten la integración del vector en el genoma de la célula hospedadora o la replicación autónoma del vector en la célula independiente del genoma.

Para la integración en el genoma de la célula hospedadora, el vector puede basarse en la secuencia del polinucleótido que codifica la proteína quimérica o cualquier otro elemento del vector para su integración en el genoma mediante recombinación homóloga o no homóloga. Como alternativa, el vector puede contener secuencias de nucleótidos adicionales para dirigir la integración mediante recombinación homóloga en el genoma de la célula hospedadora en una ubicación o ubicaciones precisas en el cromosoma o cromosomas. Los elementos de integración pueden ser cualquier secuencia que sea homóloga con la secuencia diana en el genoma de la célula hospedadora. Asimismo, los elementos de integración pueden ser secuencias de nucleótidos codificantes o no codificantes. Por otro lado, el vector puede integrarse en el genoma de la célula hospedadora mediante recombinación no homóloga.

Para la replicación autónoma, el vector puede comprender adicionalmente un origen de replicación que permita al vector replicarse de manera autónoma en la célula hospedadora en cuestión. El origen de replicación puede ser cualquier replicador plasmídico que medie la replicación autónoma que actúa en una célula. La expresión "origen de replicación" o "replicador plasmídico" se define en el presente documento como una secuencia de nucleótidos que permite que un plásmido o vector se replique in vivo.

Son ejemplos de orígenes bacterianos de replicación los orígenes de replicación de los plásmidos pBR322, pUC19, pACYC177 y pACYC184, que permiten la replicación en E. coli, y pUB1 10, pE194, pTA1060 y pAMpI que permiten la replicación en Bacillus.

Son ejemplos de orígenes de replicación para su uso en una célula hospedadora de levadura el origen de replicación de 2 micrómetros, ARS1, ARS4, la combinación de ARS1 y CEN3 y la combinación de ARS4 y CEN6.

Son ejemplos de orígenes de replicación útiles en una célula de hongo filamentoso AMA1 y ANSI (Gems et al., 1991, Gene 98: 61-67; Cullen et al., 1987, Nucleic Acids Research 15: 9163-9175; documento WO 00/24883). El aislamiento del gen de AMA1 y la construcción de plásmidos o vectores que comprenden el gen puede lograrse según los métodos desvelados en el documento WO 00/24883.

Se puede insertar más de una copia de un polinucleótido en una célula hospedadora para aumentar la producción del producto génico. Se puede obtener un aumento del número de copias del polinucleótido mediante la integración de al menos una copia adicional de la secuencia en el genoma de la célula hospedadora o mediante la inclusión de un gen marcador seleccionable amplificable con el polinucleótido donde las células que contienen copias amplificadas del gen marcador seleccionable y, por lo tanto, copias adicionales del polinucleótido, se pueden seleccionar mediante el cultivo de las células en presencia del agente seleccionable adecuado.

Los procedimientos usados para ligar los elementos descritos anteriormente para construir los vectores de expresión recombinantes son bien conocidos para un experto en la materia.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a una célula hospedadora, en lo sucesivo en el presente documento "célula de la invención", que comprende la proteína quimérica, el polinucleótido y/o el vector de la invención.

La expresión "célula hospedadora" significa cualquier tipo de célula que sea susceptible de transformación, transfección, transducción y similares con una construcción de ácido nucleico o vector de expresión que comprende un polinucleótido de la presente invención.

La presente invención también se refiere a células hospedadoras recombinantes, que comprenden el polinucleótido aislado de la invención, que se usan ventajosamente en la producción recombinante de la proteína quimérica. Se introduce un vector en una célula hospedadora de modo que el vector se mantenga como un integrante cromosómico o como un vector extracromosómico autorreplicante como se ha descrito anteriormente. La expresión "célula hospedadora" abarca cualquier descendencia de una célula precursora que no sea idéntica a la célula precursora debido a mutaciones que se producen durante la replicación.

La célula hospedadora puede ser cualquier célula útil en la producción recombinante de un polipéptido de la presente invención, p. ej., una procariota o eucariota tal como una célula de mamífero, insecto, vegetal o fúngica.

La célula hospedadora procariota puede ser cualquier bacteria grampositiva o una bacteria gramnegativa. Las bacterias grampositivas incluyen, pero sin limitación, Bacillus, Streptococcus, Streptomyces, Staphylococcus, Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Clostridium, Geobacillus y Oceanobacillus. Las bacterias gramnegativas incluyen, pero sin limitación, E. coli, Pseudomonas, Salmonella, Campylobacter, Helicobacter, Flavobacterium, Fusobacterium, IIyobacter, Neisseria y Ureaplasma. En una realización particular, la célula hospedadora es E. coli. Los ejemplos de cepas de E. coli útiles para la propagación de vectores y los procedimientos de clonación incluyen, sin limitación, DH10B (Invitrogen), DH5a (ATCC, Invitrogene), DM1 (Invitrogen), GeneHogs (Invitrogen), HB101 (Bio-Rad, Invitrogene, Promega), INV110 (Invitrogen), JM109 (a Tc C, Promega), JS5 (Bio-Rad), LE392 (ATCC), n M522 (AS), SCS110 (Stratagene), STBL4 (Invitrogen), SURE (ATCC, Stratagene), TG1 (Stratagene), XL10-Gold (Stratagene) y XL1-Blue MRF (Stratagene). En una realización particular, la cepa de E. coli para la clonación y el almacenamiento es E. coli DH10B. En otra realización particular, la cepa de E. coli para expresar el polinucleótido de la invención es E. coli BL21 (DE3) (EMD Biosciences, San Diego, CA).

Los ejemplos de las células hospedadoras de hongos incluyen, sin limitación, célula de Aspergillus (p. ej., célula de Aspergillus awamori, Aspergillus fumigatus, Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger o Aspergillus oryzae), Aureobasidium, Bjerkandera, Ceriporiopsis (p. ej., Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis caregiea, Ceriporiopsis gilvescens, Ceriporiopsis pannocinta, Ceriporiopsis rivulosa, Ceriporiopsis subrufa, Ceriporiopsis subvermispora), Chrysosporium (p. ej., Chrysosporium keratinophilum, Chrysosporium lucknowense, Chrysosporium tropicum, Chrysosporium merdarium, Chrysosporium inops, Chrysosporium pannicola, Chrysosporium queenslandicum, Chrysosporium zonatum), Coprinus (p. ej., Coprinus cinereus), Coriolus (p. ej., Coriolus hirsutus), Cryptococcus, Filibasidium, Fusarium (p. ej., célula de Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides o Fusarium venenatum), Humicola (p. ej., Humicola insolens, Humicola lanuginosa), Magnaporthe, Mucor (p. ej., Mucor miehei), Myceliophthora (p. ej., Myceliophthora thermophila), Neocallimastix, Neurospora (p. ej., Neurospora crassa), Paecilomyces, Penicillium (p. ej., Penicillium purpurogenum) Phanerochaete (p. ej., Phanerochaete chrysosporium), Phlebia (p. ej., Phlebia radiata), Piromyces, Pleurotus (p. ej., Pleurotus eryngii), Schizophyllum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia (p. ej., Thielavia terrestris), Tolypocladium, Trametes (p. ej., Trametes villosa o Trametes versicolor) o Trichoderma (p. ej., célula de Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei o Trichoderma viride).

La célula hospedadora también puede ser una célula de levadura. "Levadura", como se usa en el presente documento, incluye levadura ascoesporógena (Endomycetales), levadura basidioesporógena y levadura que pertenece a los hongos imperfectos (Blastomicetos). Más preferentemente, la célula hospedadora de levadura es una célula de Candida, Hansenula, Kluyveromyces (p. ej., Kluyveromyces lactis), Pichia (p. ej., Pichia pastoris), Saccharomyces (p. ej., Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis o Saccharomyces oviformis, etc.), Schizosaccharomyces o Yarrowia (Yarrowia lipolytica).

La célula hospedadora también puede ser una microalga. Los ejemplos de microalgas incluyen, sin limitación, microalgas de los géneros Chlamydomonas (p. ej., Chlamydomonas reinhardtii), Botryococcus, Neochloris, Nannocloropsis, Phorphyridium, Scenedesmus, Chlorella, Tetraselmis y Spirulina. El cloroplasto de estas algas es particularmente adecuado para la producción de proteínas bacterianas, ya que imita el entorno de expresión bacteriano nativo de estas proteínas y al mismo tiempo carece de su diana de pared celular.

La célula hospedadora también puede ser una célula vegetal, en donde se usa la deposición vacuolar de proteínas recombinantes en órganos vegetativos de plantas para aumentar los rendimientos. Para lograr esto, el polinucleótido de la invención puede fusionarse con señales de clasificación vacuolar específicas de secuencia (ssVSS) típicas de proteasas o inhibidores de proteinasa y/o Ct-VSS representativas de proteínas de almacenamiento o lectinas vegetales. Ambos tipos de motivos fueron capaces de aumentar la acumulación. Es importante destacar que el tipo de VSS o la posición, ya sea el extremo N o C, no alteró la estabilidad de la proteína, los niveles o las modificaciones postraduccionales. Los ejemplos de células vegetales incluyen, sin limitación, Nicotiana sp. (p. ej., N. tabacum, N. benthamiana, etc.) caña de azúcar, tomate (Solanum lycopersicum) y zanahoria (Daucus carota).

La introducción de ADN en una célula puede, por ejemplo, efectuarse mediante transformación de protoplastos, mediante el uso de células competentes, mediante electroporación o mediante conjugación. Puede usarse cualquier método conocido en la técnica para introducir ADN en una célula hospedadora.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a una composición, en lo sucesivo en el presente documento "composición de la invención", que comprende la proteína quimérica, el polinucleótido, el vector o la célula de la invención.

Según las técnicas convencionales conocidas por los expertos en la materia, la composición según la presente invención puede formularse con un excipiente y/o vehículo. Por tanto, en una realización particular, la composición de la invención comprende un excipiente y/o vehículo. En caso de un uso terapéutico de la composición de la invención, esta puede formularse con un excipiente y/o vehículo farmacéuticamente aceptable.

El término "excipiente" se refiere a una sustancia que ayuda a absorber cualquiera de los componentes de la composición de la invención, estabiliza dichos componentes o ayuda en la preparación de la composición en el sentido de darle consistencia o, si fuera necesario, proporcionar aromas que la hagan más agradable. Por tanto, los excipientes podrían tener la función de mantener los componentes unidos entre sí, tales como, por ejemplo, almidones, azúcares o celulosas, una función edulcorante, una función colorante, la función de protección del medicamento, tal como, por ejemplo, aislándolo del aire y/o la humedad, una función de carga para un comprimido, cápsula o cualquier otra forma de formulación, tal como, por ejemplo, fosfato de calcio dibásico, una función disgregante para facilitar la disolución de los componentes y su absorción en el intestino, sin excluir otros tipos de excipientes no mencionados en este párrafo. Por lo tanto, el término "excipiente" se define como cualquier material incluido en las formas galénicas que se añade a los principios activos o a sus asociaciones para permitir su preparación y estabilidad, modificar sus propiedades organolépticas o determinar las propiedades fisicoquímicas de la composición y su biodisponibilidad. El excipiente "farmacéuticamente aceptable" debe permitir la actividad de los compuestos de la composición farmacéutica, es decir, que sea compatible con dichos componentes. Son ejemplos de excipientes aglutinantes, cargas, disgregantes, lubricantes, recubrimientos, edulcorantes, aromatizantes y colorantes. Son ejemplos no limitantes, más específicos, de excipientes aceptables almidones, azúcares, xilitol, sorbitol, fosfato de calcio, grasas esteroideas, talco, sílice o glicerina, entre otros.

El término "vehículo" se refiere a un compuesto que facilita la incorporación de otros compuestos para permitir una mejor dosificación y administración o para proporcionar consistencia y forma a la composición. Por lo tanto, el vehículo es una sustancia que se usa para diluir cualquiera de los componentes de la composición de la presente invención a un volumen o peso determinado, o incluso sin diluir dichos componentes, capaz de permitir una mejor dosificación y administración o proporcionar consistencia. Cuando la forma de presentación es líquida, el vehículo es el diluyente. En una realización particular, el vehículo es farmacéuticamente aceptable.

La proteína quimérica de la invención se puede emplear como agente terapéutico para administrar a un sujeto. En este caso, la composición proporcionada por la presente invención se considera una composición farmacéutica que puede administrarse por cualquier vía de administración adecuada; con este fin, dicha composición se formulará en la forma adecuada para la vía de administración seleccionada.

La "forma galénica" o "forma farmacéutica" es la disposición a la que se adaptan los principios activos y excipientes para formar un medicamento. Se define por la combinación de la forma en que el fabricante presenta la composición farmacéutica y la forma en que se administra.

Las vías de administración incluyen tópica, ocular, nasal, pulmonar, bucal, parenteral (intravenosa, subcutánea e intramuscular), oral, vaginal y rectal. También es posible la administración desde implantes. La composición de la invención, en particular la composición farmacéutica, también se puede administrar por vía tópica en la piel o la mucosa, es decir, por vía dérmica o transdérmica. Las formulaciones habituales para este fin incluyen geles, hidrogeles, lociones, soluciones, cremas, pomadas, polvos finos, apósitos, espumas, películas, parches cutáneos, obleas, implantes, esponjas, fibras, vendajes y microemulsiones. También se pueden usar liposomas. Los vehículos habituales incluyen alcohol, agua, aceite mineral, vaselina líquida, vaselina blanca, glicerina, polietilenglicol y propilenglicol. Se pueden incorporar potenciadores de la penetración.

La composición de la invención también se puede administrar directamente en el torrente sanguíneo, en el músculo, o en un órgano interno. Los medios adecuados para la administración parenteral incluyen la administración intravenosa, intraarterial, intraperitoneal, intratecal, intraventricular, intrauretral, intraesternal, intracraneal, intramuscular y subcutánea. Los dispositivos adecuados para la administración parenteral incluyen inyectores de aguja (incluidas microagujas), inyectores sin aguja y técnicas de infusión.

La composición de la invención también se puede administrar por vía intranasal u oral. Las formas de dosificación para administración oral incluyen, sin limitación, comprimidos (p. ej., comprimidos recubiertos o sin recubrir), cápsulas (p. ej., cápsulas de gelatina blanda, cápsulas de gelatina dura, cápsulas de HPMC o cápsulas de HPMCP), una cápsula dentro de una cápsula, pastillas para chupar, trociscos, óvulos, soluciones, emulsiones, suspensiones, jarabes, elixires, polvos y gránulos para reconstitución, polvos dispersables y gránulos, gomas medicinales, comprimidos para masticar, comprimidos efervescentes y formas farmacéuticas multiparticuladas. La composición farmacéutica también se puede proporcionar en vendajes o en suturas o similares.

Muchos cirujanos ortopédicos consideran que los seres humanos con prótesis articulares deberían ser considerados para la profilaxis antibiótica. La infección profunda tardía por S. aureus es una complicación grave que a veces conduce a la pérdida de la prótesis articular y se acompaña de una morbilidad y mortalidad significativas. Por lo tanto, puede ser posible extender el uso de la composición de la invención como reemplazo o para usar en combinación con antibióticos profilácticos en esta situación. La composición de la invención se puede administrar mediante inyección con un vehículo adecuado directamente en el sitio del dispositivo ortopédico in situ para eliminar la infección o en una superficie del dispositivo antes de la implantación.

Se ha mostrado que las partículas biodegradables (nanopartículas o micropartículas) son capaces de suministrar diversos agentes terapéuticos incluidas moléculas tales como polipéptidos o proteínas. Por tanto, la composición de la presente invención también abarca micropartículas o nanopartículas biodegradables que comprenden la proteína quimérica, el polinucleótido, el vector, la célula o la composición de la invención.

Además, la proteína quimérica de la invención se puede formular como una sal farmacéuticamente aceptable. La expresión "sal farmacéuticamente aceptable" significa una sal preparada a partir de una base o un ácido que es aceptable para su administración a un paciente, tal como un mamífero (p. ej., sales que tienen una seguridad aceptable en mamíferos para un régimen de dosificación dado). Sin embargo, se entiende que no es necesario que las sales sean sales farmacéuticamente aceptables, tales como sales de los compuestos intermedios que no están destinadas a su administración a un paciente. Las sales farmacéuticamente aceptables pueden proceder de bases inorgánicas u orgánicas farmacéuticamente aceptables y de ácidos inorgánicos u orgánicos farmacéuticamente aceptables. Además, cuando un polipéptido contiene tanto un resto básico, tal como una amina, piridina o imidazol, como un resto ácido tal como ácido carboxílico o tetrazol, se pueden formar iones dipolares y están incluidos dentro del término "sal" como se usa en el presente documento. Las sales derivadas de bases inorgánicas farmacéuticamente aceptables incluyen sales de amonio, calcio, cobre, férricas, ferrosas, litio, magnesio, mangánicas, manganosas, potasio, sodio y cinc, y similares. Las sales derivadas de bases orgánicas farmacéuticamente aceptables incluyen sales de aminas primarias, secundarias y terciarias, incluyendo aminas sustituidas, aminas cíclicas, aminas de origen natural y similares, tales como arginina, betaína, cafeína, colina, N,N'-dibenciletilendiamina, dietilamina, 2-dietilaminoetanol, 2-dimetilaminoetanol, etanolamina, etilendiamina, N-etilmorfolina, N-etilpiperidina, glucamina, glucosamina, histidina, hidrabamina, isopropilamina, lisina, metilglucamina, morfolina, piperazina, piperadina, resinas de poliamina, procaína, purinas, teobromina, trietilamina, trimetilamina, tripropilamina, trometamina y similares. Las sales derivadas de ácidos inorgánicos farmacéuticamente aceptables incluyen sales de ácidos bórico, carbónico, halídrico (bromhídrico, clorhídrico, fluorhídrico o yodhídrico), nítrico, fosfórico, sulfámico y sulfúrico. Las sales procedentes de ácidos orgánicos farmacéuticamente aceptables incluyen sales de ácidos hidroxilo alifáticos (p. ej., ácidos cítrico, glucónico, glicólico, láctico, lactobiónico, málico y tartárico), ácidos monocarboxílicos alifáticos (p. ej., ácidos acético, butírico, fórmico, propiónico y trifluoroacético), aminoácidos (p. ej., ácidos aspártico y glutámico), ácidos carboxílicos aromáticos (p. ej., ácidos benzoico, p-clorobenzoico, difenilacético, gentísico, hipúrico y trifenilacético), ácidos hidroxilo aromáticos (p. ej., ácidos o-hidroxibenzoico, p-hidroxibenzoico, 1-hidroxinaftaleno-2-carboxílico y 3-hidroxinaftaleno-2-carboxílico), ácidos ascórbico, dicarboxílico (p. ej., ácidos fumárico, maleico, oxálico y succínico), ácidos glucurónico, mandélico, múcico, nicotínico, orótico, pamoico, pantoténico, sulfónico (p. ej., ácidos bencensulfónico, canfosulfónico, edisílico, etanosulfónico, isetiónico, metanosulfónico, naftalenosulfónico, naftaleno-1,5-disulfónico, naftaleno-2,6-disulfónico y p-toluenosulfónico), ácido xinafoico y similares.

La composición de la invención puede comprender, además de la proteína quimérica, el polinucleótido, el vector o la célula de la invención, otros agentes terapéuticos tales como antibióticos, analgésicos, etc. Los ejemplos de antibióticos incluyen, sin limitación, vancomicina, teicoplanina, oxacilina, flucloxacilina, dicloxacilina, cefalosporinas de primera generación (tales como cefazolina, cefalotina, cefalexina, etc.), lincosamidas (tales como clindamicina, lincomicina, etc.), cotrimoxazol, eritromicina, rifampicina, ácido fusídico, linezolid, quinupristina/dalfopristina y cualquier combinación de los mismos.

Usos de la proteína quimérica de la invención

Como se ha explicado anteriormente al comienzo de la presente descripción, la proteína quimérica de la invención tiene una actividad lítica mejorada contra Staphylococcus sp. y una mayor estabilidad que las endolisinas precursoras de la técnica actual. Por tanto, la proteína quimérica de la invención muestra actividad de destrucción frente a especies de estafilococos, preferentemente, S. aureus, más preferentemente, S. aureus multirresistente a fármacos (MR). En consecuencia, la proteína quimérica de la invención, así como todos los aspectos derivados de ella, puede usarse eficazmente como antimicrobiano no solo en el tratamiento de enfermedades infecciosas producidas por Staphylococcus sp., en particular, S. aureus, más particularmente, S. aureus multirresistente a fármacos, sino también en el tratamiento de superficies abióticas o alimentos para la desinfección y/o descontaminación de superficies abióticas. En lo sucesivo en el presente documento, estos aspectos inventivos se denominan usos de la invención.

En consecuencia, en otro aspecto, la presente invención se refiere a la proteína quimérica, el polinucleótido, el vector, la célula o la composición de la invención para su uso como medicamento.

En otro aspecto, la invención se refiere a la proteína quimérica, el polinucleótido, el vector, la célula o la composición de la invención para su uso en el tratamiento y/o prevención de una infección de Staphylococcus sp, preferentemente, S. aureus, más preferentemente, S. aureus multirresistente a fármacos (MR).

El término "tratar" (o "trata" o "tratamiento") se refiere a procesos que implican ralentizar, interrumpir, detener, controlar, parar, reducir o invertir el avance o la gravedad de un síntoma, trastorno, afección o enfermedad existente, pero no implican necesariamente una eliminación total de todos los síntomas relacionados con la enfermedad, afecciones o trastornos asociados con una infección de Staphylococcus sp, preferentemente, S. aureus, más preferentemente, S. aureus multirresistente a fármacos (MR). El tratamiento de un trastorno o enfermedad puede, por ejemplo, conducir a una detención de la progresión del trastorno o la enfermedad (p. ej., sin deterioro de síntomas) o a un retraso en la progresión del trastorno o la enfermedad (en caso de que la detención de la progresión sea solo de naturaleza transitoria). El "tratamiento" de un trastorno o enfermedad también puede conducir a una respuesta parcial (p. ej., alivio de los síntomas) o una respuesta completa (p. ej., desaparición de los síntomas) del sujeto/paciente que padece el trastorno o la enfermedad. Debe entenderse que un sujeto/paciente puede experimentar una amplia gama de respuestas a un tratamiento (tales como las respuestas ilustrativas descritas anteriormente en el presente documento). El tratamiento de la asociada a una infección de Staphylococcus sp, puede, entre otros, comprender el tratamiento curativo (preferentemente que conduce a una respuesta completa y, con el tiempo, a la curación del trastorno o la enfermedad) y el tratamiento paliativo (incluido el alivio sintomático).

Como se usa en el presente documento, el término "prevención" se refiere a la inhibición o retraso de una infección de Staphylococcus sp, preferentemente, S. aureus, más preferentemente, S. aureus multirresistente a fármacos (MR) en un sujeto.

Los ejemplos de especies de Staphylococcus incluyen, sin limitación, S. argenteus, S. argensis, S. aureus, S. schweitzeri, S. simiae, S. auricularis, S. carnosus, S. caseolyticus, S. condimenti, S. massiliensis, S. piscifermentans, S. simulans, S. capitis, S. caprae, S. epidermidis, S. saccharolyticus, S. devriesei, S. haemolyticus, S. hominis, S. agnetis, S. chromogenes, S. felis, S. delphini, S. hyicus, S. intermedius, S. lutrae, S. microti, S. muscae, S. petrasii, S. pettenkoferi, S. pseudintermedius, S. pulvereri, S. rostri, S. schleiferi, S. lugdunensis, S. arlettae, S. cohnii, S. equorum, S. gallinarum, S. kloosii, S. nepalensis, S. saprophyticus, S. succinus, S. xylosus, S. fleurettii, S. lentus, S. sciuri, S. stepanovicii, S. vitulinus, S. pasteuri y S. warneri. En una realización particular, la enfermedad se produce por una infección de S. aureus, más en particular, S. aureus MR.

S. aureus (también conocido como estafilococo dorado) es una bacteria grampositiva, de forma redonda que es miembro de los Firmicutes y se encuentra con frecuencia en la nariz, las vías respiratorias y en la piel y membranas mucosas de seres humanos y algunos otros animales.

S. aureus puede causar una serie de enfermedades, desde infecciones cutáneas menores hasta enfermedades potencialmente mortales. Los ejemplos de estas incluyen, sin limitación, granos, impétigo, forúnculos, celulitis, foliculitis, ántrax, epidermólisis, abscesos, neumonía, meningitis, osteomielitis, endocarditis, síndrome de choque tóxico, bacteriemia y septicemia.

El sujeto o paciente que se va a tratar de una enfermedad relacionada con un Staphylococcus sp, preferentemente S. aureus, infección, tal como el sujeto que necesita tratamiento, puede ser un animal (p. ej., un animal no humano), un animal vertebrado, un mamífero, un roedor (p. ej., una cobaya, un hámster, una rata, un ratón), un canino (p. ej., un perro), un felino (p. ej., un gato), un porcino (p. ej., un cerdo), un equino (p. ej., un caballo), un primate, un simio (p. ej., un mono o un homínido), un mono (p. ej., un tití, un babuino), un homínido (p. ej., un gorila, chimpancé, orangután, gibón) o un ser humano. En el contexto de la presente invención, también está previsto que se traten animales importantes desde el punto de vista económico o agronómico. Son ejemplos no limitantes de animales agronómicamente importantes son ovejas, bovinos y porcinos, mientras que, por ejemplo, los gatos y los perros pueden considerarse animales económicamente importantes. Preferentemente, el sujeto/paciente es un mamífero; más preferentemente, el sujeto/paciente es un ser humano o un mamífero no humano (tal como, p. ej., una cobaya, un hámster, una rata, un ratón, un conejo, un perro, un gato, un caballo, un mono, un homínido, un tití, un babuino, un gorila, un chimpancé, un orangután, un gibón, una oveja, bovino o un cerdo); lo más preferentemente, el sujeto/paciente es un ser humano.

En particular, el sujeto humano puede ser un lactante menor, un lactante mayor, un adolescente, un joven o un adulto (p. ej., de al menos 18 años, al menos 20 años, al menos 25 años, al menos 30 años, al menos 35 años, al menos 40 años, al menos 45 años, al menos 50 años, al menos 55 años, al menos 60 años, al menos 65 años, al menos 70 años, al menos 75 años, al menos 80 años, al menos 85 años, al menos 90 años, al menos 95 años o al menos 100 años). En algunos ejemplos, el sujeto tiene un sistema inmunitario suprimido o debilitado (p. ej., sistema inmunitario humoral o celular).

El polipéptido, el polinucleótido, el vector, la célula o la composición de la invención se pueden administrar al sujeto que padece una infección de Staphylococcus sp, preferentemente, S. aureus, más preferentemente, S. aureus multirresistente a fármacos (MR) en combinación con un segundo agente terapéutico, en donde el segundo agente terapéutico es un agente antibiótico o un agente inmunoterapéutico. Los agentes antibióticos ilustrativos incluyen, sin limitación, linezolid, eritromicina, mupirocina, ertapenem, doripenem, imipenem, cilastatina, meropenem, cefadroxilo, cefazolina, cefalotina, cefalotina, cefalexina, ceflacor, cefamandol, cefoxitina, cefprozilo, cefuroxima, cefixima, cefdinir, cefditoreno, cefoperazona, cefotaxima, cefpodoxima, ceftazidima, ceftibuteno, ceftizoxima, ceftriaxona, ceftarolina fosamilo, ceftobiprol, teicoplanina, vancomicina, televancina, clindamicina, lincomicina, daptomicina, amoxicilina, ampicilina, azlocilina, carbenicilina, cloxacilina, dicloxacilina, flucloxacilina, mezlocilina, meticilina, nafcilina, oxacilina, penicilina G, penicilina V, piperacilina, penicilina G, temocilina, ticarcilina, bacitracina, colistina, polimixina B, ciprofloxacina, enoxacino, gatifloxacino, gemifloxacino, levofloxacino, lomefloxacino, moxifloxacino, ácido nalidíxico, norfloxacino, ofloxacino, trovafloxacino, grepafloxacino, esparfloxacino, temafloxacino, mafenida, sulfacetamida, sulfadiazina, sulfadiazina de plata, sulfadimetoxina, sulfametizol, sulfametoxazol, sulfanilamida, sulfasalazina, sulfisoxazol, trimetoprim-sulfametoxazol, sulfonamidocrisoidina, desmeclociclina, doxiciclina, minociclina, oxitetraciclina, tetraciclina y combinaciones de los mismos. Los agentes inmunoterapéuticos ilustrativos incluyen, sin limitación, tefibazumab, BSYX-A110, Aurexis™ y combinaciones de los mismos. Se entiende que las listas anteriores de agentes antibióticos y agentes inmunoterapéuticos son ejemplos no limitantes; por tanto, también se contemplan otros agentes antibióticos o agentes inmunoterapéuticos. También se pueden usar combinaciones o mezclas del segundo agente terapéutico para los fines de la presente invención. Estos agentes se pueden administrar al mismo tiempo o como una sola formulación.

Para tratar una enfermedad, es decir, una enfermedad asociada a Staphylococcus sp, preferentemente, S. aureus, más preferentemente, S. aureus multirresistente a fármacos (MR), la proteína quimérica de la invención (así como todos los aspectos procedentes de ella tales como el polinucleótido, el vector, la célula o la composición de la invención) se administra en una "dosis eficaz" al sujeto que se va a tratar. Como se usa en el presente documento, la expresión "cantidad eficaz" o "dosis eficaz" o "cantidad farmacéuticamente eficaz" se refiere a una cantidad suficiente para lograr un efecto terapéutico deseado, p. ej., una cantidad que da lugar al tratamiento de, o una disminución en, una infección de Staphylococcus sp. En el contexto de las aplicaciones terapéuticas, la cantidad de una composición administrada al sujeto dependerá del tipo y la gravedad de la enfermedad y de las características del individuo, tales como la salud general, la edad, el sexo, el peso corporal y la tolerancia a los fármacos. También dependerá del grado, la gravedad y el tipo de infección. El experto podrá determinar las dosis adecuadas dependiendo de estos y otros factores. La dosis precisa será en última instancia a discreción del médico o veterinario a cargo.

Cuando se emplea la administración in vivo de la proteína quimérica de la invención (así como todos los aspectos derivados de la misma), las cantidades de dosificación normales pueden variar entre aproximadamente 10 ng/kg y 1000 mg/kg de peso corporal de mamífero o más al día o entre aproximadamente 1 pg/kg/día y 10000 mg/kg/día, dependiendo de la vía de administración. A continuación, así como en la bibliografía, también se proporciona orientación acerca de dosis particulares y métodos de suministro. Se anticipa que diferentes formulaciones serán eficaces para diferentes compuestos de tratamiento y diferentes trastornos. La administración dirigida a un órgano o tejido en particular puede requerir un suministro diferente a la de otro órgano o tejido. La proteína quimérica de la invención se puede aplicar desde una vez hasta varias veces al día y se puede aplicar durante un periodo de tiempo corto o largo. El uso puede durar días o semanas. Cualquier forma de dosificación empleada debe proporcionar un número mínimo de unidades durante un periodo de tiempo mínimo. La concentración de las unidades activas de un péptido quimérico que se cree que proporciona una cantidad o dosificación eficaz de enzima puede estar en el intervalo de aproximadamente 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 unidades/ml hasta aproximadamente 10000000 unidades/ml de composición, en un intervalo de aproximadamente 1000 unidades/ml a aproximadamente 10000000 unidades/ml y de aproximadamente 10000 a 10000000 unidades/ml.

Las composiciones también se pueden administrar en combinación con uno o más compuestos terapéuticos adicionales para el tratamiento de infecciones de Staphylococcus sp, preferentemente, Staphylococcus aureus, más preferentemente, S. aureus multirresistente a fármacos (MR). En los párrafos anteriores se han desvelado ejemplos de compuestos terapéuticos.

Los métodos de tratamientos equivalentes a los usos de la presente invención también se incluyen dentro de los aspectos inventivos de la presente invención. Por tanto, la invención se refiere a un método para el tratamiento de un sujeto de una infección por S. aureus que comprende administrar al sujeto la proteína quimérica, el polinucleótido, el vector, la célula o la composición de la invención. Los términos "sujeto" y "tratamiento" se han desvelado anteriormente en la presente descripción.

Como se sabe, las bacterias que persisten en una biopelícula en el cuerpo de los mamíferos causan aproximadamente dos tercios de todas las enfermedades crónicas o recurrentes. Estas biopelículas están compuestas de bacterias protegidas por un "limo" externo que con frecuencia se compone principalmente de ADN que impide que los sistemas inmunitarios innatos y adaptativos, antibióticos y otros agentes antibacterianos tengan acceso a las bacterias dentro de la biopelícula, lo que hace extremadamente difícil eliminar la infección del cuerpo. Asimismo, la biopelícula puede actuar como depósito para futuras infecciones agudas, con frecuencia con consecuencias letales. Por tanto, las infecciones por biopelículas representan un reto clínico, ya que son muy resistentes a las terapias antimicrobianas y con frecuencia aparecen en áreas del cuerpo que no son fácilmente accesibles para el tratamiento. Los estafilococos, en particular, representan una gran parte de las infecciones basadas en biopelículas, tales como la infección crónica de heridas, otitis media crónica, osteomielitis crónica, rinosinusitis crónica, infección recurrente del tracto urinario, endocarditis e infección pulmonar asociada a fibrosis quística, entre otras. Por otra parte, también causan infecciones de dispositivos médicos y heridas quirúrgicas, que son una carga importante para el sistema de salud.

El término "biopelícula" se refiere a una comunidad organizada de microorganismos que en ocasiones se adhieren a la superficie de una estructura que puede ser orgánica o inorgánica, junto con los polisacáridos, proteínas y ADN que secretan y/o liberan. Las biopelículas son muy resistentes a los microbióticos y agentes antimicrobianos.

La presente invención también abarca los usos de la proteína quimérica, el polinucleótido, el vector, el hospedador o la composición de la invención para inhibir, prevenir o descomponer una biopelícula microbiana que comprende Staphylococcus sp, preferentemente, S. aureus, más preferentemente, S. aureus multirresistente a fármacos (MR). Por lo tanto, la presente invención también proporciona un método para inhibir, prevenir o descomponer una biopelícula en un sujeto que comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de la proteína quimérica, el polinucleótido, el vector, el hospedador o la composición de la invención, de este modo inhibiendo, previniendo, eliminando o descomponiendo la biopelícula microbiana.

Además, debido a la capacidad de la proteína quimérica de la invención (así como todos los aspectos derivados de ella) para destruir Staphylococcus sp., su uso ex vivo como antimicrobiano también se contempla dentro del alcance de la presente invención. Los ejemplos de usos ex vivo incluyen, sin limitación, limpieza o desinfección de superficies en la industria alimentaria, en granjas (tales como establos, graneros, etc.), en laboratorios y en hospitales (tales como habitaciones, quirófanos, herramientas quirúrgicas, suelos, dispositivos médicos invasivos (catéteres, válvulas, prótesis, etc.). La formación de biopelículas también puede producirse en entornos industriales, ya que es la causa de problemas de funcionamiento al disminuir la transferencia de calor, bloquear los tubos, obstruir los filtros y causar daños a las superficies. Concretamente, en la industria alimentaria, la capacidad de las bacterias para adherirse a las superficies en contacto con los alimentos proporciona un depósito de contaminación para patógenos con los consiguientes riesgos para la salud humana. El análisis de la composición microbiana de las biopelículas formadas en las superficies industriales de alimentos reveló la presencia de biopelículas mixtas que incluyen bacterias patógenas y de deterioro. Estos microorganismos pueden llegar a la industria alimentaria a través de diversas fuentes tales como el agua, alimentos crudos, animales, manipuladores y pueden persistir en el equipo durante largos periodos de tiempo. Por lo tanto, los productos alimentarios pueden contaminarse en cualquier etapa de la cadena alimentaria, a pesar de que se han aplicado todos los protocolos de limpieza necesarios, porque los procesos de desinfección y limpieza en la industria alimentaria suelen ser ineficaces. Por ejemplo, en la industria láctea, algunos microorganismos pueden sobrevivir después de los procedimientos de limpieza in situ (CIP). Las biopelículas causan problemas principalmente en las industrias de procesamiento de productos lácteos, carne, aves de corral, mariscos y vegetales. Dependiendo de la industria, la ruta de acceso a los alimentos es diferente.

En vista de lo anterior, otro aspecto de la presente invención se refiere al uso de la proteína quimérica, el polinucleótido, el vector, la célula hospedadora y/o una composición de la invención para eliminar, inhibir y/o prevenir la formación de biopelículas de Staphylococcus sp. en superficies abióticas. El término biopelícula, y ejemplos del mismo, se ha definido anteriormente.

En otro aspecto, la invención se refiere al uso de la proteína quimérica, el polinucleótido, el vector, la célula hospedadora y/o una composición de la invención para eliminar y/o prevenir la contaminación por Staphylococcus sp. de alimentos y/o superficies abióticas.

Como se usa en el presente documento, el término "eliminar" se refiere a reducir la carga de Staphylococcus sp. hasta una cantidad que no se considera perjudicial para un sujeto, preferentemente, un sujeto humano. Como conoce la persona experta, la carga microbiana que puede estar presente en un alimento (o en una superficie abiótica) depende del tipo de alimento y del microorganismo. La carga microbiana mínima que se permite que esté presente en los alimentos (o superficies abióticas) para cada microorganismo patógeno es ampliamente conocida en la técnica actual y se puede consultar en manuales internacionales.

En el caso de Staphylococcus sp., los ejemplos de carga microbiana mínima incluyen, sin limitación, los siguientes valores:

- En los quesos elaborados con leche cruda el límite de estafilococos positivos para coagulasa es de 104 - 105 UFC/g (método analítico de referencia: EN/ISO 6888-2).

- En los quesos elaborados con leche que se ha sometido a un tratamiento térmico inferior a la pasteurización y en los quesos curados elaborados con leche o suero que se haya sometido a pasteurización o un tratamiento térmico más intenso, el límite es de 100 - 1000 UFC/g (método analítico de referencia: EN/ISO 6888-1 o 2);

- En los quesos blandos sin madurar (quesos frescos) elaborados con leche o suero que se ha sometido a pasteurización o a un tratamiento térmico más fuerte, el límite es de 10 - 100 UFC/g (método analítico de referencia: EN/ISO 6888-1 o 2).

- De manera análoga, no deberían detectarse enterotoxinas estafilocócicas en 25 g de queso, leche en polvo y productos de suero en polvo (método analítico de referencia: método de cribado europeo de la CRL para estafilococos positivos para coagulasa).

- En los productos descascarados y desconchados de crustáceos y moluscos cocidos, el límite de estafilococos positivos para coagulasa es de 100 - 1000 UFC/g (método analítico de referencia: EN/ISO 6888-1 o 2)

Estos datos se han obtenido del REGLAMENTO DE LA COMISIÓN (EC) n.° 2073/2005 del 15 de noviembre de 2005 sobre criterios microbiológicos para productos alimentarios y del REGLAMENTO DE LA COMISIÓN (EC) n.° 1441/2007 del 5 de diciembre de 2007 por el que se modifica el Reglamento (EC) n.° 2073/2005 sobre criterios microbiológicos para productos alimentarios.

Como se usa en el presente documento, en el contexto del presente aspecto inventivo, el término "prevención" o "prevenir" se refiere a prevenir, evitar o impedir que una superficie o un alimento sea contaminado o colonizado por Staphylococcus sp. Por tanto, la proteína quimérica de la invención (y todos los aspectos derivados de la misma) puede usarse como bioconservador en productos alimentarios y como desinfectante en entornos alimentarios y agrícolas.

Los ejemplos de alimentos que pueden tratarse con la proteína quimérica, el polinucleótido, el vector, la célula hospedadora y/o una composición de la invención incluyen, sin limitación, pienso para animales, productos lácteos, productos vegetales, productos cárnicos, aperitivos, chocolates, bebidas, alimentos para bebés, cereales, comida frita, productos de repostería, galletas, etc. Los ejemplos de productos lácteos incluyen, pero sin limitación, productos lácteos fermentados (tales como, pero sin limitación, yogur o queso) o productos no fermentados (por ejemplo, pero sin limitación, nata, mantequilla, margarina o suero). Un producto vegetal es, por ejemplo, pero sin limitación, un cereal en cualquier forma de presentación, fermentado o sin fermentar, o un aperitivo. La bebida puede ser, pero sin limitación, leche no fermentada.

En el contexto de la presente invención, la expresión "superficie abiótica" se refiere a cualquier superficie inerte hecha de cualquier material. Los ejemplos de materiales incluyen, sin limitación, poliestireno, acero inoxidable, caucho, cerámica, policarbonato, plástico, vidrio, metal y cualquier otro material usado para la fabricación de dispositivos médicos.

Los ejemplos de lugares cuyas superficies abióticas pueden tratarse con la proteína quimérica, el polinucleótido, el vector, la célula hospedadora y/o una composición de la invención incluyen, sin limitación, establos, graneros, laboratorios y hospitales (tales como habitaciones, quirófanos, herramientas quirúrgicas, suelos, dispositivos médicos invasivos (catéteres, válvulas, prótesis, etc.), tubos, tuberías y filtros de taponamiento.

En una realización particular, el Staphylococcus sp. es Staphylococcus aureus, más preferentemente, S. aureus multirresistente a fármacos (MR)

En otro aspecto, la presente invención se refiere a un kit, en lo sucesivo en el presente documento "kit de la invención", que comprende la proteína quimérica, el polinucleótido, el vector, la célula hospedadora y/o la composición de la invención.

En la presente invención, por "kit" se entiende un producto que comprende los diferentes reactivos para el tratamiento de infección por Staphylococcus sp, preferentemente, S. aureus, más preferentemente, S. aureus multirresistente a fármacos (MR), es decir, la proteína quimérica, el polinucleótido, el vector, la célula o la composición de la invención. Otro componente que puede estar presente en el kit es un envase que permita mantener los reactivos dentro de límites determinados. Los materiales adecuados para preparar tales envases incluyen vidrio, plástico (polietileno, polipropileno, policarbonato y similares), frascos, viales, papel, sobres y similares. El kit de la invención puede contener adicionalmente instrucciones para usar los reactivos en el método de la invención. Dichas instrucciones se pueden encontrar en forma de material impreso o en forma de un soporte electrónico que puede almacenar instrucciones para que puedan ser leídas por un sujeto, tales como medios de almacenamiento electrónico (discos magnéticos, cintas y similares), medios ópticos (CD-ROM DVD) y similares. Los medios pueden contener adicionalmente o como alternativa sitios web de Internet que proporcionen dichas instrucciones.

Por lo tanto, la presente invención también abarca el uso del kit de la invención para tratar a un sujeto de una infección por Staphylococcus sp, preferentemente, S. aureus, más preferentemente, S. aureus multirresistente a fármacos (MR).

La presente invención también se refiere a métodos para producir la proteína quimérica de la presente invención que comprende el cultivo de una célula hospedadora recombinante, como se describe en el presente documento, en condiciones propicias para producir el polipéptido de la invención y recuperar dicho polipéptido. Por tanto, en otro aspecto, la presente invención se refiere a un método de producción de una proteína quimérica de la invención, en lo sucesivo en el presente documento "método de la invención", que comprende

(i) transformar una célula hospedadora con el polinucleótido o el vector de la invención,

(ii) cultivar la célula hospedadora resultante de la etapa (i) en condiciones para expresar el polinucleótido o el vector de la invención y, opcionalmente,

(iii) recuperar la proteína quimérica.

En la técnica se conocen bien métodos para transformar o transfectar células hospedadoras con polinucleótidos o vectores y dependen del sistema de hospedador seleccionado, como se describe en Sambrook y Russell, Molecular Cloning: a laboratory manual (Cold Springs Laboratory Press, 2001). Para las células bacterianas, las técnicas adecuadas incluyen transformación con cloruro de calcio, electroporación y transfección usando bacteriófagos. Para las células eucariotas, las técnicas adecuadas incluyen transfección con fosfato de calcio, DEAE-dextrano, electroporación, transfección mediada por liposomas y transducción usando retrovirus o cualquier otro vector vírico. Para las células de insectos, el vector de transferencia que contiene la construcción polinucleotídica de la presente invención se cotransfecta con ADN de baculovirus, tal como AcNPV, para facilitar la producción de un virus recombinante. La infección vírica recombinante posterior de células Sf da lugar a una alta tasa de producción de proteína recombinante.

En el método de producción de la presente invención, las células se cultivan en un medio nutritivo adecuado para la producción de la composición enzimática usando métodos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, la célula se puede cultivar mediante cultivo en matraz de agitación y fermentación a pequeña o gran escala (incluidas fermentaciones continua, discontinua, semicontinua o en estado sólido) en fermentadores industriales o de laboratorio realizados en un medio adecuado y en condiciones que permitan expresar el polinucleótido y/o aislar la proteína resultante. El cultivo tiene lugar en medios de nutrientes adecuados que comprenden fuentes de carbono y nitrógeno y sales inorgánicas, usando procedimientos conocidos en la materia. Los medios adecuados están disponibles en proveedores comerciales o se pueden preparar según las composiciones publicadas (p. ej., en los catálogos de la Colección Americana de Cultivos Tipo). Si la proteína quimérica se secreta en el medio nutritivo, la composición enzimática se puede recuperar directamente del medio. Si la proteína quimérica no se secreta en el medio, puede recuperarse de lisados celulares.

Una vez que el polipéptido es producido por el cultivo de la célula hospedadora, se puede detectar, purificar y/o aislar usando métodos conocidos en la técnica. Estos métodos de detección incluyen, sin limitación, el uso de anticuerpos específicos, formación de un producto enzimático o desaparición de un sustrato enzimático. La proteína quimérica puede recuperarse mediante procedimientos convencionales incluidos, pero sin limitación, cromatografía de afinidad iónica, centrifugación, filtración, extracción, secado por pulverización, evaporación o precipitación.

Como se usa en el presente documento, el término "purificada" en la expresión "proteína quimérica purificada" significa alterado "por la mano del hombre" con respecto a su estado natural (es decir, si se presenta en la naturaleza, se ha cambiado o eliminado de su ambiente original) o se ha sintetizado en un ambiente no natural. Estos términos no requieren pureza absoluta (tal como una preparación homogénea), sino que representan una indicación de que es relativamente más puro que en el entorno natural.

Como alternativa, la proteína quimérica de la invención también se puede obtener mediante síntesis. Las técnicas particulares para sintetizar péptidos o proteínas incluyen métodos clásicos en los que se aíslan péptidos de tamaño creciente antes de la adición de cada aminoácido o péptido preformado, la síntesis química clásica aminoácido a aminoácido y la síntesis peptídica en fase sólida en la que el péptido se construye unido a una resina tal como una resina de Merrifield. En estos procedimientos sintéticos, los grupos en los aminoácidos generalmente estarán protegidos del uso de grupos protectores convencionales tales como t-butoxicarbonilo. Si es necesario, estos grupos protectores se escinden una vez que se completa la síntesis. Los métodos de síntesis química, por ejemplo, mediante síntesis de péptidos en fase sólida, síntesis en solución, una combinación de métodos de síntesis en fase sólida y síntesis en solución o enzimática, son conocidos por el experto en la materia.

A menos que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que el que entiende normalmente un experto habitual en la materia a la que pertenece la presente invención. En la práctica de la presente invención pueden usarse métodos y materiales similares o equivalentes a los que se describen en el presente documento. A lo largo de la descripción y las reivindicaciones, no se pretende que la palabra "comprende" y sus variaciones excluyan otras características técnicas, aditivos, componentes o etapas. Los objetos, ventajas y características adicionales de la invención resultarán evidentes para los expertos en la materia tras examinar la descripción o pueden aprenderse mediante la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos, dibujos y listado de secuencias se proporcionan a modo de ilustración y no tienen por objeto ser limitantes de la presente invención.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1. Actividad lítica específica de las proteínas contra S. aureus Sa9. Las barras representan la actividad (ADO600 x minutos-1 x |jM-1) de cada proteína. Los datos son la media ± desviación típica de tres repeticiones biológicas. Las barras que tienen letras minúsculas distintas son estadísticamente diferentes (p<0,05) según la prueba de comparación post-hoc ANOVA y SLK.

Figura 2. Curva de destrucción en función del tiempo de S. aureus Sa9 tratada con cantidades equimolares de proteínas (0,1 j M). Los resultados (medias ± desviaciones típicas de tres repeticiones) se presentan como reducción bacteriana (unidades Iog10) en relación con el control sin tratar. Las barras que tienen un asterisco son estadísticamente diferentes (p<0,05) del control sin tratar, según la prueba de t de Student.

Figura 3. Inhibición del crecimiento de biopelículas en presencia de 0,7 j M de proteína. El porcentaje de inhibición de biopelículas se calculó mediante tinción con violeta cristal después del crecimiento de las biopelículas durante 24 horas. Los resultados se presentan como medias ± desviaciones típicas de tres repeticiones. Las barras que tienen letras minúsculas distintas son estadísticamente diferentes (p<0,05) según la prueba de comparación posthoc ANOVA y SLK.

Figura 4. Eliminación de biopelículas de 8 horas de S. aureus 15981 después de la adición de 2,5 j M de proteína e incubación adicional a 37 °C durante 16 h. El porcentaje de eliminación de biopelícula se calculó mediante tinción con violeta cristal después del tratamiento. Los resultados son medias ± desviaciones típicas de tres repeticiones. Las barras que tienen letras minúsculas distintas son estadísticamente diferentes (p<0,05) según la prueba de comparación post-hoc ANOVA y SLK.

Ejemplo 1

Diseño de una proteína de fago quimérico con alta actividad antimicrobiana contra Staphylococcus aureus SARM

I. MATERIAL Y MÉTODOS

Endolisinas de S. aureus.

Las endolisinas precursoras están codificadas en dos bacteriófagos: philPLA88 (un derivado lítico del fago moderado 0H5) (42526 pb; ORF 61) (García, P., et al. 2009a. J Dairy Sci. 92, 3019-3026; y García, P., et al. 2009b. Appl Environ Microbiol. 75, 7663-7673); y philPLA-RODI (142348 pb; ORF 213) (Gutiérrez et al., 2015a. Appl Environ Microbiol. 81, 3336-3348). Los genes que codifican las endolisinas se identificaron en los genomas de fago: La endolisina LysH5 (481 aminoácidos; 54,2 kDa) está codificada por orf61 (1446 nucleótidos) del genoma del fago philPLA88. Esta proteína se ha caracterizado previamente (Obeso et al., 2008, Int J Food Microbiol. 128, 212-218.). La endolisina LysRODI (496 aminoácidos, 54,81 kDa) está codificada por orf57 (1491 nucleótidos) del genoma del fago phiIPLA-RODI.

Cepas bacterianas y condiciones de cultivo.

Todas las cepas estafilocócicas (Tabla 1) usadas en este estudio se cultivaron en caldo de soja tríptico (TSB; Difco, Franklin Lakes, NJ) a 37 °C con agitación o en placas TSB que contenían agar bacteriológico (TSA) al 2 % (p/vol). Se usó Escherichia coli DH10B (Invitrogen, Carlsbad, CA) para la clonación y el almacenamiento. Se usó E. coli BL21 (DE3) (EMD Biosciences, San Diego, CA) para la expresión de proteínas. Todas las cepas de E. coli se cultivaron a 37 °C con agitación en medio LB (triptona al 1 %, extracto de levadura al 0,5 %, NaCl al 1 %) o en LB complementado con agar al 2 % (p/v). Para una correcta selección de los clones, se usaron 100 pg/ml de ampicilina o 50 pg/ml de kanamicina.

Tabla 1. Las cepas de estafilococos usadas en este estudio, origen y sensibilidad a las proteínas líticas expresadas como concentración inhibidora mínima (CIM). La CIM se expresa como el modo de tres repeticiones biológicas independientes (pM). (Ref.) Referencia; (1) García et al., 2007 Int Dairy J. 17, 7.; (2) Valle et al., 2003, Mol Microbiol.

48, 1075-1087.; (3), (4), (6) Inédito; (5) Delgado et al., 2009. BMC Microbiol. 9, 82; (7) Martin et al., 2012 J Hum Lact.

28, 36-44.

Construcción de plásmidos y manipulación de ADN.

Los genes que codifican LysRODI (número de referencia de Genbank YP_009195893.1, SEQ ID NO: 7) y LysH5 (número de referencia de Genbank YP_002332536.1, SEQ ID NO: 8) de los fagos vB_SauM_philPLA-RODI y vB_SauS-phiIPLA88, respectivamente, se optimizaron en función del uso codónico de E. coli por la tecnología de optimización de codones OptimumGeneTM. Además, se añadieron sitios de restricción Ndel y Xhol en los sitios terminales 5' y 3'. Las secuencias optimizadas se sintetizaron, se clonaron en el vector pUC57 mediante GenScript (Township, n J, Estados Unidos) y se subclonaron en el vector de expresión pET21a que introduce un marcador His6 C-terminal y porta un gen de resistencia a la ampicilina.

Para la construcción de proteínas quiméricas, los dominios conservados de LysRODI y LysH5 se predijeron a partir de la secuencia proteica usando BLASTP (Altschul et al., 1990. J Mol Biol. 215:403-410.) y HMMER v3.1b2 (hmmer.org). La estructura tridimensional predicha se calculó usando Phyre2. El diseño por ordenador de la proteína quimérica ClyRODI-H5 se construyó mediante la fusión del dominio CHAP de LysRODI y el dominio SH3b de LysH5. Para garantizar un plegado correcto, el dominio CHAP de LysRODI se clonó a partir del extremo N de la proteína y se flanqueó con 5 aminoácidos adicionales después del extremo C. De manera similar, el dominio SH3b de LysH5 se clonó a partir de 56 aminoácidos ubicados antes del extremo N de este dominio hasta el extremo C de la proteína. Se obtuvo el gen que codificaba ClyRODI-H5, en el Laboratorio de Tecnología Genética, Facultad de Ingeniería de Biociencias (Universidad de Lovaina, Bélgica), usando la técnica de mezclado VersaTile (actualmente bajo patente), seguido de una subclonación en un vector de expresión derivado de pNIC28-Bsa4 que porta un gen de resistencia a la kanamicina.

Los vectores de expresión que contenían las endolisinas y los genes de proteínas quiméricas se transformaron finalmente en E. coli BL21 (DE3) por electroporación.

Sobreexpresión y purificación de proteínas.

Se realizó purificación de proteínas como se ha descrito anteriormente con algunas modificaciones (Gutiérrez et al., 2015b, Front Microbiol. 6, 1315). En resumen, se indujeron cultivos en crecimiento exponencial (DO600 = 0,5) con IPTG (isopropil-p-D-tiogalactopiranósido) 1 mM y se incubaron a 16 °C durante 16 horas. Se sedimentaron quinientos mililitros de células en cultivo (10000 rpm, 30 minutos), se suspendieron en 10 ml de tampón de lisis (NaH2PO4 20 mM, NaCl 500 mM, imidazol 10 mM, pH 7,4) y se congelaron/descongelaron tres veces a -80 °C. Posteriormente, se realizó sonicación (pulsos de 15 x 5 s con recuperación de 15 s en hielo). A continuación, la suspensión se centrifugó a 10000 rpm. Cada proteína de fusión marcada con His6 se purificó del sobrenadante aclarado mediante cromatografía de afinidad de iones metálicos inmovilizados usando columnas de resina Superflow de níquel-NTA (Qiagen, Valencia, CA, Estados Unidos). Para la purificación de proteínas unidas, se determinó empíricamente que los perfiles de lavado y elución eran 20 ml de imidazol 10 mM, 40 ml de imidazol 20 mM y elución con 1 ml de imidazol 250 mM en solución salina tamponada con fosfato (NaH2PO4 50 mM, NaCl 300 mM, pH 7,4). Las proteínas purificadas se almacenaron a -80 °C con 30 % de glicerol para evitar la precipitación. La pureza de las proteínas se evaluó en SDS-PAGE al 12 % (vol/p) procesado a 150 V usando geles prefabricados Criterion (Bio-Rad, Inc., Hercules, CA) y se reveló adicionalmente a través de la tinción de Coomassie convencional. Antes de realizar experimentos de actividad, todas las proteínas purificadas se filtraron usando filtros de membrana PES de 0,45 pm (VWR, España) y se diluyeron en tampón de fosfato de sodio 50 mM (pH=7,4). La cantidad de proteína se cuantificó mediante el ensayo de proteínas Quick Start Bradford (BioRad, Hercules, CA, Estados Unidos).

Cuantificación de la actividad lítica específica.

El ensayo de reducción de turbidez se realizó como se ha descrito anteriormente (Obeso et al., 2008. Int J Food Microbiol. 128, 212-218.) usando células S. aureus Sa9 suspendidas en tampón de fosfato de sodio 50 mM, (pH=7,4) y se trató con diluciones dobles de las proteínas purificadas (0,02-50 pM). La actividad de la bacteriocina lisostafina (Sigma, Misuri, Estados Unidos), producida por Staphylococcus simulans, también se probó como control positivo. Los resultados se expresaron como la actividad lítica específica (ADO6OO x minutos'1 x pM'1). Evaluar la actividad de las proteínas en presencia de diferentes iones (KCI, MgCI2, NaCl, MnCI2, ZnCI2, CaCl2), estos se añadieron a una concentración final de 1 mM al ensayo de turbidez. La estabilidad de las proteínas frente a diferentes condiciones fisicoquímicas se evaluó incubando una alícuota de la proteína purificada durante 30 minutos a temperaturas que oscilaron entre 40 °C y 90 °C. Después, se llevó a cabo el ensayo de reducción de la turbidez como se ha descrito anteriormente. Por otra parte, la actividad de las proteínas se analizó diluyendo (1:100) cada proteína purificada en el tampón universal de pH de Britton-Robinson (KCI 150 mM, KH2PO4 10 mM, citrato sódico 10 mM, H³BO³ 10 mM) ajustado a un pH de 3 a 11. En este caso, el ensayo de reducción de la turbidez se llevó a cabo con células S. aureus Sa9 suspendidas en el tampón de Britton-Robinson. Todos los experimentos se realizaron usando tres repeticiones biológicas.

Concentración inhibidora mínima (CIM) de proteínas líticas de fago.

La CIM de las proteínas se determinó por triplicado mediante una técnica convencional de microdilución en caldo en TSB (CLSI, 2015). Se añadió una dilución doble de cada proteína a una placa de microtitulación, conteniendo cada pocillo 106 UFC de cepa estafilocócica. La CIM se definió como la concentración de proteína más baja que inhibía el crecimiento bacteriano visible después de 24 horas de incubación a 37 °C y se expresó como la moda de tres repeticiones biológicas independientes.

Ensayo de ensayo de destrucción en función del tiempo.

Se recogieron células en crecimiento exponencial (DO600 = 0,5) de S. aureus Sa9 en medio TSB mediante centrifugación (10000 rpm, 5 minutos), se lavaron dos veces y se suspendieron en tampón de fosfato de sodio 50 mM (pH = 7,4) hasta una concentración final de ±106 UFC/ml. Cada proteína (0,1 j M) se añadió a 1 ml de suspensión bacteriana y se incubó a 37 °C con agitación. En diferentes puntos temporales (2 - 60 minutos), se tomaron 50 j l y se añadieron 0,15 jg de proteinasa K para detener la reacción. Se sembraron diluciones adecuadas de las suspensiones se sembraron en agar TSB y se incubaron a 37 °C durante 16 horas. La actividad antibacteriana se cuantificó como la inactivación relativa en unidades logarítmicas (Iog10 [N0/Ni] con N0 como el número inicial de células sin tratar y Ni como el número de células residuales contadas después del tratamiento). Todos los experimentos se realizaron usando tres repeticiones biológicas.

Determinación de la resistencia bacteriana a las proteínas líticas.

El desarrollo de resistencia se probó usando exposiciones repetidas calculadas según los valores de CIM (Rodríguez-Rubio et al., 2013. PLoS One, 8, e64671). Se usaron diluciones en serie dobles de las proteínas (0,02 - 50 j M) contra S. aureus Sa9 (106 UFC) cultivadas en una placa de microtitulación de poliestireno 96, a 37 °C durante 16 horas. Al día siguiente, se inocularon 100 j l del primer pocillo con crecimiento (1/2 CIM) en 5 ml de TSB y se cultivaron hasta una DO600=0,5. Estos cultivos se usaron para el siguiente ciclo de exposición a CIM. El experimento se repitió durante 10 ciclos, seguido de 5 ciclos adicionales en TSB sin la proteína para permitir la reversión del fenotipo. Se realizó además ensayo de CIM para medir la sensibilidad a las proteínas. Los experimentos se realizaron usando tres repeticiones biológicas independientes.

Ensayos de biopelículas.

Se obtuvieron biopelículas estafilocócicas como se ha descrito anteriormente (Gutiérrez et al., 2014 PLoS One. 9, e107307) usando S. aureus 15981. En resumen, se diluyeron cultivos de una noche (o/n) en TSBg nuevo (TSB complementado con 0,25 % p/v de D-(+)-glucosa) hasta 106 UFC/ml y se vertieron 200 j l en placas TC Microwell 96U con tapa nunclon D SI (Thermo Scientific, NUNC, Madrid, España) y se incubaron a 37 °C durante 8 horas. Los pocillos se lavaron dos veces con solución salina tamponada con fosfato (tampón PBS) estéril (NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, Na2HPO4 10 mM y KH2PO42 mM; pH 7,4). Para el tratamiento de biopelículas estafilocócicas, se añadieron a cada pocillo 200 j l de cada proteína (concentración final de 2,5 j M) o tampón de fosfato de sodio 50 mM (pH 7,4), como control. Las placas se incubaron a 37 °C durante 16 h. A continuación, los pocillos se lavaron dos veces con tampón de PBS y la biomasa restante se determinó mediante tinción con violeta cristal (0,1 % p/v) durante 15 minutos, seguido de un lavado suave con agua del grifo y decoloración en ácido acético (33 % v/v). La absorbancia se midió a una longitud de onda de 595 nm. Todos los ensayos se realizaron usando tres repeticiones biológicas.

Además, la capacidad de las proteínas para prevenir la formación de biopelículas se probó usando una técnica convencional de microdilución en caldo. Se añadieron diluciones dobles de las proteínas (0,02-50 j M) en TSBg a placas TC Microwell 96U con tapa nunclon DSI (Thermo Scientific, NUNC, Madrid, España). Cada pocillo se inoculó previamente con 106 UFC/pocillo de S. aureus 15981. Las placas se incubaron a 37 °C durante 24 horas. La formación de biopelículas se cuantificó mediante tinción con violeta cristal como se ha descrito anteriormente.

Análisis estadístico.

Se usó el paquete de SPSS Statistics para Windows V. 22.0 (IBM Corp.) para determinar las diferencias de actividad entre las proteínas líticas. Se usó un análisis de varianza (ANOVA) unidireccional seguido de la Student-Newman-Keuls para determinar las diferencias entre la actividad de cada proteína a un nivel de significación p<0,05. Por otro lado, se realizó una prueba de t de Student para comparar las diferencias entre el cultivo bacteriano tratado y sin tratar a un nivel de significación p<0,05. Los datos se expresaron como la media ± desviación típica de tres repeticiones biológicas.

II. RESULTADOS

Endolisinas de S. aureus.

Inicialmente, se identificaron dos endolisinas codificadas por dos bacteriófagos que infectan S. aureus. Estas endolisinas (endolisinas precursoras) se usarán como fuente de las endolisinas quiméricas. La endolisina LysH5 está codificada por orf61 del genoma del fago philPLA88. La endolisina LysRODI está codificada por orf57 del genoma del fago phiIPLA-RODI.

El análisis bioinformático usando BLASTP y HMMER permitió determinar que LysRODI y LysH5 muestran una organización modular que consiste en dos dominios enzimáticos (EAD) que catalizan la degradación de peptidoglucano (una cisteína N-terminal, aminohidrolasa/peptidasa dependiente de histidina (CHAP) y una N-acetilmuramoil-L-alanina amidasa ubicada centralmente) y un dominio de unión a la pared celular (CBD) (un SH3b ubicado en el extremo C). Estos dominios están separados por secuencias de aminoácidos que se denominan conectores. También están presentes conectores al principio y al final de la proteína.

Mejora de la expresión y purificación de dos endolisinas contra S. aureus.

Los genes que codifican las endolisinas precursoras (LysH5 y LysRODI) se clonaron en el vector de expresión pET21a y se transformaron en E. coli BL21 (DE3) para la expresión y purificación adicional de las proteínas. No obstante, después del proceso de purificación, las proteínas no eran solubles, la concentración de proteína purificada oscila entre 0,3 y 0,6 mg/ml. Para resolver este problema, los genes que codifican las endolisinas precursoras se optimizaron para la expresión en E. coli, lo que da lugar a una secuencia de ADN diferente a la depositada en las bases de datos (material complementario S1). Los nuevos genes sintéticos también se clonaron en pET21a y se transformaron en E. coli BL21 (DE3) para la expresión y purificación adicional de las proteínas. Estas nuevas construcciones dieron lugar a proteínas completamente solubles después del proceso de purificación. La cantidad de proteínas purificadas osciló entre 0,8 y 2 mg/ml.

La proteína lítica quimérica ClyRODI-H5 muestra una mayor actividad en comparación con las endolisinas precursoras.

A partir de las secuencias de nucleótidos optimizadas que codifican las endolisinas precursoras (LysRODI y LysH5), se obtuvo una proteína lítica quimérica (ClyRODI-H5) mediante mezcla de dominios. ClyRODI-H5 se diseñó usando la combinación de los dominios catalíticos (dominio CHAP) y de unión a la pared celular (SH3b) de las endolisinas de tipo silvestre LysRODI y LysH5, respectivamente. Antes de diseñar el gen por ordenador que codifica la proteína quimérica, las estructuras tridimensionales predichas de las endolisinas precursoras se obtuvieron usando el programa informático Phyre2. Para garantizar un plegamiento adecuado de la proteína lítica quimérica ClyRODI-H5, se eligió el dominio CHAP de LysRODI que incluía los aminoácidos del comienzo de la proteína y 5 aminoácidos después del dominio. Los análisis de Phyre2 revelaron que hay una hélice alfa predicha en la región conectora que precede al dominio SH3b de LysH5. Por tanto, la región SH3b elegida incluye todos los aminoácidos hasta el final de la proteína y 59 aminoácidos antes del dominio que contiene la hélice alfa completa. Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de ClyRODI-H5 se incluyen en el material complementario S2. La proteína lítica quimérica se clonó con éxito en un vector de expresión derivado de pNIC28-Bsa4 usando la tecnología VersaTile (bajo patente de KU Leuven). Se purificó ClyRODI-H5 alcanzando una cantidad de 2 mg/ml de proteína.

Después de la purificación, se evaluó la actividad antimicrobiana de las proteínas LysRODI, LysH5 y ClyRODI-H5 contra S. aureus Sa9 usando el ensayo de reducción de la turbidez. La actividad lítica específica de cada proteína (ADO6OO x minutos'1 x pM-1) mostró una actividad de ClyRODI-H5 aumentada en 3 y 24 veces en comparación con las endolisinas precursoras LysRODI y LysH5, respectivamente (figura 1). Esta actividad específica más alta es indicativa de una eliminación de bacterias más rápida que la causada por las endolisinas precursoras. Además, se comparó la actividad de la proteína ClyRODI-H5 con la de la lisostafina (una bacteriocina con alta actividad contra S. aureus) y se calculó adicionalmente la actividad lítica específica (ADO600 x minutos-1 x pM-1). ClyRODI-H5 mostró una actividad aproximadamente 24 veces mayor que la lisostafina (figura 1).

Influencia de las condiciones fisicoquímicas sobre la actividad de la proteína quimérica.

Para analizar la estabilidad de las proteínas precursoras y quiméricas, se determinó la influencia de dos parámetros ambientales (temperatura y pH) sobre su actividad lítica específica. El efecto de la temperatura se probó mediante la incubación de proteínas durante 30 minutos en un intervalo de 40 °C-90 °C. Todas las proteínas se inactivaron por completo a más de 50 °C. Es notable que LysH5 mantuvo su actividad a 40 °C, mientras que la actividad de LysRODI disminuyó 7 veces a la misma temperatura. ClyRODI-H5 también se inactivó a 40 °C.

La actividad de las proteínas se probó a diferentes pH (3 a 11). Las endolisinas precursoras (LysRODI y LysH5) conservaron su actividad a un pH que oscilaba entre 5 y 9 y se inactivaron por completo a pH 3 y 11. Curiosamente, la proteína quimérica ClyRODI-H5 conservó su actividad en un intervalo más amplio de pH (3-11). Por otra parte, se observó un ligero aumento de actividad (1,2 veces) para esta proteína a pH 5.

También se evaluó la influencia de diferentes iones (KCI, MgCb, NaCl, MnCb, ZnCb, CaCb) sobre la actividad lítica. LysRODI y LysH5 se inactivaron por completo en presencia de MnCb y ZnCI2. LysRODI también fue inactivado por CaCb, mientras que este ion aumentó 1,3 veces la actividad de LysH5. MgCb también aumentó la actividad de LysH5 (1,3 veces). Por el contrario, la actividad de la proteína quimérica ClyRODI-H5 tuvo influencia negativa por la presencia de todos los iones, ya que se observó una disminución que oscilaba entre 1,7 y 4 veces. Cabe destacar que la proteína

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Una proteína quimérica que comprende:

(a) una primera secuencia de aminoácidos que comprende el dominio catalítico CHAP de la endolisina LysRODI del fago PhilPLA-RODI y

(b) una segunda secuencia de aminoácidos que comprende el dominio de unión a la pared celular SH3b de la endolisina LysH5 del fago philPLA88,

en donde la primera secuencia de aminoácidos (a) está unida a la segunda secuencia de aminoácidos (b); y en donde (i) la estabilidad y (ii) la actividad lítica de la proteína quimérica contra Staphylococcus sp. mejoran en comparación con las de las endolisinas precursoras.

2. Proteína quimérica según la reivindicación 1, en donde la secuencia de aminoácidos del dominio catalítico CHAP comprende una secuencia de aminoácidos con una identidad de secuencia de al menos 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 % con la SEQ ID NO: 1.

3. Proteína quimérica según la reivindicación 1 o 2, en donde la primera secuencia de aminoácidos comprende la secuencia SEQ ID NO: 2.

4. Proteína quimérica según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la secuencia de aminoácidos del dominio de unión a la pared celular SH3b comprende una secuencia de aminoácidos con una identidad de secuencia de al menos 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 % con la SEQ ID NO: 3.

5. Proteína quimérica según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la segunda secuencia de aminoácidos comprende la secuencia SEQ ID NO: 4.

6. Proteína quimérica según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 5.

7. Un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína quimérica según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, preferentemente, la secuencia de nucleótidos que codifica una proteína quimérica comprende la secuencia SEQ ID NO: 6.

8. Un vector que comprende un polinucleótido según la reivindicación 7.

9. Una célula hospedadora que comprende una proteína quimérica según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, un polinucleótido según la reivindicación 7 y/o un vector según la reivindicación 8, preferentemente, la célula hospedadora es Escherichia coli.

10. Una composición que comprende una proteína quimérica según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, un polinucleótido según la reivindicación 7, un vector según la reivindicación 8 y/o una célula hospedadora según la reivindicación 9.

11. Una proteína quimérica según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, un polinucleótido según la reivindicación 7, un vector según la reivindicación 8, una célula hospedadora según la reivindicación 9 y/o una composición según la reivindicación 10 para su uso como medicamento.

12. Una proteína quimérica según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, un polinucleótido según la reivindicación 7, un vector según la reivindicación 8, una célula hospedadora según la reivindicación 9 y/o una composición según la reivindicación 10 para su uso en el tratamiento y/o prevención de una infección de Staphylococcus sp, preferentemente, Staphylococcus aureus, más preferentemente, S. aureus multirresistente a fármacos (MR).

13. Uso de una proteína quimérica según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, un polinucleótido según la reivindicación 7, un vector según la reivindicación 8, una célula hospedadora según la reivindicación 9 y/o una composición según la reivindicación 10 para eliminar, inhibir y/o prevenir la formación de biopelículas de Staphylococcus sp. en superficies abióticas o para eliminar y/o prevenir la contaminación por Staphylococcus sp. de alimentos y/o superficies abióticas, preferentemente, el Staphylococcus sp. es Staphylococcus aureus, más preferentemente, S. aureus multirresistente a fármacos (MR).

14. Un método para producir una proteína quimérica según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 que comprende (i) transformar una célula hospedadora con un polinucleótido según la reivindicación 7 o un vector según la reivindicación 8,

(ii) cultivar la célula hospedadora resultante de la etapa (a) en condiciones adecuadas para expresar el polinucleótido según la reivindicación 7 o el vector según la reivindicación 8 y, opcionalmente,

(iii) recuperar la proteína quimérica.

15. Un kit que comprende proteína quimérica según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, un polinucleótido según la reivindicación 7, un vector según la reivindicación 8, una célula hospedadora según la reivindicación 9 y/o una composición según la reivindicación 10.