CN116143899B - 一种重组抗菌肽pANG4及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种重组抗菌肽pANG4及其制备方法与应用。该重组抗菌肽pANG4的氨基酸序列如SEQ_1所示，编码SEQ_1所示氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ_2所示。这种新的抗菌肽pANG4具有广谱抗菌性，对革兰氏阴性病原菌E. coli K88+(CVCC225)、E. coli (ATCC25922)、Salmonella typhimurium (ATCC14028)、(Pseudomonas aeruginosa (ATCC27853)和革兰氏阳性病原菌Staphylococcus aureus (ATCC25923)、Erysipelothrix rhusiopathiae(CVCC1241)均有抑菌作用，128μg/mL及以下浓度无溶血性，无细胞毒性；并且在猪的肠上皮细胞中表现出促进细胞增殖，降低肠道凋亡基因表达，抑制肠道炎性因子基因表达，并且能够通过上调紧密连接蛋白基因表达从而提高肠道屏障功能。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程及生物技术领域，具体涉及一种重组抗菌肽pANG4及其制备方法与应用。
背景技术
我国于2020年7月起禁止将抗生素添加于饲料中。研发抗生素替代产品是畜牧行业发展的迫切需要。抗菌肽、中草药制剂、益生菌、植物提取物和酶制剂等是目前研究较多的替抗制剂。其中抗菌肽作为一种非特异性抗菌蛋白，是生物体内由特定基因编码的内源性多肽，在生物机体免疫系统中具有重要作用。其在动物、植物甚至微生物体内都广泛存在，对细菌、病毒、肿瘤和寄生虫都具有杀伤作用，并且对多种耐药菌有效、不易产生耐药性，具有十分广阔的应用前景。
血管生成素（Angiogenin, ANG）家族是一个与血管生成密切相关的家族，是一族分泌性单链蛋白，属于核糖核酸酶（RNase A）超家族，具有较低的RNase活性。该家族广泛存在于生物机体多种组织中，具有促进血管生成，调节炎症，抑制细菌蛋白质合成的作用。ANG4（Angiogenin 4, ANG4）是ANG家族中的一种新型抗菌肽，在小鼠、猪和鸡中均有表达，研究发现，鼠源ANG4（mouse angiogenin 4, mANG4）具有选择性抑菌功能，对肠道微生物菌群具有调节作用。另有研究发现IL-25 （Interleukin 25）、IL-13（Interleukin 13）等抗炎因子可促进ANG4的分泌，而ANG4主要是在肠道内分泌，从而推测ANG4可能在调节肠道炎症，维护肠道屏障完整性等方面发挥了重要作用。分析发现，猪源ANG4（porcine angiogenin4, pANG4）与鼠源ANG4同源性为97.20%，预示着猪源ANG4也可能拥有多样的生物学功能，但有关猪源ANG4的生物学功能的研究鲜有报道。
巴斯德毕赤酵母是一种较低等的真核生物，其基因易被改造，且易于培养，可进行大量发酵。真核表达系统中的毕赤酵母表达系统与高等生物的表达更为相似，相比于大肠杆菌等原核表达系统而言，可以以甲醇为唯一碳源用于生长和诱导表达蛋白；重组表达菌株可进行高密度发酵，更高效地表达外源基因；毕赤酵母为真核表达系统，目的基因可在毕赤酵母中翻译后进行加工，且其内环境适合蛋白质正确折叠并进行糖链加工，能保证表达蛋白的活性；诱导分泌型质粒还能将目的蛋白分泌到培养液中，有利于蛋白纯化。为此本发明尝试以毕赤酵母外源表达猪源ANG4开发一种重组抗菌肽，进而为异源表达抗菌肽开发抗生素替代产品的研究提供一定的技术支撑。
发明内容
针对现有技术存在的问题和缺陷，本发明提供一种重组抗菌肽pANG4及其制备方法与应用。该重组抗菌肽pANG4具有广谱抗菌性，对革兰氏阴性病原菌E. coli K88+ (CVCC225)、E. coli (ATCC25922)、Salmonella typhimurium (ATCC14028)、(Pseudomonas aeruginosa (ATCC27853)和革兰氏阳性病原菌Staphylococcus aureus (ATCC25923)、Erysipelothrix rhusiopathiae (CVCC1241)均有抑菌作用，并且可以提高肠上皮细胞活性，降低肠道凋亡基因表达，抑制肠道炎性因子基因表达。本发明的技术方案为：
第一方面，本发明提供一种重组抗菌肽pANG4，所述重组抗菌肽pANG4的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
第二方面，本发明提供包含上述重组抗菌肽pANG4的重组表达载体。
进一步地，所述重组表达载体为以pPICZαA为目的质粒的pPICZαA-pANG4。
第三方面，本发明提供可表达上述重组抗菌肽pANG4的重组毕赤酵母工程菌。
第四方面，本发明提供一种重组抗菌肽pANG4的制备方法，包括：
步骤1，获得如SEQ ID NO.3所示的猪源ANG4成熟肽基因序列；
步骤2，根据 P. pastoris 偏嗜性优化ANG4成熟肽基因序列，且在目的基因N端添加Xho Ⅰ识别序列，C端添加Xba Ⅰ识别序列，在基因的N端设Kex2蛋白酶裂解位点，C段加上防移码碱基，并合成设计好的基因片段；
步骤3，将合成基因片段连接到目的质粒中，构建重组表达质粒；
步骤4，制备毕赤酵母X-33感受态细胞；
步骤5，采用电击转化法将重组表达质粒转入到毕赤酵母X-33感受态细胞中，获得阳性转化子；
步骤6，将阳性转化子在毕赤酵母培养基中培养进行诱导表达，离心，得上清液分离纯化，即得。
进一步地，所述步骤3中目的质粒为pPICZαA。
进一步地，所述步骤6中，毕赤酵母培养基为BMGY培养基，培养的条件是29℃、220r/min振荡培养，诱导表达使用的诱导剂是体积终浓度为1%的甲醇，每隔24 h补充甲醇至体积终浓度为1%，诱导表达的时间为72～96h。
所述步骤6中，分离纯化方式为镍柱层析。
第五方面，本发明提供上述重组抗菌肽pANG4在制备广谱抗菌药物中的应用。
第六方面，本发明提供上述重组抗菌肽pANG4在肠上皮细胞增殖培养上的应用。
第七方面，本发明提供一种肠上皮细胞增殖培养方法，包括：
（1）将肠上皮细胞采用DMEM-F12完全培养基进行初步培养至融合度达到80±5%；
（2）加入上述重组抗菌肽pANG4预处理肠上皮细胞，再加入H2O2进一步处理肠上皮细胞。
进一步地，所述肠上皮细胞为IPEC-J2。
进一步地，所述DMEM-F12完全培养基按照体积百分比的组成为：10% FBS，1% 双抗PS，余量为DMEM-F12。
进一步地，所述重组抗菌肽pANG4在培养体系中的终浓度为16~64μg/mL，处理时间为6~12h。
优选地，所述重组抗菌肽pANG4在培养体系中的终浓度为32μg/mL，处理时间为12h。
进一步地，所述H2O2在培养体系中的终浓度为0.4~0.8mmol/L，处理时间为2~3h。
优选地，所述H2O2在培养体系中的终浓度为0.6mmol/L，处理时间为2h。
第八方面，本发明提供上述重组抗菌肽pANG4在制备预防、缓解、治疗肠道炎性损伤的药物上的应用。
本发明提供了一种新的重组抗菌肽—重组猪源血管生产素4（pANG4），以及编码该重组抗菌肽的核苷酸序列，毕赤酵母可分泌表达pANG4至细胞外，解决了细胞破碎的繁琐步骤。这种新的抗菌肽pANG4具有广谱抗菌性，对革兰氏阴性病原菌E. coli K88+(CVCC225)、E. coli (ATCC25922)、Salmonella typhimurium (ATCC14028)、(Pseudomonas aeruginosa (ATCC27853)和革兰氏阳性病原菌Staphylococcus aureus (ATCC25923)、Erysipelothrix rhusiopathiae (CVCC1241)均有抑菌作用，128 μg/mL及以下浓度无溶血性，无细胞毒性；并且在猪的肠上皮细胞中表现出促进细胞增殖，降低肠道凋亡基因表达，抑制肠道炎性因子基因表达，并且能够通过上调紧密连接蛋白基因表达从而提高肠道屏障功能。
附图说明
图1为菌液PCR产物凝胶电泳结果，M: DNA标准分子量(DL2000)；1、5：使用通用引物T1、T2扩增得到837bp目的产物；3、7：使用ANG4成熟肽的引物T3、T4扩增得到360bp目的产物；2、4、6：空白泳道；
图2为重组表达质粒pPICZαA-pANG4双酶切结果，M1: DNA标准分子量(DL2000)；M2: DNA标准分子量(DL5000)；1：质粒pPICZαA-pANG4双酶切鉴定结果；2：质粒pPICZαA-pANG4未酶切鉴定结果；
图3为本发明工程菌PCR鉴定结果，M：DNA标准分子量(DL2000)；每两个泳道为一个转化子的两对引物PCR鉴定结果，即1，2：同一个转化子分别用通用引物T1、T2扩增得到837bp目的产物，用ANG4成熟肽的引物T3、T4扩增得到360bp目的产物，1-32：表示共鉴定了16个转化子，其中以能同时扩增出873 bp和360 bp的克隆子定为阳性转化子；
图4为本发明重组抗菌肽pANG4的表达结果，图4中A图，M：蛋白质marker；1-5：重组X-33-pPICZαA-pANG4诱导24h，48h，72h，96h和120h上清；6：空载体表达蛋白； B图，M：蛋白质marker；1-5：重组X-33-pPICZαA-pANG4甲醇诱导浓度0%，0.5%，1%，1.5%和2%的上清；
图5为本发明重组抗菌肽pANG4的表达产物及纯化产物的蛋白电泳检测结果，M：蛋白质marker；1-3：重组抗菌肽pANG4上清液；4-5：重组抗菌肽pANG4菌体；6-8：重组抗菌肽pANG4上清液；9-10：空载体上清液；11-12：重组抗菌肽pANG4液纯化后的上清；
图6为本发明抗菌肽pANG4的表达产物与另一优化的ANG4基因序列（SEQ ID NO.4）得到的表达产物蛋白电泳检测结果，M：蛋白质marker；1-2：SEQ ID NO.4序列获得的重组抗菌肽pANG4上清液；3-5：本发明（SEQ ID NO.2序列）重组抗菌肽pANG4上清液；
图7为本发明重组抗菌肽pANG4对猪血红细胞的溶血活性结果；
图8为本发明重组抗菌肽pANG4对猪IPEC-J2细胞的细胞毒性结果；*表示差异显著，**表示差异极显著，图9、图10相同；
图9为本发明重组抗菌肽pANG4对猪IPEC-J2细胞的活性影响结果，图9中A图为rpANG4浓度梯度对猪IPEC-J2细胞的活性影响结果；B图为 rpANG4处理时间对猪IPEC-J2细胞的活性影响结果；
图10为 H2O2对IPEC-J2细胞炎性因子和紧密连接蛋白基因相对表达量的影响，图10中A图为对TNFα相对表达量的影响，B图为对IL-1β相对表达量的影响，C图为对IL-8相对表达量的影响，D图为对Claudin-1相对表达量的影响，E图为对ZO-1相对表达量的影响；
图11为本发明重组抗菌肽rpANG4和H2O2对IPEC-J2细胞活性的影响结果；图中所标字母不同表明不同处理组之间的差异有统计学意义（P < 0.05），以下所有图同此；
图12为本发明重组抗菌肽rpANG4和H2O2对IPEC-J2细胞凋亡基因相对表达量的影响结果, 图12中A图为对Caspase 3相对表达量的影响，B图为对Caspase 8相对表达量的影响，C图为对Caspase 9相对表达量的影响，D图为对Bax相对表达量的影响，E图为对Bcl-2相对表达量的影响，F图为对Bcl-2和Bax相对表达量比值的影响；
图13为本发明重组抗菌肽rpANG4和H2O2对IPEC-J2炎症因子mRNA相对表达量的影响结果，图13中A图为对TNFα相对表达量的影响，B图为对IL-1β相对表达量的影响，C图为对IL-6相对表达量的影响，D图为对IL-8相对表达量的影响， E图为对IL-10相对表达量的影响；
图14为本发明重组抗菌肽rpANG4和H2O2对IPEC-J2紧密连接蛋白基因相对表达量的影响结果，图14中A图为对ZO-1相对表达量的影响，B图为对Occludin相对表达量的影响，C图为对Claudin-1相对表达量的影响。
图15为重组抗菌肽pANG4与猪源ANG4成熟肽基因序列对比图。红色碱基代表根据P. pastoris密码子碱基偏嗜性优化后的碱基。
具体实施方式
LB液体培养基，按照质量百分比的组成为：0.5% 酵母提取物（Yeast Extract）、1.0% 胰蛋白胨（Tryptone）、0.5% NaCl，加入1.5% 琼脂粉（Agar）可制成固体培养基。
BMGY液体培养基，按照质量百分比的组成为：1% 酵母提取物（Yeast Extract），2%胰蛋白胨（Tryptone），1.34% YNB[含(NH4)2SO4]，4×10-5 % 生物素（Biotin），0.1 mol/L磷酸缓冲液（PBS，pH6.0），1% 甘油（glycerin）。
BMMY液体培养基，按照质量百分比的组成为：1% 酵母提取物（Yeast Extract），2%蛋白胨（Peptone），1.34% YNB[含(NH4)2SO4]，4×10-5% 生物素（Biotin），0.1 mol/L磷酸缓冲液（PBS, pH6.0），1% 甲醇（Methanol）。
Ni-IDA-Sefinose Column柱层析，市售。
在本发明的描述中，需要说明的是，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下面结合附图和具体的实施例对本发明做进一步详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
实施例1
一、重组抗菌肽基因工程菌的构建
1、目标基因片段的合成与重组质粒pPICZαA-pANG4的构建
根据GenBank上发表的猪源ANG4成熟肽基因序列（SEQ ID NO.3所示），根据 P. pastoris 偏嗜性优化ANG4基因序列（SEQ ID NO.2所示），同时还根据P. pastoris 偏嗜性产生了另外1个优化的ANG4基因序列（如SEQ ID NO.4所示）。且在以上目的基因N端添加XhoⅠ识别序列，C端添加Xba Ⅰ识别序列，在基因的N端设Kex2蛋白酶裂解位点，C段加上防移码碱基。合成设计好的基因，并连接到目的质粒pPICZαA中，构建表达质粒pPICZαA-pANG4，并转化进入E. coli TOP10菌株。
检测：取E. coli TOP10菌株在LB培养基中扩增培养，37℃条件下250 r/min振摇，直到OD600达到2.5，进行菌液PCR鉴定。菌液OD值测定后，抽提质粒，用限制性内切酶Xho Ⅰ和Xba Ⅰ双酶切鉴定后凝胶电泳检测和测序鉴定。表1提供了PCR鉴定采用的引物，其中以T1和T2为一对通用引物，以菌液为PCR模板扩增获得的产物片段，长度为873bp，T3和T4为获得ANG4目的基因条带的引物，以菌液为PCR模板扩增获得的产物片段，长度为360bp。
表1 PCR鉴定采用的引物
PCR反应体系及反应条件如表2及表3所示：
表2 反应体系
表3 反应条件
取PCR后的产物5 μL进行1.2%琼脂糖电泳分析，并观察电泳条带。
菌液PCR电泳结果如图1所示，得到含有大小为360bp的目的基因片段；双酶切结果如图2所示；根据测序图谱，读出目的基因片段序列，SEQ ID NO.2所示，与原猪源ANG4成熟肽基因序列的对比如图15所示。
2、工程菌的制作
毕赤酵母X-33感受态细胞的制备：
1）将X-33菌液在YPD平板中划线培养至长出单菌落；
2）挑取平板中长势较好大小适中的单菌落，接种5 mL的YPD培养基（50 mL的锥形瓶），29℃条件下220 r/min振摇过夜；
3）取1 mL过夜培养的菌液，接种入25 mL新鲜配制的YPD培养基中，29℃条件下220r/min振摇过夜；
4）取该培养液于4℃条件下2000 r/min离心5 min；
5）弃上清液，加入25 mL冰预冷的无菌水，轻柔吹打重悬菌体，4℃条件下2000 r/min离心5 min，重复两次；
6）弃去上清液，加入13 mL冰预冷的1 mol/L的灭菌后的山梨醇溶液，轻柔吹打重悬菌体，4℃条件下2000 r/min离心5 min，重复两次；
7）弃上清液，加入100 μL冰预冷的1 mol/L的无菌山梨醇溶液，轻柔吹打混匀，即制备为X-33感受态细胞，感受态细胞最好现用现制，电转效果更佳。
电击转化法将线性化完全的重组质粒pPICZαA-pANG4转入到毕赤酵母中：
8）将冰浴后的100 μL感受态细胞移至1.5 mL无菌EP管中，加入10 μg线性化并浓缩后的质粒（约10 μL，浓度约1 μg/μL，此时浓度越高越好），轻柔混匀后转入0.2 cm型的电穿孔转化杯中；
9）电击杯冰浴5 min，为了持续保持低温；
10）设置电击条件电压，电阻，电容，脉冲时间分别为2000 V，200 Ω，25 μF，10mS，电击一次，电击后，迅速地（越快越好）在电击杯中加入1 mL 4℃预冷的1 mol/L山梨醇溶液，轻柔地吹打均匀；
11）将电转杯中的菌液吹打均匀后转入1.5 mL无菌管中，置于29℃条件下恒温培养1 h；
12）取10-20 μL电转后菌液，涂布于含100 μg/mL Zeocin的YPDS平板，置于29℃条件下培养，观察转化子的生长（约3天），筛选阳性克隆。
鉴定：采用PCR方法鉴定转化子，用煮-冻-煮法提取毕赤酵母基因组，以T1和T2，T3和T4为两对引物，以能扩增出360 bp和873 bp的克隆子定为阳性转化子。
检测结果如图3所示，说明构建得到了含有360bp目的基因片段的工程菌。
二、本发明重组抗菌肽的制备
1、毕赤酵母阳性转化子的诱导培养
1）将上述筛选为阳性酵母菌株的菌液按照1:25的比例转接于13 mL BMGY培养基中，29℃条件下220 r/min培养过夜；
2）取13 mL菌液，2000 r/min离心5 min，去上清液后，重悬于50 mL BMMY培养基中重悬，用封口膜封口，29℃条件下220 r/min培养进行诱导表达；
3）每隔24 h补充甲醇至1%（v/v），96 h时取样进行下一步检测。
2、重组抗菌肽纯化
1）根据上述条件诱导表达目的蛋白，取上清液20 μL点样至SDS-PAGE上层胶点样孔中，设置电压80 V电泳至蛋白Maker分离，而后调整电压为100 V，电泳至靠近凝胶底部约2 cm处停止电泳，将胶分离出后置于考马斯亮蓝R250染色液中，置于摇床上轻柔振摇染色1h，然后用纯水洗去浮色后置于脱色液中，振摇脱色至背景清晰。
2）诱导时间优化：酵母阳性重组子采用甲醇诱导的方法诱导表达，每隔24 h补充甲醇至1%，24 h、48 h、72 h、96 h和120 h分别取样，SDS-PAGE鉴定。
3）诱导剂甲醇浓度的优化：酵母阳性重组子采用甲醇诱导的方法诱导表达，每隔24 h补充甲醇至0%，0.5%，1%，1.5%，2%，96 h分别取样进行SDS-PAGE鉴定。
4）rpANG4的纯化回收及浓缩：将Ni柱经Binding Buffer洗后，上清液过滤除菌后与Binding Buffer 1：1混合再过Ni柱，含有HIS标签的蛋白可挂在Ni柱上，再经BindingBuffer洗去杂蛋白后，加Elution Buffer洗脱蛋白得到纯rpANG4蛋白，再经透析脱盐后使用Amicon Ultra-15超滤离心管进行浓缩后进行下一步抑菌试验。采用BCA试剂盒测定浓缩后的蛋白浓度。
检测结果如图4所示，最佳诱导时间为72-96 h，最佳甲醇诱导浓度是1%。
检测结果如图5所示，由SEQ ID NO.2序列得到的菌体表达上清液中含有大量目的蛋白，经过纯化后得到了纯蛋白，其分子量为16.5KD，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。检测结果如图6所示，由SEQ ID NO.4序列得到的菌体表达上清液中含的目的蛋白量远低于SEQID NO.2序列得到的菌体表达的ANG4蛋白，由此后续实施例皆用SEQ ID NO.2序列得到的菌体表达的ANG4蛋白进行应用。
3、重组抗菌肽抑菌活性分析
参考中国药典中的MIC法检测前述方法制备得到的重组抗菌肽的抑菌生物活性。MIC是抑制生长超过50%的最小抗菌肽浓度，具体方法如下：
用灭菌水二倍稀释rpANG4浓度至512，256，128，64，32，16，8，4，2和1 μg/mL。96孔板每孔加100 μL稀释后的rpANG4（对照组加100 μL灭菌水），每孔加100 μL重悬在MH的2~7×105 CFU/mL的E. coli K88+ (CVCC225)、E. coli (ATCC25922)、Salmonella typhimurium (ATCC14028)、(Pseudomonas aeruginosa (ATCC27853)和革兰氏阳性病原菌Staphylococcus aureus (ATCC25923)、Erysipelothrix rhusiopathiae (CVCC1241)的菌液后，将96孔板置于37℃恒温条件下培养至少18h（具体观察菌的生长情况），读取OD600值，试验重复三次。
本发明制备得到的重组抗菌肽对革兰氏阴性病原菌E. coli K88+ (CVCC225)、E. coli (ATCC25922)、Salmonella typhimurium (ATCC14028)、(Pseudomonas aeruginosa (ATCC27853)和革兰氏阳性病原菌Staphylococcus aureus (ATCC25923)、Erysipelothrix rhusiopathiae (CVCC1241)均有抑菌作用，MIC抑菌浓度如表4所示。
表4重组蛋白pANG4对不同致病菌的MIC
表4的数据表明，pANG4对革兰氏阴性和阳性菌都有抗菌作用，具有广谱抗菌性。
4、重组抗菌肽溶血性分析
抗菌肽的红细胞溶血性是检测抗菌肽处理后猪血细胞中释放血红蛋白的量，方法参照前人研究（Su等，2018）：
1）用抗凝管采集猪全血，1500 r/min 4℃离心10 min后，用10 mmol/L PBS（pH7.3）洗血细胞，直到上清液变为透明；
2）将洗涤后的血细胞稀释成4%，将100 μL血细胞和同体积的1~512 μg/mL rpANG4置于1.5mL无菌管中轻柔混合后置于37℃恒温条件下温浴1h；
3）温浴后离心5 min取150 μL上清液至酶标板中，检测OD540；
4）分别以PBS和0.1% Triton X-100作为0和100%溶血对照，试验重复三次。
检测结果如图7所示，本发明制备得到的重组抗菌肽浓度从0.5 μg/mL到128 μg/mL，rpANG4对猪红细胞的溶血性极低（0.08%到0.32%）；浓度达到256 μg/mL时，rpANG4对猪红细胞的溶血性为30%。
5、重组抗菌肽细胞毒性分析
检测rpANG4对猪肠上皮细胞IPEC-J2是否有毒性，以细胞活性高低判断rpANG4对IPEC-J2的毒性，具体方法如下：
1）在96孔板中，处理孔中加入50 μL细胞悬液（1×105 cell/mL），置于细胞培养箱中培养；
2）待细胞融合度达到80%左右时，加入同体积的rpANG4，至终浓度达到0、4、16、64和256 μg/mL，培养24 h；
3）每孔加入10 μL的CCK8溶液，继续培养2 h，测定OD450，试验重复三次。
检测结果如图8所示，本发明制备得到的重组抗菌肽对肠上皮细胞IPEC-J2没有显著毒性；相反，当浓度为32 μg/mL和128 μg/mL时，显著提高了IPEC-J2细胞活性。
三、本发明重组抗菌肽的应用
重组蛋白rpANG4由上述方法获得，H2O2购自成都市科隆化学品有限公司，肠上皮细胞IPEC-J2由本实验室保存。DMEM/F12培养基（11320-033），澳洲特级胎牛血清FBS（10099141C），双抗PS（15140122）购自GIBCO。
1、rpANG4处理IPEC-J2浓度梯度和时间梯度
试验采用单因素设计，培养板用96孔板，每孔加100 μL的1×105 cell/mL的细胞悬液，当细胞融合度达到80%左右，加入不同浓度（终浓度至0，4，16，32，64 μg/mL）的rpANG4（n = 10），处理12h后，检测细胞活性，试验重复三次。
1）IPEC-J2细胞采用DMEM-F12完全培养基培养：DMEM-F12 + 10% FBS + 1% PS。首先复苏细胞，将细胞从液氮罐中取出后置于37℃温浴解冻，后添加37℃预热的完全培养基混匀，在800×g离心3 min，弃上清液后在加4mL完全培养基重悬，转入可贴壁培养瓶中，置于细胞培养箱中培养（37℃，5% CO2），可传代2-3次，观察细胞状态，当细胞长势和形态良好时进行试验。将细胞计数并铺板于细胞培养板中，在IPEC-J2培养到融合度达到80%左右时，用rpANG4预处理IPEC-J2细胞，然后用H2O2处理2 h。
2）采用CCK8试剂盒检测细胞活性。细胞处理后每孔加10 μL的CCK8溶液，在细胞培养箱中培养1-2 h，然后用酶标仪测定OD450，可每隔半小时测量一次。
3）试验用肠上皮细胞IPEC-J2，培养板用96孔板，每孔加100 μL的1×105 cell/mL的细胞悬液，加纯化获得的rpANG4，终浓度为32 μg/mL，分别处理0，3，6，12，24 h（n = 10），处理后检测细胞活性，试验重复三次。
检测结果如图9所示，本发明制备得到的重组抗菌肽rpANG4浓度在0 μg/mL到32 μg/mL时（9A），IPEC-J2细胞活性随着rpANG4浓度的增加呈梯度上升且当rpANG4浓度为32 μg/mL时，rpANG4显著提高了IPEC-J2细胞活性。
由上述结果可知32 μg/mL的rpANG4处理IPEC-J2的效果显著，因此，试验用32 μg/mL的rpANG4分别处理IPEC-J2细胞0、3、6、12和24 h。结果发现，IPEC-J2细胞活性随着rpANG4处理时间的增加呈梯度上升（9B）；当处理6 h时，rpANG4对细胞的增殖效果有显著促进作用；当处理12 h时，细胞的活性达到最大。
2、H2O2处理IPEC-J2浓度梯度
为了得到更好的H2O2处理IPEC-J2细胞的浓度，分别用0、0.4、0.6、0.8 mmol/L处理IPEC-J2细胞2 h（n = 6），检测炎症基因TNFα、IL-1β和IL-8以及紧密连接蛋白基因Claudin-1和ZO-1的表达量，试验重复三次。
荧光定量PCR：使用RNAiso Plus试剂从细胞中提取总RNA（Takara），并反转录（Vazyme），采用qPCR检测（Vazyme）：炎症基因TNFα、IL-1β、IL-6、IL-8，抗炎基因IL-10，紧密连接蛋白基因ZO-1、Occludin、Claudin-1，凋亡相关基因Bcl-2、Bax、Caspase 3、Capase 8和Caspase 9的表达量。采用的基因引物序列如表5所示：
表5 基因引物序列
IL-10：白介素10；TNFα：肿瘤坏死因子α；IL-1β：白介素1β；IL-6：白介素6；IL-8：白介素8；ZO-1：闭合小环蛋白；Occludin：咬合蛋白；Claudin-1：闭合蛋白：Bcl-2：B细胞淋巴瘤-2；Bax：B细胞淋巴瘤蛋白-2相关X蛋白；Caspase 3：半胱天冬酶 3；Caspase 8：半胱天冬酶 8；Caspase 9：半胱天冬酶 9；GAPDH：甘油醛-3-磷酸脱氢酶。
检测结果如图10所示，0.6 mmol/L和0.8 mmol/L H2O2处理IPEC-J2细胞2 h，显著增加了TNFα基因的表达量（P < 0.05，图10A）。0.4、0.6和0.8 mmol/L H2O2处理IPEC-J2细胞2 h，显著增加了IL-1β（图10B）和IL-8（图10C）基因的表达量（P < 0.05）。0.6 mmol/L H2O2处理IPEC-J2细胞2 h，显著降低了ZO-1基因的表达量（P < 0.05，图10E）。0.8 mmol/L H2O2处理IPEC-J2细胞2 h，显著降低了Claudin-1基因的表达量（P < 0.05，如图10D）。综上结果后续选用浓度为0.6 mmol/L的H2O2构建细胞炎性损伤。
3、rpANG4缓解IPEC-J2肠道炎性损伤
试验采用双因子设计，分为4个处理组（n = 6）：CON组，rpANG4组，H2O2组，rpANG4+H2O2组。rpANG4组和rpANG4+H2O2组，肠上皮细胞IPEC-J2先用rpANG4预处理12 h（CON组和H2O2组用等体积PBS），然后应激组用H2O2处理2 h，其余组添加等体积的PBS，采用CCK8试剂盒检测细胞活性。采用RT-PCR检测炎症基因TNFα、IL-6、IL-1β和IL-8，凋亡相关基因Bcl-2、Bax、Caspase 3、Caspase 8和Caspase 9，紧密连接蛋白基因Claudin-1、Occludin和ZO-1表达量，试验重复三次。
检测结果如图11所示，H2O2处理显著降低了IPEC-J2细胞活性（P < 0.05），本发明制备得到的重组抗菌肽rpANG4处理显著升高了IPEC-J2细胞活性（P < 0.05），且rpANG4处理和H2O2处理存在交互作用（P < 0.05）。
检测结果如图12所示，H2O2处理显著升高了Caspase 8基因表达量，显著降低了Bcl-2和Bcl-2/Bax（P < 0.05）。本发明制备得到的重组抗菌肽rpANG4处理IPEC-J2细胞显著降低了细胞凋亡相关基因Bax、Bcl-2、Caspase 3和Caspase 9表达量（P < 0.05）。与H2O2处理组相比，rpANG4预处理可显著降低Caspase 8基因表达量（P < 0.05）。
检测结果如图13所示，H2O2处理显著升高了促炎因子TNFα、IL-1β、IL-6和IL-8和抗炎因子IL-10基因的表达量（P < 0.05）。本发明制备得到的重组抗菌肽rpANG4处理IPEC-J2细胞显著降低了促炎因子TNFα和IL-1β和抗炎因子IL-10基因的表达量（P < 0.05），对IL-6有降低的趋势（P = 0.079）。与H2O2组相比，rpANG4+H2O2组显著降低了IL-8基因的表达量。rpANG4和H2O2对IL-10、TNFα、IL-1β和IL-8基因表达量有显著交互作用（P < 0.05）。
检测结果如图14所示，H2O2处理显著降低了Claudin-1基因表达量（P < 0.05）。本发明制备得到的重组抗菌肽rpANG4处理IPEC-J2细胞显著提高了ZO-1基因表达量（P <0.05），对Claudin-1基因表达量有提高的趋势（P = 0.097）。当单独加rpANG4处理细胞时对Claudin-1基因表达量没有显著影响，但在rpANG4预处理后再H2O2处理，Claudin-1基因表达量将不会受到H2O2处理的影响（P < 0.05）。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (5)
1.一种编码重组抗菌肽pANG4的核酸分子，其特征在于：所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.包含权利要求1所述的编码重组抗菌肽pANG4的核酸分子的重组表达载体。
3.一种重组抗菌肽pANG4的制备方法，其特征在于：包括：
步骤1，获得如SEQ ID NO.3所示的猪源ANG4成熟肽基因序列；
步骤2，根据 P. pastoris 偏嗜性优化ANG4成熟肽基因序列，获得权利要求1所述的核酸分子，且在目的基因N端添加Xho Ⅰ识别序列，C端添加Xba Ⅰ识别序列，在基因的N端设Kex2蛋白酶裂解位点，C段加上防移码碱基，并合成设计好的基因片段；
步骤3，将合成基因片段连接到目的质粒中，构建重组表达质粒；
步骤4，制备毕赤酵母X-33感受态细胞；
步骤5，采用电击转化法将重组表达质粒转入到毕赤酵母X-33感受态细胞中，获得阳性转化子；
步骤6，将阳性转化子在毕赤酵母培养基中培养进行诱导表达，离心，得上清液分离纯化，即得。
4.根据权利要求3所述的一种重组抗菌肽pANG4的制备方法，其特征在于：所述步骤3中目的质粒为pPICZαA。
5.根据权利要求3所述的一种重组抗菌肽pANG4的制备方法，其特征在于：所述步骤6中，毕赤酵母培养基为BMGY培养基，培养的条件是29℃、220r/min振荡培养，诱导表达使用的诱导剂是体积终浓度为1%的甲醇，每隔24 h补充甲醇至体积终浓度为1%，诱导表达的时间为72～96h。
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| GR01 | Patent grant | ||
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