CN110863027A - 一种生物转化法降低夫西地酸副产物含量的方法 - Google Patents
一种生物转化法降低夫西地酸副产物含量的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN110863027A CN110863027A CN201911164008.0A CN201911164008A CN110863027A CN 110863027 A CN110863027 A CN 110863027A CN 201911164008 A CN201911164008 A CN 201911164008A CN 110863027 A CN110863027 A CN 110863027A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- fusidic acid
- percent
- rhizopus
- fermentation
- culture medium
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P33/00—Preparation of steroids
Landscapes
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明属于发酵工程和微生物甾体转化技术领域,具体涉及一种生物转化法降低夫西地酸副产物含量的方法。本方法以黑根霉或米根霉为转化菌,将夫西地酸粗提液中M副产物转化为夫西地酸。具体包括以下步骤:将黑根霉孢子悬浮液或米根霉孢子悬浮液接入黑根霉或米根霉发酵培养基中,发酵培养24 h;将发酵获得的夫西地酸发酵液经过浸提、离心处理后得到上清液,将上清液蒸发浓缩得到M杂质乙醇浓缩液,将M杂质乙醇浓缩液投入到经发酵培养24 h后的黑根霉或米根霉发酵培养基中,加入氧载体,继续转化M杂质,即可。本发明利用生物转化减低夫西地酸中M杂质含量的方法,使其含量低于2%,显著提升夫西地酸产品质量。
Description
技术领域
本发明属于发酵工程和微生物甾体转化技术领域,具体涉及一种生物转化法降低夫西地酸副产物含量的方法。
背景技术
夫西地酸,分子式为C31H48O6,分子量为516.69,化学名称为:16β-乙酰氧
基-3α,11α-二羟基-4α,8α,14β-三甲基-18-去甲-5α,10β-胆甾-(17Z) -17(20) ,24-二烯-21-酸,具有甾体样结构,其分子结构与烟曲孢酸、头孢菌素P都有着较高的相似度,仅少部分基团存在差异,差异基团的存在赋予了其特有的抑菌作用。研究表明,夫西地酸水溶性极微、脂溶性较好,而夫西地酸钠易溶于水。
夫西地酸是一种重要的抗生素,对G+菌有很强的抑制活性。药物商品主要有夫西地酸钠软膏、夫西地酸钠针剂和干混悬剂等类型,这些不同的剂型可适用于由各种敏感细菌的感染引发的病症,如注射用夫西地酸钠可用于:四肢关节感染、败血症(由细菌引起的)、心脏内膜炎症、囊性纤维化、骨髓炎、皮肤组织感染、肺炎及身体各处创伤性感染等;夫西地酸钠软膏可适用于治疗由于葡萄球菌、链球菌、极小棒状杆菌及其它对夫西地酸钠敏感细菌引起的感染等病症。夫西地酸属于甾体化合物,由于其分子中不对称中心的存在,化学合成步骤繁琐、成本高、得率低,化学法难以应用到实际工业化的生产中,目前国内外均主要采用微生物发酵法生产制备。
夫西地酸从真菌发酵的次级代谢产物中分离得到,目前,除了球形梭链孢菌,尚未发现其他菌种能够合成夫西地酸。与此同时,球形梭链孢菌发酵次级代谢产物夫西地酸中常伴有副产物的存在,特别是M杂质与主产物夫西地酸结构极其相似,仅在C11位缺失一个α-OH,欧洲药典及行业标准明文规定夫西地酸产品中M物质含量应低于2%。球形梭链孢菌发酵法高产制备获得的夫西地酸粗提液中M副产物含量通常约7.0-8.0%。目前,已有关于菌种转化甾体类C11位进行α羟化的报道。因此,选择高表达11α-羟化酶的菌株转化发酵法制得的夫西地酸中的M杂质,减低其含量以提高夫西地酸产品质量并满足药典标准要求,具有重要的经济价值和社会效益。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中球形梭链孢菌发酵法高产制备获得的夫西地酸中M副产物含量偏高,约7.0-8.0%,从而提供一种生物转化法降低夫西地酸副产物含量的方法,本发明利用生物转化减低夫西地酸中M杂质含量的方法,使其含量低于2%,显著提升夫西地酸产品质量。
为了实现上述目的,本发明提供如下技术方案:
本发明利用黑根霉(Rhizopus nigricans)、米根霉(Rhizopus oryzae)分别生物转化降低发酵制备夫西地酸时主要副产物含量的方法。本发明涉及三种菌株,菌株名称为黑根霉、米根霉以及球形梭链孢菌(Fusidiumcoccineum,保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号,保藏日期为2018年3月21日,保藏编号为CGMCC No. 15473)。
一种生物转化法降低夫西地酸副产物含量的方法,以黑根霉或米根霉为转化菌,将夫西地酸粗提液中M副产物转化为夫西地酸。
优选地,所述生物转化法降低夫西地酸副产物含量的方法,具体包括以下步骤:
(1)转化菌的培养:将经PDA固体培养基培养4-5 d后的黑根霉或米根霉,洗涤其孢子,得到黑根霉孢子悬浮液或米根霉孢子悬浮液;将黑根霉孢子悬浮液或米根霉孢子悬浮液接入黑根霉或米根霉发酵培养基中,发酵培养24 h;
(2)将发酵获得的夫西地酸发酵液以稀盐酸调节pH至3.5~4.0后,经过浸提、离心处理后得到上清液,将上清液蒸发浓缩得到M杂质乙醇浓缩液,将M杂质乙醇浓缩液投入到步骤(1)中经发酵培养24 h后的黑根霉或米根霉发酵培养基中,加入氧载体,继续转化M杂质,即可。
优选地,所述步骤(2)中夫西地酸发酵液的制备方法如下:将经PDA固体培养基培养5-6 d的夫西地酸生产菌株接入一级种子培养基中,26 ℃培养72±5 h后按1%接种量转接入二级扩大培养基中,26 ℃培养25±5 h,再按10%的接种量转接入发酵培养基中,26 ℃培养7-8 d,制备得到夫西地酸发酵液。
优选地,所述步骤(2)中氧载体为H2O2或油酸。
优选地,所述步骤(2)中转化条件为为常压、200 rpm、28 ℃振荡全细胞转化共43h。
优选地,所述步骤(1)中黑根霉或米根霉发酵培养基的组成为:葡萄糖5%,玉米浆4%,(NH4)2SO4 0.3%, KH2PO4 0.03%,MgSO4·7H2O 0.075%,ZnSO4·7H2O 0.02%, CaCO30.5%,自然 pH。
优选地,所述一级种子培养基的组成为:种子培养基含葡萄糖2.5%,鱼粉蛋白胨1.0%,酵母粉0.2%,KH2PO4 0.1%,MgSO4 0.05%,玉米浆4.0%,轻质碳酸钙0.2%,pH 5.9±0.1。
优选地,所述的二级扩大种子培养基的组成为:葡萄糖2.5%,鱼粉蛋白胨1.0%,酵母粉0.2%,KH2PO4 0.1%,MgSO4 0.05%,玉米浆4.0%,轻质碳酸钙0.2%,pH 5.9±0.1。
优选地,所述的发酵培养基的组成为:蔗糖10.0%,麸质粉0.5%,酵母粉2.0%,玉米浆1.0%,黄豆饼粉0.5%,KH2PO4 0.1%,MgSO4 0.05%,轻质碳酸钙0.3%,pH 5.9±0.1。
优选地,所述PDA固体培养基组成为:马铃薯20.0%(去皮切块煮沸至泥状,六层纱布过滤去渣),葡萄糖2.0%,琼脂2.0%,自然pH。
与现有技术相比,本发明具有以下有益效果:
(1)本发明显著提高了夫西地酸产品质量,在实际生物法高效制备夫西地酸生产中得到充分应用,具有良好的经济价值和社会效益。
(2)本发明提供的夫西地酸发酵产量为3205 μg/ml,M杂质含量为7.72%,黑根霉和米根霉分别转化完成后,夫西地酸产量分别为3293 μg/ml和3251 μg/ml,夫西地酸产量均有所提升。
(3)本发明提供的夫西地酸菌株,其发酵液M杂质物质产量为268 μg/ml,黑根霉和米根霉分别转化后,杂质剩余为38 μg/ml和58 μg/ml,转化率分别达85.72%和78.49%,杂质含量均低于2%。
(4)本发明提供的生物转化减低夫西地酸中M杂质含量方法,培育条件温和、操作简单,产出投入比高、转化效果明显且容易实施;夫西地酸乙醇粗提液经低温旋转蒸发浓缩等预处理后投料,减少高浓度有机溶剂对黑根霉、米根霉全细胞转化体系的影响。
附图说明
图1是本发明涉及的三个菌株的图,图1(a)为黑根霉(Rhizopus nigricans),图1(b)为米根霉(Rhizopus oryzae),图1(c)为球形梭链孢菌NJWW(Fusidium coccineum);
图2是利用球形梭链孢菌制备夫西地酸发酵液中两种主要甾体类化合物的分子结构图,其中,图2(a)为主产物夫西地酸,图2(b)为副产物M杂质;
图3是高效液相色谱法测定夫西地酸浓度标准曲线图。
具体实施方式
下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
其中,本发明所述的转化用菌株黑根霉在PDA培养基上生长,27 ℃培养4-5 d,也可长成成片菌落,菌落前期气生菌丝丰富且成白色、基内菌丝较少,后期基内菌丝增多,气生菌丝进一步增多,颜色加深并产生大量黑色孢子(如图1(a)所示)。
本发明所述的转化用菌株米根霉在PDA培养基上生长,27 ℃培养4-5 d,可长成成片菌落,菌落前期呈白色,气生菌丝丰富、基内菌丝较少,后期可产生众多黑色孢子(如图1(b)所示)。
所述的夫西地酸高产菌株球形梭链孢菌在PDA培养基上生长,26 ℃培养6 d,菌落直径4-6 mm,菌落颜色白色至灰白色,偶有淡粉色,气生菌丝丰富、基内菌丝及孢子较少,中心有孢子形成的小白点样的突起,有轻微渗出液,无可溶性色素,菌落整体状态较干硬(如图1(c)所示)。
实施例1
将保藏的黑根霉及米根霉甘油管分别涂布于配制的PDA固体培养基上,28 ℃恒温培养4-5 d后,以无菌生理盐水或0.5%的Tween-80无菌水溶液洗涤平板,收集孢子,以1 ml(108个/ml)分别接入发酵培养基中,28 ℃下、200 rpm恒温振荡联合培养24 h后备用。
实施例2
配制PDA固体培养基,将保藏的球形梭链孢菌甘油管涂布于该培养基上,培养基培养5-6 d的夫西地酸生产菌株接入一级种子培养基中,26 ℃培养72±5 h后按1%接种量转接入二级扩大培养基中,26℃培养25±5 h,再按10%的接种量转接入发酵培养基中,26 ℃培养7-8 d,制备得到夫西地酸发酵液。经检测,球形梭链孢菌发酵制备夫西地酸产量为3205 μg/ml,M杂质产量为268 μg/ml(含量为7.72%)。
实施例3
收集发酵所得的夫西地酸发酵液,以稀盐酸调节pH3.5~4.0,静置30 min,用4倍体积的无水乙醇浸提30 min,期间不断晃动混合液。结束后取样适量放置于4 ℃冰箱保存。将此发酵提取液离心,经低温旋转蒸发浓缩上清液。
实施例4
将夫西地酸乙醇浓缩液分别投入到培养24 h后的黑根霉和米根霉的发酵液中,加入3mmol/L的氧载体(H2O2或油酸),在常压下,28 ℃、200 rpm恒温振荡,继续发酵转化至43 h,结束发酵。
实施例5
利用布氏漏斗抽滤分别收集黑根霉和米根霉菌丝及发酵上清液,将菌丝滤饼80℃,处理15 mins后,加入无水乙醇振荡充分混合,待均一后继续加入乙醇并持续混合液漩涡振荡30 min,10000 rpm离心15 min,取上清液,该乙醇上清液以及发酵上清液分别加入等体积乙酸乙酯萃取夫西地酸,合并夫西地酸乙酸乙酯萃取液,测定夫西地酸浓度并确定M杂质含量(如图3所示)。
实施例6
黑根霉和米根霉分别转化完成后,夫西地酸产量分别为3293 μg/ml和3251 μg/ml,夫西地酸产量均有所提升;黑根霉和米根霉分别转化后,杂质剩余为38 μg/ml和58 μg/ml,转化率分别达85.72%和78.49%,杂质含量均低于2%。
以上所述仅为本发明的具体实施方式,但本发明的保护范围并不局限于此,任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内,可轻易想到的变化或替换,都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此,本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
Claims (10)
1.一种生物转化法降低夫西地酸副产物含量的方法,其特征在于,以黑根霉或米根霉为转化菌,将夫西地酸粗提液中M副产物转化为夫西地酸。
2.根据权利要求1所述的一种生物转化法降低夫西地酸副产物含量的方法,其特征在于,具体包括以下步骤:
(1)转化菌的培养:将经PDA固体培养基培养4-5 d后的黑根霉或米根霉,洗涤其孢子,得到黑根霉孢子悬浮液或米根霉孢子悬浮液;将黑根霉孢子悬浮液或米根霉孢子悬浮液接入黑根霉或米根霉发酵培养基中,发酵培养24 h;
(2)将发酵获得的夫西地酸发酵液调节pH至3.5~4.0后,经过浸提、离心处理后得到上清液,将上清液蒸发浓缩得到M杂质乙醇浓缩液,将M杂质乙醇浓缩液投入到步骤(1)中经发酵培养24 h后的黑根霉或米根霉发酵培养基中,加入氧载体,继续转化M杂质,即可。
3. 根据权利要求2所述的一种生物转化法降低夫西地酸副产物含量的方法,其特征在于,所述步骤(2)中夫西地酸发酵液的制备方法如下:将经PDA固体培养基培养5-6 d的夫西地酸生产菌株接入一级种子培养基中,26 ℃培养72±5 h后按1%接种量转接入二级扩大培养基中,26 ℃培养25±5 h,再按10%的接种量转接入发酵培养基中,26 ℃培养7-8 d,制备得到夫西地酸发酵液。
4.根据权利要求2所述的一种生物转化法降低夫西地酸副产物含量的方法,其特征在于,所述步骤(2)中氧载体为H2O2或油酸。
5. 根据权利要求2所述的一种生物转化法降低夫西地酸副产物含量的方法,其特征在于,所述步骤(2)中转化条件为为常压、200 rpm、28 ℃振荡全细胞转化共43 h。
6. 根据权利要求2所述的一种生物转化法降低夫西地酸副产物含量的方法,其特征在于,所述步骤(1)中黑根霉或米根霉发酵培养基的组成为:葡萄糖5%,玉米浆4%,(NH4)2SO40.3%, KH2PO4 0.03%,MgSO4 ·7H2O 0.075%,ZnSO4·7H2O 0.02%, CaCO3 0.5%,自然 pH。
7. 根据权利要求3所述的一种生物转化法降低夫西地酸副产物含量的方法,其特征在于,所述一级种子培养基的组成为:种子培养基含葡萄糖2.5%,鱼粉蛋白胨1.0%,酵母粉0.2%,KH2PO4 0.1%,MgSO4 0.05%,玉米浆4.0%,轻质碳酸钙0.2%,pH 5.9±0.1。
8. 根据权利要求3所述的一种生物转化法降低夫西地酸副产物含量的方法,其特征在于,所述的二级扩大种子培养基的组成为:葡萄糖2.5%,鱼粉蛋白胨1.0%,酵母粉0.2%,KH2PO4 0.1%,MgSO4 0.05%,玉米浆4.0%,轻质碳酸钙0.2%,pH 5.9±0.1。
9. 根据权利要求3所述的一种生物转化法降低夫西地酸副产物含量的方法,其特征在于,所述的发酵培养基的组成为:蔗糖10.0%,麸质粉0.5%,酵母粉2.0%,玉米浆1.0%,黄豆饼粉0.5%,KH2PO4 0.1%,MgSO4 0.05%,轻质碳酸钙0.3%,pH 5.9±0.1。
10.根据权利要求2或3所述的一种生物转化法降低夫西地酸副产物含量的方法,其特征在于,所述PDA固体培养基组成为:马铃薯20.0%,葡萄糖2.0%,琼脂2.0%,自然pH。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201911164008.0A CN110863027A (zh) | 2019-11-22 | 2019-11-22 | 一种生物转化法降低夫西地酸副产物含量的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201911164008.0A CN110863027A (zh) | 2019-11-22 | 2019-11-22 | 一种生物转化法降低夫西地酸副产物含量的方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN110863027A true CN110863027A (zh) | 2020-03-06 |
Family
ID=69655940
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201911164008.0A Pending CN110863027A (zh) | 2019-11-22 | 2019-11-22 | 一种生物转化法降低夫西地酸副产物含量的方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN110863027A (zh) |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4345030A (en) * | 1976-10-22 | 1982-08-17 | The Upjohn Company | Microorganism mutant conversion of sterols to androsta-4-ene-3,17-dione |
CN103088013A (zh) * | 2012-11-06 | 2013-05-08 | 湖南科源生物制品有限公司 | 一种黑根霉及其催化甾体羟基化反应的微生物转化方法 |
EP3488860A1 (en) * | 2017-11-28 | 2019-05-29 | Consejo Superior De Investigaciones Científicas (CSIC) | Chimeric protein with high antimicrobial activity |
-
2019
- 2019-11-22 CN CN201911164008.0A patent/CN110863027A/zh active Pending
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4345030A (en) * | 1976-10-22 | 1982-08-17 | The Upjohn Company | Microorganism mutant conversion of sterols to androsta-4-ene-3,17-dione |
CN103088013A (zh) * | 2012-11-06 | 2013-05-08 | 湖南科源生物制品有限公司 | 一种黑根霉及其催化甾体羟基化反应的微生物转化方法 |
EP3488860A1 (en) * | 2017-11-28 | 2019-05-29 | Consejo Superior De Investigaciones Científicas (CSIC) | Chimeric protein with high antimicrobial activity |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
S PETRIČ等: "Discovery of a steroid 11α-hydroxylase from Rhizopus oryzae and its biotechnological application", 《JOURNAL OF BIOTECHNOLOGY》 * |
万金营: "不同反应体系中黑根霉催化甾体C11α-羟基化的研究", 《中国优秀博硕士学位论文全文数据库(硕士) 工程科技I辑》 * |
杜大庆等: "黑根霉对甾体的C_(11)α羟基化反应", 《河南工业大学学报(自然科学版)》 * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP2011525357A (ja) | 酵母バイオマスの製造方法 | |
WO2013155866A1 (zh) | 一种利用扩张蛋白提高虫草多糖产量的液体发酵方法 | |
CN102061320B (zh) | 11α,17α-二羟基-雄甾-4-烯-3,20-二酮的制备方法 | |
JPS58165786A (ja) | クロストリジウム・アセトブチリカムのブタノールおよびアセトン高生産性突然変異体の創製方法 | |
CN104694401A (zh) | 纯绿青霉菌株及用其生产麦角甾醇过氧化物的方法 | |
CN109680032B (zh) | 一种利用微生物合成7,21-二羟基-20-甲基孕甾-4-烯-3-酮的方法 | |
CN102363796B (zh) | 一种微生物发酵转化生产甘草次酸的方法 | |
CN106701604B (zh) | 一株高效转化甘草酸生产gamg的东乡野生稻内生真菌及其应用 | |
CN101386870A (zh) | 用微生物混合菌株制备红景天液态转化发酵物的方法 | |
CN102703558B (zh) | 一种利用亚麻刺盘孢霉羟化去氢表雄酮的方法 | |
CN108753626B (zh) | 一株生物合成16β-羟基-19-去甲-4-雄烯二酮的菌株及其应用 | |
CN109251870B (zh) | 一种新金色分枝杆菌突变株及其在制备hip的应用 | |
CN103695325A (zh) | 一种热带假丝酵母及一种微生物法制备l-缬氨酸的方法 | |
CN110863027A (zh) | 一种生物转化法降低夫西地酸副产物含量的方法 | |
CN114032187B (zh) | 西藏酸奶来源的马克斯克鲁维酵母菌株及其应用 | |
CN114107105A (zh) | 一种含有水果渣酶解液的发酵培养基及其应用 | |
CN114369627A (zh) | 一种黑曲霉促进餐厨垃圾和菌糠共发酵产乳酸的方法 | |
CN108690853B (zh) | 一种发酵生产丁醇的方法 | |
RU2405828C2 (ru) | Способ получения органических растворителей | |
CN107034261B (zh) | 炭黑曲霉转化黄芪甲苷制备6-o-葡萄糖-环黄芪醇的方法 | |
CN102329829B (zh) | 利用青霉菌转化大豆苷元为8-羟基大豆苷元的方法 | |
US20040259217A1 (en) | Plant mangrove-associated fungus Culvularia lunata and a simple and efficient method of obtaining high yield of pure mannitol from the same | |
CN114958667B (zh) | 一种高产l-乳酸的乳球菌及其应用 | |
CN110643667B (zh) | 甲睾酮c1,2位的生物脱氢方法 | |
CN110656147B (zh) | 雄烯二酮c1,2位的生物脱氢方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20200306 |
|
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |