KR20210049023A - 리신-항미생물 펩타이드(amp) 폴리펩타이드 작제물, 리신, 이를 인코딩하는 단리된 폴리뉴클레오타이드 및 이의 용도 - Google Patents

리신-항미생물 펩타이드(amp) 폴리펩타이드 작제물, 리신, 이를 인코딩하는 단리된 폴리뉴클레오타이드 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 개시내용은 리신-AMP 폴리펩타이드 작제물, 단리된 리신 폴리펩타이드, 및 단리된 폴리펩타이드 및/또는 리신-AMP 폴리펩타이드 작제물을 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 폐 계면활성제가 존재하는 장기 또는 조직의 박테리아 감염 또는 생물막과 관련된 그람-음성균 감염을 치료하는 방법을 포함하여, 리신-AMP 폴리펩타이드 작제물, 단리된 리신 폴리펩타이드 및 약제학적 조성물을 사용하는 방법이 또한 본원에 제공된다. 또한, 리신-AMP 폴리펩타이드 작제물 및 단리된 리신 폴리펩타이드를 인코딩하는 단리된 폴리뉴클레오타이드가 본원에 개시되어 있다.

Description

리신-항미생물 펩타이드(AMP) 폴리펩타이드 작제물, 리신, 이를 인코딩하는 단리된 폴리뉴클레오타이드 및 이의 용도
관련 출원에 대한 교차 참조
[1] 본 출원은 2018년 8월 24일자로 출원된 미국 가출원 제62/722,793호, 2018년 3월 29일자로 출원된 미국 가출원 제62/650,235호, 및 2018년 8월 23일자로 출원된 미국 가출원 제62/721,969호의 우선권 이익을 주장하는, 2019년 3월 29일자로 출원된 PCT 출원 제PCT/US2019/024912호의 이익을 주장하고 이의 출원일에 따르며, 또한, 2019년 5월 17일자로 출원된 미국 가출원 제62/849,320호 및 2019년 6월 13일자로 출원된 미국 가출원 제62/860,836호의 출원일에 따르며, 이들 각각은 그 전문이 본원에 참조로 포함되어 있다.
서열 목록
[2] 본 출원은 ASCII 형식으로 전자적으로 제출되었고 그 전문이 본원에 참조로 포함된 서열 목록을 포함한다. 2019년 8월 22에 생성된 상기 ASCII 사본은 이름이 0341_0021-00-304_ST25.txt이고, 크기가 249,856 바이트이다.
본 개시내용의 분야
[3] 본 개시내용은 항균제 분야에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 그람-음성균에 대한 리신 활성을 갖는 폴리펩타이드 및 그람-음성균을 사멸시키고 박테리아 감염 및 오염을 퇴치함에 있어서 이들 작용제의 용도에 관한 것이다.
[4] 그람-음성균, 특히, 슈도모나스( Pseudomonas ) 속의 일원 및 부상하는 다약제 내성 병원균 아시네토박터 바우마니 ( Acinetobacter baumannii )는 심각하고 잠재적으로 생명을 위협하는 침습성 감염의 중요한 원인이다. 슈도모나스 감염은 화상 상처, 만성 상처, 만성 폐쇄성 폐질환(COPD), 낭포성 섬유증, 이식된 생체물질의 표면 성장, 그리고 취약한 환자에게 많은 위협을 가하는 병원 표면 및 상수도 내에서 주요 문제를 나타낸다.
[5] 일단 환자에게서 확립되면, 피. 아에루기노사(P. aeruginosa)는 특히 치료하기 어려울 수 있다. 게놈은 베타-락탐 및 아미노글리코시드 항생제에 대한 내성을 부여하는 다약물 유출 펌프 및 효소를 포함한 다수의 내성 유전자를 인코딩하므로 이 그람-음성 병원균에 대한 치료가 새로운 항미생물 치료제의 부족으로 인해 특히 어렵게 된다. 이 문제는, 숙주 방어 및 화학요법으로부터 박테리아를 보호함으로써 감염을 유발하는 능력을 향상시킬 수 있는, 피. 아에루기노사가 생물막에서 자라는 능력으로 인해 더 심각해진다.
[6] 의료 환경에서, 슈도모나스 아에루기노사의 약물-내성 균주의 발생이 증가하고 있다. 지역 병원의 건강관리-관련 혈류 감염(BSI)에 대한 관찰 연구에서 피. 아에루기노사는 상위 4대 다중 약제 내성(Multiple 약물 내성; MDR) 병원균 중 하나로 전체 병원 사망률의 18%를 차지하였다. 또한, MDR 피. 아에루기노사의 발생은 문서로 잘 기록되어 있다. 불량한 결과는 콜리스틴과 같은 최후 수단의 약물을 사용한 치료가 흔히 필요한 피. 아에루기노사의 MDR 균주와 결부된다.
[7] 더욱이, 항생제 내성 발달보다는 폐 계면활성제와 같은 감염 환경의 요인으로 인해 감염과 싸우는데 특정 항생제의 효과 감소가 관찰된다. 예를 들어, 댑토마이신과 같은 특정 항생제는 심각한 지역사회 획득 폐렴에 대한 임상시험 기준을 충족시키지 못했다. 이 결핍은 댑토마이신과 폐 계면활성제 사이의 상호작용으로 인한 것으로 나타났으며, 이는 구체적으로 폐 환경에서 보다 일반적으로 폐 계면활성제가 존재하는 기도 환경에서 이 항생제의 활성을 억제한다[참조: Silverman, J.A. et al., "Surfactant Inhibition of Daptomycin," JID, 191: 2149-2152 (2005)]. 따라서, 댑토마이신은 폐 및 보다 일반적으로 기도(특히 하기도) 감염의 치료에 사용되지 않으며, 당업자는 이러한 감염을 치료하기 위해 댑토마이신을 포함하는 치료 요법을 사용하지 않을 것이다. 폐 계면활성제가 존재하는 상태에서 댑토마이신이 감염과 싸우지 못하는 것은, 예를 들어, 문헌[참조: Koplowicz, Y.B. et al., "Development of daptomycin-susceptible methicillin-resistant Staphylococcus aureus Pneumonia during high-dose daptomycin therapy", Clin Infect Dis. 49(8):1286-7 (2009)]에서 극적으로 나타났다. 최근 연구에서는 구조적으로 관련된 리포펩타이드(lipopeptide) A54145의 하이브리드 분자의 항균 활성을 검사하고 평가하여 계면활성제 존재하에 댑토마이신 비활성을 극복하는데 초점을 맞추었다[참조: Nguyen, K.T. et al., "Genetically engineered lipopeptide antibiotics related to A54145 and daptomycin with improved properties", Antimicrob. Agents Chemother. 2010 Apr; 54(4):1404-1413].
[8] 상피 표면액(epithelial lining fluid)의 주요 성분인 폐 계면활성제는 기도의 내부 표면을 코팅하는 복잡한 지질-및-단백질 혼합물로, 폐포 내의 표면 장력을 감소시킨다. 계면활성제는 주로 디팔미토일포스파티딜콜린(모든 포유동물 종에서 약 80%)과 상당한 양의 포스파티딜글리세롤(PG) 및 소량의 소수 인지질, 중성 지질 및 콜레스테롤로 구성된다. 4가지 단백질 성분이 있다: 친수성 단백질 SP-A 및 SP-D와 소수성 단백질 SP-B 및 SP-C[참조: Goerke, J., "Pulmonary Surfactant: functions and molecular composition", Biochim . Biophys . Acta. 1998; 1408:79-89]. 댑토마이신은 포스파티딜콜린(PC) 및 PC/PG로 구성된 인공막 소포에 삽입된다[참조: Lakey J.H. et al., "Fluorescence indicates a calcium-dependent interaction between the lipopeptide antibiotic LY146032 and phospholipid membranes," Biochemistry 1988; 27:4639-45; Jung, D. et al., "Structural transitions as determinants of the action of the calcium-dependent antibiotic daptomycin", Chem. Biol. 2004; 11:949-57].
[9] 따라서, 달리 효과적인 항생제가 감염 부위인 장기 또는 조직에 존재하는 요인, 예를 들어 폐 또는 다른 기도 및 보다 일반적으로 호흡기 감염의 경우에 폐 계면활성제에 의해 억제되는 범위까지, 이러한 항생제의 활동을 회복하고 심지어 증가시킬 수 있는 치료 요법이 상업적 및 공중 보건 가치가 있을 것이다.
[10] 상기 논의된 댑토마이신 외에도, 폐 계면활성제에 의해 억제되는 것으로 공지된 다른 항생제로는 폐렴의 일반적인 원인인 그람-음성 박테리아 슈도모나스 아에루기노사에 의해 유발된 감염을 치료하는데 사용되는 아미노글리코시드인, 토브라마이신(참조: van 't Veen, A. et al., "Influence of pulmonary surfactant on in vitro bactericidal activities of amoxicillin, ceftazidime, and tobramycin", Antimicrob . Agents Chemother. 39:329-333 (1995)), 및 피. 아에루기노사를 포함한 그람-음성균에 대해 광범위하게 활성인 사이클릭 리포펩타이드(폴리믹신)인, 콜리스틴이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다[참조: Schwameis, R. et al., "Effect of Pulmonary surfactant on antimicrobial activity in vitro", Antimicrob. Agents Chemother. 57(10):5151-54 (2013)].
[11] 새로운 메커니즘을 가진 새로운 항미생물제의 필요성을 해결하기 위해 연구자들은 다양한 약물과 생물제제를 연구하고 있다. 이러한 종류의 항미생물제 중 하나는 리신을 포함한다. 리신은 세포벽 펩티도글리칸 가수분해효소로, 세포 형상을 유지하고 내부 삼투압을 견디는 역할을 하는 펩티도글리칸 그물을 분해하는 "분자 가위" 역할을 한다. 펩티도글리칸이 분해되면 삼투 용해(osmotic lysis)가 일어난다. 그러나, 리신은 전형적으로 그람-양성균에는 없고 바로밑 펩티도글리칸에 대한 접근을 제한하는 외막(OM)의 존재로 인해 적어도 부분적으로 그람-음성균에 대해 효과적이지 않았다. 변형된 리신("아티리신(artilysin)")도 개발되었다. 다양이온성, 양극성 및 소수성 특징을 갖는 특정 α-나선 도메인에 융합된 리신을 포함하는 이러한 작용제는 OM을 가로질러 전위될 수 있다. 그러나 아티리신은 전형적으로 낮은 생체내 활성을 나타낸다.
[12] 최근 간행물에서는 생체내에서 다양한 수준의 효능으로 그람-음성균에 사용할 수 있는 새로운 리신을 설명했지만, MDR 피. 아에루기노사 및 침습성 감염 치료를 위한 다른 그람-음성균을 표적으로 하는, 인간 혈액 매트릭스 또는 폐 계면활성제에서 활성을 유지하는 추가 항균제에 대한 지속적인 의학적 요구가 남아 있다.
[13] 본 출원은, 예를 들어, 그람-음성균, 특히 슈도모나스 아에루기노사를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 다약제 내성 그람-음성균에 의해 유발된 감염을 포함하여, 박테리아 감염을 치료하기 위해 사용될 수 있는 리신 및 항미생물 펩타이드(AMP)를 포함하는 신규한 폴리펩타이드 작제물에 관한 것이다. 새로 확인된 리신 및 이의 변이체, 뿐만 아니라 다른 리신의 변이체도 제공된다. 본원에 기재된 바와 같이, 리신-AMP 폴리펩타이드 작제물, 새로 얻어진 리신 및 변이 리신이, 예를 들어, 박테리아 감염을 치료하는데 사용될 수 있는 약제학적 조성물에 포함될 수 있다. 또한, 특히, 박테리아 감염을 치료하거나, 항생제의 효능을 증가시키거나, 일반적으로 성장을 억제하거나, 개체군을 감소시키거나, 그람-음성균, 예를 들어 피. 아에루기노사를 사멸시키기 위해 리신-AMP 폴리펩타이드 작제물, 새로 확인된 리신 및 변이 리신을 사용하는 방법이 본원에 제공된다. 리신 변이 폴리펩타이드 및 상기 작제물 및 리신 변이체를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드도 제공된다. 특정 구현예에서, 리신-AMP 폴리펩타이드 작제물, 새로 얻어진 리신 및 변이 리신은 폐 계면활성제가 존재하는 장기 또는 조직에서 박테리아 감염, 예를 들어, 폐렴(병원성 폐렴 포함) 및 낭포성 섬유증을 치료하는데 사용될 수 있다. 다른 구현예에서, 리신-AMP 폴리펩타이드 작제물, 새로 얻어진 리신 및 변이 리신은 생물막과 관련된 그람-음성균 감염을 치료하는데 사용될 수 있다.
[14] 일 측면에서, 본 개시내용은 (a) 다음의 폴리펩타이드 서열을 포함하는 제1 성분: (i) GN76(서열번호 203), GN4(서열번호 74), GN146(서열번호 78), GN14(서열번호 124), 임의로 단일 pI-증가 돌연변이가 있는 GN37(서열번호 84), 임의로 단일 점 돌연변이가 있는 GN316(서열번호 22), 리신 Pap2_gp17(서열번호 96), GN329(서열번호 26), GN424(서열번호 56), GN202(서열번호 118), GN425(서열번호 58), GN428(서열번호 60), GN431(서열번호 64), GN486(서열번호 66), GN333(서열번호 28), GN485(서열번호 68), GN123(서열번호 173) 및 GN121(서열번호 175)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 리신; 또는 (ii) 리신 활성이 있고, 서열번호 203, 74, 78, 124, 84, 22, 96, 26, 56, 118, 58, 60, 64, 66, 28, 68, 173 또는 175 중 적어도 하나의 폴리펩타이드 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드; 또는 (iii) 리신의 활성 단편; 및 (b) 다음의 폴리펩타이드 서열을 포함하는 제2 성분: (i) Chp1(서열번호 133), Chp2(서열번호 70), CPAR39(서열번호 135), Chp3(서열번호 137), Chp4(서열번호 102), Chp6(서열번호 106), Chp7(서열번호 139), Chp8(서열번호 141), Chp9(서열번호 143), Chp10(서열번호 145), Chp11(서열번호 147), Chp12(서열번호 149), Gkh1(서열번호 151), Gkh2(서열번호 90), Unp1(서열번호 153), Ecp1(서열번호 155), Ecp2(서열번호 104), Tma1(서열번호 157), Osp1(서열번호 108), Unp2(서열번호 159), Unp3(서열번호 161), Gkh3(서열번호 163), Unp5(서열번호 165), Unp6(서열번호 167), Spi1(서열번호 169), Spi2(서열번호 171), Ecp3(서열번호 177), Ecp4(서열번호 179), ALCES1(서열번호 181), AVQ206(서열번호 183), AVQ244(서열번호 185), CDL907(서열번호 187), AGT915(서열번호 189), HH3930(서열번호 191), Fen7875(서열번호 193), SBR77(서열번호 195), Bdp1(서열번호 197), LVP1(서열번호 199), Lvp2(서열번호 201), 에스쿨렌틴(esculentin) 단편(서열번호 80), RI12(서열번호 88), TI15(서열번호 94), RI18(서열번호 92), FIRL(서열번호 114), LPS 결합 단백질 단편(서열번호 76), RR12whydro(서열번호 110), RI18 펩타이드 유도체(서열번호 131) 및 양이온성 펩타이드(서열번호 120)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 항미생물 펩타이드(AMP) 또는 (ii) 서열번호 133, 70, 135, 137, 102, 106, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 90, 153, 155, 104, 157, 108, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 199, 201, 80, 88, 94, 92, 114, 76, 110, 131 및 120 중 적어도 하나와 적어도 80% 동일한, AMP 활성이 있는 폴리펩타이드를 포함하는 리신-AMP 폴리펩타이드 작제물에 관한 것이며, 여기서 상기 리신-AMP 폴리펩타이드 작제물은 인간 혈청의 부재 및/또는 존재하에 또는 폐 계면활성제의 존재하에 피. 아에루기노사 박테리아 성장 억제, 피. 아에루기노사 박테리아 개체군 감소 및/또는 피. 아에루기노사 사멸로부터 선택된 적어도 하나의 활성을 포함한다.
[15] 또 다른 측면에서, 본 개시내용은 GN121(서열번호 175), GN217 리신(서열번호 8), GN394 리신(서열번호 48), GN396 리신(서열번호 50), GN408 리신(서열번호 52), GN418 리신(서열번호 54), GN428(서열번호 60), 및 GN486(서열번호 66) 또는 이의 활성 단편으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 리신을 포함하는 단리된 폴리펩타이드에 관한 것이며, 여기서 상기 리신 또는 이의 활성 단편은 인간 혈청의 부재 및/또는 존재하에 또는 폐 계면활성제의 존재하에 피. 아에루기노사 박테리아 성장을 억제하고/하거나, 피. 아에루기노사 박테리아 개체군을 감소시키고/시키거나 피. 아에루기노사를 사멸시킨다.
[16] 본 개시내용은 또한 리신-항미생물 펩타이드(AMP) 폴리펩타이드 작제물을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이며, 상기 핵산 분자는
(a) 다음을 포함하는 제1 성분을 인코딩하는 제1 핵산 분자: (i) GN76(서열번호 203), GN4(서열번호 74), GN146(서열번호 78), GN14(서열번호 124), 임의로 단일 pI-증가 돌연변이가 있는 GN37(서열번호 84), 임의로 단일 점 돌연변이가 있는 GN316(서열번호 22), 리신 Pap2_gp17(서열번호 96), GN329(서열번호 26), GN424(서열번호 56), GN202(서열번호 118), GN425(서열번호 58), GN428(서열번호 60), GN431(서열번호 64), GN486(서열번호 66), GN333(서열번호 28), GN485(서열번호 68), GN123(서열번호 173) 및 GN121(서열번호 175)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 리신; 또는 (ii) 리신 활성이 있고, 서열번호 203, 74, 78, 124, 84, 22, 96, 26, 56, 118, 58, 60, 64, 66, 28, 68, 173 또는 175 중 적어도 하나와 적어도 80% 동일한 폴리펩타이드; 또는 (iii) 리신의 활성 단편; 및
(b) 다음을 포함하는 제2 성분을 인코딩하는 제2 핵산 분자: (i) Chp1(서열번호 133), Chp2(서열번호 70), CPAR39(서열번호 135), Chp3(서열번호 137), Chp4(서열번호 102), Chp6(서열번호 106), Chp7(서열번호 139), Chp8(서열번호 141), Chp9(서열번호 143), Chp10(서열번호 145), Chp11(서열번호 147), Chp12(서열번호 149), Gkh1(서열번호 151), Gkh2(서열번호 90), Unp1(서열번호 153), Ecp1(서열번호 155), Ecp2(서열번호 104), Tma1(서열번호 157), Osp1(서열번호 108), Unp2(서열번호 159), Unp3(서열번호 161), Gkh3(서열번호 163), Unp5(서열번호 165), Unp6(서열번호 167), Spi1(서열번호 169), Spi2(서열번호 171), Ecp3(서열번호 177), Ecp4(서열번호 179), ALCES1(서열번호 181), AVQ206(서열번호 183), AVQ244(서열번호 185), CDL907(서열번호 187), AGT915(서열번호 189), HH3930(서열번호 191), Fen7875(서열번호 193), SBR77(서열번호 195), Bdp1(서열번호 197), LVP1(서열번호 199), Lvp2(서열번호 201), 에스쿨렌틴 단편(서열번호 80), RI12(서열번호 88), TI15(서열번호 94), RI18(서열번호 92), FIRL(서열번호 114), LPS 결합 단백질 단편(서열번호 76), RR12whydro(서열번호 110), RI18 펩타이드 유도체(서열번호 131) 및 양이온성 펩타이드(서열번호 120)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 항미생물 펩타이드(AMP) 또는 (ii) 서열번호 133, 70, 135, 137, 102, 106, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 90, 153, 155, 104, 157, 108, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 199, 201, 80, 88, 94, 92, 114, 76, 110, 131 및 120 중 적어도 하나와 적어도 80% 동일한, AMP 활성이 있는 폴리펩타이드를 포함하고, 여기서 상기 리신-AMP 폴리펩타이드 작제물은 인간 혈청의 부재 및/또는 존재하에 또는 폐 계면활성제의 존재하에 피. 아에루기노사 박테리아 성장 억제, 피. 아에루기노사 박테리아 개체군 감소 및/또는 피. 아에루기노사 사멸로부터 선택된 적어도 하나의 활성을 포함한다.
[17] 또 다른 양태에서, 본 개시내용은 GN121(서열번호 175), GN217 리신(서열번호 8), GN394 리신(서열번호 48), GN396 리신(서열번호 50), GN408 리신(서열번호 52), GN418 리신(서열번호 54), GN428(서열번호 60), 및 GN486(서열번호 66) 또는 이의 활성 단편으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 리신을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드 서열에 관한 것이며, 여기서 상기 리신 또는 이의 활성 단편은 인간 혈청의 부재 및/또는 존재하에 또는 폐 계면활성제의 존재하에 피. 아에루기노사 박테리아 성장을 억제하고/하거나, 피. 아에루기노사 박테리아 개체군을 감소시키고/시키거나 피. 아에루기노사를 사멸시킨다.
[18] 일 측면에서, 본 개시내용은 단리된 리신 및/또는 리신-항미생물 펩타이드(AMP) 폴리펩타이드 작제물 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이며,
여기서 상기 단리된 리신은 (i) GN121(서열번호 175), GN123(서열번호 173), GN217(서열번호 8), GN316 변이체(서열번호 24), GN316(서열번호 22), GN329(서열번호 26), GN333(서열번호 28), GN394(서열번호 48), GN396(서열번호 50), GN408(서열번호 52), GN418(서열번호 54), GN424(서열번호 56), GN425(서열번호 58), GN428(서열번호 60), GN431(서열번호 64), GN486(서열번호 66), GN485(서열번호 68), 리신 PaP2_gp17(서열번호 96), (ii) 이의 활성 단편, 또는 (iii) 리신 활성이 있고, 서열번호 175, 173, 8, 24, 22, 26, 28, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 64, 66, 68, 또는 96 중 적어도 하나의 폴리펩타이드 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드 중 적어도 하나를 포함하고;
상기 리신-AMP 폴리펩타이드 작제물은 (a) 다음의 폴리펩타이드 서열을 포함하는 제1 성분: (i) GN76(서열번호 203), GN4(서열번호 74), GN146(서열번호 78), GN14(서열번호 124), 임의로 단일 pI-증가 돌연변이가 있는 GN37(서열번호 84), 임의로 단일 점 돌연변이가 있는 GN316(서열번호 22), 리신 Pap2_gp17(서열번호 96), GN329(서열번호 26), GN424(서열번호 56), GN202(서열번호 118), GN425(서열번호 58), GN428(서열번호 60), GN431(서열번호 64), GN486(서열번호 66), GN333(서열번호 28), GN485(서열번호 68), GN123(서열번호 173) 및 GN121(서열번호 175)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 리신; 또는 (ii) 리신 활성이 있고, 서열번호 203, 74, 78, 124, 84, 22, 96, 26, 56, 118, 58, 60, 64, 66, 28, 68, 173 또는 175 중 적어도 하나의 폴리펩타이드 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드; 또는 (iii) 리신의 활성 단편; 및 (b) 다음의 폴리펩타이드 서열을 포함하는 제2 성분: (i) Chp1(서열번호 133), Chp2(서열번호 70), CPAR39(서열번호 135), Chp3(서열번호 137), Chp4(서열번호 102), Chp6(서열번호 106), Chp7(서열번호 139), Chp8(서열번호 141), Chp9(서열번호 143), Chp10(서열번호 145), Chp11(서열번호 147), Chp12(서열번호 149), Gkh1(서열번호 151), Gkh2(서열번호 90), Unp1(서열번호 153), Ecp1(서열번호 155), Ecp2(서열번호 104), Tma1(서열번호 157), Osp1(서열번호 108), Unp2(서열번호 159), Unp3(서열번호 161), Gkh3(서열번호 163), Unp5(서열번호 165), Unp6(서열번호 167), Spi1(서열번호 169), Spi2(서열번호 171), Ecp3(서열번호 177), Ecp4(서열번호 179), ALCES1(서열번호 181), AVQ206(서열번호 183), AVQ244(서열번호 185), CDL907(서열번호 187), AGT915(서열번호 189), HH3930(서열번호 191), Fen7875(서열번호 193), SBR77(서열번호 195), Bdp1(서열번호 197), LVP1(서열번호 199), Lvp2(서열번호 201), 에스쿨렌틴 단편(서열번호 80), RI12(서열번호 88), TI15(서열번호 94), RI18(서열번호 92), FIRL(서열번호 114), LPS 결합 단백질 단편(서열번호 76), RR12whydro(서열번호 110), RI18 펩타이드 유도체(서열번호 131) 및 양이온성 펩타이드(서열번호 120)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 항미생물 펩타이드(AMP) 또는 (ii) 서열번호 133, 70, 135, 137, 102, 106, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 90, 153, 155, 104, 157, 108, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 199, 201, 80, 88, 94, 92, 114, 76, 110, 131 및 120 중 적어도 하나와 적어도 80% 동일한, AMP 활성이 있는 폴리펩타이드를 포함하고, 여기서 약제학적 조성물은 인간 혈청의 부재 및/또는 존재하에 또는 폐 계면활성제의 존재하에 피. 아에루기노사 박테리아 성장 억제, 피. 아에루기노사 박테리아 개체군 감소 및/또는 피. 아에루기노사 사멸로부터 선택된 적어도 하나의 활성을 포함한다.
[19] 또 다른 측면에서, 본 개시내용은 그람-음성균에 의해 유발된 박테리아 감염을 치료하는 방법에 관한 것이며, 여기서 상기 그람-음성균은 피. 아에루기 노사 및 임의로 하나 이상의 추가 종의 그람-음성균을 포함하고, 상기 방법은 박테리아 감염으로 진단받거나 박테리아 감염 위험이 있거나 박테리아 감염 증상을 나타내는 대상체에게 본원에 기재된 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, 박테리아 감염은 폐 계면활성제가 존재하는 장기 또는 조직, 예를 들어 폐 또는 기도에 있다.
[20] 또 다른 양태에서, 본 개시내용은 박테리아 감염으로 진단되거나 박테리아 감염 위험이 있거나 박테리아 감염 증상을 나타내는 대상체에게, 제1 유효량의 본원에 기재된 약제학적 조성물, 및 제2 유효량의 그람-음성균 감염의 치료에 적합한 항생제의 조합을 공투여하는 단계를 포함하는 박테리아 감염을 예방하거나 치료하는 방법에 관한 것이다.
[21] 일 측면에서, 본 개시내용은 그람-음성균 감염의 치료에 적합한 항생제의 효능을 증가시키는 방법에 관한 것으로, 유효량의 단리된 리신 및/또는 리신-항미생물 펩타이드(AMP) 폴리펩타이드 작제물을 함유하는 조성물과 함께 항생제를 공투여하는 단계를 포함하는 방법이며,
여기서 상기 단리된 리신은 (i) GN121(서열번호 175), GN123(서열번호 173), GN217(서열번호 8), GN316 변이체(서열번호 24), GN316(서열번호 22), GN329(서열번호 26), GN333(서열번호 28), GN394(서열번호 48), GN396(서열번호 50), GN408(서열번호 52), GN418(서열번호 54), GN424(서열번호 56), GN425(서열번호 58), GN428(서열번호 60), GN431(서열번호 64), GN486(서열번호 66), GN485(서열번호 68), 리신 PaP2_gp17(서열번호 96), 또는 (ii) 이의 활성 단편, 또는 (iii) 리신 활성이 있고, 서열번호 175, 173, 8, 24, 22, 26, 28, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 64, 66, 68, 또는 96 중 적어도 하나의 폴리펩타이드 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드 중 적어도 하나를 포함하고;
상기 리신-AMP 폴리펩타이드 작제물은 (a) 다음의 폴리펩타이드 서열을 포함하는 제1 성분: (i) GN76(서열번호 203), GN4(서열번호 74), GN146(서열번호 78), GN14(서열번호 124), 임의로 단일 pI-증가 돌연변이가 있는 GN37(서열번호 84), 임의로 단일 점 돌연변이가 있는 GN316(서열번호 22), 리신 Pap2_gp17(서열번호 96), GN329(서열번호 26), GN424(서열번호 56), GN202(서열번호 118), GN425(서열번호 58), GN428(서열번호 60), GN431(서열번호 64), GN486(서열번호 66), GN333(서열번호 28), GN485(서열번호 68), GN123(서열번호 173) 및 GN121(서열번호 175)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 리신; 또는 (ii) 리신 활성이 있고, 서열번호 203, 74, 78, 124, 84, 22, 26, 56, 118, 58, 60, 64, 66, 28, 68, 173 또는 175 중 적어도 하나의 폴리펩타이드 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드; 또는 (iii) 리신의 활성 단편; 및 (b) 다음의 폴리펩타이드 서열을 포함하는 제2 성분: (i) Chp1(서열번호 133), Chp2(서열번호 70), CPAR39(서열번호 135), Chp3(서열번호 137), Chp4(서열번호 102), Chp6(서열번호 106), Chp7(서열번호 139), Chp8(서열번호 141), Chp9(서열번호 143), Chp10(서열번호 145), Chp11(서열번호 147), Chp12(서열번호 149), Gkh1(서열번호 151), Gkh2(서열번호 90), Unp1(서열번호 153), Ecp1(서열번호 155), Ecp2(서열번호 104), Tma1(서열번호 157), Osp1(서열번호 108), Unp2(서열번호 159), Unp3(서열번호 161), Gkh3(서열번호 163), Unp5(서열번호 165), Unp6(서열번호 167), Spi1(서열번호 169), Spi2(서열번호 171), Ecp3(서열번호 177), Ecp4(서열번호 179), ALCES1(서열번호 181), AVQ206(서열번호 183), AVQ244(서열번호 185), CDL907(서열번호 187), AGT915(서열번호 189), HH3930(서열번호 191), Fen7875(서열번호 193), SBR77(서열번호 195), Bdp1(서열번호 197), LVP1(서열번호 199), Lvp2(서열번호 201), 에스쿨렌틴 단편(서열번호 80), RI12(서열번호 88), TI15(서열번호 94), RI18(서열번호 92), FIRL(서열번호 114), LPS 결합 단백질 단편(서열번호 76), RR12whydro(서열번호 110), RI18 펩타이드 유도체(서열번호 131) 및 양이온성 펩타이드(서열번호 120)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 항미생물 펩타이드(AMP) 또는 (ii) 서열번호 133, 70, 135, 137, 102, 106, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 90, 153, 155, 104, 157, 108, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 199, 201, 80, 88, 94, 92, 114, 76, 110, 131 및 120 중 적어도 하나와 적어도 80% 동일한, AMP 활성이 있는 폴리펩타이드를 포함하고, 여기서 상기 조성물은 인간 혈청의 부재 및/또는 존재하에 또는 폐 계면활성제의 존재하에 피. 아에루기노사 박테리아 성장 억제, 피. 아에루기노사 박테리아 개체군 감소 및/또는 피. 아에루기노사 사멸로부터 선택된 적어도 하나의 활성을 포함하고, 상기 조합의 투여는 항생제 또는 리신 또는 리신-AMP 폴리펩타이드 작제물을 개별적으로 투여하는 것보다 인간 혈청의 존재 또는 부재하에 또는 존재 및 부재 둘 다에서 또는 폐 계면활성제의 존재하에 성장 억제, 개체군 감소, 또는 그람-음성균 사멸에 더 효과적이다.
[22] 또 다른 측면에서, 본 개시내용은 적어도 하나의 그람-음성균 종의 성장을 억제하거나 개체군을 감소시키거나 사멸시키는 방법에 관한 것이며, 여기서 적어도 하나의 그람-음성균 종은 피. 아에루기노사 및 임의로 하나 이상의 추가 그람-음성균 종이고, 상기 방법은 상기 박테리아를 유효량의 단리된 리신 및/또는 리신-항미생물 펩타이드(AMP) 폴리펩타이드 작제물을 함유하는 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하고,
여기서 상기 단리된 리신은 (i) GN121(서열번호 175), GN123(서열번호 173), GN217(서열번호 8), GN316 변이체(서열번호 24), GN316(서열번호 22), GN329(서열번호 26), GN333(서열번호 28), GN394(서열번호 48), GN396(서열번호 50), GN408(서열번호 52), GN418(서열번호 54), GN424(서열번호 56), GN425(서열번호 58), GN428(서열번호 60), GN431(서열번호 64), GN486(서열번호 66), GN485(서열번호 68), 리신 PaP2_gp17(서열번호 96), 또는 (ii) 이의 활성 단편, 또는 (iii) 리신 활성이 있고, 서열번호 175, 173, 8, 24, 22, 26, 28, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 64, 66, 68, 또는 96 중 적어도 하나의 폴리펩타이드 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드 중 적어도 하나를 포함하고;
상기 리신-AMP 폴리펩타이드 작제물은 (a) 다음의 폴리펩타이드 서열을 포함하는 제1 성분: (i) GN76(서열번호 203), GN4(서열번호 74), GN146(서열번호 78), GN14(서열번호 124), 임의로 단일 pI-증가 돌연변이가 있는 GN37(서열번호 84), 임의로 단일 점 돌연변이가 있는 GN316(서열번호 22), 리신 Pap2_gp17(서열번호 96), GN329(서열번호 26), GN424(서열번호 56), GN202(서열번호 118), GN425(서열번호 58), GN428(서열번호 60), GN431(서열번호 64), GN486(서열번호 66), GN333(서열번호 28), GN485(서열번호 68), GN123(서열번호 173) 및 GN121(서열번호 175)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 리신; 또는 (ii) 리신 활성이 있고, 서열번호 203, 74, 78, 124, 84, 22, 96, 26, 56, 118, 58, 60, 64, 66, 28, 68, 173 또는 175 중 적어도 하나의 폴리펩타이드 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드; 또는 (iii) 리신의 활성 단편; 및 다음의 폴리펩타이드 서열을 포함하는 제2 성분: (i) Chp1(서열번호 133), Chp2(서열번호 70), CPAR39(서열번호 135), Chp3(서열번호 137), Chp4(서열번호 102), Chp6(서열번호 106), Chp7(서열번호 139), Chp8(서열번호 141), Chp9(서열번호 143), Chp10(서열번호 145), Chp11(서열번호 147), Chp12(서열번호 149), Gkh1(서열번호 151), Gkh2(서열번호 90), Unp1(서열번호 153), Ecp1(서열번호 155), Ecp2(서열번호 104), Tma1(서열번호 157), Osp1(서열번호 108), Unp2(서열번호 159), Unp3(서열번호 161), Gkh3(서열번호 163), Unp5(서열번호 165), Unp6(서열번호 167), Spi1(서열번호 169), Spi2(서열번호 171), Ecp3(서열번호 177), Ecp4(서열번호 179), ALCES1(서열번호 181), AVQ206(서열번호 183), AVQ244(서열번호 185), CDL907(서열번호 187), AGT915(서열번호 189), HH3930(서열번호 191), Fen7875(서열번호 193), SBR77(서열번호 195), Bdp1(서열번호 197), LVP1(서열번호 199), Lvp2(서열번호 201), 에스쿨렌틴 단편(서열번호 80), RI12(서열번호 88), TI15(서열번호 94), RI18(서열번호 92), FIRL(서열번호 114), LPS 결합 단백질 단편(서열번호 76), RR12whydro(서열번호 110), RI18 펩타이드 유도체(서열번호 131) 및 양이온성 펩타이드(서열번호 120)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 항미생물 펩타이드(AMP) 또는 (ii) AMP 활성을 갖고, 서열번호 133, 70, 135, 137, 102, 106, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 90, 153, 155, 104, 157, 108, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 199, 201, 80, 88, 94, 92, 114, 76, 110, 131 및 120 중 적어도 하나와 적어도 80% 동일한 폴리펩타이드를 포함하고, 여기서 상기 조성물은 인간 혈청의 부재 및/또는 존재하에 또는 폐 계면활성제의 존재하에 피. 아에루기노사 박테리아 성장 억제, 피. 아에루기노사 박테리아 개체군 감소 및/또는 피. 아에루기노사 사멸로부터 선택된 적어도 하나의 활성을 포함한다.
[23] 도 1은 클라미디아(Chlamydia) 파지 펩타이드(Chp) 계열 구성원 Chp1, Chp 2, Chp4, Chp5, Chp6, Chp7, Ecp1, Ecp2, 및 Osp1의 구조에 대해 I-테이저(I-Tasser)에 의해 예측된 3차원 모델을 도시한다. 인간 선천 면역 효과기 펩타이드 LL-37이 비교용으로 포함된다. 알파 나선 구조가 분명하며, 상단 말단은 일반적으로 N-말단이다.
[24] 도 2a는 실시예 6에 기재된 바와 같이, N-페닐-1-나프틸아민(NPN) 및 완충액, GN121, 또는 GN351의 존재하에 피. 아에루기노사에 대한 시간 경과에 따른 상대 형광 단위(RFU) 백분율을 보여주는 그래프이다.
[25] 도 2b는 실시예 6에 기재된 바와 같이, NPN 및 완충액, GN428, 또는 GN370의 존재하에 피. 아에루기노사에 대한 시간 경과에 따른 RFU 백분율을 보여주는 그래프이다.
[26] 도 3은 100% 인간 혈청에서 GN121(10 μg/mL) 또는 완충액 대조군("미처리")으로 15분 동안 처리된 슈도모나스 아에루기노사 균주 1292의 현미경 분석(x2000배율)을 보여주는 일련의 현미경사진이다. 샘플을 생/죽은 세포 생존력 키트(써모피셔(ThermoFisher))를 사용하여 염색하고, 미분 간섭 대비(DIC) 및 형광 현미경 둘 모두로 검사했다. 현미경사진은 실시예 7에 기재된 바와 같이, 처리되지 않은 행에서 죽은 박테리아의 부재 및 처리된 행에서 살아있는 박테리아의 감소를 보여준다.
[27] 도 4a 내지 4e는 실시예 9에 기재된 바와 같이 21일 연속 계대에 걸쳐 피. 아에루기노사(균주 WC-452)에 대한 최소 억제 농도(MIC)를 달성하는데 필요한 GN 리신 및 시프로플록사신의 배수 변화를 보여준다: GN121 (도 4a), GN351 (도 4b), GN370 (도 4c), GN428 (도 4d) 및 시프로플록사신 (도 4e).
정의
[28] 본원에 사용된 다음 용어 및 동어는 문맥상 달리 명시되지 않는 한 다음과 같은 의미를 가질 것이다:
[29] "담체"는 활성 화합물과 함께 투여되는 용매, 첨가제, 부형제, 분산매, 가용화제, 코팅제, 보존제, 등장화제 및 흡수 지연제, 계면활성제, 추진제, 희석제, 비히클 등을 나타낸다. 이러한 담체는 멸균 액체, 예를 들어 물, 식염수, 수성 덱스토로스 용액, 수성 글리세롤 용액, 및 석유, 동물, 식물 또는 합성 기원의 오일, 예를 들어 땅콩유, 대두유, 광유, 참깨유 등을 포함하는 오일일 수 있다.
[30] "약제학적으로 허용되는 담체"는 생리적으로 혼화성인 임의의 및 모든 용매, 첨가제, 부형제, 분산매, 가용화제, 코팅제, 보존제, 등장화제 및 흡수 지연제, 계면활성제, 추진제, 희석제, 비히클 등을 나타낸다. 담체(들)는 통상적으로 약제에 사용되는 양으로 치료될 피험자에게 해롭지 않다는 의미에서 "허용 가능" 해야 한다. 약제학적으로 허용되는 담체는 조성물을 의도된 목적에 부적합하게 만들지 않으면서 조성물의 다른 성분과 혼화성이다. 또한, 약제학적으로 허용되는 담체는 과도한 불리한 부작용(예를 들어 독성, 자극 및 알레르기 반응) 없이 본원에 제공된 대상체와 함께 사용하기에 적합하다. 부작용의 위험이 조성물이 제공하는 이점보다 클 때 부작용은 "과도"하다. 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제의 비제한적인 예로는 표준 약제학적 담체 예를 들어 인산염 완충 식염수, 물 및 에멀젼 예를 들어 유/수 에멀젼 및 마이크로에멀젼 중 어느 것이 포함된다. 적합한 약제학적 담체는, 예를 들어, 문헌(참조: Remington's Pharmaceutical Sciences by E.W. Martin, 18th Edition)에 기재되어 있다. 약제학적으로 허용되는 담체는 자연에 존재하지 않는 담체일 수 있다.
[31] "살균성" 또는 "살균 활성"은 박테리아 사멸을 유발하거나 18 내지 24시간에 걸쳐 초기 박테리아 개체군에서 박테리아를 적어도 3-log10(99.9%) 정도 또는 더 나은 감소까지 사멸시킬 수 있는 특성을 나타낸다.
[32] "정균성" 또는 "정균 활성"은 성장하는 박테리아 세포를 억제하는 것을 포함한 박테리아 성장을 억제하여 18 내지 24시간에 걸쳐 초기 박테리아 개체군에서 2-log10(99%) 또는 더 나은 감소 및 최대 3-log 바로 아래까지 감소를 야기하는 특성을 나타낸다.
[33] "항균제"는 정균제 및 살균제 둘 다를 지칭한다.
[34] "항생제"는 치사율 또는 성장 감소와 같은 박테리아에 부정적인 영향을 미치는 특성을 갖는 화합물을 나타낸다. 항생제는 그람-양성균, 그람-음성균, 또는 둘 모두에 대해 부정적인 영향을 미칠 수 있다. 예로서, 항생제는 세포벽 펩티도글리칸 생합성, 세포막 완전성 또는 박테리아의 DNA 또는 단백질 합성에 영향을 미칠 수 있다. 그람-음성균에 대해 활성인 항생제의 비제한적인 예로는 세팔로 스포린, 예를 들어 세프트리악손-세포탁심, 세프타지딤, 세페핌, 세포페라존, 및 세프토비프롤; 플루오로퀴놀론 예를 들어 시프로플록사신 및 레보플록사신; 아미노글리코시드 예를 들어 겐타마이신, 토브라마이신, 및 아미카신; 피페라실린, 티카르실린, 이미페넴, 메로페넴, 도리페넴, 베타-락타마아제 억제제가 있거나 없는 광범위 페니실린, 리팜피신, 폴리믹신 B, 및 콜리스틴이 포함된다.
[35] "약물 내성"은 일반적으로 약물의 항균 활성에 내성이 있는 박테리아를 지칭한다. 특정 방식으로 사용되는 경우, 약물 내성은 구체적으로 항생제 내성을 지칭할 수 있다. 어떤 경우에는 일반적으로 특정 항생제에 민감한 박테리아가 항생제에 대한 내성을 발달시켜 약물 내성 미생물 또는 균주가 될 수 있다. "다약 제 내성"("MDR") 병원균은 각각 단일요법으로 사용되는 적어도 두 가지 종류의 항미생물 약물에 내성이 발달한 병원균이다. 예를 들어, 에스 . 아우레우스(S. aureus)의 특정 균주는 메티실린 및/또는 반코마이신을 포함한 여러 항생제에 내성이 있는 것으로 밝혀졌다(참조: Antibiotic Resistant Threats in the United States, 2013, U.S. Department of Health and Services, Centers for Disease Control and Prevention). 당업자는 약물 또는 항생제에 대한 박테리아의 감수성 또는 내성을 결정하는 일상적인 실험실 기술을 사용하여 박테리아가 약물 내성인지 여부를 쉽게 결정할 수 있다.
[36] "유효량"은 적절한 빈도 또는 투여 요법으로 적용 또는 투여될 때, 박테리아 성장 또는 박테리아 부하를 예방, 감소, 억제 또는 제거하거나 치료되는 장애(예를 들어, 그람-음성 세균성 병원균 성장 또는 감염)의 발병, 중증도, 기간 또는 진행을 예방, 감소 또는 개선하거나, 치료되는 장애의 진행을 예방하거나, 치료되는 장애의 퇴행을 유발하거나, 항생제 또는 정균 요법과 같이 또 다른 요법의 예방 또는 치료 효과(들)를 향상 또는 개선하기에 충분한 양을 나타낸다.
[37] "공투여하다"는 리신 또는 리신-AMP 폴리펩타이드 및 항생제 또는 임의의 다른 항균제와 같은 두 가지 제제를 순차적으로 투여하는 것뿐만 아니라 이들 제제를, 예를 들어, 단일 혼합물/조성물 또는 별도로 제공된 용량으로 실질적으로 동시에 투여하는 것을 의미하지만, 그럼에도 불구하고 대상체에게 실질적으로 동시에, 예를 들어 같은 날 또는 24시간 기간 내에 상이한 시기에 투여된다. 리신 또는 리신-AMP 폴리펩타이드와 같은 두 가지 제제를 하나 이상의 추가 항균제와 함께 공투여하는 것은 최대 며칠, 몇 주 또는 몇 달까지 지속되는 연속 치료로 제공될 수 있다. 또한, 사용에 따라 공투여는 연속적이거나 공존할 필요는 없다. 예를 들어, 세균성 궤양 또는 감염된 당뇨병성 궤양을 치료하기 위한 국소 항균제로 사용된 경우, 리신 또는 리신-AMP 폴리펩타이드는 추가 항생제를 투여하고 24시간 이내에만 최초로 투여될 수 있으며, 이후 추가 항생제 사용은 리신 또는 리신-AMP 폴리펩타이드의 추가 투여 없이 계속될 수 있다.
[38] "대상체"는 포유동물, 식물, 하등 동물, 단세포 유기체 또는 세포 배양물을 지칭한다. 예를 들어, 용어 "대상체"는 박테리아 감염, 예를 들어 그람-양성균 또는 그람-음성균 감염에 민감하거나 이로 고통받는 유기체, 예를 들어, 원핵생물 및 진핵생물을 포함하는 것으로 의도된다. 대상체의 예로는 포유동물, 예를 들어, 인간, 개, 소, 말, 돼지, 양, 염소, 고양이, 마우스, 토끼, 랫트 및 형질전환 비-인간 동물이 포함된다. 특정 구현예에서, 대상체는, 감염이 전신, 국소 또는 달리 특정 장기 또는 조직에 집중되거나 국한되는지 여부에 관계없이, 인간, 예를 들어, 그람-음성균으로 고통받거나, 고통받을 위험이 있거나, 이에 민감한 인간이다.
[39] "폴리펩타이드"는 본원에서 용어 "펩타이드" 또는 "단백질"과 상호교환적으로 사용되며, 아미노산 잔기로 만들어지고 일반적으로 적어도 약 30개의 아미노산 잔기를 갖는 중합체를 지칭한다. 이 용어는 단리된 형태의 폴리펩타이드뿐만 아니라 이의 활성 단편 및 유도체도 포함한다. 용어 "폴리펩타이드"는 또한 본원에 기재된 리신 또는 AMP를 포함하고, 예를 들어 용해 기능을 유지하는 융합 단백질 또는 융합 폴리펩타이드를 포함한다. 상황에 따라, 폴리펩타이드는 자연 발생 폴리펩타이드 또는 재조합, 조작된 또는 합성적으로 생산된 폴리펩타이드일 수 있다. 예를 들어, 특정 리신 폴리펩타이드는, 예를 들어, 천연 단백질로부터 효소적 또는 화학적 절단에 의해 유래되거나 제거될 수 있거나, 통상적인 펩타이드 합성 기술(예를 들어, 고체상 합성) 또는 분자 생물학 기술(예를 들어 문헌[참조: Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)]에 개시된 기술)을 사용하여 제조될 수 있거나, 예를 들어, 동일하거나 적어도 하나의 공통 표적 박테리아에 대한 용해 활성을 유지하면서 전략적으로 절단되거나 분할되어 활성 단편을 생성할 수 있다.
[40] "융합 폴리펩타이드"는 통상적으로 상이한 특성 또는 기능을 갖는 2개 이상의 도메인 또는 절편을 통상적으로 갖는 융합된 발현 산물을 초래하는, 2개 이상의 핵산 절편의 융합으로 생성된 발현 산물을 지칭한다. 보다 상세한 의미에서, 용어 "융합 폴리펩타이드"는 또한 직접적으로 또는 아미노산 또는 펩타이드 링커를 통해 공유 결합된 2개 이상의 이종 폴리펩타이드 또는 펩타이드를 포함하는 폴리펩타이드 또는 펩타이드를 지칭할 수 있다. 융합 폴리펩타이드를 형성하는 폴리펩타이드는 통상적으로 C-말단에서 N-말단으로 연결되어 있지만, 이는 또한 C-말단에서 C-말단으로, N-말단에서 N-말단으로, 또는 N-말단에서 C-말단으로 연결될 수 있다. 용어 "융합 폴리펩타이드"는 용어 "융합 단백질"과 상호교환적으로 사용될 수 있다. 특정 구조를 "포함하는 폴리펩타이드"라는 개방형 표현은 융합 폴리펩타이드와 같이 언급된 구조보다 더 큰 분자를 포함한다.
[41] "이종"은 자연적으로 인접하지 않은 뉴클레오타이드, 펩타이드 또는 폴리펩타이드 서열을 지칭한다. 예를 들어, 본 개시내용의 맥락에서, 용어 "이종"은 2개 이상의 펩타이드 및/또는 폴리펩타이드의 조합 또는 융합을 설명하는데 사용될 수 있으며, 여기서 융합 펩타이드 또는 폴리펩타이드는, 예를 들어 리신 또는 이의 활성 단편 및 양이온성 및/또는 다양이온성 펩타이드, 양극성 펩타이드, 스시 펩타이드(sushi peptide)(참조: Ding et al. Cell Mol Life Sci., 65(7-8):1202-19 (2008)), 디펜신 펩타이드(참조: Ganz, T. Nature Reviews Immunology 3, 710-720 (2003)), 소수성 펩타이드(용해 활성을 향상시킬 수 있음)를 포함하는 항미생물 펩타이드와 같이 자연에서 보통 발견되지 않는다.
[42] "활성 단편"은 단편이 취해진 단리된 폴리펩타이드의 하나 이상의 기능 또는 생물학적 활성, 예를 들어 하나 이상의 그람-음성균에 대한 살균 활성을 보유하는 폴리펩타이드의 일부를 지칭한다.
[43] "양극성 펩타이드"는 친수성 및 소수성 작용기를 모두 갖는 펩타이드를 지칭한다. 특정 구현예에서, 2차 구조는 양극성 펩타이드의 반대쪽(예를 들어, 펩타이드가 물과 같은 용매에 있을 때 안쪽 대 바깥쪽)에 소수성 및 친수성 아미노산 잔기를 배치할 수 있다. 이들 펩타이드는 특정 구현예에서 알파-나선 2차 구조와 같은 나선형 2차 구조를 채택할 수 있다.
[44] "양이온성 펩타이드"는 양으로 하전된 아미노산 잔기의 비율이 높은 펩타이드를 지칭한다. 특정 구현예에서, 양이온성 펩타이드는 pKa-값이 8.0 이상이다. 본 개시내용의 맥락에서 용어 "양이온성 펩타이드"는 또한 리신(Lys) 및/또는 아르기닌(Arg) 잔기와 같이 대부분 양으로 하전된 아미노산 잔기로 구성된 합성적으로 생성된 펩타이드인 다양이온성 펩타이드를 포함한다. 양으로 하전되지 않은 아미노산 잔기는 중성으로 하전된 아미노산 잔기, 음으로 하전된 아미노산 잔기 및/또는 소수성 아미노산 잔기일 수 있다.
[45] "소수성 그룹"은 물 분자에 대해서는 친화성이 낮거나 전혀 없지만 오일 분자에 대해서는 친화성이 높은 아미노산 측쇄와 같은 화학 그룹을 지칭한다. 소수성 물질은 물 또는 수성 상에서 용해도가 낮거나 전혀 없는 경향이 있으며, 통상적으로 무극성이지만 오일상에서 용해도가 높은 경향이 있다. 소수성 아미노산의 예로는 글리신(Gly), 알라닌(Ala), 발린(Val), 류신(Leu), 이소류신(Ile), 프롤린(Pro), 페닐알라닌(Phe), 메티오닌(Met) 및 트립토판(Trp)이 포함된다.
[46] "증가하는(augmenting)"은 항미생물 활성과 같은 작용제의 활성이 다른 것보다 더 높은 정도를 나타낸다. "증가하는"은 부가 효과, 및 상승적(상가적) 효과를 포함한다.
[47] "상승적" 또는 "상가적"은 독립적으로 작용하는 두 제제의 효과의 합을 초과하는 두 물질의 조합에 의해 발생하는 유익한 효과를 지칭한다. 특정 구현예에서 상승적 또는 상가적 효과는 유의하게, 즉, 통계적으로 유의하게, 독립적으로 작용하는 두 작용제의 효과의 합을 초과한다. 활성 성분 중 하나 또는 둘 모두는 하위 임계 수준, 즉, 활성 물질이 개별적으로 사용되는 경우 효과가 없거나 매우 제한적인 수준에서 사용될 수 있다. 효과는 본원에 기재된 체커보드 검정과 같은 검정으로 측정될 수 있다.
[48] "치료"는 임의의 과정, 작용, 적용, 요법 등을 지칭하며, 여기서 인간과 같은 대상체는 장애 치료, 병원균 박멸 또는 대상체의 상태의 직접 또는 간접적 개선을 목적으로 의료 지원을 받는다. 치료는 또한 발생률 감소, 증상 완화, 재발 제거, 재발 예방, 발생 예방, 발생 위험 감소, 증상 개선, 예후 개선 또는 이들의 조합을 지칭한다. "치료"는 대상체에서 박테리아의 개체군, 성장 속도 또는 독성을 감소시킴으로써 대상체에서 박테리아 감염 또는 장기, 조직 또는 환경의 박테리아 오염을 제어 또는 감소시키는 것을 추가로 포함할 수 있다. 따라서 발생률을 감소시키는 "치료"는, 예를 들어, 대상체든 환경이든 특정 환경에서 적어도 하나의 그람-음성균의 성장을 억제하는데 효과적일 수 있다. 다른 한편으로는, 이미 확립된 감염의 "치료"는 성장 억제, 개체군 감소, 감염 또는 오염의 원인이 되는 그람-음성균을 박멸하는 것을 포함하여 사멸시키는 것을 나타낸다.
[49] "예방하는"은 박테리아 감염과 같은 장애의 발생, 재발, 확산, 발병 또는 확립의 예방을 지칭한다. 본 개시내용이 감염의 완전한 예방 또는 확립의 예방으로 제한되는 것으로 의도되지 않는다. 일부 구현예에서, 발병이 지연되거나, 후속적으로 감염된(contracted) 질환의 중증도 또는 질환에 감염될 가능성이 감소되고, 이는 예방의 예가 된다.
[50] "감염된 질환"은 열, 패혈증 또는 균혈증의 검출과 같은 임상 또는 준임상 증상을 나타내는 질환뿐만 아니라 이러한 병리와 관련된 증상이 아직 나타나지 않은 경우 세균성 병원균의 성장에 의해(예를 들어, 배양으로) 검출될 수 있는 질환을 지칭한다.
[51] 펩타이드 또는 폴리펩타이드 또는 이의 활성 단편과 관련하여 용어 "유도체"는, 예를 들어, 실질적으로 악영향을 미치거나 폴리펩타이드의 활성(예를 들어, 용해 활성)을 파괴하지 않는 아미노산 이외의 하나 이상의 화학적 모이어티를 함유하도록 변형된 폴리펩타이드를 포함하는 것으로 의도된다. 화학적 모이어티는 예를 들어, 아미노 말단 아미노산 잔기, 카복시 말단 아미노산 잔기를 통해 또는 내부 아미노산 잔기에서 펩타이드에 공유적으로 결합될 수 있다. 이러한 변형은 천연 또는 비-천연 변형일 수 있다. 특정 구현예에서, 비-천연 변형은 반응성 모이어티에 보호 그룹 또는 캡핑 그룹의 추가, 항체 및/또는 형광 표지와 같은 검출 가능한 표지의 추가, 글리코실화의 추가 또는 변형, 또는 PEG(페길화)와 같은 벌킹 그룹(bulking group)의 추가 및 당업자에게 공지된 기타 변형을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 비-천연 변형은 N-말단 아세틸화 및 C-말단 아미드화와 같은 캡핑 변형일 수 있다. 리신 폴리펩타이드 또는 AMP에 추가될 수 있는 예시적인 보호 그룹은 t-Boc 및 Fmoc를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 비제한적으로, 녹색 형광 단백질(GFP), 적색 형광 단백질(RFP), 청록색 형광 단백질(CFP), 황색 형광 단백질(YFP) 및 엠체리(mCherry)와 같이 흔히 사용되는 형광 표지 단백질은 세포 단백질의 정상적인 기능을 방해하지 않으면서 폴리펩타이드에 공유 또는 비공유 결합되거나 폴리펩타이드에 융합될 수 있는 소형(compact) 단백질이다. 특정 구현예에서, 형광 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 리신 또는 AMP 폴리뉴클레오타이드 서열의 상류 또는 하류에 삽입될 수 있다. 이로 인해, 그것이 부착된 폴리펩타이드의 세포 기능 또는 기능을 방해하지 않는 융합 단백질(예를 들어, 리신 폴리펩타이드:: GFP)이 생성될 것이다. 단백질에 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 접합은 많은 제약 단백질의 순환 반감기를 연장하는 방법으로 사용되었다. 따라서, 리신 폴리펩타이드 유도체와 같은 폴리펩타이드 유도체의 맥락에서, 용어 "유도체"는 하나 이상의 PEG 분자의 공유 부착에 의해 화학적으로 변형된 폴리펩타이드, 예를 들어 리신 폴리펩타이드를 포함한다. 페길화된 리신과 같은 리신 폴리펩타이드는 생물학적 및 치료적 활성을 유지하면서 페길화되지 않은 폴리펩타이드에 비해 순환 반감기가 연장될 것으로 예상된다.
[52] "아미노산 서열 동일성 백분율"은 서열을 정렬하고 최대 서열 동일성 백분율을 달성하기 위해 필요에 따라 갭을 도입한 후, 서열 동일성의 일부로 어떠한 보존적 치환도 고려하지 않고, 리신 폴리펩타이드 서열과 같은 기준 폴리펩타이드 서열의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열의 아미노산 잔기의 백분율을 나타낸다. 아미노산 서열 동일성 백분율을 결정하기 위한 정렬은, 예를 들어, 블라스트(BLAST)와 같은 공개적으로 이용 가능한 소프트웨어 또는, 예를 들어, 디엔에이스타(DNASTAR)로부터 상업적으로 입수가능한 소프트웨어를 사용하여 당해 분야의 기술 내에 있는 다양한 방식으로 달성될 수 있다. 둘 이상의 폴리펩타이드 서열은 0 내지 100% 동일하거나 그 사이의 임의의 정수 값일 수 있다. 본 개시내용의 맥락에서, 2개의 폴리펩타이드는 아미노산 잔기의 적어도 80%(예를 들어, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 92.5%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%)가 동일한 경우 "실질적으로 동일"하다. 본원에 기재된 용어 "아미노산 서열 동일성 백분율(%)"은 펩타이드에도 적용된다. 따라서, 용어 "실질적으로 동일한"은 본원에 기재된 단리된 리신 폴리펩타이드 및 펩타이드 및 AMP의 돌연변이된, 절단된, 융합된 또는 달리 서열-변형된 변이체, 및 이의 활성 단편뿐만 아니라 기준(야생형 또는 다른 온전한) 폴리펩타이드와 비교하여 실질적인 서열 동일성(예를 들어, 상기 언급된 하나 이상의 방법에 의해 측정된 바와 같이 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92.5%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 동일성)을 갖는 폴리펩타이드를 포함할 것이다.
[53] 본원에 사용된 바와 같이, 2개의 아미노산 서열은 아미노산 잔기의 적어도 약 80%(예를 들어, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 92.5%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%)가 동일하거나 보존적 치환을 나타내는 경우 "실질적으로 상동성"이다. 본 개시내용의 폴리펩타이드 서열은 본원에 기재된 리신, AMP 및/또는 융합 폴리펩타이드와 같은 폴리펩타이드의 아미노산의 하나 이상, 예를 들어 최대 10%, 최대 15%, 또는 최대 20%가 유사하거나 보존적인 아미노산 치환으로 치환되는 경우 실질적으로 상동성이고, 여기서 생성된 펩타이드는 본원에 기재된 리신, AMP 및/또는 융합 폴리펩타이드와 같은 기준 폴리펩타이드의 적어도 하나의 활성(예를 들어, 항균 효과) 및/또는 박테리아 특이성을 갖는다.
[54] 본원에서 사용되는 "보존적 아미노산 치환"은 아미노산 잔기가 유사한 전하를 갖는 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체되는 것이다. 전하가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 패밀리가 당해 분야에 정의되어 있다. 이러한 패밀리에는 염기성 측쇄(예를 들어, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄(예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 하전되지 않은 극성 측쇄(예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 비극성 측쇄(예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타-분지된 측쇄(예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄(예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)가 있는 아미노산이 포함된다.
[55] "흡입성 조성물"은 원자화, 분무화, 건조 분말 및/또는 에어로졸화 제형을 포함하지만, 이에 제한되지 않는, 일상적인 또는 보조 호흡(예를 들어, 기관기관지내, 폐 및/또는 비강 투여에 의한) 동안 또는 이와 함께 호흡기로 직접 전달하기 위해 제형화된 본 개시내용의 약제학적 조성물을 지칭한다.
[56] "생물막"은 박테리아 및/또는 숙주 유래 성분으로 구성될 수 있는 수화된 중합체 매트릭스에서 표면에 부착되고 응집되는 박테리아를 지칭한다. 생물막은 세포가 생물 또는 비생물 표면에서 서로 부착하는 미생물의 응집체이다. 이러한 부착성 세포는 종종, 비제한적으로, 세포외 고분자 물질(EPS)로 구성된 매트릭스 내에 포매되어 있다. 슬라임(slime)(슬라임으로 기재되는 모든 것이 생물막인 것은 아님) 또는 플라크라고도 하는 생물막 EPS는 일반적으로 세포외 DNA, 단백질 및 다당류로 구성된 중합성 복합체이다.
[57] "생물막 형성 예방"은 생물막의 발생, 재발, 확산, 개시 또는 확립을 예방하는 것을 나타낸다. 본 개시내용은 생물막의 완전한 예방 또는 확립 예방으로 제한되는 것으로 의도되지 않는다. 일부 구현예에서, 생물막의 개시가 지연되거나 생물막의 확립이 감소되거나 새로운 생물막이 형성될 가능성이 감소하며, 이는 생물막 예방의 예가 된다. 또한, 생물막의 예방은 1) 플랑크톤 박테리아의 효과적인 사멸; 2) 현탁액에 있는 "존속" 박테리아 세포, 즉, 대사적으로 비활성이고, 항생제에 내성이 있으며, 생물막 형성과 관련성이 높은 박테리아의 사멸; 및/또는 3) "응집", 즉, 단백질 또는 다당류를 통해 서로 부착하는 박테리아의 능력 예방을 포함한 임의의 메커니즘으로 인한 것일 수 있다.
[58] 생물막과 관련하여 "박멸"은 1) 생물막 내 존속 박테리아 세포를 포함하는 생물막에서 박테리아를 효과적으로 사멸시키고, 선택적으로 2) 생물막 매트릭스를 효과적으로 파괴 및/또는 손상시키는 것을 포함한다.
[59] 생물막과 관련하여 "붕괴"는 예방과 박멸 사이에 있는 메커니즘을 나타낸다. 붕괴된 생물막은 "개방되거나" 또는 달리 손상될 수 있으며, 따라서 예를 들어, 항생제가 생물막에 더 쉽게 침투하여 박테리아를 사멸시킬 수 있다.
[60] 특정 박테리아에 대해 사용하기에 적합한 항생제와 관련하여 "적합한"은 이후에 내성이 발생하더라도 해당 박테리아에 대해 효과적인 것으로 밝혀진 항생제를 나타낸다.
[61] "외막" 또는 "OM"은 그람-음성균의 특징을 나타낸다. 외막은 인지질의 내부 리플렛(internal leaflet) 및 주로 지질다당류(LPS)로 구성된 외부 양친성 리플렛이 있는 지질 이중층으로 구성된다. LPS에는 지질 A라고 하는 헥사-아실화 글루코사민-기반 인지질, 다당류 코어 및 O-항원이라고 하는 확장된 외부 다당류 사슬의 세 가지 주요 섹션이 있다. OM은 다음을 포함하는 세 가지 주요 상호작용에 의해 안정화된 비-유체 연속체를 제공한다: i) 특히 포스페이트 그룹을 중화하기 위해 양이온이 존재하는 경우, 서로에 대한 LPS 분자의 열렬한(avid) 결합; ii) 크게 포화된 아실 사슬의 단단한 패킹; 및 iii) 지질 A 모이어티의 소수성 적층. 생성된 구조는 소수성 및 친수성 분자 둘 다에 대한 장벽이다. OM 아래에 펩티도글리칸은 가수분해 절단에 매우 민감한 얇은 층을 형성하며, 두께가 30 내지 100 나노미터(nm)이고 최대 40개 층으로 구성된 그람-음성균의 펩티도글리칸과 달리, 그람-음성균의 펩티도글리칸은 두께가 겨우 2 내지 3nm이며, 1 내지 3개 층으로만 구성된다.
폴리펩타이드
리신, 변이 리신, 이의 활성 단편 또는 유도체
[62] 본 개시내용은 리신, 변이 리신, 이의 활성 단편 또는 유도체를 포함하는 단리된 폴리펩타이드에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 리신, 변이 리신, 이의 활성 단편 또는 유도체를 포함하는 단리된 폴리펩타이드는 항미생물 펩타이드("AMP")와 조합되어 리신-AMP 폴리펩타이드 작제물이 형성되고, 여기서 리신-AMP 폴리펩타이드 작제물은 리신 활성이 있다. 본원에 사용된 바와 같이 "리신 활성"은 임의로 인간 혈청 또는 폐 계면활성제의 존재하에, 리신이 박테리아(예를 들어, 피. 아에루기노사)를 사멸시키거나, 박테리아 개체군을 감소시키거나, 박테리아 성장을 억제하는(예를 들어, 그람-음성균의 외막을 침투함으로써) 능력을 포함한다. 리신 활성은 또한 임의로 인간 혈청 또는 폐 계면활성제의 존재하에, 생물막을 제거하거나 감소시키는 능력 및/또는 항생제의 최소 억제 농도(MIC)를 감소시키는 능력을 포함한다.
[63] 일부 구현예에서, 리신, 변이 리신, 이의 활성 단편 또는 이의 유도체를 포함하는 본 단리된 폴리펩타이드는 그람-음성균의 외막을 침투할 수 있다. 이론에 제한되지 않고, 외막의 침투 후, 리신, 변이 리신, 이의 활성 단편 또는 이의 유도체를 포함하는 본 단리된 폴리펩타이드는 박테리아 세포벽의 주요 구조 성분인 펩티도글리칸을 분해하여, 예를 들어, 박테리아 성장을 억제하는 세포 용해 또는 치명적이지 않은 손상을 초래할 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 리신, 변이 리신, 이의 활성 단편 또는 유도체를 포함하는 본 단리된 폴리펩타이드는 그람-음성균의 음이온성 외막에 대한 결합을 용이하게 하는 양전하(및 양극성) N- 및/또는 C-말단 α-나선 도메인을 함유하여 하위-인접 펩티도글리칸으로 전위된다.
[64] 그람-음성균의 외막을 침투하는 리신의 능력은 그 전문이 본원에 참조로 포함된 WO 2017/049233에 기재된 바와 같이, 당해 분야에 알려진 임의의 방법에 의해 평가될 수 있다. 예를 들어, 리신은 그람-음성균 및 소수성 화합물과 함께 항온배양될 수 있다. 대부분의 그람-음성균은 외막의 존재로 인해 소수성 화합물에 대해 강하게 저항하므로 1-N-페닐나프틸아민(NPN), 크리스탈 바이올렛 또는 8-아닐리노-1-나프탈렌설폰산(ANS)과 같은 소수성 작용제의 흡수를 허용하지 않는다. 예를 들어, NPN은 소수성 조건에서는 강하게 형광을 발하고 수성 조건에서는 약하게 형광을 발한다. 따라서, NPN 형광은 외막 투과성의 척도로 사용될 수 있다.
[65] 보다 상세하게는, 리신이 외벽을 침투하는 능력은 활성에 대해 검사될 리신의 존재하에 그람-음성균, 예를 들어, 피. 아에루기노사 균주 PA01과 함께 예를 들어, NPN을 항온배양함으로써 평가될 수 있다. 리신(음성 대조군)이 없을 때 방출되는 형광에 비해 형광 유도가 더 높으면 외막 침투를 나타낸다. 또한, 형광 유도는 외막 침투 수준을 평가하기 위해 EDTA(에틸렌 디아민 테트라아세테이트)와 같은 확립된 침투제(permeabilizing agent) 또는 피. 아에루기노사의 치료에 사용된 최후 수단의 항생제와 같은 항생제, 즉, 폴리믹신 B(PMB)와 비교될 수 있다.
[66] 일부 구현예에서, 리신, 변이 리신, 이의 활성 단편 또는 유도체를 포함하는 본 단리된 폴리펩타이드는 인간 혈청의 존재 및/또는 부재하에 리신 활성을 나타낸다. 인간 혈청에서 리신 활성을 평가하는 적합한 방법은 당해 분야에 공지되어 있으며 실시예에 기재되어 있다. 간단히 말해서, MIC 값(즉, 대조군과 비교하여 박테리아 성장의 적어도 80%를 억제하기에 충분한 펩타이드의 최소 농도)이 리신에 대해 결정될 수 있고, 예를 들어, 인간 혈청에서 비활성인 모 리신 또는 화합물, 예를 들어, T4 파지 리소자임 또는 아티리신 GN126과 비교될 수 있다. T4 파지 리소자임은, 예를 들어 시그마-알드리치, 인코포레이티드(Sigma-Aldrich, Inc.)로부터 상업적으로 입수가능하다. GN126은 문헌에 기재되고 AMP SMAP-29를 GN 리신 KZ144에 융합하여 얻은 Art-175에 해당한다. 그 전문이 본원에 참조로 포함된 문헌(참조: Briers et al. 2014, Antimicrob , Agents Chemother. 58:3774-3784)을 참조한다.
[67] 보다 상세하게 리신에 대한 MIC 값은 예를 들어, 뮐러-힌턴(Mueller-Hinton) 액체배지, 인간 혈청이 보충된 뮐러-힌턴 액체배지, 생리적 염 농도를 포함하는 본원에 기재된 CAA 및 인간 혈청이 보충된 CAA에서 예를 들어, 실험실 피. 아에루기노사 균주 PA01에 대해 결정될 수 있다. PA01을 사용하면 대부분의 임상 단리물과 달리 PA01이 인간 혈액 매트릭스의 항균 활성에 민감하지 않기 때문에 혈청 농도가 높아진 상태에서 검사할 수 있다.
[68] 일부 구현예에서, 리신, 변이 리신, 이의 활성 단편 또는 유도체를 포함하는 본 단리된 폴리펩타이드는 생물막을 감소시킬 수 있다. 리신 또는 AMP의 최소 생물막 제거 농도(Minimal Biofilm Eradicating Concentration; MBEC)를 평가하는 방법은 변형된 액체배지 미량희석 MIC 방법의 변형을 사용하여 결정될 수 있다(참조: Ceri et al. 1999. J. Clin Microbial. 37:1771-1776(이는 그 전문이 본원에 참조로 포함됨) 및 Schuch et al., 2017, Antimicrob . Agents Chemother. 61, pages 1-18(이는 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)). 이 방법에서, 예를 들어 피. 아에루기노사 균주, 예를 들어 ATCC 17647의 신선한 콜로니를 배지, 예를 들어 인산염 완충 용액(PBS)에 현탁하고, 예를 들어, TSBg(0.2% 글루코스가 보충된 트립신 대두 액체배지)에서 1:100으로 희석하고, 예를 들어, 0.15 ml 분취액을 캘거리 바이오필름 디바이스(Calgary Biofilm Device)(96개의 폴리카보네이트 페그가 있는 뚜껑이 있는 96웰 플레이트)에 첨가하고, 예를 들어, 37℃에서 24시간 항온배양한다. 이어서 생물막을 세척하고 예를 들어, TSBg에서 리신의 2배 희석 시리즈로 예를 들어, 37℃에서 24시간 동안 처리한다. 처리 후, 웰을 세척하고, 예를 들어, 37℃에서 공기 건조하고, 예를 들어, 0.05% 크리스탈 바이올렛으로 10분 동안 염색한다. 염색 후, 생물막은 예를 들어, 33% 아세트산에서 탈색되고 예를 들어, 추출된 크리스탈 바이올렛의 OD600이 결정된다. 각 샘플의 MBEC는 크리스탈 바이올렛 정량법으로 평가된 생물막 바이오매스의 95% 이상을 제거하는데 필요한 최소 리신 농도이다.
[69] 일부 구현예에서, 리신, 변이 리신, 이의 활성 단편 또는 유도체를 포함하는 본 단리된 폴리펩타이드는 인간 혈청의 존재 및/또는 부재하에 또는 폐 계면활성제의 존재하에 박테리아를 억제하는데 필요한 항생제의 최소 억제 농도(MIC)를 감소시킨다. MIC를 평가하기 위해 임의의 공지된 방법이 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 체커보드 검정이 항생제 농도에 대한 리신의 영향을 결정하는데 사용된다. 체커보드 검정은 액체배지 미량희석에 의한 MIC 결정을 위한 CLSI 방법의 변형본을 기반으로 한다(참조: Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI), CLSI. 2015. Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria That Grow Aerobically; Approved Standard-10th Edition. Clinical and Laboratory Standards Institute, Wayne, PA(이는 그 전문이 본원에 참조로 포함됨) 및 Ceri et al. 1999. J. Clin . Microbiol. 37: 1771-1776(이는 또한 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)).
[70] 체커보드는 먼저 예를 들어, 96웰 폴리프로필렌 미량역가 플레이트의 열을 준비하여 구성되며, 각 웰에는 수평축을 따라 2배 희석된 동일한 양의 항생제가 있다. 별도의 플레이트에서, 각 웰에 예를 들어, 수직축을 따라 2배 희석된 동일한 양의 리신이 있는 유사한 열이 준비된다. 이어서 리신과 항생제 희석액을 합하여 각 열에는 일정한 양의 항생제 및 리신의 2배 희석액이 있는 반면 각 행에는 일정한 양의 리신 및 항생제의 2배 희석액이 있다. 따라서 각각의 웰에는 리신과 항생제의 고유한 조합이 있다. 박테리아는 예를 들어, 인간 혈청 또는 폐 계면활성제(예를 들어, 서반타(Survanta)®)의 존재 또는 부재하에 CAA에서 1 x 105 CFU/ml의 농도로 약물 조합에 첨가된다. 이어서 각각의 약물의 MIC를 단독으로 및 조합하여 예를 들어, 주변 공기에서 37℃에서 16시간 후에 기록한다. 각각의 약물에 대해 합산 분획 억제 농도(summation fractional inhibitory concentration)(∑FIC)를 계산하고, 최소 ∑FIC 값(∑FICmin)을 사용하여 리신/항생제 조합의 효과를 결정한다.
[71] 일부 구현예에서, 본 리신 및 리신-AMP 폴리펩타이드 작제물은 이미페넴 및 메로페넴과 같은 항생제와 상승작용할 수 있으며, 카바페넴-내성 피. 아에 루기노사와 같은 MDR 유기체를 포함하는 그람-음성균의 재감작을 유도할 수 있다. 이러한 재감작은 본원에 기재된 바와 같은 체커보드 검정에서 본 리신 또는 리신-AMP 폴리펩타이드 작제물을 항생제와 조합함으로써 결정될 수 있다. 카바페넴-내성 피. 아에루기노사와 같은 항생제-내성 박테리아를 리신 또는 리신-AMP 폴리펩타이드 작제물 조합에 첨가한다. 일반적으로 재감작은 항생제 MIC 값이 설정된 중단점(breakpoint) 아래로 떨어지는, 예를 들어, 항생제 민감성 박테리아의 경우 MIC 값이 2 이하, 중간 민감성 박테리아의 경우 MIC 값이 4, 항생제 내성 박테리아, 예를 들어 카바페넴-내성 분리주의 경우 MIC 값이 8 이상인 상승적 조합에서 발생한다. 문헌(참조: Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI), CLSI. 2019. M100 Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; 29th Edition. Clinical and Laboratory Standards Institute, Wayne, PA, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)을 참조한다.
[72] 일부 구현예에서, 리신, 변이 리신, 이의 활성 단편 또는 유도체를 포함하는 본 단리된 폴리펩타이드는 적혈구에 대해 낮은 독성을 나타낸다. 당해 분야에 공지된 임의의 방법을 사용하여 리신, 변이 리신, 이의 활성 단편 또는 유도체를 포함하는 본 단리된 폴리펩타이드의 용혈 활성에 대한 잠재력을 평가할 수 있다.
[73] 특히 본원에 기재된 리신-AMP 폴리펩타이드 작제물과 함께 사용하기 위한 본 개시내용의 적합한 리신의 예로는 클렙시엘라 ( Klebsiella ) 파지 0507-KN2-1에서 얻어진 GN316 리신(NCBI 기준 서열: YP_008531963.1, 서열번호 22), 슈도모나스 파지에서 얻어진 리신 PaP2_gp17(NCBI 기준 서열: YP_024745.1, 서열번호 96), 델프티아 ( Delftia ) 종에서 얻어진 GN333(NCBI 기준 서열: WP_016064791.1, 서열번호 28), 버콜데리아 슈도멀티보란스 ( Burkholderia pseudomultivorans )에서 얻어진 GN424(NCBI 기준 서열: WP_060250996.1, 서열번호 56), 슈도모나스 플렉시빌리스 ( Pseudomonas flexibilis )에서 얻어진 GN425 리신(NCBI 기준 서열: WP_039605935.1, 서열번호 58), 에스케리키아(Escherichia) 바이러스 CBA120에서 얻어진 GN428(NCBI 기준 서열: YP_004957781.1, 서열번호 60), 딕케야 ( Dickeya ) 파지에서 얻어진 GN431(NCBI 기준 서열: AIM51349.1, 서열번호 64), 에르위니아 ( Erwinia ) 종 Leaf5에서 얻어진 GN485(NCBI 기준 서열: WP_056233282.1, 서열번호 68) 및 슈도모나스 파지 PhiPA3에서 얻어진 GN123(NCBI 기준 서열: YP_009217242.1, 서열번호 173)이 포함된다.
[74] 상기 기재된 리신은 생물정보학 기술에 의해 식별되었다. 식별된 서열 중 일부가 추정 펩티도글리칸 결합 단백질로 주석이 달렸지만, 이전에는 이러한 서열을 갖는 폴리펩타이드에 의해 결정적으로 기인하는 기능이 없었다. 본 발명자들은 놀랍게도 상기 식별된 서열이, 특히 실시예에 기재된 그람-음성균에 대한 항균제로서 사용하기에 적합하다는 것을 인식하였다.
[75] 본 개시내용의 적합한 리신, 특히 본 리신-AMP 폴리펩타이드 작제물과 함께 사용하기 위한 추가의 예로는 아시네토박터(Acinetobacter) 파지 vB_AbaP_CEB1에서 얻어진 GN76 리신(NCBI 기준 서열 ALC76575.1, 서열번호 203 젠뱅크(GenBank): ALC76575.1), 슈도모나스 파지 PAJU2에서 얻어진 GN4 리신(NCBI 기준 서열 YP 002284361.1, 서열번호 74), 슈도모나스 파지 Lull에서 얻어진 GN14 리신(NCBI 기준 서열 YP 006382555.1, 서열번호 124) 및 미카비브리 오 아에루기노사보루스 ( Micavibrio aeruginosavorus )에서 얻어진 GN37 리신(NCBI 기준 서열 WP _014102102.1, 서열번호 84)이 포함된다. 전술한 리신 각각은 또한 그 전문이 본원에 참조로 포함된, WO 2017/049233에 개시되어 있다.
[76] 일부 구현예에서, 본 단리된 폴리펩타이드는 리신 변이체, 예를 들어, 기준 리신 폴리펩타이드, 예를 들어, 자연 발생 리신 또는 그 자체가 변이 리신인 모 리신과 비교하여 하나 이상의 삽입, 결실 및/또는 아미노산 치환을 함유하는 리신을 포함한다. 일부 구현예에서, 변이 리신, 이의 활성 단편 또는 유도체를 포함하는 단리된 폴리펩타이드 서열은 본원에 기재된 기준 리신 및/또는 이의 활성 단편과 적어도 80%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 98% 또는 예를 들어 적어도 99% 서열 동일성을 갖는다.
[77] 본 개시내용의 리신 변이체는 통상적으로 기준 리신의 하나 이상의 기능적 또는 생물학적 활성을 유지한다. 일부 구현예에서, 변형은 리신의 항균 활성을 개선한다. 통상적으로, 리신 변이체는 기준 리신과 비교하여 개선된 시험관내 항균 활성(예를 들어 완충액 및/또는 배지에서)을 갖는다. 다른 구현예에서, 리신 변이체는 개선된 생체내 항균 활성(예를 들어, 동물 감염 모델에서)을 갖는다. 일부 구현예에서, 변형은 인간 혈청의 부재 및/또는 존재하에 리신의 항균 활성을 개선한다. 일부 구현예에서, 변형은 폐 계면활성제의 존재하에 리신의 항균 활성을 개선한다.
[78] 적합한 변이 리신, 특히 본 리신-AMP 폴리펩타이드 작제물에 사용하기 위한 것들로는 GN146 리신(서열번호 78), GN156 리신(서열번호 126), GN202 리신(서열번호 118) 및 GN121 리신(서열번호 175)이 포함된다. 전술한 리신 각각은 또한 2017년 12월 12일자로 출원된 미국 가출원 제62,597,577호, 및 2018년 8월 23일자로 출원된 미국 가출원 제62/721,969호에 개시되어 있으며, 그 전문이 본원에 침조로 포함되어 있다. 미국 가출원 제62/721,969호에 기재된 리신은 통상적으로 자연 발생 대응물을 토대로 변형되어, 예를 들어, 아미노산 치환을 도입하고/하거나 더 큰 항미생물 펩타이드로부터의 아미노산 단편을 도입함으로써 혈청에서 리신의 활성을 향상시킨다. 예를 들어, 전문이 본원에 참조로 포함된 문헌(참조: Daniels and Scepartz, 2007, J. Am. Chem . Soc. 129:14578-14579)에 기재된 아미노산 서열 GPRRPRRPGRRAPV(서열번호 126의 잔기 1-14)를, 예를 들어, GN4(서열번호 74)의 N 말단에 도입하여 비-자연 발생 리신-AMP 폴리펩타이드 작제물인 GN156(서열번호 126)이 생성된다.
[79] 일부 구현예에서, 변이 리신은 리신의 전체 등전점(pI) 즉, 예를 들어, 단일 점 돌연변이와 같은 단일 pI-증가 돌연변이를 기준 리신에 편입시킴으로써 분자가 순 중성 전하를 갖는 pH의 변화가 초래되는 변형을 포함하도록 기준 리신을 변형하여 얻어진다. 적합한 기준 리신 폴리펩타이드로는 GN76(서열번호 203), GN4(서열번호 74), GN146(서열번호 78), GN14(서열번호 124), GN37(서열번호 84) GN316(서열번호 22) 리신 Pap2_gp17(서열번호 96), GN329(서열번호 26), GN424(서열번호 56), GN202(서열번호 118), GN425(서열번호 58), GN428(서열번호 60), GN431(서열번호 64), GN486(서열번호 66), GN333(서열번호 28) GN485(서열번호 68) GN123(서열번호 173) 및 GN121(서열번호 175)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 리신이 포함된다. 특정 구현예에서, 리신 변이체는 서열번호 203, 74, 78, 124, 84, 22, 96, 26, 56, 118, 58, 60, 64, 66, 28, 68, 173 및 175로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 기준 리신 폴리펩타이드와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는다.
[80] 예를 들어, GN37 리신(서열번호 84)은 아미노산 치환, R79H를 도입함으로써 pI를 증가시키도록 변형되어 GN217 리신(서열번호 8)을 생성할 수 있다. 이 구현예에서, GN217 리신(서열번호 8)의 효능은 실시예에 기재된 바와 같이, 기준 리신, GN37(서열번호 84)의 효능과 비교하여 인간 혈청의 존재 및 부재 모두에서 증가된다.
[81] 적합한 pI 변형 돌연변이의 다른 예는 기준 리신, 예를 들어 GN316(서열번호 22)에 K218D, K228D, R85H 및/또는 K22D와 같은 아미노산 치환을 도입하여 예를 들어, 각각 GN394 리신(서열번호 48), GN396 리신(서열번호 50), GN408 리신(서열번호 52) 및 GN418 리신(서열번호 54)을 생성하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 전술한 pI 변형 돌연변이는 본원에 예시된 바와 같이 인간 혈청의 부재 및/또는 존재하에 리신의 항균 활성을 개선한다.
[82] 일부 구현예에서, 본 개시내용의 리신 변이체는 통상적으로 α-나선 도메인을 보유하도록 설계되며, 이의 존재 또는 부재는 Jpred4(compio.dundee.ac.uk/jpred), Helical Wheel(hael.net/helical.htm), HeliQuest(zhanglab.ccmb.med.umich.edu/I-TASSER/) 및 PEP-FOLD 3(bioserv.rpbs.univ-paris-diderot.fr/services/PEP-FOLD3)과 같은 다양한 소프트웨어 프로그램을 사용하여 쉽게 결정될 수 있다.
[83] 일부 구현예에서, α-나선 도메인은 리신의 C 말단에 위치한다. 다른 구현예에서, α-나선 도메인은 리신의 N-말단에 위치한다. 보다 통상적으로, α-나선 도메인은 C 말단에 위치한다. 본 개시내용의 리신의 α-나선 도메인은 크기가 약 20개 내지 40개 아미노산, 보다 통상적으로 약 15개 내지 33개 아미노산 잔기로 다양하다. 예를 들어, N 말단에 위치한 GN14 α-나선 도메인은 15개의 아미노산(서열번호 124의 잔기 66 내지 80)을 함유한다. C 말단에 위치한 GN37 α-나선 도메인은 14개의 아미노산(서열번호 84의 잔기 113 내지 126)을 함유한다. C 말단에 또한 위치한 GN4 α-나선 도메인은 25개의 아미노산(서열번호 74의 잔기 116 내지 140)을 함유한다.
[84] 일부 구현예에서, 본원에 개시된 변이 리신, 이의 활성 단편 또는 이의 유도체는 정제 태그, 예를 들어 GSHHHHHHG(서열번호 100)를 포함하도록 변형된다. 정제 태그는 통상적으로 제1 및 제2 아미노산 사이의 리신 내의 어느 곳에나 삽입될 수 있다. 예를 들어, 정제 태그를 GN316 리신(서열번호 22)의 N 말단에 있는 제1 메티오닌과 제1 알라닌 사이에 삽입하여 활성에 악영향을 미치지 않고 변이 GN316 리신(서열번호 24)을 얻을 수 있다. 다른 구현예에서, 정제 태그를 GN156 리신(서열번호 126)의 N 말단에 있는 제1 메티오닌과 제1 글리신 사이에 삽입하여 변이체 GN486(서열번호 66)을 얻을 수 있다.
[85] 리신 변이체는 당해 분야에 공지되고 WO WO 2017/049233(이는 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 기재된 바와 같은 임의의 방법에 의해, 예를 들어, 본원에 기재된 리신, 이의 활성 단편 및 유도체 중 어느 것을 부위 특이적 돌연변이유발을 통해 또는 본원에 기재된 생물학적 기능 중 하나 이상을 유지하는 본 리신을 생산하는 숙주에서 돌연변이를 통해 변형시킴으로써 형성될 수 있다. 본 리신 변이체는 절단되거나, 키메라성이거나, 셔플링되거나 또는 "천연"일 수 있으며, 예를 들어, 미국 특허 제5,604,109호(이는 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 기재된 바와 같이 조합될 수 있다.
[86] 예를 들어, 당업자는, 예를 들어, α-나선 도메인 또는 α-나선 도메인의 외부 영역에 대한 치환 또는 대체를 합리적으로 만들고 시험할 수 있다. 예를 들어, 치환을 위한 아미노산을 식별하기 위해, 예를 들어, 본원에 기재된 전체 아미노산 서열을 사용하여 젠뱅크 데이터베이스에 대한 서열 비교를 수행할 수 있다.
[87] 돌연변이는, 특정 코돈이 다른 아미노산을 코딩하는 코돈으로 변경되거나, 아미노산이 또 다른 아미노산으로 치환되거나, 하나 이상의 아미노산이 결실되도록 아미노산 서열, 또는 폴리펩타이드 및 리신, 활성 단편 또는 유도체를 인코딩하는 핵산 서열에서 만들어질 수 있다.
[88] 이러한 돌연변이는 일반적으로 가능한 최소한의 뉴클레오타이드 변화를 만들어서 이루어진다. 이러한 종류의 치환 돌연변이는 생성된 단백질의 아미노산을 비-보존적 방식으로(예를 들어, 특정 크기 또는 특성을 갖는 아미노산 그룹에 속하는 아미노산에서 또 다른 그룹에 속하는 아미노산으로 코돈을 변경함으로써) 또는 보존적 방식으로(예를 들어, 특정 크기 또는 특성을 갖는 아미노산 그룹에 속하는 아미노산에서 동일한 그룹에 속하는 아미노산으로 코돈을 변경함으로써) 변경하도록 만들어질 수 있다. 이러한 보존적 변화는 일반적으로 생성된 단백질의 구조와 기능의 변화가 덜하다. 비-보존적 변화는 생성된 단백질의 구조, 활성 또는 기능을 변경할 가능성이 더 높다. 본 개시내용은 생성된 단백질의 활성 또는 결합 특성을 유의하게 변경하지 않는 보존적 변화를 함유하는 서열을 포함하는 것으로 간주되어야 한다. 따라서, 당업자는 본원에 제공된 리신 서열에 대한 검토 및 이의 지식 및 다른 리신 폴리펩타이드에 대해 이용 가능한 공개 정보에 기초하여 리신 폴리펩타이드 서열에서 아미노산 변경 또는 치환을 만들 수 있다. 아미노산 변화는 본원에 제공된 리신(들)의 서열에서 하나 이상, 하나 또는 몇 개, 하나 또는 여러 개, 1개 내지 5개, 1개 내지 10개, 또는 이러한 다른 수의 아미노산을 대체하거나 치환하여 돌연변이 또는 이의 변이체를 생성하도록 이루어질 수 있다. 예를 들어, 피. 아에루기노사에 대해 본원에 기재된 항-박테리아 활성, 및/또는 본원에 기재되고 특히 제공된 리신(들)과 유사한 활성을 갖는 것에 대해 이러한 돌연변이체 또는 이의 변이체를 기능에 대해 예측하거나 기능 또는 능력에 대해 시험할 수 있다. 따라서, 본원에 기재된 리신, 및 돌연변이체 또는 변이체 서열에 대한 변경은 당해 분야에 공지되고 본원에 기재된 검정 및 방법을 사용하여 시험될 수 있다. 당업자는 여기의 리신(들)의 도메인 구조에 기초하여, 치환 또는 대체에 적합한 하나 이상의, 하나 또는 여러 아미노산 및/또는 합리적인 보존적 또는 비-보존적 치환을 포함한 치환 또는 대체에 적합하지 않은 하나 이상의 아미노산을 예측할 수 있다.
[89] 일부 구현예에서, 본 단리된 폴리펩타이드는 리신 또는 유도체의 활성 단편을 포함한다. 용어 "활성 단편"은 기준 리신의 하나 이상의 생물학적 활성을 유지하는 전장 리신의 일부를 지칭한다. 따라서, 본원에 사용된 바와 같이, 리신 또는 변이 리신의 활성 단편은 인간 혈청의 부재 또는 존재하에, 또는 인간 혈청의 부재 및 존재 둘 다에서 또는 폐 계면활성제의 존재하에 성장을 억제하거나, 개체군을 감소시키거나, 본원에 기재된 피. 아에루기노사 및 선택적으로 적어도 하나의 그람-음성균 종을 사멸시킨다. 리신의 적합한 활성 단편은 그 전문이 본원에 참조로 포함된 WO2017/049233에 기재된 것들을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 활성 리신 단편은 통상적으로 α-나선 도메인을 보유한다. 활성 리신 단편의 예는 서열번호 127-129에 제시된 GN4 리신(서열번호 74)의 활성 단편을 포함한다.
[90] 일부 구현예에서, 본 단리된 폴리펩타이드에 포함된 리신, 변이 리신, 이의 활성 단편 또는 유도체는 GN217(서열번호 8), GN316 변이체(서열번호 24) GN316(서열번호 22), GN329(서열번호 26), GN333(서열번호 28), GN394(서열번호 48), GN396(서열번호 50), GN408(서열번호 52), (서열번호 54 ), GN424(서열번호 56), GN425(서열번호 58 ), GN428(서열번호 60), GN431(서열번호 64), GN486(서열번호 66), GN485(서열번호 68), 리신 PaP2_gp17(서열번호 96) GN123(서열번호 173) 및 GN121(서열번호 175) 또는 이의 활성 단편으로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 여기서 리신 또는 이의 활성 단편은 인간 혈청의 부재 또는 존재하에 또는 부재 및 존재 둘 다에서 또는 폐 계면활성제의 존재하에 성장을 억제하거나 개체군을 감소시키거나 또는 본원에 기재된 피. 아에루기 노사 및 선택적으로 적어도 하나의 다른 그람-음성균 종을 사멸시킨다. 일부 구현예에서, 리신 또는 이의 활성 단편은 서열번호 8, 24, 22, 26, 28, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 64, 66, 68, 96, 173 또는 175 중 적어도 하나에 대한 적어도 하나의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입을 포함한다. 특정 구현예에서, 적어도 하나의 아미노산 치환은 보존적 아미노산 치환이다.
[91] 일부 구현예에서, 본 개시내용의 리신은 GN329(서열번호 26), GN333(서열번호 28), GN424(서열번호 56), GN425(서열번호 58), GN428(서열번호 60), GN431(서열번호 64), GN485(서열번호 68) 및 리신 PaP2_gp17(서열번호 96) 또는 이의 활성 단편으로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 여기서 리신 또는 이의 활성 단편은 인간 혈청의 부재 또는 존재하에 또는 부재 및 존재 둘 다에서 또는 폐 계면활성제의 존재하에 성장을 억제하거나 개체군을 감소시키거나 또는 본원에 기재된 피. 아에루기노사 및 선택적으로 적어도 하나의 다른 그람-음성균 종을 사멸시킨다. 일부 구현예에서, 리신, 유도체 또는 이의 활성 단편은 서열번호 26, 28, 56, 58, 60, 64, 68 또는 96에 대한 적어도 하나의 치환, 결실 또는 삽입을 포함한다. 특정 구현예에서, 적어도 하나의 아미노산 치환은 보존적 아미노산 치환이다.
[92] 일부 구현예에서, 단리된 폴리펩타이드 서열은 GN217 리신(서열번호 8), GN394 리신(서열번호 48), GN396 리신(서열번호 50), GN408 리신(서열번호 52), GN418 리신(서열번호 54) 및 GN486(서열번호 66) 또는 이의 활성 단편으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 리신을 포함하고, 여기서 리신 또는 이의 활성 단편은 인간 혈청의 부재 또는 존재하에 또는 부재 및 존재 둘 다에서 또는 폐 계면활성제의 존재하에 성장을 억제하거나 개체군을 감소시키거나 또는 본원에 기재된 피. 아에루기노사 및 선택적으로 적어도 하나의 다른 그람-음성균 종을 사멸시킨다. 일부 구현예에서, 리신 또는 이의 활성 단편은 서열번호 8, 48, 50, 52, 54, 또는 66 에 비해 적어도 하나의 치환, 결실 또는 삽입을 포함한다. 특정 구현예에서, 적어도 하나의 아미노산 치환은 보존적 아미노산 치환이다.
항-미생물 펩타이드
[93] 일부 구현예에서, 본 개시내용의 폴리펩타이드는 리신-항-미생물 펩타이드(AMP) 폴리펩타이드 작제물을 포함한다. 리신-AMP 폴리펩타이드 작제물은 본원에 기재된 리신, 변이 리신, 이의 활성 단편 또는 유도체를 포함하는 단리된 폴리펩타이드 및 항미생물 펩타이드 또는 이의 단편을 포함한다. 본원에 사용된 용어 "항미생물 펩타이드"(AMP)는 사실상 모든 유기체에서 발견될 수 있는 다양한 짧은(일반적으로 길이가 3개 내지 50개 아미노산 잔기) 유전자-인코딩된 펩타이드의 구성원, 통상적으로 항생제를 지칭한다. 이 용어는 나선형 펩타이드, β- 시트 펩타이드 및 대체로 무질서한 무작위 코일 구조를 나타내는 펩타이드를 포함한다. AMP는 디펜신, 카텔리시딘, 스시 펩타이드, 양이온성 펩타이드, 다양이온성 펩타이드, 양극성 펩타이드, 소수성 펩타이드 및/또는 AMP-유사 펩타이드, 예를 들어, 본원에 기재된 아무린 펩타이드(amurin peptide)를 포함한다. AMP, AMP 변이체 및 AMP의 유도체의 단편이 또한 이 용어에 포함된다.
[94] 본원에 사용된 용어 "AMP 활성"은 AMP 또는 이의 단편이 예를 들어, 인간 혈청의 존재 및/또는 부재하에 그람-음성균의 외막을 침투함으로써 박테리아를 사멸시키거나, 박테리아 개체군을 감소시키거나 박테리아 성장을 억제하는 능력을 포함한다. 통상적으로, AMP의 전위는 외막의 리포폴리사카라이드 부분과의 1차 정전기적 상호작용에 이어 양이온 변위, 막 해체 및 일시적인 개방, 및 일부 경우에는 AMP의 내재화에 의해 구동된다.
[95] AMP 활성은 또한 AMP 또는 이의 단편이 인간 혈청의 존재 및/또는 부재하에 항생제의 최소 억제 농도(MIC)를 감소시키는 능력을 포함한다. 본 AMP 및 이의 단편이 그람-음성균의 외막을 침투하는 능력을 평가하고 혈청의 존재 및 부재하에 항생제의 MIC 감소를 결정하는 적합한 방법은 당해 분야에 공지되어 있고, 본 리신, 이의 유도체 및 활성 단편에 대해 상기 기재된 방법이 포함된다.
[96] 일부 구현예에서, 본 AMP는 본원에 기재된 임의의 AMP와 적어도 80%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 98% 또는 예를 들어 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 변이 AMP이고, 여기서 이의 변이 AMP는 AMP 활성을 유지한다.
[97] 일부 구현예에서, 본 AMP는 α-나선 도메인과 같은 나선 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, α-나선 도메인은 대부분의 분자에 걸쳐 있다. 예를 들어, 도 1의 Chp1 및 Chp4를 참조한다. 다른 구현예에서, α-나선 도메인은 중단되거나(예를 들어, Chp2) 절단된다(예를 들어, Chp6 및 Osp1). 본원에 기재된 Chp와 같은 본 AMP의 α-나선 도메인은 크기가 약 3개 내지 32개 아미노산, 보다 통상적으로 약 10개 내지 25개 아미노산 잔기로 다양하다. 일반적으로, 나선 도메인은 활성에 필요하며, 통상적으로 리신의 C-말단 또는 N-말단에 융합될 때 유지되어야 한다.
[98] 통상적으로, 나선형 펩타이드는 양극성 특성을 나타내며, 상당한 비율(예를 들어 50%)의 소수성 잔기를 포함하며, 자주 반복되는 패턴으로 나타난다. α-나선 구조가 형성되면, 친수성 잔기는 통상적으로 나선의 동일한 면에 위치하여 형태-의존적 양친성을 나타낸다. 종종 이러한 펩타이드는 수성 환경에서 구조화되지 않지만 지질 막과 만나면 나선 형태를 채택한다. 이 그룹에 속하는 펩타이드는 통상적으로 +2에서 +11 범위의 전체 양전하를 나타내며, 일반적으로 막 결함을 만들어 전해질, 신호 물질 및 기타 요인의 구배를 상실함으로써 그람-음성균과 같은 미생물을 사멸시킨다.
[99] 일부 구현예에서, 본 AMP는 본원에서 클라미디아 파지(Chp) 펩타이드 또는 아무린 펩타이드로 지칭되는 파지 용해제를 포함하는 "AMP-유사" 펩타이드이다. 본 개시내용의 아무린 펩타이드는 아무린과 구별될 수 있다. 당해 분야에 공지된 바와 같이, ssDNA 또는 ssRNA 파지(각각 마이크로비리다에 ( Microviridae ) 및 레비비리다 에(Leviviridae))에서 수득된 아무린은 10개 내지 17개 소수성 잔기의 연장부가 바로 앞에 있는 내부 LS 디펩타이드를 포함하는 추정 도메인 구조를 갖는 통합 막 단백질이다. 아무린의 예로는, 무레인(murein) 전구체인 지질 I의 형성을 촉매하는 필수 막-포매 효소인, 박테리아 트랜스로카제 Mra Y를 억제함으로써 용해를 일으키는 91개 아미노산 막 단백질인, 파지 <pX174(마이크로비리다에 과, 마이크로빈츠 (Microvints) 속)의 단백질 E 아무린; MurA 활성을 방해하고 펩티도글리칸 생합성 과정의 조절 장애를 일으켜 용해를 일으키는 420-아미노산 구조 단백질인 파지 Q ~(레비비리다에 과, 알로레비비루스 ( Allolevivirus ) 속)의 A2 캡시드 단백질; 숙주 샤페론 DnaJ의 활성을 필요로 하는 메커니즘을 사용하여 용해를 일으키는 75개 아미노산의 통합 막 단백질인, 파지 MS2(레비비르다에(Levivirdae) 과, 레비비루 스(Levivirus) 속)의 단백질 L 아무린이 포함된다. 통상적으로, 아무린은 정제될 수 없으며, 항균 치료제로 사용하기에 적합하지 않다.
[100] 아무린과 달리, 본 개시내용의 아무린 펩타이드는 다양한 척추동물의 선천성 면역계에서 얻은 AMP와 유사한 예측 α-나선 구조를 갖는(그러나 AMP와 다른 아미노산 서열을 갖는) 작은 양이온성 펩타이드이다. 아무린 펩타이드는 주로 클라미디아마이크로바이러스(Chlamydiamicroviruses)에서 발견되며, 그보다 정도는 덜하지만, 고쿠쇼비리나아(Gokushovirinae) 아과의 다른 관련 구성원에서 발견된다. 다양한 마이크로비리다에 파지의 아무린 펩타이드는 서로 30% 내지 100% 동일성을 나타내며, 다른 펩타이드와 상동성이 없다. 세포벽 생합성 장치에 세포질 표적을 가지고 있어 외부에서 적용되는 단백질이 쉽게 접근할 수 없는 마이크로비리다에의 아무린과는 달리, 본 아무린 펩타이드는 정제된 형태로 사용되어 "외부로부터" 살균 활성을 발휘할 수 있다.
[101] 본 리신-AMP 폴리펩타이드 작제물에 사용하기 위한 적합한 아무린 펩타이드는 2018년 3월 29일자로 출원되고 그 전문이 본원에 참조로 포함된, 미국 가출원 제62/650,235호에 기재된 아무린 펩타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 클라미디아 파지(Chp)-유래 용해제와 같은 아무린 펩타이드가 사용될 수 있다. 이러한 Chp-유래 용해제는 Chp1(NCBI 기준 서열: NP_044319.1, 서열번호 133), Chp2(NCBI 기준 서열: NP_0546521.1, 서열번호 70), CPAR39(NCBI 기준 서열: NP_063898.1, 서열번호 135), Chp3(NCBI 기준 서열: YP_022484.1, 서열번호 137), Chp4(NCBI 기준 서열: YP_338243.1, 서열번호 102), Chp6(NCBI 기준 서열: NP_510878.1, 서열번호 106), Chp7(NCBI 기준 서열: CRH73061.1, 서열번호 139), Chp8(NCBI 기준 서열: CRH64983.1, 서열번호 141), Chp9(NCBI 기준 서열: CRH84960.1, 서열번호 143), Chp10(NCBI 기준 서열: CRH73061.1, 서열번호 145), Chp11(NCBI 기준 서열: CRH59954.1, 서열번호 147) 및 Chp12(NCBI 기준 서열: CRH59965.1, 서열번호 149)를 포함한다.
[102] 추가의 적합한 Chp 계열 구성원은 Gkh1(NCBI 기준 서열: YP_008798245.1, 서열번호 151), Gkh2(NCBI 기준 서열: YP_009160382.1, 서열번호 90), Unp1(NCBI 기준 서열: CDL66944.1, 서열번호 153), Ecp1(NCBI 기준 서열: WP_100756432.1, 서열번호 155), Ecp2(NCBI 기준 서열: OAC1404.1, 서열번호 104), Tma1(NCBI 기준 서열: SHG47122.1, 서열번호 157), Osp1(NCBI 기준 서열: SFP13761.1, 서열번호 108), Unp2(NCBI 기준 서열: CDL65918.1, 서열번호 159), Unp3(NCBI 기준 서열: CDL65808.1, 서열번호 161), Gkh3(NCBI 기준 서열: AGT39941.1, 서열번호 163), Unp5(NCBI 기준 서열: AGT39924.1, 서열번호 165), Unp6(NCBI 기준 서열: AGT39915.1, 서열번호 167), Spi1(NCBI 기준 서열: NP_598337.1, 서열번호 169) 및 Spi2(NCBI 기준 서열: NP_598336.1, 서열번호 171), Ecp3(NCBI 기준 서열: WP_105269219.1, 서열번호 177), Ecp4(NCBI 기준 서열: WP_105466506.1, 서열번호 179), ALCES1(NCBI 기준 서열: AXB22573.1, 서열번호 181), AVQ206(NCBI 기준 서열: AVQ10236.1, 서열번호 183), AVQ244(NCBI 기준 서열: AVQ10244.1, 서열번호 185), CDL907(NCBI 기준 서열: CDL65907.1, 서열번호 187), AGT915(NCBI 기준 서열: AGT39915.1, 서열번호 189), HH3930(NCBI 기준 서열: CCH66548.1, 서열번호 191), Fen7875(NCBI 기준 서열: YP_009160399.1, 서열번호 193), SBR77(NCBI 기준 서열: AOT25441, 서열번호 195), Bdp1 NCBI 기준 서열: NP_073546.1, 서열번호 197), LVP1(NCBI 기준 서열: NP_042306.1, 서열번호 199) 및 Lvp2(NCBI 기준 서열: NP_085469.1, 서열번호 201)를 포함한다.
[103] 보다 통상적으로, AMP는 다음의 아무린 펩타이드, Chp2(서열번호 70), Gkh2(서열번호 90), Chp4(서열번호 102), Ecp2(서열번호 104), Chp6(서열번호 106) 및 Osp1(서열번호 108) 중 하나 이상으로부터 선택된다.
[104] 일부 구현예에서, 아무린 펩타이드는 변이체 아무린 펩타이드를 생성하도록 변형된다. 본원에 기재된 바와 같이, 아무린 펩타이드는 통상적으로 α-나선 도메인과 같은 나선 도메인을 포함한다. 통상적으로, 변이체 아무린 펩타이드는 α-나선 도메인을 보유한다. 임의의 변이체 아무린 펩타이드 내의 α-나선 도메인의 보유는 통상적으로 다양한 소프트웨어 프로그램, 예를 들어 Jpred4(compio.dundee.ac.uk/jpred), Helical Wheel(hael.net/helical.htm), HeliQuest(zhanglab.ccmb.med.umich.edu/I-TASSER/) 및 PEP-FOLD 3(bioserv.rpbs.univ-paris-diderot.fr/services/PEP-FOLD3)을 사용하여 정확하게 식별된다. 일부 구현예에서, 아무린 펩타이드 변이체는 아무린 펩타이드 내의 아르기닌 및 리신과 같은 (=) 하전된 잔기를 "D" 아미노산 형태로 전환함으로써 변형된다. D 형태로의 전환의 유용성은 문헌(참조: 예를 들어, Manabe et al., Sci . Rep., 2017, pages 1-10)에 기재되어 있으며, 이는 그 전체가 본원에 참조로 포함된다. 변이 AMP는 리신, 변이체, 이의 활성 단편 및 유도체에 대해 상기 본원에 기재된 것을 포함하여 당해 분야에 공지된 임의의 방법에 따라 제조될 수 있다.
[105] 일부 구현예에서, 본 개시내용의 리신-AMP 폴리펩타이드 작제물에 사용하기 위한 AMP는 항균 활성을 보유하는 더 큰 AMP의 단편을 포함한다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 리신-AMP 폴리펩타이드 작제물의 AMP 부분은 항균 활성을 보유하는 돼지 골수성 항미생물 펩타이드-36("PMAP-36", 서열번호 204)의 단편을 포함할 수 있다. PMAP-36은 N-말단에서 양극성 α-나선 형태를 갖는 돼지 골수성 cDNA에서 비롯된 카텔리시딘-관련 AMP이다. 따라서, 적합한 PMAP-36 단편은 통상적으로 N-말단으로부터 선택되어 항균 활성을 보유하는 단편을 수득한다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 PMAP-36 단편은 위치 23에서 소수성 아미노산(Trp)을 포함한다. 다른 구현예에서, PMAP-36에 의해 유발될 수 있는 용혈을 감소시키거나 제거하기 위해 무작위 코일 C-말단이 PMAP-36 단편에서 제거된다. PMAP-36 단편의 추가 특징은, 예를 들어, 문헌(참조: Lyu et al., Scientific Reports, 2016, 6, pages 1-12)에 기재되어 있으며, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함되어 있다.
[106] 특히 바람직한 PMAP-36 단편은 RI12(서열번호 88), RI18(서열번호 92) 및 TI15(서열번호 94)를 포함한다. 다른 적합한 AMP 단편은 서열번호 80에 제시된 단편과 같은 에스쿨렌틴(NCBI 기준 서열: P40843.1)의 단편 및 서열번호 76에 제시된 단편과 같은 항-리포폴리사카라이드 인자 이소형 2(NCBI 기준 서열: AFU61125.1)의 단편을 포함한다.
[107] 일부 구현예에서, 본 개시내용의 AMP는 합성 펩타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 합성 펩타이드는 항생제의 최소 억제 농도(MIC)를 감소시켜 박테리아의 가시적인 성장을 방지하지만, 자체적으로 항균 활성을 나타내지는 않는다. 본 개시내용의 리신-AMP 폴리펩타이드 작제물과 함께 사용하기 위한 특히 바람직한 합성 펩타이드는 FIRL 펩티도미메틱(서열번호 114)을 포함한다. 이론에 제한되지 않고, 외막 단백질 생물발생에 연루된 단백질의 서열, BamD와 관련된 FIRL(서열번호 114)은 항생제에 대한 외막의 투과성을 증가시키는 것으로 보인다. 제안된 메커니즘에 관한 추가 정보는, 예를 들어, 문헌(참조: Mori et al., Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 2012, 67: 2173-2181)에서 확인할 수 있으며, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
[108] 본 개시내용의 리신-AMP 폴리펩타이드 작제물에 포함될 수 있는 그람-음성균을 항생제에 감작시키는데 유용한 다른 합성 펩타이드는, 그 전문이 본원에 참조로 포함된, 문헌(참조: Vaara and Porro, Antimicrobial agents and Chemotherapy, 1996, 1801-1805)에 기재된 양이온성 펩타이드 KFFKFFKFFK(서열번호 120)를 포함한다.
[109] 일부 구현예에서, 합성 펩타이드는, 예를 들어, 그 전문이 본원에 참조로 포함된, 문헌(참조: Monhanram et al., Biopolymers, 2016, 106: 345-346)에 기재된 바와 같이 염 및 혈청 불활성화에 내성이 있다. 특히 바람직한 염 및 혈청-저항성 합성 펩타이드는 RR12Whydro(서열번호 110) 및 RI18 펩타이드 유도체(서열번호 131)를 포함한다.
구조 안정화 성분
[110] 일부 구현예에서, 본 개시내용의 리신-AMP 폴리펩타이드 작제물은 비결합 리신 및/또는 AMP에서와 실질적으로 동일한, 작제물의 제1 및/또는 제2 성분, 예를 들어, 리신 및/또는 AMP의 구조의 적어도 일부를 유지하기 위한 적어도 하나의 구조 안정화 성분을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 안정화 구조는 링커이다. 통상적으로, 링커와 같은 적어도 하나의 구조 안정화 성분은 리신 및 AMP가 제1 및/또는 제2 단백질 모이어티의 3차원 구조를 실질적으로 보존하여 리신 및/또는 AMP의 적어도 하나의 생물학적 활성이 유지될 수 있게 한다.
[111] 2개의 폴리펩타이드를 연결하는 적합한 링커는 당해 분야에 공지되어 있다. 특정 구현예에서, 링커는 글리신 및 세린 잔기를 포함하는 펩타이드와 같은 펩타이드이다. 특정 적합한 링커는 TAGGTAGG 링커(서열번호 72), IGEM 링커 GGSGSGSGSGSP(BBa_K1485002)(서열번호 82), GGGSGGGGSGGGS(BBA_K1486037,(서열번호 86), 또는 그 전문이 본원에 참조로 포함된 문헌(참조: Briers et al., mBio, 2014, 5:e01379-14)에 기재된 링커, 즉, AGAGAGAGAGAGAGAGAS(서열번호 122)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
[112] 일부 구현예에서, 구조 안정화 성분은 펩타이드 모이어티, 예를 들어, RPP 또는 PP 모이어티이다. 이러한 펩타이드 모이어티는 리신 및/또는 AMP 단백질 모이어티의 구조를 유지하는 것을 돕기 위해 본 리신-AMP 폴리펩타이드 작제물에 포함될 수 있다. 예를 들어, RPP 또는 PP 아미노산을 링커의 C 말단 또는 N 말단에, 예를 들어 BBA_K1486037 링커의 N 말단(RPPGGGSGGGGSGGGS 서열번호 12의 잔기 126 내지 141), BBA_K1486037 링커의 N 말단(PPGGGSGGGGSGGGS, 서열번호 16의 잔기 144-158), 서열번호 18의 잔기 137-144로 나타낸 바와 같은 TAGGTAGG 링커(서열번호 72)의 N 말단 또는 BBA_K1486037 링커의 C 말단(GGGSGGGGSGGGSPP, 서열번호 20의 잔기 135-149)에 삽입할 수 있다.
[113] 다른 구현예에서, 펩타이드 MIDR(서열번호 112) 및/또는 NPTH(서열번호 116)가 리신 및/또는 AMP 단백질 모이어티의 구조를 유지하는 것을 돕기 위해 작제물에 포함된다. 예를 들어, 일부 구현예에서 FIRL(서열번호 114)과 같은 AMP 구조는 서열번호 46의 잔기 1-12(MIDRFIRLNPTH) 및 서열번호 44의 잔기 1-26으로 나타낸 바와 같은 MIDR(서열번호 112) 및/또는 NPTH(서열번호 116)의 첨가에 의해 유지된다.
리신-AMP 폴리펩타이드 작제물의 예
[114] 일부 구현예에서, 리신-AMP 작제물은 (a) 다음을 포함하는 제1 성분: (i) GN76(서열번호 203), GN4(서열번호 74), GN146(서열번호 78), GN14(서열번호 124), 임의로 단일 pI-증가 돌연변이가 있는 GN37(서열번호 84), 임의로 단일 점 돌연변이가 있는 GN316(서열번호 22), 리신 Pap2_gp17(서열번호 96), GN329(서열번호 26), GN424(서열번호 56), GN202(서열번호 118), GN425(서열번호 58), GN428(서열번호 60), GN431(서열번호 64), GN486(서열번호 66), GN333(서열번호 28), GN485(서열번호 68), GN123(서열번호 173) 및 GN121(서열번호 175)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 리신 또는 (ii) 리신 활성이 있고, 서열번호 203, 74, 78, 124, 84, 22, 96, 26, 56, 118, 58, 60, 64, 66, 28, 68, 173 또는 175 중 어느 것의 폴리펩타이드 서열과 적어도 80%, 예를 들어 적어도 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 98%, 또는 예를 들어 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드; 또는 (iii) 존재한다면 단일 점 돌연변이 및/또는 단일 pI 증가 돌연변이를 포함하는 리신의 활성 단편; (b) 다음을 포함하는 제2 성분: (i) Chp1(서열번호 133), Chp2(서열번호 70), CPAR39(서열번호 135), Chp3(서열번호 137), Chp4(서열번호 102), Chp6(서열번호 106), Chp7(서열번호 139), Chp8(서열번호 141), Chp9(서열번호 143), Chp10(서열번호 145), Chp11(서열번호 147), Chp12(서열번호 149), Gkh1(서열번호 151), Gkh2(서열번호 90), Unp1(서열번호 153), Ecp1(서열번호 155), Ecp2(서열번호 104), Tma1(서열번호 157), Osp1(서열번호 108), Unp2(서열번호 159), Unp3(서열번호 161), Gkh3(서열번호 163), Unp5(서열번호 165), Unp6(서열번호 167), Spi1(서열번호 169), Spi2(서열번호 171), Ecp3(서열번호 177), Ecp4(서열번호 179), ALCES1(서열번호 181), AVQ206(서열번호 183), AVQ244(서열번호 185), CDL907(서열번호 187), AGT915(서열번호 189), HH3930(서열번호 191), Fen7875(서열번호 193), SBR77(서열번호 195), Bdp1(서열번호 197), LVP1(서열번호 199), Lvp2(서열번호 201), 에스쿨렌틴 단편(서열번호 80), RI12(서열번호 88), TI15(서열번호 94), RI18(서열번호 92), FIRL(서열번호 114), LPS 결합 단백질 단편(서열번호 76), RR12whydro(서열번호 110), RI18 펩타이드 유도체(서열번호 131) 및 양이온성 펩타이드(서열번호 120)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 항미생물 펩타이드(AMP) 또는 (ii) AMP 활성이 있고, 서열번호 133, 70, 135, 137, 102, 106, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 90, 153, 155, 104, 157, 108, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 199, 201, 80, 88, 94, 92, 114, 76, 110, 131 및 120 중 적어도 하나와 적어도 80% 동일한 폴리펩타이드를 포함한다.
[115] 통상적으로, 개시된 AMP 또는 이의 단편과 적어도 80% 이상의 동일성을 공유하는 임의의 AMP 변이체는 이의 알파-나선 구조 및 활성과 관련된 임의의 잔기를 유지한다. 예를 들어, 상기 언급된 바와 같이, PMAP-36(서열번호 204)의 단편은 통상적으로 위치 23에서 소수성 아미노산(Trp)을 보유한다.
[116] 일부 구현예에서, GN37(서열번호 84)은 단일 pI-증가 돌연변이를 포함하며, 여기서 단일 pI-증가 돌연변이가 있는 GN37(서열번호 84)은 GN217(서열번호 8)이다. 일부 구현예에서, GN316(서열번호 22)은 단일 점 돌연변이를 포함하고, 여기서 단일 점 돌연변이가 있는 GN37(서열번호 84)은 GN396(서열번호 50), GN408(서열번호 52), GN418(서열번호 54) 및/또는 GN394(서열번호 48)이다.
[117] 일부 구현예에서, 작제물은 적어도 하나의 구조 안정화 성분을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 구조 안정화 성분은 펩타이드 링커, 예를 들어 글리신 및 세린 잔기를 포함하는 펩타이드이다. 특정 구현예에서, 펩타이드 링커는 TAGGTAGG(서열번호 72), IGEM (BBa_K1485002)(서열번호 82), PPTAGGTAGG(서열번호 98), IGEM +PP(서열번호 16의 잔기 44-58) 및 AGAGAGAGAGAGAGAGAS(서열번호 122)로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
[118] 일부 구현예에서, 리신-AMP 폴리펩타이드 작제물은 GN168 리신(서열번호 2), GN176 리신(서열번호 4), GN178 리신(서열번호 6), GN218 리신(서열번호 10), GN223 리신(서열번호 12), GN239 리신(서열번호 14), GN243 리신(서열번호 16), GN280 리신(서열번호 18), GN281 리신(서열번호 20), GN349 리신(서열번호 30), GN351 리신(서열번호 32), GN352 리신(서열번호 34), GN353 리신(서열번호 36), GN357 리신(서열번호 38), GN359 리신(서열번호 40), GN369 리신(서열번호 42), GN370 리신(서열번호 44), GN371 리신(서열번호 46) 또는 GN 93 리신(서열번호 62) 중 적어도 하나, 또는 리신 활성이 있고 서열번호 2, 4, 6, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 또는 62 중 적어도 하나의 폴리펩타이드 서열과 적어도 80%, 예를 들어 적어도 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 98%, 또는 예를 들어 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드로부터 선택된다.
[119] 보다 상세하게는, 일부 구현예에서, 리신-AMP 폴리펩타이드 작제물은 GN4 리신(서열번호 74)의 N-말단에 도입되어 GN168 리신(서열번호 2)을 생성하는, Chp2 아무린 폴리펩타이드(서열번호 70) 및 TAGGTAGG 링커(서열번호 72), 또는 리신 활성이 있고, 서열번호 2와 적어도 80%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 98%, 또는 예를 들어 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
[120] 일부 구현예에서, 인코딩된 리신-AMP 폴리펩타이드 작제물은 GN146 리신(서열번호 78)의 N-말단에 도입되어 GN176 리신(서열번호 4)을 생성하는, LPS 결합 단백질 단편(서열번호 76) 및 TAGGTAGG 링커(서열번호 72), 또는 리신 활성이 있고, 서열번호 4와 적어도 80%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 98%, 또는 예를 들어 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
[121] 일부 구현예에서, 리신-AMP 폴리펩타이드 작제물은 GN146 리신(서열번호 78)의 N-말단에 도입되어 GN178 리신(서열번호 6)을 생성하는, 에스쿨렌틴 단편(서열번호 80) 및 IGEM 링커(서열번호 82), 또는 서열번호 6과 적어도 80%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 98%, 또는 예를 들어 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
[122] 일부 구현예에서, 인코딩된 리신-AMP 폴리펩타이드 작제물은 GN37 리신(서열번호 84)의 C-말단에 도입되어 GN218 리신(서열번호 10)을 생성하는, IGEM 링커(서열번호 86) 및 RI12 항미생물 펩타이드(서열번호 88), 또는 리신 활성이 있고, 서열번호 10과 적어도 80%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 98%, 또는 예를 들어 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
[123] 일부 구현예에서, 리신-AMP 폴리펩타이드 작제물은 GN37 리신(서열번호 84)의 C-말단에 도입되어 GN223 리신(서열번호 12)을 생성하는, RPP 모이어티, IGEM 링커(서열번호 86) 및 항미생물 아무린 펩타이드 Gkh2(서열번호 90), 또는 리신 활성이 있고, 서열번호 12와 적어도 80%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 98% 또는 예를 들어 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
[124] 일부 구현예에서, 리신-AMP 폴리펩타이드 작제물은 GN37 리신(서열번호 84)의 C-말단에 도입되어 GN239 리신(서열번호 14)을 생성하는 IGEM 링커(서열번호 86) 및 RI18 펩타이드(서열번호 92), 또는 리신 활성이 있고, 서열번호 14와 적어도 80%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 98%, 또는 예를 들어 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
[125] 일부 구현예에서, 리신-AMP 폴리펩타이드 작제물은 GN37 리신(서열번호 84)의 C-말단에 도입되어 GN243 리신(서열번호 16)을 생성하는, PP 아미노산 모이어티, IGEM 링커(서열번호 86) 및 TI15 펩타이드(서열번호 94), 또는 리신 활성이 있고, 서열번호 16과 적어도 80%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 98%, 또는 예를 들어 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
[126] 일부 구현예에서, 리신-AMP 폴리펩타이드 작제물은 리신 PaP2_gp17(서열번호 96)의 C 말단에 도입되어 GN280 리신(서열번호 18)을 생성하는, RI18 항미생물 펩타이드(서열번호 92), 아미노산 서열 PPTAGGTAGG(서열번호 98)를 갖는 링커 및 TI15 항미생물 펩타이드(서열번호 94), 또는 리신 활성이 있고, 서열번호 18과 적어도 80%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 98%, 또는 예를 들어 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
[127] 일부 구현예에서, 리신-AMP 폴리펩타이드 작제물은 리신 PaP2_gp17(서열번호 96)의 C 말단에 도입되어 GN281 리신(서열번호 20)을 생성하는, RI18 펩타이드(서열번호 92), IGEM 링커(서열번호 86), PP 아미노산 모이어티(리신 및/또는 AMP의 구조를 유지하기 위해 첨가됨), 및 TI15 펩타이드(서열번호 94), 또는 리신 활성이 있고, 서열번호 20과 적어도 80%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 98%, 또는 예를 들어 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
[128] 일부 구현예에서, 리신-AMP 폴리펩타이드 작제물은 GN316 리신(서열번호 22)의 C-말단에 도입되어 GN349 리신(서열번호 30)을 생성하는, 아미노산 서열 TAGGTAGG를 갖는 링커(서열번호 72) 및 아무린 펩타이드 Chp4(서열번호 102) 또는 리신 활성이 있고, 서열번호 30과 적어도 80%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 98%, 또는 예를 들어 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
[129] 일부 구현예에서, 리신-AMP 폴리펩타이드 작제물은 GN316 리신(서열번호 22)의 C-말단에 도입되어 GN351 리신(서열번호 32)을 생성하는, 아미노산 서열 TAGGTAGG를 갖는 링커(서열번호 72) 및 아무린 펩타이드 Ecp2(서열번호 104), 또는 리신 활성이 있고 서열번호 32와 적어도 80%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 98%, 또는 예를 들어 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
[130] 일부 구현예에서, 리신-AMP 폴리펩타이드 작제물은 GN316 리신(서열번호 22)의 C-말단에 도입되어 GN352 리신(서열번호 34)을 생성하는, 아미노산 서열 TAGGTAGG를 갖는 링커(서열번호 72) 및 아무린 펩타이드 Chp7(서열번호 139), 또는 리신 활성이 있고, 서열번호 34와 적어도 80%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 98%, 또는 예를 들어 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
[131] 일부 구현예에서, 리신-AMP 폴리펩타이드 작제물은 GN316 리신(서열번호 22)의 C-말단에 도입되어 GN353 리신(서열번호 36)을 생성하는, 아미노산 서열 TAGGTAGG를 갖는 링커(서열번호 72) 및 아무린 펩타이드 Osp1(서열번호 108), 또는 리신 활성이 있고, 서열번호 36과 적어도 80%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 98%, 또는 예를 들어 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
[132] 일부 구현예에서, 리신-AMP 폴리펩타이드 작제물은 GN316 리신(서열번호 22)의 C-말단에 도입되어 GN357 리신(서열번호 38)을 생성하는, 아미노산 서열 TAGGTAGG를 갖는 링커(서열번호 72) 및 RR12Whydro(서열번호 110), 또는 리신 활성이 있고, 서열번호 38과 적어도 80%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 98%, 또는 예를 들어 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
[133] 일부 구현예에서, 리신-AMP 폴리펩타이드 작제물은 GN316 리신(서열번호 22)의 C-말단에 도입되어 GN359 리신(서열번호 40)을 생성하는, 아미노산 서열 TAGGTAGG를 갖는 링커(서열번호 72) 및 PMAP-36의 TI15 펩타이드 유도체(서열번호 94), 또는 리신 활성이 있고, 서열번호 40과 적어도 80%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 98%, 또는 예를 들어 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
[134] 일부 구현예에서, 리신-AMP 폴리펩타이드 작제물은 GN316 리신(서열번호 22)의 C-말단에 도입되어 GN369 리신(서열번호 42)을 생성하는 RR18(서열번호 92) 또는 리신 활성이 있고, 서열번호 42와 적어도 80%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 98%, 또는 예를 들어 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
[135] 일부 구현예에서, 리신-AMP 폴리펩타이드 작제물은 GN202 리신(서열번호 118)의 N-말단에 도입되어 GN370 리신(서열번호 44)을 생성하는, MIDR 모이어티(서열번호 112), FIRL 모이어티(서열번호114) 및 NPTH 모이어티(서열번호 116) 또는 리신 활성이 있고, 서열번호 44와 적어도 80%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 98%, 또는 예를 들어 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
[136] 일부 구현예에서, 리신-AMP 폴리펩타이드 작제물은 GN146 리신(서열번호 78)의 C-말단에 도입되어 GN371 리신(서열번호 46)을 생성하는, MIDR 모이어티(서열번호 112), FIRL(서열번호 114) 및 NPTH 모이어티(서열번호 116), 또는 리신 활성이 있고, 서열번호 46과 적어도 80%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 98%, 또는 예를 들어 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
[137] 일부 구현예에서, 리신-AMP 폴리펩타이드 작제물은 GN14 리신(서열번호 124)의 N-말단에 도입되어 GN93 리신(서열번호 62)을 생성하는, 양이온성 펩타이드(서열번호 120) 및 링커 도메인(서열번호 122), 또는 리신 활성이 있고, 서열번호 62와 적어도 80%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 98%, 또는 예를 들어 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
[138] 하기 표 1은 본원에 기재된 리신 및 리신-AMP 작제물의 구체적인 예를 나타낸다. GN168(서열번호 2), GN176(서열번호 4), GN178(서열번호 6), GN370(서열번호 44), GN371(서열번호 46) 및 GN93(서열번호 62)의 경우 작제물의 AMP 부분은 이중으로 밑줄이 그어져 있다. 기타 모든 작제물의 경우에, 이중 밑줄은 리신에 해당한다. 링커와 같은 구조 안정화 성분은 이탤릭체로 표시되어 있다. GN486(서열번호 66)의 정제 태그는 이탤릭체로 굵게 표시되어 있다. 단일 점 돌연변이는 굵게 표시되어 있다.
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
[139] 일부 구현예에서, 본 개시내용의 리신 및/또는 리신-AMP 폴리펩타이드 작제물은 화학적으로 변형된다. 화학적 변형은 화학적 모이어티의 추가, 새로운 결합의 생성 및 화학적 모이어티의 제거를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 화학적 변형은 아미노산 측쇄, 및 아미노 또는 카복실 말단을 포함하여, 리신 및/또는 리신-AMP 폴리펩타이드 작제물의 어느 곳에서나 발생할 수 있다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 리신 또는 리신-AMP 폴리펩타이드 작제물은 N-말단 아세틸화 변형을 포함한다. 특정 구현예에서, 리신 또는 리신-AMP 폴리펩타이드 작제물은 C-말단 아미드화 변형을 포함한다. 이러한 변형은 리신 및/또는 리신-AMP 폴리펩타이드 작제물 내 하나 초과의 부위에 존재할 수 있다.
[140] 또한, 리신 및/또는 리신-AMP 폴리펩타이드 작제물의 하나 이상의 측기 또는 말단기는 당업자에게 알려진 보호 그룹에 의해 보호될 수 있다.
[141] 일부 구현예에서, 리신 및/또는 리신-AMP 폴리펩타이드 작제물은 지속시간 향상 모이어티에 접합된다. 일부 구현예에서, 지속시간 향상 모이어티는 폴리에틸렌 글리콜이다. 폴리에틸렌 글리콜("PEG")은 지속시간이 향상된 치료용 폴리펩타이드를 얻는데 사용되었다(참조: Zalipsky, S., Bioconjugate Chemistry, 6:150-165 (1995); Mehvar, R., J. Pharm . Pharmaceut . Sci ., 3:125-136 (2000), 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함됨). PEG 골격, (CH2CH2-0-)n(여기서 n은 반복 단량체의 수임)은 가요성이고 양친성이다. 리신 및/또는 리신-AMP 폴리펩타이드 작제물과 같이 또 다른 화학 물질에 부착될 때, PEG 중합체 사슬은 이러한 폴리펩타이드를 면역 반응 및 기타 제거 메커니즘으로부터 보호할 수 있다. 그 결과, 페길화는 약동학을 최적화하고, 생체이용률을 높이고, 면역원성과 투여량 및/또는 투여 빈도를 감소시켜 효능과 안전성을 개선시킬 수 있다.
폴리뉴클레오타이드
[142] 일 측면에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 리신, 변이 리신, 이의 활성 단편 또는 유도체를 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 단리된 폴리뉴클레오타이드 서열은 DNA 서열이다. 다른 구현예에서, 단리된 폴리뉴클레오타이드는 cDNA 서열이다.
[143] 일부 구현예에서, 단리된 폴리뉴클레오타이드는 본원에 기재된 리신, 변이 리신, 이의 활성 단편 또는 유도체와 적어도 80%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 98%, 또는 예를 들어 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 분자를 포함하며, 여기서 인코딩된 폴리펩타이드는 인간 혈청의 부재 또는 존재하에 또는 인간 혈청의 부재 및 존재 둘 다에서 또는 폐 계면활성제의 존재하에 본원에 기재된 바와 같이 성장을 억제하거나 개체군을 감소시키거나 피. 아에루기노사 및 선택적으로 적어도 하나의 다른 그람-음성균 종을 사멸시킨다.
[144] 일부 구현예에서, 단리된 폴리뉴클레오타이드는 GN217(서열번호 8), GN316 변이체(서열번호 24) GN316(서열번호 22), GN329(서열번호 26), GN333(서열번호 28), GN394(서열번호 48), GN396(서열번호 50 ), GN408(서열번호 52), GN418(서열번호 54), GN424(서열번호 56), GN425(서열번호 58), GN428(서열번호 60), GN431(서열번호 64), GN486(서열번호 66), GN485(서열번호 68), 리신 PaP2_gp17(서열번호 96), GN123(서열번호 173) 또는 GN121(서열번호 175) 또는 변이체 또는 이의 활성 단편 또는 유도체로부터 선택된 리신을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하며, 여기서 단리된 폴리뉴클레오타이드에 의해 인코딩된 리신 변이체 또는 이의 활성 단편 또는 유도체는 인간 혈청의 부재 또는 존재하에, 또는 인간 혈청의 부재 및 존재 둘 다에서 또는 폐 계면활성제의 존재하에 성장을 억제하거나, 개체군을 감소시키거나, 피. 아에루기노사 및 선택적으로 적어도 하나의 다른 그람-음성균 종을 사멸시킨다. 특정 구현예에서, 단리된 폴리뉴클레오타이드는 적어도 하나의 아미노산 치환, 삽입 또는 결실과 같이 서열번호 8, 24, 22, 26, 28, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 64, 66, 68, 96, 173 및 175 중 적어도 하나에 대한 적어도 하나의 변형을 함유하는 리신, 변이체 또는 이의 활성 단편 또는 유도체를 인코딩하는 핵산 분자를 포함한다. 특정 구현예에서, 단리된 폴리뉴클레오타이드는 각각 서열번호 7, 23, 21, 25, 27, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 63, 65, 67 95, 172 및 174로 이루어진 그룹으로부터 선택된 핵산 서열, 이의 보체 또는 서열번호 7, 23, 21, 25, 27, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 63, 65, 67 95, 172 및 174 중 하나와 적어도 80%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 98%, 또는 예를 들어 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열 또는 이의 보체를 포함하며, 여기서 인코딩된 폴리펩타이드는 인간 혈청의 부재 또는 존재하에, 또는 인간 혈청의 부재 및 존재 둘 다에서 또는 폐 계면활성제의 존재하에 성장을 억제하거나, 개체군을 감소시키거나, 피. 아 에루기노사 및 선택적으로 적어도 하나의 다른 그람-음성균 종을 사멸시킨다.
[145] 일부 구현예에서, 단리된 폴리뉴클레오타이드는 GN217 리신(서열번호 8), GN394 리신(서열번호 48), GN396 리신(서열번호 50), GN408 리신(서열번호 52), GN418 리신(서열번호 54) 및 GN486(서열번호 66) 중 적어도 하나로부터 선택된 리신 또는 변이체 또는 이의 활성 단편 또는 유도체를 인코딩하는 핵산 분자를 포함한다. 특정 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 7, 47, 49, 51, 53 및 65로 이루어진 그룹으로부터 선택된 핵산 서열 이의 보체 또는 서열번호 77, 47, 49, 51, 53 또는 65 중 하나와 적어도 80%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 98%, 또는 예를 들어 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열 또는 이의 보체를 포함하고, 여기서 인코딩된 폴리펩타이드는 인간 혈청의 부재 또는 존재하에, 또는 인간 혈청의 부재 및 존재 둘 다에서 또는 폐 계면활성제의 존재하에 성장을 억제하거나, 개체군을 감소시키거나, 피. 아에루기노사 및 선택적으로 적어도 하나의 다른 그람-음성균 종을 사멸시킨다.
[146] 일부 구현예에서, 단리된 폴리뉴클레오타이드는 GN316(서열번호 22), GN329(서열번호 26), GN333(서열번호 28), GN424(서열번호 56), GN425(서열번호 58), GN428(서열번호 60), GN431(서열번호 64), GN485(서열번호 68) 중 적어도 하나로부터 선택된 리신 또는 변이체 또는 이의 활성 단편 또는 유도체를 인코딩하는 핵산 분자를 포함하고, 여기서 인코딩된 폴리펩타이드는 인간 혈청의 부재 또는 존재하에, 또는 인간 혈청의 부재 및 존재 둘 다에서 또는 폐 계면활성제의 존재하에 성장을 억제하거나, 개체군을 감소시키거나, 피. 아에루기 노사 및 선택적으로 적어도 하나의 다른 그람-음성균 종을 사멸시킨다. 특정 구현예에서, 변이체, 이의 활성 단편 또는 유도체는 적어도 하나의 아미노산 치환, 삽입 또는 결실과 같이 서열번호 22, 26, 28, 56, 58, 60, 64 또는 68 중 적어도 하나에 대한 적어도 하나의 변형을 함유한다. 특정 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 21, 25, 27, 55, 57, 59, 63 및 67로 이루어진 그룹으로부터 선택된 핵산 서열, 이의 보체 또는 서열번호 21, 25, 27, 55, 57, 59, 63 또는 67 중 하나와 적어도 80%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 98%, 또는 예를 들어 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열 또는 이의 보체를 포함하고, 여기서 인코딩된 폴리펩타이드는 인간 혈청의 부재 또는 존재하에, 또는 인간 혈청의 부재 및 존재 둘 다에서 또는 폐 계면활성제의 존재하에 성장을 억제하거나, 개체군을 감소시키거나, 피. 아에루기노사 및 선택적으로 적어도 하나의 다른 그람-음성균 종을 사멸시킨다.
[147] 또 다른 측면에서, 본 개시내용은 다음을 포함하는 리신-AMP 폴리펩타이드 작제물을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다:
(a) 다음을 포함하는 제1 성분을 인코딩하는 제1 핵산 분자: (i) GN76(서열번호 203), GN4(서열번호 74), GN146(서열번호 78), GN14(서열번호 124), 임의로 단일 pI-증가 돌연변이가 있는 GN37(서열번호 84), 임의로 단일 점 돌연변이가 있는 GN316(서열번호 22), 리신 Pap2_gp17(서열번호 96), GN329(서열번호 26), GN424(서열번호 56), GN202(서열번호 118), GN425(서열번호 58), GN428(서열번호 60), GN431(서열번호 64), GN486(서열번호 66), GN333(서열번호 28), and GN485(서열번호 68), GN123(서열번호 173) 및 GN121(서열번호 175)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 리신; 또는 (ii) 리신 활성이 있고, 서열번호 203, 74, 78, 124, 84, 22, 96, 26, 56, 118, 58, 60, 64, 66, 28, 68, 173 또는 175 중 적어도 하나와 적어도 80% 동일한 폴리펩타이드; 또는 (iii) 리신의 활성 단편;
(b) 다음을 포함하는 제2 성분을 인코딩하는 제2 핵산 분자: (i) Chp1(서열번호 133), Chp2(서열번호 70), CPAR39(서열번호 135), Chp3(서열번호 137), Chp4(서열번호 102), Chp6(서열번호 106), Chp7(서열번호 139), Chp8(서열번호 141), Chp9(서열번호 143), Chp10(서열번호 145), Chp11(서열번호 147), Chp12(서열번호 149), Gkh1(서열번호 151), Gkh2(서열번호 90), Unp1(서열번호 153), Ecp1(서열번호 155), Ecp2(서열번호 104), Tma1(서열번호 157), Osp1(서열번호 108), Unp2(서열번호 159), Unp3(서열번호 161), Gkh3(서열번호 163), Unp5(서열번호 165), Unp6(서열번호 167), Spi1(서열번호 169), Spi2(서열번호 171), Ecp3(서열번호 177), Ecp4(서열번호 179), ALCES1(서열번호 181), AVQ206(서열번호 183), AVQ244(서열번호 185), CDL907(서열번호 187), AGT915(서열번호 189), HH3930(서열번호 191), Fen7875(서열번호 193), SBR77(서열번호 195), Bdp1(서열번호 197), LVP1(서열번호 199), Lvp2(서열번호 201), 에스쿨렌틴 단편(서열번호 80), RI12(서열번호 88), TI15(서열번호 94), RI18(서열번호 92), FIRL(서열번호 114), LPS 결합 단백질 단편(서열번호 76), RR12whydro(서열번호 110), RI18 펩타이드 유도체(서열번호 131) 및 양이온성 펩타이드(서열번호 120)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 항미생물 펩타이드(AMP) 또는 (ii) AMP 활성이 있고, 서열번호 133, 70, 135, 137, 102, 106, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 90, 153, 155, 104, 157, 108, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 199, 201, 80, 88, 94, 92, 114, 76, 110, 131 및 120 중 적어도 하나와 적어도 80% 동일한 폴리펩타이드.
[148] 일부 구현예에서, 본 개시내용의 단리된 폴리뉴클레오타이드는 리신-AMP 작제물의 제1 성분을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하며, 여기서 제1 성분은 GN394(서열번호 48), GN396(서열번호 50), GN408(서열번호 52) 및 GN418(서열번호 54)로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
[149] 일부 구현예에서, 본 개시내용의 단리된 폴리뉴클레오타이드는 리신-AMP 작제물의 제2 성분을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하고, 여기서 제2 성분은 Chp1(서열번호 133), Chp2(서열번호 70), CPAR39(서열번호 135), Chp3(서열번호 137), Chp4(서열번호 102), Chp6(서열번호 106), Chp7(서열번호 139), Chp8(서열번호 141), Chp9(서열번호 143), Chp10(서열번호 145), Chp11(서열번호 147), Chp12(서열번호 149), Gkh1(서열번호 151), Gkh2(서열번호 90), Unp1(서열번호 153), Ecp1(서열번호 155), Ecp2(서열번호 104), Tma1(서열번호 157), Osp1(서열번호 108), Unp2(서열번호 159), Unp3(서열번호 161), Gkh3(서열번호 163), Unp5(서열번호 165), Unp6(서열번호 167), Spi1(서열번호 169), Spi2(서열번호 171), Ecp3(서열번호 177), Ecp4(서열번호 179), ALCES1(서열번호 181), AVQ206(서열번호 183), AVQ244(서열번호 185), CDL907(서열번호 187), AGT915(서열번호 189), HH3930(서열번호 191), Fen7875(서열번호 193), SBR77(서열번호 195), Bdp1(서열번호 197), LVP1(서열번호 199), Lvp2(서열번호 201), 에스쿨렌틴 단편(서열번호 80), RI12(서열번호 88), TI15(서열번호 94), RI18(서열번호 92), FIRL(서열번호 114), LPS 결합 단백질 단편(서열번호 76), RR12whydro(서열번호 110), RI18 펩타이드 유도체(서열번호 131) 및 양이온성 펩타이드(서열번호 120)로 이루어진 그룹 또는 (ii) AMP 활성이 있고, 서열번호 133, 70, 135, 137, 102, 106, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 90, 153, 155, 104, 157, 108, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 199, 201, 80, 88, 94, 92, 114, 76, 110, 131 및 120 중 적어도 하나와 적어도 80% 동일한 폴리펩타이드로부터 선택된다.
[150] 일부 구현예에서, 본 개시내용의 단리된 폴리뉴클레오타이드는 비결합 리신 및/또는 AMP에서와 실질적으로 동일한, 작제물의 제1 및/또는 제2 성분의 구조의 적어도 일부를 유지하기 위한 적어도 하나의 리신-AMP 폴리펩타이드 작제물의 구조 안정화 성분을 인코딩하는 핵산 분자를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 본 단리된 폴리뉴클레오타이드는 적어도 하나의 구조 안정화 성분을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하며, 여기서 적어도 하나의 구조 안정화 성분은 펩타이드, 예를 들어 글리신 및/또는 세린 잔기를 포함하는 펩타이드이다. 일 구현예에서, 펩타이드는 TAGGTAGG(서열번호 72), IGEM (BBa_K1485002)(서열번호 82), PPTAGGTAGG(서열번호 98), IGEM +PP (서열번호 16의 잔기 44-58) 및 AGAGAGAGAGAGAGAGAS(서열번호 122)로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
[151] 보다 상세하게는, 일부 구현예에서, 단리된 폴리뉴클레오타이드는 리신-AMP 폴리펩타이드 작제물을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하며, 여기서 리신-AMP 폴리펩타이드 작제물은 GN168 리신(서열번호 2), 또는 리신 활성이 있고 서열번호 2와 적어도 80%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 98%, 또는 예를 들어 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드이다.
[152] 일부 구현예에서, GN168 리신을 인코딩하는 핵산 분자는 서열번호 1의 핵산 서열, 이의 보체 또는 리신 활성이 있고 서열번호 1과 적어도 80%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 98%, 또는 예를 들어 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 서열, 또는 이의 보체를 포함한다.
[153] 일부 구현예에서, 단리된 폴리뉴클레오타이드는 리신-AMP 폴리펩타이드 작제물을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하며, 여기서 리신-AMP 폴리펩타이드 작제물은 GN176 리신(서열번호 4) 또는 리신 활성이 있고 서열번호 4와 적어도 80%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 98%, 또는 예를 들어 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 분자이다.
[154] 일부 구현예에서, GN176 리신을 인코딩하는 핵산 분자는 서열번호 3의 핵산 서열, 이의 보체 또는 리신 활성이 있고 서열번호 3과 적어도 80%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 98%, 또는 예를 들어 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 서열, 또는 이의 보체를 포함한다.
[155] 일부 구현예에서, 단리된 폴리뉴클레오타이드는 리신-AMP 폴리펩타이드 작제물을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하고, 여기서 리신-AMP 폴리펩타이드 작제물은 GN178 리신(서열번호 6) 또는 서열번호 6과 적어도 80%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 98%, 또는 예를 들어 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 서열이다.
[156] 일부 구현예에서, GN178 리신을 인코딩하는 핵산 분자는 서열번호 5의 핵산 서열, 이의 보체 또는 리신 활성이 있고 서열번호 5와 적어도 80%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 98%, 또는 예를 들어 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 서열, 또는 이의 보체를 포함한다.
[157] 일부 구현예에서, 단리된 폴리뉴클레오타이드는 리신-AMP 폴리펩타이드 작제물을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하며, 여기서 리신-AMP 폴리펩타이드 작제물은 GN218 리신(서열번호 10) 또는 리신 활성이 있고 서열번호 10과 적어도 80%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 98%, 또는 예를 들어 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 분자이다.
[158] 일부 구현예에서, GN218 리신을 인코딩하는 핵산 분자는 서열번호 9의 핵산 서열, 이의 보체 또는 리신 활성이 있고 서열번호 9와 적어도 80%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 98%, 또는 예를 들어 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 서열, 또는 이의 보체를 포함한다.
[159] 일부 구현예에서, 단리된 폴리뉴클레오타이드는 리신-AMP 폴리펩타이드 작제물을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하며, 여기서 리신-AMP 폴리펩타이드 작제물은 GN223 리신(서열번호 12) 또는 리신 활성이 있고 서열번호 12와 적어도 80%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 98% 또는 예를 들어 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 분자이다.
[160] 일부 구현예에서, GN223 리신을 인코딩하는 핵산 분자는 서열번호 11의 핵산 서열, 이의 보체 또는 리신 활성이 있고 서열번호 11과 적어도 80%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 98% 또는 예를 들어 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 서열, 또는 이의 보체를 포함한다.
[161] 일부 구현예에서, 단리된 폴리뉴클레오타이드는 리신-AMP 폴리펩타이드 작제물을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하며, 여기서 리신-AMP 폴리펩타이드 작제물은 GN239 리신(서열번호 14) 또는 리신 활성이 있고 서열번호 14와 적어도 80%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 98%, 또는 예를 들어 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 분자이다.
[162] 일부 구현예에서, GN239 리신을 인코딩하는 핵산 분자는 서열번호 13의 핵산 서열, 이의 보체 또는 리신 활성이 있고 서열번호 13과 적어도 80%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 98%, 또는 예를 들어 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 서열, 또는 이의 보체를 포함한다.
[163] 일부 구현예에서, 단리된 폴리뉴클레오타이드는 리신-AMP 폴리펩타이드 작제물을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하며, 여기서 리신-AMP 폴리펩타이드 작제물은 GN243 리신(서열번호 16) 또는 리신 활성이 있고 서열번호 16과 적어도 80%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 98%, 또는 예를 들어 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 분자이다.
[164] 일부 구현예에서, GN243 리신을 인코딩하는 핵산 분자는 서열번호 15의 핵산 서열, 이의 보체 또는 리신 활성이 있고 서열번호 15와 적어도 80%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 98%, 또는 예를 들어 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 서열, 또는 이의 보체를 포함한다.
[165] 일부 구현예에서, 단리된 폴리뉴클레오타이드는 리신-AMP 폴리펩타이드 작제물을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하며, 여기서 리신-AMP 폴리펩타이드 작제물은 GN280 리신(서열번호 18) 또는 리신 활성이 있고 서열번호 18과 적어도 80%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 98%, 또는 예를 들어 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 분자이다.
[166] 일부 구현예에서, GN280 리신을 인코딩하는 핵산 분자는 서열번호 17의 핵산 서열, 이의 보체 또는 리신 활성이 있고 서열번호 17과 적어도 80%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 98%, 또는 예를 들어 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 서열, 또는 이의 보체를 포함한다.
[167] 일부 구현예에서, 단리된 폴리뉴클레오타이드는 리신-AMP 폴리펩타이드 작제물을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하며, 여기서 리신-AMP 폴리펩타이드 작제물은 GN281 리신(서열번호 20) 또는 리신 활성이 있고, 서열번호 20과 적어도 80%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 98%, 또는 예를 들어 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 분자이다.
[168] 일부 구현예에서, GN281 리신을 인코딩하는 핵산 분자는 서열번호 19의 핵산 서열, 이의 보체 또는 리신 활성이 있고 서열번호 19와 적어도 80%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 98%, 또는 예를 들어 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 서열, 또는 이의 보체를 포함한다.
[169] 일부 구현예에서, 단리된 폴리뉴클레오타이드는 리신-AMP 폴리펩타이드 작제물을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하며, 여기서 리신-AMP 폴리펩타이드 작제물은 GN349 리신(서열번호 30) 또는 리신 활성이 있고 서열번호 30과 적어도 80%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 98%, 또는 예를 들어 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 분자이다.
[170] 일부 구현예에서, GN349 리신을 인코딩하는 핵산 분자는 서열번호 29의 핵산 서열, 이의 보체 또는 리신 활성이 있고 서열번호 29와 적어도 80%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 98%, 또는 예를 들어 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 서열, 또는 이의 보체를 포함한다.
[171] 일부 구현예에서, 단리된 폴리뉴클레오타이드는 리신-AMP 폴리펩타이드 작제물을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하며, 여기서 리신-AMP 폴리펩타이드 작제물은 GN351 리신(서열번호 32) 또는 리신 활성이 있고 서열번호 32와 적어도 80%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 98%, 또는 예를 들어 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 분자이다.
[172] 일부 구현예에서, GN351 리신을 인코딩하는 핵산 분자는 서열번호 31의 핵산 서열, 이의 보체 또는 리신 활성이 있고 서열번호 31과 적어도 80%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 98%, 또는 예를 들어 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 서열, 또는 이의 보체를 포함한다.
[173] 일부 구현예에서, 단리된 폴리뉴클레오타이드는 리신-AMP 폴리펩타이드 작제물을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하며, 여기서 리신-AMP 폴리펩타이드 작제물은 GN352 리신(서열번호 34) 또는 리신 활성이 있고 서열번호 34와 적어도 80%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 98%, 또는 예를 들어 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 분자이다.
[174] 일부 구현예에서, GN352 리신을 인코딩하는 핵산 분자는 서열번호 33의 핵산 서열, 이의 보체 또는 리신 활성이 있고 서열번호 33과 적어도 80%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 98%, 또는 예를 들어 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 서열, 또는 이의 보체를 포함한다.
[175] 일부 구현예에서, 단리된 폴리뉴클레오타이드는 리신-AMP 폴리펩타이드 작제물을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하며, 여기서 리신-AMP 폴리펩타이드 작제물은 GN353 리신(서열번호 36) 또는 리신 활성이 있고 서열번호 36과 적어도 80%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 98%, 또는 예를 들어 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 분자이다.
[176] 일부 구현예에서, GN353 리신을 인코딩하는 핵산 분자는 서열번호 35의 핵산 서열, 이의 보체 또는 리신 활성이 있고 서열번호 35와 적어도 80%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 98%, 또는 예를 들어 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 서열, 또는 이의 보체를 포함한다.
[177] 일부 구현예에서, 단리된 폴리뉴클레오타이드는 리신-AMP 폴리펩타이드 작제물을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하며, 여기서 리신-AMP 폴리펩타이드 작제물은 GN357 리신(서열번호 38) 또는 리신 활성이 있고 서열번호 38과 적어도 80%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 98%, 또는 예를 들어 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 분자이다.
[178] 일부 구현예에서, GN357 리신을 인코딩하는 핵산 분자는 서열번호 37의 핵산 서열, 이의 보체 또는 리신 활성이 있고 서열번호 37과 적어도 80%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 98%, 또는 예를 들어 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 서열, 또는 이의 보체를 포함한다.
[179] 일부 구현예에서, 단리된 폴리뉴클레오타이드는 리신-AMP 폴리펩타이드 작제물을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하며, 여기서 리신-AMP 폴리펩타이드 작제물은 GN359 리신(서열번호 40) 또는 리신 활성이 있고 서열번호 40과 적어도 80%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 98%, 또는 예를 들어 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 분자이다.
[180] 일부 구현예에서, GN359 리신을 인코딩하는 핵산 분자는 서열번호 39의 핵산 서열, 이의 보체 또는 리신 활성이 있고 서열번호 39와 적어도 80%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 98%, 또는 예를 들어 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 서열, 또는 이의 보체를 포함한다.
[181] 일부 구현예에서, 단리된 폴리뉴클레오타이드는 리신-AMP 폴리펩타이드 작제물을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하며, 여기서 리신-AMP 폴리펩타이드 작제물은 GN369 리신(서열번호 42) 또는 리신 활성이 있고, 서열번호 42와 적어도 80%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 98%, 또는 예를 들어 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 분자이다.
[182] 일부 구현예에서, GN369 리신을 인코딩하는 핵산 분자는 서열번호 41의 핵산 서열, 이의 보체 또는 리신 활성이 있고 서열번호 41과 적어도 80%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 98%, 또는 예를 들어 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 서열, 또는 이의 보체를 포함한다.
[183] 일부 구현예에서, 단리된 폴리뉴클레오타이드는 리신-AMP 폴리펩타이드 작제물을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하며, 여기서 리신-AMP 폴리펩타이드 작제물은 GN370 리신(서열번호 44) 또는 리신 활성이 있고 서열번호 44와 적어도 80%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 98%, 또는 예를 들어 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 분자이다.
[184] 일부 구현예에서, GN370 리신을 인코딩하는 핵산 분자는 서열번호 43의 핵산 서열, 이의 보체 또는 리신 활성이 있고 서열번호 43과 적어도 80%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 98%, 또는 예를 들어 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 서열, 또는 이의 보체를 포함한다.
[185] 일부 구현예에서, 단리된 폴리뉴클레오타이드는 리신-AMP 폴리펩타이드 작제물을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하며, 여기서 리신-AMP 폴리펩타이드 작제물은 GN371 리신(서열번호 46) 또는 리신 활성이 있고 서열번호 46과 적어도 80%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 98%, 또는 예를 들어 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 분자이다.
[186] 일부 구현예에서, GN371 리신을 인코딩하는 핵산 분자는 서열번호 45의 핵산 서열, 이의 보체 또는 리신 활성이 있고 서열번호 45와 적어도 80%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 98%, 또는 예를 들어 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 서열, 또는 이의 보체를 포함한다.
[187] 일부 구현예에서, 단리된 폴리뉴클레오타이드는 리신-AMP 폴리펩타이드 작제물을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하며, 여기서 리신-AMP 폴리펩타이드 작제물은 GN93 리신(서열번호 62) 또는 리신 활성이 있고 서열번호 62와 적어도 80%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 98%, 또는 예를 들어 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 분자이다.
[188] 일부 구현예에서, GN93을 인코딩하는 핵산 분자는 서열번호 61의 핵산 서열, 이의 보체 또는 리신 활성이 있고 서열번호 61과 적어도 80%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 98%, 또는 예를 들어 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 서열, 또는 이의 보체를 포함한다.
벡터 및 숙주 세포
[189] 또 다른 측면에서, 본 개시내용은 본원에 개시된 리신-AMP 폴리펩타이드, 리신 폴리펩타이드, 변이체, 이의 활성 단편 또는 유도체 중 어느 것을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드 또는 본 단리된 폴리뉴클레오타이드의 상보적인 서열을 포함하는 벡터에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 벡터는 플라스미드 또는 코스미드이다. 다른 구현예에서, 벡터는 바이러스 벡터이고, 여기서 추가적인 DNA 단편이 바이러스 벡터에 연결될 수 있다. 일부 구현예에서, 벡터는 그것이 도입되는 숙주 세포에서 자체적으로 복제할 수 있다. 일부 구현예에서, 벡터는 숙주 세포에 도입될 때 숙주 세포의 게놈에 통합될 수 있으며, 이에 따라 숙주 게놈과 함께 복제될 수 있다.
[190] 일부 구현예에서, 본원에서 "재조합 발현 벡터" 또는 "발현 벡터"로 지칭되는 특정 벡터는 이들이 작동 가능하게 연결된 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 폴리뉴클레오타이드 서열은 또 다른 뉴클레오타이드 서열과 기능적 관계로 배치될 때 "작동 가능하게 연결"된다. 예를 들어, 프로모터 또는 조절 DNA 서열은 두 서열이 작동 가능하게 연결되어 있거나 프로모터 또는 조절 DNA 서열이 코딩 또는 구조적 DNA 서열의 발현 수준에 영향을 미치도록 위치하는 경우 RNA 및/또는 단백질을 코딩하는 DNA 서열에 "작동 가능하게 연결"된다고 한다. 작동 가능하게 연결된 DNA 서열은 통상적으로 인접하지만, 반드시 그런 것은 아니다.
[191] 일반적으로, 숙주에서 폴리펩타이드를 유지, 증식 또는 발현하기에 적합한 임의의 시스템 또는 벡터는 본 리신-AMP 폴리펩타이드, 리신 폴리펩타이드, 변이체, 이의 활성 단편 또는 유도체의 발현에 사용될 수 있다. 적절한 DNA/폴리뉴클레오타이드 서열은, 예를 들어, 문헌[참조: Sambrook et al., eds., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd Ed.), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory (2001)]에 기재된 것들과 같은 임의의 여라 잘 알려져 있고 일상적인 기술에 의해 발현 시스템에 삽입될 수 있다. 추가로, 태그를 본 개시내용의 리신-AMP 폴리펩타이드, 리신 폴리펩타이드, 변이체, 이의 활성 단편 또는 유도체에 또한 추가하여 편리한 단리 방법, 예를 들어, c-myc, 비오틴, 폴리-His 등을 제공할 수 있다. 이러한 발현 시스템을 위한 키트는 상업적으로 입수가능하다.
[192] 본 리신-AMP 폴리펩타이드, 리신 폴리펩타이드, 변이체, 이의 활성 단편 또는 유도체를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 발현하는데 매우 다양한 숙주/발현 벡터 조합이 사용될 수 있다. 많은 수의 적합한 벡터가 당업자에게 알려져 있고 상업적으로 입수가능하다. 적합한 벡터의 예는, 예를 들어, 문헌[참조: Sambrook et al, eds., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd Ed.), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory (2001)]에서 제공된다. 이러한 벡터는, 특히, 염색체, 에피솜 및 바이러스 유래 벡터, 예를 들어, 박테리아 플라스미드, 박테리오파지, 트랜스포존, 효모 에피솜, 삽입 요소, 효모 염색체 요소, 바이러스 예를 들어 바큘로바이러스, 파포바 바이러스, 예를 들어, SV40, 백시니아 바이러스, 아데노바이러스, 수두 바이러스, 가성광견병 바이러스 및 레트로바이러스로부터 유래된 벡터, 및 플라스미드 및 박테리오파지 유전 요소, 예를 들어 코스미드 및 파스미드(phagemid)로부터 유래된 것들과 같이 이들의 조합으로부터 유래된 벡터를 포함한다.
[193] 또한, 벡터는 본 개시내용의 리신-AMP 폴리펩타이드, 리신 폴리펩타이드, 변이체, 이의 활성 단편 또는 유도체의 구성적 또는 유도성 발현을 제공할 수 있다. 적합한 벡터는 SV40의 유도체 및 공지된 박테리아 플라스미드, 예를 들어, 이. 콜라이 (E. coli ) 플라스미드 colEl, pCRl, pBR322, pMB9 및 이들의 유도체, 플라스미드, 예를 들어 RP4, pBAD24 및 pBAD-TOPO; 파지 DNAS, 예를 들어, 파지 A의 수많은 유도체, 예를 들어, NM989, 및 다른 파지 DNA, 예를 들어, M13 및 필라멘트 단일 가닥 파지 DNA; 효모 플라스미드 예를 들어 2 D 플라스미드 또는 이의 유도체; 진핵 세포에 유용한 벡터, 예를 들어 곤충 또는 포유동물 세포에 유용한 벡터; 플라스미드 및 파지 DNA의 조합으로부터 유래된 벡터, 예를 들어 파지 DNA 또는 다른 발현 제어 서열을 사용하도록 변형된 플라스미드; 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 상기 언급된 많은 벡터는 뉴 잉글랜드 바이오랩스 인코포레이티드(New England Biolabs Inc.), 애드진(Addgene), 다카라 바이오 인코포레이티드(Takara Bio Inc.), 써모피셔 사이언티픽 인코포레이티드(ThermoFisher Scientific Inc.) 등에서 상업적으로 입수가능하다.
[194] 추가로, 벡터는 다양한 조절 요소(프로모터, 리보솜 결합 부위, 종결자, 인핸서, 발현 수준을 조절하기 위한 다양한 시스-요소 포함)를 포함할 수 있으며, 여기서 벡터는 숙주 세포에 따라 구축된다. 본 개시내용의 리신-AMP 폴리펩타이드, 리신 폴리펩타이드, 변이체, 이의 활성 단편 또는 이의 유도체를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 발현하기 위해 매우 다양한 임의의 발현 제어 서열(이와 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오타이드 서열의 발현을 제어하는 서열)이 이러한 벡터에서 사용될 수 있다. 유용한 제어 서열로는 SV40, CMV, 백시니아, 폴리오마 또는 아데노바이러스의 초기 또는 후기 프로모터, lac 시스템, trp 시스템, TAC 시스템, TRC 시스템, LTR 시스템, 파지 A의 주요 작동 및 프로모터 영역, fd 코트 단백질의 제어 영역, 3-포스포글리세레이트 키나제 또는 다른 해당 효소에 대한 프로모터, 산 포스파타제의 프로모터(예를 들어, Pho5), 효모-교배 인자의 프로모터, 박테리아에서의 발현을 위한 이. 콜라이 프로모터, 및 원핵 세포 또는 진핵 세포 또는 이들의 바이러스의 유전자 발현을 제어하는 것으로 공지된 다른 프로모터 서열, 및 이들의 다양한 조합이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 통상적으로, 리신-AMP 폴리펩타이드, 리신 폴리펩타이드, 변이체, 이의 활성 단편 또는 유도체를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열은 이종 프로모터 또는 조절 요소에 작동 가능하게 연결된다.
[195] 또 다른 측면에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 리신-AMP 폴리펩타이드, 리신 폴리펩타이드, 변이체, 이의 활성 단편 또는 유도체를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 발현 벡터를 포함하는 본원에 개시된 임의의 벡터를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다. 본 폴리펩타이드를 발현하는데 매우 다양한 숙주 세포가 유용하다. 본 폴리펩타이드의 발현에 적합한 숙주 세포의 비제한적인 예로는 잘 알려진 진핵생물 및 원핵생물 숙주, 예를 들어 이. 콜라이, 슈도모나스, 바실러 스(Bacillus), 스트렙토마이세스(Streptomyces)의 균주, 효모와 같은 진균, 및 동물 세포, 예를 들어 CHO, Rl.l, B-W 및 L-M 세포, 아프리카 그린 원숭이(African Green Monkey) 신장 세포(예를 들어, COS 1, COS 7, BSCl, BSC40, 및 BMT10), 곤충 세포(예를 들어, Sf9), 및 조직 배양물 중의 인간 세포 및 식물 세포가 포함된다. 통상적인 구현예에서 발현 숙주는 임의의 공지된 발현 숙주 세포일 수 있지만, 발현 숙주는 이. 콜라이의 균주 중 하나이다. 이는 상업적으로 입수가능한 이. 콜라 이 균주 예를 들어 Top10(써모피셔 사이언티픽 인코포레이티드), DH5a(써모 피셔 사이언티픽 인코포레이티드), XLI-Blue(애질런트 테크놀로지스, 인코포레이티드(Agilent Technologies, Inc.)), SCSllO(애질런트 테크놀로지스, 인코포레이티드), JM109(프로메가, 인코포레이티드(Promega, Inc.)), LMG194(ATCC), 및 BL21(써모 피셔 사이언티픽 인코포레이티드)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
[196] 이. 콜라이를 숙주 시스템으로 사용하면 다음과 같은 몇 가지 이점이 있다: 빠른 성장 동역학, 최적의 환경 조건하에 배가 시간은 약 20분임(참조: Sezonov et al., J. Bacterial. 189 8746-8749 (2007)), 쉽게 달성되는 고밀도 배양, 외인성 DNA를 이용한 쉽고 빠른 형질전환 등. 플라스미드 선택 및 균주 선택을 포함하여 이. 콜라이에서의 단백질 발현에 관한 세부 사항은 문헌(참조: Rosano, G. and Ceccarelli, E., Front Microbial., 5: 172 (2014))에 상세히 논의된다.
[197] 본 리신-AMP 폴리펩타이드, 리신 폴리펩타이드, 변이체, 이의 활성 단편 또는 유도체의 효율적인 발현은 최적의 발현 신호(전사 및 번역 수준 모두에서), 정확한 단백질 폴딩 및 세포 성장 특성과 같은 다양한 요인에 따라 달라진다. 벡터를 구축하는 방법 및 구축된 재조합 벡터를 숙주 세포로 형질도입하는 방법은 당해 분야에 공지된 통상적인 방법을 이용할 수 있다. 모든 벡터, 발현 제어 서열 및 숙주가 본 개시내용의 리신-AMP 폴리펩타이드, 리신 폴리펩타이드, 변이체, 이의 활성 단편 또는 유도체를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 발현하는데 동등하게 잘 기능하는 것은 아니라는 것이 이해되지만, 당업자는 본 개시내용의 범위를 벗어나지 않고 원하는 발현을 달성하기 위해 과도한 실험 없이 적절한 벡터, 발현 제어 서열 및 숙주를 선택할 수 있을 것이다.
[198] 일부 구현예에서, 본 발명자들은 발현된 폴리펩타이드의 발현 수준과 활성 사이의 상관관계를 발견하였고; 특히 이. 콜라이 발현 시스템에서, 중간 수준의 발현(예를 들어 약 1 내지 10mg/L)은 이. 콜라이에서 더 높은 수준(예를 들어 약 20 내지 약 100mg/L)으로 발현된 것보다 더 높은 수준의 활성을 갖는 리신-AMP 폴리펩타이드, 리신 폴리펩타이드, 변이체, 이의 활성 단편 또는 유도체를 산출하였고, 후자는 때때로 완전히 불활성인 폴리펩타이드를 산출하였다.
[199] 본 개시내용의 리신-AMP 폴리펩타이드, 리신 폴리펩타이드, 변이체, 이의 활성 단편 또는 유도체는 황산암모늄 또는 에탄올 침전, 산 추출, 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 포스포셀룰로스 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 수산화 인회석 크로마토그래피 및 렉틴 크로마토그래피를 포함하는 잘 알려진 방법에 의해 재조합 세포 배양물로부터 회수 및 정제될 수 있다. 고성능 액체 크로마토그래피는 리신 폴리펩타이드 정제에도 사용될 수 있다.
[200] 대안적으로, 본 개시내용의 리신-AMP 폴리펩타이드, 리신 폴리펩타이드, 변이체, 이의 활성 단편 또는 유도체의 생산에 사용된 벡터 시스템은 무세포 발현 시스템일 수 있다. 프로메가(Promega), 라이프테크놀로지스(LifeTechnologies), 클론테크(Clonetech) 등으로부터 입수가능한 것을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 다양한 무세포 발현 시스템이 상업적으로 입수가능하다.
[201] 상기 지시된 바와 같이, 단백질 생산 및 정제에 관한 한 다양한 선택이 존재한다. 단백질 생산 및 정제에 고려되는 적합한 방법 및 전략의 예는 그 전문이 본원에 참조로 포함된 WO 2017/049233에 제공되며, 문헌(참조: Structural Genomics Consortium et al., Nat. Methods., 5(2): 135-146 (2008))에 추가로 제공된다.
약제학적 조성물
[202] 또 다른 측면에서, 본 개시내용은 유효량의 본원에 기재된 리신-AMP 폴리펩타이드, 리신 폴리펩타이드, 변이체, 이의 활성 단편 또는 유도체 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 본 약제학적 조성물은 인간 혈청의 부재 및/또는 존재하에 또는 폐 계면활성제의 존재하에 피. 아에루기노사 박테리아 성장 억제, 피. 아에루기노사 박테리아 개체군 감소 및/또는 피. 아에루기노사 사멸로부터 선택된 적어도 하나의 활성을 포함한다.
[203] 일부 구현예에서, 본 약제학적 조성물은 그람-음성균의 치료에 적합한 하나 이상의 항생제를 추가로 포함한다. 통상적인 항생제로는 세프타지딤, 세페핌, 세포페라존, 세프토비프롤, 시프로플록사신, 레보플록사신, 아미노글리코시드, 이미페넴, 메로페넴, 도리페넴, 겐타마이신, 토브라마이신, 아미카신, 피페라실린, 티카르실린, 페니실린, 리팜피신, 폴리믹신 B, 및 콜리스틴 중 하나 이상이 포함된다. 추가의 적합한 항생제는 표 3에 기재되어 있다.
[204] 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 용액, 현탁액, 에멀젼, 흡입성 분말, 에어로졸 또는 스프레이이다. 본 개시내용의 약제학적 조성물은 용액, 현탁액, 에멀젼, 정제, 알약, 펠릿, 캡슐, 액체를 함유하는 캡슐, 분말, 서방형 제형, 좌제, 탐폰 적용 에멀젼, 에어로졸, 스프레이, 현탁액, 로젠지, 트로키, 캔디, 주사제(injectant), 츄잉검(chewing gum), 연고, 스미어(smear), 지속 방출(time-release) 패치, 액체 흡수 와이프 및 이들의 조합의 형태를 취할 수 있다.
[205] 본 개시내용의 약제학적 조성물의 투여는 국소일 수 있으며, 즉, 약제학적 조성물은 이의 작용이 필요한 곳에 직접(예를 들어 상처에 직접) 적용된다. 본 개시내용의 국소 조성물은 약제학적으로 또는 생리적으로 허용되는 담체, 예를 들어 피부과적으로 또는 귀에 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 피부과적으로 허용되는 담체의 경우 이러한 담체는 바람직하게는 피부, 손톱, 점막, 조직 및/또는 모발에 적합할 수 있으며, 이러한 요건을 충족하는 통상적으로 사용되는 임의의 피부과 담체를 포함할 수 있다. 귀에 허용되는 담체의 경우, 담체는 바람직하게는 귀의 모든 부분에 적합하다. 이러한 담체는 당업자에 의해 용이하게 선택될 수 있다.
[206] 본 개시내용의 리신, 이의 활성 단편 및/또는 리신-AMP 폴리펩타이드 작제물의 국소 투여용 담체는 미네랄 오일, 액화 석유, 백색 석유(white petroleum), 프로필렌 글리콜, 폴리옥시에틸렌 및/또는 폴리옥시프로필렌 화합물, 유화 왁스, 소르비탄 모노스테아레이트, 폴리소르베이트 60, 세틸 에스테르 왁스, 세테아릴 알코올, 2-옥틸도데칸올, 벤질 알코올 및 물을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 피부 연고를 제형화할 때, 본 개시내용의 활성 성분은 유성 탄화수소 베이스, 무수 흡수 베이스, 유중수 흡수 베이스, 수중유 수분 제거가능 베이스 및/또는 수용성 베이스에서 제형화될 수 있다. 귀 조성물을 제형화할 때, 본 개시내용의 활성 성분은 덱스트란, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리비닐피롤리돈, 폴리사카라이드 겔, 겔라이트(Gelrite)®, 셀룰로오스 중합체 예를 들어 하이드록시프로필 메틸셀룰로스 및 카복시-함유 중합체 예를 들어 아크릴산의 중합체 또는 공중합체와 같은 담체를 포함하는 수성 중합성 현탁액, 뿐만 아니라 다른 중합성 완화제(demulcent)에서 제형화될 수 있다.
[207] 본 개시내용에 따른 국소 조성물은 수성, 수성-알코올성 또는 유성 용액, 로션 또는 혈청 분산액, 수성, 무수 또는 유성 겔, 수성 상에서 지방 상의 분산에 의해 얻어진 에멀젼(OAV 또는 수중유) 또는 정반대(W/O 또는 유중수), 마이크로에멀젼 또는 대안적으로 마이크로캡슐, 미세입자 또는 이온성 및/또는 비이온성 유형의 지질 소포 분산액, 크림, 로션, 겔, 폼(이는 일반적으로 가압 캐니스터, 적합한 도포기, 유화제 및 불활성 추진제가 필요할 것임), 에센스, 밀크, 현탁액 또는 패치를 포함하는 국소 적용에 적합한 임의의 형태일 수 있다. 본 개시내용의 국소 조성물은 또한 친수성 또는 친유성 겔화제, 친수성 또는 친유성 활성제, 보존제, 항산화제, 용매, 방향제, 충전제, 자외선 차단제, 냄새 흡수제 및 염료와 같은 보조제를 함유할 수 있다. 추가 측면에서, 국소 조성물은 대상체의 피부 또는 다른 조직에 부착되거나 달리 결합될 수 있고 치료적 유효량의 본 개시내용에 따른 하나 이상의 항균 펩타이드를 전달할 수 있는 경피 패치, 드레싱, 패드, 랩, 매트릭스 및 붕대와 같은 장치와 함께 투여될 수 있다.
[208] 일 구현예에서, 본 개시내용의 국소 조성물은 국소 화상 치료에 사용되는 하나 이상의 성분을 추가로 포함한다. 이러한 성분은 통상적으로 프로필렌 글리콜 히드로겔; 글리콜, 셀룰로스 유도체 및 수용성 알루미늄 염의 조합; 방부제; 항생제; 및 코르티코스테로이드를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 보습제(예를 들어 고체 또는 액체 왁스 에스테르), 흡수 촉진제(예를 들어 친수성 점토, 또는 전분), 점도 형성제(viscocity building agent), 및 피부-보호제를 또한 첨가할 수 있다. 국소 제형은 구강 세정제와 같은 린스 형태일 수 있다. 예를 들어, WO2004/004650을 참조한다.
[209] 일부 구현예에서, 본 개시내용의 약제학적 조성물의 투여는 전신적일 수 있다. 전신 투여는 장관 또는 경구일 수 있으며, 즉, 물질은 소화관을 통해, 비경구적으로 투여되고, 즉, 물질은 주사 또는 흡입과 같은 소화관 이외의 경로로 투여된다. 따라서, 본 개시내용의 리신-AMP 폴리펩타이드, 리신 폴리펩타이드, 변이체, 이의 활성 단편 또는 유도체를 포함하는 폴리펩타이드는 경구, 비경구, 흡입, 국소, 직장, 비강, 협측 또는 이식된 저장소를 통해 또는 임의의 다른 공지된 방법에 의해 대상체에게 투여될 수 있다. 본 개시내용의 리신-AMP 폴리펩타이드, 리신 폴리펩타이드, 변이체, 이의 활성 단편 또는 유도체는 또한 지속 방출 투여형으로 투여될 수 있다.
[210] 경구 투여를 위해, 본 개시내용의 리신-AMP 폴리펩타이드, 리신 폴리펩타이드, 변이체, 이의 활성 단편 또는 유도체는 고체 또는 액체 제제, 예를 들어, 정제, 캡슐, 분말, 용액, 현탁액 및 분산액으로 제형화될 수 있다. 리신, 이의 활성 단편 및/또는 리신-AMP 폴리펩타이드 작제물은, 예를 들어, 락토스, 수크로스, 옥수수 전분, 젤라틴, 감자 전분, 알긴산 및/또는 마그네슘 스테아레이트와 같은 부형제와 함께 제형화될 수 있다.
[211] 정제 및 알약과 같은 고체 조성물을 제조하기 위해, 본 개시내용의 리신-AMP 폴리펩타이드, 리신 폴리펩타이드, 변이체, 이의 활성 단편 또는 유도체를 약제학적 부형제와 혼합하여 고체 예비-제형 조성물을 형성한다. 원하는 경우, 정제는 표준 기술에 의해 당 코팅되거나 장용 코팅될 수 있다. 정제 또는 알약은 코팅되거나 그렇지 않으면 배합되어 장기간 작용의 이점을 제공하는 투여형을 제공할 수 있다. 예를 들어, 정제 또는 알약은 내부 투여 및 외부 투여 성분을 포함할 수 있으며, 후자는 전자를 덮는 외피 형태이다. 두 가지 투여 성분은 장용 층에 의해 분리될 수 있으며, 이는 위 내에서의 붕해에 저항하고 내부 성분이 십이지장으로 온전히 통과하거나 방출을 지연시키는 역할을 한다. 이러한 장용 층 또는 코팅을 위해서는 다양한 물질이 사용될 수 있으며, 이러한 물질은 다수의 중합체 산 및 셸락, 세틸 알코올 및 셀룰로오스 아세테이트와 같은 물질과 중합체 산의 혼합물을 포함한다.
[212] 본 개시내용의 약제학적 조성물은 또한 주사에 의해 투여될 수 있다. 예를 들어, 약제학적 조성물은 그람-음성균에 의한 감염, 보다 구체적으로는 피. 아에루기노사에 의해 유발된 감염을 치료하기 위해 근육내, 경막내, 진피하(subdermal), 피하 또는 정맥내로 투여될 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체는 증류수, 식염수, 알부민, 혈청 또는 이들의 임의의 조합으로 구성될 수 있다. 추가로, 비경구 주사액의 약제학적 조성물은 pH 완충 용액, 보조제(예를 들어, 보존제, 습윤제, 유화제 및 분산제), 리포좀 제형, 나노입자, 분산액, 현탁액 또는 에멀젼뿐만 아니라 사용 직전 멸균 주사 용액 또는 분산액으로 재구성하기 위한 멸균 분말을 포함할 수 있다.
[213] 비경구 주사가 선택된 투여 방식인 경우, 등장성 제형이 바람직하게 사용된다. 일반적으로, 등장성을 위한 첨가제는 염화나트륨, 덱스트로스, 만니톨, 소르비톨 및 락토스를 포함할 수 있다. 어떤 경우에는 인산염 완충 식염수와 같은 등장성 용액이 선호된다. 안정제로는 젤라틴 및 알부민이 포함될 수 있다. 혈관 수축제가 제형에 첨가될 수 있다. 이러한 유형의 적용에 따른 약제학적 제제는 멸균 및 발열원이 없는 상태로 제공된다.
[214] 또 다른 구현예에서, 본 개시내용의 약제학적 조성물은 흡입성 조성물이다. 일부 구현예에서, 본 약제학적 조성물은 유리하게는 무수, 흡입성 분말로 제형화된다. 특정 구현예에서, 본 약제학적 조성물은 에어로졸 전달을 위한 추진제와 함께 추가로 제형화될 수 있다. 적합한 추진제의 예로는 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로-테트라플루오로에탄 및 이산화탄소가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 특정 구현예에서, 제형은 분무될 수 있다.
[215] 약제와 추진제 사이의 표면 및 계면 장력을 낮추기 위해 계면활성제가 본 개시내용의 흡입성 약제학적 조성물에 첨가될 수 있다. 계면활성제는 본 폴리펩타이드와 반응하지 않는 임의의 적합한 무독성 화합물일 수 있다.
[216] 적합한 계면활성제의 예로는 올레산; 소르비탄 트리올레에이트; 세틸 피리디늄 클로라이드; 대두 레시틴; 폴리옥시에틸렌(20) 소르비탄 모노라우레이트; 폴리옥시에틸렌 (10) 스테아릴 에테르; 폴리옥시에틸렌 (2) 올레일 에테르; 폴리옥시프로필렌-폴리옥시에틸렌 에틸렌 디아민 블록 공중합체; 폴리옥시에틸렌(20) 소르비탄 모노스테아레이트; 폴리옥시에틸렌(20) 소르비탄 모노올레에이트; 폴리옥시프로필렌-폴리옥시에틸렌 블록 공중합체; 피마자유 에톡실레이트; 및 이들의 조합이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다.
[217] 일부 구현예에서, 흡입성 약제학적 조성물은 부형제를 포함한다. 적합한 부형제의 예로는 락토스, 전분, 중쇄 지방산의 프로필렌 글리콜 디에스테르; 중쇄 지방산, 단쇄 또는 장쇄의 트리글리세라이드 에스테르, 또는 이들의 임의의 조합; 퍼플루오로디메틸사이클로부탄; 퍼플루오로사이클로부탄; 폴리에틸렌 글리콜; 멘톨; 라우로글리콜; 디에틸렌 글리콜 모노에틸에테르; 중쇄 지방산의 폴리글리콜화 글리세라이드; 알코올; 유칼립투스 오일; 단쇄 지방산; 및 이들의 조합이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다.
[218] 일부 구현예에서, 본 개시내용의 약제학적 조성물은 비강 제형을 포함한다. 비강 제형에는, 예를 들어, 비강 스프레이, 비강 점적제, 비강 연고, 비강 세정액, 비강 주사액, 비강 패킹, 기관지 스프레이 및 흡입기, 또는 간접적으로 인후 로젠지, 구강 세정제 또는 가글의 사용을 통해, 또는 콧구멍 또는 얼굴에 도포된 연고의 사용을 통해 또는 이들 및 유사한 적용 방법의 임의의 조합이 포함된다.
[219] 또 다른 구현예에서, 본 개시내용의 약제학적 조성물은 하나 이상의 항미생물제 및/또는 하나 이상의 통상적인 항생제를 포함하는 보완제(complementary agent)를 포함한다. 감염의 치료를 가속화하거나 항균 효과를 증가시키기 위해, 본 개시내용의 리신-AMP 폴리펩타이드, 리신 폴리펩타이드, 변이체, 이의 활성 단편 또는 유도체를 함유하는 치료제는 펩타이드의 살균 활성을 또한 강화시킬 수 있는 적어도 하나의 보완제를 추가로 포함할 수 있다. 보완제는 그람-음성균을 치료하는데 사용되는 하나 이상의 항생제일 수 있다. 일 구현예에서, 보완제는 피. 아에루기노사에 의해 유발된 감염 치료에 사용되는 항생제 또는 항미생물제이다.
[220] 본 개시내용의 약제학적 조성물은 단위 투여 형태로 제공될 수 있고, 당해 분야에 잘 알려진 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 단일 투여형을 생성하기 위해 담체 물질과 조합될 수 있는 활성 성분의 양은 치료되는 숙주, 감염성 박테리아에 대한 수용자의 노출 기간, 대상체의 크기 및 체중, 및 특정 투여 방식에 따라 달라질 것이다. 단일 투여형을 생성하기 위해 담체 물질과 조합될 수 있는 활성 성분의 양은 일반적으로 치료 효과를 가져오는 각 화합물의 양일 것이다. 일반적으로, 100% 중 총량은 약 1% 내지 약 99%의 활성 성분, 바람직하게는 약 5% 내지 약 70%, 가장 바람직하게는 약 10% 내지 약 30% 범위일 것이다.
투여량 및 투여
[221] 투여되는 투여량은 치료되는 감염의 활성, 치료될 대상체의 연령, 건강 및 일반적인 신체 상태, 특정 리신-AMP 폴리펩타이드, 리신 폴리펩타이드, 변이체, 이의 활성 단편 또는 유도체의 활성, 존재한다면 본 개시내용에 따른 리신-AMP 폴리펩타이드, 리신 폴리펩타이드, 변이체, 이의 활성 단편 또는 유도체가 쌍을 이루는 항생제의 성질 및 활성 및 이러한 쌍의 조합된 효과를 포함한 여러 요인에 따라 달라진다. 일반적으로, 투여될 유효량의 본 리신-AMP 폴리펩타이드, 리신 폴리펩타이드, 변이체, 이의 활성 단편 또는 유도체는 최대 14일 동안 1일 1회 내지 4회 투여되는 1 내지 50mg/kg(또는 1 내지 50mcg/ml) 범위에 속할 것으로 예상된다. 항생제는 사용되어도 표준 투여 요법으로 또는 시너지 측면에서 보다 적은 양으로 투여될 것이다. 그러나 이러한 모든 투여량 및 요법(리신-AMP 폴리펩타이드, 리신 폴리펩타이드, 변이체, 이의 활성 단편 또는 유도체이든 또는 이와 함께 투여되는 임의의 항생제이든)은 최적화의 대상이 된다. 최적의 투여량은 본 개시내용을 고려하면서 당해 분야의 기술 내에 있는 시험관내 및 생체내 파일럿 효능 실험을 수행함으로써 결정될 수 있다.
[222] 본 리신-AMP 폴리펩타이드, 리신 폴리펩타이드, 변이체, 이의 활성 단편 또는 유도체는 살균 효과를 제공하고, 소량으로 사용되는 경우, 정균 효과를 제공하며, 다양한 항생제 내성 박테리아에 대해 유효하고, 진화하는 내성과 관련이 없다. 본 개시내용에 기초하여, 임상 환경에서, 본 리신-AMP 폴리펩타이드, 리신 폴리펩타이드, 변이체, 이의 활성 단편 또는 유도체는 약물 및 다약물 내성 박테리아에서 발생하는 감염을 단독으로 또는 항생제(내성이 발달한 항생제도 포함)와 함께 치료하기 위한 조성물의 강력한 대안(또는 첨가제 또는 성분)이다. 그람-음성균에 대한 기존의 내성 메커니즘은 본 폴리펩타이드의 용해 활성에 대한 감수성에 영향을 미치지 않아야 한다.
[223] 일부 구현예에서, 본 리신-AMP 폴리펩타이드, 리신 폴리펩타이드, 변이체, 이의 활성 단편 또는 유도체에 대한 시간 노출은 ml당 원하는 활성 폴리펩타이드 단위 농도에 영향을 미칠 수 있다. "장기" 또는 "저속" 방출 담체(예를 들어, 특정 비강 스프레이 또는 로젠지)로 분류된 담체는 ml당 더 낮은 농도의 폴리펩타이드 단위를 보유 또는 제공할 수 있지만, 더 오랜 기간에 걸쳐 보유 또는 제공할 수 있는 반면, "단기" 또는 "고속" 방출 담체(예를 들어, 가글)는 ml당 고농도 폴리펩타이드 단위(mcg)를 보유하거나 제공할 수 있지만, 더 짧은 기간에 걸쳐 보유 또는 제공할 수 있다. 훨씬 더 높은 단위/ml 투여량 또는 더 낮은 단위/ml 투여량이 필요할 수 있는 상황이 있다.
[224] 본 개시내용의 임의의 폴리펩타이드의 경우, 치료적 유효 용량은 초기에 세포 배양 검정 또는 동물 모델, 일반적으로 마우스, 토끼, 개 또는 돼지에서 추정될 수 있다. 동물 모델은 또한 바람직한 농도 범위 및 투여 경로를 달성하기 위해 사용될 수 있다. 이어서 얻은 정보를 사용하여 인간에서의 투여 경로뿐만 아니라 유효 용량을 결정할 수 있다. 충분한 수준의 활성 성분을 제공하거나 원하는 효과를 유지하기 위해 투여량 및 투여를 추가로 조정할 수 있다. 고려할 수 있는 추가 요소로는 환자의 질환 상태의 중증도, 연령, 체중 및 성별; 식이, 원하는 치료 기간, 투여 방법, 투여 시간 및 빈도, 약물 조합(들), 반응 감도, 및 치료에 대한 내성/반응 및 치료 의사의 판단이 포함된다.
[225] 치료 요법은 매일 투여(예를 들어, 1일 1회, 2회, 3회 등), 격일(예를 들어, 격일로 1회, 2회, 3회 등), 주 2회, 매주, 2주마다 1회, 한 달에 한 번 등을 수반할 수 있다. 일 구현예에서, 치료는 연속 주입으로 제공될 수 있다. 단위 용량은 여러 번 투여할 수 있다. 임상 증상을 모니터링하여 지시된 대로 간격이 불규칙할 수도 있다. 대안적으로, 단위 용량은 지속 방출 제형으로 투여될 수 있으며, 이 경우 덜 빈번한 투여가 필요하다. 투여량과 빈도는 환자에 따라 다를 수 있다. 이러한 가이드라인은 국소 투여, 예를 들어, 비강내, 흡입, 직장 등, 또는 전신 투여, 예를 들어 구강, 직장(예를 들어, 관장을 통해), i.m.(근육내), i.p.(복강내), i.v.(정맥내), s.c.(피하), 경요도 등을 위해 조정될 것임을 당업자는 이해할 것이다.
방법
[226] 또 다른 측면에서, 본 개시내용은 피. 아에루기노사 및 임의로 본원에 기재된 하나 이상의 추가 그람-음성균 종에 의해 유발된 박테리아 감염을 치료하는 방법에 관한 것으로, 박테리아 감염으로 진단받거나 박테리아 감염 위험이 있거나 박테리아 감염 증상을 나타내는 대상체에게 본원에 기재된 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 일 측면에서, 박테리아 감염은 폐 계면활성제가 존재하는 장기 또는 조직의 감염이다.
[227] 용어 "감염" 및 "박테리아 감염"은 낭포성 섬유증(CF)을 앓는 환자의 호흡기 감염과 같은 호흡기 감염(RTI), 만성 기관지염의 급성 악화(ACEB)와 같은 하기도 감염, 급성 부비동염, 지역사회 획득 폐렴(CAP), 병원성 폐렴(HAP) 및 병원내 호흡기 감염; 임균성 자궁경부염 및 임균성 요도염과 같은 성 매개 질환; 요로 감염; 급성 중이염; 신생아 패혈증(neonatal septisemia) 및 카테터-관련 패혈증을 포함한 패혈증; 및 골수염을 포함하는 것을 의미한다. 약물-내성 박테리아 및 다약물-내성 박테리아에 의해 유발된 감염도 고려된다.
[228] 피. 아에루기노사에 의해 유발된 감염의 비제한적인 예는 다음을 포함한다: A) 병원내 감염: 1. 특히 낭포성 섬유증 환자 및 기계-환기 환자에서의 호흡기 감염; 2. 균혈증 및 패혈증; 3. 상처 감염, 특히 화상 피해자의 상처 감염; 4. 요로 감염; 5. 침습성 장치의 수술 후 감염; 6. 오염된 약물 용액의 정맥내 투여에 의한 심내막염; 7. 후천성 면역결핍 증후군, 암 화학요법, 스테로이드 요법, 혈액학상의 악성 종양, 장기 이식, 신대체요법 및 기타 중증 호중구감소증이 있는 상태. B) 지역사회 획득 감염: 1. 지역사회 획득 호흡기 감염; 2. 수막염; 3. 오염된 물에 의해 유발된 이도의 모낭염 및 감염; 4. 노인 및 당뇨병 환자의 악성 외이도염; 5. 소아에서 종골(caleaneus)의 골수염; 6. 일반적으로 오염된 콘택트 렌즈와 관련된 안구 감염; 7. 손이 자주 물에 노출되는 사람들의 손발톱 감염과 같은 피부 감염; 8. 위장관 감염; 및 9. 근골격계 감염.
[229] 본 방법의 하나 이상의 추가 그람-음성균 종은 본원에 기재된 임의의 추가의 그람-음성균 종을 포함할 수 있다. 통상적으로, 추가의 그람-음성균 종은 아시네토박터 바우마니 , 아시네토박터 헤몰리티쿠스 ( Acinetobacter haemolyticus), 악티노바실러스 악티노마이세템코미탄스 ( Actinobacillus actinomycetemcomitans), 아에로모나스 하이드로필라 ( Aeromonas hydrophila ), 박테 로이데스(Bacteroides) 종, 예를 들어, 박테로이데스 프라길리스 ( Bacteroides fragilis), 박테로이데스 테아타이오아타미크론 ( Bacteroides theataioatamicron ), 박테로이데스 디스타소니스 ( Bacteroides distasonis ), 박테로이데스 오바투 스(Bacteroides ovatus ), 박테로이데스 불가투스 ( Bacteroides vulgatus ), 바르토넬 라 퀸타나 ( Bartonella Quintana ), 보르데텔라 퍼투시스 ( Bordetella pertussis ), 브루셀라(Brucella) 종, 예를 들어, 브루셀라 멜리텐시스 ( Brucella melitensis ), 버 크홀데리아(Burkholderia) 종, 예를 들어, 버크홀데리아 세파시아 ( Burkholderia cepacia), 버크홀데리아 슈도말레이 ( Burkholderia pseudo말레이 ), 및 버크홀데리아 말레이(Burkholderia mallei ), 푸소박테리움 ( Fusobacterium ), 프레보텔라 코르포리스 (Prevotella corporis ), 프레보텔라 인터미디아 ( Prevotella intermedia ), 프레보 텔라 엔도돈탈리스 ( Prevotella endodontalis ), 포르피로모나스 아사차롤리티 카(Porphyromonas asaccharolytica ), 캄필로박터 제주니( Campylobacter jejuni ), 캄필로박터 페투스 ( Campylobacter fetus), 캄필로박터 콜라이 ( Campylobacter coli), 클라미디아 종, 예를 들어 클라미디아 뉴모니아에 ( Chlamydia pneumoniae ) 및 클라미디아 트라코마티스 ( Chlamydia trachomatis ), 시트로박터 프룬 디(Citrobacter freundii ), 시트로박터 코세리 ( Citrobacter koseri ), 콕시엘라 부 르네티(Coxiella burnetii ), 에드워지엘라 ( Edwarsiella ) 종, 예를 들어, 에드워지 엘라 타르다( Edwarsiella tarda ), 아이케넬라 코로덴스 ( Eikenella corrodens ), 엔테로박터(Enterobacter) 종, 예를 들어, 엔테로박터 클로아카에( Enterobacter cloacae), 엔테로박터 아에로제네스 ( Enterobacter aerogenes ), 및 엔테로박터 아글 로메란스(Enterobacter agglomerans ), 에스케리키아 콜라이 , 프란시셀라 툴라렌시 스(Francisella tularensis ), 헤모필루스 인플루엔자에( Haemophilus influenzae ), 헤모필루스 두크레이( Haemophilus ducreyi ), 헬리코박터 파일로리 ( Helicobacter pylori), 킹젤라 킹가에 ( Kingella kingae ), 클렙시엘라 종, 예를 들어, 클렙시엘라 뉴모니아에(Klebsiella pneumoniae ), 클렙시엘라 옥시토카 ( Klebsiella oxytoca ), 클렙시엘라 리노스클레로마티스 ( Klebsiella rhinoscleromatis ), 및 클렙시엘라 오 자에나에(Klebsiella ozaenae ), 레지오넬라 뉴모필라 ( Legionella penumophila ), 모락셀라(Moraxella) 종, 예를 들어, 모락셀라 카타랄리스 ( Moraxella catarrhalis ), 모르가넬라(Morganella) 종, 예를 들어, 모르가넬라 모르가니 ( Morganella morganii), 나이세리아 고노로에아에 ( Neisseria gonorrhoeae ), 나이세리아 메닝기 티디스(Neisseria meningitidis ), 피. 아에루기노사 , 파스퇴렐라 물토시 다(Pasteurella multocida ), 플레시오모나스 시겔로이데스 ( Plesiomonas shigelloides), 프로테우스 미라빌리스( Proteus mirabilis ), 프로테우스 불가리스(Proteus vulgaris ), 프로테우스 페네리 ( Proteus penneri ), 프로테우스 믹소파시 엔스(Proteus myxofaciens ), 프로비덴시아 ( Providencia ) 종, 예를 들어, 프로비덴 시아 스투아르티 ( Providencia stuartii ), 프로비덴시아 레트게리 ( Providencia rettgeri), 프로비덴시아 알칼리파시엔스 ( Providencia alcalifaciens ), 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens ), 살모넬라 티피 (Salmonella typhi ), 살모넬라 티피무리움 (Salmonella typhimurium ), 살모넬라 파라티피 (Salmonella paratyphi), 세라티아( Serratia ) 종, 예를 들어, 세라티아 마르세센스 ( Serratia marcescens), 시겔라 ( Shigella ) 종, 예를 들어, 시겔라 플렉스네리 ( Shigella flexneri), 시겔라 보이디( Shigella boydii ), 시겔라 손네이 ( Shigella sonnei ), 및 시겔라 디센테리아에 ( Shigella dysenteriae ), 스테노트로포모나스 말토필리 아(Stenotrophomonas maltophilia ), 스트렙토바실러스 모닐리포르미스 (Streptobacillus moniliformis ), 비브리오 콜레라에( Vibrio cholerae ), 비브리 오 파라헤몰리티쿠스 ( Vibrio parahaemolyticus ), 비브리오 불니피쿠스 ( Vibrio vulnificus), 비브리오 알기놀리티쿠스 ( Vibrio alginolyticus ), 에르시니아 엔테로 콜리티카(Yersinia enterocolitica ), 에르시니아 페스티스 ( Yersinia pestis ), 에르시니아 슈도투버쿨로시스 ( Yersinia pseudotuberculosis), 클라미디아 뉴모니아에 , 클라미디아 트라코마티스 , 리케치아 프로와제키 ( Ricketsia prowazekii ), 콕시엘라 부르네티, 에를리치아 차페엔시스 ( Ehrlichia chafeensis ) 및/또는 바르토넬라 헨세 나에(Bartonella hensenae ) 중 하나 이상으로부터 선택된다.
[230] 보다 통상적으로, 적어도 하나의 다른 그람-음성균 종은 아시네토박터 바우마니 , 보르데텔라 퍼투시스 , 버크홀데리아 세파시아 , 버크홀데리아 슈 도말레이, 버크홀데리아 말레이, 캄필로박터 제주니, 캄필로박터 콜라이 , 엔테로박터 클로아카에, 엔테로박터 아에로제네스 , 에스케리키아 콜라이 , 프란시셀라 툴라렌시스 , 헤모필루스 인플루엔자에, 헤모필루스 두크레이, 헬리코박터 파일로리 , 클렙시엘라 뉴모니아에 , 레지오넬라 뉴모필라 , 모락셀라 카타랄리스 , 모르가넬라 모르가니 , 나이세리아 고노로에아에 , 나이세리아 메닝기티디스 , 파스퇴렐라 물토시다 , 프로테우스 미라빌리스, 프로테우스 불가리스, 살모넬라 티피 , 세라티아 마르세센스 , 시겔라 플렉스네리 , 시겔라 보이디, 시겔라 손네이 , 시겔라 디센테리아에 , 스테노트로포모나스 말토필리아 , 비브리오 콜레라에, 및/또는 클라미디아 뉴모니아 에 중 하나 이상으로부터 선택된다.
[231] 더욱 더 통상적으로, 적어도 하나의 다른 그람-음성균 종은 살모넬라 티피무리움 , 살모넬라 티피 , 시겔라 종, 에스케리키아 콜라이 , 아시네토박터 바우마니 ( Acinetobacter baumanii ), 클렙시엘라 폐렴, 나이세리아 고노 로에아에 , 나이 세리아 메닝기티데스 ( Neisseria meningitides), 세라티아 종 프로테우스 미라빌리스, 모르가넬라 모르가니 , 프로비덴시아 종, 에드워드지엘라 ( Edwardsiella ) 종, 에 르시니아 종, 헤모필루스 인플루엔자, 바르토넬라 퀸타나 , 브루셀라 종, 보르데텔라 퍼투시스 , 버크홀데리아 종, 모락셀라 종, 프란시셀라 툴라렌시스 , 레지오넬라 뉴모필라, 콕시엘라 부르네티 , 박테로이데스 종, 엔테로박터 종, 및/또는 클라미디아 종 중 하나 이상으로부터 선택된다.
[232] 더욱 더 통상적으로, 하나 이상의 추가 그람-음성균 종은 클렙시엘라 종, 엔테로박터 종, 에스케리키아 콜라이 , 시트로박터 프룬디 , 살모넬라 티 피무리움, 에르시니아 페스티스 , 및/또는 프란시셀라 툴러렌시스(Franciscella tulerensis)이다.
[233] 일부 구현예에서, 그람-음성균에 의한 감염은 국소 박테리아 감염, 예를 들어, 피부 상처와 같은 국소 감염을 초래한다. 다른 구현예에서, 박테리아 감염은 전신 병원성 박테리아 감염이다. 일반적인 그람-음성 병원균 및 관련 감염은 본 개시내용의 표 2에 열거되어 있다. 이들은 본 리신, 이의 활성 단편 및 리신-AMP 폴리펩타이드 작제물로 치료, 완화 또는 예방될 수 있는 박테리아 감염의 예로서 사용되는 것을 의미하며, 제한적인 것으로 의도되지 않는다.
Figure pct00005
[234] 일부 구현예에서, 본 개시내용의 리신-AMP 폴리펩타이드, 리신 폴리펩타이드, 변이체, 이의 활성 단편 또는 유도체는 피. 아에루기노사 및/또는 또 다른 그람-음성균으로 인한 감염에 걸릴 위험이 있는 대상체를 치료하는데 사용된다. 피. 아에루기노사 또는 기타 그람-음성균 감염에 걸릴 위험이 있는 대상체는, 예를 들어, 낭포성 섬유증 환자, 호중구감소증 환자, 괴사성 장염 환자, 화상 피해자, 상처 감염 환자, 보다 일반적으로, 병원 환경에 있는 환자, 특히 수술 환자 및 카테터, 예를 들어 중앙 정맥 카테터, 히크만 장치(Hickman device) 또는 전기생리 학적 심장 장치, 예를 들어 심박 조율기 및 이식형 제세동기와 같은 이식형 의료 장치를 사용하여 치료중인 환자를 포함한다. 피. 아에루기노사를 포함하여 그람-음성균에 감염될 위험이 있는 다른 환자 그룹에는 전체 관절 교체(예를 들어 전체 무릎 또는 고관절 교체)와 같은 이식된 인공삽입물을 갖는 환자가 제한 없이 포함된다.
[235] 또 다른 측면에서, 본 개시내용은 박테리아 감염으로 진단받거나 박테리아 감염 위험이 있거나 박테리아 감염 증상을 나타내는 대상체에게 유효량의 본원에 기재된 리신-AMP 폴리펩타이드, 리신 폴리펩타이드, 변이체, 이의 활성 단편 또는 유도체를 함유하는 제1 유효량의 조성물, 및 제2 유효량의 그람-음성균 감염 치료에 적합한 항생제를 공투여하는 것을 포함하는 박테리아 감염을 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이다.
[236] 본 개시내용의 리신-AMP 폴리펩타이드, 리신 폴리펩타이드, 변이체, 이의 활성 단편 또는 유도체는 표준 치료 항생제 또는 최후 수단의 항생제와 개별적으로 또는 당해 분야의 기술 내에서 다양한 조합으로 공투여될 수 있다. 피. 아에루기노사에 대해 사용된 전통적인 항생제는 표 3에 기재되어 있다. 다른 그람-음성균, 예를 들어 클렙시엘라 종, 엔테로박터 종, 에스케리키아 콜라이, 시트로박터 프룬디, 살모넬라 티피무리움, 에르시니아 페스티스, 및 프란시셀라 툴러렌시스에 대한 항생제는 피. 아에루기노사에 대해 표 3에 제공된 것과 유사하다.
Figure pct00006
[237] 보다 구체적인 구현예에서, 항생제는 세프타지딤, 세페핌, 세포페라존, 세프토비프롤, 시프로플록사신, 레보플록사신, 아미노글리코시드, 이미페넴, 메로페넴, 도리페넴, 겐타마이신, 토브라마이신, 아미카신, 피페라실린, 티카르실린, 페니실린, 리팜피신, 폴리믹신 B 및 콜리스틴 중 하나 이상으로부터 선택된다. 특정 구현예에서, 항생제는 메로페넴이다.
[238] 본 개시내용의 리신-AMP 폴리펩타이드, 리신 폴리펩타이드, 변이체, 이의 활성 단편 또는 유도체를 항생제와 조합하면 효과적인 항균 요법이 제공된다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 리신-AMP 폴리펩타이드, 리신 폴리펩타이드, 변이체, 이의 활성 단편 또는 유도체와 하나 이상의 항생제의 공투여는 감소된 용량 및 양의 리신-AMP 폴리펩타이드, 리신 폴리펩타이드, 변이체, 이의 활성 단편 또는 유도체 또는 항생제 또는 둘 모두에서 및/또는 감소된 빈도 및/또는 치료 기간에 증가된 살균 및 정균 활성, 감소된 항생제 내성 위험 및 감소된 유해한 신경계 또는 신장 부작용 위험(예를 들어 콜리스틴 또는 폴리믹신 B 사용과 관련된 것들)으로 수행될 수 있다. 이전 연구에서는, 총 누적 콜리스틴 용량이 신장 손상과 관련이 있으며, 이는 리신-AMP 폴리펩타이드, 리신 폴리펩타이드, 변이체, 이의 활성 단편 또는 유도체와의 병용 요법을 사용한 용량 감소 또는 치료 기간 단축이 신독성 발생률을 감소시킬 수 있음을 보여준다(참조: Spapen et al. Ann Intensive Care. 1: 14 (2011), 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함됨). 본원에 사용된 용어 "감소된 용량"은 동일한 활성 성분을 사용한 단일요법과 비교하여 조합된 하나의 활성 성분의 용량을 지칭한다. 일부 구현예에서, 조합된 리신, 이의 활성 단편 및 리신-AMP 폴리펩타이드 작제물 또는 항생제의 용량은 각각의 단일요법에 비해 최적 용량 이하이거나 심지어 역치 이하일 수 있다.
[239] 일부 구현예에서, 본 개시내용은 본원에 개시된 하나 이상의 리신-AMP 폴리펩타이드, 리신 폴리펩타이드, 변이체, 이의 활성 단편 또는 유도체를 관심 항생제와 함께 대상체에게 투여함으로써 단독으로 사용된 상기 항생제의 활성과 비교하여 그람-음성균에 대한 하나 이상의 항생제의 항생제 활성을 증가시키는 방법을 제공한다. 이 조합은 박테리아에 대해 효과적이며 항생제에 대한 내성을 극복하고/하거나 항생제가 더 낮은 용량으로 사용되도록 하여 폴리믹신 B의 신독성 및 신경독성 효과와 같은 바람직하지 않은 부작용을 감소시킨다.
[240] 본 개시내용의 항생제와 임의로 조합된 리신-AMP 폴리펩타이드, 리신 폴리펩타이드, 변이체, 이의 활성 단편 또는 유도체는 금속 킬레이터, 예를 들어 EDTA, TRIS, 락트산, 락토페린, 폴리믹신, 시트르산을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 추가의 그람-음성균 외막 침투제와 더 조합될 수 있다(참조: Vaara M. Microbial Rev. 56(3):395-441 (1992), 이는 그 내용이 본원에 참조로 포함됨).
[241] 또 다른 양태에서, 본 개시내용은 성장을 억제하거나 개체군을 감소시키거나 적어도 하나의 그람-음성균 종을 사멸시키는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 박테리아를 유효량의 본원에 기재된 리신-AMP 폴리펩타이드, 리신 폴리펩타이드, 변이체, 이의 활성 단편 또는 유도체를 함유하는 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하고, 여기서 리신-AMP 폴리펩타이드, 리신 폴리펩타이드, 변이체, 이의 활성 단편 또는 유도체는 성장을 억제하거나 개체군을 감소시키거나 피. 아에루기노사 및 임의로 적어도 하나의 다른 그람-음성균 종을 사멸시킨다.
[242] 일부 구현예에서, 성장 억제 또는 개체군 감소 또는 적어도 하나의 그람-음성균 종의 사멸은 박테리아를 본원에 기재된 리신, 이의 활성 단편 및/또는 리신-AMP 폴리펩타이드 작제물과 접촉시키는 것을 포함하고, 여기서 박테리아는 예를 들어, 병원의 의료 장치, 바닥, 계단, 벽 및 카운터톱(countertop) 및 기타 건강 관련 또는 공공 사용 건물의 표면과 수술실, 응급실, 병실, 클리닉 및 욕실 등의 장비 표면에 존재한다.
[243] 본원에 기재된 리신-AMP 폴리펩타이드, 리신 폴리펩타이드, 변이체, 이의 활성 단편 또는 유도체를 사용하여 보호될 수 있는 의료 장치의 예로는 튜빙 및 다른 표면 의료 장치, 예를 들어 요로 카테터, 점액 추출 카테터, 흡입 카테터, 제대 캐뉼라(umbilical cannulae), 콘택트렌즈, 자궁속 장치, 질내 및 장내 장치, 기관내관, 기관지경, 치과 보철물 및 치과교정 장치, 외과 기구, 치과 기구, 튜빙, 치과 워터 라인(dental water line), 패브릭, 페이퍼, 지시 스트립(예를 들어, 종이 지시 스트립 또는 플라스틱 지시 스트립), 접착제(예를 들어, 히드로겔 접착제, 핫-멜트 접착제, 또는 용매-기반 접착제), 붕대, 조직 드레싱 또는 치료 장치(healing device) 및 밀봉 패치(occlusive patch), 및 의료 분야에 사용된 임의의 기타 표면 장치가 포함되지만 이에 제한되지 않는다. 상기 장치는 전극, 외부 보철물, 고정 테이프, 압박 붕대 및 다양한 유형의 모니터를 포함할 수 있다. 의료 장치는 삽입 또는 이식 부위 근처의 피부와 같이 삽입 또는 이식 부위에 배치될 수 있고, 그람-음성균에 의한 집락화에 민감한 적어도 하나의 표면을 포함할 수 있는 임의의 장치를 또한 포함할 수 있다.
[244] 본원에 기재된 바와 같이 생체내 또는 시험관내에서 사용될 수 있는 본 개시내용의 리신-AMP 폴리펩타이드, 리신 폴리펩타이드, 변이체, 이의 활성 단편 또는 유도체는 또한 생물막 형성과 관련된 피. 아에루기노사와 같은 그람-음성균으로 인한 박테리아 감염을 치료하는데 사용될 수 있다.
[245] 예를 들어, 일부 구현예에서, 본 리신-AMP 폴리펩타이드, 리신 폴리펩타이드, 변이체, 이의 활성 단편 또는 유도체는 피. 아에루기노사와 같은 그람-음성균에 의해 형성된 박테리아 생물막의 예방, 제어, 붕괴 및/또는 박멸에 사용될 수 있다. 생물막 형성은 미생물 세포가 서로 붙어서 표면의 세포외 고분자 물질(EPS) 매트릭스에 포매될 때 발생한다. 생체거대분자(예를 들어 다당류, 핵산 및 단백질)와 영양소가 풍부한 보호된 환경에서 미생물의 성장은 미생물 크로스-토크(cross-talk)를 향상시키고 독성을 증가시킨다. 생물막은 CF 폐의 점액 플러그, 오염된 카테터, 콘택트렌즈 등과 같은 생물 및 무생물 표면을 포함한 임의의 지지 환경에서 발생할 수 있다(참조: Sharma et al. Biologicals , 42(1):1-7 (2014), 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함됨). 따라서, 일 구현예에서, 본 개시내용의 리신-AMP 폴리펩타이드, 리신 폴리펩타이드, 변이체, 이의 활성 단편 또는 유도체는, 박테리아가 박테리아 생물막에 의해 보호될 때, 피. 아에루기노사와 같은 그람-음성균으로 인한 박테리아 감염의 예방, 제어, 붕괴, 박멸 및 치료에 사용될 수 있다.
[246] 보다 상세하게는, 일부 측면에서, 본 개시내용은 생물 또는 무생물 표면을 포함하는 표면을 그람 음성균을 사멸시키는데 효과적인 본 개시내용의 리신-AMP 폴리펩타이드, 리신 폴리펩타이드, 변이체, 이의 활성 단편 또는 유도체를 포함하는 조성물과 접촉시키는 것을 포함하는 그람-음성균 생물막의 예방, 붕괴 또는 박멸 방법에 관한 것이며, 여기서 생물막은 효과적으로 예방, 붕괴 또는 박멸된다.
[247] 일부 측면에서, 본 개시내용은 이를 필요로 하는 대상체에게 조성물을 투여하는 것을 포함하는 그람-음성균 생물막의 예방, 붕괴 또는 박멸 방법에 관한 것이며, 여기서 상기 조성물은 표면상의 그람 음성균을 사멸시키는데 효과적인 본 개시내용의 리신-AMP 폴리펩타이드, 리신 폴리펩타이드, 변이체, 이의 활성 단편 또는 유도체를 포함하고, 여기서 생물막은 효과적으로 예방, 붕괴 또는 박멸된다.
[248] 일부 구현예에서, 표면은 생물 표면, 예를 들어 단단한 생체 표면, 예를 들어, 피부이다. 다른 구현예에서, 표면은 무생물 표면이다. 일부 구현예에서, 표면은 콘택트렌즈와 같은 의료 장치; 약물 펌프, 치과 임플란트, 심장 임플란트 예를 들어 심박 조율기, 인공 심장 판막, 심실 보조 장치, 합성 혈관 이식편 및 스텐트를 포함하는 임플란트; 복막 투석 카테터, 혈액투석 및 화학치료제의 만성 투여를 위한 유치 카테터(히크먼 카테터(Hickman catheter)), 요로 카테터 및 요로 보철물, 인공 관절을 포함하는 보철 장치를 포함하는 카테터; 정형외과용 재료; 및 기관 및 벤틸레이터 튜빙의 표면이다.
[249] 일부 구현예에서, 대상체는 생물막과 관련된 그람-음성균 감염으로 고통받고 있다. 이러한 박테리아 감염은 편도염, 골수염, 박테리아 심내막염, 부비동염, 각막의 감염, 요로 감염, 담도의 감염, 감염성 신장 결석, 요도염, 전립선염, 중이 감염, 치태 형성, 치은염, 치주염, 낭포성 섬유증, 상처 감염, 특히 당뇨병과 관련된 상처, 및 카테터 감염 및 관절 보철물 및 심장 판막의 감염을 포함하는 본원에 기재된 의료 장치의 감염을 포함한다.
[250] 일부 구현예에서, 생물막 감염을 치료하기 위한 조성물은 본원에 기재된 하나 이상의 항생제를 포함한다. 다른 구현예에서, 본원에 기재된 본 리신 또는 이의 활성 단편 또는 이의 변이체 또는 유도체는 본원에 기재된 하나 이상의 항생제와 동시에 대상체에게 투여되고/되거나 표면에 접촉된다. 다른 구현예에서, 본 개시내용의 리신-AMP 폴리펩타이드, 리신 폴리펩타이드, 변이체, 이의 활성 단편 또는 유도체 및 본원에 기재된 하나 이상의 항생제는 임의의 순서로 순차적으로 대상체에게 투여되고/되거나 표면에 접촉된다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 본 리신-AMP 폴리펩타이드, 리신 폴리펩타이드, 변이체, 이의 활성 단편 또는 유도체 및 본원에 기재된 하나 이상의 항생제는 단일 용량 또는 다중 용량, 단독 또는 조합으로 대상체에게 투여되고/되거나 표면에 접촉될 수 있다.
[251] 일부 구현예에서, 본 조성물은 생물막 형성을 예방하는데 사용된다. 이러한 구현예에서, 접촉된 표면은 생물막을 함유하거나, 생물막을 함유하지 않거나, 최소량만의 확립된 생물막을 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 표면상의 신규 생물막 형성은 본원에 기재된 임의의 메커니즘에 따라서 예방된다.
[252] 일부 구현예에서, 접촉된 표면은 생물막을 포함하고, 생물막은 붕괴 또는 박멸된다. 일부 구현예에서, 박멸은 존속 박테리아를 포함하여 생물막 내 박테리아를 사멸시키는 것을 포함한다. 다른 구현예에서, 본 개시내용의 본 리신-AMP 폴리펩타이드, 리신 폴리펩타이드, 변이체, 이의 활성 단편 또는 유도체는 생물막 내의 박테리아를 사멸시켜 생물막을 박멸할 뿐만 아니라 생물막 매트릭스를 붕괴 또는 파괴한다. 이러한 능력은 살아있는 박테리아가 없는 경우에도 매트릭스가 종종 빠르게 재감염되기 때문에 유리하다.
실시예
실시예 1. 인간 혈청이 보충된 배지에서 리신 및 리신-AMP 폴리펩타이드 작 제물의 활성.
재료 및 방법
[253] 그람-음성균, 예를 들어, 피. 아에루기노사를 배양하고, 카사미노산(CAA) 배지(5g/L 카사미노산, 아메레스코(Ameresco)/VWR; 5.2mM K2HPO4, 시그마-알드리치; 1mM MgSO4, 시그마-알드리치), 150mM NaCl이 보충된 CAA, 2.5% 인간 혈청(AB형, 남성, 풀링됨; 시그마-알드리치)이 보충된 CAA, 12.5% 인간 혈청이 보충된 CAA, 및 6.25% 서반타®가 보충된 CAA에서 시험하였다. 12.% 인간 혈청 및 6.25% 서반타®가 보충된 CAA 모두에 대해 다양한 피. 아에루기노사 분리주를 평가하였다. 6.25% 서반타®는 1.5mg/mL 인지질에 상응한다.
최소 억제 농도( MIC )의 결정
[254] MIC 값은 문헌(참조: Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI), CLSI. 2015. Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria That Grow Aerobically; Approved Standard-10th Edition. Clinical and Laboratory Standards Institute, Wayne, PA)에 정의된 표준 액체배지 미량희석 기준 방법의 변형본을 사용하여 결정되었다. 변형은 뮐러 힌턴 액체배지를 CAA 배지(NaCl의 존재 및 부재하에), 2.5% 인간 혈청이 보충된 CAA(표 4), 12.5% 인간 혈청이 보충된 CAA(표 A), 또는 6.25% 서반타®가 보충된 CAA(표 B)로 교체한 것을 토대로 하였다. MIC는 대조군에 비해 적어도 80%의 박테리아 성장을 억제하는데 충분한 펩타이드의 최소 농도이다.
결과
[255] 이러한 실험 결과는 하기 표 4, A 및 B에 요약되어 있다. 표 4는 또한 본 폴리펩타이드의 분자량 및 등전점을 제공한다. 다양한 폴리펩타이드의 서열 및 성분을 비교함으로써 등전점(높은 pI는 외막 침투에 유리함) 및 활성(MIC에 의해 평가됨)에 대한 특정 구조적 변형의 효과를 결정할 수 있다.
[256] 예를 들어, GN316(서열번호 22)에 대한 단일 점 돌연변이의 효과를 볼 수 있다. GN394(서열번호 48)는 CAA에서 pI가 낮고 활성이 높지만 인간 혈청이 있는 CAA에서는 활성이 낮다. 인간 혈청에서의 활성 감소는 GN396(서열번호 50)의 경우 더 적은 반면 GN408(서열번호 52)은 인간 혈청의 존재 및 부재 둘 다에서 실질적으로 보다 강력하다. 반면에 GN418(서열번호 54)은 보충되지 않은 CAA 배지에서 활성을 잃지만 인간 혈청의 존재하에 효능을 얻는다.
[257] GN217(서열번호 8)에서의 단일 점 돌연변이는 인간 혈청의 부재 및 존재 둘 다에서 GN37에 비해 이의 효능이 개선된다. GN218(서열번호 10), GN223(서열번호 12), GN239(서열번호 14) 및 GN243(서열번호 16)을 생성하는 GN37(서열번호 84)에 대한 변형은 인간 혈청의 존재하에 매우 강한 활성을 나타낸다. 다른 폴리펩타이드의 서열 및 성분 비교에 기초하여 유사한 관찰 결과가 얻어질 수 있다.
실시예 2. 항생제와 리신 또는 리신-AMP 폴리펩타이드 작제물 간의 상승작용
[258] GN76(서열번호 203), GN121(서열번호 175), GN123(서열번호 173), GN351(서열번호 32), GN370(서열번호 44) 및 GN428(서열번호 60)과 12가지 상이한 항생제 간의 상승작용을, 카바페넴-내성 임상 균주 WC-452를 사용하여 본원에 기재된 인간 혈청이 보충된 CAA 배지를 사용한 체커보드 검정으로 검사하였다. 모든 조합에 대해 분획 억제제 농도 지수(FICI) 값을 결정하였고; 0.5 미만의 값은 상승작용을 나타낸다.
[259] 하기 표 5에 지시된 바와 같이, 전술한 리신 및 리신-AMP 작제물은 다양한 항생제에 걸쳐 상승작용을 나타낸다. 이미페넴의 경우, 상승작용은 카바페넴 항생제에 대한 재감작과 일치한다.
실시예 3. 리신과 함께 항생제를 사용한 카바페넴 -내성 임상 균주의 재감 작.
[260] 카바페넴-내성 피. 아에루기노사 균주를 카바페넴에 재감작시키는 GN121(서열번호 175) 또는 GN123(서열번호 173)의 능력은 각각의 전술한 리신을 2가지 카바페넴, 즉, 이미페넴(IPM) 또는 메로페넴(MEM)과 조합하여 평가하였다. 7개 이하의 파바페넴-내성 분리주를 평가하였다. 재감작은 카바페넴 MIC 값이 설정된 중단점 아래로 떨어지는, 예를 들어, 카바페넴-민감성 분리주의 경우 MIC 값이 2 이하, 중간 민감성 카바페넴 분리주의 경우 MIC 값이 4, 카바페넴-내성 분리주의 경우 MIC 값이 8 이상인 상승적 조합에서 발생한다. 문헌(참조: Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI), CLSI. 2019. M100 Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; 29th Edition. Clinical and Laboratory Standards Institute, Wayne, PA)을 참조한다.
[261] 표 6 내지 9에 지시된 바와 같이, GN123(서열번호 173) 또는 GN121(서열번호 175)과의 상승적 조합은 IPM 및 MEM MIC가 검사된 7개의 카바페넴 각각에 대한 중단점 값 아래로 감소함을 보여주었다. 이러한 관찰은 재감작과 일치한다.
실시예 4. 추가의 리신 또는 리신-AMP 작제물과 함께 항생제를 사용한 카 바페넴-내성 임상 균주의 재감작 .
[262] 카바페넴-내성 임상 균주를 카바페넴에 재감작시키는 GN351(서열번호 32), GN370(서열번호 44) 또는 GN428(서열번호 60)의 능력은 전술한 리신 또는 리신-AMP 폴리펩타이드 작제물 각각을 IPM 또는 MEM과 조합하여 평가하였다. 카바페넴-내성 분리주인 WC-452를 평가하였다. 상기 실시예 3에 언급된 바와 같이, 재감작은 카바페넴 MIC 값이 이전에 기재된 중단점 아래로 떨어지는 상승적 조합에서 발생한다.
[263] 표 10에 지시된 바와 같이 GN351(서열번호 32), GN370(서열번호 44) 또는 GN428(서열번호 60)과의 상승적 조합은 IPM 및 MEM MIC가 WC-452에 대한 중단점 값 아래로 감소함을 보여주었다. 이러한 관찰은 재감작과 일치한다.
[264] 실시예 3 및 4의 발견은 본원에 기재된 리신 및 리신-AMP 폴리펩타이드 작제물이 피. 아에루기노사를 카바페넴 항생제에 재감작시켜 MIC를 시험관 내에서 중단점 값 아래로 유도할 수 있음을 시사한다. 항생제-내성 균주를 통상적인 항생제에 재감작시키는 리신 및 리신-AMP 폴리펩타이드 작제물의 이러한 새로운 능력은 항미생물제 내성을 퇴치하고 역전시키는 치료제로서 이러한 생물제제의 이점을 시사한다.
[265] 표 A - 인간 혈청에서 리신 또는 리신-AMP 폴리펩타이드 작제물의 활성
Figure pct00007
[266] 표 B - 폐 계면활성제(서반타®)에서의 활성
Figure pct00008
[267] 표 4. 인간 혈청에서 리신 또는 리신-AMP 폴리펩타이드 작제물의 감도
Figure pct00009
[268] 표 5. 항생제와 리신 또는 리신-AMP 폴리펩타이드 작제물 간의 상승작용
Figure pct00010
[269] 표 6. 이미페넴 및 GN123(서열번호 173)의 조합을 사용한 그람-음성균 재감작
Figure pct00011
[270] 표 7. 메로페넴 및 GN123(서열번호 173)의 조합을 사용한 그람-음성균 재감작
Figure pct00012
[271] 표 8. 이미페넴 및 GN121(서열번호 175)의 조합을 사용한 그람-음성균 재감작
Figure pct00013
[272] 표 9. 메로페넴 및 GN121(서열번호 175)의 조합을 사용한 그람-음성균 재감작
Figure pct00014
[273] 표 10. MEM 또는 IPM 및 GN351(서열번호 32), GN370(서열번호 44), 또는 GN428(서열번호 60)의 조합을 사용한 그람-음성균 재감작
Figure pct00015
실시예 5. 인간 혈청 및 폐 계면활성제에서 슈도모나스 아에루기노사 에 대한 그람-음성 리신 살균 활성
[274] 인간 혈청 또는 폐 계면활성제를 포함하는 표준 시험관내 감수성 시험 포맷을 사용하여 본원에 기재된 4가지 항-슈도모나스(anti-pseudomonal) 리신, GN121, GN351, GN370 및 GN428의 용균 활성에 대한 추가 특성화를 평가하였다. 그람-음성 리신 작용의 메커니즘은 실시예 6 및 7에서 논의된 바와 같이 형광 및 투과 전자 현미경(TEM)에 의해 추가로 평가되었다.
[275] 재료 및 방법: MIC는 인간 혈청 및 폐 계면활성제(서반타®; 미오덤 클리니칼 서플라이즈(Myoderm Clinical Supplies))가 보충된 배지에서 액체배지 미량희석에 의해 결정되었다. 항생제와의 상승작용을 체커보드 검정으로 검사하고, 최소 생물막 박멸 농도(MBEC)를 표준 방법을 사용하여 결정하였다. MBEC는 12.5% 인간 혈청이 보충된 CAA를 사용하여 측정되었다. LIVE/DEAD 염색(써모피셔) 후 형광 현미경검사를 수행하고 TEM을 수행하였다.
[276] 결과: 인간 혈청 및 폐 계면활성제(서반타®)에서 그람-음성 리신의 활성이 관찰되었다. 리신 MIC 값은 표준 AST 포맷 배지(0.25 mM MgSO4가 포함된 25% 카사미노산 배지) 단독 및 12.5% 인간 혈청과 0.78% 서반타®의 존재하에 결정되었다. 0.78%의 서반타® 농도는 생리적 수준의 폐 계면활성제를 나타낸다. 슈도모나스 아에루기노사 균주 CFS-1292(메로페넴 내성)를 리포터 균주로 사용하였다. 하기 표 11에 나타낸 바와 같이, 그람-음성 리신 GN121, GN351, GN428, 및 GN370은 인간 혈청 및 폐 계면활성제에서 활성이 있는 것으로 결론내려졌다. 마찬가지로, 하기 표 C에 나타낸 바와 같이, 리신 및 AMP-리신 폴리펩타이드 작제물은 12.5% 인간 혈청을 사용하여 강력한 항생물막 효과를 나타냈으며, MBEC 값은 MIC에서 관찰된 것과 유사한 1μg/mL 이하였다.
[277] 표 11 - 배지 단독(25% CAA) 및 인간 혈청 또는 폐 계면활성제가 보충된 배지에서 리신의 MIC 값
Figure pct00016
[278] 표 C - 리신 및 리신-AMP 폴리펩타이드 작제물의 MBEC 값
Figure pct00017
[279] 폐 계면활성제(서반타®)의 존재하에 그람-음성 리신의 활성을 MIC 검정 포맷에서 다양한 농도의 서반타®에 걸쳐 측정하였다. AST-포맷(25% SAA)에 보충된 다양한 농도의 서반타®(25%, 12.5%, 6.25%, 3.12%, 1.56%, 0.78%, 및 0.39%)의 존재하에 MIC의 배수 변화는 표 12에 나와 있다. 배수 변화는 25% CAA 단독으로 결정된 것과 MIC 값의 비교를 기반으로 한다. 폐 계면활성제의 생리적 농도는 0.78% 내지 0.39%의 범위이다. 슈도모나스 아에루기노사 균주 CFS-1292(메로페넴 내성)을 리포터 균주로 사용하였다. 시험된 그람-음성 리신은 생리적 수준의 폐 계면활성제(서반타®)의 존재하에 활성이 있는 것으로 결론내려졌다.
[280] 표 12 - 서반타®의 존재하의 배수 증가(MIC)
Figure pct00018
[281] 2가 양이온의 존재하에 그람-음성 리신의 활성을 평가하고, 생리적 농도에서 2가 양이온의 영향을 MIC 검정 포맷으로 검사하였다. MIC의 배수 변화는 AST 배지(25% CAA)에 보충된 다양한 양이온 농도(1.25mM CaCl2, 0.78mM MgCl2, 및 1.25mM CaCl2와 0.78mM MgCl2의 조합)의 존재하에 측정되었다. 결과는 하기 표 13에 나와 있다. 25% CAA는 통상적으로 0.25 nM MgSO4를 가지고 있음에 유의한다. 슈도모나스 아에루기노사 균주 CFS-1292(메로페넴 내성)를 리포터 균주로 사용하였다. 시험된 그람-음성 리신은 생리적 수준의 칼슘 및 마그네슘의 존재하에 활성이 있는 것으로 결론내려졌다.
[282] 표 13 - 양이온의 존재하의 배수 증가(MIC)
Figure pct00019
실시예 6. 그람-음성 리신이 박테리아 외막을 불안정화시키는 능력
[283] 피. 아에루기노사의 외막을 불안정화시키는 그람-음성 리신의 능력을 N-페닐-1-나프틸아민(NPN) 흡수 검정을 사용하여 평가하였다. 문헌(참조: Dassanayake, R.P. et al., Antimicrobial activity of bovine NK-lysin-derived peptides on Mycoplasma bovis, PLOS One 2018; 9(1):e86364)을 참조한다. 지수증식(exponential) 피. 아에루기노사(CFS 1292)를 수거하고, 세척하고, pH 7.4에서 5mM 4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄설폰산(HEPES) 완충액 및 5mM 글루코스에 재현탁하였다. NPN을 10mM의 최종 농도로 첨가하였다. GN121, GN351, GN428 및 GN370을 포함하는 그람-음성 리신을 100μg/웰의 최종 농도로 첨가하였다. 2시간에 걸쳐 형광 변화를 기록하였다(여기 l = 350nm; 방출 l = 420nm). 막에 통합된 NPN은 형광을 증가시켰다. 도 2a 및 2b에 도시된 바와 같이, 그람-음성 리신은 박테리아 세포벽의 외막의 붕괴를 매개하였다. 각각의 그람-음성 리신에 대한 데이터는 하기 표 14에 나와 있다.
[284] 표 14 - NPN 및 그람-음성 리신에 노출된 피. 아에루기노사의 시간 경과에 따른 형광
Figure pct00020
실시예 7. 현미경검사는 혈청에서 그람-음성 리신 살균성을 보여줌
[285] 슈도모나스 아에루기노사 균주 1292를 100% 인간 혈청에서 GN121(10μg/mL) 또는 완충액 대조군으로 15분간 처리하였다. 생/죽은 세포 생존력 키트(써모피셔)를 사용하여 샘플을 염색하고 미분 간섭 대비(DIC) 및 형광 현미경검사 둘 다로 검사하였다. 현미경 분석(x2000 배율)을 보여주는 일련의 현미경 사진을 보여주는 도 3에 묘사된 바와 같이, 처리되지 않은 행에는 죽은 박테리아가 없었고, 처리된 행에는 살아있는 박테리아가 감소하였다.
실시예 8. 인간 혈청에서 그람-음성 리신과 메로페넴의 상승작용
[286] 표준 체커보드 검정을 수행하여 인간 혈청의 존재하에 그람-음성 리신과 메로페넴의 상승작용을 평가하였다. 피. 아에루기노사 균주 CFS 1292, 1557(PA19), 1558(PA20) CFS 1559(PA21), CFS 1560(PA22), CFS 1561(PA23), CFS 1562(PA24), 및 CFS 1766(ATCC 27853)을 25% CAA 및 12.5% 인간 혈청의 용액에 현탁시키고, 분획 억제제 농도 지수(FICI) 값을 측정하여 상승작용을 평가하였다. 0.5 이하의 FICI 값은 강력한 상승작용과 일치하였다. 하기 표 15에 나타낸 바와 같이, GN121, GN351, GN370 및 GN428은 모두 평가된 3가지 피. 아에루기노사 균주 각각에 대해 메로페넴과의 상승작용을 나타냈다.
[287] 표 15 - 인간 혈청에서 메로페넴과 그람-음성 리신 간의 상승작용
Figure pct00021
Figure pct00022
[288] 실시예 9. GN 리신에 대한 낮은 내성 경향
[289] 또 다른 실험에서, 그람-음성균은 21일 연속 계대 내성 검정에서 GN121, GN351, GN370 및 GN428에 대한 내성이 발달하지 않는 것으로 확인되었다. 박테리아 내성 분석은 GN-리신 희석 시리즈(중복)의 존재하에 21일의 연속 계대에 걸쳐 피. 아에루기노사(균주 WC-452)를 사용하여 수행되었다. 간단히 말하면, 2배 희석 범위의 GN 리신을 37℃에서 18시간 동안 CAA 액체배지에서 박테리아 5x10e6 CFU/ml 개시 농도로 배양한 액체배지 미량희석 MIC 포맷을 사용하였다. 이어서 박테리아 성장이 관찰된 GN 리신 농도가 가장 높은 웰을 다음날 계대를 위한 접종물로 사용하고, 그 과정을 21일의 기간에 걸쳐 반복하였다. 매일 시점의 MIC를 기록하고, 내성을 MIC의 단계적 증가로 측정하였다.
[290] 상기 검정에서, GN121, GN351, GN370 및 GN428 리신 MIC는 18일 동안 최대 1-log2 희석(2배)까지 증가했으며, 이는 계대 통제(처리 부재)와 비슷했다. 도 4a 내지 4d. 그에 반해, 시프로플록사신 대조군은 18일 동안 4-log2 희석(16배) 증가하였다(도 4e). 디리마(D'Lima) 등은 또한 연속 계대 동안 시프로플록사신 MIC의 증가를 발견하였다. 21일 연속 계대에 걸쳐 최대 32배의 시프로플록사신 MIC 증가를 보고한 문헌(참조: D'Lima et al., 2012, Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 56: 2753-2755)을 참조한다. 본 발명자들의 결과는 GN 리신 내성에 대한 낮은 경향과 일치하며, 이는 그람-양성 리신에서 관찰된 것과 유사하다. 예를 들어, 2019년 2월 26일자로 출원되고 그 전문이 본원에 참조로 포함된 PCT/US19/19638을 참조한다.
<110> CONTRAFECT CORPORATION <120> NUCLEIC ACIDS ENCODING LYSINS, LYSIN-ANTIMICROBIAL PEPTIDE (AMP) CONSTRUCTS, POLYPEPTIDES THEREOF AND USES THEREOF <130> 0341.0021-00-304 <150> PCT/US19/024916 <151> 2019-03-29 <150> 62/722,793 <151> 2018-08-24 <150> 62/721,969 <151> 2018-08-23 <150> 62/650,235 <151> 2018-03-29 <150> 62860836 <151> 2019-06-13 <150> 62849320 <151> 2019-05-17 <160> 204 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 636 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <222> (28)..(162) <223> GN168 lysin <220> <221> CDS <222> (28)..(612) <400> 1 gtttaacttt aagaaggaga attcacc atg agg tta aaa atg gca cga aga aga 54 Met Arg Leu Lys Met Ala Arg Arg Arg 1 5 tac aga ctt ccg cga cgt aga agt cga aga ctt ttt tca aga act gca 102 Tyr Arg Leu Pro Arg Arg Arg Ser Arg Arg Leu Phe Ser Arg Thr Ala 10 15 20 25 ttg agg atg cat cca aga aat agg ctt cga aga att atg cgt ggc ggc 150 Leu Arg Met His Pro Arg Asn Arg Leu Arg 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Gln Ala Glu Arg Met Leu Ser Asn Asp Ile Gln Arg Phe 100 105 110 Glu Pro Glu Leu Asp Arg Leu Ala Lys Val Pro Leu Asn Gln Asn Gln 115 120 125 Trp Asp Ala Leu Met Ser Phe Val Tyr Asn Leu Gly Ala Ala Asn Leu 130 135 140 Ala Ser Ser Thr Leu Leu Asp Leu Leu Asn Lys Gly Asp Tyr Gln Gly 145 150 155 160 Ala Ala Asp Gln Phe Pro His Trp Val Asn Ala Gly Gly Lys Arg Leu 165 170 175 Asp Gly Leu Val Lys Arg Arg Ala Ala Glu Arg Ala Leu Phe Leu Glu 180 185 190 Pro Leu Ser 195 <210> 3 <211> 567 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <221> CDS <222> (28)..(543) <220> <221> misc_feature <222> (29)..(543) <223> GN 176 lysin <400> 3 gtttaacttt aagaaggaga attcacc atg agc ttt aac gtg acc ccg aaa ttt 54 Met Ser Phe Asn Val Thr Pro Lys Phe 1 5 aaa cgc tgg cag ctg tat ttt cgc ggc cgc atg tgg acc gcg ggc ggc 102 Lys Arg Trp Gln Leu Tyr Phe Arg Gly Arg Met Trp Thr Ala Gly Gly 10 15 20 25 acc gcg ggc ggc cgt aca tcc caa cga ggc atc gac ctc 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Lys Arg Leu Lys Lys Ile Gly Lys Val Leu Lys Trp Ile 145 150 155 <210> 19 <211> 543 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <223> GN281 lysin <220> <221> CDS <222> (28)..(519) <400> 19 gtttaacttt aagaaggaga attcacc atg aaa ctc agc gaa aaa cga gca ctg 54 Met Lys Leu Ser Glu Lys Arg Ala Leu 1 5 ttc acc cag ctg ctt gcc cag tta att ctt tgg gca gga act cag gat 102 Phe Thr Gln Leu Leu Ala Gln Leu Ile Leu Trp Ala Gly Thr Gln Asp 10 15 20 25 cga gtg tca gta gcc ttg gat caa gtg aaa agg aca cag gct gaa gct 150 Arg Val Ser Val Ala Leu Asp Gln Val Lys Arg Thr Gln Ala Glu Ala 30 35 40 gat gcc aat gct aag tct gga gca ggc att agg aac tct ctc cat cta 198 Asp Ala Asn Ala Lys Ser Gly Ala Gly Ile Arg Asn Ser Leu His Leu 45 50 55 ctg gga tta gcc ggt gat ctt atc ctc tac aag gat ggt aaa tac atg 246 Leu Gly Leu Ala Gly Asp Leu Ile Leu Tyr Lys Asp Gly Lys Tyr Met 60 65 70 gat aag agc gag gat tat aag ttc ctg gga gat 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tatttggtaa agcgactgac aacgccgtca gggcagttca ggcaggtgcc 180 ggactggtcg ttgatggtat tgctggcccc aagaccatgt atgcgattcg caacgcaggg 240 gagtctcatc aggatcatct gactgaggct gacttgattg acgctgctcg tgaattgtct 300 gttgaccttg ctagcatcaa ggcagtcaac caagtagaat cgcgcggtac tggcttcacc 360 aagtctggta agatcaagac attgtttgaa cgccacatca tgtacaaaaa gctgaatgcc 420 aagttcggtc aggcaaaagc caatgctctg gcccagcttt acccgacgtt ggttaacgcc 480 aaagccgggg gatacacagg tggggacgcg gagttggaac gactccatgg tgcaatagcg 540 atcgataaag attgcgccta cgagagcgct tcctacgggt tattccagat catggggttc 600 aactgcgtta tttgtggata tgacaatgcc gaggagatgt tcaacgactt tctcactggt 660 gaacgtgctc agctcatggc atttgtcaag ttcatcaagg ctgacgccaa tctgtggaaa 720 gcattgaagg acaagaattg ggctgagttt gctcggcgtt acaatggccc ggcgtatgca 780 cagaaccagt acgacaccaa gctggctgca gcatacaaat cattcagtta gtaaaagctt 840 ggctgttttg gc 852 <210> 22 <211> 264 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE 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acaaaaagct gaatgccaag ttcggtcagg caaaagccaa tgctctggcc 480 cagctttacc cgacgttggt taacgccaaa gccgggggat acacaggtgg ggacgcggag 540 ttggaacgac tccatggtgc aatagcgatc gataaagatt gcgcctacga gagcgcttcc 600 tacgggttat tccagatcat ggggttcaac tgcgttattt gtggatatga caatgccgag 660 gagatgttca acgactttct cactggtgaa cgtgctcagc tcatggcatt tgtcaagttc 720 atcaaggctg acgccaatct gtggaaagca ttgaaggaca agaattgggc tgagtttgct 780 cggcgttaca atggcccggc gtatgcacag aaccagtacg acaccaagct ggctgcagca 840 tacaaatcat tcagttagta aaagcttggc tgttttggc 879 <210> 24 <211> 273 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(273) <223> modified GN316 lysin <400> 24 Met Gly Ser His His His His His His Gly Ala Ile Leu Lys Ile Gly 1 5 10 15 Ser Lys Gly Leu Glu Val Lys Asn Leu Gln Thr Ser Leu Asn Lys Ile 20 25 30 Gly Phe Asn Leu Val Ala Asp Gly Ile Phe Gly Lys Ala Thr Asp Asn 35 40 45 Ala Val Arg Ala Val Gln Ala Gly Ala Gly Leu Val Val 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<212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(8) <223> linker <400> 72 Thr Ala Gly Gly Thr Ala Gly Gly 1 5 <210> 73 <211> 435 <212> DNA <213> Pseudomonas phage PAJU2 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(435) <223> GN4 <400> 73 atgcgtacat cccaacgagg catcgacctc atcaaatcct tcgagggcct gcgcctgtcc 60 gcttaccagg actcggtggg tgtctggacc ataggttacg gcaccactcg gggcgtcacc 120 cgctacatga cgatcaccgt cgagcaggcc gagcggatgc tgtcgaacga cattcagcgc 180 ttcgagccag agctagacag gctggcgaag gtgccactga accagaacca gtgggatgcc 240 ctgatgagct tcgtgtacaa cctgggcgcg gccaatctgg cgtcgtccac gctgctcaag 300 ctgctgaaca agggtgacta ccagggagca gcggaccagt tcccgcgctg ggtgaatgcg 360 ggcggtaagc gcttggatgg tctggttaag cgtcgagcag ccgagcgtgc gctgttcctg 420 gagccactat cgtga 435 <210> 74 <211> 144 <212> PRT <213> Pseudomonas phage PAJU2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(144) <223> GN4 <400> 74 Met Arg Thr Ser Gln Arg Gly Ile Asp Leu Ile Lys 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Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(438) <223> Modified GN4 lysin, GN146 <400> 77 atgcgtacat cccaacgagg catcgacctc atcaaatcct tcgagggcct gcgcctgtcc 60 gcttaccagg actcggtggg tgtctggacc ataggttacg gcaccactcg gggcgtcacc 120 cgctacatga cgatcaccgt cgagcaggcc gagcggatgc tgtcgaacga cattcagcgc 180 ttcgagccag agctagacag gctggcgaag gtgccactga accagaacca gtgggatgcc 240 ctgatgagct tcgtgtacaa cctgggcgcg gccaatctgg cgtcgtccac gctgctcgac 300 ctgctgaaca agggtgacta ccagggagca gcggaccagt tcccgcattg ggtgaatgcg 360 ggcggtaagc gcttggatgg tctggttaag cgtcgagcag ccgagcgtgc gctgttcctg 420 gagccactat cgtgataa 438 <210> 78 <211> 144 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(144) <223> Modified GN4 lysin, GN146 <400> 78 Met Arg Thr Ser Gln Arg Gly Ile Asp Leu Ile Lys Ser Phe Glu Gly 1 5 10 15 Leu Arg Leu Ser Ala Tyr Gln Asp Ser Val Gly Val Trp Thr Ile Gly 20 25 30 Tyr 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misc_feature <222> (1)..(27) <223> purification tag GSHHHHHHG <400> 99 ggatcccatc atcaccacca tcatggt 27 <210> 100 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 100 Gly Ser His His His His His His Gly 1 5 <210> 101 <211> 120 <212> DNA <213> Chlamydia phage 4 <400> 101 atggcacgaa gatacagact ttcgcgacgc agaagtcgac gacttttttc aagaactgca 60 ttaagaatgc atcgaagaaa tagacttcga agaattatgc gtggcggcat taggttttag 120 <210> 102 <211> 39 <212> PRT <213> Chlamydia phage 4 <400> 102 Met Ala Arg Arg Tyr Arg Leu Ser Arg Arg Arg Ser Arg Arg Leu Phe 1 5 10 15 Ser Arg Thr Ala Leu Arg Met His Arg Arg Asn Arg Leu Arg Arg Ile 20 25 30 Met Arg Gly Gly Ile Arg Phe 35 <210> 103 <211> 126 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 103 atggctcgtt cccgtagacg tatgtctaag cgttcttccc gccgttcgtt ccgcaagtat 60 gcgaagtcgc ataagaagaa ctttaaagcc cgctcaatgc gtggcggtat ccgtttatga 120 taataa 126 <210> 104 <211> 39 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 104 Met Ala 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PC13 <400> 107 atgagaaagc gaatgtctaa gcgtgttgac aagaaggtgt tccgtcgtac tgccgcatct 60 gccaagaaga ttaacattga ccccaagatt taccgtggag gtattcgcct atga 114 <210> 108 <211> 37 <212> PRT <213> Oscillibacter sp. PC13 <400> 108 Met Arg Lys Arg Met Ser Lys Arg Val Asp Lys Lys Val Phe Arg Arg 1 5 10 15 Thr Ala Ala Ser Ala Lys Lys Ile Asn Ile Asp Pro Lys Ile Tyr Arg 20 25 30 Gly Gly Ile Arg Leu 35 <210> 109 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(36) <223> RR12 <400> 109 cgccgcctga ttcgcctgtg gctgcgcctg ctgcgc 36 <210> 110 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 110 Arg Arg Leu Ile Arg Leu Trp Leu Arg Leu Leu Arg 1 5 10 <210> 111 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(12) <223> structure moiety <400> 111 atgatcgacc gt 12 <210> 112 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 112 Met Ile Asp Arg 1 <210> 113 <211> 12 <212> 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ttcgtacatc ccaacgaggc 60 atcgacctca tcaaatcctt cgagggcctg cgcctgtccg cttaccagga ctcggtgggt 120 gtctggacca taggttacgg caccactcgg ggcgtcaccc gctacatgac gatcaccgtc 180 gagcaggccg agcggatgct gtcgaacgac attcagcgct tcgagccaga gctagacagg 240 ctggcgaagg tgccactgaa ccagaaccag tgggatgccc tgatgagctt cgtgtacaac 300 ctgggcgcgg ccaatctggc gtcgtccacg ctgctcgacc tgctgaacaa gggtgactac 360 cagggagcag cggaccagtt cccgcattgg gtgaatgcgg gcggtaagcg cttggatggt 420 ctggttaagc gtcgagcagc cgagcgtgcg ctgttcctgg agccactatc gtgataa 477 <210> 118 <211> 158 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 118 Met Gly Pro Arg Arg Pro Arg Arg Pro Gly Arg Arg Ala Pro Val Arg 1 5 10 15 Thr Ser Gln Arg Gly Ile Asp Leu Ile Lys Ser Phe Glu Gly Leu Arg 20 25 30 Leu Ser Ala Tyr Gln Asp Ser Val Gly Val Trp Thr Ile Gly Tyr Gly 35 40 45 Thr Thr Arg Gly Val Thr Arg Tyr Met Thr Ile Thr Val Glu Gln Ala 50 55 60 Glu Arg Met Leu Ser Asn Asp Ile Gln Arg Phe Glu Pro Glu Leu 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gccggcgcag gagctggtgc aggagctggt gcaggagctg gtgcaggagc tagc 54 <210> 122 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 122 Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly 1 5 10 15 Ala Ser <210> 123 <211> 543 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(543) <223> GN14 lysin <400> 123 aataacgaac ttccttgggt agccgaagcc cgaaagtata tcggccttcg cgaagacact 60 tcgaagactt cgcataaccc gaaacttctt gccatgcttg accgcatggg cgaattttcc 120 aacgaatccc gcgcttggtg gcacgacgac gaaacgcctt ggtgcggact gttcgtcggc 180 tattgcttgg gcgttgccgg gcgctacgtc gtccgcgaat ggtacagggc gcgggcatgg 240 gaagccccgc agcttacgaa gcttgaccgg cccgcatacg gcgcgcttgt gaccttcacg 300 cgaagcggcg gcggccacgt cggttttatt gtgggcaagg atgcgcgcgg aaatcttatg 360 gttcttggcg gtaatcagtc gaacgccgta agtatcgcac cgttcgcagt atcccgcgta 420 accggctatt tctggccgtc gttctggcga aacaagaccg cagttaaaag cgttccgttt 480 gaagaacgtt attcgctgcc gctgttgaag tcgaacggcg aactttcgac gaatgaagcg 540 taa 543 <210> 124 <211> 180 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 124 Asn Asn Glu Leu Pro Trp Val Ala Glu Ala Arg Lys Tyr Ile Gly Leu 1 5 10 15 Arg Glu Asp Thr Ser Lys Thr Ser His Asn Pro Lys Leu Leu Ala Met 20 25 30 Leu Asp Arg Met Gly Glu Phe Ser Asn Glu Ser Arg Ala Trp Trp His 35 40 45 Asp Asp Glu Thr Pro Trp Cys Gly Leu Phe Val Gly Tyr Cys Leu Gly 50 55 60 Val Ala Gly Arg Tyr Val Val Arg Glu Trp Tyr Arg Ala Arg Ala Trp 65 70 75 80 Glu Ala Pro Gln Leu Thr Lys Leu Asp Arg Pro Ala Tyr Gly Ala Leu 85 90 95 Val Thr Phe Thr Arg Ser Gly Gly Gly His Val Gly Phe Ile Val Gly 100 105 110 Lys Asp Ala Arg Gly Asn Leu Met Val Leu Gly Gly Asn Gln Ser Asn 115 120 125 Ala Val Ser Ile Ala Pro Phe Ala Val Ser Arg Val Thr Gly Tyr Phe 130 135 140 Trp Pro Ser Phe Trp Arg Asn Lys Thr Ala Val Lys Ser Val Pro Phe 145 150 155 160 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<213> Chlamydia trachomatis <400> 144 gtgaaacgtc gtaaactgtc caaaaagaaa tctcgcaaga ttttcactcg cggtgctgta 60 aatgtgaaaa agcgtaacct tcgcgctcgc ccaatgcgcg gcggtttccg gatctaa 117 <210> 145 <211> 38 <212> PRT <213> Chlamydia trachomatis <400> 145 Met Lys Arg Arg Lys Leu Ser Lys Lys Lys Ser Arg Lys Ile Phe Thr 1 5 10 15 Arg Gly Ala Val Asn Val Lys Lys Arg Asn Leu Arg Ala Arg Pro Met 20 25 30 Arg Gly Gly Phe Arg Ile 35 <210> 146 <211> 114 <212> DNA <213> Chlamydia trachomatis <400> 146 atggctaaaa aaatgactaa aggcaaggat cgtcaggttt ttcgtaaaac cgctgatcgt 60 actaagaaac tcaatgttag accgttgtta tatcgaggag gtatcagatt atga 114 <210> 147 <211> 37 <212> PRT <213> Chlamydia trachomatis <400> 147 Met Ala Lys Lys Met Thr Lys Gly Lys Asp Arg Gln Val Phe Arg Lys 1 5 10 15 Thr Ala Asp Arg Thr Lys Lys Leu Asn Val Arg Pro Leu Leu Tyr Arg 20 25 30 Gly Gly Ile Arg Leu 35 <210> 148 <211> 120 <212> DNA <213> Chlamydia trachomatis <400> 148 atggcaggaa aaaaaatggt atcaaaagga aaagatagac agattttccg aaaaactgct 60 gatcgcacta 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atagagtacg tagaagatgg 60 tttaatcata gaagacgtta tagatag 87 <210> 169 <211> 28 <212> PRT <213> Spiroplasma virus SpV4 <400> 169 Met Ala Tyr Arg Gly Phe Lys Thr Ser Arg Val Val Lys His Arg Val 1 5 10 15 Arg Arg Arg Trp Phe Asn His Arg Arg Arg Tyr Arg 20 25 <210> 170 <211> 117 <212> DNA <213> Spiroplasma virus SpV4 <400> 170 gtgagacgca aggttaagaa cacaaagcgt catcagtgga ggttgactca ttctgcacgt 60 tcaattaaac gtgctaatat aatgccgtca aatcctcgtg gtggacgtcg tttttag 117 <210> 171 <211> 38 <212> PRT <213> Spiroplasma virus SpV4 <400> 171 Met Arg Arg Lys Val Lys Asn Thr Lys Arg His Gln Trp Arg Leu Thr 1 5 10 15 His Ser Ala Arg Ser Ile Lys Arg Ala Asn Ile Met Pro Ser Asn Pro 20 25 30 Arg Gly Gly Arg Arg Phe 35 <210> 172 <211> 798 <212> DNA <213> Pseudomonas phage PhiPA3 <400> 172 atgacattac tgaagaaagg cgacaagggt gacgccgtaa aacaactaca gcagaaactc 60 aaagaccttg ggtataccct gggtgtcgat ggcaacttcg gtaatggcac cgatactgtc 120 gttcgttctt tccaaaccaa aatgaagctt agtgttgatg gtgtggttgg taatggtact 180 atgagtacta ttgactctac tctagcaggc attaaagcgt ggaagactag tgtacctttc 240 cctgcgacga acaaatcccg agcaatggca atgccaacgt tgactgaaat aggtcgactg 300 acaaacgttg atcctaaatt gctagcgaca ttctgttcta tcgaaagcgc gtttgattac 360 acagctaaac cctacaagcc cgatggcaca gtgtacagct ccgccgaagg ttggttccag 420 ttcctggatg caacatggga tgacgaagtg cgtaaacacg gtaagcaata tagcttccct 480 gttgatcctg gtcgttcttt gcgtaaagat ccacgggcta atggcttgat gggcgctgag 540 ttcctcaaag ggaatgctgc tattctgcgg ccagtactgg gtcatgaacc gagcgacaca 600 gatctttatc tagcccattt catgggagca ggtggcgcaa aacagttcct tatggccgat 660 caaaataaat tggctgccga attgttccct ggtccagcta aggctaatcc taacatcttc 720 tataaatccg gaaatattgc ccgcacttta gcagaggtct atgcagtcct cgatgctaag 780 gtagccaagc atagagct 798 <210> 173 <211> 266 <212> PRT <213> Pseudomonas phage PhiPA3 <400> 173 Met Thr Leu Leu Lys Lys Gly Asp Lys Gly Asp Ala Val Lys Gln Leu 1 5 10 15 Gln Gln Lys Leu Lys Asp Leu Gly Tyr Thr Leu Gly Val Asp Gly Asn 20 25 30 Phe Gly Asn Gly Thr Asp Thr Val Val Arg Ser Phe Gln Thr Lys Met 35 40 45 Lys Leu Ser Val Asp Gly Val Val Gly Asn Gly Thr Met Ser Thr Ile 50 55 60 Asp Ser Thr Leu Ala Gly Ile Lys Ala Trp Lys Thr Ser Val Pro Phe 65 70 75 80 Pro Ala Thr Asn Lys Ser Arg Ala Met Ala Met Pro Thr Leu Thr Glu 85 90 95 Ile Gly Arg Leu Thr Asn Val Asp Pro Lys Leu Leu Ala Thr Phe Cys 100 105 110 Ser Ile Glu Ser Ala Phe Asp Tyr Thr Ala Lys Pro Tyr Lys Pro Asp 115 120 125 Gly Thr Val Tyr Ser Ser Ala Glu Gly Trp Phe Gln Phe Leu Asp Ala 130 135 140 Thr Trp Asp Asp Glu Val Arg Lys His Gly Lys Gln Tyr Ser Phe Pro 145 150 155 160 Val Asp Pro Gly Arg Ser Leu Arg Lys Asp Pro Arg Ala Asn Gly Leu 165 170 175 Met Gly Ala Glu Phe Leu Lys Gly Asn Ala Ala Ile Leu Arg Pro Val 180 185 190 Leu Gly His Glu Pro Ser Asp Thr Asp Leu Tyr Leu Ala His Phe Met 195 200 205 Gly Ala Gly Gly Ala Lys Gln Phe Leu Met Ala Asp Gln Asn Lys Leu 210 215 220 Ala Ala Glu Leu Phe Pro Gly Pro Ala Lys Ala Asn Pro Asn Ile Phe 225 230 235 240 Tyr Lys Ser Gly Asn Ile Ala Arg Thr Leu Ala Glu Val Tyr Ala Val 245 250 255 Leu Asp Ala Lys Val Ala Lys His Arg Ala 260 265 <210> 174 <211> 435 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(435) <223> GN37 and RI18 <400> 174 atgacataca ccctgagcaa aagaagcctg gataacctaa aaggcgttca tcccgatctg 60 gttgccgttg tccatcgcgc catccagctt acaccggttg atttcgcggt gatcgaaggc 120 ctgcgctccg tatcccgcca aaaggaactg gtggccgccg gcgccagcaa gaccatgaac 180 agccgacacc tgacaggcca tgcggttgat ctagccgctt acgtcaatgg catccgctgg 240 gactggcccc tgtatgacgc catcgccgtg gctgtgaaag ccgcagcaaa ggaattgggt 300 gtggccatcg tgtggggcgg tgactggacc acgtttaagg atggcccgca ctttgaactg 360 gatcggagca aatacagatg acgtaaaaaa acccgtaaac gtctgaaaaa aatcggtaaa 420 gttctgaaat ggatc 435 <210> 175 <211> 144 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 175 Met Thr Tyr Thr Leu Ser Lys Arg Ser Leu Asp Asn Leu Lys Gly Val 1 5 10 15 His Pro Asp Leu Val Ala Val Val His Arg Ala Ile Gln Leu Thr Pro 20 25 30 Val Asp Phe Ala Val Ile Glu Gly Leu Arg Ser Val Ser Arg Gln Lys 35 40 45 Glu Leu Val Ala Ala Gly Ala Ser Lys Thr Met Asn Ser Arg His Leu 50 55 60 Thr Gly His Ala Val Asp Leu Ala Ala Tyr Val Asn Gly Ile Arg Trp 65 70 75 80 Asp Trp Pro Leu Tyr Asp Ala Ile Ala Val Ala Val Lys Ala Ala Ala 85 90 95 Lys Glu Leu Gly Val Ala Ile Val Trp Gly Gly Asp Trp Thr Thr Phe 100 105 110 Lys Asp Gly Pro His Phe Glu Leu Asp Arg Ser Lys Tyr Arg Arg Lys 115 120 125 Lys Thr Arg Lys Arg Leu Lys Lys Ile Gly Lys Val Leu Lys Trp Ile 130 135 140 <210> 176 <211> 120 <212> DNA <213> Escherichia sp. <400> 176 atggctcgtt ctcgtcgtcg tatgtctaaa cgttcttctc gtcgttcttt tcgtaaatat 60 gctaaaactc ataaaaaaaa ttttaaagct cgttctatgc gtggaggaat tcgtttataa 120 <210> 177 <211> 39 <212> PRT <213> Escherichia sp. <400> 177 Met Ala Arg Ser Arg Arg Arg Met Ser Lys Arg Ser Ser Arg Arg Ser 1 5 10 15 Phe Arg Lys Tyr Ala Lys Thr His Lys Lys Asn Phe Lys Ala Arg Ser 20 25 30 Met Arg Gly Gly Ile Arg Leu 35 <210> 178 <211> 117 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 178 atggcgcgca gccgccgccg catgagcaaa cgcagcagcc gccgcagctt tcgcaaatat 60 gcgaaaagcc ataaaaaaaa ctttaaagcg cgcagcatgc gcggcggcat tcgcctg 117 <210> 179 <211> 39 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 179 Met Ala Arg Ser Arg Arg Arg Met Ser Lys Arg Ser Ser Arg Arg Ser 1 5 10 15 Phe Arg Lys Tyr Ala Lys Ser His Lys Lys Asn Phe Lys Ala Arg Ser 20 25 30 Met Arg Gly Gly Ile Arg Leu 35 <210> 180 <211> 117 <212> DNA <213> Alces alces faeces associated microvirus MP12 5423 <400> 180 atggcaaaga aaattagaaa caaagcacgt gatagacgta tcttcacaag aacagcttca 60 cgcatgcaca aggcaaaccg cacaccaaga tttatgagag gcggtattag gttatga 117 <210> 181 <211> 38 <212> PRT <213> Alces alces faeces associated microvirus MP12 5423 <400> 181 Met Ala Lys Lys Ile Arg Asn Lys Ala Arg Asp Arg Arg Ile Phe Thr 1 5 10 15 Arg Thr Ala Ser Arg Met His Lys Ala Asn Arg Thr Pro Arg Phe Met 20 25 30 Arg Gly Gly Ile Arg Leu 35 <210> 182 <211> 117 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Gokushovirinae environmental sample sequence <400> 182 atgcgtcgta aaaaaatgtc acgcggtaaa tcaaaaaaac tctttcgccg aacagcaaaa 60 cgcgttcatc gaaaaaacct acgagctcgc ccaatgcgtg gcggcatacg catgtag 117 <210> 183 <211> 38 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Gokushovirinae environmental sample sequence <400> 183 Met Arg Arg Lys Lys Met Ser Arg Gly Lys Ser Lys Lys Leu Phe Arg 1 5 10 15 Arg Thr Ala Lys Arg Val His Arg Lys Asn Leu Arg Ala Arg Pro Met 20 25 30 Arg Gly Gly Ile Arg Met 35 <210> 184 <211> 120 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Gokushovirinae environmental sample sequence <400> 184 atggcgaagc gacacaaaat cccgcaacgc gcgtcacaac attccttcac gcgccatgcg 60 caaaaggtcc accctaagaa cgttccccgc ctgccaatgc gaggcggtat ccgtctctaa 120 <210> 185 <211> 39 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Gokushovirinae environmental sample sequence <400> 185 Met Ala Lys Arg His Lys Ile Pro Gln Arg Ala Ser Gln His Ser Phe 1 5 10 15 Thr Arg His Ala Gln Lys Val His Pro Lys Asn Val Pro Arg Leu Pro 20 25 30 Met Arg Gly Gly Ile Arg Leu 35 <210> 186 <211> 114 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: uncultured bacterium sequence <400> 186 atgcgtaaaa aaatgcacaa atcattagac aagcgagtgt ttaaccgcac tgcaaaaaaa 60 tcaaaaaaaa taaatgttaa tcctgtagtt tatcgtggag gtattagatt atga 114 <210> 187 <211> 37 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: uncultured bacterium sequence <400> 187 Met Arg Lys Lys Met His Lys Ser Leu Asp Lys Arg Val Phe Asn Arg 1 5 10 15 Thr Ala Lys Lys Ser Lys Lys Ile Asn Val Asn Pro Val Val Tyr Arg 20 25 30 Gly Gly Ile Arg Leu 35 <210> 188 <211> 117 <212> DNA <213> Marine gokushovirus <400> 188 atgcgacgtt acaatgtaaa taaaggtaaa tctgctaaga agtttcgaaa gcaggtaagt 60 aagacgaagg ttgcaaacct acgttctaat ccaatgcgag gtggttggag actctaa 117 <210> 189 <211> 38 <212> PRT <213> Marine gokushovirus <400> 189 Met Arg Arg Tyr Asn Val Asn Lys Gly Lys Ser Ala Lys Lys Phe Arg 1 5 10 15 Lys Gln Val Ser Lys Thr Lys Val Ala Asn Leu Arg Ser Asn Pro Met 20 25 30 Arg Gly Gly Trp Arg Leu 35 <210> 190 <211> 126 <212> DNA <213> Richelia intracellularis HH01 <400> 190 atgcgtccag ttaaaagatc aagagtaaat aaggcccgat ctgcaggcaa gtttcgtaag 60 caggtcggta aaacaaagat ggcaaatctg cgtagtaatc cgatgcgcgg cggatggcgg 120 ctgtga 126 <210> 191 <211> 41 <212> PRT <213> Richelia intracellularis HH01 <400> 191 Met Arg Pro Val Lys Arg Ser Arg Val Asn Lys Ala Arg Ser Ala Gly 1 5 10 15 Lys Phe Arg Lys Gln Val Gly Lys Thr Lys Met Ala Asn Leu Arg Ser 20 25 30 Asn Pro Met Arg Gly Gly Trp Arg Leu 35 40 <210> 192 <211> 126 <212> DNA <213> Gokushovirinae Fen7875_21 <400> 192 atgaagccat tgaagcgtaa gccggttcag aaggcgcggt cagcagccaa gttccgtcga 60 aatgtgtcta ccgttaaggc tgccaatatg gcggtgaagc cgatgcgcgg cggttggcgg 120 ttctga 126 <210> 193 <211> 41 <212> PRT <213> Gokushovirinae Fen7875_21 <400> 193 Met Lys Pro Leu Lys Arg Lys Pro Val Gln Lys Ala Arg Ser Ala Ala 1 5 10 15 Lys Phe Arg Arg Asn Val Ser Thr Val Lys Ala Ala Asn Met Ala Val 20 25 30 Lys Pro Met Arg Gly Gly Trp Arg Phe 35 40 <210> 194 <211> 135 <212> DNA <213> Mycobacterium phage BabyRay <400> 194 atgaccaaga gagacatcga gtaccggaaa gctttggggc tcaacccatc tgagccgctc 60 ccgaagattg tgggtgccgt cacccgccac ggggccactc tgaaacgccc acgggtcacc 120 gcactggccc gatag 135 <210> 195 <211> 44 <212> PRT <213> Mycobacterium phage BabyRay <400> 195 Met Thr Lys Arg Asp Ile Glu Tyr Arg Lys Ala Leu Gly Leu Asn Pro 1 5 10 15 Ser Glu Pro Leu Pro Lys Ile Val Gly Ala Val Thr Arg His Gly Ala 20 25 30 Thr Leu Lys Arg Pro Arg Val Thr Ala Leu Ala Arg 35 40 <210> 196 <211> 117 <212> DNA <213> Bdellovibrio phage phiMH2K <400> 196 atgaaaagaa aaccaatgag ccgcaaggcc tctcaaaaaa ccttcaaaaa gaacacaggc 60 gttcaacgca tgaaccatct caacccacgc gccatgcgtg gtggcattag actataa 117 <210> 197 <211> 38 <212> PRT <213> Bdellovibrio phage phiMH2K <400> 197 Met Lys Arg Lys Pro Met Ser Arg Lys Ala Ser Gln Lys Thr Phe Lys 1 5 10 15 Lys Asn Thr Gly Val Gln Arg Met Asn His Leu Asn Pro Arg Ala Met 20 25 30 Arg Gly Gly Ile Arg Leu 35 <210> 198 <211> 168 <212> DNA <213> Pseudomonas phage PP7 <400> 198 ttgtcgtcaa ccttgtgccg ctgggccgtt aaggccctgc ggtgtacccg tgtgtataag 60 gagtttatat ggaaaccctt agtagcgctc agttacgtga cgttgtatct tctgagctcg 120 gtcttcctgt cccaactcag ctaccccatc gggagctggg cggtgtag 168 <210> 199 <211> 55 <212> PRT <213> Pseudomonas phage PP7 <400> 199 Met Ser Ser Thr Leu Cys Arg Trp Ala Val Lys Ala Leu Arg Cys Thr 1 5 10 15 Arg Val Tyr Lys Glu Phe Ile Trp Lys Pro Leu Val Ala Leu Ser Tyr 20 25 30 Val Thr Leu Tyr Leu Leu Ser Ser Val Phe Leu Ser Gln Leu Ser Tyr 35 40 45 Pro Ile Gly Ser Trp Ala Val 50 55 <210> 200 <211> 108 <212> DNA <213> Acinetobacter phage AP205 <400> 200 atgaagaaaa ggacaaaagc cttgcttccc tatgcggttt tcatcatact cagctttcaa 60 ctaacattgt tgactgcctt gtttatgtat taccattata ccttttag 108 <210> 201 <211> 35 <212> PRT <213> Acinetobacter phage AP205 <400> 201 Met Lys Lys Arg Thr Lys Ala Leu Leu Pro Tyr Ala Val Phe Ile Ile 1 5 10 15 Leu Ser Phe Gln Leu Thr Leu Leu Thr Ala Leu Phe Met Tyr Tyr His 20 25 30 Tyr Thr Phe 35 <210> 202 <211> 558 <212> DNA <213> Acinetobacter phage vB_AbaP_CEB1 <400> 202 atgattctga ctaaagatgg gtttggtatt atccgtaatg aactattcgg aggtaagtta 60 gatcaaactc aagtagatgc aataaacttt attgtagaga aagctactga gtctggttta 120 tcttatccag aggcagccta tttactagct accatctatc atgagactgg tctaccaagc 180 ggttatcgaa ctatgcaacc tattaaagaa gctggttctg ataactacct tcgatctaag 240 aagtactacc cgtacattgg ttatggttat gtacagttaa cttggaagga gaactatgga 300 cggattggta aacttattgg aattgaccta attaagaatc ctgagaaagc gctagaacct 360 ttaattgcta ttcagattgc tatcaaaggc atgttgaatg gttggttcac aggtgttgga 420 ttccgacgta aacgtccagt tagtaaatac aacaaacagc agtacatagc tgcgcgtaat 480 atcattaatg ggaaagataa ggctgagctt atagcgaagt acgctattat ctttgaacgc 540 gctctacgga gcttataa 558 <210> 203 <211> 185 <212> PRT <213> Acinetobacter phage vB_AbaP_CEB1 <400> 203 Met Ile Leu Thr Lys Asp Gly Phe Gly Ile Ile Arg Asn Glu Leu Phe 1 5 10 15 Gly Gly Lys Leu Asp Gln Thr Gln Val Asp Ala Ile Asn Phe Ile Val 20 25 30 Glu Lys Ala Thr Glu Ser Gly Leu Ser Tyr Pro Glu Ala Ala Tyr Leu 35 40 45 Leu Ala Thr Ile Tyr His Glu Thr Gly Leu Pro Ser Gly Tyr Arg Thr 50 55 60 Met Gln Pro Ile Lys Glu Ala Gly Ser Asp Asn Tyr Leu Arg Ser Lys 65 70 75 80 Lys Tyr Tyr Pro Tyr Ile Gly Tyr Gly Tyr Val Gln Leu Thr Trp Lys 85 90 95 Glu Asn Tyr Gly Arg Ile Gly Lys Leu Ile Gly Ile Asp Leu Ile Lys 100 105 110 Asn Pro Glu Lys Ala Leu Glu Pro Leu Ile Ala Ile Gln Ile Ala Ile 115 120 125 Lys Gly Met Leu Asn Gly Trp Phe Thr Gly Val Gly Phe Arg Arg Lys 130 135 140 Arg Pro Val Ser Lys Tyr Asn Lys Gln Gln Tyr Ile Ala Ala Arg Asn 145 150 155 160 Ile Ile Asn Gly Lys Asp Lys Ala Glu Leu Ile Ala Lys Tyr Ala Ile 165 170 175 Ile Phe Glu Arg Ala Leu Arg Ser Leu 180 185 <210> 204 <211> 36 <212> PRT <213> Sus scrofa <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(36) <223> PMAP-36 <400> 204 Gly Arg Phe Arg Arg Leu Arg Lys Lys Thr Arg Lys Arg Leu Lys Lys 1 5 10 15 Ile Gly Lys Val Leu Lys Trp Ile Pro Pro Ile Val Gly Ser Ile Pro 20 25 30 Leu Gly Cys Gly 35

Claims (57)

  1. 리신-AMP 폴리펩타이드 작제물로서,
    (a) 다음의 폴리펩타이드 서열을 포함하는 제1 성분:
    (i) GN76(서열번호 203), GN4(서열번호 74), GN146(서열번호 78), GN14(서열번호 124), 임의로 단일 pI-증가 돌연변이가 있는 GN37(서열번호 84), GN76(서열번호 203), 임의로 단일 점 돌연변이가 있는 GN316(서열번호 22), 리신 Pap2_gp17(서열번호 96), GN329(서열번호 26), GN424(서열번호 56), GN202(서열번호 118), GN425(서열번호 58), GN428(서열번호 60), GN431(서열번호 64), GN486(서열번호 66), GN333(서열번호 28), GN485(서열번호 68), GN123(서열번호 173) 및 GN121(서열번호 175)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 리신; 또는
    (ii) 리신 활성이 있고, 서열번호 203, 74, 78, 124, 84, 22, 96, 26, 56, 118, 58, 60, 64, 66, 28, 68, 173 또는 175 중 적어도 하나의 폴리펩타이드 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드; 또는
    (iii) 리신의 활성 단편; 및
    (b) 다음의 폴리펩타이드 서열을 포함하는 제2 성분:
    (i) Chp1(서열번호 133), Chp2(서열번호 70), CPAR39(서열번호 135), Chp3(서열번호 137), Chp4(서열번호 102), Chp6(서열번호 106), Chp7(서열번호 139), Chp8(서열번호 141), Chp9(서열번호 143), Chp10(서열번호 145), Chp11(서열번호 147), Chp12(서열번호 149), Gkh1(서열번호 151), Gkh2(서열번호 90), Unp1(서열번호 153), Ecp1(서열번호 155), Ecp2(서열번호 104), Tma1(서열번호 157), Osp1(서열번호 108), Unp2(서열번호 159), Unp3(서열번호 161), Gkh3(서열번호 163), Unp5(서열번호 165), Unp6(서열번호 167), Spi1(서열번호 169), Spi2(서열번호 171), Ecp3(서열번호 177), Ecp4(서열번호 179), ALCES1(서열번호 181), AVQ206(서열번호 183), AVQ244(서열번호 185), CDL907(서열번호 187), AGT915(서열번호 189), HH3930(서열번호 191), Fen7875(서열번호 193), SBR77(서열번호 195), Bdp1(서열번호 197), LVP1(서열번호 199), Lvp2(서열번호 201), 에스쿨렌틴(esculentin) 단편(서열번호 80), RI12(서열번호 88), TI15(서열번호 94), RI18(서열번호 92), FIRL(서열번호 114), LPS 결합 단백질 단편(서열번호 76), RR12whydro(서열번호 110), RI18 펩타이드 유도체(서열번호 131) 및 양이온성 펩타이드(서열번호 120)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 항미생물 펩타이드(AMP) 또는
    (ii) AMP 활성이 있고, 서열번호 133, 70, 135, 137, 102, 106, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 90, 153, 155, 104, 157, 108, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 199, 201, 80, 88, 94, 92, 114, 76, 110, 131 및 120 중 적어도 하나와 적어도 80% 동일한 폴리펩타이드를 포함하고,
    상기 리신-AMP 폴리펩타이드 작제물은 폐 계면활성제의 존재하에 피. 아에루기노사 박테리아 성장 억제, 피. 아에루기노사 박테리아 개체군 감소 및/또는 피. 아에루기노사 사멸로부터 선택된 적어도 하나의 활성을 포함하는, 리신-AMP 폴리펩타이드 작제물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 제1 성분은 GN394(서열번호 48), GN396(서열번호 50), GN408(서열번호 52) 및 GN418(서열번호 54)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 리신-AMP 폴리펩타이드 작제물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 작제물은 비결합 (unconjugated) 리신 및/또는 AMP에서와 실질적으로 동일한 작제물의 제1 및/또는 제2 성분의 구조의 적어도 일부를 유지하기 위한 적어도 하나의 구조 안정화 성분을 추가로 포함하는, 리신-AMP 폴리펩타이드 작제물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 적어도 하나의 구조 안정화 성분은 펩타이드인, 리신-AMP 폴리펩타이드 작제물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 펩타이드는 TAGGTAGG(서열번호 72), IGEM (BBa_K1485002)(서열번호 82), PPTAGGTAGG(서열번호 98), IGEM +PP(서열번호 16의 잔기 44-58) 및 AGAGAGAGAGAGAGAGAS(서열번호 122)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 리신-AMP 폴리펩타이드 작제물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, GN37 리신(서열번호 84)은 단일 pI-증가 돌연변이를 포함하고, GN316(서열번호 22)은 단일 점 돌연변이를 포함하고, 여기서 단일 pI-증가 돌연변이가 있는 GN37(서열번호 84)은 GN217(서열번호 8)이고, 단일 점 돌연변이가 있는 GN316(서열번호 22)은 GN396(서열번호 50), GN408(서열번호 52), GN418(서열번호 54) 및 GN394(서열번호 48)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 리신-AMP 폴리펩타이드 작제물.
  7. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 리신-AMP 폴리펩타이드 작제물은 (i) GN168(서열번호 2), GN176(서열번호 4), GN178(서열번호 6), GN218(서열번호 10), GN223(서열번호 12), GN239(서열번호 14), GN243(서열번호 16), GN280(서열번호 18), GN281(서열번호 20), GN349(서열번호 30), GN351(서열번호 32), GN352(서열번호 34), GN353(서열번호 36), GN357(서열번호 38), GN359(서열번호 40), GN369(서열번호 42), GN370(서열번호 44), GN371(서열번호 46), GN428(서열번호 60), 및 GN93(서열번호 62)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 폴리펩타이드 서열, 또는 (ii) 리신 활성이 있고, 서열번호 2, 4, 6, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 60 및 62 중 적어도 하나와 적어도 80% 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함하는, 리신-AMP 폴리펩타이드 작제물.
  8. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 리신-AMP 폴리펩타이드 작제물은 (i) GN351(서열번호 32) 및 GN370(서열번호 36)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 폴리펩타이드 서열, 또는 (ii) 리신 활성이 있고, 서열번호 32 및 36 중 적어도 하나와 적어도 80% 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함하는, 리신-AMP 폴리펩타이드 작제물.
  9. GN121(서열번호 175), GN217 리신(서열번호 8), GN394 리신(서열번호 48), GN396 리신(서열번호 50), GN408 리신(서열번호 52), GN418 리신(서열번호 54), GN428(서열번호 60), 및 GN486(서열번호 66) 또는 이의 활성 단편으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 리신을 포함하는 단리된 폴리펩타이드로서, 상기 리신 또는 이의 활성 단편은 폐 계면활성제의 존재하에 피. 아에루기노사 박테리아 성장 억제, 피. 아에루기노사 박테리아 개체군 감소 및/또는 피. 아에루기노사 사멸로부터 선택된 적어도 하나의 활성을 포함하는, 단리된 폴리펩타이드.
  10. 제9항에 있어서, 상기 리신은 GN121(서열번호 175) 및 GN428(서열번호 60)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 단리된 폴리펩타이드.
  11. 리신-항미생물 펩타이드(AMP) 폴리펩타이드 작제물을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드로서, 상기 핵산 분자는
    (a) 다음을 포함하는 제1 성분을 인코딩하는 제1 핵산 분자:
    (i) GN76(서열번호 203), GN4(서열번호 74), GN146(서열번호 78), GN14(서열번호 124), 임의로 단일 pI-증가 돌연변이가 있는 GN37(서열번호 84), 임의로 단일 점 돌연변이가 있는 GN316(서열번호 22), 리신 Pap2_gp17(서열번호 96), GN329(서열번호 26), GN424(서열번호 56), GN202(서열번호 118), GN425(서열번호 58), GN428(서열번호 60), GN431(서열번호 64), GN486(서열번호 66), GN333(서열번호 28), GN485(서열번호 68), GN123(서열번호 173) 및 GN121(서열번호 175)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 리신; 또는
    (ii) 리신 활성이 있고, 서열번호 203, 74, 78, 124, 84, 22, 96, 26, 56, 118, 58, 60, 64, 66, 28, 68, 173 또는 175 중 적어도 하나와 적어도 80% 동일한 폴리펩타이드; 또는
    (iii) 리신의 활성 단편;
    (b) 다음의 폴리펩타이드 서열을 포함하는 제2 성분을 인코딩하는 제2 핵산 분자:
    (i) Chp1(서열번호 133), Chp2(서열번호 70), CPAR39(서열번호 135), Chp3(서열번호 137), Chp4(서열번호 102), Chp6(서열번호 106), Chp7(서열번호 139), Chp8(서열번호 141), Chp9(서열번호 143), Chp10(서열번호 145), Chp11(서열번호 147), Chp12(서열번호 149), Gkh1(서열번호 151), Gkh2(서열번호 90), Unp1(서열번호 153), Ecp1(서열번호 155), Ecp2(서열번호 104), Tma1(서열번호 157), Osp1(서열번호 108), Unp2(서열번호 159), Unp3(서열번호 161), Gkh3(서열번호 163), Unp5(서열번호 165), Unp6(서열번호 167), Spi1(서열번호 169), Spi2(서열번호 171), Ecp3(서열번호 177), Ecp4(서열번호 179), ALCES1(서열번호 181), AVQ206(서열번호 183), AVQ244(서열번호 185), CDL907(서열번호 187), AGT915(서열번호 189), HH3930(서열번호 191), Fen7875(서열번호 193), SBR77(서열번호 195), Bdp1(서열번호 197), LVP1(서열번호 199), Lvp2(서열번호 201), 에스쿨렌틴 단편(서열번호 80), RI12(서열번호 88), TI15(서열번호 94), RI18(서열번호 92), FIRL(서열번호 114), LPS 결합 단백질 단편(서열번호 76), RR12whydro(서열번호 110), RI18 펩타이드 유도체(서열번호 131) 및 양이온성 펩타이드(서열번호 120)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 항미생물 펩타이드(AMP) 또는
    (ii) AMP 활성이 있고, 서열번호 133, 70, 135, 137, 102, 106, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 90, 153, 155, 104, 157, 108, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 199, 201, 80, 88, 94, 92, 114, 76, 110, 131 및 120 중 적어도 하나와 적어도 80% 동일한 폴리펩타이드를 포함하고,
    상기 리신-AMP 폴리펩타이드 작제물은 폐 계면활성제의 존재하에 피. 아에루기노사 박테리아 성장 억제, 피. 아에루기노사 박테리아 개체군 감소 및/또는 피. 아 에루기노사 사멸로부터 선택된 적어도 하나의 활성을 포함하는, 단리된 폴리뉴클레오타이드.
  12. 제11항에 있어서, 상기 핵산 분자는 (c) 적어도 하나의 구조 안정화 성분을 포함하는 제3 성분을 인코딩하는 제3 핵산 분자를 추가로 포함하고, 여기서 상기 적어도 하나의 구조 안정화 성분은 비결합 리신 및/또는 AMP에서와 실질적으로 동일한 작제물의 제1 및/또는 제2 성분의 구조의 적어도 일부를 유지하는, 단리된 폴리뉴클레오타이드.
  13. 제12항에 있어서, 상기 적어도 하나의 구조 안정화 성분은 펩타이드를 포함하는, 단리된 폴리뉴클레오타이드.
  14. 제13항에 있어서, 상기 펩타이드는 TAGGTAGG(서열번호 72), IGEM (BBa_K1485002)(서열번호 82), PPTAGGTAGG(서열번호 98), IGEM +PP(서열번호 16의 잔기 44-58) 및 AGAGAGAGAGAGAGAGAS(서열번호 122)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 단리된 폴리뉴클레오타이드.
  15. 제11항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, GN37(서열번호 84)은 단일 pI-증가 돌연변이를 포함하고, GN316(서열번호 22)은 단일 점 돌연변이를 포함하고, 여기서 단일 pI-증가 돌연변이가 있는 GN37(서열번호 84)은 GN217(서열번호 8)이고, 단일 점 돌연변이가 있는 GN316(서열번호 22)은 GN396(서열번호 50), GN408(서열번호 52), GN418(서열번호 54) 및 GN394(서열번호 48)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 단리된 폴리뉴클레오타이드.
  16. 제11항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 리신-AMP 폴리펩타이드 작제물을 인코딩하는 핵산 분자는
    (i) GN168(서열번호 2), GN176(서열번호 4), GN178(서열번호 6), GN218(서열번호 10), GN223(서열번호 12), GN239(서열번호 14), GN243(서열번호 16), GN280(서열번호 18), GN281(서열번호 20), GN349(서열번호 30), GN351(서열번호 32), GN352(서열번호 34), GN353(서열번호 36), GN357(서열번호 38), GN359 리신(서열번호 40), GN369 리신(서열번호 42), GN370 리신(서열번호 44), GN371 리신(서열번호 46) 및 GN93 리신(서열번호 62)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되거나;
    (ii) 리신 활성이 있고, 서열번호 2, 4, 6, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46 또는 62 중 적어도 하나의 폴리펩타이드 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 분자인, 단리된 폴리뉴클레오타이드.
  17. GN121(서열번호 175), GN217 리신(서열번호 8), GN394 리신(서열번호 48), GN396 리신(서열번호 50), GN408 리신(서열번호 52), GN418 리신(서열번호 54), GN428(서열번호 60), 및 GN486(서열번호 66) 또는 이의 활성 단편으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 리신을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드 서열로서, 상기 리신 또는 이의 활성 단편은 폐 계면활성제의 존재하에 피. 아에루기노사 박테리아 성장을 억제하고/하거나 피. 아에루기노사 박테리아 개체군을 감소시키고/시키거나 피. 아에루기노사를 사멸시키는, 단리된 폴리뉴클레오타이드 서열.
  18. 제11항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단리된 폴리뉴클레오타이드는 DNA를 포함하는, 단리된 폴리뉴클레오타이드.
  19. 제11항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단리된 폴리뉴클레오타이드는 cDNA를 포함하는, 단리된 폴리뉴클레오타이드.
  20. 제11항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 단리된 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터.
  21. 제20항에 있어서, 상기 단리된 폴리뉴클레오타이드 서열은 이종 프로모터에 작동 가능하게 연결된, 재조합 벡터.
  22. 제20항 또는 제21항에 있어서, 상기 재조합 벡터는 재조합 발현 벡터인, 재조합 벡터.
  23. 제20항 내지 제22항 중 어느 한 항의 재조합 벡터를 포함하는 단리된 숙주 세포.
  24. 단리된 리신 및/또는 리신-항미생물 펩타이드(AMP) 폴리펩타이드 작제물 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물로서,
    상기 단리된 리신은 다음 중 적어도 하나를 포함하고:
    (i) GN121(서열번호 175), GN123(서열번호 173), GN217(서열번호 8), GN316 변이체(서열번호 24), GN316(서열번호 22), GN329(서열번호 26), GN333(서열번호 28), GN394(서열번호 48), GN396(서열번호 50), GN408(서열번호 52), GN418(서열번호 54), GN424(서열번호 56), GN425(서열번호 58), GN428(서열번호 60), GN431(서열번호 64), GN486(서열번호 66), GN485(서열번호 68), 리신 PaP2_gp17(서열번호 96),
    (ii) 이의 활성 단편, 또는
    (iii) 리신 활성이 있고, 서열번호 175, 173, 8, 24, 22, 26, 28, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 64, 66, 68, 또는 96 중 적어도 하나의 폴리펩타이드 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드;
    상기 리신-AMP 폴리펩타이드 작제물은
    (a) 다음의 폴리펩타이드 서열을 포함하는 제1 성분:
    (i) GN76(서열번호 203), GN4(서열번호 74), GN146(서열번호 78), GN14(서열번호 124), 임의로 단일 pI-증가 돌연변이가 있는 GN37(서열번호 84), 임의로 단일 점 돌연변이가 있는 GN316(서열번호 22), 리신 Pap2_gp17(서열번호 96), GN329(서열번호 26), GN424(서열번호 56), GN202(서열번호 118), GN425(서열번호 58), GN428(서열번호 60), GN431(서열번호 64), GN486(서열번호 66), GN333(서열번호 28), GN485(서열번호 68), GN123(서열번호 173) 및 GN121(서열번호 175)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 리신; 또는
    (ii) 리신 활성이 있고, 서열번호 203, 74, 78, 124, 84, 22, 26, 56, 118, 58, 60, 64, 66, 28, 68, 173 또는 175 중 적어도 하나의 폴리펩타이드 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드; 또는
    (iii) 리신의 활성 단편; 및
    (b) 다음의 폴리펩타이드 서열을 포함하는 제2 성분:
    (i) Chp1(서열번호 133), Chp2(서열번호 70), CPAR39(서열번호 135), Chp3(서열번호 137), Chp4(서열번호 102), Chp6(서열번호 106), Chp7(서열번호 139), Chp8(서열번호 141), Chp9(서열번호 143), Chp10(서열번호 145), Chp11(서열번호 147), Chp12(서열번호 149), Gkh1(서열번호 151), Gkh2(서열번호 90), Unp1(서열번호 153), Ecp1(서열번호 155), Ecp2(서열번호 104), Tma1(서열번호 157), Osp1(서열번호 108), Unp2(서열번호 159), Unp3(서열번호 161), Gkh3(서열번호 163), Unp5(서열번호 165), Unp6(서열번호 167), Spi1(서열번호 169), Spi2(서열번호 171), Ecp3(서열번호 177), Ecp4(서열번호 179), ALCES1(서열번호 181), AVQ206(서열번호 183), AVQ244(서열번호 185), CDL907(서열번호 187), AGT915(서열번호 189), HH3930(서열번호 191), Fen7875(서열번호 193), SBR77(서열번호 195), Bdp1(서열번호 197), LVP1(서열번호 199), Lvp2(서열번호 201), 에스쿨렌틴 단편(서열번호 80), RI12(서열번호 88), TI15(서열번호 94), RI18(서열번호 92), FIRL(서열번호 114), LPS 결합 단백질 단편(서열번호 76), RR12whydro(서열번호 110), RI18 펩타이드 유도체(서열번호 131) 및 양이온성 펩타이드(서열번호 120)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 항미생물 펩타이드(AMP) 또는 (ii) AMP 활성이 있고, 서열번호 133, 70, 135, 137, 102, 106, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 90, 153, 155, 104, 157, 108, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 199, 201, 80, 88, 94, 92, 114, 76, 110, 131 및 120 중 적어도 하나와 적어도 80% 동일한 폴리펩타이드를 포함하고,
    상기 약제학적 조성물은 폐 계면활성제의 존재하에 피. 아에루기노사 박테리아 성장을 억제하고/하거나 피. 아에루기노사 박테리아 개체군을 감소시키고/시키거나 피. 아에루기노사를 사멸시키는, 약제학적 조성물.
  25. 제24항에 있어서, 상기 리신-AMP 폴리펩타이드 작제물은 비결합 리신 및/또는 AMP에서와 실질적으로 동일한 작제물의 제1 및/또는 제2 성분의 구조의 적어도 일부를 유지하기 위한 적어도 하나의 구조 안정화 성분을 추가로 포함하는, 약제학적 조성물.
  26. 제25항에 있어서, 상기 적어도 하나의 구조 안정화 성분은 펩타이드인, 약제학적 조성물.
  27. 제26항에 있어서, 상기 펩타이드는 TAGGTAGG(서열번호 72), IGEM (BBa_K1485002)(서열번호 82), PPTAGGTAGG(서열번호 98), IGEM +PP (서열번호 16의 잔기 44-58) 및 AGAGAGAGAGAGAGAGAS(서열번호 122)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 약제학적 조성물.
  28. 제24항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 리신은 GN316(서열번호 22), GN329(서열번호 26), GN333(서열번호 28), GN424(서열번호 56), GN425(서열번호 58), GN428(서열번호 60), GN431(서열번호 64), GN485(서열번호 68), 리신 PaP2_gp17(서열번호 96) 및 이의 활성 단편으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 약제학적 조성물.
  29. 제28항에 있어서, 상기 리신 또는 이의 활성 단편은 서열번호 22, 26, 28, 56, 58, 60, 64, 68 또는 96에 대한 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하는, 약제학적 조성물.
  30. 제24항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 리신-AMP 폴리펩타이드 작제물은 GN168(서열번호 2), GN176(서열번호 4), GN178(서열번호 6), GN218(서열번호 10), GN223(서열번호 12), GN239(서열번호 14), GN243(서열번호 16), GN280(서열번호 18), GN281(서열번호 20), GN349(서열번호 30), GN351(서열번호 32), GN352(서열번호 34), GN353(서열번호 36), GN357(서열번호 38), GN359(서열번호 40), GN369(서열번호 42), GN370(서열번호 44), GN371(서열번호 46), GN428(서열번호 60), GN93(서열번호 62) 중 적어도 하나로부터 선택된 폴리펩타이드 서열, 또는 리신 활성이 있고, 서열번호 2, 4, 6, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 60 및 62 중 적어도 하나와 적어도 80% 동일성을 갖는 폴리펩타이드 서열을 포함하는, 약제학적 조성물.
  31. 제24항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단리된 리신은 GN121(서열번호 175) 및 GN428(서열번호 60) 중 적어도 하나로부터 선택된 폴리펩타이드 서열, 또는 리신 활성이 있고, 서열번호 175 및 60 중 적어도 하나와 적어도 80% 동일성을 갖는 폴리펩타이드 서열을 포함하는, 약제학적 조성물.
  32. 제24항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 용액, 현탁액, 에멀젼, 흡입성 분말, 에어로졸 또는 스프레이로 제형화되는, 약제학적 조성물.
  33. 제24항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 그람-음성균의 치료에 적합한 항생제를 추가로 포함하는, 약제학적 조성물.
  34. 그람-음성균에 의해 유발된 박테리아 감염의 치료 방법으로서, 상기 그람-음성균은 피. 아에루기노사 및 임의로 하나 이상의 추가 그람-음성균 종을 포함하고, 상기 방법은
    박테리아 감염으로 진단받거나 박테리아 감염 위험이 있거나 박테리아 감염 증상을 나타내는 대상체에게 제24항 내지 제33항 중 어느 한 항에 따른 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  35. 제34항에 있어서, 상기 박테리아 감염은 국소 또는 전신 병원성 박테리아 감염인, 방법.
  36. 박테리아 감염의 예방 또는 치료 방법으로서,
    박테리아 감염으로 진단받거나 박테리아 감염 위험이 있거나 박테리아 감염 증상을 나타내는 대상체에게 제1 유효량의 제24항 내지 제35항 중 어느 한 항에 따른 약제학적 조성물 및
    제2 유효량의 그람-음성균 감염의 치료에 적합한 항생제의 조합을 공투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  37. 그람-음성균 감염의 치료에 적합한 항생제의 효능을 증가시키는 방법으로서,
    유효량의 단리된 리신 및/또는 리신-항미생물 펩타이드(AMP) 폴리펩타이드 작제물을 함유하는 조성물과 함께 항생제를 공투여하는 단계를 포함하고,
    여기서 상기 단리된 리신은 다음 중 적어도 하나를 포함하고:
    (i) GN121(서열번호 175), GN123(서열번호 173), GN217(서열번호 8), GN316 변이체(서열번호 24), GN316(서열번호 22), GN329(서열번호 26), GN333(서열번호 28), GN394(서열번호 48), GN396(서열번호 50), GN408(서열번호 52), GN418(서열번호 54), GN424(서열번호 56), GN425(서열번호 58), GN428(서열번호 60), GN431(서열번호 64), GN486(서열번호 66), GN485(서열번호 68), 리신 PaP2_gp17(서열번호 96), 또는
    (ii) 이의 활성 단편, 또는
    (iii) 리신 활성이 있고, 서열번호 175, 173, 8, 24, 22, 26, 28, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 64, 66, 68, 또는 96 중 적어도 하나의 폴리펩타이드 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드;
    상기 리신-AMP 폴리펩타이드 작제물은
    (a) 다음의 폴리펩타이드 서열을 포함하는 제1 성분:
    (i) GN76(서열번호 203), GN4(서열번호 74), GN146(서열번호 78), GN14(서열번호 124), 임의로 단일 pI-증가 돌연변이가 있는 GN37(서열번호 84), 임의로 단일 점 돌연변이가 있는 GN316(서열번호 22), 리신 Pap2_gp17(서열번호 96), GN329(서열번호 26), GN424(서열번호 56), GN202(서열번호 118), GN425(서열번호 58), GN428(서열번호 60), GN431(서열번호 64), GN486(서열번호 66), GN333(서열번호 28), GN485(서열번호 68), GN123(서열번호 173) 및 GN121(서열번호 175)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 리신; 또는
    (ii) 리신 활성이 있고, 서열번호 203, 74, 78, 124, 84, 22, 96, 26, 56, 118, 58, 60, 64, 66, 28, 68, 173 또는 175 중 적어도 하나의 폴리펩타이드 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드; 또는
    (iii) 리신의 활성 단편; 및
    (b) 다음의 폴리펩타이드 서열을 포함하는 제2 성분:
    (i) Chp1(서열번호 133), Chp2(서열번호 70), CPAR39(서열번호 135), Chp3(서열번호 137), Chp4(서열번호 102), Chp6(서열번호 106), Chp7(서열번호 139), Chp8(서열번호 141), Chp9(서열번호 143), Chp10(서열번호 145), Chp11(서열번호 147), Chp12(서열번호 149), Gkh1(서열번호 151), Gkh2(서열번호 90), Unp1(서열번호 153), Ecp1(서열번호 155), Ecp2(서열번호 104), Tma1(서열번호 157), Osp1(서열번호 108), Unp2(서열번호 159), Unp3(서열번호 161), Gkh3(서열번호 163), Unp5(서열번호 165), Unp6(서열번호 167), Spi1(서열번호 169), Spi2(서열번호 171), Ecp3(서열번호 177), Ecp4(서열번호 179), ALCES1(서열번호 181), AVQ206(서열번호 183), AVQ244(서열번호 185), CDL907(서열번호 187), AGT915(서열번호 189), HH3930(서열번호 191), Fen7875(서열번호 193), SBR77(서열번호 195), Bdp1(서열번호 197), LVP1(서열번호 199), Lvp2(서열번호 201), 에스쿨렌틴 단편(서열번호 80), RI12(서열번호 88), TI15(서열번호 94), RI18(서열번호 92), FIRL(서열번호 114), LPS 결합 단백질 단편(서열번호 76), RR12whydro(서열번호 110), RI18 펩타이드 유도체(서열번호 131) 및 양이온성 펩타이드(서열번호 120)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 항미생물 펩타이드(AMP) 또는
    (ii) AMP 활성이 있고, 서열번호 133, 70, 135, 137, 102, 106, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 90, 153, 155, 104, 157, 108, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 199, 201, 80, 88, 94, 92, 114, 76, 110, 131 및 120 중 적어도 하나와 적어도 80% 동일한 폴리펩타이드를 포함하고,
    상기 조성물은 폐 계면활성제의 존재하에 피. 아에루기노사 박테리아 성장 억제, 피. 아에루기노사 박테리아 개체군 감소 및/또는 피. 아에루기노사 사멸로부터 선택된 적어도 하나의 활성을 포함하고,
    상기 조합의 투여는 항생제 또는 리신 또는 리신-AMP 폴리펩타이드 작제물을 개별적으로 투여하는 것보다 폐 계면활성제의 존재하에 그람-음성균 성장을 억제하거나, 그람-음성균 개체군을 감소시키거나, 그람-음성균을 사멸시키는데 더 효과적인, 방법.
  38. 적어도 하나의 그람-음성균 종의 성장을 억제하거나 적어도 하나의 그람-음성균 종의 개체군을 감소시키거나 적어도 하나의 그람-음성균 종을 사멸시키는 방법으로서, 상기 적어도 하나의 그람-음성균 종은 피. 아에루기노사 및 임의로 하나 이상의 추가 그람-음성균 종이고, 상기 방법은
    박테리아를 유효량의 단리된 리신 및/또는 리신-항미생물 펩타이드(AMP) 폴리펩타이드 작제물을 함유하는 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하고,
    여기서 상기 단리된 리신은 다음 중 적어도 하나를 포함하고:
    (i) GN121(서열번호 175), GN123(서열번호 173), GN217(서열번호 8), GN316 변이체(서열번호 24), GN316(서열번호 22), GN329(서열번호 26), GN333(서열번호 28), GN394(서열번호 48), GN396(서열번호 50), GN408(서열번호 52), GN418(서열번호 54), GN424(서열번호 56), GN425(서열번호 58), GN428(서열번호 60), GN431(서열번호 64), GN486(서열번호 66), GN485(서열번호 68), 리신 PaP2_gp17(서열번호 96), 또는
    (ii) 이의 활성 단편, 또는
    (iii) 리신 활성이 있고, 서열번호 175, 173, 8, 24, 22, 26, 28, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 64, 66, 68, 또는 96 중 적어도 하나의 폴리펩타이드 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드;
    상기 리신-AMP 폴리펩타이드 작제물은
    (a) 다음의 폴리펩타이드 서열을 포함하는 제1 성분:
    (i) GN76(서열번호 203), GN4(서열번호 74), GN146(서열번호 78), GN14(서열번호 124), 임의로 단일 pI-증가 돌연변이가 있는 GN37(서열번호 84), 임의로 단일 점 돌연변이가 있는 GN316(서열번호 22), 리신 Pap2_gp17(서열번호 96), GN329(서열번호 26), GN424(서열번호 56), GN202(서열번호 118), GN425(서열번호 58), GN428(서열번호 60), GN431(서열번호 64), GN486(서열번호 66), GN333(서열번호 28), GN485(서열번호 68), GN123(서열번호 173) 및 GN121(서열번호 175)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 리신; 또는
    (ii) 리신 활성이 있고, 서열번호 203, 74, 78, 124, 84, 22, 96, 26, 56, 118, 58, 60, 64, 66, 28, 68, 173 또는 175 중 적어도 하나의 폴리펩타이드 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드; 또는
    (iii) 리신의 활성 단편; 및
    (b) 다음의 폴리펩타이드 서열을 포함하는 제2 성분:
    (i) Chp1(서열번호 133), Chp2(서열번호 70), CPAR39(서열번호 135), Chp3(서열번호 137), Chp4(서열번호 102), Chp6(서열번호 106), Chp7(서열번호 139), Chp8(서열번호 141), Chp9(서열번호 143), Chp10(서열번호 145), Chp11(서열번호 147), Chp12(서열번호 149), Gkh1(서열번호 151), Gkh2(서열번호 90), Unp1(서열번호 153), Ecp1(서열번호 155), Ecp2(서열번호 104), Tma1(서열번호 157), Osp1(서열번호 108), Unp2(서열번호 159), Unp3(서열번호 161), Gkh3(서열번호 163), Unp5(서열번호 165), Unp6(서열번호 167), Spi1(서열번호 169), Spi2(서열번호 171), Ecp3(서열번호 177), Ecp4(서열번호 179), ALCES1(서열번호 181), AVQ206(서열번호 183), AVQ244(서열번호 185), CDL907(서열번호 187), AGT915(서열번호 189), HH3930(서열번호 191), Fen7875(서열번호 193), SBR77(서열번호 195), Bdp1(서열번호 197), LVP1(서열번호 199), Lvp2(서열번호 201), 에스쿨렌틴 단편(서열번호 80), RI12(서열번호 88), TI15(서열번호 94), RI18(서열번호 92), FIRL(서열번호 114), LPS 결합 단백질 단편(서열번호 76), RR12whydro(서열번호 110), RI18 펩타이드 유도체(서열번호 131) 및 양이온성 펩타이드(서열번호 120)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 항미생물 펩타이드(AMP) 또는
    (ii) AMP 활성이 있고, 서열번호 133, 70, 135, 137, 102, 106, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 90, 153, 155, 104, 157, 108, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 199, 201, 80, 88, 94, 92, 114, 76, 110, 131 및 120 중 적어도 하나와 적어도 80% 동일한 폴리펩타이드를 포함하고,
    상기 조성물은 폐 계면활성제의 존재하에 피. 아에루기노사 박테리아 성장 억제, 피. 아에루기노사 박테리아 개체군 감소 및/또는 피. 아에루기노사 사멸로부터 선택된 적어도 하나의 활성을 포함하는, 방법.
  39. 제34항, 제35항 및 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 추가 그람-음성균 종은 클렙시엘라 ( Klebsiella ) 종, 엔테로박터( Enterobacter ) 종, 에스케리키아 콜라이 ( Escherichia coli ), 시트로박터 프룬디 ( Citrobacter freundii ), 살모넬라 티피무리움 (Salmonella typhimurium ), 에르시니아 페스티스 ( Yersinia pestis), 및 프란시셀라 툴러렌시스 ( Franciscella tulerensis )로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  40. 제33항, 제36항 및 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항생제는 세프타지딤, 세페핌, 세포페라존, 세프토비프롤, 시프로플록사신, 레보플록사신, 아미노글리코시드, 이미페넴, 메로페넴, 도리페넴, 겐타마이신, 토브라마이신, 아미카신, 피페라실린, 티카르실린, 페니실린, 리팜피신, 폴리믹신 B, 및 콜리스틴 중 하나 이상으로부터 선택되는, 약제학적 조성물 또는 방법.
  41. 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 활성은 피. 아에루기노사에 더하여 적어도 하나의 그람-음성균 종의 성장 억제 또는 개체군 감소를 추가로 포함하는, 리신-AMP 폴리펩타이드 작제물, 단리된 폴리펩타이드, 단리된 폴리뉴클레오타이드, 재조합 벡터, 숙주 세포, 약제학적 조성물 또는 방법.
  42. 제38항에 있어서, 피. 아에루기노사에 더하여 상기 적어도 하나의 그람-음성균 종은 클렙시엘라 종, 엔테로박터 종, 에스케리키아 콜라이, 시트로박터 프룬디, 살모넬라 티피무리움, 에르시니아 페스티스, 및 프란시셀라 툴러렌시스로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 리신-AMP 폴리펩타이드 작제물, 단리된 폴리펩타이드, 단리된 폴리뉴클레오타이드, 재조합 벡터, 숙주 세포, 약제학적 조성물 또는 방법.
  43. 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 리신-AMP 폴리펩타이드 작제물 또는 상기 단리된 폴리펩타이드는 피. 아에루기노사를 항생제에 재감작시키는, 리신-AMP 폴리펩타이드 작제물, 단리된 폴리펩타이드, 단리된 폴리뉴클레오타이드, 재조합 벡터, 숙주 세포, 약제학적 조성물 또는 방법.
  44. 제43항에 있어서, 상기 항생제는 카바페넴인, 리신-AMP 폴리펩타이드 작제물, 단리된 폴리펩타이드, 단리된 폴리뉴클레오타이드, 재조합 벡터, 숙주 세포, 약제학적 조성물 또는 방법.
  45. 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항생제는 메로페넴인, 리신-AMP 폴리펩타이드 작제물, 단리된 폴리펩타이드, 단리된 폴리뉴클레오타이드, 재조합 벡터, 숙주 세포, 약제학적 조성물 또는 방법.
  46. 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 그람-음성균의 의해 유발된 상기 박테리아 감염은 폐 계면활성제가 존재하는 장기 또는 조직의 박테리아 감염인, 리신-AMP 폴리펩타이드 작제물, 단리된 폴리펩타이드, 단리된 폴리뉴클레오타이드, 재조합 벡터, 숙주 세포, 약제학적 조성물 또는 방법.
  47. 그람-음성균 생물막의 예방, 붕괴 또는 박멸 방법으로서,
    표면을 생물막에서 그람-음성균을 사멸시키는데 효과적인 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 리신-AMP 폴리펩타이드 작제물, 제9항 또는 제10항의 단리된 폴리펩타이드를 포함하는 조성물 또는 제24항 내지 제32항 중 어느 한 항의 약제학적 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하고, 여기서 상기 생물막은 효과적으로 예방, 붕괴 또는 박멸되는, 방법.
  48. 그람-음성균 생물막의 예방, 붕괴 또는 박멸 방법으로서,
    생물막에서 그람-음성균을 사멸시키는데 효과적인 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 리신-AMP 폴리펩타이드 작제물, 제9항 또는 제10항의 단리된 폴리펩타이드를 포함하는 조성물 또는 제24항 내지 제32항 중 어느 한 항의 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 표면상의 상기 생물막은 효과적으로 예방, 붕괴 또는 박멸되는, 방법.
  49. 제47항 또는 제48항에 있어서, 상기 표면은 의료 장치의 표면을 포함하는, 방법.
  50. 제49항에 있어서, 상기 의료 장치는 콘택트렌즈, 약물 펌프, 임플란트, 카테터 또는 보철 장치인, 방법.
  51. 제47항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물 또는 약제학적 조성물은 하나 이상의 항생제(들)를 추가로 포함하는, 방법.
  52. 제47항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표면은 하나 이상의 항생제(들)와 추가로 접촉되는, 방법.
  53. 제51항 또는 제52항에 있어서, 상기 하나 이상의 항생제는 페니실린, 세팔로스포린, 모노박탐, 플루오로퀴놀론, 카바페멘(carbapemen), 아미노글리코시드, 폴리믹신, 마크롤라이드 또는 포스포마이신으로부터 선택되는, 방법.
  54. 제47항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표면은 생물 표면인, 방법.
  55. 제47항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표면은 골수염, 박테리아 심내막염, 편도염 부비동염, 각막의 감염, 요로 감염, 담도의 감염, 감염성 신장 결석, 요도염, 전립선염, 중이 감염, 치태 형성, 치은염, 치주염, 낭포성 섬유증, 상처 감염 및 의료 장치의 감염으로부터 선택된 그람-음성균 감염으로 감염되는, 방법.
  56. 제47항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 생물막 형성을 예방하는, 방법.
  57. 제47항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물막은 붕괴 또는 박멸되는, 방법.
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