CN112321697B - 一种黑水虻抗菌肽Cecropin-α及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种黑水虻抗菌肽Cecropin‑α及其应用，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。该抗菌肽用于杀灭或抑制以大肠杆菌、沙门氏菌为代表的革兰氏阴性菌或以金黄色葡萄球菌为代表的革兰氏阳性菌。本发明获得的黑水虻抗菌肽Cecropin‑α具有抗菌作用，可应用于制备抗细菌类产品，抗细菌类产品包括饲料添加剂、兽药、防腐剂、医药产品如抗菌药物等。

Description

一种黑水虻抗菌肽Cecropin-α及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种黑水虻抗菌肽Cecropin-α及其应用，其是能够抑制和杀灭细菌的抗菌肽，具体是一种能抑制和杀灭多种革兰氏阴性/阳性菌及其耐药菌株的抗菌肽。

背景技术

抗菌肽是一类具有抗菌活性的小分子多肽，能够直接杀灭病原体或激活宿主免疫防御体系，在宿主对抗病原体入侵的免疫防御中起着重要的作用。当前我国医疗领域和规模化禽畜养殖领域中抗生素的长期滥用，导致病原菌的耐药谱和抗药性不断提高，诱发“超级细菌”的滋生。除了严格规范抗生素使用外，这也迫切要求人们找寻一些能够替代传统抗生素，且无毒害、不易耐药的新型药物，而抗菌肽就是其中的研究热点。从生活环境较为污秽的昆虫体内鉴定具有高效抗菌活性的抗菌肽是研究热点之一。

黑水虻（Hermetia illucens L.，也称亮斑扁角水虻）隶属于昆虫纲双翅目短角亚目水虻科，在自然界中以动物粪便、腐烂的有机物及植物性垃圾为食，营腐生性生活。黑水虻幼虫可以取食禽畜粪便或餐厨垃圾等有机废弃物，将其转化为动物蛋白饲料，是一种优良的资源昆虫；且黑水虻幼虫取食有机废弃物后，不仅可以减少其体积和恶臭气味，还可以显著降低其中大肠杆菌和沙门氏菌等细菌量，大大改善生活环境。

研究表明，黑水虻幼虫因长期暴露于高浓度有害微生物中，其体内具有极为强大的免疫系统和种类丰富的抗菌肽等天然免疫分子，近年来也逐渐引起了人们的高度关注。夏嫱等用不同方法诱导黑水虻幼虫后研磨提取的粗提物能够显著抑制大肠杆菌的生长（夏嫱等，环境昆虫学报，2013年01期，44-48）；Park 等从黑水虻血淋巴中分离纯化了防御素类抗菌肽DLP2和DLP4对革兰氏阳性菌具有较好的抑制效果（Soon-Ik Park et al.,Developmental & Comparative Immunology, 2015 52(1):98-106）；Elhag 等从黑水虻中分离纯化了 Cecropin、 Sarcotoxin、 Stomoxyn 类的7个抗菌肽具有较好的抗革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌活性（Osama Elhag et al., PLoS One, 2017 12(1): e0169582）；Alvarez等从黑水虻幼虫血淋巴中分离出来了4种约4.2 KDa的抗菌肽，具有较好的抗幽门螺旋杆菌活性（Daniela Alvarez et al., Journal of Insect Science, 2019 19(6):17）。

申请人使用沙门氏菌针刺处理黑水虻幼虫，获取其血淋巴后进行转录组测序和生物信息学分析，鉴定出168条表达显著上调的抗菌肽编码基因，通过Real-Time PCR对这些基因进行验证和筛选，鉴定出了其中表达差异最为显著的抗菌肽，分析发现其为典型的天蚕素类抗菌肽，将其命名为Cecropin-α；我们进一步克隆了其编码基因，在毕赤酵母中进行了体外表达和蛋白纯化；检测其抗菌活性发现，该抗菌肽对大肠杆菌、沙门氏菌等革兰氏阴性菌、以及金黄色葡萄球菌等革兰氏阳性菌、以及对应的抗生素耐药菌，均具有极强的抗菌活性。

发明内容

为实现上述目的，本发明公开了如下的技术内容：

一种黑水虻抗菌肽Cecropin-α，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述的抗菌肽Cecropin-α既能抑制又能杀灭革兰氏阳性菌/革兰氏阴性菌。氨基酸序列如SEQ ID NO.1：MNFSKLFVFVAVVIALLVAFAGQSEAGWSRSLWFKKIEKPVERAGQRIRDATIQGIAIQQGANVLTVRGGVLAQARGLKG

本发明进一步公开了黑水虻抗菌肽Cecropin-α在制备治疗大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌及相应耐药菌感染药物中的应用。本发明所述的应用在用于制备人用或畜禽用药物。特别是畜禽饲料添加剂中的应用。实验结果显示：对革兰式阳性菌和革兰氏阴性菌的多种细菌具有抑菌活性，可用于抗病原微生物感染的生物技术产品研发。以黑水虻抗菌肽Cecropin-α氨基酸序列或基因序列为基础，通过基因工程、蛋白质工程、发酵工程、转基因和其它生物技术手段，可以大规模获得黑水虻抗菌肽蛋白，用于抗病原微生物感染的生物技术产品研发。

本发明获得的黑水虻抗菌肽Cecropin-α具有生物活性，具有抗菌作用。分离纯化的黑水虻抗菌肽Cecropin-α对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌标准菌株的MIC依次为4.8、5.1、8.4 µg/mL，对各自对应的抗生素耐药菌的MIC依次为5.2、5.5、7.8 µg/mL。因此，本发明的黑水虻抗菌肽Cecropin-α可应用于制备抗细菌类产品，抗细菌类产品包括饲料添加剂、兽药、防腐剂、医药产品如抗菌药物等。

本发明主要解决了当前我国医疗领域和规模化禽畜养殖领域中抗生素的长期滥用，导致病原菌的耐药谱和抗药性不断提高，迫切要求人们找寻一些无毒害、不易耐药的抗生素替代品问题；重点考察了具有极为强大的免疫系统的黑水虻幼虫体内的抗菌肽，筛选出了具有最佳抗菌活性的天蚕素类抗菌肽Cecropin-α，并在体外表达纯化了该蛋白，检测了抑制或杀灭革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌及耐药菌株的活性；工作的主要难点在于从黑水虻体内高通量鉴定出大批抗菌肽基因，并筛选出效果最佳的抗菌肽。

附图说明

图1为实验组和对照组样品转录组测序后差异表达基因分析；

图2为Real-Time PCR检测差异最显著抗菌肽基因在对照组/实验组中的转录水平；

图3为Cecropin-α基因克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K；其中A为PCR扩增Cecropin-α基因产物的琼脂糖电泳图；B为pPIC9K质粒酶切谱；C为重组质粒酶切鉴定后的琼脂糖电泳图；

图4为Cecropin-α在毕赤酵母中的诱导表达与蛋白纯化；其中A为甲醇诱导Cecropin-α表达后进行SDS-PAGE电泳和考马斯亮蓝染色的结果图；B为酵母发酵上清液进行硫酸铵分级沉淀和复溶后的电泳并染色结果图；C为对蛋白粗提物使用AKTA purifier10进行纯化后的电泳并染色结果图；

图5为Cecropin-α对沙门氏菌标准菌株和耐药菌株的抑菌活性检测；其中A为Cecropin-α对沙门氏菌标准菌株CVCC541的抑菌活性检测；B为Cecropin-α对沙门氏菌抗生素耐药株的抑菌活性检测；对照组滴加25 μg/mL 左氧氟沙星，1、2、3、4、5号分别滴加50、25、10、5、1 μg/mL的抗菌肽Cecropin-α。

具体实施方式

下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。

本发明所用原料及试剂均有市售，其中大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、克雷伯氏肺炎菌、绿脓杆菌、痢疾志贺氏菌、表皮葡萄球菌、溶血性链球菌、变形链球菌的标准菌株购自ATCC或CMCC等权威生物资源中心，大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌的抗生素耐药菌为自行从临床细菌感染患者的痰培养物中分离，所有菌株均为天津师范大学生命科学学院微生物与免疫教研室保存，黑水虻虫卵为购自江苏普立天生物科技有限公司的广西品系，幼虫通过虫卵自行孵化后获得。

实施例1

沙门氏菌针刺诱导下的黑水虻幼虫转录组测序和黑水虻抗菌肽数据挖掘

使用沙门氏菌标准菌株CVCC541的菌液针刺浸泡诱导黑水虻幼虫，并继续饲养24h后使用TRIzol提取其总RNA，送交北京诺禾致源公司进行RNA-seq转录组测序。对测序数据进行了详细的生物信息学分析，发现与对照组相比，实验组测序结果在≤300bp和300-500bp范围内的mRNA序列显著上升（见图1），而抗菌肽这种小分子多肽的编码基因多处于这个长度范围内，根据各类抗菌肽的结构特征从中筛选得到了168个抗菌肽序列。

实施例2

Real-Time PCR检测抗菌肽基因在对照组/实验组中的转录水平差异

我们使用对照组和实验组的cDNA为模板，根据上述168个基因的ORF序列设计引物，通过Real-Time PCR再次验证了这些基因在抗菌肽诱导下的表达情况，三次重复后筛选出其中变化最为显著的前10个基因（见图2），其中抗菌肽AMP93的变化最为显著，根据其序列特征归属于天蚕素类，将其命名为Cecropin-α。

实施例3

Cecropin-α的基因扩增与表达载体的构建

我们将根据上述测序获得的Cecropin-α基因序列设计引物，通过PCR扩增获得Cecropin-α基因，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳（见图3A），使用EcoRⅠ和NotⅠ将PCR片段进行酶切，并连接到使用同样限制性内切酶进行酶切的毕赤酵母分泌表达载体pPIC9K中（谱图见图3B），将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞后，涂布在LB+Amp琼脂平板上，挑取单克隆进行扩增培养和质粒抽提，构建含有Cecropin-α基因的毕赤酵母表达载体pPIC9K-Cecα。该质粒使用EcoRⅠ和NotⅠ进行酶切鉴定，酶切产物经1.5%的琼脂糖凝胶电泳得到约500 bp的条带即为阳性克隆质粒（见图3C）。将阳性克隆质粒送交金唯智公司进行Sanger测序，选择其中序列正确的质粒。

实施例4

Cecropin-α在毕赤酵母中的表达与纯化

我们将构建得到的pPIC9K-Cecα重组粒线性化后电转化到毕赤酵母菌中，经筛选获得Mut⁺阳性转化子，提取其基因组DNA后通过PCR验证目的基因是否成功整合到酵母染色体中。将成功整合菌株接种到BMGY培养基中划线培养，随后转接至BMMY液体培养基中扩增培养，通过甲醇诱导靶基因表达，抗菌肽Cecropin-α应该存在于发酵上清液中。

在30℃下，利用0.6 mM 甲醇诱导24h，收集发酵上清液后通过冷冻干燥浓缩，然后进行SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色（见图4A）。与未诱导组（泳道1）相比，甲醇诱导组（泳道2）表达了一条分子量＜17 kDa间的蛋白质，该蛋白的分子量与预期的Cecropin-α的分子量（8.6 kDa）相符，说明我们成功构建了Cecropin-α的毕赤酵母表达系统。

我们对上述最佳诱导条件下获得的毕赤酵母发酵上清液进行硫酸铵分级沉淀，获得了在0-20%、20-40%、40-60%、60-80%共4个盐饱和度区间对应蛋白沉淀组分。对上述沉淀复溶后进行SDS-PAGE电泳检测（见图4B），当盐饱和度为40%-60%时，在相应的8.6 kDa的位置能明显看到目标Cecropin-α条带，而且通过硫酸铵分级沉淀除去了很多杂蛋白。因此，硫酸铵分级沉淀可以显著除去大量杂蛋白，实现目的蛋白的粗提纯。

接下来，我们使用AKTA purifier 10对蛋白粗提物进行纯化，选择溶液pH值为8.5，产物进行SDS-PAGE电泳和考马斯亮蓝染色（见图4C）。泳道1和2分别是纯化前样品和上样时的穿出样品，可以看出当溶液pH值为8.5时＜17 kDa之间的目的蛋白几乎全部结合到柱子上。利用1 M NaCl 对结合的蛋白进行线性梯度洗脱，选择NaCl百分比为10%-100%（泳道3-12）。当NaCl百分比达到50%时，目的蛋白被特异性洗脱下来（泳道7），后面随着NaCl百分比增加，其它杂蛋白被洗脱下来。泳道7目的蛋白洗脱峰的最大紫外峰值（UV280nm）为2100，为我们筛选的蛋白纯化条件。

实施例6

黑水虻抗菌肽Cecropin-α对沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的抑制作用

检测方法按照美国临床实验室标准化研究所标准（CLSI）执行。

纸片扩散法：分别培养沙门氏菌标准菌株CVCC541及临床耐药株，细胞计数并调整浓度至2×10⁵ CFU/mL,将500μL菌液均匀涂布在LB琼脂平板上，并在每个平板上均匀放置6个滤纸圆片，分别标注为对照、1、2、3、4、5。对照组滴加阳性对照药（25 μg/mL 左氧氟沙星），1-5号分别滴加50、25、10、5、1μg/mL的抗菌肽Cecropin-α，37℃培养24 h后，量取抑菌环直径(mm)，观察抑菌效果。

Cecropin-α对沙门氏菌标准菌株CVCC541的抑菌活性结果显示（见图5A），同等药物浓度下，Cecropin-α对沙门氏菌标准菌株CVCC541的抑菌活性基本与左氧氟沙星相当；Cecropin-α对沙门氏菌标耐药株的抑菌活性结果显示（见图5B），左氧氟沙星对沙门氏菌耐药株基本无抑菌活性，而5 μg/mL以上浓度的Cecropin-α对沙门氏菌耐药株具有较为显著的抑菌效果。

肉汤稀释法：分别培养下述各种以大肠杆菌、沙门氏菌为代表的革兰氏阴性菌和以金黄色葡萄球菌为代表的革兰氏阳性菌，细胞计数并调整浓度至1×10⁵ CFU/mL,平底96微孔板上取3个微孔作为空白对照孔，后面每孔内分别加入50 μL细菌培养液。留3个微孔作为阳性对照，在之后的微孔中加入不同浓度抗菌肽Cecropin-α 50ul，然后从中吸取50ul混悬液至下一孔，依此类推。于37℃过夜培养，波长 600 nm 下测定微孔板中各孔内培养液的吸光度值，统计各孔中样品的抑菌率，计算抗菌肽Cecropin-α对各细菌的最小抑菌浓度MIC，结果见表1。

表1，抗菌肽Cecropin-α对各细菌菌株的最小抑菌浓度

这个结果显示：分离纯化的黑水虻抗菌肽Cecropin-α对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌标准菌株的MIC依次为4.8、5.1、8.4 µg/mL，对各自对应的抗生素耐药菌的MIC依次为5.2、5.5、7.8 µg/mL，对克雷伯氏肺炎菌、绿脓杆菌、痢疾志贺氏菌等革兰氏阴性菌的MIC依次为14.9、12.7、8.3 µg/mL，对表皮葡萄球菌、溶血性链球菌、变形链球菌的MIC依次为12.8、21.9、24.1 µg/mL。这个结果说明，我们分离纯化的黑水虻抗菌肽Cecropin-α对于以大肠杆菌、沙门氏菌为代表的革兰氏阴性菌、以金黄色葡萄球菌为代表的革兰氏阳性菌，以及各自对应的抗生素耐药菌，具有较好的杀灭或抑制效果。

实施例7

使用该抗菌肽制备畜禽饲料添加剂、兽药、抗菌药物

本实施例的畜禽饲料添加剂，是将纯化的抗菌肽Cecropin-α，使用生理盐水稀释至5mg/mL的母液，按照1:1000的比例，添加到雏鸡的饲料中。对于已经发生白痢的雏鸡，连续采食7日为一周期，一周期后雏鸡康复；对于正常饲养中的雏鸡，连续采食7日为一周期，使用后，雏鸡发生白痢或其它病原菌感染疾病的发病率降低为0%。

SEQUENCE LISTING

<110> 天津市农业科学院

<120> 一种黑水虻抗菌肽Cecropin-α及其应用

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 80

<212> PRT

<213> 氨基酸序列

<400> 1

Met Asn Phe Ser Lys Leu Phe Val Phe Val Ala Val Val Ile Ala Leu

1 5 10 15

Leu Val Ala Phe Ala Gly Gln Ser Glu Ala Gly Trp Ser Arg Ser Leu

20 25 30

Trp Phe Lys Lys Ile Glu Lys Pro Val Glu Arg Ala Gly Gln Arg Ile

35 40 45

Arg Asp Ala Thr Ile Gln Gly Ile Ala Ile Gln Gln Gly Ala Asn Val

50 55 60

Leu Thr Val Arg Gly Gly Val Leu Ala Gln Ala Arg Gly Leu Lys Gly

65 70 75 80

Claims (4)

1.一种黑水虻抗菌肽Cecropin-α，其特征在于它的氨基酸序列如SEQ ID NO .1所示；所述的抗菌肽Cecropin-α既能抑制又能杀灭革兰氏阳性菌/革兰氏阴性菌。

2.权利要求1所述黑水虻抗菌肽Cecropin-α在制备治疗大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌感染的产品中的应用。

3.权利要求2所述的应用，其特征在所述应用为用于制备人用或畜禽用药物。

4.权利要求2所述的应用，其特征在所述应用为用于制备畜禽饲料添加剂中的应用。

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