EA037202B1 - Слитые белки для лечения инфекций, вызванных грамотрицательными бактериями - Google Patents

Слитые белки для лечения инфекций, вызванных грамотрицательными бактериями Download PDF

Info

Publication number
EA037202B1
EA037202B1 EA201270079A EA201270079A EA037202B1 EA 037202 B1 EA037202 B1 EA 037202B1 EA 201270079 A EA201270079 A EA 201270079A EA 201270079 A EA201270079 A EA 201270079A EA 037202 B1 EA037202 B1 EA 037202B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
ala
gly
leu
lys
fusion protein
Prior art date
Application number
EA201270079A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201270079A1 (ru
Inventor
Роб Лавинь
Стефан Миллер
Ивс Брирс
Гёйдо Волкарт
Маартен Валмах
Original Assignee
Катхолике Университейт Лёвен, К.У. Лёвен Р Энд Д
Лисандо Аг
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Катхолике Университейт Лёвен, К.У. Лёвен Р Энд Д, Лисандо Аг filed Critical Катхолике Университейт Лёвен, К.У. Лёвен Р Энд Д
Publication of EA201270079A1 publication Critical patent/EA201270079A1/ru
Publication of EA037202B1 publication Critical patent/EA037202B1/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/47—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2), e.g. cellulases, lactases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2/00—Methods or apparatus for disinfecting or sterilising materials or objects other than foodstuffs or contact lenses; Accessories therefor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/02—Nasal agents, e.g. decongestants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/08—Bronchodilators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/02—Drugs for disorders of the urinary system of urine or of the urinary tract, e.g. urine acidifiers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/16—Otologicals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4723—Cationic antimicrobial peptides, e.g. defensins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2462—Lysozyme (3.2.1.17)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/503—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01017—Lysozyme (3.2.1.17)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Otolaryngology (AREA)

Abstract

Изобретение относится к антимикробным агентам, активным в отношении грамотрицательных бактерий, в частности к слитым белкам, состоящим из эндолизина с функцией разрушения клеточной стенки грамотрицательных бактерий и амфипатичной пептидной цепи, слитой с эндолизином на N- и/или С-конце. Помимо этого изобретение относится к молекулам нуклеиновой кислоты, кодирующим заявленный слитый белок, векторам, содержащим заявленные молекулы нуклеиновой кислоты, и клеткам-хозяинам, содержащим либо заявленные молекулы нуклеиновой кислоты, либо заявленные векторы. Дополнительно изобретение относится к применению заявленного слитого белка в качестве медикаментозного препарата, в частности, для лечения или профилактики инфекций, вызываемых грамотрицательными бактериями, средства диагностики или компонента косметических препаратов. Изобретение также относится к обработке или профилактике заражения грамотрицательными бактериями пищевых продуктов, оборудования на предприятиях пищевой промышленности, поверхностей, контактирующих с пищевыми продуктами, медицинского оборудования, поверхностей в стационарах и хирургических блоках. Кроме этого изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей заявленный слитый белок.

Description

(54) СЛИТЫЕ БЕЛКИ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ИНФЕКЦИЙ, ВЫЗВАННЫХ ГРАМО ТРИЦАТЕ Л ЬНЫМИ БАКТЕРИЯМИ (31) 09163953.4 (32) 2009.06.26 (33) ЕР (43) 2012.06.29 (86) PCT/EP2010/059146 (87) WO 2010/149792 2010.12.29 (71)(73) Заявитель и патентовладелец:
КАТХОЛИКЕ УНИВЕРСИТЕЙТ ЛЁВЕН, К.У ЛЁВЕН Р ЭНД Д (BE); ЛИСАНДО АГ (LI) (72) Изобретатель:
Лавинь Роб (BE), Миллер Стефан (DE), Брире Иве (СН), Волкарт Гёйдо, Валмах Маартен (BE) (74) Представитель:
Гончаров В.В. (BY) (56) VAN DER LINDEN DANITSJA S. ET AL.: Synergistic effects of ovine-derived cathelicidins and other antimicrobials against Escherichia coli 0157:H7 and Staphylococcus aureus 1056 MRSA. BIOTECHNOLOGY LETTERS AUG 2009 LNKD-PUBMED: 19396584, vol. 31, no. 8, 26 April 2009 (2009-04-26), pages 1265-1267,
XP002604248 ISSN: 1573-6776 Published online: 26 April 2009 the whole document
WO-A2-2005108563
WO-A1-2005024002
WO-A1-0100855
ARIMA H. ET AL.: Bactericidal action of lysozymes attached with various sizes of hydrophobic peptides to the C-terminal using genetic modification FEBS LETTERS, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL LNKD- DOL10.1016/S0014-5793(97)01071-5, vol. 415, no. 1, 22 September 1997 (1997-09-22), pages 114-118, XP004261147 ISSN: 0014-5793 e.g. abstract the whole document
IBRAHIM H.R. ET AL.: Enhanced bactericidal action of lysozyme to Escherichia coli by inserting a hydrophobic pentapeptide into its C terminus JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, AMERICAN SOCIETY I FOR BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY, INC, US, vol. 269, no. 7, 18 February 1994 (1994-02-18), 1 pages 5059-5063, XP002579297 ISSN: 0021-9258 e.g. abstract the whole document
DONOVAN D.M. ET AL.: Peptidoglycan hydrolase fusions maintain their parental specificities APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, AMERICAN SOCIETY FOR MICROBIOLOGY, US LNKD- DOI:10.1128/AEM.72.4.2988-2996.2006, vol. 72, no. 4, 1 April 2006 (2006-04-01), pages 2988-2996, XP002582772 ISSN: 0099-2240 e.g. abstract the whole document
US-A1-2006147442
037202 В1
037202 Bl (57) Изобретение относится к антимикробным агентам, активным в отношении грамотрицательных бактерий, в частности к слитым белкам, состоящим из эндолизина с функцией разрушения клеточной стенки грамотрицательных бактерий и амфипатичной пептидной цепи, слитой с эндолизином на N- и/или С-конце. Помимо этого изобретение относится к молекулам нуклеиновой кислоты, кодирующим заявленный слитый белок, векторам, содержащим заявленные молекулы нуклеиновой кислоты, и клеткам-хозяинам, содержащим либо заявленные молекулы нуклеиновой кислоты, либо заявленные векторы. Дополнительно изобретение относится к применению заявленного слитого белка в качестве медикаментозного препарата, в частности, для лечения или профилактики инфекций, вызываемых грамотрицательными бактериями, средства диагностики или компонента косметических препаратов. Изобретение также относится к обработке или профилактике заражения грамотрицательными бактериями пищевых продуктов, оборудования на предприятиях пищевой промышленности, поверхностей, контактирующих с пищевыми продуктами, медицинского оборудования, поверхностей в стационарах и хирургических блоках. Кроме этого изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей заявленный слитый белок.
Изобретение относится к антимикробным агентам, активным в отношении грамотрицательных бактерий, а именно к слитым белкам, включающим энзим с функцией разрушения клеточной стенки грамотрицательных бактерий и дополнительной удлиненной пептидной цепи, слитой с энзимом на N- или Сконцах. Помимо этого изобретение относится к молекулам нуклеиновой кислоты, кодирующим упомянутый слитый белок, векторам, включающим упомянутые молекулы нуклеиновой кислоты, и клеткамхозяинам, содержащим либо упомянутые молекулы нуклеиновой кислоты, либо упомянутые векторы. Дополнительно изобретение относится к применению упомянутого слитого белка в качестве медикаментозного препарата, в частности, в лечении или профилактике инфекций, вызываемых грамотрицательными бактериями, в качестве средства диагностики или компонента косметического препарата. Изобретение также относится к обработке или профилактике заражения грамотрицательными бактериями пищевых продуктов, оборудования и помещений на предприятиях пищевой промышленности, поверхностей, контактирующих с пищевыми продуктами, медицинского оборудования, поверхностей в медицинских стационарах и хирургических блоках. Помимо этого изобретение относится к фармацевтическим или косметическим композициям, содержащим упомянутый слитый белок.
Грамотрицательные бактерии обладают внешней мембраной с отличительным признаком в виде характерного ассиметричного двойного слоя. Внешний мембранный двойной слой состоит из внутреннего одинарного слоя, включающего фосфолипиды (преимущественно фосфатидил этаноламин) и внешнего одинарного слоя, который по преимуществу состоит из одного гликолипида, липополисахарида (ЛПС). В мире бактерий существует огромное множество структур ЛПС, и структура ЛПС может изменяться в ответ на превалирующие условия окружающей среды. Стабильность слоя ЛПС и взаимодействие между различными молекулами ЛПС главным образом происходят благодаря электростатическому взаимодействию бивалентных ионов (Mg2+, Са2+) с анионными компонентами молекулы ЛПС (фосфатные группы в липиде А, а также внутреннее ядро и карбоксигруппы KDO). Помимо этого, компактное и упорядоченное расположение гидрофобной группы липида А, характеризуемое отсутствием ненасыщенных жирных кислот, образует жесткую структуру с высокой вязкостью. Это придает ей меньшую проницаемость, предотвращающую от проникновения липофильных молекул, а также дополнительную устойчивость внешней мембраны (ВМ).
Известны различные типы агентов с бактерицидным или бактериостатическим действием, например антибиотики, эндолизины, антимикробные пептиды и дефензины. Возрастающая микробная устойчивость в отношении антибиотиков, тем не менее, создает проблемы в лечении все большего числа инфекций, вызываемых бактериями, в частности, что касается инфекций, вызываемых грамотрицательными бактериями, как, например, Pseudomonas aeruginosa и Enterobacteriaceae.
Эндолизины представляют собой пептидогликангидролазы, кодированные бактериофагами (или бактериальными вирусами). Они синтезируются во время экспрессии поздних генов в литическом цикле мультипликации фагов и опосредуют высвобождение прогенных вирионов из инфицированных клеток путем разрушения бактериального пептидогликана. Они являются либо в(1,4)-гликолазами (лизосимами), трансгликолазами, амидазами или эндопептидазами. Антимикробное применение эндолизинов было предложено еще в 1991 г. Gasson (GB 2243611). Несмотря на то, что способность к уничтожению микробов, наблюдаемая у эндолизинов, известна в течение длительного времени, использование данных энзимов в качестве антимикробных веществ игнорировали по причине успешного и доминирующего применения антибиотиков. Только после обнаружения бактерий с множественной устойчивостью к антибиотикам, стали проявлять интерес к применению эндолизинов в качестве препаратов против патогенных микроорганизмов, вызывающих заболевания у человека. Возникла насущная потребность в разработке совершенно новых классов антибактериальных агентов, и эндолизины, используемые в качестве энизибиотиков - термин-гибрид (энзимы и антибиотики), прекрасно выполняют данную функцию. В 2001 г. Fischetti и соавторы впервые продемонстрировали терапевтический потенциал эндолизина бактериофага Cl в отношении стрептококков группы A (Nelson et al., 2001). С того времени множество публикаций подтвердили функцию эндолизинов в качестве приемлемого и дополнительного альтернативного средства для контроля бактериальных инфекций, вызываемых в частности грамположительными бактериями. Впоследствии была подтверждена эффективность в качестве энзибиотиков у различных эндолизинов, активных в отношении других грамположительных патогенов, как, например, Streptococcus pneumoniae (Loeffler и соавторы, 2001), Bacillus anthracis (Schuch и соавторы, 2002), S. agalactiae (Cheng и соавторы, 2005) и Staphylococcus aureus (Rashel и соавторы, 2007). В настоящее время самую насущную проблему в терапии с использованием эндолизинов представляет нечувствительность грамотрицательных бактерий к экзогенному действию эндолизинов, поскольку внешняя мембрана выполняет функцию щита, защищающего бактерии от проникновения эндолизинов из пептидогликанов. Данное свойство в настоящее время препятствует расширению перечня эффективных эндолизинов, применяемых в отношении важных грамотрицательных патогенов.
Антимикробные пептиды (АМП) представляют широкий спектр малых, катионных, генкодированных пептидных антибиотиков, которые можно обнаружить в практически любом организме. Различные АМП обладают различными свойствами, многие пептиды в данном классе являются предметом интенсивных научных исследований не только как антибиотики, но также как образцы для создания
- 1 037202 пептидов, проникающих через клеточную стенку. Несмотря на наличие нескольких схожих свойств (например, катионность, амфипатичность и малый размер), существует огромное разнообразие последовательностей АМП, и в связи с этим предложили как минимум четыре структурные группы (α-спиральные, β-складчатые, растянутые и закольцованные) для систематизации всего разнообразия наблюдаемых АМП. Аналогичным образом, по мере появления новых антибиотиков было предложено несколько вариантов механизмов действия и было доказано, что, например, основной мишенью многих из этих пептидов является клеточная мембрана, в то время как основной мишенью для других пептидов является проникновение в цитоплазматическую мембрану и нарушение основных функций метаболизма. АМП могут приобретать концентрацию, достаточную для синергического действия, несмотря на отсутствие специфического связывания мишеней; например, путем образования поры в мембране, как, например, в случае многих АМП. Тем не менее, данное явление наблюдается только в модельных фосфолипидных бислоях, а в некоторых случаях концентрация АМП в мембране была настолько высока, что необходимо соотношение одной пептидной молекулы на шесть фосфолипидных молекул. Данные концентрации приближаются к и практически эквивалентны состоянию полной мембранной насыщаемости. Поскольку минимальная подавляющая концентрация (МПК) для АМП, как правило, находится в пределах низкого микромолярного диапазона, значимость определения данных значений и их роль в проведении опытов in vivo сопровождается совершенно объяснимым скептицизмом (Melo et al., Nature reviews, Microbiology, 2009, 245).
Дефензины представляют собой большую группу малых, катионных, с повышенным содержанием цистеина и аргинина антимикробных пептидов, присутствующих как в позвоночной, так и межпозвоночной тканях. Дефензины подразделяют на пять групп в соответствии с сеткой размещения цистеинов: растительные, межпозвоночные, α-, β- и θ-дефензины. Последние три в большинстве случаев встречаются у млекопитающих. α-Дефензины представляют собой белки, встречающиеся в нейтрофилах и эпителии ЖКТ. β-Дефензины по преимуществу являются наиболее широко встречающимися и вырабатываются лейкоцитами и эпителиальными клетками различных видов. До настоящего времени θ-дефензины редко обнаруживали, например, в лейкоцитах макак-резусов. Дефензины проявляют активность в отношении бактерий, грибков и многих вирусов с оболочкой и без. Тем не менее, для эффективного уничтожения бактерий необходимы по преимуществу высокие концентрации, например, в микромолярном диапазоне. Активность многих пептидов может снижаться в условиях, приближенных к условиям физиологической соли, бивалентных катионов и сыворотки. В зависимости от содержания гидрофобных аминокислотных остатков дефензины также проявляют гемолитическую активность.
Термин белок в том смысле, в котором он используется в описании заявленного изобретения, синонимично соотносится с термином полипептид. Термин белок в том смысле, в котором он используется в описании заявленного изобретения, относится к линейному полимеру аминокислотных остатков, связанных пептидными связями в специфичной последовательности. Аминокислотные остатки белка могут быть модифицированы, например, ковалентными прикреплениями различных групп, как, например, углеводы и фосфаты. Прочие вещества могут быть более свободно ассоциированы с полипептидными цепочками, как, например, гемы или липиды, приводя к образованию конъюгированных белков, которые также обозначают термином белок, в том смысле, в котором он используется в описании заявленного изобретения. Описаны различные варианты с включением полипептидных цепей, в частности, что касается присутствия α-спиральных и β-складчатых структур. Термин белок в том смысле, в котором он используется в описании заявленного изобретения, относится к четырем классам белков, а именно α, β, α/β и а-плюс-β. Помимо этого, термин белок относится к комплексному соединению, причем комплекс представляет собой гомомер.
Термин слитый белок в том смысле, в котором он используется в описании заявленного изобретения, относится к продукту экспрессии, являющемуся результатом слияния двух последовательностей нуклеиновых кислот. Такой белок получают, например, в системах экспрессии рекомбинантных ДНК. Помимо этого термин слитый белок, в том смысле, в котором он используется в описании заявленного изобретения, относится к слиянию первой аминокислотной последовательности, как, например, энзиму, со второй или последующими аминокислотными последовательностями. Вторая или последующие аминокислотные последовательности могут определять домен или прочие участки пептидной цепи. Более предпочтительно упомянутые вторая или последующие аминокислотные последовательности чужеродны и по преимуществу не гомогенны с любой областью первой аминокислотной последовательности.
Термин пептидная цепь в том смысле, в котором он используется в описании заявленного изобретения, относится к любому типу пептида, связанного с белком, например с энзимом.
Термин пептид, в том смысле, в котором он используется в описании заявленного изобретения, относится к малым полипептидам, состоящим из от примерно 2 до примерно 100 аминокислотных остатков, более предпочтительно от примерно 4 до примерно 50 аминокислотных остатков, наиболее предпочтительно от примерно 5 до 30 аминокислотных остатков, причем аминогруппа одного аминокислотного остатка соединена пептидной связью с карбоксигруппой другого аминокислотного остатка. Пептид может обладать специфической функцией. Пептид может представлять собой природный пептид или
- 2 037202 пептид, сконструированный и полученный синтетическим путем. Пептид могут, к примеру, извлекать или получать путем удаления из нативного белка при помощи энзиматического (ферментативного) или химического расщепления либо могут приготавливать с использованием методов традиционного синтеза пептидов (например, твердофазный синтез) или способов молекулярной биологии (see Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)). Примерами природных пептидов могут служить антимикробные пептиды, дефензины, Sushi пептиды. Примерами синтетически полученных пептидов являются поликатионные, амфипатичные или гидрофобные пептиды. Пептид в описании заявленного изобретения не обозначает His-таги (-метки), Strep-таги, белки, связывающие тиоредоксин или мальтозу (МВР) и им подобные, которые используют для очистки или локализации белков.
Термин эндолизин в том смысле, в котором он используется в описании заявленного изобретения, относится к энзиму, применение которого приемлемо для гидролиза клеточных стенок бактерий. Эндолизины состоят как минимум из одного энзим-активного домена (ЭАД) и обладают свойствами как минимум одного из нижеперечисленных компонентов: эндопептидаза, хитиназа, Т4-подобная мураминидаза, лямбда-подобная мураминидаза, N-ацетил-мурамоил-L-аланин-амидаза (амидаза), мурамоил-Lаланин-амидаза, мурамидаза, литическая трансгликолаза (С), литическая трансгликолаза (М), N-ацетилмурамидаза, N-ацетил-глюкозаминидаза (лизосим) или трансгликолаза, как, например, KZ144 или EL188. Дополнительно эндолизины могут включать также энзим-неактивные области, которые могут связываться с клеточной стенкой бактерии-хозяина, так называемые домены связывания с клеточной стенкой.
Термин ЭАД в том смысле, в котором он используется в описании заявленного изобретения, относится к энзим-активному домену эндолизина. ЭАД ответственен за гидролиз бактериальных пептидогликанов. Этот домен обладает как минимум одной энзим-функцией эндолизина. ЭАД также может состоять из более чем одного энзим-активного модуля.
Термин аутолизины относится к энзимам, подобным эндолизинам, но кодируемым бактериями и, например, вовлеченными в процесс клеточного деления. Подробное описание аутолизинов можно найти в Bacterial peptidoglycan(murein)hydrolases. Vollmer W., Joris B., Charlier P., Foster S. FEMS Microbiol Rev. 2008 Mar; 32(2):259-86.
Термин бактериоцин в том смысле, в котором он используется в описании заявленного изобретения, относится к белковоподобным, полипептид-подобным или пептид-подобным веществам, которые могут ингибировать рост других бактерий. Более предпочтительно упомянутый процесс ингибирования происходит специфически путем абсорбции упомянутых прочих бактерий специфическими рецепторами бактериоцина. Обычно бактериоцины продуцируются микроорганизмами. Тем не менее, термин бактериоцин в том смысле, в котором он используется в описании заявленного изобретения, относится как к изолированной форме микроорганизма, так и синтетически получаемой форме, и относится к вариантам, которые преимущественно сохраняют свойства своих родительских бактериоцинов, но чьи последовательности были изменены путем инсерции или делеции одного или более аминокислотных остатков.
Термин антимикробные пептиды (АМП) в том смысле, в котором он используется в описании заявленного изобретения, относится к любому пептиду с микробицидной и/или микробиостатической функциями. Так, например, термин антимикробный пептид в том смысле, в котором он используется в описании заявленного изобретения, относится, в частности, к любому пептиду с антимикробной, антигрибковой, антимикотической, антипаразитарной, антипротозойной, антивирусной, антиинфекционной, антиконтагиозной и/или бактерицидной, альгицидной, амебоцидной, микробицидной, бактерицидной, фунгицидной, паразитицидной, протозоицидной функцией.
Термин дефензин в том смысле, в котором он используется в описании заявленного изобретения, относится к пептиду, встречающемуся в животном мире, предпочтительно у млекопитающих, более предпочтительно у человека, причем дефензин выполняет важную функцию в механизме внутренней защитной системы организма-хозяина, разрушая чужеродные вещества, как, например, инфекционные бактерии и/или инфекционные вирусы и/или грибки. Дефензин представляет собой микробицидный и/или туморицидный белок, пептид или полипептид типа неантитело. Примерами дефензинов могут являться дефензины млекопитающих, α-дефензины, β-дефензины, индолицин и магаинины. Термин дефензины, в том смысле, в котором он используется в описании заявленного изобретения, относится как к изолированной форме из клеток животных, так и к синтетически получаемой форме, и также относится к вариантам, которые преимущественно сохраняют цитотоксические свойства своих родительских белков, но чьи последовательности изменили путем инсерции или делеции одного или более аминокислотных остатков.
Термин Sushi пептид, в том смысле, в котором он используется в описании заявленного изобретения, относится к белкам комплементарного контроля с короткими повторениями транскрипции. Sushi модуль Sushi пептидов функционирует как домен взаимодействия белок-белок в различных белках. Доказано, что пептиды, содержащие Sushi домен, показывают антимикробную активность.
В контексте описания заявленного изобретения термин катионный пептид относится к пептиду с положительно заряженными аминокислотными остатками. Предпочтительно катионный пептид имеет значение pKa 9,0 или более. Как правило, как минимум четыре аминокислотных остатка катионного пеп- 3 037202 тида могут быть положительно заряженными, например лизин или аргинин.
Термин положительно заряженные относится к боковым цепям аминокислотных остатков, имеющих номинальное значение номинального положительного заряда на уровне примерно физиологической среды. Примерами природных катионных пептидов, которые могут быть получены рекомбинантным способом, являются дефензины, магаинины, меллитин и цекропины.
Термин поликатионные пептиды, в том смысле, в котором он используется в описании заявленного изобретения, относится к синтетически получаемым пептидам, состоящим преимущественно из остатков лизина и/или аргинина.
Термин амфипатичный пептид в том смысле, в котором он используется в описании заявленного изобретения, относится к пептидам, имеющим как гидрофильные, так и гидрофобные функциональные группы. Предпочтительно в контексте описания заявленного изобретения, термин амфипатичный пептид относится к пептиду, имеющему определенное расположение гидрофильных и гидрофобных групп, например, амфипатичные пептиды могут являться α-спиральными, с превалирующими неполярными боковыми цепями вдоль одной стороны спирали и полярными остатками вдоль остальной части поверхности.
Термин гидрофобная группа в том смысле, в котором он используется в описании заявленного изобретения, относится к химическим группам, как, например, аминокислотные боковые цепи, которые преимущественно водонерастворимы, но растворимы в масляной фазе, причем растворимость в масляной фазе выше, чем растворимость в воде или водной фазе. В воде аминокислоты с гидрофобной боковой цепью взаимодействуют друг с другом для получения неводной среды. Примерами аминокислот с гидрофобными боковыми цепями являются аланин, валин, лейцин, изолейцин, фенилаланин, гистидин, триптофан и тирозин.
Термин делеция в том смысле, в котором он используется в описании заявленного изобретения, относится к делеции (удалению) 1, 2, 3, 4, 5 или более аминоксилотных остатков из соответствующей стартовой последовательности.
Термины инсерция или аддиция в том смысле, в котором они используются в описании заявленного изобретения, относятся к инсерции или аддиции 1, 2, 3, 4, 5 или более аминокислотных остатков соответствующей стартовой последовательности.
Термин субституция в том смысле, в котором он используется в описании заявленного изобретения, относится к замене аминокислотного остатка, расположенного на определенной позиции, на другой аминокислотный остаток.
Заявленное изобретение относится к новым антибактериальным агентам, активным в отношении грамотрицательных бактерий. Данной цели достигают путем практического воплощения сути заявленного изобретения, изложенного ниже в описании и в формуле изобретения.
В частности, изобретением представлен слитый белок, состоящий из эндолизина с функцией разрушения клеточной стенки грамотрицательных бактерий и амфипатичной пептидной цепи, слитой с эндолизином со стороны N-конца и/или С-конца, причем амфипатичная пептидная цепь содержит от 5 до 100 аминокислотных остатков и при этом один или более аминокислотных остатков амфипатичной пептидной цепи представляют собой положительно заряженные остатки лизина и/или аргинина и как минимум 60% аминокислотных остатков амфипатичной пептидной цепи представляют собой гидрофобные остатки валина, изолейцина, лейцина, метионина, фенилаланина, триптофана, цистеина, аланина, тирозина, треонина, серина, пролина и/или глицина.
В другом предпочтительном варианте практического воплощения заявленного изобретения амфипатичная пептидная цепь содержит от 5 до 50 аминокислотных остатков.
Достижение цели изобретения обеспечивается и тем, что амфипатичная пептидная цепь представляет собой природный пептид.
Слитый белок характеризуется тем, что как минимум 30% аминокислотных остатков амфипатичной пептидной цепи являются положительно заряженными остатками лизина и/или аргинина.
Представленная амфипатичная пептидная цепь имеет последовательность SEQ ID NO: 11, 6, 7, 8, 9, 12, 13, 14, 15, 16, 19, 26, 27, 28, 29, 30 или 31.
В соответствии с данным изобретением эндолизин обладает функцией разрушения клеточной стенки Campylobacter.
Представленный выше слитый белок характеризуется тем, что эндолизин имеет происхождение из эндолизинов Pseudomonas aeruginosa фагов ψΚΖ и EL и эндолизин имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 25, 22, 24, 2, 3, 4, 5, 18, 20, 21 или 23.
Слитый белок содержит дополнительный аминокислотный остаток на N-конце.
Слитый белок включает метку (tag) на С- и/или N-концах, причем метка (tag) связана со слитым белком по меньшей мере через один дополнительный аминокислотный остаток.
Слитый белок характеризуется и тем, что амфипатичная пептидная цепь связана с эндолизином по меньшей мере через один дополнительный аминокислотный остаток.
Слитый белок имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 46, 82, 95, 36, 37, 38, 39, 40,
- 4 037202
43, 45, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 77, 78, 81, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90,
96, 97, 98 или 99.
Изобретением представлены также изолированная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая упомянутый выше слитый белок; вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты, и клетка-хозяин, содержащая молекулу нуклеиновой кислоты или указанный вектор; причем клетка-хозяин представляет собой бактериальную или дрожжевую клетку.
Достижение цели изобретения обеспечивается и следующими применениями слитого белка: в качестве компонента косметического препарата; в качестве медикаментозного препарата для лечения или профилактики инфекций, вызываемых грамотрицательными бактериями; в качестве дезинфектанта; как средства для обработки или профилактики заражения грамотрицательными бактериями пищевых продуктов, оборудования на предприятиях пищевой промышленности, поверхностей, контактирующих с пищевыми продуктами, медицинского оборудования, поверхностей в стационарах и хирургических блоках; а также в качестве средства диагностики инфекций, вызываемых грамотрицательными бактериями, в медицине, пищевой промышленности и природоохранной деятельности.
Достижение цели изобретения обеспечивается и фармацевтической композицией для лечения или профилактики инфекций, вызываемых грамотрицательными бактериями, которая содержит слитый белок по любому из пп.1-13.
Предпочтительные слитые белки в соответствии с заявленным изобретением представлены в SEQ ID NO: 36 до SEQ ID NO: 63. Слитые белки в соответствии с последовательностями от SEQ ID NO: 36 до SEQ ID NO: 63 могут содержать один или более дополнительных аминокислотных остатков на N-конце. Предпочтительно дополнительным аминокислотным остатком является метионин.
Предпочтительно эндолизин кодируют бактериофагами, специфичными в отношении грамотрицательных бактерий бактериальных групп, семейств, родов или видов, которые содержат штаммы, патогенные в отношении человека или животных, как, например, Enterobacteriaceae (Escherichia, в особенности Е. coli, Salmonella, Shigella, Citrobacter, Edwardsiella, Enterobacter, Hafnia, Klebsiella, в особенности K. pneumoniae, Morganella, Proteus, Providencia, Serratia, Yersinia), Pseudomonadaceae (Pseudomonas, в особенности Р. aeruginosa, Burkholderia, Stenotrophomonas, Shewanella, Sphingomonas, Comamonas), Neisseria, Moraxella, Vibrio, Aeromonas, Brucella, Francisella, Bordetella, Legionella, Bartonella, Coxiella, Haemophilus, Pasteurella, Mannheimia, Actinobacillus, Gardnerella, Spirochaetaceae (Treponema и Borrelia), Leptospiraceae, Campylobacter, Helicobacter, Spirillum, Streptobacillus, Bacteroidaceae (Bacteroides, Fusobacterium, Prevotella, Porphyromonas), Acinetobacter, в особенности A. baumanii.
Энзим в соответствии с заявленным изобретением обладает функцией разрушения клеточной стенки грамотрицательных бактерий бактериальных групп, семейств, родов или видов, которые содержат штаммы, патогенные в отношении человека или животных, как, например, Enterobacteriaceae (Escherichia, в особенности Е. coli, Salmonella, Shigella, Citrobacter, Edwardsiella, Enterobacter, Hafnia, Klebsiella, в особенности K. pneumoniae, Morganella, Proteus, Providencia, Serratia, Yersinia), Pseudomonadaceae (Pseudomonas, в особенности Р. aeruginosa, Burkholderia, Stenotrophomonas, Shewanella, Sphingomonas, Comamonas), Neisseria, Moraxella, Vibrio, Aeromonas, Brucella, Francisella, Bordetella, Legionella, Bartonella, Coxiella, Haemophilus, Pasteurella, Mannheimia, Actinobacillus, Gardnerella, Spirochaetaceae (Treponema и Borrelia), Leptospiraceae, Campylobacter, Helicobacter, Spirillum, Streptobacillus, Bacteroidaceae (Bacteroides, Fusobacterium, Prevotella, Porphyromonas), Acinetobacter, в особенности A. baumanii.
Специфические примеры эндолизиновых составляющих, извлеченные из фага или эндолизин природного типа, представлены в следующей таблице.
- 5 037202
Таблица 1
Фаг Источник (публикация) Эндолизин дикого типа Прогнозируемая функция эндолизина
ФУ10 Perry, L.L. and Applegate. В.М. PhiV10p30 хитиназа
FELS-1 McClelland, М. and Wilson, R.K. STM0907.FelsO хитиназа
ε15 Kropinksi, A.M. and McConnel, M.R. epsilon15p25 хитиназа
YUA Ceyssens. P. (Laboratory for Gene technology) YuA20 литическая трансгликаза (С) /1 трансмембранно-воздушный домен (N)
ВЗ Braid, M.D. and Kitts, C.L. ORF23 литическая трансгликаза (С)/2 трансмембранно-воздушный домен (N)
ВСЕРр Slimmer, E.J. and Young, R. BcepMu22 литическая трансгликаза (М) /1 трансмембранно-воздушный домен (N)
F116 Byme, M. and Kropinski, A.M. F116p62 мураминидаза (Т4-подобная)
FELS-2 McClelland, M. and Wilson, R.K. STM2715.S.Fels2 мураминидаза (Т4-подобная)
ES18 Casjens, S.R and Hendrix, R.W. gp76 мураминидаза (Т4-подобная)
SETP3 De Lappe, N and Cormican, M. SPSV3_gp23 мураминидаза (Т4-подобная)
ФЕСО32 Savalia, D and Severinov, К phi32_17 мураминидаза (Т4-подобная)
НК022 Juhala , R and Hendrix, R.W. HK022p54 мураминидаза (лямбда-подобная)
НК97 Juhala , R and Hendrix, R.W. HK97p58 мураминидаза (лямбда-подобная)
НК620 Clark, A.J. and Dhillon, T.S. HK620p36 мураминидаза (лямбда-подобная)
Е1 Pickard, D. and Dougan, G VIP0007 мураминидаза (лямбда-подобная)
SF6 Casjens, S and Clark, A.J. Sf6p62 мураминидаза (лямбда-подобная)
SFV Allison. G.E. and Verma, N.K. R (SfVp40) мураминидаза (лямбда-подобная)
ВСЕРС6В Summer, EJ and Young, R gP22 мураминидаза (лямбда-подобная)
BCEPNAZGUL Summer, EJ and Young, R. Nazgul38 мураминидаза (лямбда-подобная)
Р2 Christie, G.E. and Calender, R. К (P2p09) мураминидаза (лямбда-подобная)
WΦ Christie, G.E. and Esposito, D. К (Wphi09) мураминидаза (лямбда-подобная)
RV5 Kropinski, A.M. and Johnson rv5_gp085 мураминидаза (лямбда-подобная)
JS98 Zuber, S and Denou, E. EpJS98_gpt 16 мураминидаза (Т4-подобная)
13А Savalia, D and Molineux, I. gp3.5 мурамоил-1_-аланин амидаза
ВА14 Savalia, D and Molineux, I. gp3.5 мурамоил-1_-аланин амидаза
ECODS1 Savalia, D and Molineux, I. gp3.5 мурамоил-1_-аланин амидаза
K1F Scholl, D and Merril, C CKV1F_gp16 мурамоил-Ьаланин амидаза
ТЗ Pajunen, M.l. and Mollineux, I.J. T3p18 мурамоил-1-аланин амидаза
GH-1 Kropinski, A.M. and Kovalyova, I.V. gh-1p12 мурамоил-1-аланин амидаза
К11 Molineux, I. and Savalia, D. gp3.5 мурамоил-Ьаланин амидаза
ФСТХ Nakayama, К and Hayashi, T. ORF12 ПГ-связывающий домен (N) / мурамидаза (С)
ВСЕР43 Summer. EJ and Young, R. Bcep43-27 ПГ-связывающий домен (N) / мурамидаза (С)
ВСЕР781 Summer. EJ and Young, R. Bcep781-27 ПГ-связывающий домен (N) / мурамидаза (С)
ВСЕР1 Summer, EJ and Young, R. Bcep1-28 ПГ-связывающий домен (N) / мурамидаза (С)
BCEPNY3 Summer, EJ and Young, R. BcepNY3gene26 ПГ-связывающий домен (N) / мурамидаза (С)
ФЕ12-2 DeShazer, D and Nierman, W.C. gp45 ПГ-связывающий домен (N) / мурамидаза (С)
Ф52237 DeShazer, D and Nierman, W.C. gp28 ПГ-связывающий домен (N) / мурамидаза (С)
ФР27 Recktenwald, J and Schmidt, H. P27p30 эндопептидаза
RB49 Monod, C and Krisch, H.M. RB49p102 эндопептидаза
Ф1 Arbiol, C. and Comeau, A.M. phi1-p102 эндопептидаза
Т5 Pankova. N.V.and Ksenzenko, V.N. lys (T5.040) эндопептидаза
201 рП!2-1 Thomas etal., 2008 ПГ-связывающий домен (N) / неизвестный каталитический домен (С)
Aeh1 Monod, C and Krisch, H.M. Aeh1p339 мураминидаза (Т4-подобная)
YYZ-2008 Kropinski, A.M. YYZgp45 мураминидаза (лямбда-подобная)
Также предпочтительны эндолизиновые составляющие, извлеченные из эндолизинов Pseudomonas aeruginosa фагов <pKZ и EL, Pseudomonas putida фага, Е. coli фага N4, фага LUZ24, gp61 мурамидазы,
- 6 037202
STM0016 эндолизина и PSP3 эндолизина.
Помимо этого, эндолизиновые составляющие выбирают из группы, включающей phiKZgp144 в соответствии с SEQ ID NO: 1, ELgp188 в соответствии с SEQ ID NO: 2, Salmonella эндолизин в соответствии с SEQ ID NO: 3, эндолизин Т4 энтеробактериального фага в соответствии с SEQ ID NO: 4, Acinetobacter baumanii endolysin в соответствии с SEQ ID NO: 5, эндолизин E.coli фага K1F в соответствии с SEQ ID NO: 18, OBPgpLYS в соответствии с SEQ ID NO: 34, эндолизин PSP3 Salmonella (PSP3gp10) в соответствии с SEQ ID NO: 20, эндолизин E.coli фага Р2 (P2gp09) в соответствии с SEQ ID NO: 21, мурамидаза Salmonella typhimurium фага STM0016 в соответствии с SEQ ID NO: 22, E.coli фаг N4 мурамидаза N4gp61 в соответствии с SEQ ID NO: 23 и N4-gp61 в соответствии с SEQ ID NO: 24, KZ144 в соответствии с SEQ ID NO: 25.
В другом предпочтительном варианте практического воплощения заявленного изобретения эндолизины слитого белка в соответствии с заявленным изобретением содержат модификации и/или изменения аминокислотных последовательностей. Такие изменения и/или модификации могут включать мутации, как, например, делеции, инсерции и аддиции, субституции или сочетания вышеупомянутых и/или химические изменения аминокислотных остатков, например биотинилирование, ацетилирование, пегилирование, химические изменения амино-, SH- или карбоксигрупп. Упомянутые эндолизины слитого белка в соответствии с заявленным изобретением показывают литическую активностть соответствующего эндолизина дикого типа. Тем не менее, упомянутая активность может быть на том же самом уровне, выше или ниже способности соответствующего эндолизина дикого типа. Упомянутая активность может находиться на уровне 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 или примерно 200% от уровня активности соответствующего эндолизина дикого типа или даже более. Активность можно измерить опытным путем при помощи методов, хорошо известных специалистам в данной области техники, как, например, чашечный тест определения (гемолиза) или анализ в жидкой среде, которые описаны в публикациях Briers et al., J. Biochem. Biophys Methods 70: 531-533, (2007) или Donovan D.M., Lardeo M., Foster-Frey J. FEMS Microbiol Lett. 2006 Dec; 265 (1) или в аналогичных публикациях.
Предпочтительно удлиненная пептидная цепь слитого белка в соответствии с заявленным изобретением слита с N-концом и/или С-концом эндолизина, аутолизина или бактериоцина. В более предпочтительном варианте практического воплощения заявленного изобретения упомянутая удлиненная пептидная цепь слита только с N-концом энзима. В другом предпочтительном варианте практического воплощения заявленного изобретения удлиненная пептидная цепь слита только с С-концом энзима. Тем не менее, предпочтительными также являются модифицированные слитые белки с удлиненной пептидной цепью на обоих N-конце и С-конце. Упомянутые пептидные цепи на N-конце и С-конце могут быть одинаковыми или различными пептидными цепями. Пептидная цепь может быть связана с энзимом дополнительными аминокислотными остатками, например, из-за клонирования. Предпочтительно упомянутая пептидная цепь может быть связана со слитым белком при помощи как минимум 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 дополнительных аминокислотных остатков. В предпочтительном варианте практического воплощения пептидная цепь связана с энзимом дополнительными аминокислотными остатками глицина и серина (Gly-Ser) или лейцина и глутаминовой кислоты (Leu-Glu). Более того, пептидная цепь слитого белка в соответствии с заявленным изобретением может также содержать дополнительные аминокислоты на Nконце. Предпочтительно пептидная цепь содержит аминокислоты метионин (Met), аланин и метионин и глицин (Ala-Met-Gly-Ser) или аланин и метионин и глицин и серии (Ala-Met-Gly-Ser).
Пептидная цепь слитого белка в соответствии с заявленным изобретением предпочтительно связана ковалентной связью с энзимом. Предпочтительно упомянутая пептидная цепь состоит как минимум из 5, более предпочтительно как минимум из 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25,
26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55,
56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85,
86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или как минимум 100 аминокислотных остатков. Наиболее предпочтительной является пептидная цепь, содержащая от примерно 5 до примерно 100 аминокислотных остатков, от примерно 5 до примерно 50 или от примерно 5 до примерно 30 аминокислотных остатков. Более предпочтительной является пептидная цепь, содержащая от примерно 6 до примерно 42 аминокислотных остатков, от примерно 6 до примерно 39 аминокислотных остатков, от примерно 6 до примерно 38 аминокислотных остатков, от примерно 6 до примерно 31 аминокислотных остатков, от примерно 6 до примерно 25 аминокислотных остатков, от примерно 6 до примерно 24 аминокислотных остатков, от примерно 6 до примерно 22 аминокислотных остатков, от примерно 6 до примерно 21 аминокислотных остатков, от примерно 6 до примерно 20 аминокислотных остатков, от примерно 6 до примерно 19 аминокислотных остатков, от примерно 6 до примерно 16 аминокислотных остатков, от примерно 6 до примерно 14 аминокислотных остатков, от примерно 6 до примерно 12 аминокислотных остатков, от примерно 6 до примерно 10 аминокислотных остатков или от примерно 6 до примерно 9 аминокислотных остатков.
Предпочтительно пептидная цепь не содержит таг (метку), как, например, His-таг, Strep-таг, Aviтаг, Мус-таг, Gst-таг, JS-таг, цистеин-таг, FLAG-таг или прочих тагов, известных из уровня техники и никаких тиоредоксин- или мальтоза-связывающих белков (МВР). Тем не менее, пептидная цепь и/или
- 7 037202 эндолизин, аутолизин или бактериоцин в соответствии с заявленным изобретением могут содержать дополнительно такой таг(и).
Более предпочтительно пептидная цепь обладает способностью направлять слитой белок через внешнюю мембрану, но также обладает активностью, в том числе ничтожной или минимальной, при введении без слития с энзимом. Функция проведения слитого белка через внешнюю мембрану грамотрицательных бактерий обусловлена потенциалом внешней мембраны или ЛПС разрушающей или проникающей или дестабилизирующей активностью упомянутой пептидной цепи.
В одном из аспектов заявленного изобретения слитая пептидная цепь представляет собой амфипатичный пептид, который содержит один или более положительно заряженных аминокислотных остатков лизина, аргинина и/или гистидина, в сочетании с одним или более гидрофобными аминокислотными остатками валина, изолейцина, лейцина, метионина, фенилаланина, триптофана, цистеина, аланина, тирозина, гистидина, треонина, серина, пролина и/или глицина. Боковые цепи аминокислотных остатков предпочтительно ориентированы с учетом того, что катионные и гидрофобные поверхности упорядочены в кластеры на противоположных сторонах пептида. Предпочтительно более чем примерно 30, 40, 50, 60 или 70% аминокислотных остатков в упомянутом пептиде являются положительно заряженными аминокислотами. Предпочтительно более чем примерно 30, 40, 50, 60 или 70% аминокислотных остатков в упомянутом пептиде являются гидрофобными аминокислотными остатками. Предпочтительно амфипатичный пептид слит с N-концом и/или С-концом энзима, обладающего способностью разрушать клеточную стенку, повышая таким образом амфипатичность упомянутых белков.
В другом варианте практического воплощения заявленного изобретения амфипатичный пептид, слитый с энзимом, содержит как минимум 5, более предпочтительно как минимум 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 или 50 аминокислотных остатков. В предпочтительном варианте практического воплощения как минимум примерно 30, 40, 50, 60 или 70% упомянутых аминокислотных остатков амфипатичного пептида являются остатками либо аргинина, либо лизина и/или как минимум 30, 40, 50, 60 или 70% упомянутых аминокислотных остатков амфипатичного пептида являются остатками гидрофобных аминокислот валина, изолейцина, лейцина, метионина, фенилаланина, триптофана, цистеина, аланина, тирозина, гистидина, треонина, серина, пролина и/или глицина.
Предпочтительными амфипатичными пептидами являются Pleurocidin в соответствии с SEQ ID NO: 6, Cecropin P1 в соответствии с SEQ ID NO: 7, Butorin II в соответствии с SEQ ID NO: 8, Buforin I в соответствии с SEQ ID NO: 19 и Magainin в соответствии с SEQ ID NO: 9. Более предпочтительными амфипатичными пептидами являются Cathelidicine e.g. LL-37 в соответствии с SEQ ID NO: 10, Nigrocine 2 в соответствии с SEQ ID NO: 26 и Ascaphine 5 в соответствии с SEQ ID NO: 27.
В другом аспекте заявленного изобретения слитая пептидная цепь представляет собой антимикробный пептид, который содержит номинальный положительный заряд и примерно 50% гидрофобных аминокислотных остатков. Антимикробные пептиды являются амфипатичными, с длиной примерно от 12 до примерно 50 аминокислотных остатков.
Специфические примеры антимикробных пептидов в соответствии с завяленным изобретением приведены в нижеследующей таблице.
Таблица 2
Пептид Последовательность
LL-37 LLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTES SEQ ID NO: 10
S MAP-29 RGLRRLGRKIAHGVKKYGPTVLRIIRIAG SEQ ID NO: 11
Indolicidin ILPWKWPWWPWRR SEQ ID NO: 12
P rotegrin RGGRLCYCRRRFCVCVGR SEQ ID NO: 13
Cecropin P1 SWLSKTAKKLENSAKKRISEGIAIAIQGGPR SEQ ID NO:7
Magainin GIGKFLHSAKKFGKAFVGEIMNS SEQ ID NO:9
Pleurocidin GWGSFFKKAAHVGKHVGKAALTHYL SEQ ID NO:6
Cecropin A (A.aegypti) GGLKKLGKKLEGAGKRVFNAAEKALPWAGAKALRK SEQ ID NO: 14
Cecropin A (D. melanogaster) GWLKKIGKKIERVGQHTRDATIQGLGIPQQAANVAATARG SEQ ID NO: 15
Buforin II TRSSRAGLQFPVGRVHRLLRK SEQ ID NO:3
Sarcotoxin IA GWLKKIGKKIERVGQHTRDATIQGLGIAQQAANVAATAR SEQ ID NO: 16
Apidaecin ANRPVYIPPPRPPHPRL SEQ ID NO:28
Ascaphine 5 GIKDWIKGAAKKLIKTVASHIANQ SEQ ID NO:27
Nigrocine 2 GLLSKVLGVGKKVLCGVSGLVC SEQ ID NO:26
Pseud in 1 GLNTLKKVFQGLHEAIKLINNHVQ SEQ ID NO:29
Ranalexin FLGGLIVPAMICAVTKKC SEQ ID NO:30
Melittin GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ SEQ ID NO:31
Еще в одном аспекте заявленного изобретения слитая пептидная цепь представляет собой Sushi пептид, описанный в публикации Ding J.L., Li P., Но В. Cell. Mol. Life Sci. 2008 Apr; 65 (7-8): 1202-19. The Sushi peptides: structural characterization and mode of action against Gram-negative bacteria. Особенно
- 8 037202 предпочтительным является Sushi 1 пептид в соответствии с SEQ ID NO: 32.
Предпочтительные Sushi пептиды - это Sushi пептиды S1 и S3 и их производные; FASEB J. 2000
Sep; 14(12): 1801-13.
В еще одном аспекте заявленного изобретения слитая пептидная цепь представляет собой дефензин, предпочтительно Cathelicidine, Cecropin P1, Cecropin А или Magainin II.
В еще одном аспекте заявленного изобретения слитая пептидная цепь представляет собой гидрофобную пептидную группу. Apidaecine с аминокислотной последовательностью в соответствии с SEQ ID NO: 28, WLBU2-Variant с аминокислотной последовательностью в соответствии с SEQ ID NO: 33 и Walmagh1 с аминокислотной последовательностью в соответствии с SEQ ID NO: 35. Гидрофобный пептид с аминокислотной последовательностью Phe-Phe-Val-Ala-Pro (SEQ ID NO: 17) не является частью заявленного изобретения.
В еще одном аспекте заявленного изобретения пептидные цепи слитого белка в соответствии с заявленным изобретением содержат модификации и/или изменения аминокислотных последовательностей. Такие изменения и/или модификации могут содержать мутации, как, например, делеции, инсерции и добавления, субституции или сочетания вышеупомянутых и/или химические изменения аминокислотных остатков, например биотинилирование, ацетилирование, пегилирование, химические изменения амино-, SH- или карбоксигрупп.
Специфические примеры слитых белков в соответствии с заявленным изобретением приведены в нижеследующей таблице.
Таблица 3
Слитый белок Слитый белок Энзимная составляющая Пептидная цепь (N-конец, если не указано иначе)
Р1-Е6 SEQIDNO 36 KZ144 (SEQ ID NO:25) Ascaphine 5 (SEQIDNO:27)
Р2-Е6 SEQIDNO 37 KZ144 (SEQ ID NO:25) Apiadaecine (SEQIDNO28)
РЗ-Е6 SEQIDNO: 38 KZ144 (SEQ ID NO25) Nigrocine 2 (SEQ ID NO 26)
Р4-Е6 SEQIDNO: 39 KZ144 (SEQ ID NO:25) Pseudin 1 (SEQIDNO:29)
Р7-Е6 SEQIDNO: 40 KZ144 (SEQ ID NO:25) Ranalexin (SEQIDNO:30)
Р8-Е6 SEQIDNO 41 KZ144 (SEQ ID NO:25) WLBU2-Variant (SEQ ID NO: 33)
Р9-Е6 SEQ ID NO: 42 KZ144 (SEQ ID NO25) Sushi 1 (SEQ ID NO:32)
Р10-Е6 SEQIDNO 43 KZ144 (SEQ ID NO:25) Melittin (SEQIDNO31)
Р11-Е6 SEQ ID NO: 44 KZ144 LL-37
- 9 037202
(SEQIDNO25) (SEQ ID NO: 10)
Р12-Е6 SEQ Ю NO 45 KZ144 (SEQIDNO:25) Indolicidin (SEQ ID NO: 12)
Р13-Е6 SEQ ID NO: 46 KZ144 (SEQ ID NO 25) SMAP-29 (SEQ ID NO 11)
Р14-Е6 SEQ ID NO 47 KZ144 (SEQ ID NO :25) Protegrin (SEQ ID NO 13)
Р15-Е6 SEQ ID NO: 48 KZ144 (SEQIDNO:25) Cecropin Pl (SEQ ID NO:7)
Р16-Е6 SEQ ID NO: 49 KZ144 (SEQIDNO:25) Magainin (SEQ ID NO:9)
Р17-Е6 SEQ ID NO: 50 KZ144 (SEQ ID NO 25) Pleurocidin (SEQ ID NO :6)
P1S-E6 SEQ ID NO 51 KZ144 (SEQ ID NO:25) Cecropin A (A. aegypti) (SEQ ID NO: 14)
Р19-Е6 SEQ ID NO: 52 KZ144 (SEQ ID NO:25) Cecropin A (A. melanogaster) (SEQ ID NO: 15)
Р20-Е6 SEQ ID NO: 53 KZ144 (SEQ ID NO:25) Buforin II (SEQ Ш NO S)
Р21-Е6 SEQ ID NO: 54 KZ144 (SEQ ID NO:25) Sarcotoxin IA (SEQ ID NO: 16)
Р1-ЕЗ SEQ ID NO: 55 STM0016 (SEQ ID NO 22) Ascaphine 5 (SEQ ID NO:27)
SEQ ID NO: 56 STM0016 (SEQIDNO:22) Nigrocine 2 (SEQ ID NO:26)
SEQ ID NO: 57 STM00I6 (SEQIDNO:22) SMAP-29 (SEQ ID NO 11)
SEQ ID NO: 58 STM0016 (SEQ ID NO:22) Sarcotoxin IA (SEQ ID NO: 16)
Р10-Е4 SEQ ID NO: 59 N4-gp61 (SEQ ID NO:23) Melittin (SEQIDNO:31)
SEQ ID NO: 60 N4-gp61 (SEQIDNO:23) SMAP-29 (SEQ ID NO :11)
Р10-Е5 SEQ ID NO 61 N4-gp61 trunc (SEQ ID NO:24) Melittin (SEQ ID NO 31)
SEQ ID NO: 62 N4-gp61 trunc. (SEQ ID NO24) Cecropin Pl (SEQIDNO7)
SEQ ID NO 63 N4-gp61 trunc. (SEQ ID NO:24) SMAP-29 (SEQ ID NO: 11)
Слитый белок в соответствии с заявленным изобретением и, в особенности, наиболее предпочитаемые слитые белки в соответствии с последовательностями от SEQ ID NO: 36 до SEQ ID NO: 63 могут дополнительно содержать метионин на N-конце.
Слитый белок в соответствии с заявленным изобретением и, в особенности, наиболее предпочитаемые слитые белки в соответствии с SEQ ID NO: 36 до 63 могут дополнительно содержать таг (метку), например, с целью пурификации. Предпочтительным является His6-таг предпочтительно на С-конце и/или на N-конце слитого белка. Упомянутый таг можно связать со слитым белком при помощи дополнительных аминокислотных остатков, например, по причине клонирования. Предпочтительно упомянутый таг может быть связан со слитым белком при помощи как минимум 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 дополнительных аминокислотных остатков. В предпочтительном варианте практического воплощения заявленного изобретения слитый белок содержит His6-таг на С-конце, связанный со слитым белком при помощи дополнительных аминокислотных остатков лизина и глицина (Lys-Gly) или лейцина и глутами
- 10 037202 новой кислоты (Leu-Glu). В другом предпочтительном варианте практического воплощения заявленного изобретения слитый белок содержит His6-таг на N-конце, связанный со слитым белком при помощи дополнительных аминокислотных остатков лизина и глицина (Lys-Gly) или лейцина и глутаминовой кислоты (Leu-Glu). Еще в одном предпочтительном варианте практического воплощения заявленного изобретения слитый белок содержит Hisg-таг на N- и С-концах, связанный со слитым белком при помощи дополнительных аминокислотных остатков лизина и глицина (Lys-Gly) или лейцина и глутаминовой кислоты (Leu-Glu).
В более предпочтительном варианте практического воплощения заявленного изобретения слитый белок содержит His6-таг на С-конце, связанный со слитым белком при помощи дополнительных аминокислотных остатков лейцина и глутаминовой кислоты (Leu-Glu), а пептидная цепь слитого белка в соответствии с заявленным изобретением связана с N-концом энзима при помощи дополнительных аминокислотных остатков глицина и серина. В другом предпочтительном варианте практического воплощения заявленного изобретения слитый белок содержит His6-таг на С-конце, связанный со слитым белком при помощи дополнительных аминокислотных остатков лейцина и глутаминовой кислоты (Leu-Glu), а пептидная цепь слитого белка в соответствии с заявленным изобретением связана с N-концом энзима при помощи дополнительных аминокислотных остатков глицина и серина (Gly-Ser), причем слитый белок содержит на N-конце дополнительные аминокислотные остатки метионина (Met) или аланина, метионина и глицина (Ala-Met-Gly) или аланина, метионина, глицина и серина (Ala-Met-Gly-Ser). Предпочтительно применяют слитые белки в соответствии с SEQ ID NO: от 77 до 90.
Слитые белки получают построением путем связывания как минимум двух последовательностей нуклеиновой кислоты с использованием стандартных методов клонирования в соответствии с Sambrook et al. 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Такой белок можно получить, например, в системах экспрессии рекомбинантных ДНК. Подобные слитые белки в соответствии с заявленным изобретением можно получать путем слияния нуклеиновых кислот для эндолизина и соответствующей пептидной цепи.
Слитые белки в соответствии с заявленным изобретением можно слить или связать с другими дополнительными белками. Примером такого дополнительного белка является тиоредоксин.
Помимо вышеописанного заявленное изобретение относится к изолированной молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей слитый белок в соответствии с заявленным изобретением. Заявленное изобретение также относится к вектору, содержащему молекулу нуклеиновой кислоты в соответствии с заявленным изобретением. Упомянутый вектор может быть применим в конститутивной или индуцируемой экспрессии упомянутого слитого белка в соответствии с заявленным изобретением.
Описанные слитые белки могут быть получены из микроорганизма, как, например, генетически модифицированная приемлемая клетка-хозяин, которая экспрессирует упомянутые слитые белки. Упомянутая клетка-хозяин может представлять собой микроорганизм, как, например, бактерия или дрожжевая клетка, или клетка животного, например, млекопитающего, в частности человека. В одном из вариантов практического воплощения заявленного изобретения клетка-хозяин представляет собой клетку Pichia pastoris. Клетку-хозяина могут выбирать вследствие чисто биологических параметров, например, выход, растворимость, затраты и пр., но также и по медицинским параметрам, например непатогенные бактерии или дрожжи, клетки организма человека.
В другом из аспектов заявленного изобретения происходит генетическая трансформаци приемлемой клетки-хозяина с целью получения слитых белков, при которой клетку-хозяина генетически модифицируют путем введения в неё генетического материала, кодирующего упомянутые слитые белки, и последующих трансляции и экспрессии с использованием методов генной инженерии, известных специалистам в данной области.
Еще в одном из аспектов заявленное изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей слитый белок в соответствии с заявленным изобретением и/или хозяин, трансформированный с использованием молекулы нуклеиновой кислоты или вектора, содержащего нуклеотидную последовательность, кодирующую слитый белок в соответствии с заявленным изобретением.
В предпочтительном варианте практического воплощения заявленного изобретения композиция дополнительно содержит агенты, пермеабилизирующие внешнюю мембрану грамотрицательных бактерий, как, например, хелаты металлов, как-то ЭДТК, ТРИС, молочная кислота, лактоферрин, полимиксин, лимонная кислота и/или другие вещества, как описано в публикации Vaara (Agents that increase the permeability of the outer membrane. Vaara M. Microbiol. Rev. 1992 Sep; 56 (3):395-441). Предпочтительными также являются композиции, содержащие сочетания вышеупомянутых пермеабилизирующих агентов. Особенно предпочтительной является композиция, содержащая от примерно 10 мкМ до примерно 100 мМ ЭДТК, более предпочтительно от примерно 50 мкМ до примерно 10 мМ ЭДТК, более предпочтительно от примерно 0,5 до примерно 10 мМ ЭДТК, более предпочтительно от примерно 0,5 до примерно 2 мМ ЭДТК, более предпочтительно от примерно 0,5 до 1 мМ ЭДТК. Тем не менее, предпочтительными также являются композиции, содержащие от примерно 10 мкМ до примерно 0,5 мМ ЭДТК. Также предпочтительной является композиция, содержащая от примерно 0,5 до примерно 2 мМ ЭДТК, более предпочтительно от примерно 1 мМ ЭДТК и дополнительно от примерно 10 до примерно 100 мМ ТРИС.
Заявленное изобретение также относится к слитому белку в соответствии с заявленным изобретени
- 11 037202 ем и/или хозяину, трансформированному с использованием нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую слитый белок в соответствии с заявленным изобретением для применения в качестве медикаментозного препарата. В другом аспекте заявленное изобретение относится к применению слитого белка в соответствии с заявленным изобретением и/или хозяину, трансформированному с использованием вектора, содержащего молекулу нуклеиновой кислоты, включающую нуклеотидную последовательность, кодирующую модифицированный слитый белок в соответствии с заявленным изобретением для применения в производстве медикаментозного препарата для лечения и/или профилактики расстройств, заболеваний и прочих дисфункций, ассоциируемых с грамотрицательными бактериями. В частности, применение для лечения и/или профилактики расстройств, заболеваний и пр.дисфункций, которые могут быть вызваны грамотрицательными бактериями, бактериальными группами, семействами, родами или видами, содержащими штаммы, патогенные для человека или животных, а именно Enterobacteriaceae (Escherichia, в особенности Е. coli, Salmonella, Shigella, Citrobacter, Edwardsiella, Enterobacter, Hafnia, Klebsiella, в особенности K. pneumoniae, Morganella, Proteus, Providencia, Serratia, Yersinia), Pseudomonadaceae (Pseudomonas, в особенности Р. aeruginosa, Burkholderia, Stenotrophomonas, Shewanella, Sphingomonas, Comamonas), Neisseria, Moraxella, Vibrio, Aeromonas, Brucella, Francisella, Bordetella, Legionella, Bartonella, Coxiella, Haemophilus, Pasteurella, Mannheimia, Actinobacillus, Gardnerella, Spirochaetaceae (Treponema and Borrelia), Leptospiraceae, Campylobacter, Helicobacter, Spirillum, Streptobacillus, Bacteroidaceae (Bacteroides, Fusobacterium, Prevotella, Porphyromonas), Acinetobacter, в особенности A. baumanii.
Способ лечения заболеваний, расстройств или прочих дисфункций у пациентов предусматривает введение пациенту эффективной дозы слитого белка в соответствии с заявленным изобретением и/или эффективного количества хозяина, трансформированного с использованием нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую слитый белок в соответствии с заявленным изобретением или композицию в соответствии с заявленным изобретением. Пациентами могут быть человек или животные.
В частности, упомянутый способ лечения могут применять для лечения и/или профилактики инфекций кожи, мягких тканей, респираторной системы, легких, пищеварительного тракта, глаз, ушей, зубов, носоглотки, рта, костной системы, влагалища, осложнений в виде раневых поверхностей при бактериемии и/или эндокардите, вызываемых грамотрицательными бактериями, в частности вышеперечисленными грамотрицательными бактериями.
Дозировка и путь введения, используемые в способе лечения (или профилактики) в соответствии с заявленным изобретением, зависит от специфики заболевания/локализации инфекции. Путь введения, например, может быть пероральный, наружный, внутриносовой, парентеральный, внутривенный, ректальный или другие.
Для введения слитого белка в соответствии с заявленным изобретением и/или эффективного количества хозяина, трансформированного с использованием нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую слитый белок в соответствии с заявленным изобретением или композицию в соответствии с заявленным изобретением, в место локализации (или возможного распространения инфекции), применяют такую форму упаковки, которая защищает активные компоненты от воздействий внешних факторов, таких как протеазы, окисление, иммунный ответ и т.п., вплоть до достижения ими очага инфекции. Следовательно, лекарственная форма может представлять собой капсулу, драже, таблетку, порошок, суппозиторий, эмульсию, гель, лосьон, крем, мазь, инъекционный раствор, сироп, спрей, состав для ингаляций или любую другую приемлемую по медицинским показаниям упаковку. Предпочтительно фармацевтическая композиция может содержать подобранные носители, стабилизаторы, красители, буферы или другие подходящие реагенты. Например, для местного нанесения лекарственная форма может представлять собой лосьон, крем, гель, мазь или пластырь, для назофарингального применения - физраствор для интраназального нанесения при помощи спрея. Для перорального применения с целью лечения и/или профилактики очага инфекции, к примеру, во внутренних органах возникает необходимость в дополнительной защите слитого белка в соответствии с заявленным изобретением от агрессивного воздействия среды желудочно-кишечного тракта вплоть до проникновения в очаг инфекции. Таким образом, при пероральном введении в очаг инфекции во внутренних органах требуется использование бактерии как носителя, который преодолеет начальные стадии пищеварения в желудке и только после этого секрецируется на слитый белок в соответствии с заявленным изобретением.
В одном из узконаправленных воплощений заявленного изобретения использование слитого белка в соответствии с заявленным изобретением и/или хозяина, трансформированного с использованием вектора, содержащего молекулу нуклеиновой кислоты с нуклеотидной последовательностью, кодирующей слитый белок в соответствии с заявленным изобретением, для применения в производстве медикаментозного средства для лечения и/или профилактики дисфункции, заболевания или симптоматики, вызванных Pseudomonas, в особенности Pseudomonas aeruginosa в особенности, поражения внутренних органов, в частности у грудных младенцев, инфекционные менингиты, например геморрагический менингит, инфекции среднего уха, кожного покрова (Ecthyma gangraenosum), в частности ожоги, мочеполового тракта, риниты, бактериальные пневмонии, в частности, при которых пациент страдает от кистозного фибро
- 12 037202 за (муковисцидоза) или гематологических осложнений, например, при лейкемии, при развитии нейтропении в период проведения иммунодепрессивной терапии, септицемии, в особенности вследствие длительной внутривенной или мочевой катетеризации, полостных хирургических операций и тяжелых ожоговых поражений, эндокардита, в частности, при котором пациент находится на внутривенном катетерном введении лекарственных препаратов, или пациент с осложнениями после открытого хирургического вмешательства на сердце, при тяжелых инфекциях глаз, в частности, после использования зараженных офтальмологических растворов или тяжелых ожоговых поражений лица, остеохондроза, в частности вследствие тяжелых травм или колотых ран с входным отверстием сквозь грязную одежду.
В другом специализированном варианте практического воплощения заявленного изобретения, дисфункция, заболевание или симптоматика вызваны бактериями Burkholderia pseudomallei, в особенности болезнь Уитмора, хроническая пневмония, септицемия, в частности, при которой у пациента наблюдается травматическое поражение кожного покрова.
В другом узконаправленном практическом воплощении заявленного изобретения дисфункция, заболевание или симптоматика вызваны бактериями Salmonella thyphimurium и Salmonella enteritidis, в особенности острые гастроэнтериты и локальные гнойные процессы, в частности остеомиелит, эндокардит, холецистит и особенно менингит, вызванный бактериями Salmonella thyphimurium, при котором возраст пациента менее 2 лет.
В другом узконаправленном практическом воплощении заявленного изобретения дисфункция, заболевание или симптоматика вызваны бактериями Salmonella typhi, в частности тиф.
В другом узконаправленном практическом воплощении заявленного изобретения дисфункция, заболевание или симптоматика вызваны бактериями Salmonell paratyphi, в частности паратиф.
В другом узконаправленном практическом воплощении заявленного изобретения дисфункция, заболевание или симптоматика вызваны бактериями Acinetobacter baumannii, в частности бронхит, пневмония, раневые инфекции и септицемия, в особенности вследствие внутривенной катетеризации.
В другом узконаправленном практическом воплощении заявленного изобретения дисфункция, заболевание или симптоматика вызваны бактериями Escherichia coli, в особенности экстраинтестинальные инфекции, в частности аппендицит, гнойный холецистит, периотонит, гнойный менингит и инфекции мочеполового тракта, интраинтестинальные инфекции, вызванные бактериями Е. coli, в частности эпидемический энтерит, а также инфекционные заболевания, подобные дизентерии, септицемия, энтеротоксемия, мастит и дизентерия.
В другом узконаправленном практическом воплощении заявленного изобретения дисфункция, заболевание или симптоматика вызваны бактериями Klebsiella pneumoniae, в частности пневмония, бактериемия, менингит и инфекции мочеполового тракта.
Предпочтительно слитый белок в соответствии с заявленным изобретением используется как компонент терапии или профилактики в случае, если инфекция вызвана мультирезистентными бактериальными штаммами, в частности штаммами, устойчивыми к одному или более из следующей группы антибиотиков: стрептомицин, тетрациклин, цефалотин, гентамицин, цефатоксин, цефалоспорин, цефтазидим или имипенем. Кроме этого, слитый белок в соответствии с заявленным изобретением применяют как компонент терапии путем введения в сочетании с традиционными антибактериальными препаратами, такими как антибиотики, лантибиотики, бактериоцины или эндолизины и т.п.
Композиция в соответствии с заявленным изобретением может представлять собой косметическую композицию. Некоторые виды бактерий могут вызывать раздражение на открытых участках тела пациента, например на кожном покрове. Для предотвращения появления таких раздражений кожного покрова или вероятного патогенного влияния упомянутых бактериальных организмов представляется возможным применение специальных косметических составов, которые содержат достаточное количество слитого белка в соответствии с заявленным изобретением для разрушения уже размножившихся или потенциально опасных очагов инфекции, вызванных грамотрицательными бактериями.
В расширенном аспекте заявленное изобретение относится к применению слитого белка в соответствии с заявленным изобретением в качестве средства диагностики в здравоохранении, пищевой и природоохранной промышленности, в частности в качестве средства диагностики для диагностирования бактериальных инфекций, вызванных, в частности, грамотрицательными бактериями. Слитый белок в соответствии с заявленным изобретением можно применять в качестве инструмента направленного разрушения патогенных бактерий, в особенности грамотрицательных патогенных бактерий. Разрушению бактериальных стенок слитым белком в соответствии с заявленным изобретением можно способствовать путем добавления детергентов, как, например, Triton Х-100 или других добавок, которые ослабляют клеточную защиту бактерий, например полимиксин В. Специально направленное разрушение клеток небходимо как начальный этап последующего направленного уничтожения бактерий с использованием НКметодов, как, например, полимеразная цепная реакция (ПЦР), гибридизация нуклеиновой кислоты или амплификация, основанная на последовательности нуклеиновых кислот, иммунобиологических методов, например, IMS, иммунофлюоресценции или анализ ELISA, или методов, основанных на распознавании клеточного материала бактерий, как то энзим-анализы с использованием протеинов, чувствительных к определенным группам или видам бактерий (например, β-галактоидаза для энтеробактерий, коагулаза
- 13 037202 для коагулаз-позитивных штаммов).
Заявленное изобретение относится также к использованию слитого белка для устранения, уменьшения и/или профилактики заражения грамотрицательными бактериями пищевых продуктов, оборудования на пищеперерабатывающих предприятиях, различных поверхностей, контактирующих с пищевыми продуктами, как, например, полки и места хранения пищевых продуктов, а также в любой другой области, где присутствует вероятность заражения пищевых продуктов, медицинского инструментария или прочих поверхностей в клиниках и хирургических блоках патогенными, потенциально болезнетворными и пр. нежелательными бактериями.
В частности, слитые белки в соответствии с заявленным изобретением можно применять в профилактических целях в качестве обеззараживающего средства. Такое обеззараживающее средство можно использовать до или после хирургических вмешательств, или, например, во время гемодиализа. Кроме того, слитый белок в соответствии с заявленным изобретением можно применять как компонент терапии у недоношенных детей, пациентов с ослабленной иммунной реакцией или пациентов с протезными устройствами. Данную терапию можно проводить как профилактику, так и в острый период. В этом же контексте внутрибольничные инфекции, в особенности вызванные резистентными к антибиотикам штаммами, как, например, бактериями Pseudomonas aeruginosa (FQRP), Acinetobacter и энтеробактерии, как, например, E.coli, Salmonella, Shigella, Citrobacter, Edwardsiella, Enterobacter, Hafnia, Klebsiella, Morganella, Proteus, Providencia, Serratia и Yersinia можно лечить как профилактически, так и в стадии острого обострения с использованием слитого белка в соответствии с заявленным изобретением. В связи с этим, слитый белок в соответствии с заявленным изобретением можно использовать в качестве дезинфицирующего средства, а также в сочетании с другими ингредиентами в составе дезинфицирующего раствора, как, например, детергенты, поверхностно-активные вещества, растворители, антибиотики, лантибиотики или бактериоцины.
Применение слитого белка в соответствии с заявленным изобретением в качестве дезинфицирующего средства, например, в клиниках, стоматологических и ветеринарных кабинетах, кухне или ванной комнате сопровождается приготовлением состава в виде жидкости, порошка, геля или ингредиента дезинфицирующих салфеток или простыней. В данный состав можно дополнительно включить подходящий носитель, добавки, растворители и/или эксципиенты для различных способов применения, а также агенты, которые способствуют повышению антимикробной активности, такие как, например, ЭДТК или агенты, повышающие антимикробную активность слитых белков. Слитые белки можно использовать с традиционными дезинфицирующими агентами, такими, как, например, этиловые спирты, альдегиды, окислители, фенолы, четвертичные аммониевые соединения или УФ-излучение. Для дезинфекции, например, поверхностей, объектов и/или приборов, слитый белок можно наносить на указанные поверхности, объекты и/или приборы. Нанесение можно осуществлять при помощи мягкой ткани, смоченной в дезинфицирующем составе, нанесенном при помощи спрея или окунания. Слитые белки можно использовать в различных концентрациях, в зависимости от соответствующего способа нанесения и времени воздействия для достижения эффекта полного обеззараживания.
Другим аспектом заявленного изобретения является тот факт, что заявленное изобретение может служить универсальным алгоритмом, т.е. любая пептидная цепь, заявленная в описании, может быть слита с любым эндолизином, аутолизином или бактериоцином, также заявленными в описании. Таким образом, представляется возможным комбинировать соответствующую пептидную цепь, которая позволяет осуществить связывание слитого белка с соответствующими бактериями и эндолизином, аутолизином или бактериоцином, которые препятствуют росту соответствующих бактерий. Наконец, представляется возможным построение приемлемого слитого белка для любых бактерий, которые необходимо уничтожить.
Далее по тексту описания заявленного изобретения следует расширенное описание применимости заявленного изобретения; тем не менее, следует понимать, что подробное описание и конкретные примеры, при том, что таковые служат исключительно цели продемонстрировать примеры практического воплощения заявленного изобретения, не носят ограничительный характер, поскольку различные изменения и модификации, не выходящие за рамки цели и задач изобретения, понятны специалистам в данной области техники. Необходимо понимать, что как описание, так и примеры носят иллюстративный характер и не являются ограничительными касательно сути заявленного изобретения.
Если не указано иначе, в нижеследующих примерах использованы стандартные методики, принятые в молекулярной биологии, как, например, описано в издании Sambrock et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York.
Пример 1. Клонирование, экспрессия и очистка gp144 и gp188, модифицированных с использованием амфипатичного пептида.
В качестве доказательного примера продемонстрировали потенциал ЛПС-разрушающей активности амфипатичных пептидов при направлении gp144 и gp188 через внешнюю мембрану и последующую антибактериальную активность в отношении грамотрицательных бактерий. gp144 и gp188 представляют собой модульные эндолизины, полученные из Pseudomonas aeruginosa фагов ψΚΖ и EL с N-концевым пептидогликанным связыванием и С-концевым каталитическим доменом (Briers et al., 2007).
- 14 037202
Для удлинения 5' конца открытой рамки считывания, кодирующей gp144 или gp188 с генным фрагментом, кодирующим амфипатичный α4 спиральный Т4 лизосом (аа 143-155: Pro-Asn-Arg-Ala-Lys-ArgVal-Ile-Thr-Thr-Phe-Arg-Thr в соответствии с SEQ ID NO: 92), применили хвост PCR с удлиненным 5' праймером и стандартным 3' праймером. Продукт ПЦР клонировали в экспрессионном векторе рЕХР5СТ/ТОРО® (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA).
Экспрессию всех составляющих провели в клетках Е. coli BL21 (DE3) pLysS. Все белки подвергли очистке при помощи Ni2+ аффинной хроматографии с использованием С-концевого 6xHis-тага. Выход при различных очистках представлен в табл. 4. Показательно, что получение a4-KZ144 не оказало токсичного воздействия на хозяина, по сравнению с KZ144, приводя к значительно большему выходу.
Очищенные стоковые растворы показали степень очистки ~90%. Все производные gp144 показали образование мультимеров, которые могут быть превращены в мономеры путем аддиции β-меркаптоэтанола, что доказывает, что междисульфидные связи вызывают мультимеризацию.
Таблица 4
Выходы рекомбинантной очистки эндолизинов, модифицированных с использованием амфипатичного пептида*
Слитый белок Эндолизин gpl44 gpl88 a4 спиральный 179 мг 38 мг
Примечание*. Показан общий выход очищенного рекомбинантного белка на литр экспрессионной культуры клеток Е. coli. Данное значение определили спектрофотометрическим измерением концентрации белка и общего объема очищенного стокового раствора. Очистку производных gp188 провели при более жестких условиях (65 мМ имидазола) по сравнению с производными gp144 (50 мМ имидазола) с целью обеспечения высокой степени очистки.
Характеристика gp144 и gp188, модифицированных с использованием амфипатичного пептида.
.А. Энзиматическая (ферментативная) активность gp144 и gp188, модифицированных с использованием амфипатичного пептида.
Для оценки влияния модификации на энзиматическую активность gp144 или gp188 измерили специфическую активность вариантов при помощи хлороформ-пермеабилизированных клеток Pseudomonas aeruginosa и сравнили с соответствующим немодифицированным эндолизином. Измерили различные величины прироста всех модифицированных эндолизинов с целью определения (построения) соответствующей кривой насыщаемости. Угловой коэффициент линейной регрессии линейной области данной кривой служит мерой специфичной активности и экспрессирован относительно углового коэффициента немодифицированных gp144 или gp188 (табл. 5).
Таблица 5
Энзиматическая активность gp144 или gp188, модифицированных с использованием амфипатичного пептида*
Слитый белок Эндолизин gpl44 gpl88
α.4 спиральный 23% 146%
Примечание*. Определена специфичная энзиматическая активность различных вариантов и экспрессирована относительно специфичной активности соответствующего начального эндолизина (=100%) с одновременным тестированием. Буферные условия теста представляли собой оптимальные условия соответствующих эндолизинов (KH2PO4/K2HPO4 I = 120 мМ рН 6,2 и I = 80 мМ рН 7,3 для gp144 и gp188 соответственно).
.Б. Антибактериальная активность gp144 и gp188, модифицированных с использованием амфипатичного пептида.
Экспоненциальные клетки (~106/мл) P. aeruginosa PAO1 инкубировали при комнатной температуре с немодифицированными и модифицированными gp144/gp188. По истечении 1 ч клеточные суспензии разбавили и поместили в чашки Петри. Остаточные колонии пересчитали после ночного инкубирования (табл. 6). Немодифицированный gp144 gp188 не уменьшает число клеток в значительной степени по сравнению с отрицательным контролем. Данный факт наглядно демонстрирует эффективность внешней мембраны как защитного барьера. Слитые белки с амфипатичным а4-спиральным инактивирует экспоненциальные клетки с 50±11 и 34±11% для a4-KZ144 и a4-EL188 соответственно. При использовании стационарных клеток с 100-кратноувеличенной плотностью данные величины одинаковы (35±18 и
- 15 037202
32±17% соответственно). Несмотря на довольно высокую вариабельность между различными репликами, данные величины значительно отличаются от необработанных клеток (α = 0.05). В целом, модифицированные gp144 производные показывают тенденцию к более высокой антибактериальной активности, чем gp188 производные.
Таблица 6
Антибактериальная активность эндолизинов gp144 и gp188 и их производных*
Экспоненциально растущие клетки Эндолизины
gp!44 gpl88
Слитый % ЛОГ % лог
немодифицированный 0± 15 0.00 ± 0,06 10± 13 0,05 ± 0,06
«4 спиральный 50 ± 11 0,31 ±0,09 34 ± 11 0,19 ±0,07
Примечание* Экспоненциально растущие клетки P. aeruginosa PAO1 разбавили 100 х и инкубировали (конечная плотность ~106/мл) с 10 мкг недиализированного белка (конечная концентрация 100 мкг/мл, буфер 20 мМ NaH2PO4-NaOH рН 7.4; 0.5М NaCl; 0.5М имидазола) в течение 1 ч при комнатной температуре. Аликвоты разбавили поместили в чашки Петри. Антибактериальная активность выражена как относительная инактивация (%) (=100(Ni/No)x 100 м, N0 = число необработанных клеток и Ni = число обработанных клеток) и в логарифмических единицах (=log10N0/Ni). Все образцы реплицировали в шесть раз. Представлены средние/стандартные отклонения. Статистический анализ осуществили с использованием Т-теста.
Пример 2. Клонирование, экспрессия и очистка gp144 and gp188, модифицированных с использованием гидрофобного пептида.
В качестве доказательного примера продемонстрировали потенциал ЛПС-разрушающей активности гидрофобных пентапептидов при направлении gp144 и gp188 через внешнюю мембрану и последующую антибактериальную активность в отношении грамотрицательных бактерий. gp144 и gp188 представляют собой модульные эндолизины, полученные из Pseudomonas aeruginosa фагов ψΚΖ и EL с N-концевым пептидогликанным связыванием и С-концевым каталитическим доменом (Briers et al., 2007).
Для удлинения 5' конца открытой рамки считывания, кодирующей gp144 или gp188, генным фрагментом, кодирующим 5 гидрофобных остатков (Phe-Phe-Val-Ala-Pro), применили хвост ПЦР с удлиненным 5' праймером и стандартным 3' праймером. Продукт ПЦР клонировали в экспрессионном векторе рЕХР5СТ/ТОРО® (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA).
Экспрессию всех составляющих провели в клетках Е. coli BL21 (DE3) pLysS. Все белки подвергли очистке при помощи Ni2+ аффинной хроматографии с использованием С-концевого 6xHis-тага. Выход при различных очистках представлен в табл. 7.
Очищенные стоковые растворы показали степень очистки ~90%. Все производные gp144 показали образование мультимеров, которые могут быть превращены в мономеры путем аддиции β-меркаптоэтанола, что доказывает, что междисульфидные связи вызывают мультимеризацию.
Таблица 7
Выходы рекомбинантной очистки производных эндолизинов*
Слитый белок Эндолизин
gpl44 gpl88
Phe-Phe-Val-Ala-Pro 25 мг 85 мг
Примечание*. Показан общий выход очищенного рекомбинантного белка на литр экспрессионной культуры клеток Е. coli. Данное значение определили спектрофотометрическим измерением концентрации белка и общего объема очищенного стокового раствора. Очистку производных gp188 провели при более жестких условиях (65 мМ имидазола) по сравнению с производными gp144 (50 мМ имидазола) с целью обеспечения высокой степени очистки.
Характеристика gp144 и gp188, модифицированных с использованием гидрофобного пентапептида.
.А. Энзиматическая (ферментативная) активность gp144 и gp188, модифицированных с использованием гидрофобного пентапептида.
Для оценки влияния модификации на энзиматическую активность gp144 или gp188 измерили специфическую активность вариантов при помощи хлороформ-пермеабилизированных клеток Pseudomonas aeruginosa и сравнили с соответствующим немодифицированным эндолизином. Измерили различные величины прироста всех модифицированных эндолизинов с целью определения (построения) соответствующей кривой насыщаемости. Угловой коэффициент линейной регрессии линейной области данной
- 16 037202 кривой служит мерой специфичной активности и экспрессирован относительно углового коэффициента ^модифицированных gp144 или gp188 (табл. 8).
Таблица 8
Энзиматическая активность gp144 или gp188, модифицированных с использованием гидрофобного пептида*
Слитый белок Эндолизин
gp!44 gpl88
Г идрофобный пентапептид 150% 100%
Примечание*. Определена специфичная энзиматическая активность различных вариантов и экспрессирована относительно специфичной активности соответствующего начального эндолизина (=100%) с одновременным тестированием. Буферные условия теста представляли собой оптимальные условия соответствующих эндолизинов (KH2PO4/K2HPO4 I = 120 мМ рН 6,2 и I = 80 мМ рН 7,3 для gp144 и gp188 соответственно).
.Б. Антибактериальная активность gp144 и gp188, модифицированных с использованием гидрофобного пентапептида.
Экспоненциальные клетки (~106/мл) P. aeruginosa PAO1 инкубировали при комнатной температуре с немодифицированными и модифицированными gp144/gp188. По истечении 1 ч клеточные суспензии разбавили и поместили в чашки Петри. Остаточные колонии пересчитали после ночного инкубирования (табл. 9). Немодифицированный gp144 gp188 не уменьшает число клеток в значительной степени по сравнению с отрицательным контролем. Данный факт наглядно демонстрирует эффективность внешней мембраны как защитного барьера. Инкубация с использованием гидрофобных пентапептидных слитых белков вызывает значительное снижение (α= 0.05) числа бактериальных клеток (83±7 и 69±21% для модифицированных gp144 и gp188 соответственно). В целом, модифицированные gp144 производные показывают тенденцию к более высокой антибактериальной активности, чем gp188 производные.
Таблица 9
Антибактериальная активность эндолизинов gp144 и gp188 и их производных*
Экспоненциально растущие клетки Эндолизины
gpl44 gpl88
Слитый % log % log
немодифицированный 0± 15 0,00 ± 0,06 10 ± 13 0,05 ± 0,06
Гидрофобный пентапептид 83 ±7 0,9 ± 0,2 69 ±21 0,7 ±0,3
Примечание*. Экспоненциально растущие клетки P. aeruginosa PAO1 разбавили 100х и инкубировали (конечная плотность ~106/мл) с 10 мкг недиализированного белка (конечная концентрация 100 мкг/мл, буфер: 20 мМ NaH2PO4-NaOH рН 7.4; 0.5М NaCl; 0.5М имидазола) в течение 1 ч при комнатной температуре. Аликвоты разбавили поместили в чашки Петри. Антибактериальная активность выражена как относительная инактивация (%) (=100-(Ni/No)x 100 с N0 = число необработанных клеток и Ni = число обработанных клеток) и в логарифмических единицах (=log10N0/Ni). Все образцы реплицировали в шесть раз. Представлены средние/стандартные отклонения. Статистический анализ осуществили с использованием Т-теста.
Пример 3. Клонирование, экспрессия и очистка KZ144 и STM0016, модифицированных с использованием различных пептидных цепей на N-конце эндолизина.
KZ144 в соответствии с SEQ ID NO: 25 представляет собой модульный эндолизин, получаемый из Pseudomonas aeruginosa фага φΚΖ с N-концевым пептидогликанным связыванием и С-концевым каталитическим доменом (Briers et al., 2007). Эндолизин KZ144 кодируют молекулой нуклеиновой кислоты в соответствии с SEQ ID NO: 64. Молекулу нуклеиновой кислоты в соответствии с SEQ ID NO: 64 получили синтетическим путем с BamH I (5'-GGA ТСС-3') сайтом рестрикции на 5'-конце молекулы нуклеиновой кислоты и Xho I (5'-СТС GAG-3') сайтом рестрикции на 3'- конце молекулы нуклеиновой кислоты.
STM0016 является гипотетическим белком с гомологией в отношении Е. coli фага N4 эндолизина N4-gp61. Эндолизин STM0016 кодируют молекулой нуклеиновой кислоты в соответствии с SEQ ID NO: 65. Молекулу нуклеиновой кислоты в соответствии с SEQ ID NO: 65 получили синтетическим путем с BamH I (5'-GGA ТСС-3') сайтом рестрикции на 5'-конце молекулы нуклеиновой кислоты и Xho I (5'-CTC GAG-3') сайтом рестрикции на 3'- конце молекулы нуклеиновой кислоты.
N4-gp61 является Е. coli N4 фагом эндолизина. Эндолизин кодируют молекулой нуклеиновой кислоты в соответствии с SEQ ID NO: 91. Молекулу нуклеиновой кислоты в соответствии с SEQ ID NO: 91 получили синтетическим путем с BamH I (5'-GGA ТСС-3') сайтом рестрикции на 5'-конце молекулы нук- 17 037202 леиновой кислоты и Xho I (5'-CTC GAG-3') сайтом рестрикции на З'-конце молекулы нуклеиновой кислоты.
Представленные в табл. 10 пептидные цепи использовали для получения слитых белков с эндолизином KZ144 или STM0016.
Таблица 10
Пептидная цепь Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая пептидную цепь
Pseudin 1 (SEQ ID NO:29) SEQ ID NO: 66
Ranalexin (SEQ ID NO 30) SEQ ID NO 67
Sushi 1 (SEQ ID NO :32) SEQ ID NO 68
WLBU2-Vari ant (SEQIDNO:33) SEQIDNO:69
Melittin SEQTONO70
(SEQIDNO:31)
SMAP-29 (SEQ ID NO: 11) SEQIDNO:71
Pleurocidin (SEQ ID NO: 6) SEQ ID NO: 72
Cecropin A (A. aegypti) (SEQ ID NO: 14) SEQ ID NO 73
Cecropin A (A. melanogaster) (SEQ TO NO: 15) SEQ ID NO:74
Butorin II (SEQ ID NO:8) SEQ ID NO:75
Sarcotoxin IA (SEQ ID NO: 16) SEQ ID NO 76
Молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие соответствующие пептидные цепи, получили синтетическим путем с Nde I (5'-CAT ATG-3') сайтом рестрикции на 5'-конце молекулы нуклеиновой кислоты и BamH I (5'-GGA TCC-3') сайтом рестрикции на 3'- конце молекулы нуклеиновой кислоты за исключением молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей Sushi 1 пептид, который получили с Nco I сайтом рестрикции плюс два дополнительных нуклеотида (5'-ССА TGG GC-3') на 5'-конце молекулы нуклеиновой кислоты.
Слитые белки получают путем соединения как минимум двух последовательностей нуклеиновых кислот с использованием стандартных методов клонирования, описанных, например, в публикации Sambrook et al. 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Таким образом, молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие пептидные цепи, частично расщепили с соответствующими энзимами рестрикции Nde I и BamH I, и в случае молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей пептидную цепь Sushi 1, поглощение осуществили с энзимами рестрикции Nco I и BamH I. После этого расщепленные нуклеиновые кислоты, кодирующие пептидные цепи, лигандировали в рЕТ21Ь экспрессионном векторе (Novagen, Darmstadt, Germany), который также до этого подвергли расщеплению с соответствующими энзимами рестрикции Nde Iand BamH I. Расщепленную молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую пептидную цепь Sushi I, лигандировали в модифицированный рЕТ32Ь экспрессионный вектор (немодифицированный вектор производства компании Novagen, Darmstadt, Germany), который также до этого подвергли расщеплению с соответствующими энзимами рестрикции Nco I and BamH I. Модификация pET32b экспрессионного вектора относится к делеции последовательности, кодирующей S-таг и центральный His-таг.
После этого молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую эндолизин KZ144, частично расщепили с энзимом рестрикции BamH I и Xho I, таким образом, чтобы было возможно лигандировать эндолизин в рЕТ21Ь экспрессионном векторе (Novagen, Darmstadt, Germany) и в модифицированном рЕТ32Ь экспрессионном векторе, соответственно, который также до этого подвергли расщеплению с соответствующими энзимами рестрикции BamH I and Xho I. Молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую эндолизин STM0016, и молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую эндолизин N4gp61, подвергли частичному расщеплению с энзимом рестрикции BamH I and Xho I, таким образом, чтобы было возможно лигандировать эндолизин в рЕТ21Ь экспрессионном векторе (Novagen, Darmstadt, Germany).
- 18 037202
Таким образом, молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую пептидную цепь, лигандировали в соответствующем векторе на 5-конце молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей эндолизин KZ144 или STM0016. Помимо этого, молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующей эндолизин KZ144 или STM0016, лигандировали в соответствующей плазмиде, таким образом, чтобы молекула, кодирующая His-таг, состоящий из шести гистидиновых остатков, ассоциировалась на 3'-конце молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей эндолизин.
Поскольку некоторые слитые белки могут либо проявлять токсичность после экспрессии в бактериальных клетках, либо терять гомогенность вследствие деградации белка, стратегическим выходом из сложившейся дилеммы была бы экспрессия данных слитых белков, в слиянии или соединении в другими белками. Примером такого прочего дополнительного белка является тиоредоксин, который показал способность опосредовать экспрессию токсичных антимикробных пептидов в клетках E.coli (TrxA mediating fusion expression of antimicrobial peptide CM4 from multiple joined genes in Escherichia coli. Zhou L., Zhao Z., Li B., Cai Y., Zhang S. Protein Expr Purif. 2009 Apr; 64(2):225-230). В случае слитого белка, состоящего из N-концевого Sushi 1 пептида и эндолизина KZ144, Sushi 1 пептид лигандируют в модифицированном рЕТ32Ь экспрессионном векторе, таким образом, чтобы дополнительный тиоредоксин ассоциировался на 5'-конце Sushi 1 пептида. Тиоредоксин можно удалить из экспрессированного слитого белка путем использования энтерокиназы, причем сайт рестрикции энтерокиназы вводят между молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей Sushi пептид, и молекулой, кодирующей тиоредоксин.
Последовательность слияний эндолизин-пептид контролировали при помощи секвенирования ДНК, а корректные клоны трансформировали в E.coli BL21(DE3) (Novagen, Darmstadt, Germany) для экспрессии белка.
Рекомбинантную экспрессию слитого белка в соответствии с SEQ ID NO: 77 до 90 осуществили в клетках Е. coli BL21 (DE3) pLysS и Е. coli BL21 (DE3) (Novagen, Darmstadt, Germany). Клетки росли до достижения уровня значения оптической плотности OD600 0,5-0,8 мкм. Затем индуцировали экспрессию слитого белка с 1 мМ IPTG (изопропилтиогалактозидом) и осуществили экспрессию при 37°С в течение 4 ч.
Клетки E.coli BL21 собрали центрифугированием в течение 20 мин при 6000 г и дезинтегрировали путем разрушения ультразвуком на льду. Суммарный экстракт растворимой и нерастворимой фракций клеток E.coli сепарировали центрифугированием (Sorvall, SS34, 30 мин, 15000 об/мин). Все белки очистили при помощи Ni2+ аффинной хроматографии (Akta FPLC, GE Healthcare) с использованием Сконцевого 6xHis-тага, кодируемого векторами рЕТ21Ь и pET32b.
Как описано выше, некоторые слитые белки экспрессировали с использованием модифицированного рЕТ32Ь вектора (S-таг и центральный His-таг удалили), который соединяет слиянием тиоредоксин на N-конце необходимых белков. Вектор также содержит сайт расщепления энтерокиназы, как раз непосредственно перед необходимым белком. Данный сайт позволяет осуществить протеолитическое расщепление между тиоредоксином и необходимым белком, который может быть очищен через оставшийся Сконцевой His-таг. Для повышения антимикробной активности слитого белка Sushi 1-KZ144 может возникнуть необходимость удаления тиоредоксина путем электролитического расщепления. В связи с этим, слитый белок расщепили с использованием 2-4 юнитов/мг рекомбинантной энтерокиназы (Novagen, Darmstadt, Germany) для удаления тиоредоксина в соответствии с протоколом производителя. После энтекрокиназного расщепления слитый белок очистили при помощи His-таг очистки, как описано далее по тексту.
Ni2+ аффинную хроматографию осуществили в 4 последовательных этапа, все при комнатной температуре.
1. Эквилибрация Histrap HP 5 мл колонки (GE Healthcare) с 10 об. колонки отмывочного буфера (20 мМ имидазола, 1 М NaCl и 20 мМ Hepes (N-2-гидроксиэтилпиперазин-N-2-этансульфоновой кислоты) при рН 7,4) при скорости потока 3-5 мл/мин.
2. Загрузка всего лизата (с требуемым объемом слитого белка) в Histrap HP 5 мл колонки при скорости потока 3-5 мл/мин.
3. Отмывка колонки с 10 об. колонки отмывочного буфера для удаления несвязанного образца с последующей повторной отмывкой с 10% элюирующего буфера (500 мМ имидазола, 0,5 М NaCl и 20 мМ Hepes при рН 7.4) при скорости потока 3-5 мл/мин.
4. Элюирование связанных слитых белков из колонки с линейным градиентом 4 об. колонки элюирующего буфера (500 мМ имидазола, 0,5 мМ NaCl и 20 мМ Hepes при рН 7,4) до 100% при скорости потока 3-5 мл/мин.
Очищенные стоковые растворы слитых белков в элюирующем буфере (20 мМ Hepes рН 7,4; 0,5 М NaCl; 500 мМ имидазола) показали как минимум 90% степень чистоты в соответствии с визуальным контролем на SDS-PAGE гелях (данные не приведены).
Пример 4. Антимикробная активность эндолизина KZ144, модифицированного с использованием различных пептидных цепей на N-конце.
Слитый белок, содержащий KZ144 и пептидную цепь α4 спираль, построили в соответствии с опи- 19 037202 санием в примере 1. Другие слитые белки, содержащие KZ144 и соответствующие пептидные цепи, построили в соответствии с описанием в примере 3.
Клетки Е. coli DSMZ 11753, Acinetobacter baumannii DSMZ 30007 и Pseudomonas aeruginosa PAO1p (Burn wound isolate, Queen Astrid Hospital, Brussels; Pirnay J.P. et al. (2003), J. Clin. Microbiol., 41(3): 11921202) использовали в качестве тест-штаммов. Инкубированные в течение ночного времени суток культуры разбавили в 10 раз в свежей среде Лурия-Бертани и вырастили до OD600=0.6. Культуру осадили центрифугированием и разбавили в 10 раз в буфере разбавления (10 мМ HEPES, 0,5 мМ ЭДТК; рН 7.4). Бактерии инкубировали при комнатной температуре с 10 мкг недиализированного слитого белка при конечной концентрации 100 мкг/мл в буфере (20 мМ NaH2PO4-NaOH рН 7,4; 0,5 М NaCl; 0,5 М имидазола). По истечении 1 ч в ФСБ построили серии разведения клеток и высеяли на среду Лурия-Бертани. Дополнительно отрицательный контроль высеяли с использованием буфера (20 мМ NaH2PO4-NaOH рН 7,4; 0,5 М NaCl; 0,5 М имидазола). Остаточные колонии пересчитали после ночной инкубации при 37°С. На основе чисел клеток рассчитали антибактериальную активность в логарифмических юнитах (=log10N0/Ni с N0 = число необработанных клеток и Ni = число обработанных клеток) (табл. 11). Все образцы реплицировали как минимум в 4 раза.
Антимикробная активность данных слитых белков представлена в следующей таблице.
Таблица 11 Антимикробная активность KZ144, модифицированного с использованием различных пептидных цепей, в отношении грамотрицательных бактерий
Слитый белок Энзимная составляющая Пептидная цепь (N-концевая, если не указано иначе) Активность в отношении Pseudomonas aeruginosa Активность в отношении Е. coli DSMZ 11753 Активность в отношении Acinetobacter baumamtii DSMZ 30007
SEQID KZ144 Pseudin 1 + не опр не опр
NO: 77 (SEQID NO:25) (SEQID NO :29)
SEQID NO: 78 KZ144 (SEQID NO25) Ranalexin (SEQID NO:30) + не опр. не опр.
SEQID NO: 79 KZ144 (SEQID NO:25) Sushi 1 (SEQID NO:32) + не опр. ++
SEQID NO: 80 KZ144 (SEQID NO25) WLBU2Variant (SEQID NO:33) не опр. + не опр..
SEQID NO: 81 KZ144 (SEQID NO25) Melittin (SEQID NO:31) + не опр. не опр.
SEQID NO: 82 KZ144 (SEQID NO:25) SMAP-29 (SEQID NO:11) +++ +++ не опр
SEQID NO: 83 KZ144 (SEQID NO:25) Cecropin A (A aegypti) (SEQID NO: 14) ++ + ++
SEQID NO: 84 KZ144 (SEQID NO:25) Pleurocidin (SEQ ID NO: 0 + не опр. не опр.
SEQID NO: 85 KZ144 (SEQID NO25) Cecropin A (A. melanogaster) (SEQID NO: 15) + не опр. не опр.
SEQID NO: 86 KZ144 (SEQID NO:25) Bufori η II (SEQIDNO:8) + не опр. не опр.
SEQID NO: 87 KZ144 (SEQID NO25) Sarcotoxin IA (SEQID NO: 16) ++ ++ ++
SEQID NO: 93 KZ144 (SEQID NO25) a4 helix (SEQID NO:92) ± не опр. не опр.
Сокращения: ± <1 лог; +: 1 лог; ++: 2-3 лог; +++: 4 или более лог; не опр. обозначает, что данный штамм не был тестирован с соответствующим слитым белком.
- 20 037202
Пример5. Антимикробная активность эндолизина STM0016, модифицированного с использованием различных пептидных цепей на N-конце.
Слитые белки, состоящие из STM0016, и пептидную цепь Sarcotoxin IA или SMAP-29 построили в соответствии с описанием в примере 3.
Клетки Е. coli DSMZ 11753, Salmonella typhimujrium DSMZ 17058 and Pseudomonas aeruginosa PAO1p (Burn wound isolate, Queen Astrid Hospital, Brussels; Pirnay J.P. et al. (2003), J. Clin. Microbiol., 41(3): 1192-1202) использовали в качестве тест-штаммов. Исследовали в соответствии с описанием в примере 4 антимикробную активность слитых белков, состоящих из эндолизина STM0016 и пептида Sarcotoxin IA или SMAP-29. Антимикробная активность данных слитых белков представлена в следующей таблице.
Таблица 12
Слитый белок Энзимная составляющая Пептидная цепь (N-концевая, если не указано иначе) Активность в отношении Pseudomonas aeruginosa Активность в отношении Е. coli DSMZ 11753 Активность в отношении Salmonella typhimurium DSMZ 17058
SEQ ГО NO: 88 STM0016 (SEQIDNO: 22) Sarcotoxin ΙΑ (SEQ ГО NO: 16) + не опр. +
SEQ ГО NO: 89 STM0016 (SEQIDNO 22) SMAP-29 (SEQ ID NO: 11) + + +
Сокращения: +: 1 лог; не опр. обозначает, что данный штамм не был тестирован с соответствующим слитым белком.
Пример 6. Антимикробная активность эндолизина N4gp61, модифицированного с использованием пептидной цепи на N-конце.
Слитый белок, содержащий N4gp61, и пептидную цепь SMAP-29 спираль построили в соответствии с описанием в примере 3.
Клетки Е. coli DSMZ 11753, Salmonella typhimujrium DSMZ 17058 и Pseudomonas aeruginosa PAO1p (Burn wound isolate, Queen Astrid Hospital, Brussels; Pirnay J.P. et al. (2003), J. Clin. Microbiol, 41(3): 11921202) использовали в качестве тест-штаммов. Исследовали в соответствии с описанием в примере 4 антимикробную активность слитого белка, состоящего из эндолизина N4gp61 и пептида SMAP-29. Антимикробная активность данного слитого белка представлена в следующей таблице.
Таблица 13
Слитый белок Энзимная составляющая Пептидная цепь (N-концевая, если не указано иначе) Активность в отношении Pseudomonas aeruginosa Активность в отношении Е. coli DSMZ 11753 Активность в отношении Salmonella typhimurium DSMZ 17058
SEQ ГО NO: 90 N4-gp61 (SEQ ID NO 23) SMAP-29 (SEQ ГО NO И) + + +
Сокращения: +: 1 лог; не опр. обозначает, что данный штамм не был тестирован с соответствующим слитым белком.
Пример 7. Антимикробная активность эндолизина gp188, модифицированного с использованием пептидной цепи на N-конце.
Слитые белки, содержащие эндолизин gp188, и пептидные цепи α4 спирали, SMAP-29 или Sarcotoxin IA построили в соответствии с описанием в примере 1. Клетки Е. coli DSMZ 11753, Acinetobacter baumannii DSMZ 30007 и Pseudomonas aeruginosa PAO1p (Burn wound isolate, Queen Astrid Hospital, Brussels; Pirnay J.P. et al. (2003), J. Clin. Microbiol., 41(3): 1192-1202) использовали в качестве тест-штаммов. Исследовали в соответствии с описанием в примере 4 антимикробную активность слитого белка, состоящего из эндолизина gp188 и соответствующих пептидных цепей. Антимикробная активность данных слитых белков представлена в следующей таблице.
- 21 037202
Таблица 14
Слитый белок Энзимная составляющая Пептидная цепь (N-концевая, если не указано иначе) Активность в отношении Pseudomonas aeruginosa Активность в отношении Е, сой DSMZ 11753 Активность в отношении Acinetobacter baumannii
DSMZ 30007
SEQIDNO 94 gpl88 (SEQ ПЭ NO :2) а4 helix (SEQ Ш NO: 92) ± nd nd.
SEQ ID NO: 95 gpl88 (SEQIDNO:2) SMAP-29 (SEQIDNO: Π) ++ ++ ++
SEQ ПЭ NO: 96 gpl88 (SEQ Π9ΝΟ:2) Sarcotoxin ΙΑ (SEQIDNO: 16) + + +
Сокращения: ± <1 лог; +: 1 лог; ++: 2-3 лог; не опр. обозначает, что данный штамм не был тестирован с соответствующим слитым белком.
Пример 8. Антимикробная активность эндолизина Salmonella, модифицированного с использованием пептидной цепи SMAP-29 на N-конце.
Слитые белки, содержащие эндолизин Salmonella с аминокислотной последовательностью, в соответствии с SEQ ID NO: 3 и пептидной цепью SMAP-29 построили в соответствии с описанием в примере 3. Клетки Е. coli DSMZ 11753 и Salmonella typhimurium DSMZ 17058 использовали в качестве тестштаммов. Исследовали в соответствии с описанием в примере 4 антимикробную активность слитого белка. Антимикробная активность данного слитого белка представлена в следующей таблице.
Таблица 15
Слитый белок Энзимная составляющая Пептидная цепь (N-концевая, если не указано иначе) Активность в отношении Е. coli DSMZ 11753 Активность в отношении Salmonella typhimurium DSMZ 17058
SEQ ID NO: 97 Salmonella endolysin (SEQTDNO3) SMAP-29 (SEQIDNO: 11) + +
Сокращения: +: 1 лог.
Пример 9. Антимикробная активность эндолизина Acinetobacter baumannii, модифированного с различными пептидными цепями на N-конце.
Слитые белки, содержащие эндолизин Acinetobacter baumannii с аминокислотной последовательностью, в соответствии с SEQ ID NO: 5 и пептидными цепями SMAP-29, Pseudin 1 и Sushi 1 построили в соответствии с описанием в примере 3. Клетки Acinetobacter baumannii DSMZ 30007 и Pseudomonas aeruginosa PAO1p (Burn wound isolate, Queen Astrid Hospital, Brussels; Pirnay J.P. et al. (2003), J. Clin. Microbiol., 41(3): 1192-1202) использовали в качестве тест-штаммов. Исследовали в соответствии с описанием в примере 4 антимикробную активность слитых белков. Антимикробная активность данных слитых белков представлена в следующей табл. 16.
- 22 037202
Таблица 16
Слитый белок Энзимная составляющая Пептидная цепь (N-концевая, если не указано иначе) Активность в отношении Pseudomonas aeruginosa Активность в отношении Acinetobacter baumannii DSMZ 30007
SEQ ID NO: 98 Acinetobacter baumanrtii эндолизин (SEQ ID NO:5) Pseudin 1 (SEQ ID NO 29) ± не опр.
SEQ ID NO: 99 Acinetobacter baumannii ЭНДОЛИЗИН (SEQ ID NO:5) SMAP-29 (SEQ ID NO: H)
SEQ ID NO: 100 Acinetobacter baumanrtii ЭНДОЛИЗИН (SEQ ID NO:5) Sushi 1 (SEQ ID NO 32) + +
Сокращения: ± <1 лог; +: 1 лог; ++: 2-3 лог; не опр. обозначает, что данный штамм не был тестирован с соответствующим слитым белком.
Слитые белки в табл. 11-16 без тагов (меток) и линкеров также были протестированы в соответствии с вышеописанными опытами по определению активности. Все они показали антимикробную активность в отношении используемых бактериальных штаммов (данные не приведены).
Список последовательностей <110> КАТХОЛИКЕ УНИВЕРСИТЕЙТ ЛЕВЕН
ЛИСАНДО ХОЛДИНГ АГ <120> Слитые белки для лечения инфекций, вызванных грамотрицательными бактериями <130> LYS-002 РСТ <140> неизвестно <141> 2010-06-28 <150> 09 163 953.4 <151> 2009-06-26 <160> 100 <170> версия для патентования 3.3 <210> 1 <211> 260 <212> PRT <213> неизвестно <220>
<223> phiK2gpl44 <400> 1
Met Lys Val Leu Arg Lys Gly Asp Arg Gly Asp Glu Val Cys Gin Leu
1015
Gin Thr Leu Leu Asn Leu Cys Gly Tyr Asp Val Gly Lys Pro Asp Gly
2530 lie Phe Gly Asn Asn Thr Phe Asn Gin Val Val Lys Phe Gin Lys Asp 35 4045
Asn Cys Leu Asp Ser Asp Gly lie Val Gly Lys Asn Thr Trp Ala Glu 50 5560
Leu Phe Ser Lys Tyr Ser Pro Pro lie Pro Tyr Lys Thr lie Pro Met 65 70 7580
Pro Thr Ala Asn Lys Ser Arg Ala Ala Ala Thr Pro Val Met Asn Ala 85 9095
Val Glu Asn Ala Thr Gly Val Arg Ser Gin Leu Leu Leu Thr Phe Ala
100 105110
- 23 037202
Ser lie Glu Ser Ala Phe Asp Tyr Glu lie Lys Ala Lys Thr Ser Ser
115 120125
Ala Thr Gly Trp Phe Gin Phe Leu Thr Gly Thr Trp Lys Thr Met lie
130 135140
Glu Asn Tyr Gly Met Lys Tyr Gly Val Leu Thr Asp Pro Thr Gly Ala
145 150 155160
Leu Arg Lys Asp Pro Arg lie Ser Ala Leu Met Gly Ala Glu Leu lie
165 170175
Lys Glu Asn Met Asn lie Leu Arg Pro Val Leu Lys Arg Glu Pro Thr
180 185190
Asp Thr Asp Leu Tyr Leu Ala His Phe Phe Gly Pro Gly Ala Ala Arg
195 200205
Arg Phe Leu Thr Thr Gly Gin Asn Glu Leu Ala Ala Thr His Phe Pro
210 215220
Lys Glu Ala Gin Ala Asn Pro Ser lie Phe Tyr Asn Lys Asp Gly Ser
225 230 235240
Pro Lys Thr lie Gin Glu Val Tyr Asn Leu Met Asp Gly Lys Val Ala
245 250255
Ala His Arg Lys
260 <210> 2 <211> 292 <212> PRT <213> неизвестно <220>
<223> ELgpl88 <400> 2
Met Asn Phe Arg Thr Lys Asn Gly Tyr Arg Asp Leu Gin Ala Leu Val 15 10 15
Lys Glu Leu Gly Leu Tyr Thr Gly Gin lie Asp Gly Val Trp Gly Lys
Gly Thr Ser Ser Ser Thr Glu Thr 3540
Val Gly Lys Asn Thr Gly Gly lie 5055 :530
Leu Leu Arg Gly Tyr Ala Glu Val
Gly Leu Pro Thr Thr Ser Asp Ala 60
Ser Gly Tyr Asn Val He Thr Ala
70
Leu Gin Arg Asn Leu Ala Phe Leu
80
Gly Leu Tyr Ser Leu Thr Val Asp
Gly lie Trp Gly Asn Gly Thr Leu
95
Ser Gly Leu Asp Lys Ala Phe Glu
100
Val Tyr Lys Glu Arg Tyr Arg Thr
105 110
Pro Thr Tyr Asp He Ala Trp Ser
115 120
Gly Lys Val Ser Pro Ala Phe Thr
125
Ala Lys Val Lys Asp Trp Cys Gly
130 135
Val His Val Pro Asn His Arg Ala
140
Pro His Trp Leu Met Ala Cys Met
145 150
Ala Phe Glu Thr Gly Gin Thr Phe
155 160
Ser Pro Ser lie Lys Asn Ala Ala
165
Gly Ser Glu Ala Tyr Gly Leu lie
170 175
Gin Phe Met Ser Pro Ala Ala Asn
180
Asp Leu Asn Val Pro Leu Ser Val
185 190 lie Arg Ser Met Asp Gin Leu Thr
195 200
Gin Leu Asp Leu Val Phe Lys Tyr
205
Phe Glu Met Trp Met Lys Arg Gly
210 215
Lys Arg Tyr Thr Gin Leu Glu Asp
220
Phe Tyr Leu Thr lie Phe His Pro
225 230
Ala Ser Val Gly Lys Lys Ala Asp
235 240
Glu Val Leu Phe Leu Gin Gly Ser
245
Lys Ala Tyr Leu Gin Asn Lys Gly
250 255
- 24 037202
Phe Asp Val Asp 260 Lys Asp Gly Lys lie 265 Thr Leu Gly Glu lie 270 Ser Ser
Thr Leu Tyr Thr Thr Tyr Tyr 275 Val lie Ser Tyr 290 <210> 3 <211> 181 <212> PRT <213> неизвестно <220> <223> Salmonella эндолизин <400> 3 Lys 280 Gly Leu Leu Pro Glu 285 Asn Arg His
Met 1 Lys Pro Lys Asp 5 Glu lie Phe Asp Glu 10 lie Leu Gly Lys Glu 15 Gly
Gly Tyr Val Asn 20 His Pro Asp Asp Lys 25 Gly Gly Pro Thr Lys 30 Trp Gly
lie Thr Glu 35 Lys Val Ala Arg Ala 40 His Gly Tyr Arg Gly 45 Asp Met Arg
Asn Leu 50 Thr Arg Gly Gln Ala 55 Leu Glu lie Leu Glu 60 Thr Asp Tyr Trp
Tyr 65 Gly Pro Arg Phe Asp 70 Arg Val Ala Lys Ala 75 Ser Pro Asp Val Ala 80
Ala Glu Leu Cys Asp 85 Thr Gly Val Asn Met 90 Gly Pro Ser Val Ala 95 Ala
Lys Met Leu Gln 100 Arg Trp Leu Asn Val 105 Phe Asn Gln Gly Gly 110 Arg Leu
Tyr Pro Asp 115 Met Asp Thr Asp Gly 120 Arg lie Gly Pro Arg 125 Thr Leu Asn
Ala Leu 130 Arg Val Tyr Leu Glu 135 Lys Arg Gly Lys Asp 140 Gly Glu Arg Val
Leu 145 Leu Val Ala Leu Asn 150 Cys Thr Gln Gly Glu 155 Arg Tyr Leu Glu Leu 160
Ala Glu Glu Arg <210> <211> <212> <213> <220> <223> <400> Lys Arg Glu Ala Asp Glu Ser Phe 165 170 Val Leu lie 180 4 163 PRT неизвестно Enterobacteria фаг T4 эндолизин 4 Val Tyr Gly Trp Met 175 Lys
Met 1 Asn lie Phe Glu 5 Met Leu Arg lie Asp 10 Glu Gly Leu Arg Leu 15 Lys
lie Tyr Lys Asp 20 Thr Glu Gly Tyr Tyr 25 Thr lie Gly lie Gly 30 His Leu
Leu Thr Lys 35 Ser Pro Ser Leu Asn 40 Ala Ala Lys Ser Glu 45 Leu Asp Lys
Ala lie 50 Gly Arg Asn Cys Asn 55 Gly Val lie Thr Lys 60 Asp Glu Ala Glu
Lys 65 Leu Phe Asn Gln Asp 70 Val Asp Ala Ala Val 75 Arg Gly lie Leu Arg 80
Asn Ala Lys Leu Lys 85 Pro Val Tyr Asp Ser 90 Leu Asp Ala Val Arg 95 Arg
Cys Ala Leu lie 100 Asn Met Val Phe Gln 105 Met Gly Glu Thr Gly 110 Val Ala
Gly Phe Thr 115 Asn Ser Leu Arg Met 120 Leu Gln Gln Lys Arg 125 Trp Asp Glu
Ala Ala 130 Val Asn Leu Ala Lys 135 Ser Arg Trp Tyr Asn 140 Gln Thr Pro Asn
Arg Ala Lys Arg Vai lie Thr Thr Phe Arg Thr Gly Thr Trp Asp Ala
145 150 155 160
Tyr Lys Asn <210> 5 <211> 280 <212> PRT <213> неизвестно <220>
<223> Acinetobacter baumanii эндолизин <400> 5
Met 1 Glu Tyr Asp Met 5 lie Leu Lys Phe Gly 10 Ser Lys Gly Asp Ala 15 Vai
Ala Thr Leu Gin 20 Lys Gin Leu Ala Lys 25 Met Gly Tyr Lys Gly 30 Vai Lys
Asp Lys Pro 35 Leu Ser Vai Asp Gly 40 His Phe Gly Glu Ser 45 Thr Glu Phe
Ala Vai 50 lie Gin Leu Gin Arg 55 Lys Phe Gly Leu Vai 60 Ala Asp Gly Lys
Vai 65 Gly Asp Lys Thr Arg 70 Gin Ala Leu Ala Gly 75 Asp Ser Vai Ser Lys 80
Phe Leu Lys Asp Glu 85 Asp Tyr Lys Lys Ala 90 Ala He Arg Leu Lys 95 Vai
Pro Glu Leu Vai 100 He Arg Vai Phe Gly 105 Ala Vai Glu Gly Leu 110 Gly Vai
Gly Phe Leu 115 Pro Asn Gly Lys Ala 120 Lys He Leu Phe Glu 125 Arg His Arg
Met Tyr 130 Phe Tyr Leu Cys Gin 135 Ala Leu Gly Lys Thr 140 Phe Ala Asn Ser
Gin 145 Vai Lys He Thr Pro 150 Asn He Vai Asn Thr 155 Leu Thr Gly Gly Tyr 160
Lys Gly Asp Ala Ala Glu Tyr Thr Arg Leu Ser Met Ala lie Asn He
165 170 175
His Lys Glu Ser Ala Leu Met Ser 180 Thr Ser 185 Trp Gly Gin Phe Gin He 190
Met Gly Glu Asn Trp Lys Asp Leu 195 200 Gly Tyr Ser Ser Vai Gin Glu Phe 205
Vai Asp 210 Gin Gin Gin Leu Asn Glu 215 Gly Asn Gin Leu Glu Ala Phe He 220
Arg Phe 225 He Glu Trp Lys Pro Gly 230 Leu Leu Glu Ala Leu Arg Lys Gin 235 240
Asp Trp Asp Thr Vai Phe Thr Leu 245 Tyr Asn 250 Gly Lys Asn Tyr Lys Lys 255
Leu Gly Tyr Gin Ala Lys Phe Gin 260 Lys Glu 265 Trp Asp His Leu Glu Pro 270
lie Tyr Arg Glu Lys Thr Ala Ala
275 280 <210> 6 <211> 25 <212> PRT <213> неизвестно <220>
<223> амфипатический пептид Плеуроцидин <400> 6
Gly Trp Gly Ser Phe Phe Lys Lys Ala Ala His Vai Gly Lys His Vai
10 15
Gly Lys Ala Ala Leu Thr His Tyr Leu
25 <210> 7 <211> 31 <212> PRT <213> неизвестно <220>
<223> амфипатический пептид Цекропин Pl
- 26 037202 <400> 7
Ser Trp Leu Ser Lys Thr Ala Lys Lys Leu Glu Asn Ser Ala Lys Lys 15 10 15
Arg lie Ser Glu Gly lie Ala lie Ala lie Gin Gly Gly Pro Arg
25 30 <210> 8 <211> 21 <212> PRT <213> неизвестно <220>
<223> амфипатический пептид Буфорин II <400> 8
Thr Arg Ser Ser Arg Ala Gly Leu Gin Phe Pro Val Gly Arg Val His 15 10 15
Arg Leu Leu Arg Lys <210> 9 <211> 23 <212> PRT <213> неизвестно <220>
<223> амфипатический пептид amphipatic peptide Магаинин <400> 9
Gly lie Gly Lys Phe Leu His Ser Ala Lys Lys Phe Gly Lys Ala Phe 15 10 15
Val Gly Glu lie Met Asn Ser <210> 10 <211> 37 <212> PRT <213> неизвестно <220>
<223> амфипатический пептид Кателицидин LL-37 <400> 10
Leu Leu Gly Asp Phe Phe Arg Lys 15
Phe Lys Arg lie Val Gin Arg lie 20
Ser Lys Glu Lys lie Gly Lys Glu 1015
Lys Asp Phe Leu Arg Asn Leu Val 2530
Pro Arg Thr Glu Ser <210> 11 <211> 29 <212> PRT <213> неизвестно <220>
<223> SMAP-29 <400> 11
Arg Gly Leu Arg Arg Leu Gly Arg
5
Lys lie Ala His Gly Val Lys Lys
15
Tyr Gly Pro Thr Val Leu Arg lie lie Arg lie Ala Gly 25 <210> 12 <211> 13 <212> PRT <213> неизвестно <220>
<223> Indolicidin <400> 12 lie Leu Pro Trp Lys Trp Pro Trp
5
Trp Pro Trp Arg Arg 10 <210> 13 <211> 18 <212> PRT <213> неизвестно <220>
<223> Протегрин <400> 13
Arg Gly Gly Arg Leu Cys Tyr Cys
5
Arg Arg Arg Phe Cys Val Cys Val
15
Gly Arg
- 27 037202 <210> 14 <211> 36 <212> PRT <213> неизвестно <220>
<223> Цекропин A (A.aegypti) <400> 14
Gly Gly Leu Lys Lys Leu Gly Lys Lys Leu Glu Gly Ala Gly Lys Arg
1015
Val Phe Asn Ala Ala Glu Lys Ala Leu Pro Val Val Ala Gly Ala Lys
2530
Ala Leu Arg Lys <210> 15 <211>40 <212> PRT <213> неизвестно <220>
<223> Цекропин A (D. melanogas <4O0> 15
Gly Trp Leu Lys Lys He Gly Lys 1 5 >r)
Lys lie Glu Arg Val Gly Gin His
15
Thr Arg Asp Ala Thr He Gin Gly
Leu Gly He Pro Gin Gin Ala Ala 25 30
Asn Val Ala Ala Thr Ala Arg Gly
40 <210> 16 <211> 39 <212> PRT <213> неизвестно <220>
<22 3> Саркотоксин IA <400> 16
Gly Trp Leu Lys Lys lie Gly Lys
5
Lys He Glu Arg Val Gly Gin His
15
Thr Arg Asp Ala Thr He Gin Gly
Leu Gly lie Ala Gin Gin Ala Ala
30
Asn Val Ala Ala Thr Ala Arg 35 <210> 17 <211> 5 <212> PRT <213> неизвестно <220>
<223> Pentapeptide <400> 17
Phe Phe Val Ala Pro 1 5 <210> 18 <211> 152 <212> PRT <213> неизвестно <220>
<223> E. coli фаг K1F <400> 18
Met Val Ser Lys Val Gin Phe Asn
5
Pro Arg Ser Arg Thr Asp Ala lie
15
Phe Val His Cys Ser Ala Thr Lys
Pro Glu Met Asp lie Gly Val Glu
30
Thr He Arg Met Trp His Lys Gin
40
Gin Ala Trp Leu Asp Val Gly Tyr
His Phe lie lie Lys Arg Asp Gly
55
Thr Val Glu Glu Gly Arg Pro Val 60
Asn Val Val Gly Ser His Val Lys 65 70
Asp Trp Asn Ser Arg Ser Val Gly
80
Val Cys Leu Val Gly Gly lie Asn 85
Ala Lys Gly Gin Phe Glu Ala Asn
95
- 28 037202
Phe Thr Pro Ala Gin Met Asn Ser
100
Leu Arg Asn Lys Leu Asp Asp Leu
105 110
Lys Vai Met Tyr Pro Gin Ala Glu
115 120
He Arg Ala His His Asp Vai Ala
125
Pro Lys Ala Cys Pro Ser Phe Asp
130 135
Leu Gin Arg Trp Leu Ser Thr Asn
140
Glu Leu Vai Thr Ser Asp Arg Gly
145 150 <210> 19 <211> 39 <212> PRT <213> неизвестно <220>
<223> Буфорин I <400> 19
Ala
Arg
Gly Arg Gly Lys 5
Ser Ser Arg Ala 20
Gin Gly Gly Lys Vai Arg Ala Lys Ala Lys Thr 10 15
Gly Leu Gin Phe Pro Vai Gly Arg Vai His Arg 25 30
Leu Leu Arg Lys Gly Asn Tyr <210> 20 <211> 165 <212> PRT <213> неизвестно <220>
<223> PSP3 gplO Salmonella эндолизин <400> 20
Met Pro Vai He Asn Thr His Gin Asn lie Ala Ala Phe Leu Asp Met
1015
Leu Ala Tyr Ser Glu Gly Thr Ala Asn His Pro Leu Thr Lys Asn Arg
2530
Gly Tyr Asp Vai lie Vai Thr Gly Phe Asp Gly Ser Pro Glu lie Phe
4045
Thr Asp Tyr Ser Asp His Pro Phe Ala His Gly Arg Pro Pro Lys Vai
5560
Phe Asn Arg Arg Gly Glu Lys Ser Thr Ala Ser Gly Arg Tyr Gin Gin
70 7580
Leu Tyr lie Phe Trp Pro His Tyr Lys Lys Gin Leu Ala Leu Pro Asp 85 9095
Phe Ser Pro Leu Ser Gin Asp Lys Leu Ala lie Gin Leu lie Arg Glu
100 105110
Arg Gly Ala lie Asp Asp lie Arg Ala Gly Arg lie Glu Arg Ala Vai
115 120125
Ser Arg Cys Arg Asn lie Trp Ala Ser Leu Pro Gly Ala Gly Tyr Gly
130 135140
Gin Arg Glu His Ser Leu Glu Lys Leu Vai Thr Vai Trp Arg Thr Ala
145 150 155160
Gly Gly Vai Met Ala
165 <210> 21 <211> 165 <212> PRT <213> неизвестно <220>
<223> E. coli фаг эндолизин P2gp09 <400> 21
Met Pro Vai lie Asn Thr His Gin Asn lie Ala Ala Phe Leu Asp Met
1015
Leu Ala Vai Ser Glu Gly Thr Ala Asn His Pro Leu Thr Lys Asn Arg 20 2530
Gly Tyr Asp Vai lie Vai Thr Gly Leu Asp Gly Lys Pro Glu lie Phe
4045
- 29 037202
Thr Asp Tyr Ser Asp His Pro Phe
55
Ala His Gly Arg Pro Ala Lys Val 60
Phe Asn Arg Arg Gly Glu Lys Ser
70
Thr Ala Ser Gly Arg Tyr Gin Gin
80
Leu Tyr Leu Phe Trp Pro His Tyr
Arg Lys Gin Leu Ala Leu Pro Asp
95
Phe Ser Pro Leu Ser Gin Asp Arg
100
Leu Ala lie Gin Leu lie Arg Glu
105 110
Arg Gly Ala Leu Asp Asp lie Arg
115 120
Ala Gly Arg He Glu Arg Ala He
125
Ser Arg Cys Arg Asn lie Trp Ala
130 135
Ser Leu Pro Gly Ala Gly Tyr Gly
140
Gin Arg Glu His Ser Leu Glu Lys 145 150
Leu Val Thr Val Trp Arg Thr Ala
155 160
Gly Gly Val Pro Ala
165 <210> 22 <211> 176 <212> PRT <213> неизвестно <220>
<223> STM0O16 <400> 22
Asn Pro lie He Asp Gly He lie
5
Ala Leu Glu Gly Gly Tyr Val Phe
15
Asn Pro Lys Asp Lys Gly Gly Ala
Thr His Trp Gly He Thr Glu Ala 25 30
Thr Ala Arg Ala His Gly Tyr Ala
40
Gly Asp Met Arg Asp Leu Thr His 45
Ala Glu Ala Tyr Ala lie Leu Glu 5055
Phe Asp Val He Ser Thr Leu Ser 6570
Glu Asp Tyr Trp lie Lys Pro Gly
Trp Pro Val Ser Phe Glu Leu Cys 7580
Asp Ala Ala Val Asn He Gly Ala
Tyr His Pro Ser Ala Trp Leu Gin
95
Arg Trp Leu Asn Val Phe Asn His
100
Glu Gly Lys Arg Tyr Pro Asp lie
105 110
His Val Asp Gly Asn He Gly Pro
115 120
Arg Thr Leu Ala Ala Leu Glu His
125
Tyr Leu Ala Trp Arg Gly Gin Glu
130 135
Gly Glu Ala Val Leu Val Lys Ala
140
Leu Asn Cys Ser Gin Gly Thr Tyr
145 150
Tyr Leu Asn Val Ala Glu Lys Asn
155 160
His Asn Asn Glu Gin Phe lie Tyr
165
Gly Trp lie Lys Asn Arg Val Thr
170 175 <210> 23 <211> 208 <212> PRT <213> неизвестно <220>
<223> E.coli фаг N4 мурамидаза <400> 23
Met Ala lie Ser Lys Lys Lys Val 1 5
N4-gp61
Gly Gly Val Gly Gly Val He Ala
15
Ala lie lie Ala Ala Val Phe Ala
Val Glu Gly Gly Tyr Val Asn Asp 25 30
Pro Lys Asp Pro Gly Gly Glu Thr
40
Asn His Gly Val Thr lie Gin Val
Ala Gin Lys His Lys Gin Glu Leu
55
Glu Ser Met Tyr Asn Trp Asp Gly 60
Ser Met Lys Asn Leu Thr Gin Glu 65 70
Met Ala Ser Ser lie Tyr Tyr Asn
80
Asp Tyr lie Leu Lys Pro Gly Phe Val Lys Phe Ala Asp Val Ser Pro
9095
Ala Val Thr Glu Lys Leu Val Asp Ala Gly Val Asn Thr Gly Pro Ala
100 105110
Arg Pro Ser Arg Trp Leu Gin Glu Ser Leu Asn Ala Phe Ser Arg Asn
115 120125
Gly Lys Asp Tyr Pro Lys lie Gin Val Asp Gly Lys Val Gly Ser Gly
130 135140
Thr Leu Ser Ala Tyr Lys Ser Leu Gin Asn Lys Arg Gly Lys Val Glu
145 150 155160
Ala Cys Lys Leu lie Leu Lys Ser Leu Asp Gly Lys Gin Leu Asn Tyr
165 170175
Tyr Leu Ser Leu Asn Met Pro Glu Tyr Thr Thr Gly Trp lie Ala Asn
180 185190
Arg lie Gly Asn Val Pro Leu Glu Arg Cys Asn Glu Asp lie Val Asn
195 200205 <210> 24 <211> 184 <212> PRT <213> неизвестно <220>
<223> 24 N4-gp61 trunc <400> 24
Val 1 Glu Gly Gly Tyr 5 Val Asn Asp Pro Lys Asp Pro Gly Gly Glu Thr
10 15
Asn His Gly Val 20 Thr lie Gin Val Ala Gin Lys His Lys Gin Glu Leu 25 30
Glu Ser Met 35 Tyr Asn Trp Asp Gly 40 Sej : Met Lys Asn Leu Thr Gin Glu 45
Met Ala 50 Ser Ser lie Tyr Tyr 55 Asn . Asf > Tyr He Leu Lys Pro Gly Phe 60
Val 65 Lys Phe Ala Asp Val 70 Ser Pro Ala Val Thr 75 Glu Lys Leu Val Asp 80
Ala Gly Val Asn Thr 85 Gly Pro Ala Arg Pro 90 Ser Arg Trp Leu Gin 95 Glu
Ser Leu Asn Ala 100 Phe Ser Arg Asn Gly 105 Lys Asp Tyr Pro Lys 110 lie Gin
Val Asp Gly 115 Lys Val Gly Ser Gly 120 Thr Leu Ser Ala Tyr 125 Lys Ser Leu
Gin Asn 130 Lys Arg Gly Lys Val 135 Glu Ala Cys Lys Leu 140 lie Leu Lys Ser
Leu 145 Asp Gly Lys Gin Leu 150 Asn Tyr Tyr Leu Ser 155 Leu Asn Met Pro Glu 160
Tyr Thr Thr Gly Trp 165 He Ala Asn Arg lie 170 Gly Asn Val Pro Leu 175 Glu
Arg Cys Asn Glu 180 Asp lie Val Asn
<210> <211> <212> <213> 25 259 PRT неизвестно
<220> <223> E.coli фаг K2144
<400> 25
Lys 1 Val Leu Arg Lys 5 Gly Asp Arg Gly Asp 10 Glu Val Cys Gin Leu 15 Gin
Thr Leu Leu Asn 20 Leu Cys Gly Tyr Asp 25 Val Gly Lys Pro Asp 30 Gly lie
Phe Gly Asn 35 Asn Thr Phe Asn Gin 40 Val Val Lys Phe Gin 45 Lys Asp Asn
Cys Leu 50 Asp Ser Asp Gly He 55 Val Gly Lys Asn Thr 60 Trp Ala Glu Leu
Phe Ser Lys Tyr Ser Pro Pro He Pro Tyr Lys Thr He Pro Met Pro 65 70 7580
Thr Ala Asn Lys Ser Arg Ala Ala Ala Thr Pro Vai Met Asn Ala Vai
9095
Glu Asn Ala Thr Gly Vai Arg Ser Gin Leu Leu Leu Thr Phe Ala Ser
100 105110
He Glu Ser Ala Phe Asp Tyr Glu He Lys Ala Lys Thr Ser Ser Ala
115 120125
Thr Gly Trp Phe Gin Phe Leu Thr Gly Thr Trp Lys Thr Met He Glu
130 135140
Asn Tyr Gly Met Lys Tyr Gly Vai Leu Thr Asp Pro Thr Gly Ala Leu
145 150 155160
Arg Lys Asp Pro Arg He Ser Ala Leu Met Gly Ala Glu Leu He Lys
165 170175
Glu Asn Met Asn He Leu Arg Pro Vai Leu Lys Arg Glu Pro Thr Asp
180 185190
Thr Asp Leu Tyr Leu Ala His Phe Phe Gly Pro Gly Ala Ala Arg Arg
195 200205
Phe Leu Thr Thr Gly Gin Asn Glu Leu Ala Ala Thr His Phe Pro Lys
210 215220
Glu Ala Gin Ala Asn Pro Ser He Phe Tyr Asn Lys Asp Gly Ser Pro
225 230 235240
Lys Thr He Gin Glu Vai Tyr Asn Leu Met Asp Gly Lys Vai Ala Ala
245 250255
His Arg Lys <210> 26 <211> 22 <212> PRT <213> неизвестно <220>
<223> Нигроцин 2 <400> 26
Gly Leu Leu Ser Lys Vai Leu Gly Vai Gly Lys Lys Vai Leu Cys Gly
10 15
Vai Ser Gly Leu Vai Cys <210> 27 <211> 24 <212> PRT <213> неизвестно <220>
<223> Аскафин 5 <400> 27
Gly He Lys Asp Trp He Lys Gly Ala Ala Lys Lys Leu He Lys Thr 15 10 15
Vai Ala Ser His lie Ala Asn Gin <210> 28 <211> 17 <212> PRT <213> неизвестно <220>
<223> Апидаецин <400> 28
Ala Asn Arg Pro Vai Tyr He Pro Pro Pro Arg Pro Pro His Pro Arg
10 15
Leu <210> 29 <211> 24 <212> PRT <213> неизвестно <220>
<223> Псеудин 1 <400> 29
- 33 037202
Ala lie Asp Ala 100 Leu Val Lys Ser Tyr 105 Arg Gln lie Thr Glu 110 Ala Glu
Arg Ala Gly Ser 115 Thr Leu Pro Leu 120 Gly Leu Ala Thr Val 125 Met Ser Lys
His Met 130 Ser lie Glu Gln Leu 135 Arg Ala Met Leu Pro 140 Thr Asp Arg Gln
Gly 145 Tyr Ala Glu Val Tyr 150 lie Asp Pro Leu Asn 155 Glu Thr Met Asp lie 160
Phe Glu lie Asn Thr 165 Pro Leu Arg lie Ala 170 His Phe Met Ala Gln lie 175
Leu His Glu Thr 180 Ala Cys Phe Lys Tyr 185 Thr Glu Glu Leu Ala 190 Ser Gly
Lys Ala Tyr Glu 195 Gly Arg Ala Asp 200 Leu Gly Asn Thr Arg 205 Pro Gly Asp
Gly Pro 210 Leu Phe Lys Gly Arg 215 Gly Leu Leu Gln lie 220 Thr Gly Arg Leu
Asn 225 Tyr Val Lys Cys Gln 230 Val Tyr Leu Arg Glu 235 Lys Leu Lys Asp Pro 240
Thr Phe Asp lie Thr 245 Ser Ser Val Thr Cys 250 Ala Gln Gln Leu Ser Glu 255
Ser Pro Leu Leu 260 Ala Ala Leu Ala Ser 265 Gly Tyr Phe Trp Arg 270 Phe lie
Lys Pro Lys Leu 275 Asn Glu Thr Ala 280 Asp Lys Asp Asp lie 285 Tyr Trp Val
Ser Val 290 Tyr Val Asn Gly Tyr 295 Ala Lys Gln Ala Asn 300 Pro Tyr Tyr Pro
Asn Arg 305 Ala Val <210> <211> <212> <213> <220> <223> <400> Asp Lys Glu Thr Lys Lys 325 35 18 PRT неизвестно 35 Walmaghl 35 Pro 310 Ala Asn Leu His Gly Met lie Lys Val 330 Glu 315 Lys Arg Gly Val Gln Met Leu 320
Gly Phe 1 Val Pro <210> <211> <212> <213> <220> <223> <400> Phe lie Pro Ala 5 36 203 PRT неизвестно Аскафин5-К2144 36 Val lie Leu Pro 10 Ser lie Ala Phe Leu lie 15
Gly 1 lie Lys Asp Trp 5 lie Lys Gly Ala Ala 10 Lys Lys Leu lie Lys Thr 15
Val Ala Ser His 20 lie Ala Asn Gln Lys 25 Val Leu Arg Lys Gly 30 Asp Arg
Gly Asp Glu Val 35 Cys Gln Leu Gln 40 Thr Leu Leu Asn Leu 45 Cys Gly Tyr
Asp Val 50 Gly Lys Pro Asp Gly 55 lie Phe Gly Asn Asn 60 Thr Phe Asn Gln
Val 65 Val Lys Phe Gln Lys 70 Asp Asn Cys Leu Asp 75 Ser Asp Gly lie Val 80
Gly Lys Asn Thr Trp 85 Ala Glu Leu Phe Ser 90 Lys Tyr Ser Pro Pro lie 95
Pro Tyr Lys Thr 100 lie Pro Met Pro Thr 105 Ala Asn Lys Ser Arg 110 Ala Ala
- 34 037202
Ala Thr Pro 115 Val Met Asn Ala Val 120 Glu Asn Ala Thr Gly Val Arg Ser
125
Gin Leu Leu Leu Thr Phe Ala Ser He Glu Ser Ala Phe Asp Tyr Glu
He 130 Lys Ala Lys Thr Ser 135 Ser Ala Thr Gly 140 Trp Phe Gin Phe Leu Thr
145 Gly Thr Trp Lys Thr 150 Met lie Glu Asn Tyr 155 160 Gly Met Lys Tyr Gly Val
Leu Thr Asp Pro 165 Thr Gly Ala Leu Arg 170 Lys 175 Asp Pro Arg lie Ser Ala
Leu Met Gly 180 Ala Glu Leu lie Lys 185 Glu Asn 190 Met Asn lie Leu Arg Pro
Val Leu 195 Lys Arg Glu Pro Thr 200 Asp Thr Asp 205 Leu Tyr Leu Ala His Phe
Phe 210 Gly Pro Gly Ala Ala 215 Arg Arg Phe Leu 220 Thr Thr Gly Gin Asn Glu
225 Leu Ala Ala Thr His 230 Phe Pro Lys Glu Ala 235 240 Gin Ala Asn Pro Ser lie
Phe Tyr Asn Lys 245 Asp Gly Ser Pro Lys 250 Thr 255 He Gin Glu Val Tyr Asn
Leu Met Asp 260 Gly Lys Val Ala Ala 265 His Arg 270 Lys
<210 <211 <212 <213 <220 <223 <400 Ala 275 > 37 > 276 > PRT > неизвестно > > Апидаецин-К2144 > 37 Asn Arg Pro Val Tyr lie 280 Pro Pro Pro Arg Pro Pro His Pro Arg
1 Leu Lys Val Leu 5 Arg Lys Gly Asp Arg 10 Gly 15 Asp Glu Val Cys Gin Leu
Gin Thr Leu 20 Leu Asn Leu Cys Gly 25 Tyr Asp 30 Val Gly Lys Pro Asp Gly
He Phe 35 Gly Asn Asn Thr Phe 40 Asn Gin Val 45 Val Lys Phe Gin Lys Asp
Asn 50 Cys Leu Asp Ser Asp 55 Gly lie Val Gly 60 Lys Asn Thr Trp Ala Glu
65 Leu Phe Ser Lys Tyr 70 Ser Pro Pro lie Pro 75 80 Tyr Lys Thr lie Pro Met
Pro Thr Ala Asn 85 Lys Ser Arg Ala Ala 90 Ala 95 Thr Pro Val Met Asn Ala
Val Glu Asn 100 Ala Thr Gly Val Arg 105 Ser Gin 110 Leu Leu Leu Thr Phe Ala
Ser lie 115 Glu Ser Ala Phe Asp 120 Tyr Glu lie 125 Lys Ala Lys Thr Ser Ser
Ala 130 Thr Gly Trp Phe Gin 135 Phe Leu Thr Gly 140 Thr Trp Lys Thr Met lie
145 Glu Asn Tyr Gly Met 150 Lys Tyr Gly Val Leu 155 160 Thr Asp Pro Thr Gly Ala
Leu Arg Lys Asp 165 Pro Arg lie Ser Ala 170 Leu 175 Met Gly Ala Glu Leu lie
Lys Glu Asn 180 Met Asn lie Leu Arg 185 Pro Val 190 Leu Lys Arg Glu Pro Thr
Asp Thr 195 Asp Leu Tyr Leu Ala 200 His Phe Phe 205 Gly Pro Gly Ala Ala Arg
Arg 210 Phe Leu Thr Thr Gly 215 Gin Asn Glu Leu 220 Ala Ala Thr His Phe Pro
225 Lys Glu Ala Gin Ala 230 Asn Pro Ser lie Phe 235 240 Tyr Asn Lys Asp Gly Ser
- 35 037202
Asp Pro Thr Gly
Arg lie Ser Ala
Lys Arg Glu Pre
Leu Arg Lys Gly
Leu Asn Leu Cys
50 55 60
Val 65 Val Lys Phe Gin Lys 70 Asp Asn Cys Leu Asp 75 Ser Asp Gly lie Val 80
Gly Lys Asn Thr Trp Ala 85 Glu Leu Phe Ser Lys 90 Tyr Ser Pro Pro lie 95
Pro Tyr Lys Thr lie Pro 100 Met Pro Thr Ala Asn 105 Lys Ser Arg Ala Ala 110
Ala Thr Pro Val Met Asn 115 Ala Val Glu Asn Ala 120 Thr Gly Val Arg Ser 125
Gin Leu Leu Leu Thr Phe 130 Ala Ser lie Glu Ser 135 Ala Phe Asp Tyr Glu 140
He 145 Lys Ala Lys Thr Ser 150 Ser Ala Thr Gly Trp 155 Phe Gin Phe Leu Thr 160
Gly Thr Trp Lys Thr Met 165 lie Glu Asn Tyr Gly 170 Met Lys Tyr Gly Val 175
Leu Thr Asp Pro Thr Gly 180 Ala Leu Arg Lys Asp 185 Pro Arg lie Ser Ala 190
Leu Met Gly Ala Glu Leu 195 lie Lys Glu Asn Met 200 Asn lie Leu Arg Pro 205
Val Leu Lys Arg Glu Pro 210 Thr Asp Thr Asp Leu 215 Tyr Leu Ala His Phe 220
Phe 225 Gly Pro Gly Ala Ala 230 Arg Arg Phe Leu Thr 235 Thr Gly Gin Asn Glu 240
Leu Ala Ala Thr His Phe 245 Pro Lys Glu Ala Gin 250 Ala Asn Pro Ser lie 255
Phe Tyr Asn Lys Asp Gly 260 Leu Met Asp Gly Lys Val 275 <210> 40 <211> 277 <212> PRT <213> неизвестно <220> <223> Раналексин-К2144 <400> 40 Ser Pro Lys Thr lie 265 Ala Ala His Arg Lys 280 Gin Glu Val Tyr Asn 270
Phe 1 Leu Gly Gly Leu lie 5 Val Pro Ala Met lie 10 Cys Ala Val Thr Lys 15
Lys Cys Lys Val Leu Arg 20 Lys Gly Asp Arg Gly 25 Asp Glu Val Cys Gin 30
Leu Gin Thr Leu Leu Asn 35 Leu Cys Gly Tyr Asp 40 Val Gly Lys Pro Asp 45
Gly lie Phe Gly Asn Asn 50 Thr Phe Asn Gin Val 55 Val Lys Phe Gin Lys 60
Asp 65 Asn Cys Leu Asp Ser 70 Asp Gly lie Val Gly 75 Lys Asn Thr Trp Ala 80
Glu Leu Phe Ser Lys Tyr 85 Ser Pro Pro lie Pro 90 Tyr Lys Thr lie Pro 95
Met Pro Thr Ala Asn Lys 100 Ser Arg Ala Ala Ala 105 Thr Pro Val Met Asn 110
Ala Val Glu Asn Ala Thr 115 Gly Val Arg Ser Gin 120 Leu Leu Leu Thr Phe 125
Ala Ser lie Glu Ser Ala 130 Phe Asp Tyr Glu lie 135 Lys Ala Lys Thr Ser 140
Ser 145 Ala Thr Gly Trp Phe 150 Gin Phe Leu Thr Gly 155 Thr Trp Lys Thr Met 160
He Glu Asn Tyr Gly Met 165 Lys Tyr Gly Val Leu 170 Thr Asp Pro Thr Gly 175
Ala Leu Arg Lys Asp Pro 180 Arg lie Ser Ala Leu 185 Met Gly Ala Glu Leu 190
- 37 037202
lie Lys Glu Asn Met 195 Asn lie Leu 200 Arg Pro Val Leu Lys 205 Arg Glu Pro
Thr Asp Thr Asp Leu 210 Tyr Leu 215 Ala His Phe Phe Gly 220 Pro Gly Ala Ala
Arg Arg Phe Leu Thr 225 Thr 230 Gly Gin Asn Glu Leu 235 Ala Ala Thr His Phe 240
Pro Lys Glu Ala Gin 245 Ala Asn Pro Ser lie 250 Phe Tyr Asn Lys Asp 255 Gly
Ser Pro Lys Thr Ile 260 Gin Glu Val Tyr 265 Asn Leu Met Asp Gly 270 Lys Val
Ala Ala His Arg Lys 275
<210> 41 <211> 286 <212> PRT <213> неизвестно
<220> <223> WLBU2-BapwaHT -KZ144
<400> 41
Lys Arg Trp Val Lys 1 5 Arg Val Lys Arg Val 10 Lys Arg Trp Val Lys 15 Arg
Val Val Arg Val Val 20 Lys Arg Trp Val 25 Lys Arg Lys Val Leu 30 Arg Lys
Gly Asp Arg Gly Asp 35 Glu Val Cys 40 Gin Leu Gin Thr Leu 45 Leu Asn Leu
Cys Gly Tyr Asp Val 50 Gly Lys 55 Pro Asp Gly lie Phe 60 Gly Asn Asn Thr
Phe Asn Gin Val Val 65 Lys 70 Phe Gin Lys Asp Asn 75 Cys Leu Asp Ser Asp 80
Gly lie Val Gly Lys 85 Asn Thr Trp Ala Glu 90 Leu Phe Ser Lys Tyr 95 Ser
Pro Pro lie Pro Tyr 100 Lys Thr lie Pro 105 Met Pro Thr Ala Asn 110 Lys Ser
Arg Ala Ala Ala Thr 115 Pro Val Met 120 Asn Ala Val Glu Asn 125 Ala Thr Gly
Val Arg Ser Gin Leu 130 . Leu Leu 135 Thr Phe Ala Ser lie 140 Glu Ser Ala Phe
Asp Tyr Glu lie Lys 145 Ala 150 Lys Thr Ser Ser Ala 155 Thr Gly Trp Phe Gin 160
Phe Leu Thr Gly Thr 165 Trp Lys Thr Met lie 170 Glu Asn Tyr Gly Met 175 Lys
Tyr Gly Val Leu Thr 180 Asp Pro Thr Gly 185 Ala Leu Arg Lys Asp 190 Pro Arg
lie Ser Ala Leu Met 195 Gly Ala Glu 200 Leu lie Lys Glu Asn 205 Met Asn lie
Leu Arg Pro Val Leu 210 . Lys Arg 215 Glu Pro Thr Asp Thr 220 Asp Leu Tyr Leu
Ala His Phe Phe Gly 225 • Pro 230 Gly Ala Ala Arg Arg 235 Phe Leu Thr Thr Gly 240
Gin Asn Glu Leu Ala 245 Ala Thr His Phe Pro 250 Lys Glu Ala Gin Ala 255 Asn
Pro Ser lie Phe Tyr 260 Asn Lys Asp Gly 265 Ser Pro Lys Thr lie 270 Gin Glu
Val Tyr Asn Leu Met 275 Asp Gly Lys 280 Val Ala Ala His Arg 285 Lys
<210> 42 <211> 293 <212> PRT <213> неизвестно <220>
<223> Sushil-KZ144 <400> 42
Phe Tyr Asn
Thr His Phe Pro 260 Lys Glu Ala Gin Ala 265 Asn Pro Ser lie Phe 270 Tyr Asn
Lys Asp Gly Ser Pro Lys 275 Gly Lys Vai Ala Ala His 290 <210> 45 <211> 272 <212> PRT <213> неизвестно <220> <223> Индолицин-KZ14 4 <400> 45 Thr Arg 295 He 280 Lys Gin Glu Val Tyr Asn 285 Leu Met Asp
He 1 Leu Pro Trp Lys 5 Trp Pro Trp Trp Pro 10 Trp Arg Arg Lys Val 15 Leu
Arg Lys Gly Asp 20 Arg Gly Asp Glu Vai 25 Cys Gin Leu Gin Thr 30 Leu Leu
Asn Leu Cys 35 Gly Tyr Asp Vai Gly 40 Lys Pro Asp Gly lie 45 Phe Gly Asn
Asn Thr 50 Phe Asn Gin Vai Vai 55 Lys Phe Gin Lys Asp 60 Asn Cys Leu Asp
Ser 65 Asp Gly He Vai Gly 70 Lys Asn Thr Trp Ala 75 Glu Leu Phe Ser Lys 80
Tyr Ser Pro Pro lie 85 Pro Tyr Lys Thr lie 90 Pro Met Pro Thr Ala 95 Asn
Lys Ser Arg Ala 100 Ala Ala Thr Pro Val 105 Met Asn Ala Val Glu 110 Asn Ala
Thr Gly Vai 115 Arg Ser Gin Leu Leu 120 Leu Thr Phe Ala Ser 125 lie Glu Ser
Alla Phe 130 Asp Tyr Glu He Lys 135 Ala Lys Thr Ser Ser 140 Ala Thr Gly Trp
Phe 145 Gin Phe Leu Thr Gly 150 Thr Trp Lys Thr Met 155 He Glu Asn Tyr Gly 160
Met Lys Tyr Gly Vai 165 Leu Thr Asp Pro Thr 170 Gly Ala Leu Arg Lys 175 Asp
Pro Arg He Ser 180 Ala Leu Met Gly Ala 185 Glu Leu He Lys Glu 190 Asn Met
Asn He Leu 195 Arg Pro Vai Leu Lys 200 Arg Glu Pro Thr Asp 205 Thr Asp Leu
Tyr Leu 210 Ala His Phe Phe Gly 215 Pro Gly Ala Ala Arg 220 Arg Phe Leu Thr
Thr 225 Gly Gin Asn Glu Leu 230 Ala Ala Thr His Phe 235 Pro Lys Glu Ala Gin 240
Ala Asn Pro Ser lie 245 Phe Tyr Asn Lys Asp 250 Gly Ser Pro Lys Thr 255 lie
Gin Glu <210> <211> <212> <213> <220> <223> <400> Vai Tyr Asn 260 46 288 PRT неизвестно SMAP-29-KZ14· 46 Leu Met Asp Gly 265 Lys Val Ala Ala His 270 Arg Lys
Arg 1 Gly Leu Arg Arg 5 Leu Gly Arg Lys He 10 Ala His Gly Val Lys 15 Lys
Tyr Gly Pro Thr 20 Vai Leu Arg lie lie 25 Arg lie Ala Gly Lys 30 Val Leu
Arg Lys Gly 35 Asp Arg Gly Asp Glu 40 Val Cys Gin Leu Gin 45 Thr Leu Leu
Asn Leu 50 Cys Gly Tyr Asp Vai 55 Gly Lys Pro Asp Gly 60 He Phe Gly Asn
Asn 65 Thr Phe Asn Gin Val 70 Val Lys Phe Gin Lys 75 Asp Asn Cys Leu Asp 80
Ser Asp Gly He Val 85 Gly Lys Asn Thr Trp 90 Ala Glu Leu Phe Ser 95 Lys
Tyr Ser Pro Pro 100 lie Pro Tyr Lys Thr 105 lie Pro Met Pro Thr 110 Ala Asn
Lys Ser Arg 115 Ala Ala Ala Thr Pro 120 Val Met Asn Ala Val 125 Glu Asn Ala
Thr Gly 130 Val Arg Ser Gin Leu 135 Leu Leu Thr Phe Ala 140 Ser He Glu Ser
Ala 145 Phe Asp Tyr Glu He 150 Lys Ala Lys Thr Ser 155 Ser Ala Thr Gly Trp 160
Phe Gin Phe Leu Thr 165 Gly Thr Trp Lys Thr 170 Met He Glu Asn Tyr 175 Gly
Met Lys Tyr Gly 180 Val Leu Thr Asp Pro 185 Thr Gly Ala Leu Arg 190 Lys Asp
Pro Arg lie 195 Ser Ala Leu Met Gly 200 Ala Glu Leu lie Lys 205 Glu Asn Met
Asn He 210 Leu Arg Pro Val Leu 215 Lys Arg Glu Pro Thr 220 Asp Thr Asp Leu
Tyr 225 Leu Ala His Phe Phe 230 Gly Pro Gly Ala Ala 235 Arg Arg Phe Leu Thr 240
Thr Gly Gin Asn Glu 245 Leu Ala Ala Thr His 250 Phe Pro Lys Glu Ala 255 Gin
Ala Asn Pro Ser 260 lie Phe Tyr Asn Lys 265 Asp Gly Ser Pro Lys 270 Thr lie
Gin Glu <210> < <211> <212> <213> <220> <223> : <400> Val Tyr Asn Leu 275 17 277 PRT неизвестно Протегрин-К2144 47 Met Asp 280 Gly Lys Val Ala Ala 285 His Arg Lys
Arg 1 Gly Gly Arg Leu 5 Cys Tyr Cys Arg Arg 10 Arg Phe Cys Val Cys 15 Val
Gly Arg Lys Val 20 Leu Arg Lys Gly Asp 25 Arg Gly Asp Glu Val 30 Cys Gin
Leu Gin Thr 35 Leu Leu Asn Leu Cys 40 Gly Tyr Asp Val Gly 45 Lys Pro Asp
Gly lie 50 Phe Gly Asn Asn Thr 55 Phe Asn Gin Val Val 60 Lys Phe Gin Lys
Asp 65 Asn Cys Leu Asp Ser 70 Asp Gly He Val Gly 75 Lys Asn Thr Trp Ala 80
Glu Leu Phe Ser Lys 85 Tyr Ser Pro Pro lie 90 Pro Tyr Lys Thr lie 95 Pro
Met Pro Thr Ala 100 Asn Lys Ser Arg Ala 105 Ala Ala Thr Pro Val 110 Met Asn
Ala Val Glu 115 Asn Ala Thr Gly Val 120 Arg Ser Gin Leu Leu 125 Leu Thr Phe
Ala Ser 130 lie Glu Ser Ala Phe 135 Asp Tyr Glu lie Lys 140 Ala Lys Thr Ser
Ser 145 Ala Thr Gly Trp Phe 150 Gin Phe Leu Thr Gly 155 Thr Trp Lys Thr Met 160
He Glu Asn Tyr Gly 165 Met Lys Tyr Gly Val 170 Leu Thr Asp Pro Thr 175 Gly
Ala Leu Arg Lys 180 Asp Pro Arg He Ser 185 Ala Leu Met Gly Ala 190 Glu Leu
lie Lys Glu Asn Met Asn lie Leu Arg Pro Val Leu Lys Arg Glu Pro
- 42 037202
195 200
Thr Asp Thr Asp Leu 210 Tyr Leu Ala 215
Arg Arg Phe Leu Thr 225 Thr Gly Gin 230
Pro Lys Glu Ala Gin 245 Ala Asn Pro
Ser Pro Lys Thr lie 260 Ala Ala His Arg Lys 275 <210> 48 <211> 290 <212> PRT <213> неизвестно Gin Glu Val
<220>
<223> Цекропин P1-KZ144
<400> 48
Ser Trp Leu Ser Lys 1 5 Thr Ala Lys
Arg lie Ser Glu Gly 20 He Ala lie
Val Leu Arg Lys Gly 35 Asp Arg Gly 40
Leu Leu Asn Leu Cys 50 Gly Tyr Asp 55
Gly Asn Asn Thr Phe 65 Asn Gin Val 70
Leu Asp Ser Asp Gly 85 He Val Gly
Ser Lys Tyr Ser Pro 100 Pro He Pro
Ala Asn Lys Ser Arg 115 Ala Ala Ala 120
Asn Ala Thr Gly Val 130 Arg Ser Gin 135
Glu Ser Ala Phe Asp 145 Tyr Glu He 150
Gly Trp Phe Gin Phe 165 Leu Thr Gly
Tyr Gly Met Lys Tyr 180 Gly Val Leu
Lys Asp Pro Arg He 195 Ser Ala Leu 200
Asn Met Asn lie Leu 210 Arg Pro Val 215
Asp Leu Tyr Leu Ala 225 His Phe Phe 230
Leu Thr Thr Gly Gin 245 Asn Glu Leu
Ala Gin Ala Asn Pro 260 Ser He Phe
Thr He Gin Glu Val 275 Arg Lys 290 Tyr Asn Leu 280
205
His Phe Phe Gly Pro Gly Ala Ala 220
Asn Glu Leu Ala Ala Thr His Phe
235240
Ser lie Phe Tyr Asn Lys Asp Gly 250255
Tyr Asn Leu Met Asp Gly Lys Val
265270
Lys Leu Glu Asn Ser Ala Lys Lys
1015
Ala lie Gin Gly Gly Pro Arg Lys 2530
Asp Glu Val Cys Gin Leu Gin Thr 45
Val Gly Lys Pro Asp Gly He Phe
Val Lys Phe Gin Lys Asp Asn Cys 7580
Lys Asn Thr Trp Ala Glu Leu Phe
9095
Tyr Lys Thr He Pro Met Pro Thr
105110
Thr Pro Val Met Asn Ala Val Glu
125
Leu Leu Leu Thr Phe Ala Ser lie
140
Lys Ala Lys Thr Ser Ser Ala Thr
155160
Thr Trp Lys Thr Met lie Glu Asn
170175
Thr Asp Pro Thr Gly Ala Leu Arg 185190
Met Gly Ala Glu Leu He Lys Glu
205
Leu Lys Arg Glu Pro Thr Asp Thr
220
Gly Pro Gly Ala Ala Arg Arg Phe
235240
Ala Ala Thr His Phe Pro Lys Glu
250255
Tyr Asn Lys Asp Gly Ser Pro Lys
265270
Met Asp Gly Lys Val Ala Ala His
285 <210> 49 <211> 282 <212> PRT <213> неизвестно <220>
<223> Магаинин-К2144 <400> 49
Gly 1 He Gly Lys Phe 5 Leu His Ser Ala Lys 10 Lys Phe Gly Lys Ala Phe
15
Val Gly Glu He 20 Met Asn Ser Lys Val 25 Leu Arg Lys Gly Asp Arg Gly 30
Asp Glu Val 35 Cys Gin Leu Gin Thr 40 Leu Leu Asn Leu Cys Gly Tyr Asp 45
Val Gly 50 Lys Pro Asp Gly He 55 Phe Gly Asn Asn Thr 60 Phe Asn Gin Val
Val 65 Lys Phe Gin Lys Asp 70 Asn Cys Leu Asp Ser 75 Asp Gly lie Val Gly 80
Lys Asn Thr Trp Ala 85 Glu Leu Phe Ser Lys 90 Tyr Ser Pro Pro lie Pro 95
Tyr Lys Thr He 100 Pro Met Pro Thr Ala 105 Asn Lys Ser Arg Ala Ala Ala 110
Thr Pro Val 115 Met Asn Ala Val Glu 120 Asn Ala Thr Gly Val Arg Ser Gin 125
Leu Leu 130 Leu Thr Phe Ala Ser 135 He Glu Ser Ala Phe 140 Asp Tyr Glu He
Lys 145 Ala Lys Thr Ser Ser 150 Ala Thr Gly Trp Phe 155 Gin Phe Leu Thr Gly 160
Thr Trp Lys Thr Met 165 He Glu Asn Tyr Gly 170 Met Lys Tyr Gly Val Leu 175
Thr Asp Pro Thr 180 Gly Ala Leu Arg Lys 185 Asp Pro Arg lie Ser Ala Leu 190
Met Gly Ala 195 Glu Leu He Lys Glu 200 Asn Met Asn He Leu Arg Pro Val 205
Leu Lys 210 Arg Glu Pro Thr Asp 215 Thr Asp Leu Tyr Leu 220 Ala His Phe Phe
Gly 225 Pro Gly Ala Ala Arg 230 Arg Phe Leu Thr Thr 235 Gly Gin Asn Glu Leu 240
Ala Ala Thr His Phe 245 Pro Lys Glu Ala Gin 250 Ala Asn Pro Ser lie Phe 255
Tyr Asn Lys Asp Gly Ser 260 Met Asp Gly Lys Val Ala 275 <210> 50 <211> 284 <212> PRT <213> неизвестно <220> <223> Плеуроцидин-К2144 <400> 50 Pro Ala I Lys His 280 Thr 265 Arg lie Lys Gin Glu Val Tyr Asn Leu 270
Gly 1 Trp Gly Ser Phe 5 Phe Lys Lys Ala Ala 10 His Val Gly Lys His Val 15
Gly Lys Ala Ala 20 Leu Thr His Tyr Leu 25 Lys Val Leu Arg Lys Gly Asp 30
Arg Gly Asp 35 Glu Val Cys Gin Leu 40 Gin Thr Leu Leu Asn Leu Cys Gly 45
Tyr Asp 50 Val Gly Lys Pro Asp 55 Gly lie Phe Gly Asn 60 Asn Thr Phe Asn
Gin 65 Val Val Lys Phe Gin 70 Lys Asp Asn Cys Leu 75 Asp Ser Asp Gly lie 80
Val Gly Lys Asn Thr 85 Trp Ala Glu Leu Phe 90 Ser Lys Tyr Ser Pro Pro 95
He Pro Tyr Lys 100 Thr lie Pro Met Pro 105 Thr Ala Asn Lys Ser Arg Ala 110
Ala Ala Thr 115 Pro Val Met Asn Ala 120 Val Glu Asn Ala Thr Gly Val Arg 125
- 44 037202
Ser Gin 130 Leu Leu Leu Thr Phe 135 Ala Ser lie Glu Ser 140 Ala Phe Asp Tyr
Glu 145 He Lys Ala Lys Thr 150 Ser Ser Ala Thr Gly 155 Trp Phe Gin Phe Leu 160
Thr Gly Thr Trp Lys 165 Thr Met He Glu Asn 170 Tyr Gly Met Lys Tyr 175 Gly
Val Leu Thr Asp 180 Pro Thr Gly Ala Leu 185 Arg Lys Asp Pro Arg 190 He Ser
Ala Leu Met 195 Gly Ala Glu Leu He 200 Lys Glu Asn Met Asn 205 He Leu Arg
Pro Val 210 Leu Lys Arg Glu Pro 215 Thr Asp Thr Asp Leu 220 Tyr Leu Ala His
Phe 225 Phe Gly Pro Gly Ala 230 Ala Arg Arg Phe Leu 235 Thr Thr Gly Gin Asn 240
Glu Leu Ala Ala Thr 245 His Phe Pro Lys Glu 250 Ala Gin Ala Asn Pro 255 Ser
He Phe Tyr Asn Lys 260 Asn Leu Met Asp Gly 275 <210> 51 <211> 295 <212> PRT <213> неизвестно <220> <223> Цекропин A (A <400> 51 Asp Gly Ser Pro 265 Lys Val Ala Ala 280 i. aegypti) - KZ14 4 Lys His Thr Arg He Lys Gin Glu 270 Val Tyr
Gly 1 Gly Leu Lys Lys 5 Leu Gly Lys Lys Leu 10 Glu Gly Ala Gly Lys 15 Arg
Val Phe Asn Ala 20 Ala Glu Lys Ala Leu 25 Pro Val Val Ala Gly 30 Ala Lys
Ala Leu Arg 35 Lys Lys Val Leu Arg 40 Lys Gly Asp Arg Gly 45 Asp Glu Val
Cys Gin 50 Leu Gin Thr Leu Leu 55 Asn Leu Cys Gly Tyr 60 Asp Val Gly Lys
Pro 65 Asp Gly lie Phe Gly 70 Asn Asn Thr Phe Asn 75 Gin Val Val Lys Phe 80
Gin Lys Asp Asn Cys 85 Leu Asp Ser Asp Gly 90 He Val Gly Lys Asn 95 Thr
Trp Ala Glu Leu 100 Phe Ser Lys Tyr Ser 105 Pro Pro lie Pro Tyr 110 Lys Thr
He Pro Met 115 Pro Thr Ala Asn Lys 120 Ser Arg Ala Ala Ala 125 Thr Pro Val
Met Asn 130 Ala Val Glu Asn Ala 135 Thr Gly Val Arg Ser 140 Gin Leu Leu Leu
Thr 145 Phe Ala Ser lie Glu 150 Ser Ala Phe Asp Tyr 155 Glu He Lys Ala Lys 160
Thr Ser Ser Ala Thr 165 Gly Trp Phe Gin Phe 170 Leu Thr Gly Thr Trp 175 Lys
Thr Met He Glu 180 Asn Tyr Gly Met Lys 185 Tyr Gly Val Leu Thr 190 Asp Pro
Thr Gly Ala 195 Leu Arg Lys Asp Pro 200 Arg He Ser Ala Leu 205 Met Gly Ala
Glu Leu 210 He Lys Glu Asn Met 215 Asn lie Leu Arg Pro 220 Val Leu Lys Arg
Glu 225 Pro Thr Asp Thr Asp 230 Leu Tyr Leu Ala His 235 Phe Phe Gly Pro Gly 240
Ala Ala Arg Arg Phe 245 Leu Thr Thr Gly Gin 250 Asn Glu Leu Ala Ala 255 Thr
His Phe Pro Lys Glu Ala Gin Ala Asn Pro Ser He Phe Tyr Asn Lys
Met Lys Tyr Gly Vai
Asp Ara Gly Asp Glu
- 46 037202
- 47 037202
Thr Trp Lys Thr 180 Met lie Glu Asn Tyr 185 Gly Met Lys Tyr Gly 190 Val Leu
Thr Asp Pro 195 Thr Gly Ala Leu Arg 200 Lys Asp Pro Arg He 205 Ser Ala Leu
Met Gly 210 Ala Glu Leu lie Lys 215 Glu Asn Met Asn lie 220 Leu Arg Pro Val
Leu 225 Lys Arg Glu Pro Thr 230 Asp Thr Asp Leu Tyr 235 Leu Ala His Phe Phe 240
Gly Pro Gly Ala Ala 245 Arg Arg Phe Leu Thr 250 Thr Gly Gin Asn Glu 255 Leu
Ala Ala Thr His 260 Phe Pro Lys Glu Ala 265 Gin Ala Asn Pro Ser 270 lie Phe
Tyr Asn Lys Asp Gly Ser Pro 275 Met Asp Gly Lys Val Ala Ala 290 295 <210> 55 <211> 200 <212> PRT <213> неизвестно <220> <223> Аскафин 5-STM0016 <400> 55 Lys 280 His Thr Arg He Lys Gin Glu Val 285 Tyr Asn Leu
Gly 1 He Lys Asp Trp 5 He Lys Gly Ala Ala 10 Lys Lys Leu lie Lys 15 Thr
Val Ala Ser His 20 He Ala Asn Gin Asn 25 Pro He He Asp Gly 30 He He
Ala Leu Glu 35 Gly Gly Tyr Val Phe 40 Asn Pro Lys Asp Lys 45 Gly Gly Ala
Thr His 50 Trp Gly He Thr Glu 55 Ala Thr Ala Arg Ala 60 His Gly Tyr Ala
Gly 65 Asp Met Arg Asp Leu 70 Thr His Ala Glu Ala 75 Tyr Ala He Leu Glu 80
Glu Asp Tyr Trp lie 85 Lys Pro Gly Phe Asp 90 Val lie Ser Thr Leu 95 Ser
Trp Pro Val Ser 100 Phe Glu Leu Cys Asp 105 Ala Ala Val Asn He 110 Gly Ala
Tyr His Pro 115 Ser Ala Trp Leu Gin 120 Arg Trp Leu Asn Val 125 Phe Asn His
Glu Gly 130 Lys Arg Tyr Pro Asp 135 lie His Val Asp Gly 140 Asn lie Gly Pro
Arg 145 Thr Leu Ala Ala Leu 150 Glu His Tyr Leu Ala 155 Trp Arg Gly Gin Glu 160
Gly Glu Ala Val Leu 165 Val Lys Ala Leu Asn 170 Cys Ser Gin Gly Thr 175 Tyr
Tyr Leu Gly Trp <210> <211> <212> <213> <220> <223> : <400> Asn Val Ala Glu Lys 180 He Lys Asn Arg Val 195 56 198 PRT неизвестно Нигр оцин2-STM0 016 56 Asn Thr 200 His 185 Asn Asn Glu Gin Phe 190 He Tyr
Gly 1 Leu Leu Ser Lys 5 Val Leu Gly Val Gly 10 Lys Lys Val Leu Cys 15 Gly
Val Ser Gly Leu 20 Val Cys Asn Pro He 25 He Asp Gly He He 30 Ala Leu
Glu Gly Gly 35 Tyr Val Phe Asn Pro 40 Lys Asp Lys Gly Gly 45 Ala Thr His
- 48 037202
Trp Gly He Thr Glu Ala Thr 55 Ala Arg Ala His Gly Tyr Ala Gly Asp
50 60
Met Arg Asp 65 Leu Thr His 70 Ala Glu Ala Tyr Ala lie Leu Glu Glu Asp 75 80
Tyr Trp lie Lys Pro 85 Gly Phe Asp Val lie 90 Ser Thr Leu Ser Trp Pro 95
Val Ser Phe Glu 100 Leu Cys Asp Ala Ala 105 Val Asn lie Gly Ala Tyr His 110
Pro Ser Ala 115 Trp Leu Gin Arg Trp 120 Leu Asn Val Phe Asn His Glu Gly 125
Lys Arg Tyr 130 Pro Asp He His 135 Val Asp Gly Asn lie Gly Pro Arg Thr 140
Leu Ala Ala 145 Leu Glu His 150 Tyr Leu Ala Trp Arg Gly Gin Glu Gly Glu 155 160
Ala Val Leu Val Lys 165 Ala Leu Asn Cys Ser 170 Gin Gly Thr Tyr Tyr Leu 175
Asn Val Ala Glu Lys Asn 180 He Lys Asn Arg Val Thr 195 <210> 57 <211> 205 <212> PRT <213> неизвестно <220 <223> SMAP-29-STM0016 His Asn Asn 185 Glu Gin Phe lie Tyr Gly Trp 190
<400> 57
Arg Gly Leu 1 Arg Arg 5 Leu Gly Arg Lys He 10 Ala His Gly Val Lys Lys 15
Tyr Gly Pro Thr 20 Val Leu Arg He He 25 Arg lie Ala Gly Asn Pro lie 30
lie Asp Gly 35 He lie Ala Leu Glu 40 Gly Gly Tyr Val Phe Asn Pro Lys 45
Asp Lys Gly 50 Gly Ala Thr His 55 Trp Gly lie Thr Glu Ala Thr Ala Arg 60
Ala His Gly 65 Tyr Ala Gly 70 Asp Met Arg Asp Leu Thr His Ala Glu Ala 75 80
Tyr Ala lie Leu Glu 85 Glu Asp Tyr Trp lie 90 Lys Pro Gly Phe Asp Val 95
He Ser Thr Leu 100 Ser Trp Pro Val Ser 105 Phe Glu Leu Cys Asp Ala Ala 110
Val Asn lie 115 Gly Ala Tyr His Pro 120 Ser Ala Trp Leu Gin Arg Trp Leu 125
Asn Val Phe 130 Asn His Glu Gly 135 Lys Arg Tyr Pro Asp lie His Val Asp 140
Gly Asn lie 145 Gly Pro Arg 150 Thr Leu Ala Ala Leu Glu His Tyr Leu Ala 155 160
Trp Arg Gly Gin Glu 165 Gly Glu Ala Val Leu 170 Val Lys Ala Leu Asn Cys 175
Ser Gin Gly Thr 180 Tyr Tyr Leu Asn Val 185 Ala Glu Lys Asn His Asn Asn 190
Glu Gin Phe 195 lie Tyr Gly Trp lie 200 Lys Asn Arg Val Thr 205
<210> 58 <211> 215 <212> PRT <213> неизвестно <220>
<223> Саркотоксин IA-STM0016 <400> 58
Gly Trp Leu Lys Lys He Gly Lys Lys 1 5
He Glu Arg Val Gly Gin His
15
- 49 037202
Thr Arg Asp Ala 20 Thr He Gin Gly Leu 25 Gly He Ala Gin Gin 30 Ala Ala
Asn Vai Ala 35 Ala Thr Ala Arg Asn 40 Pro He He Asp Gly 45 He He Ala
Leu Glu 50 Gly Gly Tyr Val Phe 55 Asn Pro Lys Asp Lys 60 Gly Gly Ala Thr
His 65 Trp Gly He Thr Glu 70 Ala Thr Ala Arg Ala 75 His Gly Tyr Ala Gly 80
Asp Met Arg Asp Leu 85 Thr His Ala Glu Ala 90 Tyr Ala He Leu Glu 95 Glu
Asp Tyr Trp He 100 Lys Pro Gly Phe Asp 105 Val He Ser Thr Leu 110 Ser Trp
Pro Vai Ser 115 Phe Glu Leu Cys Asp 120 Ala Ala Val Asn He 125 Gly Ala Tyr
His Pro 130 Ser Ala Trp Leu Gin 135 Arg Trp Leu Asn Val 140 Phe Asn His Glu
Gly 145 Lys Arg Tyr Pro Asp 150 He His Val Asp Gly 155 Asn He Gly Pro Arg 160
Thr Leu Ala Ala Leu 165 Glu His Tyr Leu Ala 170 Trp Arg Gly Gin Glu 175 Gly
Glu Ala Vai Leu 180 Vai Lys Ala Leu Asn 185 Cys Ser Gin Gly Thr 190 Tyr Tyr
Leu Asn Vai Ala Glu Lys 195 Trp He Lys Asn Arg Vai 210 <210> 59 <211> 233 <212> PRT <213> неизвестно <220> <223> Мелитин-Ы4др61 <400> 59 Asn Thr 215 His 200 Asn Asn Glu Gin Phe 205 He Tyr Gly
Gly 1 He Gly Ala Val 5 Leu Lys Val Leu Thr 10 Thr Gly Leu Pro Ala 15 Leu
He Ser Trp He 20 Lys Arg Lys Arg Gin 25 Gin Ala He Ser Lys 30 Lys Lys
Vai Gly Gly 35 Vai Gly Gly Val He 40 Ala Ala He He Ala 45 Ala Val Phe
Ala Vai 50 Glu Gly Gly Tyr Val 55 Asn Asp Pro Lys Asp 60 Pro Gly Gly Glu
Thr 65 Asn His Gly Val Thr 70 He Gin Val Ala Gin 75 Lys His Lys Gin Glu 80
Leu Glu Ser Met Tyr 85 Asn Trp Asp Gly Ser 90 Met Lys Asn Leu Thr 95 Gin
Glu Met Ala Ser 100 Ser He Tyr Tyr Asn 105 Asp Tyr He Leu Lys 110 Pro Gly
Phe Vai Lys 115 Phe Ala Asp Val Ser 120 Pro Ala Val Thr Glu 125 Lys Leu Val
Asp Ala 130 Gly Vai Asn Thr Gly 135 Pro Ala Arg Pro Ser 140 Arg Trp Leu Gin
Glu 145 Ser Leu Asn Ala Phe 150 Ser Arg Asn Gly Lys 155 Asp Tyr Pro Lys He 160
Gin Vai Asp Gly Lys 165 Val Gly Ser Gly Thr 170 Leu Ser Ala Tyr Lys 175 Ser
Leu Gin Asn Lys 180 Arg Gly Lys Val Glu 185 Ala Cys Lys Leu He 190 Leu Lys
Ser Leu Asp 195 Gly Lys Gin Leu Asn 200 Tyr Tyr Leu Ser Leu 205 Asn Met Pro
Glu Tyr Thr Thr Gly Trp He Ala Asn Arg He Gly Asn Val Pro Leu
210 215 220
Glu Arg Cys Asn Glu Asp lie Val Asn
225 230 <210> 60 <211> 236 <212> PRT <213> неизвестно <220>
<223> SMAP-29-N4gp61 <400> 60
Arg Gly Leu Arg Arg Leu Gly Arg Lys lie Ala His Gly Val Lys Lys
1015
Tyr Gly Pro Thr Val Leu Arg lie lie Arg lie Ala Gly Ala lie Ser
2530
Lys Lys Lys Val Gly Gly Val Gly Gly Val lie Ala Ala lie lie Ala 35 4045
Ala Val Phe Ala Val Glu Gly Gly Tyr Val Asn Asp Pro Lys Asp Pro
5560
Gly Gly Glu Thr Asn His Gly Val Thr lie Gln Val Ala Gln Lys His 65 70 7580
Lys Gln Glu Leu Glu Ser Met Tyr Asn Trp Asp Gly Ser Met Lys Asn 85 9095
Leu Thr Gln Glu Met Ala Ser Ser lie Tyr Tyr Asn Asp Tyr lie Leu
100 105110
Lys Pro Gly Phe Val Lys Phe Ala Asp Val Ser Pro Ala Val Thr Glu
115 120125
Lys Leu Val Asp Ala Gly Val Asn Thr Gly Pro Ala Arg Pro Ser Arg
130 135140
Trp Leu Gln Glu Ser Leu Asn Ala Phe Ser Arg Asn Gly Lys Asp Tyr
145 150 155160
Pro Lys lie Gln Val Asp Gly Lys Val Gly Ser Gly Thr Leu Ser Ala
165 170175
Tyr Lys Ser Leu Gln Asn Lys Arg Gly Lys Val Glu Ala Cys Lys Leu
180 185190 lie Leu Lys Ser Leu Asp Gly Lys Gln Leu Asn Tyr Tyr Leu Ser Leu
195 200205
Asn Met Pro Glu Tyr Thr Thr Gly Trp lie Ala Asn Arg lie Gly Asn
210 215220
Val Pro Leu Glu Arg Cys Asn Glu Asp lie Val Asn
225 230235 <210> 61 <211> 210 <212> PRT <213> неизвестно <220>
<223> мелитин-Ы4др61Ргипс <400> 61
Gly lie Gly Ala Val Leu Lys Val Leu Thr Thr Gly Leu Pro Ala Leu 15 1015 lie Ser Trp lie Lys Arg Lys Arg Gln Gln Val Glu Gly Gly Tyr Val 20 2530
Asn Asp Pro Lys Asp Pro Gly Gly Glu Thr Asn His Gly Val Thr lie 35 4045
Gln Val Ala Gln Lys His Lys Gln Glu Leu Glu Ser Met Tyr Asn Trp 50 5560
Asp Gly Ser Met Lys Asn Leu Thr Gln Glu Met Ala Ser Ser lie Tyr 65 70 7580
Tyr Asn Asp Tyr lie Leu Lys Pro Gly Phe Val Lys Phe Ala Asp Val 85 9095
Ser Pro Ala Val Thr Glu Lys Leu Val Asp Ala Gly Val Asn Thr Gly
100 105110
Pro Ala Arg Pro Ser Arg Trp Leu Gln Glu Ser Leu Asn Ala Phe Ser
- 51 037202
115 120125
Arg Asn Gly Lys Asp Tyr Pro Lys He Gin Val Asp Gly Lys Val Gly
130 135140
Ser Gly Thr Leu Ser Ala Tyr Lys Ser Leu Gin Asn Lys Arg Gly Lys
145 150 155160
Val Glu Ala Cys Lys Leu He Leu Lys Ser Leu Asp Gly Lys Gin Leu
165 170175
Asn Tyr Tyr Leu Ser Leu Asn Met Pro Glu Tyr Thr Thr Gly Trp He 180 185190
Ala Asn Arg He Gly Asn Val Pro Leu Glu Arg Cys Asn Glu Asp He
195 200205
Val Asn
210 <210>62 <211> 215 <212> PET <213> неизвестно <220>
<223> цекропин Pl-M4gp61trunc <400> 62
Ser 1 Trp Leu Ser Lys 5 Thr Ala Lys Lys Leu 10 Glu Asn Ser Ala Lys Lys
15
Arg lie Ser Glu 20 Gly lie Ala lie Ala 25 He Gin Gly Gly Pro Arg Val 30
Glu Gly Gly 35 Tyr Val Asn Asp Pro 40 Lys Asp Pro Gly Gly Glu Thr Asn 45
His Gly 50 Val Thr He Gin Val 55 Ala Gin Lys His Lys 60 Gin Glu Leu Glu
Ser 65 Met Tyr Asn Trp Asp 70 Gly Ser Met Lys Asn 75 Leu Thr Gin Glu Met 80
Ala Ser Ser He Tyr 85 Tyr Asn Asp Tyr He 90 Leu Lys Pro Gly Phe Val 95
Lys Phe Ala Asp 100 Val Ser Pro Ala Val 105 Thr Glu Lys Leu Val Asp Ala 110
Gly Val Asn 115 Thr Gly Pro Ala Arg 120 Pro Ser Arg Trp Leu Gin Glu Ser 125
Leu Asn 130 Ala Phe Ser Arg Asn 135 Gly Lys Asp Tyr Pro 140 Lys lie Gin Val
Asp 145 Gly Lys Val Gly Ser 150 Gly Thr Leu Ser Ala 155 Tyr Lys Ser Leu Gin 160
Asn Lys Arg Gly Lys 165 Val Glu Ala Cys Lys 170 Leu lie Leu Lys Ser Leu 175
Asp Gly Lys Gin 180 Leu Asn Tyr Tyr Leu 185 Ser Leu Asn Met Pro Glu Tyr 190
Thr Cys Thr Asn 210 Gly 195 Glu Trp Asp lie lie Ala Val Asn Asn 215 Arg 200 lie Gly Asn Val Pro Leu Glu Arg 205
<210> 63 <211> 213 <212> PRT <213> неизвестно <220>
<223> SMAP-29-N4gp61trunc <400> 63
Arg 1 Gly Leu Arg Arg 5 Leu Gly Arg Lys lie 10 Ala His Gly Val Lys 15 Lys
Tyr Gly Pro Thr Val Leu Arg lie lie Arg lie Ala Gly Val Glu Gly
20 25 30
Gly Tyr Val Asn Asp Pro Lys Asp Pro Gly Gly Glu Thr Asn His Gly
35 40 45
Val Thr lie Gin Val Ala Gin Lys His Lys Gin Glu Leu Glu Ser Met
5560
Tyr Asn Trp Asp Gly Ser Met Lys Asn Leu Thr Gin Glu Met Ala Ser 65 70 7580
Ser He Tyr Tyr Asn Asp Tyr lie Leu Lys Pro Gly Phe Val Lys Phe
9095
Ala Asp Val Ser Pro Ala Val Thr Glu Lys Leu Val Asp Ala Gly Val
100 105110
Asn Thr Gly Pro Ala Arg Pro Ser Arg Trp Leu Gin Glu Ser Leu Asn
115 120125
Ala Phe Ser Arg Asn Gly Lys Asp Tyr Pro Lys He Gin Val Asp Gly
130 135140
Lys Val Gly Ser Gly Thr Leu Ser Ala Tyr Lys Ser Leu Gin Asn Lys
145 150 155160
Arg Gly Lys Val Glu Ala Cys Lys Leu lie Leu Lys Ser Leu Asp Gly
165 170175
Lys Gin Leu Asn Tyr Tyr Leu Ser Leu Asn Met Pro Glu Tyr Thr Thr
180 185190
Gly Trp lie Ala Asn Arg lie Gly Asn Val Pro Leu Glu Arg Cys Asn
195 200 205
Glu Asp He Val Asn 210 <210> 64 <211> 777 <212> DNA <213> неизвестно <220> <223> KZ144 <400> 64 aaagtattac gcaaaggcga taggggtgat gaggtatgtc aactccagac actcttaaat 60
ttatgtggct atgatgttgg aaagccagat ggtatttttg gaaataacac ctttaatcag 120
gtagttaaat ttcaaaaaga taattgtcta gatagtgatg gtattgtagg taagaatact 180
tgggctgaat tattcagtaa atattctcca cctattcctt ataaaactat ccctatgcca 240
actgcaaata aatcacgtgc agctgcaact ccagttatga atgcagtaga aaatgctact 300
ggcgttcgta gccagttgct actaacattt gcttctattg aatcagcatt cgattacgaa 360
ataaaagcta agacttcatc agctactggt tggttccaat tccttactgg aacatggaaa 420
acaatgattg aaaattatgg catgaagtat ggcgtactta ctgatccaac tggggcatta 480
cgtaaagatc cacgtataag tgctttaatg ggtgccgaac taattaaaga gaatatgaat 540
attcttcgtc ctgtccttaa acgtgaacca actgatactg atctttattt agctcacttc 600
tttgggcctg gtgcagcccg tcgtttcctg accactggcc agaatgaatt agctgctacc 660
catttcccaa aagaagctca ggcaaaccca tctatttttt ataacaaaga tgggtcacct 720
aaaaccattc aagaagttta taacttaatg gatggtaaag ttgcagcaca tagaaaa 777
<210> 65 <211> 528 <212> DNA <213> неизвестно <220> <223> STM0016 <400> 65 aacccgatta tcgatggcat tatcgcgctg gaaggaggtt acgtctttaa tccgaaagat 60
aagggtggag caacacattg gggtattaca gaagcgacgg cacgagcaca tggttatgca 120
ggagacatgc gtgatctaac tcatgccgaa gcctacgcaa tacttgagga ggattactgg 180
atcaaaccgg gttttgatgt tatctcaacg ctgtcgtggc ctgtgagctt tgaattgtgt 240
gatgcagcgg ttaacatagg tgcataccac cctagtgcct ggttacagag atggcttaac 300
gtgttcaatc acgaaggcaa acgctatcca gacattcatg tagacggcaa cattggtccc 360
aggactttag cagccttaga acattacttg gcttggagag ggcaagaagg tgaagctgta 420
ctggtgaaag ctctgaattg cagccaaggg acctactatc taaacgtcgc tgagaagaac 480
cacaacaacg aacagttcat ctacggttgg atcaagaatc gtgtgacc 528
<210> 66 <211> 528 <212> DNA <213> неизвестно <220>
<223> Псеудин 1 <400> 66
aacccgatta tcgatggcat tatcgcgctg gaaggaggtt acgtctttaa tccgaaagat 60
aagggtggag caacacattg gggtattaca gaagcgacgg cacgagcaca tggttatgca 120
ggagacatgc gtgatctaac tcatgccgaa gcctacgcaa tacttgagga ggattactgg 180
atcaaaccgg gttttgatgt tatctcaacg ctgtcgtggc ctgtgagctt tgaattgtgt 240
gatgcagcgg ttaacatagg tgcataccac cctagtgcct ggttacagag atggcttaac 300
gtgttcaatc acgaaggcaa acgctatcca gacattcatg tagacggcaa cattggtccc 360
aggactttag cagccttaga acattacttg gcttggagag ggcaagaagg tgaagctgta 420
ctggtgaaag ctctgaattg cagccaaggg acctactatc taaacgtcgc tgagaagaac 480
cacaacaacg aacagttcat ctacggttgg atcaagaatc gtgtgacc 528
DNA неизвестно
Раналексин <400>
ttcctgggcg gtctgattgt tccagctatg atctgtgcgg tgaccaaaaa atgc 54
102
DNA unknown
Sushi 1 <400>
ggcttcaaac tgaaaggtat ggctcgtatc tcctgtctgc caaacggtca gtggtctaac 60 tttccaccga aatgcatccg tgaatgcgcg atggttagct ct 102
DNA неизвестно
WLBU2-Вариант <400>
aaacgctggg ttaaacgcgt gaaacgtgtc aaacgttggg tcaaacgtgt tgtccgtgta 60 gtgaaacgtt gggtgaaacg c 81
DNA неизвестно
Мелитин <220>
<223>
<400>
ggtatcggtg ctgtgctgaa agttctgacc actggtctgc cggcactgat ttcttggatc 60 aaacgcaaac gtcagcag 78
DNA неизвестно s MAP-2 9 <210>
<211>
<212>
<213>
<220>
<223>
<400>
cgtggtctgc gtcgcctggg tcgcaaaatt gcgcacggcg tcaaaaaata cggcccgacc 60 gtgctgcgca ttatccgcat cgctggt 87
DNA неизвестно
Плеуроцидин <400>
ggctggggtt ctttctttaa aaaagcggct cacgttggca aacatgtagg taaagcagct 60 ctgacccact atctg 75
108
DNA неизвестно
Цекропин A (A. aegypti)
<400>
ggcggcctga aaaaactggg caaaaaactg gaaggtgccg gcaaacgtgt gttcaacgct 60 gcagaaaaag cactgccggt tgtagctggt gctaaagctc tccgtaaa 108
120 DNA
- 54 037202 <213> неизвестно <220>
<223> Цекропин A (D. melanogaster) <400> 74 ggctggctga aaaaaattgg caaaaaaatc gaacgcgtgg gccagcacac gcgtgatgca 60 accatccagg gtctgggtat cccacagcag gcagctaacg tagccgcgac tgctcgtggt 120 <210> 75 <211> 63 <212> DNA <213> неизвестно <220>
<223> Буфорин II <400> 75 acccgtagct ctcgtgctgg cctgcagttt ccggttggtc gcgtgcaccg tctgctccgc 60 aaa 63 <210> 76 <211> 117 <212> DNA <213> неизвестно <220>
<223> Сакротоксин IA <400> 76 ggatggctca aaaagattgg caagaaaatc gagcgagtcg gtcagcatac gcgtgatgca 60 actatccagg gtttaggtat cgcacagcaa gcagctaatg tagcagctac tgctcgg 117 <210> 77 <211> 294 <212> PRT <213> неизвестно <220>
<223> Псеудин 1-KZ144 <400> 77
Met 1 Gly Leu Asn Thr Leu Lys 5 Lys Val Phe Gin Gly Leu His Glu Ala
10 15
He Gly Lys : Asp ι Leu lie Asn Asn His 20 <\.гд Gly Asp Glu Val 35 Val Cys Gin 25 Gin 40 Gly Leu Ser Lys Val Leu Arg Lys 30 Gin Thr Leu Leu Asn Leu 45
Cys Gly 50 Tyr Asp Val Gly Lys 55 Pro Asp Gly He Phe 60 Gly Asn Asn Thr
Phe 65 Asn Gin Val Val Lys 70 Phe Gin Lys Asp Asn 75 Cys Leu Asp Ser Asp 80
Gly He Val Gly Lys 85 Asn Thr Trp Ala Glu 90 Leu Phe Ser Lys Tyr 95 Ser
Pro Pro He Pro 100 Tyr Lys Thr He Pro 105 Met Pro Thr Ala Asn 110 Lys Ser
Arg Ala Ala 115 Ala Thr Pro Val Met 120 Asn Ala Val Glu Asn 125 Ala Thr Gly
Val Arg 130 Ser Gin Leu Leu Leu 135 Thr Phe Ala Ser He 140 Glu Ser Ala Phe
Asp 145 Tyr G1U He Lys Ala 150 Lys Thr Ser Ser Ala 155 Thr Gly Trp Phe Gin 160
Phe Leu Thr Gly Thr 165 Trp Lys Thr Met He 170 Glu Asn Tyr Gly Met 175 Lys
Tyr Gly Val Leu 180 Thr Asp Pro Thr Gly 185 Ala Leu Arg Lys Asp 190 Pro Arg
He Ser 195 Leu Met Gly Ala Glu 200 Leu He Lys Glu Asn 205 Met Asn He
Leu Arg 210 Pro Val Leu Lys Arg 215 Glu Pro Thr Asp Thr 220 Asp Leu Tyr Leu
Ala 225 His Phe Phe Gly Pro 230 Gly Ala Ala Arg Arg 235 Phe Leu Thr Thr Gly 240
Gin Asn Glu Leu Ala 245 Ala Thr His Phe Pro 250 Lys Glu Ala Gin Ala 255 Asn
Pro Ser He Phe 260 Tyr Asn Lys Asp Gly 265 Ser Pro Lys Thr He 270 Gin Glu
- 55 037202
Val Tyr Asn 275 Leu Met Asp Gly Lys 280 Val Ala Ala His Arg 285 Lys Leu Glu
His His 290 <210> <211> <212> <213> <220> <223> <400> His His His His 78 288 PRT неизвестно Раналексин-Кг144 78
Met 1 Phe Leu Gly Gly 5 Leu He Val Pro Ala 10 Met He Cys Ala Val 15 Thr
Lys Lys Cys Gly 20 Ser Lys Val Leu Arg 25 Lys Gly Asp Arg Gly 30 Asp Glu
Val Cys Gin 35 Leu Gin Thr Leu Leu 40 Asn Leu Cys Gly Tyr 45 Asp Val Gly
Lys Pro 50 Asp Gly He Phe Gly 55 Asn Asn Thr Phe Asn 60 Gin Val Val Lys
Phe 65 Gin Lys Asp Asn Cys 70 Leu Asp Ser Asp Gly 75 He Val Gly Lys Asn 80
Thr Trp Ala Glu Leu 85 Phe Ser Lys Tyr Ser 90 Pro Pro He Pro Tyr 95 Lys
Thr He Pro Met 100 Pro Thr Ala Asn Lys 105 Ser Arg Ala Ala Ala 110 Thr Pro
Val Met Asn 115 Ala Val Glu Asn Ala 120 Thr Gly Val Arg Ser 125 Gin Leu Leu
Leu Thr 130 Phe Ala Ser He Glu 135 Ser Ala Phe Asp Tyr 140 Glu He Lys Ala
Lys 145 Thr Ser Ser Ala Thr 150 Gly Trp Phe Gin Phe 155 Leu Thr Gly Thr Trp 160
Lys Thr Met He Glu 165 Asn Tyr Gly Met Lys 170 Tyr Gly Val Leu Thr 175 Asp
Pro Thr Gly Ala 180 Leu Arg Lys Asp Pro 185 Arg He Ser Ala Leu 190 Met Gly
Ala Glu Leu 195 He Lys Glu Asn Met 200 Asn He Leu Arg Pro 205 Val Leu Lys
Arg Glu 210 Pro Thr Asp Thr Asp 215 Leu Tyr Leu Ala His 220 Phe Phe Gly Pro
Gly 225 Ala Ala Arg Arg Phe 230 Leu Thr Thr Gly Gin 235 Asn Glu Leu Ala Ala 240
Thr His Phe Pro Lys 245 Glu Ala Gin Ala Asn 250 Pro Ser He Phe Tyr 255 Asn
Ly$ Asp Gly Ser 260 Pro Lys Thr He Gin 265 Glu Val Tyr Asn Leu 270 Met Asp
Gly Lys Val Ala Ala 275 <210> 79 <211> 306 <212> PRT <213> неизвестно <220> <223> Sushil-KZ144 <400> 79 His Arg Lys 280 Leu Glu His His His 285 His His His
Ala 1 Met Gly Gly Phe 5 Lys Leu Lys Gly Met 10 Ala Arg He Ser Cys 15 Leu
Pro Asn Gly Gin 20 Trp Ser Asn Phe Pro 25 Pro Lys Cys He Arg 30 Glu Cys
Ala Met Val 35 Ser Ser Gly Ser Lys 40 Val Leu Arg Lys Gly 45 Asp Arg Gly
Asp Glu 50 Val Cys Gin Leu Gin 55 Thr Leu Leu Asn Leu 60 Cys Gly Tyr Asp
- 56 037202
Val Gly Lys Pro Asp Gly He Phe 65 70
Gly Asn Asn Thr Phe Asn Gin Val 75 80
Val Lys Phe Gin Lys Asp Asn Cys
Leu Asp Ser Asp Gly lie Val Gly
95
Lys Asn Thr Trp Ala Glu Leu Phe
100
Ser Lys Tyr Ser Pro Pro lie Pro
105 110
Tyr Lys Thr lie Pro Met Pro Thr
115 120
Ala Asn Lys Ser Arg Ala Ala Ala
125
Thr Pro Val Met Asn Ala Val Glu
130 135
Asn Ala Thr Gly Val Arg Ser Gin
140
Leu Leu Leu Thr Phe Ala Ser lie
145 150
Glu Ser Ala Phe Asp Tyr Glu lie
155 160
Lys Ala Lys Thr Ser Ser Ala Thr
165
Gly Trp Phe Gin Phe Leu Thr Gly
170 175
Thr Trp Lys Thr Met lie Glu Asn
180
Tyr Gly Met Lys Tyr Gly Val Leu
185 190
Thr Asp Pro Thr Gly Ala Leu Arg
195 200
Lys Asp Pro Arg lie Ser Ala Leu
205
Met Gly Ala Glu Leu lie Lys Glu
210 215
Asn Met Asn lie Leu Arg Pro Val
220
Leu Lys Arg Glu Pro Thr Asp Thr
225 230
Asp Leu Tyr Leu Ala His Phe Phe
235 240
Gly Pro Gly Ala Ala Arg Arg Phe
245
Leu Thr Thr Gly Gin Asn Glu Leu
250 255
Ala Ala Thr His Phe Pro Lys Glu
260
Ala Gin Ala Asn Pro Ser lie Phe
265 270
Tyr Asn Lys Asp Gly Ser Pro Lys
275 280
Met Asp Gly Lys Val Ala Ala His
290 295
His His
305
Thr lie Gin Glu Val Tyr Asn Leu
285
Arg Lys Leu Glu His His His His
300 <210> 80 <211> 297 <212> PRT <213> неизвестно <220>
<223> WLBU2-BapMaHT-KZ144 <400> 80
Met Lys Arg Trp Val Lys Arg Val 1 5
Lys Arg Val Lys Arg Trp Val Lys
15
Arg Val Val Arg Val Val Lys Arg 20
Trp Val Lys Arg Gly Ser Lys Val 25 30
Leu Arg Lys Gly Asp Arg Gly Asp
40
Glu Val Cys Gin Leu Gin Thr Leu
Leu Asn Leu Cys Gly Tyr Asp Val
55
Gly Lys Pro Asp Gly lie Phe Gly 60
Asn Asn Thr Phe Asn Gin Val Val
70
Lys Phe Gin Lys Asp Asn Cys Leu
80
Asp Ser Asp Gly lie Val Gly Lys
Asn Thr Trp Ala Glu Leu Phe Ser
95
Lys Tyr Ser Pro Pro lie Pro Tyr
100
Lys Thr lie Pro Met Pro Thr Ala
105 110
Asn Lys Ser Arg Ala Ala Ala Thr
115 120
Pro Val Met Asn Ala Val Glu Asn
125
Ala Thr Gly Val Arg Ser Gin Leu
130 135
Leu Leu Thr Phe Ala Ser lie Glu
140
Ser Ala Phe Asp Tyr Glu lie Lys
145 150
Ala Lys Thr Ser Ser Ala Thr Gly
155 160
Trp Phe Gin Phe Leu Thr Gly Thr
Trp Lys Thr Met lie Glu Asn Tyr
Tyr Asp Val
Leu Thr G±y Thr
Leu Glu His His His His His His
290 295 <210> 82 <211> 299 <212> PRT <213> неизвестно <220>
<223> SMAP-29-KZ144 <400> 82
Met 1 Arg Gly Leu Arg 5 Arg Leu Gly Arg Lys 10 lie Ala His Gly Val 15 Lys
Lys Tyr Gly Pro 20 Thr Val Leu Arg He 25 He Arg He Ala Gly 30 Gly Ser
Lys Val Leu 35 Arg Lys Gly Asp Arg 40 Gly Asp Glu Val Cys 45 Gin Leu Gin
Thr Leu 50 Leu Asn Leu Cys Gly 55 Tyr Asp Val Gly Lys 60 Pro Asp Gly He
Phe 65 Gly Asn Asn Thr Phe 70 Asn Gin Val Val Lys 75 Phe Gin Lys Asp Asn 80
Cys Leu Asp Ser Asp 85 Gly He Val Gly Lys 90 Asn Thr Trp Ala Glu 95 Leu
Phe Ser Lys Tyr 1O0 Ser Pro Pro He Pro 105 Tyr Lys Thr He Pro 110 Met Pro
Thr Ala Asn 115 Lys Ser Arg Ala Ala 120 Ala Thr Pro Val Met 125 Asn Ala Val
Glu Asn 130 Ala Thr Gly Val Arg 135 Ser Gin Leu Leu Leu 140 Thr Phe Ala Ser
He 145 Glu Ser Ala Phe Asp 150 Tyr Glu He Lys Ala 155 Lys Thr Ser Ser Ala 160
Thr Gly Trp Phe Gin 165 Phe Leu Thr Gly Thr 170 Trp Lys Thr Met lie 175 Glu
Asn Tyr Gly Met Lys Tyr Gly Val Leu Thr Asp Pro Thr Gly Ala Leu
180 185190
Arg Lys Asp Pro Arg He Ser Ala Leu Met Gly Ala Glu Leu lie Lys
195 200205
Glu Asn Met Asn He Leu Arg Pro Val Leu Lys Arg Glu Pro Thr Asp
210 215220
Thr Asp Leu Tyr Leu Ala His Phe Phe Gly Pro Gly Ala Ala Arg Arg
225 230 235240
Phe Leu Thr Thr Gly Gin Asn Glu Leu Ala Ala Thr His Phe Pro Lys
245 250255
Glu Ala Gin Ala Asn Pro Ser He Phe Tyr Asn Lys Asp Gly Ser Pro
260 265270
Lys Thr lie Gin Glu Val Tyr Asn Leu Met Asp Gly Lys Val Ala Ala
275 280285
His Arg Lys Leu Glu His His His His His His
290295 <210> 83 <211> 306 <212> PRT <213> неизвестно <220>
<223> Цекропин A (A. aegypti)-KZ144 <400> 83
Met 1 Gly Gly Leu Lys 5 Lys Leu Gly Lys Lys 10 Leu Glu Gly Ala Gly 15 Lys
Arg Val Phe Asn 20 Ala Ala Glu Lys Al a 25 Leu Pro Val Val Ala 30 Gly Ala
Lys Ala Leu 35 Arg Lys Gly Ser Lys 40 Val Leu Arg Lys Gly 45 Asp Arg Gly
Asp Glu 50 Val Cys Gin Leu Gin 55 Thr Leu Leu Asn Leu 60 Cys Gly Tyr Asp
- 59 037202
Val Gly Lys Pro Asp Gly lie Phe 65 70
Gly Asn Asn Thr Phe Asn Gln Val
80
Val Lys Phe Gln Lys Asp Asn Cys 85
Leu Asp Ser Asp Gly lie Val Gly
95
Lys Asn Thr Trp Ala Glu Leu Phe
100
Ser Lys Tyr Ser Pro Pro lie Pro
105 110
Tyr Lys Thr lie Pro Met Pro Thr
115 120
Ala Asn Lys Ser Arg Ala Ala Ala
125
Thr Pro Val Met Asn Ala Val Glu
130 135
Asn Ala Thr Gly Val Arg Ser Gln
140
Leu Leu Leu Thr Phe Ala Ser lie
145 150
Glu Ser Ala Phe Asp Tyr Glu lie
155 160
Lys Ala Lys Thr Ser Ser Ala Thr
165
Gly Trp Phe Gln Phe Leu Thr Gly
170 175
Thr Trp Lys Thr Met lie Glu Asn
180
Tyr Gly Met Lys Tyr Gly Val Leu
185 190
Thr Asp Pro Thr Gly Ala Leu Arg
195 200
Lys Asp Pro Arg lie Ser Ala Leu
205
Met Gly Ala Glu Leu lie Lys Glu
210 215
Asn Met Asn lie Leu Arg Pro Val
220
Leu Lys Arg Glu Pro Thr Asp Thr
225 230
Asp Leu Tyr Leu Ala His Phe Phe
235 240
Gly Pro Gly Ala Ala Arg Arg Phe
245
Leu Thr Thr Gly Gln Asn Glu Leu
250 255
Ala Ala Thr His Phe Pro Lys Glu
260
Ala Gln Ala Asn Pro Ser lie Phe
265 270
Tyr Asn Lys Asp Gly Ser Pro Lys
275 280
Thr lie Gln Glu Val Tyr Asn Leu
285
Met Asp Gly Lys Val Ala Ala His
290 295
Arg Lys Leu Glu His His His His
300
His His
305 <210> 84 <211> 295 <212> PRT <213> неизвестно <220>
<223> Плеуроцидин-К2144 <400> 84
Met Gly Trp Gly Ser Phe Phe Lys
5
Lys Ala Ala His Val Gly Lys His
15
Val Gly Lys Ala Ala Leu Thr His
Tyr Leu Gly Ser Lys Val Leu Arg 25 30
Lys Gly Asp Arg Gly Asp Glu Val
40
Cys Gln Leu Gln Thr Leu Leu Asn
Leu Cys Gly Tyr Asp Val Gly Lys
55
Pro Asp Gly lie Phe Gly Asn Asn
Thr Phe Asn Gln Val Val Lys Phe 65 70
Gln Lys Asp Asn Cys Leu Asp Ser
80
Asp Gly lie Val Gly Lys Asn Thr 85
Trp Ala Glu Leu Phe Ser Lys Tyr
95
Ser Pro Pro lie Pro Tyr Lys Thr
100 lie Pro Met Pro Thr Ala Asn Lys
105 110
Ser Arg Ala Ala Ala Thr Pro Val
115 120
Met Asn Ala Val Glu Asn Ala Thr
125
Gly Val Arg Ser Gln Leu Leu Leu
130 135
Thr Phe Ala Ser lie Glu Ser Ala
140
Phe Asp Tyr Glu lie Lys Ala Lys
145 150
Thr Ser Ser Ala Thr Gly Trp Phe
155 160
Gln Phe Leu Thr Gly Thr Trp Lys
Thr Met lie Glu Asn Tyr Gly Met
- 60 037202
165 170 175
Lys Туг Gly Val 180 Leu Thr Asp Pro Thr 185 Gly Ala Leu Arg Lys 190 Asp Pro
Arg Не Ser Ala 195 Leu Met Gly Ala 200 Glu Leu He Lys Glu 205 Asn Met Asn
lie Leu 210 Arg Pro Val Leu Lys 215 Arg Glu Pro Thr Asp 220 Thr Asp Leu Tyr
Leu Ala 225 His Phe Phe Gly 230 Pro Gly Ala Ala Arg 235 Arg Phe Leu Thr Thr 240
Gly Gin Asn Glu Leu 245 Ala Ala Thr His Phe 250 Pro Lys Glu Ala Gin 255 Ala
Asn Pro Ser He 260 Phe Tyr Asn Lys Asp 265 Gly Ser Pro Lys Thr 270 He Gin
Glu Val Tyr Asn Leu Met Asp Gly Lys Val 275 280 Glu His His His His His His 290 295 <210> 85 <211> 310 <212> PRT <213> неизвестно <220> <223> Цекролин A (D.melanogaster)-KZ144 <400> 85 Ala 1 Ala His 285 Arg Lys Leu
Met Gly 1 Trp Leu Lys 5 Lys lie Gly Lys Lys 10 He Glu Arg Val Gly 15 Gin
His Thr Arg Asp 20 Ala Thr He Gin Gly 25 Leu Gly He Pro Gin 30 Gin Ala
Ala Asn Val Ala 35 Ala Thr Ala Arg 40 Gly Gly Ser Lys Val 45 Leu Arg Lys
Gly Asp 50 Arg Gly Asp Glu Val 55 Cys Gin Leu Gin Thr 60 Leu Leu Asn Leu
Cys Gly 65 Tyr Asp Val Gly 70 Lys Pro Asp Gly lie 75 Phe Gly Asn Asn Thr 80
Phe Asn Gin Val Val 85 Lys Phe Gin Lys Asp 90 Asn Cys Leu Asp Ser 95 Asp
Gly He Val Gly 100 Lys Asn Thr Trp Ala 105 Glu Leu Phe Ser Lys 110 Tyr Ser
Pro Pro lie Pro 115 Tyr Lys Thr lie 120 Pro Met Pro Thr Ala 125 Asn Lys Ser
Arg Ala 130 Ala Ala Thr Pro Val 135 Met Asn Ala Val Glu 140 Asn Ala Thr Gly
Val Arg 145 Ser Gin Leu Leu 150 Leu Thr Phe Ala Ser 155 lie Glu Ser Ala Phe 160
Asp Tyr Glu lie Lys 165 Ala Lys Thr Ser Ser 170 Ala Thr Gly Trp Phe 175 Gin
Phe Leu Thr Gly 180 Thr Trp Lys Thr Met 185 lie Glu Asn Tyr Gly 190 Met Lys
Tyr Gly Val Leu 195 Thr Asp Pro Thr 200 Gly Ala Leu Arg Lys 205 Asp Pro Arg
lie Ser 210 Ala Leu Met Gly Ala 215 Glu Leu lie Lys Glu 220 Asn Met Asn lie
Leu Arg 225 Pro Val Leu Lys 230 Arg Glu Pro Thr Asp 235 Thr Asp Leu Tyr Leu 240
Ala His Phe Phe Gly 245 Pro Gly Ala Ala Arg 250 Arg Phe Leu Thr Thr 255 Gly
Gin Asn Glu Leu 260 Ala Ala Thr His Phe 265 Pro Lys Glu Ala Gin 270 Ala Asn
Pro Ser lie Phe 275 Tyr Asn Lys Asp 280 Gly Ser Pro Lys Thr 285 lie Gin Glu
Val Tyr Asn Leu Met Asp
290
Gly Lys Val Ala Ala His Arg Lys Leu Glu 295 300
His His His His His His
305 310 <210> 86 <211> 291 <212> PRT <213> неизвестно <220>
<223> Буфорин11-К2144 <400> 86
Met 1 Thr Arg Ser Ser Arg 5 Ala Gly Leu Gin 10 Phe Pro Val Gly Arg 15 Val
His Arg Leu Leu 20 Arg Lys Gly Ser Lys 25 Val Leu Arg Lys Gly 30 Asp Arg
Gly Asp Glu 35 Val Cys Gin Leu Gin 40 Thr Leu Leu Asn Leu 45 Cys Gly Tyr
Asp Val 50 Gly Lys Pro Asp Gly 55 He Phe Gly Asn Asn 60 Thr Phe Asn Gin
Val 65 Val Lys Phe Gin Lys 70 Asp Asn Cys Leu Asp 75 Ser Asp Gly He Val 80
Gly Lys Asn Thr Trp 85 Ala Glu Leu Phe Ser 90 Lys Tyr Ser Pro Pro 95 He
Pro Tyr Lys Thr 100 He Pro Met Pro Thr 105 Ala Asn Lys Ser Arg 110 Ala Ala
Ala Thr Pro 115 Val Met Asn Ala Val 120 Glu Asn Ala Thr Gly 125 Val Arg Ser
Gin Leu 130 Leu Leu Thr Phe Ala 135 Ser He Glu Ser Ala 140 Phe Asp Tyr Glu
He 145 Lys Ala Lys Thr Ser 150 Ser Ala Thr Gly Trp 155 Phe Gin Phe Leu Thr 160
Gly Thr Trp Lys Thr 165 Met He Glu Asn Tyr 170 Gly Met Lys Tyr Gly 175 Val
Leu Thr Asp Pro 180 Thr Gly Ala Leu Arg 185 Lys Asp Pro Arg He 190 Ser Ala
Leu Met Gly 195 Ala Glu Leu He Lys 200 Glu Asn Met Asn He 205 Leu Arg Pro
Val Leu 210 Lys Arg Glu Pro Thr 215 Asp Thr Asp Leu Tyr 220 Leu Ala His Phe
Phe 225 Gly Pro Gly Ala Ala 230 Arg Arg Phe Leu Thr 235 Thr Gly Gin Asn Glu 240
Leu Ala Ala Thr His 245 Phe Pro Lys Glu Ala 250 Gin Ala Asn Pro Ser 255 He
Phe Tyr Asn Lys 260 Asp Gly Ser Pro Lys 265 Thr He Gin Glu Val 270 Tyr Asn
Leu Met Asp 275 Gly Lys Val Ala Ala 280 His Arg Lys Leu Glu 285 His His His
His His His
290 <210> 87 <211> 309 <212> PRT <213> неизвестно <220>
<223> Саркотоксин IA-KZ144 <400> 87
Met Gly Trp Leu Lys Lys He 1 5
Gly Lys Lys lie Glu Arg Val Gly Gin
His Thr Arg Asp Ala Thr lie
Gin Gly Leu
Gly lie Ala Gin Gin Ala
Ala Asn Val Ala Ala Thr Ala
Arg Gly Ser 40
Lys Val Leu Arg Lys Gly
- 62 037202
Asp Arg 50 Gly Asp Glu Val Cys 55 Gin Leu Gin Thr Leu 60 Leu Asn Leu Cys
Gly 65 Tyr Asp Val Gly Lys 70 Pro Asp Gly He Phe 75 Gly Asn Asn Thr Phe 80
Asn Gin Val Val Lys 85 Phe Gin Lys Asp Asn 90 Cys Leu Asp Ser Asp 95 Gly
He Val Gly Lys 100 Asn Thr Trp Ala Glu 105 Leu Phe Ser Lys Tyr 110 Ser Pro
Pro He Pro 115 Tyr Lys Thr He Pro 120 Met Pro Thr Ala Asn 125 Lys Ser Arg
Ala Ala 130 Ala Thr Pro Val Met 135 Asn Ala Val Glu Asn 140 Ala Thr Gly Val
Arg 145 Ser Gin Leu Leu Leu 150 Thr Phe Ala Ser He 155 Glu Ser Ala Phe Asp 160
Tyr Glu He Lys Ala 165 Lys Thr Ser Ser Ala 170 Thr Gly Trp Phe Gin 175 Phe
Leu Thr Gly Thr 180 Trp Lys Thr Met He 185 Glu Asn Tyr Gly Met 190 Lys Tyr
Gly Val Leu 195 Thr Asp Pro Thr Gly 200 Ala Leu Arg Lys Asp 205 Pro Arg He
Ser Ala 210 Leu Met Gly Ala Glu 215 Leu He Lys Glu Asn 220 Met Asn He Leu
Arg 225 Pro Val Leu Lys Arg 230 Glu Pro Thr Asp Thr 235 Asp Leu Tyr Leu Ala 240
His Phe Phe Gly Pro 245 Gly Ala Ala Arg Arg 250 Phe Leu Thr Thr Gly 255 Gin
Asn Glu Leu Ala 260 Ala Thr His Phe Pro 265 Lys Glu Ala Gin Ala 270 Asn Pro
Ser He Phe Tyr Asn Lys Asp Gly Ser Pro Lys Thr He Gin Glu Val
275 280 285
Tyr Asn Leu Met Asp Gly Lys Val Ala Ala His Arg Lys Leu Glu His
290 295 300
His His His His His
305 <210> 88 <211> 226 <212> PRT <213> неизвестно <220>
<223> Саркотоксин IA-STM0016 <400> 88
Met 1 Gly Trp Leu Lys 5 Lys He Gly Lys Lys 10 He Glu Arg Val Gly 15 Gin
His Thr Arg Asp 20 Ala Thr He Gin Gly 25 Leu Gly He Ala Gin 30 Gin Ala
Ala Asn Val 35 Ala Ala Thr Ala Arg 40 Gly Ser Asn Pro He 45 He Asp Gly
He He 50 Ala Leu Glu Gly Gly 55 Tyr Val Phe Asn Pro 60 Lys Asp Lys Gly
Gly 65 Ala Thr His Trp Gly 70 He Thr Glu Ala Thr 75 Ala Arg Ala His Gly 80
Tyr Ala Gly Asp Met 85 Arg Asp Leu Thr His 90 Ala Glu Ala Tyr Ala 95 He
Leu Glu Glu Asp 100 Tyr Trp He Lys Pro 105 Gly Phe Asp Val He 110 Ser Thr
Leu Ser Trp 115 Pro Val Ser Phe Glu 120 Leu Cys Asp Ala Ala 125 Val Asn He
Gly Ala 130 Tyr His Pro Ser Ala 135 Trp Leu Gin Arg Trp 140 Leu Asn Val Phe
Asn His Glu Gly Lys Arg Tyr Pro Asp He His Val Asp Gly Asn He
145 150 155160
Gly Pro Arg Thr Leu Ala Ala Leu Glu His Tyr Leu Ala Trp Arg Gly
165 170175
Gin Glu Gly Glu Ala Val Leu Val Lys Ala Leu Asn Cys Ser Gin Gly
180 185190
Thr Tyr Tyr Leu Asn Val Ala Glu Lys Asn His Asn Asn Glu Gin Phe
195 200205
He Tyr Gly Trp He Lys Asn Arg Val Thr Leu Glu His His His His
210 215220
His His
225 <210> 89 <211> 216 <212> PRT <213> неизвестно <220>
<223> SMAP-29-STM0016 <400> 89
Met Arg Gly Leu Arg Arg Leu Gly Arg Lys lie Ala His Gly Val Lys
1015
Lys Tyr Gly Pro Thr Val Leu Arg He He Arg lie Ala Gly Gly Ser 20 2530
Asn Pro He lie Asp Gly He lie Ala Leu Glu Gly Gly Tyr Val Phe
4045
Asn Pro Lys Asp Lys Gly Gly Ala Thr His Trp Gly lie Thr Glu Ala
5560
Thr Ala Arg Ala His Gly Tyr Ala Gly Asp Met Arg Asp Leu Thr His 65 70 7580
Ala Glu Ala Tyr Ala He Leu Glu Glu Asp Tyr Trp He Lys Pro Gly 85 9095
Phe Asp Val lie Ser Thr Leu Ser Trp Pro Val Ser Phe Glu Leu Cys
100 105110
Asp Ala Ala Val Asn He Gly Ala Tyr His Pro Ser Ala Trp Leu Gin
115 120125
Arg Trp Leu Asn Val Phe Asn His Glu Gly Lys Arg Tyr Pro Asp He
130 135140
His Val Asp Gly Asn He Gly Pro Arg Thr Leu Ala Ala Leu Glu His
145 150 155160
Tyr Leu Ala Trp Arg Gly Gin Glu Gly Glu Ala Val Leu Val Lys Ala
165 170175
Leu Asn Cys Ser Gin Gly Thr Tyr Tyr Leu Asn Val Ala Glu Lys Asn
180 185190
His Asn Asn Glu Gin Phe He Tyr Gly Trp He Lys Asn Arg Val Thr
195 200205
Leu Glu His His His His His His
210215 <210> 90 <211> 247 <212> PRT <213> неизвестно <220>
<223> SMAP-29-N4gp61 <400> 90
Met Arg Gly Leu Arg Arg Leu Gly Arg Lys He Ala His Gly Val Lys
1015
Lys Tyr Gly Pro Thr Val Leu Arg He He Arg He Ala Gly Gly Ser
2530
Ala He Ser Lys Lys Lys Val Gly Gly Val Gly Gly Val He Ala Ala 35 4045
He He Ala Ala Val Phe Ala Val Glu Gly Gly Tyr Val Asn Asp Pro
5560
Lys Asp Pro Gly Gly Glu Thr Asn His Gly Val Thr He Gin Val Ala
70 7580
Gin Lys His Lys Gin Glu Leu Glu Ser Met Tyr Asn Trp Asp Gly Ser
9095
Met Lys Asn Leu Thr Gin Glu Met Ala Ser Ser He Tyr Tyr Asn Asp
100 105110
Tyr lie Leu Lys Pro Gly Phe Val Lys Phe Ala Asp Val Ser Pro Ala
115 120125
Val Thr Glu Lys Leu Val Asp Ala Gly Val Asn Thr Gly Pro Ala Arg
130 135140
Pro Ser Arg Trp Leu Gin Glu Ser Leu Asn Ala Phe Ser Arg Asn Gly
145 150 155160
Lys Asp Tyr Pro Lys lie Gin Val Asp Gly Lys Val Gly Ser Gly Thr
165 170175
Leu Ser Ala Tyr Lys Ser Leu Gin Asn Lys Arg Gly Lys Val Glu Ala
180 185190
Cys Lys Leu lie Leu Lys Ser Leu Asp Gly Lys Gin Leu Asn Tyr Tyr
195 200205
Leu Ser Leu Asn Met Pro Glu Tyr Thr Thr Gly Trp He Ala Asn Arg
210 215220 lie Gly Asn Val Pro Leu Glu Arg Cys Asn Glu Asp lie Val Asn Leu
225 230 235240
Glu His His His His His His
245 <210> 91 <211> 624 <212> DNA <213> неизвестно <220>
<223> N4gp61 <400> 91 atggccatct cgaagaaaaa agttggaggt gttggtggag ttattgcggc aatcattgct60 gcagtatttg ccgttgaagg tggatacgtt aatgacccga aagatccagg aggtgaaaca120 aaccatggtg taactattca ggtcgcacaa aaacacaagc aagaacttga gtcgatgtat180 aactgggacg ggtcaatgaa gaatctgaca caggagatgg cctcaagtat atattacaac240 gattatatcc tcaagcctgg ctttgtgaaa tttgcggatg taagtccagc ggttacggaa300 aaacttgtgg atgctggagt aaatacaggt ccagcaagac caagccgttg gttacaagaa360 tccttgaatg ctttctcacg caacggcaaa gattatccga aaatccaagt tgacgggaaa420 gtaggttctg gaactttgag tgcttacaaa agcctgcaga ataagcgagg aaaagtggaa480 gcctgcaaat taatactgaa gtctctggat ggcaagcagc taaactacta tctgagcctc540 aatatgcctg agtataccac aggttggatt gcgaatcgta ttggaaatgt gcctttggaa600 cgctgtaatg aagatatcgt caac624 <210> 92 <211> 13 <212> PRT <213> неизвестно <220>
<223> beta 4 helix <400> 92
Pro Asn Arg Ala Lys Arg Val lie Thr Thr Phe Arg Thr
10 <210> 93 <211> 272 <212> PRT <213> неизвестно <220>
<223> beta 4 helix:KZ144 <400> 93
Pro Asn Arg Ala Lys Arg Val lie Thr Thr Phe Arg Thr Lys Val Leu 15 1015
Arg Lys Gly Asp Arg Gly Asp Glu Val Cys Gin Leu Gin Thr Leu Leu 20 2530
Asn Leu Cys Gly Tyr Asp Val Gly Lys Pro Asp Gly lie Phe Gly Asn
4045
Asn Thr Phe Asn Gin Val Val Lys Phe Gin Lys Asp Asn Cys Leu Asp
Ser Asp Gly lie Val Gly Lys Asn Thr Trp Ala Glu Leu Phe Ser Lys 65 70 7580
Tyr Ser Pro Pro lie Pro Tyr Lys Thr lie Pro Met Pro Thr Ala Asn
9095
Lys Ser Arg Ala Ala Ala Thr Pro Val Met Asn Ala Val Glu Asn Ala
100 105110
Thr Gly Val Arg Ser Gin Leu Leu Leu Thr Phe Ala Ser lie Glu Ser
115 120125
Ala Phe Asp Tyr Glu lie Lys Ala Lys Thr Ser Ser Ala Thr Gly Trp
130 135140
Phe Gin Phe Leu Thr Gly Thr Trp Lys Thr Met lie Glu Asn Tyr Gly
145 150 155160
Met Lys Tyr Gly Val Leu Thr Asp Pro Thr Gly Ala Leu Arg Lys Asp
165 170175
Pro Arg lie Ser Ala Leu Met Gly Ala Glu Leu lie Lys Glu Asn Met
180 185190
Asn lie Leu Arg Pro Val Leu Lys Arg Glu Pro Thr Asp Thr Asp Leu
195 200205
Tyr Leu Ala His Phe Phe Gly Pro Gly Ala Ala Arg Arg Phe Leu Thr
210 215220
Thr Gly Gin Asn Glu Leu Ala Ala Thr His Phe Pro Lys Glu Ala Gin
225 230 235240
Ala Asn Pro Ser lie Phe Tyr Asn Lys Asp Gly Ser Pro Lys Thr lie
245 250255
Gin Glu Val Tyr Asn Leu Met Asp Gly Lys Val Ala Ala His Arg Lys
260 265270 <210> 94 <211> 304 <212> PRT <213> неизвестно <220>
<223> beta 4 helix:gpl88 <400> 94
Pro Asn Arg Ala Lys Arg Val lie Thr Thr Phe Arg Thr Asn Phe Arg 15 1015
Thr Lys Asn Gly Tyr Arg Asp Leu Gin Ala Leu Val Lys Glu Leu Gly 20 2530
Leu Tyr Thr Gly Gin lie Asp Gly Val Trp Gly Lys Gly Thr Ser Ser
4045
Ser Thr Glu Thr Leu Leu Arg Gly Tyr Ala Glu Val Val Gly Lys Asn 50 5560
Thr Gly Gly lie Gly Leu Pro Thr Thr Ser Asp Ala Ser Gly Tyr Asn 65 70 7580
Val lie Thr Ala Leu Gin Arg Asn Leu Ala Phe Leu Gly Leu Tyr Ser
9095
Leu Thr Val Asp Gly lie Trp Gly Asn Gly Thr Leu Ser Gly Leu Asp
100 105110
Lys Ala Phe Glu Val Tyr Lys Glu Arg Tyr Arg Thr Pro Thr Tyr Asp
115 120125 lie Ala Trp Ser Gly Lys Val Ser
130 135
Pro Ala Phe Thr Ala Lys Val Lys
140
Asp Trp Cys Gly Val His Val Pro
145 150
Asn His Arg Ala Pro His Trp Leu
155 160
Met Ala Cys Met Ala Phe Glu Thr
165
Gly Gin Thr Phe Ser Pro Ser lie
170 175
Lys Asn Ala Ala Gly Ser Glu Ala
180
Tyr Gly Leu lie Gin Phe Met Ser 185 190
Pro Ala Ala Asn Asp Leu Asn Val
195 200
Pro Leu Ser Val lie Arg Ser Met
205
- 66 037202
Asp Gin 210 Leu Thr Gin Leu Asp 215 Leu Val Phe Lys Tyr 220 Phe Glu Met Trp
Met 225 Lys Arg Gly Lys Arg 230 Tyr Thr Gin Leu Glu 235 Asp Phe Tyr Leu Thr 240
He Phe His Pro Ala 245 Ser Val Gly Lys Lys 250 Ala Asp Glu Val Leu 255 Phe
Leu Gin Gly Ser 260 Lys Ala Tyr Leu Gin 265 Asn Lys Gly Phe Asp 270 Val Asp
Lys Asp Gly 275 Lys He Thr Leu Gly 280 Glu He Ser Ser Thr 285 Leu Tyr Thr
Thr Tyr Tyr Lys Gly 290 <210> 95 <211> 320 <212> PRT <213> неизвестно <220> <223> SMAP-29:gpl8£ <400> 95 Leu ! Leu 295 Pro Glu Asn Arg His 300 Val lie Ser Tyr
Arg 1 Gly Leu Arg Arg 5 Leu Gly Arg Lys He 10 Ala His Gly Val Lys 15 Lys
Tyr Gly Pro Thr 20 Val Leu Arg lie lie 25 Arg lie Ala Gly Asn 30 Phe Arg
Thr Lys Asn 35 Gly Tyr Arg Asp Leu 40 Gin Ala Leu Val Lys 45 Glu Leu Gly
Leu Tyr 50 Thr Gly Gin He Asp 55 Gly Val Trp Gly Lys 60 Gly Thr Ser Ser
Ser 65 Thr Glu Thr Leu Leu 70 Arg Gly Tyr Ala Glu 75 Val Val Gly Lys Asn 80
Thr Gly Gly He Gly 85 Leu Pro Thr Thr Ser 90 Asp Ala Ser Gly Tyr 95 Asn
Val lie Thr Ala 100 Leu Gin Arg Asn Leu 105 Ala Phe Leu Gly Leu 110 Tyr Ser
Leu Thr Val 115 Asp Gly He Trp Gly 120 Asn Gly Thr Leu Ser 125 Gly Leu Asp
Lys Ala 130 Phe Glu Val Tyr Lys 135 Glu Arg Tyr Arg Thr 140 Pro Thr Tyr Asp
lie 145 Ala Trp Ser Gly Lys 150 Val Ser Pro Ala Phe 155 Thr Ala Lys Val Lys 160
Asp Trp Cys Gly Val 165 His Val Pro Asn His 170 Arg Ala Pro His Trp 175 Leu
Met Ala Cys Met 180 Ala Phe Glu Thr Gly 185 Gin Thr Phe Ser Pro 190 Ser lie
Lys Asn Ala 195 Ala Gly Ser Glu Ala 200 Tyr Gly Leu He Gin 205 Phe Met Ser
Pro Ala 210 Ala Asn Asp Leu Asn 215 Val Pro Leu Ser Val 220 lie Arg Ser Met
Asp 225 Gin Leu Thr Gin Leu 230 Asp Leu Val Phe Lys 235 Tyr Phe Glu Met Trp 240
Met Lys Arg Gly Lys 245 Arg Tyr Thr Gin Leu 250 Glu Asp Phe Tyr Leu 255 Thr
lie Phe His Pro 260 Ala Ser Val Gly Lys 265 Lys Ala Asp Glu Val 270 Leu Phe
Leu Gin Gly 275 Ser Lys Ala Tyr Leu 280 Gin Asn Lys Gly Phe 285 Asp Val Asp
Lys Asp 290 Gly Lys lie Thr Leu 295 Gly Glu lie Ser Ser 300 Thr Leu Tyr Thr
Thr 305 Tyr Tyr Lys Gly Leu 310 Leu Pro Glu Asn Arg 315 His Val He Ser Tyr 320
<210> 96
- 67 037202 <211> 330 <212> PRT <213> неизвестно <220>
<223> Саркотоксин IA:gpl88
<400> < Gly Trp )6 Leu Lys Lys lie Gly Lys Lys lie Glu Arg Val Gly Gln His
1 Thr Arg Asp Ala 5 Thr lie Gln Gly Leu 10 Gly lie Ala Gln Gln 15 Ala Ala
Asn Val Ala 20 Ma Thr Ma Arg Asn 25 Phe Arg Thr Lys Asn 30 Gly Tyr Arg
Asp Leu 35 Gln Ala Leu Val Lys 40 Glu Leu Gly Leu Tyr 45 Thr Gly Gln lie
Asp 50 Gly Val Trp Gly Lys 55 Gly Thr Ser Ser Ser 60 Thr Glu Thr Leu Leu
65 Arg Gly Tyr Ala Glu 70 Val Val Gly Lys Asn 75 Thr Gly Gly He Gly 80 Leu
Pro Thr Thr Ser 85 Asp Ala Ser Gly Tyr 90 Asn Val lie Thr Ala 95 Leu Gln
Arg Asn Leu 100 Ma Phe Leu Gly Leu 105 Tyr Ser Leu Thr Val 110 Asp Gly He
Trp Gly 115 Asn Gly Thr Leu Ser 120 Gly Leu Asp Lys Ala 125 Phe Glu Val Tyr
Lys 130 Glu Arg Tyr Arg Thr 135 Pro Thr Tyr Asp lie 140 Ma Trp Ser Gly Lys
145 Val Ser Pro Ala Phe 150 Thr Ala Lys Val Lys 155 Asp Trp Cys Gly Val 160 His
Val Pro Asn His 165 Arg Ma Pro His Trp 170 Leu Met Ma Cys Met 175 Ma Phe
Glu Thr Gly 180 Gln Thr Phe Ser Pro 185 Ser lie Lys Asn Ala 190 Ala Gly Ser
Glu Ala 195 Tyr Gly Leu He Gln 200 Phe Met Ser Pro Ma 205 Ma Asn Asp Leu
Asn 210 Val Pro Leu Ser Val 215 lie Arg Ser Met Asp 220 Gln Leu Thr Gln Leu
225 Asp Leu Val Phe Lys 230 Tyr Phe Glu Met Trp 235 Met Lys Arg Gly Lys 240 Arg
Tyr Thr Gln Leu 245 Glu Asp Phe Tyr Leu 250 Thr lie Phe His Pro 255 Ala Ser
Val Gly Lys 260 Lys Ma Asp Glu Val 265 Leu Phe Leu Gln Gly 270 Ser Lys Ma
Tyr Leu 275 Gln Asn Lys Gly Phe 280 Asp Val Asp Lys Asp 285 Gly Lys He Thr
Leu 290 Gly Glu lie Ser Ser 295 Thr Leu Tyr Thr Thr 300 Tyr Tyr Lys Gly Leu
305 Leu Pro <210> <211> <212> <213> <220> <223> <400> Arg Gly 310 Glu Asn Arg His Val lie Ser 325 97 209 PRT неизвестно SMAP-29: Salmonella эндолизин 97 Leu Arg Arg Leu Gly Arg Lys Tyr 330 lie 315 Ala His Gly Val Lys 320 Lys
1 Tyr Gly Pro Thr 5 Val Leu Arg lie lie 10 Arg lie Ma Gly Lys 15 Pro Lys
Asp Glu lie 20 Phe Asp Glu lie Leu 25 Gly Lys Glu Gly Gly 30 Tyr Val Asn
His Pro 35 Asp Asp Lys Gly Gly 40 Pro Thr Lys Trp Gly 45 lie Thr Glu Lys
55
Val Ala Arg Ala His Gly Tyr Arg 65 70
Gly Asp Met Arg Asn Leu Thr Arg
80
Gly Gin Ala Leu Glu lie Leu Glu
Thr Asp Tyr Trp Tyr Gly Pro Arg
95
Phe Asp Arg Val Ala Lys Ala Ser
100
Pro Asp Val Ala Ala Glu Leu Cys
105 110
Asp Thr Gly Val Asn Met Gly Pro
115 120
Ser Val Ala Ala Lys Met Leu Gin
125
Arg Trp Leu Asn Val Phe Asn Gin
130 135
Gly Gly Arg Leu Tyr Pro Asp Met
140
Asp Thr Asp Gly Arg lie Gly Pro
145 150
Arg Thr Leu Asn Ala Leu Arg Val
155 160
Tyr Leu Glu Lys Arg Gly Lys Asp
165
Gly Glu Arg Val Leu Leu Val Ala
170 175
Leu Asn Cys Thr Gin Gly Glu Arg
180
Tyr Leu Glu Leu Ala Glu Lys Arg
185 190
Glu Ala Asp Glu Ser Phe Val Tyr
195 200
Gly Trp Met Lys Glu Arg Val Leu
205 lie <210> 98 <211> 303 <212> PRT <213> неизвестно <220>
<223> Псеудин 1:Acinetobacter b <400> 98
Gly Leu Asn Thr Leu Lys Lys Val 1 5 aumannii эндолизин
Phe Gin Gly Leu His Glu Ala lie
15
Lys Leu lie Asn Asn His Val Gin
Glu Tyr Asp Met lie Leu Lys Phe
30
Gly Ser Lys Gly Asp Ala Val Ala
40
Thr Leu Gin Lys Gin Leu Ala Lys
Met Gly Tyr Lys Gly Val Lys Asp
55
Lys Pro Leu Ser Val Asp Gly His 60
Phe Gly Glu Ser Thr Glu Phe Ala
70
Val lie Gin Leu Gin Arg Lys Phe
80
Gly Leu Val Ala Asp Gly Lys Val 85
Gly Asp Lys Thr Arg Gin Ala Leu
95
Ala Gly Asp Ser Val Ser Lys Phe
100
Leu Lys Asp Glu Asp Tyr Lys Lys
105 110
Ala Ala lie Arg Leu Lys Val Pro
115 120
Glu Leu Val lie Arg Val Phe Gly
125
Ala Val Glu Gly Leu Gly Val Gly
130 135
Phe Leu Pro Asn Gly Lys Ala Lys
140 lie Leu Phe Glu Arg His Arg Met
145 150
Tyr Phe Tyr Leu Cys Gin Ala Leu
155 160
Gly Lys Thr Phe Ala Asn Ser Gin
165
Val Lys lie Thr Pro Asn lie Val
170 175
Asn Thr Leu Thr Gly Gly Tyr Lys
180
Gly Asp Ala Ala Glu Tyr Thr Arg
185 190
Leu Ser Met Ala lie Asn lie His
195 200
Lys Glu Ser Ala Leu Met Ser Thr
205
Ser Trp Gly Gin Phe Gin lie Met
210 215
Gly Glu Asn Trp Lys Asp Leu Gly
220
Tyr Ser Ser Val Gin Glu Phe Val
225 230
Asp Gin Gin Gin Leu Asn Glu Gly
235 240
Asn Gin Leu Glu Ala Phe lie Arg
245
Phe lie Glu Trp Lys Pro Gly Leu
250 255
- 69 037202
Leu Glu Ala Leu Arg Lys Gin Asp Trp Asp Thr Val Phe Thr Leu Tyr
260 265270
Asn Gly Lys Asn Tyr Lys Lys Leu Gly Tyr Gin Ala Lys Phe Gin Lys
275 280285
Glu Trp Asp His Leu Glu Pro He Tyr Arg Glu Lys Thr Ala Ala
290 295300 <210> 99 <211> 308 <212> PRT <213> неизвестно <220>
<223> SMAP-29: Acinetobacter baumannii эндолизин <400> 99
Arg Gly Leu Arg Arg Leu Gly Arg Lys He Ala His Gly Val Lys Lys
1015
Tyr Gly Pro Thr Val Leu Arg lie lie Arg lie Ala Gly Glu Tyr Asp
2530
Met lie Leu Lys Phe Gly Ser Lys Gly Asp Ala Val Ala Thr Leu Gin 35 4045
Lys Gin Leu Ala Lys Met Gly Tyr Lys Gly Val Lys Asp Lys Pro Leu
5560
Ser Val Asp Gly His Phe Gly Glu Ser Thr Glu Phe Ala Val He Gin 65 70 7580
Leu Gin Arg Lys Phe Gly Leu Val Ala Asp Gly Lys Val Gly Asp Lys
9095
Thr Arg Gin Ala Leu Ala Gly Asp Ser Val Ser Lys Phe Leu Lys Asp
100 105110
Glu Asp Tyr Lys Lys Ala Ala lie Arg Leu Lys Val Pro Glu Leu Val
115 120125
He Arg Val Phe Gly Ala Val Glu Gly Leu Gly Val Gly Phe Leu Pro 130 135140
Asn Gly Lys Ala Lys lie Leu Phe Glu Arg His Arg Met Tyr PheTyr
145 150 155160
Leu Cys Gin Ala Leu Gly Lys Thr Phe Ala Asn Ser Gin Val Lyslie
165 170175
Thr Pro Asn lie Val Asn Thr Leu Thr Gly Gly Tyr Lys Gly Asp Ala
180 185190
Ala Glu Tyr Thr Arg Leu Ser Met Ala lie Asn lie His Lys Glu Ser
195 200205
Ala Leu Met Ser Thr Ser Trp Gly Gin Phe Gin lie Met Gly Glu Asn
210 215220
Trp Lys Asp Leu Gly Tyr Ser Ser Val Gin Glu Phe Val Asp Gin Gin
225 230 235240
Gin Leu Asn Glu Gly Asn Gin Leu Glu Ala Phe lie Arg Phe lie Glu
245 250255
Trp Lys Pro Gly Leu Leu Glu Ala Leu Arg Lys Gin Asp Trp Asp Thr
260 265270
Val Phe Thr Leu Tyr Asn Gly Lys Asn Tyr Lys Lys Leu Gly Tyr Gin
275 280285
Ala Lys Phe Gin Lys Glu Trp Asp His Leu Glu Pro lie Tyr Arg Glu
290 295300
Lys Thr Ala Ala 305 <210> 100 <211> 313 <212> PRT <213> неизвестно <220>
<223> Sushi 1: Acinetobacter baumannii эндолизин <400> 100
Gly Phe Lys Leu Lys Gly Met Ala Arg lie Ser Cys Leu Pro Asn Gly
10 15
- 70 037202
Gin Trp Ser Asn 20 Phe Pro Pro Lys Cys 25 He Arg Glu Cys Ala 30 Met Val
Ser Ser Glu 35 Tyr Asp Met He Leu 40 Lys Phe Gly Ser Lys 45 Gly Asp Ala
Val Ala 50 Thr Leu Gin Lys Gin 55 Leu Ala Lys Met Gly 60 Tyr Lys Gly Val
Lys 65 Asp Lys Pro Leu Ser 70 Val Asp Gly His Phe 75 Gly Glu Ser Thr Glu 80
Phe Ala Val He Gin 85 Leu Gin Arg Lys Phe 90 Gly Leu Val Ala Asp 95 Gly
Lys Val Gly Asp 100 Lys Thr Arg Gin Ala 105 Leu Ala Gly Asp Ser 110 Val Ser
Lys Phe Leu 115 Lys Asp Glu Asp Tyr 120 Lys Lys Ala Ala lie 125 Arg Leu Lys
Val Pro 130 Glu Leu Val lie Arg 135 Val Phe Gly Ala Val 140 Glu Gly Leu Gly
Val 145 Gly Phe Leu Pro Asn 150 Gly Lys Ala Lys lie 155 Leu Phe G1U Arg His 160
Arg Met Tyr Phe Tyr 165 Leu Cys Gin Ala Leu 170 Gly Lys Thr Phe Ala 175 Asn
Ser Gin Val Lys 180 He Thr Pro Asn lie 185 Val Asn Thr Leu Thr 190 Gly Gly
Tyr Lys Gly 195 Asp Ala Ala Glu Tyr 200 Thr Arg Leu Ser Met 205 Ala lie Asn
He His 210 Lys Glu Ser Ala Leu 215 Met Ser Thr Ser Trp 220 Gly Gin Phe Gin
He 225 Met Gly Glu Asn Trp 230 Lys Asp Leu Gly Tyr 235 Ser Ser Val Gin Glu 240
Phe Val Asp Gin Gin Gin Leu Asn Glu Gly Asn Gin Leu Glu Ala Phe
245 250 255
He Arg Phe He 260 Glu Trp Lys Pro Gly 265 Leu Leu Glu Ala Leu 270 Arg Lys
Gin Asp Trp 275 Asp Thr Val Phe Thr 280 Leu Tyr Asn Gly Lys 285 Asn Tyr Lys
Lys Leu 290 Gly Tyr Gin Ala Lys 295 Phe Gin Lys Glu Trp 300 Asp His Leu G1U
Pro 305 He Tyr Arg Glu Lys 310 Thr Ala Ala
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Claims (23)

1. Слитый белок, состоящий из эндолизина с функцией разрушения клеточной стенки грамотрицательных бактерий и амфипатичной пептидной цепи, слитой с эндолизином со стороны N-конца и/или С-конца, причем амфипатичная пептидная цепь содержит от 5 до 100 аминокислотных остатков, при этом один или более аминокислотных остатков амфипатичной пептидной цепи представляют собой положительно заряженные остатки лизина и/или аргинина, и как минимум 60% аминокислотных остатков амфипатичной пептидной цепи представляют собой гидрофобные остатки валина, изолейцина, лейцина, метионина, фенилаланина, триптофана, цистеина, аланина, тирозина, треонина, серина, пролина и/или глицина.
2. Слитый белок по п.1, характеризующийся тем, что амфипатичная пептидная цепь содержит от 5 до 50 аминокислотных остатков.
3. Слитый белок по п.1 или 2, характеризующийся тем, что амфипатичная пептидная цепь представляет собой природный пептид.
4. Слитый белок по любому из предшествующих пунктов, характеризующийся тем, что как минимум 30% аминокислотных остатков амфипатичной пептидной цепи являются положительно заряженными остатками лизина и/или аргинина.
5. Слитый белок по любому из предшествующих пунктов, характеризующийся тем, что амфипатичная пептидная цепь имеет последовательность SEQ ID NO: 11, 6, 7, 8, 9, 12, 13, 14, 15, 16, 19, 26, 27,
- 71 037202
28, 29, 30 или 31.
6. Слитый белок по любому из предшествующих пунктов, характеризующийся тем, что эндолизин обладает функцией разрушения клеточной стенки Campylobacter.
7. Слитый белок по любому из предшествующих пунктов, характеризующийся тем, что эндолизин имеет происхождение из эндолизинов Pseudomonas aeruginosa фагов ψΚΖ и EL.
8. Слитый белок по любому из пп.1-6, характеризующийся тем, что эндолизин имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 25, 22, 24, 2, 3, 4, 5, 18, 20, 21 или 23.
9. Слитый белок по любому из предшествующих пунктов, характеризующийся тем, что содержит дополнительный аминокислотный остаток на N-конце.
10. Слитый белок по любому из предшествующих пунктов, характеризующийся тем, что включает метку (tag) на С- и/или N-концах.
11. Слитый белок по п.10, характеризующийся тем, что метка (tag) связана со слитым белком по меньшей мере через один дополнительный аминокислотный остаток.
12. Слитый белок по любому из предшествующих пунктов, характеризующийся тем, что амфипатичная пептидная цепь связана с эндолизином по меньшей мере через один дополнительный аминокислотный остаток.
13. Слитый белок по любому из предшествующих пунктов, характеризующийся тем, что имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 46, 82, 95, 36, 37, 38, 39, 40, 43, 45, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 77, 78, 81, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 96, 97, 98 или 99.
14. Изолированная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая слитый белок по любому из пп.113.
15. Вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты по п.14.
16. Клетка-хозяин, содержащая молекулу нуклеиновой кислоты по п.14 или вектор по п.15.
17. Клетка-хозяин по п.16, представляющая собой бактериальную или дрожжевую клетку.
18. Применение слитого белка по любому из пп.1-13 в качестве компонента косметического препарата.
19. Применение слитого белка по любому из пп.1-13 в качестве медикаментозного препарата для лечения или профилактики инфекций, вызываемых грамотрицательными бактериями.
20. Применение слитого белка по любому из пп.1-13 в качестве дезинфектанта.
21. Применение слитого белка по любому из пп.1-13 для обработки или профилактики заражения грамотрицательными бактериями пищевых продуктов, оборудования на предприятиях пищевой промышленности, поверхностей, контактирующих с пищевыми продуктами, медицинского оборудования, поверхностей в стационарах и хирургических блоках.
22. Применение слитого белка по любому из пп.1-13 в качестве средства диагностики инфекций, вызываемых грамотрицательными бактериями, в медицине, пищевой промышленности и природоохранной деятельности.
23. Фармацевтическая композиция для лечения или профилактики инфекций, вызываемых грамотрицательными бактериями, содержащая слитый белок по любому из пп.1-13.
О Евразийская патентная организация, ЕАПВ
EA201270079A 2009-06-26 2010-06-28 Слитые белки для лечения инфекций, вызванных грамотрицательными бактериями EA037202B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP09163953 2009-06-26
PCT/EP2010/059146 WO2010149792A2 (en) 2009-06-26 2010-06-28 Antimicrobial agents

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201270079A1 EA201270079A1 (ru) 2012-06-29
EA037202B1 true EA037202B1 (ru) 2021-02-18

Family

ID=42799668

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201270079A EA037202B1 (ru) 2009-06-26 2010-06-28 Слитые белки для лечения инфекций, вызванных грамотрицательными бактериями

Country Status (18)

Country Link
US (3) US8906365B2 (ru)
EP (3) EP2445515B1 (ru)
JP (2) JP6034187B2 (ru)
KR (2) KR20170024129A (ru)
CN (2) CN102458452B (ru)
AU (3) AU2010264656B2 (ru)
BR (1) BRPI1015192A2 (ru)
CA (1) CA2764131C (ru)
DK (1) DK2445515T3 (ru)
EA (1) EA037202B1 (ru)
ES (1) ES2579806T3 (ru)
HK (1) HK1169311A1 (ru)
IL (2) IL217124A (ru)
MX (2) MX360300B (ru)
PL (1) PL2445515T3 (ru)
SG (1) SG177370A1 (ru)
SI (1) SI2445515T1 (ru)
WO (1) WO2010149792A2 (ru)

Families Citing this family (39)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB0815484D0 (en) 2008-08-26 2008-10-01 Univ Leuven Kath Antibacterial agents
KR101701890B1 (ko) 2009-06-26 2017-02-02 뤼산도 아게 항균제
KR20170024129A (ko) 2009-06-26 2017-03-06 카톨리에케 유니버시테이트 루벤 항균제
MX2012002216A (es) 2009-08-24 2012-04-10 Univ Leuven Kath Nueva endolisina obpgplys.
MX340520B (es) * 2010-04-27 2016-07-12 Lysando Ag * Metodo de reduccion de biopeliculas.
EP2468856A1 (en) * 2010-12-23 2012-06-27 Lysando Aktiengesellschaft Antimicrobial Agents
WO2012140676A2 (en) 2011-04-12 2012-10-18 Appaiah C B Chimeric antibacterial polypeptides
US9068204B2 (en) 2013-03-15 2015-06-30 The United States Of America, As Represented By The Secretary Of Agriculture Peptidoglycan hydrolase antimicrobials for eradicating lactobacilli that contaminate and reduce ethanol yields in biofuel fermentation
WO2015070912A1 (en) * 2013-11-14 2015-05-21 Lysando Ag Modified el188 endolysin sequence
WO2015070911A1 (en) * 2013-11-14 2015-05-21 Lysando Ag Modified kz144 endolysin sequence
US10329550B2 (en) 2014-02-14 2019-06-25 Lysando Ag Antimicrobial agents
EA201692031A1 (ru) * 2014-04-08 2017-07-31 Лисандо Аг Фармацевтическая композиция с активным действием в отношении хронических бактериальных инфекций
BR112016030580B1 (pt) * 2014-06-26 2023-12-19 The Rockefeller University Polipeptídeo de lisina e fragmento de polipeptídeo com atividade para matar bactérias gram-negativas
CN105734029B (zh) * 2014-12-12 2020-09-25 丰益(上海)生物技术研发中心有限公司 磷脂酶抗菌肽
RU2728682C2 (ru) 2015-09-17 2020-07-31 Контрафект Корпорейшн Применение лизина для восстановления/увеличения антибактериальной активности антибиотиков в присутствии легочного сурфактанта, который ингибирует указанные антибиотики
CN105175509A (zh) * 2015-10-19 2015-12-23 河南科技学院 一种抗菌肽xyz-1及其应用
JP7105696B2 (ja) * 2016-02-29 2022-07-25 デイナ ファーバー キャンサー インスティチュート，インコーポレイテッド 感染症を治療するステープル化細胞内ターゲティング抗微生物ペプチド
CA3022334A1 (en) * 2016-04-28 2017-11-02 Lysando Ag Antimicrobial agents against salmonella bacteria
WO2018100408A1 (en) 2016-11-30 2018-06-07 Sasinapas Co.,Ltd. Modified peptides
WO2018109229A1 (en) * 2016-12-16 2018-06-21 Universidade Do Minho Novel endolysin
US20180208938A1 (en) * 2017-01-23 2018-07-26 Innate Immunity LLC Compositions and Methods for Protecting Plants Against Bacterial Infections
WO2018185634A1 (en) * 2017-04-03 2018-10-11 Sasinapas Co., Ltd. Engineered gram-negative endolysins
US11325955B2 (en) 2017-07-19 2022-05-10 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Stabilized anti-microbial peptides for the treatment of antibiotic-resistant bacterial infections
WO2019155002A1 (en) * 2018-02-08 2019-08-15 Institut Pasteur Anti-prevotella bacteriocin methods and compositions
CN112368376A (zh) * 2018-03-29 2021-02-12 康特拉费克特公司 溶素-抗微生物肽(amp)多肽构建体、溶素、其分离的编码多核苷酸及其用途
CN108410840A (zh) * 2018-04-03 2018-08-17 大连理工大学 一种铜绿假单胞菌噬菌体内溶素及其编码基因与应用
JP6979210B2 (ja) * 2018-04-26 2021-12-08 株式会社ニューギン 遊技機
US20210198645A1 (en) 2018-05-30 2021-07-01 Lysando Ag Novel antimicrobial fusion proteins
AU2019276253A1 (en) * 2018-05-30 2020-11-26 Lysando Ag Novel antimicrobial proteins
KR20210049023A (ko) * 2018-08-23 2021-05-04 콘트라펙트 코포레이션 리신-항미생물 펩타이드(amp) 폴리펩타이드 작제물, 리신, 이를 인코딩하는 단리된 폴리뉴클레오타이드 및 이의 용도
CA3175024A1 (en) 2020-03-11 2021-09-16 Telum Therapeutics S.L. New recombinant lysin and its use in the treatment of gram-negative bacterial infections
CA3171721A1 (en) 2020-03-19 2021-09-23 Fritz Eichenseher A stabilized protein of interest
JP2023526388A (ja) * 2020-05-22 2023-06-21 ライセンテク カンパニー リミテッド 新規なポリペプチド、融合ポリペプチド、およびこれを含むグラム陰性菌に対する抗生物質
KR102286544B1 (ko) * 2021-02-10 2021-08-05 주식회사 라이센텍 융합 폴리펩타이드 및 이를 포함하는 그람음성균에 대한 항생제
AU2021309132A1 (en) * 2020-07-17 2023-02-23 The University Of Western Australia Compositions and methods for the treatment of cancer
CN111876400B (zh) * 2020-08-06 2022-05-24 昆明理工大学 一种常温裂解酶Sly和编码此酶的多核苷酸
SK289101B6 (sk) * 2020-12-17 2023-08-09 Ústav molekulárnej biológie Slovenskej akadémie vied, verejná výskumná inštitúcia Antimikrobiálny proteín, antimikrobiálny rekombinantný proteín s lytickými vlastnosťami, expresný vektor, spôsob ich prípravy a použitie
US11548917B1 (en) * 2021-11-24 2023-01-10 Intron Biotechnology, Inc. Antibacterial composition effective in treating gram negative bacterial infections and method for preparing the same
CN117534733B (zh) * 2024-01-10 2024-03-29 黑龙江八一农垦大学 抗菌肽cm24、重组基因、乳酸工程菌及其应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001000855A1 (en) * 1999-06-23 2001-01-04 Ppl Therapeutics (Scotland) Ltd. Fusion proteins incorporating lysozyme
WO2005024002A1 (en) * 2003-09-11 2005-03-17 Novozymes A/S Recombinant production of antimicrobial agents
WO2005108563A2 (en) * 2004-04-19 2005-11-17 University Of Chicago Peptidoglycan-hydrolyzing protein encoded by bacteriophage n4
US20060147442A1 (en) * 2003-05-15 2006-07-06 Iogenetics Biocides

Family Cites Families (31)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2132088A (en) 1987-07-06 1989-01-30 Louisiana State University Agricultural And Mechanical College Inhibition of eucaryotic pathogens and neoplasms and stimulation of fibroblasts and lymphocytes with lytic peptides
GB8816693D0 (en) 1988-07-13 1988-08-17 Agricultural & Food Res Viral enzyme & gene
GB2255561B (en) 1991-04-20 1995-06-21 Agricultural & Food Res Lysins from bacteriophages
DE69332740T2 (de) 1992-08-21 2004-02-05 The University Of British Columbia, Vancouver Kationische peptide und verfahren zu deren herstellung
PT778733E (pt) * 1994-09-01 2001-06-29 Novozymes As Composicao proteica basica para matar ou inibir celulas microbianas
US6503881B2 (en) 1996-08-21 2003-01-07 Micrologix Biotech Inc. Compositions and methods for treating infections using cationic peptides alone or in combination with antibiotics
US5997862A (en) 1997-10-31 1999-12-07 New Horizons Diagnostics Corporation Therapeutic treatment of group A streptococcal infections
US20030113298A1 (en) * 1997-10-31 2003-06-19 Vincent Fischetti Use of bacterial phage associated lysing proteins for the prophylactic and therapeutic treatment of various illnesses
US6428784B1 (en) 1997-10-31 2002-08-06 New Horizons Diagnostics Corp Vaginal suppository for treating group B Streptococcus infection
US6288212B1 (en) * 1998-08-28 2001-09-11 The University Of British Columbia Anti-endotoxic, antimicrobial cationic peptides and methods of use therefor
US5993809A (en) 1998-11-18 1999-11-30 Children's Hospital Medical Center Lysozyme fusion proteins in infections
US7338936B2 (en) * 2000-11-28 2008-03-04 House Ear Institute Use of antimicrobial proteins and peptides for the treatment of otitis media and paranasal sinusitis
EP1501935B1 (en) * 2002-04-22 2009-09-23 Dow Global Technologies Inc. Low-cost production of peptides
US20070207209A1 (en) * 2004-08-27 2007-09-06 Murphy Christopher J Trophic factor combinations for nervous system treatment
US7572602B1 (en) 2004-12-03 2009-08-11 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Nucleic acid encoding endolysin fusion protein
DE102005040347A1 (de) 2005-08-25 2007-03-01 Profos Ag Verfahren und Mittel zur Anreicherung, Entfernung und zum Nachweis von Listerien
ES2346808T3 (es) 2006-03-31 2010-10-20 The University Court Of The University Of St. Andrews Composiciones antimicrobianas que comprenden un peptido cationico y una endopeptidasa de glicilglicina.
DE102006061002A1 (de) 2006-12-22 2008-06-26 Profos Ag Verfahren und Mittel zur Anreicherung, Entfernung und zum Nachweis von gram-positiven Bakterien
US9296789B2 (en) * 2007-09-25 2016-03-29 Pastoral Greenhouse Gas Research Ltd. Vaccines and vaccine components for inhibition of microbial cells
US20100310522A1 (en) 2007-11-26 2010-12-09 Plant Bioscience Limited Novel Polypeptides Having Endolysin Activity and Uses Thereof
US8481289B2 (en) 2008-07-24 2013-07-09 The United States Of America, As Represented By The Secretary Of Agriculture Triple acting antimicrobials that are refractory to resistance development
EP2157100A1 (en) 2008-08-19 2010-02-24 Profos AG Artificial peptidoglycan lysing enzymes and peptidoglycan binding proteins
GB0815484D0 (en) 2008-08-26 2008-10-01 Univ Leuven Kath Antibacterial agents
WO2010091078A2 (en) * 2009-02-03 2010-08-12 Danfoss Aquaz A/S Nanofabricated membrane using polymerized proteoliposomes
US8389679B2 (en) 2009-02-05 2013-03-05 The Regents Of The University Of California Targeted antimicrobial moieties
US8383102B2 (en) 2009-05-21 2013-02-26 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Fusion of peptidoglycan hydrolase enzymes to a protein transduction domain allows eradication of both extracellular and intracellular gram positive pathogens
KR101701890B1 (ko) 2009-06-26 2017-02-02 뤼산도 아게 항균제
KR20170024129A (ko) 2009-06-26 2017-03-06 카톨리에케 유니버시테이트 루벤 항균제
MX2012002216A (es) 2009-08-24 2012-04-10 Univ Leuven Kath Nueva endolisina obpgplys.
MX340520B (es) 2010-04-27 2016-07-12 Lysando Ag * Metodo de reduccion de biopeliculas.
US9388400B2 (en) 2012-06-29 2016-07-12 Lysando Ag Composition for use in mycobacteria diagnosis

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001000855A1 (en) * 1999-06-23 2001-01-04 Ppl Therapeutics (Scotland) Ltd. Fusion proteins incorporating lysozyme
US20060147442A1 (en) * 2003-05-15 2006-07-06 Iogenetics Biocides
WO2005024002A1 (en) * 2003-09-11 2005-03-17 Novozymes A/S Recombinant production of antimicrobial agents
WO2005108563A2 (en) * 2004-04-19 2005-11-17 University Of Chicago Peptidoglycan-hydrolyzing protein encoded by bacteriophage n4

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ARIMA H., IBRAHIM H.R., KINOSHITA T. KATO A.: "Bactericidal action of lysozymes attached with various sizes of hydrophobic peptides to the C-terminal using genetic modification", FEBS LETTERS, ELSEVIER, AMSTERDAM., NL, vol. 415, no. 1, 22 September 1997 (1997-09-22), NL, pages 114 - 118, XP004261147, ISSN: 0014-5793, DOI: 10.1016/S0014-5793(97)01071-5 *
DONOVAN D M, ET AL: "Peptidoglycan hydrolase fusions maintain their parental specificities", APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, AMERICAN SOCIETY FOR MICROBIOLOGY, US, vol. 72, no. 4, 1 April 2006 (2006-04-01), US, pages 2988 - 2996, XP002582772, ISSN: 0099-2240, DOI: 10.1128/AEM.72.4.2988-2996.2006 *
IBRAHIM H R, ET AL: "Enhanced bactericidal action of lysozyme to Escherichia coli by inserting a hydrophobic pentapeptide into its C terminus.", JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, AMERICAN SOCIETY FOR BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY, vol. 269, no. 7, 18 February 1994 (1994-02-18), pages 5059 - 5063, XP002579297, ISSN: 0021-9258 *
VAN DER LINDEN DANITSJA S ET AL: "Synergistic effects of ovine-derived cathelicidins and other antimicrobials against Escherichia coli O157:H7 and Staphylococcus aureus 1056 MRSA.", BIOTECHNOLOGY LETTERS, SPRINGER NETHERLANDS, DORDRECHT, vol. 31, no. 8, 1 August 2009 (2009-08-01), Dordrecht, pages 1265 - 1267, XP002604248, ISSN: 1573-6776, DOI: 10.1007/S10529-009-0010-9 *

Also Published As

Publication number Publication date
SI2445515T1 (sl) 2016-08-31
EA201270079A1 (ru) 2012-06-29
CN105440139A (zh) 2016-03-30
US8906365B2 (en) 2014-12-09
KR20170024129A (ko) 2017-03-06
AU2018201931A1 (en) 2018-05-31
MX360300B (es) 2018-10-29
ES2579806T3 (es) 2016-08-16
MX2011013288A (es) 2012-02-28
SG177370A1 (en) 2012-02-28
AU2010264656A1 (en) 2011-12-08
EP3058950A3 (en) 2016-10-12
CA2764131A1 (en) 2010-12-29
US11052137B2 (en) 2021-07-06
IL217124A0 (en) 2012-02-29
AU2010264656B2 (en) 2016-01-21
US20120189606A1 (en) 2012-07-26
JP2017008033A (ja) 2017-01-12
JP6034187B2 (ja) 2016-11-30
IL250938B (en) 2019-12-31
IL217124A (en) 2017-03-30
EP3058950A2 (en) 2016-08-24
KR20120095345A (ko) 2012-08-28
CN102458452B (zh) 2015-12-02
DK2445515T3 (en) 2016-07-04
CN102458452A (zh) 2012-05-16
CA2764131C (en) 2022-05-10
EP3714895A3 (en) 2020-11-25
EP3714895A2 (en) 2020-09-30
IL250938A0 (en) 2017-04-30
WO2010149792A3 (en) 2011-02-24
KR101711062B1 (ko) 2017-02-28
WO2010149792A2 (en) 2010-12-29
BRPI1015192A2 (pt) 2019-09-17
JP2012530509A (ja) 2012-12-06
AU2018201931B2 (en) 2019-08-15
US20190209663A1 (en) 2019-07-11
PL2445515T3 (pl) 2016-10-31
US10137175B2 (en) 2018-11-27
EP2445515B1 (en) 2016-04-06
CN105440139B (zh) 2019-08-13
AU2016202296B2 (en) 2017-12-21
HK1169311A1 (zh) 2013-01-25
EP3058950B1 (en) 2020-03-04
EP2445515A2 (en) 2012-05-02
US20150118731A1 (en) 2015-04-30
AU2016202296A1 (en) 2016-05-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2018201931B2 (en) Antimicrobial Agents
EP2446028B1 (en) Antimicrobial agents
CA2822732C (en) Antimicrobial fusion proteins

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ KZ KG MD TJ TM