ES2579806T3

ES2579806T3 - Agentes antimicrobianos

Info

Publication number: ES2579806T3
Application number: ES10730139.2T
Authority: ES
Inventors: Rob Lavigne; Stefan Miller; Yves Briers; Guido Volckaert; Maarten Walmagh
Original assignee: Katholieke Universiteit Leuven; Lysando AG
Current assignee: Katholieke Universiteit Leuven; Lysando AG
Priority date: 2009-06-26
Filing date: 2010-06-28
Publication date: 2016-08-16
Anticipated expiration: 2030-06-28
Also published as: WO2010149792A2; CA2764131C; JP6034187B2; JP2012530509A; AU2010264656A1; DK2445515T3; EP3058950B1; CN102458452A; KR20170024129A; AU2018201931B2; KR20120095345A; IL250938A0; US10137175B2; EP3714895A3; US8906365B2; JP2017008033A; US20190209663A1; MX2011013288A; EP2445515B1; EA037202B1

Abstract

Una proteína de fusión compuesta de endolisina que tiene la actividad de degradación de la pared celular de bacterias Gram negativas y un tramo peptídico fusionado a la endolisina en el extremo N- o C-terminal, o en ambos extremos, en donde el tramo peptídico tiene una secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID NO: 11.

Description

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En la siguiente tabla, se representan ejemplos específicos de una parte endolisina derivada de un fago o que es una endolisina de tipo silvestre:

Tabla 1: 5

Fago: Publicación Endolisina de tipo silvestre Función prevista de la endolisina

ΦV10: Perry, L. L. y Applegate, B. M. PhiV10p30 quitinasa

FELS-1: McClelland, M. y Wilson, R. K. STM0907.Fels0 quitinasa

ε15: Kropinksi, A. M. y McConnel, M. R. epsilon15p25 quitinasa

YUA: Ceyssens. P. (Laboratory for Gene technology) YuA20 transglicosilasa lítica (C)/1 dominio transmembrana (N)

B3: Braid, M. D. y Kitts, C. L. ORF23 transglicosilasa lítica (C)/2 dominios transmembrana (N)

BCEPµ: Summer, E. J. y Young, R. BcepMu22 transglicosilasa lítica (M)/1 dominio transmembrana (N)

F116: Byme, M. y Kropinski, A. M. F116p62 muraminidasa (de tipo T4)

FELS-2: McClelland, M. y Wilson, R. K. STM2715.S.Fels2 muraminidasa (de tipo T4)

ES18: Casjens, S. R. y Hendrix, R. W. gp76 muraminidasa (de tipo T4)

SETP3: De Lappe, N. y Cormican, M. SPSV3_gp23 muraminidasa (de tipo T4)

ΦECO32: Savalia, D. y Severinov, K. phi32_17 muraminidasa (de tipo T4)

HK022: Juhala, R. y Hendrix, R. W. HK022p54 muraminidasa (de tipo lambda)

HK97: Juhala , R. y Hendrix, R. W. HK97p58 muraminidasa (de tipo lambda)

HK620: Clark, A. J. y Dhillon, T. S. HK620p36 muraminidasa (de tipo lambda)

E1: Pickard, D. y Dougan, G VIP0007 muraminidasa (de tipo lambda)

SF6: Casjens, S. y Clark, A. J. Sf6p62 muraminidasa (de tipo lambda)

SFV: Allison, G. E. y Verma, N. K. R (SfVp40) muraminidasa (de tipo lambda)

BCEPC6B: Summer, E. J. y Young, R. gp22 muraminidasa (de tipo lambda)

BCEPNAZGUL: Summer, E. J. y Young, R. Nazgul38 muraminidasa (de tipo lambda)

P2: Christie, G. E. y Calender, R. K (P2p09) muraminidasa (de tipo lambda)

WΦ: Christie, G. E. y Esposito, D. K (Wphi09) muraminidasa (de tipo lambda)

RV5: Kropinski, A. M. y Johnson rv5_gp085 muraminidasa (de tipo lambda)

JS98: Zuber, S. y Denou, E. EpJS98_gp116 muraminidasa (de tipo T4)

13A: Savalia, D. y Molineux, I. gp3.5 muramoil-L-alanina amidasa

BA14: Savalia, D. y Molineux, I. gp3.5 muramoil-L-alanina amidasa

ECODS1: Savalia, D. y Molineux, I. gp3.5 muramoil-L-alanina amidasa

K1F: Scholl, D. y Merril, C. CKV1F_gpI6 muramoil-L-alanina amidasa

T3: Pajunen, M. I. y Mollineux, L. J. T3p18 muramoil-L-alanina amidasa

GH-1: Kropinski, A. M. y Kovalyova, L. V. gh-1p12 muramoil-L-alanina amidasa

K11: Molineux, I. y Savalia, D. gp3.5 muramoil-L-alanina amidasa

ΦCTX: Nakayama, K. y Hayashi, T. ORF12 dominio de unión a PG (N)/muramidasa (C)

BCEP43: Summer, E. J. y Young, R. Bcep43-27 dominio de unión a PG (N)/muramidasa (C)

BCEP781: Summer, E. J. y Young, R. Bcep781 -27 dominio de unión a PG (N)/muramidasa (C)

BCEP1: Summer, E. J. y Young, R. Bcep1-28 dominio de unión a PG (N)/muramidasa (C)

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BCEPNY3: Summer, E. J. y Young, R. BcepNY3gene26 dominio de unión a PG (N)/muramidasa (C)

ΦE12-2: DeShazer, D. y Nierman, W. C. gp45 dominio de unión a PG (N) muramidasa (C)

Φ52237: DeShazer, D. y Nierman, W. C. gp28 dominio de unión a PG (N)/muramidasa (C)

ΦPP27: Recktenwald, J. y Schmidt, H. P27p30 endopeptidasa

RB49: Monod, C. y Krisch, H. M. RB49p102 endopeptidasa

Φ1: Arbiol, C. y Comeau, A. M. phi1-p102 endopeptidasa

T5: Pankova, N. V. y Ksenzenko, V. N. lys (T5.040) endopeptidasa

201phi2-1: Thomas et al., 2008 dominio de unión a PG (N)/dominio catalítico desconocido (C)

Aeh1: Monod, C. y Krisch, H. M. Aeh1p339 muraminidasa (de tipo T4)

YYZ-2008: Kropinski, A. M. YYZgp45 muraminidasa (de tipo lambda)

También se prefiere la parte endolisina derivada de las endolisinas de los fagos ΦKZ y EL de Pseudomonas aeruginosa, del fago de Pseudomonas putida, del fago N4 de E. coli, del fago LUZ24, de la muramidasa de gp61, de la endolisina de STM0016 y de la endolisina de PSP3.

Otros ejemplos de la parte endolisina se seleccionan del grupo que consiste en phiKZgp144 de acuerdo con la SEQ ID NO: 1, ELgp188 de acuerdo con la SEQ ID NO: 2, endolisina de Salmonella de acuerdo con la SEQ ID NO: 3, endolisina del fago T4 de Enterobacteria de acuerdo con la SEQ ID NO: 4, endolisina de Acinetobacter baumanii de acuerdo con la SEQ ID NO: 5, endolisina del Fago K1F de E. coli de acuerdo con la SEQ ID NO: 18, OBPgpLYS de acuerdo con la SEQ ID NO: 34, endolisina PSP3 de Salmonella (PSP3gp10) de acuerdo con la SEQ ID NO: 20, la endolisina del Fago P2 de E. coli (P2gp09) de acuerdo con la SEQ ID NO: 21, muramidasa de fago de Salmonella typhimurium STM0016 de acuerdo con SEQ ID NO:22, muramidasa de Fago N4 de E. coli N4-gp61 de acuerdo con SEQ ID NO:23 y N4-gp61 trunc. de acuerdo con SEQ ID NO: 24, KZ144 de acuerdo con SEQ ID NO: 25.

En otra realización preferida de la presente invención las endolisinas de la proteína de fusión de acuerdo con la presente invención comprenden modificaciones y/o alteraciones de la secuencias de aminoácidos. Dichas alteraciones y/o modificaciones pueden comprender mutaciones tales como deleciones, inserciones y adiciones, sustituciones o combinaciones de las mismas y/o cambios químicos de los restos de aminoácidos, por ejemplo, biotinilación, acetilación, PEGilación, cambios químicos de los grupos amino, SH o carboxilo. Dichas endolisinas de la proteína de fusión de acuerdo con la presente invención presentan la actividad lítica de la endolisina de tipo silvestre respectiva. Sin embargo, dicha actividad puede ser igual, superior o inferior a la actividad de la endolisina de tipo silvestre respectiva. Dicha actividad puede ser del aproximadamente 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 20 170, 180, 190 o del aproximadamente 200 % de la actividad de la endolisina de tipo silvestre respectiva o incluso más. La actividad se puede medir mediante ensayos muy conocidos en la técnica por un experto en la materia, tale como, por ejemplo, el ensayo de lisis en placa o el ensayo lisis en líquidos, descritos, por ejemplo, en Briers et al., J. Biochem. Biophys Methods 70: 531 -533, (2007) o Donovan D. M., Lardeo M., Foster-Frey J. FEMS Microbiol Lett. Diciembre de 2006; 265 (1) o publicaciones similares.

Preferentemente, el tramo peptídico de la proteína de fusión de acuerdo con la invención se fusiona al extremo Nterminal y/o al extremo C-terminal de la endolisina. En una realización preferida particular, dicho tramo peptídico solo se fusiona al extremo N-terminal de la enzima. En otra realización preferida, el tramo peptídico solo se fusiona al extremo C-terminal de la enzima. Sin embargo, también se prefieren las proteínas de fusión modificadas que tienen un tramo peptídico tanto en el extremo N-terminal como en el extremo C-terminal. Dichos tramos peptídicos en el extremo N-terminal y en el extremo C-terminal pueden ser tramos peptídicos iguales o diferentes. El tramo peptídico puede estar ligado a la enzima por restos de aminoácidos adicionales, por ejemplo, por razones de clonación. Preferentemente, dicho tramo peptídico puede estar ligado a la proteína de fusión por al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 restos de aminoácidos adicionales. En una realización preferida, el tramo peptídico está ligado a la enzima por los restos de aminoácidos adicionales glicina y serina (Gly-Ser) o leucina y ácido glutámico (Glu Leu). Por otra parte, el tramo peptídico de la proteína de fusión de acuerdo con la invención comprende, además, aminoácidos adicionales en su extremo N-terminal. Preferentemente, el tramo peptídico comprende el aminoácido metionina (Met), alanina y metionina y glicina (AIa-Met-Gly-Ser) o alanina y metionina y glicina y serina (Ala-Met-Gly-Ser).

El tramo peptídico de la proteína de fusión de acuerdo con la presente invención está preferentemente unido covalentemente a la enzima. Preferentemente, dicho tramo peptídico consiste en al menos 5, más preferentemente al menos 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97,

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98, 99 o al menos 100 restos de aminoácidos. Es especialmente preferido un tramo peptídico que comprende de aproximadamente 5 a aproximadamente 100 restos de aminoácidos, de aproximadamente 5 a aproximadamente 50

: o de aproximadamente 5 a aproximadamente 30 restos de aminoácidos. Es más preferido un tramo peptídico que comprende de aproximadamente 6 a aproximadamente 42 restos de aminoácidos, de aproximadamente 6 a aproximadamente 39 restos de aminoácidos, de aproximadamente 6 a aproximadamente 38 restos de aminoácidos, de aproximadamente 6 a aproximadamente 31 restos de aminoácidos, de aproximadamente 6 a aproximadamente 25 restos de aminoácidos, de aproximadamente 6 a aproximadamente 24 restos de aminoácidos, de aproximadamente 6 a aproximadamente 22 restos de aminoácidos, de aproximadamente 6 a aproximadamente 21 restos de aminoácidos, de aproximadamente 6 a aproximadamente 20 restos de aminoácidos, de aproximadamente 6 a aproximadamente 19 restos de aminoácidos, de aproximadamente 6 a aproximadamente 16 restos de aminoácidos, de aproximadamente 6 a aproximadamente 14 restos de aminoácidos, de aproximadamente 6 a aproximadamente 12 restos de aminoácidos, de aproximadamente 6 a aproximadamente 10 restos de aminoácidos

: o de aproximadamente 6 a aproximadamente 9 restos de aminoácidos.

Preferentemente, el tramo peptídico no es un marcador tal como un marcador de His, un marcador de Strep, un marcador de Avi, un marcador de Myc, un marcador de Gst, un marcador de JS, un marcador de cisteína, un marcador de FLAG u otros marcadores conocidos en la técnica, y no es proteínas de unión a la tiorredoxina o a la maltosa (MBP). Sin embargo, el tramo peptídico y/o la endolisina, la autolisina o la bacteriocina de acuerdo con la presente invención pueden comprender además dicho marcador o marcadores.

Más preferentemente, el tramo peptídico tiene la función de dirigir la proteína de fusión a través de la membrana exterior, pero puede tener actividad o puede no tener ninguna actividad o tener solo una baja actividad cuando se administra sin estar fusionado a la enzima. La función de dirigir la proteína de fusión a través de la membrana externa de las bacterias Gram negativas es causada por el potencial de la membrana exterior, o la actividad de interrupción o permeabilización o desestabilización de los LPS de dicho tramo peptídico.

En un aspecto de la presente invención, el tramo peptídico fusionado es un péptido anfipático que comprende uno o más de los restos de aminoácidos cargados positivamente de lisina, arginina y/o histidina, combinados con uno o más de los restos de aminoácidos hidrófobos de valina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, triptófano, cisteína, alanina, tirosina, histidina, treonina, serina, prolina y/o glicina. Las cadenas laterales de los restos de aminoácidos están orientadas preferentemente para que las superficies catiónicas e hidrófobas se agrupen en los lados opuestos del péptido. Preferentemente, más del aproximadamente 30, 40, 50, 60 o 70 % de los restos de aminoácidos de dicho péptido son aminoácidos cargados positivamente. Preferentemente, más del aproximadamente 30, 40, 50, 60 o 70 %, de los restos de aminoácidos de dicho péptido son restos de aminoácidos hidrófobos. Ventajosamente, el péptido anfipático se fusiona al extremo N-terminal y/o al extremo C-terminal de la enzima que tiene actividad de degradación de la pared celular, mejorando así la anfipaticidad de las últimas proteínas.

En otra realización de la invención, el péptido anfipático fusionado a la enzima consiste en al menos 5, más preferentemente al menos 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 o 50 restos de aminoácidos. En una realización preferida, al menos aproximadamente el 30, 40, 50, 60 o 70 % de dichos restos de aminoácidos del péptido anfipático son bien restos de arginina o de lisina y/o al menos aproximadamente el 30, 40, 50, 60 o 70 % de dichos restos de aminoácidos del péptido anfipático son de los aminoácidos hidrófobos valina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, triptófano, cisteína, alanina, tirosina, histidina, treonina, serina, prolina y/o glicina.

Los péptidos anfipáticos preferidos son Pleurocidina de acuerdo con SEQ ID NO: 6, Cecropina P1 de acuerdo con SEQ ID NO: 7, Buforina II de acuerdo con SEQ ID NO: 8, Buforina I de acuerdo con SEQ ID NO: 19 y Magainina de acuerdo con SEQ ID NO: 9. Otros péptidos anfipáticos preferidos son Catelidicina, por ejemplo, LL-37 de acuerdo con SEQ ID NO: 10, Nigrocina 2 de acuerdo con SEQ ID NO: 26 y Ascafina 5 de acuerdo con SEQ ID NO: 27.

En un aspecto adicional de la presente invención, el tramo peptídico fusionado es un péptido antimicrobiano que comprende una carga neta positiva y aproximadamente el 50 % de los aminoácidos hidrófobos. Los péptidos antimicrobianos son anfipáticos, con una longitud de aproximadamente 12 a aproximadamente 50 restos de aminoácidos.

En la siguiente tabla, se enumeran ejemplos específicos de péptidos antimicrobianos de acuerdo con la presente invención.

Tabla 2:

Péptido: Secuencia

LL-37: LLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTES SEQ ID NO: 10

SMAP-29: RGLRRLGRKIAHGVKKYGPTVLRIIRIAG SEQ ID NO: 11

Indolicidina: ILPWKWPWWPWRR SEQ ID NO: 12

Protegrina: RGGRLCYCRRRFCVCVGR SEQ ID NO: 13

Cecropina P1: SWLSKTAKKLENSAKKRISEGIAIAIQGGPR SEQ ID NO: 7

Magainina: GIGKFLHSAKKFGKAFVGEIMNS SEQ ID NO: 9

Pleurocidina: GWGSFFKKAAHVGKHVGKAALTHYL SEQ ID NO: 6

Cecropina A (A. aegypti): GGLKKLGKKLEGAGKRVFNAAEKALPVVAGAKALRK SEQ ID NO: 14

Cecropina A (D. melanogaster): GWLKKIGKKIERVGQHTRDATIQGLGIPQQAANVAATARG SEQ ID NO: 15

Buforina II: TRSSRAGLQFPVGRVHRLLRK SEQ ID NO: 8

Sarcotoxina IA: GWLKKIGKKIERVGQHTRDATIQGLGIAQQAANVAATAR SEQ ID NO: 16

Apidaecina: ANRPVYIPPPRPPHPRL SEQ ID NO: 28

Ascafina 5: GIKDWIKGAAKKLIKTVASHIANQ SEQ ID NO: 27

Nigrocina 2: GLLSKVLGVGKKVLCGVSGLVC SEQ ID NO: 26

Pseudina 1: GLNTLKKVFQGLH EAIKLINNHVQ SEQ ID NO: 29

Ranalexina: FLGGLIVPAMICAVTKKC SEQ ID NO: 30

Melitina: GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ SEQ ID NO: 31

En un aspecto adicional de la presente invención, el tramo peptídico fusionado es un péptido sushi, descrito por J. L. Ding, Li P., Ho B. Cell Mol Life Sci., abril de 2008; 65(7-8): 1202-19. “The Sushi peptides: structural characterization and mode of action against Gram-negative bacteria”. Se prefiere especialmente el péptido sushi 1 de acuerdo con

5 SEQ ID NO: 32.

Los péptidos sushi preferidos son los péptidos sushi S1 y S3, y los múltiplos de los mismos; FASEB J., septiembre de 2000; 14(12): 1801-13.

10 En un aspecto adicional de la presente invención, el tramo peptídico fusionado es una defensina, preferentemente Catelicidina, Cecropina P1, Cecropina A o Magainina II.

En un aspecto adicional de la presente invención, el tramo peptídico fusionado es un péptido hidrófobo, por ejemplo, Apidaecina, que tiene la secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID NO: 28, la variante WLBU2, que tiene la

15 secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID NO: 33, y Walmagh1, que tiene la secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID NO: 35. El péptido hidrófobo que tiene la secuencia de aminoácidos Phe-Phe-VaI-Ala-Pro (SEQ ID NO: 17) no forma parte de la presente invención.

En otra realización preferida de la presente invención, los tramos peptídicos de la proteína de fusión de acuerdo con

20 la presente invención comprenden modificaciones y/o alteraciones de las secuencias de aminoácidos. Dichas alteraciones y/o modificaciones pueden comprender mutaciones tales como deleciones, inserciones y adiciones, sustituciones o combinaciones de las mismas y/o cambios químicos de los restos de aminoácidos, por ejemplo, biotinilación, acetilación, PEGilación, cambios químicos de los grupos amino, SH o carboxilo.

25 Los ejemplos específicos de las proteínas de fusión de acuerdo con la presente invención se enumeran en la siguiente tabla: Tabla 3:

Proteína de fusión
Proteína de fusión: Parte enzimática Tramo peptídico (extremo N-terminal, a menos que se indique lo contrario)

P1-E6: SEQ ID NO: 36 KZ144 (SEQ ID NO:25) Ascafina 5 (SEQ ID NO:27)

P2-E6: SEQ ID NO: 37 KZ144 (SEQ ID NO:25) Apiadaecina (SEQ ID NO:28)

P3-E6: SEQ ID NO: 38 KZ144 (SEQ ID NO:25) Nigrocina 2 (SEQ ID NO:26)

P4-E6: SEQ ID NO: 39 KZ144 (SEQ ID NO:25) Pseudina 1 (SEQ ID NO:29)

P7-E6: SEQ ID NO: 40 KZ144 (SEQ ID NO:25) Ranalexina (SEQ ID NO:30)

P8-E6: SEQ ID NO: 41 KZ144 (SEQ ID NO:25) Variante WLBU2 (SEQ ID NO:33)

P9-E6: SEQ ID NO: 42 KZ144 (SEQ ID NO:25) sushi 1 (SEQ ID NO:32)

P10-E6: SEQ ID NO: 43 KZ144 (SEQ ID NO:25) Meliltina (SEQ ID NO:31)

P11-E6: SEQ ID NO: 44 KZ144 (SEQ ID NO:25) LL-37 (SEQ ID NO:10)

P12-E6: SEQ ID NO: 45 KZ144 (SEQ ID NO:25) Indolicidina (SEQ ID NO:12)

P13-E6: SEQ ID NO: 46 KZ144 (SEQ ID NO:25) SMAP-29 (SEQ ID NO:11)

P14-E6: SEQ ID NO: 47 KZ144 (SEQ ID NO:25) Protegrina (SEQ ID NO:13)

P15-E6: SEQ ID NO: 48 KZ144 (SEQ ID NO:25) Cecropina P1 (SEQ ID NO:7)

P16-E6: SEQ ID NO: 49 KZ144 (SEQ ID NO:25) Magainina (SEQ ID NO:9)

P17-E6: SEQ ID NO: 50 KZ144 (SEQ ID NO:25) Pleurocidina (SEQ ID NO:6)

P18-E6: SEQ ID NO: 51 KZ144 (SEQ ID NO:25) Cecropina A (A. aegypti) (SEQ ID NO:14)

P19-E6: SEQ ID NO: 52 KZ144 (SEQ ID NO:25) Cecropina A (A. melanogaster) (SEQ ID NO:15)

P20-E6: SEQ ID NO: 53 KZ144 (SEQ ID NO:25) Buforina II (SEQ ID NO:8)

P21-E6: SEQ ID NO: 54 KZ144 (SEQ ID NO:25) Sarcotoxina IA (SEQ ID NO: 16)

P1-E3: SEQ ID NO: 55 STM0016 (SEQ ID NO:22) Ascafina 5 (SEQ ID NO:27)

SEQ ID NO: 56: STM0016 (SEQ ID NO:22) Nigrocina 2 (SEQ ID NO:26)

SEQ ID NO: 57: STM0016 (SEQ ID NO:22) SMAP-29 (SEQ ID NO:11)

SEQ ID NO: 58: STM0016 (SEQ ID NO:22) Sarcotoxina IA (SEQ ID NO: 16)

P10-E4: SEQ ID NO: 59 N4-gp61 (SEQ ID NO:23) Melitina (SEQ ID NO:31)

SEQ ID NO: 60: N4-gp61 (SEQ ID NO:23) SMAP-29 SEQ ID NO:11)

P10-E5: SEQ ID NO: 61 N4-gp61 trunc. (SEQ ID NO:24) Melitina (SEQ ID NO:31)

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transformado con una molécula de ácido nucleico o un vector que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de fusión de acuerdo con la presente invención.

En una realización preferida de la presente invención, la composición comprende además agentes permeabilizantes de la membrana externa de las bacterias Gram negativas tales como quelantes metálicos como, por ejemplo, EDTA, TRIS, ácido láctico, lactoferrina, polimixina, ácido cítrico y/u otras sustancias según lo descrito, por ejemplo, por Vaara (“Agents that increase the permeability of the outer membrane”. Vaara M. Microbiol Rev., septiembre de 1992; 56(3):395-441). También se prefieren las composiciones que comprendan combinaciones de los agentes permeabilizantes mencionados anteriormente. Se prefiere en especial una composición que comprenda EDTA de aproximadamente 10 µM a aproximadamente 100 mM, más preferentemente EDTA de aproximadamente 50 µMa aproximadamente 10 mM, más preferentemente EDTA de aproximadamente 0,5 mM a aproximadamente 10 mM, más preferentemente EDTA de aproximadamente 0,5 mM a aproximadamente 2 mM, más preferentemente EDTA de aproximadamente 0,5 mM a 1 mM. Sin embargo, también se prefieren las composiciones que comprenden EDTA de aproximadamente 10 µM a aproximadamente 0,5 mM. También se prefiere una composición que comprende EDTA de aproximadamente 0,5 mM a aproximadamente 2 mM, más preferentemente EDTA aproximadamente 1 mM y además TRIS de aproximadamente 10 a aproximadamente 100 mM.

La presente invención también se refiere a una proteína de fusión de acuerdo con la presente invención y/o a un huésped transformado con un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de fusión de acuerdo con la presente invención, para su uso como un medicamento. En un aspecto adicional, la presente invención se refiere al uso de una proteína de fusión de acuerdo con la presente invención y/o a un huésped transformado con un vector que comprende una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de fusión, modificada, de acuerdo con la presente invención, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento y/o la prevención de un trastorno, una enfermedad o una afección asociado con bacterias Gram negativas. En particular, el tratamiento y/o la prevención del trastorno, de la enfermedad o de la afección puede producirse por bacterias Gram negativas de grupos, familias, géneros o especies de bacterias que comprenden cepas patógenas para los seres humanos o animales como Enterobacteriaceae (Escherichia, especialmente E. coli, Salmonella, Shigella, Citrobacter, Edwardsiella, Enterobacter, Hafnia, Klebsiella, especialmente K. pneumoniae, Morganella, Proteus, Providencia, Serratia, Yersinia), Pseudomonadaceae (Pseudomonas, especialmente P. aeruginosa, Burkholderia, Stenotrophomonas, Shewanella, Sphingomonas, Comamonas), Neisseria, Moraxella, Vibrio, Aeromonas, Brucella, Francisella, Bordetella, Legionella, Bartonella, Coxiella, Haemophilus, Pasteurella, Mannheimia, Actinobacillus, Gardnerella, Spirochaetaceae (Treponema y Borrelia), Leptospiraceae, Campylobucter, Helicobacter, Spirillum, Streptobacillus, Bacteroidaceae (Bacteroides, Fusobacterium, Prevotella, Porphyromonas), Acinetobacter, especialmente, A. baumanii.

La presente invención se refiere además a un medicamento que comprende una proteína de fusión de acuerdo con la presente invención y/o un huésped transformado con un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de fusión de acuerdo con la presente invención.

En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a una proteína de fusión para su uso en un método de tratamiento de un trastorno, de una enfermedad o de una afección en un sujeto que necesita el tratamiento y/o la prevención, método que comprende administrar a dicho sujeto una cantidad eficaz de una proteína de fusión de acuerdo con la presente invención y/o una cantidad eficaz de un huésped transformado con un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de fusión de acuerdo con la presente invención

o una composición de acuerdo con la presente invención. El sujeto puede ser un ser humano o un animal.

En particular, dicho método de tratamiento puede ser para el tratamiento y/o la prevención de infecciones de la piel, de tejidos blandos, del sistema respiratorio, los pulmones, el tracto digestivo, los ojos, los oídos, los dientes, la nasofaringe, la boca, los huesos, la vagina, heridas de bacteriemia y/o endocarditis causadas por bacterias Gram negativas, en particular, por las bacterias Gram negativas enumeradas anteriormente.

La dosis y la vía de administración usadas en un método de tratamiento (o profilaxis) de acuerdo con la presente invención dependen de la enfermedad/del sitio de infección específicos que se vayan a tratar. La vía de administración puede ser, por ejemplo, oral, tópica, nasofaríngea, parenteral, intravenosa, rectal o cualquier otra vía de administración.

Para la aplicación de una proteína de fusión de acuerdo con la presente invención y/o de una cantidad eficaz de un huésped transformado con un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de fusión de acuerdo con la presente invención o una composición de acuerdo con la presente invención, en un sitio de infección (o en un sitio con peligro de infectarse), se puede usar una formulación que proteja los compuestos activos de las influencias ambientales, tales como proteasas, oxidación, respuesta inmunitaria, etc., hasta que alcance el sitio de infección. Por lo tanto, la formulación puede ser una cápsula, una gragea, una píldora, un polvo, un supositorio, una emulsión, una suspensión, un gel, una loción, una crema, una pomada, una solución inyectable, un jarabe, un pulverizado, un inhalante o cualquier otra formulación galénica razonable desde el punto de vista médico. Preferentemente, la formulación galénica puede comprender vehículos, estabilizantes, aromatizantes, tampones u otros reactivos adecuados. Por ejemplo, para la aplicación tópica, la formulación puede ser una loción,

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una crema, un gel, una pomada o un parche; para la aplicación nasofaríngea, la formulación puede ser solución salina aplicada mediante un pulverizador en la nariz. Para la administración oral, en caso del tratamiento y/o de la prevención de un sitio de infección específico, por ejemplo, en el intestino, puede ser necesario proteger una proteína de fusión de acuerdo con la presente invención del adverso medio digestivo del tracto gastrointestinal hasta que se alcance el sitio de infección. Por lo tanto, como vehículos, se pueden usar bacterias, que sobrevivan a las etapas iniciales de la digestión en el estómago y que secreten posteriormente en el medio intestinal una proteína de fusión de acuerdo con la presente invención.

En una realización específica de la presente invención, se usa una proteína de fusión de acuerdo con la presente invención y/o un huésped transformado con un vector que comprende una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de fusión de acuerdo con la presente invención en la fabricación de un medicamento para el tratamiento y/o la prevención de un trastorno, una enfermedad o una afección causada por Pseudomonas, particularmente Pseudomonas aeruginosa, en particular, afecciones intestinales, en particular, en niños, infección de las meninges, por ejemplo meningitis hemorrágica, infecciones del oído medio, la piel (Ecthyma gangraenosum), en particular, quemaduras, tracto urinario, rinitis, neumonía bacterémica, en particular, en la que el paciente padece fibrosis quística o tumores hematológicos tales como leucemia, o pacientes con neutropenia de terapia inmunosupresora, septicemia, en particular, por cateterización intravenosa o urinaria a largo plazo, procedimientos quirúrgicos invasivos y quemaduras graves, endocarditis, en particular, cuando el paciente usa fármacos intravenosos o en un paciente con complicaciones de cirugía cardiaca, infecciones oculares muy destructivas, en particular, tras el uso de soluciones oftalmológicas contaminadas o quemaduras faciales graves, osteocondritis, en particular, como consecuencia de un traumatismo grave o heridas por punción a través de ropa contaminada.

En otra realización específica de la presente invención, el trastorno, la enfermedad o la afección están causados por Burkholderia pseudomallei, en particular, la enfermedad de Whitmore, neumonía crónica, septicemia, en particular, cuando el paciente tiene una lesión cutánea por traumatismo.

En otra realización específica de la presente invención, el trastorno, la enfermedad o la afección están causados por Salmonella thyphimurium y Salmonella enteritidis, en particular, gastroenteritis aguda y procesos purulentos locales, particularmente osteomielitis, endocarditis, colecistitis y, especialmente, meningitis causada por Salmonella thryphimurium, en particular, cuando el paciente es menor de dos años.

En otra realización específica de la presente invención, el trastorno, la enfermedad o la afección están causados por Salmonella typhi, en particular, tifosis.

En otra realización específica de la presente invención, el trastorno, la enfermedad o la afección están causados por Salmonella paratyphi, en particular, paratifosis.

En otra realización específica de la presente invención, el trastorno, la enfermedad o la afección están causados por Acinetobacter baumanii, en particular, bronquitis, neumonía, infecciones de heridas y septicemia, en particular, como consecuencia de cateterización intravenosa.

En otra realización específica de la presente invención el trastorno, la enfermedad o la afección están causados por Escherichia coli, en particular, infecciones extraintestinales, particularmente apendicitis, colecistitis purulenta, peritonitis, meningitis purulenta e infecciones del tracto urinario, infecciones intraintestinales por E. coli, particularmente enteritis epidémica y enfermedades infecciosas similares a la disentería, septicemia, enterotoxemia, mastitis y disentería.

En otra realización específica de la presente invención, el trastorno, la enfermedad o la afección están causados por Klebsiella pneumoniae, en particular, neumonía, bacteriemia, meningitis e infecciones del tracto urinario.

Preferentemente, se usa una proteína de fusión de acuerdo con la presente invención para el tratamiento médico, si la infección que se va a tratar (o prevenir) está causada por cepas bacterianas multirresistentes, en particular, por cepas resistentes contra uno o más de los siguientes antibióticos: estreptomicina, tetraciclina, cefalotina, gentamicina, cefotaxime, cefalosporina, ceftazidime o imipenem. Además, se puede usar una proteína de fusión de acuerdo con la presente invención en métodos de tratamiento mediante su administración en combinación con agentes antibacterianos convencionales tales como antibióticos, lantibióticos, bacteriocinas o endolisinas, etc.

La presente invención también se refiere a un envase farmacéutico que comprende uno o más compartimentos, en el que al menos un compartimento comprende una o más proteínas de fusión de acuerdo con la presente invención y/o uno o más huéspedes transformados con un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de fusión de acuerdo con la presente invención o una composición de acuerdo con la presente invención.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a un proceso de preparación de una composición farmacéutica, comprendiendo dicho proceso mezclar una o más proteínas de fusión de acuerdo con la presente invención y/o uno

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*Se muestra el rendimiento total de la proteína recombinante purificada por litro de cultivo de expresión de E. coli. Este valor se determinó mediante la medición espectrofotométrica de la concentración de proteína y el volumen total de la solución madre purificada. La purificación de los derivados de gp188 se realizó en condiciones más rigurosas (imidazol 65 mM) en comparación con los derivados de gp144 (imidazol 50 mM) para garantizar una pureza alta.

Caracterización de gp144 y gp188 modificadas con un pentapéptido hidrófobo

2.A. Actividad enzimática de gp144 y gp188 modificadas con un pentapéptido hidrófobo

Para evaluar la influencia de las modificaciones sobre la actividad enzimática de gp144 o gp188, se midió la actividad específica de las variantes en células de Pseudomonas aeruginosa permeabilizadas con cloroformo y se compararon con la endolisina no modificada correspondiente. Se ensayaron diferentes cantidades graduales de todas las endolisinas modificadas para determinar la curva de saturación correspondiente. La pendiente de la regresión lineal de la región lineal de esta curva es una medida de la actividad específica, y se expresó con relación a la pendiente de gp144 o gp188 sin modificar (Tabla 8).

Tabla 8 -Actividad enzimática de gp144 o gp188 modificadas con un péptido hidrófobo*

Fusión Endolisina

gp144 gp188

Pentapéptido hidrófobo 150 % 100 %

*Se determinó la actividad enzimática específica de las diferentes variantes y se expresó con relación a la actividad específica de la endolisina original correspondiente (= 100 %), que se ensayó simultáneamente. Las condiciones del tampón del ensayo fueron las condiciones óptimas de las endolisinas correspondientes (KH2PO4/K2HPO4I = 120 mM, pH 6,2 e I = 80 mM a pH 7,3 para gp144 y gp188, respectivamente).

2.B. Actividad antibacteriana de gp144 y gp188 modificadas con un pentapéptido hidrófobo

Se incubaron células PAO1 de P. aeruginosa exponenciales (~106/ml) a temperatura ambiente con gp144/gp188 sin modificar y modificadas. Después de 1 hora, se diluyeron las suspensiones celulares y se sembraron. Se contaron las colonias residuales tras una incubación durante la noche (Tabla 9). gp188 y gp144 sin modificar no reducen el número de células significativamente en comparación con el control negativo. Esta observación ilustra la eficacia de la membrana externa como barrera. La incubación con las proteínas de fusión de pentapéptidos hidrófobos causa una reducción significativa (α = 0,05) del número de células bacterianas (83 ± 7 y 69 ± 21 % para gp144 y gp188 modificadas, respectivamente). En general, los derivados de gp144 modificados tienden a tener una actividad antibacteriana más alta que los derivados de gp188.

Tabla 9 -Efecto antibacteriano de endolisinas gp144 y gp188 y sus derivados*

Células en crecimiento exponencial: Endolisina

gp144: gp188

Fusión: % log % log

Sin modificar: 0 ± 15 0,00 ± 0,06 10 ± 13 0,05 ± 0,06

Pentapéptido hidrófobo: 83 ± 7 0,9 ± 0,2 69 ± 21 0,7 ± 0,3

*Se diluyeron 100 veces células PAO1 de P. aeruginosa en crecimiento exponencial y se incubaron (densidad final de ~106/ml) con 10 µg de proteína no dializada (concentración final de 100 µg/ml, tampón: NaH2PO4-NaOH 30 mM, pH 7,4; NaCl 0,5 M; imidazol 0,5 M) durante 1 hora a temperatura ambiente. Las alícuotas se diluyen y se siembran. La actividad antibacteriana se expresa como la inactivación relativa (%) (= 100-(Ni/N0) * 100 con N0 = número de células no tratadas y Ni = número de células tratadas) y en unidades logarítmicas (=log10N0/Ni). Todas las muestras se replicaron seis veces. Se representan las medias/desviaciones estándar. El análisis estadístico se realizó mediante la prueba t de Student.

Ejemplo 3 Clonación, expresión y purificación de KZ144 y STM0016 modificadas con diversos tramos peptídicos en el extremo N-terminal de la endolisina

KZ144 de acuerdo con SEQ ID NO: 25 es una endolisina modular procedente del fago de Pseudomonas aeruginosa ΦKZ con un dominio de unión al peptidoglicano N-terminal y un dominio catalítico C-terminal (Briers et al., 2007). La endolisina KZ144 está codificada por la molécula de ácido nucleico de acuerdo con SEQ ID NO: 64. La molécula de ácido nucleico de acuerdo con SEQ ID NO: 64 se produjo sintéticamente con un sitio de restricción de BamH I (5'-GGA TCC-3') en el extremo 5' de la molécula de ácido nucleico y un sitio de restricción de Xho I (5'-CTC GAG-3’) en

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el extremo 3' de la molécula de ácido nucleico.

STM0016 es una hipotética proteína con homología con la endolisina N4-gp61 del fago N4 de E coli. La endolisina STM0016 está codificada por la molécula de ácido nucleico de acuerdo con SEQ ID NO: 65. La molécula de ácido nucleico de acuerdo con SEQ ID NO: 65 se produjo sintéticamente con un sitio de restricción de BamH I (5'-GGA TCC-3') en el extremo 5' de la molécula de ácido nucleico y un sitio de restricción de Xho I (5'-CTC GAG-3’) en el extremo 3' de la molécula de ácido nucleico.

N4-gp61 es una endolisina del fago N4 de E coli. La endolisina está codificada por el ácido nucleico de acuerdo con SEQ ID NO: 91. La molécula de ácido nucleico de acuerdo con SEQ ID NO: 91 se produjo sintéticamente con un sitio de restricción de BamH I (5'-GGA TCC-3') en el extremo 5' de la molécula de ácido nucleico y un sitio de restricción de Xho I (5'-CTC GAG-3’) en el extremo 3' de la molécula de ácido nucleico.

Los siguientes tramos peptídicos de la Tabla 10 se usaron para la producción de proteínas de fusión con la endolisina KZ144 o STM0016:

Tabla 10:

Tramo peptídico: Molécula de ácido nucleico que codifica el tramo peptídico

Pseudina 1 (SEQ ID NO:29): SEQ ID NO: 66

Ranalexina (SEQ ID NO:30): SEQ ID NO: 67

sushi 1 (SEQ ID NO:32): SEQ ID NO: 68

Variante de WLBU2 (SEQ ID NO:33): SEQ ID NO: 69

Melitina (SEQ ID NO:31): SEQ ID NO: 70

SMAP-29 (SEQ ID NO:11): SEQ ID NO: 71

Pleurocidina (SEQ ID NO: 6): SEQ ID NO: 72

Cecropina A (A. aegypti) (SEQ ID NO:14): SEQ ID NO: 73

Cecropina A (A. melanogaster) (SEQ ID NO: 15): SEQ ID NO: 74

Buforina II (SEQ ID NO:8): SEQ ID NO: 75

Sarcotoxina IA (SEQ ID NO:16): SEQ ID NO: 76

Las moléculas de ácido nucleico que codifican los respectivos tramos peptídicos se produjeron sintéticamente con un sitio de restricción de Nde I (5'-CAT ATG-3') en el extremo 5' de la molécula de ácido nucleico y un sitio de restricción de BamH I (5'-GGA TCC-3') en el extremo 3' de la molécula de ácido nucleico, excepto la molécula de ácido nucleico que codifica el péptido sushi 1, que se produjo con un sitio de restricción Nco I más dos nucleótidos adicionales (5'-CCA TGG GC-3') en el extremo 5' de la molécula de ácido nucleico.

Las proteínas de fusión se construyen mediante la unión de al menos dos secuencias de ácido nucleico usando técnicas de clonación convencionales según lo descrito, por ejemplo, por Sambrook et al. 2001, “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”. Por lo tanto, las moléculas de ácido nucleico que codifican los tramos peptídicos se escindieron en un producto de digestión con las respectivas enzimas de restricción Nde I y BamH I, y en el caso de la molécula de ácido nucleico que codifica el tramo peptídico sushi 1, el producto de digestión se realizó con las enzimas de restricción Nco I y BamH I. Posteriormente, se ligaron los ácidos nucleicos escindidos codificantes de los tramos peptídicos al vector de expresión pET21 b (Novagen, Darmstadt, Alemania), que también se escindió en un producto de digestión con las respectivas enzimas de restricción Nde I y BamH I anteriores. La molécula de ácido nucleico escindida que codifica el tramo peptídico sushi I se ligó a un vector de expresión pET32 b modificado (vector no modificado que se puede obtener en Novagen, Darmstadt, Alemania), que también se escindió en un producto de digestión con las respectivas enzimas de restricción Nco I y BamH I anteriores. La modificación del vector de expresión pET32b se refiere a la deleción de la secuencia que codifica un marcador de S y el marcador de His central.

Tras ello, se escindió la molécula de ácido nucleico codificante de la endolisina KZ144 en un producto de digestión con la enzima de restricción BamH I y Xho I, de modo que la endolisina se pudiera ligar al vector de expresión pET21b (Novagen, Darmstadt, Alemania) y al vector de expresión pET32 b modificado, respectivamente, que también se escindieron en un producto de digestión con las respectivas enzimas de restricción BamH I y Xho I anteriores. La molécula de ácido nucleico codificante de la endolisina STM0016 y la molécula de ácido nucleico codificante de la endolisina N4gp61 se escindieron en un producto de digestión con la enzima de restricción BamH I y Xho I, de modo que la endolisina respectiva se pudiera ligar al vector de expresión pET21b (Novagen, Darmstadt ,

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Ejemplo 4: Actividad antimicrobiana de la endolisina KZ144 modificada con diversos tramos peptídicos en el extremo N-terminal.

Se construyó la proteína de fusión que consistía en KZ144 y el tramo peptídico de hélice α4 como se describe en el 5 Ejemplo 1. Las otras proteínas de fusión que consistían en KZ144 y los respectivos tramos peptídicos se construyeron como se describe en el Ejemplo 3.

Como las cepas de ensayo, se usaron células DSMZ 11753 de E. coli, DSMZ 30007 de Accinetobacter baumannii y PAO1p de Pseudomonas aeruginosa (aislado de herida de quemadura, Queen Astrid Hospital, Brussels; Pirnay J. P. 10 et al. (2003), J Clin Microbiol., 41(3):1192-1202). Se diluyeron diez veces cultivos de una noche en medio LB recién preparado y se cultivaron a DO600 = 0,6. Se centrifugó el cultivo y se diluyó 10 veces en tampón de dilución (HEPES 10 mM, EDTA 0,5 mM; pH 7,4). Se incubaron las bacterias a temperatura ambiente con 10 µg de cada proteína de fusión no dializada a una concentración final de 100 µg/ml en tampón (NaH2PO4-NaOH 20 mM a pH 7,4; NaCl 0,5 M; imidazol 0,5 M). Tras 1 hora, se prepararon series de dilución de las células en PBS y se sembraron en LB. Además,

15 se sembró un control negativo usando tampón (NaH2PO4-NaOH 20 mM a pH 7,4; NaCl 0,5 M; imidazol 0,5 M). Se contaron las colonias residuales tras una incubación durante la noche a 37 ºC. Basándose en el recuento del número de células, se calculó la actividad antibacteriana como unidades logarítmicas (= log10N0/Ni con N0 = número de células no tratadas y Ni = número de células tratadas) (Tabla 11). Todas las muestras se replicaron cuatro veces.

20 La actividad antimicrobiana de estas proteínas de fusión se da en la siguiente tabla.

Tabla 11. Actividad antimicrobiana de KZ144 modificada con diversos tramos peptídicos frente a bacterias Gram negativas

Proteína de fusión: Parte enzimática Tramo peptídico (Nterminal a menos que se indique lo contrario) Actividad contra Pseudomonas aeruginosa Actividad contra DSMZ 11753 de E. coli Actividad contra DSMZ 30007 de Acinetobacter baumannii

SEQ ID NO: 77: KZ144 (SEQ ID NO:25) Pseudina 1 (SEQ ID NO:29) + n.d. n.d.

SEQ ID NO: 78: KZ144 (SEQ ID NO:25) Ranalexina (SEQ ID NO:30) + n.d. n.d.

SEQ ID NO: 79: KZ144 (SEQ ID NO:25) sushi 1 (SEQ ID NO:32) + n.d. ++

SEQ ID NO: 80: KZ144 (SEQ ID NO:25) Variante de WLBU2 (SEQ ID NO:33) n.d. + n.d.

SEQ ID NO: 81: KZ144 (SEQ ID NO:25) Melitina (SEQ ID NO:31) + n.d. n.d.

SEQ ID NO: 82: KZ144 (SEQ ID NO:25) SMAP-29 (SEQ ID NO: 11) +++ +++ n.d.

SEQ ID NO: 83: KZ144 (SEQ ID NO:25) Cecropina A (A. aegypti) (SEQ ID NO: 14) ++ + ++

SEQ ID NO: 84: KZ144 (SEQ ID NO:25) Pleurocidina (SEQ ID NO: 6) + n.d. n.d.

SEQ ID NO: 85: KZ144 (SEQ ID NO:25) Cecropina A (A. melanogaster) (SEQ ID NO:15) + n.d. n.d.

SEQ ID NO: 86: KZ144 (SEQ ID NO:25) Buforina II (SEQ ID NO:8) + n.d. n.d.

(SEQID NO: 87: KZ144 (SEQ ID NO:25) Sarcotoxina IA (SEQ ID NO:16) ++ ++ ++

SEQ ID NO: 93: KZ144 (SEQ ID NO:25) Hélice α4 (SEQ ID NO:92) ± n.d. n.d.

Abreviaturas: ± < 1 registro; +: 1 registro; ++: 2-3 registros; +++: 4 o más registros; n.d. significa que esta cepa no se ensayó con la proteína de fusión respectiva.

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Tabla 14:

SEQ ID NO: 94: gp188 (SEQ ID NO:2) hélice α4 (SEQ ID NO: 92) 6 n.d. n.d.

SEQ ID NO: 95: gp188 (SEQ ID NO:2) SMAP-29 (SEQ ID NO:11) ++ ++ ++

SEQ ID NO: 96: gp188 (SEQ ID NO:2) Sarcotoxina IA (SEQ ID NO: 16) + + +

Abreviaturas: ± < 1 registro; +: 1 registro; ++: 2-3 registros; n.d. significa que esta cepa no se ensayó con la proteína de fusión respectiva.

Ejemplo 8: Actividad antimicrobiana de la endolisina de Salmonella modificada con el tramo peptídico SMAP-29 en el extremo N-terminal

5 Las proteínas de fusión que consistían en la endolisina de Salmonella que tiene una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 3 y el tramo peptídico SMAP-29 se construyeron de manera análoga a la del Ejemplo 3. Como cepas de ensayo, se usaron DSMZ 11753 de E. coli y DSMZ 17058 de Salmonella typhimurium. La actividad antimicrobiana de la proteína de fusión se examinó como se describe en el Ejemplo 4. La actividad antimicrobiana

10 de esta proteína de fusión se da en la siguiente tabla.

Tabla 15:

Proteína de fusión: Parte enzimática Tramo peptídico (N-terminal a menos que se indique lo contrario) Actividad contra DSMZ 11753 de E. coli Actividad contra DSMZ 17058 de Salmonella typhimurium

SEQ ID NO: 97: Endolisina de Salmonella (SEQ ID NO:3) SMAP-29 (SEQ ID NO: 11) + +

Abreviaturas: +: 1 registro;

Ejemplo 9: La actividad antimicrobiana de la endolisina de Acinetobacter baumannii modificada con diversos tramos 15 peptídicos en el extremo N-terminal

Las proteínas de fusión que consistían en la endolisina de Acinetobacter baumannii que tiene una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 5 y los tramos peptídicos SMAP-29, Pseudina 1 y sushi 1 se construyeron de manera análoga a la del Ejemplo 3. Como cepas de ensayo, se usaron células DSMZ 30007 de

20 Acinetobacter baumannii y PAO1p de Pseudomonas aeruginosa (aislado de herida de quemadura, Queen Astrid Hospital, Brussels; Pirnay J. P. et al. (2003), J Clin Microbiol., 41(3):1192-1202). La actividad antimicrobiana de las proteínas de fusión se examinó como se describe en el Ejemplo 4. La actividad antimicrobiana de estas proteínas de fusión se da en la siguiente tabla.

25 Tabla 16:

Proteína de fusión: Parte enzimática Tramo peptídico (Nterminal a menos que se indique lo contrario) Actividad contra Pseudomonas aeruginosa Actividad contra DSMZ 30007 de Acinetobacter baumannii

(SEQ ID NO: 98: Endolisina de Acinetobacter baumannii (SEQ ID NO:5) Pseudina 1 (SEQ ID NO: 29) ± n.d.

SEQ ID NO: 99: Endolisina de Acinetobacter baumannii (SEQ ID NO:5) SMAP-29 (SEQ ID NO: 11) ++ ++

SEQ ID NO: 100: Endolisina de Acinetobacter baumannii (SEQ ID NO:5) sushi 1 (SEQ ID NO: 32) + +

Claims

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