CN107177508B - 一种生物法合成生产长链十二碳二元酸的方法 - Google Patents
一种生物法合成生产长链十二碳二元酸的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN107177508B CN107177508B CN201610139691.2A CN201610139691A CN107177508B CN 107177508 B CN107177508 B CN 107177508B CN 201610139691 A CN201610139691 A CN 201610139691A CN 107177508 B CN107177508 B CN 107177508B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- fermentation
- candida tropicalis
- hours
- liquid
- culturing
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
- C12N1/16—Yeasts; Culture media therefor
- C12N1/165—Yeast isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
- C12R2001/72—Candida
- C12R2001/74—Candida tropicalis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
- Botany (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本产品涉及一种新发现的菌株热带假丝酵母(Candida tropicalis)C1201,该菌株一方面能保持现有高水平发酵生产DC12的能力,又具有高度专一的α,ω‑氧化能力,使得产品一元酸的含量大大降低,本发明的DC12产品具有令人满意的晶体状形态,更容易满足欧洲无尘化、低粉尘产品出口要求。
Description
技术领域
本发明涉及一种生物法合成生产长链十二碳二元酸的方法与菌株。
背景技术
长链二元酸是指碳原子数在十个以及以上的二元酸,一般指直链二元酸。十二碳二元酸(DC12)是合成高性能尼龙工程塑料尼龙1212和服装用高档尼龙热熔胶和高级涂料的重要原料。
DC12可以通过微生物发酵或化学合成两种方法制备生产。传统的生产长链二酸的化学方法需要9个复杂的反应步骤,高温、高压和催化剂;生产时需要防火、防爆和防毒装置,收率低、成本高和环境污染严重。而生物发酵法合成工艺简单,常温常压下就能生产,无污染、收率高,具备成本优势。
然而,生物法合成十二碳二元酸的现有方法中,依然存在发酵水平不高,产品纯度达不到制备长链二元酸酯的要求,特别是二元酸产品中由于发酵菌株α,ω-氧化位点的不同,会产生一定含量的一元酸杂质,由于一元酸和二元酸不容易分离,这给后面合成尼龙1212的工艺带来巨大不便。
发明内容
令人意外地,本发明的发明人通过长期生产实践过程中,意外地在发酵后废液(即含有废弃的生产菌株的发酵液中)筛选出一株热带假丝酵母(Candida tropicalis)C1201(保藏号CCTCC NO.M2014545,保藏日期为2014年11月4 日,保藏地点为武汉大学,中国典型培养物保藏中心,分类命名Candida tropicalis C1201),其一方面能保持现有高水平发酵生产DC12的能力或略有提高,又具有高度专一的α,ω-氧化能力,使得产品一元酸的含量大大降低,即热带假丝酵母(Candida tropicalis)C1201为具有单一产品二元酸的高产菌株。此外,该菌株发酵获得产品二元酸,具有更大晶形,使得产品更容易达到后续工艺无尘化和低尘化要求,更加符合欧美市场特别是欧盟市场对无尘化产品的要求
热带假丝酵母(Candida tropicalis)C1201的生理特征如下:
一、糖类的发酵:葡萄糖+,半乳糖+,蔗糖+,麦芽糖+,乳糖-。
二、同化:葡萄糖+,半乳糖+,山梨糖-,蔗糖+,麦芽糖+,纤维二糖+,海藻糖+,乳糖-,密二糖-,棉子糖-,松二糖+,菊芋糖-,可溶性淀粉+,木糖+, L-阿戊糖+,D-阿戊糖-,核糖-,鼠李糖-,α-甲基葡萄糖苷+,甘油+,乙醇+,赤鲜醇-,甘露醇+,肌醇-,核糠醇+,半乳糖醇-,葡萄糖醇+,柠檬酸钠-,丁二酸钠+,乳酸钙-。
三、生长素的需要:生物素++,维生素B1++,维生素B2+,维生素B6+,维生素B12+,叶酸+,烟酸+,泛酸+,肌醇+,对氨基苯甲酸+。四、其它:硝酸盐-,冻化牛奶-,熊果酸分解-,凝固牛奶-,油脂酶-。
形态特征:奶油白色,皱褶型,菌落为蛋糕状和桃酥状。
培养特征:在麦芽汁液体培养基中培养时,假菌丝多而长;在烷烃种子培养基培养时,有一定数量的短假菌丝;而在发酵培养基中发酵时,大部分是单个椭圆细胞。
发明所述的发酵转化正十二烷(nC12)生产十二碳二元酸(DC12)的方法是以热带假丝酵母(Candida tropicalis)C1201为发酵菌种,在以正十二烷为基质的培养基混合液中同步发酵,生产α,ω-十二碳二元酸。
发明所述的发酵转化正十二烷(nC12)生产十二碳二元酸(DC12)的方法的步骤为:
第一阶段为生产热带假丝酵母(Candidatropicalis)C1201的种子培养,即
优选地,把用一株热带假丝酵母C1201(Candidatropicalis)培养成的种母液接入pH值为5.5~9.0含有5~40%(v/v)12个碳原子的正烷烃和95~60%(v/v) 发酵培养基的混合液中。
优选地,本发明的种子培养基:
(1)10巴林糖度的麦芽汁加2%琼脂制成的固体斜面;
(2)10巴林糖度的麦芽汁液体培养基;
(3)烷烃种子培养基包含:KH2PO46~12g/L,酵母膏3~8g/L,玉米浆3~8g/L,蔗糖3~6g/L,重蜡40~70g/L,自来水配置,自然pH。
优选地,培养种子的过程为:取一接种环热带假丝酵母(Candida tropicalis)C1201酵母菌体,涂布在麦芽汁固体斜面上(试管,每支装6~7mL培养基,灭菌后放成斜面),于29~30℃培养40小时。取1~2 支上述培养好的菌种全部刮入装有30mL烷烃种子培养基的250mL三角瓶中,于29~30℃220转/分的旋转摇床上培养40~48小时,作为摇瓶发酵种子或取两支上述培养好的斜面菌种全部刮入装有500mL培养基的5000mL三角瓶中,于200转/分的旋转摇床29~30℃培养44~48小时,菌株生长OD 值达到0.6~0.85时,作为发酵液的种子。
应当明确,以上种子培养基及培养方法仅为优选方法,在本发明说明书给出了该菌株的培养特征、营养特征的前提下,可以对上述条件进行改变,只要使得菌株生长正常能够达到OD值达到0.6~0.85,作为发酵液的种子即可。
优选地,用本发明的C1201菌株生产长链二元酸,特别是十二碳二元酸的第二阶段是:
优选地,把培养好的经过镜检,没有杂菌的发酵液种子接入pH值为5.5~ 9.0含有5~40%(v/v)12个碳原子的正烷烃和95~60%(v/v)发酵培养基的混合液中。
更优选地,把培养好的经过镜检,没有杂菌的发酵液种子接入pH6.0~6.8 的含有15~30%(v/v)的C12的正烷烃和85~70%(v/v)发酵培养基的混合液中。
优选地,发酵培养基的组成为:碱金属磷酸盐4~15g/L,最好为6~10g/L,氯化钠0.5~2.5g/L,最好为1.0~2.0g/L,消泡剂400~1200ppm,重蜡或蔗糖15~30g/L及一些其他公知的营养源。
应当明确,以上种子培养基及培养方法仅为优选方法,在本发明说明书给出了该菌株的培养特征、营养特征的前提下,可以根据菌体在不同培养罐中的环境对上述条件进行改变。
优选地,所述热带假丝酵母C1201(Candida tropicalis)的发酵培养阶段为:将所述混合液在24~34℃下转化48~168小时,然后将生产的十二碳二元酸进行分离纯化。
更优选地,所述热带假丝酵母C1201(Candida tropicalis)的发酵培养阶段为:在pH6.0~7.5下将上述混合物在25~34℃,最优选地在27~31℃通气发酵72~168小时。
优选地,发酵阶段的第一阶段中,体系pH控制在6.0~6.8,以菌体生长为主,同时生产一定数量的二元酸;第二阶段,体系pH控制7.0~8.0之间,以发酵产酸为主,也生长部分菌体;第三阶段,只产酸,不长菌体。更优选地,从72小时开始,每天补加一定量正烷烃,使发酵液中正烷烃浓度始终> 5%(v/v),碱金属磷酸盐可从KH2PO4或KH2PO4中选一种。
优选地,本发明还包括将发酵液中产物十二碳二元酸分离回收阶段:
即发酵结束后,将发酵液加热加碱破乳,加热至80-90℃,加碱至pH10 左右,压入静置分层罐分层。优选地,本发明还包括将残余正烷烃回收再用的步骤,即膜分离除去菌体,清液放置,冷却至20℃,收集DC12钠盐的晶体,母液直接酸化结晶,收集DC12钠盐和DC12,用水或有机溶剂进行重结晶,得到DC12白色结晶。
用本发明的热带假丝酵母C1201菌株和发酵方法,可在50m3发酵罐,从 nC12发酵生产DC12时,发酵163小时,产酸量达220g/L以上,转化率达到 90%以上,DC12纯度达到98%以上,其中一元酸的含量小于0.01%。此外,令人意外地,如说明书附图图1所示,本发明的DC12产品具有令人满意的晶体状形态,这对欧洲无尘化、低粉尘产品进口要求而言更具有竞争力。
附图说明
图1为本发明方法与对比例1方法制备的十二碳二元酸产品示例图;
其中,图1a为本发明方法实施例1制备的十二碳二元酸晶体;
图1b为对比例1方法制备的十二碳二元酸粉末产品。
具体实施方式
实施例1:
(1)、取一接种环热带假丝酵母C1201菌体,涂布在15×180大试管麦芽汁固体斜面上,在28℃培养2天。
(2)、取上述菌种一支,接入装有30ml液体种子培养基的250ml三角瓶中于 28-30℃在220转/分的旋转摇床上培养40小时。液体种子培养基中含有 KH2PO48g/l,酵母膏5g/l,玉米浆3g/l,蔗糖30g/l,尿素3g/l,自来水配置, pH5.0。
(3)、在装有15ml发酵培养基的500ml三角瓶中,接入3.5ml上述培养好的种子液,于28-30℃,220转/分旋转摇床上发酵4天,每24小时用6N NaOH 调一次pH至7.5-8.0。发酵培养基混合液中含KH2PO410g/l,蔗糖20g/l,酵母膏3g/l,玉米浆3.5g/l,尿素1.5g/l,以及nC12200ml/l,自来水配置,pH7.2。在110℃下灭菌30分钟。
发酵结束后,用6N的HCl调节pH至2-3,用120ml乙醚抽提后,蒸去乙醚,得到DC12白色结晶,用15ml中性乙醇溶解后,用标准NaOH溶液滴定,计算出发酵液中DC12含量为89.8g/l,纯度99.43%,其中一元酸含量0.009%。
实施例2:
(1)种子培养基及培养方法和发酵培养基同实例1。
(2)把3000mL培养两天,OD(×30,620nm)为0.81pH 3.8,健壮,无杂菌种液接入装有700L种子培养基,经121℃灭菌40分钟的一级种子罐中,29℃350 转/分,罐压0.8kg/cm2,通气量1∶0.8,培养36小时,作为二级种母的种子。
(3)把(2)中培养的健壮,无杂菌的700L种液接入装有6.5m3种子培养基,经过121℃灭菌40分钟的10m3二级种母罐中,30℃,200转/分,罐压1kg/cm2,通气量1∶0.7,培养40~48小时,作为发酵的种子。
(4)把(3)中培养的健壮、无杂菌的种液,接入装有33m3发酵培养基,经121℃灭菌40分钟的50m3发酵罐中,30℃,200转/分,罐压1kg/cm2,通气量1∶0.5,开始时,nC124m3,30小时内,体系pH控制在7.0以下,菌体迅速生长,同时产生28.5g/LDC12,然后体系pH在7.0~8.0,继续发酵,到67小时,产酸量达到120g/L,70小时后每天补加一定量nC12,使发酵液中正烷烃浓度始终>5%(v/v)。发酵139小时,产酸量达205.8g/L,发酵到163小时结束,产酸量达225g/L。
发酵结束后,进行破乳分层,回收上层残余nC12,下层菌体层通过压滤,除去菌体,合并清液,加入0.6~0.7%活性炭90℃脱色20分钟,压滤除去活性炭,脱色清液加热后加入浓H2SO4至pH3,冷却至室温,压滤,空气吹干,固形物经烘干机烘干,得白色结晶状DC12产品。nC12转化率为92.8%,后处理总收率达到90.5%,DC12纯度达到99.35%,其中一元酸的含量0.008%。
实施例3:
(1)种子培养基及培养方法及发酵培养基、发酵方法同实例2。
(2)把3000mL培养两天,OD(×30,620nm)为0.81pH 3.8,健壮,无杂菌种液接入装有2个700L种子培养基,经121℃灭菌40分钟的一级种子罐中, 29℃350转/分,罐压0.8kg/cm2,通气量1∶0.8,培养36小时,合并作为二级种母的种子。
(3)把(2)中培养的健壮,无杂菌的2个700L种液分别接入2个装有26.5m3种子培养基,经过121℃灭菌40分钟的10m3二级种母罐中,30℃,200转/ 分,罐压1kg/cm2,通气量1∶0.7,培养40~48小时,合并作为发酵的种子。
(4)把(3)中培养的健壮、无杂菌的种液,接入装有66m3发酵培养基,经 121℃灭菌40分钟的100m3发酵罐中,30℃,200转/分,罐压1kg/cm2,通气量1∶0.5,开始时,nC128m3,30小时内,体系pH控制在7.0以下,菌体迅速生长,同时产生32g/LDC12,然后体系pH在7.0~8.0,继续发酵,到67 小时,产酸量达到125g/L,70小时后每天补加一定量nC12,使发酵液中正烷烃浓度始终>5%(v/v)。发酵140小时,产酸量达215g/L,发酵到163小时结束,产酸量达213g/L。
发酵结束后,进行破乳分层,回收上层残余nC12,下层菌体层通过压滤,除去菌体,合并清液,加入0.6~0.7%活性炭90℃脱色20分钟,压滤除去活性炭,脱色清液加热后加入浓H2SO4至pH3,冷却至室温,压滤,空气吹干,固形物经烘干机烘干,得白色结晶状DC12产品。nC12转化率为90.8%,后处理总收率达到91.6%,DC12纯度达到99.45%,其中一元酸的含量0.009%。
对比例1:
该对比例使用中国科学院微生物所许可专利菌株热带假丝酵母UH-2-48,保藏号为CGMCC NO.0239菌株(参见专利ZL 95117436.3),其他方法同实施例1即:
(1)、取一接种环热带假丝酵母UH-2-48菌体,涂布在15×180大试管麦芽汁固体斜面上,在28℃培养2天。
(2)、取上述菌种一支,接入装有30ml液体种子培养基的250ml三角瓶中于 28-30℃在220转/分的旋转摇床上培养40小时。液体种子培养基中含有 KH2PO48g/l,酵母膏5g/l,玉米浆3g/l,蔗糖30g/l,尿素3g/l,自来水配置, pH5.0。
(3)、在装有15ml发酵培养基的500ml三角瓶中,接入3.5ml上述培养好的种子液,于28-30℃,220转/分旋转摇床上发酵4天,每24小时用6N NaOH 调一次pH至7.5-8.0。发酵培养基混合液中含KH2PO410g/l,蔗糖20g/l,酵母膏3g/l,玉米浆3.5g/l,尿素1.5g/l,以及nC12200ml/l,自来水配置,pH7.2。在110℃下灭菌30分钟。
发酵结束后,用6N的HCl调节pH至2-3,用120ml乙醚抽提后,蒸去乙醚,得到DC12白色粉末,用15ml中型乙醇溶解后,用标准NaOH溶液滴定,计算出发酵液中DC12含量为62.7g/l,纯度97.23%,其中一元酸的含量为大于1.2%。
此外,通过附图1的比较,本发明的实施例1获得产品晶体更大,而对比例1获得产品基本为粉末状。
对比例2:
该对比例使用微生物所许可专利菌株热带假丝酵母UH-2-48,保藏号为 CGMCCNO.0239菌株(参见专利ZL 95117436.3),其他方法同实施例2即:
(1)种子培养基及培养方法及发酵培养基、发酵方法同实例2。
(2)把3000mL培养两天,OD(×30,620nm)为0.81pH 3.8,健壮,热带假丝酵母UH-2-48无杂菌种液接入装有700L种子培养基,经121℃灭菌40分钟的一级种子罐中,29℃350转/分,罐压0.8kg/cm2,通气量1∶0.8,培养36小时,作为二级种母的种子。
(3)把(2)中培养的健壮,无杂菌的700L种液接入装有6.5m3种子培养基,经过121℃灭菌40分钟的10m3二级种母罐中,30℃,200转/分,罐压1kg/cm2,通气量1∶0.7,培养40~48小时,作为发酵的种子。
(4)把(3)中培养的健壮、无杂菌的无杂菌种液种液,接入装有33m3发酵培养基,经121℃灭菌40分钟的50m3发酵罐中,30℃,200转/分,罐压1kg/cm2,通气量1∶0.5,开始时,nC124m3,30小时内,体系pH控制在7.0以下,菌体迅速生长,同时产生20.1g/LDC12,然后体系pH在7.0~8.0,继续发酵,到67小时,产酸量达到108g/L,70小时后每天补加一定量nC12,使发酵液中正烷烃浓度始终>5%(v/v)。发酵139小时,产酸量达133g/L,发酵到163 小时结束,产酸量达143g/L。
发酵结束后,进行破乳分层,回收上层残余nC12,下层菌体层通过压滤,除去菌体,合并清液,加入0.6~0.7%活性炭90℃脱色20分钟,压滤除去活性炭,脱色清液加热后加入浓H2SO4至pH 3,冷却至室温,压滤,空气吹干,固形物经烘干机烘干,得白色粉末状DC12产品。nC12转化率为88.8%,后处理总收率达到85%,DC12纯度达到96.35%,其中一元酸的含量大于 1.5%。
以上实施例仅用以说明本发明专利的技术方案而非限制,尽管参照较佳实施例对本发明专利进行了详细说明,本领域的普通技术人员应当理解,可以对本发明专利的技术方案进行修改或者等同替换,而不脱离本技术方案的宗旨和范围,其均应涵盖在本发明专利的权利要求范围当中。
Claims (4)
1.一种利用生物法合成生产长链十二碳二元酸的方法,其特征在于,包括以下步骤:
1)、取一接种环热带假丝酵母(Candida tropicalis)C1201菌体,涂布在15×180大试管麦芽汁固体斜面上,在28℃培养2天;
2)、取上述菌种一支,接入装有30ml液体种子培养基的250ml三角瓶中于28-30℃在220转/分的旋转摇床上培养40小时,液体种子培养基中含有KH2PO4 8g/l,酵母膏5g/l,玉米浆3g/l,蔗糖30g/l,尿素3g/l,自来水配置,pH5.0;
3)、在装有15ml发酵培养基的500ml三角瓶中,接入3.5ml上述培养好的种子液,于28-30℃,220转/分旋转摇床上发酵4天,每24小时用6N NaOH调一次pH至7.5-8.0;所述发酵培养基中含KH2PO4 10g/l,蔗糖20g/l,酵母膏3g/l,玉米浆3.5g/l,尿素1.5g/l,以及nC12200ml/l,自来水配置,pH7.2,在110℃下灭菌30分钟;
发酵结束后,用6N的HCl调节pH至2-3,用120ml乙醚抽提后,蒸去乙醚,得到DC12白色结晶,用15ml中性乙醇溶解后,用标准NaOH溶液滴定,计算出发酵液中DC12含量为89.8g/l,纯度99.43%,其中一元酸含量0.009%;
其中,所述热带假丝酵母(Candida tropicalis)C1201为保藏号CCTCC NO.M2014545的热带假丝酵母(Candida tropicalis);
所述固体斜面为10巴林糖度的麦芽汁液体培养基。
2.一种利用生物法合成生产长链十二碳二元酸的方法,其特征在于包 括以下步骤:
1)、取一接种环热带假丝酵母(Candida tropicalis)C1201菌体,涂布在15×180大试管麦芽汁固体斜面上,在28℃培养2天;
2)、取上述菌种一支,接入装有30ml液体种子培养基的250ml三角瓶中于28-30℃在220转/分的旋转摇床上培养40小时,液体种子培养基中含有KH2PO4 8g/l,酵母膏5g/l,玉米浆3g/l,蔗糖30g/l,尿素3g/l,自来水配置,pH5.0;
3)把3000mL培养两天,OD为0.81,pH 3.8,健壮,无杂菌种液接入装有700L种子培养基,经121℃灭菌40分钟的一级种子罐中,29℃350转/分,罐压0.8kg/cm2,通气量1∶0.8,培养36小时,作为二级种母的种子;
4)把3)中培养的健壮,无杂菌的700L种液接入装有6.5m3种子培养基,经过121℃灭菌40分钟的10m3二级种母罐中,30℃,200转/分,罐压1kg/cm2,通气量1∶0.7,培养40~48小时,作为发酵的种子;
5)把4)中培养的健壮、无杂菌的种液,接入装有33m3发酵培养基,经121℃灭菌40分钟的50m3发酵罐中,30℃,200转/分,罐压1kg/cm2,通气量1∶0.5,开始时,nC12 4m3,30小时内,体系pH控制在7.0以下,菌体迅速生长,同时产生28.5g/L DC12,然后体系pH在7.0~8.0,继续发酵,到67小时,产酸量达到120g/L,70小时后每天补加一定量nC12,使发酵液中正烷烃浓度始终>5%(v/v);发酵139小时,产酸量达205.8g/L,发酵到163小时结束,产酸量达225g/L;
发酵结束后,进行破乳分层,回收上层残余nC12,下层菌体层通过压滤,除去菌体,合并清液,加入0.6~0.7%活性炭90℃脱色20分钟,压滤除去活性炭,脱色清液加热后加入浓H2SO4至pH3,冷却至室温,压滤,空气吹干,固形物经烘干机烘干,得白色结晶状DC12产品;nC12转化率为92.8%,后处理总收率达到90.5%,DC12纯度达到99.35%,其中一元酸的含量0.008%;
其中,所述热带假丝酵母(Candida tropicalis)C1201为保藏号CCTCC NO.M2014545的热带假丝酵母(Candida tropicalis);
所述固体斜面为10巴林糖度的麦芽汁液体培养基;
所述发酵培养基中含KH2PO4 10g/l,蔗糖20 g/l,酵母膏3g/l,玉米浆3.5g/l,尿素1.5g/l,以及nC12 200ml/l,自来水配置,pH7.2,在110℃下灭菌30分钟。
3.一种利用生物法合成生产长链十二碳二元酸的方法,其特征在于,包括以下步骤:
1)、取一接种环热带假丝酵母(Candida tropicalis)C1201菌体,涂布在15×180大试管麦芽汁固体斜面上,在28℃培养2天;
2)、取上述菌种一支,接入装有30ml液体种子培养基的250ml三角瓶中于28-30℃在220转/分的旋转摇床上培养40小时,液体种子培养基中含有KH2PO4 8g/l,酵母膏5g/l,玉米浆3g/l,蔗糖30g/l,尿素3g/l,自来水配置,pH5.0;
3)把3000mL培养两天,OD为0.81,pH 3.8,健壮,无杂菌种液接入装有2个700L种子培养基,经121℃灭菌40分钟的一级种子罐中,29℃350转/分,罐压0.8kg/cm2,通气量1∶0.8,培养36小时,合并作为二级种母的种子;
4)把3)中培养的健壮,无杂菌的2个700L种液分别接入2个装有26.5m3种子培养基,经过121℃灭菌40分钟的10m3二级种母罐中,30℃,200转/分,罐压1kg/cm2,通气量1∶0.7,培养40~48小时,合并作为发酵的种子;
5)把4)中培养的健壮、无杂菌的种液,接入装有66m3发酵培养基,经121℃灭菌40分钟的100m3发酵罐中,30℃,200转/分,罐压1kg/cm2,通气量1∶0.5,开始时,nC12 8m3,30小时内,体系pH控制在7.0以下,菌体迅速生长,同时产生32g/L DC12,然后体系pH在7.0~8.0,继续发酵,到67小时,产酸量达到125g/L,70小时后每天补加一定量nC12,使发酵液中正烷烃浓度始终>5%(v/v),发酵140小时,产酸量达215g/L;
发酵结束后,进行破乳分层,回收上层残余nC12,下层菌体层通过压滤,除去菌体,合并清液,加入0.6~0.7%活性炭90℃脱色20分钟,压滤除去活性炭,脱色清液加热后加入浓H2SO4至pH3,冷却至室温,压滤,空气吹干,固形物经烘干机烘干,得白色结晶状DC12产品,其中nC12转化率为90.8%,后处理总收率达到91.6%,DC12纯度达到99.45%,其中一元酸的含量0.009%;
其中,所述热带假丝酵母(Candida tropicalis)C1201为保藏号CCTCC NO.M2014545的热带假丝酵母(Candida tropicalis);
所述固体斜面为10巴林糖度的麦芽汁液体培养基;
所述发酵培养基中含KH2PO4 10g/l,蔗糖20g/l,酵母膏3g/l,玉米浆3.5g/l,尿素1.5g/l,以及nC12 200ml/l,自来水配置,pH7.2,在110℃下灭菌30分钟。
4.热带假丝酵母(Candida tropicalis) C1201菌株,其中,所述热带假丝酵母(Candida tropicalis)C1201为保藏号CCTCC NO.M2014545的热带假丝酵母(Candidatropicalis)。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201610139691.2A CN107177508B (zh) | 2016-03-11 | 2016-03-11 | 一种生物法合成生产长链十二碳二元酸的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201610139691.2A CN107177508B (zh) | 2016-03-11 | 2016-03-11 | 一种生物法合成生产长链十二碳二元酸的方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN107177508A CN107177508A (zh) | 2017-09-19 |
CN107177508B true CN107177508B (zh) | 2020-05-19 |
Family
ID=59830701
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201610139691.2A Active CN107177508B (zh) | 2016-03-11 | 2016-03-11 | 一种生物法合成生产长链十二碳二元酸的方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN107177508B (zh) |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN111848388A (zh) * | 2019-04-29 | 2020-10-30 | 中国科学院微生物研究所 | 一种十二碳二元酸的晶体及其制备方法 |
CN110616158B (zh) * | 2019-06-25 | 2023-04-18 | 张艾琳 | 一种维斯假丝酵母发酵生产十二碳二元酸的方法 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1928100A (zh) * | 2006-09-06 | 2007-03-14 | 中国科学院微生物研究所 | 生物合成生产十二碳二元酸的新方法 |
CN103030550A (zh) * | 2011-09-30 | 2013-04-10 | 中国科学院微生物研究所 | 长链二元酸提纯精制的方法及产品 |
-
2016
- 2016-03-11 CN CN201610139691.2A patent/CN107177508B/zh active Active
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1928100A (zh) * | 2006-09-06 | 2007-03-14 | 中国科学院微生物研究所 | 生物合成生产十二碳二元酸的新方法 |
CN103030550A (zh) * | 2011-09-30 | 2013-04-10 | 中国科学院微生物研究所 | 长链二元酸提纯精制的方法及产品 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
十二碳二元酸的发酵研究;任刚等;《生物工程学报》;20000331;第16卷(第2期);第198-202页 * |
微生物发酵生产十二碳二元酸的研究;葛明华等;《科技成果管理与研究》;20101231(第10期);第65-67页 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN107177508A (zh) | 2017-09-19 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN107326051B (zh) | 一种微生物发酵法生产的癸二酸及其制备方法 | |
AU2016399463B2 (en) | Omega-7 fatty acid composition, methods of cultivation of Tribonema for production of composition and application of composition | |
CN110616158B (zh) | 一种维斯假丝酵母发酵生产十二碳二元酸的方法 | |
CN1928100A (zh) | 生物合成生产十二碳二元酸的新方法 | |
CN117210343A (zh) | 一种热带假丝酵母菌及其应用、以及一种长链二元酸的生产方法 | |
CN111100800B (zh) | 一株酿酒酵母及其应用 | |
CN107312804B (zh) | 一种正长链十三碳二元酸的生物发酵新方法 | |
CN107177508B (zh) | 一种生物法合成生产长链十二碳二元酸的方法 | |
CN109680032B (zh) | 一种利用微生物合成7,21-二羟基-20-甲基孕甾-4-烯-3-酮的方法 | |
CN112680368A (zh) | 一种生产长链二元酸的菌株及其发酵方法 | |
CN111748480B (zh) | 一种维斯假丝酵母及其应用 | |
CN107058414B (zh) | 一种制备l-丙氨酸的方法 | |
CN111019995B (zh) | 一种以丁香酚为底物发酵生成香兰素的方法 | |
CN101270374B (zh) | 微生物转化油脂生产饱和及不饱和α,ω-二羧酸的方法 | |
CN100335646C (zh) | 一种高含量灵芝多糖精粉及其副产品的综合利用生产工艺 | |
CN102115768B (zh) | 微生物同步发酵正十六烷生产十六碳二元酸的方法 | |
CN102115767B (zh) | 微生物同步发酵正十一烷生产十一碳二羧酸方法 | |
CN110564784B (zh) | 一种维斯假丝酵母发酵生产十四碳二元酸的方法 | |
CN110616235B (zh) | 一种维斯假丝酵母发酵生产十三碳二元酸的方法 | |
CN110564785B (zh) | 一种维斯假丝酵母发酵生产十一碳二元酸的方法 | |
CN111286522B (zh) | 一种含有鼠李糖脂的发酵液的制备方法 | |
CN102071231B (zh) | 一种微生物转化制备s-(+)-3-羟基四氢呋喃的方法 | |
CN113980825B (zh) | 富含麦角甾醇的菌株及其联产麦角甾醇和浸出物的方法 | |
CN1186452C (zh) | 微生物同步发酵正十四烷生产十四碳二羧酸的方法 | |
CN111139189B (zh) | 曲霉wbx-38及其在生产环匹阿尼酸中的应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
CB02 | Change of applicant information | ||
CB02 | Change of applicant information |
Address after: 266000 Laoshan Road, Laoshan District, Qingdao, Shandong Province, No. 111 Applicant after: Zhang Ailin Address before: 100021 Beijing city Chaoyang District Lin Road No. 1 Austrian Deputy Applicant before: Zhang Ailin |
|
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |