KR20220029746A - 항미생물성 박테리오파지 유도된 폴리펩타이드 및 이의 그람 음성 및 항산성 세균에 대한 사용 - Google Patents

Abstract

서열 번호 81~91 및 94~102로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 단리된 Chp 펩타이드 또는 이와 약 80%의 서열 동일성을 갖는 변형된 Chp 펩타이드; 및 약제학적으로 허용되는 담체를 유효량으로 포함하는 약제학적 조성물이 본 출원에서 개시되며, 여기서, 상기 변형된 Chp 펩타이드는 그람 음성 세균 또는 항산성 세균의 적어도 한 종의 성장을 억제하거나 이의 집단을 감소시키거나 이를 사멸시킨다. 단리된 Chp 펩타이드 뿐만 아니라, 상기 Chp 펩타이드를 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터 및 벡터를 포함하는 숙주 세포도 본 출원에서 추가로 개시된다. 그람 음성 세균 또는 항산성 세균의 적어도 한 종의 성장을 억제하거나 이의 집단을 감소시키거나 이를 사멸시키는 방법, 대상체에서 세균 감염을 치료하는 방법, 또는 그람 음성 세균을 포함하는 생물막의 방지, 파괴 또는 처리를 위한 방법도 또한 본 출원에서 개시된다.

Description

항미생물성 박테리오파지 유도된 폴리펩타이드 및 이의 그람 음성 및 항산성 세균에 대한 사용

관련 출원에 대한 상호 참조

본 출원은 2019년 7월 5일자로 출원된 미국 가특허 출원 US 62/870,908; 2019년 8월 28일자로 출원된 미국 가특허 출원 US 62/892,783; 2019년 10월 7일자로 출원된 미국 가특허 출원 US 62/911,900; 2019년 12월 13일자로 출원된 미국 가특허 출원 US 62/948,052; 및 2020년 1월 23일자로 출원된 미국 가특허 출원 US 62/964,743의 이익을 주장하고 이들의 출원일에 의존하며, 이들 각각의 전체 개시 내용은 본 출원에 참조로 포함된다.

서열 목록

본 출원은 ASCII 형식으로 전자적으로 제출된 서열 목록을 포함하며, 이로써 그 전체가 참조로 포함된다. 2020년 6월 25일자로 생성된 상기 ASCII 사본은 0341_0019-00-304_SL.txt로 명명되며, 56,128 byte의 크기이다.

기술 분야

본 개시 내용은 항미생물제 분야에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 그람 음성 세균 및/또는 항산성 세균을 감염시키는 파지 유도된 항미생물성 아무린 펩타이드 및 그람 음성 세균 및/또는 항산성 세균을 사멸시키고 세균 감염 및 오염을 퇴치하는데 있어서 이러한 펩타이드의 용도에 관한 것이다.

그람 음성 세균, 특히, 슈도모나스 (Pseudomonas) 속의 구성원 및 최근에 출현한 다제내성 병원체 아시네토박터 바우마니 (Acinetobacter baumannii)는 심각하고 잠재적으로 생명을 위협하는 침습성 감염의 중요한 원인이다. 슈도모나스 감염은 화상 상처, 만성 상처, 만성 폐쇄성 폐 장애 (chronic obstructive pulmonary disorder: COPD), 낭포성 섬유증, 이식된 생체 재료 상의 표면 성장, 및 취약한 환자에게 많은 위협을 가하는 병원 표면 및 물 공급원 내에서 주요 문제를 나타낸다.

환자에서 확립되면, 슈도모나스 아에루기노사 (P. aeruginosa)는 특히 치료하기 어려울 수 있다. 게놈은 다약제 유출 펌프와 베타-락탐 및 아미노글리코사이드 항생제에 대한 내성을 부여하는 효소를 비롯하여 다수의 저항성 유전자를 인코딩하여, 이러한 그람 음성 병원체에 대한 치료를 특히 신규한 항미생물성 치료제의 부족으로 인해 도전적으로 만든다. 이러한 도전은, 숙주 방어 및 화학 요법으로부터 세균을 보호함으로써 감염을 유발하는 능력을 증진시킬 수 있는, 생물막에서 성장하는 슈도모나스 아에루기노사의 능력에 의해 복합적으로 작용한다.

의료 환경에서, 슈도모나스 아에루기노사 (Pseudomonas aeruginosa)의 내약성 균주의 발병률이 증가하고 있다. 지역 병원의 건강 관리 관련 혈류 감염 (BSI)에 대한 관찰 연구에서, 슈도모나스 아에루기노사는 상위 4개 다제내성 (Multiple Drug Resistant: MDR) 병원체 중 하나이었으며, 전체 병원 사망률의 18%에 기여한다. 또한, MDR 슈도모나스 아에루기노사의 발생은 잘 문서화되어 있다. 나쁜 결과는 콜리스틴과 같은 최후의 수단의 약물로 치료를 자주 필요로 하는 슈도모나스 아에루기노사의 MDR 균주와 연관되어 있다.

세계 보건 기구 (World Health Organization: WHO) 및 질병 통제 센터 (Centers for Disease Control: CDC)에 의해 중대한 위협으로 확인된 기타 내약성 세균으로는 다음과 같은 그람 음성 세균이 포함된다: 아시네토박터 바우마니, 슈도모나스 아에루기노사, 엔테로박테리아세아에 (Enterobacteriaceae) (에세리키아 콜라이 (Escherichia coli), 클렙시엘라 뉴모니아 (Klebsiella pneumoniae) 및 엔테로박터 클로아카 (Enterobacter cloacae) 포함), 살모넬라 (Salmonella) 종, 나이세리아 고노레아 (Neisseria gonorrhoeae) 및 시겔라 (Shigella) 종 (문헌 [Tillotson G. 2018. A crucial list of pathogens. Lancet Infect Dis 18:234-236]).

일반적으로 세포벽에서 높은 마이콜산 함량을 갖는 항산성 세균은 Ziehl-Neelsen 염색과 같은 실험실 염색 동안 산에 의한 탈색에 대한 세균의 내성을 측정하여 동정될 수 있다. 항산성 세균은 산성 기반 염색의 탈색에 대해 내성일 수 있다. 그람 음성 세균과 마찬가지로, 항산성 세균, 예를 들어, 악티노박테리아 (actinobacteria)는 생명 위협성 질환의 원인이 된다. 예를 들어, 마이코박테리움 (mycobacterium)은 악티노박테리아 속이며, 결핵 및 나병을 비롯한 심각한 질병을 일으키는 것으로 공지된 병원체를 포함한다. 마이코박테리움 투베르쿨로시스 (Mycobacterium tuberculosis)는 일반적으로 폐를 감염시킴으로써 나타나며, 예를 들어, 감염된 대상체가 기침, 재채기 또는 말할 때 공기를 통해 퍼질 수 있다. 슈도모나스 아에루기노사와 마찬가지로, 마이코박테리움 투베르쿨로시스 (M. tuberculosis)도 약물 내성 균주의 발생을 증가시켜 결핵 감염을 치료하는 것을 점점 더 어렵게 한다.

신규한 메커니즘을 갖는 신규한 항미생물제에 대한 필요성을 다루기 위해, 연구자들은 다양한 약물과 생물제제를 연구하고 있다. 이러한 클래스의 항미생물제 중 하나로는 리신이 포함된다. 리신은, "분자 가위"로서 작용하여, 세포 형상을 유지하고 내부 삼투압을 견디는 역할을 하는 펩티도글리칸 섬유주 (meshwork)를 분해하는 세포벽 펩티도글리칸 하이드롤라아제이다. 펩티도글리칸의 분해는 삼투 용해를 초래한다. 그러나, 그람 양성 세균에는 없고 하부 펩티도글리칸에 대한 접근을 제한하는 외막 (outer membrane: OM)의 존재로 인해, 특정 리신은 적어도 부분적으로 그람 음성 세균에 대해 효과적이지 않았다. 변형된 리신 ("아틸리신")도 또한 개발되었다. 다가 양이온성, 양친매성 및 소수성 특징을 갖는 특정 α-나선 도메인에 융합된 리신을 포함하는 이러한 제제는 OM 전체에 걸쳐 전위될 수 있다. 그러나, 특정 아틸리신은 낮은 생체내 활성을 나타낸다. 이것은 사람 혈청의 구성 성분, 구체적으로는 생리학적 염과 2가 양이온에 기인할 수 있다. 이들 구성 성분이 지질다당류 결합 부위에 대해 경쟁하고 리신의 α-나선 전위 도메인을 방해할 수 있으므로, 혈액 내에서 활성을 제한하고 침습성 감염을 치료하기 위한 특정 리신 및 아틸리신의 효과를 제한한다. 혈액 내 유사한 활성 부족이 복수의 상이한 외막 침투 및 항미생물성 펩타이드의 탈안정화에 대해 보고되었다.

리신 및 아틸리신에 추가하여, "아무린"을 비롯한 다른 파지 인코딩된 숙주 용해 시스템이 확인되었다 (문헌 [Chamakura KR et al., 2017. Mutational analysis of the MS2 lysis protein L. Microbiology 163:961-969]). 아무린이라는 용어는 ssDNA 및 ssRNA 파지 (각각 마이크로비리대 (Microviridae) 및 레비비리대 (Leviviridae)) 모두로부터의 제한된 세트의 비무랄리틱 (nonmuralytic) ("벽 파괴"가 아님, 즉, 세포벽의 펩티도글리칸 가수 분해에 기초하지 않음) 용해 활성을 기술한다. 예를 들어, 파지 φX174 (마이크로비리대과 마이크로바이러스 (Microvirus)속)의 단백질 E 아무린은 뮤레인 전구체인 지질 I의 형성을 촉매하는 필수 막 고정 효소인 세균 트랜스로카아제 MraY를 억제하여 용해를 일으키는 91개의 아미노산 막 단백질이다 (문헌 [Zheng Y et al., 2009. Purification and functional characterization of phiX174 lysis protein E. Biochemistry 48:4999-5006]). 또한, 파지 Qβ의 A2 캡시드 단백질 (레비비리대과 알로레비바이러스 (Allolevivirus)과)은 MurA 활성을 방해하고 펩티도글리칸 생합성 과정을 이상 조절 (dysregulating)하여 용해를 일으키는 420개의 아미노산 구조 단백질 (및 아무린)이다 (문헌 [Gorzelnik KV et al., 2016. Proc Natl Acad Sci USA 113:11519-11524]). 다른 비제한적인 예로는 MurJ의 특정 억제제인 파지 M의 LysM 아무린, 이. 콜라이 (E. coli)의 지질 II 플립파아제, 및 75개의 아미노산 내재성 막 단백질이며 숙주 샤페론 DnaJ의 활성을 요구하는 방식으로 용해를 일으키는 파지 MS2의 단백질 L 아무린 (레비비리대과 레비바이러스 (Levivirus)속이 포함된다 (문헌 [Chamakura KR et al., 2017. J Bacteriol 199]). L 유사 아무린에 대한 추정 도메인 구조가 할당되었으며, 10~17개의 소수성 잔기의 스트레치가 바로 앞에 있는 내부 류실세린 디펩타이드를 포함한다. 이러한 아무린은 내재성 막 단백질이며, 리신처럼 정제되고 사용되지 않았다. 또한, 이들의 표적은 세포질에 있다. 이들은 용해제로서 테스트되지 않았다. 일부 아무린은, 예를 들어, 국제공개공보 WO 2001/009382에 상세히 기재되어 있지만, 이들은 기껏해야 치료제 개발을 위한 기초를 구성하고 항균 치료제로 개발되지 않았다.

최근 간행물이 다양한 수준의 생체내 효능으로 그람 음성 세균에 대해 사용될 수 있는 리신/아틸리신 및 다른 숙주 용해 시스템 (예를 들어, 아무린)을 기재하였지만, 침습성 감염의 치료를 위해 MDR 슈도모나스 아에루기노사, 슈도모나스 아에루기노사 및 기타 그람 음성 세균 및 항산성 세균을 표적화하는 추가의 항균 화합물, 특히, 매우 가용성이고 혈청 및/또는 폐 계면 활성제의 존재하에 생체내에서 여전히 활성이고/이거나 용혈 활성을 갖지 않고/않거나 내성에 대한 낮은 경향을 갖는 항균 화합물에 대한 필요성이 여전히 남아 있다.

발명의 개요

본 출원은, 예를 들어, 마이크로비리대 게놈 서열로부터 유래되고 공지된 리신/아틸리신 및 아무린을 비롯한 다른 이러한 제제와는 완전히 다른 신규한 클래스의 파지 용해제를 개시한다. 본 출원에서 개시된 파지 용해제는 "아무린 펩타이드" (아무린과 서열 유사성을 의미하지 않는 기능적 정의)로도 또한 지칭되는 클라미디아 파지 (Chp) 펩타이드로 지칭된다. 특정 용균 단백질 계열 뿐만 아니라 이러한 Chp 펩타이드의 비자연 발생 변형된 변이체 (서열 번호 81~91 및 94~102에 상응함)를 구성하는 확인된 다양한 Chp 펩타이드가 본 출원에서 개시된다. 본 출원에서 사용되는 "Chp 펩타이드"는 야생형 Chp 펩타이드와 비교하여 자연 발생 Chp 펩타이드, 이의 비자연 발생 변형된 변이체, 및 적어도 하나의 변형 (예를 들어, 치환)을 갖는 변형된 Chp 펩타이드 모두를 지칭한다. 본 출원에서 개시된 몇몇 Chp 펩타이드는 서로 주목할만한 서열 유사성을 나타내지만, 서열 데이터베이스에서의 다른 공지된 펩타이드와는 구별된다. Chp 펩타이드의 특유한 서열에도 불구하고, 이들은 모두 이전에 기재된 척추 동물의 선천성 면역계의 일부 항미생물성 펩타이드 (antimicrobial peptide: AMP)와 유사하지만 이러한 AMP와 어떠한 서열 유사성도 갖지 않는 알파 나선형 구조를 채택할 것으로 예상된다 (문헌 [E.F. Haney et al, 2017, In Hansen PR (ed), Antimicrobial Peptides: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology, vol. 1548]). Chp 클래스에 대한 항균 작용과 일치하게, 몇몇의 상이한 정제된 Chp 펩타이드에 대한 그람 음성 병원체 및 항산성 병원체에 대한 강력하고 광범위한 살균 활성이 본 출원에서 개시된다. 외부에서 적용되는 단백질에 의해 용이하게 접근할 수 없는 세포벽 생합성 장치에서 세포질 표적을 갖는 이전에 기재된 마이크로비리대 아무린과는 달리, 본 출원에서 개시된 Chp 펩타이드는 정제된 형태로 사용되어 "외부에서", 즉, 세포벽의 외부에 작용함으로써 살균 활성을 발휘할 수 있다. 본 출원에서 확인된 Chp 펩타이드는 그람 음성 병원체 및 항산성 병원체에 대한 광범위한 스펙트럼 활성과 혈청 및/또는 폐 계면 활성제의 존재하에 지속되는 능력을 갖는 신규한 클래스의 항균제를 나타낸다.

하나의 양태에서, 본 개시 내용은 약제학적으로 허용되는 담체 및 유효량의 (i) 서열 번호 81~91 및 94~102로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 단리된 Chp 펩타이드 또는 이의 활성 단편, 또는 (ii) 서열 번호 81~91 및 94~102 중 적어도 하나의 아미노산 서열과 적어도 80%, 예를 들어, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92.5%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 변형된 Chp 펩타이드로서, 여기서, 상기 변형된 Chp 펩타이드가, 임의로 사람 혈청 및/또는 폐 계면 활성제의 존재하에, 그람 음성 세균 또는 항산성 세균의 적어도 한 종의 성장을 억제하고/하거나 이의 집단을 감소시키고/시키거나 이를 사멸시키는, 변형된 Chp 펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 특정 실시 형태에서, 상기 그람 음성 세균의 적어도 한 종은 슈도모나스 아에루기노사를 포함한다. 특정 실시 형태에서, 상기 항산성 세균의 적어도 한 종은 마이코박테리움의 적어도 한 종을 포함한다. 특정 실시 형태에서, 상기 항산성 세균의 적어도 한 종은 마이코박테리움 투베르쿨로시스를 포함한다. 특정 실시 형태에서, 상기 항산성 세균의 적어도 한 종은 비결핵성 마이코박테리아 (nontuberculous mycobacteria: NTM)를 포함한다.

본 출원에서 개시된 또 다른 실시 형태에서, 상기 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체, 및 펩타이드 Chp2-M1, Chp2-Cys, Chp2-NC, Chp4::Chp2, Chp2-CAV 및 Ecp1-CAV로 이루어진 그룹으로부터 선택된 유효량의 단리된 Chp 펩타이드 또는 이의 활성 단편을 포함한다.

일부 실시 형태에서, 상기 Chp 펩타이드는 Chp2-M1, Chp4-M1, Ecp1-M1, Chp6-M1, Chp10-M1, Unp2-M1, Agt1-M1 또는 Ecp3-M1이다.

본 개시 내용의 다양한 실시 형태에서, 상기 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체 및 유효량의 (i) 서열 번호 81, 서열 번호 82, 서열 번호 83, 서열 번호 84, 서열 번호 85 및 서열 번호 86으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 단리된 Chp 펩타이드 또는 이의 활성 단편, 또는 (ii) 서열 번호 81~86 중 적어도 하나의 아미노산 서열과 적어도 80%, 예를 들어, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92.5%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 변형된 Chp 펩타이드로서, 여기서, 상기 변형된 Chp 펩타이드가, 임의로 사람 혈청 및/또는 폐 계면 활성제의 존재하에, 그람 음성 세균 또는 항산성 세균의 적어도 한 종의 성장을 억제하고/하거나 이의 집단을 감소시키고/시키거나 이를 사멸시키는, 변형된 Chp 펩타이드를 포함한다.

특정 실시 형태에서, 상기 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체 및 유효량의 (i) 서열 번호 81, 서열 번호 87, 서열 번호 88, 서열 번호 89, 서열 번호 91, 서열 번호 97, 서열 번호 100 및 서열 번호 101로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 단리된 Chp 펩타이드 또는 이의 활성 단편, 또는 (ii) 서열 번호 81, 87, 88, 89, 91, 97, 100 및 101 중 적어도 하나의 아미노산 서열과 적어도 80%, 예를 들어, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92.5%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 변형된 Chp 펩타이드로서, 여기서, 상기 변형된 Chp 펩타이드가, 임의로 사람 혈청 및/또는 폐 계면 활성제의 존재하에, 그람 음성 세균 또는 항산성 세균의 적어도 한 종의 성장을 억제하고/하거나 이의 집단을 감소시키고/시키거나 이를 사멸시키는, 변형된 Chp 펩타이드를 포함한다.

특정 실시 형태에서, 본 출원에서 개시된 바와 같은 Chp 펩타이드 또는 이의 활성 단편은 서열 번호 81~91 및 94~102 중 어느 하나, 예를 들어, 서열 번호 94 또는 서열 번호 102의 아미노산 서열에 대해 적어도 하나의 비자연 변형을 포함하고, 특정 실시 형태에서, 상기 비자연 변형은 치환 변형, 예를 들어, 아미노산 치환; N-말단 아세틸화 변형; 및 C-말단 아미드화 변형으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 특정 실시 형태에서, 상기 변형된 Chp 펩타이드는 서열 번호 81~91 및 94~102 중 어느 하나의 아미노산 서열에 대해 적어도 하나의 아미노산 치환, 삽입 또는 결실을 포함하고, 여기서, 상기 변형된 Chp 펩타이드는, 임의로 사람 혈청 및/또는 폐 계면 활성제의 존재하에, 그람 음성 세균 또는 항산성 세균의 적어도 한 종의 성장을 억제하거나 이의 집단을 감소시키거나 이를 사멸시킨다. 특정 실시 형태에서, 상기 그람 음성 세균의 적어도 한 종은 슈도모나스 아에루기노사를 포함한다. 특정 실시 형태에서, 상기 항산성 세균의 적어도 한 종은 마이코박테리움 종을 포함한다. 특정 실시 형태에서, 상기 항산성 세균의 적어도 한 종은 마이코박테리움 투베르쿨로시스를 포함한다. 특정 실시 형태에서, 상기 항산성 세균의 적어도 한 종은 비결핵성 마이코박테리아 (NTM)를 포함한다. 특정 실시 형태에서, 상기 적어도 하나의 아미노산 치환은 보존적 아미노산 치환이다. 특정 실시 형태에서, 서열 번호 81~91 및 94~102 중 어느 하나의 아미노산 서열에 대해 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하는 상기 변형된 Chp 펩타이드는 적어도 하나의 알파 나선 도메인을 갖는 양이온성 펩타이드이다.

일부 실시 형태에서, 상기 약제학적 조성물은 용액, 현탁액, 에멀젼, 흡입성 분말, 에어로졸 또는 스프레이일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 상기 약제학적 조성물은 또한 그람 음성 세균 또는 항산성 세균의 치료에 적합한 하나 이상의 항생제를 포함할 수 있다. 임의로, 상기 Chp1 펩타이드는 상기 약제학적 조성물이 Chp1을 포함하지 않도록 배제된다.

특정 실시 형태에서, (i) 서열 번호 81~91 및 94~102로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 Chp 펩타이드 또는 이의 활성 단편, 또는 (ii) 서열 번호 81~91 및 94~102 중 적어도 하나의 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92.5%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 Chp 펩타이드를 인코딩하는 핵산을 포함하는 벡터가 본 출원에서 개시되며, 여기서, 상기 변형된 Chp 펩타이드는, 임의로 사람 혈청 및/또는 폐 계면 활성제의 존재하에, 그람 음성 세균 또는 항산성 세균의 적어도 한 종의 성장을 억제하고/하거나 이의 집단을 감소시키고/시키거나 이를 사멸시킨다. 특정 실시 형태에서, 상기 그람 음성 세균의 적어도 한 종은 슈도모나스 아에루기노사를 포함한다. 특정 실시 형태에서, 상기 항산성 세균의 적어도 한 종은 마이코박테리움 투베르쿨로시스를 포함한다. 특정 실시 형태에서, 상기 항산성 세균의 적어도 한 종은 비결핵성 마이코박테리아 (NTM)를 포함한다.

(i) 서열 번호 81~91 및 94~102로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 Chp 펩타이드 또는 이의 활성 단편, 또는 (ii) 서열 번호 81~91 및 94~102 중 적어도 하나의 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92.5%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 변형된 Chp 펩타이드를 인코딩하는 핵산을 포함하는 재조합 발현 벡터가 또한 본 출원에서 개시되며, 여기서, 상기 변형된 Chp 펩타이드는, 임의로 사람 혈청 및/또는 폐 계면 활성제의 존재하에, 그람 음성 세균의 적어도 한 종의 성장을 억제하고/하거나 이의 집단을 감소시키고/시키거나 이를 사멸시킨다. 특정 실시 형태에서, 상기 그람 음성 세균의 적어도 한 종은 슈도모나스 아에루기노사를 포함한다. 특정 실시 형태에서, 상기 핵산은 이종 프로모터에 작동적으로 연결된다. 특정 실시 형태에서, 상기 핵산은 서열 번호 81~86으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 Chp 펩타이드 또는 이의 활성 단편을 인코딩하며, 특정 실시 형태에서, 상기 핵산은 서열 번호 81, 서열 번호 87, 서열 번호, 88, 서열 번호 89, 서열 번호 91, 서열 번호 97, 서열 번호 100 및 서열 번호 101로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 Chp 펩타이드 또는 이의 활성 단편을 인코딩한다.

본 출원에서 개시된 추가의 실시 형태는 상술한 벡터를 포함하는 단리된 숙주 세포를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 핵산 서열은 cDNA 서열이다.

더 또 다른 양태에서, 본 개시 내용은 서열 번호 81~91 및 94~102로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 Chp 펩타이드 또는 이의 활성 단편을 인코딩하는 단리되고 정제된 핵산에 관한 것이다. 특정 실시 형태에서, 상기 핵산은 서열 번호 81~86으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 Chp 펩타이드 또는 이의 활성 단편을 인코딩한다. 대안적인 실시 형태에서, 상기 단리되고 정제된 DNA는 서열 번호 81, 87, 88, 89, 91, 97, 100 및 101로 이루어진 그룹으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 임의로, 상기 핵산은 cDNA이다. 특정 실시 형태에서, 상기 뉴클레오타이드 서열은 적어도 하나의 비자연 변형, 예를 들어, 돌연 변이 (예를 들어, 치환, 삽입 또는 결실), 또는 N-말단 변형 또는 C-말단 변형을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다.

다른 양태에서, 본 개시 내용은 다양한 방법/용도에 관한 것이다. 이러한 용도 중 하나는 그람 음성 세균의 적어도 한 종의 성장을 억제하고/하거나 이의 집단을 감소시키고/시키거나 이를 사멸시키는 방법이며, 상기 방법은 상기 세균을, 유효량의 (i) 서열 번호 81~91 및 94~102로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 Chp 펩타이드 또는 이의 활성 단편, 또는 (ii) 서열 번호 81~91 및 94~102 중 적어도 하나와 적어도 80%, 예를 들어, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92.5%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 변형된 Chp 펩타이드를 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하고, 여기서, 상기 Chp 펩타이드는 상기 성장을 억제하고/하거나 상기 집단을 감소시키고/시키거나 상기 그람 음성 세균의 적어도 한 종을 사멸시킨다. 특정 실시 형태에서, 상기 Chp 펩타이드는 서열 번호 81~86으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열 또는 이의 활성 단편을 포함한다.

다른 양태에서, 항산성 세균의 적어도 한 종의 성장을 억제하고/하거나 이의 집단을 감소시키고/시키거나 이를 사멸시키는 방법이 제공되며, 상기 방법은 상기 세균을, 유효량의 (i) 서열 번호 1, 2, 4, 6, 8~16, 18~21, 23~26, 59~61, 63~65, 67, 81~91 및 94~102로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 Chp 펩타이드 또는 이의 활성 단편, 또는 (ii) 서열 번호 1, 2, 4, 6, 8~16, 18~21, 23~26, 59~61, 63~65, 67, 81~91 및 94~102 중 적어도 하나와 적어도 80%, 예를 들어, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92.5%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 변형된 Chp 펩타이드를 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하고, 여기서, 상기 Chp 펩타이드는 상기 항산성 세균의 적어도 한 종의 성장을 억제하고/하거나 이의 집단을 감소시키고/시키거나 이를 사멸시킨다. 특정 실시 형태에서, 상기 Chp 펩타이드는 서열 번호 81, 87, 88, 89, 91, 97, 100 및 101로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열 또는 이의 활성 단편을 포함한다.

특정 실시 형태에서, 상기 그람 음성 세균의 적어도 한 종은 슈도모나스 아에루기노사이고, 특정 실시 형태에서, 상기 방법은 슈도모나스 아에루기노사에 추가하여 그람 음성 세균의 적어도 다른 한 종을 사멸시키는 것을 추가로 포함한다.

특정 실시 형태에서, 상기 항산성 세균의 적어도 한 종은 마이코박테리움 종이며, 특정 실시 형태에서, 상기 마이코박테리움은 마이코박테리움 투베르쿨로시스이다. 특정 실시 형태에서, 상기 항산성 세균의 적어도 한 종은 비결핵 마이코박테리움 종이다. 특정 실시 형태에서, 상기 비결핵 마이코박테리움은 마이코박테리움 스메그마티스 (Mycobactium smegmatis), 마이코박테리움 아비움 (Mycobacterium avium), 마이코박테리움 칸사시 (Mycobacterium kansasii), 마이코박테리움 스크로풀라세움 (Mycobacterium scrofulaceum), 마이코박테리움 페레그리눔 (Mycobacterium peregrinum), 마이코박테리움 마리눔 (Mycobacterium marinum), 마이코박테리움 인트라셀룰라레 (Mycobacterium intracellulare) 및 마이코박테리움 포르투이툼 (Mycobacterium fortuitum) 중 적어도 하나로부터 선택된다. 특정 실시 형태에서, 비결핵 마이코박테리움은 마이코박테리움 스메그마티스 (M. smegmatis)이다.

본 출원에서 개시된 바와 같은 서열 번호 81~91 및 94~102로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 Chp 펩타이드, 이의 활성 단편 또는 이의 변형된 Chp 펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물을, 세균 감염으로 진단되거나 이의 위험에 처해 있거나 이의 증상을 나타내는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 그람 음성 세균에 기인하는 세균 감염을 치료하는 방법이 또한 본 출원에서 개시된다. 본 출원에서 개시된 바와 같은 서열 번호 1, 2, 4, 6, 8~16, 18~21, 23~26, 59~61, 63~65, 67, 81~91 및 94~102로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 Chp 펩타이드, 이의 활성 단편 또는 이의 변형된 Chp 펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물을, 세균 감염으로 진단되거나 이의 위험에 처해 있거나 이의 증상을 나타내는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 항산성 세균에 기인하는 세균 감염을 치료하는 방법이 본 출원에서 추가로 개시된다.

더 또 다른 양태에서, 그람 음성 세균을 포함하는 생물막의 방지, 파괴 또는 제거를 위한 방법이 제공되며, 상기 방법은 (i) 서열 번호 81~91 및 94~102로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 단리된 Chp 펩타이드 또는 이의 활성 단편, 또는 (ii) 서열 번호 81~91 및 94~102 중 적어도 하나의 아미노산 서열과 80%의 서열 동일성을 갖는 변형된 Chp 펩타이드로서, 여기서, 상기 변형된 Chp 펩타이드가 그람 음성 세균의 적어도 한 종의 성장을 억제하거나 이의 집단을 감소시키거나 이를 사멸시키는, 변형된 Chp 펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물을 생물막과 접촉시키는 단계를 포함하고, 상기 생물막은 효과적으로 방지, 파괴 또는 처리된다.

임의의 상기 방법/용도에서, 상기 그람 음성 세균은 스테노트로포모나스 (Stenotrophomonas) 종, 아시네토박터 바우마니, 슈도모나스 아에루기노사, 에세리키아 콜라이, 클렙시엘라 뉴모니아, 엔테로박터 클로아카 (Enterobacter cloacae), 살모넬라 종 (예를 들어, 살모넬라 센프텐베르그 (Salmonella Senftenberg), 살모넬라 엔테리티디스 (Salmonella Enteritidis), 살모넬라 티피무리움 (Salmonella Typhimurium) 및 살모넬라 오슬로 (Salmonella Oslo)), 나이세리아 고노레아, 시트로박터 프룬디 (Citrobacter freundii), 세라티아 마르세센스 (Serratia marcescens), 모르가넬라 모르가니 (Morganella morganii), 라울텔라 오르니티놀리티카 (Raoultella ornithinolytica), 클루이베라 아스코르바타 (Kluyvera ascorbata), 클렙시엘라 옥시토카 (Klebsiella oxytoca), 프로테우스 미라빌리스 (Proteus mirabilis), 엔테로박터 에어로게네스 (Enterbacter aerogenes), 엔테로코커스 패시움 (Enterococcus faecium), 부르크홀데리아 (Burkholderia) 종, 아크로모박터 (Achromobacter) 종 및 시겔라 종으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 그람 음성 세균일 수 있다. 특정 실시 형태에서, 상기 그람 음성 세균은 슈도모나스 아에루기노사이다. 특정 실시 형태에서, 상기 스테노트로포모나스 종은 스테노트로포모나스 말토필리아 (Stenotrophomonas maltophilia)이다.

임의의 상기 방법/용도에서, 상기 항산성 세균은 마이코박테리움 스메그마티스, 마이코박테리움 투베르쿨로시스 및 비결핵 마이코박테리아로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 악티노박테리아일 수 있다.

본 출원에서 개시된 방법/용도의 특정 실시 형태에서, 상기 그람 음성 세균의 적어도 한 종은 그람 음성 세균 감염의 치료에 전형적으로 적합한 하나 이상의 항생제에 대해 내성이다. 특정 실시 형태에서, 상기 그람 음성 세균의 적어도 한 종은 다제내성 (MDR) 병원체이다. 본 출원에서 개시된 바와 같은 서열 번호 81~91 및 94~102로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 Chp 펩타이드, 이의 활성 단편 또는 이의 변형된 Chp 펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물을, 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 그람 음성 세균에 기인하는 국소 또는 전신 병원성 세균 감염을 치료 또는 예방하는 방법이 또한 본 출원에서 개시된다. 특정 실시 형태에서, 본 출원에서 개시된 바와 같은 서열 번호 1, 2, 4, 6, 8~16, 18~21, 23~26, 59~61, 63~65, 67, 81~91 및 94~102로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 Chp 펩타이드, 이의 활성 단편 또는 이의 변형된 Chp 펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물을, 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 항산성 세균에 기인하는 국소 또는 전신 병원성 세균 감염을 치료 또는 예방하는 방법이 본 출원에서 개시된다.

본 출원에서 개시된 바와 같은 서열 번호 81~91 및 94~102로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 Chp 펩타이드, 이의 활성 단편 또는 이의 변형된 Chp 펩타이드를 포함하는 제1 양의 약제학적 조성물과 그람 음성 세균 감염의 치료에 적합한 제2 양의 항생제의 조합을 세균 감염으로 진단되거나 이의 위험에 처해 있거나 이의 증상을 나타내는 대상체에게 공동 투여하는 단계를 포함하는, 세균 감염을 예방하거나 치료하는 방법이 추가로 본 출원에서 개시된다. 본 출원에서 개시된 바와 같은 서열 번호 1, 2, 4, 6, 8~16, 18~21, 23~26, 59~61, 63~65, 67, 81~91 및 94~102로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 Chp 펩타이드, 이의 활성 단편 또는 이의 변형된 Chp 펩타이드를 포함하는 제1 양의 약제학적 조성물과 항산성 세균 감염의 치료에 적합한 제2 양의 항생제의 조합을 상기 항산성 세균 감염으로 진단되거나 이의 위험에 처해 있거나 이의 증상을 나타내는 대상체에게 공동 투여하는 단계를 포함하는, 세균 감염을 예방하거나 치료하는 방법이 또한 본 출원에서 개시된다.

일부 실시 형태에서, 상기 그람 음성 세균 감염의 치료에 적합한 항생제는 암피실린, 세파탁심, 세프트리악손, 미노사이클린, 테트라사이클린, 티게사이클린, 트리메토프림, 설파메톡사졸, 세프타지딤, 세페핌, 세포페라존, 세프토비프롤, 시프로플록사신, 레보플록사신, 아미노글리코사이드, 이미페넴, 메로페넴, 도리페넴, 겐타마이신, 토브라마이신, 아미카신, 피페라실린, 티카르실린, 페니실린, 리팜피신, 폴리믹신 B 및 콜리스틴 중 하나 이상으로부터 선택된다. 특정 실시 형태에서, 상기 항생제는 아미카신, 아지트로마이신, 아즈트레오남, 시프로플록사신, 콜리스틴, 포스포마이신, 겐타마이신, 이미페넴, 피페라실린, 리팜피신 및 토브라마이신 중 하나 이상으로부터 선택된다. 일부 실시 형태에서, 상기 항산성 세균 감염의 치료에 적합한 항생제는 이소니아지드, 리팜핀, 에탐부톨 및 피라진아미드 중 하나 이상으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.

더 또 다른 실시 형태에서, 그람 음성 세균 감염의 치료에 적합한 항생제를 본 출원에서 개시된 바와 같은 서열 번호 81~91 및 94~102로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 Chp 펩타이드, 이의 활성 단편 또는 이의 변형된 Chp 펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물과 조합하여 공동 투여하는 단계를 포함하는, 그람 음성 세균 감염의 치료에 적합한 항생제의 효능을 증대시키는 방법이 개시되며, 여기서, 상기 조합의 투여는 상기 항생제 또는 이의 약제학적 조성물의 개별 투여 보다 그람 음성 세균의 성장을 억제하거나 이의 집단을 감소시키거나 이를 사멸시키는데 더 효과적이다. 항산성 세균 감염의 치료에 적합한 항생제를 본 출원에서 개시된 바와 같은 서열 번호 1, 2, 4, 6, 8~16, 18~21, 23~26, 59~61, 63~65, 67, 81~91 및 94~102로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 Chp 펩타이드, 이의 활성 단편 또는 이의 변형된 Chp 펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물과 조합하여 공동 투여하는 단계를 포함하는, 항산성 세균 감염의 치료에 적합한 항생제의 효능을 증대시키는 방법이 또한 개시되며, 여기서, 상기 조합의 투여는 상기 항생제 또는 이의 약제학적 조성물의 개별 투여 보다 상기 항산성 세균의 성장을 억제하거나 이의 집단을 감소시키거나 이를 사멸시키는데 더 효과적이다.

도 1a는 클라미디아 파지 펩타이드 (Chlamydia phage peptide: Chp) 계열 구성원 Chp1, Chp 2, Chp4, Chp5, Chp6, Chp7, Ecp1, Ecp2 및 Osp1의 구조에 대해 I-테이저 (I-Tasser)에 의해 예측된 3차원 모델이다. 사람의 선천성 면역 이펙터 펩타이드 LL-37이 비교용으로 포함된다. 알파 나선 구조가 분명하며, 상단 말단은 일반적으로 N-말단이다.
도 1b는 JPRED4를 사용하는 Chp2 (서열 번호 2)에 대한 공통 2차 구조 예측을 도시한 것이다. 알파 나선은 두꺼운 줄무늬 막대로 표시된다.
도 1c는 JPRED4를 사용하는 Chp4 (서열 번호 4)에 대한 공통 2차 구조 예측을 도시한 것이다. 알파 나선은 두꺼운 줄무늬 막대로 표시된다.
도 2a는 ClustalW 정렬로부터 생성된 특정 Chp 계열 구성원의 뿌리 내린 (rooted) (UPGMA 클러스터링 방법) 계통수이다.
도 2b는 ClustalW 정렬로부터 생성된 특정 Chp 계열 구성원의 뿌리 뽑힌 (unrooted) (이웃-접합 클러스터링 방법) 계통수이다.
도 3은 100% 사람 혈청에서 Chp2 (10 μg/mL) 또는 완충액 대조군 ("미처리")으로 15분 동안 처리된 슈도모나스 아에루기노사 균주 1292의 현미경 분석 (x2000 배율)을 나타내는 일련의 현미경 사진이다. 생/사 (Live/Dead) 세포 생존력 키트 (ThermoFisher)를 사용하여 샘플을 염색하고, 미분 간섭 대비 (differential interference contrast: DIC) 및 형광 현미경 검사로 검사하였다. 현미경 사진은 미처리된 행 (row)에서 죽은 세균의 부재 및 처리된 행에서 살아있는 세균의 감소를 도시한 것이다.
도 4a는 Survanta® 미처리 및 1 μg/mL, 10 μg/mL 및 100 μg/mL에서 Chp2-M1 처리 후 5분에 슈도모나스 아에루기노사 균주 1292의 대한 현미경 분석 (x2000 배율)을 도시하는 일련의 현미경 사진이다. 생/사 염색제 SYTOX® Green (살아있음) 및 프로피디움 요오다이드 (죽음)를 사용하여 샘플을 염색하고, 명시야 (bright field: BF) 및 형광 현미경 검사법으로 검사하였다. 현미경 사진은 미처리된 행에서 죽은 세균의 부재 및 처리된 행에서 살아있는 세균의 감소를 도시한 것이며, 여기서, 상기 감소는 Chp2-M1의 농도가 증가함에 따라 증가한다.
도 4b는 Survanta® 미처리 및 1 μg/mL, 10 μg/mL 및 100 μg/mL에서 Chp2-M1 처리 후 30분에 슈도모나스 아에루기노사 균주 1292의 대한 현미경 분석 (x2000 배율)을 도시하는 일련의 현미경 사진이다. 생/사 염색제 SYTOX® Green (살아있음) 및 프로피디움 요오다이드 (죽음)를 사용하여 샘플을 염색하고, BF 및 형광 현미경 검사법으로 검사하였다. 현미경 사진은 미처리된 행에서 죽은 세균의 부재 및 처리된 행에서 살아있는 세균의 감소를 도시한 것이며, 여기서, 상기 감소는 Chp2-M1의 농도가 증가함에 따라 증가한다.
도 5a는 Survanta® 미처리 및 1 μg/mL, 10 μg/mL 및 100 μg/mL에서 Ecp3-M1 처리 후 5분에 슈도모나스 아에루기노사 균주 1292의 대한 현미경 분석 (x2000 배율)을 도시하는 일련의 현미경 사진이다. 생/사 염색제 SYTOX® Green (살아있음) 및 프로피디움 요오다이드 (죽음)를 사용하여 샘플을 염색하고, BF 및 형광 현미경 검사법으로 검사하였다. 현미경 사진은 미처리된 행에서 죽은 세균의 부재 및 처리된 행에서 살아있는 세균의 감소를 도시한 것이며, 여기서, 상기 감소는 Ecp3-M1의 농도가 증가함에 따라 증가한다.
도 5b는 Survanta® 미처리 및 1 μg/mL, 10 μg/mL 및 100 μg/mL에서 Ecp3-M1 처리 후 30분에 슈도모나스 아에루기노사 균주 1292의 대한 현미경 분석 (x2000 배율)을 도시하는 일련의 현미경 사진이다. 생/사 염색제 SYTOX® Green (살아있음) 및 프로피디움 요오다이드 (죽음)를 사용하여 샘플을 염색하고, BF 및 형광 현미경 검사법으로 검사하였다. 현미경 사진은 미처리된 행에서 죽은 세균의 부재 및 처리된 행에서 살아있는 세균의 감소를 도시한 것이며, 여기서, 상기 감소는 Ecp3-M1의 농도가 증가함에 따라 증가한다.
도 6a는 사람 혈청 미처리 및 1 μg/mL, 10 μg/mL 및 100 μg/mL에서 Chp2-M1 처리 후 5분에 슈도모나스 아에루기노사 균주 1292의 대한 현미경 분석 (x2000 배율)을 도시하는 일련의 현미경 사진이다. 생/사 염색제 SYTOX® Green (살아있음) 및 프로피디움 요오다이드 (죽음)를 사용하여 샘플을 염색하고, BF 및 형광 현미경 검사법으로 검사하였다. 현미경 사진은 미처리된 행에서 죽은 세균의 부재 및 처리된 행에서 살아있는 세균의 감소를 도시한 것이며, 여기서, 상기 감소는 Chp2-M1의 농도가 증가함에 따라 증가한다.
도 6b는 사람 혈청 미처리 및 1 μg/mL 및 10 μg/mL에서 Chp2-M1 처리 후 30분에 슈도모나스 아에루기노사 균주 1292의 대한 현미경 분석 (x2000 배율)을 도시하는 일련의 현미경 사진이다. 생/사 염색제 SYTOX® Green (살아있음) 및 프로피디움 요오다이드 (죽음)를 사용하여 샘플을 염색하고, BF 및 형광 현미경 검사법으로 검사하였다. 현미경 사진은 미처리된 행에서 죽은 세균의 부재 및 처리된 행에서 살아있는 세균의 감소를 도시한 것이며, 여기서, 상기 감소는 Chp2-M1의 농도가 증가함에 따라 증가한다.
도 7a는 사람 혈청 미처리 및 1 μg/mL, 10 μg/mL 및 100 μg/mL에서 Ecp3-M1 처리 후 5분에 슈도모나스 아에루기노사 균주 1292의 대한 현미경 분석 (x2000 배율)을 도시하는 일련의 현미경 사진이다. 생/사 염색제 SYTOX® Green (살아있음) 및 프로피디움 요오다이드 (죽음)를 사용하여 샘플을 염색하고, BF 및 형광 현미경 검사법으로 검사하였다. 현미경 사진은 미처리된 행에서 죽은 세균의 부재 및 처리된 행에서 살아있는 세균의 감소를 도시한 것이며, 여기서, 상기 감소는 Ecp3-M1의 농도가 증가함에 따라 증가한다.
도 7b는 사람 혈청 미처리 및 1 μg/mL, 10 μg/mL 및 100 μg/mL에서 Ecp3-M1 처리 후 30분에 슈도모나스 아에루기노사 균주 1292의 대한 현미경 분석 (x2000 배율)을 도시하는 일련의 현미경 사진이다. 생/사 염색제 SYTOX® Green (살아있음) 및 프로피디움 요오다이드 (죽음)를 사용하여 샘플을 염색하고, BF 및 형광 현미경 검사법으로 검사하였다. 현미경 사진은 미처리된 행에서 죽은 세균의 부재 및 처리된 행에서 살아있는 세균의 감소를 도시한 것이며, 여기서, 상기 감소는 Ecp3-M1의 농도가 증가함에 따라 증가한다.

정의

본 출원에서 사용되는 다음 용어 및 이의 동의어는, 문맥이 달리 명백하게 명시되지 않는다면, 하기 의미를 가질 것이다:

"담체"는 활성 화합물과 함께 투여되는 용매, 첨가제, 부형제, 분산매, 가용화제, 코팅제, 보존제, 등장화제 및 흡수 지연제, 계면 활성제, 추진제, 희석제, 비히클 등을 지칭한다. 이러한 담체는 물, 생리 식염수, 덱스트로오스 수용액, 글리세롤 수용액과 같은 멸균 액체, 및 석유, 동물, 식물 또는 합성 기원의 오일, 예를 들어, 땅콩유, 대두유, 미네랄 오일, 참기름 등을 비롯한 오일일 수 있다.

"약제학적으로 허용되는 담체"는 생리학적으로 상용 가능한 임의의 및 모든 용매, 첨가제, 부형제, 분산매, 가용화제, 코팅제, 보존제, 등장화제 및 흡수 지연제, 계면 활성제, 추진체, 희석제, 비히클 등을 지칭한다. 상기 담체(들)는 의약에서 전형적으로 사용되는 양으로 치료되는 대상체에게 유해하지 않다는 의미에서 "허용되어야" 한다. 약제학적으로 허용되는 담체는 상기 조성물을 이의 의도된 목적에 부적합하게 하지 않으면서 상기 조성물의 다른 성분과 상용 가능하다. 또한, 약제학적으로 허용되는 담체는 과도한 불리한 부작용 (예를 들어, 독성, 자극 및 알러지 반응) 없이 본 출원에서 제공된 바와 같은 대상체에게 사용하기에 적합하다. 부작용은 이의 위험이 상기 조성물에 의해 제공되는 이익 보다 클 때 "과도하다". 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제의 비제한적인 예로는 포스페이트 완충 생리 식염수, 물 및 에멀전, 예를 들어, 오일/물 에멀젼 및 마이크로에멀젼과 같은 임의의 표준 약제학적 담체가 포함된다. 적합한 약제학적 담체는, 예를 들어, 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences by E.W. Martin, 18th Edition]에 기재되어 있다. 상기 약제학적으로 허용되는 담체는 자연에 존재하지 않는 담체일 수 있다.

"살균성" 또는 "살균 활성"은 18~24 시간에 걸쳐 세균의 초기 집단에서 적어도 3-log10 (99.9%) 이상의 감소 정도까지 세균의 사멸을 유발하거나 세균을 사멸시킬 수 있는 특성을 지칭한다.

"정균성 (bacteriostatic)" 또는 "정균 활성"은 세균 세포의 성장을 억제하고 이에 따라 18~24 시간에 걸쳐 세균의 초기 집단에서 2-log10 (99%) 이상 및 3-log 이하의 감소를 초래하는 것을 포함하는 세균 성장을 억제하는 특성을 지칭한다.

"항균제"는 정균제와 살균제 둘 다를 지칭한다.

"항생제"는 치사율 또는 성장 감소와 같은, 세균에 부정적인 영향을 미치는 특성을 갖는 화합물을 지칭한다. 항생제는 그람 양성 세균, 그람 음성 세균, 항산성 세균 및 비-항산성 세균 중 어느 하나 및 이들의 모든 조합에 부정적인 영향을 미칠 수 있다. 예로서, 항생제는 세포벽 펩티도글리칸 생합성, 세포막 완결성 또는 세균의 DNA 또는 단백질 합성에 영향을 미칠 수 있다. 그람 음성 세균에 대해 활성인 항생제의 비제한적인 예로는 세팔로스포린, 예를 들어, 세프트리악손-세포탁심, 세프타지딤, 세페핌, 세포페라존 및 세프토비프롤; 플루오로퀴놀론, 예를 들어, 시프로플록사신 및 레보플록사신; 아미노글리코사이드, 예를 들어, 겐타마이신, 토브라마이신 및 아미카신; 피페라실린, 티카르실린, 이미페넴, 메로페넴, 도리페넴, 베타-락타마아제 억제제를 함유하거나 함유하지 않는 광범위한 스펙트럼 페니실린, 리팜피신, 폴리믹신 B 및 콜리스틴이 포함된다. 항산성 세균에 대해 활성인 항생제의 비제한적인 예로는 이소니아지드, 리팜핀, 에탐부톨 및 피라진아미드가 포함된다.

"내약성"은 일반적으로 약물의 항균 활성에 대해 내성이 있는 세균을 지칭한다. 특정 방식으로 사용될 때, 내약성은 구체적으로 항생제 내성을 지칭할 수 있다. 일부 경우에서, 일반적으로 특정 항생제에 민감한 세균은 상기 항생제에 대해 내성을 일으켜 내약성 미생물 또는 균주가 될 수 있다. "다제내성" (multi-drug resistant: "MDR") 병원체는 각각 단일 요법으로 사용되는 적어도 2가지 클래스의 항미생물성 약물에 대해 내성을 일으키는 병원체이다. 예를 들어, 스태필로코커스 아우레우스 (S. aureus)의 특정 균주는 메티실린 및/또는 반코마이신을 비롯한 몇몇 항생제에 대해 내성이 있는 것으로 밝혀졌다 (문헌 [Antibiotic Resistant Threats in the United States, 2013, U.S. Department of Health and Services, Centers for Disease Control and Prevention]). 당해 분야의 통상의 기술자는 약물 또는 항생제에 대한 세균의 감수성 또는 내성을 결정하는 일상적인 실험실 기법을 사용하여 세균이 내약성이 있는지 여부를 용이하게 결정할 수 있다.

"유효량"은, 적절한 빈도 또는 투약 방법으로 적용되거나 투여될 때, 세균 성장 또는 세균 부하를 예방, 감소, 억제 또는 제거하거나, 치료되는 장애 (예를 들어, 그람 음성 또는 항산성 세균 병원체 성장 또는 감염)의 발병, 중증도, 지속 기간 또는 진행을 예방, 감소 또는 개선시키거나, 치료되는 장애의 진전을 예방하거나, 치료되는 장애의 퇴행을 유발하거나, 항생제 또는 정균 요법과 같은 또 다른 요법의 예방학적 또는 치료학적 효과(들)를 증진시키거나 개선시키기에 충분한 양을 지칭한다.

"공동 투여"는, 순차적인 방식으로 Chp 펩타이드와 항생제 또는 임의의 다른 항균제와 같은 2가지 제제를 투여하는 것 뿐만 아니라, 실질적으로 동시적인 방식으로, 예를 들어, 대상체에게 단일 혼합물/조성물로, 또는 개별적으로 제공되지만 실질적으로 동시에, 예를 들어, 같은 날 또는 24 시간 내에 상이한 시간에 투여되는 용량으로 이들 제제를 투여하는 것을 지칭한다. Chp 펩타이드와 하나 이상의 추가의 항균제의 이러한 공동 투여는 수일, 수주 또는 수개월까지 지속되는 연속적 치료로서 제공될 수 있다. 또한, 용도에 따라, 상기 공동 투여는 연속적이거나 동시적일 필요는 없다. 예를 들어, 상기 용도가 세균성 궤양 또는 감염된 당뇨병성 궤양을 치료하기 위한 국소 항균제로서인 경우, Chp 펩타이드는 추가의 항생제 후 24 시간 이내에 초기에만 투여될 수 있으며, 이어서, 상기 추가의 항생제 사용은 상기 Chp 펩타이드의 추가 투여 없이 계속될 수 있다.

"대상체"는 포유 동물, 식물, 하등 동물, 단세포 유기체 또는 세포 배양물을 지칭한다. 예를 들어, "대상체"라는 용어는, 세균 감염, 예를 들어, 그람 양성 세균 감염, 그람 음성 세균 감염 또는 항산성 세균 감염에 걸리기 쉽거나 걸린 유기체, 예를 들어, 원핵 생물 및 진핵 생물을 포함하는 것으로 의도된다. 대상체의 예로는 표유 동물, 예를 들어, 사람, 개, 소, 말, 돼지, 양, 염소, 고양이, 마우스, 래빗, 래트 및 형질 전환 비-사람 동물이 포함된다. 특정 실시 형태에서, 상기 대상체는 사람, 예를 들어, 그람 음성 세균 또는 항산성 세균에 의한 감염을 앓고 있거나 앓을 위험에 처해 있거나 이에 걸리기 쉬운 사람이며, 이러한 감염은 전신적이든지 국소적이든지 그 밖에 특별한 장기 또는 조직에 집중되거나 한정되든지에 관계 없다.

"폴리펩타이드"는, 본 출원에서 "펩타이드"라는 용어와 상호 교환적으로 사용되며, 아미노산 잔기로 만들어지고 일반적으로 적어도 약 30개의 아미노산 잔기를 갖는 중합체를 지칭한다. 상기 용어는 변형된 변이체를 비롯하여 단리된 형태의 폴리펩타이드 뿐만 아니라 이의 활성 단편 및 유도체도 포함한다. "폴리펩타이드"라는 용어는 또한 본 출원에서 기재된 바와 같은 Chp 펩타이드를 포함하고, 예를 들어, 용균 기능을 유지하는 융합 단백질 또는 융합 폴리펩타이드를 포괄한다. 문맥에 따라, 폴리펩타이드는 자연 발생 폴리펩타이드, 또는 재조합, 조작 또는 합성으로 생산된 폴리펩타이드일 수 있다. 특별한 Chp 펩타이드는, 예를 들어, 효소적 또는 화학적 절단에 의해 본래의 단백질로부터 유래 또는 제거될 수 있거나, 통상적인 펩타이드 합성 기술 (예를 들어, 고체상 합성) 또는 분자 생물학 기술 (예를 들어, 문헌 [Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)]에 개시된 것들)을 사용하여 제조될 수 있거나, 활성 단편을 생산하여 동일하거나 적어도 하나의 공통 표적 세균에 대해 용균 활성을 유지하도록 전략적으로 절단되거나 분절화될 수 있다.

"융합 폴리펩타이드"는, 2개 이상의 핵산 분절의 융합으로 생성되어 상이한 특성 또는 기능성을 전형적으로 갖는 2개 이상의 도메인 또는 분절을 전형적으로 갖는 융합된 발현 생성물을 생성하는 발현 생성물을 지칭한다. 보다 특별한 의미에서, "융합 폴리펩타이드"라는 용어는 또한 직접적으로 또는 아미노산 또는 펩타이드 링커를 통해 공유적으로 연결된 2개 이상의 이종 폴리펩타이드 또는 펩타이드를 포함하는 폴리펩타이드 또는 펩타이드를 지칭할 수 있다. 상기 융합 폴리펩타이드를 형성하는 폴리펩타이드는 전형적으로는 C-말단에서 N-말단으로 연결되지만, 이들은 또한 C-말단에서 C-말단으로, N-말단에서 N-말단으로, N-말단에서 C-말단으로 연결될 수 있다. "융합 폴리펩타이드"라는 용어는 "융합 단백질"이라는 용어와 상호 교환적으로 사용될 수 있다. 특정 구조를 "포함하는 폴리펩타이드"라는 개방형 표현은 융합 폴리펩타이드와 같은 언급된 구조 보다 더 큰 분자를 포함한다.

"이종"은 자연적으로 인접하지 않은 뉴클레오타이드, 펩타이드 또는 폴리펩타이드 서열을 지칭한다. 예를 들어, 본 개시 내용의 문맥에서, "이종"이라는 용어는 2개 이상의 펩타이드 및/또는 폴리펩타이드의 조합 또는 융합을 기술하기 위해 사용될 수 있으며, 여기서, 상기 융합 펩타이드 또는 폴리펩타이드는 통상적으로, 예를 들어, Chp 펩타이드 또는 이의 활성 단편, 및 증진된 용균 활성을 가질 수 있는 양이온성 및/또는 다가 양이온성 펩타이드, 양친매성 펩타이드, 스시 (sushi) 펩타이드 (문헌 [Ding et al. Cell Mol Life Sci., 65(7-8):1202-19 (2008)]), 디펜신 펩타이드 (문헌 [Ganz, T. Nature Reviews Immunology 3, 710-720 (2003)]), 소수성 펩타이드 및/또는 항미생물성 펩타이드와 같이 자연에서 발견되지 않는다. 2개 이상의 Chp 펩타이드 또는 이의 활성 단편이 이러한 정의에 포함된다. 이들은 용균 활성을 갖는 융합 폴리펩타이드를 제조하는데 사용될 수 있다.

"활성 단편"은, 단편이 취해진 단리된 폴리펩타이드의 하나 이상의 기능 또는 생물학적 활성, 예를 들어, 하나 이상의 그람 음성 세균 또는 항산성 세균에 대한 살균 활성을 보유하는 폴리펩타이드의 일부분을 지칭한다.

"양친매성 펩타이드"는 친수성 작용기와 소수성 작용기 둘 다를 갖는 펩타이드를 지칭한다. 특정 실시 형태에서, 2차 구조는 양친매성 펩타이드의 반대편 (예를 들어, 펩타이드가 물과 같은 용매 중에 있을 때, 내부 대 외부)에 소수성 및 친수성 아미노산 잔기를 배치할 수 있다. 특정 실시 형태에서는 이러한 펩타이드들이 알파-나선 2차 구조와 같은 나선형 2차 구조를 채택할 수 있다.

"양이온성 펩타이드"는 높은 퍼센트의 양으로 하전된 아미노산 잔기를 갖는 펩타이드를 지칭한다. 특정 실시 형태에서, 양이온성 펩타이드는 8.0 이상의 pKa 값을 갖는다. 본 개시 내용의 문맥에서의 "양이온성 펩타이드"라는 용어는 또한 대부분 양으로 하전된 아미노산 잔기, 예를 들어, 라이신 (Lys) 및/또는 아르기닌 (Arg) 잔기로 구성된 합성으로 생성된 펩타이드인 다가 양이온성 펩타이드를 포괄한다. 양으로 하전되지 않은 아미노산 잔기는 중성으로 하전된 아미노산 잔기, 음으로 하전된 아미노산 잔기 및/또는 소수성 아미노산 잔기일 수 있다.

"소수성기"는 물 분자에 대해서는 낮은 친화성을 갖거나 친화성을 갖지 않지만 오일 분자에 대해서는 보다 높은 친화성을 갖는 아미노산 측쇄와 같은 화학기를 지칭한다. 소수성 물질은 수상 또는 수성상에서 낮은 용해성을 갖거나 용해성을 갖지 않는 경향이 있으며, 전형적으로는 무극성이지만 오일상에서 보다 높은 용해성을 갖는 경향이 있다. 소수성 아미노산의 예로는 글리신 (Gly), 알라닌 (Ala), 발린 (Val), 류신 (Leu), 이소류신 (Ile), 프롤린 (Pro), 페닐알라닌 (Phe), 메티오닌 (Met) 및 트립토판 (Trp)이 포함된다.

"증대하는 (augmenting)"은 항미생물 활성과 같은 제제의 활성 정도가 그렇지 않은 것 보다 더 높다는 것을 지칭한다. "증대하는"은 상가 효과 뿐만 아니라 상승 (초상가 (superadditive)) 효과를 포괄한다.

"상승 작용적" 또는 "초상가 작용적"은, 독립적으로 작용하는 2개의 제제의 효과의 합을 초과하는 조합물 중의 2개의 물질에 의해 초래되는 유익한 효과를 지칭한다. 특정 실시 형태에서, 상승 효과 또는 초상가 효과는 독립적으로 작용하는 2개의 제제의 효과의 합을 유의하게, 즉, 통계상으로 유의하게 초과한다. 활성 성분 중 하나 또는 둘 다는, 역치 이하 수준 (subthreshold level), 즉, 활성 물질이 개별적으로 사용되는 경우에 효과가 없거나 매우 제한적인 효과를 생성하는 수준으로 이용될 수 있다. 상기 효과는 본 출원에서 기재된 체커보드 검정 (checkerboard assay)과 같은 검정에 의해 측정될 수 있다.

"치료"는, 사람과 같은 대상체가 직접 또는 간접적으로 장애를 치유하거나 병원체를 박멸시키거나 대상체의 병태를 개선시킬 목적으로 의료 지원을 받는 임의의 과정, 작용, 적용, 요법 등을 지칭한다. 치료는 또한 발병률의 감소, 증상의 경감, 재발의 제거, 재발의 예방, 발병률의 예방, 발병률 위험의 감소, 증상의 개선, 예후의 개선 또는 이들의 조합을 지칭한다. "치료"는 대상체에서 세균의 집단, 성장률 또는 병독성을 감소시켜 대상체의 세균 감염, 또는 장기, 조직 또는 환경의 세균 오염을 제어 또는 감소시키는 것을 추가로 포괄할 수 있다. 따라서, 발병률을 감소시키는 "치료"는, 예를 들어, 대상체든지 환경이든지 간에, 특별한 환경에서 적어도 하나의 그람 음성 세균 또는 항산성 세균의 성장을 억제하는데 효과적일 수 있다. 다른 한편으로는, 이미 확립된 감염의 "치료"는, 심지어 감염 또는 오염의 원인이 되는 그람 음성 세균 및/또는 항산성 세균을 박멸시키는 것을 비롯하여 이의 성장을 억제하거나 이의 집단을 감소시키거나 이를 사멸시키는 것을 지칭한다.

"예방하는"은 세균 감염과 같은 장애의 발병률, 재발, 전염, 발병 또는 확립의 예방을 포함한다. 본 개시 내용이 감염의 확립의 완전한 예방 또는 예방에 한정되도록 의도되는 것은 아니다. 일부 실시 형태에서, 발병이 지연되거나, 후속적으로 걸리는 질병의 중증도 및 질병에 걸리는 기회가 감소되며, 이러한 것들은 예방의 예를 구성한다.

"걸린 질환"은 열병, 패혈증 또는 균혈증의 검출과 같은 임상적 또는 준임상적 증상으로 나타나는 질환 뿐만 아니라, 이러한 병리와 관련된 증상이 아직 나타나지 않을 때, 세균성 병원체 (예를 들어, 배양물 중)의 성장에 의해 검출될 수 있는 질환을 지칭한다.

펩타이드 또는 폴리펩타이드 또는 이의 활성 단편의 문맥에서 "유도체"라는 용어는, 예를 들어, 용균 활성에 실질적으로 불리하게 영향을 미치거나 이를 파괴하지 않는 아미노산 이외의 하나 이상의 화학적 모이어티 (moiety)를 함유하도록 변형된 폴리펩타이드를 포괄하는 것으로 의도된다. 상기 화학적 모이어티는, 예를 들어, 아미노 말단 아미노산 잔기, 카복시 말단 아미노산 잔기 또는 내부 아미노산 잔기를 통해, 상기 펩타이드에 공유적으로 연결될 수 있다. 이러한 개질은 자연적 또는 비자연적일 수 있다. 특정 실시 형태에서, 비자연적 개질은 반응성 모이어티에 보호기 또는 캡핑기의 부가, 항체 및/또는 형광 라벨과 같은 검출 가능 라벨의 부가, 글리코실화의 부가 또는 개질, 또는 PEG (페길화)와 같은 벌킹기 (bulking group)의 부가 및 당해 분야의 통상의 기술자에게 공지된 다른 변경을 포함할 수 있다. 특정 실시 형태에서, 비자연적 개질은 N-말단 아세틸화 및 C-말단 아미드화와 같은 캡핑 개질일 수 있다. Chp 펩타이드에 첨가될 수 있는 예시적인 보호기로는 t-Boc 및 Fmoc가 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 녹색 형광 단백질 (green fluorescent protein: GFP), 적색 형광 단백질 (red fluorescent protein: RFP), 시안 형광 단백질 (cyan fluorescent protein: CFP), 황색 형광 단백질 (yellow fluorescent protein: YFP) 및 mCherry 등과 같지만 이들에 한정되는 것이 아닌 통상적으로 사용되는 형광 라벨 단백질은, Chp 펩타이드에 공유적으로 또는 비공유적으로 결합되거나 세포 단백질의 정상적인 기능을 방해하지 않으면서 Chp 펩타이드에 융합될 수 있는 콤팩트 단백질이다. 특정 실시 형태에서, 형광 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 Chp 폴리뉴클레오타이드 서열의 업스트림 또는 다운스트림에 삽입될 수 있다. 이것은 세포 기능 또는 이에 부착되는 Chp 펩타이드의 기능을 방해하지 않는 융합 단백질 (예를 들어, Chp 펩타이드::GFP)을 생성할 것이다. 단백질에 대한 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 컨쥬게이션이 다수의 약제학적 단백질의 순환 반감기를 연장시키는 방법으로서 사용되어 왔다. 따라서, Chp 펩타이드 유도체의 문맥에서, "유도체"라는 용어는 하나 이상의 PEG 분자의 공유 부착에 의해 화학적으로 변형된 Chp 펩타이드를 포괄한다. 페길화 Chp 펩타이드는, 생물학적 및 치료학적 활성을 유지하면서, 페길화되지 않은 Chp 펩타이드와 비교하여, 연장된 순환 반감기를 나타낼 것으로 예상된다.

"변형된 변이체"는 비자연 발생 변형이 용균 활성을 증진시키거나 상기 Chp 펩타이드의 용균 활성에 실질적으로 부정적인 영향을 미치거나 이를 파괴하지 않는 아미노산 서열에 대해 이루어진 Chp 펩타이드를 지칭한다. 변형된 변이체에 대해 이루어질 수 있는 예시적인 변형으로는 양으로 하전된 아미노산과 같은 Chp 펩타이드의 아미노산을 L-형태에서 D-형태로 변형하는 것; 아미노산 잔기 또는 잔기들을 C-말단 및/또는 N-말단에 부가하는 것; 융합 폴리펩타이드를 형성하는 것; 전하 어레이 변이체를 형성하는 것 (여기서, 아미노산 전하는 재배열됨)이 포함된다.

"아미노산 서열 동일성 퍼센트"는, 최대 서열 동일성 퍼센트를 달성하기 위해 서열을 정렬하고, 필요에 따라 갭을 도입한 후, 임의의 보존적 치환을 서열 동일성의 일부로서 고려하지 않는, 특정 Chp 펩타이드 서열과 같은 기준 폴리펩타이드 서열 내의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열 내의 아미노산 잔기의 백분율을 지칭한다. 아미노산 서열 동일성 퍼센트를 결정하기 위한 정렬은, 예를 들어, BLAST와 같은 공개적으로 이용 가능한 소프트웨어 또는, 예를 들어, DNASTAR로부터 상업적으로 이용 가능한 소프트웨어를 사용하여 당해 분야의 기술 범위 내에 있는 다양한 방법으로 달성될 수 있다. 2개 이상의 폴리펩타이드 서열은 0~100% 동일하거나, 그 사이의 임의의 정수 값일 수 있다. 본 개시 내용의 맥락에서, 2개의 폴리펩타이드는 아미노산 잔기 중 적어도 80% (예를 들어, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 92.5%, 적어도 약 95%, 적어도 98% 또는 적어도 약 99%)가 동일할 때 "실질적으로 동일하다". 본 출원에서 기재된 바와 같은 "아미노산 서열 동일성 퍼센트 (%)"라는 용어는 Chp 펩타이드에도 마찬가지로 적용된다. 따라서, "실질적으로 동일한"이라는 용어는, 본 출원에서 기재된 단리된 Chp 폴리펩타이드 및 펩타이드의 돌연변이되거나 절단되거나 융합되거나 다르게는 서열 변형된 형태 및 이의 활성 단편 뿐만 아니라, 기준 (야생형 또는 다른 온전한) 폴리펩타이드와 비교하여 실질적인 서열 동일성 (예를 들어, 상기에서 언급된 하나 이상의 방법으로 측정될 때, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92.5%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성)을 갖는 폴리펩타이드도 포괄할 것이다.

본 출원에서 사용되는 바와 같이, 2개의 아미노산 서열은 아미노산 잔기 중 적어도 약 80% (예를 들어, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 92.5%, 적어도 95%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99%)가 동일하거나 보존적 치환을 나타낼 때 "실질적으로 상동이다". 본 개시 내용의 폴리펩타이드의 서열들은 본 출원에서 기재된 Chp 펩타이드와 같은 폴리펩타이드의 아미노산 중 하나 이상, 예를 들어, 10% 이하, 15% 이하 또는 20% 이하가 유사한 또는 보존적 아미노산 치환으로 치환될 때 실질적으로 상동이며, 여기서, 상기 생성된 펩타이드는 본 출원에서 개시된 Chp 펩타이드와 같은 기준 폴리펩타이드의 적어도 하나의 활성 (예를 들어, 항균 효과) 및/또는 세균 특이성을 갖는다.

본 출원에서 사용되는 "보존적 아미노산 치환"은 아미노산 잔기가 유사한 전하의 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체되는 치환이다. 유사한 전하의 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 계열은 당해 분야에 정의되어 있다. 이러한 계열들로는 염기성 측쇄 (예를 들어, 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄 (예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 비하전 극성 측쇄 (예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 타이로신, 시스테인), 비극성 측쇄 (예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타-분지형 측쇄 (예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄 (예를 들어, 타이로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)를 갖는 아미노산이 포함된다.

"흡입성 조성물"은 일상 호흡 또는 보조 호흡 동안 또는 이러한 호흡들과 함께 기도로 (예를 들어, 기관기관지내, 폐 및/또는 비강 투여에 의해) 직접 전달하기 위해 제형화되는 본 개시 내용의 약제학적 조성물을 지칭하며, 미립화, 네불라이즈화, 건조 분말 및/또는 에어로졸화된 제형을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

"생물막"은 세균 유도되고/되거나 숙주 유도된 성분으로 구성될 수 있는 수화된 중합체성 매트릭스 중에서 응집하고 표면에 부착하는 세균을 지칭한다. 생물막은 세포가 생물 또는 무생물 표면 상에 서로 부착되는 미생물의 응집체이다. 이러한 부착 세포는 종종 세포외 중합체성 물질 (extracellular polymeric substance: EPS)로 구성되지만 이에 한정되지 않는 매트릭스 내에 매립된다. 점액으로도 또한 지칭되는 생물막 EPS (점액으로서 기재되는 모든 것이 생물막인 것은 아님) 또는 플라크는 일반적으로 세포외 DNA, 단백질 및 다당류로 구성된 중합체성 응집체이다.

"생물막 형성을 방지하는"은 생물막의 발생, 재발, 전염, 발병 또는 확립의 예방을 포함한다. 본 개시 내용이 생물막의 확립의 완전한 예방 또는 예방에 한정되도록 의도되는 것은 아니다. 일부 실시 형태에서, 생물막의 발생이 지연되거나, 생물막의 확립이 감소하거나, 새로운 생물막의 형성 기회가 감소하는 등은 생물막의 방지의 예를 구성한다. 또한, 생물막의 방지는 1) 플랑크톤 세균을 효과적으로 사멸하는 것; 2) 현탁액에서 "지속" 세균 세포, 즉, 대사적으로 불활성이고 항생제에 내성이 있으며 생물막 형성과 매우 관련된 세균을 사멸하는 것; 및/또는 3) "응집", 즉, 단백질 또는 다당류를 통해 서로 부착하는 세균의 능력을 방지하는 것을 포함하는 임의의 기전에 기인할 수 있다.

생물막과 관련한 "제거"는 1) 생물막 내의 지속 세균 (persister bacterial) 세포를 비롯한 생물막 내의 세균을 효과적으로 사멸하는 것, 및 임의로 2) 생물막 매트릭스를 효과적으로 파괴 및/또는 손상시키는 것을 포함한다.

생물막과 관련한 "파괴"는 방지와 제거 사이에 있는 기전을 지칭한다. 파괴되는 생물막은 "개방되거나" 손상될 수 있으며, 이에 따라, 예를 들어, 항생제는 생물막에 보다 용이하게 침투하여 세균을 사멸시킬 수 있다.

특정 세균에 대해 사용하기에 적합한 항생제의 문맥에서의 "적합한"은 내성이 추후에 발생하더라도 이러한 세균에 대해 효과적인 것으로 밝혀진 항생제를 지칭한다.

"외막" 또는 "OM"은 그람 음성 세균의 특징을 지칭한다. 상기 외막은 크게 지질 다당류 (lipopolysaccharide: LPS)로 이루어진 외부 양친매성 리플렛 (leaflet) 및 인지질의 내부 리플렛을 갖는 지질 이중층으로 구성된다. 상기 LPS는 다음 3가지 주요 섹션을 갖는다: 지질 A로 불리는 헥사-아실화 글루코사민계 인지질, 다당류 코어 및 O-항원으로 불리는 확장된 외부 다당류 쇄. 상기 OM은 다음을 포함하는 3가지 주요 상호 작용에 의해 안정화된 비유체 연속체를 제공한다: i) 특히 양이온이 인산기를 중화시키기 위해 존재하는 경우, LPS 분자 서로의 강렬한 결합 (avid binding); ii) 상당히 포화된 아실 쇄의 단단한 패킹; 및 iii) 지질 A 모이어티의 소수성 스태킹 (stacking). 생성된 구조는 소수성 및 친수성 분자 모두에 대한 장벽이다. 상기 OM 아래에서, 펩티도글리칸은 가수 분해 절단에 매우 민감한 박층을 형성한다 - 30~100 마노미터 (nm) 두께이고 최대 40개의 층으로 이루어진 그람 음성 세균의 펩티도글리칸과는 달리, 그람 음성 세균의 펩티도글리칸은 단지 2~3 nm 두께이며 1~3층으로 이루어진다.

마이크로비리대 단계

마이크로비리대과 파지의 구성원은 여러 가지 이유로 항감염체의 잠재적 공급원으로서 특별한 관심 대상일 수 있다. 본 출원에서 개시된 바와 같이, 클라미디아마이크로바이러스 (Chlamydiamicrovirus) 속의 것들 (마이크로바이러스과, 고쿠쇼비리내 (Gokushovirinae) 아과)을 비롯한 이러한 파지의 큰 서브 세트는 보존된 아무린 서열을 갖지 않는 대신에 지금까지 특성화되지 않은 용해 시스템의 기초를 형성하는 것으로 보이는 작은 특성화되지 않은 양이온성 펩타이드를 인코딩하는 것으로 밝혀졌다. 또한, 마이크로비리대과의 박테리오파지는 엔테로박테리아세아에, 슈도모나다세아에 (Pseudomonadaceae) 및 클라미디아세아에 (Chlamydiaceae) 과의 구성원을 비롯하여 의학적으로 관련된 유기체를 감염시킨다 (문헌 [Doore SM et al, 2016. Virology 491:45-55]). 이들은 또한 아무린이 결핍되는 대신에 본 출원에서 개시된 바와 같이 이전에 확인되지 않았거나 이들에 기인한 기능을 갖는 특유의 특성화되지 않은 항균 유사 펩타이드 (아무린 펩타이드라고 호칭됨)를 인코딩한다. 추정되는 항미생물 유사 펩타이드가 이전에 기재된 항미생물성 펩타이드 (AMP)와 유사한 방식으로 작용한다면, 이들은 아무린 및 이들의 세포질 표적으로는 불가능한 방식으로 "외인성 용해"를 가능하게 할 것으로 예측될 것이라고 추론되었다.

모든 주석이 달린 GenBank의 마이크로비리대 게놈 서열에 대한 생물 정보학 분석 (아무린이 결핍되는 파지에 중점을 두고 있음)에 기초하여, 여러 신규 및 합성 오픈 리딩 프레임이 확인되었다. 이들은 다양한 척추 동물의 선천성 면역계로부터의 AMP와 유사한 (하지만, AMP와 상이한 아미노산 서열을 가짐) 예측된 알파 나선 구조를 갖는 작은 양이온성 펩타이드를 인코딩한다. "Chp 펩타이드" 또는 "아무린 펩타이드"로서 총괄하여 지칭되는 이러한 펩타이드들은 주로 클라미디아마이크로바이러스 속에서 및 보다 적게는 고쿠쇼비리내 아과의 다른 관련 구성원에서 발견된다. 예를 들어, 하기 표 1 및 2를 참조한다. 다양한 마이크로비리대 파지 유래의 Chp 펩타이드는 서로 30~100%의 동일성을 나타낼 수 있으며, 단백질 서열 데이터베이스에서 다른 펩타이드와 상동성을 젼혀 갖지 않거나 거의 갖지 않을 수 있다. 예를 들어, 하기 표 3을 참조한다. 또한, 여러 변형된 변이체는 확인된 Chp 펩타이드로부터 유도되었다. Chp 펩타이드가 AMP 유사 활성을 갖는다는 예측에 기초하여, 상기 계열 구성원 및 변형된 변이체는 상이한 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라아제 (Aspartate Aminotransferase: AST) 검정에서 분석을 위해 합성되었다 (Chp2 및 Chp3는 동일한 아미노산 서열임). 사람 혈청의 존재하에 0.25~4 μg/mL의 최소 억제 농도 (minimum inhibitory concentration: MIC) 값에 기초하여, 몇몇 Chp 펩타이드는 테스트된 최대 17개의 공지된 AMP 그룹 (선천성 면역 이펙터 및 이의 유도체 포함)과 비교하여 우수한 혈청 활성을 입증하였다. 여러 Chp 펩타이드는 답토마이신과 같은 다른 공지된 항생제에 대해 억제하는 농도로 폐 계면 활성제 (Survanta®)에서 우수한 활성을 추가로 입증하였다. 또한, 슈도모나스 아에루기노사, 이. 콜라이, 엔테로박터 클로아카 (E. cloacae), 클렙시엘라 뉴모니아 (K. pneumoniae), 아시네토박터 바우마니 (A. baumannii) 및 살모넬라 티피무리움 (S. typhimurium)과 세계 보건 기구 (WHO) 및 질병 통제 센터 (CDC) 우선 순위 목록에 있는 몇몇을 비롯하여 다양한 그람 음성 병원체에 대한 활성이 입증되었다. 유사하게, 항산성 병원균인 마이코박테리움 스메그마티스에 대한 활성은 여러 Chp 펩타이드에 대해 입증되었으며, Chp2-M1은 스테노트로포모나스 말토필리아와 같은스테노트로포모나스 종을 포함하는 생물막에 대해 항생물막 활성을 갖는 것으로 입증되었다.

Chp2, Chp2-M1, Chp4, Chp4-M1, Chp6-M1, Chp10-M1 및 Unp2-M1을 비롯한 여러 Chp 펩타이드의 경우, 그람 음성 감염의 임상 치료에 사용되는 항생제를 비롯한 슈도모나스 아에루기노사, 클렙시엘라 뉴모니아 및/또는 아시네토박터 바우마니에 대해 다양한 11개 범위의 항생제와 시험관 내에서 상승 작용하는 능력이 입증되었다. 또한, Chp2, Chp2-M1, Chp10-M1 및 Chp4는 MBEC 검정 형식 (MBEC = 0.25 μg/mL)에서 강력한 항생물막 활성 및 1 μg/mL 이하의 농도에서 시간-사멸 검정 형식에서 살균 활성을 갖는 것으로 나타났다. 하기 실시예 4 및 5를 참조한다.

전반적으로, 이러한 결과는 숙주 세포 용해의 과정에서 (박테리오파지 생활 주기의 맥락에서) Chp 계열 구성원의 역할 및 그람 음성 병원체 및/또는 항산성 병원체를 표적화하기 위한 광범위한 스펙트럼 항균제로서 정제된 Chp 펩타이드, 변형된 변이체 또는 이의 유도체의 용도와 모두 일치한다. 침습성 감염에 대한 치료제로서 이전에 기재된 AMP의 용도에 대한 1가지 주요 단점은 적혈구에 대한 독성 및 일반화된 막 용해 활성 (즉, 용혈)과 관련이 있다 (문헌 [Oddo A. et al., 2017. Hemolytic Activity of Antimicrobial Peptides. Methods Mol Biol 1548:427-435]). 일반적으로, 이것은 사람 적혈구의 용해를 검출하기 위한 표준화 검정을 사용하여 시험관내에서 테스트될 수 있다. 본 출원에서 개시된 다수의 Chp 펩타이드는, 용혈 활성을 갖는 문헌에 기재된 여러 AMP (및 Triton X-100)와 대조적으로, 사람 적혈구에 대해 용혈 활성을 나타내지 않는다. 특정 실시 형태에서, 본 출원에서 개시된 Chp 펩타이드는 AMP와 비교하여 사람 적혈구에 대해 최소 용혈 활성만을 나타내거나 용혈 활성을 전혀 나타내지 않을 수 있다. 문헌에서 기재된 AMP의 또 다른 단점은 사람 혈액 매트릭스 및 생리학적 염 농도의 존재하에 활성 손실에 관한 것이며 (문헌 [Mohanram H. et al., 2016. Salt-resistant short antimicrobial peptides. Biopolymers 106:345-356]); 실제로, 공지된 AMP의 이러한 효과는 하기 실시예 6 및 표 28에서 입증되는 바와 같이 관찰될 수 있다. 본 출원에서 제공된 데이터는 특정 Chp 펩타이드가 사람 혈청 또는 혈장의 존재하에 활성이고/이거나 생리학적 염 농도를 함유하는 Mueller Hinton 브로쓰 및 카사미노산 배지와 같은 성장 배지에서 활성이다는 것을 입증한다. 이론에 구속시키고자 하는 것은 아니지만, (문헌에서) Chp 펩타이드와 AMP 펩타이드의 활성에서 관찰된 차이는, Chp 펩타이드가 파지로부터 유래하고 AMP가 주로 척추 동물 면역계의 선천성 면역 이펙터를 기반으로 하는 2가지 유형의 작용제의 특유한 공급원에 기인할 수 있는 것으로 믿어진다. Chp 펩타이드의 높은 활성, 혈액 매트릭스에서 Chp 펩타이드의 활성 및/또는 용혈 활성의 부재는 이들을 침습성 질환을 치료하는데 사용하기에 적합하게 만든다. 예를 들어, 특정 실시 형태에서, Chp 펩타이드는 나노 몰 양에서 활성일 수 있다.

요약하면, 병원체 특이적 표적화 리신 치료제는 공지된 MDR 병원체에 인하는 심각한 단일 미생물 감염에 대한 맞춤형 치료법의 역할을 하는 능력을 가질 수 있지만, 다중 미생물 내성 그람 음성 감염 (예를 들어, 특정 복강내 감염 뿐만 아니라 심각한 화상, 수술 및 기타 상처 감염) 및 항산성 세균 감염 (예를 들어, 결핵)에 기인하는 심각한 생명 위협성 감염을 다루기 위한 약제에 대한 미충족 의료 요구가 여전히 존재한다. 본 출원에서 개시된 Chp 펩타이드는 MDR과 일반적으로 관련된 모든 주요 ESKAPE 병원체 (엔테로코커스 패시움, 스태필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus), 클렙시엘라 뉴모니아, 아시네토박터 바우마니, 슈도모나스 아에루기노사 및 엔테로박터)에 대해 강력한 활성을 나타내는 것으로 본 출원에서 나타났으며 다수의 그람 음성 세균 뿐만 아니라 항산성 세균에 대해서도 활성일 것으로 예상되기 때문에 이러한 요구를 충족시키는데 도움이 된다. 특정 실시 형태에서, 본 출원에 개시된 Chp 펩타이드는 예를 들어, 시트로박터 프룬디, 세라티아 마르세센스, 살모넬라 센프텐베르그, 모르가넬라 모르가니, 라울텔라 오르니티놀리티카, 클루이베라 아스코르바타, 클렙시엘라 옥시토카, 프로테우스 미라빌리스, 엔테로박터 에어로게네스, 살모넬라 엔테리티디스, 엔테로코커스 패시움, 살모넬라 티피무리움 및 살모넬라 오슬로의 종으로부터의 MDR 세균주를 비롯한 다른 MDR 세균주에 대해서도 활성일 수 있다. 특정 실시 형태에서, 상기 그람 음성 세균은 이미페넴 내성 세균주와 같은 카바페남 내성 세균주이다. 특정 실시 형태에서, 상기 그람 음성 세균은 렐레박탐 내성 세균주이다. 본 출원에서 개시된 Chp 펩타이드는 활성 리신의 것들에 필적하는 높은 나노 몰 농도에서 활성일 수 있다. 본 출원에서 개시된 Chp 펩타이드는 또한 매우 강력하고 신속한 용균 효과, 생물막 제거 능력, 통상적인 항생제와의 상승 작용 및 서로의 상승 작용, 예를 들어, 2개 이상의 Chp 펩타이드들 사이의 상승 작용의 원인이 될 수 있다.

본 개시 내용의 Chp 펩타이드는 항미생물성 펩타이드의 첨가에 의해 변형될 필요가 없지만, 특정 실시 형태에서, 본 출원에서 개시된 Chp 펩타이드는 융합 단백질에 혼입될 수 있다. 예를 들어, 융합 단백질은 본 출원에서 개시된 Chp 펩타이드 및 리신, 예를 들어, 그람 음성 세균에 대해 활성인 리신을 포함할 수 있거나 2개의 Chp 펩타이드를 포함할 수 있다. 특정 실시 형태에서, 상기 Chp 펩타이드는 링커 서열의 존재 또는 부재하에 리신 또는 제2 Chp 펩타이드의 N-말단 또는 C-말단에 부가될 수 있다. 1개 초과의 용균 분절을 함유하는 융합 폴리펩타이드는 모체 리신 및/또는 모체 Chp 펩타이드의 용균 활성에 긍정적으로 기여할 수 있는 것으로 고려된다.

폴리펩타이드

본 출원에서 입증되고 설명된 바와 같이, 야생형 Chp 펩타이드, 변형된 Chp 펩타이드, 유도체, 변형된 변이체 또는 이의 활성 단편을 비롯하여 본 섹션에서 기재되는 Chp 펩타이드는 본 출원에서 기재된 약제학적 조성물 및 방법에 사용될 수 있다.

일부 실시 형태에서, 상기 Chp 펩타이드는 Chp1 (서열 번호 1), Chp2 (서열 번호 2), CPAR39 (서열 번호 3), Chp3 (서열 번호 54); Chp4 (서열 번호 4), Chp6 (서열 번호 6), Chp7 (서열 번호 7), Chp8 (서열 번호 8), Chp 9 (서열 번호 9), Chp 10 (서열 번호 10), Chp 11 (서열 번호 11), Chp12 (서열 번호 12), Gkh1 (서열 번호 13), Gkh2 (서열 번호 14), Unp1 (서열 번호 15), Ecp1 (서열 번호 16), Tma1 (서열 번호 17), Ecp2 (서열 번호 18), Osp1 (서열 번호 19), Unp2 (서열 번호 20), Unp3 (서열 번호 21), Gkh3 (서열 번호 22), Unp5 (서열 번호 23), Unp6 (서열 번호 24), Spi1 (서열 번호 25), Spi2 (서열 번호 26), Ecp3 (서열 번호 55), Ecp4 (서열 번호 56); Lvp1 (서열 번호 57), Lvp2 (서열 번호 58), ALCES1 (서열 번호 59), AVQ206 (서열 번호 60), AVQ244 (서열 번호 61), CDL907 (서열 번호 62), AGT915 (서열 번호 63), HH3930 (서열 번호 64), Fen7875 (서열 번호 65), SBR77 (서열 번호 66) 및 Bdp1 (서열 번호 67) 중 하나 이상 또는 용균 활성을 갖는 이의 활성 단편으로부터 선택된다.

일부 실시 형태에서, 상기 Chp 펩타이드는 Chp2-M1 (서열 번호 81), Chp2-Cys (서열 번호 82), Chp2-NC (서열 번호 83), Chp4::Chp2 (서열 번호 84), Chp2-CAV (서열 번호 85), Ecp1-CAV (서열 번호 86), Ecp1-M1 (서열 번호 87), Chp6-M1 (서열 번호 88), Chp10-M1 (서열 번호 89), Mse-M1 (서열 번호 90), Chp4-M1 (서열 번호 91), Chp2-SCR1 (서열 번호 92), Chp2-SCR1-M1 (서열 번호 93), Unp4 (서열 번호 94), Chp7-M1 (서열 번호 95), Osp1-M1 (서열 번호 96), Unp2-M1 (서열 번호 97), Unp3-M1 (서열 번호 98), Spi2-M1 (서열 번호 99), Ecp3-M1 (서열 번호 100), Agt1-M1 (서열 번호 101) 및 Myo1 (서열 번호 102) 중 적어도 하나 또는 용균 활성을 갖는 이의 활성 단편으로부터 선택된다.

상기 Chp 펩타이드는 변형된 Chp 펩타이드 또는 이의 활성 단편일 수 있다. 특정 실시 형태에서, 상기 Chp 펩타이드 또는 이의 활성 단편은 서열 번호 1~4, 6~26, 54~66 및 81~102 중 적어도 하나에 대해 적어도 하나의 비자연 발생 변형, 예를 들어, 적어도 하나의 아미노산 치환, 삽입 또는 결실을 포함한다.

본 개시 내용의 변형된 Chp 펩타이드는 전형적으로 Jpred4 (compio.dundee.ac.uk/jpred) 및 Helical Wheel (hael.net/helical.htm)과 같은 다양한 소프트웨어 프로그램을 사용하여 그 존재 또는 부재를 용이하게 결정할 수 있는 α-나선 도메인을 보유하도록 설계된다.

일부 실시 형태에서, α-나선 도메인은 분자의 대부분에 걸쳐 있다. 예를 들어, 도 1의 Chp1 및 Chp4를 참조한다. 일부 실시 형태에서는 α-나선 도메인이 중단되고 (예를 들어, 도 1의 Chp2 참조), 일부 실시 형태에서는 α-나선 도메인이 절단된다 (예를 들어,도 1의 Chp6 및 Osp1 참조). 본 개시 내용의 Chp 펩타이드의 α-나선 도메인은 크기가 약 3 내지 32개의 아미노산, 보다 전형적으로는 약 10 내지 25개의 아미노산 잔기로 다양하다.

본 개시 내용의 변형된 Chp 펩타이드는 전형적으로 기준 Chp 펩타이드의 하나 이상의 기능적 또는 생물학적 활성을 보유한다. 일부 실시 형태에서, 변형은 Chp 펩타이드의 항균 활성을 개선한다. 전형적으로, 변형된 Chp 펩타이드는 기준 Chp 펩타이드와 비교하여 개선된 시험관내 항균 활성 (예를 들어, 완충액 및/또는 배지에서)을 갖는다. 다른 실시 형태에서, 변형된 Chp 펩타이드는 개선된 생체내 항균 활성 (예를 들어, 동물 감염 모델에서)을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 변형은 사람 혈청의 부재 및/또는 존재하에 Chp 펩타이드의 항균 활성을 개선한다.

일부 실시 형태에서, 본 출원에서 개시된 Chp 펩타이드 또는 이의 변이체 또는 활성 단편은, 사람 혈청의 부재 또는 존재하에 또는 이의 부재와 존재 둘 다 하에, 슈도모나스 아에루기노사 및/또는 항산성 세균, 예를 들어, 마이코박테리움 투베르쿨로시스의 적어도 한 종, 및 임의로 그람 음성 세균 또는 항산성 세균의 적어도 다른 한 종의 성장을 억제하거나 이의 집단을 감소시키거나 이를 사멸시킬 수 있다. 일부 실시 형태에서, 본 출원에서 개시된 Chp 펩타이드 또는 이의 변이체 또는 활성 단편은, 폐 계면 활성제의 부재 또는 존재하에 또는 이의 부재와 존재 둘 다 하에, 슈도모나스 아에루기노사 및/또는 항산성 세균, 예를 들어, 마이코박테리움 투베르쿨로시스의 적어도 한 종, 및 임의로 그람 음성 세균 또는 항산성 세균의 적어도 다른 한 종의 성장을 억제하거나 이의 집단을 감소시키거나 이를 사멸시킬 수 있다.

특정 실시 형태에서, 변형된 Chp 펩타이드는 서열 번호 1~4, 6~26, 54~66, 81~91 및 94~102로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 Chp 펩타이드 또는 이의 활성 단편의 아미노산 서열과 적어도 80%, 예를 들어, 적어도 85%, 예를 들어, 적어도 90%, 예를 들어, 적어도 92.5%, 예를 들어, 적어도 95%, 예를 들어, 적어도 98%, 또는, 예를 들어, 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드 서열을 포함하며, 여기서, 상기 변형된 Chp 펩타이드는, 임의로 사람 혈청 및/또는 폐 계면 활성제의 존재하에, 본 출원에서 기재된 바와 같은 그람 음성 세균의 적어도 한 종, 예를 들어, 슈도모나스 아에루기노사, 또는 항산성 세균의 적어도 한 종, 예를 들어, 마이코박테리아를 비롯한 악티노박테리아, 및 임의로 그람 음성 세균 또는 항산성 세균의 적어도 추가의 한 종의 성장을 억제하고/하거나, 이의 집단을 감소시키고/시키거나 이를 사멸시킨다.

일부 실시 형태에서, 상기 Chp 펩타이드는 (i) Chp1 (서열 번호 1), Chp2 (서열 번호 2), CPAR39 (서열 번호 3), Chp3 (서열 번호 54); Chp4 (서열 번호 4), Chp6 (서열 번호 6), Chp7 (서열 번호 7), Chp8 (서열 번호 8), Chp10 (서열 번호 10), Chp11 (서열 번호 11), Ecp1 (서열 번호 16), Ecp2 (서열 번호 18), Ecp3 (서열 번호 55), Ecp4 (서열 번호 56), Osp1 (서열 번호 19), Unp2 (서열 번호 20), Gkh3 (서열 번호 22), Unp5 (서열 번호 23), Unp6 (서열 번호 24), Spi1 (서열 번호 25), Lvp1 (서열 번호 57), ALCES1 (서열 번호 59), AVQ206 (서열 번호 60), CDL907 (서열 번호 62), AGT915 (서열 번호 63) 및 SBR77 (서열 번호 66) 중 적어도 하나 또는 이의 활성 단편, 또는 (ii) 서열 번호 1~4, 6~8, 10, 11, 16, 18, 19, 21~25, 54~57, 59, 60, 62, 63 및 66 중 적어도 하나와 적어도 80%, 예를 들어, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92.5%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 변형된 Chp 펩타이드로부터 선택되고, 여기서, 상기 변형된 Chp 펩타이드는, 임의로 사람 혈청 및/또는 폐 계면 활성제의 존재하에, 슈도모나스 아에루기노사 또는 항산성 세균의 적어도 한 종, 및 임의로 그람 음성 세균 또는 항산성 세균의 적어도 추가의 한 종의 성장을 억제하고/하거나, 이의 집단을 감소시키고/시키거나 이를 사멸시킨다.

일부 실시 형태에서, 상기 Chp 펩타이드는 (i) Chp2-M1 (서열 번호 81), Chp2-Cys (서열 번호 82), Chp2-NC (서열 번호 83), Chp4::Chp2 (서열 번호 84), Chp2-CAV (서열 번호 85), Ecp1-CAV (서열 번호 86), Ecp1-M1 (서열 번호 87), Chp6-M1 (서열 번호 88), Chp10-M1 (서열 번호 89), Chp4-M1 (서열 번호 91), Chp7-M1 (서열 번호 95), Osp1-M1 (서열 번호 96), Unp2-M1 (서열 번호 97), Unp3-M1 (서열 번호 98), Ecp3-M1 (서열 번호 100) 및 Agt1-M1 (서열 번호 101) 중 적어도 하나 이의 활성 단편, 또는 (ii) 서열 번호 81~89, 91, 95~98, 100 및 101 중 적어도 하나와 적어도 80%, 예를 들어, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92.5%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 변형된 Chp 펩타이드로부터 선택되고, 여기서, 상기 변형된 Chp 펩타이드는, 임의로 사람 혈청 및/또는 폐 계면 활성제의 존재하에, 슈도모나스 아에루기노사 또는 항산성 세균의 적어도 한 종, 및 임의로 그람 음성 세균 또는 항산성 세균의 적어도 추가의 한 종의 성장을 억제하고/하거나, 이의 집단을 감소시키고/시키거나 이를 사멸시킨다.

일부 실시 형태에서, 상기 Chp 펩타이드는 (i) Chp2-M1 (서열 번호 81), Chp2-Cys (서열 번호 82), Chp2-NC (서열 번호 83), Chp4::Chp2 (서열 번호 84), Chp2-CAV (서열 번호 85) 및 Ecp1-CAV (서열 번호 86) 중 적어도 하나, 또는 (ii) 서열 번호 81~86 중 적어도 하나와 적어도 80%, 예를 들어, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92.5%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 변형된 Chp 펩타이드로부터 선택되며, 여기서, 상기 변형된 Chp 펩타이드는, 임의로 사람 혈청 및/또는 폐 계면 활성제의 존재하에, 슈도모나스 아에루기노사 또는 항산성 세균의 적어도 한 종의 성장을 억제하고/하거나, 이의 집단을 감소시키고/시키거나 이를 사멸시킨다.

일부 실시 형태에서, 상기 Chp 펩타이드는 (i) Chp2-M1 (서열 번호 81), Ecp1-M1 (서열 번호 87), Chp6-M1 (서열 번호 88), Chp10-M1 (서열 번호 89), Chp4-M1 (서열 번호 91); Unp2-M1 (서열 번호 97); Ecp3-M1 (서열 번호 100); 및 Agt1-M1 (서열 번호 101) 중 적어도 하나 또는 이의 활성 단편, 또는 (ii) 서열 번호 81, 87, 88, 89, 91, 97, 100 및 101 중 적어도 하나와 적어도 80%, 예를 들어, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92.5%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 변형된 Chp 펩타이드로부터 선택되며, 여기서, 상기 변형된 Chp 펩타이드는, 임의로 사람 혈청 및/또는 폐 계면 활성제의 존재하에, 항산성 세균의 적어도 한 종의 성장을 억제하고/하거나, 이의 집단을 감소시키고/시키거나 이를 사멸시킨다.

일부 실시 형태에서, 상기 Chp 펩타이드는 (i) Chp2 (서열 번호 2), Chp3 (서열 번호 54), Chp4 (서열 번호 4), Chp6 (서열 번호 6), Ecp1 (서열 번호 16), and Ecp2 (서열 번호 18) 중 적어도 하나 또는 이의 활성 단편, 또는 (ii) 서열 번호 2, 4, 6, 16 및 18 중 적어도 하나와 적어도 80%, 예를 들어, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92.5%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 변형된 Chp 펩타이드로부터 선택되며, 여기서, 상기 변형된 Chp 펩타이드는, 임의로 사람 혈청 및/또는 폐 계면 활성제의 존재하에, 그람 음성 세균의 적어도 한 종, 예를 들어, 슈도모나스 아에루기노사 및 그람 음성 세균의 적어도 추가의 한 종의 성장을 억제하고/하거나, 이의 집단을 감소시키고/시키거나 이를 사멸시킨다.

특정 실시 형태에서, 상기 Chp 펩타이드는 (i) 서열 번호 2, 서열 번호 4 및 서열 번호 6으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 적어도 하나의 Chp 펩타이드 또는 이의 활성 단편, 또는 (ii) 서열 번호 2, 4 및 6 중 적어도 하나와 적어도 92.5%의 서열 동일성을 갖는 변형된 Chp 펩타이드로부터 선택되며, 여기서, 상기 변형된 Chp 펩타이드는, 임의로 사람 혈청 및/또는 폐 계면 활성제의 존재하에, 그람 음성 세균의 적어도 한 종, 예를 들어, 슈도모나스 아에루기노사, 또는 항산성 세균의 적어도 한 종, 및 그람 음성 세균의 적어도 추가의 한 종의 성장을 억제하고/하거나, 이의 집단을 감소시키고/시키거나 이를 사멸시킨다.

일부 실시 형태에서, 본 개시 내용의 Chp 펩타이드는 화학적으로 변형된 기준 Chp 펩타이드 중 하나의 유도체이다. 화학적 변형으로는 화학적 모이어티의 추가, 새로운 결합의 생성 및 화학적 모이어티의 제거가 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 화학적 변형은 아미노산 측쇄 뿐만 아니라 아미노 또는 카복실 말단을 비롯하여 Chp 펩타이드의 어느 곳에서나 발생할 수 있다. 예를 들어, 특정 실시 형태에서, 상기 Chp 펩타이드는 N-말단 아세틸화 변형을 포함한다. 특정 실시 형태에서, 상기 Chp 펩타이드 또는 이의 활성 단편은 C-말단 아미드화 변형을 포함한다. 이러한 변형들은 Chp 펩타이드에서 1개 초과의 부위에 존재할 수 있다.

또한, Chp 펩타이드 또는 이의 활성 단편의 하나 이상의 측쇄기 또는 말단기는 당해 분야의 통상의 기술자에게 공지된 보호기에 의해 보호될 수 있다.

일부 실시 형태에서, 상기 Chp 펩타이드 또는 이의 활성 단편은 지속 기간 증진 모이어티에 컨쥬게이트된다. 일부 실시 형태에서, 상기 지속 기간 증진 모이어티는 폴리에틸렌 글리콜이다. 폴리에틸렌 글리콜 ( "PEG")은 증진된 지속 기간의 치료학적 폴리펩타이드를 수득하기 위해 사용되었다 (그 전문이 본 출원에 참조로 포함되는 문헌 [Zalipsky, S., Bioconjugate Chemistry, 6:150-165 (1995)], [Mehvar, R., J. Pharm. Pharmaceut. Sci., 3:125-136 (2000)]). PEG 백본, (CH2CH2-0-)n (여기서, n은 반복 단량체의 수이다)은 가요성이고 양친매성이다. Chp 펩타이드 또는 이의 활성 단편과 같은 또 다른 화학 물질에 부착될 때, PEG 중합체 쇄는 이러한 폴리펩타이드를 면역 반응 및 다른 제거 메커니즘으로부터 보호할 수 있다. 결과적으로, 페길화는 약동학을 최적화하고 생체 이용률을 증가시키고 면역원성과 투여량 및/또는 투여 빈도를 감소시켜 효능과 안전성을 개선시킬 수 있다.

특정 실시 형태에서, 상기 Chp 펩타이드는 L-이소형에서 자연적으로 나타나는 양성 아미노산 (아르기닌, 라이신 및 히스티딘)이 D-이소형에서 동일한 아미노산으로 대체된 변형된 변이체이다. D-이소형 아미노산을 함유하는 변이체가 보다 높은 항미생물 활성을 나타낼 수 있다는 것은 사페신 B로부터 유래된 다른 항미생물성 단백질로 나타났다. 예를 들어, 문헌 [Manabe et al., Scientific Reports (2017); DOI:10.1038/srep43384]을 참조한다. 특정 실시 형태에서, 상기 Chp 펩타이드는 아미노산 잔기 또는 잔기들이 C-말단, N-말단, 또는 C-말단과 N-말단 둘 다에 부가된 변형된 변이체이다. 예를 들어, 특정 실시 형태에서, 시스테인이 C-말단 및/또는 N-말단에 부가될 수 있다. 특정 실시 형태에서, 알파-나선에 안정성을 부여하고/하거나 염의 존재하에 활성을 촉진하는 것으로 공지된 잔기가 C-말단 및/또는 N-말단에 부가될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Park et al., Helix stability confers salt resistance upon helical antimicrobial peptides, J. Biol. Chem. (2004); 279(14):13896-901]을 참조한다. 또 다른 실시 형태에서, 상기 Chp 펩타이드는 전하 어레이 변이체인 변형된 변이체이며, 여기서, 상기 아미노산은 양친매성 나선 구조를 유지하기 위해 이의 전하를 기반으로 재정렬되었다. 더 추가의 실시 형태에서, 상기 아미노산 잔기는 스크램블되어 특정 실시 형태에서 대조군 펩타이드로서 역할을 할 수 있는 변형된 변이체를 생성할 수 있다.

일부 실시 형태에서, 본 출원에서 개시된 Chp 펩타이드 및 이의 활성 단편은 그람 음성 세균의 외막을 침투할 수 있다. 이론에 제한되지 않고, 외막의 침투 후, Chp 펩타이드 또는 이의 활성 단편은 세균 세포벽의 주요 구조 성분인 펩티도글리칸을 분해하여 세포 용해를 초래할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 본 출원에서 개시된 Chp 펩타이드 또는 이의 활성 단편은 그람 음성 세균의 음이온성 외막에 대한 결합을 용이하게 하는 양으로 하전된 (및 양친매성) N-말단 및/또는 C-말단 α-나선 도메인을 함유하여 아래에 인접한 펩티도글리칸으로의 전위를 수행한다.

그람 음성 세균의 외막을 침투하는 Chp 펩타이드 또는 이의 활성 단편의 능력은 그 전문이 본 출원에 참조로 포함되는 국제공개공보 WO 2017/049233에 기재된 바와 같은 당해 분야에 공지된 임의의 방법에 의해 평가될 수 있다. 예를 들어, Chp 펩타이드 또는 이의 활성 단편은 그람 음성 세균 및 소수성 화합물과 함께 인큐베이션될 수 있다. 대부분의 그람 음성 세균은 외막의 존재로 인해 소수성 화합물에 대해 내성이 강하므로, 1-N-페닐나프틸아민 (NPN), 크리스탈 바이올렛 또는 8-아닐리노-1-나프탈렌설폰산 (ANS)과 같은 소수성제의 흡수를 허용하지 않는다. NPN은 대체로 온전한 그람 음성 세균에 의해 배제되지만, NPN의 증진된 흡수가 손상되거나 투과성 외막을 갖는 세포에서 일어날 수 있다. NPN은 소수성 조건하에 강하게 형광을 내고 수성 조건하에 약하게 형광을 낸다. 그러므로, NPN의 세균 외피의 막 인지질과의 상호 작용은 형광 신호를 증가시키며, 손상된 세균 막의 지표 및 외막 투과성의 측정으로서 사용될 수 있다.

보다 구체적으로는, 외벽을 침투하는 Chp 펩타이드 또는 이의 활성 단편의 능력은 활성에 대해 검사되는 Chp 펩타이드 또는 이의 활성 단편의 존재하에 그람 음성 세균, 예를 들어, 슈도모나스 아에루기노사 균주 PA01과 함께, 예를 들어, NPN을 인큐베이션함으로써 평가될 수 있다. Chp 펩타이드 (음성 대조군)의 부재하에 방출되는 형광과 비교하여 보다 높은 형광 유도는 외막 침투를 나타낸다. 또한, 형광 유도는 외막 투과의 수준을 평가하기 위해 에틸렌 디아민 테트라아세테이트 (EDTA)와 같은 확립된 투과제 (permeabilizing agent) 또는 슈도모나스 아에루기노사의 치료에 사용되는 최후 수단의 항생제, 즉, 폴리믹신 B (PMB)와 같은 항생제와 비교될 수 있다.

예를 들어, (1) 문헌 [Mohamed et al., A short D-enantiomeric antimicrobial peptide with potent immunomodulatory and antibiofilm activity against multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter baumannii, Scientific Reports 2017; 6953(7):1-13]; (2) 문헌 [Lv et al., Antimicrobial Properties and Membrane-Active Mechanism of a Potential -Helical Antimicrobial Derived from Cathelicidin PMAP-36, PLoS One 2014; 9:e86364]; (3) 문헌 [Wang et al., High specific selectivity and Membrane-Active Mechanism of the synthetic centrosymmetric -helical peptides with Gly-Gly pairs, Scientific Reports 2015; 15963(5):1-19]; 및 (4) 문헌 [Shao et al., Symmetrical Modification of Minimized Dermaseptins to Extend the Spectrum of Antimicrobials with Endotoxin Neutralization Potency, International J. Mol. Sci. 2019; 1417(20)]과 같은 문헌 전반에 걸친 여러 프로토콜은 NPN 및 아무린 펩타이드를 사용하는 다양한 작용 연구 방법을 자세히 설명한다. 따라서, 상기 문헌에 기초하여, 특정 대조군 펩타이드가 사용되고 본 출원에서 개시된 Chp 펩타이드와 비교될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Lv et al. 2014]은 신속한 (예를 들어, 수분 이내) 막 파괴 및 NPN 흡수의 빠른 증가를 유발하는 봉독 펩타이드인 멜리틴을 개시하고 있다. 문헌 [Wang et al. 2015]은 막 파괴 및 NPN 흡수를 유발하는 사람의 선천성 면역 분자인 LL-37을 개시하고 있다. 또한, 강력한 막 파괴 활성을 갖는 공지된 펩타이드인 콜리스틴, 및 Chp5와 같은 본 출원에서 개시된 Chp 펩타이드의 하전 역전된 변이체는, 예를 들어, 본 출원에 개시된 펩타이드의 Chp의 작용 기전 연구를 촉진하기 위해 대조군으로 사용될 수 있다.

그람 음성 세균의 외막을 파괴하는 Chp 펩타이드의 능력은, 예를 들어, EC₅₀, 또는 세균 샘플이 10분에 외막으로 50% 최대 NPN 혼입을 갖는 농도를 측정함으로써 평가될 수 있다. Chp 펩타이드 Chp2, Chp2-M1 및 Chp10-M1이 그람 음성 세균 (슈도모나스 아에루기노사, 엔테로박터 클로아카, 클렙시엘라 뉴모니아, 이. 콜라이 및 아시네토박터 바우마니 포함)의 외막을 투과하는 능력에 대해 테스트되었을 때, 콜리스틴, LL37 및 멜리틴과 동등한 외막 투과성의 용량 의존적 증가가 관찰되었다. 따라서, 특정 실시 형태에서, 그람 음성 세균이 본 출원에서 개시된 바와 같은 Chp 펩타이드와 접촉될 때, 그람 음성 세균은 콜리스틴, LL-37 또는 멜리틴과 같은 대조군 펩타이드에 노출된 그람 음성 세균의 EC₅₀에 필적하거나 이보다 작은 EC₅₀을 나타낼 수 있는데, 이는 본 출원에서 개시된 Chp 펩타이드가 슈도모나스 아에루기노사, 엔테로박터 클로아카, 클렙시엘라 뉴모니아, 이. 콜라이 및 아시네토박터 바우마니를 비롯한 그람 음성 세균의 외막의 증가된 NPN 흡수 및 투과 퍼센트를 허용한다는 것을 나타낸다.

본 명세서에 개시된 Chp 펩타이드의 작용 기전은 또한 그람 음성 세균의 내막의 탈분극을 측정함으로써 평가될 수 있다. 상기 내막은 카디오리핀, 포스파티딜글리세롤 및 포스파티딜세린과 같은 수산화 인지질을 포함한다. 이는 본 출원에 개시된 Chp 펩타이드를 포함하는 양이온성 펩타이드의 결합을 향상시키는 것으로 여겨지는 생리학적 pH에서 순 음전하를 생성한다. 외막의 투과시, 세포질 막 전위 구배 (ΔΨ)의 손실을 유도하는 Chp 펩타이드의 능력은, 예를 들어, 미처리된 대조군과 비교하여 시간의 함수로서 3,3'-디프로필티아디카보시아닌 (diSC₃-5)의 방출에 따라 검사될 수 있다. DiSC₃-5는 세균 내막 내에 농축된 갇힌 양이온인 형광단이며 세균막 전위 구배의 영향을 받는다. 높은 농도에서, diSC₃-5는 자체 소멸되어 형광의 억제를 초래한다. 내막이 열화되거나 양성자를 포함한 양이온에 대해 누출될 때, ΔΨ이 손실되어 diSC₃-5의 방출 및 후속적인 형광의 증가를 초래한다. LL-37 및 멜리틴과 같은 대조군 펩타이드는 ΔΨ을 손실시키는 것으로 나타났으며, 다양한 그람 음성 세균에서 본 출원에서 개시된 Chp 펩타이드의 손실 가능성을 평가하기 위한 비교로서 사용될 수 있다. Chp 펩타이드 Chp2, Chp2-M1 및 Chp10-M1이 그람 음성 세균 (슈도모나스 아에루기노사, 엔테로박터 클로아카, 클렙시엘라 뉴모니아, 이. 콜라이 및 아시네토박터 바우마니 포함)의 내막을 탈분극하는 능력에 대해 테스트되었을 때, 멜리틴, LL37, RI-18 및 PMBN과 동등하거나 이보다 우수한 막 탈분극의 용량 의존적 증가가 관찰되었다. 이론에 구속시키고자 하는 것은 아니지만, Chp 펩타이드의 내막에 대한 흡착 및 결합과 지질 이중층으로의 삽입은 막 투과 및 기공/이온 채널 형성을 초래하며, 이는 막의 전위 붕괴와 동시에 발생한다.

본 출원에서 개시된 Chp 펩타이드에 기인하는 그람 음성 세균의 외막 및 내막에 대한 손상은 또한 프로피디움 요오다이드와 같은 불투과성 염료로 평가될 수 있다. 프로피디움 요오다이드가 아무린 펩타이드에 의해 손상된 세균 막을 가로지르고 DNA에 삽입되고 형광 신호를 방출하는 능력을 평가하기 위한 프로토콜은, 예를 들어, 문헌 [Mohamed et al. 2017]; [Wang et al. 2015]; [Kwon et al., Mechanism of action of antimicrobial peptide P5 truncation against Pseudomonas aeruginosa and Staphyloccus aureus, AMB Express 2019; 9:122]; 및 [Nagant et al., Identification of Peptides Derived from the Human Antimicrobial Peptide LL-37 Active against Biofilms Formed by Pseudomonas aeruginosa Using a Library of Truncated Fragments, Antimicrob. Agents Chemo. 2012; 56:5698-5708]을 비롯하여 당해 분야에 공지되어 있다. NPN과 마찬가지로, 프로피디움 요오다이드의 EC₅₀은 주어진 시간 후에 Chp 펩타이드와 접촉된 그람 음성 세균에서 측정되고, 미처리되거나, 예를 들어, 콜리스틴, LL-37 또는 멜리틴과 같은 대조군 펩타이드와 접촉된 그람 음성 세균의 EC₅₀과 비교될 수 있다. Chp 펩타이드 Chp2, Chp2-M1 및 Chp10-M1이 그람 음성 세균 (슈도모나스 아에루기노사, 엔테로박터 클로아카, 클렙시엘라 뉴모니아, 이. 콜라이 및 아시네토박터 바우마니 포함)에서 프로피디움 요오다이드의 흡수를 증진시키는 능력에 대해 테스트되었을 때, 세포 외피 투과성의 용량 의존적 증가는 콜리스틴, LL37 및 멜리틴과 동등하였다

추가로, 본 출원에서 개시된 Chp 펩타이드의 작용 기전은 주사 전자 현미경 검사 (canning Electron Microscopy: SEM) 및 투과 전자 현미경 경사 (Transmission Electron Microscopy: TEM) 기법의 사용을 통해 평가될 수 있다. 위에서 논의한 바와 같이 Chp 펩타이드와 접촉할 때 박테리아 막의 빠른 투과 및 탈분극으로 인해 막 손상은 SEM 및 TEM을 통해 시각화될 수 있다. SEM 및 TEM 이미지는 본 출원에서 개시된 Chp 펩타이드가 많은 공지된 리신과 마찬가지로 "막 기포"의 출현에 이어서 막의 용해로 표시될 수 있다는 것을 입증한다. 슈도모나스 아에루기노사와의 Chp 펩타이드 (8 μg/mL) 접촉 후 대략 2분에 촬영된 TEM 및 SEM 이미지는 세균 막 상의 다중 돌출부 (bulge) 형성 뿐만 아니라 세포막의 기공 형성 및 분해의 출현을 나타낸다. 슈도모나스 아에루기노사와의 Chp 펩타이드 (8 μg/mL) 접촉 후 대략 5분에 촬영된 TEM 및 SEM 이미지는 세포막 분해, 높은 전자 밀도의 세포질 물질의 응축, 스페로플라스트 형성 및 기공 형성과 함께 막 돌출부의 지속적 형성을 나타낸다. 슈도모나스 아에루기노사와의 Chp 펩타이드 (8 μg/mL) 접촉 후 대략 20분에 촬영된 TEM 및 SEM 이미지는 기공 형성의 복수의 예 및 세포내 내용물이 없는 유령 세포의 출현을 나타낸다. 종합해 보면, 상기 TEM 및 SEM 이미지는 본 출원에서 개시된 Chp 펩타이드와의 접촉으로 인한 막 용해가 막 기포 형성 또는 돌출부 형성, 기공 형성 및 세포 용해를 포함하는 3단계 과정을 통해 일어나서 섬유상 물질의 방출을 초래할 수 있다는 것을 입증한다.

일부 실시 형태에서, 본 출원에서 개시된 Chp 펩타이드 또는 이의 활성 단편은 사람 혈청의 존재 및/또는 부재하에 용균 활성을 나타낸다. 사람 혈청에서 Chp 펩타이드 또는 이의 활성 단편의 활성을 평가하는 적합한 방법은 당해 분야에 공지되어 있으며 실시예에 기재되어 있다. 간단히 말하자면, MIC 값 (즉, 대조군과 비교하여 세균 성장의 적어도 80%를 억제하기에 충분한 펩타이드의 최소 농도)이 Chp 펩타이드 또는 이의 활성 단편에 대해 결정될 수 있으며, 예를 들어, 사람 혈청에서 불활성인 화합물, 예를 들어, T4 파지 라이소자임 또는 아틸리신 GN126과 비교될 수 있다. T4 파지 라이소자임은, 예를 들어, Sigma-Aldrich, Inc.로부터 상업적으로 입수 가능하다. GN126은 문헌에 기재되어 있고 AMP SMAP-29를 GN 리신 KZ144에 융합시켜 수득된 Art-175에 상응한다. 그 전문이 본 출원에 참조로 포함되는 문헌 [Briers et al. 2014, Antimicrob, Agents Chemother. 58:3774-3784]을 참조한다.

일부 실시 형태에서, 본 출원에서 개시된 Chp 펩타이드 또는 이의 활성 단편은 폐 계면 활성제의 존재 및/또는 부재하에 용균 활성을 나타낸다. 폐 계면 활성제에서 Chp 펩타이드 또는 이의 활성 단편의 활성을 평가하는 적합한 방법은 당해 분야에 공지되어 있으며 실시예에 기재되어 있다. 사람 혈청에서 활성을 평가할 때와 같이, MIC 값이 폐 계면 활성제 또는 적합한 대체물 (예를 들어, Survanta®)에서 Chp 펩타이드 또는 이의 활성 단편에 대해 결정되고, 임의로, 폐 계면 활성제 및 /또는 Survanta®, 예를 들어, 답토마이신에서 감소된 활성을 나타내는 화합물과 비교될 수 있다.

보다 구체적으로, Chp 펩타이드 또는 이의 활성 단편에 대한 MIC 값은 다양한 표준 및 비표준 배지, 예를 들어, Mueller-Hinton 브로쓰 (MHB), 사람 혈청 또는 Survanta®로 보충된 MHB, 전분을 함유하지 않은 MHB (MHBns), 생리학적 염 농도를 포함하는 본 출원에서 기재된 바와 같은 CAA, 사람 혈청 또는 Survanta®로 보충된 CAA, Tween 80®, 예를 들어, 0.002% Tween 80®으로 보충된 CAA (CAA_T), 전분 또는 소고기 추출물로 보충된 CAA_T, 변형 RPMI, Dulbecco의 변형 이글 배지 (Dulbecco's Modified Eagle Medium: DMEM) 및 트립신 분해성 대두 브로쓰에서, 예를 들어, 실험실 균주 슈도모나스 아에루기노사 PA01 및 CFS-1292를 비롯한 특정 세균에 대해 결정될 수 있다. 대부분의 임상 분리주와 달리, PA01은 사람 혈액 매트릭스의 항균 활성에 민감하지 않기 때문에, PA01의 사용은 상승된 혈청 농도의 존재하에 테스트를 가능하게 한다. 예를 들어, 실험실 균주 마이코박테리움 스메그마티스 MC²155; 약독화된 마이코박테리움 투베르쿨로시스 (Zopf) Lehmann 및 Neumann ATCC® 균주 35818, 25177, 35817 및 35818; 및 비결핵 마이코박테리움 균주, 예를 들어, 마이코박테리움 아비움 균주 Chester (ATCC® 700898), 마이코박테리움 칸사시 균주 Hauduroy (ATCC® 12478), 마이코박테리움 스크로풀라세움 균주 Prissick 및 Masson (ATCC® 19981), 마이코박테리움 페레그리눔 균주 Kusunoki 및 Ezaki (ATCC® 700686), 마이코박테리움 마리눔 균주 Aronson (ATCC® 927), 마이코박테리움 인트라셀룰라레 균주 (Cuttino 및 McCabe) Runyon (ATCC® 13950) 및 마이코박테리움 포르투이툼 아종 포르투이툼 다 코스타 크루즈 (fortuitum da Costa Cruz) (ATCC® 6841)를 비롯한 다른 세균이 또한 Chp 펩타이드 또는 이의 활성 단편에 대한 MIC 값을 결정하는데 사용될 수 있다.

일부 실시 형태에서, 본 출원에서 개시된 Chp 펩타이드 또는 이의 활성 단편은 생물막을 감소시킬 수 있다. Chp 펩타이드 또는 이의 활성 단편의 최소 생물막 제거 농도 (Minimal Biofilm Eradicating Concentration: MBEC)를 평가하는 방법은 수정된 브로쓰 미량 희석 MIC 방법의 변형을 사용하여 결정될 수 있다 (그 전문이 본 출원에 참조로 포함되는 문헌 [Ceri et al. 1999. J. Clin Microbial. 37:1771-1776] 및 그 전문이 본 출원에 참조로 포함되는 문헌 [Schuch et al., 2017, Antimicrob. Agents Chemother. 61, pages 1-18] 참조). 이러한 방법에서, 예를 들어, ATCC 17647와 같은 스태필로코커스 아우레우스 균주의 새로운 콜로니를 배지, 예를 들어, TSBg (0.2% 글루코오스로 보충된 트립신 분해성 대두 브로쓰)로, 예를 들어, 1:100 희석된 포스페이트 완충 용액 (phosphate buffer solution: PBS)) 중에 현탁시키고, Calgary 생물막 장치 (96 폴리카보네이트 페그를 갖는 뚜껑이 있는 96웰 플레이트; lnnovotech Inc.)에, 예를 들어, 0.15 ml 분취량으로 첨가하고, 예를 들어, 37℃에서 24 시간 인큐베이션한다. 그 다음, 생물막을 세척하고, 예를 들어, 37℃에서 24 시간 동안 TSBg 중에서, 예를 들어, 2배 희석 시리즈의 리신으로 처리한다. 처리 후, 웰을 세척하고, 예를 들어, 37℃에서 공기 건조시키고, 예를 들어, 0.05% 크리스탈 바이올렛으로 10분 동안 염색한다. 염색 후, 상기 생물막을, 예를 들어, 33% 아세트산 중에서 탈염색하고, 예를 들어, 추출된 크리스탈 바이올렛의 OD600을 측정한다. 각 샘플의 MBEC는 크리스탈 바이올렛 정량화에 의해 평가된 생물막 바이오 매스의 적어도 95%를 제거하는데 필요한 최소 Chp 펩타이드 농도이다.

일부 실시 형태에서, 본 출원에서 개시된 Chp 펩타이드 또는 이의 활성 단편은 사람 혈청 및/또는 폐 계면 활성제의 존재 및/또는 부재하에 항생제의 최소 억제 농도 (MIC)를 감소시킨다. MIC를 평가하는 임의의 공지된 방법을 사용할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 항생제 농도에 대한 Chp 펩타이드 또는 이의 활성 단편의 효과를 결정하기 위해 체커보드 검정을 사용한다. 체커보드 검정은 브로쓰 미량 희석에 의한 MIC 결정을 위한 CLSI 방법의 수정에 기반한다 (그 전문이 본 출원에 참조로 포함되는 문헌 [Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI), CLSI. 2015. Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria That Grow Aerobically; Approved Standard-10th Edition. Clinical and Laboratory Standards Institute, Wayne, PA] 및 또한 그 전문이 본 출원에 참조로 포함되는 문헌 [Ceri et al. 1999. J. Clin. Microbiol. 37: 1771-1776] 참조).

체커보드는, 예를 들어, 96-웰 폴리프로필렌 미세 역가 플레이트의 열 (column)을 먼저 생성함으로써 구성되며, 여기서, 각 웰은 수평 축을 따라 2배 희석된 동량의 항생제를 갖는다. 별개의 플레이트에서, 각 웰이 수직 축을 따라, 예를 들어, 2배 희석된 동량의 Chp 펩타이드 또는 이의 활성 단편을 갖는 필적하는 행을 생성한다. 그 다음, Chp 펩타이드 또는 이의 활성 단편과 항생제 희석물을 합하여, 각 열은 일정량의 항생제 및 Chp 펩타이드의 2배 희석물을 갖는 반면에, 각 행은 일정량의 Chp 펩타이드 및 항생제의 2배 희석물을 갖도록 한다. 따라서, 각 웰은 Chp 펩타이드과 항생제의 독특한 조합물을 갖는다. 세균을 약물 조합물에, 예를 들어, 사람 혈청 또는 폐 계면 활성제의 존재 또는 부재하에 CAA 중 1x10⁵ GFU/ml의 농도로 첨가한다. 그 다음, 단독 및 조합물로서의 각 약물의 MIC를, 예를 들어, 주위 공기 중에 37℃에서 16 시간 후에 기록한다. 각 약물에 대해 분획 억제 농도 합산 (summation fractional inhibitory concentrations) (∑FIC)을 계산하고, 최소 ∑FIC값 (∑FICmin)을 사용하여 Chp 펩타이드/항생제 조합물의 효과를 결정한다.

일부 실시 형태에서, 본 출원에서 개시된 Chp 펩타이드 또는 이의 활성 단편은 적혈구에 대해 낮은 독성을 나타낸다. 당해 분야에 공지된 임의의 방법을 사용하여 본 발명의 Chp 펩타이드 또는 이의 활성 단편의 용혈 활성에 대한 잠재력을 평가할 수 있다.

폴리뉴클레오타이드

Chp 펩타이드 및 이의 활성 단편

하나의 양태에서, 본 개시 내용은 용균 활성을 갖는 Chp 펩타이드 또는 이의 활성 단편을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. 본 출원에서 사용되는 "용균 활성"은, 예를 들어, 사람 혈청의 존재 또는 부재하에 그람 음성 세균 (예를 들어, 슈도모나스 아에루기노사)의 외막 또는 항산성 세균 (예를 들어, 마이코박테리움 투베르쿨로시스)의 세포벽을 침투함으로써, 세균을 사멸시키거나 세균의 집단을 감소시키거나 세균의 성장을 억제하는 Chp 펩타이드의 능력을 포괄한다. 용균 활성은 또한 사람 혈청의 존재 및/또는 부재하에 생물막을 제거하거나 감소시키는 능력 및/또는 항생제의 최소 억제 농도 (MIC)를 감소시키는 능력을 포괄한다.

특정 실시 형태에서, 상기 핵산 분자는 (i) 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4, 서열 번호 6, 서열 번호 7, 서열 번호 8, 서열 번호 9, 서열 번호 10, 서열 번호 11, 서열 번호 12, 서열 번호 13, 서열 번호 14, 서열 번호 15, 서열 번호 16, 서열 번호 17, 서열 번호 18, 서열 번호 19, 서열 번호 20, 서열 번호 21, 서열 번호 22, 서열 번호 23, 서열 번호 24, 서열 번호 25, 서열 번호 26, 서열 번호 54, 서열 번호 55, 서열 번호 56, 서열 번호 57, 서열 번호 58, 서열 번호 59, 서열 번호 60, 서열 번호 61, 서열 번호 62, 서열 번호 63, 서열 번호 64, 서열 번호 65 및 서열 번호 66으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 Chp 펩타이드 또는 이의 활성 단편을 인코딩한다.

특정 실시 형태에서, 상기 핵산 분자는 (i) 서열 번호 81, 서열 번호 82, 서열 번호 83, 서열 번호 84, 서열 번호 85, 서열 번호 86, 서열 번호 87, 서열 번호 88, 서열 번호 89, 서열 번호 90, 서열 번호 91, 서열 번호 92, 서열 번호 93, 서열 번호 94, 서열 번호 95, 서열 번호 96, 서열 번호 97, 서열 번호 98, 서열 번호 99, 서열 번호 100, 서열 번호 101 및 서열 번호 102로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 Chp 펩타이드 또는 이의 활성 단편을 인코딩한다.

특정 실시 형태에서, 상기 핵산 분자는 서열 번호 81, 서열 번호 82, 서열 번호 83, 서열 번호 84, 서열 번호 85 및 서열 번호 86으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 Chp 펩타이드 또는 이의 활성 단편을 인코딩한다. 특정 실시 형태에서, 상기 핵산 분자는 서열 번호 81, 서열 번호 87, 서열 번호 88, 서열 번호 89, 서열 번호 91, 서열 번호 97, 서열 번호 100 및 서열 번호 101로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 Chp 펩타이드 또는 이의 활성 단편을 인코딩한다.

특정 실시 형태에서, 상기 핵산 분자는 (i) 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4, 서열 번호 6, 서열 번호 7, 서열 번호 8, 서열 번호 9, 서열 번호 10, 서열 번호 11, 서열 번호 12, 서열 번호 14, 서열 번호 16, 서열 번호 17, 서열 번호 18, 서열 번호 19, 서열 번호 20, 서열 번호 21, 서열 번호 22, 서열 번호 23, 서열 번호 24, 서열 번호 25, 서열 번호 54, 서열 번호 55, 서열 번호 56, 서열 번호 57, 서열 번호 58, 서열 번호 59, 서열 번호 60, 서열 번호 62, 서열 번호 63, 서열 번호 64, 서열 번호 65 및 서열 번호 66으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 Chp 펩타이드 또는 이의 활성 단편을 인코딩한다.

특정 실시 형태에서, 상기 핵산 분자는 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4, 서열 번호 6, 서열 번호 7, 서열 번호 8, 서열 번호 10, 서열 번호 11, 서열 번호 16, 서열 번호 18, 서열 번호 19, 서열 번호 20, 서열 번호 22, 서열 번호 23, 서열 번호 24, 서열 번호 25, 서열 번호 54, 서열 번호 55, 서열 번호 56, 서열 번호 57, 서열 번호 59, 서열 번호 60, 서열 번호 62, 서열 번호 63 및 서열 번호 66으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 Chp 펩타이드 또는 이의 활성 단편을 인코딩하고, 특정 실시 형태에서, 상기 핵산은 서열 번호 2, 서열 번호 4, 서열 번호 6, 서열 번호 16, 서열 번호 18 및 서열 번호 54로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 Chp 펩타이드 또는 이의 활성 단편을 인코딩한다.

일부 실시 형태에서, 본 개시 내용의 단리된 폴리펩타이드는 변형된 Chp 펩타이드, 예를 들어, 기준 Chp 펩타이드와 비교하여 하나 이상의 삽입, 결실 및/또는 아미노산 치환을 포함하는 Chp 펩타이드를 인코딩하는 핵산을 포함한다. 이러한 기준 Chp 펩타이드는 서열 번호 1~4, 6~26, 54~66 및 81~102 중 어느 하나를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 변형된 Chp 펩타이드는 서열 번호 1~4, 6~26, 54~66 및 81~102로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 기준 Chp 펩타이드와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는다.

일부 실시 형태에서, 본 개시 내용의 핵산 분자는 본 출원에서 개시된 Chp 펩타이드 또는 변형된 Chp 펩타이드의 활성 단편을 인코딩한다. "활성 단편"이라는 용어는 기준 펩타이드의 하나 이상의 생물학적 활성을 보유하는 전장 Chp 펩타이드의 일부를 지칭한다. 따라서, 본 출원에서 사용되는 바와 같은 Chp 펩타이드 또는 변형된 Chp 펩타이드의 활성 단편은, 사람 혈청 및/또는 폐 계면 활성제의 부재 또는 존재하에 또는 이의 부재와 존재 둘 다 하에, 슈도모나스 아에루기노사 및/또는 항산성 세균의 적어도 한 종 및 임의로 본 출원에서 기재된 바와 같은 그람 음성 세균 또는 항산성 세균의 적어도 한 종의 성장을 억제하거나 이의 집단을 감소시키거나 이를 사멸시킨다. 전형적으로, 활성 단편은 α-나선 도메인을 보유한다. 특정 실시 형태에서, 활성 단편은 α-나선 도메인을 보유하는 양이온 성 펩타이드이다.

벡터 및 숙주 세포

또 다른 양태에서, 본 개시 내용은 본 출원에서 개시된 임의의 Chp 펩타이드 또는 이의 활성 단편을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드 또는 본 단리된 폴리뉴클레오타이드의 상보적 서열을 포함하는 벡터에 관한 것이다. 일부 실시 형태에서, 상기 벡터는 플라스미드 또는 코스미드이다. 다른 실시 형태에서, 벡터는 추가의 DNA 분절이 바이러스 게놈에 연결될 수 있는 바이러스 벡터이다. 일부 실시 형태에서, 상기 벡터는 도입되는 숙주 세포에서 자율적으로 복제될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 상기 벡터는 숙주 세포로 도입시 숙주 세포의 게놈 내로 통합될 수 있으므로 숙주 게놈과 함께 복제될 수 있다.

일부 실시 형태에서, 본 출원에서 "재조합 발현 벡터" 또는 "발현 벡터"로서 지칭되는 특별한 벡터는 이들이 작동적으로 연결되어 있는 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 폴리뉴클레오타이드 서열은 또 다른 뉴클레오타이드 서열과 기능적 관계로 배치될 때 "작동적으로 연결되어" 있다. 예를 들어, 2개의 서열이 작동적으로 연결되어 있거나, 프로모터 또는 조절 DNA 서열이 코딩 또는 구조적 DNA 서열의 발현 수준에 영향을 미치도록 위치하는 경우, 상기 프로모터 또는 조절 DNA 서열은 RNA 및/또는 단백질을 코딩하는 DNA 서열에 "작동적으로 연결되어" 있다고 한다. 작동적으로 연결된 DNA 서열은 전형적으로는 연속적이지만 반드시 그런것은 아니다.

일부 실시 형태에서, 본 개시 내용은 (i) 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4, 서열 번호 6, 서열 번호 7, 서열 번호 8, 서열 번호 9, 서열 번호 10, 서열 번호 11, 서열 번호 12, 서열 번호 13, 서열 번호 14, 서열 번호 15, 서열 번호 16, 서열 번호 17, 서열 번호 18, 서열 번호 19, 서열 번호 20, 서열 번호 21, 서열 번호 22, 서열 번호 23, 서열 번호 24, 서열 번호 25, 서열 번호 26, 서열 번호 54, 서열 번호 55, 서열 번호 56, 서열 번호 57, 서열 번호 58, 서열 번호 59, 서열 번호 60, 서열 번호 61, 서열 번호 62, 서열 번호 63, 서열 번호 64, 서열 번호 65 및 서열 번호 66으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 Chp 펩타이드 또는 이의 활성 단편을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터에 관한 것이다.

일부 실시 형태에서, 본 개시 내용은 (i) 서열 번호 81, 서열 번호 82, 서열 번호 83, 서열 번호 84, 서열 번호 85, 서열 번호 86, 서열 번호 87, 서열 번호 88, 서열 번호 89, 서열 번호 90, 서열 번호 91, 서열 번호 92, 서열 번호 93, 서열 번호 94, 서열 번호 95, 서열 번호 96, 서열 번호 97, 서열 번호 98, 서열 번호 99, 서열 번호 100, 서열 번호 101 및 서열 번호 102로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 Chp 펩타이드 또는 이의 활성 단편을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터에 관한 것이다.

일부 실시 형태에서, 본 개시 내용은 서열 번호 81, 서열 번호 82, 서열 번호 83, 서열 번호 84, 서열 번호 85 및 서열 번호 86으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 Chp 펩타이드 또는 이의 활성 단편을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터에 관한 것이다. 일부 실시 형태에서, 본 개시 내용은 서열 번호 81, 서열 번호 87, 서열 번호 88, 서열 번호 89, 서열 번호 91, 서열 번호 97, 서열 번호 100 및 서열 번호 101로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 Chp 펩타이드 또는 이의 활성 단편을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터에 관한 것이다.

특정 실시 형태에서, 상기 벡터는 (i) 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4, 서열 번호 6, 서열 번호 7, 서열 번호 8, 서열 번호 9, 서열 번호 10, 서열 번호 11, 서열 번호 12, 서열 번호 14, 서열 번호 16, 서열 번호 17, 서열 번호 18, 서열 번호 19, 서열 번호 20, 서열 번호 21, 서열 번호 22, 서열 번호 23, 서열 번호 24, 서열 번호 25, 서열 번호 54, 서열 번호 55, 서열 번호 56, 서열 번호 57, 서열 번호 58, 서열 번호 59, 서열 번호 60, 서열 번호 62, 서열 번호 63, 서열 번호 64, 서열 번호 65 및 서열 번호 66으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 Chp 펩타이드 또는 이의 활성 단편을 인코딩하는 핵산 분자를 포함한다.

특정 실시 형태에서, 상기 벡터는 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4, 서열 번호 6, 서열 번호 7, 서열 번호 8, 서열 번호 10, 서열 번호 11, 서열 번호 16, 서열 번호 18, 서열 번호 19, 서열 번호 20, 서열 번호 22, 서열 번호 23, 서열 번호 24, 서열 번호 25, 서열 번호 54, 서열 번호 55, 서열 번호 56, 서열 번호 57, 서열 번호 59, 서열 번호 60, 서열 번호 62, 서열 번호 63 및 서열 번호 66으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 Chp 펩타이드 또는 이의 활성 단편을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하고, 특정 실시 형태에서, 상기 벡터는 서열 번호 2, 서열 번호 4, 서열 번호 6, 서열 번호 16, 서열 번호 18 및 서열 번호 54로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 Chp 펩타이드 또는 이의 활성 단편을 인코딩하는 핵산 분자를 포함한다.

일반적으로, 숙주에서 폴리펩타이드를 유지하거나 증식시키거나 발현시키기에 적합한 임의의 시스템 또는 벡터는 본 출원에서 개시된 Chp 펩타이드 또는 이의 활성 단편의 발현에 사용될 수 있다. 적절한 DNA/폴리뉴클레오타이드 서열은, 예를 들어, 문헌 [Sambrook et al., eds., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd Ed.), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory (2001)]에 제시된 것들과 같은 임의의 다양한 널리 공지되어 있는 일상적인 기술에 의해 발현 시스템 내로 삽입될 수 있다. 추가로, 태그, 예를 들어, c-myc, 비오틴, 폴리-His 등이 또한 Chp 펩타이드 또는 이의 활성 단편에 첨가되어 편리한 단리 방법을 제공할 수 있다. 이러한 발현 시스템을 위한 키트는 상업적으로 이용 가능하다.

매우 다양한 숙주/발현 벡터 조합이 본 출원에서 개시된 Chp 펩타이드 또는 이의 활성 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 발현하는데 사용될 수 있다. 다수의 적합한 벡터는 당해 분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있으며 상업적으로 이용 가능하다. 적합한 벡터의 예는, 예를 들어, 문헌 [Sambrook et al, eds., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd Ed.), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory (2001)]에 제공되어 있다. 이러한 벡터로는, 특히, 염색체, 에피솜 및 바이러스 유래 벡터, 예를 들어, 세균 플라스미드, 박테리오파지, 트랜스포손, 효모 에피솜, 삽입 요소, 효모 염색체 요소, 바이러스, 예를 들어, 바큘로바이러스, 파포바바이러스, 예를 들어, SV40, 백시니아 바이러스, 아데노바이러스, 계두 바이러스, 가성 광견병 바이러스 및 레트로바이러스로부터 유래된 벡터, 및 이들의 조합으로부터 유래된 벡터, 예를 들어, 플라스미드와 박테리오파지 유전 요소, 예를 들어, 코스미드 및 파지미드로부터 유래된 벡터가 포함된다.

또한, 벡터는 본 개시 내용의 Chp 펩타이드 또는 이의 활성 단편의 항시성 또는 유도성 발현을 제공할 수 있다. 적합한 벡터로는 SV40의 유도체 및 공지된 세균 플라스미드, 예를 들어, 이. 콜라이 플라스미드 colE1, pCR1, pBR322, pMB9 및 이들의 유도체, 플라스미드, 예를 들어, RP4, pBAD24 및 pBAD-TOPO; 파지 DNAS, 예를 들어, 파지 A의 수많은 유도체, 예를 들어, NM989, 및 기타 파지 DNA, 예를 들어, M13 및 섬유상 단일 가닥 파지 DNA; 효모 플라스미드, 예를 들어, 2D 플라스미드 또는 이의 유도체; 진핵 세포에서 유용한 벡터, 예를 들어, 곤충 또는 포유 동물 세포에서 유용한 벡터; 플라스미드 및 파지 DNA의 조합으로부터 유래된 벡터, 예를 들어, 파지 DNA 또는 다른 발현 제어 서열을 사용하도록 변형된 플라스미드 등이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 상기에서 언급된 벡터의 다수는 New England Biolabs Inc., Addgene, Takara Bio Inc., ThermoFisher Scientific Inc. 등과 같은 판매 회사로부터 상업적으로 이용 가능하다.

또한, 벡터는 다양한 조절 요소 (프로모터, 리보솜 결합 부위, 터미네이터, 인핸서, 발현 수준을 조절하기 위한 다양한 시스-요소 포함)를 포함할 수 있으며, 여기서, 상기 백터는 숙주 세포에 따라 작제된다. 임의의 매우 다양한 발현 제어 서열 (여기에 작동적으로 연결된 폴리뉴클레오타이드 서열의 발현을 제어하는 서열)이 본 개시 내용의 Chp 펩타이드 또는 이의 활성 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 발현하기 위해 이들 벡터에서 사용될 수 있다. 유용한 제어 서열로는 SV40, CMV, 백시니아, 폴리오마 또는 아데노바이러스의 초기 또는 후기 프로모터, lac 시스템, trp 시스템, TAC 시스템, TRC 시스템, LTR 시스템, 파지 A의 주요 작동유전자 및 프로모터 영역, fd 피막 단백질의 제어 영역, 3-포스포글리세레이트 키나아제 또는 다른 당분해 효소에 대한 프로모터, 산 포스파타아제 (예를 들어, Pho5)의 프로모터, 효모 접합 인자의 프로모터, 세균에서의 발현을 위한 이. 콜라이 프로모터, 및 원핵 세포 또는 진핵 세포 또는 이들의 바이러스의 유전자 발현을 제어하는 것으로 공지된 기타 프로모터 서열, 및 이들의 다양한 조합이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 전형적으로, Chp 펩타이드 또는 이의 활성 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열은 이종 프로모터 또는 조절 요소에 작동적으로 연결되어 있다.

또 다른 양태에서, 본 개시 내용은 본 개시 내용의 Chp 펩타이드 또는 이의 활성 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 발현 벡터를 포함하는 본 출원에서 개시된 임의의 벡터를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다. 매우 다양한 숙주 세포가 본 발명의 폴리펩타이드를 발현하는데 유용하다. 본 발명의 폴리펩타이드의 발현에 적합한 숙주 세포의 비제한적 예로는, 널리 공지된 진핵 및 원핵 숙주, 예를 들어, 이. 콜라이, 슈도모나스, 바실러스, 스트렙토마이세스의 균주, 진균, 예를 들어, 효모, 및 동물 세포, 예를 들어, CHO, Rl.l, B-W 및 L-M 세포, 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (예를 들어, COS 1, COS 7, BSC1, BSC40 및 BMT10), 곤충 세포 (예를 들어, Sf9) 및 조직 배양물 중의 사람 세포 및 식물 세포가 포함된다. 상기 발현 숙주는 임의의 공지된 발현 숙주 세포일 수 있지만, 전형적인 실시 형태에서는 상기 발현 숙주가 이. 콜라이 균주 중 하나이다. 이들로는 Top10 (ThermoFisher Scientific, Inc.), DH5a (Thermo Fisher Scientific, Inc.), XLI-Blue (Agilent Technologies, Inc.), SCSllO (Agilent Technologies, Inc.), JM109 (Promega, Inc.), LMG194 (ATCC) 및 BL21 (Thermo Fisher Scientific, Inc.)과 같은 상업적으로 이용 가능한 이. 콜라이 균주가 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.

최적 환경 조건하의 배가 시간이 약 20분인 신속한 성장 동력학 (문헌 [Sezonov et al., J. Bacterial. 189 8746-8749 (2007)]), 용이하게 달성된 고밀도 배양, 외인성 DNA에 의한 용이하고 신속한 형질 전환 등을 비롯하여, 이. 콜라이를 숙주 시스템으로서 사용하는 몇 가지 이점이 있다. 플라스미드 선택 뿐만 아니라 균주 선택을 비롯한 이. 콜라이에서의 단백질 발현에 관한 세부 사항은 문헌 [Rosano, G. and Ceccarelli, E., Front Microbial., 5: 172 (2014)]에 상세히 논의되어 있다.

본 Chp 펩타이드 또는 이의 활성 단편의 효율적인 발현은 최적의 발현 신호 (전사 및 번역의 수준 둘 다에서), 정확한 단백질 폴딩 및 세포 성장 특징과 같은 다양한 요인에 좌우된다. 벡터를 작제하는 방법 및 작제된 재조합 벡터를 숙주 세포에 형질 도입하는 방법과 관련하여, 당해 분야에 공지된 통상적인 방법을 이용할 수 있다. 모든 벡터, 발현 제어 서열 및 숙주가 본 개시 내용의 Chp 펩타이드 또는 이의 활성 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 발현하는데 동등하게 잘 기능하지 않을 것으로 이해되지만, 당해 분야의 통상의 기술자는 본 개시 내용의 범위를 벗어나지 않으면서 목적하는 발현을 달성하기 위한 과도한 실험 없이 적절한 벡터, 발현 제어 서열 및 숙주를 선택할 수 있을 것이다.

본 개시 내용의 Chp 펩타이드 또는 이의 활성 단편은 암모늄 설페이트 또는 에탄올 침전, 산 추출, 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 포스포셀룰로오스 크로마토그래피, 소수성 상호 작용 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 하이드록실아파타이트 크로마토그래피 및 렉틴 크로마토그래피를 비롯하여 널리 공지된 방법에 의해 재조합 세포 배양물로부터 회수 및 정제될 수 있다. 고성능 액체 크로마토그래피도 또한 Chp 펩타이드 정제에 사용될 수 있다.

대안으로, 본 개시 내용의 Chp 펩타이드 또는 활성 단편의 생산에 사용되는 벡터 시스템은 무세포 발현 시스템일 수 있다. Promega, LifeTechnologies, Clonetech 등으로부터 이용 가능한 것들을 비롯한 다양한 무세포 발현 시스템이 상업적으로 이용 가능하지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.

상기에서 나타낸 바와 같이, 단백질 생산 및 정제에 관하여 다양한 선택이 존재한다. 단백질 생산 및 정제에 고려되는 적합한 방법 및 전략의 예는 그 전문이 본 출원에 참조로 포함되는 국제공개공보 WO 2017/049233에서 제공되며, 문헌 [Structural Genomics Consortium et al., Nat. Methods., 5(2): 135-146 (2008)]에서 추가로 제공된다.

약제학적 조성물

본 개시 내용의 조성물은 용액, 현탁액, 에멀젼, 정제, 환제, 펠렛, 캡슐, 액체를 함유하는 캡슐, 분말, 지효성 제형, 좌제, 탐폰 적용 에멀젼, 에어로졸, 스프레이, 현탁액, 로젠지, 트로키, 캔디, 주사제, 츄잉검, 연고, 스미어 (smear), 지속 방출 (time-release) 패치, 액체 흡수 와이프 및 이들의 조합의 형태를 취할 수 있다.

본 개시 내용의 조성물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 형태의 투여는 국소 (즉, 약제학적 조성물은 이의 작용이 필요한 곳에 직접 (예를 들어, 상처에 직접) 적용된다) 또는 전신일 수 있다. 결국, 전신 투여는 장내 또는 경구 (즉, 조성물은 소화관을 통해 제공 될 수 있다), 비경구 (즉, 조성물은 주사 또는 흡입과 같은 소화관 이외의 경로에 의해 제공될 수 있다)일 수 있다. 따라서, 본 개시 내용의 Chp 펩타이드 및 이를 포함하는 조성물은 경구로, 비경구로, 흡입으로, 국소로, 직장으로, 비강으로, 협측으로, 이식된 저장소를 통해, 또는 임의의 공지된 다른 방법에 의해 대상체에게 투여될 수 있다. 본 개시 내용의 Chp 펩타이드 또는 이의 활성 단편은 또한 지효성 투여 형태 (dosage form)에 의해 투여될 수 있다.

경구 투여의 경우, 본 개시 내용의 Chp 펩타이드 또는 이의 활성 단편은 고체 또는 액상 제제, 예를 들어, 정제, 캡슐제, 분말제, 용액, 현탁액 및 분산물로 제형화될 수 있다. 조성물을, 예를 들어, 락토오스, 수크로오스, 옥수수 전분, 젤라틴, 감자 전분, 알긴산 및/또는 마그네슘 스테아레이트와 같은 부형제와 함께 제형화할 수 있다.

정제 및 환제와 같은 고체 조성물을 제조하는 경우, 본 개시 내용의 Chp 펩타이드 또는 이의 활성 단편을 약제학적 부형제와 혼합하여 고체 예비 제형 조성물을 형성할 수 있다. 원하는 경우, 정제를 표준 기술에 의해 당 코팅하거나 장용 코팅할 수 있다. 정제 또는 환제를 코팅하거나 다르게는 배합하여 연장된 작용의 이점을 제공하는 투여 형태를 제공할 수 있다. 예를 들어, 정제 또는 환제는 내부 투여 및 외부 투여 성분을 포함할 수 있으며, 후자는 전자를 덮는 외피의 형태이다. 상기 2개의 성분은 장용층에 의해 분리될 수 있으며, 이러한 장용층은 위에서 분해에 저항하고 내부 성분을 십이지장으로 온전히 통과하도록 하거나 방출이 지연되도록 하는 역할을 한다. 다양한 물질이 이러한 장용층 또는 코팅물에 사용될 수 있으며, 이러한 물질로는 다수의 중합체 산, 및 중합체 산과 셸락, 세틸 알코올 및 셀룰로오스 아세테이트와 같은 물질의 혼합물이 포함된다.

본 개시 내용의 국소 조성물은 약제학적으로 또는 생리학적으로 허용되는 담체, 예를 들어, 피부학적으로 또는 귀에 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 피부학적으로 허용되는 담체의 경우, 이러한 담체는 피부, 손톱, 점막, 조직 및/또는 모발과 상용 가능하며, 이러한 요건들을 충족하는 통상적으로 사용되는 임의의 피부학적 담체를 포함할 수 있다. 귀에 허용되는 담체의 경우, 이러한 담체는 귀의 모든 부분과 상용 가능할 수 있다. 이러한 담체는 당해 분야의 통상의 기술자에 의해 용이하게 선택될 수 있다. 본 개시 내용의 조성물의 국소 투여를 위한 담체로는 미네랄 오일, 액체 석유, 백색 석유, 프로필렌 글리콜, 폴리옥시에틸렌 및/또는 폴리옥시프로필렌 화합물, 유화 왁스, 소르비탄 모노스테아레이트, 폴리소르베이트 60, 세틸 에스테르 왁스, 세테아릴 알코올, 2-옥틸도데칸올, 벤질 알코올 및 물이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 피부 연고의 제형화에서, 본 개시 내용의 활성 성분은, 예를 들어, 유성 탄화수소 기제, 무수 흡수 기제, 유중수 흡수 기제, 수중유 물 제거 기제 및/또는 수용성 기제로 제형화될 수 있다. 귀 조성물의 제형화에서, 본 개시 내용의 활성 성분은, 예를 들어, 덱스트란, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리비닐피롤리돈, 폴리사카라이드 겔, 젤라틴 검, 예를 들어, Gelrite®, 셀룰로스 중합체, 예를 들어, 하이드록시프로필 메틸셀룰로스, 및 카복시 함유 중합체, 예를 들어, 아크릴산의 중합체 또는 공중합체 뿐만 아니라 다른 중합체 완화제와 같은 담체를 포함하는 수성 중합체 현탁액으로 제형화될 수 있다. 본 개시 내용에 따른 국소 조성물은 수성, 수성-알콜성 또는 유성 용액; 로션 또는 혈청 분산물; 수성, 무수 또는 유성 겔; 수성상 중 지방상의 분산 (OAV 또는 수중유) 또는 반대로 지방상 중 수성상의 분산 (W/O 또는 유중수)에 의해 수득된 에멀젼; 마이크로에멀젼 또는 다르게는 마이크로캡슐, 극미립자 또는 이온성 및/또는 비이온성 유형의 지질 소포 분산물; 크림; 로션; 겔; 폼 (가압 캐니스터, 적합한 어플리케이터, 유화제 및 불활성 추진체 사용 가능); 에센스; 우유; 현탁액; 및 패치를 비롯하여 국소 적용에 적합한 임의의 형태일 수 있다. 본 개시 내용의 국소 조성물은 또한 친수성 또는 친유성 겔화제, 친수성 또는 친유성 활성제, 보존제, 산화 방지제, 용매, 향료, 충전제, 자외선 차단제, 악취 흡수제 및 염료와 같은 보조제를 함유할 수 있다. 추가의 양태에서, 본 출원에서 개시된 국소 조성물은 대상체의 피부 또는 다른 조직과 부착되거나 다르게는 결합될 수 있는 경피 패치, 드레싱, 패드, 랩, 매트릭스 및 붕대와 같은 장치와 함께 투여될 수 있으며, 본 출원에서 개시된 바와 같은 하나 이상의 Chp 펩타이드 또는 이의 활성 단편을 치료학적 유효량으로 전달할 수 있다.

하나의 실시 형태에서, 본 개시 내용의 국소 조성물은 국소 화상을 치료하는데 사용되는 하나 이상의 성분을 추가로 포함한다. 이러한 성분은 프로필렌 글리콜 하이드로겔; 글리콜, 셀룰로오스 유도체 및 수용성 알루미늄 염의 조합; 방부제; 항생제; 및 코르티코스테로이드를 포함할 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 습윤제, 예를 들어, 고체 또는 액체 왁스 에스테르; 흡수 촉진제, 예를 들어, 친수성 점토 또는 전분; 점도 형성제; 및 피부 보호제가 또한 첨가될 수 있다. 국소 제형은 구강 세정제와 같은 린스의 형태일 수 있다. 예를 들어, 국제공개공보 WO 2004/004650을 참조한다.

본 개시 내용의 조성물은 또한 적절한 양의 Chp 펩타이드 또는 이의 활성 단편 및 담체를 포함하는 치료제의 주사에 의해 투여될 수 있다. 예를 들어, Chp 펩타이드 또는 이의 활성 단편은 그람 음성 세균에 의한 감염, 예를 들어, 슈도모나스 아에루기노사에 기인하는 감염, 및/또는 항산성 세균에 기인하는 감염, 예를 들어, 마이코박테리움 투베르쿨로시스 및 비결핵 마이코박테리아를 비롯한 악티노박테리아의 종에 기인하는 감염을 치료하기 위해 근육내, 경막내, 진피하 (subdermal), 피하 또는 정맥내로 투여될 수 있다. 담체는 증류수, 생리 식염수, 알부민, 혈청 또는 이들의 임의의 조합으로 구성될 수 있다. 또한, 비경구 주사제의 약제학적 조성물은, pH 완충 용액, 아쥬반트 (예를 들어, 보존제, 습윤제, 유화제 및 분산제), 리포좀 제형, 나노입자, 분산물, 현탁액 또는 에멀젼 중 하나 이상에 추가하여, 본 출원에서 개시된 바와 같은 Chp 펩타이드 또는 이의 활성 단편의 약제학적으로 허용되는 수성 또는 비수성 용액 뿐만 아니라, 사용 직전에 멸균 주사 용액 또는 분산물로 재구성하기 위한 멸균 분말제를 포함할 수 있다.

비경구 주사가 선택된 투여 방식인 경우, 등장성 제형이 사용될 수 있다. 일반적으로, 등장성용 첨가제로는 염화 나트륨, 덱스트로오스, 만니톨, 소르비톨 및 락토오스가 포함될 수 있다. 일부 경우에서, 포스페이트 완충 식염수와 같은 등장성 용액이 바람직하다. 안정화제로는 젤라틴 및 알부민이 포함될 수 있다. 혈관 수축제가 제형에 첨가될 수 있다. 이러한 유형의 적용에 따른 약제학적 제제는 멸균 및 무발열원 상태로 제공될 수 있다.

희석제는 에탄올, 프로필렌 글리콜, 오일, 또는 약제학적으로 허용되는 유화제 또는 계면 활성제와 같은 하나 이상의 다른 부형제를 추가로 포함할 수 있다.

또 다른 실시 형태에서, 본 개시 내용의 조성물은 흡입성 조성물이다. 본 개시 내용의 흡입성 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 하나의 실시 형태에서, 본 개시 내용의 Chp 펩타이드 또는 이의 활성 단편은 건조한 흡입성 분말로서 제제화될 수 있다. 구체적인 실시 형태에서, Chp 펩타이드 또는 이의 활성 단편을 포함하는 흡입 용액은 에어로졸 전달을 위한 추진체와 함께 추가로 제형화될 수 있다. 특정 실시 형태에서, 용액은 네불라이즈화될 수 있다.

계면 활성제는 약제와 추진제 사이의 표면 및 계면 장력을 낮추기 위해 본 개시 내용의 흡입성 약제학적 조성물에 첨가될 수 있다. 약제, 추진체 및 부형제가 현탁액을 형성해야 하는 경우, 계면 활성제가 사용되거나 사용되지 않을 수 있다. 약제, 추진체 및 부형제가 용액을 형성해야 하는 경우, 계면 활성제가, 예를 들어, 특별한 약제 및 부형제의 용해도에 따라 사용되거나 사용되지 않을 수 있다. 계면 활성제는 약제와 무반응성이고 약제, 부형제 및 추진체 사이의 표면 장력을 감소시키고/시키거나 밸브 윤활제로서 작용하는 임의의 적합한 무독성 화합물일 수 있다.

적합한 계면 활성제의 예로는 올레산; 소르비탄 트리올레이트; 세틸 피리디늄 클로라이드; 대두 레시틴; 폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노라우레이트; 폴리옥시에틸렌 (10) 스테아릴 에테르; 폴리옥시에틸렌 (2) 올레일 에테르; 폴리옥시프로필렌-폴리옥시에틸렌 에틸렌 디아민 블록 공중합체; 폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노스테아레이트; 폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노올레이트; 폴리옥시프로필렌-폴리옥시에틸렌 블록 공중합체; 피마자유 에톡실레이트; 및 이들의 조합물이 포함되지만 이들에 한정되는 것은 아니다.

적합한 추진체의 예로는 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로-테트라플루오로에탄 및 이산화탄소가 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.

흡입성 조성물에 사용하기에 적합한 부형제의 예로는 락토오스, 전분, 중쇄 지방산의 프로필렌 글리콜 디에스테르; 중쇄 지방산, 단쇄 또는 장쇄, 또는 이들의 임의의 조합의 트리글리세라이드 에스테르; 퍼플루오로디메틸사이클로부탄; 퍼플루오로사이클로부탄; 폴리에틸렌 글리콜; 멘톨; 라우로글리콜; 디에틸렌 글리콜 모노에틸에테르; 중쇄 지방산의 폴리글리콜화 글리세라이드; 알코올: 유칼립투스 오일: 단쇄 지방산; 및 이들의 조합이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.

일부 실시 형태에서, 본 개시 내용의 조성물은 비강 적용을 포함한다. 비강 적용으로는 비강 스프레이, 점비액, 비용 연고, 세비액, 비강 주사, 비강 패킹, 기관지 스프레이 및 흡입제와 같은 직접 사용을 위한 적용 뿐만 아니라, 인후 로젠지, 구강 세정제 또는 가글과 같은 간접 사용을 위한 적용, 또는 콧구멍 또는 안면에 적용되는 연고의 사용을 통해, 및 이들 및 유사한 적용 방법의 임의의 조합이 포함된다.

또 다른 실시 형태에서, 본 개시 내용의 약제학적 조성물은 하나 이상의 항미생물제 및/또는 하나 이상의 통상적인 항생제를 비롯하여 보완제 (complementary agent)를 포함한다. 감염의 치료를 가속화하거나 항균 효과를 증대시키기 위해, 본 개시 내용의 Chp 펩타이드 또는 이의 활성 단편을 함유하는 치료제는 펩타이드의 살균 활성을 또한 강화시킬 수 있는 적어도 하나의 보완제를 추가로 포함할 수 있다. 상기 보완제는 그람 음성 세균을 치료하는데 사용되는 하나 이상의 항생제 또는 항산성 세균을 치료하는데 사용되는 하나 이상의 항생제일 수 있다. 하나의 실시 형태에서, 상기 보완제는 슈도모나스 아에루기노사에 기인하는 감염의 치료에 사용되는 항생제 또는 항미생물제이다. 하나의 실시 형태에서, 상기 보완제는 마이코박테리움 투베르쿨로시스에 기인하는 감염의 치료에 사용되는 항생제 또는 항미생물제이며, 하나의 실시 형태에서, 상기 보완제는 비결핵 마이코박테리아에 기인하는 감염의 치료에 사용되는 항생제 또는 항미생물제이다.

본 개시 내용의 조성물은 단위 투여 형태로 제공될 수 있으며, 당해 분야에 잘 공지된 임의의 방법으로 제조될 수 있다. 단일 투여 형태를 생성하기 위해 담체 물질과 조합될 수 있는 활성 성분의 양은, 예를 들어, 치료되는 숙주, 감염성 세균에 대한 수여자의 노출 지속 기간, 대상체의 크기 및 체중, 및 특별한 투여 방식에 따라 달라질 것이다. 단일 투여 형태를 생성하기 위해 담체 물질과 조합될 수 있는 활성 성분의 양은, 예를 들어, 치료학적 효과를 가져오는 각 화합물의 양일 수 있다. 특정 실시 형태에서, 100% 중 총량은 약 1% 내지 약 99%의 활성 성분, 예를 들어, 약 5% 내지 약 70%, 또는 약 10% 내지 약 30%의 범위일 수 있다.

투약량 및 투여

투여되는 투약량은 치료되는 감염의 활성; 치료되는 대상체의 연령, 건강 및 전반적 신체 상태; 특별한 Chp 펩타이드 또는 이의 활성 단편의 활성; 존재한다면 본 개시 내용에 따른 Chp 펩타이드 또는 이의 활성 단편과 짝을 이루는 항생제의 성질 및 활성; 및 이러한 쌍을 이루는 것의 조합 효과와 같은 다수의 요인에 좌우될 수 있다. 특정 실시 형태에서, 투여되는 Chp 펩타이드 또는 이의 활성 단편의 유효량은 약 1~50 mg/kg (또는 1 내지 50 mcg/ml)의 범위 내에 있을 수 있다. 특정 실시 형태에서, 투여되는 Chp 펩타이드 또는 이의 활성 단편의 유효량은 약 1~50 μg/mL의 범위 내, 예를 들어, 약 1~10 μg/mL의 범위 내, 약 1 μg/mL 또는 약 10 μg/mL일 수 있다. 특정 실시 형태에서, Chp 펩타이드 또는 이의 활성 단편은 1 내지 14일 범위의 기간 동안 매일 1~4회 투여될 수 있다. 항생제가 또한 사용되는 경우, 상기 항생제는 표준 투여 방법으로서 또는 임의의 상승 작용 관점에서 보다 적은 양으로 투여될 수 있다. 그러나, 이러한 모든 투약량 및 방법 (Chp 펩타이드 또는 이의 활성 단편 또는 이와 함께 투여되는 임의의 항생제)은 최적화를 거친다. 최적 투약량은 당해 분야의 기술 범위 내에 있는 바와 같이 시험관내 및 생체내 파일럿 효능 실험을 수행하지만 본 개시 내용을 고려함으로써 결정될 수 있다.

본 출원에서 개시된 Chp 펩타이드 또는 이의 활성 단편은 신속한 살균 효과를 제공할 수 있으며, MIC 이하 양으로 사용될 때, 정균 효과를 제공할 수 있는 것으로 고려된다. 본 출원에서 개시된 Chp 펩타이드 또는 이의 활성 단편은 다양한 항생제 내성 세균에 대해 활성일 수 있으며, 진화하는 내성과 관련이 없을 수 있는 것으로 추가로 고려된다. 본 개시 내용에 기초하여, 임상 환경에서는 본 Chp 펩타이드 또는 이의 활성 단편이 내약성 및 다제내성 세균으로부터 발생하는 감염을 단독으로 또는 항생제 (내성이 발생한 항생제 포함)와 함께 치료하기 위한 강력한 대체물 (또는 첨가제)일 수 있다. 그람 음성 세균에 대한 기존 내성 메커니즘은 본 Chp 펩타이드 또는 이의 활성 단편의 용균 활성에 대한 감수성에 영향을 미치지 않는 것으로 믿어진다.

일부 실시 형태에서, 본 출원에서 개시된 Chp 펩타이드 또는 이의 활성 단편에 대한 시간 노출은 ml 당 활성 펩타이드 단위의 목적하는 농도에 영향을 줄 수 있다. "장 (long)" 또는 "서 (low)" 방출 담체 (예를 들어, 특정 비강 스프레이 또는 로젠지)로서 분류되는 담체는 ml 당 펩타이드 단위의 보다 낮은 농도를 장기간에 걸쳐 보유하거나 제공할 수 있는 반면, "단 (short)" 또는 "속 (fast)" 방출 담체 (예를 들어, 가글)는 ml 당 펩타이드 단위 (mcg)의 높은 농도를 단기간에 걸쳐 보유하거나 제공할 수 있다. 보다 높은 단위/ml 투약량 또는 보다 낮은 단위/ml 투약량을 갖는 것이 바람직할 수 있는 상황이 존재한다.

본 개시 내용의 Chp 펩타이드 또는 이의 활성 단편의 경우, 치료학적 유효 용량은 세포 배양 검정에서 또는 동물 모델, 일반적으로 마우스, 래빗, 개 또는 돼지에서 초기에 추정될 수 있다. 상기 동물 모델은 또한 바람직한 농도 범위 및 투여 경로를 달성하기 위해 사용될 수 있다. 그 다음, 수득된 정보를 사용하여 사람에서 유효 용량 뿐만 아니라 투여 경로를 결정할 수 있다. 용량 및 투여를 충분한 수준의 활성 성분을 제공하거나 목적하는 효과를 유지하기 위해 추가로 조정할 수 있다. 고려될 수 있는 추가의 요인으로는 질환 상태의 중증도; 환자의 연령, 체중 및 성별; 식이; 목적하는 치료 기간; 투여 방법; 투여 시간 및 빈도; 약물 조합; 반응 민감도; 요법에 대한 허용 (tolerance)/반응; 및 치료 의사의 판단이 포함된다.

치료 방법은 매일 투여 (예를 들어, 1일 1회, 2회, 3회 등), 격일 투여 (예를 들어, 격일마다 1회, 2회, 3회 등), 주 2회, 매주, 2주마다 1회, 월 1회 등을 수반할 수 있다. 하나의 실시 형태에서, 치료는 연속 주입으로서 제공될 수 있다. 단위 용량은 복수 회로 투여될 수 있다. 간격은 또한 임상 증상을 모니터링함으로써 표시된 바와 같이 불규칙할 수 있다. 대안으로, 상기 단위 용량은 지효성 제형으로서 투여될 수 있으며, 이러한 경우에는 덜 빈번한 투여가 사용될 수 있다. 투약량 및 빈도는 환자에 따라 달라질 수 있다. 당해 분야의 통상의 기술자라면, 이러한 지침이 국소 투여, 예를 들어, 비강내, 흡입, 직장 등, 또는 전신 투여, 예를 들어, 경구, 직장 (예를 들어, 관장을 통해), 근육내 (i.m), 복강내 (i.p.), 정맥내 (i.v.), 피하 (s.c.), 경요도 등에 맞게 조정될 것으로 이해할 것이다.

방법

따라서, 본 개시 내용의 Chp 펩타이드 및 이의 활성 단편은 생체 내에서, 예를 들어, 대상체에서 슈도모나스 아에루기노사와 같은 그람 음성 세균으로 인한 세균 감염 또는 악티노박테리아와 같은 항산성 세균으로 인한 세균 감염을 치료하기 위해서 뿐만 아니라 시험관내에서, 예를 들어, 의료 장치의, 예를 들어, 표면 상의 세균 오염의 수준을 감소시키기 위해서 사용될 수 있다. 특정 실시 형태에서, 상기 그람 음성 세균은 적어도 하나의 항생제에 내성이거나 MDR 병원체이다.

예를 들어, 일부 실시 형태에서, 본 발명의 Chp 펩타이드 또는 이의 활성 단편은 그람 음성 세균 또는 항산성 세균에 의해 형성된 세균 생물막의 방지, 파괴 및/또는 제거에 사용될 수 있다. 생물막 형성은 미생물 세포가 서로 부착하여 표면 상의 세포외 중합체성 물질 (extracellular polymeric substance: EPS) 매트릭스에 매립될 때 발생한다. 생체 거대 분자 (예를 들어, 다당류, 핵산 및 단백질) 및 영양소가 풍부한 이러한 보호된 환경에서의 미생물의 성장은 증진된 미생물 누화 (cross-talk) 및 증가된 독성을 가능하게 한다. 생물막은 폐 (예를 들어, 낭포성 섬유증 환자의 폐)의 점액전, 오염된 카테터, 콘택트 렌즈 등과 같은 생물 및 무생물 표면을 비롯한 모든 지원 환경에서 발생할 수 있다 (그 전체가 본 출원에 참조로 포함되는 문헌 [Sharma et al. Biologicals, 42(1):1-7 (2014)]). 따라서, 하나의 실시 형태에서, 본 개시 내용의 Chp 펩타이드 또는 이의 활성 단편은 그람 음성 세균 또는 항산성 세균이 세균 생물막에 의해 보호될 때 이들 세균으로 인한 세균 감염의 예방, 파괴 및/또는 박멸에 사용될 수 있다. 하나의 실시 형태에서, Chp2-M1 또는 이의 활성 단편은 그람 음성 세균이 세균 생물막에 의해 보호될 때 이러한 세균으로 인한 세균 감염의 예방, 파괴 및/또는 박멸에 사용될 수 있다. 하나의 실시 형태에서, Chp2-M1 또는 이의 활성 단편은 스테노트로포모나스 종, 예를 들어, 스테노트로포모나스 말토필리아 세균이 세균 생물막에 의해 보호될 때 이러한 세균으로 인한 세균 감염의 예방, 파괴 및/또는 박멸에 사용될 수 있다. 특정 실시 형태에서, Chp2-M1 또는 이의 활성 단편은 스테노트로포모나스 말토필리아 세균 생물막과 같은 그람 음성 세균 생물막을 박멸할 수 있다.

하나의 양태에서, 본 개시 내용은 세균 감염으로 진단되거나 이의 위험에 처해 있거나 이의 증상을 나타내는 대상체에게 본 출원에서 기재된 바와 같은 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 본 출원에서 기재된 바와 같은 하나 이상의 추가의 그람 음성 세균에 기인하는 세균 감염을 치료하는 방법에 관한 것이다. 하나의 양태에서, 본 개시 내용은 세균 감염으로 진단되거나 이의 위험에 처해 있거나 이의 증상을 나타내는 대상체에게 본 출원에서 기재된 바와 같은 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 본 출원에서 기재된 바와 같은 하나 이상의 추가의 항산성 세균에 기인하는 세균 감염을 치료하는 방법에 관한 것이다.

"감염" 및 "세균 감염"이라는 용어는 기도 감염 (respiratory tract infection: RTI), 예를 들어, 낭포성 섬유증 (cystic fibrosis: CF) 환자의 기도 감염, 하기도 감염, 예를 들어, 만성 기관지염의 급성 악화 (acute exacerbation of chronic bronchitis: ACEB), 급성 부비동염, 지역 사회 획득 폐렴 (community-acquired pneumonia: CAP), 원내 획득 폐렴 (hospital-acquired pneumonia: HAP) 및 병원내 기도 감염; 성 전염성 질환, 예를 들어, 임균성 자궁경부염 및 임균성 요도염; 요로 감염; 급성 중이염; 신생아 패혈증 및 카테터 관련 패혈증을 비롯한 패혈증; 골수염; 결핵 및 비결핵 마이코박테리아 감염을 포함하는 것을 의미한다. 내약성 세균 및 다제내성 세균에 기인하는 감염도 또한 고려된다.

그람 음성 세균, 예를 들어, 슈도모나스 아에루기노사, 스테노트로포모나스 말토필리아, 또는 항산성 세균에 기인하는 감염의 비제한적인 예로는 다음이 포함된다: A) 병원내 감염: 1. 특별히 낭포성 섬유증 환자 및 기계적 환기 환자에서의 기도 감염; 2. 균혈증 및 패혈증; 3. 상처 감염, 특히, 화상 피해자의 감염; 4. 요로 감염; 5. 침습성 장치에서의 수술 후 감염; 6. 오염된 약물 용액의 정맥내 투여에 의한 심내막염; 7. 후천성 면역 결핍 증후군, 암 화학 요법, 스테로이드 요법, 혈액 악성 종양, 장기 이식, 신장 대체 요법 및 중증 호중구 감소증을 동반한 기타 병태를 갖는 환자의 감염. B) 지역사회 획득 감염: 1. 지역사회 획득 기도 감염, 예를 들어, 결핵; 2. 수막염; 3. 오염된 물에 기인하는 이도의 모낭염 및 감염; 4. 노인 및 당뇨병 환자의 악성 외이도염; 5. 소아에서 종골의 골수염; 6. 오염된 콘택트 렌즈와 흔히 관련된 안구 감염; 7. 손이 빈번하게 물에 노출되는 사람들의 손발톱 감염과 같은 피부 감염; 8. 위장관 감염; 및 9. 근골격계 감염.

본 방법의 그람 음성 세균의 하나 이상의 종은 본 출원에서 기재된 바와 같은 그람 음성 세균의 임의의 종을 포함할 수 있다. 전형적으로, 그람 음성 세균의 추가의 종은 아시네토박터 바우마니, 아시네토박터 해몰리티쿠스 (Acinetobacter haemolyticus), 악티노바실러스 악티노마이세템코미탄스 (Actinobacillus actinomycetemcomitans), 에어로모나스 하이드로필라 (Aeromonas hydrophila), 아크로모박터 (Achromobacter) 종, 예를 들어, 아크로모박터 돌렌스 (Achromobacter dolens), 아크로모박터 루흘란디 (Achromobacter ruhlandii) 및 아크로모박터 크실로속시단스 (Achromobacter xylosoxidans), 박테로이데스 (Bacteroides) 종, 예를 들어, 박테로이데스 프라질리스 (Bacteroides fragilis), 박테로이데스 테아타이오아타미크론 (Bacteroides theataioatamicron), 박테로이데스 디스타소니스 (Bacteroides distasonis), 박테로이데스 오바투스 (Bacteroides ovatus), 박테로이데스 불가투스 (Bacteroides vulgatus), 바르토넬라 퀸타나 (Bartonella Quintana), 보르데텔라 페르투시스 (Bordetella pertussis), 브루셀라 (Brucella) 종, 예를 들어, 브루셀라 멜리텐시스 (Brucella melitensis), 부르크홀데리아 (Burkholderia) 종, 예를 들어, 부르크홀데리아 안티나 (Burkholderia anthina), 부르크홀데리아 세파시아 (Burkholderia cepacia), 부르크홀데리아 세나세파시아 (Burkholderia cenacepacia), 부르크홀데리아 글라디올리 (Burkholderia gladioli), 부르크홀데리아 물티보란스 (Burkholderia multivorans), 부르크홀데리아 슈도말레이 (Burkholderia pseudomallei) 및 부르크홀데리아 말레이 (Burkholderia mallei), 푸소박테리움 (Fusobacterium), 프레보텔라 코르포리스 (Prevotella corporis), 프레보텔라 인테르메디아 (Prevotella intermedia), 프레보텔라 엔도돈탈리스 (Prevotella endodontalis), 포르피로모나스 아사카롤리티카 (Porphyromonas asaccharolytica), 캄필로박터 제주니 (Campylobacter jejuni), 캄필로박터 페투스 (Campylobacter fetus), 캄필로박터 콜라이 (Campylobacter coli), 클라미디아 종, 예를 들어, 클라미디아 뉴모니아 (Chlamydia pneumoniae) 및 클라미디아 트라코마티스 (Chlamydia trachomatis), 시트로박터 프룬디 (Citrobacter freundii), 시트로박터 코세리 (Citrobacter koseri), 콕시엘라 부르네티 (Coxiella burnetii), 에드워지엘라 (Edwarsiella) 종, 예를 들어, 에드워지엘라 타르다 (Edwarsiella tarda), 에이케넬라 코로덴스 (Eikenella corrodens), 엔테로박터 종, 예를 들어, 엔테로박터 클로아카 (Enterobacter cloacae), 엔테로박터 에어로게네스 (Enterobacter aerogenes), 엔테로박터 패시움 (Enterobacater faecium) 및 엔테로박터 아글로메란스 (Enterobacter agglomerans), 에세리키아 콜라이, 프란시셀라 툴라렌시스 (Francisella tularensis), 헤모필루스 인플루엔자 (Haemophilus influenzae), 헤모필루스 듀크레이 (Haemophilus ducreyi), 헬리코박터 파일로리 (Helicobacter pylori), 킹겔라 킹가 (Kingella kingae), 클렙시엘라 종, 예를 들어, 클렙시엘라 뉴모니아, 클렙시엘라 옥시토카 (Klebsiella oxytoca), 클렙시엘라 리노스클레로마티스(Klebsiella rhinoscleromatis) 및 클렙시엘라 오자에나 (Klebsiella ozaenae), 클루이베라 아스코르바타 (Kluyvera ascorbata), 레지오넬라 뉴모필라 (Legionella penumophila), 모락셀라 (Moraxella) 종, 예를 들어, 모락셀라 카타랄리스 (Moraxella catarrhalis), 모르가넬라 (Morganella) 종, 예를 들어, 모르가넬라 모르가니 (Morganella morganii), 나이세리아 고노레아 (Neisseria gonorrhoeae), 나이세리아 메닌지티디스 (Neisseria meningitidis), 슈도모나스 아에루기노사, 파스퇴렐라 물토시다 (Pasteurella multocida), 플레시오모나스 시겔로이데스 (Plesiomonas shigelloides), 프로테우스 미라빌리스 (Proteus mirabilis), 프로테우스 불가리스 (Proteus vulgaris), 프로테우스 페네리 (Proteus penneri), 프로테우스 믹소파시엔스 (Proteus myxofaciens), 프로비덴시아 (Providencia) 종, 예를 들어, 프로비덴시아 스투아르티 (Providencia stuartii), 프로비덴시아 레트게리 (Providencia rettgeri), 프로비덴시아 알칼리파시엔스 (Providencia alcalifaciens), 슈도모나스 플루오레센스 (Pseudomonas fluorescens), 라울텔라 오르니티놀리티카 (Raoultella ornithinolytica), 살모넬라 티피 (Salmonella typhi), 살모넬라 티피무리움, 살모넬라 파라티피 (Salmonella paratyphi), 세라티아 (Serratia) 종, 예를 들어, 세라티아 마르세센스 (Serratia marcescens), 시겔라 종, 예를 들어, 시겔라 플렉스네리 (Shigella flexneri), 시겔라 보이디 (Shigella boydii), 시겔라 소네이 (Shigella sonnei) 및 시겔라 디센테리아 (Shigella dysenteriae), 스테노트로포모나스 말토필리아 (Stenotrophomonas maltophilia), 스트렙토바실러스 모닐리포르미스 (Streptobacillus moniliformis), 비브리오 콜레라 (Vibrio cholerae), 비브리오 파라헤몰리티쿠스 (Vibrio parahaemolyticus), 비브리오 불니피쿠스 (Vibrio vulnificus), 비브리오 알지놀리티쿠스 (Vibrio alginolyticus), 여시니아 엔테로콜리티카 (Yersinia enterocolitica), 여시니아 페스티스 (Yersinia pestis), 여시니아 슈도투베르쿨로시스 (Yersinia pseudotuberculosis), 클라미디아 뉴모니아, 클라미디아 트라코마티스, 리케차 프로와제키 (Ricketsia prowazekii), 콕시엘라 부르네티, 에를리히아 샤펜시스 (Ehrlichia chafeensis) 및/또는 바르토넬라 헨세나 (Bartonella hensenae) 중 하나 이상으로부터 선택된다.

보다 전형적으로, 그람 음성 세균의 적어도 하나의 다른 종은 아시네토박터 바우마니, 보르데텔라 페르투시스, 부르크홀데리아 세파시아, 부르크홀데리아 슈도말레이, 부르크홀데리아 말레이, 캄필로박터 제주니, 캄필로박터 콜라이, 엔테로박터 클로아카, 엔테로박터 에어로게네스, 에세리키아 콜라이, 프란시셀라 툴라렌시스, 헤모필루스 인플루엔자, 헤모필루스 듀크레이, 헬리코박터 파일로리, 클렙시엘라 뉴모니아, 레지오넬라 뉴모필라, 모락셀라 카타랄리스, 모르가넬라 모르가니, 나이세리아 고노레아, 나이세리아 메닌지티디스, 파스퇴렐라 물토시다, 프로테우스 미라빌리스, 프로테우스 불가리스, 살모넬라 티피, 세라티아 마르세센스, 시겔라 플렉스네리, 시겔라 보이디, 시겔라 소네이, 시겔라 디센테리아, 스테노트로포모나스 말토필리아, 비브리오 콜레라 및/또는 클라미디아 뉴모니아 중 하나 이상으로부터 선택된다.

보다 더 전형적으로, 그람 음성 세균의 적어도 하나의 다른 종으로는 스테노트로포모나스 종 (예를 들어, 스테노트로포모나스 말토필리아), 살모넬라 티피무리움, 살모넬라 티피, 시겔라 종, 에세리키아 콜라이, 아시네토박터 바우마니, 클렙시엘라 뉴모니아, 나이세리아 고노레아, 나이세리아 메닌지티디스, 세라티아 종, 프로테우스 미라빌리스, 모르가넬라 모르가니, 프로비덴시아 종, 에드워지엘라 종, 여시니아 종, 헤모필루스 인플루엔자, 바르토넬라 퀸타나, 브루셀라 종, 보르데텔라 페르투시스, 부르크홀데리아 종, 모락셀라 종, 프란시셀라 툴라렌시스, 레지오넬라 뉴모필라, 콕시엘라 부르네티, 박테로이데스 종, 엔테로박터 종 및/또는 클라미디아 종 중 하나 이상으로부터 선택된다.

훨씬 보다 더 전형적으로, 그람 음성 세균의 적어도 하나의 다른 종은 클렙시엘라 종, 엔테로박터 종, 에세리키아 콜라이, 시트로박터 프룬디, 살모넬라 티피무리움, 여시니아 페스티스, 스테노트로포모나스 말토필리아 및/또는 프란시셀라 툴러렌시스 중 하나 이상으로부터 선택된다.

본 방법의 항산성 세균의 하나 이상의 종은 본 출원에서 기재된 바와 같은 항산성 세균의 임의의 종을 포함할 수 있다. 전형적으로, 상기 항산성 세균의 추가의 종은 마이코박테리아와 같은 악티노박테리아 중 하나 이상의 종으로부터 선택된다.

마이코박테리아는 진단 및 치료 목적으로 3가지 주요 그룹으로 분류될 수 있는 작은 막대 모양의 바실러스 과이다. 제1 그룹은 폐결핵을 유발할 수 있는 마이코박테리움 투베르쿨로시스 복합체이며, 마이코박테리움 투베르쿨로시스, 마이코박테리움 보비스 (M. bovis), 마이코박테리움 아프리카눔 (M. africanum), 마이코박테리움 마이크로티 (M. microti) 및 마이코박테리움 카네티 (M. canetti)를 포함한다. 제2 그룹은 한센병 또는 나병을 일으키는 마이코박테리움 레프라에 (M. leprae) 및 마이코박테리움 레프로마토시스 (M. lepromatosis)를 포함한다. 제3 그룹은 결핵과 유사한 폐 질환, 림프절염, 피부 질환 또는 파종성 질환을 유발할 수 있는 다른 모든 마이코박테리아를 포함하는 비결핵성 마이코박테리아 (NTM)이다. NTM으로는 마이코박테리움 아비움 콤플렉스 (M. avium Complex: MAC), 마이코박테리움 아비움, 마이코박테리움 칸사시, 마이코박테리움 압세수스 (M. abscessus), 마이코박테리움 첼로네 (M. chelonae), 마이코박테리움 포르투이툼 (M. fortuitum), 마이코박테리움 게나벤스 (M. genavense), 마이코박테리움 고르도네 (M. gordonae), 마이코박테리움 헤모필룸 (M. haemophilum), 마이코박테리움 이뮤노게눔 (M. immunogenum), 마이코박테리움 인트라셀룰라레, 마이코박테리움 말모엔스 (M. malmoense), 마이코박테리움 마리눔, 마이코박테리움 무코제니쿰 (M. mucogenicum), 마이코박테리움 논크로모제니쿰 (M. nonchromogenicum), 마이코박테리움 스크로풀라세움, 마이코박테리움 시미아에 (M. simiae), 마이코박테리움 스메그마티스, 마이코박테리움 스줄가이 (M. szulgai), 마이코박테리움 테라에 (M. terrae), 마이코박테리움 테라에 복합체, 마이코박테리움 울세란스 (M. ulcerans) 및 마이코박테리움 제노피 (M. xenopi)가 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. MAC는 적어도 2종의 마이코박테리아 종인 마이코박테리움 아비움 및 마이코박테리움 인트라셀룰라레를 포함한다. 이러한 2종은 전통적인 물리적 또는 생화학적 테스트에 기초하여 구별될 수 없지만, 상기 2종을 동정하고 이들을 구별하는데 사용될 수 있는 핵산 프로브가 있다.

특정 실시 형태에서, 상기 항산성 세균은 마이코박테리움 스메그마티스, 마이코박테리움 투베르쿨로시스, 마이코박테리움 아비움, 마이코박테리움 칸사시, 마이코박테리움 스크로풀라세움, 마이코박테리움 페레그리눔, 마이코박테리움 마리눔, 마이코박테리움 인트라셀룰라레 및/또는 마이코박테리움 포르투이툼 중 하나 이상으로부터 선택될 수 있다.

일부 실시 형태에서, 그람 음성 세균 또는 항산성 세균에 의한 감염은 국소 세균 감염, 예를 들어, 피부 상처와 같은 국소 감염을 초래한다. 다른 실시 형태에서, 세균 감염은 전신 병원성 세균 감염이다. 일반적인 항산성 감염으로는 결핵 및 비결핵 마이코박테리아 감염이 포함된다. 흔한 그람 음성 병원체 및 관련 감염은 본 개시 내용의 표 A에 열거되어 있다. 이들은 본 Chp 펩타이드 및 이의 활성 단편으로 치료, 경감 또는 예방될 수 있는 세균 감염의 예의 역할을 하는 것을 의미하며, 제한적인 것으로 의도되지 않는다.

[표 A] - 의학적으로 관련된 그람 음성 세균 및 관련 질환

일부 실시 형태에서, 본 개시 내용의 Chp 펩타이드 및 이의 활성 단편은 그람 음성 세균 또는 항산성 세균으로 인한 감염에 걸릴 위험에 처해 있는 대상체를 치료하는데 사용된다. 그람 음성 세균 감염 또는 항산성 세균 감염에 걸릴 위험에 처해 있는 대상체로는, 예를 들어, 낭포성 섬유증 환자, 호중구 감소증 환자, 괴사성 소장대장염 환자, 화상 피해자, 상처 감염 환자, 보다 일반적으로는 병원 환경에 있는 환자, 특히, 수술 환자 및 카테터, 예를 들어, 중앙 정맥 카테터, Hickman 장치 또는 전기 생리학적 심장 장치, 예를 들어, 심박 조율기 및 이식형 제세동기와 같은 이식형 의료 장치를 사용하여 치료되는 환자가 포함된다. 그람 음성 세균 또는 항산성 세균으로 감염될 위험에 처해 있는 다른 환자 그룹으로는 전체 관절 교체 (예를 들어, 전체 무릎 또는 고관절 교체)와 같은 이식 보철을 갖는 환자가 제한 없이 포함된다.

또 다른 양태에서, 본 개시 내용은 세균 감염으로 진단되거나 이의 위험에 처해 있거나 이의 증상을 나타내는 대상체에게 본 출원에서 기재된 바와 같은 유효량의 Chp 펩타이드 또는 이의 활성 단편을 함유하는 제1 유효량의 조성물과 그람 음성 세균 감염의 치료에 적합한 제2 유효량의 항생제의 조합물을 공동 투여하는 단계를 포함하는, 세균 감염을 예방하거나 치료하는 방법에 관한 것이다. 특정 양태에서, 본 개시 내용은 세균 감염으로 진단되거나 이의 위험에 처해 있거나 이의 증상을 나타내는 대상체에게 본 출원에서 기재된 바와 같은 유효량의 Chp 펩타이드 또는 이의 활성 단편을 함유하는 제1 유효량의 조성물과 항산성 세균 감염의 치료에 적합한 제2 유효량의 항생제의 조합물을 공동 투여하는 단계를 포함하는, 세균 감염을 예방하거나 치료하는 방법에 관한 것이다.

본 개시 내용의 Chp 펩타이드 및 이의 활성 단편은 당해 분야의 기술 범위 내에서와 같이 표준 치료 항생제 또는 최후 수단의 항생제와 개별적으로 또는 다양한 조합으로 공동 투여될 수 있다. 마이코박테리아 감염에 대해 사용되는 전통적인 항생제로는, 예를 들어, 마크롤라이드 (클라리트로마이신, 아지트로마이신), 에탐부톨, 리파마이신 (리팜핀, 리파부틴), 이소니아지드, 피라진아미드 및 아미노글리코사이드 (스트렙토마이신, 아미카신)가 포함된다. 슈도모나스 아에루기노사에 대해 사용되는 전통적인 항생제는 표 B에 기재되어 있다. 다른 그람 음성 세균, 예를 들어, 클렙시엘라 종, 엔테로박터 종, 에세리키아 콜라이, 시트로박터 프룬디, 살모넬라 티피무리움, 여시니아 페스티스 및 프란시셀라 툴라렌시스에 대한 항생제는 슈도모나스 아에루기노사에 대해 표 B에서 제공된 것과 유사하다.

[표 B] - 슈도모나스 아에루기노사의 처리를 위해 사용되는 항생제

보다 구체적인 실시 형태에 있어서, 상기 항생제는 세프타지딤, 세페핌, 세포페라존, 세프토비프롤, 시프로플록사신, 레보플록사신, 아미노글리코사이드, 이미페넴, 메로페넴, 도리페넴, 겐타마이신, 토브라마이신, 아미카신, 피페라실린, 티카르실린, 페니실린, 리팜피신, 폴리믹신 B 및 콜리스틴 중 하나 이상으로부터 선택된다. 특정 실시 형태에서, 상기 항생제는 이소니아지드, 리팜핀, 에탐부톨 및 피라진아미드로부터 선택된다.

본 개시 내용의 Chp 펩타이드 또는 이의 활성 단편을 항생제와 조합하면 효과적인 항균 요법이 제공된다. 일부 실시 형태에서, 하나 이상의 항생제와 본 개시 내용의 Chp 펩타이드 또는 이의 활성 단편의 공동 투여는 증대된 살균 및 정균 활성, 감소된 항생제 내성 위험 및 감소된 유해한 신경학적 또는 신장 부작용 (예를 들어, 콜리스틴 또는 폴리믹신 B 사용과 관련된 것들) 위험과 함께 Chp 펩타이드 또는 이의 활성 단편 또는 항생제 또는 이들 둘 다의 감소된 용량 및 양 및/또는 감소된 치료 빈도 및/또는 치료 기간으로 수행될 수 있다. 이전 연구는 총 누적 콜리스틴 용량이 신장 손상과 관련이 있으며, 이는 Chp 펩타이드 또는 이의 활성 단편과의 조합 요법을 사용하는 투약량 감소 또는 치료 기간 단축이 신장 독성의 발생률을 감소시킬 수 있다는 것을 시사한다 (그 전문이 본 출원에 참조로 포함되는 문헌 [Spapen et al. Ann Intensive Care. 1: 14 (2011)]). 본 출원에서 사용되는 "감소된 용량"이라는 용어는 동일한 활성 성분에 의한 단일 요법과 비교한 조합물 중 하나의 활성 성분의 용량을 지칭한다. 일부 실시 형태에서, 조합물 중 Chp 펩타이드 또는 이의 활성 단편 또는 항생제의 용량은 각각의 단일 요법과 비교하여 최적 이하 (suboptimal)이거나 심지어 역치 이하일 수 있다.

일부 실시 형태에서, 본 개시 내용은 본 출원에서 개시된 Chp 펩타이드 또는 이의 활성 단편을 관심 대상 항생제와 함께 대상체에게 투여함으로써 그람 음성 세균 또는 항산성 세균에 대한 하나 이상의 항생제의 항생제 활성을 단독으로 사용된 상기 항생제의 활성과 비교하여 증대시키는 방법을 제공한다. 이러한 조합은 세균에 대해 효과적이며, 항생제에 대한 내성을 극복하고/하거나 항생제를 보다 낮은 용량으로 사용하여 폴리믹신 B의 신장 독성 및 신경 독성 효과와 같은 바람직하지 않은 부작용을 감소시키도록 한다.

본 개시 내용의 항생제와 임의로 조합되는 Chp 펩타이드 또는 이의 활성 단편은 금속 킬레이트화제, 예를 들어, EDTA, TRIS, 락트산, 락토페린, 폴리믹신, 시트르산을 포함하지만 이들에 한정되지 않는 그람 음성 세균 외막의 추가의 침투제와 추가로 조합될 수 있다 (그 전문이 본 출원에 참조로 포함되는 문헌 [Vaara M. Microbial Rev. 56(3):395-441 (1992)]).

또 다른 양태에서, 본 개시 내용은 그람 음성 세균 또는 항산성 세균의 적어도 한 종의 성장을 억제하거나 이의 집단을 감소시키거나 이를 사멸시키는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 상기 세균을 본 출원에서 기재된 바와 같은 유효량의 Chp 펩타이드 또는 이의 활성 단편을 함유하는 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하고, 여기서, 상기 Chp 펩타이드 또는 이의 활성 단편은 그람 음성 세균 또는 항산성 세균의 적어도 한 종의 성장을 억제하거나 이의 집단을 감소시키거나 이를 사멸시킨다.

일부 실시 형태에서, 그람 음성 세균 또는 항산성 세균의 적어도 한 종의 성장을 억제하거나 이의 집단을 감소시키거나 이를 사멸시키는 것은 세균을 본 출원에서 기재된 바와 같은 Chp 펩타이드 또는 활성 단편과 접촉시키는 것을 포함하고, 여기서, 상기 세균은, 예를 들어, 병원내 의료 장치, 바닥, 계단, 벽 및 조리대 및 기타 건강 관련 또는 공공 사용 건물의 표면 및 수술실, 응급실, 병실, 진료소 및 욕실 내 장비의 표면 등에 존재한다.

본 출원에서 기재된 Chp 펩타이드 또는 이의 활성 단편을 사용하여 보호될 수 있는 의료 장치의 예로는 배관, 및 의료 장치, 예를 들어, 요도 카테터, 점막 절제 카테터, 흡인 카테터, 제대 캐뉼라, 콘택트 렌즈, 자궁내 장치, 질내 및 장내 장치, 기관내 튜브, 기관지경, 치과 보철물 및 치과 교정 장치, 수술 기구, 치과 기구, 배관, 치과 용수 라인, 섬유, 종이, 지시약 스트립 (예를 들어, 종이 지시약 스트립 또는 플라스틱 지시약 스트립), 접착제 (예를 들어, 하이드로겔 접착제, 고온 용융 접착제 또는 용매계 접착제), 붕대, 조직 드레싱 또는 치료용 장치 및 폐쇄성 패치의 기타 표면, 및 의료 분야에서 사용되는 임의의 장치의 기타 표면이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 이러한 장치는 다양한 종류의 전극, 외부 보철물, 고정 테이프, 압박 붕대 및 모니터를 포함할 수 있다. 의료 장치는 또한 삽입 또는 이식 부위 근처의 피부와 같은 삽입 또는 이식 부위에 놓일 수 있으며, 그람 음성 세균 및/또는 항산성 세균에 의한 콜로니화에 민감한 적어도 하나의 표면을 포함할 수 있는 임의의 장치를 포함할 수 있다.

실시예

재료 및 방법

세균 균주 및 성장 조건. 뉴욕 특수 수술 병원 (Hospital for Special Surgery)에서 사람 혈액 (병리학과 실험실 의학 교수 Lars Westblade 박사 제공)으로부터 수득된 카바페넴 내성 슈도모나스 아에루기노사 임상 분리주 CFS-1292를 사용하여 본 출원에서 개시된 대부분의 연구를 수행하였지만, 상업적으로 이용 가능한 항생제 내성 분리주도 또한 사용할 수 있다. 다른 모든 분리주를 American Type Culture Collection ("ATCC"), d' Herelle 컬렉션 ("HER"), BEI Resources ("HM") 또는 뉴욕 특수 수술 병원 ("HSS")으로부터 수득하였다. 분리주를 리소겐 브로쓰 (lysogeny broth: LB; Sigma-Aldrich), 카사미노산 (casamino acid: CAA) 배지 (5 g/L 카사미노산 Ameresco/VWR; 5.2 mM K₂HPO₄, Sigma-Aldrich; 1 mM MgSO₄, Sigma- Aldrich), 100 mM NaCl로 보충된 CAA, 또는 2.5% 사람 혈청으로 보충된 CAA (타입 AB, 남성, 풀링됨 (pooled); Sigma-Aldrich)에서 배양하고 테스트하였다. 달리 명시되지 않는다면, 모든 항생제 및 단백질 시약 (예를 들어, T4 라이소자임)을 Sigma-Aldrich로부터 수득하였다.

생물 정보학 연구. 모든 마이크로비리대 및 레비비리대 게놈에 대한 주석이 달린 GenBank 데이터베이스 항목에서 모든 단백질을 확인하였다. 각 Chp 그룹 펩타이드에 대한 수탁 번호는 하기 표 1 및 2에 나타나 있다. uniprot.org/blast/에서 이용 가능한 UniProt 서버를 사용하여 Blastp 분석을 수행하였다. www.compbio.dundee.ac.uk/jpred/index에서 이용 가능한 JPRED4, 및 www.zhanglab.ccmb.med.umich.edu/I-TASSER/에서 이용 가능한 I-Tasser를 사용하여 단백질 이차 구조 예측을 수행하였다. www.genome.jp/tools-bin/clustalw에서 이용 가능한 ClustalW Multiple Sequence Alignment 도구를 사용하여 계통 발생학 분석을 수행하였다. web.expasy.org/compute_pi/에서 이용 가능한 ExPASy Resource Portal을 사용하여 예측 분자량 및 등전점을 결정하였다.

최소 억제 농도 (MIC)의 결정. 미국 임상 검사 표준 연구소 (Clinical and Laboratory Standards Institute: CLSI)에 의해 정의된 표준 브로쓰 미량 희석 기준 방법의 변형을 사용하여 MIC 값을 결정하였다 (문헌 [2015. Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria That Grow Aerobically; Approved Standard-10th Edition. Clinical and Laboratory Standards Institute, Wayne, PA]). 상기 변형은 일부 경우에 CAA 배지 (NaCl 존재 및 부재) 또는 2.5% 사람 혈청으로 보충된 CAA에 의한 Mueller Hinton Broth의 대체에 기초하였다. 본 출원에서 사용되는 바와 같이, MIC는 대조군과 비교하여 세균 성장의 적어도 80%를 억제하기에 충분한 펩타이드의 최소 농도이다.

최소 생물막 제거 농도 (MBEC)의 결정. 변형된 브로쓰 미량희석 MIC 방법의 변형을 사용하여 MBEC 값을 결정하였다 (문헌 [Ceri H et al., 1999. J Clin Microbiol 37:1771-1776; and Schuch R et al., 2017. Antimicrob Agents Chemother 61]). 슈도모나스 아에루기노사 균주 ATCC 17647의 새로운 콜로니를 PBS (0.5 McFarland 단위) 중에 현탁시키고, 0.2% 글루코오스를 포함하는 LB로 1:100 희석하고, 96-웰 Calgary Biofilm Device (Innovotech)의 각 웰에 0.15 ml의 분취량을 첨가하고, 폴리카보네이트 페그 상에 생물막의 형성을 위해 37℃에서 24 시간 동안 인큐베이션하였다. 생물막을 세척하고, 37℃에서 16 시간 동안 TSBg 중에서 2배 희석 시리즈의 각 펩타이드로 처리하였다. 처리 후, 웰을 세척하고, 37℃에서 공기 건조시키고, 10분 동안 0.05% 크리스탈 바이올렛으로 염색하고, 33% 아세트산으로 탈염색하였다. 추출된 크리스탈 바이올렛의 D₆₀₀을 측정하였다. 각 샘플의 MBEC 값은 크리스탈 바이올렛 정량화에 의해 평가된 생물막 바이오 매스의 > 95%를 제거하는데 필요한 최소 약물 농도로서 결정되었다 (미처리된 대조군과 비교함). T4 파지 라이소자임은 음성 대조군으로 사용되었으며, 항-생물막 활성을 제공하지 않는다.

체커보드 검정. 체커 보드 검정은 브로쓰 미량 희석에 의한 MIC 결정을 위한 CLSI 방법의 변형을 기반으로 한다 (CLSI 2015; 및 문헌 [Moody J. 2010. Synergy testing: broth microdilution checkerboard and broth macrodilution methods, p 5.12.11-15.12.23. In Garcia LS (ed), Clinical Microbiology Procedures Handbook, vol 2]). 체커보드는 먼저 96-웰 폴리프로필렌 마이크로타이터 플레이트의 열을 제조함으로써 구성되었으며, 여기서, 각 웰은 수평 축을 따라 2배 희석된 동량의 항생제를 가졌다. 별개의 플레이트에서, 각 웰이 수직 축을 따라 2배 희석된 동량의 펩타이드를 갖는 필적하는 행을 제조하였다. 그 다음, 상기 펩타이드 및 항생제 희석물을 합하여, 각 열 (column)은 일정량의 항생제 및 Chp 펩타이드의 배가 희석물을 포함하였으며, 각 행 (row)은 일정량의 Chp 펩타이드 및 항생제의 배가 희석물을 포함하였다. 따라서, 각 웰은 펩타이드와 항생제의 독특한 조합을 가졌다. 세균을 각 웰에 2.5% 사람 혈청을 함유하는 CAA 중 1 x 10⁵ CFU/mL의 농도로 첨가하였다. 그 다음, 달리 명시되지 않는다면, 각 제제 단독 및 조합물 중 각 제제의 MIC를 주변 공기 중에서 37℃에서 16 시간 후에 기록하였다. 분획 억제 농도 지수 (fractional inhibitory concentration index: FICI)의 합계를 각 약물에 대해 계산하고, 최소 FICI를 사용하여 상승 작용을 결정하였다. FICI를 다음과 같이 계산하였다: FICI = FIC A + FIC B, 여기서, FIC A는 조합물 중 각 항생제의 MIC/각 항생제 단독의 MIC이며, FIC B는 조합물 중 각 Chp 펩타이드의 MIC/각 Chp 펩타이드 단독의 MIC이다. 상기 조합물은, FICI가 ≤0.5일 때 상승 작용을 가지며, FICI가 >0.5 내지 <1일 때 강력한 상가 작용을 가지며, FICI가 1 ~ <2일 때 상가 작용을 가지며, FICI가 ≥2일 때 길항 작용을 갖는 것으로 간주된다. 아미카신, 아지트로마이신, 아즈트레오남, 시프로플록사신, 콜리스틴, 포스포마이신, 겐타마이신, 이미페넴, 피페라실린, 리팜피신 및 토브라마이신을 비롯한 11개의 다양한 상이한 항생제에 대해 Chp2 또는 Chp4의 조합물을 갖는 CAA/HuS 중에서 슈도모나스 아에루기노사 균주 CFS-1292를 사용하여 체커보드 검정을 수행하였다. ≤0.5의 FICI 값이 대부분의 조합에서 관찰되었으며, 이는 광범위한 항생제와 상승 작용하는 Chp2 및 Chp4의 능력을 나타낸다 (하기 표 8 참조). 이러한 결과는 Chp 펩타이드가 항생제의 존재하에 강력한 항균 활성을 제공할 수 있다는 것을 시사한다.

Chp 펩타이드 용혈 활성의 검정. 용혈 활성을 사람 적혈구의 용해에 의해 방출되는 헤모글로빈의 양으로서 측정하였다 (문헌 [Lv Y et al, 2014. PLoS One 9:e86364]). 간단히 말하자면, 헤파린을 함유하는 폴리카보네이트 튜브 중의 풀링된 건강한 공여자 (BioreclamationIVT)로부터 수득된 3 ml의 새로운 사람 혈액 세포 (hRBC)를 1,000xg로 4℃에서 5분 동안 원심 분리하였다. 수득된 적혈구를 포스페이트 완충 식염수 (phosphate-buffered saline: PBS) 용액 (pH 7.2)으로 3회 세척하고, 30 ml의 PBS 중에 재현탁시켰다. 50 μl 부피의 적혈구 용액을 37℃에서 1 시간 동안 2배 희석 범위 (128 μg/mL 내지 0.25 μg/mL)의 50 μl의 각 Chp 펩타이드 (PBS 중)과 함께 인큐베이션하였다. 온전한 적혈구를 1,000xg로 4℃에서 5분 동안 원심 분리하여 펠렛화하고, 상청액을 새로운 96-웰 플레이트에 옮겼다. 570 nm의 광학 밀도 (optical density: OD)에서 흡광도를 측정함으로써 헤모글로빈의 방출을 모니터링하였다. 최소 용혈 농도는 시각적 용해를 나타내는 최저 펩타이드 농도 (미처리된 대조군 샘플의 ≥5%의 OD 값을 초래하는 최소 농도에 상응함)로서 결정되었다. 0.1% Triton X-100 또는 RR12, RR12polar 및 RR12hydrophobic (문헌 [Mohanram H. et al, 2016. Biopolymers 106:345-356])을 비롯하여 공지된 용혈 활성을 갖고 RI18 (문헌 [Lyu Y. et al., 2016. Sci Rep 6:27258]) 및 RR22를 비롯하여 용혈 활성을 거의 갖지 않거나 젼혀 갖지 않는 일련의 항균 펩타이드 각각으로 상기에서와 같이 처리된 PBS 중에 hRBC를 포함하는 추가의 대조군을 사용하였다.

Chp 펩타이드 활성의 시간-사멸 검정. 슈도모나스 아에루기노사 균주 CFS-1292의 밤새 배양물을 2.5% 사람 혈청을 갖는 새로운 CAA 배지 (CAA/HuS)로 1:100 희석하고, 교반하면서 37℃에서 2.5 시간 동안 성장시켰다. 그 다음, 지수기 세균을 CAA/HuS로 1:100 희석하고, 펩타이드를 1 또는 10 μg/mL의 최종 농도로 첨가하였다. 펩타이드를 첨가하지 않은 대조군 배양물 (즉, 완충액 대조군)을 포함시켰다. 배양물을 통기하면서 37℃에서 인큐베이션하고, 1 시간, 3 시간 및 24 시간 시점에서 CAA 한천 플레이트 상의 정량적 플레이팅을 위해 샘플을 제거하였다.

현미경 검사. LB 중에서 2.5 시간 동안 성장시킨 슈도모나스 아에루기노사 균주 CFS-1292의 분취량을 PBS로 세척하고, PBS 또는 100% 사람 혈청 중에 재현탁시키고, 10 μg/mL의 최종 농도로 펩타이드 Chp2의 존재 및 부재하에 실온에서 15분 동안 처리하였다. 살아 있는/죽은 세포 생존력 키트 (ThermoFisher)를 사용하여 제조업자의 프로토콜에 따라 샘플 서브 세트를 염색하고, 비분 간섭 대비 (DIC) 현미경 검사 및 형광 현미경 검사로 검사하였다.

실시예 1: Chp 펩타이드의 확인

그람 음성 세균 클라미디아를 특이적으로 감염시키고 사멸시키는 특정한 불충분하게 설명된 박테리오파지 (클라미디아마이크로바이러스)에 대한 지식을 가지고, 공개된 이들 유기체 게놈을 연구하였으며, 처음에는 신규한 리신을 확인하기 위해 조사하였지만, 리신 유사 서열이나 이전에 기재된 아무린과 유사한 서열은 관찰되지 않았다. 클라미디아는 구조에서 다른 세균 만큼 풍부하게 펩티도글리칸 (공지된 리신의 표적)을 이용하지 않지만, 오히려 클라미디아는 일반적으로 분열 중에 펩티도글리칸만을 사용한다. 따라서, 클라미디아 파지의 표적이 무엇인지에 대한 의문이 제기되었다. 클라미디아 파지가 이의 표적을 침입하는 메커니즘은 이전에 공지된 메커니즘과 상이할 수 있으며, 이의 표적은 그람 음성 세균의 외막의 주성분 및 외막의 리신에 의한 침투에 대한 장애인 지질 다당류 (LPS)와 상이하고 이에 집중될 수 있다.

유사한 기능을 시사하는 동염색체 유전자좌, 즉, 유전적으로 관련된 파지 그룹의 게놈에서 동일한 위치에 있는 유사 유전자를 확인하기 위해 공개된 클라미디아마이크로바이러스 게놈을 연구하였다. 이전에 확인된 항미생물성 펩타이드 (AMP)와 매우 유사한 분자 전하 프로파일을 갖는 작은 고도 양이온성 펩타이드가 확인되었다. 클라미디아 파지 서열은 AMP, 리신 또는 공지된 아무린 단백질 (예를 들어, 단백질 A2, 단백질 E 및 기타)과 단백질 서열 유사성을 갖지 않았지만, 전체 양 전하는 두드러진 특징이었다. 상기에서 기재된 바와 같은 생물 정보학 기술 (JPRED 및 iTASSAR)을 사용하여, 많은 AMP의 홀마크 특징인 알파 나선의 존재를 드러내는 구조 예측을 수행하였다. 알파 나선, 전체 전하, 클라미디아 간 보존 및 관련 그람 음성 세균 파지 게놈 모두는 이러한 단백질이 이전에 특성화되지 않은 파지 용균 폴리펩타이드의 계열을 나타낼 수 있으며 이전에 기재되지 않은 파지 용균 메커니즘을 정의할 수 있다는 것을 시사하였다. 크기가 작고 가용성 (전하 프로파일에 기초함)인 것으로 예측되었다는 사실은, 일단 합성되면 이들은 이들을 감수성 세균 배양물에 단순히 첨가함으로써 용이하게 테스트를 잘 받아 들일 것 같다는 것을 또한 의미한다.

상술한 내용에 기초하여, GenBank 데이터베이스의 마이크로비리대 게놈과 특별히 클라미디아마이크로바이러스 게놈 (및 하기에서 기재된 일부 다른 바이러스)으로부터 동염색체 유전자좌 내의 12개의 보존된 서열을 추출하였다. 12개의 보존된 서열은 가상적이거나 특성화되지 않거나 비구조적인 단백질로만 주석으로만 주석을 달았으며, 알파-나선 구조를 채택할 것으로 예측되는 작은 (추정적으로) 양이온성 단백질을 인코딩하였다. 이러한 12개의 서열은 표 1에 제시되어 있다. 표 1의 펩타이드들 중 하나인 Chp5는 양으로 하전된 아르기닌 및 라이신을 음 전하의 아미노산 잔기로 대체하여 Chp4와 상이한 분자 전하를 갖도록 합성되었다. Chp5는 불활성일 것으로 예측되었다. 이러한 펩타이드들은 다른 용균 또는 항미생물성 단백질과 서열 유사성을 나타내지 않지만, 대규모 항균제 AMP 계열의 서브 세트와 유사한 알파-나선 구조 (예를 들어, 도 1 참조)를 채택할 것으로 예측된다. Chp 펩타이드는 유래된 파지에 대해 숙주 용해 기능을 수행할 것으로 가정되었다.

상술한 고려 사항에 기초하여, 그람 음성 세균을 감염시키는 다른 파지 (클라미디아마이크로바이러스와 관련, 동일 계열인 마이크로비리대에서) 뿐만 아니라 동일한 동염색체 (synteny) 및 전하 프로파일을 제공하는 다른 특성화되지 않은 공급원의 게놈에 대한 추가의 연구는 표 2에 열거된 29개의 추가의 펩타이드를 생성하였다. 촐괄하여, 모든 41개의 펩타이드 (Chp5 제외)는 신규한 파지 용해제의 관련 계열을 형성한다. 이들은 마이크로박테리움 (Microbacterium)으로부터 유래되는 Myo1 (서열 번호 102)을 제외하고는 모두 마이크로비리대 공급원으로부터 유래된다.

또한, 이들 펩타이드들 중 일부를 변형하여 새로운 변이체를 합성하였다. 특히, Chp2의 경우, D-형태가 항균 활성을 증진시킬 수 있는지 여부를 확인하기 위해, 각각의 양으로 하전된 아미노산 (아르기닌 및 라이신)의 L-형태는 해당 아미노산의 D-형태를 대체하였다.

이러한 변형은 Chp2-M1 (서열 번호 81)을 생성하였다. Ecp1-M1 서열 번호 87), Chp6-M1 서열 번호 88), Chp10-M1 서열 번호 89), Mse-M1 서열 번호 90), Chp4-M1 서열 번호 91), Chp2-SCR-M1 서열 번호 93), Chp7-M1 서열 번호 95), Osp-M1 서열 번호 96), Unp2-M1 서열 번호 97), Unp3-M1 서열 번호 98), Spi2-M1 서열 번호 99), Ecp3-M1 서열 번호 100) 및 Agt1-M1 (서열 번호 101)에 도달하도록 본래의 Chp 펩타이드 또는 Chp 펩타이드의 변형된 변이체로부터 유사한 D 형태 변이체를 생성하였다.

Chp2의 경우와 마찬가지로, C-말단에 시스테인 잔기를 부가하여 Chp2-Cys (서열 번호 82)에 도달하고, 이전에 알파 나선 안정성을 부여하고 염의 존재하에 활성을 촉진하는 것으로 나타난 추가의 잔기를 C-말단 및 N-말단 모두에 부가하여 Chp2-NC (서열 번호 83)에 도달하였다. 문헌 [Park et al., Helix stability confers salt resistance upon helical antimicrobial peptides, J. Biol. Chem. (2004); 279(14):13896-901].

Chp4::Chp2 (서열 번호 84)는 Chp4 (서열 번호 4) 및 Chp2 (서열 번호 2)로부터의 알파 나선을 포함하는 융합 펩타이드이다. Chp2-CAV (서열 번호 85) 및 Ecp1-CAV (서열 번호 86)는 전하 어레이 변이체이며, 여기서, 다양한 아미노산 전하는 양친매성 나선을 유지하도록 재정렬되었다. Chp2-SCR1 (서열 번호 92)은 Chp2 (서열 번호 2)의 변형된 변이체이며, 여기서, 상기 아미노산 잔기는 대조군 펩타이드를 생성하도록 스크램블되었다.

따라서, 모든 Chp 계열 구성원 (각 펩타이드의 특정 특징 포함)의 완전한 목록은 표 1, 표 2 및 표 C에 제공되어 있다. 이러한 그룹에는 11개의 상이한 클라미디아마이크로바이러스로부터 유래된 펩타이드 Chp1~4 및 6~12 및 CPAR39가 포함되고, 표 1에 기재되어 있으며; Chp2 및 Chp3 펩타이드는 2개의 상이한 파지로부터 유래된 2개의 동일한 펩타이드이다. 상기에서 명시된 바와 같이, Chp5는 아르기닌 및 라이신을 비롯한 모든 양으로 하전된 아미노산을 글루타민 및 글루타민산을 비롯한 음으로 하전된 아미노산으로 대체하여 생성된 Chp4의 변형된 유도체이다. 추가의 Chp 계열 구성원은 클라미디아마이크로바이러스 단백질과의 상동성에 의해 확인되었으며, 표 2 ("추가의 Chp 계열 구성원")에 기재되어 있다. 상기 추가의 Chp 계열 구성원은 클라미디아마이크로바이러스 공급원이 아니라 추정상 마이크로비리대 및 마이크로박테리움 파지 공급원으로부터 유래한다. 표 C는 상기에서 논의된 바와 같은 D-형태 변이체 및 전하 어레이 변이체를 비롯한 Chp 펩타이드의 여러 변형된 변이체를 제공한다. 표 C에서, 이탤릭체로 굵게 표시된 아미노산은 L-형태에서 D-형태로 변경된 아미노산 잔기를 나타낸다.

[표 1] - 클라미디아 파지 (Chp) 유도된 용균제

[표 2] - 추가의 Chp 계열 구성원

[표 C] - 변형된 Chp 펩타이드 계열 구성원

여러 Chp 계열 구성원의 단백질 서열 상동성에 대한 추가의 정보는 표 3에 제공되어 있다. Chp1, Bdp1, Lvp1 및 Lvp2는 예측된 활성이 GenBank 주석에 표시되어 있는 유일한 Chp 계열 구성원이다. Chp1 (GenBank 서열 NP_044319.1)은 DNA 결합 단백질로서 주석이 달려 있지만, 이를 뒷받침하는 데이터는 제공되지 않으며, 주석은 숙주 용해에서 추정 역할과 일치하지 않는다. 전반적으로, Chp 단백질은 서로 39~100% 동일하며, 단백질 서열 데이터베이스의 다른 펩타이드와 상동이 아니다. Chp 계열의 특정 구성원을 보여주는 뿌리 내린 계통수 및 뿌리 뽑힌 계통수는 각각 도 2a와 2b에 나타나 있다.

[표 3] - Chp 계열 단백질의 주석 및 유사성

실시예 2: Chp 펩타이드의 합성

서비스 당 요금 기준으로 GenScript (NJ, USA)에 의해 캡핑 [N-말단 아세틸화 (Ac) 및 C-말단 아미드화 (NH₂)]을 갖는 모든 Chp 펩타이드를 합성하였다. GenScript는 고성능 액체 크로마토 그래피 (HPLC) 및 질량 분광법 (MS)을 통해 각 펩타이드의 순도를 평가하였다. GenScript는 또한 모든 펩타이드에 대한 용해도 테스트를 수행하고, Vario MICRO 유기 원소 분석기를 사용하여 순 펩타이드 함량 (NPC %)을 결정하였다. Chp5, Lvp1 및 Lvp2를 제외하고, 모든 펩타이드는 물에 가용성이었으며, 1 mg/mL, 5 mg/mL 또는 10 mg/mL의 농도로 현탁하였다. Chp5 및 Lvp1을 10 mg/mL의 농도로 DMSO 중에 현탁하였으며; Lvp2를 2 mg/mL의 농도로 DMSO 중에 현탁하였다. Ecp1-CAV의 용해도는 결정되지 않았다. 대조군 펩타이드 RI18, RP-1, WLBU2, BAC3, GN-2 amp, GN-3 amp, GN-4 amp, GN-6 amp 및 Bac8c도 또한 상기와 같이 GenScript에서 합성하였다. 모든 추가의 펩타이드는 GenScript 또는 Anaspec으로부터 구입한 시판 제품이었다.

실시예 3: Chp 펩타이드의 활성 - 그람 음성 세균에 대한 최소 억제 농도 (MIC)

Chp 펩타이드 (Chp2와 동일한 펩타이드 서열을 갖는 Chp3 제외)를 합성하고 항미생물 감수성 테스트 (antimicrobial susceptibility testing: AST) 형식으로 검사하였다. 100% CAA 배지, 2.5% 사람 혈청으로 보충된 CAA 배지, 및 12.5% 사함 혈청으로 보충된 CAA 배지에서 카바페넴 내성 슈도모나스 아에루기노사 임상 분리주 CFS-1292에 대해 MIC 값을 결정하였다 (표 4). Chp1, Chp2, Chp4, Chp6, CPAR39 (디티오트레이톨 (DTT) 함유), Chp7, Chp8, Chp10, Chp11, Ecp1, Ecp2, Osp1, Spi1, Gkh3, Unp2, Unp5, Unp6, Ecp3, Ecp4, Lvp1, ALCES1, AVQ206, CDL907, AGT915, SBR77, Chp2-M1, Chp2-Cys, Chp4::Chp2 및 Chp2-CAV를 비롯한 여러 펩타이드는 2.5% 사람 혈청으로 보충된 CAA 배지에서 0.25~4 μg/mL 범위의 우수한 MIC 값을 나타냈다. 펩타이드 Chp5, CPAR39 (DTT 부재), Gkh1, Unp1, Spi2 및 Bdp1은 활성이 불충분하였으며, 2.5% 사람 혈청으로 보충된 CAA 배지에서 ≥32 μg/mL의 MIC 값을 나타냈다. 또한, 몇몇 펩타이드는 또한 하기 실시예 14에 기재된 바와 같이 12.5% 사람 혈청으로 보충된 CAA 배지에서 0.25~4 μg/mL 범위의 우수한 MIC 값을 나타냈다.

CPAR39는 내부 시스테인 잔기를 함유하고 활성을 위해 0.5 mM DTT의 존재를 필요로 하기 때문에 이러한 그룹에서 독특하다. Chp5는 모든 양으로 하전된 잔기가 음전하로 변경된 Chp4의 유도체로서 설계되었으며; 양이온성 AMP 연구에 기초하여, 양이온성 잔기는 항균 활성을 위해 필요하며, 음이온성 잔기에 의한 양이온성 잔기의 제거는 활성을 제거할 것으로 예측된다. 따라서, Chp5 (MIC>64 μg/mL)는 Chp4 (MIC=0.5 μg/mL)의 불활성 변이체이다. CPAR39 (DTT 부재)와 Chp5 둘 다는 음성 대조군으로서 사용된다.

[표 4]

특정 주요 ESKAPE 병원체를 포함하는, 슈도모나스 아에루기노사, 에세리키아 콜라이, 엔테로박터 클로아카, 클렙시엘라 뉴모니아 및 아시네토박터 바우마니를 비롯한 다양한 그람 음성 유기체에 대해 펩타이드 Chp1, Chp2, Chp4, CPAR39 (DTT 부재), Chp6, Ecp1 및 Ecp2를 사용하여 추가의 MIC 테스트를 수행하였다 (표 5). 사람 혈청의 존재에 대한 표적 유기체의 차등 감수성으로 인해, 테스트를 2.5% 사람 혈청으로 보충되지 않은 CAA (생리학적 염 농도 함유)에서 수행하였다. 1~4 μg/mL의 우수한 MIC 값이 Chp2, Chp4, Chp6, Ecp1 및 Ecp2에 대해 테스트된 모든 균주에 대해 관찰되었으며, 이는 생리학적 염 농도의 맥락에서 본 발명의 Chp 펩타이드에 대한 광범위한 스펙트럼 활성을 나타낸다. Chp2 및 Ecp1을 살모넬라 티피무리움에 대해 추가로 테스트하였으며, MIC는 2 μg/mL인 것으로 입증되었다.

[표 5]

사람 혈청으로 보충된 CAA에서 ESKAPE 병원체 에세리키아 콜라이, 엔테로박터 클로아카, 클렙시엘라 뉴모니아 및 아시네토박터 바우마니에 대한 여러 펩타이드에 대해 추가의 MIC 테스트를 수행하였다 (표 D). 1~4 μg/mL의 우수한 MIC 값이 표 D에 나타난 바와 같이 여러 펩타이드에 대해 테스트된 모든 균주에 대해 관찰되었다.

[표 D]

이론에 구속시키고자 하는 것은 아니지만, 라이신 대신에 Chp 펩타이드의 특정 위치에서의 아르기닌의 존재가 그람 음성 ESKAPE 병원체에 대해 증진된 활성에 기여할 수 있는 것으로 가정된다.

50% 사람 혈장 또는 사람 혈청으로 보충된 Mueller-Hinton 브로쓰에서 실험실 슈도모나스 아에루기노사 균주 PAO1에 대해, Chp2와 Chp4 둘 다에 대한 MIC 값을 또한 결정하고, 문헌의 다양한 AMP (선천성 면역 이펙터 및 이의 유도체 포함)와 비교하였다 (표 6). 여기서, PAO1 (실험실 분리주)의 사용은 상승된 혈청 또는 혈장 농도의 존재하에 테스트를 가능하게 하며; 대부분의 임상 분리주와 달리, PAO1은 사람 혈액 매트릭스의 항균 활성에 민감하지 않다. 표 6에서, Chp2 및 Chp4에 대한 MIC 값은 2 μg/mL이었으며; 비교해 보면, RI18과 프로테그린만이 유사하게 활성이었고 (MIC = 1~4 μg/mL), 테스트된 18개의 추가의 펩타이드는 불활성이거나 활성이 낮았다.

[표 6]

실시예 4: Chp 펩타이드의 활성 - 그람 음성 세균의 생물막의 제거

항-생물막 활성을 평가하기 위해, 2% 글루코오스로 보충된 트립신 소화성 대두 브로쓰 배지에서 슈도모나스 아에루기노사 균주 ATCC 17647에 의해 형성된 성숙 생물막에 대해 펩타이드 Chp2 및 Chp4에 대한 MBEC (최소 생물막 제거 농도) 값을 결정하였다. 0.25 μg/mL의 MBEC 값이 Chp2와 Chp4 둘 다에 대해 관찰되었으며 (표 7), 이는 성숙 생물막을 제거하는 강력한 능력과 일치한다. 비교해 보면, 높은 활성 AMP (15)인 RI18의 활성은 4 μg/mL로 상당히 낮은 것으로 관찰되었으며, 낮은 활성 리신인 T4 라이소자임의 활성은 >64 μg/mL인 것으로 관찰되었다.

[표 7]

5종의 그람 음성 세균의 8개의 상이한 균주에서 Chp2, Chp2-M1 및 Chp10-M1에 대해서도 마찬가지로 MBEC 값을 결정하였다. LB 배지에서 24 시간에 걸쳐 생물막을 형성하고, 포스페이트 완충 식염수로 세척한 다음, Chp 펩타이드 또는 대조군 (LL-37 항미생물성 펩타이드 또는 토브라마이신 항생제)으로 16 시간 동안 처리하였다. 그 다음, 생물막을 세척하고, 크리스탈 바이올렛으로 염색하여 MBEC를 시각화하였다. 하기 표 8에 나타낸 결과는 Chp2, Chp2-M1 및 Chp10-M1 모두가 강력한 항생물막 활성을 나타낸다는 것을 입증한다.

[표 8]

실시예 5: Chp 펩타이드와 항생제의 조합

Chp2 또는 Chp4와 11개의 다양한 항생제 사이의 상승 작용을 평가하기 위해, 2.5% 사람 혈청으로 보충된 CAA 배지에서 슈도모나스 아에루기노사 균주 CFS-1292를 사용하여 표준 체커보드 검정 형식으로 Chp2와 11개의 항생제의 조합 및 Chp4와 11개의 항생제의 조합을 각각 테스트하였다. 체커보드 검정에서, 분획 억제 농도 지수 (FICI) 값을 계산한다. ≤0.5의 FICI 값은 상승 작용과 일치하고, >0.5~1의 값은 강력한 상가 활성과 일치하고, 1~2의 값은 상가 활성과 일치하며, >2의 값은 길항 작용으로 간주된다. 하기 표 9에 나타난 바와 같이, Chp2와 Chp4 둘 다의 경우, 값은 Chp 펩타이드와 항생제 사이의 상승 작용 (즉, ≤0.5) 또는 강력한 상가 (즉, >0.5~1) 상호 작용과 일치하였다.

[표 9]

슈도모나스 아에루기노사 균주 CFS-1292와 동일한 방법을 사용하여, Chp2, Chp2-M1, Chp4-M1, Chp6-M1, Chp10-M1 및 Unp2-M1에 대해 추가의 FICI 값을 계산하였다. 그 결과는 하기 표 10~15에 나타나 있다. 테스트된 모든 Chp 펩타이드의 경우, FICI 값은 Chp4-M1 및 이미페넴을 제외하고 Chp 펩타이드와 항생제 사이의 상승 작용 (즉, ≤0.5) 또는 강력한 상가적 (즉, >0.5~1) 상호 작용과 일치하였다.

[표 10] - Chp 2 및 슈도모나스 아에루기노사 FICI 값

[표 11] - Chp2-M1 및 슈도모나스 아에루기노사 FICI 값

[표 12] - Chp4-M1 및 슈도모나스 아에루기노사 FICI 값

[표 13] - Chp6-M1 및 슈도모나스 아에루기노사 FICI 값

[표 14] - Chp10-M1 및 슈도모나스 아에루기노사 FICI 값

[표 15] - Unp2-M1 및 슈도모나스 아에루기노사 FICI 값

클렙시엘라 뉴모니아 균주 1139와 동일한 방법을 사용하여, Chp2, Chp2-M1, Chp4-M1, Chp6-M1, Chp10-M1 및 Unp2-M1에 대해 FICI 값을 또한 계산하였다. 그 결과는 하기 표 16~21에 나타나 있다. 테스트된 모든 Chp 펩타이드의 경우, 상기 값은 Chp 펩타이드와 항생제 사이의 상승 작용 (즉, ≤0.5) 또는 강력한 상가적 (즉, >0.5~1) 상호 작용과 일치하였다.

[표 16] - Chp2 및 클렙시엘라 뉴모니아 FICI 값

[표 17] - Chp2-M1 및 클렙시엘라 뉴모니아 FICI 값

[표 18] - Chp4-M1 및 클렙시엘라 뉴모니아 FICI 값

[표 19] - Chp6-M1 및 클렙시엘라 뉴모니아 FICI 값

[표 20] - Chp10-M1 및 클렙시엘라 뉴모니아 FICI 값

[표 21] - Unp2-M1 및 클렙시엘라 뉴모니아 FICI 값

아시네토박터 바우마니 균주 30과 동일한 방법을 사용하여, Chp2, Chp2-M1, Chp4-M1, Chp6-M1, Chp10-M1 및 Unp2-M1에 대해 FICI 값을 또한 계산하였다. 그 결과는 하기 표 22~27에 나타나 있다. 테스트된 모든 Chp 펩타이드의 경우, 상기 값은 Chp 펩타이드와 항생제 사이의 상승 작용 (즉, ≤0.5) 또는 강력한 상가적 (즉, >0.5~1) 상호 작용과 일치하였다.

[표 22] - Chp2 및 아시네토박터 바우마니 FICI 값

[표 23] - Chp2-M1 및 아시네토박터 바우마니 FICI 값

[표 24] - Chp4-M1 및 아시네토박터 바우마니 FICI 값

[표 25] - Chp6-M1 및 아시네토박터 바우마니 FICI 값

[표 26] - Chp10-M1 및 아시네토박터 바우마니 FICI 값

[표 27] - Unp2-M1 및 아시네토박터 바우마니 FICI 값

실시예 6: Chp 펩타이드의 용균 활성의 평가

침습성 감염을 치료하는데 사용할 수 있는 항미생물성 펩타이드는 적혈구에 대해 낮은 독성을 나타내야 한다 (문헌 [Oddo A. et al, 2017. Methods Mol Biol 1548:427-435]). 용혈 활성에 대한 가능성을 검사하기 위해, 사람 적혈구에 대한 최소 용혈 농도 (minimal hemolytic concentration: MHC)의 결정에 기초하여 적혈구를 용해하는 AMP의 능력을 측정하기 위한 흔한 방법 (상기 재료 및 방법에 기재됨)을 사용하였다. 테스트된 대부분의 Chp 펩타이드의 경우, 어떠한 용혈의 증거도 관찰되지 않았으며 MHC 값은 >128 μg/mL이었다 (표 28). Triton X100 대조군을 2%의 시작 농도에서 테스트하였으며, MHC는 5% 초과의 용해가 관찰되는 펩타이드의 최소량이다. 비교해 보면, WLBU2, RI18, R12, RR12p 및 RR12h를 비롯한 공지된 용혈 활성을 갖는 5개의 AMP는 4~128 μg/mL 범위의 MHC 값으로 관찰되었다. 용혈 검정에서 양성 대조군으로서 흔히 사용되는 막 용해 계면 활성제 (detergent)인 Triton X-100은 2% 내지 0.007%의 농도 범위에 걸쳐 용혈되었다. 이러한 결과는 Chp 펩타이드가 AMP에 대해 흔히 관찰되는 시험관내 독성 (즉, 용혈 활성)으 갖지 않는다는 것을 시사한다. 이러한 특성은, 서열 동일성 퍼센트, 3D 구조 유사성 및 전하 프로파일 뿐만 아니라 용해제로서의 본 발명의 펩타이드가 그람 음성 세포 외피에 대해 매우 높게 특이적일 가능성이 높다는 기대에 기초하여, 표 1, 2 및 C의 나머지 Chp 펩타이드에 대해 예상된다.

[표 28] - 사람 적혈구에 대해 결정된 최소 용혈 농도 (MHC) 값

실시예 7: 그람 음성 세균에 대한 용균 활성의 지속 기간

재료 및 방법에서 기재된 바와 같이 2.5% 사람 혈청을 함유하는 CAA를 사용하여 Chp2 및 Chp4의 활성을 시간-사멸 형식으로 슈도모나스 아에루기노사 균주 CFS-1292에 대해 검사하였다. 1 μg/mL 및 10 μg/mL 농도의 Chp2 또는 Chp4에 의한 처리 후 1, 3 및 24 시간에서의 세균 생존력의 평가는 모든 경우에서 강력한 살균 활성과 일치하는 다중 로그 배수 감소를 초래하였다 (표 29). 표 29은 2.5% 사람 혈청으로 보충된 CAA에서의 처리 후 슈도모나스 아에루기노사 균주 CFS-1292에 대한 시간-사멸 형식을 사용하여 결정된 콜로니 형성 단위의 로그 감소 (처리되지 않은 대조군과 비교)를 제시한다.

[표 29]

슈도모나스 아에루기노사, 클렙시엘라 뉴모니아 및 아시네토박터 바우마니에 대해 0.2x, 1x 및 5x MIC (및 완충액 대조군)에서 13개의 상이한 Chp 펩타이드를 사용하여 추가의 24 시간 동안 시간-사멸 검정을 수행하였다. 통기와 함께 37℃하에 CAA 배지에서 시간-사멸 검정을 수행하였다. 정량적 플레이팅을 0 시간, 1 시간, 3 시간 및 24 시간의 시간에서 수행하였다. 다음 Chp 펩타이드를 평가하였다: Chp2, Chp4, Chp2-M1, Chp4-M1, Chp6, Chp6-M1, Chp10, Chp10-M1, Ecp3, Ecp3-M1, Unp2, Unp2-M1 및 Ecp1-M1.

테스트된 13개의 모든 Chp 펩타이드는 미처리된 대조군 완충액과 비교하여 슈도모나스 아에루기노사의 Log₁₀ CFU/mL를 유의하게 감소시켰으며, Chp10을 제외한 모두는 최대 24 시간 동안 강력한 효능을 유지하였다. 마찬가지로, 테스트된 13개의 모든 Chp 펩타이드는 미처리된 대조군 완충액과 비교하여 클렙시엘라 뉴모니아의 Log₁₀ CFU/mL를 유의하게 감소시켰으며, 최대 24 시간 동안 강력한 효능을 유지하였다. 테스트된 13개의 모든 Chp 펩타이드는 미처리된 대조군 완충액과 비교하여 아시네토박터 바우마니의 Log₁₀ CFU/mL를 유의하게 감소시켰으며, Chp10-M1을 제외한 모두는 최대 24 시간 동안 강력한 효능을 유지하였다.

추가로, 실시예 2에서 상기에서 기재된 바와 같이 제조된 펩타이드의 인큐베이션 후 MIC의 배수 변화를 검출하기 위해 안정성 평가를 수행하였다. 10분, 1 시간 및 2 시간 후 37℃에서 100% 사람 혈청에서의 인큐베이션 후 안정성을 평가하였다. 그 결과는 하기 표 30에 나타나 있다.

[표 30]

표 30에서 나타난 바와 같이, Chp1, Chp2, CPAR39, Chp4, Chp5, Chp6, Chp7, Chp8, Chp9, Chp10, Chp11, Chp12, Gkh1, Gkh2, Gkh3, Ecp1, Ecp2, Ecp3, Osp1, Unp1, Unp2, Unp3, Unp5, Unp6, Spi1, Spi2, Bdp1, Lvp2, ALCES1, AVQ206, AVQ244, CDL907, AGT915, SBR77, Chp2-M1, Chp2-Cys, Chp2-NC, Chp4::Chp2 및 Chp2-CAV 모두는 10분, 1 시간 및 2 시간 후에 충분히 안정하였다.

상기에서 논의된 동일한 방법을 사용하여 100% CAA 및 토끼 혈청에서 안정성 평가를 추가로 수행하였다. 하기 표 31에 나타낸 결과는 Chp 펩타이드가 37℃에서 2 시간 동안 토끼 혈청 및 100% CAA 성장 배지에서 안정하다는 것을 나타낸다.

[표 31] - 100% CAA 및 토끼 혈청에서의 안정성 평가

4℃ 및 24℃에서 인큐베이션 동안 래트 혈청 및 말 혈청의 안정성 뿐만 아니라 토끼 혈청 및 100% CAA의 안정성도 관찰하였다. 어떤 경우에도 침전이 관찰되지 않았다.

실시예 8: 비결핵 마이코박테리움(NTM) 및 마이코박테리움 투베르쿨로시스 균주 모두에서 MIC 측정

96웰 미세 역가 형식의 브로쓰 미량 희석에 대한 CLSI 방법을 사용하여 다양한 Chp 펩타이드에 대한 MIC 값을 결정하였다. 각 펩타이드를 x축을 가로질러 2배 희석하고, Mueller Hinton 브로쓰 배지에서 대략 1x105개 세포/mL를 갖는 고정 농도의 다음 NTM 균주와 합하였다: 마이코박테리움 스메그마티스, 마이코박테리움 포르투이툼, 마이코박테리움 아비움, 마이코박테리움 스크로풀라세움 및 마이코박테리움 인트라셀룰라레. 플레이트를 37℃에서 45시간 동안 인큐베이션하고, MIC를 결정하였다. 결과는 하기 표 32에 나타나 있다.

[표 32]

표 32에서 나타낸 바와 같이, Chp 펩타이드는 여러 NTM 균주에 대해 다양한 수준의 활성을 나타냈다. 예를 들어, ALCES1, Chp2-M1, Ecp-M1, Chp6-M1, Ecp-M1, Chp4-M1, Chp10, Chp10-M1, Unp2-M1, Agt1 및 Spi2-M1을 비롯한 11개의 Chp 펩타이드는 마이코박테리움 스메그마티스에 대해 1 μg/mL 이하의 강한 MIC 값을 나타냈다.

다음으로, 2개의 상이한 마이코박테리움 투베르쿨로시스 균주에 대해 96웰 미세 역가 형식의 브로쓰 미량 희석에 대한 상기 CLSI 방법을 사용하여 다양한 Chp 펩타이드에 대한 MIC 값을 결정하였다. NTM 균주에 대해 상기에서 설명한 바와 같이 MIC를 결정하였다. 그 결과는 하기 표 33에 나타나 있다.

[표 33]

실시예 9: 이식된 혈액 투석 카테터에서 Chp 펩타이드의 항생물막 활성

카테터 관련 혈류 감염으로 의심되는 혈액 투석 환자로부터 제거된 3개의 이식된 투석 카테터 샘플에서 사람 생물막에 대한 Chp2-M1의 활성을 조사하였다. 이식된 혈액 투석 카테터를 동일한 길이로 절단하고, 이등분하여 내강을 노출시켰다.

생물막 세균의 회수 및 정량화를 위해, 문헌 [Jorgensen et al., A modified chronic infection model for testing treatment of Staphylococcus aureus biofilms on implants, PLoS ONE 2014; 9:e103688]에서 제시된 표준 방법론에 따라 Precellys® 24 조직 균질화기 (Bertin Technologies)로 카테터 분절을 균질화하였다.

한천 상에 정량적 플레이팅을 수행하고, CFU 수, 용혈성 표현형 평가, 배양 순도 및 스테노트로포모나스 종 콜로니화에 대해 관찰하였다. 종 동정을 16s rRNA 증폭 산물의 서열 분석에 의해 수행하고, Chp2-M1에 대해 MIC를 결정하였다.

연구된 3개의 카테터 샘플 중 첫 번째의 경우, 분절을 다음 그룹에 무작위로 할당하였다 (N = 그룹 당 3개 분절): (1) 완충액 대조군 (즉, Lactated Ringer 용액 처리); (2) 예를 들어, 그 전문이 본 출원에 참조로 포함되는 Fischetti 등의 미국 특허 US 9,034,322에 개시된 바와 같은 야생형 PlySs2 리신인 1 μg/mL CF-301 처리; (3) 1 μg/mL의 답토마이신 단독 처리; 및 (4) 10 μg/mL의 Chp2-M1 단독 처리. Lactated Ringer 용액으로 헹구기 전에, 샘플을 37℃에서 4 시간 동안 처리하였다.

하기 표 34에 나타낸 바와 같이, Chp2-M1은 10 μg/mL에서 첫 번째 카테터 샘플의 스테노트로포모나스 함유 생물막을 제거한 반면, 1 μg/mL의 CF-301 및 답토마이신은 제거하지 못하였다.

[표 34] - 카테터 생물막에 대한 CF-301, 답토마이신 및 Chp2-M1의 효과

첫 번째 카테터 샘플로부터 회수된 세균 콜로니는 혈액 한천 플레이트 상에서 균일한 표현형을 나타냈는데, 이는 단일 미생물 생물막을 시사한다. 16s rRNA 증폭 산물 서열 분석 (Charles River)은 주로 슈도모나스 (스테노트로포모나스) 종과 관련된 서열을 산출하였으며, 유기체는 Chp2-M1에서 2 μg/mL의 MIC 값을 나타냈다.

다음으로, 동일한 카테터의 상이한 부분으로부터 수득된 나머지 2개의 카테터 샘플의 생물막에 대한 효과를 평가하기 위해 1 μg/mL Chp2-M1 단독 처리를 사용하였다. 첫 번째 카테터에 대한 슈도모나스 (스테노트로포모나스)의 그람 음성 임상 분리주에 대해 관찰된 >2 μg/mL의 상기 MIC 값에 기초하여 1 μg/mL의 농도를 선택하였다.

하기 표 35에 나타난 결과는 Chp2-M1이 CFU/g의 3~4 log₁₀ 감소 뿐만 아니라 시험관 내에서 복제될 수 없는 혈소판, 피브리노겐 및 기타 혈액 성분을 함유하는 사람 숙주에서 형성된 생물막을 제거하는 능력을 보인다는 것을 나타냈다.

[표 35] - 2개의 카테터 생물막 샘플에 대한 CF-301, 답토마이신 및 Chp2-M1의 효과

첫 번째 카테터 샘플과 마찬가지로, 나머지 2개의 카테터 샘플의 경우, 세균 콜로니는 혈액 한천 플레이트 상에서 균일한 표현형을 나타냈는데, 이는 단일 미생물 생물막을 시사한다. 16s rRNA 증폭 산물 서열 분석 (Charles River)은 주로 슈도모나스 (스테노트로포모나스) 종과 관련된 서열을 산출하였으며, 유기체는 Chp2-M1에서 1 μg/mL의 MIC 값을 나타냈다.

3개의 추가의 감염된 혈액 투석 카테터 샘플을 2명의 환자로부터 제거하였다 (첫 번째 환자로부터의 1개의 카테터 및 두 번째 환자로부터의 2개의 카테터). 상기에서 기재된 바와 같이, 카테터 분절을 이등분하고, Chp2-M1 및 Lactated Ringer 완충액 대조군과 함께 상이한 처리 그룹 (n= 그룹 당 8개의 분절)에 할당하였다. 1 μg/mL 및 10 μg/mL 농도의 Chp2-M1 모두를 사용하였으며, 두 번째 환자로부터의 2개의 카테터 중 1개에 대해 1 μg/mL의 메로페넴 대조군 처리를 사용하였다. 상기 샘플을 37℃에서 4 시간 동안 인큐베이션하였다.

Chp2-M1, 완충액 또는 메로페넴에 의한 4 시간 처리 후, 샘플을 균질화하고 (Precellys 24 조직 균질화기, Bertin Technologies), TSA 혈액 한천 플레이트 상에 정량적으로 플레이팅하여 계수하였다.

첫 번째 환자로부터 이식된 첫 번째 카테터의 경우, 처리 대조군은 3.37의 log₁₀ CFU/g를 초래한 반면, 10 μg/mL의 Chp2-M1은 <0.7의 log₁₀ CFU/g을 나타냈다. 37℃에서 24 시간의 인큐베이션 후 생존 세균를 계수하였다. 검출 한계는 0.7 log₁₀ CFU/g 카테터이었다. 두 번째 환자의 첫 번째 카테터 샘플의 경우, 1 μg/mL에서의 메로페넴의 log₁₀ CFU/g가 검출되지 않았으며 1 μg/mL에서의 Chp2-M1에 대한 log₁₀ CFU/g는 <0.7이었다. 두 번째 환자로부터의 두 번째 카테터 샘플의 경우, 1 μg/mL에서의 메로페넴의 log₁₀ CFU/g은 3.16이었으며, 1 μg/mL에서의 Chp2-M1의 log₁₀ CFU/g는 <0.7이었다. 회수된 세균 콜로니는 혈액 한천 플레이트 상에서 균일한 표현형을 나타냈는데, 이는 각 카테터에 대해 단일 미생물 생물막을 시사하며, 유사한 콜로니 형태가 3개의 카테터 샘플 모두로부터의 모든 세균에 대해 관찰되었는데, 이는 동일하거나 유사한 병원체를 시사한다.

1 μg/mL 및 10 μg/mL 모두에서의 Chp2-M1에 의한 생물막의 제거는 Chp2-M1을 사용하는 다양한 그람 음성 병원체에 대한 ≤2 μg/mL의 최소 생물막 제거 농도의 시험관내 관찰과 일치한다. 메로페넴 단독은 1 μg/mL에서 생물막을 제거하지 못하였다. 서열 분석은 ≤2 μg/mL의 Chp2-M1 MIC 값을 갖는 스테노트로포모나스 유기체의 균일한 존재를 나타냈다.

균질화 후, 생성된 분리주 (n=16)의 서브세트를 검사하여 16s rRNA 증폭 산물의 서열 분석 (AccuGENX-ID, Charles River Laboratory)에 의해 종분화를 결정하고, Chp2-M1 및 메로페넴에 대한 MIC 값을 결정하였다.16s RNA 서열 분석은 3개의 카테터 샘플 각각에 대해 회수된 모든 유기체에 대해 스테노트로포모나스 종의 존재를 확인하였다. 샘플링된 3개의 카테터 각각의 경우, Chp2-M1에 대한 MIC 값은 각각 2, 1 및 1로 결정되었다.

이러한 결과에 기초하여, Chp2-M1은 μg/mL의 농도에서 사람 숙주 내의 카테터 상에 형성된 스테노트로포모나스를 함유하는 생물막을 제거할 수 있다고 결론지었다.

실시예 10 - NaCl 수준, pH 또는 2가 양이온에 의해 억제되지 않는 Chp 펩타이드

특정 Chp 펩타이드를 생리학적 NaCl 수준 및 pH 값의 범위에 걸쳐 평가하였으며, 다양한 2가 양이온의 존재하에 활성에 대해 추가로 평가하였다. 슈도모나스 아에루기노사 균주 CFS-1292에 대해 NaCl (140 mM)의 존재 및 부재 둘 모두에서 Chp 펩타이드에 대한 MIC 값을 결정하였다 (표 36). 하기 표 36에서 나타낸 바와 같이, Unp3-M1을 제외하고, 테스트된 모든 Chp 펩타이드는 NaCl의 존재하에 4배 미만의 MIC 증가를 나타냈다.

[표 36]

Chp 펩타이드를 다양한 pH 수준에서 추가로 평가하였다. 슈도모나스 아에루기노사 균주 CFS-1292에 대한 18개의 상이한 Chp 펩타이드에 대해 pH 6, pH 7 및 pH 8에서 MIC 값을 결정하였다. 하기 표 37에서 나타낸 바와 같이, Agt1 및 Spi2-M1을 제외한 테스트된 모든 Chp 펩타이드는 4 미만의 배수 변화와 함께 pH에 관계 없이 4 이하의 MIC 값을 유지하였다.

[표 37]

다음으로, 상이한 2가 양이온의 존재하에 Chp 펩타이드를 평가하였다. (1) 칼슘 및 마그네슘 모두의 부재하에, (2) 2 mM 염화 칼슘 단독의 존재하에, (3) 1 mM 황산 마그네슘 단독의 존재하에, 및 (4) 2 mM 염화칼슘 및 1 mM 황산 마그네슘 모두의 존재 하에 MIC를 결정하였다. 표 38에서 나타낸 바와 같이, 테스트된 모든 Chp 펩타이드는 ≤2의 MIC 값을 나타냈는데, 이는 Chp 펩타이드 중 어느 것도 2가 양이온의 존재에 의해 억제되지 않았다는 것을 나타낸다.

[표 38]

실시예 11 - 폐 계면 활성제에 의해 억제되지 않은 Chp 펩타이드

슈도모나스 아에루기노사 균주 CFS-1292에 대한 MIC 값을 합성 폐 계면 활성제인 Survanta®의 2개의 농도 (0.19 mg/mL 및 0.78 mg/mL)의 존재 및 부재하에 결정하였다. 테스트된 Survanta® 농도는 스태필로코커스 아우레우스에 대한 답토마이신 활성을 억제하는 것으로 공지되어 있다. 그럼에도 불구하고, 표 39에서 보고된 바와 같이, Survanta®는 테스트된 각 Chp 펩타이드에 대한 MIC의 <4배 변화에 의해 나타난 바와 같이 슈도모나스 아에루기노사에 대한 Chp 펩타이드 활성을 억제하지 않았다.

[표 39]

Chp2-M1과 Ecp3-M1 둘 다의 효능을 생/사 염색에 의해 Survanta® (1.5 mg/mL)에 현탁된 슈도모나스 아에루기노사 균주 CFS-1292에 대해 평가하였다. 1 μg/mL, 10 μg/mL 및 100 μg/mL의 다양한 농도의 Chp2-M1 또는 Ecp3-M1을 현탁액 샘플에 첨가하였다. 상기 현탁액을 Chp2-M1 또는 Ecp3-M1로 처리하기 1 시간 전, Chp2-M1 또는 Ecp2-M1로 처리한 후 5분, 및 Chp2-M1 또는 Ecp3-M1로 처리한 후 30분에 평가하였다. 샘플을 명시야 (BF) 및 형광 현미경 검사 (10 ms 노출)로 시각화하였다. Sytox Green을 사용하여 살아있는 세포를 라벨링하고, 프로피디움 요오다이드 (PI)를 사용하여 손상되고 죽은 세포를 라벨링하였다. 도 4a~4b에서 도시된 바와 같이, Chp2-M1은 테스트된 모든 농도에서 5분 후 (도 4a) 및 30분 후 (도 4b) 슈도모나스 아에루기노사의 신속한 사멸을 유도하였다. 마찬가지로, 도 5a~5b에서 도시된 바와 같이, Ecp3-M1은 테스트된 모든 농도에서 5분 후 (도 5a) 및 30분 후 (도 5b) 슈도모나스 아에루기노사의 신속한 사멸을 유도하였다.

실시예 12 - ESKAPE 병원체를 비롯한 광범위한 세균에 대해 활성인 Chp 펩타이드

실시예 3에서 상기에서 논의된 결과에 추가하여, 여러 Chp 펩타이드에 대해 추가의 테스트를 수행하였다. 슈도모나스 아에루기노사, 클렙시엘라 뉴모니아, 아시네토박터 바우마니, 엔테로박터 클로아카, 이. 콜라이 및 스테노트로포모나스 말토필리아를 비롯한 다양한 종에 대해 MIC 값을 결정하였으며, 그 결과는 하기 표 40~45에 제시되어 있으며, 여기서, n = 각 종에 대해 테스트된 분리주의 수이고, MIC는 μg/mL로서 측정된다. 우수한 활성을 0 내지 ≤4 (즉, ≤4의 MIC₁₀₀) 범위의 MIC에 상응하는 것으로 결정하였다. 하기 표 40~45에 나타낸 바와 같이, 테스트된 여러 Chp 펩타이드는 ESKAPE 병원체 (슈도모나스 아에루기노사, 클렙시엘라 뉴모니아, 아시네토박터 바우마니 및 엔테로박터 클로아카 포함) 뿐만 아니라 이. 콜라이 및 스테노트로포모나스 말토필리아에 대해 우수한 활성을 입증하였다.

[표 40] - 슈도모나스 아에루기노사에 대한 Chp 펩타이드 활성

[표 41] - 클렙시엘라 뉴모니아에 대한 Chp 펩타이드 활성

[표 42] - 아시네토박터 바우마니에 대한 Chp 펩타이드 활성

[표 43] - 엔테로박터 클로아카에 대한 Chp 펩타이드 활성

[표 44] - 이. 콜라이에 대한 Chp 펩타이드 활성

[표 45] - 스테노트로포모나스 말토필리아에 대한 Chp 펩타이드 활성

상기 데이터에 기초하여, 다음 13개의 Chp 펩타이드들이 슈도모나스 아에루기노사, 클렙시엘라 뉴모니아, 아시네토박터 바우마니, 엔테로박터 클로아카 및 이. 콜라이 모두에 대해 우수한 활성을 나타냈다는 것에 유의한다: Chp2, Chp2-M1, Chp4, Chp4-M1, Chp6, Chp6-M1, Chp10, Chp10-M1, Ecp1-M1, Ecp3, Ecp3-M1, Unp2 및 Unp2-M1. 상기 13개의 Chp 펩타이드들 중 Chp2, Chp2-M1, Chp4-M1, Chp6, Chp6-M1, Ecp1-M1, Ecp3-M1, Unp2 및 Unp2-M1이 마찬가지로 스테노트로포모나스 말토필리아에 대해 활성이었다는 것에 추가로 유의하였다. 또한, 아시네토박터 바우마니는 테스트된 다양한 Chp 펩타이드 중 가장 광범위한 펩타이드에 민감하였다.

테스트된 다른 세균 종 중에서, Chp2 (n=12), Chp4 (n=12) 및 Unp2 (n=12)는 아크로모박터 크실로속시단스에 대해 양성 활성 (MIC ≤4)을 나타냈다. Chp2 (n=1) 및 Chp4-M1 (n=1)은 부르크홀데리아 안티나에 대해 양성 활성 (MIC ≤4)을 나타냈다. Chp2-M1, Chp4, Chp6, Chp6-M1, Ecp1-M1, Ecp3-M1 및 Spi1-M1 (모두 n=2)은 세라티아 마르세센스에 대해 양성 활성 (MIC ≤4)을 나타냈다. 다음 Chp 펩타이드는 부르크홀데리아 세파시아에 대해 양성 활성 (MIC ≤4)을 나타냈다: Agt1-M1, Mse1, Avq1, Chp1, Chp2, Chp2-M1, Chp4, Chp4-M1, Chp6, Chp6-M1, Chp8, Chp9, Chp10, Chp10-M1, Ecp1, Ecp1-M1, Ecp2, Ecp3, Ecp3-M1, Gkh1, Spi1, Unp2 및 Unp2-M1.

실시예 13 - 카바페넴 내성 분리주에 대해 활성인 Chp 펩타이드

단리된 7개의 상이한 카르바페넴 내성 세균을 다양한 Chp 펩타이드로 테스트하고, 상기 펩타이드의 MIC를 측정하고, μg/mL로서 표 46에 제시하였다. 하기 표 46에서 나타낸 바와 같이, 몇몇 Chp 펩타이드는 카르바페넴 내성 세균주에 대해 우수한 활성 (MIC ≤4)을 나타냈다. 메로페넴에 대한 MIC 값은 표 46에서 분석된 각 균주에 대해 괄호 안에 표시되어 있다.

[표 46] - 카바페넴 내성 분리주에 대한 Chp 펩타이드 활성

실시예 14 - 동물 혈청에서의 Chp 펩타이드 활성

동물 혈청에서 슈도모나스 아에루기노사 균주 CFS-1292에 대한 여러 Chp 펩타이드의 활성을 평가하였다. MIC를 마우스, 래트, 토끼 및 사람 혈청 (각각 12.5%) 및 CAA의 존재하에 결정하였으며, 그 결과는 하기 표 47에 나타나 있다. 래트, 마우스 및 토끼 혈청 모두를 풀링된 (pooled) 성별 샘플로부터 수득하였다. 사람 혈청과 비교한 ≤8배의 MIC 증가는 슈도모나스 아에루기노사에 대한 충분한 활성을 나타냈으며, 생체내 효능 연구를 위한 종을 동정하는데 도움이 될 수 있다.

[표 47] - 마우스, 래트, 토끼 및 사람 혈청에서의 Chp 펩타이드 활성

상기 결과는 래트 및 토끼 혈청이 동등한 수준의 활성을 지원하고 사람 혈청과 유사하다는 것을 나타낸다. 그러나, 마우스 혈청은 래트, 토끼 및 사람에 대해 관찰된 것보다 몇 배 더 높았다.

Chp2-M1과 Ecp3-M1 둘 다의 효능을 생/사 염색에 의해 100% 사람 혈청에 현탁된 슈도모나스 아에루기노사 균주 CFS-1292에 대해 평가하였다. 1 μg/mL, 10 μg/mL 및 100 μg/mL의 다양한 농도의 Chp2-M1 또는 Ecp3-M1을 현탁액 샘플에 첨가하였다. 상기 현탁액을 Chp2-M1 또는 Ecp3-M1로 처리하기 1 시간 전, Chp2-M2 또는 Ecp2-M1로 처리한 후 5분, 및 Chp2-M1 또는 Ecp3-M1로 처리한 후 30분에 평가하였다. 샘플을 BF 및 형광 현미경 검사 (10 ms 노출)로 시각화하였다. Sytox Green을 사용하여 살아있는 세포를 라벨링하고, PI를 사용하여 손상되고 죽은 세포를 라벨링하였다. 도 6a~6b에서 도시된 바와 같이, Chp2-M1은 테스트된 모든 농도에서 5분 후 (도 6a) 및 30분 후 (도 6b) 슈도모나스 아에루기노사의 신속한 사멸을 유도하였다. 마찬가지로, 도 7a~7b에서 도시된 바와 같이, Ecp3-M1은 테스트된 모든 농도에서 5분 후 (도 7a) 및 30분 후 (도 7b) 슈도모나스 아에루기노사의 신속한 사멸을 유도하였다.

실시예 15 - 자발적 내성

문헌 [Drago, et al. In vitro selection of resistance in Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter spp. by levofloxacin and ciprofloxacin alone and in combination with β-lactams and amikacin, J. Antimicrob. Chemotherapy. 2005; 56(2):353-359] 및 [Rodriguez-Rojas et al., Frequency of Spontaneous Resistance to Fosfomycin Combined with Different Antibiotics in Pseudomonas aeruginosa, Antimicrobial Agents and Chemotherapy 2010; 54(11):4948-49]에서 기재된 바와 같이 자발적 내성을 평가하였다.

4x MIC에서 Chp 펩타이드 또는 항생제 (시프로플록사신 또는 토브라마이신)으로 보충된 CAA 배지 상에 후기 대수 증식기 슈도모나스 아에루기노사 균주 CFS-1292를 플레이팅하였다. 48 시간 후 내성 콜로니 수를 선택 부재하의 정량적 플레이팅에 의해 결정된 총 CFU 수로 나누어 자발적 내성의 빈도를 계산하였다. 하기 표 48에서 나타낸 바와 같이, 테스트된 모든 Chp 펩타이드는 자발적 내성에 대한 낮은 경향을 나타냈다.

[표 48] - Chp 펩타이드의 자발적 내성

실시예 16 - 연속 계대 연구

2배 희석 연속 계대 연구를 21일 기간에 걸쳐 7개의 Chp 펩타이드 및 2개의 항생제 (중복)에 대해 슈도모나스 아에루기노사 균주 CFS 1292로 수행하였다. 계대 배양물의 MIC를 매일 0~9 일차에 결정하고, 미처리된 대조군과 비교하였다. 그 결과는 하기 표 49 및 50에 나타나 있다. 표 49에서 나타낸 바와 같이, 9 일차에, 어떠한 유의한 변화도 테스트된 7개의 Chp 펩타이드 중 어느 것에 대한 MIC 값에서 관찰되지 않았으나; 시프로플록사신은 MIC의 4배 증가를 나타냈다. 표 50에서 나타낸 바와 같이, 21일 후, Chp2, Chp2-M1, Chp4-M1, Chp6-M1 및 Chp10-M1 모두는 MIC 값의 유의한 변화를 나타내지 않은 반면, Ecp3-M1 및 Unp2-M1은 MIC의 2배 증가를 나타냈다. 시프로플록사신 및 토브라마이신 모두는 21일 후 MIC 값의 유의한 증가를 나타냈는데, 이는 해당 항생제에서 자발적 내성에 대한 상대적으로 높은 경향을 입증한다.

[표 49] - 9일에 걸친 Chp 펩타이드의 연속 계대 MIC (μg/mL)

[표 50] - 21일에 걸친 Chp 펩타이드의 연속 계대 MIC (μg/mL)

Chp2, Chp2-M1, Chp10-M1, 시프로플록사신 및 토브라마이신의 슈도모나스 아에루기노사에 대한 내성의 감소된 감수성에 대한 가능성을 조사하기 위해 스폿 희석 검정 (spot dilution assay)을 또한 수행하였다. 슈도모나스 아에루기노사 (CFS 1292)를 CAA 한천 상에 플레이팅하고, 플레이트 중앙에 25 μL의 1 mg/mL 테스트 제제를 스폿팅하였다. 그 다음, 플레이트를 24℃에서 2일 동안 인큐베이션하고, 투명대 (clearing zone)를 관찰하였다. 투명대 내에서 또는 주변부에서 형성된 콜로니를 계대 배양 (3x)하고, MIC 값에 대해 테스트하였다. Chp2, Chp2-M1 및 Chp10-M1에 대해 생성된 콜로니를 4개의 추가의 연속 계대 (총 5회 계대)를 위한 접종물로서 사용하여 항균 내성을 발생시키는 경향을 조사하였다. 하기 표 51은 미처리된 대조군, 투명대의 주변부 및 투명대의 중앙에서 테스트된 제제의 MIC를 나타낸다. 굵은 활자로 표시된 값들은 4회 연속 계대를 거친 콜로니를 나타내며, 그 결과는 하기 표 52에 나타나 있다.

[표 51] - 스폿 희석 검정에서 제제의 MIC (μg/mL)

[표 52] - Chp 펩타이드의 연속 계대

표 52의 결과는 Chp2, Chp2-M1 및 Chp10-M1이 내성 경향을 나타내지 않았다는 것을 입증한다.

실시예 17 - CDC 내성 패널로부터의 그람 음성 세균 분리주에 대한 Chp 펩타이드 활성

상기에서 기재된 방법론, 즉, CLSI에 의해 정의된 표준 브로쓰 미량 희석 기준 방법을 사용하여 MIC 값을 결정하였다. 본 출원에서 사용되는 MIC는 대조군과 비교하여 세균 성장의 적어도 80%를 억제하기에 충분한 펩타이드의 최소 농도이고, MIC₅₀은 대조군과 비교하여 세균 성장의 적어도 50%를 억제하기에 충분한 펩타이드의 최소 농도이고, MIC₉₀은 대조군과 비교하여 세균 성장의 적어도 90%를 억제하기에 충분한 펩타이드의 최소 농도이다.

질병 통제 센터의 균주 목록으로부터 5개의 상이한 항생제 내성 분리주 은행 패널을 선택하였다. 구체적으로, 41개의 아시네토박터 바우마니 분리주와 55개의 슈도모나스 아에루기노사 분리주의 2개 패널을 선택하여 감염 치료에 사용되는 약물에 대한 다양한 항미생물제 감수성 결과를 나타냈다. 상기 균주는, 예를 들어, 각각 아시네토박터 바우마니 분리주 및 슈도모나스 아에루기노사 분리주에 대해 wwwn.cdc.gov/ARIsolateBank/Panel/PanelDetail?ID=1 and wwwn.cdc.gov/ARIsolateBank/Panel/PanelDetail?ID=12에 기재되어 있다.

또한, 53개의 카바페나마아제 생성 엔테로박테리아세아에 분리주의 세 번째 패널을 선택하여 다양한 종과 카바페나마아제를 나타냈다. wwwn.cdc.gov/ARIsolateBank/Panel/PanelDetail?ID=8을 참조한다.

이미페넴 및 렐레박탐에 대한 다양한 감수성을 갖는 28개의 그람 음성 세균의 네 번째 패널 (wwwn.cdc.gov/ARIsolateBank/Panel/PanelDetail?ID=1034 참조)도 또한 선택하였다. 마지막으로, 새로운 항생제 내성을 갖는 것으로 확인된 17개의 분리주 중 11개의 다섯 번째 패널을 선택하였으며, 여기서, 상기 항생제 내성은 새로운 내성 기전 또는 표현형에 기초할 수 있다. wwwn.cdc.gov/ARIsolateBank/Panel/PanelDetail?ID=10을 참조한다. 수득된 데이터는 하기 표 53~57에 요약되어 있다.

[표 53] - 악티노박터 바우마니 ( Actinobacter baumannii ) 패널 (n=41)

[표 54] - 슈도모나스 아에루기노사 패널 (n=55)

[표 55] - 카바페나마아제 엔테로박테리아세아에 패널 (n=53)

[표 56] - 이미페넴/렐레박탐 패널 (n=28)

[표 57] - 새로운 항생제 내성 패널 (n=11)

표 53에서 요약된 악티노박터 바우마니 패널의 경우, Chp2, Chp2-M1 및 Chp10-M1에 대한 MIC₅₀은 각각 0.5, 0.5 및 0.25이고, MIC₉₀은 1, 1 및 0.5이었다. 표 54에서 요약된 슈도모나스 아에루기노사 패널의 경우, Chp2, Chp2-M1 및 Chp10-M1에 대한 MIC₅₀은 각각 1, 1 및 0.25이고, MIC₉₀은 1, 1 및 0.5이었다. 표 55에서 요약된 카바페나마아제 엔테로박테리아세아에 패널의 경우, Chp2, Chp2-M1 및 Chp10-M1에 대한 MIC₅₀은 각각 0.5, 0.25 및 0.125이고, MIC₉₀은 1, 1 및 0.5이었다. 표 56에서 요약된 이미페넴/렐레박탐 패널의 경우, Chp2, Chp2-M1 및 Chp10-M1에 대한 MIC₅₀은 각각 0.5, 0.5 및 0.25이고, MIC₉₀은 1, 1 및 0.5이었다. 표 57에서 요약된 새로운 항생제 내성 패널의 경우, Chp2, Chp2-M1 및 Chp10-M1에 대한 MIC₅₀은 각각 0.5, 0.125 및 0.0313이고, MIC₉₀은 1, 0.25 및 0.125이었다.

상기 결과들은 다양한 표준 치료 항생제에 대한 항생제 내성을 나타내는 다양한 세균주가 그럼에도 불구하고 Chp2, Chp2-M1 및 Chp10-M1을 비롯한 본 출원에서 개시된 Chp 펩타이드에 매우 민감하다는 것을 확립한다.

실시예 18 - Chp 펩타이드에 의한 내독소 중화

폴리글리칸 및 내독소로도 또한 공지된 지질다당류 (LPS)는 그람 음성 세균의 외막 전체에 널리 퍼져 있다. LPS는 전염증성 사이토카인의 발현을 자극할 수 있다. 특정 아무린 펩타이드는 항균 활성에 추가하여 LPS에 결합하고 이를 중화하는 능력도 또한 나타낸다. 예를 들어, LL-37과 콜리스틴 모두는 LPS에 강하게 결합한다. 예를 들어, 문헌 [Rosenfeld et al., Endotoxin (Lipopolysaccharide) Neutralization by Innate Immunity Host-Defense Peptides, J. Bio. Chem. 2005; 281(3):1636-1643] 및 [Mohamed et al., A short D-enantiomeric antimicrobial peptide with potent immunomodulatory and antibiofilm activity against multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter baumannii, Scientific Reports 2017; 6953(7):1-13]을 참조한다. LPS에 결합하고 이의 독성 효과를 중화하는 분자가 임상 적용을 가질 수 있으므로, 본 출원에서 개시된 바와 같은 Chp 펩타이드의 능력을 평가하여 LPS에 대한 이의 결합 능력을 결정하였다.

시험관내 투구게 변형 세포 용해물 (limulus amoebocyte lysate: LAL) 효소 검정을 사용하여 LPS에 결합하고 LPS 유도된 LAL 효소 활성화 뿐만 아니라 발색성 리포터의 다운스트림 절단을 억제하는 Chp 펩타이드 Chp2, Chp2-M1 및 Chp10-M1의 능력을 검사하였다.

문헌 [Mohamed et al., 2017 and Roberts et al., In Vitro Evaluation of the Interaction of Dextrin-Colistin Conjugates with Bacterial Lipopolysaccharide, J. Med. Chem. 2016; 59:647-654]에 기재된 프로토콜에 따랐으며, Pierce Chromogenic Endotoxin Quant Kit (ThermoFisher Scientific)를 사용하여 내독소 중화를 평가한 것을 제외하고는 콜리스틴, LL-37 및 Chp5를 대조군으로서 사용하였다. 구체적으로, 표시된 농도 범위 (0.125 μg/mL ~ 64 μg/mL)의 Chp 펩타이드 또는 대조군 펩타이드를 함유하는 발열성 물질 제거수 (0.8 EU/mL, 여기서, EU는 내독소 단위를 나타내며, 1 EU는 대략 0.1 내지 0.2 ng 내독소/mL의 용액과 동일함)에 LPS를 용해하였다. 표준 참조 샘플은 발열성 물질 제거수에 용해된 LPS만을 함유하였다. 용액을 잘 혼합하고, 24℃에서 1 시간 동안 인큐베이션하고, 내독소의 정량적 검출을 위한 제조 업체의 테스트 절차를 따랐다. 표 58은 Chp 펩타이드 및 대조군 펩타이드의 투약량이 증가함에 따라 관찰된 LPS 결합의 백분율을 나타낸다.

[표 58] - LPS의 Chp 펩타이드 결합

상기 결과들은 콜리스틴과 LL-37 모두가 LPS 결합의 용량 의존적 증가를 입증하고 Chp5가 LPS에 결합하지 않는다는 것을 나타낸다. Chp2, Chp2-M1 및 Ch10-M1 모두는 LPS에 대한 결합을 입증하는데, 이는 매우 낮은 농도와 매우 높은 농도 모두에서 우선적으로 결합하는 패턴을 나타낸다.

실시예 19 - 지속 세포에 대한 Chp 펩타이드 활성

문헌 [Defraine, V. et al., Efficacy of Artilysin Art-175 against Resistant and Persistent Acinetobacter baumannii, Antimicrob. Agents and Chemother. 2016; 60(6):3480-3488]에 제시된 방법을 사용하여, 아시네토박터 바우마니 및 슈도모나스 아에루기노사의 지속 세포 (다양한 클래스의 항생제에 대해 내성이 매우 강한 세균 세포 변이체)에 대한 Chp 펩타이드 Chp2, Chp2-M1 및 Chp10-M1의 활성을 평가하였다. 간단히 말하자면, 아시네토박터 바우마니 균주 BAA-747을 5% 트립신 분해성 대두 브로쓰에서 밤새 37℃에서 진탕하면서 성장시켰다. 18 시간에, 배양물을 37℃에서 5 시간 동안 60x MIC 토브라마이신에 노출시켜 지속 세포를 선택하였다. 항생제 처리에서 생존하는 지속 세포를 수확하고; 그 다음, 시프로플록사신, 라이소자임, Chp2, Chp2-M1, Chp10-M1, Chp5 및 완충액 대조군의 샘플을 100 mL 부피의 단리된 지속 세포 분획에 첨가하고, 샘플은 37℃에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 그 다음, 세포를 수확하고, 한천 플레이트 상에 플레이팅하고, 최대 3일 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 그 다음, 임의의 생존 세균의 MIC를 측정하였으며, 여기서, 검출 한계는 1.6-log₁₀ CFU/mL이었다. 그 결과는 하기 표 59에 나타나 있다.

[표 59] - 아시네토박터 바우마니 지속 세포의 MIC Log ₁₀ (CFU/mL)

표 59에서 나타낸 바와 같이, 아시네토박터 바우마니 지속 세포는 각각 3.1, 3.3 및 3.0의 완충액과 비교하여 log₁₀ CFU/mL 감소로 Chp2, Chp2-M1 및 Chp10-M1 모두에 대해 민감하였다. Chp 펩타이드 처리의 생존 지속 세포는 MIC 값의 변화를 나타내지 않았다.

아시네토박터 바우마니에 대해 상기에서 개략적으로 서술된 방법을 슈도모나스 아에루기노사 균주 PA20에 반복하였으며, 여기서, 검출 한계는 2-log₁₀ CFU/mL이었고, 그 결과는 하기 표 60에 나타나 있다.

[표 60] - 슈도모나스 아에루기노사 지속 세포의 MIC Log ₁₀ (CFU/mL)

표 60에서 나타낸 바와 같이, 슈도모나스 아에루기노사 지속 세포는 각각 2.1, 1.8 및 2.3의 완충액과 비교하여 log₁₀ CFU/mL 감소로 Chp2, Chp2-M1 및 Chp1-M1 모두에 대해 민감하였다. Chp 펩타이드 처리의 생존 지속 세포는 MIC 값의 변화를 나타내지 않았다.

<110> CONTRAFECT CORPORATION <120> ANTIMICROBIAL, BACTERIOPHAGE-DERIVED POLYPEPTIDES AND THEIR USE AGAINST GRAM-NEGATIVE AND ACID-FAST BACTERIA <130> 0341.0019-00-304 <140> <141> <150> 62/964,743 <151> 2020-01-23 <150> 62/948,052 <151> 2019-12-13 <150> 62/911,900 <151> 2019-10-07 <150> 62/892,783 <151> 2019-08-28 <150> 62/870,908 <151> 2019-07-05 <160> 124 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 36 <212> PRT <213> Chlamydia virus Chp1 <400> 1 Met Val Arg Arg Arg Arg Leu Arg Arg Arg Ile Ser Arg Arg Ile Phe 1 5 10 15 Arg Arg Thr Val Ala Arg Val Gly Arg Arg Arg Arg Ser Phe Arg Gly 20 25 30 Gly Ile Arg Phe 35 <210> 2 <211> 44 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Chlamydia phage 2 sequence <400> 2 Met Arg Leu Lys Met Ala Arg Arg Arg Tyr Arg Leu Pro Arg Arg Arg 1 5 10 15 Ser Arg Arg Leu Phe Ser Arg Thr Ala Leu Arg Met His Pro Arg Asn 20 25 30 Arg Leu Arg Arg Ile Met Arg Gly Gly Ile Arg Phe 35 40 <210> 3 <211> 35 <212> PRT <213> Chlamydia virus CPAR39 <400> 3 Met Cys Lys Lys 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Chlamydia trachomatis <400> 11 Met Ala Lys Lys Met Thr Lys Gly Lys Asp Arg Gln Val Phe Arg Lys 1 5 10 15 Thr Ala Asp Arg Thr Lys Lys Leu Asn Val Arg Pro Leu Leu Tyr Arg 20 25 30 Gly Gly Ile Arg Leu 35 <210> 12 <211> 39 <212> PRT <213> Chlamydia trachomatis <400> 12 Met Ala Gly Lys Lys Met Val Ser Lys Gly Lys Asp Arg Gln Ile Phe 1 5 10 15 Arg Lys Thr Ala Asp Arg Thr Lys Lys Met Asn Val Arg Pro Leu Leu 20 25 30 Tyr Arg Gly Gly Ile Arg Leu 35 <210> 13 <211> 41 <212> PRT <213> Marine gokushovirus <400> 13 Met Arg Arg Pro Arg Lys Met Asn Tyr Lys Lys Ser Lys Arg Met Phe 1 5 10 15 Ser Arg Thr Ala Ala Arg Thr His Arg Lys Asn Ser Leu Arg Gly Ser 20 25 30 Arg Pro Met Arg Gly Gly Ile Arg Leu 35 40 <210> 14 <211> 34 <212> PRT <213> Gokushovirinae Fen672_31 <400> 14 Met Ser Lys Lys Ala Ser Arg Lys Ser Phe Thr Lys Gly Ala Val Lys 1 5 10 15 Val His Lys Lys Asn Val Pro Thr Arg Val Pro Met Arg Gly Gly Ile 20 25 30 Arg Leu <210> 15 <211> 35 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: uncultured bacterium sequence <400> 15 Met Lys Met Arg Lys Arg Thr Asp Lys Arg Val Phe Thr Arg Thr Ala 1 5 10 15 Ala Lys Ser Lys Lys Val Asn Ile Ala Pro Lys Ile Phe Arg Gly Gly 20 25 30 Ile Arg Leu 35 <210> 16 <211> 39 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 16 Met Ala Arg Ser Arg Arg Arg Met Ser Lys Arg Ser Ser Arg Arg Ser 1 5 10 15 Phe Arg Lys Tyr Ala Lys Thr His Lys Arg Asn Phe Lys Ala Arg Ser 20 25 30 Met Arg Gly Gly Ile Arg Leu 35 <210> 17 <211> 47 <212> PRT <213> Cognatishimia maritima <400> 17 Met Glu Ser Pro Asn Ser Arg Ser Gln Leu Gly Ile Thr Leu Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Ser Thr Ile Phe Pro Asp Ala Cys Phe Arg Tyr Arg Arg Glu Leu 20 25 30 Pro Tyr Pro Leu Val Ile Trp Gly Val Ala Thr Leu Cys Leu Gln 35 40 45 <210> 18 <211> 39 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 18 Met Ala Arg Ser Arg Arg Arg Met Ser Lys Arg Ser Ser Arg Arg Ser 1 5 10 15 Phe Arg Lys Tyr Ala Lys Ser His Lys Lys Asn Phe Lys Ala Arg Ser 20 25 30 Met Arg Gly Gly Ile Arg Leu 35 <210> 19 <211> 37 <212> PRT <213> Oscillibacter sp. <400> 19 Met Arg Lys Arg Met Ser Lys Arg Val Asp Lys Lys Val Phe Arg Arg 1 5 10 15 Thr Ala Ala Ser Ala Lys Lys Ile Asn Ile Asp Pro Lys Ile Tyr Arg 20 25 30 Gly Gly Ile Arg Leu 35 <210> 20 <211> 37 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: uncultured bacterium sequence <400> 20 Met Arg Arg Arg Arg Leu Ser Arg Arg Thr Ser Arg Arg Phe Phe Arg 1 5 10 15 Lys Gly Leu Lys Val Arg Arg Arg Asn Leu Arg Ala Arg Pro Met Arg 20 25 30 Gly Gly Phe Arg Ile 35 <210> 21 <211> 39 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: uncultured bacterium sequence <400> 21 Met Ala Arg Arg Lys Lys Met Lys Gly Lys Arg Asp Lys Arg Val Phe 1 5 10 15 Lys Gln Thr Ala Asn Lys Thr Lys Ala Ile Asn Ile Ser Pro Lys Asn 20 25 30 Met Arg Gly Gly Thr Arg Leu 35 <210> 22 <211> 53 <212> PRT <213> Marine gokushovirus <400> 22 Met Leu Thr Val Trp Ser Asp Thr Pro Thr Ile Lys Arg Arg Lys Asp 1 5 10 15 Met Tyr Arg Lys Arg Met Ser Arg Lys Lys Ser Lys Lys Val Phe Ala 20 25 30 Lys Thr Ala Met Lys Val Asn Lys Arg Asn His Val Lys Pro Met Arg 35 40 45 Gly Gly Tyr Arg Ile 50 <210> 23 <211> 39 <212> PRT <213> Marine gokushovirus <400> 23 Met Met Lys Tyr Arg Lys Lys Met Ser Ala Lys Ser Ser Arg Lys Gln 1 5 10 15 Phe Thr Lys Gly Ala Met Lys Val Lys Gly Lys Asn Phe Thr Lys Pro 20 25 30 Met Arg Gly Gly Ile Arg Leu 35 <210> 24 <211> 38 <212> PRT <213> Marine gokushovirus <400> 24 Met Arg Arg Tyr Asn Val Asn Lys Gly Lys Ser Ala Lys Lys Phe Arg 1 5 10 15 Lys Gln Val Ser Lys Thr Lys Val Ala Asn Leu Arg Ser Asn Pro Met 20 25 30 Arg Gly Gly Trp Arg Leu 35 <210> 25 <211> 28 <212> PRT <213> Spiroplasma virus SpV4 <400> 25 Met Ala Tyr Arg Gly Phe Lys Thr Ser Arg Val Val Lys His Arg Val 1 5 10 15 Arg Arg Arg Trp Phe Asn His Arg Arg Arg Tyr Arg 20 25 <210> 26 <211> 38 <212> PRT <213> Spiroplasma virus SpV4 <400> 26 Met Arg Arg Lys Val Lys Asn Thr Lys Arg His Gln Trp Arg Leu Thr 1 5 10 15 His Ser Ala Arg Ser Ile Lys Arg Ala Asn Ile Met Pro Ser Asn Pro 20 25 30 Arg Gly Gly Arg Arg Phe 35 <210> 27 <211> 111 <212> DNA <213> Chlamydia virus Chp1 <400> 27 atggttcgta gaagacgttt gagaagaaga ataagtagaa gaatttttag aagaacagta 60 gctagagttg gtagaaggcg aaggtctttt cgtggtggta ttagatttta a 111 <210> 28 <211> 135 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Chlamydia phage 2 sequence <400> 28 atgaggttaa aaatggcacg aagaagatac agacttccgc gacgtagaag tcgaagactt 60 ttttcaagaa ctgcattgag gatgcatcca agaaataggc ttcgaagaat tatgcgtggc 120 ggcattaggt tctag 135 <210> 29 <211> 108 <212> DNA <213> Chlamydia virus CPAR39 <400> 29 ttgtgcaaaa aagtgtgcaa aaaatgccca aaaaaagggc caaaaaatgc ccccaaaatc 60 ggagcatttt acgagagaaa aacacctaga cttaaacagt ctacttga 108 <210> 30 <211> 120 <212> DNA <213> Chlamydia phage 4 <400> 30 atggcacgaa gatacagact ttcgcgacgc agaagtcgac gacttttttc aagaactgca 60 ttaagaatgc atcgaagaaa tagacttcga agaattatgc gtggcggcat taggttttag 120 <210> 31 <211> 120 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 31 atggcggaac agtatgaact gagccaggaa cagagcgaac agctgtttag cgaaaccgcg 60 ctgcagatgc atgaacagaa cgaactgcag gaaattatgc agggcggcat tgaattttaa 120 <210> 32 <211> 123 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Guinea pig Chlamydia phage sequence <400> 32 atggcacgaa gaagatacag acttccgcga cgtagaagtc gaagactttt ttcaagaact 60 gcattaagga tgcatccaag aaataggctt cgaagaatta tgcgtggcgg cattaggttc 120 tag 123 <210> 33 <211> 117 <212> DNA <213> Chlamydia trachomatis <400> 33 atgaaacgta gaaaaatgac aagaaaaggt tctaagcgtc tttttactgc aactgctgat 60 aaaactaaat ctatcaatac tgccccgccg ccaatgcgtg gcggtatccg gttgtaa 117 <210> 34 <211> 120 <212> DNA <213> Chlamydia trachomatis <400> 34 atgtctaaaa agcgttctcg catgtctcgc cgccgttcta agaagttgtt ctcgaaaacg 60 gctctccgca cgaagagtgt caacacccgt ccgcctatgc gcggagggtt ccggttctga 120 <210> 35 <211> 123 <212> DNA <213> Chlamydia trachomatis <400> 35 atgtctcttc gtcgtcataa gctttctcgt aaggcgtcta agcgtatttt tcgtaaaggt 60 gcatcacgca cgaagacttt gaatactcgt gctacgccta tgcgcggcgg tttccgtatt 120 taa 123 <210> 36 <211> 117 <212> DNA <213> Chlamydia trachomatis <400> 36 atgaaacgtc gtaaactgtc caaaaagaaa tctcgcaaga ttttcactcg cggtgctgta 60 aatgtgaaaa agcgtaacct tcgcgctcgc ccaatgcgcg gcggtttccg gatctaa 117 <210> 37 <211> 114 <212> DNA <213> Chlamydia trachomatis <400> 37 atggctaaaa aaatgactaa aggcaaggat cgtcaggttt ttcgtaaaac cgctgatcgt 60 actaagaaac tcaatgttag accgttgtta tatcgaggag gtatcagatt atga 114 <210> 38 <211> 120 <212> DNA <213> Chlamydia trachomatis <400> 38 atggcaggaa aaaaaatggt atcaaaagga aaagatagac agattttccg aaaaactgct 60 gatcgcacta aaaaaatgaa tgtgcgcccg ctattatatc gtggaggtat tagattatga 120 <210> 39 <211> 126 <212> DNA <213> Marine gokushovirus <400> 39 atgagaagac caagaaaaat gaactataaa aaatcaaaaa gaatgttttc acgcacagca 60 gcgagaacac acagaaaaaa ctctctaaga ggtagccgac ctatgagagg cggaatacgt 120 ctttaa 126 <210> 40 <211> 105 <212> DNA <213> Gokushovirinae Fen672_31 <400> 40 atgtcgaaga aggcgtcgag gaagagtttt actaagggtg ccgttaaggt tcataagaaa 60 aatgttccta ctcgtgttcc tatgcgtggc ggtattaggc tttag 105 <210> 41 <211> 108 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: uncultured bacterium sequence <400> 41 atgaaaatgc gtaagcggac ggacaagcga gtgtttaccc gcaccgctgc taagtccaag 60 aaagtgaaca ttgccccgaa aatttttaga ggaggtatcc gtctgtga 108 <210> 42 <211> 120 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 42 atggctcgtt ctcgccgtcg tatgtccaag cgttcttccc gtcgttcgtt ccgtaagtac 60 gcaaagacgc ataaacgtaa ctttaaagcc cgctctatgc gtggtggaat tcgtctttga 120 <210> 43 <211> 144 <212> DNA <213> Cognatishimia maritima <400> 43 atggaaagcc cgaacagccg cagccagctg ggcattaccc tgtatctgct gagcaccatt 60 tttccggatg cgtgctttcg ctatcgccgc gaactgccgt atccgctggt gatttggggc 120 gtggcgaccc tgtgcctgca gtaa 144 <210> 44 <211> 120 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 44 atggctcgtt cccgtagacg tatgtctaag cgttcttccc gccgttcgtt ccgcaagtat 60 gcgaagtcgc ataagaagaa ctttaaagcc cgctcaatgc gtggcggtat ccgtttataa 120 <210> 45 <211> 114 <212> DNA <213> Oscillibacter sp. <400> 45 atgagaaagc gaatgtctaa gcgtgttgac aagaaggtgt tccgtcgtac tgccgcatct 60 gccaagaaga ttaacattga ccccaagatt taccgtggag gtattcgcct atga 114 <210> 46 <211> 114 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: uncultured bacterium sequence <400> 46 atgagacgtc gtcgtctatc ccgcagaact tcccgccgtt ttttccgtaa aggacttaag 60 gttcgccgtc gtaacctccg cgcgagaccc atgagaggcg gattcagaat ttga 114 <210> 47 <211> 120 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: uncultured bacterium sequence <400> 47 atggcacgac gcaagaagat gaaaggcaag cgggataaac gggtgtttaa gcagacagcc 60 aacaaaacca aggctatcaa catcagccca aaaaacatga gagggggtac gagactgtga 120 <210> 48 <211> 162 <212> DNA <213> Marine gokushovirus <400> 48 atgttaactg tgtggagtga cacccctacc ataaaaagga gaaaagacat gtatagaaag 60 agaatgtcaa gaaagaaaag taaaaaggtt tttgcaaaaa ccgcaatgaa agtaaataaa 120 agaaaccacg ttaaacctat gcgtggtgga tatagaatat aa 162 <210> 49 <211> 120 <212> DNA <213> Marine gokushovirus <400> 49 atgatgaagt acagaaaaaa aatgagcgct aaaagtagcc gaaagcaatt tacaaaaggc 60 gccatgaaag tgaagggtaa aaacttcaca aaaccaatgc gcggaggcat ccgtctatag 120 <210> 50 <211> 117 <212> DNA <213> Marine gokushovirus <400> 50 atgcgacgtt acaatgtaaa taaaggtaaa tctgctaaga agtttcgaaa gcaggtaagt 60 aagacgaagg ttgcaaacct acgttctaat ccaatgcgag gtggttggag actctaa 117 <210> 51 <211> 87 <212> DNA <213> Spiroplasma virus SpV4 <400> 51 atggcttatc gtggttttaa aacgagtcgt gttgtaaaac atagagtacg tagaagatgg 60 tttaatcata gaagacgtta tagatag 87 <210> 52 <211> 114 <212> DNA <213> Spiroplasma virus SpV4 <400> 52 atgcgtcgta aagttaaaaa caccaaacgt caccagtggc gtctgaccca ctctgctcgt 60 tctatcaaac gtgctaacat catgccgtct aacccgcgtg gtggtcgtcg tttc 114 <210> 53 <211> 135 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Chlamydia phage 3 sequence <400> 53 atgaggttaa aaatggcacg aagaagatac agacttccgc gacgtagaag tcgaagactt 60 ttttcaagaa ctgcattaag gatgcatcca agaaataggc ttcgaagaat tatgcgtggc 120 ggcattaggt tctag 135 <210> 54 <211> 44 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Chlamydia phage 3 sequence <400> 54 Met Arg Leu Lys Met Ala Arg Arg Arg Tyr Arg Leu Pro Arg Arg Arg 1 5 10 15 Ser Arg Arg Leu Phe Ser Arg Thr Ala Leu Arg Met His Pro Arg Asn 20 25 30 Arg Leu Arg Arg Ile Met Arg Gly Gly Ile Arg Phe 35 40 <210> 55 <211> 39 <212> PRT <213> Escherichia sp. <400> 55 Met Ala Arg Ser Arg Arg Arg Met Ser Lys Arg Ser Ser Arg Arg Ser 1 5 10 15 Phe Arg Lys Tyr Ala Lys Thr His Lys Lys Asn Phe Lys Ala Arg Ser 20 25 30 Met Arg Gly Gly Ile Arg Leu 35 <210> 56 <211> 39 <212> PRT <213> Escherichia sp. <400> 56 Met Ala Arg Ser Arg Arg Arg Met Ser Lys Arg Ser Ser Arg Arg Ser 1 5 10 15 Phe Arg Lys Tyr Ala Lys Ser His Lys Lys Asn Phe Lys Ala Arg Ser 20 25 30 Met Arg Gly Gly Ile Arg Leu 35 <210> 57 <211> 55 <212> PRT <213> Pseudomonas phage PP7 <400> 57 Met Ser Ser Thr Leu Cys Arg Trp Ala Val Lys Ala Leu Arg Cys Thr 1 5 10 15 Arg Val Tyr Lys Glu Phe Ile Trp Lys Pro Leu Val Ala Leu Ser Tyr 20 25 30 Val Thr Leu Tyr Leu Leu Ser Ser Val Phe Leu Ser Gln Leu Ser Tyr 35 40 45 Pro Ile Gly Ser Trp Ala Val 50 55 <210> 58 <211> 35 <212> PRT <213> Acinetobacter phage AP205 <400> 58 Met Lys Lys Arg Thr Lys Ala Leu Leu Pro Tyr Ala Val Phe Ile Ile 1 5 10 15 Leu Ser Phe Gln Leu Thr Leu Leu Thr Ala Leu Phe Met Tyr Tyr His 20 25 30 Tyr Thr Phe 35 <210> 59 <211> 38 <212> PRT <213> Alces alces faeces associated microvirus MP12 5423 <400> 59 Met Ala Lys Lys Ile Arg Asn Lys Ala Arg Asp Arg Arg Ile Phe Thr 1 5 10 15 Arg Thr Ala Ser Arg Met His Lys Ala Asn Arg Thr Pro Arg Phe Met 20 25 30 Arg Gly Gly Ile Arg Leu 35 <210> 60 <211> 38 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Gokushovirinae environmental samples sequence <400> 60 Met Arg Arg Lys Lys Met Ser Arg Gly Lys Ser Lys Lys Leu Phe Arg 1 5 10 15 Arg Thr Ala Lys Arg Val His Arg Lys Asn Leu Arg Ala Arg Pro Met 20 25 30 Arg Gly Gly Ile Arg Met 35 <210> 61 <211> 39 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Gokushovirinae environmental samples sequence <400> 61 Met Ala Lys Arg His Lys Ile Pro Gln Arg Ala Ser Gln His Ser Phe 1 5 10 15 Thr Arg His Ala Gln Lys Val His Pro Lys Asn Val Pro Arg Leu Pro 20 25 30 Met Arg Gly Gly Ile Arg Leu 35 <210> 62 <211> 37 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: uncultured bacterium sequence <400> 62 Met Arg Lys Lys Met His Lys Ser Leu Asp Lys Arg Val Phe Asn Arg 1 5 10 15 Thr Ala Lys Lys Ser Lys Lys Ile Asn Val Asn Pro Val Val Tyr Arg 20 25 30 Gly Gly Ile Arg Leu 35 <210> 63 <211> 38 <212> PRT <213> Marine gokushovirus <400> 63 Met Arg Arg Tyr Asn Val Asn Lys Gly Lys Ser Ala Lys Lys Phe Arg 1 5 10 15 Lys Gln Val Ser Lys Thr Lys Val Ala Asn Leu Arg Ser Asn Pro Met 20 25 30 Arg Gly Gly Trp Arg Leu 35 <210> 64 <211> 41 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Richelia intracellularis HH01 sequence <400> 64 Met Arg Pro Val Lys Arg Ser Arg Val Asn Lys Ala Arg Ser Ala Gly 1 5 10 15 Lys Phe Arg Lys Gln Val Gly Lys Thr Lys Met Ala Asn Leu Arg Ser 20 25 30 Asn Pro Met Arg Gly Gly Trp Arg Leu 35 40 <210> 65 <211> 41 <212> PRT <213> Gokushovirinae Fen7875_21 <400> 65 Met Lys Pro Leu Lys Arg Lys Pro Val Gln Lys Ala Arg Ser Ala Ala 1 5 10 15 Lys Phe Arg Arg Asn Val Ser Thr Val Lys Ala Ala Asn Met Ala Val 20 25 30 Lys Pro Met Arg Gly Gly Trp Arg Phe 35 40 <210> 66 <211> 44 <212> PRT <213> Mycobacterium phage BabyRay <400> 66 Met Thr Lys Arg Asp Ile Glu Tyr Arg Lys Ala Leu Gly Leu Asn Pro 1 5 10 15 Ser Glu Pro Leu Pro Lys Ile Val Gly Ala Val Thr Arg His Gly Ala 20 25 30 Thr Leu Lys Arg Pro Arg Val Thr Ala Leu Ala Arg 35 40 <210> 67 <211> 38 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Bdellovibrio phage phiMH2K sequence <400> 67 Met Lys Arg Lys Pro Met Ser Arg Lys Ala Ser Gln Lys Thr Phe Lys 1 5 10 15 Lys Asn Thr Gly Val Gln Arg Met Asn His Leu Asn Pro Arg Ala Met 20 25 30 Arg Gly Gly Ile Arg Leu 35 <210> 68 <211> 120 <212> DNA <213> Escherichia sp. <400> 68 atggctcgtt ctcgtcgtcg tatgtctaaa cgttcttctc gtcgttcttt tcgtaaatat 60 gctaaaactc ataaaaaaaa ttttaaagct cgttctatgc gtggaggaat tcgtttataa 120 <210> 69 <211> 117 <212> DNA <213> Escherichia sp. <400> 69 atggcgcgca gccgccgccg catgagcaaa cgcagcagcc gccgcagctt tcgcaaatat 60 gcgaaaagcc ataaaaaaaa ctttaaagcg cgcagcatgc gcggcggcat tcgcctg 117 <210> 70 <211> 165 <212> DNA <213> Pseudomonas phage PP7 <400> 70 atgtcttcta ccctgtgccg ttgggctgtt aaagctctgc gttgcacccg tgtttacaaa 60 gaattcatct ggaaaccgct ggttgctctg tcttacgtta ccctgtacct gctgtcttct 120 gttttcctgt ctcagctgtc ttacccgatc ggttcttggg ctgtt 165 <210> 71 <211> 108 <212> DNA <213> Acinetobacter phage AP205 <400> 71 atgaagaaaa ggacaaaagc cttgcttccc tatgcggttt tcatcatact cagctttcaa 60 ctaacattgt tgactgcctt gtttatgtat taccattata ccttttag 108 <210> 72 <211> 117 <212> DNA <213> Alces alces faeces associated microvirus MP12 5423 <400> 72 atggcaaaga aaattagaaa caaagcacgt gatagacgta tcttcacaag aacagcttca 60 cgcatgcaca aggcaaaccg cacaccaaga tttatgagag gcggtattag gttatga 117 <210> 73 <211> 114 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Gokushovirinae environmental samples sequence <400> 73 atgcgtcgta aaaaaatgtc tcgtggtaaa tctaaaaaac tgttccgtcg taccgctaaa 60 cgtgttcacc gtaaaaacct gcgtgctcgt ccgatgcgtg gtggtatccg tatg 114 <210> 74 <211> 117 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Gokushovirinae environmental samples sequence <400> 74 atggctaaac gtcacaaaat cccgcagcgt gcttctcagc actctttcac ccgtcacgct 60 cagaaagttc acccgaaaaa cgttccgcgt ctgccgatgc gtggtggtat ccgtctg 117 <210> 75 <211> 111 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: uncultured bacterium sequence <400> 75 atgcgtaaaa aaatgcacaa atctctggac aaacgtgttt tcaaccgtac cgctaaaaaa 60 tctaaaaaaa tcaacgttaa cccggttgtt taccgtggtg gtatccgtct g 111 <210> 76 <211> 117 <212> DNA <213> Marine gokushovirus <400> 76 atgcgacgtt acaatgtaaa taaaggtaaa tctgctaaga agtttcgaaa gcaggtaagt 60 aagacgaagg ttgcaaacct acgttctaat ccaatgcgag gtggttggag actctaa 117 <210> 77 <211> 126 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Richelia intracellularis HH01 sequence <400> 77 atgcgtccag ttaaaagatc aagagtaaat aaggcccgat ctgcaggcaa gtttcgtaag 60 caggtcggta aaacaaagat ggcaaatctg cgtagtaatc cgatgcgcgg cggatggcgg 120 ctgtga 126 <210> 78 <211> 126 <212> DNA <213> Gokushovirinae Fen7875_21 <400> 78 atgaagccat tgaagcgtaa gccggttcag aaggcgcggt cagcagccaa gttccgtcga 60 aatgtgtcta ccgttaaggc tgccaatatg gcggtgaagc cgatgcgcgg cggttggcgg 120 ttctga 126 <210> 79 <211> 135 <212> DNA <213> Mycobacterium phage BabyRay <400> 79 atgaccaaga gagacatcga gtaccggaaa gctttggggc tcaacccatc tgagccgctc 60 ccgaagattg tgggtgccgt cacccgccac ggggccactc tgaaacgccc acgggtcacc 120 gcactggccc gatag 135 <210> 80 <211> 117 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Bdellovibrio phage phiMH2K sequence <400> 80 atgaaaagaa aaccaatgag ccgcaaggcc tctcaaaaaa ccttcaaaaa gaacacaggc 60 gttcaacgca tgaaccatct caacccacgc gccatgcgtg gtggcattag actataa 117 <210> 81 <211> 44 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> D-amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> D-amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(9) <223> D-amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (11)..(11) <223> D-amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (14)..(16) <223> D-amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (18)..(19) <223> D-amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (23)..(23) <223> D-amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (27)..(27) <223> D-amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (31)..(31) <223> D-amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (33)..(33) <223> D-amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (35)..(36) <223> D-amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (39)..(39) <223> D-amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (43)..(43) <223> D-amino acid <400> 81 Met Arg Leu Lys Met Ala Arg Arg Arg Tyr Arg Leu Pro Arg Arg Arg 1 5 10 15 Ser Arg Arg Leu Phe Ser Arg Thr Ala Leu Arg Met His Pro Arg Asn 20 25 30 Arg Leu Arg Arg Ile Met Arg Gly Gly Ile Arg Phe 35 40 <210> 82 <211> 45 <212> 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Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(5) <223> D-amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (8)..(9) <223> D-amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (12)..(13) <223> D-amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (21)..(21) <223> D-amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (23)..(23) <223> D-amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (33)..(33) <223> D-amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (37)..(37) <223> D-amino acid <400> 95 Met Lys Arg Arg Lys Met Thr Arg Lys Gly Ser Lys Arg Leu Phe Thr 1 5 10 15 Ala Thr Ala Asp Lys Thr Lys Ser Ile Asn Thr Ala Pro Pro Pro Met 20 25 30 Arg Gly Gly Ile Arg Leu 35 <210> 96 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(4) <223> D-amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(8) <223> D-amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (11)..(12) <223> D-amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (15)..(16) <223> D-amino 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Arg Asp Lys Arg Val Phe 1 5 10 15 Lys Gln Thr Ala Asn Lys Thr Lys Ala Ile Asn Ile Ser Pro Lys Asn 20 25 30 Met Arg Gly Gly Thr Arg Leu 35 <210> 99 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(4) <223> D-amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> D-amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (9)..(10) <223> D-amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (14)..(14) <223> D-amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (20)..(20) <223> D-amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (23)..(24) <223> D-amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (33)..(33) <223> D-amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (36)..(37) <223> D-amino acid <400> 99 Met Arg Arg Lys Val Lys Asn Thr Lys Arg His Gln Trp Arg Leu Thr 1 5 10 15 His Ser Ala Arg Ser Ile Lys Arg Ala Asn Ile Met Pro Ser Asn Pro 20 25 30 Arg Gly Gly Arg Arg 35 <210> 100 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> D-amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(7) <223> D-amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(11) <223> D-amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (14)..(15) <223> D-amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (18)..(19) <223> D-amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (22)..(22) <223> D-amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (25)..(26) <223> D-amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (29)..(29) <223> D-amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (31)..(31) <223> D-amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (34)..(34) <223> D-amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (38)..(38) <223> D-amino acid <400> 100 Met Ala Arg Ser Arg Arg Arg Met Ser Lys Arg Ser Ser Arg Arg Ser 1 5 10 15 Phe Arg Lys Tyr Ala Lys Thr His Lys Lys Asn Phe Lys Ala Arg Ser 20 25 30 Met Arg Gly Gly Ile Arg Leu 35 <210> 101 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(3) <223> D-amino acid <220> 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Marine gokushovirus <400> 103 atgatcgttc gtcgtcacaa aatgtctcgt cgtcgttctc gtaaactgtt ctctaaaacc 60 gcttctcgta cccgttctaa aaacctgcgt tctcgtccga tgcgtggtgg ttaccgtatc 120 <210> 104 <211> 138 <212> DNA <213> Mycobacterium virus Peaches <400> 104 atgaaactga ccaaatctga catcgcttac cgtgaagctc tgggtctgtc taccaccgac 60 ccgctgccgg ctgaaatcgg tatggttacc cgtcgtgcta accgtctgaa acgtccgcgt 120 aaaaccgctc gtttccgt 138 <210> 105 <211> 132 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 105 atgaggttaa aaatggcacg aagaagatac agacttccgc gacgtagaag tcgaagactt 60 ttttcaagaa ctgcattgag gatgcatcca agaaataggc ttcgaagaat tatgcgtggc 120 ggcattaggt tc 132 <210> 106 <211> 135 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 106 atgaggttaa aaatggcacg aagaagatac agacttccgc gacgtagaag tcgaagactt 60 ttttcaagaa ctgcattgag gatgcatcca agaaataggc ttcgaagaat tatgcgtggc 120 ggcattaggt tctgt 135 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Claims (40)

1. 하기를 포함하는 약제학적 조성물:
   유효량의 (i) 서열 번호 81~91 및 94~102로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 단리된 Chp 펩타이드 또는 이의 활성 단편, 또는 (ii) 서열 번호 81~91 및 94~102 중 적어도 하나의 아미노산 서열과 80%의 서열 동일성을 갖는 변형된 Chp 펩타이드로서, 여기서, 상기 변형된 Chp 펩타이드가 그람 음성 세균 또는 항산성 세균의 적어도 한 종의 성장을 억제하거나 이의 집단을 감소시키거나 이를 사멸시키는, 변형된 Chp 펩타이드; 및
   약제학적으로 허용되는 담체.
2. 제1항에 있어서, 상기 Chp 펩타이드가 서열 번호 94 및 서열 번호 102로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 가지며, 적어도 하나의 비자연 변형을 함유하는, 약제학적 조성물.
3. 제2항에 있어서, 상기 비자연 변형이 치환 변형, N-말단 아세틸화 변형 및 C-말단 아미드화 변형으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 약제학적 조성물.
4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 아미노산 서열이 서열 번호 81~86으로 이루어진 그룹으로부터 선택되거나 이의 활성 단편인, 약제학적 조성물.
5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 아미노산 서열이 서열 번호 81, 서열 번호 87, 서열 번호 88, 서열 번호 89, 서열 번호 91, 서열 번호 97, 서열 번호 100 및 서열 번호 101로 이루어진 그룹으로부터 선택되거나 이의 활성 단편인, 약제학적 조성물.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 용액, 현탁액, 에멀젼, 흡입성 분말, 에어로졸 또는 스프레이인, 약제학적 조성물.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 그람 음성 세균 또는 항산성 세균의 치료에 적합한 하나 이상의 항생제를 추가로 포함하는, 약제학적 조성물.
8. (i) 서열 번호 81~91 및 94~102로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 Chp 펩타이드 또는 이의 활성 단편, 또는 (ii) 서열 번호 81~91 및 94~102 중 적어도 하나의 아미노산 서열과 80%의 서열 동일성을 갖는 변형된 Chp 펩타이드로서, 여기서, 상기 변형된 Chp 펩타이드가 그람 음성 세균 또는 항산성 세균의 적어도 한 종의 성장을 억제하거나 이의 집단을 감소시키거나 이를 사멸시키는, 변형된 Chp 펩타이드를 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터.
9. (i) 서열 번호 81~91 및 94~102로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 Chp 펩타이드 또는 이의 활성 단편, 또는 (ii) 서열 번호 81~91 및 94~102 중 적어도 하나의 아미노산 서열과 80%의 서열 동일성을 갖는 변형된 Chp 펩타이드로서, 여기서, 상기 변형된 Chp 펩타이드가 그람 음성 세균 또는 항산성 세균의 적어도 한 종의 성장을 억제하거나 이의 집단을 감소시키거나 이를 사멸시키는, 변형된 Chp 펩타이드를 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 재조합 발현 벡터로서, 상기 핵산이 이종 프로모터에 작동적으로 연결되어 있는, 재조합 발현 벡터.
10. 제9항에 있어서, 상기 아미노산 서열이 서열 번호 81~86으로 이루어진 그룹으로부터 선택되거나 이의 활성 단편인, 재조합 발현 벡터.
11. 제9항에 있어서, 상기 아미노산 서열이 서열 번호 81, 서열 번호 87, 서열 번호 88, 서열 번호 89, 서열 번호 91, 서열 번호 97, 서열 번호 100 및 서열 번호 101로 이루어진 그룹으로부터 선택되거나 이의 활성 단편인, 재조합 발현 벡터.
12. 제8항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산 분자가 cDNA 서열인, 재조합 발현 벡터.
13. 제8항 내지 제12항 중 어느 한 항의 벡터를 포함하는 단리된 숙주 세포.
14. 서열 번호 81~91 및 94~102로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 Chp 펩타이드 또는 이의 활성 단편을 인코딩하는 단리되고 정제된 핵산 또는 이와 상보적인 서열을 포함하는 핵산.
15. 제14항에 있어서, 상기 Chp 펩타이드가 서열 번호 94 및 서열 번호 102로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하며, 적어도 하나의 비자연 변형을 함유하는, 단리되고 정제된 핵산.
16. 제15항에 있어서, 상기 변형이 치환 변형, N-말단 아세틸화 변형 및 C-말단 아미드화 변형으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 단리되고 정제된 핵산.
17. 서열 번호 103~115 및 서열 번호 118~124로 이루어진 그룹으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 단리되고 정제된 DNA.
18. 제17항에 있어서, 상기 뉴클레오타이드 서열이 적어도 하나의 비자연 변형을 함유하는, 단리되고 정제된 DNA.
19. 제17항 또는 제18항에 있어서, 상기 비자연 변형이 N-말단 아세틸화 변형 또는 C-말단 아미드화 변형을 인코딩하는 돌연변이 또는 핵산 서열인, 단리되고 정제된 DNA.
20. 그람 음성 세균의 적어도 한 종의 성장을 억제하거나 이의 집단을 감소시키거나 이를 사멸시키는 방법으로서, 상기 방법이 상기 세균을, 유효량의 (i) 서열 번호 81~91 및 94~102로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 Chp 펩타이드 또는 이의 활성 단편, 또는 (ii) 서열 번호 81~91 및 94~102 중 적어도 하나의 아미노산 서열과 80%의 서열 동일성을 갖는 변형된 Chp 펩타이드를 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하고, 상기 Chp 펩타이드 또는 변형된 Chp 펩타이드가 상기 그람 음성 세균의 적어도 한 종의 성장을 억제하거나 이의 집단을 감소시키거나 이를 사멸시키기에 충분한 시간 동안 용균 활성을 갖는, 방법.
21. 제20항에 있어서, 상기 아미노산 서열이 서열 번호 81~86으로 이루어진 그룹으로부터 선택되거나 이의 활성 단편인, 방법.
22. 항산성 세균의 적어도 한 종의 성장을 억제하거나 이의 집단을 감소시키거나 이를 사멸시키는 방법으로서, 상기 방법이 상기 세균을, 유효량의 (i) 서열 번호 1, 2, 4, 6, 8~21, 23~26, 59~61, 63~65, 67, 81, 87~89, 91, 97 및 99~101로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 Chp 펩타이드 또는 이의 활성 단편, 또는 (ii) 서열 번호 1, 2, 4, 6, 8~21, 23~26, 59~61, 63~65, 67, 81, 87~89, 91, 97 및 99~101 중 적어도 하나의 아미노산 서열과 80%의 서열 동일성을 갖는 변형된 Chp 펩타이드를 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하고, 상기 Chp 펩타이드 또는 변형된 Chp 펩타이드가 상기 항산성 세균의 적어도 한 종의 성장을 억제하거나 이의 집단을 감소시키거나 이를 사멸시키기에 충분한 시간 동안 용균 활성을 갖는, 방법.
23. 제22항에 있어서, 상기 아미노산 서열이 서열 번호 81, 87, 88, 89, 91, 97, 100 및 101로 이루어진 그룹으로부터 선택되거나 이의 활성 단편인, 방법.
24. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 약제학적 조성물을, 세균 감염으로 진단되거나 이의 위험에 처해 있거나 이의 증상을 나타내는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 그람 음성 세균 또는 항산성 세균의 적어도 한 종에 기인하는 세균 감염을 예방하거나 치료하는 방법.
25. 제20항, 제21항 또는 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 그람 음성 세균의 적어도 한 종이 아시네토박터 바우마니 (Acinetobacter baumannii), 슈도모나스 아에루기노사 (Pseudomonas aeruginosa), 에세리키아 콜라이 (Escherichia coli), 클렙시엘라 뉴모니아 (Klebsiella pneumoniae), 엔테로박터 클로아카 (Enterobacter cloacae), 살모넬라 (Salmonella), 나이세리아 고노레아 (Neisseria gonorrhoeae) 및 시겔라 (Shigella)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
26. 제20항, 제21항, 제24항 또는 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 그람 음성 세균의 적어도 한 종이 슈도모나스 아에루기노사인, 방법.
27. 제20항, 제21항, 또는 제24항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 그람 음성 세균의 적어도 한 종이 지속 세포 (persister cell)를 포함하는, 방법.
28. 제22항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항산성 세균의 적어도 한 종이 마이코박테리움 스메그마티스 (Mycobactium smegmatis), 마이코박테리움 투베르쿨로시스 (Mycobacterium tuberculosis), 마이코박테리움 아비움 (Mycobacterium avium), 마이코박테리움 칸사시 (Mycobacterium kansasii), 마이코박테리움 스크로풀라세움 (Mycobacterium scrofulaceum), 마이코박테리움 페레그리눔 (Mycobacterium peregrinum), 마이코박테리움 마리눔 (Mycobacterium marinum), 마이코박테리움 인트라셀룰라레 (Mycobacterium intracellulare) 및 마이코박테리움 포르투이툼 (Mycobacterium fortuitum)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
29. 제22항 내지 제24항, 또는 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항산성 세균의 적어도 한 종이 마이코박테리움 투베르쿨로시스인, 방법.
30. 제20항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세균 감염이 국소 또는 전신 세균 감염인, 방법.
31. 제24항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 그람 음성 세균 감염 또는 항산성 세균 감염의 치료에 적합한 항생제를 상기 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
32. 제31항에 있어서, 상기 그람 음성 세균 감염의 치료에 적합한 항생제가 아지트로마이신, 아즈트레오남, 포스포마이신, 세프타지딤, 세페핌, 세포페라존, 세프토비프롤, 시프로플록사신, 레보플록사신, 아미노글리코사이드, 이미페넴, 메로페넴, 도리페넴, 겐타마이신, 토브라마이신, 아미카신, 피페라실린, 티카르실린, 페니실린, 리팜피신, 폴리믹신 B 및 콜리스틴 중 하나 이상으로부터 선택되는, 방법.
33. 제31항 또는 제32항에 있어서, 상기 그람 음성 세균 감염의 치료에 적합한 항생제가 아미카신, 아지트로마이신, 아즈트레오남, 시프로플록사신, 콜리스틴, 포스포마이신, 겐타마이신, 이미페넴, 피페라실린, 리팜피신 및 토브라마이신 중 하나 이상으로부터 선택되는, 방법.
34. 제30항에 있어서, 상기 항산성 세균 감염의 치료에 적합한 항생제가 이소니아지드, 리팜핀, 에탐부톨 및 피라진아미드 중 하나 이상으로부터 선택되는, 방법.
35. 제30항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 약제학적 조성물을 투여하는 것이 항생제 단독을 투여하는 것 보다 그람 음성 세균 또는 항산성 세균의 성장을 억제하거나 이의 집단을 감소시키거나 이를 사멸시키는데 더 효과적인, 방법.
36. 제30항 내지 제34항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 그람 음성 세균 또는 항산성 세균이 사람 혈청 및/또는 폐 계면 활성제에 존재하는, 방법.
37. 그람 음성 세균의 적어도 한 종을 포함하는 생물막의 방지, 파괴 또는 제거를 위한 방법으로서, 상기 방법이 상기 생물막을 (i) 서열 번호 81~91 및 94~102로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 단리된 Chp 펩타이드 또는 이의 활성 단편, 또는 (ii) 서열 번호 81~91 및 94~102 중 적어도 하나의 아미노산 서열과 80%의 서열 동일성을 갖는 변형된 Chp 펩타이드로서, 여기서, 상기 변형된 Chp 펩타이드가 그람 음성 세균의 적어도 한 종의 성장을 억제하거나 이의 집단을 감소시키거나 이를 사멸시키는, 변형된 Chp 펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하고, 상기 생물막이 효과적으로 방지, 파괴 또는 제거되는, 방법.
38. 제36항에 있어서, 상기 그람 음성 세균의 적어도 한 종이 스테노트로포모나스 말토필리아 (Stenotrophomonas maltophilia)인, 방법.
39. 제36항 또는 제37항에 있어서, 상기 단리된 Chp 펩타이드가 서열 번호 81의 아미노산 서열 또는 이의 활성 단편, 또는 서열 번호 81과 80%의 서열 동일성을 갖는 변형된 Chp 펩타이드를 가지며, 여기서, 상기 변형된 Chp 펩타이드가 그람 음성 세균의 적어도 한 종의 성장을 억제하거나 이의 집단을 감소시키거나 이를 사멸시키는, 방법.
40. 제20항, 제21항, 제24항 내지 제26항, 또는 제29항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 그람 음성 세균의 적어도 한 종이 그람 음성 세균 감염의 치료에 적합한 적어도 하나의 항생제에 내성인, 방법.
    

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