CN102753011A

CN102753011A - 在植物中血管生成素的表达

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Publication number: CN102753011A
Application number: CN2010800616390A
Authority: CN
Inventors: G·斯潘根贝格; A·莫拉多夫; 王江辉; B·G·科克斯; M·奈特; M·麦克多纳
Original assignee: Agriculture Victoria Services Pty Ltd
Current assignee: Agriculture Victoria Services Pty Ltd
Priority date: 2009-11-18
Filing date: 2010-11-18
Publication date: 2012-10-24
Anticipated expiration: 2030-11-18
Also published as: EP2501219A4; US11692183B2; BR112012012563A2; EP2501219A1; AU2010321676B2; EP3272211A1; US20240026319A1; CA2780989A1; US20120309092A1; AR079065A1; NZ600007A; US20190359960A1; AR121223A2; EP2501219B1; CN102753011B; BR112012012563B1; US20210032611A1; WO2011060490A1; CA2780989C; ES2646139T3

Abstract

本发明涉及植物生成的血管生成素、相关的植物细胞、植物愈伤组织、植物、种子和其他植物部分以及从中得到的产物，还涉及由植物生成的血管生成素的用途。本发明也涉及血管生成素基因在植物中的表达，以及相关的核酸、构建体和方法。

Description

在植物中血管生成素的表达

技术领域

本发明涉及植物生成的血管生成素、相关的植物细胞、植物愈伤组织、植物、种子和其他植物部分以及从中得到的产物，还涉及由植物生成的血管生成素的用途。

本发明也涉及血管生成素基因在植物中的表达，以及相关的核酸、构建体和方法。

背景技术

由ANG基因编码的血管生成素属于核糖核酸酶(RNA酶)超家族中的一员。血管生成素(也称为核糖核酸酶5)是一个14kDa、非糖基化分泌的核糖核酸酶多肽。血管生成素被认为通过称为血管生成的过程来调控新生血管的生成，并被认为可以调节在蛋白中出现功能性突变——可导致神经肌肉紊乱肌萎缩性侧索硬化症(ALS)——的神经元的存活。

在血管生成期间，血管生成素蛋白结合到位于内皮细胞和平滑肌细胞表面的受体上并进行核转位，使其刺激对于毛细血管生成的细胞的生长和分裂所必需的核糖体RNA(rRNA)的生成。与锻炼相关的血管生成导致毛细血管生长，使得可以将更大量的营养物和氧气供应到肌肉组织中。

在我们共同待决的申请PCT/AU2009/000603中，我们证明血管生成素可在体外提高肌细胞的生长和分化，显著减轻肌肉生长抑制素对成肌细胞的强力抑制作用。血管生成素富含在与促进哺乳期的哺乳动物健康、成长和发育有关的分泌物的初乳和牛奶中。当加入到小鼠的饲料中时，在4星期的时间内，从牛奶中纯化的血管生成素可以将其运动肌肉的生长提高50％。在我们共同待决的申请PCT/AU2009/000602中，我们证明血管生成素在口服施用时是生物可用的。

血管生成素也同样被显示具有多种其他活性。这些包括去除皮肤缺陷(如色斑)、调节免疫反应、保护多形核白细胞免受自发性退化，以及对系统性细菌和真菌病原体的抗微生物活性的能力。血管生成素同样看起来对生长因子，例如VEGF、EGF和FGF的有效活性是必需的。另外，血管生成素蛋白中的功能性突变会导致神经肌肉紊乱肌萎缩性侧索硬化症(ALS)。

血管生成素可以有多种应用，包括在药学、饮食食品添加剂和化妆品中的应用。然而，血管生成素在这些应用中的用途则要求通过适当的来源在商业规模上有效地制备该蛋白的过程。

血管生成素可在牛奶中获得，但牛奶作为血管生成素来源的用途并不受青睐，因为血管生成素仅以较低的水平存在于牛奶中。同样地，在牛奶中存在某些蛋白，例如酪蛋白，以及牛奶乳清蛋白(例如免疫球蛋白、乳铁传递蛋白和乳过氧化物酶)掩盖了血管生成素，妨碍了其提纯。

本说明书对任何现有技术的引用不是，也不应被认为是对这样一种情况的确认或者任何形式的建议，即该现有技术构成了澳大利亚或者其他任何地区的公共知识的一部分，或者该现有技术会有理由被本领域技术人员认为是确定、理解并认为是相关的。

本发明的目的是克服，或者至少是减轻与现有技术相关的一种或多种困难或缺陷。

发明内容

在第一方面，本发明提供了包含血管生成素基因或者其功能活性片段或变型和/或血管生成素多肽的植物细胞、植物愈伤组织、植物、种子或其他植物部分。

在第二方面，本发明提供了使用包含血管生成素的植物细胞、植物愈伤组织、植物、种子或其他植物部分，例如作为原料或用于人类消费的方法。

在进一步方面，本发明提供了植物生成的血管生成素。

在进一步方面，本发明提供了包含植物生成的血管生成素的饲料储备、饲料添加剂或兽医产品。

在进一步方面，本发明提供了包含植物生成的血管生成素的食物、饮料、食品添加剂、营养品或药物。

在进一步方面，本发明提供了用于生产表达血管生成素基因的转化的植物细胞的方法。

在进一步方面，本发明提供了从转化的植物细胞中分离血管生成素的方法。

在进一步方面，本发明提供了从转化的植物细胞中再生转化的植物愈伤组织、植物、种子或其他植物部分的方法。

在更进一步方面，本发明提供了从转化的植物愈伤组织、植物、种子或其他植物部分中分离血管生成素的方法。

在更进一步方面，本发明提供了在植物中提高血管生成素表达、活性或分离的方法，所述方法包括与血管生成素活性的调节子或调控子共表达血管生成素。

在更进一步方面，本发明提供了包含血管生成素基因的人工构建体，所述构建体使得所述血管生成素基因能够在植物细胞中进行表达。

在更进一步方面，本发明提供了包含血管生成素基因和编码血管生成素活性的调节子或调控子的基因的人工构建体或嵌合序列。

在更进一步方面，本发明提供了包含血管生成素基因和植物信号肽的嵌合序列。

在更进一步方面，本发明提供了含适用于植物的密码子的血管生成素基因，使得所述血管生成素基因能够在植物细胞中表达。

在本说明书中所使用的，除非文中另外要求，否则术语“包含”以及该术语的变型，例如“含”和“包括”，并非意味着排除了进一步的添加剂、组分、完整物或步骤。

本说明书中所使用的，除非文中另外要求，否则单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数方面。

附图说明

图1.牛血管生成素、核糖核酸酶、RNase A家族，5(ANG)的核苷酸序列(SEQ ID NO：1)。NCBI登记号NM_001078144。由NCBI鉴定的该72bp的信号肽序列为黑体字并有下划线。

图2.牛血管生成素、核醣核酸、RNase A家族，5(ANG)的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)。NCBI登记号NP_001071612。由NCBI鉴定的该24aa的信号序列为黑体字并有下划线。血管生成素受体结合域以黑色突出，活性位点残基以灰色突出。以粗体和下划线突出的Asp(D)氨基酸是提高血管生成素活性的可能的突变位点。

图3.修饰用于如Murray等人(1989)所定义的植物密码子偏倚的牛血管生成素、核糖核酸酶、RNase A家族、5(ANG)的核苷酸序列(SEQ ID NO3)。在氨基酸序列中未观察到与在图2中所提出的变化。

图4.来自不同生物体中的代表性血管生成素基因的核苷酸序列比对(SEQ ID NO：4-12)。

图5.来自不同生物体中的代表性血管生成素基因的氨基酸序列比对(SEQ ID NO：13-21)。

图6.在减去其信号肽序列后，修饰的用于单子叶植物密码子偏倚的牛血管生成素、核醣核酸、RNase A家族、5(ANG)的核苷酸序列(SEQ IDNO：22)。

图7.在减去其信号肽序列后，修饰的用于双子叶植物密码子偏倚的牛血管生成素、核糖核酸酶、RNase A家族、5(ANG)的核苷酸序列(SEQID NO：23)。

图8.在修饰的用于单子叶和双子叶植物密码子偏倚的ANG之间的核苷酸序列比对，显示出80.7％的相似度。在氨基酸序列中未观察到与在图2中所提出的变化。

图9.拟南芥油质蛋白_ANG融合基因的核苷酸序列(SEQ ID NO：24)。拟南芥油质蛋白基因以普通的大写显示。凝血酶蛋白酶识别位点以黑色突出，后面是以下划线大写字体的ANG基因。起始和终止密码子以灰色突出。

图10.拟南芥油质蛋白_ANG融合蛋白的氨基酸序列(SEQ IDNO：25)。拟南芥油质蛋白以普通的大写显示。凝血酶蛋白酶识别位点以黑色斜体突出，后面是下划线大写字体的ANG蛋白。

图11.表达盒的核苷酸序列(SEQ ID NO：26)，所述表达盒包含由AtRbcS光调节启动子及胭脂碱合酶(nos)终止子所调控的具有内质网信号保留肽的ANG基因，用于在双子叶植物组织中积聚。所述表达盒包括在图7中提出的双子叶优化的ANG基因序列。AtRbcS启动子以大写斜体显示，ANG基因以普通大写显示，内质网信号保留肽以下划线显示，起始和终止密码子以灰色突出。nos终止子以小写显示。

图12.在图11中列出的序列的载体图谱，所述序列含由AtRbcS光调节启动子和nos终止子调控的具有内质网信号保留肽的ANG基因，用于在双子叶植物组织中转染和积聚。

图13.对照表达盒的载体图谱，所述对照表达盒被设计为在来自植物花椰菜花叶病毒(CaMV)的组成性CaMV35s启动子的控制下表达荧光报告子(turboGFP)，以确认在双子叶植物组织中的表达。

图14.表达盒的核苷酸序列(SEQ ID NO：27)，所述表达盒包含由TaRbcS光调节启动子及胭脂碱合酶(nos)终止子调控的具有内质网信号保留肽的ANG基因，用于在单子叶植物组织中积聚。所述表达盒包括在图6中提出的单子叶优化的ANG基因序列。TaRbcS启动子以大写斜体显示，ANG基因以普通大写显示，内质网信号保留肽以下划线显示，起始和终止密码子以灰色突出。nos终止子以小写显示。

图15.在图14中列出的序列的载体图谱，所述序列含由TaRbcS光调节启动子和nos终止子调控的内质网信号保留肽的ANG基因，用于在单子叶植物组织中积聚。

图16.对照表达盒的载体图谱，所述对照表达盒被设计为在从玉米(ZmUbi)的组成性泛素启动子的控制下表达荧光报告子(dsRED)，以确认在单子叶植物组织中的表达。

图17.表达盒的核苷酸序列(SEQ ID NO：28)，所述表达盒包含由AtRbcS光调节启动子及CaMV35S终止子调控的具有内质网信号保留肽的ANG基因，用于在双子叶植物组织中转化和积聚。所述表达盒包括在图3中提出的ANG基因序列。AtRbcS启动子以大写斜体显示，ANG基因以普通大写显示，内质网信号保留肽以下划线显示，起始和终止密码子以灰色突出。CaMV35S终止子以小写显示。

图18.在图11中列出的序列的质粒图谱，所述序列含由AtRbcS光调节启动子和nos终止子调控的具有内质网信号保留肽的ANG基因，用于在单子叶植物组织中转化和积聚。所述基础载体序列包括在适当的选择下，对于土壤杆菌介导的转化和再生所必要的元素。

图19.表达盒的代表性核苷酸序列(SEQ ID NO：29)，所述表达盒包含由TaRbcS光调节启动子及终止子调控的具有内质网信号保留肽的ANG基因，用于在单子叶植物组织中积聚。所述表达盒包括在图6中提出的ANG基因序列。TaRbcS启动子以大写斜体显示，ANG基因以普通大写显示，内质网信号保留肽以下划线显示，起始和终止密码子以灰色突出。TaRbcS终止子以小写显示。

图20.在图14中列出的序列的载体图谱，所述序列含由TaRbcS光调节启动子和nos终止子调控的具有内质网信号保留肽的ANG基因，用于在双子叶植物组织中转化和积聚。所述基础载体序列包括在适当的选择下，对于再生所必要的元素。

图21.表达盒的代表性核苷酸序列(SEQ ID NO：30)，所述表达盒包含由LpRbcS光调节启动子及LpFT4终止子所调控的具有内质网信号保留肽的ANG基因，用于在单子叶植物组织中积聚。所述表达盒包括在图6中提出的ANG基因序列。LpRbcS启动子以大写斜体显示，ANG基因以普通大写显示，内质网信号保留肽以下划线显示，起始和终止密码子以灰色突出。LpFT4终止子以小写显示。

图22.表达盒的代表性核苷酸序列(SEQ ID NO：31)，所述表达盒包含由油菜(Brassica napus)napin基因种子特异性启动子和CaMV35S终止子所调控的具有内质网信号保留肽的ANG基因，用于在双子叶植物种子中积聚。所述表达盒包括在图7中提出的ANG基因序列。所述napin基因启动子以大写斜体显示，ANG基因以普通大写显示，内质网信号保留肽以下划线显示，起始和终止密码子以灰色突出。CaMV35S终止子以小写显示。

图23.表达盒的核苷酸序列(SEQ ID NO：32)，所述表达盒包含由油菜napin基因种子特异性启动子和nos终止子所调控的具有内质网信号保留肽的ANG基因，用于在双子叶植物种子中积聚。所述表达盒包括在图7中提出的ANG基因序列。油菜_napin基因启动子以大写斜体显示，ANG基因以普通大写显示，内质网信号保留肽以下划线显示，起始和终止密码子以灰色突出。nos终止子以小写显示。

图24.在图23中列出的的序列的载体图谱，所述序列含由油菜napin启动子和nos终止子所调控的具有内质网信号保留肽的ANG基因，用于在双子叶植物种子组织中转化和积聚。所述基础载体序列包括在适当的选择下，对于土壤杆菌介导的转化和再生所必要的元素。

图25.表达盒的代表性核苷酸序列(SEQ ID NO：33)，所述表达盒包含由玉米(Zea mays)的玉米醇溶蛋白4基因种子特异性启动子和CaMV35S终止子所调控的具有内质网信号保留肽的ANG基因，用于在单子叶植物种子中积聚。所述表达盒包括在图6中提出的ANG基因序列。所述玉米醇溶蛋白启动子以大写斜体显示，ANG基因以普通大写显示，内质网信号保留肽以下划线显示，起始和终止密码子以灰色突出。CaMV35S终止子以小写显示。

图26.表达盒的核苷酸序列(SEQ ID NO：34)，所述表达盒包含由玉米醇溶蛋白4基因种子特异性启动子和nos终止子所调控的具有内质网信号保留肽的ANG基因，用于在单子叶植物种子中积聚。所述表达盒包括在图6中提出的ANG基因序列。玉米_玉米醇溶蛋白4基因启动子以大写斜体显示，ANG基因以普通大写显示，内质网信号保留肽以下划线显示，起始和终止密码子以灰色突出。nos终止子以小写显示。

图27.在图26中列出的序列的载体图谱，所述序列含由玉米的玉米醇溶蛋白4启动子和nos终止子玉米醇溶蛋白调控的具有内质网信号保留肽的ANG基因，用于在单子叶植物种子组织中转化和积聚。所述基础载体序列包括在适当的选择下，对于土壤杆菌介导的转化和再生所必要的元素。

图28.表达盒的核苷酸序列(SEQ ID NO：35)，所述表达盒包含由水稻(Orysa sativa)PR602基因种子特异性启动子和nos终止子所调控的具有内质网信号保留肽的ANG基因，用于在单子叶植物种子中积聚。所述表达盒包括在图6中提出的ANG基因序列。所述PR602基因启动子以大写斜体显示，ANG基因以普通大写显示，内质网信号保留肽以下划线显示，起始和终止密码子以灰色突出。nos终止子以小写显示。

图29.在图28中列出的序列的载体图谱，所述序列含由水稻PR602启动子和nos终止子所调控的具有内质网信号保留肽的ANG基因，用于在单子叶植物种子组织中转化和积聚。所述基础载体序列包括在适当的选择下，对于土壤杆菌介导的转化和再生所必要的元素。

图30.表达盒的核苷酸序列(SEQ ID NO：36)，所述表达盒包含由小麦(Triticum aestivum)谷蛋白基因种子特异性启动子和nos终止子所调控的具有内质网信号保留肽的ANG基因，用于在单子叶植物种子中积聚。所述表达盒包括在图6中提出的ANG基因序列。所述谷蛋白基因启动子以大写斜体显示，ANG基因以普通大写显示，内质网信号保留肽以下划线显示，起始和终止密码子以灰色突出。nos终止子以小写显示。

图31.在图30中列出的序列的质粒图谱，所述序列含由小麦谷蛋白启动子和nos终止子所调控的具有内质网信号保留肽的ANG基因用于在单子叶植物种子组织中转化和积聚。所述基础载体序列包括在适当的选择下，对于土壤杆菌介导的转化和再生所必要的元素。

图32.表达盒的代表性核苷酸序列(SEQ ID NO：37)，所述表达盒包含由组成性CaMV35S启动子和终止子调控的具有烟草钙网蛋白质外体信号肽的ANG基因，用于在植物中排水分泌。所述表达盒包括在图7中提出的ANG基因序列。所述CaMV35S启动子以大写斜体显示，ANG基因以普通大写显示，质外体信号肽以下划线显示，起始和终止密码子以灰色突出。CaMV35S终止子以小写显示。

图33.表达盒的代表性核苷酸序列(SEQ ID NO：38)，所述表达盒包含由拟南芥(Arabidopsis)磷酸盐转运体(AtPHT1)基因根特异性启动子和CaMV35S终止子调控的具有烟草calreticulin质外体信号肽的ANG基因，使在双子叶植物根部中分泌。所述表达盒包括在图7中提出的ANG基因序列。所述AtPHT1启动子以大写斜体显示，ANG基因以普通大写显示，质外体信号肽以下划线显示，起始和终止密码子以灰色突出。CaMV35S终止子以小写显示。

图34.表达盒的代表性核苷酸序列(SEQ ID NO：39)，所述表达盒包含由大麦(Hordeum vulgare)磷酸盐转运体(HvPHT1)基因根特异性启动子和CaMV35S终止子调控的具有烟草钙网蛋白质外体信号肽的ANG基因，使在单子叶植物根部中分泌。所述表达盒包括在图6中提出的ANG基因序列。所述HvPHT1启动子以大写斜体显示，ANG基因以普通大写显示，质外体信号肽以下划线显示，起始和终止密码子以灰色突出。CaMV35S终止子以小写显示。

图35.表达盒的代表性核苷酸序列(SEQ ID NO：40)，所述表达盒包含由拟南芥油质蛋白基因启动子和CaMV35S终止子调控的油质蛋白_ANG基因融合体，目标为双子叶植物中的油体。所述表达盒包括在图7中提出的ANG基因序列。拟南芥油质蛋白基因启动子以大写斜体显示。拟南芥油质蛋白基因以普通大写显示，ANG基因以下划线大写显示，凝血酶蛋白酶识别位点以黑色突出，起始和终止密码子以灰色突出。CaMV35S终止子以小写显示。

图36.包含烟草16sRNA操纵子(Prrn)启动子和终止子调控序列(Zoubenko等人，1994)，以在叶绿体中表达血管生成素基因的表达盒的代表性核苷酸序列(SEQ ID NO：41)。16sRNA操纵子(Prrn)启动子以大写斜体显示，ANG基因以普通大写显示，起始和终止密码子以灰色突出。16sRNA操纵子(Prrn)终止子以小写显示。

图37.A.从大约4-6周龄的体外生长的叶中回收的烟草(Nicotianatabacum)的源自叶肉的原生质体；转染后0天；B.对原生质体活力的评估，死细胞由黑暗染色表示，使用埃文氏蓝染色法显示出大于95％的生存力；转染前；C.对原生质体活力的评估，死细胞由黑暗染色表示，使用埃文氏蓝染色法显示出大于95％的生存力；转染后36小时。

图38.用含编码绿色荧光蛋白的turboGFP基因的质粒DNA转染后36小时的瞬时表达评估。在A.明视场和B.荧光灯下显现的细胞。在荧光灯下绿色荧光蛋白以明亮的斑点被观测到。

图39.逆转录酶PCR样品和对照的电泳图。泳道1：对于由0957286CaMV35S-p_turboGFP_nos-t转染的烟草叶肉原生质体上的ANG(F和R)引物进行的非逆转录对照反应。泳道2：用ANG(F和R)引物扩增的来自0957286 CaMV35S-p_turboGFP_nos-t转染的烟草叶肉原生质体的cDNA。泳道3：在由1031308 AtRbcS-p_ANG_nos-t转染的烟草叶肉原生质体上用ANG(F和R)引物进行的非逆转录对照反应。泳道4：用ANG(F和R)引物扩增的来自1031308 AtRbcS-p_ANG_nos-t转染的烟草叶肉原生质体的cDNA。泳道5：无模板(ANG F和R引物)进行的阴性对照反应。泳道6：由质粒模板(ANG F和R引物)进行的阳性对照反应。泳道7：大于1kb的DNA梯形条带(Invitrogen)。泳道8：对于由0957286CaMV35S-p_turboGFP_nos-t转染的烟草叶肉原生质体用肌动蛋白(F和R)引物进行的非逆转录对照反应。泳道9：用肌动蛋白(F和R)引物扩增的来自0957286 CaMV35S-p_turboGFP_nos-t转染的烟草叶肉原生质体的cDNA。泳道10：对于由1031308 AtRbcS-p_ANG_nos-t转染的烟草叶肉原生质体用肌动蛋白(F和R)引物进行的非逆转录对照反应。泳道11：用肌动蛋白(F和R)引物扩增的来自1031308 AtRbcS-p_ANG_nos-t转染的烟草叶肉原生质体的cDNA。泳道12：无模板(肌动蛋白F和R引物)进行的阴性对照反应。

图40.A.从小麦成熟的叶中回收的源自叶肉的原生质体；转染后0天；B.对原生质体活力的评估，死细胞由黑暗染色表示，使用埃文氏蓝染色法显示出大于95％的生存力；转染前；C.对原生质体活力的评估，死细胞由黑暗染色表示，使用埃文氏蓝染色法显示出大于81％的生存力；转染后24小时。

图41.用含编码dsRED蛋白的dsRED基因的质粒DNA转染后36小时的瞬时表达评估。在A.明视场和B.荧光灯下显现的原生质体。在荧光灯下dsRED蛋白以明亮的斑点被观测到。

图42.逆转录酶PCR样品和对照的电泳图。泳道1：用ANG_F和多聚T_R引物在小麦叶肉原生质体上进行的非逆转录对照反应。泳道2：用ANG_F和多聚T_R引物扩增小麦叶肉原生质体的总RNA中获得的通过用寡-dT进行逆转录生成的cDNA。泳道3：对于由1031312TaRbcS-p_ANG_nos-t转染的小麦叶肉原生质体用ANG_F和多聚T_R引物进行的非逆转录对照反应。泳道4：从用ANG_F和多聚T_R引物扩增的来自1031312_TaRbcS-p_ANG_nos-t转染的小麦叶肉原生质体的cDNA。泳道5：无模板(ANG F和多聚T_R引物)进行的阴性对照反应。泳道6：大于1kb的DNA梯形条带(Invitrogen)。泳道7：用肌动蛋白_F和多聚T_R引物在小麦叶肉原生质体上进行的非逆转录对照反应。泳道8：用肌动蛋白_F和多聚T_R引物扩增来自小麦叶肉原生质体的cDNA。泳道9：对于由1031308 AtRbcS-p_ANG_nos-t转染的烟草叶肉原生质体用肌动蛋白_F和多聚T_R引物进行的非逆转录对照反应。泳道10：用肌动蛋白_F和多聚T_R引物扩增的来自1031312_TaRbcS-p_ANG_nos-t转染的小麦叶肉原生质体的cDNA。泳道11：无模板(肌动蛋白_F和多聚T_R引物)进行的阴性对照反应。

图43.土壤杆菌介导的油菜(Brassica napus)转化：A.在滤纸支持件上吸涨种子；B.种子的同步发芽；C.发出的嫩芽的预处理；D.加工子叶，用作外植体；E.芽再生，继而与土壤杆菌混合培养；以及F.温室中使植物成熟。

图44.制备胚性愈伤组织以及多年生黑麦草的基因枪转化：A.在表面灭菌之前开花的温室生长植物的分蘖；B.分离幼穗，以体外培养；C.体外培养幼穗组织4-6周后的胚性愈伤组织；D-E.在微粒轰击之前分离的松散型胚性愈伤组织的3-5毫米外植体；F.用包覆有转化构建体的金颗粒对愈伤组织进行基因枪轰击；G-H.在选择性培养基上的抗生素抗性的嫩芽；I.在根诱导培养基的容器中的抗生素抗性的嫩芽；J.推定的土壤中的转基因植株。

图45.土壤杆菌介导的面包小麦的转化：A.准备采集的供体植物；B&C.采集的用于作为胚体外植体来源的材料；D.愈伤组织材料；E.在组织培养基上预再生材料；F.显示出报告基因表达的愈伤组织材料；G.从愈伤组织中的嫩芽的再生；H.在选择性培养基上的生根的嫩芽；和I.在土壤中生根的植物。

图46.土壤杆菌介导的白三叶草的转化：A.从成熟种子中分离的子叶外植体；B.在再生培养基上选择抗生素抗性的嫩芽，C.在根诱导培养基的容器中的抗生素抗性的嫩芽和D.推定的在土壤中的转基因植株。

图47.包含nos_nptII_nos选择性标记盒以及AtRbcS_ANG_CamV35S(图17)表达盒，用于土壤杆菌介导的白三叶草转化的转化载体图谱。

图48.阳性和阴性对照(泳道5和6)以及推定的转基因血管生成素白三叶草植物(泳道1-4)的RT-PCR(逆转录PCR)。使用的是专门针对血管生成素基因的引物。

图49.非转基因对照和转基因白三叶草植物的2DE凝胶蛋白分析。三个圆圈代表二磷酸核酮糖羧化酶小亚基。血管生成素蛋白由正方形表示。

图50.2DE凝胶蛋白序列分析(SEQ ID NO：42)。从凝胶中提取的蛋白获得了67％的序列覆盖(以粗体和下划线显示)。

图51.PCR样品和对照的电泳图。泳道1：大于1kb的DNA梯形条带(Invitrogen)。泳道2和3：来自用pPFG000023 AtRbcS-ANG_nos-t转化的拟南芥转基因株系1的DNA，用ANG(F和R)引物扩增的PCR。泳道4和5：来自用pPFG000023 AtRbcS-ANG_nos-t转化的拟南芥转基因株系2的DNA，用ANG(F和R)引物扩增的PCR。泳道6和7：来自野生型未转化的拟南芥的DNA，通过ANG(F和R)引物扩增的PCR。泳道8和9：由pPFG000023质粒模板(ANG F和R引物)进行的阳性对照反应。

具体实施方式

在第一方面，本发明提供了包含血管生成素基因或者其功能活性片段或变型和/或血管生成素多肽的植物细胞、植物愈伤组织、植物、种子或其他植物部分。优选地，所述植物细胞、植物愈伤组织、植物、种子或其他植物部分由本说明书中描述的方法产生。

在一个优选方面，血管生成素基因或其功能活性片段或变型可以与血管生成素活性的调控子或调节子共表达。

“植物细胞”指的是任何由半透膜束缚并包含质体的自我繁殖的细胞。如果需要进一步繁殖的话，这种细胞同样要求具有细胞壁。本说明书中使用的植物细胞包含(并非限制性)藻类、蓝细菌、种子悬浮培养物、胚体、分生组织域、愈伤组织、叶、根、芽、配子体、孢子体、花粉和小孢子。

在第二方面，本发明提供了使用包含血管生成素的植物细胞、植物愈伤组织、植物、种子或其他植物部分的方法，其中血管生成素作为例如用于动物的饲料储备、饲料添加剂或兽医产品的组合物，用于动物或适合于人类消费的食物、食品添加剂、营养品或药物的组合物。例如，添加了商品的植物材料，包括血管生成素蛋白，可被作为增强原料而用于多种用途。

因此，本发明提供了使用包括血管生成素的植物细胞、植物愈伤组织、植物、种子或其他植物部分，用于作为动物的饲料储备或作为适于人类消费的组合物的方法，所述方法包括在植物细胞、植物愈伤组织、植物、种子或其他植物部分中生成血管生成素，以及将其制备成适于作为动物的饲料储备或适于人类消费的组合物的形式。

本发明可能会应用到的动物包括猪、鸡(肉鸡和蛋用鸡)、食用牛、乳品牛、山羊、绵羊等家畜，这些可从由植物提供的丰富来源的血管生成素中受益，也可应用于宠物和表演动物如马、狗。

可能需要将源自植物的血管生成素制成胶囊或以其他保护方式施用，以更有效地通过瘤胃或胃。较不易消化的组织，例如种皮和根(与果实和叶相比)，可延长在肠中的通过以及消化道蛋白释放，以利于小肠结合和摄取。

也可考虑与其他添加剂和治疗剂，如生长激素(如牛生长激素)、抗生素、动物营养物添加剂共同施用。

在第三方面，本发明提供了植物生成的血管生成素。优选地，所述血管生成素由本说明书中所描述的方法生成。

在进一步方面，本发明提供了包含植物生成的血管生成素的饲料储备、饲料添加剂或兽医产品。优选地，所述血管生成素由本说明书中所描述的方法生成。

在进一步方面，本发明提供了包含植物生成的血管生成素的食物、饮料、食品添加剂、营养品或药物。优选地，所述血管生成素由本说明书中所描述的方法生成。

在进一步方面，本发明提供了生产表达血管生成素基因的转化的植物细胞的方法，所述方法包括

提供编码血管生成素基因或其功能活性片段或变型，以及植物细胞；

将血管生成素基因引入植物细胞中，生成转化的植物细胞；和

培养转化的植物细胞，生成表达血管生成素基因的转化的植物细胞。

“转化的植物细胞”指的是经过转化的植物细胞。

“转化”指的是将核酸转移入植物细胞中。

“编码血管生成素的基因”或“血管生成素基因”指的是编码具有血管生成素的一个或多个生物学性质的多肽的核酸。编码血管生成素的基因可以是转基因。编码血管生成素的基因可以包含血管生成素编码序列，所述血管生成素编码序列可选择地与编码一个或多个血管生成素活性的启动子、信号肽、终止子和调节子或调控子有效连接。

“转基因”指的是适于转化植物细胞的核酸。

血管生成素基因的“功能活性”片段或变型指的是编码具有血管生成素的一个或多个生物学性质的多肽的片段或变型(例如类似物、衍生物或突变体)。这种变型包括天然存在的等位基因变型和非天然存在的变型。一个或多个核苷酸的增加、缺失、置换和衍生均被考虑，只要这种修饰不会导致片段或变型的功能活性的缺失。

优选地，功能活性片段或变型与所述片段或变型相对应的指定序列的相关部分具有至少大约80％的同一性，更加优选具有至少大约90％的同一性，更加优选具有至少大约95％的同一性，最优选至少大约98％的同一性。

优选地，所述片段的大小至少为20个核苷酸，更加优选至少50个核苷酸，更加优选至少100个核苷酸，更加优选至少200个核苷酸，更加优选至少300个核苷酸。

这种功能活性变型和片段包括，例如，具有保守核酸变化的，具有适于植物应用的密码子选择的，以及在其中信号肽被去除以及可选地由另一个信号肽置换的。

“保守核酸变化”指的是由于遗传密码的简并性，使得导致在其编码的蛋白质中氨基酸保守的核酸置换。这种功能活性变型和片段同样包括，例如，那些具有核酸变化会导致在相应的氨基酸序列中的一个或多个残基发生保守氨基酸置换的。

“保守氨基酸置换”指的是一个氨基酸由另一个同类氨基酸所置换，分类如下所述：

非极性的：Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Met、Phe、Trp

不带电极性的：Gly、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn、Gln

酸性的：Asp、Glu

碱性的：Lys、Arg、His

其他保守氨基酸的置换可按如下进行：

芳香族的：Phe、Tyr、His

质子供体的：Asn、Gln、Lys、Arg、His、Trp

质子受体的：Glu、Asp、Thr、Ser、Tyr、Asn、Gln

特别优选的片段和变型包括一个或多个保守结合域，如编码催化核心或细胞结合位点的序列。这类域的示例在图2中示出，优选包括序列Arg、Asn、Gly、Gln、Pro、Tyr、Arg、Gly、Asp(SEQ ID NO：43)。

特别优选的片段和变型包括催化核心。“催化核心”指的是多肽的除了信号肽和N和C末端可变区的、包括催化氨基酸的内部区域。催化氨基酸类的示例在图2中示出。

对于其血管生成活性，血管生成素两个分开的域需要包括能够切断RNA的含His-13、Lys-41和His-115的催化位点，和包含至少残基60-68的非催化的细胞结合位点。核糖核酸酶活性和受体结合力，虽然需要，但对于血管生成活性来说是不够的：胞吞作用和核转位也是必需的。

血管生成素中的催化残基包括比如His-13、Lys-40、Gln-12和Thr-44。这些残基可以是保守的，以保留核糖核酸酶和/或细胞活性。

可通过改变位于活性位点中或附近的关键氨基酸而增加或降低其活性，可以通过比如将Asp-116置换成His而提高其活性(Acharva，Shapiro等人)。Arg-5和Arg-33对于活性也可能是重要的。

在增生的内皮细胞中对于血管生成素的细胞摄取由域介导，并不取决于核糖核酸酶活性，因为酶学无活性的突变体可以被内在化。例如K41Q和H13A突变体就是酶学无活性但是易位的。更容易被细胞内在化及更有效的改进型的血管生成素也属于本发明的范围，并且这种变型可通过对培养基中的上皮和肌细胞进行体外摄取和活性测试而进行检测。

特别优选的片段和变型包括缺少信号肽的那些。“信号肽”指的是N末端的信号序列。信号肽的一个示例在图2中示出，包括序列Met、Val、Met、Val、Leu、Ser、Pro、Leu、Phe、Leu、Val、Phe、Ile、Leu、Gly、Leu、Gly、Leu、Thr、Pro、Val、Ala、Pro、Ala(SEQ ID NO：44)。

特别优选的片段和变型具有适于植物的密码子选择，包括对于单子叶植物和双子叶植物的翻译起始子。因此，所述片段或变型编码具有一种或多种血管生成素生物学性质的多肽，但一个或多个密码子(尤其是在第三位处)可能会变化，使得与对应的动物基因相比，该基因更容易在植物中进行表达。一个或多个核苷酸的变化是可以考虑的，只要这种修饰不会导致所述片段或变型的功能活性的缺失。优选地，所述片段或变型与和所述修饰的基因相对应的原始动物序列的相关部分具有至少大约60％的同一性，更加优选具有至少大约80％的同一性，更加优选具有至少大约95％的同一性，最优选至少大约98％的同一性。特别优选的片段和变型具有隐蔽剪接位点和/或失活或切除的RNA不稳定序列元件。

切除可能导致mRNA不稳定的富含A+T的序列也可能是合乎需要的。这可提高mRNA的稳定性或异常剪接，并提高植物细胞核中转录的效率。也可除去可能的未成熟的聚(A)。

优选地，血管生成素基因从动物，更加优选从母牛、人、大猩猩、黑猩猩、猴子、马、猪、大鼠、小鼠、鱼或鸡，更加优选从牛(母牛)或与之相对应的血管生成素基因中分离出来，。

在一个特别优选的实施例中，血管生成素基因编码包含如图2所示序列的多肽。

在另一个特别优选的实施例中，血管生成素基因包含从由图4中示出的序列组成的组中挑选出的序列；还包括其功能活性片段和变型。

为减少异常发展表型的可能性，血管生成素基因可被修饰以改变其靶向信号序列，以引导血管生成素基因作用到亚细胞组分或植物组织上，例如内质网、质外体、过氧化物酶体或液泡。

更加具体地，可以制造嵌合序列，凭该序列，血管生成素基因的信号肽便可被去除以及可选地由另一个信号肽，例如植物信号肽所置换，所述植物信号肽可选地使得血管生成素积聚到所选择的亚细胞组分或植物组织上。

因此，在进一步优选方面，本发明提供了包含血管生成素基因、或其功能活性片段或变型，以及植物信号肽的嵌合序列。

在一个优选实施例中，所述植物信号肽可以来自内质网衍生蛋白的信号肽或与之对应，例如来自包含C-末端4-氨基酸保守序列，KDEL(lys-asp-glu-leu)的蛋白。

血管生成素基因可通过任何合适的技术引入到植物细胞中。将血管生成素基因整合进植物细胞中的技术(例如通过转导、转染、转化或基因靶向)对于本领域技术人员来说是熟知的。这些技术包括土壤杆菌介导的引入，根瘤菌介导的引入，对于组织、细胞和原生质体的电穿孔，原生质体融合，注射进生殖器官中，注射进未成熟的胚体和高速射弹进入细胞、组织、愈伤组织、未成熟的和成熟胚体，基因枪转化，Whiskers转化，以及它们的组合。对于技术的选择较大程度取决于待转化的植物细胞种类，并且可以很容易地由合适的技术人员所决定。

本发明可被用于多种植物，包括单子叶植物[例如草(例如包括多年生黑麦草、牛尾草、多花黑麦草、臂形草、雀稗的饲料草类)、高梁、甘蔗、玉米、燕麦、小麦、水稻和大麦)]，双子叶植物[例如饲料豆类(例如白三叶草、红三叶草、地三叶、苜蓿)、大豆、羽扇豆、豌豆、扁豆、鸡豆、油菜、植物芸苔、莴苣、菠菜、果类植物(例如香蕉、柑橘、草莓、苹果)、油棕榈、亚麻子、棉籽、红花、烟草]和裸子植物。

在进一步方面，本发明提供了在植物中生产血管生成素的方法，所述方法包括

将血管生成素基因引入植物细胞中，生成转化的植物细胞；

培养转化的植物细胞，生成表达血管生成素基因的转化的植物细胞；和

分离由植物细胞生成的血管生成素。

血管生成素可以通过本领域技术人员所知的技术进行分离。例如，可以使用阳离子交换提纯(或富集)，或大小选择。

术语“分离”指的是将血管生成素从其初始的环境中移走，优选从转化系统中的某些或所有的共存材料中分离出。优选地，血管生成素至少大约90％纯度，更加优选至少大约95％纯度，甚至更加优选至少大约98％纯度。

在进一步方面，本发明提供了包括生成含血管生成素的转化的植物愈伤组织、植物、种子或其他植物部分的方法，所述方法包括

提供编码血管生成素或其功能活性片段或变型的基因，以及植物细胞；

将血管生成素基因引入植物细胞中，生成转化的植物细胞；

培养转化的植物细胞，生成包含血管生成素的转化的植物愈伤组织、植物、种子或其他植物部分。

可以选择整合了血管生成素基因的细胞(如下所述)，然后培养在适当的培养基中，再生出转化的植物愈伤组织、植物、种子或其他植物部分，使用的是本领域所熟知的技术。培养条件，例如温度、pH等等，对于本领域技术人员来说是显而易见的。生成的植物可以通过有性或无性繁殖，使用的是本领域所熟知的方法，生成转化植物的连续后代。

在进一步方面，所述方法进一步包括将血管生成素从转化的植物愈伤组织、植物、种子或其他植物部分中的分离。

血管生成素可以通过本领域技术人员所知的技术(例如通过提取)而进行分离。例如，血管生成素可以通过超滤法分离(Fedorova等人，2002)，包括用硫酸铵沉淀，继而阳离子交换纯化，或使用胎盘核糖核酸酶抑制剂结合试验(Bond和Vallee，1988)。对于人类应用和加工的食品成分和构建体可能需要进一步纯化。

在更进一步方面，本发明提供了在植物中提高血管生成素表达、活性或分离的方法。血管生成素基因可被修饰，以提高其在动物中，特别是哺乳类中的功能。植物表达可被加工以提高在人类和其他动物中活性蛋白的制备、消化吸收和生物活性。例如，血管生成素基因可以被修饰，以提高由以下所组成的组中挑选出的功能：细胞递送、生肌活性、核糖核酸酶酶活性、rRNA转录活性和/或DNA结合活性、rRNA处理和/或剪接活性和受体结合和/或胞吞作用。例如，蛋白酶稳定性、热稳定性和/或pH耐性可被提高，这可反过来帮助加工和/或提纯植物生成的血管生成素。

采集后处理和/或加工也可提高热稳定性、蛋白酶稳定性和/或纤维素酶治疗剂的相容性。

本发明同样考虑到植物中青贮(silage)相容性表达。可以使用抗微生物共表达，以通过防止或减少细菌的和/或真菌的降解来稳定天然蛋白。示例包括由细菌(细菌素)或植物(例如硫堇、植物防御素)或真菌(来自丝状真菌中的AFP和PAF)或动物(cathelicidins、防御素、溶菌酶)制造的抗菌肽。血管生成素可以与核糖核酸酶抑制剂复合，当共表达时减少植物中的毒性，以提高血管生成素的表达。

本发明同样考虑到血管生成素基因或其功能活性片段或变型与编码血管生成素活性的调节子或调控子的基因的共表达。

“血管生成素活性的调节子或调控子”指的是一种分子，可提高或否则修饰血管生成素在植物细胞、植物愈伤组织、植物、种子或其他植物部分中的表达、活性或分离。例如，血管生成素活性的调节子或调控子可提高蛋白积聚，提高蛋白作用或活性，或使得蛋白的分离更加有效。其他示例包括采集后的处理、青贮相容性或加工的增强，蛋白酶稳定性或热稳定性的改善和治疗剂相容性的改善。

例如，血管生成素基因可以与编码一种或多种抗微生物剂、蛋白酶抑制剂、核糖核酸酶抑制剂、卵泡抑素的基因，以及迟发型植物器官衰老基因的基因共表达。

本发明同样考虑到包含血管生成素基因或其功能活性片段或变型以及编码血管生成素活性的调节子或调控子的基因的人工构建体或嵌合序列。

“嵌合序列”指的是一种杂合体，由通过表达包含两个或更多个连接的核酸(最初编码分开的蛋白，或其功能活性片段或变型)的融合基因而重组生成。

“融合基因”指的是两个或更多个核酸以能够表达融合蛋白，优选为翻译融合体的方式进行连接。这通常包括将终止密码子从编码第一蛋白的核酸序列上移除，然后在框内上附加第二蛋白的核酸序列。融合基因继而由细胞表达成单一蛋白。该蛋白可被设计为包括两个原始蛋白的全部序列，或者包括任一个或两者的功能活性片段或变型。

本发明同样提供了具有适于植物的密码子选择的血管生成素基因，所述血管生成素基因能够在已经被所述基因转化的植物细胞中表达。

优选地，血管生成素基因从动物，更加优选从牛(母牛)中分离而出或与其中的血管生成素基因相对应。

“具有适于植物的密码子选择的血管生成素基因”指的是血管生成素基因编码具有一种或多种血管生成素的生物学性质的多肽，但这种一个或多个密码子(尤其是位于第三位)已被改变，使得该基因相对于对应的动物基因来说，更易于在植物中表达。一个或多个核苷酸的变化是可以考虑的，只要这种修饰不会导致所述片段或变型的功能活性的缺失。优选地，所述适于植物的密码子选择的血管生成素基因与和所述修饰的基因相对应的原始动物序列的相关部分具有至少大约60％的同一性，更加优选具有至少大约80％的同一性，甚至更加优选具有至少大约95％的同一性，最优选至少大约98％的同一性。

在本发明的进一步方面，提供了能够使得血管生成素基因在植物细胞中表达的人工构建体，所述人工构建体包括启动子(有效地与血管生成素基因连接)，或者其功能活性片段或变型。

“人工构建体”指的是重组体核酸分子。

“启动子”指的是一种核酸序列，足够直接转录有效连接的核酸序列。

“有效连接”指的是核酸和调控序列，例如启动子，以使得所述核酸在适当的条件下，例如当适当的分子(比如说转录激活剂蛋白)与调控序列结合时能够表达的方式进行连接。优选地，有效连接的启动子位于相关核酸的上游。

“上游”指的是沿核酸的3’-＞5’方向。

“基因”指的是能够传递遗传信息的核苷酸链。该术语通常指的是基因或其功能活性片段或变型和/或在生物体的染色体组中能够影响其表型的其他序列。术语“基因”包括DNA(例如cDNA或基因组DNA)和单链或双链的RNA(例如mRNA或微RNA)，可选的包括合成的、非天然或修改的核苷酸碱基、合成的核酸和它们的组合。

在优选实施例中，根据本发明的人工构建体可以是载体。

“载体”指的是用于将遗传物质转移进靶细胞中的遗传构建体。

载体可以是任何合适的类型，可以是病毒或非病毒的。载体可以是表达载体。这种载体包括染色体的、非染色体的和合成的核酸序列，例如植物病毒衍生物；细菌质粒；源自根癌土壤杆菌的Ti质粒的衍生物；源自土壤杆菌的Ri质粒的衍生物；噬菌体DNA；酵母人工染色体；细菌人工染色体；双元细菌人工染色体；源自质粒和噬菌体DNA结合的载体。然而，任何其他载体均可使用，只要其在植物细胞中可复制或可整合或可存活。

在本发明这方面的一个优选实施例中，人工构建体可进一步包括终止子；所述启动子、基因和终止子可有效连接。

启动子、基因和终止子可以是任何合适的类型，可以是内源于靶植物细胞的或可以是外原性的，只要它们可在靶植物细胞中起作用。

本发明的构建体和方法中使用的启动子可以是组成性、组织特异性或可诱导的启动子。例如，启动子可以是用于在许多植物组织中进行表达的组成性花椰菜花叶病毒(CaMV35S)启动子，能够在光照条件下介导植物的光合组织中基因表达的可诱导“光合作用启动子”(例如核酮糖1，5-二磷酸)，或者是例如种子特异性启动子的组织特异性启动子，比如从由如下组成的组中挑选而出的基因：油菜的napin基因、玉米玉米醇溶蛋白4基因、水稻PR602基因和小麦谷蛋白基因。

多种可用在本发明的人工构建体上的终止子也同样为本领域技术人员所熟知。终止子可以与启动子序列源自相同的基因或不同的基因。特别适合的终止子为聚腺苷酸化信号，例如源自胭脂碱合酶(nos)和章鱼肉碱合酶(ocs)基因的CaMV35S聚A和其他终止子。

人工构建体，除启动子之外，基因和终止子可以不同的组合包括对于表达基因所必需的进一步元件，例如载体骨架、复制起点(ori)、多克隆位点、间隔序列、增强子、内含子(例如玉米泛素Ubi内含子)、抗生素耐性基因和其他可选择的标记基因[例如新霉素磷酸转移酶(nptII)基因、潮霉素磷酸转移酶(hph)基因、草胺膦乙酰基转移酶(bar或pat)基因]，以及报告基因[例如β-葡糖苷酸酶(GUS)基因(gusA)]。人工构建体也可包含用于翻译起始的核糖体结合位点。人工构建体也可包括用于扩增表达的适当的序列。

本领域技术人员应该明白，人工构建体的各种组分是有效连接的，使得可以导致血管生成素基因的表达。有效连接本发明的人工构建体组分的技术对于本领域技术人员来说是熟知的。这些技术包括连接子(例如合成的，例如包括一个或多个限制性酶切位点的连接子)的使用。

优选地，人工构建体为基本上纯化或分离出的。“基本上纯化”指的是人工构建体不含基因，这些在从本发明的核酸或启动子起源的生物体的天然发生的染色体组中的基因位于核酸或启动子两侧。该术语因此包括的人工构建体为，比如说，整合进入载体中的；整合进入独立复制的质粒或病毒中的；或整合进入原核生物或真核生物的基因组DNA中的；或者作为独立于其他序列的以分开的分子形式存在(例如由PCR或限制性内切酶消化生成的cDNA或基因组或cDNA片段)。同样包括为编码附加多肽序列的杂合基因的部分的人工构建体。优选地，基本上纯化的人工构建体具有至少大约90％的纯度，更加优选至少大约95％的纯度，甚至更加优选至少大约98％的纯度。

术语“分离出的”指的是将材料从其初始环境中(例如自然环境，如果其是天然存在的话)移除。例如，存在于活的植物中的天然存在的核酸并非是分离出的，但从自然系统中的某些或所有的共存材料中分离的相同的核酸则是分离出的。这种核酸可能是载体的部分和/或这种核酸可能是组合物的部分，且仍然分离出的，因为这种载体或组成物并非其自然环境的部分。

作为可为选择转化的宿主细胞而提供表型特征的一种可选标记基因的用途的一种选择，在转化细胞中存在的人工构建体可以通过本领域所熟知的其他技术进行测定，例如PCR(聚合酶链反应)、DNA印迹杂交分析、组织化学检验(例如GUS检验)、薄层色谱法(TLC)、RNA印迹和蛋白印迹杂交分析。

申请人惊讶地发现，相对于在转基因植物细胞中传统生成的蛋白产率来说，本发明的方法可导致转化的植物细胞中血管生成素产率的提高。

在一个优选实施例中，本发明的方法提供了占全部可溶性蛋白的在约0.1％和5％之间，更加优选在约5％和10％之间，更加优选在约10％和30％之间的产率。

实施例

实施例1

牛血管生成素基因的克隆

牛(母牛)血管生成素、核糖核酸酶、核糖核酸酶A家族、5(ANG)、mRNA序列可从国家生物技术信息中心(NCBI)获得，登记号为AM_0011078144。所预测的开放阅读框架(ORF)包括444个碱基对(bp)(图1)，编码148个氨基酸(aa)(图2)序列。通过使用SignalP3.0服务器预测氨基酸序列中信号肽切割位点的存在和位置，鉴定出一个24aa(72bp)的信号肽序列(图1和2)。

通过与一个已知过敏原数据库，即内布拉斯加大学食品过敏和资源研究计划的过敏原蛋白数据库(FARRP过敏原联机版本7.0)相比较，对血管生成素蛋白序列进行了分析。包含在蛋白内的每80个氨基酸肽的BLASTp都针对FAARP过敏原联机数据库进行了检索。没有氨基酸肽包含与该已知数据库中的过敏原35％或更高的同一性，这一标准经常被用作变应原性担心的阈值。对于血管生成素蛋白整体的BLASTp也同样针对FARRP过敏原联机数据库进行了检索。血管生成素蛋白并不包括与该数据库中任何成员相同的八个或更多个连续的氨基酸，这一标准被经常用作对于变应原性担心的阈值。

通过使用血管生成素NCBI序列，引物被设计为可扩增适于如Murray等人(1989)所定义的植物密码子选择的修饰的ANG基因(图3)。在氨基酸序列中未观察到与在图2中所提出的变化。

不同生物的血管生成素基因

应用牛血管生成素基因作为查询序列，鉴定出了一系列不同的序列，并可从NCBI处获得。不同生物的血管生成素的核苷酸和氨基酸的序列比对(图4和5)。

血管生成素基因在植物中表达的密码子优化

与在图1和图3中列出的不同的ANG核苷酸序列，对单子叶植物和双子叶植物的密码子偏倚进行了替换法优化，以提高植物中的蛋白表达(图6和7)。可负性影响表达的阴性顺式作用位点均被尽可能地切除，GC含量也被调整以延长mRNA的半衰期。指示在单子叶植物和双子叶植物优化序列之间序列同源性差异的比对在图8中示出。在两个序列之间的序列同源性的程度为80.7％。所接受的密码子最优化并不改变在图2中(不含信号肽序列)列出的氨基酸序列的翻译。

实施例2

用于血管生成素更大积聚、增强作用或改善提取的融合蛋白的生成

有可能制造血管生成素和其活性的调节子或调控子的融合蛋白，以帮助改善蛋白积聚、增强蛋白作用，或者可有效提取该蛋白。

增强血管生成素作用的融合蛋白

酵母双杂交技术已鉴定出潜在的ANG-相互作用的分子(Goa和Xu，2008)，例如α-肌动蛋白2(ACTN-2)(Hu等人，2005)、调节蛋白如卵泡抑素(FS)(Goa等人，2007)以及细胞外基质蛋白如腓骨蛋白-1(Zhang等人，2008)。假设通过与ACTN-2的相互作用，ANG可以调节细胞的移动或细胞分裂，卵泡抑素可以作为血管生成素作用的调节器，ANG和腓骨蛋白之间的相互作用可促进细胞黏附。

已知卵泡抑素通过结合并阻断肌肉生长抑素可作用于肌肉生长和调节肌细胞发育，其中肌肉生长抑素属于TGF家族成员，是成肌细胞生长和分化的有力负性调节器。结合核糖核酸酶5，卵泡抑素作为正性调节器可直接和协同作用于肌肉生长和分化。已经证明，在体外肌肉细胞生长和分化的核糖核酸酶5激活可由卵泡抑素所增强(专利PCT/AU2009/000603)。制造这两种基因的翻译融合体，用于植物中表达的密码子优化，可被用于提高血管生成素控制肌肉发育的能力。

血管生成素的活性可由核糖核酸酶抑制剂所阻断。为在植物中表达进行密码子优化的血管生成素与核糖核酸酶抑制剂的共表达，可被用于调节细胞内血管生成素的活性和通过降低植物中的毒性而提高其表达。

用于改善血管生成素提取的融合蛋白

油质蛋白提供了一种用于纯化植物中重组生成的蛋白的很简单的方法。油质蛋白为在称为油体的独特的籽油储存细胞器中发现的结构蛋白。据认为，油质蛋白基因内的中央疏水域最有可能起到定位在油体中的作用。因此，通过与油质蛋白共价融合，重组蛋白便可指向油体，这使得更容易提取。Abenes等人(1997)显示拟南芥油质蛋白-GUS融合蛋白可在至少五种油菜籽中被表达并靶向于油体内。因此，血管生成素蛋白可通过制造油质蛋白_血管生成素融合序列(图9和10)而被指向油体。合并位于两个序列之间的蛋白酶识别位点使得油质蛋白可与感兴趣的蛋白切割开。

实施例3

对于血管生成素靶向表达的启动子序列的鉴定

需要将具有组织特异性的启动子用于驱动庄稼中转基因的表达，以靶向积聚在特定的组织/器官中，避免在别处的不需要的表达。因此高度表达但同时紧紧受控的启动子是合乎需要的。

组织特异性或调控启动子

对于启动子的选择会影响转基因表达浓度，以及生长、组织和细胞特异性。驱动转基因表达不同物质的不同启动子的示例在表1中示出。

表1.驱动转基因表达的不同启动子的实施例

与血管生成素基因连接的光调节、种子和根特异性启动子的代表性实施例在图11-34中示出。

实施例4

对于血管生成素靶向表达的信号肽序列的鉴定

信号肽为短的(3-60个氨基酸长度)肽链，引导蛋白向不同的亚细胞隔室如细胞核、线粒体基质、内质网(ER)、叶绿体、质外体、液泡和过氧化物酶体的运输。

大多数运输到内质网中的蛋白在N末端具有由5-10个疏水性氨基酸组成的序列。这些蛋白中的大多数继而从内质网运输到高尔基氏体，除非这些蛋白具有4-氨基酸保留序列KDEL(lys-asp-glu-leu)的C末端，这会将它们维持在内质网中。

细胞核和核仁可分别由核定位信号(NLS)或核仁定位信号(缩写为NoLS或NOS)进行靶向。指向线粒体基质的信号肽通常称为线粒体靶向信号(MTS)。有两种类型(N末端和C末端)的过氧化物酶体靶向信号(PTS)。PTS1，在蛋白的C末端由三个氨基酸组成，而PTS2在蛋白的N末端由9个氨基酸的序列组成。

包含组织特异性或调节启动子的构建体

可靶向积聚重组体蛋白，用于从植物分泌物或植物组织中进行提取的信号肽是合乎需要的。驱动目标蛋白在不同的亚细胞隔室中积聚的不同信号肽的示例在表2中示出。

表2.用于靶向转基因表达的不同信号肽序列的示例

实施例5

用于转染双子叶植物和单子叶植物原生质体的载体的制备

用于转染双子叶植物原生质体的载体的制备

制备了一个表达载体，用于在双子叶植物原生质体细胞中瞬时表达血管生成素。表达盒的核苷酸序列包含由AtRbcS光调节启动子和胭脂碱合酶(nos)终止子(源自根癌土壤杆菌)调控的具有ER信号保留肽的ANG基因(1031312_AtRbcS-p_ANG_nos-t；图11和12)，用于在双子叶植物组织中积聚。

编码用于在双子叶植物细胞中表达荧光标记物(turboGFP)的盒的对照载体(0957286 CaMV35s-p_turboGFP_nos-t；图13)也被用于证实蛋白表达。所述盒由CaMV35S启动子、turboGFP蛋白编码序列(为在双子叶植物中表达而进行了密码子优化)和胭脂碱合酶(nos)终止子组成。

用于转染单子叶植物原生质体的载体的制备

制备了一个表达载体，用于在单子叶植物原生质体细胞中瞬时表达血管生成素。表达盒的核苷酸序列包含由TaRbcS光调节启动子和胭脂碱合酶(nos)终止子(源自根癌土壤杆菌)调控的具有ER信号保留肽的ANG基因(1031308_TaRbcS-p_ANG_nos-t；图14和15)，用于在单子叶植物组织中积聚。

编码用于在单子叶植物细胞中表达荧光标记物(dsRED)的盒的对照载体(0957284 ZmUbi-p_dsRED_nos-t；图16)也被用于证实蛋白表达。所述盒由源自玉米的泛素启动子、dsRED蛋白编码序列(为在小麦中表达而进行了密码子优化)和胭脂碱合酶(nos)终止子组成。

实施例6

转基因植物的稳定转化和生产的载体的制备

在用于饲料储存或人类消费的可食用组织中表达重组体蛋白，为递送提供了方便和廉价的来源。然而，也可通过从主要来源中将重组体蛋白作为副产品进行提取而获得更大的价值。因此，选择调节表达以及引导血管生成素蛋白的元件的综合对于这两种方法都是最重要的。

用于基因枪和土壤杆菌介导的转化的表达载体的生产

基础转化载体需要包含对于植物的基因枪和土壤杆菌介导的转化的所有必要元件。为此，需要有多种可选择的标记盒(包含受启动子和终止子调控序列控制的可选择的标记基因)，以在不同的转化过程内进行选择，以及用于不同的植物类型。

通过将包含ANG基因(含由靶向表达启动子驱动的修饰的信号序列)的表达盒引入不同的基础载体中，从而制备了表达载体，用于基因枪和土壤杆菌介导的转化。表达盒启动子和信号序列会按特别的策略进行优化，使得强度和蛋白的靶向递送适于转基因植物的最终处理。

包含内质网信号肽和光调节启动子，用于在双子叶植物组织中积聚的表达盒

为实现在光合作用的双子叶植物组织中蛋白的高水平积聚，光调节启动子(AtRbcS)与包含KDEL内质网保留信号的图3修饰的ANG基因，以及花椰菜花叶病毒CamV35S终止子序列(图17)进行结合。

制备了一个表达载体，用于在双子叶植物细胞中稳定表达血管生成素。表达盒的核苷酸序列包含由TaRbcS光调节启动子和胭脂碱合酶(nos)终止子(源自根癌土壤杆菌)调控的具有ER信号保留肽的ANG基因(pPFG000023 AtRbcS-p_ANG_nos-t；图11和18)，用于在双子叶植物组织中积聚。

包含内质网信号肽和光调节启动子，用于在单子叶植物组织中积聚的表达盒

为实现在光合作用的单子叶植物组织中蛋白的高水平积聚，光调节启动子(TaRbcS和LpRbcS)与包含KDEL内质网保留信号的图6修饰的ANG基因，以及花椰菜花叶病毒CamV35S终止子序列(分别为图20和21)进行结合。

包含内质网信号肽和油菜napin基因启动子，用于在双子叶植物种子中积聚的表达盒

重组体种子使得有可能直接用作可食用的植物组织，或者是有希望的用于提取的目标。为实现在双子叶植物种子中蛋白的高水平积聚，将种子特异性启动子(油菜napin基因)与包含KDEL内质网保留信号的图7修饰的ANG基因，以及花椰菜花叶病毒CaMV35S或nos终止子序列(图22，23和24)进行结合。

包含内质网信号肽和玉米醇溶蛋白基因启动子，用于在单子叶植物种子中积聚的表达盒

重组体种子使得有可能直接用作可食用的植物组织，或者是有希望的用于提取的目标。为实现在单子叶植物种子中蛋白的高水平积聚，将种子特异性启动子(玉米醇溶蛋白基因)与包含KDEL内质网保留信号的图6修饰的ANG基因，以及花椰菜花叶病毒CaMV35S或nos终止子序列(图25，26和27)进行结合。

包含质外体信号肽和组成性启动子，用于分泌在吐水液体中的表达盒

通过增加产量、取消提取和简化后续加工，靶向分泌有可能增加重组体蛋白生产技术的效率。例如，通过应用融合到重组体蛋白序列中的内质网信号肽，植物可通过叶细胞内空间将蛋白分泌至吐水液体中。吐水为在植物叶的边缘处的液体形式，由过量的水势能在夜晚产生。吐水液体在植物的一生中均可进行收集，因此为重组体蛋白的生产提供了一个连续和非破坏性的系统。

为通过吐水实现在单子叶植物和双子叶植物中高水平的蛋白分泌，将花椰菜花叶病毒(CaMV35S)组成性启动子和终止子序列与包含烟草钙网蛋白质外体信号肽的图7修饰的ANG基因(图32)进行结合。

包含质外体信号肽和根特异性启动子，用于在双子叶植物中进行根分泌的表达盒

也可使用靶向和直接表达以产生根分泌，这是一种从根部生产和分泌重组体蛋白的方法(Gleba，等人，1998)。使用拟南芥根特异性启动子(AtPHTI)表达ANG，并由烟草钙网蛋白质外体信号肽进行靶向，重组体蛋白可从水培生长的转基因单子叶植物(图33)的根分泌中进行提取。

也可使用靶向和直接表达以产生根分泌，这是一种从根部生产和分泌重组体蛋白的方法(Gleba，等人，1998)。使用大麦根特异性启动子(HvPHTI)表达ANG，并由烟草钙网蛋白质外体信号肽进行靶向，重组体蛋白可从水培生长的转基因植物(图34)的根分泌中进行提取。

包含油质蛋白启动子和ANG_油质蛋白融合基因，用于从油体进行提取的表达盒

为实现在油体中蛋白的高水平，将拟南芥油质蛋白启动子和CaMV35S终止子与油质蛋白ANG融合基因(图9)进行结合，以生成表达盒(图35)。

用于转化植物叶绿体基因组的表达盒

通过使用烟草叶绿体基因组，许多生物制药的转基因已经很稳定地整合并表达，以得到希望的农学特征或表达高水平的蛋白(Daniell等人，2005)。图7修饰的ANG基因已经与烟草16sRNA操纵子(Prrn)启动子和终止子序列(Zoubenko等人，1994)进行配对，以在叶绿体中表达血管生成素基因(图36)。

实施例7

表达嵌合血管生成素基因的转基因植物的生产

遗传构建体可通过任何合适的技术引入到植物中。用于将本发明的遗传构建体整合到植物细胞中的技术(例如可通过转导、转染或转化)。这些技术包括土壤杆菌介导的引入，组织、细胞和原生质体的电穿孔，原生质体融合，注射进生殖器官中，注射进未成熟的胚体和高速射弹进入细胞、组织、愈伤组织、未成熟的和成熟胚体，基因枪转化，以及它们的组合。技术的选择较大程度取决于待转化的植物种类，以及所选择的方法会使用的合适的载体。

可以按照所用的载体选择整合了本发明的遗传构建体的细胞，然后将细胞培养在合适的培养基中，使用完全建立好的技术再生出转化的植物。生成的植物可以通过有性或无性繁殖，生成转化植物的连续后代。

实施例8

双子叶植物和单子叶植物原生质体的转染

血管生成素的双子叶植物原生质体转染

使用在Spangenberg和Potrykus，1996中所描述的方法，从双子叶植物烟草的叶肉组织中释放出原生质体。使用Huang等人，1986所描述的伊凡斯蓝染色法测定烟草原生质体的生存力(图37)。

编码被设计为在AtRbcS启动子控制下表达ANG蛋白的表达盒(1031312_TaRbcS-p_ANG_nos-t；图11和12)，或者编码被设计为在组成性CaMV35S启动子控制下表达荧光报告蛋白(turboGFP)的对照表达盒(0957286 CaMV35s-p_turboGFP_nos-t；图13)的两种质粒中的DNA进行了纯化。

这两种质粒载体通过限制性内切酶的消化被切成线性，并递送至原生质体细胞的部分中。24小时后，通过在对照样品中观察到荧光标记而确认递送和基因表达成功(图38)。

在双子叶植物原生质体中血管生成素的瞬时基因表达和检测

为检测血管生成素的表达，从原生质体样品中纯化出不含DNA的RNA。合成了互补DNA(cDNA)，，使用如表3列出的血管生成素(ANG F和R)和内源性管家基因肌动蛋白(肌动蛋白F和R)的引物对每个样品进行逆转录-PCR(RT-PCR)分析。

表3.检测ANG转基因和内源性肌动蛋白表达的引物

引物名称	引物序列	SEQ ID NO：
			ANG_正向(F)	5’GAACGACATCAAGGCTATCTG 3’	45
ANG_反向(R)	5′AGCACCGTATCTACAAGGAG 3′	46
			肌动蛋白_正向(F)	5′CCCTCCCACATGCTATTCT 3′	47
肌动蛋白_反向(R)	5′AGAGCCTCCAATCCAGACA 3′	48
			寡-dT_反向(R)	5′TTCTAGAATTCAGCGGCCGCT30RN 3′	49
聚-T_反向(R)	5′TTCTAGAATTCAGCGGCCGCT 3′	50

将每个PCR样品上样到琼脂糖凝胶上，进行电泳，可观测到DNA(图39)。

两种turboGFP和ANG转染的原生质体样品的cDNA的完整性，通过从用肌动蛋白引物扩增的样品中具有预期大小(524bp)的条带的出现来确认。(图39，分别为泳道9和11)。对于从转染的DNA模板未发生产品扩增，可以通过从用相同的引物(相对于没有加入逆转录酶的那些)进行扩增的两种turboGFP和ANG转染的原生质体样品观察到缺少一个条带来进行确认(图39，泳道8和10)。

血管生成素的表达，可通过在用ANG(从用1031308AtRbcS-p_ANG_nos-t进行转染的细胞中获得)的引物进行扩增的样品中出现预期大小(138bp)的条带(图29，泳道4)，以及在合同样的引物但没有加入逆转录酶的样品中没有出现条带(图39，泳道3)进行证实。由ANG引物和1031308 AtRbcS-p_ANG_nos-t质粒DNA完成的阳性对照在图39，泳道6中被观察到，指示了所预期片段的大小。

血管生成素的单子叶植物原生质体转染

使用在Spangenberg和Potrykus，1996中所描述的方法，从单子叶植物小麦的叶肉组织中释放出原生质体。使用Huang等人，1986所描述的伊凡斯蓝染色法测定烟草原生质体的生存力(图40)。

编码被设计为在TaRbcS启动子控制下表达ANG蛋白的表达盒(1031308_AtRbcS-p_ANG_nos-t；图14和15)或者编码被设计为在来自玉米的组成性泛素启动子控制下表达荧光报告蛋白(dsRED)的对照表达盒(0957284 ZmUbi-p_dsRED_nos-t；图16)的两种质粒中的DNA进行了纯化。质粒DNA被递送到原生质体细胞部分中。24小时后，通过在对照样品中观察到荧光标记而确认递送和基因表达成功(图41)。

在单子叶植物原生质体中血管生成素的瞬时基因表达和检测

为检测血管生成素的表达，从原生质体中纯化出不含DNA的RNA，用寡-dT反向引物合成cDNA(表3)。使用为血管生成素或肌动蛋白而设计的正向引物，以及为合成cDNA的寡-dT引物的配合序列进行退火而设计的聚-T反向引物(表3)对每个样品进行RT-PCR分析，以保证没有对质粒模板进行扩增。

将每个PCR样品上样到琼脂糖凝胶上，进行电泳，可观测到DNA(图42)。

所有小麦原生质体样品的cDNA的完整性，由用肌动蛋白_F和聚-T_R引物扩增的样品出现预期大小(920bp)的条带(图42，泳道8和10)，以及用相同的引物进行扩增但没有加入逆转录酶的样品没有出现条带(图42，泳道7和9)而进行确认。

血管生成素的表达(核糖核酸酶5)，可通过用ANG_F的引物和聚-T_R引物进行扩增的样品(从用1031312 TaRbcS-p_ANG_nos-t进行转染的细胞中获得)出现预期大小(740bp)的条带(图42，泳道4)，以及用相同的引物但没有加入逆转录酶的样品(图42，泳道3)以及从没有用1031312TaRbcS-p_ANG_nos-t进行转染的样品(图42，泳道1和2)没有出现条带进行确认。

实施例9

表达嵌合血管生成素基因的油菜的土壤杆菌介导的转化

包含受不同启动子控制的嵌合ANG基因的二元载体被用于油菜胚轴部分的土壤杆菌介导的转化，如在下面列出并在图43中显示。

油菜种子在70％的乙醇中进行了2分钟的表面杀菌，无菌水冲洗3次，然后在含1％(w/v)次氯酸钙和0.1(v/v)吐温20的溶液中进一步表面杀菌30分钟。种子在无菌水中至少洗涤3次，种植在含固态萌发培养基的120ml培养皿中，其中固态萌发培养基包含1×Murashige和Skoog(Murashige和Skoog Physiol.Plant，15：473-497，1962)常量营养素，1×微量营养素和B5有机维生素，补充以500mg/L MES，2％(w/v)蔗糖，pH5.8并加入4g/L的脱乙酰吉兰糖胶。该皿在25℃、16小时光照/8小时黑暗的条件下孵育7天，以利于发芽。

7天后，油菜的幼苗(整个幼苗)被转移到液体培养基上，液体培养基由1×Murashige和Skoog常量营养素，1x微量营养素和B5有机维生素组成，补充以500mg/L MES，3％(w/v)蔗糖，pH为5.8。将幼苗聚集在一块，切除根和子叶，然后将胚轴切成7-10mm的部分，平铺在含有预先处理的培养基的9×1.5cm培养皿上，所述培养基由1×Murashige和Skoog常量营养素，1×微量营养素和B5有机维生素组成，补充以500mg/LMES，3％(w/v)蔗糖，pH为5.8，由6.4/l Bacto-琼脂进行固化。

将胚轴部分培养24小时，然后用由1×Murashige和Skoog常量营养素，1×微量营养素和B5有机维生素组成的、在pH5.8下补充以500mg/LMES，100μM乙酰丁香酮，3％(w/v)蔗糖的土壤杆菌悬浮液(OD₆₀₀＝0.2)进行接种。

接种后，胚轴部分在无菌纸巾上吸干，转入9×1.5cm培养皿中，培养皿中含有1×Murashige和Skoog常量营养素，1×微量营养素和B5有机维生素，以及500mg/L MES，100μM乙酰丁香酮，1mg/L 2，4-D，3％(w/v)蔗糖，pH为5.8，以8g/l Bacto-琼脂进行固化。外植体在25℃、16小时光照/8小时黑暗条件下孵育72小时，进行共培养。

共培养后，20-30个胚轴外植体转入9×1.5cm培养皿中，其中培养皿含有由1×Murashige和Skoog常量营养素，1×微量营养素和B5有机维生素组成的固化选择性培养基，在pH5.8下补充以500mg/L MES，1mg/L2，4-D，3％(w/v)蔗糖，由8g/lBacto-琼脂进行固化，补充以250mg/l泰门汀和10mg/l潮霉素以选择具有潮霉素抗性的芽。培养板在25℃、16小时光照/8小时黑暗条件下进行孵育。

7天后，将胚轴外植体转入9×2.0cm的培养皿中，其中培养皿包含由1×Murashige和Skoog常量营养素，1×微量营养素和B5有机维生素组成的固化再生培养基，在pH5.8下补充以500mg/L MES，1mg/L 2，4-D，3％(w/v)蔗糖，由8g/l的Bacto-琼脂进行固化，补充以4mg/l BAP，2mg/l玉米素，5mg/l硝酸银，250mg/l泰门汀和10mg/l潮霉素。培养板在25℃、直射荧光的光照条件(16小时光照/8小时黑暗光周期；55mmol m^-2sec^-1)下孵育4周，以促进芽的发育。

每周监测再生情况，将胚轴外植体转入新鲜的含固化再生培养基的9×2.0cm培养皿中6-8周，其中再生培养基补充以4mg/l苯甲腺嘌呤，2mg/l玉米素，5mg/l硝酸银，250mg/l泰门汀和10mg/l潮霉素，以促进芽的发育。

潮霉素抗性(Hyg^r)的芽被转入120ml的含有固化的根诱导培养基RIM1的培养皿中，RIM1由1×Murashige和Skoog常量营养素，1×微量营养素和B5有机维生素组成，在pH5.8下补充以500mg/L MES，1mg/L2，4-D，1％(w/v)蔗糖，并由8g/l的Bacto-琼脂进行固化，并加入250mg/l的泰门汀。芽在25℃、直接荧光照射(16小时光照/8小时黑暗的光周期；55mmol m^-2sec^-1)下孵育超过4-5周，以促进芽的伸长和根的发育。所有具有发育的芽和根系的Hyg^r芽在温室条件下被转入土壤中并生长。

实施例10

表达嵌合血管生成素基因的小麦基因枪转化

如下所述，将包含嵌合ANG基因的转化载体用于小麦(Triticumaestivum L.MPB Bobwhite 26)的基因枪转化。

步骤1(供体植物生产)：

将小麦(Bobwhite 26)种子用于供体植物材料的生产。小麦植物生长在由堆肥的松树皮、珍珠岩和蛭石组成的苗圃混合物中，每五株植物一罐，每罐最大尺寸为20cm。将植物置于大约22-24℃的温室条件下约12-16周(图45A)。当旗叶中长出第一个穗状花序时，标记植物，并收集开花后12-15时最高头处的胚体。

步骤2(第1天)：

采集处于所希望的发育阶段的穗状花序(图45B)。从穗状花序上切下颖果，将其表面放于0.8％(v/v)NaOCl溶液中杀菌20分钟，并在无菌蒸馏水中漂洗至少四次。

使用解剖显微镜从每个颖果(去除了轴)上无菌切下长度最大为10mm的胚体，并将胚体轴侧向下培养在渗透培养基(E3maltose)中，该培养基由2×Murashige和Skoog(1962)常量营养素，1×微量营养素和有机维生素，40mg/L硫胺，150mg/L L-天冬酰胺组成，补充以15％(w/v)麦芽糖，0.8％(w/v)西格玛-琼脂和2.5mg/L 2，4-D(图45C和D)。将胚体培养在含15mL培养基的60mm×15mm透明聚丙烯培养皿中。在进行轰击前，将培养皿在24℃、黑暗条件下孵育4小时。使用BioRad PDS1000基因枪，在6cm处，以1μg的凝结在0.6μm胶体金颗粒上的载体质粒DNA，按照900psi(磅/平方英寸)对胚体进行轰击。轰击后，将胚体置于渗透培养基中在黑暗里孵育过夜。

步骤3(第2天)：

将胚体转入愈伤组织诱导培养基(E3calli)中，该诱导培养基由2×Murashige和Skoog(1962)常量营养素和1×微量营养素和有机维生素，40mg/L硫胺，150mg/L L-天冬酰胺所组成，补充以6％(w/v)蔗糖，0.8％(w/v)西格玛-琼脂和2.5mg/L 2，4-D。胚体在24℃、黑暗条件下培养两周。

步骤4(第16天)：

在E3calli上培养2周后，胚体已经生成了胚性愈伤组织并被分培在选择性培养基(E3Select)上，其中选择性培养基由2×Murashige和Skoog(1962)常量营养素和1×微量营养素和有机维生素，40mg/L硫胺，150mg/L L-天冬酰胺所组成，补充以2％(w/v)蔗糖，0.8％(w/v)西格玛-琼脂，5mg/L的D，L草铵膦(PPT)，不含植物生长调节剂(图45E-G)。将培养物在24℃、12小时光周期的光照下继续在E3Select上孵育14天。

步骤5(第30天)：

在E3Select上培养14天后，胚性愈伤组织被继续分培在新鲜的E3Select上14天(图45E-G)。

步骤6(第44天)：

在E3Select上培养约4周后，从胚性愈伤组织块上切下发育的小植株，在含根诱导培养基(RM)的65mm×80mm或65mm×150mm聚碳酸酯组织培养皿中继续培养三周。根诱导培养基由1×Murashige和Skoog(1962)常量营养素，微量营养素和有机维生素，40mg/L硫胺，150mg/L L-天冬酰胺所组成，补充以2％(w/v)蔗糖，0.8％(w/v)西格玛-琼脂，和5mg/L的PPT(图45H)。剩余的胚性愈伤组织在E3Select上继续培养14天。

步骤7(第65天后)：

在RM上存活超过3周且生成了健康的根的再生植株被栽培到由泥炭和沙(1∶1)组成的苗圃混合物中，在苗圃湿度箱系统中维持在22-24℃的高湿度下。两周后，将植物从湿度箱中取出，每周浇水和浸有液体的Aquasol^TM(水溶胶)，直至成熟。T₀植物为被抽取的样本，用于基因组DNA和分子分析。收集并种植T1种子，用于高通量Q-PCR分析。

实施例11

表达嵌合血管生成素基因的小麦的土壤杆菌介导的转化

土壤杆菌介导的面包小麦的转化在图45中示出。采集已预备好的小麦供体植物用于胚体外植体的来源，以进行土壤杆菌介导的转化。被土壤杆菌感染后，经过合适的选择，愈伤组织材料在组织培养基上再生，直到观察到再生的芽。经过几轮的选择后，将生根的植物栽培在土壤中。

实施例12

表达嵌合血管生成素基因的本生烟草(Nicotiana benthamiana)的土壤杆菌介导的转化

在烟草中，土壤杆菌转化的不定芽可从叶的外植体中以很高的频率进行再生。土壤杆菌介导的烟草转化是一个四级的过程。

1.再生分离块的土壤杆菌细胞悬液接种。

2.接种在再生培养基上的外植体在基因转移发生时2-3天的共培养。

3.转化后的芽的再生及选择和细菌的清除。

4.推定的转基因植物的生物化学和分子分析。

实施例13

表达嵌合血管生成素基因的苜蓿(Medicago sativa)的土壤杆菌介导的转化

包含受不同启动子控制的嵌合ANG基因的二元载体用于来自高度可再生的苜蓿(M.sativa)克隆的苜蓿叶柄外植体的土壤杆菌介导的转化。

与含有二元载体的根癌土壤杆菌菌株LBA 4404共培养后，苜蓿外植体用含氨中噻肟头孢菌素的培养基洗涤，并用于在含25mg/l卡那霉素的选择性培养基中诱导胚性愈伤组织。转基因胚性苜蓿愈伤组织被回收并能够再生出转基因的苜蓿芽，所述苜蓿芽被转移到根源培养基上，使得表达嵌合ANG基因的转基因苜蓿植物得到回收。

实施例14

表达嵌合血管生成素基因的多年生黑麦草(Lolium perenne)基因枪转化

在多年生黑麦草的胚性愈伤组织上用含TaRbcS和LpRbcS调控序列，驱动ANG基因表达的载体(图19、20和21)和用于潮霉素抗性的pAcH1载体基因枪共转化多年生黑麦草。pAcH1载体以前就已构造好并已经成功用于植物转化实验(Bilang，等人，1991；Spangenberg，等人，1995a；Spangenberg，等人，1995b；Ye，等人，1997；Bai，等人，2001)。在图44中提供了多年生黑麦草基因枪转化的方法。

实施例15

表达嵌合血管生成素基因的白三叶草(Trifolium repens)的土壤杆菌介导的转化

如下面所列出的，包含受不同启动子控制的嵌合ANG基因的载体被用于白三叶草的土壤杆菌介导的转化。

组织培养基中的所有材料均在24℃、16小时光照/8小时黑暗的条件下生长。白三叶草的种子在70％v/v乙醇中洗涤，在1.5％次氯酸钠(12.5g/L活性氯)中进行表面杀菌，无菌蒸馏水中漂洗，并在4℃的暗处过夜吸干。子叶外植体与其所固定的胚轴的1-2毫米的片段进行切割。外植体在土壤杆菌培养基(OD₆₀₀＝大约0.35)上孵育40分钟，在再生培养基上共培养，其中再生培养基由1×Murashige和Skoog基础培养基(西格玛)，30g/L蔗糖，5M噻苯隆(西格玛)，0.5M萘-乙酸，250mg/L氨中噻肟头孢菌素(凯福隆，赫斯特)和8g/LBacto-琼脂(贝克顿-狄更斯)组成，pH5.75，补充以40mg/L的乙酰丁香酮。外植体在24℃下共培养3天，转入含合适的选择性试剂的再生培养基中，每2-3周分培一次。再生的芽转入根诱导培养基中，该培养基由1×MS基础培养基，15g/L蔗糖，1.2M吲哚-丁酸，250mg/L氨中噻肟头孢菌素，合适的选择性试剂和8g/LBacto-琼脂组成，pH5.75。抗生素抗性的植株被转入土壤中并在温室条件下固定。白三叶草土壤杆菌介导的转化的方法在图46中示出。

实施例16

表达嵌合血管生成素基因的转基因白三叶草植物的生产

包含光调节启动子和内质网保留信号的构建体的用途

AtRbcS_ANG_35S表达盒被整合到含由胭脂碱合酶(nos)启动子和终止子序列驱动的新霉素磷酸转移酶(npt II)基因的选择性标记盒的载体骨架中(图47)。该载体通过土壤杆菌介导的转化插入到白三叶草基因组中。

实施例17

表达嵌合血管生成素基因的转基因白三叶草植物的特性

转基因白三叶草中血管生成素表达的检测

从用AtRbcS_ANG_35S转化及未转化的对照的白三叶草的叶和茎中提取总RNA。使用血管生成素基因特异性的引物进行逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)分析，以检测转基因植物中血管生成素的表达(图48)。

转基因白三叶草中血管生成素蛋白的检测

从非转基因(对照)和转基因的白三叶草植物组织中获取总蛋白提取物，使用2DE凝胶仪器进行分离。非转基因和转基因植物之间比较二维蛋白谱。在转基因组织中观察到包含了在对照材料中观察不到的丰富的蛋白斑点(图49)。使用MOWSE得分算法去确定转基因白三叶草中的这一丰富的蛋白斑点的同一性。这可按照如下得以完成。

将目的蛋白斑点从2DE凝胶中切下，用猪胰蛋白酶过夜消化。被消化的蛋白样品继而C18除盐，点样在MALDI-TOF/TOF质谱靶标上。被点样的蛋白样品继而使用MALDI-TOF/TOF质谱分析进行测序(图50)。从肽质指纹图谱数据中获得的所观察的肽质，以及从肽离子碎裂样式中获得的所观察的肽离子碎裂质继而结合在一起，在已知的计算肽质和已知的计算离子碎裂质的NCBInr序列数据库中进行搜索。由MALDI-TOF/TOF质谱分析获得的质谱图与NCBInr序列数据库中的牛血管生成素匹配。使用MOWSE得分算法获得的蛋白得分和离子得分为牛血管生成素阳性。

可溶性转基因白三叶草提取物中牛血管生成素的蛋白定量

将大约50ug的可溶性转基因白三叶草提取物上样到2DE凝胶上。牛血管生成素占了10％的可溶性转基因白三叶草提取物，因此是5mg的可溶性转基因白三叶草提取物。这可使用Progenesis PG240软件(非线性动力学，英国，泰恩河畔的纽卡斯尔)的密度测定法进行测定。

将放置在1.5ml的匀浆缓冲液中的200mg磨碎植物组织进行匀浆，制备可溶性转基因白三叶草提取物。转基因白三叶草中表达的水平相当于每毫克植物提取物7.5毫克的牛血管生成素。这种水平相当于在牛奶中4-8mg/ml之间的血管生成素表达。

实施例18

共表达血管生成素和其他蛋白，以提高血管生成素生产力的转基因植物的生产

有可能通过提高在植物中生产力的范围而改进现有技术，对多种应用的效率产生重大影响。

在植物中表达血管生成素的生产力可能通过与抗菌剂、蛋白酶抑制剂、核糖核酸酶抑制剂、卵泡抑素或迟发型植物器官衰老核酸和构建体共表达而得以提高。

已经建立了延长植物寿命(专利PCT/AU01/01092)，增加生物量和高果聚糖(专利PCT/AU2009/001211)的技术。用考虑这些其他因素的技术改进当前应用的技术，应该可以大大地提高植物健康和产量，而这又会反过来增加动物的健康和产量，同时提高在植物生物量中附加值产品的生成。

实施例19

表达嵌合血管生成素基因的拟南芥(Arabidopsis thaliana)的土壤杆菌介导的转化

包含受不同启动子控制的嵌合ANG基因的载体用于下面所提供的拟南芥的土壤杆菌介导的转化。

1.通过浸润法将土壤杆菌的细胞悬液接种到拟南芥上，以便于土壤杆菌进入要发生T-DNA转移的未成熟的花中。

2.植物生长和监测以及潜在转基因种子的采集。

3.在含合适的选择抗生素的发芽培养基上的转化的种子的再生和选择。

4.推定的转基因植物的生物化学和分子分析。

实施例20

包含嵌合血管生成素基因的转基因拟南芥植物的生产

包含光条件启动子和内质网保留信号的构建体的用途

AtRbcS_ANG_nos表达盒(图11)被整合进含由CSVMV启动子和CaMV35S终止子序列驱动的潮霉素磷酸转移酶(hptII)基因的可选择标记盒的载体骨架上(图18)。该载体通过土壤杆菌介导的转化插入到拟南芥基因组中。

实施例21

包含嵌合血管生成素基因的转基因白三叶草植物的特性

转基因拟南芥中的血管生成素基因的检测

从含AtRbcS_ANG_nos和野生型未转化对照的两种不同的转基因株系的拟南芥叶中提取DNA。使用血管生成素基因特异性的引物(表3)进行聚合酶链反应(PCR)分析，检测转基因植物株系中血管生成素基因的存在情况(图51)。

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