CN109680032B - 一种利用微生物合成7，21-二羟基-20-甲基孕甾-4-烯-3-酮的方法 - Google Patents

一种利用微生物合成7，21-二羟基-20-甲基孕甾-4-烯-3-酮的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN109680032B
CN109680032B CN201811563245.XA CN201811563245A CN109680032B CN 109680032 B CN109680032 B CN 109680032B CN 201811563245 A CN201811563245 A CN 201811563245A CN 109680032 B CN109680032 B CN 109680032B
Authority
CN
China
Prior art keywords
hbc
mucor
fermentation
cctcc
conversion
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201811563245.XA
Other languages
English (en)
Other versions
CN109680032A (zh
Inventor
王福聚
董华强
李小连
孙强
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Beijing Panqiu Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Beijing Panqiu Biotechnology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Beijing Panqiu Biotechnology Co ltd filed Critical Beijing Panqiu Biotechnology Co ltd
Priority to CN201811563245.XA priority Critical patent/CN109680032B/zh
Publication of CN109680032A publication Critical patent/CN109680032A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN109680032B publication Critical patent/CN109680032B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P39/00—Processes involving microorganisms of different genera in the same process, simultaneously
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P33/00—Preparation of steroids
    • C12P33/06—Hydroxylating

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供了一种利用微生物合成7，21‑二羟基‑20‑甲基孕甾‑4‑烯‑3‑酮的方法。本发明通过两步发酵法，利用卷枝毛霉、直立枝顶孢霉、总状毛霉及烟曲霉中的一种或多种的发酵液将4‑HBC高效转化为7α‑OH‑4‑HBC和7β‑OH‑4‑HBC。在底物4‑HBC投料量为10‑20g/L的条件下，转化率高，从产物中分离得到两种产物，7α‑和7β‑羟基‑4‑HBC,产物总得率为46.5％‑85.32％。本发明方法操作简便，成本低，得率高，为甾体药物的开发合成提供了新的方法，具有良好的经济价值。

Description

一种利用微生物合成7，21-二羟基-20-甲基孕甾-4-烯-3-酮 的方法
技术领域
本发明属于微生物发酵技术和甾体化合物生物合成制备技术领域，具体地说，涉及一种利用微生物合成7，21-二羟基-20-甲基孕甾-4-烯-3-酮的方法。
背景技术
甾体化合物广泛分布于自然界及生物体内，是一类重要的生物活性分子，被誉为药学领域的“金蛋”，伴随着微生物转化技术的发展，甾体药物已经成为世界上销售额第二大的药物，仅次于抗生素类药物,全球年产值近100亿美元。21-羟基-20-甲基孕甾-4-烯-3-酮(4-HBC)可由植物甾醇经生物转化得到，其是合成黄体酮和其它一些肾上腺皮质激素的重要中间体。目前,国家已把甾体激素药物新资源开发作为医药行业近期技术发展的方向和重点之一。
甾体类中间体7位的羟基化可用化学方法进行，但是这些方法路线长，所用试剂昂贵或有毒，不利于进行大规模生产。利用微生物转化法可以很好的克服化学合成法的不足，还具有高效、低耗、污染少等明显优势，符合现代“绿色化学”的要求。利用微生物转化法开发甾体激素药物新资源,最大的难点在于寻找对甾体具有高转化率、高选择性、高产物得率的优势菌株合成一些具有潜力的新型甾体化合物。目前,对甾体激素类药物中间体具有转化能力的主要是分枝杆菌属(Mycobacterium),其不仅转化周期长、底物转化率低而且易形成其他的多种副产物。另外,甾体激素类药物中间体的羟化产品单一，仅9α、14α、15α的羟化有见报道，关于7α或7β的羟化少见研究。因此利用高转化效率的菌株羟化4-HBC以形成具有生物活性的新型甾体化合物7α,21-二羟基-20-甲基孕甾-4-烯-3-酮(7α-OH-4-HBC)和7β,21-二羟基-20-甲基孕甾-4-烯-3-酮(7β-OH-4-HBC)，不仅为甾体药物合成提供了重要的前体化合物，同时可为甾体药物的合成开辟新途径，具有一定的理论研究价值和市场经济价值。
发明内容
本发明的目的是提供一种通过微生物发酵途径生物合成新型甾体化合物7α-OH-4-HBC和7β-OH-4-HBC的方法。
Figure BDA0001913837990000021
本发明的技术方案如下：利用微生物合成7，21-二羟基-20-甲基孕甾-4-烯-3-酮的方法，是将4-HBC加入微生物发酵液，转化得到7α-OH-4-HBC和7β-OH-4-HBC，所述微生物为卷枝毛霉(Mucor circinelloides lusitanicus)、直立枝顶孢霉(Acremoniumstrictum)、总状毛霉(Mucor.racemosus)及烟曲霉(Aspergillus fumigatus)中的一种或多种。
优选地，在本发明的实施例中，所述微生物分别为保藏编号为CCTCC M 2018850的卷枝毛霉(Mucor circinelloides lusitanicus)GB1、保藏编号为CCTCC M 2018851的直立枝顶孢霉(Acremonium strictum)GB2、保藏编号为CCTCC M 2018852的总状毛霉(Mucor.racemosus)GB3及保藏编号为CCTCC M 2018853的烟曲霉(Aspergillusfumigatus)GB4。
卷枝毛霉GB1已于2018年12月3日保藏在中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址：湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山，中国典型培养物保藏中心，邮编430072)，分类命名为卷枝毛霉(Mucor circinelloides lusitanicus)，保藏号为CCTCC M 2018850。
直立枝顶孢霉GB2已于2018年12月3日保藏在中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址：湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山，中国典型培养物保藏中心，邮编430072)，分类命名为直立枝顶孢霉(Acremonium strictum)，保藏号为CCTCC M 2018851。
总状毛霉GB3已于2018年12月3日保藏在中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址：湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山，中国典型培养物保藏中心，邮编430072)，分类命名为总状毛霉(Mucor.racemosus)，保藏号为CCTCC M 2018852。
烟曲霉GB4已于2018年12月3日保藏在中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址：湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山，中国典型培养物保藏中心，邮编430072)，分类命名为烟曲霉(Aspergillus fumigatus)，保藏号为CCTCC M 2018853。
所述微生物发酵液为：将卷枝毛霉、直立枝顶孢霉、总状毛霉及烟曲霉中的一种或多种的细胞液体培养物按照占发酵培养基体积比5％-10％加入发酵培养基至对数生长期的液体培养物；所述细胞液体培养物为菌种加入种子液培养后得到的。
所述发酵培养基，其1L配方为：葡萄糖30-100g，淀粉20-40g，蛋白胨12-50g，酵母粉10-100g，磷酸二氢钾0.1-1g、磷酸氢二钾0.1-1g、氯化钠0.2-2g、硫酸镁0.05-0.5g、硫酸亚铁0.05-0.5g，加蒸馏水至1L，pH4.0-6.5。
所述种子液，其1L配方为：葡萄糖20-50g，蛋白胨10-20g，酵母膏2-5g，磷酸二氢钾1-2g，加蒸馏水至1mL，pH 5-6。
本发明的菌株制备发酵液时培养温度为25-35℃。
本发明的上述方法中，向发酵液中加入4-HBC，使其初始浓度为10-20g/L。优选地，发酵液中4-HBC的初始浓度为10-19g/L。
更优选地，发酵液中4-HBC的初始浓度为12-19g/L。
具体地，当发酵菌株为卷枝毛霉菌株时，液中4-HBC的初始浓度为12-18g/L。当发酵菌株为直立枝顶孢霉菌株时，液中4-HBC的初始浓度为12-16g/L。当发酵菌株为总状毛霉时，发酵液中4-HBC的初始浓度为14-17g/L。当发酵菌株为烟曲霉时，发酵液中4-HBC的初始浓度为13-19g/L。
最优选地，当发酵菌株为卷枝毛霉菌株时，液中4-HBC的初始浓度为15g/L。当发酵菌株为直立枝顶孢霉菌株时，液中4-HBC的初始浓度为15g/L。当发酵菌株为总状毛霉时，发酵液中4-HBC的初始浓度为14-17g/L。当发酵菌株为烟曲霉时，发酵液中4-HBC的初始浓度为15g/L。
将4-HBC加入微生物发酵液后的转化条件为25-30℃，180-250r/min的转速下转化60-80h。
本发明采用不同的微生物，条件、参数会有针对性的调整，经过反复实验筛选后发现：
若用于发酵的微生物为卷枝毛霉时，转化条件为：26-28℃，180-250r/min的转速下转化69-75h。
若用于发酵的微生物为直立枝顶孢霉时，转化条件为：26-28℃，180-250r/min的转速下转化67-73h。
若用于发酵的微生物为总状毛霉时，转化条件为：25-27℃，180-250r/min的转速下转化75-81h。
若用于发酵的微生物为烟曲霉时，转化条件为：28-30℃，180-250r/min的转速下转化63-69h。
本发明还提供了一种用于发酵合成7，21-二羟基-20-甲基孕甾-4-烯-3-酮的微生物，含有保藏编号为CCTCC M 2018850的卷枝毛霉(Mucor circinelloides lusitanicus)、保藏编号为CCTCC M 2018851的直立枝顶孢霉(Acremonium strictum)、保藏编号为CCTCCM 2018852的总状毛霉(Mucor.racemosus)及保藏编号为CCTCC M 2018853的烟曲霉(Aspergillus fumigatus)中的一种或多种。
本发明还提供了上述微生物在发酵合成7，21-二羟基-20-甲基孕甾-4-烯-3-酮中的应用。所述7，21-二羟基-20-甲基孕甾-4-烯-3-酮为7α-OH-4-HBC和7β-OH-4-HBC。
本方法具有高转化率、高选择性、高产物得率的优势，利用高转化效率的菌株羟化4-HBC以形成具有生物活性的新型甾体化合物7α,21-二羟基-20-甲基孕甾-4-烯-3-酮(7α-OH-4-HBC)和7β,21-二羟基-20-甲基孕甾-4-烯-3-酮(7β-OH-4-HBC),在底物4-HBC投料量为10-20g/L的条件下，转化周期不超过4天，转化率超过46％，从产物中分离得到两种产物，7α-和7β-羟基-4-HBC，产物总得率为46.5％-85.32％。不仅为甾体药物合成提供了重要的前体化合物,同时可为甾体药物的合成开辟新途径，具有一定的理论研究价值和市场经济价值。
附图说明
图1为本发明的卷枝毛霉(Mucor circinelloides lusitanicus)GB1在发酵培养基中转化浓度为15g/L的4-HBC为7α-OH-4-HBC及7β-OH-4-HBC的过程研究。图中横坐标为时间(h)，纵坐标为浓度(g/l)。
图2为本发明的直立枝顶孢霉(Acremonium strictum)GB2在发酵培养基中转化浓度为10g/L的4-HBC为7α-OH-4-HBC及7β-OH-4-HBC的过程研究。图中横坐标为时间(h)，纵坐标为浓度(g/l)。
图3为本发明的总状毛霉(Mucor.racemosus)GB3在发酵培养基中转化浓度为20g/L的4-HBC为7α-OH-4-HBC及7β-OH-4-HBC的过程研究。图中横坐标为时间(h)，纵坐标为浓度(g/l)。
图4为本发明的烟曲霉(Aspergillus fumigatus)GB4在发酵培养基中转化浓度为15g/L的4-HBC为7α-OH-4-HBC及7β-OH-4-HBC的过程研究。图中横坐标为时间(h)，纵坐标为浓度(g/l)。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
本发明的PDA培养基的成分及配比：土豆200-500g/l，葡萄糖20-50g/l，酵母粉2-10g/l，琼脂粉10-20g/l，pH自然。在121℃高压蒸汽下灭菌20min.
本发明实施例的种子液培养基的成分及配比和制备方法为：葡萄糖20-50g，蛋白胨10-20g，酵母膏2-5g，磷酸二氢钾1-2g，加蒸馏水至1000mL，pH 5-6；在121℃高压蒸汽下灭菌30min。
本发明实施例的发酵液培养基的成分及配比为：葡萄糖30-100g，淀粉20-40g，蛋白胨12-50g，酵母粉10-100g，磷酸二氢钾0.1-1g、磷酸氢二钾0.1-1g、氯化钠0.2-2g、硫酸镁0.05-0.5g、硫酸亚铁0.05-0.5g，加蒸馏水至1000mL，pH4.0-6.5在121℃高压蒸汽下灭菌30min。
本发明实施例所述的微生物为卷枝毛霉(Mucor circinelloides lusitanicus)、直立枝顶孢霉(Acremonium strictum)、总状毛霉(Mucor.racemosus)及烟曲霉(Aspergillus fumigatus)均为常规上述菌种经诱变得到的诱变后的菌株，申请人于2018年12月3日保藏在中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址：湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山，中国典型培养物保藏中心，邮编430072)对其进行了生物保藏，保藏编号分别为CCTCC M 2018850、CCTCC M 2018851、CCTCC M 2018852、CCTCC M 2018853。
实施例1卷枝毛霉(Mucor circinelloides lusitanicus)菌GB1合成7α-和7β-羟基-4-HBC的方法
1、制备卷枝毛霉菌株GB1的细胞液培养物
挑取固体培养基上的卷枝毛霉菌株GB1一环，接种在装有种子培养基的三角瓶中，在28℃下，置于摇床上以200r/min的转速培养至对数生长期，即制得卷枝毛霉的细胞液体培养物。
2、卷枝毛霉(Mucor circinelloides lusitanicus)菌株的摇瓶发酵
将上述卷枝毛霉(Mucor circinelloides lusitanicus)细胞培养液以8％(v/v)的接种量接入发酵培养基,装液量为250ml三角瓶中装30ml发酵培养基，培养温度为25-30℃，在220r/min的转速下培养菌体进入对数生长期。
3、卷枝毛霉(Mucor circinelloides lusitanicus)菌株生物转化4-HBC
精确称取适量底物4-HBC，投入步骤2中的菌体发酵液，使其终浓度为15g/l，在转化温度28℃，180-250r/min的转速下转化60-80h，即得转化液。转化过程见图1。
4、生物转化4-HBC产物的收集
将转化液过滤除去菌丝体，滤液用乙酸乙酯萃取3次，萃取液浓缩后用饱和NaHCO3、饱和食盐水及水各洗3次，无水硫酸钠干燥后减压蒸干溶剂，得到白色固体。经柱层析(V乙酸乙酯:V石油醚＝1∶3)分离得到化合物1和2。
化合物1：1H-NMR(400MHz,CDCl3)：δ：1.12(3H，s)，1.22(3H，s)，1.34(3H，s)，1.38(3H，m)，1.40(3H，m)，1.51(6H，m)，1.63(2H，m)，1.77(H，m)，2.30(2H，m)，2.61(2H，m)，2.93(2H，m)，3.32(H，m)，3.46(H，d)，3.69(H，d)，5.96(H，d)；13C-NMR(100MHz，CDCl3)：δ：201.9，175.2，124.6，74.8，68.2，55.6，50.3，44.3，46.2，42.7，39.8，39.1，38.2，37.5，35.9，33.2，28.8，27.0，24.2，22.5，21.7,16.4；HR-MS m/z％:[M+H]+347.2。
化合物2：1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ：0.98(3H,s)，1.02(3H，s)，1.15(3H，s)，1.22(3H，m)，1.30(3H，m)，1.39(6H，m)，1.58(2H，m)，1.71(H，m)，2.23(2H，m)，2.46(2H，m)，2.87(2H，m)，3.15(H，m)，3.26(H，d)，3.55(H，d)，5.78(H，d)；13C-NMR(100MHz，CDCl3)：δ：198.6，167.2，125.2，76.8，67.3，53.9，52.3，46.3，42.6，40.6，40.1，38.6，37.9，36.5，34.8，34.2，27.5，26.3，23.6，22.9，20.7，15.2；HR-MS m/z％:[M+H]+347.2。
经NMR及HRMS方法确证，分别确定为21-羟基-20-甲基孕甾-4-烯-3-酮(4-HBC)的7α-和7β-羟基衍生物。其中7α-羟基-4HBC的收率为28.73％，7β-羟基-4HBC的收率为56.59％。
对比例：精确称取适量底物4-HBC，投入上述步骤2中的菌体发酵液中，使其终浓度分别为8、10、12、15、18、21g/l，在转化温度28℃，180-250r/min的转速下转化72h，得转化液。
按上述步骤4进行产物的收集，得到化合物1和2，在不同浓度4-HBC的条件下，各自的收率见下表1：
表1不同底物4-HBC浓度的产物收率
4-HBC的浓度(g/l) 化合物1的收率(％) 化合物2的收率(％) 总收率(％)
8 23.21 20.45 43.66
10 32.54 35.76 68.3
12 31.22 50.31 81.53
15 28.73 56.59 85.32
18 24.64 45.22 69.86
21 13.37 20.42 33.79
从上表可以看出，4-HBC的浓度达到21g/L时，转化反应得到抑制，收率明显降低，当4-HBC的浓度为8g/L时，收率明显降低。
实施例2直立枝顶孢霉(Acremonium strictum)GB2合成7α-和7β-羟基-4-HBC的方法
1、制备直立枝顶孢霉菌株GB2的细胞液培养物
挑取固体培养基上的直立枝顶孢霉菌株GB2一环，接种在装有种子培养基的三角瓶中，在28℃下，置于摇床上以200r/min的转速培养至对数期，即制得直立枝顶孢霉的细胞液体培养物。
2、直立枝顶孢霉(Acremonium strictum)菌株的摇瓶发酵
将上述直立枝顶孢霉(Acremonium strictum)细胞培养液以8％(v/v)的接种量接入发酵培养基,装液量为250ml三角瓶中装30ml发酵培养基，培养温度为25-30℃，200r/min的转速下培养菌体进入对数生长期。3、直立枝顶孢霉(Acremonium strictum)菌株生物转化4-HBC
精确称取适量底物4-HBC，投入步骤2中的菌体发酵液，使其终浓度为10g/l，在转化温度28℃，180-250r/min的转速下转化60-80h，即得转化液。转化过程见图2。
4、生物转化4-HBC产物的收集
将转化液过滤除去菌丝体，滤液用乙酸乙酯萃取3次，萃取液浓缩后用饱和NaHCO3、饱和食盐水及水各洗3次，无水硫酸钠干燥后减压蒸干溶剂，得到白色固体。经柱层析(V乙酸乙酯:V石油醚＝1∶3)分离得到化合物1和2。
化合物1：1H-NMR(400MHz,CDCl3)：δ：1.12(3H，s)，1.22(3H，s)，1.34(3H，s)，1.38(3H，m)，1.40(3H，m)，1.51(6H，m)，1.63(2H，m)，1.77(H，m)，2.30(2H，m)，2.61(2H，m)，2.93(2H，m)，3.32(H，m)，3.46(H，d)，3.69(H，d)，5.96(H，d)；13C-NMR(100MHz，CDCl3)：δ：201.9，175.2，124.6，74.8，68.2，55.6，50.3，44.3，46.2，42.7，39.8，39.1，38.2，37.5，35.9，33.2，28.8，27.0，24.2，22.5，21.7,16.4；HR-MS m/z％:[M+H]+347.2。
化合物2：1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ：0.98(3H,s)，1.02(3H，s)，1.15(3H，s)，1.22(3H，m)，1.30(3H，m)，1.39(6H，m)，1.58(2H，m)，1.71(H，m)，2.23(2H，m)，2.46(2H，m)，2.87(2H，m)，3.15(H，m)，3.26(H，d)，3.55(H，d)，5.78(H，d)；13C-NMR(100MHz，CDCl3)：δ：198.6，167.2，125.2，76.8，67.3，53.9，52.3，46.3，42.6，40.6，40.1，38.6，37.9，36.5，34.8，34.2，27.5，26.3，23.6，22.9，20.7，15.2；HR-MS m/z％:[M+H]+347.2。
经NMR及HRMS方法确证，分别确定为21-羟基-20-甲基孕甾-4-烯-3-酮(4-HBC)的7α-和7β-羟基衍生物。其中7α-羟基-4HBC的收率为38.09％，7β-羟基-4HBC的收率为27.24％。
对比例：精确称取适量底物4-HBC，投入上述步骤2中的菌体发酵液中，使其终浓度分别为6g/L、10g/l、15g/l、20g/l，在转化温度28℃，180r/min的转速下转化70h，得转化液。
按上述步骤4进行产物的收集，得到化合物1和2，在不同浓度4-HBC的条件下，各自的收率见下表2：
表2不同底物4-HBC浓度的产物收率
4-HBC的浓度(g/l) 化合物1的收率(％) 化合物2的收率(％) 总收率(％)
6 19.43 26.42 45.85
10 38.09 27.24 65.33
15 41.87 28.48 70.35
20 21.56 25.78 47.34
从表2可以看出，4-HBC的浓度达到20g/L时，转化反应得到抑制，收率降低。
实施例3总状毛霉(Mucor.racemosus)GB3合成7α-和7β-羟基-4-HBC的方法
1、制备总状毛霉(Mucor.racemosus)GB3的细胞液培养物
挑取固体培养基上的总状毛霉菌株GB3一环，接种在装有种子培养基的三角瓶中，在28℃下，置于摇床上以200r/min的转速培养至对数期，即制得总状毛霉的细胞液体培养物。
2、总状毛霉(Mucor.racemosus)菌株的摇瓶发酵
将上述总状毛霉(Mucor.racemosus)细胞培养液以8％(v/v)的接种量接入发酵培养基,装液量为250ml三角瓶中装30ml发酵培养基，培养温度为25-30℃，在200r/min的转速下培养菌体进入对数生长期。
3、总状毛霉(Mucor.racemosus)菌株生物转化4-HBC
精确称取适量底物4-HBC，投入步骤2中的菌体发酵液，使其终浓度为20g/l，在转化温度28℃，180--250r/min的转速下转化60-80h，即得转化液。转化过程见图3。
4、生物转化4-HBC产物的收集
将转化液过滤除去菌丝体，滤液用乙酸乙酯萃取3次，萃取液浓缩后用饱和NaHCO3、饱和食盐水及水各洗3次，无水硫酸钠干燥后减压蒸干溶剂，得到白色固体。经柱层析(V乙酸乙酯:V石油醚＝1∶3)分离得到化合物1和2，
化合物1：1H-NMR(400MHz,CDCl3)：δ：1.12(3H，s)，1.22(3H，s)，1.34(3H，s)，1.38(3H，m)，1.40(3H，m)，1.51(6H，m)，1.63(2H，m)，1.77(H，m)，2.30(2H，m)，2.61(2H，m)，2.93(2H，m)，3.32(H，m)，3.46(H，d)，3.69(H，d)，5.96(H，d)；13C-NMR(100MHz，CDCl3)：δ：201.9，175.2，124.6，74.8，68.2，55.6，50.3，44.3，46.2，42.7，39.8，39.1，38.2，37.5，35.9，33.2，28.8，27.0，24.2，22.5，21.7,16.4；HR-MS m/z％:[M+H]+347.2。
化合物2：1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ：0.98(3H,s)，1.02(3H，s)，1.15(3H，s)，1.22(3H，m)，1.30(3H，m)，1.39(6H，m)，1.58(2H，m)，1.71(H，m)，2.23(2H，m)，2.46(2H，m)，2.87(2H，m)，3.15(H，m)，3.26(H，d)，3.55(H，d)，5.78(H，d)；13C-NMR(100MHz，CDCl3)：δ：198.6，167.2，125.2，76.8，67.3，53.9，52.3，46.3，42.6，40.6，40.1，38.6，37.9，36.5，34.8，34.2，27.5，26.3，23.6，22.9，20.7，15.2；HR-MS m/z％:[M+H]+347.2。
经NMR及HRMS方法确证，分别确定为21-羟基-20-甲基孕甾-4-烯-3-酮(4-HBC)的7α-和7β-羟基衍生物。其中7α-羟基-4HBC的收率为19％，7β-羟基-4HB的收率为27.5％。
对比例：精确称取适量底物4-HBC，投入上述步骤2中的菌体发酵液中，使其终浓度分别为14g/L、17g/l、20g/l、23g/l，在转化温度28℃，180-250r/min的转速下转化78h，得转化液。
按上述步骤4进行产物的收集，得到化合物1和2，在不同浓度4-HBC的条件下，各自的收率见下表3：
表3不同底物4-HBC浓度的产物收率
4-HBC的浓度(g/l) 化合物1的收率(％) 化合物2的收率(％) 总收率(％)
14 42.24 31.76 74
17 35.64 38.97 74.61
20 19 27.5 46.5
23 10.21 14.31 24.52
从上表可以看出，4-HBC的浓度达到23g/L时，转化反应得到抑制，收率大幅降低。
实施例4烟曲霉(Aspergillus fumigatus)GB4合成7α-和7β-羟基-4-HBC的方法
1、制备烟曲霉(Aspergillus fumigatus)GB4的细胞液培养物
挑取固体培养基上的烟曲霉菌株GB4一环，接种在装有种子培养基的三角瓶中，在28℃下，置于摇床上以200r/min的转速培养至对数期，即制得烟曲霉的细胞液体培养物。
2、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)菌株的摇瓶发酵
将上述烟曲霉(Aspergillus fumigatus)细胞培养液以8％(v/v)的接种量接入发酵培养基,装液量为250ml三角瓶中装30ml发酵培养基，培养温度为25-30℃，在200r/min的转速下培养菌体进入对数生长期。
3、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)菌株生物转化4-HBC
精确称取适量底物4-HBC，投入步骤2中的菌体发酵液，使其终浓度为15g/l，在转化温度28℃，180-250r/min的转速下转化60-80h，即得转化液。转化过程见图4。
4、生物转化4-HBC产物的收集
将转化液过滤除去菌丝体，滤液用乙酸乙酯萃取3次，萃取液浓缩后用饱和NaHCO3、饱和食盐水及水各洗3次，无水硫酸钠干燥后减压蒸干溶剂，得到白色固体。经柱层析(V乙酸乙酯:V石油醚＝1∶3)分离得到化合物1和2。
化合物1：1H-NMR(400MHz,CDCl3)：δ：1.12(3H，s)，1.22(3H，s)，1.34(3H，s)，1.38(3H，m)，1.40(3H，m)，1.51(6H，m)，1.63(2H，m)，1.77(H，m)，2.30(2H，m)，2.61(2H，m)，2.93(2H，m)，3.32(H，m)，3.46(H，d)，3.69(H，d)，5.96(H，d)；13C-NMR(100MHz，CDCl3)：δ：201.9，175.2，124.6，74.8，68.2，55.6，50.3，44.3，46.2，42.7，39.8，39.1，38.2，37.5，35.9，33.2，28.8，27.0，24.2，22.5，21.7,16.4；HR-MS m/z％:[M+H]+347.2。
化合物2：1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ：0.98(3H,s)，1.02(3H，s)，1.15(3H，s)，1.22(3H，m)，1.30(3H，m)，1.39(6H，m)，1.58(2H，m)，1.71(H，m)，2.23(2H，m)，2.46(2H，m)，2.87(2H，m)，3.15(H，m)，3.26(H，d)，3.55(H，d)，5.78(H，d)；13C-NMR(100MHz，CDCl3)：δ：198.6，167.2，125.2，76.8，67.3，53.9，52.3，46.3，42.6，40.6，40.1，38.6，37.9，36.5，34.8，34.2，27.5，26.3，23.6，22.9，20.7，15.2；HR-MS m/z％:[M+H]+347.2。
经NMR及HRMS方法确证，分别确定为21-羟基-20-甲基孕甾-4-烯-3-酮(4-HBC)的7α-和7β-羟基衍生物。其中7α-羟基-4HBC的收率为31.33％，7β-羟基-4HBC的收率为36.6％。
对比例：精确称取适量底物4-HBC，投入上述步骤2中的菌体发酵液中，使其终浓度分别为8g/L、10g/L、15g/l、19g/l、22g/l、24g/l，在转化温度28℃，180-250r/min的转速下转化66h，得转化液。
按上述步骤4进行产物的收集，得到化合物1和2，在不同浓度4-HBC的条件下，各自的收率见下表4：
表4不同底物4-HBC浓度的产物收率
4-HBC的浓度(g/l) 化合物1的收率(％) 化合物2的收率(％) 总收率(％)
8 19.45 24.72 44.17
10 21.32 28.42 49.74
15 31.33 36.67 68
19 27.75 31.22 58.97
22 21.63 20.41 42.04
24 12.34 9.46 21.8
从上表可以看出，4-HBC的浓度达到24g/L时，转化反应得到抑制，收率大幅降低。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (13)

1.一种利用微生物合成7，21-二羟基-20-甲基孕甾-4-烯-3-酮的方法，其特征在于：将4-HBC加入微生物发酵液，转化得到 7α-OH-4-HBC和7β-OH-4-HBC，所述微生物为保藏编号为CCTCC M 2018850的卷枝毛霉(Mucor circinelloides lusitanicus)、保藏编号为CCTCCM 2018851的直立枝顶孢霉（Acremonium strictum）、保藏编号为CCTCC M 2018852的总状毛霉(Mucor. racemosus )及保藏编号为CCTCC M 2018853的烟曲霉（Aspergillus fumigatus）中的一种或多种。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述微生物发酵液为：将卷枝毛霉(Mucor circinelloides lusitanicus)、直立枝顶孢霉（Acremonium strictum）、总状毛霉(Mucor. racemosus )及烟曲霉（Aspergillus fumigatus）中的一种或多种的细胞液体培养物按照 占发酵培养基体积比5%-10%加入发酵培养基培养至对数生长期的发酵液；所述细胞液体培养物为菌种加入种子液培养后得到的。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基，其1L配方为：葡萄糖30-100 g，淀粉20-40 g，蛋白胨12-50 g，酵母粉10-100 g，磷酸二氢钾0.1-1 g、磷酸氢二钾0.1-1 g、氯化钠0.2-2 g、硫酸镁0.05-0.5g、硫酸亚铁0.05-0.5g，加蒸馏水至 1L，pH4.0-6.5；
所述种子液，其1L配方为：葡萄糖20-50 g，蛋白胨10-20 g，酵母膏2-5 g，磷酸二氢钾1-2 g，加蒸馏水至1L，pH 5-6。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，培养温度为25-35℃。
5.根据权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于，发酵液中4-HBC的初始浓度为10-20g/L。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，发酵液中4-HBC的初始浓度为10-19 g/L。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，发酵液中4-HBC的初始浓度为12-19 g/L。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，将4-HBC加入微生物发酵液后的转化条件为25-30℃，180-250 r/min的转速下转化60-80h。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，
若用于发酵的微生物为卷枝毛霉时，转化条件为：26-28℃，180-250 r/min的转速下转化69-75 h；
若用于发酵的微生物为直立枝顶孢霉时，转化条件为：26-28℃，180-250 r/min的转速下转化67-73 h；
若用于发酵的微生物为总状毛霉时，转化条件为：25-27℃，180-250 r/min的转速下转化75-81 h；
若用于发酵的微生物为烟曲霉时，转化条件为：28-30℃，180-250 r/min的转速下转化63-69 h。
10.一种用于发酵合成7，21-二羟基-20-甲基孕甾-4-烯-3-酮的微生物，其特征在于，其为保藏编号为CCTCC M 2018850的卷枝毛霉(Mucor circinelloides lusitanicus)。
11.一种用于发酵合成7，21-二羟基-20-甲基孕甾-4-烯-3-酮的微生物，其特征在于，其为保藏编号为CCTCC M 2018851的直立枝顶孢霉（Acremonium strictum）。
12.一种用于发酵合成7，21-二羟基-20-甲基孕甾-4-烯-3-酮的微生物，其特征在于，其为保藏编号为CCTCC M 2018852的总状毛霉(Mucor. racemosus )。
13.一种用于发酵合成7，21-二羟基-20-甲基孕甾-4-烯-3-酮的微生物，其特征在于，其为保藏编号为CCTCC M 2018853的烟曲霉（Aspergillus fumigatus）。
CN201811563245.XA 2018-12-20 2018-12-20 一种利用微生物合成7，21-二羟基-20-甲基孕甾-4-烯-3-酮的方法 Active CN109680032B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811563245.XA CN109680032B (zh) 2018-12-20 2018-12-20 一种利用微生物合成7，21-二羟基-20-甲基孕甾-4-烯-3-酮的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811563245.XA CN109680032B (zh) 2018-12-20 2018-12-20 一种利用微生物合成7，21-二羟基-20-甲基孕甾-4-烯-3-酮的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN109680032A CN109680032A (zh) 2019-04-26
CN109680032B true CN109680032B (zh) 2021-05-14

Family

ID=66187980

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201811563245.XA Active CN109680032B (zh) 2018-12-20 2018-12-20 一种利用微生物合成7，21-二羟基-20-甲基孕甾-4-烯-3-酮的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN109680032B (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113461764A (zh) * 2021-06-22 2021-10-01 北京泛球生物科技有限公司 一种熊去氧胆酸的合成方法
CN113621016B (zh) * 2021-09-06 2022-05-17 北京泛球生物科技有限公司 一种地屈孕酮关键中间体的合成方法
CN114933973B (zh) * 2022-02-17 2023-09-01 浙江树人学院（浙江树人大学） 拉斯坦毛霉hz-6-27及其在黄精多糖提取中的应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005095434A1 (ja) * 2004-03-31 2005-10-13 Kuraray Co., Ltd. ５α－プレグナン誘導体の製造方法
CN106591155A (zh) * 2017-01-13 2017-04-26 郑州大学 尖孢镰刀菌株及其在制备3β，7α，15α‑三羟基雄甾‑5‑烯‑17‑酮中的应用

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002020552A1 (fr) * 2000-09-08 2002-03-14 Kuraray Co., Ltd. Procédé de préparation de dérivés de prégnane

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005095434A1 (ja) * 2004-03-31 2005-10-13 Kuraray Co., Ltd. ５α－プレグナン誘導体の製造方法
CN106591155A (zh) * 2017-01-13 2017-04-26 郑州大学 尖孢镰刀菌株及其在制备3β，7α，15α‑三羟基雄甾‑5‑烯‑17‑酮中的应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Microbial 7ao-Hydroxylation of 3-Ketobisnorcholenol;CARL W. DESPREAUX等;《APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY》;19860531;全文 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN109680032A (zh) 2019-04-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN109680032B (zh) 一种利用微生物合成7，21-二羟基-20-甲基孕甾-4-烯-3-酮的方法
EP1734128A1 (en) Method for producing vanillic acid and vanillin from waste residue of rice bran oil by fermentation and biotransformation
CN110407847B (zh) 一种从土曲霉中获得的azaphilones类化合物及其制备和应用
CN108559766B (zh) 甾体药物中间体的制备方法
CN110863021B (zh) 一种细胞松弛素类化合物的制备方法和应用
CN104694401A (zh) 纯绿青霉菌株及用其生产麦角甾醇过氧化物的方法
EP3029147A1 (en) A method of semi-solid state fermentation for producing surfactin from a mutant strain of bacillus subtilis subsp
CN113563361B (zh) 一种从伯克霍尔德菌发酵液提取fr901464的方法
CN111411134B (zh) 一种海洋芽孢杆菌Bacillus sp.JIN118发酵生产嘌呤的制备方法
CN110628860A (zh) 植物甾醇转化分离9α-OH-AD和甲酯物的方法
CN109666707B (zh) 利用土曲霉菌株生产4-o-去甲基巴尔巴地衣酸进而合成合成橡苔的方法
CN111117893B (zh) 一种产生4-o-去甲基巴尔巴地衣酸的土曲霉菌株极其应用
CN111116370B (zh) 利用4-o-去甲基巴尔巴地衣酸合成2,4-二羟基-3,6-二甲基苯甲酸甲酯的方法
CN109251870B (zh) 一种新金色分枝杆菌突变株及其在制备hip的应用
CN109136111B (zh) 一种利用海洋真菌大规模制备色氨酸-丙氨酸环二肽的方法
CN110846370A (zh) 采用生长细胞生物发酵麦角固醇醚化物制备中间体的方法
CN108753626B (zh) 一株生物合成16β-羟基-19-去甲-4-雄烯二酮的菌株及其应用
CN107177508B (zh) 一种生物法合成生产长链十二碳二元酸的方法
CN110872338B (zh) 一种吲哚二萜类化合物及其制备方法和用途
CN108251490B (zh) 一种提高液体发酵灵芝菌丝体中灵芝酸a的发酵培养基及发酵方法
CN113004237A (zh) 一种螺环化合物及其制备方法和应用
CN110713509A (zh) 采用生长细胞生物发酵麦角固醇醚化物制备中间体的方法
CN108441526B (zh) 一种利用海洋真菌大规模生产penicilone类化合物的方法
CN108277170B (zh) 一种新金分枝杆菌及其在制备9-羟基黄体酮中的应用
CN110656147B (zh) 雄烯二酮c1,2位的生物脱氢方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant