CN112725385B - 一种发酵制备长链二元酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种发酵制备长链二元酸的方法，是将长链二元酸终止发酵液进行过滤，得到过滤清液和发酵菌渣，将发酵菌渣进行破乳处理，随后进行糖溶处理，获得菌渣浓缩液；将菌渣浓缩液替代发酵培养基中氮源和碳源，用于长链二元酸发酵；过滤清液经酸析、过滤、烘干后，获得长链二元酸粗酸产品。本发明方法能够减少菌体可溶性蛋白的损失，并将菌体夹带的未转化烷烃重新回用，提高烷烃转化率和发酵效果。
Description
技术领域
本发明属于生物化工领域，具体涉及一种发酵制备长链二元酸的方法。
背景技术
长链二元酸（Long chain dicarboxylic acids）是指碳链中含有10个以上碳原子的脂肪族二羧酸（简称DCn），包括饱和及不饱和二羧酸，是一类有着重要和广泛工业用途的精细化工产品。同时也是化学工业中合成高级香料、高性能尼龙工程塑料、高档尼龙热熔胶、高温电介质、高级油漆和涂料、高级润滑油、耐寒性增塑剂、树脂、医药和农药等重要原料。
发酵法生产长链二元酸是利用微生物特有的氧化能力和微生物胞内酶的作用，在常温常压下分别通过α、ω-氧化，将长链正烷烃两端的甲基氧化成为羧基，生成相应链长的各种长链二元酸。能通过发酵生产长链二元酸的细菌、霉菌和放线菌的种类很多，其中假丝酵母属（candida）的酵母菌是正烷烃发酵生产二元酸的高产微生物。
现阶段一般将酵母菌作为发酵菌株，进行长链二元酸发酵生产。如中国专利CN102115767A、中国专利CN102115768A、中国专利CN103805643A等。酵母菌生长活性高，在长链二元酸长周期发酵过程中，会形成较高的生物量，有利于提高长链二元酸的发酵水平，但酵母菌是典型的真核微生物，细胞宽度约2-6μm，长度5-30μm，细胞较大，至发酵末期菌体干重可达到17g/L以上。因此，发酵菌渣的处理问题，阻碍了长链二元酸发酵技术的大规模应用。
目前酵母菌菌渣可以作为酵母膏的制备原料，中国专利CN103992363A公开了一种利用啤酒废酵母制备海藻糖及酵母膏的方法，其特征是先将啤酒废酵母洗涤脱苦纯化，纯化后加入壳聚糖的醋酸溶液和5-磷酸二酯酶酶液使酵母细胞自溶，酵母细胞自溶后离心，收集沉淀物，离心所得上清液经过超滤，超滤透过液经透析袋透析或经交换树脂脱离子脱色，透析浓缩液或洗脱液在乙醇中抽提，然后干燥得海藻糖；将超滤浓缩液、透析析出液以及酵母细胞自溶后离心所得的沉淀物混合后再加入适量淀粉，制得酵母膏。但是，长链二元酸发酵体系是一个高盐体系，并且烷烃不能完全转化，因此长链二元酸的酵母菌渣成分更为复杂，不仅有菌体，还含有烷烃、长链二元酸以及高盐水等，并不适用于进行酵母膏的制备。
目前有关发酵菌渣再利用的工艺，通常采用发酵菌体先降解，再提取干物的方式，其作用是提高发酵产物的收率。如中国专利CN106434770 A公开了一种利用产黄青霉菌渣发酵生产乙醇的方法，其特征是包括采用含有产黄青霉菌渣的降解处理产物的发酵培养基利用发酵菌种进行厌氧发酵获得富含乙醇的发酵醪液的步骤。但是发酵菌体先降解，可溶性蛋白成分会大量损失，尤其对于长链二元酸发酵体系，随着菌体降解，菌体内未消耗的烷烃、可溶性蛋白均会进入到膜过滤的清液中，不但会造成粗酸产品中氮含量较高，还会增加烷烃的损失。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种发酵制备长链二元酸的方法。本发明方法能够减少菌体可溶性蛋白的损失，并将菌体夹带的未转化烷烃重新回用，提高烷烃转化率和发酵效果。
本发明提供的发酵制备长链二元酸的方法，包括如下步骤：
（1）将长链二元酸终止发酵液进行过滤，得到过滤清液和发酵菌渣；
（2）将发酵菌渣进行破乳处理，随后进行糖溶处理，获得菌渣浓缩液；
（3）将菌渣浓缩液替代发酵培养基中氮源和碳源，用于长链二元酸发酵，终止发酵液采用步骤（1）处理过程，过滤清液经酸析、过滤、烘干后，获得长链二元酸粗酸产品。
本发明中，步骤（1）所述的长链二元羧的分子通式为CnH2n-2O4，其中n为10-16。
本发明中，步骤（1）所述的长链二元酸终止发酵液是将发酵菌接种到发酵培养基利用烷烃进行发酵，发酵结束后得到的含长链二元酸发酵液。所述的发酵菌为具有完整α、ω-氧化途径的酵母菌，如可以是假丝酵母属、隐球酵母属、内孢霉属、汉逊氏酵母属、毕赤氏酵母属、红酵母属、球拟酵母属或丝孢酵母属等中的至少一种，优选热带假丝酵母菌。所述发酵培养基的配方为：蔗糖20～28g/L、玉米浆0.8～1.5g/L、酵母膏2.0～4.0g/L、氯化钠0.8～1.2g/L、磷酸二氢钾3.0～3.5g/L、硫酸镁1.2～1.8g/L、尿素1.2～4.8g/L，硫酸铵1.5～2.0g/L、醋酸钠1.5～1.8g/L。烷烃用量为发酵液总体积的15%～30%，优选20%～30%。所述发酵条件为：发酵温度为25～37℃，优选28～32℃；搅拌转速为120～500rpm，优选150～300rpm；通气量为0.2～1.0VVM，优选0.5～1.0VVM；在发酵0～24h内，不进行pH控制，24h后将pH调整至6.8～7.0，随后每间隔24h将pH提高0.1～0.3，发酵时间为138～144小时。
本发明中，步骤（1）所述的过滤采用膜过滤，膜孔直径为10～50nm，优选20～25nm；过滤温度为30～50℃，优选40～50℃。过滤至发酵菌渣含水率为20%～50%，优选25%～40%。
本发明中，步骤（2）所述的破乳处理是将发酵菌渣进行碱性pH调节并加热处理，碱性pH调节范围为8～11，优选为9～10；加热处理采用持续升温的方式，将温度控制在80～90℃，优选85～90℃后，恒温20～40min，优选20～30min。碱性pH调节采用氢氧化钠、氢氧化钾等中的至少一种，质量浓度为20%～40%，优选20%～30%。
本发明中，步骤（2）所述糖溶处理是指破乳菌渣降温至50～60℃后，加入糖恒温处理2～3h，所述糖为单糖或/和二糖，其中单糖优选葡萄糖，二糖优选蔗糖，所述糖添加量为40～60g/L。
本发明中，步骤（3）采用菌渣浓缩液替代发酵培养基中氮源和碳源，并应用于长链二元酸发酵，发酵结束后经同步骤（1）进行处理，得到过滤清液和发酵菌渣；发酵菌渣可以继续采用步骤（2）所述方法进行处理，并替代发酵培养基中氮源和碳源用于长链二元酸发酵，如此能够循环多次，如5-10次也不会影响发酵效果。
本发明中，步骤（1）和步骤（3）得到的过滤清液经酸析、过滤、烘干后，获得长链二元酸粗酸产品。所述酸析是指将过滤清液进行酸性pH调节，控制pH为3～5，优选3～4，使长链二元酸析出。使用的酸性pH调节剂为强酸，如可以是硫酸、盐酸、硝酸等中的至少一种。所述过滤是采用板框过滤，过滤压力为0.1～1.0MPa，过滤温度为10～40℃。所述的烘干温度为80～105℃，烘干时间为5～20h。
与现有技术相比，本发明方法具有以下有益效果：
（1）本发明通过对终止发酵液直接进行过滤，并通过对发酵菌渣的破乳处理和糖溶处理，形成菌渣浓缩液，将其应用于发酵体系的中，提高了长链二元酸的发酵效果，而且解决了菌渣排放量大的问题，提高了发酵工艺的经济性。
（2）本方明针对长链二元酸发酵工艺，将常规发酵精制工艺中破乳工序安排在菌渣处理工段，避免了可溶性蛋白的流失，保留了酵母菌体内含烷烃，有助于实现烷烃与可溶性蛋白的回用，减少了底物消耗。
（3）本方明利用破乳处理、高糖处理的组合手段，提高酵母细胞破壁破膜效果，既起到提高浓度作用，又能保持酵母菌营养物质活性，可以直接应用于培养基配制。酵母菌菌体细胞内含有丰富的硫胺素，能够进一步促进糖代谢，本方案在菌渣利用过程中，能够将硫胺素保留于菌渣浓缩液中，提高了发酵水平。
具体实施方式
下面通过实施例来进一步说明本发明方法和效果。实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
以下实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为本领域常规方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均可从生化试剂商店购买得到。
长链二元酸的提取总收率T的计算公式为：
其中，V为长链二元酸发酵液经膜过滤，除去未反应烷烃后获得的清液体积，L；M为提取的长链二元羧酸干重，g；C为长链二元羧酸的下罐浓度，g/L。
烷烃单耗R计算公式为：
其中，R为制备单位质量长链二元酸产品，所消耗的烷烃质量，简称烷烃单耗，g/g；M1为发酵过程中加入的烷烃总质量，g；M2为膜过滤过程中回收的烷烃总质量，g。
本发明实施例中选用热带假丝酵母（Candida tropicalis）突变株PF-UV-56作为发酵菌株进行长链烷烃发酵生产长链二元酸，该突变株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.0356。
实施例1
发酵培养基配方为：蔗糖28g/L、玉米浆1.5g/L、酵母膏4.0g/L、氯化钠1.2g/L、磷酸二氢钾3.5g/L、硫酸镁1.8g/L、尿素4.8g/L、硫酸铵2.0g/L、醋酸钠1.8g/L。
（1）于500L发酵罐进行长链二元酸发酵，装液体积360L，烷烃添加总量108L，发酵温度32℃、通气量1.0VVM、搅拌转速为250rpm，在发酵0～24h内，不进行pH控制，24h后将pH调整至7.0，随后每间隔24h将pH控制值提高0.2，发酵时间为144小时。经检测，发酵液中长链二元酸的浓度为146.0g/L。发酵液经膜过滤进行固液分离，获得含水率40%的菌渣和水相清液。过滤条件为膜孔直径为20nm，过滤温度40℃。
（2）将步骤（2）的菌渣，用质量浓度20%氢氧化钠溶液调节pH至10，并升温至85℃，恒温30min。充分破乳后，降温至60℃，加入60g/L蔗糖，充分混合恒温3h后得到菌渣浓缩液。
（3）采用步骤（2）的菌渣浓缩液代替发酵培养基中的蔗糖、玉米浆、酵母膏配制第二批次发酵培养基，并按照步骤（1）的条件进行发酵，发酵时间144小时。经检测，发酵液中长链二元酸的浓度为158.0g/L。发酵液进行固液分离，获得第二批次发酵菌渣和水相清液。
将两批水相清液流加浓硫酸，调pH至3，水相清液中长链二元酸结晶析出。经板框过滤及烘干后获得长链二元酸粗酸产品。过滤条件：过滤压力0.5MPa，过滤温度30℃；烘干温度80℃，烘干时间20h，获得长链二元酸粗酸产品质量109.4kg，粗酸提取收率89.9%，烷烃单耗1.23 g/g。
实施例2
发酵培养基配方为：蔗糖20g/L、玉米浆0.8g/L、酵母膏2.0g/L、氯化钠0.8g/L、磷酸二氢钾3.0g/L、硫酸镁1.2g/L、尿素1.2g/L、硫酸铵1.5g/L、醋酸钠1.5g/L。
（1）于500L发酵罐进行长链二元酸发酵，装液体积360L，烷烃添加总量72L，发酵温度29℃、通气量0.5VVM、搅拌转速为200rpm，在发酵0～24h内，不进行pH控制，24h后将pH调整至7.0，随后每间隔24h将pH控制值提高0.2，发酵时间为138小时。经检测，发酵液中长链二元酸的浓度为142.0g/L。发酵液经膜过滤进行固液分离，获得含水率25%的菌渣和水相清液。过滤条件为膜孔直径为25nm，过滤温度50℃。
（2）将步骤（2）的菌渣，用质量浓度30%氢氧化钠溶液调节pH至9，并升温至90℃，恒温20min。充分破乳后，降温至50℃，加入40g/L蔗糖，充分混合恒温3h后降至室温得到菌渣浓缩液。
（3）采用步骤（2）的菌渣浓缩液代替发酵培养基中的蔗糖、玉米浆、酵母膏配制第二批次发酵培养基，并按照步骤（1）的条件进行发酵，发酵138h结束。经检测，发酵液中长链二元酸的浓度为154.0 g/L。发酵液进行固液分离，获得第二批次的发酵菌渣和水相清液。
将两批水相清液流加浓硫酸，调pH至4，水相清液中长链二元酸结晶析出。经板框过滤及烘干后获得长链二元酸粗酸产品。过滤条件：过滤压力1.0MPa，过滤温度30℃；烘干温度105℃，烘干时间5h。获得长链二元酸粗酸产品106.2kg，粗酸提取收率88.9%，烷烃单耗1.27 g/g。
实施例3
将实施例1中步骤（1）、（2）、（3）连续进行5个批次发酵，其中第2～5批次发酵培养基配制过程中，均按照实施例1中步骤（3）的方法，采用前一批次的菌渣浓缩液代替发酵培养中的蔗糖、玉米浆、酵母膏。5个批次发酵结束后，将第1～5批次的过滤水相清液流加浓硫酸，调pH至4，水相清液中长链二元酸结晶析出，经板框过滤及烘干后获得长链二元酸粗酸产品。过滤条件：过滤压力0.5MPa，过滤温度30℃。烘干温度80℃，烘干时间20h。
第1～5批次发酵结束后，长链二元酸浓度分别为145.0g/L 、152.0 g/L 、155.0g/L 、159.0g/L、162.0 g/L，共获得长链二元酸粗酸产品总质量282kg，粗酸提取平均收率90.9%，烷烃平均单耗1.19。
实施例4
同实施例1，不同在于：步骤（3）中以20%氢氧化钾溶液调节pH至10。两批次发酵结束后，长链二元酸浓度分别为144.0 g/L 、149.0 g/L，两个批次共获得长链二元酸粗酸产品质量103.4kg，粗酸提取收率89.9%，烷烃单耗1.30 g/g。
实施例5
按照实施例1的方法，以十三碳烷烃为发酵底物，进行十三碳二元酸发酵。两批次发酵结束后，长链二元酸浓度分别为136.0 g/L 、144.0 g/L。经酸析、烘干处理，共获得长链二元酸粗酸产品总质量99.6kg，粗酸提取平均收率89.9%，烷烃平均单耗1.35g/g。
实施例6
同实施例1，不同在于步骤（2）将步骤（1）的菌渣用20%氢氧化钠溶液调节pH至10，并升温至85℃，恒温30min。充分破乳后，降温至60℃，加入60g/L葡萄糖，充分混合恒温3h后得到菌渣浓缩液。两批次发酵结束后，长链二元酸浓度分别为143.0 g/L 、148.0 g/L，两个批次共获得长链二元酸粗酸产品质量101.6kg，粗酸提取收率89.9%，烷烃单耗1.32 g/g。
实施例7
同实施例1，不同在于将步骤（1）的菌渣，用20%氢氧化钠溶液调节pH至10，并升温至85℃，恒温30min。充分破乳后，降温至60℃，加入30g/L蔗糖、30g/L葡萄糖，充分混合恒温3h后得到菌渣浓缩液。两批次发酵结束后，长链二元酸浓度分别为143.0 g/L 、156.0 g/L，两个批次共获得长链二元酸粗酸产品质量106.6kg，粗酸提取收率89.9%，烷烃单耗1.26 g/g。
比较例1
采用CN103805643A公开的方式，发酵结束后进行破乳、酸析结晶等长链二元酸提取，不进行菌渣浓缩回用。试验结果为：长链二元酸发酵浓度146.0 g/L，长链二元酸粗酸产品质量52.3kg，粗酸提取收率92.0%，烷烃单耗1.29。
比较例2
同实施例1，不同在于步骤（1）发酵结束后，用20%氢氧化钠溶液调节pH至10，并升温至85℃，恒温30min。充分破乳后，降温至60℃。并按照实施例1的步骤（1）进行固液分离，获得菌渣后，加入60g/L蔗糖，充分混合恒温3h后降至室温得到菌渣浓缩液，用于第二批次发酵培养基配制。两批次发酵结束后，长链二元酸浓度分别为143.0 g/L 、101.0 g/L，两个批次共获得长链二元酸粗酸产品质量为86.8kg，粗酸提取收率92.0%，烷烃单耗1.39 g/g。
比较例3
同实施例1，不同在于将步骤（2）的菌渣不进行破乳，加入60g/L蔗糖，60℃恒温3h后，降至室温得到菌渣浓缩液，用于第二批次发酵培养基配制。试验结果为：两批次发酵结束后，长链二元酸浓度分别为144.0 g/L 、119.0 g/L，两个批次共获得长链二元酸粗酸产品质量92.68kg，粗酸提取收率89.9%，烷烃单耗1.35 g/g。
比较例4
同实施例1，不同在于步骤（2）将菌渣用20%氢氧化钠溶液调节pH至10，并升温至85℃，恒温30min，充分破乳后降至室温得到菌渣浓缩液，将该菌渣浓缩液用于第二批次发酵培养基配制，并在培养基中额外加入实施例1步骤（2）的相同质量的蔗糖。试验结果为：两批次发酵结束后，长链二元酸浓度分别为145.0 g/L 、133.0 g/L，两个批次共获得长链二元酸粗酸产品质量97.4kg，粗酸提取收率89.9%，烷烃单耗1.30 g/g。
Claims (21)
1.一种发酵制备长链二元酸的方法，其特征在于包括如下步骤：
（1）将长链二元酸终止发酵液进行过滤，得到过滤清液和发酵菌渣；
（2）将发酵菌渣进行破乳处理，随后进行糖溶处理，获得菌渣浓缩液；所述的破乳处理是将发酵菌渣进行碱性pH调节并加热处理，碱性pH调节范围为8～11，加热处理采用持续升温的方式，将温度控制在80～90℃，恒温20～40min；所述糖溶处理是指破乳菌渣降温至50～60℃后，加入糖恒温处理2～3h，所述糖为单糖或/和二糖；
（3）将菌渣浓缩液替代发酵培养基中氮源和碳源，用于长链二元酸发酵，终止发酵液采用步骤（1）处理过程，过滤清液经酸析、过滤、烘干后，获得长链二元酸粗酸产品。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的长链二元酸的分子通式为CnH2n-2O4，其中n为10-16。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：步骤（1）所述的终止发酵液是将发酵菌接种到发酵培养基利用烷烃进行发酵，发酵结束后得到的含长链二元酸发酵液。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述的发酵菌为具有完整α、ω-氧化途径的酵母菌，具体是假丝酵母属、隐球酵母属、内孢霉属、汉逊氏酵母属、毕赤氏酵母属、红酵母属、球拟酵母属或丝孢酵母属中的至少一种。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述的发酵菌为热带假丝酵母菌。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述发酵培养基的配方为：蔗糖20～28g/L、玉米浆0.8～1.5g/L、酵母膏2.0～4.0g/L、氯化钠0.8～1.2g/L、磷酸二氢钾3.0～3.5g/L、硫酸镁1.2～1.8g/L、尿素1.2～4.8g/L，硫酸铵1.5～2.0g/L、醋酸钠1.5～1.8g/L。
7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述烷烃用量为发酵液总体积的15%～30%。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述烷烃用量为发酵液总体积的20%～30%。
9.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述发酵条件为：发酵温度为25～37℃，搅拌转速为120～500rpm，通气量为0.2～1.0VVM，在发酵0～24h内，不进行pH控制，24h后将pH调整至6.8～7.0，随后每间隔24h将pH提高0.1～0.3，发酵时间为138～144小时。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：发酵温度为28～32℃，搅拌转速为150～300rpm，通气量为0.5～1.0VVM。
11.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1）所述的过滤采用膜过滤，膜孔直径为10～50nm；过滤温度为30～50℃。
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于：膜孔直径为20～25nm；过滤温度为40～50℃。
13.根据权利要求1或11所述的方法，其特征在于：步骤（1）过滤至发酵菌渣含水率为20%～50%。
14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于：过滤至发酵菌渣含水率为25%～40%。
15.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（2）所述的破乳处理，碱性pH调节范围为9～10；将温度控制在85～90℃后，恒温20～30min。
16.根据权利要求15所述的方法，其特征在于：步骤（2）碱性pH调节采用氢氧化钠、氢氧化钾中的至少一种，质量浓度为20%～40%。
17.根据权利要求16所述的方法，其特征在于：质量浓度为20%～30%。
18.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述糖溶处理采用葡萄糖或/和蔗糖，添加量为40～60g/L。
19.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（3）发酵结束后同步骤（1）进行处理，得到过滤清液和发酵菌渣；发酵菌渣继续采用步骤（2）所述方法进行处理，如此能够循环多次。
20.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（3）所述酸析是将过滤清液进行酸性pH调节，控制pH为3～5。
21.根据权利要求20所述的方法，其特征在于：控制pH为3～4。
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| GR01 | Patent grant | ||
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