CN111378696B

CN111378696B - 一种发酵底物及其发酵生产长链二元酸的方法

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Publication number: CN111378696B
Application number: CN201811639567.8A
Authority: CN
Inventors: 徐敏; 郝英利; 杨晨; 刘修才
Original assignee: Kaisai Taiyuan Biotechnology Co ltd; Cathay R&D Center Co Ltd; CIBT America Inc
Current assignee: Kaisai Taiyuan Biotechnology Co ltd; Cathay R&D Center Co Ltd; CIBT America Inc
Priority date: 2018-12-29
Filing date: 2018-12-29
Publication date: 2022-06-28
Anticipated expiration: 2038-12-29
Also published as: CN111378696A

Abstract

本发明涉及一种发酵生产长链二元酸的发酵底物及利用该发酵底物发酵生产长链二元酸的方法，所述发酵底物来源于煤间接液化反应获得的碳数分布在C2‑C23的烷烃类产物。本发明提供的方法有效地利用了煤炭资源，使煤间接液化技术及费托反应获得的产物可以用于发酵生产长链二元酸，并获得较高纯度的长链二元酸产品，使其满足聚合反应的条件，并获得高质量聚合产品。

Description

一种发酵底物及其发酵生产长链二元酸的方法

技术领域

本发明涉及生物技术和生物发酵领域，具体涉及一种发酵生产长链二元酸的发酵底物及其方法，而且其使用的烷烃底物来源于煤间接液化反应。

背景技术

长链二元酸(LCDA)有着非常广泛的用途，以长链二元酸为原料可以合成特种尼龙、高级香料、高档热熔胶、耐寒增塑剂、高级润滑油、高级防锈剂、高级油漆和涂料等。长链二元酸通常可以用化学法或生物法来合成。化学法合成路线长，反应需要高温高压，对催化剂要求比较苛刻，因此在工业规模上的长链二元酸品种较少，只有十二碳长链二元酸等少数品种。而生物法是以烷烃、直链饱和脂肪酸和直链饱和脂肪酸衍生物等为底物，通过微生物转化得到，其生产过程常温、常压，可以规模化生产如从C9到C18等多种长链二元酸。

常规的烷烃或脂肪酸来源石化和油脂行业，而中国具有富煤、贫油、少气的先天性能源结构特点。煤炭在我国的一次能源生产中占70％，占一次能源总消耗的60％。而煤间接液化技术已非常成熟，费托合成(Fischer-Tropsch synthesis)是煤间接液化技术之一，它以煤气化生成的合成气(CO和H₂)为原料在催化剂和适当反应条件下合成以石蜡烃为主的液体燃料的工艺过程。费托反应生成的产物十分复杂，有烷烃、烯烃、环烷、芳烃等，其烃类的碳原子数分布很广，以蜡为主的烃类产物还需经加氢裂解和加氢异构改质为汽油等液态产品。

在化工领域，聚合是难度较高的工艺，对操作条件要求严格，特别是对原料的纯度要求非常苛刻。这是因为聚合过程是游离基链不断增长的过程，对于能够产生游离基的杂质，特别是含氧、含硫和含氮的有机化合物，必须严格控制其含量。否则一旦杂质含量偏高，产生新的游离基会阻断聚合链，就会产生低分子化合物，使聚合物的分子量达不到预期要求，进而影响聚合物性能。因此，作为聚合物的原料，纯度要求极高，杂质越少越好。虽然煤间接液化技术或费托反应获得的中间油品经过分离纯化等工艺可以获得烷烃类产物，但是因为反应条件、原料等多种因素而使煤制的烷烃类产物含有较多复杂组分，作为发酵生产长链二元酸的底物可能会对发酵过程产生抑制，复杂组分杂质还会使长链二元酸提取纯化工艺变得复杂，大大影响下游聚合反应的性能。

因此，为了有效利用煤炭资源，使煤间接液化技术及费托反应获得的产物可以用于发酵生产长链二元酸，并获得较高纯度和少量杂质的长链二元酸产品，使其满足聚合反应的条件，获得高质量聚合产品，相关发酵工艺需要进一步的探索和研究。

发明内容

为解决现有技术中存在的技术问题，本发明的目的在于提供一种发酵生产长链二元酸的发酵底物及其发酵方法。本发明方法有效利用了煤间接液化技术的产物，并可以工业化放大生产长链二元酸。

本发明提供了一种发酵生产长链二元酸的发酵底物，所述发酵底物来源于煤间接液化反应获得的碳数分布在C2-C23的烷烃类产物。

优选地，所述烷烃类产物为经过分馏塔和/或分子筛处理获得的含有正构烷烃的烷烃类产物；

优选地，所述烷烃类产物含有75.0-99.9％的正构烷烃；

优选地，所述烷烃类产物含有90.0-99.9％的正构烷烃。

优选地，所述正构烷烃的碳链长度为C9-C18，优选地，所述正构烷烃是Cn链长的正构烷烃，其中n＝9-18，即碳链长度为C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18中的一种或多种的正构烷烃。

优选的，所述正构烷烃包含十碳正构烷烃、十一碳正构烷烃、十二碳正构烷烃、十三碳正构烷烃、十四碳正构烷烃、十五碳正构烷烃、十六碳正构烷烃、十七碳正构烷烃、或十八碳正构烷烃中的任意一种或几种。

本发明还提供了一种利用上述任意一项发酵底物发酵生产长链二元酸的方法，其特征在于，所述方法使用的菌株包括热带假丝酵母(Candida tropicalis)菌株或清酒假丝酵母(Candida sake)菌株；

优选地，发酵使用的菌株为热带假丝酵母(Candida tropicalis)菌株Mu8618，其保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC M 2018735。

优选地，发酵培养时控制发酵液中正构烷烃的浓度为0.5％～17％；

优选地，控制发酵的温度为28～32℃，风量为0.3～0.7vvm，压力为0.05～0.14MPa，菌体转化期的pH为5.0～8.0。

优选地，所述长链二元酸为C9-C18的直链饱和二元酸中的一种或多种。

优选地，本发明中，所述的长链二元酸为C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18的直链饱和二元酸中的一种或多种，包括十碳二元酸(DC10)、十一碳二元酸(DC11)、十二碳二元酸(DC12)、十三碳二元酸(DC13)、十四碳二元酸(DC14)、十五碳二元酸(DC15)、十六碳二元酸(DC16)、十七碳二元酸(DC17)、十八碳二元酸(DC18)中的至少一种。

优选地，所述方法还包括提取长链二元酸的步骤，其包括：酸化处理发酵液或发酵处理液，分离，收集长链二元酸；

优选地，先向发酵液或发酵处理液加碱调节pH至7以上，离心和/或膜过滤的方式分离发酵液或发酵处理液中包含菌体、残烃、杂烃的杂质，再酸化处理剩余发酵液或发酵处理液，固液分离，收集长链二元酸；

优选地，直接酸化处理发酵液或发酵处理液，分离长链二元酸和包含菌体、残烃、杂烃的杂质，收集长链二元酸；

优选地，所述方法还包括使用活性炭对发酵液或发酵处理液进行脱色；

优选地，所述方法还包括使用有机溶剂进一步纯化收集到的长链二元酸，其中所述有机溶剂包括醇、酸、酮和酯的一种或多种。

优选地，收集长链二元酸后，再对剩余的发酵液或发酵处理液进行离心和/或膜过滤以分离其中剩余残烃、杂烃。

本发明还提供了一种长链二元酸，所述长链二元酸由上述任意一项发酵底物制备获得。

本发明还提供了一种长链二元酸，所述长链二元酸由上述任意一项发酵生产长链二元酸的方法制备获得。

现有技术中通过煤间接液化反应、费托合成获得的烷烃产物，除了含有正构烷烃以外，还会有少量的异构烷烃，以及烯烃、醇类和其它含氧烃等副产物生成，直接作为发酵生产长链二元酸的发酵底物难以获得满足聚合反应对长链二元酸作为原料的纯度和杂质的要求。而本发明提供的发酵方法可以以来源于煤间接液化反应获得的烷烃类产物作为发酵底物进行生物发酵，并且通过对发酵液进行进一步的提取、纯化，可以获得高纯度的长链二元酸产品，使其满足聚合反应的需求，扩大了发酵生产长链二元酸的原料可用范围，显著降低长链二元酸的成本并提高煤炭资源的利用率。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

以下实施例中如无特殊说明，使用的培养基的配制方法为常规方法，于121℃灭菌20分钟。

按照发酵领域常识，本发明中所述发酵培养基的百分比为质量体积比，即：w/v；％表示g/100mL。本发明所述的OD值为菌体光密度。

本发明所述的煤间接液化反应可以使用本领域常用的方法，例如先使煤炭在高温下与氧气和水蒸气反应，使煤炭全部气化、转化成合成气，所述合成气即一氧化碳和氢气的混合物，然后再在催化剂的作用下通过费托(Fischer-Tropsch)合成反应获得烷烃等烃类产物。常用的催化剂有钴剂或铁剂催化剂，铁剂分沉淀铁和熔融铁催化剂二种。

所述费托合成反应包括一系列的生成多种烃类的化学反应，其中主要的生产烷烃的反应方程式如下所示，其中烷烃用通式C_nH_2n+2表示：

(2n+1)H₂+nCO→C_nH_(2n+2)+nH₂O，其中的n＝2-23。

生成的烷烃大多数倾向于成直链烷烃，以及少量带支链的异构烷烃，除了烷烃以外，还会有少量的烯烃、醇类和其它含氧烃作为副产物生成。

在本发明一些具体的实施方式中，所述发酵底物来源于煤间接液化反应获得的碳数分布在C2-C23的烷烃类产物或称为煤制烷烃，优选为经过分馏塔和/或分子筛的分离处理获得含有正构烷烃的烷烃类产物。

在本发明一些具体的实施方式中，所述分馏塔可以使用本领域常用的分馏塔，分馏塔可以根据需要设置不同条件以分离出不同碳链长度的烷烃。

在本发明一些具体的实施方式中，所述分子筛优选为5A分子筛，分子式是3/4CaO·1/4Na₂O·Al₂O₃·2SiO₂·9/2H₂O。利用5A分子筛吸附原料中的正构烷烃，从而使正构烷烃与非正构烷烃得到分离。正构烷烃被5A分子筛吸附后，再采用由60％正戊烷和40％异辛烷组成的脱附剂，将其从分子筛的孔穴中脱附出来，接着用分馏的方法将脱附剂和抽出物(即主要成分为正构烷烃的抽出物)及异构烷烃分离。

在本发明一些具体的实施方式中，所述正构烷烃是Cn链长的正构烷烃，其中n＝9-18，即碳链长度为C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18中的一种或多种的正构烷烃。

在本发明一些具体的实施方式中，所述含有正构烷烃的烷烃类产物含有75.0％-99.9％碳链长度为C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18中的任意一种或几种的正构烷烃。

在本发明一些具体的实施方式中，所述烷烃类产物含有75.0％-99.9％碳链长度为C11、C12、C13或DC16等正构烷烃。优选地，所述烷烃类产物含有90.0-99.9％的正构烷烃。所述任意一种的正构烷烃的含量还可以是79.0％-83.0％，88.0％-94.0％或98.0％-99.0％。

在本发明一些具体的实施方式中，所述长链二元酸为选自壬二酸、癸二酸、十一碳二元酸、十二碳二元酸、十三碳二元酸、十四碳二元酸、十五碳二元酸、十六碳二元酸、十七碳二元酸、十八碳二元酸中的任意一种或几种。

在本发明一些具体的实施方式中，发酵生产长链二元酸时使用的热带假丝酵母(Candida tropicalis)菌株为菌株Mu8618，所述热带假丝酵母(Candida tropicalis)菌株Mu8618已于2018年11月1日进行生物保藏，保藏单位：中国典型培养物保藏中心(地址：中国.武汉.武汉大学)，保藏编号：CCTCC M 2018735。

本发明提供了一种长链二元酸的生产方法，优选地，包括发酵热带假丝酵母(Candida tropicalis)Mu8618或其菌剂，得到长链二元酸的步骤；

优选的，所述发酵方法包括如下步骤：

(1)菌种活化培养：将所述的热带假丝酵母(Candida tropicalis)Mu8618接种于活化培养基，进行活化培养；

(2)种子培养：将活化的菌种接种于种子培养基中，培养至种子成熟；

(3)发酵培养：将获得的种子培养液接种于含有发酵底物的发酵培养基中，或者，接种于发酵培养基中，再加入发酵底物，进行长链二元酸的发酵生产；

其中，所述发酵底物为来源于煤间接液化技术获得的含有正构烷烃的烷烃类产物。

本发明的一个优选的技术方案，所述菌株在种子阶段培养至菌体光密度(OD₆₂₀)为0.5以上(稀释30倍)时，可以视为成熟，再加入发酵底物进行发酵转化。当发酵转化过程于发酵培养基中进行时，可直接向培养基中加入发酵底物，也可以在后续发酵过程中补加发酵底物。

本发明的一个优选的技术方案，所述发酵的温度为28～32℃。

本发明的一个优选的技术方案，所述发酵的风量为0.3～0.7vvm。

本发明的一个优选的技术方案，所述发酵的压力为0.05～0.14MPa。优选的，当使用发酵罐发酵时可以通过控制罐压(表压)实现。

本发明的一个优选的技术方案，所述发酵的转化期的溶氧不低于15％，优选不低于10％。

本发明的一个优选的技术方案，所述发酵包括菌体生长期和转化期，所述菌体生长期发酵体系的pH值不低于3.0，优选为3.5～6.8。所述转化期也可称为产酸期，优选控制所述转化期发酵体系的pH值为5～8。

具体地，所述菌种活化培养工艺可以为：取热带假丝酵母(Candida tropicalis)Mu8618的甘油管菌种接种于装有活化培养基的种子瓶中，pH自然，28～32℃下，200～250rpm摇床培养1～2天。菌种活化时活化培养基可以包含如下成分：葡萄糖0.5％-3％，酵母膏0.2％～2％，蛋白胨0.2％-3％

具体地，所述种子培养培养工艺可以为：取摇瓶种子接入装有种子培养基的种子罐中，接种量为10％～30％(v/v，相对种子培养的起始体积)，接种后发酵体系的起始pH值为6.0～6.8，28～32℃下，通风量0.3～0.7vvm，罐压0.05～0.14MPa保持一定的搅拌速度以控制种子培养过程的溶氧不低于10％，培养至种子成熟时结束，培养成熟种子的标准为稀释30倍后OD₆₂₀≥0.5，OD₆₂₀可以是0.5～1.0，也可以是0.8。

本发明的生产方法使用的“种子培养基”是制备微生物种子所需要的培养基，微生物菌种接种于种子培养基，在一定的条件下进行培养，培养成熟后，可以作为进一步扩大培养、发酵所需要的种子。种子培养时所述种子培养基优选是一种水溶液培养基，可以包含如下成分：蔗糖1％～3％、玉米浆0.15％～1％、酵母膏0.2％～1.5％、KH₂PO₄ 0.4％～1.5％、尿素0.05％～0.5％。

本发明的一个优选的技术方案，所述发酵培养工艺为：将在种子罐培养所得的种子液接种到含有发酵培养基的发酵罐中，接种后起始体积为4～6L，接种量10％～30％(v/v，相对发酵起始体积)，发酵起始可以添加0～10％(v/v，相对发酵起始体积，下同)的含有正构烷烃的发酵底物，发酵过程控制温度28～32℃，通风量约为0.3～0.7vvm，罐压(表压力)为0.05～0.14MPa，保持一定的搅拌速度，控制溶氧不低于10％。控制发酵液的pH值，控制发酵起始pH约为5.0～6.8，随着微生物的生长，发酵液的pH逐步下降，控制pH不低于3.0，待菌体光密度(OD₆₂₀)大于0.5(稀释30倍)时，控制pH约为5～8，直至发酵结束。在发酵周期为10～20小时时开始批次加入发酵底物，控制发酵液中的正构烷烃浓度为0.5％～17％，总发酵周期约为100～180小时。可选地，发酵过程中通过补加糖水溶液控制发酵液糖浓度在0.1％～1％(w/v)。

本发明一些具体的实施方式中，所述发酵培养基可以包括：碳源、氮源、无机盐和营养盐等。

其中，所述碳源优选包括：葡萄糖、蔗糖和麦芽糖中的一种或多种；所述碳源的添加量优选1％～10％(w/v)。

其中，所述氮源优选包括：蛋白胨、酵母膏、玉米浆、硫酸铵、尿素和硝酸钾中的一种或多种；所述氮源的总添加量优选0.1％～3％(w/v)。

其中，所述无机盐优选包括：磷酸二氢钾、氯化钾、硫酸镁、氯化钙、氯化铁、硫酸铜中的一种或多种；所述无机盐的总添加量优选0.1％～1.5％(w/v)。

其中，所述营养因子优选包括：维生素B1、维生素B2，维生素C、生物素中的一种或多种；所述营养因子的总添加量优选0～1％(w/v)。

本发明的一个优选的技术方案，所述发酵培养基包括以下成分：葡萄糖1％～5％(w/v)、玉米浆0.1％～0.9％(w/v)、酵母膏0.1％～0.5％(w/v)、硝酸钾0.05％～1.2％(w/v)、磷酸二氢钾0.05％～1.0％(w/v)、尿素0.05％～0.3％(w/v)以及氯化钠0.05％～0.2％(w/v)。所述发酵培养基可以适用于从几十毫升的摇瓶到几百吨发酵罐规模的发酵生产。其可用水配制，在121℃下灭菌20min，冷却到合适温度，作为发酵培养使用。

本发明的一个优选的技术方案，所述发酵的菌株Mu8618的接种量为10％～30％。在本发明的一些优选实施方式中，菌株的接种量可以为10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、22％、24％、25％、27％、29％。

本发明所述的发酵底物中正构烷烃的百分比是体积百分比。

在本发明的一个优选实施方式中，当发酵生产长链二元酸时，控制发酵底物的浓度为0.5％～17％，优选为0.5％～15％，进而优选为0.5％～13％。优选将发酵底物浓度的范围控制在0.5～6％、2～8％、1％～7％、3％～9％、4％～10％、5％～11％、6％～12％或7％～13％中的任意一个范围内，或这些范围的端点值任意组合构成的其他浓度范围内，如3％和10％端点值构成的3％～10％的浓度范围，或，1％和8％端点值构成的1％～8％的浓度范围。所述底物浓度指发酵底物在发酵液中的体积浓度。控制底物浓度指控制发酵底物在整个发酵过程中发酵液中的体积浓度。所述底物的浓度可以通过发酵过程中发酵底物的添加速度进行控制并通过气质联用进行检测。

在本发明的一个优选实施方式中，当发酵生产长链二元酸时，控制发酵底物的浓度为2％～8％。

在本发明一些具体的实施方式中，对发酵结束后获得的发酵液进行提取以获得长链二元酸成品，将发酵液以及发酵液中的杂质与长链二元酸分离，所述杂质包括但不限于菌体、大蛋白、残余烷烃、发酵底物中无法参与发酵的烃类杂质等杂质。

在本发明一些具体的实施方式中，所述提取长链二元酸的步骤，其包括：酸化处理发酵液或发酵处理液，分离，收集长链二元酸。

优选地，先向发酵液或发酵处理液加碱调节pH至7以上，获得含有长链二元酸盐的碱溶液或称为发酵处理液，再离心和/或膜过滤的方式分离发酵液或发酵处理液中包含菌体、残烃、杂烃的杂质，再酸化处理剩余发酵液或发酵处理液，固液分离，收集长链二元酸。所述离心可以使用常用的固液分离离心设备。

在本发明一些具体的实施方式中，使用离心设备对含有长链二元酸盐的碱溶液进行离心处理，优选地，离心后再膜过滤，即使用过滤膜继续分离包含菌体等的杂质。或者，直接膜过滤，即使用过滤膜处理含有长链二元酸盐的碱溶液，将残余菌体、大蛋白等杂质与液体分离。

优选地，膜过滤时使用的过滤膜优选陶瓷膜、中空纤维膜或板式膜；进而优选模芯孔径为0.05-0.2微米的陶瓷膜或分子量在5-10万的中空纤维膜。优选地，膜过滤时可以先调节发酵液中长链二元酸的浓度为5-20wt％。优选地，所述膜过滤时的温度为25-60℃；膜前压力为0.2-0.4MPa。

在本发明一些具体的实施方式中，直接酸化处理发酵液或发酵处理液，分离长链二元酸和包含菌体、残烃、杂烃的杂质，收集长链二元酸。

所述发酵处理液可以是对发酵液进行碱化、脱色、固液分离等步骤处理后获得的混合溶液。所述发酵处理液可以包括菌体，也可以不包括菌体。

所述酸化即对发酵液或发酵处理液进行酸化处理，使用酸调节发酵液或发酵处理液pH值为2-6.5，酸化时优选使用无机酸，如硫酸、盐酸、硝酸、或其混合酸。

当发酵底物含有不能参加发酵反应的烃类杂质时，这些烃类杂质(或称为杂烃)与可能存在的未反应完全的烷烃残留在发酵液中，在提取长链二元酸的时候优选对发酵液或发酵处理液进行进一步分离杂烃处理。尤其是当作为发酵底物的烷烃类产物含有的正构烷烃含量低于90％时，优选对发酵液或发酵处理液进行进一步的分离杂烃处理，减少含有较多杂烃的液体直接进入后续废液系统，避免加剧废液处理压力。分离出来的杂烃或残烃可以废物利用。

在本发明一些具体的实施方式中，所述方法还包括去除发酵液或发酵处理液中残烃或杂烃的步骤，其包括对发酵液或发酵处理液进行碱化处理，调节pH至7以上，优选pH为8-11，再使用离心和/或膜过滤的方式分离残烃与发酵液或发酵处理液。

碱化处理调节pH时可以使用氢氧化钠、氨水或氢氧化钾。

在本发明一些具体的实施方式中，直接酸化处理发酵液或发酵处理液时，包括调节发酵结束后发酵液的pH值为2-6.5，分离长链二元酸和包含菌体、残烃、杂烃的杂质，收集长链二元酸。分离得长链二元酸后可以将长链二元酸溶解在有机溶剂中进行进一步纯化，再分离得清液，将清液结晶，获得长链二元酸产品。

优选地，所述提取的步骤还包括对含有长链二元酸盐的发酵液或发酵处理液进行脱色，向发酵液或发酵处理液中加入活性炭进行脱色处理，脱色处理后再过滤除去活性炭，脱色步骤可以进一步脱除长链二元酸溶液中的杂质。优选地，活性炭的加量为0.1-10wt％(相对于溶液中含有的长链二元酸的量)。使用活性炭脱色时，脱色的温度为60～100℃，脱色的时间为15～165min。

优选地，对获得的长链二元酸沉淀进行进一步纯化处理，将长链二元酸沉淀溶于有机溶剂中，使长链二元酸结晶，再分离晶体，获得纯化后长链二元酸。所述有机溶剂包括醇、酸、酮和酯的一种或多种；其中，所述醇包括甲醇、乙醇、异丙醇、正丙醇、正丁醇中的一种或多种；所述酸包括乙酸或甲酸；所述酮包括丙酮；所述酯包括乙酸乙酯和/或乙酸丁酯。所述纯化时优选在70～100℃保温30-180分钟，再冷却结晶，固液分离。优选地，所述纯化的次数为一次以上。

在本发明一些具体的实施方式中，获得的长链二元酸产品可以与戊二胺、封端剂及其他添加剂，制备获得生物基长链聚酰胺。

在本发明一些具体的实施方式中，制备长碳链聚酰胺树脂的方法，包括如下步骤：1)在氮气或惰性气体保护下，将反应原料加入反应容器中，配制聚酰胺盐水溶液；2)将步骤1)所得聚酰胺盐水溶液转移至聚合釜中，进行缩聚反应。

本发明如下具体实施例中，使用HCl和NaOH调节pH值。

以下实施例对比例中采用气相色谱法测定发酵液中正构烷烃、二元酸的含量以及固体样品纯度，其中发酵液和固体样品需要经过常规气相色谱前处理。

具体色谱条件如下：

色谱柱：Supelco SPB-50 30m*0.53mm*0.5μm(货号54983)。

气相色谱仪(Shimadzu，GC-2014)。

方法：初温100℃，15℃/min升温至230℃，保持2min。载气为氢气，进样口温度280℃，FID温度280℃，进样量4μL。

下面通过实施例对本发明进行详细说明，以使本发明的特征和优点更清楚。但应该指出，实施例用于理解本发明的构思，本发明的范围并不仅仅局限于本文中所列出的实施例。

如下实施例和对比例中使用的培养基等如没有特殊说明，均按照如下方法制备获得：

1、活化培养基：葡萄糖2％，酵母膏<总氮含量6.5wt％，下同>1％，蛋白胨2％。

2、种子培养基：蔗糖2％，玉米浆<总氮含量2.5wt％，下同>0.2％，酵母膏0.2％，KH₂PO₄ 0.8％，尿素0.3％。

3、发酵培养基：葡萄糖3％、玉米浆0.2％、酵母膏0.6％、硝酸钾0.7％、磷酸二氢钾0.8％、尿素0.2％以及氯化钠0.1％。根据不同的二元酸产品添加不同的发酵底物。

4、种子液的制备：取热带假丝酵母(Candida tropicalis)Mu8618的甘油管菌种接种于装有80mL活化培养基的种子瓶中，pH自然，30℃下，转速230rpm的摇床培养2天。取摇瓶中的种子接入装有6L种子培养基的10L种子罐中，接种量为20％，接种后体系的起始pH值为6.2，保持发酵体系温度在30℃以下，通风量0.5vvm，罐压0.1MPa，培养20h，培养过程中pH自然下降至3。OD₆₂₀长至0.5以上即为成熟种子，待接发酵。

5、如下实施例和对比例中使用的发酵底物如果未做特殊说明，均为来源于煤间接液化反应获得的含有正构烷烃的烷烃类产物，其经过本领域常用的分馏塔分馏和5A分子筛的分离，获得了以Cn(n＝11,12,13,16)碳数正构烷烃为主的烷烃类产物。

实施例1

本实施例提供一种热带假丝酵母(Candida tropicalis)Mu8618发酵生产DC12的方法。使用的发酵底物为来源于煤间接液化反应获得的含有十二碳正构烷烃的产物，其中十二碳正构烷烃的含量为99％。

将热带假丝酵母(Candida tropicalis)Mu8618的种子液接种到含有发酵培养基的发酵罐中，接种后起始体积为6L，接种量10％(v/v，相对发酵起始体积)，发酵起始添加5％(v/v，相对发酵起始体积)的发酵底物，发酵过程控制温度29℃，通风量约为0.5vvm，罐压(表压)约为0.1MPa，保持一定的搅拌速度，控制溶氧不低于10％。控制发酵起始pH约为6.2，随着微生物的生长，发酵液的pH逐步下降，控制pH不低于3.0，待菌体光密度OD₆₂₀大于0.5时，控制pH为7.0，直至发酵结束；在发酵周期为16小时时开始批次加入发酵底物，控制发酵液中十二碳正构烷烃的浓度为2％～8％。总发酵周期约为150小时，发酵结束后，测量发酵液中的十二碳二元酸为154.0mg/g，十二碳二元酸转化率93.5％(转化率定义为生成的长链二元酸与加入的对应碳链长度的正构烷烃的质量百分比，下同)。

实施例2

本实施例提供一种热带假丝酵母(Candida tropicalis)Mu8618发酵生产DC12的方法。使用的发酵底物为来源于煤间接液化反应获得的含有十二碳正构烷烃的产物，其中十二碳正构烷烃的含量为98％。

发酵方法与实施例1相同，总发酵周期约为151小时，发酵结束后，测量发酵液中的十二碳二元酸153.3mg/g，十二碳二元酸质量转化率93.3％。

实施例3

本实施例提供一种热带假丝酵母(Candida tropicalis)Mu8618发酵生产DC12的方法。使用的发酵底物为来源于煤间接液化反应获得的含有十二碳正构烷烃的产物，其中十二碳正构烷烃的含量为94％。

发酵方法与实施例1相同，总发酵周期约为152小时，发酵结束后，测量发酵液中的十二碳二元酸150.2mg/g，十二碳二元酸质量转化率92.8％。

实施例4

本实施例提供一种热带假丝酵母(Candida tropicalis)Mu8618发酵生产DC12的方法。使用的发酵底物为来源于煤间接液化反应获得的含有十二碳正构烷烃的产物，其中十二碳正构烷烃的含量为88％。

发酵方法与实施例1相同，总发酵周期约为154小时，发酵结束后，测量发酵液中的十二碳二元酸144.5mg/g，十二碳二元酸质量转化率90.5％。

实施例5

本实施例提供一种热带假丝酵母(Candida tropicalis)Mu8618发酵生产DC12的方法。使用的发酵底物为来源于煤间接液化反应获得的含有十二碳正构烷烃的产物，其中十二碳正构烷烃的含量为83％。

发酵方法与实施例1相同，总发酵周期约为155小时，发酵结束后，测量发酵液中的十二碳二元酸134.0mg/g，十二碳二元酸质量转化率88.7％。

实施例6

本实施例提供一种热带假丝酵母(Candida tropicalis)Mu8618发酵生产DC12的方法。使用的发酵底物为来源于煤间接液化反应获得的含有十二碳正构烷烃的产物，其中十二碳正构烷烃的含量为79％。

发酵方法与实施例1相同，总发酵周期约为160小时，发酵结束后，测量发酵液中的十二碳二元酸121.4mg/g，十二碳二元酸质量转化率77.3％。

实施例7

本实施例提供一种热带假丝酵母(Candida tropicalis)Mu8618发酵生产DC11的方法。使用的发酵底物为来源于煤间接液化反应获得的含有十一碳正构烷烃的产物，其中十一碳正构烷烃的含量为98％。

将热带假丝酵母(Candida tropicalis)Mu8618的种子液接种到含有发酵培养基的发酵罐中，接种后起始体积为5L，接种量30％(v/v，相对发酵起始体积)，发酵过程控制温度29℃，通风量约为0.5vvm，罐压(表压)约为0.1MPa，保持一定的搅拌速度，控制溶氧不低于10％。发酵起始pH约为6.4，随着微生物的生长，发酵液的pH逐步下降，控制pH4.0待菌体光密度OD₆₂₀大于0.5时，控制pH为7.2，直至发酵结束；在发酵周期为16小时时开始批次加入发酵底物，控制发酵液中十一碳正构烷烃的浓度为2％～8％。总发酵周期约为140小时，发酵结束后，测量发酵液中的十一碳二元酸131.0mg/g，十一碳二元酸质量转化率85.6％。

实施例8

本实施例提供一种热带假丝酵母(Candida tropicalis)Mu8618发酵生产DC13的方法。使用的发酵底物为来源于煤间接液化反应获得的含有十三碳正构烷烃的产物，其中十三碳正构烷烃的含量为98％。

将热带假丝酵母(Candida tropicalis)Mu8618种子液接种到含有发酵培养基的发酵罐中，接种后起始体积为5L，接种量20％(v/v，相对发酵起始体积)，发酵起始添加3％(v/v，相对发酵起始体积)的发酵底物，发酵过程控制温度29℃，通风量约为0.5vvm，罐压(表压)约为0.1MPa，保持一定的搅拌速度，控制溶氧不低于10％。发酵起始pH约为6.3，随着微生物的生长，发酵液的pH逐步下降，控制pH为5.0，待菌体光密度OD₆₂₀大于0.5时，控制pH为7.5，直至发酵结束；在发酵周期为16小时开始批次加入发酵底物，控制发酵液中十三碳正构烷烃的浓度为2％～8％。总发酵周期约为160小时，发酵结束后，测量发酵液中的十三碳二元酸148.0mg/g，十三碳二元酸质量转化率89.5％。

实施例9

本实施例提供一种热带假丝酵母(Candida tropicalis)Mu8618发酵生产DC16的方法。使用的发酵底物为来源于煤间接液化反应获得的含有十六碳正构烷烃的产物，其中十六碳正构烷烃的含量为98％。

将热带假丝酵母(Candida tropicalis)Mu8618种子液接种到含有发酵培养基的发酵罐中，接种后起始体积为4L，接种量18％(v/v，相对发酵起始体积)，发酵起始添加2％(v/v，相对发酵起始体积)的发酵底物，发酵过程控制温度29℃，通风量约为0.5vvm，罐压(表压)约为0.1MPa，保持一定的搅拌速度，控制溶氧不低于10％。发酵起始pH约为6.5，随着微生物的生长，发酵液的pH逐步下降，控制pH5.0，待菌体光密度OD₆₂₀大于0.5时，控制pH为7.8，直至发酵结束；在发酵周期为16小时时开始批次加入发酵底物，控制发酵液中十六碳正构烷烃的浓度为2％～8％。总发酵周期约为155小时，发酵结束后，测量发酵液中的十六碳二元酸124.8mg/g，十六碳二元酸质量转化率63.2％。

实施例10

具体发酵步骤与实施例2相同，区别在于，在发酵周期为16小时时开始批次加入发酵底物，控制发酵液中十二碳正构烷烃的浓度为10％-15％。总发酵周期约为167小时，发酵结束后，测量发酵液中的十二碳二元酸为139.1mg/g，十二碳二元酸转化率87.2％。

实施例11

具体发酵步骤与实施例2相同，区别在于，在发酵周期为16小时时开始批次加入发酵底物，控制发酵液中十二碳正构烷烃的浓度为11％-17％。总发酵周期约为179小时，发酵结束后，测量发酵液中的十二碳二元酸为123.1mg/g，十二碳二元酸转化率76.4％。

实施例12

本实施例提供一种热带假丝酵母(Candida tropicalis)CCTCC NO:M2011192(保藏单位：中国典型培养物保藏中心[中国.武汉.武汉大学]，保藏编号：CCTCC M 2011192)发酵生产DC12的方法。使用的发酵底物和发酵方法与实施例7相同，总发酵周期约为185小时，发酵结束后，测量发酵液中的十二碳二元酸86.5mg/g，十二碳二元酸质量转化率65.3％。

对比例1

本实施例提供一种热带假丝酵母(Candida tropicalis)Mu8618发酵生产DC12的方法。使用的发酵底物为石油来源的烷烃，其以十二碳正构烷烃为主要成分，其中正构烷烃99％。

发酵方法与实施例1相同，发酵结束后，总发酵周期约为149小时，发酵结束后，测量发酵液中的十二碳二元酸153.8mg/g，十二碳二元酸质量转化率93.6％。

实施例13-21

将实施例1-3、4-6、10-11，对比例1获得的长链二元酸发酵液进行提取、纯化，步骤如下所示：

(1)先用质量浓度30％的氢氧化钠溶液调节发酵液的pH为8.0，加水调节至长链二元酸浓度为10wt％，加热到60℃，用0.1微米孔径的陶瓷膜对发酵液进行过滤，膜前压力设定0.3MPa，通过膜过滤方式分离菌体、大蛋白、残余烷烃、发酵底物中无法参与发酵的烃类杂质等杂质，收集膜清液。

(2)向收集的膜清液中加入5wt％的粉末活性炭于60℃脱色1h，再过滤得到澄清液体。

(3)再向所述澄清液体中加入硫酸，调pH至3.5，降至室温后过滤得到湿固体，用3倍于湿固体重量的纯净水洗涤滤饼，过滤后烘干，获得对应长链二元酸初级品。

洗涤后的溶液通过加入质量浓度30％的氢氧化钠溶液调节pH为9.0，使用离心设备分离其中的残余的烃类杂质等杂质，回收烃类杂质以做其他回收利用。

(4)取200g步骤(3)获得的长链二元酸初级品，加入1L乙酸乙酯，加热溶解，在70℃下保持2小时，缓慢降温至长链二元酸结晶，获得的一次结晶产品；再加入加入1L乙酸乙酯，加热溶解，在70℃下保持30分钟，缓慢降温至15℃使长链二元酸结晶，获得二次结晶产品。固液分离后使用水洗涤湿固体，烘干后即得长链二元酸成品，编号标记为13#(来源于实施例1)，14#(来源于实施例2)，15#(来源于实施例3)，16#(来源于实施例4)，17#(来源于实施例5)，18#(来源于实施例6)，19#(来源于实施例10)，20#(来源于实施例11)，21#(来源于对比例1)。

长链二元酸成品13#～21#的纯度如下表1所示：

表1

DC12样品编号	13#	14#	15#	16#	17#	18#	19#	20#	21#
										原始发酵液DC12含量(mg/g)	154.0	153.3	150.2	144.5	134.0	121.4	139.1	123.1	153.8
十二碳二元酸成品纯度(％)	99.8	99.8	99.7	99.6	99.6	99.5	99.7	99.5	99.8

将长链二元酸成品13#～21#作为原料按照如下方法制备聚酰胺512磨料丝：

1)将100升聚合釜(K/SY166-2007型)用氮气置换空气，向反应釜中加入25kg纯水，然后加入11.75kg(115.2mol)戊二胺[购自凯赛(金乡)生物材料有限公司]，搅拌后，加入26.47kg(115.2mol)十二碳二元酸成品13#～21#，用少量戊二胺和十二碳二元酸成品13#～21#将pH值调节至6.95(30℃盐溶液稀释至10％时的检测结果)，制得聚酰胺盐水溶液。

2)氮气环境下，油浴温度逐步升至290℃，待聚合釜内压力升至1.5MPa，开始排气，待釜内温度达到245℃时，使反应容器内压力逐步降至常压，釜内温度达272℃，抽真空至-0.07Mpa，保持该真空度36min，后充氮气至常压，继续搅拌30min，向聚合釜内充入氮气至压力0.4MPa，熔融出料，并利用切粒机造粒，将获得的聚酰胺512切片分别编号标记为：切片512-13#～切片512-21#；

3)将步骤2)获得的聚酰胺切片512-13#～切片512-21#80wt％与0.5wt％的DN-27磷酸酯偶联剂、0.5wt％的抗氧剂1076、19wt％的氧化锆陶瓷粉磨料(尺寸为240目)进行混合均匀，采用螺杆挤出机加热熔融，螺杆挤出机采用五区加热，一区温度为180℃，二区温度为220℃，三区温度为240℃，四区温度为250℃，五区温度为260℃。同时通过侧喂料螺杆加入磨料，得到混合熔体；将混合熔体通过计量泵准确计量，从喷丝孔挤出形成初生丝；对所述初生丝进行冷却处理、牵伸处理、热定型处理、卷绕处理，所述冷却处理为水浴冷却，且水浴冷却温度为30℃；牵伸处理中，牵伸倍数为4.5，牵伸温度为80℃；热定型处理中，热定型温度为170℃；卷绕处理中，卷绕速度为280m/min。最终得到聚酰胺512磨料丝，分别编号标记为磨料丝512-13#～磨料丝512-21#。

对磨料丝512-13#～磨料丝512-21#进行如下参数测定，测定结果见表2。

(1)直径：用手持测厚仪测磨料丝截面10个不同位置，取平均值，然后选取直径为0.8mm的磨料丝进行如下(2)和(3)的测试。

(2)断裂强力和初始模量：采用万能强力试验机，按GB/T21032-2007方法测定断裂强力；初始模量＝(1％断裂伸长率对应的断裂强力/线密度)×100％。

(3)耐磨性：采用往复式磨损试验机测定磨料丝的耐磨性，并根据下式计算强度保持率。强度保持率＝(磨损10000次后的断裂强度/磨损前的断裂强度)×100％。

表2

从表2可以看出，来源于煤间接液化反应获得的含有正构烷烃的烷烃类底物经过发酵、长链二元酸的提取、纯化，与戊二胺合成聚酰胺512，最终制备获得的聚酰胺512磨料丝可以获得与来源于石油的烷烃原料制备获得的聚酰胺512磨料丝相当的断裂强力、初始模量和强度保持率。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种发酵生产长链二元酸的方法，其特征在于，所述方法使用的菌株为热带假丝酵母(Candida tropicalis)菌株Mu8618，其保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC M 2018735；

所述发酵生产长链二元酸的方法利用煤间接液化反应获得的碳数分布在C9-C18的烷烃类产物作为发酵底物；

所述烷烃类产物为经过分馏塔和/或分子筛处理获得的含有正构烷烃的烷烃类产物；

所述烷烃类产物含有75.0-99.9％的正构烷烃；

所述正构烷烃包含十碳正构烷烃、十一碳正构烷烃、十二碳正构烷烃、十三碳正构烷烃、十四碳正构烷烃、十五碳正构烷烃、十六碳正构烷烃、十七碳正构烷烃、或十八碳正构烷烃中的任意一种或几种；

发酵培养时控制发酵液中正构烷烃的浓度为2％～17％。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述烷烃类产物含有90.0-99.9％的正构烷烃。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，发酵培养时控制发酵液中正构烷烃的浓度为2％～8％。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，发酵培养时控制发酵液中正构烷烃的浓度为10％～15％。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，发酵培养时控制发酵液中正构烷烃的浓度为11％～17％。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，控制发酵的温度为28～32℃，风量为0.3～0.7vvm，压力为0.05～0.14MPa，菌体转化期的pH为5.0～8.0。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述长链二元酸为C9-C18的直链饱和二元酸中的一种或多种。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括提取长链二元酸的步骤，其包括：酸化处理发酵液或发酵处理液，分离，收集长链二元酸。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，先向发酵液或发酵处理液加碱调节pH至7以上，离心和/或膜过滤的方式分离发酵液或发酵处理液中包含菌体、残烃、杂烃的杂质，再酸化处理剩余发酵液或发酵处理液，固液分离，收集长链二元酸。

10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，直接酸化处理发酵液或发酵处理液，分离长链二元酸和包含菌体、残烃、杂烃的杂质，收集长链二元酸。

11.根据权利要求8至10任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括使用活性炭对发酵液或发酵处理液进行脱色。

12.根据权利要求8至10任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括使用有机溶剂进一步纯化收集到的长链二元酸，其中所述有机溶剂包括醇、酸、酮和酯的一种或多种。

13.根据权利要求8至10任一项所述的方法，其特征在于，收集长链二元酸后，再对剩余的发酵液或发酵处理液进行离心和/或膜过滤以分离其中剩余残烃、杂烃。