CN107326051B - 一种微生物发酵法生产的癸二酸及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种微生物发酵法生产的癸二酸，其中的十碳脂肪酸、十碳羟基脂肪酸等杂质含量具有非常低的水平。本发明还提供了所述癸二酸的制备方法以及由其所制得的聚合物。本发明提供的癸二酸通过微生物发酵法制得，通过微生物发酵过程以及分离纯化过程的处理，可得到纯度更高、杂质含量更低、热稳定性更好的癸二酸产品，尤其是生物法制癸二酸中常见的十碳脂肪酸和十碳羟基脂肪酸杂质含量较低。高纯度、低杂质含量的癸二酸产品可满足高档聚酰胺、聚酯等聚合物产品的质量要求，所得的聚合物产品性能更加优异。本发明的癸二酸制备方法条件温和、环境友好、产品转化率高且品质好，可以替代化学法用于癸二酸产品的工业化规模生产。

Description

一种微生物发酵法生产的癸二酸及其制备方法
技术领域
本发明涉及微生物发酵领域，具体涉及一种微生物发酵法生产的癸二酸及其制备方法。
背景技术
癸二酸广泛用于生产聚酰胺工程塑料，如尼龙1010、尼龙610。也可用于耐高温润滑油、环氧树脂固化剂、合成润滑脂及人造香料、耐寒增塑剂等，是应用广泛的化工原料之一。
目前工业生产和应用的癸二酸是用蓖麻油为原料，通过化学法制备得到的。主要工艺流程是蓖麻油水解生成蓖麻油酸钠皂，然后进一步制备得到蓖麻油酸，蓖麻油酸在苯酚的存在下，加碱、加热进行高温裂解，生成癸二酸双钠盐，然后进一步加热、加酸、脱色、结晶得到癸二酸。采用蓖麻油催化裂解法制癸二酸，生产过程复杂、在250～270℃的高温下进行反应，使用苯酚或邻甲酚有毒试剂，污染环境，严重制约着化学法生产癸二酸产业的发展。
生物法制备癸二酸具有生产工艺简单、绿色环保的特点。前人对生物法癸二酸的制备做了一些研究，特别是在70年代和80年代，相关的研究比较多。中国科学院微生物所的余志华通过诱变筛选得到一株优良菌株，并对该菌株产癸二酸的条件进行了优化，在16升发酵罐上，发酵液中癸二酸达到71g/L以上，通过水相结晶得到了癸二酸成品，产品纯度达到99.6％以上，提取收率85％。刘祖同等人筛选了能产癸二酸的菌株，产癸二酸的浓度为2.9％。中科院林业土壤研究所筛选得到的解脂假丝酵母可以产癸二酸，产酸30～40g/L，转化率43～55％。
由于生物法制备的癸二酸中含有大量的发酵杂质，不易纯化，所得产品难以达到更低的杂质含量，杂质的存在会对癸二酸后续使用如聚合制备聚酰胺等产生重要影响，使所得的聚合物产品难以达到更高的质量性能，而现有研究也多集中在发酵环节，没有系统研究发酵液的后续纯化工艺，更没有研究发酵过程中产生的十碳脂肪酸、十碳羟基脂肪酸等杂质对于产品性能的影响，因此，急需开发一种杂质含量更低、产品性能更高的生物法癸二酸产品。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种微生物发酵法生产的癸二酸，其杂质含量更低，产品性能更好。
本发明的另一个目的是提供所述癸二酸的制备方法。
本发明的还一个目的是提供一种包含所述微生物发酵法生产的癸二酸而制得的聚合物产品。
本发明提供的微生物发酵法生产的癸二酸，其中的十碳脂肪酸杂质含量低于200ppm，优选低于50ppm，以及十碳羟基脂肪酸杂质含量低于300ppm，优选低于100ppm。本发明提供的微生物发酵法生产的癸二酸，其中的十碳脂肪酸杂质和十碳羟基脂肪酸杂质含量可达到极低的水平，本发明人发现，此时的癸二酸产品具有更好的产品性能，尤其是用于制备聚酰胺、聚酯等聚合物时，可明显提高聚合物产品的性能。
进一步地，本发明提供的微生物发酵法生产的癸二酸，其热稳定性大于90％，优选大于等于95％，更优选大于等于97％。
癸二酸产品中常见的一些杂质如糖、氮和一些非饱和的化合物在高温、有氧气存在的情况下发生反应，易导致产品颜色变黄，称为产品的热稳定性。热稳定性的测定为：将产品加热熔融，通入一定量氧气，反应一段时间，测定其透光率。本发明提供的癸二酸可明显提高热稳定性。
本发明提供的上述技术方案任一项所述的癸二酸的制备方法为：首先将热带假丝酵母(Candida tropicalis)进行种子培养，然后将所得种子接入发酵培养基，并加入癸烷开始发酵转化得到发酵液，最后将所述发酵液纯化即得。
本发明的制备方法优选采用热带假丝酵母CAT N145，其保藏号为CCTCCM2011192，它具备的生物学和遗传学特点如公开号为CN102839133A、公开日为2012-12-26的中国发明专利申请所述。利用该菌株生产癸二酸，癸烷到癸二酸的重量转化率可以达到80％以上，产酸可达到100g/L以上。
本发明的制备方法中，种子培养过程中使用的培养基可以为微生物发酵领域中常见的种子培养基种类，例如，可包括碳源、氮源、无机盐、营养因子等等，再如，碳源包括但不限于葡萄糖、麦芽糖、蔗糖等；氮源包括但不限于酵母膏、玉米浆、尿素、硫酸铵、硝酸钾等；无机盐包括但不限于硝酸钾、磷酸二氢钾、氯化钠、硫酸亚铁、硫酸锌等；营养因子包括但不限于维生素C、维生素B1、生物素等。优选地，种子培养基可以包括以下成分：蔗糖15～30g/L、玉米浆2～10g/L、酵母膏1～8g/L、磷酸二氢钾4～12g/L以及尿素1～4g/L。种子培养过程的温度可以为28～30℃，当种子生长至对数生长期可视为完成种子培养，将其接入发酵培养基进行后续发酵转化过程，接种量可以为5～25％(v/v)。
本发明的制备方法中，所述发酵培养基包括以下成分：葡萄糖0～50g/L、硝酸钾1～10g/L、玉米浆2～10g/L、酵母膏1～8g/L、磷酸二氢钾1～10g/L以及硫酸铵1～4g/L。
优选地，所述发酵培养基包括以下成分：葡萄糖25～40g/L、硝酸钾1.2～2.5g/L、玉米浆2～5g/L、酵母膏1～3g/L、磷酸二氢钾1.8～3.5g/L以及硫酸铵1.2～2g/L。
通过控制发酵培养基中的葡萄糖、硫酸铵、硝酸钾、磷酸二氢钾的含量，可更好地控制微生物的生长速度以及利用微生物转化癸二酸和其他代谢副产物的生成速率，特别是控制十碳脂肪酸和十碳羟基脂肪酸的生成速率，从而可有效降低十碳脂肪酸和羟基脂肪酸杂质的含量，减轻后续纯化过程的负担，最终降低癸二酸产品的十碳脂肪酸和羟基脂肪酸杂质含量。
本发明的制备方法中，将种子培养所得种子接入发酵培养基后培养菌体，当菌体稀释三十倍后OD620达到0.5以上时加入癸烷开始发酵转化，在发酵转化过程中，控制菌体稀释三十倍后OD620达到0.3～0.8，更优选为0.4～0.7，进一步优选为0.4～0.5。通过控制菌体含量，可以抑制十碳脂肪酸和十碳羟基脂肪酸的累积并促进癸烷转化。
本发明的制备方法中，发酵过程中的pH值控制为5.0～8.0，pH低于5.0时，发酵体系中容易大量累积十碳脂肪酸和十碳羟基脂肪酸，pH高于8.0时则癸二酸的合成效率较低。
本发明的制备方法中，所述发酵转化过程中相对溶氧维持在10％(v/v)以上，优选在10～70％，更优选在40～70％。相对溶氧可通过调节发酵转化过程中的搅拌转速和风量来控制，一般来说，风量可控制在0.1～0.8VVM，搅拌转速根据不同规模的生产量调整。
本发明的制备方法中，所述发酵转化过程中通过连续流加或者批次补加的方式控制发酵培养体系中癸烷的量大于等于1％(v/v)，发酵过程结束后控制所得发酵液中癸烷的量小于等于0.5％(v/v)。
本发明的制备方法中，其他发酵工艺参数如温度、压力等可选择常规条件，或由本领域技术人员根据其他工艺条件进行适应性调整，例如，本发明的发酵转化过程中，温度可以控制为28～32℃，发酵罐压控制可以为0.03～0.1Mpa。
本发明的制备方法中，所述发酵液的纯化过程依次包括以下步骤：
S1：通过膜过滤、板框过滤、离心分离中的一种或多种分离方式除杂得到癸二酸粗品；
S2：将所得的癸二酸粗品经过一次或多次结晶得到癸二酸晶体；以及
S3：将所得的癸二酸晶体洗涤、干燥后即得所述癸二酸。
步骤S1主要用于将发酵液中的菌体、残烃以及影响下游聚合的代谢杂质去除，提取出癸二酸粗品，经步骤S1后可除去过半量的十碳脂肪酸及十碳羟基脂肪酸杂质。其中的膜过滤为优选的分离方式，可选用常见的微滤膜、超滤膜等等，一般操作温度可以在50～80℃，进膜和出膜压力可根据癸二酸粗品情况调整。离心分离的一般操作温度可以在70～80℃，离心转速根据处理规模可以为2000-4000转/分钟。
步骤S2主要是通过结晶的方式对所得的癸二酸粗品进行精制，以进一步降低十碳脂肪酸及十碳羟基脂肪酸杂质的含量。结晶方式可包括水结晶和/或溶剂结晶。溶剂结晶采用的溶剂可以为乙醇、乙酸、乙酸乙酯、乙酸丁酯中的一种或多种。
水结晶过程一般可以为：将癸二酸粗品和一定量的水进行混合，癸二酸含量5～10％(w/v)，将该混合液的温度逐步升高到95～110℃，然后冷却到25～30℃析晶，通过离心或者板框过滤的方式得到晶体。
更进一步地，溶剂结晶采用的溶剂为乙酸，待结晶癸二酸粗品和所述乙酸的质量比可以为1:2～4，优选为1:2.5～3.5，结晶过程为将溶解癸二酸粗品的乙酸溶液升温到90～95℃，然后再降温到20～30℃进行析晶。所得的癸二酸晶体控制乙酸含量低于500ppm，更优选低于300ppm。
步骤S3主要是对精制的癸二酸晶体进行洗涤、干燥处理得到最终的产品。
本发明还提供了一种微生物发酵法生产的癸二酸，其中的十碳脂肪酸杂质含量低于200ppm，优选低于50ppm，十碳羟基脂肪酸杂质含量低于300ppm，优选低于100ppm，乙酸杂质含量低于500ppm，更优选低于300ppm；和/或
热稳定性大于90％，优选大于等于95％，更优选大于等于97％。
本发明还提供了一种包含以上技术方案任一项所述的癸二酸作为聚合单体的聚合物。
所述聚合物可以为现有任意种类包含癸二酸作为聚合单体的聚合物或改性聚合物，不限于分子量、聚合方式等。优选的聚合物为聚酰胺或聚酯。更优选的聚合物为聚酰胺，由所述癸二酸与C5～C12脂肪胺聚合所得的聚酰胺；所述脂肪胺包括但不限于戊二胺、己二胺、癸二胺等。
本发明提供的癸二酸通过微生物发酵法制得，通过微生物发酵过程以及分离纯化过程的处理，可得到纯度更高、杂质含量更低、热稳定性更好的癸二酸产品，尤其是生物法制癸二酸中常见的十碳脂肪酸和十碳羟基脂肪酸杂质。高纯度、低杂质含量的癸二酸产品可满足高档聚酰胺、聚酯等产品的质量要求，所得的聚合物产品性能更加优异。而且，本发明提供的癸二酸制备方法条件温和、环境友好、产品转化率高且品质好，可以替代化学法用于癸二酸产品的工业化规模生产。
具体实施方式
下面通过实施例，对本发明的技术方案进一步具体的说明。
实施例1
将热带假丝酵母CAT N145，保藏号为CCTCC M2011192接种于种子培养基，30℃下进行培养，当种子生长至对数生长期，将种子液接入发酵培养基，进行发酵，接种量10％(v/v)。发酵温度30℃，发酵过程中pH值控制为5.0～8.0，风量控制为0.5VVM，发酵罐压控制为0.05MPa，发酵过程中相对溶氧维持在30％。
种子接入发酵罐后，菌体开始生长繁殖，当菌体浓度OD620(稀释30倍)达到0.5以上，开始加入癸烷进行转化。发酵过程中控制发酵液中癸烷的量大于等于1％(v/v)，发酵结束前24h，停止补加癸烷，将发酵液中的残留的癸烷进一步转化完后，停止发酵。发酵结束，取发酵液采用气相色谱法分析10碳脂肪酸、10碳羟基酸含量。
种子培养基：
蔗糖20g/L、玉米浆10g/L、酵母膏3g/L、磷酸二氢钾6g/L以及尿素3g/L。
发酵培养基：
硫酸铵、硝酸钾、磷酸二氢钾浓度如表1的所示，其他培养基组成为：葡萄糖50g/L、玉米浆3g/L以及酵母膏1g/L。
表1
Figure BDA0001368612020000061
由表1可知，发酵培养基中不同的硫酸铵、硝酸钾及磷酸二氢钾含量可以调控烷烃转化期的菌体浓度，从而控制微生物转化底物生成癸二酸和其他代谢副产物的生成速率，特别是控制十碳脂肪酸和十碳羟基脂肪酸的生成速率。
控制起始培养基葡萄糖含量，其他发酵培养基同1#方案，进行发酵，结果如表2所示。
表2
Figure BDA0001368612020000071
由表2可知，发酵培养基中的葡萄糖含量也影响代谢副产物的生成速率，特别是控制十碳羟基脂肪酸的生成速率，发酵培养基中的葡萄糖含量为25-40g/L时，发酵液中十碳羟基脂肪酸的含量可控制在较低的水平。
实施例2
采用发酵培养基为：葡萄糖50g/L、玉米浆3g/L、酵母膏1g/L、硫酸铵3.2g/L、硝酸钾3.4g/L以及磷酸二氢钾5g/L。
通过调节搅拌和风量，控制转化过程中的相对溶氧，不同的相对溶氧对发酵液中的十碳羟基脂肪酸和十碳脂肪酸的含量有影响，其余步骤与条件参数同实施例1。结果如表3所示。
表3
Figure BDA0001368612020000072
由表3可知，发酵转化过程中的相对溶氧控制在90％以下可使十碳羟基脂肪酸和十碳脂肪酸的含量控制在较低的水平，优选地，相对溶氧控制在10-70％，更优选控制在40-70％。
实施例3
将实施例1的表1中的2#癸二酸发酵液和4#癸二酸发酵液分别进行膜过滤处理。将发酵液的pH调节到9.0～11.0，加热到70～80℃，用孔径0.05μm微滤膜进行过滤，物料泵控制进膜压力约为0.15～0.2MPa，出膜压力为0.1MPa左右。经过膜过滤可以有效地截留十碳脂肪酸和大部分羟基酸，结果如表4所示。
表4
Figure BDA0001368612020000081
实施例4
将实施例1的表1中的2#癸二酸发酵液和4#癸二酸发酵液分别加热到70～80℃，然后进行离心分离以去除十碳脂肪酸和十碳羟基脂肪酸，离心转速为3000转/分钟，离心分离可以有效地将十碳脂肪酸和部分羟基酸分离除去，结果如表5所示：
表5
Figure BDA0001368612020000082
实施例5
将实施例4经过离心的4#、2#发酵液分别加10-15倍的去离子水，逐步加热到100～105℃，然后逐步降温，控制养晶过程，得到癸二酸水结晶的晶体，将该晶体通过板框过滤、干燥得到对应的癸二酸产品，产品中十碳脂肪酸和羟基酸的含量如表6所示。
表6
Figure BDA0001368612020000091
实施例6
将实施例5水相结晶得到的癸二酸产品分别标记为4#-水、2#-水，分别加入乙酸进行溶剂结晶，癸二酸产品和乙酸的比例控制在1:2-4，将上述物料升温加热到80～100℃，然后逐步降温到20～35℃，控制养晶时间，析出晶体后进行固液分离，并对得到的晶体分别进行溶剂洗剂、水洗剂，干燥得到产品。杂质含量如表7所示。
表7
Figure BDA0001368612020000092
用乙酸乙酯替换乙酸按照上述步骤进行结晶处理，所得癸二酸产品如表8所示。
表8
Figure BDA0001368612020000101
实施例7
将不同批次经过溶剂结晶的癸二酸产品使用实施例6的乙酸结晶操作，可进一步降低产品中的杂质含量，提高产品质量。实验数据如表9所示。
表9
Figure BDA0001368612020000102
实验例
按照以下步骤，分别用常规化学法制得的癸二酸市售产品和本发明的癸二酸产品来制备PA610。产品指标和制备的对应PA610的指标分别如下表所示。
PA610制备过程如下：
(1)将100升聚合釜用氮气置换空气，向反应釜中加入20kg纯水，然后加入11kg己二胺，搅拌后，加入19kg癸二酸，用少量己二胺和癸二酸将pH值调节至8.2(盐溶液稀释至10％w/w检测结果)，制得聚酰胺盐水溶液。
(2)氮气环境下，油浴温度逐步升至280℃，待聚合釜内压力升至1.73Mpa，开始排气，釜内温度达到245℃时，加入含90g TiO2的焦磷酸钠水溶液，待釜内温度达到270℃时，抽真空至-0.08Mpa，保持该真空度20min，制得尼龙610。
(3)向聚合釜内充入氮气至压力0.6Mpa，开始熔融出料，并利用切粒机造粒。110℃干燥真空干燥24小时后塑封包装。
表10癸二酸产品指标对比
Figure BDA0001368612020000111
表11PA610指标对比
Figure BDA0001368612020000112
由表10、表11结果可知，本发明的癸二酸产品相对于常规化学法生产的癸二酸产品具有更好的产品性能，尤其是在杂质含量、热稳定性方面，使得其在后续制备聚合物时可进一步提高聚合物产品的质量和性能。本发明的癸二酸产品和制备方法使得生物法制备的癸二酸具有更好的应用潜力，为工业上替代化学法癸二酸产品提供了可能。
除非特别限定，本发明所用术语均为本领域技术人员通常理解的含义。
本发明所描述的实施方式仅出于示例性目的，并非用以限制本发明的保护范围，本领域技术人员可在本发明的范围内作出各种其他替换、改变和改进，因而，本发明不限于上述实施方式，而仅由权利要求限定。

Claims (17)

1.一种癸二酸的制备方法，其特征在于，首先将热带假丝酵母(Candida tropicalis)进行种子培养，然后将所得种子接入发酵培养基，并加入癸烷开始发酵转化得到发酵液，最后将所述发酵液纯化即得；
其中，所述发酵培养基包括以下成分：葡萄糖25～40g/L、硝酸钾1.2～2.5g/L、玉米浆2～5g/L、酵母膏1～3g/L、磷酸二氢钾1.8～3.5g/L以及硫酸铵1.2～2g/L；
所述发酵转化过程中相对溶氧维持在10～70％。
2.根据权利要求1所述的癸二酸的制备方法，其特征在于，将种子培养所得种子接入发酵培养基后培养菌体，当菌体稀释三十倍后OD620达到0.5以上时加入癸烷开始发酵转化，在发酵转化过程中，控制菌体稀释三十倍后OD620为0.3～0.8。
3.根据权利要求2所述的癸二酸的制备方法，其特征在于，在发酵转化过程中，控制菌体稀释三十倍后OD620为0.4～0.7。
4.根据权利要求2所述的癸二酸的制备方法，其特征在于，在发酵转化过程中，控制菌体稀释三十倍后OD620为0.4～0.5。
5.根据权利要求1所述的癸二酸的制备方法，其特征在于，所述发酵转化过程中相对溶氧维持在40～70％。
6.根据权利要求1所述的癸二酸的制备方法，其特征在于，所述发酵转化过程中pH值控制为5.0～8.0。
7.根据权利要求1所述的癸二酸的制备方法，其特征在于，所述发酵转化过程中通过连续流加或者批次补加的方式控制发酵体系中癸烷的量大于等于1％(v/v)，发酵过程结束后控制所得发酵液中癸烷的量小于等于0.5％(v/v)。
8.根据权利要求1所述的癸二酸的制备方法，其特征在于，所述热带假丝酵母(Candida tropicalis)为热带假丝酵母CAT N145。
9.根据权利要求1-8任一项所述的癸二酸的制备方法，其特征在于，所述发酵液的纯化过程依次包括以下步骤：
S1：通过膜过滤、板框过滤、离心分离中的一种或多种分离方式除杂得到癸二酸粗品；
S2：将所得的癸二酸粗品经过一次或多次结晶得到癸二酸晶体；以及
S3：将所得的癸二酸晶体洗涤、干燥后即得所述癸二酸。
10.根据权利要求9所述的癸二酸的制备方法，其特征在于，步骤S2所述的结晶包括水结晶和/或溶剂结晶。
11.根据权利要求10所述的癸二酸的制备方法，其特征在于，所述溶剂结晶采用的溶剂为乙醇、乙酸、乙酸乙酯、乙酸丁酯中的一种或多种。
12.根据权利要求11所述的癸二酸的制备方法，其特征在于，所述溶剂结晶采用的溶剂为乙酸，并控制所得的癸二酸晶体中乙酸含量低于500ppm。
13.根据权利要求12所述的癸二酸的制备方法，其特征在于，控制所得的癸二酸晶体中乙酸含量低于300ppm。
14.根据权利要求12所述的癸二酸的制备方法，其特征在于，所述癸二酸的热稳定性大于等于95％。
15.根据权利要求12所述的癸二酸的制备方法，其特征在于，所述癸二酸的热稳定性大于等于97％。
16.根据权利要求9所述的癸二酸的制备方法，其特征在于，所述癸二酸中的十碳脂肪酸杂质含量低于200ppm，以及十碳羟基脂肪酸杂质含量低于300ppm。
17.根据权利要求16所述的癸二酸的制备方法，其特征在于，所述癸二酸中的所述十碳脂肪酸杂质含量低于50ppm，以及所述十碳羟基脂肪酸杂质含量低于100ppm。
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