CN117534733B - 抗菌肽cm24、重组基因、乳酸工程菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及基因工程技术领域，特别是涉及抗菌肽CM24、重组基因、乳酸工程菌及其应用。本发明提供的抗菌肽CM24对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均有良好的抑菌和杀菌效果，对无乳链球菌的最小抑菌浓度达到4μg/mL，对鼠和羊溶血活性低，RAW264.7细胞毒性低，具有应用潜质。另外，本发明提供的重组基因通过优化信号肽，提高了抗菌肽CM24在乳酸乳球菌中的外源蛋白的分泌，将为规模化生产饲料添加剂以及工程乳酸菌制剂等提供技术支持。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，特别是涉及抗菌肽CM24、重组基因、乳酸工程菌及其应用。
背景技术
近年来传统抗生素的大规模滥用导致越来越严重的病原微生物耐药问题，导致细菌对抗生素的耐药性越来越强，催生了大量的耐药性“超级细菌”，如广泛耐药的鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii）及金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）等。为了应对全球日益严重的抗生素耐药问题，急需开发新型的抗菌药物分子。
抗菌肽是一类具有抗菌活性的多肽类小分子，在昆虫、动物及植物中分布广泛，表现出良好且广谱的抗菌活性。同时由于抗菌肽具有分子量小、热稳定性强、水溶性好、无免疫原性、不易产生耐药性、抗菌谱广等特点使其成为了最优的抗生素替代分子。但现有的抗菌肽抗菌效果不理想，对无乳链球菌（Streptococcus agalactiae）这一类强有力的病原体的抗菌效果较差。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了抗菌肽CM24、重组基因、乳酸工程菌及其应用。本发明提供的抗菌肽CM24对无乳链球菌具有较好的抑制效果，MIC达到4 μg/mL，对鼠和羊溶血活性低，RAW264.7细胞毒性低，具有应用潜质。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
本发明提供了一种抗菌肽CM24，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明提供了一种重组基因，包括第一编码序列、第二编码序列和第三编码序列；所述第二编码序列位于所述第一编码序列和所述第三编码序列之间；所述第一编码序列为编码信号肽的核苷酸序列，所述信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述第二编码序列为编码前导肽的核苷酸序列，所述前导肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述第三编码序列为编码上述技术方案所述抗菌肽CM24的核苷酸序列。
优选的，所述第一编码序列如SEQ ID NO.9所示，所述第二编码序列如SEQ IDNO.10所示，所述第三编码序列如SEQ ID NO.12所示。
本发明提供了一种重组质粒，包括上述技术方案所述的重组基因和原始质粒。
优选的，所述原始质粒包括pNZ8148质粒。
本发明提供了一种工程乳酸菌，包括上述技术方案所述的重组质粒和原始乳酸菌。
本发明提供了上述技术方案所述的抗菌肽CM24或上述技术方案所述的重组基因或上述技术方案所述的重组质粒或上述技术方案所述的工程乳酸菌在制备抗菌产品中的应用，所述抗菌产品针对的菌包括革兰氏阴性菌和/或革兰氏阳性菌。
优选的，所述革兰氏阴性菌包括大肠杆菌（Escherichia coli）、鸡沙门氏菌（Salmonella enterica）和产气肠杆菌（Enterobacter aerogenes）中的一种或多种；所述革兰氏阳性菌包括无乳链球菌（Streptococcus agalactiae）和/或金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）。
优选的，所述抗菌产品包括抗菌药物或饲料添加剂。
本发明提供了一种抗细菌感染药物，所述抗细菌感染药物的有效成分包括上述技术方案所述的抗菌肽CM24。
有益效果：
本发明提供了一种抗菌肽CM24，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明提供的抗菌肽CM24对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均有良好的抑菌和杀菌效果，对无乳链球菌的最小抑菌浓度达到4 μg/mL，对鼠和羊溶血活性低，RAW264.7细胞毒性低，具有应用潜质。
另外，乳酸乳球菌用于生产饲料添加剂虽然不需要担心毒性问题，但乳酸乳球菌分泌表达抗菌肽时信号肽的断裂残基易影响抗菌肽活性和产量，本发明提供的重组基因通过优化信号肽，提高了抗菌肽CM24在乳酸乳球菌中的外源蛋白的分泌，将为规模化生产饲料添加剂以及工程乳酸菌制剂等提供技术支持。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为抗菌肽CM24重组菌PCR鉴定结果；
图2为抗菌肽CM24重组菌双酶切鉴定结果；
图3为抗菌肽CM24重组菌的SDS-PAGE鉴定结果；
图4为抗菌肽CM24重组菌的Tricine-SDS-PAGE鉴定结果；
图5为抗菌肽CM24重组菌的Western Blot鉴定鉴定结果；
图6为pNZ8148-USP45-1-CM24-EGFP乳酸菌表达肽的荧光效果；
图7为优化前后的乳酸菌USP45信号肽引导外源蛋白表达量的对比图。
具体实施方式
本发明提供了一种抗菌肽CM24，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，具体为：GWLKGWLKKIGKKIKRVGQHWRAL。本发明所述抗菌肽CM24对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均有良好的抑菌和杀菌效果，可人工合成也可通过工程菌进行外源表达。
为了提高抗菌肽CM24在工程菌中的外源表达量，本发明提供了一种重组基因，包括第一编码序列、第二编码序列和第三编码序列；所述第二编码序列位于所述第一编码序列和所述第三编码序列之间；所述第一编码序列为编码信号肽的核苷酸序列，所述信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述第二编码序列为编码前导肽的核苷酸序列，所述前导肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述第三编码序列为编码上述技术方案所述抗菌肽CM24的核苷酸序列。
在本发明中，所述第一编码序列优选如SEQ ID NO.9所示，所述第二编码序列优选如SEQ ID NO.10所示，所述第三编码序列优选如SEQ ID NO.12所示。本发明对所述重组基因的合成方法没有特殊要求，采用本领域技术人员所熟知的方法即可。乳酸乳球菌分泌表达抗菌肽时信号肽的断裂残基易影响抗菌肽活性和产量，本发明提供的重组基因通过优化信号肽，提高了抗菌肽CM24在乳酸乳球菌中的外源蛋白的分泌，将为规模化生产饲料添加剂以及工程乳酸菌制剂等提供技术支持。
本发明还提供了一种重组质粒，包括上述技术方案所述的重组基因和原始质粒。在本发明中，所述原始质粒优选包括pNZ8148质粒；所述重组基因优选位于pNZ8148质粒的Nco I和Hind III酶切位点之间。
本发明还提供了一种工程乳酸菌，包括上述技术方案所述的重组质粒和原始乳酸菌。在本发明中，所述原始乳酸菌优选包括乳酸乳球菌（Lactococcus lactis），更优选为乳酸乳球菌NZ9000。
本发明还提供了上述技术方案所述的抗菌肽CM24或上述技术方案所述的重组基因或上述技术方案所述的重组质粒或上述技术方案所述的工程乳酸菌在制备抗菌产品中的应用，所述抗菌产品针对的菌包括革兰氏阴性菌和/或革兰氏阳性菌。在本发明中，所述革兰氏阴性菌优选包括大肠杆菌、鸡沙门氏菌和产气肠杆菌中的一种或多种；所述革兰氏阳性菌包括无乳链球菌和/或金黄色葡萄球菌；所述抗菌产品优选包括抗菌药物或饲料添加剂。
本发明还提供了一种抗细菌感染药物，所述抗细菌感染药物的有效成分包括上述技术方案所述的抗菌肽CM24。在本发明中，所述抗菌肽CM24的最小抑菌浓度为4~64μg/mL。
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的抗菌肽CM24、重组基因、乳酸工程菌及其应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
抗菌肽CM24的合成及保存
将设计的抗菌肽CM24的序列（SEQ ID NO.1）送到吉尔生化（上海）有限公司进行化学合成（固相合成线型肽），合成的多肽经过高效液相色谱纯化，纯化纯度需达到95%以上。利用电喷雾质谱法（MMALDI-TOF MS）进行质谱鉴定，分析其分子质量，判定是否合成成功。将合成后冻干粉状态的多肽分装成小份后置于-80 ℃中保存。
试验菌株与试剂
大肠杆菌（Escherichia coli，E. coli ATCC25922）、鸡沙门氏菌（Salmonellaenterica ATCC10398）、产气肠杆菌（Enterobacter aerogenes，E. aerogenesATCC13048）、无乳链球菌（Streptococcus agalactiae ATCC13813）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，S. aureus ATCC43300）。
MH肉汤培养基（MHB）、MH琼脂培养基（MHA）：购于青岛海博生物技术有限公司；DMEM细胞培养基（Hyclone）、胎牛血清（Hyclone）、胰酶（Gibco）：购自于ThermoFisherScientific（美国）。
抗菌肽CM24最小抑菌浓度（MIC）测定
将试验细菌在37 ℃的MHB中培养至对数期，然后将菌悬液用MHB稀释至最终浓度为1×105 CFU/mL。然后，将50 µL含有不同浓度的抗菌肽CM24（终浓度为0.5~256 μg/mL）与50 µL细菌溶液混合添加到96孔板中，于37 ℃孵育16 h后，通过测量490 nm处的OD值得出MIC（最小抑菌浓度是荧光值忽然变大的前一浓度），以用MHB代替抗菌肽组作为阴性对照组，以加入等体积的细菌悬液组作为阳性对照组。每个处理组设置3次重复测定，3次重复得到的数值相同时，作为最终结果。结果见表1。
表1 抗菌肽CM24的最小抑菌浓度（μg/mL）
由表1可知，抗菌肽CM24对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的最小抑菌浓度为4~64μg/mL，对无乳链球菌的抑菌效果最好，最小抑菌浓度达到4 μg/mL。
抗菌肽杀菌浓度（MBC）的测定
根据抑菌浓度测定的基础上，在选择出最小抑菌浓度之后，抽取大于最小抑菌浓度的所有孔中的液体，涂在MHA培养基上，过夜培养，无菌落生长的平板所对应得抗菌肽浓度就是其杀菌浓度。结果见表2。
表2 抗菌肽CM24的杀菌浓度（μg/mL）
由表2可知，抗菌肽CM24对大肠杆菌、无乳链球菌和金黄色葡萄球菌有较好的杀菌效果。
溶血活性测定
参照Steiner等【Steiner H, Hultmark D, Engström A, et al. Sequence andspecificity of two antibacterial proteins involved in insect immunity[J].Journal of Immunology, 2009, 182(11):6635-6637.】提出的方法用于测定抗菌肽CM24的溶血活性。
采集健康的人、鼠、羊、兔和鸡的血，并将其在4 ℃下以1500 g离心5 min。将获得的红细胞洗涤3次并在10 mM PBS缓冲液（pH=7.4）中稀释10倍。然后，将50 μL红细胞悬液（终浓度为2%）加入等体积的抗菌肽CM24（PBS中的终浓度范围为0.5~256 μg/mL）。在37 ℃下孵育60 min后，使用酶标仪在570 nm下测量光吸收值。用0.1% Triton X-100处理的红细胞和用等体积PBS处理的红细胞分别用作阳性对照和阴性对照。每个处理组设置3次重复测定，根据以下公式计算溶血程度：
溶血率（%）=（试验管吸光度－阴性对照管吸光度）/（阳性对照管吸光度－阴性对照管吸光度）×100%。
红细胞溶血率达10%时抗菌肽的作用浓度见表3。
表3 红细胞溶血率达10%时抗菌肽的作用浓度（μg/mL）
由表3可知，以动物溶血率为10%时抗菌肽浓度为验证指标，动物红细胞受抗菌肽作用影响由大到小为：兔、鸡、人、鼠/羊。
人红细胞10%溶血时的最小溶血浓度，用MHC表示。并计算出不同革兰氏阴性菌和不同革兰氏阳性菌存在时抗菌肽CM24 MIC的几何平均值（GM），当MIC的值大于256 μg/mL时，将使用512 μg/mL的值来计算几何平均值。MHC和GM值用于计算治疗指数（TI），治疗指数公式为MHC/GM，当MHC的值大于256 μg/mL时，使用512 μg/mL的值来计算治疗指数。结果见表4。
表4 肽的MHC，GM和TI值
由表4可知，抗菌肽CM24对革兰氏阳性菌显示出更好的细胞选择性，表明CM24对革兰氏阳性菌具有更大的治疗潜力。
抗菌肽CM24对真核细胞活力的影响
抗菌肽对真核细胞的毒性参考Dong等【Dong N, Ma Q, Shan A, et al. Strandlength-dependent antimicrobial activity and membrane-active mechanism ofarginine-and valine-rich beta-hairpin-like antimicrobial peptides[J].Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2012, 56:2994-3003.】方法，采用MTT比色法测定。小鼠单核巨噬细胞株RAW 264.7接种在96孔中，密度为4×105细胞/孔，在37 ℃、5%CO2培养箱中孵育24 h，使细胞黏附于壁，当细胞完全贴壁后，将等体积（100 μL）的不同浓度的抗菌肽CM24（16~256 μg/mL）加入到96孔板中，然后在5% CO2中于37 ℃孵育24 h。随后，将10 μL MTT溶液（5 mg/mL）添加到每个孔中，并在37 ℃下孵育3~4 h。在每个孔中将混合溶液替换为100 μL二甲基亚砜（DMSO），并用酶标仪测定OD492吸光度测。每个处理组设置3次重复测定。
细胞存活率根据下面公式进行计算：细胞存活率（%）=（实验组OD值-阴性对照组OD值）/（阳性对照组OD值-阴性对照组OD值）×100%。
测定结果见表5。
表5 抗菌肽CM24的细胞毒性结果
注：IC50是指抗菌肽CM24能够引起小鼠巨噬细胞RAW 264.7达到半数致死量时的浓度。
由表5可知，抗菌肽CM24对RAW264.7细胞的毒性低。
实施例2
乳酸菌信号肽USP45的优化及抗菌肽CM24基因设计
通过NCBI检索信号肽USP45序列（GenBank: APW83827.1），其序列为：MVMKKKIISAILMSTVILSAAAPLSGVYAACGTTSSRELKLSLNQN，SEQ ID NO.2，根据文献【Zhou Y, Chen P, ShiS, et al. Expression of gallus epidermal growth factor (gEGF) with food-gradelactococcus lactis expression system and its biological effects on broilerchickens[J]. Biomolecules, 2021, 11(1): 103.】的记载，删除其非功能部分，以SEQ IDNO.8所述的序列为USP45序列的编码序列作为对照。在USP45氨基酸序列的基础上，通过删除非信号肽序列部分，并增加信号肽N端正电荷以及H区疏水性氨基酸个数，优化氨基酸使用频率，得到改进信号肽USP45-1序列，其序列如下：MGKKKIILAILMSLVILSAAAPLSGVYA，SEQID NO.3。在信号肽和抗菌肽CM24之间设计一段前导肽，序列如下：LEISSTCDA，SEQ IDNO.4；根据改进前后的信号肽、前导肽和抗菌肽CM24设计优化前后的重组基因，本发明的核苷酸序列均是5’-3’方向，具体序列如下：
优化前未含有荧光蛋白的重组基因作为对照，记为USP45-CM24，核苷酸序列如SEQID NO.5所示，具体如下：CCATGGGCATGGTTATGAAGAAGAAGATTATTTCAGCTATTTTAATGTCAACTGTTATTTTATCAGCTGCTGCTCCATTATCAGGTGTTTATGCTGGTTGGTTAAAAGGTTGGTTAAAGAAGATTGGTAAGAAGATTAAGCGTGTTGGTCAACATTGGCGTGCTTTACATCATCATCATCATCATTAAAAGCTT；
优化前含有荧光蛋白的重组基因，记为USP45-CM24-EGFP，核苷酸序列如SEQ IDNO.6所示，具体如下：CCATGGGCATGGTTATGAAGAAGAAGATTATTTCAGCTATTTTAATGTCAACTGTTATTTTATCAGCTGCTGCTCCATTATCAGGTGTTTATGCTTTAGAAATTTCAAGTACTTGTGATGCTGGTTGGTTAAAAGGTTGGTTAAAGAAGATTGGTAAGAAGATTAAGCGTGTTGGTCAACATTGGCGTGCTTTAATGGTTAGTAAGGGTGAAGAATTATTTACTGGTGTTGTTCCTATTTTAGTTGAATTAGATGGTGATGTTAATGGTCATAAATTTTCAGTTTCAGGTGAAGGTGAAGGTGATGCTACTTATGGTAAATTAACTTTAAAGTTTATTTGTACTACTGGTAAGTTACCAGTTCCTTGGCCAACTTTAGTTACTACTTTAACTTATGGTGTTCAATGTTTTTCACGTTATCCAGATCATATGAAGCAACATGATTTTTTTAAGTCAGCTATGCCTGAAGGTTATGTTCAAGAACGTACTATTTTTTTTAAGGATGATGGTAATTATAAGACTCGTGCTGAAGTTAAGTTTGAAGGTGATACTTTAGTTAATCGTATTGAATTAAAGGGTATTGATTTTAAGGAAGATGGTAATATTTTAGGTCATAAGTTAGAATATAATTATAATTCACATAATGTTTATATTATGGCTGATAAGCAAAAGAATGGTATTAAAGTTAATTTTAAGATTCGTCATAATATTGAAGATGGTAGTGTTCAATTAGCTGATCATTATCAACAAAATACTCCAATTGGTGATGGTCCAGTTTTATTACCAGATAATCATTATTTATCAACTCAATCAGCTTTATCAAAGGATCCAAATGAAAAACGTGATCATATGGTTTTATTAGAATTTGTTACTGCTGCTGGTATTACTTTAGGTATGGATGAATTATATAAGTCAGGTGCTGCAGCTGCTGCTGCTGCAGCTGCAGCTGAATTTCCAGGTTTAGAAAAATTAGGTTCAACTGGTTCACGTCATCATCATCATCATCATTAAAAGCTT；
优化后含有荧光蛋白的重组基因，记为USP45-1-CM24-EGFP，核苷酸序列如SEQ IDNO.7所示，具体如下：CCATGGGCATGGGTAAGAAGAAGATTATTTTAGCTATTTTAATGTCATTAGTTATTTTATCAGCTGCTGCTCCATTATCAGGTGTTTATGCTTTAGAAATTTCAAGTACTTGTGATGCTGGTTGGTTAAAAGGTTGGTTAAAGAAGATTGGTAAGAAGATTAAGCGTGTTGGTCAACATTGGCGTGCTTTAATGGTTAGTAAGGGTGAAGAATTATTTACTGGTGTTGTTCCTATTTTAGTTGAATTAGATGGTGATGTTAATGGTCATAAATTTTCAGTTTCAGGTGAAGGTGAAGGTGATGCTACTTATGGTAAATTAACTTTAAAGTTTATTTGTACTACTGGTAAGTTACCAGTTCCTTGGCCAACTTTAGTTACTACTTTAACTTATGGTGTTCAATGTTTTTCACGTTATCCAGATCATATGAAGCAACATGATTTTTTTAAGTCAGCTATGCCTGAAGGTTATGTTCAAGAACGTACTATTTTTTTTAAGGATGATGGTAATTATAAGACTCGTGCTGAAGTTAAGTTTGAAGGTGATACTTTAGTTAATCGTATTGAATTAAAGGGTATTGATTTTAAGGAAGATGGTAATATTTTAGGTCATAAGTTAGAATATAATTATAATTCACATAATGTTTATATTATGGCTGATAAGCAAAAGAATGGTATTAAAGTTAATTTTAAGATTCGTCATAATATTGAAGATGGTAGTGTTCAATTAGCTGATCATTATCAACAAAATACTCCAATTGGTGATGGTCCAGTTTTATTACCAGATAATCATTATTTATCAACTCAATCAGCTTTATCAAAGGATCCAAATGAAAAACGTGATCATATGGTTTTATTAGAATTTGTTACTGCTGCTGGTATTACTTTAGGTATGGATGAATTATATAAGTCAGGTGCTGCAGCTGCTGCTGCTGCAGCTGCAGCTGAATTTCCAGGTTTAGAAAAATTAGGTTCAACTGGTTCACGTCATCATCATCATCATCATTAAAAGCTT；
其中，SEQ ID NO.5~SEQ ID NO.7的序列中，CCATGG为Nco I酶切位点序列，第7~8位的碱基GC为保护性碱基；ATGGTTATGAAGAAGAAGATTATTTCAGCTATTTTAATGTCAACTGTTATTTTATCAGCTGCTGCTCCATTATCAGGTGTTTATGCT（SEQ ID NO.8）为信号肽USP45的编码序列；ATGGGTAAGAAGAAGATTATTTTAGCTATTTTAATGTCATTAGTTATTTTATCAGCTGCTGCTCCATTATCAGGTGTTTATGCT（SEQ ID NO.9）为信号肽USP45-1的编码序列；TTAGAAATTTCAAGTACTTGTGATGCT（SEQ IDNO.10）为前导肽的编码序列；GGTTGGTTAAAAGGTTGGTTAAAGAAGATTGGTAAGAAGATTAAGCGTGTTGGTCAACATTGGCGTGCTTTA（SEQ ID NO.11）为抗菌肽CM24的编码序列；ATGGTTAGTAAGGGTGAAGAATTATTTACTGGTGTTGTTCCTATTTTAGTTGAATTAGATGGTGATGTTAATGGTCATAAATTTTCAGTTTCAGGTGAAGGTGAAGGTGATGCTACTTATGGTAAATTAACTTTAAAGTTTATTTGTACTACTGGTAAGTTACCAGTTCCTTGGCCAACTTTAGTTACTACTTTAACTTATGGTGTTCAATGTTTTTCACGTTATCCAGATCATATGAAGCAACATGATTTTTTTAAGTCAGCTATGCCTGAAGGTTATGTTCAAGAACGTACTATTTTTTTTAAGGATGATGGTAATTATAAGACTCGTGCTGAAGTTAAGTTTGAAGGTGATACTTTAGTTAATCGTATTGAATTAAAGGGTATTGATTTTAAGGAAGATGGTAATATTTTAGGTCATAAGTTAGAATATAATTATAATTCACATAATGTTTATATTATGGCTGATAAGCAAAAGAATGGTATTAAAGTTAATTTTAAGATTCGTCATAATATTGAAGATGGTAGTGTTCAATTAGCTGATCATTATCAACAAAATACTCCAATTGGTGATGGTCCAGTTTTATTACCAGATAATCATTATTTATCAACTCAATCAGCTTTATCAAAGGATCCAAATGAAAAACGTGATCATATGGTTTTATTAGAATTTGTTACTGCTGCTGGTATTACTTTAGGTATGGATGAATTATATAAGTCAGGTGCTGCAGCTGCTGCTGCTGCAGCTGCAGCTGAATTTCCAGGTTTAGAAAAATTAGGTTCAACTGGTTCACGT（SEQ ID NO.12）为EGFP荧光蛋白的编码序列；CATCATCATCATCATCAT（SEQ ID NO.13）为组氨酸标签的编码序列；AAGCTT为Hind III酶切位点序列。
将重组基因USP45-CM24、USP45-CM24-EGFP和USP45-1-CM24-EGFP由南京钟鼎生物技术有限公司进行全基因合成，并分别构建于载体pNZ8148中，得到重组质粒pNZ8148-USP45-CM24、pNZ8148-USP45-CM24-EGFP和pNZ8148-USP45-1-CM24-EGFP，分别转化到大肠杆菌MC1061中。
实施例3
抗菌肽CM24重组菌的构建与鉴定
（1）乳酸菌（Lactococcus lactis）NZ9000感受态的制备：复苏乳酸菌NZ9000，并接种于MRS固体培养基中，30℃静置培养36 h；挑取单一菌落于5 mL G/L-SGM17液体培养基中，30℃静置培养12 h；所述G/L-SGM17液体培养基的配方为：4.225 g GM17肉汤、17.1 g蔗糖、2.5 g甘氨酸，溶于100 mL双蒸水，115℃，灭菌20min，pH=6.25；按照1：10（V/V）的比例接种于50 mL G/L-SGM17液体培养基中，30℃静置培养，当菌液OD600=0.3时停止培养；取2 mL培养后菌液于2 mL离心管中，7500 rpm，4℃离心10 min，弃去离心后的上清液，用1 mL洗涤液1充分重悬，7500 rpm、10 min、4℃离心，弃去上清液，用1 mL洗涤液2进行重悬，将重悬后的菌液置于冰上冰浴15 min，冰浴结束后7500 rpm、10 min、4℃离心，弃去上清液，用1 mL洗涤液1进行重悬，7500 rpm、10 min、4℃离心，弃去上清液，最后用40 μL洗涤液1进行重悬；所述洗涤液1的配方为：8.55 g蔗糖、5 mL甘油，50 mL容量瓶添加双蒸水定容至50 mL，使用滤膜过滤备用；所述洗涤液2的配方为：8.55 g蔗糖、5 mL甘油、0.9306 g EDTA，50 mL容量瓶添加双蒸水定容至50 mL，使用滤膜过滤备用。
（2）抗菌肽CM24重组菌的电转化：将0.2 cm电转杯提前置于无水乙醇中浸泡30min后，取出放置在超净台中晾干，最后放于冰上预冷备用。提取实施例2构建的3种重组质粒，并将重组质粒浓度调整至100 ng/μL。将步骤（1）中的乳酸菌NZ9000感受态细胞置于冰上解冻，解冻后，向其中加入2 μL重组质粒，用移液枪轻轻混匀；取出预冷后的电转杯，向电转杯中央缓慢滴加感受态细胞与重组质粒的混合溶液，尽量避免气泡的产生，盖好电转杯盖子；设置双波电穿孔系统电场为12.5 kV/cm、电容为25 μF、电阻为220 Ω、电压为2.5kV、脉冲为4.5~5.0 msec；将电转杯插入电转槽中，盖好防护罩进行电转；电转结束后立即向电转杯中加入960 μL复苏培养基；所述复苏培养基的配方为：4.23 g/L M17肉汤（购自酷莱博）、0.022 g/L氯化镁和0.19 g/L氯化钙；将电转杯置于冰上冰浴5 min，取冰浴后电转杯内菌液于灭菌后的1.5 mL离心管中，30℃静置复苏培养1.5 h，最后分别取10 μL和100 μL复苏后菌液于含25 μg/mL氯霉素的MRS固体培养基上进行涂板，30℃恒温静置培养36 h，进行菌落计数和质粒提取。
（3）乳酸菌质粒提取、PCR和双酶切验证：挑取每个抗菌肽CM24重组菌样本单菌落（每个样本6个），分别接种于5 mL含25 μg/mL氯霉素的GM17液体培养基（含0.5%葡萄糖的M17培养基，M17购自酷莱博）中，30℃静置培养12 h，培养后的菌液用索莱宝公司的革兰氏阳性菌质粒小量提取试剂盒进行质粒提取。
将提取的质粒浓度，用双蒸水稀释至0.5~20 ng/μL，依照反应体系将所用试剂加入PCR管中；所述反应体系为：2×Taq PCR Mix 25μL、上下游引物各1μL、质粒1μL和双蒸水22μL；重组质粒pNZ8148-USP45-CM24、pNZ8148-USP45-CM24-EGFP使用引物的引物均如下所示：
上游引物：CCATGGGCATGGTTATGAAG，SEQ ID NO.14；
下游引物：AAGCTTTTAATGATGATGAT，SEQ ID NO.15；
pNZ8148-USP45-1-CM24-EGFP使用的引物如下所示：
上游引物：CCATGGGCATGGGTAAGAAG，SEQ ID NO.16；
下游引物：AAGCTTTTAATGATGATGAT，SEQ ID NO.15；
反应条件设置为：95℃预变性3min；95℃变性25s，58℃退火40s，72℃延伸1min，72℃复性7min，25个循环。反应结束后进行琼脂糖凝胶电泳。结果如图1所示，其中M：DNAMarker；1-6：pNZ8148-USP45-CM24；7-12：pNZ8148-USP45-1-CM24-EGFP；13-18：pNZ8148-USP45-CM24-EGFP。
由图1可知，3条抗菌肽CM24重组菌的PCR条带与电转前PCR结果一致，初步证明抗菌肽CM24重组菌构建成功。
将质粒用限制性内切酶Nco I和Hind III按照体系（K Buffer 2 μL、BSA 2μL、模版1 μg、Nco I 1μL、Hind III 1μL、双蒸水补至20 μL）加至0.2 mL离心管中，37℃水浴加热4 h，取9 μL双酶切反应产物与1 μL Loading Buffer混匀，进行琼脂糖凝胶电泳。结果如图2所示，其中M：DNA Marker；1：pNZ8148-USP45-CM24-EGFP；2：pNZ8148-USP45-1-CM24-EGFP；3：pNZ8148-USP45-CM24。
由图2可知，3条重组菌的双酶切条带与电转前一致，进一步证实抗菌肽CM24重组菌构建成功。
实施例4
抗菌肽CM24重组菌蛋白的诱导表达、验证与表达产物活性检测
挑取实施例3电转化成功的转化子接种于5 mL新鲜的GM17液体培养基中，30℃恒温静置培养12 h，以1：20的比例接种于100 mL GM17液体培养基内，当菌液OD600=0.4时，加入4 mL稀释1000倍的Nisin母液（CAS号：1414-45-5），继续30℃恒温静置培养12 h后，停止培养。
取2 mL培养后菌液于2 mL离心管内，8000 rpm，4℃离心10 min；吸取1 mL离心后上清液于1.5 mL离心管内，加入111 μL 100%的三氯乙酸（TCA），置于4℃冰箱内过夜；次日12000 rpm，4℃离心15 min，弃去上清液，沉淀用1 mL预冷的丙酮洗涤两次，洗涤后的沉淀于室温下风干，用40 μL 50 mM的氢氧化钠（NaOH）溶液溶解。
SDS-PAGE鉴定、Tricine-SDS-PAGE鉴定和Western Blot鉴定：
（1）向沉淀后pNZ8148-USP45-CM24-EGFP和pNZ8148-USP45-1-CM24-EGFP的蛋白样品中加入10 μL 5×上样缓冲液（碧云天，P0015），95℃金属浴加热10 min，加热后冷却至室温后备用。经SDS-PAGE凝胶制备、SDS-PAGE凝胶电泳和凝胶染色、显影后，观察结果。结果如图3所示，其中，M：蛋白Marker；1：乳酸菌NZ9000上清液；2：pNZ8148-USP45-CM24-EGFP菌液上清蛋白沉淀；3：pNZ8148-USP45-1-CM24-EGFP菌液上清蛋白沉淀；4：pNZ8148-USP45-CM24-EGFP菌体破碎后上清；5：pNZ8148-USP45-1-CM24-EGFP菌体破碎后上清；6：pNZ8148-USP45-CM24-EGFP菌体破碎后沉淀；7：pNZ8148-USP45-1-CM24-EGFP菌体破碎后沉淀。
（2）将pNZ8148-USP45-CM24蛋白沉淀与40 μL 2×上样缓冲液混合，100℃金属浴加热10 min，冷却至室温后备用。经过Tricine-SDS-PAGE凝胶制备、Tricine-SDS-PAGE凝胶电泳和凝胶染色、显影后，观察结果。结果如图4所示，其中，M：蛋白Marker；1-2：pNZ8148-USP45-CM24菌液上清沉淀。
（3）取不经染色的SDS-PAGE和Tricine-SDS-PAGE电泳后的分离胶，将PVDE膜和厚滤纸剪裁成与分离胶相同的大小，在电转印液内浸泡30 s，取出后放入双蒸水中浸泡1min；将海绵、滤纸、PVDE膜依次叠加，轻轻擀开膜间气泡，放入电转印槽内，75 V、200 mA、40min进行转膜。转膜结束后，将PVDE膜放入盛有脱脂奶粉溶液的容器中，37℃脱色摇床慢摇2h进行封闭。封闭结束后，取出PVDE膜，放入干净容器内，加入没过PVDE膜的TBST，放置脱色摇床慢摇10 min，倒掉TBST完成清洗，共清洗3次。清洗后在PVDE膜的容器内加入适量的His-tag抗体（一抗），4℃慢摇过夜；次日用TBST清洗3次，之后加入山羊抗小鼠二抗进行孵育，37℃慢摇1 h；孵育结束后，用TBST清洗3次；最后取出PVDE膜，均匀滴加发光液曝光显影后，观察结果。结果如图5和图6所示，其中图5中的A，M：蛋白Marker；1：pNZ8148-USP45-CM24-EGFP；2：pNZ8148-USP45-1-CM24-EGFP；图5中的B，M：蛋白Marker；1：pNZ8148-USP45-CM24。
由图3可知，2~5道在31.0~43.0 kDa处出现一条颜色较深也较为粗的条带，与前期蛋白预测大小36.85 kDa和36.72 kDa结果相近，其中改进前信号肽目的条带占比60.9%、改进后信号肽目的条带占比62.8%。同时从2~3道出现条带可以证实抗菌肽CM24重组菌通过诱导剂Nisin的诱导能够生产蛋白，并且实现了蛋白的外表达；而2~3道与4~5道相对比，明显可以看出菌液上清的蛋白浓度要高于细菌内的蛋白浓度，在破碎细菌沉淀中几乎看不出有蛋白条带。
由图4可知，在5.8~7.8 kDa之间有条带，而pNZ8148-USP45-CM24蛋白的预测大小为6.7 kDa，其结果相近；同时Tricine-SDS-PAGE结果同样证明抗菌肽CM24重组菌可以对蛋白进行细胞外表达。
由图5中的A可知，条带大小与预测和SDS-PAGE的结果相一致；图5中的B也与预测和Tricine-SDS-PAGE结果一致，图6（标尺为100μm）显示所设计的信号肽可以辅助表达CM24-GFP，这证明了乳酸菌表达系统能够表达抗菌肽CM24，也证明了所设计信号肽的适用性。
综合SDS-PAGE和WB的结果可知，改进后信号肽的条带要更粗且更明显，这是因为改进后其蛋白表达量更高，因此在结果图中更为清晰，可见改进后的信号肽要优于改进前。
BCA蛋白浓度测定：BCA蛋白浓度测定试剂盒购自碧云天公司，根据试剂盒说明书操作，对沉淀后的抗菌肽CM24重组菌蛋白进行蛋白浓度测定。将1 mL菌液上清通过TCA/丙酮法沉淀后，用40 μL NaOH复溶，其复溶蛋白用BCA蛋白浓度测定试剂盒进行蛋白浓度测定，根据BCA蛋白浓度测定试剂盒说明书操作，对蛋白标准进行吸光度测定，依照结果绘制蛋白标准曲线，其回归方程为y=2.793x-0.4165（R2=0.9899），依据回归方程计算出pNZ8148-USP45-CM24的40 μL的蛋白浓度为2.72 mg/mL，pNZ8148 -USP45-CM24-EGFP的40μL的蛋白浓度为2.93 mg/mL，pNZ8148-USP45-1- CM24-EGFP的40 μL的蛋白浓度为3.80mg/mL，计算出其分别是108.78 mg/L、117.10 mg/L和151.81 mg/L（图7）。
综上所述，本发明提供的抗菌肽CM24对无乳链球菌具有较好的抑制效果，MIC达到4 μg/mL，对鼠和羊溶血活性低，RAW264.7细胞毒性低，具有应用潜质。而乳酸乳球菌分泌表达抗菌肽时信号肽的断裂残基易影响抗菌肽活性和产量，通过优化信号肽，提高CM24在乳酸菌中的外源蛋白的分泌，将为规模化生产饲料添加剂以及工程乳酸菌制剂等提供技术支持。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
Claims (9)
1.一种抗菌肽CM24，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种重组基因，其特征在于，包括第一编码序列、第二编码序列和第三编码序列；所述第二编码序列位于所述第一编码序列和所述第三编码序列之间；所述第一编码序列为编码信号肽的核苷酸序列，所述信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述第二编码序列为编码前导肽的核苷酸序列，所述前导肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述第三编码序列为编码权利要求1所述抗菌肽CM24的核苷酸序列。
3.根据权利要求2所述的重组基因，其特征在于，所述第一编码序列如SEQ ID NO.9所示，所述第二编码序列如SEQ ID NO.10所示，所述第三编码序列如SEQ ID NO.12所示。
4.一种重组质粒，其特征在于，包括权利要求2或3所述的重组基因和原始质粒。
5.根据权利要求4所述的重组质粒，其特征在于，所述原始质粒包括pNZ8148质粒。
6.一种工程乳酸菌，其特征在于，包括权利要求4或5所述的重组质粒和原始乳酸菌。
7.权利要求1所述的抗菌肽CM24或权利要求2或3所述的重组基因或权利要求4或5所述的重组质粒或权利要求6所述的工程乳酸菌在制备抗菌产品中的应用，所述抗菌产品针对的菌为革兰氏阴性菌和/或革兰氏阳性菌；所述革兰氏阴性菌为大肠杆菌（Escherichia coli）、鸡沙门氏菌（Salmonella enterica）和产气肠杆菌（Enterobacter aerogenes）中的一种或多种；所述革兰氏阳性菌为无乳链球菌（Streptococcus agalactiae）和/或金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述抗菌产品包括抗菌药物或饲料添加剂。
9.一种抗细菌感染药物，其特征在于，所述抗细菌感染药物的有效成分包括权利要求1所述的抗菌肽CM24；所述抗细菌感染药物针对的菌为革兰氏阴性菌和/或革兰氏阳性菌；所述革兰氏阴性菌为大肠杆菌（Escherichia coli）、鸡沙门氏菌（Salmonella enterica）和产气肠杆菌（Enterobacter aerogenes）中的一种或多种；所述革兰氏阳性菌为无乳链球菌（Streptococcus agalactiae）和/或金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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